DE68925717T2

DE68925717T2 - Verfahren und Reagenzkombination zur Bestimmung von Nukleotidsequenzen

Info

Publication number: DE68925717T2
Application number: DE68925717T
Authority: DE
Inventors: Hans Erik Soederland; Ann-Christine Elizabe Syvaenen
Original assignee: Orion Yhtyma Oy
Current assignee: SANGTEC MEDICAL BROMMA SE AB
Priority date: 1988-11-29
Filing date: 1989-11-28
Publication date: 1996-07-04
Anticipated expiration: 2009-11-29
Also published as: PT92420B; IL92474A; JPH02219600A; IL92474A0; EP0371437A2; FI97153C; EP0371437B1; CA2004056A1; DK595389A; DK175170B1; AU4574989A; DE68925717D1; NO894746D0; FI97153B; DK595389D0; NO176362C; PT92420A; NO894746L; NO176362B; GR3019105T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Reagenzkombination zur Bestimmung einer Nucleotidsequenz in einem definierten Polynucleotidbereich sowie die Anwendung dieses Verfahrens zur Bestimmung genetischer Variationen.
Die genetische Information lebender Organismen ist in der Nucleotidsequenz ihrer Genome enthalten. Im Verlauf der Genexpression wird die Nucleotidsequenz in Aminosäuresequenzen, d.h. Proteine, übersetzt. Geringfügige Veränderungen in der Nucleotidsequenz, selbst ein einzelner Basenaustausch, können zu einem veränderten Proteinprodukt führen. Die veränderte Qualität oder Quantität bestimmter Proteine ändert den Phenotyp (d.h. die sichtbaren Merkmale) des Organismus oder der Zelle, was sich beispielsweise als Entwicklung einer Krankheit äußert. Es wäre deshalb wichtig, Veränderungen in Nucleotidsequenzen im Genom lebender Organismen genau und mit einer solchen Effizienz zu bestimmen, damit sehr viele Proben durchgemustert werden können. Das würde Möglichkeiten zur Diagnose von erblichen Prädispositionen oder Krankheiten, zum Nachweis somatischer Mutationen bei Krebs sowie zur Selektion von Zellen und Stämmen für die Pflanzen- und Tierzüchtung bieten.
Der Nachweis von Veränderungen in der Nucleotidsequenz kann auf verschiedene Weise erfolgen. Ein Verfahren, das sehr überzeugende Ergebnisse liefert, ist die Bestimmung der tatsächlichen Nucleotidsequenz in dem Bereich des Genoms, der das interessierende Gen enthält. Im Vergleich zu Nucleinsäure-Hybridisierungsverfahren ist es beim Verfahren der Nucleotidsequenz-Bestimmung nicht erforderlich, die tatsächliche Mutation zu kennen. Es ist nur erforderlich, die Position des Bereichs zu kennen, der von Interesse ist, und diesen Bereich in einer Probe mit dem gleichen Bereich eines normalen "Standard" zu vergleichen.
Zur Nucleotidsequenz-Bestimmung werden zwei grundlegende Verfahrensweisen angewendet. Das sind das chemische Verfahren von Maxam und Gilbert sowie das Kettenabbruch-Verfahren von Sanger. Beide Verfahren sind in modernen Biochemie-Lehrbüchern gut beschrieben. Beiden Verfahren ist gemeinsam, daß man das zu sequenzierende, relativ saubere Ziel- Polynucleotid in Mengen benötigt, die unter dem Mikrogramm-Bereich liegen. Meistens wird das Ziel-Polynucleotid zur biologischen Amplifikation mit Hilfe von gentechnologischen Verfahren in geeignete Vektoren doniert, um ausreichende Mengen des Nucleinsäure-Polymers zur Analyse zu gewinnen. Die wiederholte Replikationsreaktion (vgl. Kleppe et al., J. Mol. Biol. 56 (1971), 341-361) hat eine weitere Möglichkeit zur Amplifikation bestimmter Polynucleotid-Bereiche in vitro geboten. Dieses Verfahren ist später von Mullis et al. (vgl. EP 200,362) angewendet worden. Obwohl dieses Verfahren gegenüber dem donierungsverfahren bei der Herstellung ausreichender DNA-Mengen wesentliche Vorteile in Schnelligkeit und Effizienz bietet, liefert es kein Produkt, das sich direkt zur Sequenzierung eignet. Statt dessen muß der amplifizierte Bereich aus dem Amplifikations-Reaktionsgemisch sorgfältig aufgereinigt werden, beispielsweise mittels Elektrophorese oder Ultrafiltration, da es für die Sequenzierung schädlich wäre, wenn das Gemisch während des Sequenzierungsverfahrens vorhanden wäre. Diese Reinigungsverfahren sind gewöhnlich zeitaufwendig, was gegen ihre Anwendung bei Routineanalysen spricht.
Außerdem offenbart GB-A-2 202 328 ein Verfahren zur Analyse von Nucleinsäuren mit Hilfe von Hybridisierungstechniken nach Amplifikation der Ziel-Nucleinsäuresequenz. Dieses Verfahren erlaubt jedoch nur den Nachweis, daß eine Sequenz in einer Probe vorhanden ist oder nicht. Engelke et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 544-548, beschreiben die Sequenzierung amplifizierter menschlicher genomischer DNA nach Durchführung einer "Polymerase cham reaction", wo bei jedoch alle Reaktionen in Lösung durchgeführt wurden. Wong et al., Nature 330 (1987), 384-386, beschreiben die Charakterisierung einer β-Thalassämie-Mutation durch direkte genomische Sequenzierung einer PCR-amplifizierten DNA mit Hilfe des gleichen Verfahrens, das in Engelke et al., vorstehend, beschrieben ist. Stahl et al., Nucleic Acids Res. 16 (1988), 3025-3028, offenbaren ein Verfahren zur DNA-Sequenzierung an einer Festphase unter Verwendung des Biotin-Avidin-Systems. Das Verfahren umfaßt den enzymatischen Einbau von Biotin-dUTP in ein die Ziel-DNA enthaltendes Plasmid, Linearisierung des Plasmids durch ein Restriktionsenzym, Bindung des gespaltenen und mit Biotin markierten Plasmids an Avidin-Agarose, Aufschmelzen des Doppelstranges und nach Primer-Anlagerung Sequenzierung mittels des Sanger-Verfahrens.
Das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende technische Problem ist daher die Bereitstellung eines Verfahrens, das einen schnellen, zuverlässigen, einfachen und gegebenenfalls automatischen Nachweis von Veränderungen in einer Nucleotidsequenz gestattet und zur routinemäßigen Verwendung als diagnostisches Werkzeug gut angepaßt ist. Dieses technische Problem wird durch die Bereitstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens und der Kits, die dafür zu verwenden sind, gelöst. Die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind in den Patentansprüchen charakterisiert. Bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist eine donierung des Ziel-Polynucleotids in spezifische Vektoren nicht erforderlich. Die Isolierung eines enzymatisch amplifizierten Ziel-Polynucleotids ist einfach und bedingt keine zeitaufwendigen Reinigungsschritte, wie z.B. Ultrafiltration oder Gelelektrophorese. Die Sequenzierungsreaktionen werden außerdem an immobilisierten Matrizen durchgeführt, die Vorteile bei der Kontrolle des Verfahrens sowie Möglichkeiten zur Automatisierung und gleichzeitigen Sequenzierung beider Stränge eines Ziel-Polynucleotids bieten.
Das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis von Nucleotidsequenz- Veränderungen beruht auf der Bestimmung der Nucleotidsequenz in dem Bereich, der von Interesse ist. Erfindungsgemäß umfaßt der erste Schritt des Verfahrens den Erhalt einer amplifizierten DNA-Probe, wobei mindestens eine Verknüpfungseinheit in mindestens einen Strang eines spezifischen Ziel- Polynucleotids mit Hilfe einer modifizierten "Polymerase chain reaction" eingeführt worden ist. Das kann durch Kombinieren einer das Ziel- Nucleinsäurepolymer enthaltenden Probe mit einem Gemisch aus Nucleotidmonomeren (DATP, DCTP, DGTP und DTTP), einer DNA-Polymerase sowie ersten und zweiten Amplifikationsprimern erreicht werden. Jeder der Amplifikationsprimer umfaßt ein Oligonucleotid, das einen Bereich aufweist, der zu einem unterschiedlichen Strang (d.h. zu dem einen oder zu dem anderen der zwei komplementären Stränge) des Ziel-Nucleinsäurepolymers komplementär ist und damit hybridisiert, und das als Primer zur DNA- Polymerisation durch die DNA-Polymerase wirken kann. Mindestens einer der Amplifikationsprimer umfaßt weiter eine erste Verknüpfungseinheit, die an das Oligonucleotid gebunden ist. Zur Bildung einer amplifizierten Probe, die Kopien der an die Verknüpfungseinheit gebundenen Ziel- Nucleinsäuresequenz umfaßt, werden mit dem erhaltenen Amplifikationsgemisch wiederholt Zyklen zwischen einem ersten Zustand, unter dem DNA-Polymerisation erfolgt, und einem zweiten Zustand durchgeführt, unter dem eine Denaturierung doppelsträngiger DNA zu einzelsträngiger DNA erfolgt, wobei die Anzahl der Zyklen zur Herstellung von Kopien des Ziel-Nucleinsäurepolymers in einer zur Verwendung in einem DNA-Sequenzierungsverfahren geeigneten Menge ausreichend ist. Vorteilhafterweise kann vor jedem Polymerisationsschritt ein dritter Inkubationszustand eingefügt werden, unter dem eine Aneinanderlagerung von Einzelsträngen zu doppeisträngiger DNA erfolgt, insbesondere eine Anlagerung von einzelsträngigen Amplifikationsprimern an die einzelsträngige Matrizen-DNA.
Nach Amplifikation werden die eine Verknüpfungseinheit tragenden Stränge des Ziel-Nucleinsäurepolymers unter Verwendung einer festen Matrix eingefangen, die mit einer Verknüpfungsstelle beschichtet ist, an die die Verknüpfungseinheit oder eine Modifikation davon binden kann. Auf diese Weise werden die Stränge der Ziel-Nucleinsäure an die feste Matrix gebunden und können zusammen mit der festen Matrix ohne weiteres von den ungebundenen Reaktanten abgetrennt werden.
Die gereinigten Kopien des Ziel-Polynucleotids werden entweder vor Immobilisierung oder nach Trennung der festen Matrix von den ungebundenen Reaktanten denaturiert und die Sequenz des amplifizierten Ziel-Polymers wird bestimmt. An den denaturierten Kopien des Ziel- Polynucleotids, die jetzt als Matrizen wirken, können beispielsweise Kettenabbruch-Sequenzierungsreaktionen eingeleitet werden. Die neu synthetisierten Produkte der Sequenzierungsreaktion werden dann von der Matrize freigesetzt, davon getrennt und anhand ihrer Größe nachgewiesen.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch eine Reagenz-Kombination oder einen Kit zur praktischen Umsetzung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Obwohl die genaue Verpackung von den ausgewählten Kombinationen der Verknüpfungseinheiten und Verknüpfungsstellen abhängt, umfaßt ein solcher Kit im allgemeinen einen Amplifikationsprimer mit einer Verknüpfungseinheit, einen zur Immobilisierung des Amplifikationsprimers abgeänderten Träger und einen Sequenzierungsprimer.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist zur Bestimmung mindestens einer potentiellen Nucleotidvariation in einer Ziel-Nucleinsäure geeignet, wobei die Variation ein Nucleotidaustausch, eine Deletion oder eine Insertion ist. Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich daher bei gerichtsmedizinischen Analysen oder der Analyse von erblichen Prädispositionen oder Krankheiten anwenden. Bei einigen dieser Analysen ist die Nucleotidvariation eine somatische Mutation.
Aus den vorstehenden Erläuterungen wird deutlich, daß sich das erfindungsgemäße Verfahren auch zur Selektion von Zellen, Stämmen oder Arten in Pflanzen- oder Tierzüchtung oder zur Selektion von Mikroorganismen, die einen gewünschten Genotyp zeigen, anwenden läßt.
Die erfindungsgemäßen Kits sind zur Durchführung der vorstehend erwähnten Verfahren geeignet.
Figur 1 ist eine schematische Darstellung der Reihenfolge der Schritte, die in einer Ausführungsform der Erfindung verwendet werden; und
Figur 2 ist eine schematische Darstellung von möglichen komplementären Bereichen zwischen einer Ziel-Nucleinsäure und einem Sequenzierungsprimer.
Die vorliegende Erfindung offenbart ein Verfahren zur Bestimmung der Nucleotidsequenz von bereits definierten Bereichen in komplexen Nucleinsäuregemischen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden zwei bekannte grundlegende Verfahren verwendet: das Kettenabbruch- Sequenzierungsverfahren von Sanger und die wiederholte Replikationsreaktion (RRR). In der Erfindung wird auch das in GB-A-2202328 beschriebene auf Affinität basierende Hybridgewinnungs-Verfahren verwendet. Die neuartige Kombination dieser Verfahren in der vorliegenden Erfindung ergibt ein einfaches und effizientes Verfahren zur Sequenzierung von Nucleinsäuren, das zum Nachweis genetischer Schäden gut geeignet ist.
Erfindungsgemäß wird zuerst eine kleine Probe einer Ziel-Nucleinsäure unter Anwendung einer wiederholten Replikationsreaktion (RRR) amplifiziert, wobei einer oder beide der Amplifikationsprimer modifiziert werden, so daß sie eine Verknüpfungseinheit, beispielsweise einen Bestandteil eines Affinitätspaars, umfassen. Die interessierende Ziel-Sequenz wird mit einer geeigneten Anzahl von Zyklen dieser modifizierten RRR-Reaktion amplifiziert. Danach kann die Probe zur Überführung der doppelsträngigen Nucleinsäuren in die einzelsträngige Form behandelt werden, wobei alle mit einer bestimmten Verknüpfungseinheit modifizierten Moleküle an eine feste Matrix gebunden werden, die mit einer komplementären Verknüpfungsstelle beschichtet ist, beispielsweise dem anderen Bestandteil eines Affinitätspaars. Dann wird die Matrix zur Entfernung des gesamten ungebundenen Materials gewaschen. Die Verknüpfung einer amplifizierten DNA mit der Matrix ist auch vor der Denaturierung möglich. In diesem Fall erfolgt die Denaturierung der doppelsträngigen adsorbierten Nucleinsäure-Moleküle in die einzelsträngige Form nach Immobilisierung (Verknüpfung). Diese Verfahrensweise ermöglicht auch die Elution des im wesentlichen reinen komplementären Stranges, selbst wenn er nicht mit einer Verknüpfungseinheit synthetisiert worden ist.
Unabhängig von der Stufe, in der der Denaturierungsschritt durchgeführt wird, wird ein fester Träger erhalten, an den eine einzelsträngige Nucleinsäure mit einem Ende gebunden ist. Dieser feste Träger, vorzugsweise Mikrogelkörner, wird danach in das Reaktionsgemisch des Kettenabbruch- Sequenzierungsverfahrens eingeführt, wobei für jedes Nucleotid A, C, G und T ein Reaktionsgemisch verwendet wird. Man läßt den Polymerisationsschritt an den Gelkörnern ablaufen. Falls gewünscht können die Gelkörner danach gewaschen werden, anschließend wird das Polymerisationsprodukt von den Gelkörnern eluiert und wie für eine Anzahl von manuellen, halbmanuellen oder automatisierten Sequenzierungsprotokollen beschrieben, mittels Gelelektrophorese analysiert. Bei einer Modifikation dieses Verfahrens wird der im wesentlichen reine komplementäre Strang, der von dem an die Matrix gebundenen modifizierten Strang eluiert wurde, als Sequenzierungsmatrize verwendet. Wenn beide Amplifikationsprimer mit einer unterschiedlichen Verknüpfungseinheit modifiziert werden und die erhaltene amplifizierte DNA mit unterschiedlichen, physisch trennbaren Matrizen verknüpft wird, können beide Stränge in das gleiche Sequenzierungsreaktions-Gemisch eingeführt werden und die Matrizen, mit der sie verknüpft werden, können spätestens unmittelbar vor der letzten Denaturierung und der Gelelektrophorese voneinander getrennt werden. Die Möglichkeit der gleichzeitigen Sequenzierung beider Stränge, wobei eine Trennung beider Stränge erst unmittelbar vor der Elektrophorese erfolgt, senkt den Arbeitsaufwand der Sequenzierung fast um den Faktor zwei. Die unterschiedlichen Formen der praktischen Umsetzung der vorliegenden Erfindung werden nun genauer beschrieben.

(a) Modifikation von Ziel-Nucleinsäurefragmenten mit Verknüpfungseinheiten

Die Quelle der Ziel-Nucleinsäure (DNA oder RNA), die durch das erfindungsgemäße Verfahren analysiert werden soll, kann eine beliebige menschliche, tierische oder pflanzliche Zelle oder ein beliebiger Mikroorganismus sein. Die Ziel-Nucleinsäure kann aus biologischen Proben mit Hilfe üblicher Nucleinsäure-Aufreinigungsverfahren isoliert werden, erfindungsgemäß besteht jedoch auch die Möglichkeit der direkten Verwendung ungereinigter biologischer Proben.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden Verknüpfungseinheiten durch die modifizierte wiederholte Replikationsreaktion mit Hilfe von zwei Oligonucleotid-Primern pro Bereich, der amplifiziert werden soll, in das Ziel- Polynucleotid eingeführt. Mindestens einer dieser "Amplifikations"-Primer ist mit einer Verknüpfungseinheit modifiziert worden. Für die Zwecke der vorliegenden Anmeldung und der Patentansprüche davon ist eine Verknüpfungseinheit ein Bestandteil, der zu einem anderen Bestandteil Affinität aufweist und mit diesem anderen Bestandteil durch bevorzugte und selektive Bindung ein Affinitätspaar bildet. Solche Affinitätspaare sind beispielsweise Biotin/Avidin oder Streptavidin, komplementäre Polynudeotide einschließlich Homopolynudeotide, wie z.B. Poly-dA/Poly-dT und Poly- dG/Poly-dC, Hapten/Antikörper und Metall/Chelat. Als Affinitätspaar können beliebige Paare von Bestandteilen mit starker Affinität zueinander dienen. Eine Verknüpfungseinheit ist eine Affinitätseinheit oder eine Einheit, die eine Stelle zur Verknüpfung einer Affinitätseinheit bietet.
Die Oligonucleotid-Primer können mit Hilfe chemischer Standardverfahren synthetisiert werden. Zur Herstellung der Primer können auch DNA- Rekombinationsverfahren verwendet werden. Die Größe der Primer liegt vorzugsweise zwischen 14 und 40 Basen, jedoch können auch Primer verwendet werden, die mindestens 8 Basen enthalten oder beträchtlich länger als 40 Basen sind. Unter Anwendung chemischer, enzymatischer oder beliebiger anderer Verfahren werden die Primer mit Verknüpfungseinheiten modifiziert. Die Verknüpfungseinheit wird vorzugsweise mit dem 5'-Ende des Primers verknüpft. Andere Verknüpfungsstellen sind auch möglich, vorausgesetzt, daß das Basenpaarungsverhalten des Primers und seine Primer- Funktion erhalten bleiben.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden zwei modifizierte Primer verwendet. In diesem Fall müssen die Primer mit unterschiedlichen Verknüpfungseinheiten modifiziert werden.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die Amplifikationsprimer, wobei einer oder beide modifiziert ist/sind, die Ziel-Nucleinsäure, Mononucleosidtriphosphate und ein Nucleinsäure synthetisierendes Enzym, z.B. eine DNA-Polymerase, kombiniert. Entsprechend einem beliebigen Protokoll der wiederholten Replikationsreaktion werden zur Denaturierung des Zielmoleküls, Anlagerung der Primer an die Zielstränge und enzymatischer Verlängerung der Primer so viele wiederholte Zyklen durchgeführt, wie zum Erhalt einer Nucleinsäuremenge erforderlich ist, die zur Verwendung in der DNA-Sequenzierung ausreicht. Zur Verwendung bei Kettenabbruch-Sequenzierungsreaktionen werden vorzugsweise mindestens 10¹&sup0; DNA-Moleküle gewonnen.
Durch den Einbau modifizierter Primer in die neu synthetisierten Polynucleotid-Moleküle erhält man als Ergebnis des Verfahrens Kopien des ursprünglichen Ziel-Polynucleotids, die nun mit Verknüpfungseinheiten modifiziert sind. Bei Modifikation nur eines der Primer werden Polynucleotid- Moleküle synthetisiert, bei denen nur ein Strang mit einer Verknüpfungseinheit modifiziert ist. Die Verwendung von zwei unterschiedlich modifizierten Primern, wobei jeder mit einem unterschiedlichen Strang der Ziel-Nucleinsäure hybridisiert, führt zur Herstellung von Polynucleotid-Molekülen, bei denen ein Strang mit einer Verknüpfungseinheit und der andere Strang mit einer unterschiedlichen Verknüpfungseinheit modifiziert ist. Ein spezieller Fall tritt ein, wenn einer der Primer mit einer Polynucleotid-Verknüpfungseinheit modifiziert wird. In diesem Fall wird während des RRR-Ablaufs der andere Strang mit der komplementären Sequenz modifiziert, die dann als Verknüpfungseinheit für den zweiten Strang dienen kann. Die Größe und Menge der hergestellten modifizierten Ziel-DNA wird nur durch die Eigenschaften der wiederholten Replikationsreaktion beschränkt.

(b) Isolierung eines einzelsträngigen Ziel-Polynucleotids

Nach Synthese wird das modifizierte Ziel-Polynucleotid an einer festen Matrix eingefangen, an die eine Verknüpfungsstelle gebunden worden ist. Für die Zwecke der vorliegenden Anmeldung und der Patentansprüche ist eine Verknüpfungsstelle ein Bestandteil eines Affinitätspaars, die so ausgewählt ist, daß sie vorzugsweise und selektiv an die Affinitätseinheit bindet, die als die in den Amplifikationsprimer eingebaute Verknüpfungseinheit verwendet wird, oder nachträglich an diese gebunden wird. Bei Modifikation eines Stranges des Ziel-Polynucleotids mit einer Affinitätseinheit wird eine feste Matrix und bei Modifikation beider Stränge werden zwei unterschiedliche feste Matrizen verwendet. Vorzugsweise sind die beiden Matrizen so ausgewählt, daß sie physisch voneinander getrennt werden können. In einer anderen Ausführungsform können die zwei unterschiedlich modifizierten Stränge an zwei unterschiedlichen festen Matrizen schrittweise eingefangen werden.
Die feste Matrix kann eine beliebige Form haben, z.B. als Gelkörner, Mikroteilchen, Oberfläche einer Mikrotitrationsplatte oder eines Teströhrchens, Eintauchstab oder Filter. Das Material der Matrix kann beispielsweise Polystyrol, Cellulose, Latex, Nitrocellulose, Nylon, Polyacrylamid, Dextran oder Agarose sein. Die einzige Voraussetzung für das Matrix-Material ist, daß die Verknüpfungsstelle damit verknüpft werden kann. Die Bindungskapazität der Matrix sollte es ermöglichen, daß sowohl eine ausreichende Menge des modifizierten Ziel-Polynucleotids als auch der vorhandene Überschuß an modifiziertem Primer eingefangen wird. Vorzugsweise wird eine Matrix verwendet, die sich leicht portionieren läßt, beispielsweise eine große Anzahl von Matrixteilchen mit geringerer Bindungskapazität gegenüber wenigen Matrixteilchen mit sehr hoher Kapazität.
Im Reaktionsgemisch, in dem die Amplifikation durchgeführt wurde, kann die modifizierte Ziel-Nucleinsäure mit der Affinitätsmatrix direkt in Kontakt gebracht werden. Das Gemisch kann auch verdünnt oder seine Zusammensetzung kann verändert werden, um Bedingungen zu erhalten, die die Reaktion zwischen den Bestandteilen des Affinitätspaars begünstigen.
Bei Verwendung von zwei Affinitätspaaren wird das Ziel-Polynucleotid vorzugsweise vor der Affinitäts-Einfangreaktion denaturiert, um die getrennte Gewinnung der zwei Stränge an unterschiedlichen Affinitätsmatrizen zu ermöglichen. Wenn sich diese zwei unterschiedlichen Affinitätsmatrizen physisch voneinander trennen lassen, z.B. nach der Stufe der Sequenzierungsreaktion, können die zwei Matrizen in der Einfangstufe und in der Sequenzierungsreaktions-Stufe als eine Matrix behandelt werden. Bei Modifikation nur eines Zielmolekül-Stranges kann das Ziel-Molekül gegebenenfalls vor der Einfangreaktion denaturiert werden.
Zur Gewinnung eines wesentlichen Teils der amplifizierten Ziel- Nucleinsäure, der in Abhängigkeit von der Kinetik der Bindungsreaktion unterschiedlich sein kann, läßt man die Verknüpfungseinheiten des Ziel- Polynucleotids mit der immobilisierten komplementären Verknüpfungsstelle über einen ausreichend langen Zeitraum miteinander reagieren. Falls sich die Verknüpfungseinheit nicht direkt an die Verknüpfungsstelle binden läßt, ist weiterhin die Einführung einer Bindungseinheit erforderlich, eines Moleküls mit getrennten Bindungsstellen für die Verknüpfungseinheit und die Verknüpfungsstelle, das zwischen den beiden ein Zwischenglied bildet. Nach der Einfangreaktion wird das gebundene Ziel-Polynucleotid durch Waschen der Matrix unter geeigneten Bedingungen von ungebundenem Material, das überschüssige Mononucleosidtriphosphate, nicht modifizierte Primer, Enzym, Salze, usw. umfaßt, abgetrennt. Das Trennverfahren hängt von der physikalischen Form der Matrix ab und kann beispielsweise eine Zentrifugation, eine magnetische Trennung, ein Säulenverfahren oder ein Spülen der Oberfläche der Matrix oder eine Kombination davon sein.
Nach dem Waschverfahren wird die Matrix unter Bedingungen behandelt, die das gebundene Ziel-Polynucleotid in die einzelsträngige Form überführen. Es können beliebige Bedingungen angewendet werden, die ein doppelsträngiges Polynucleotid denaturieren, wie Hitze, ein Alkali oder Enzyme, die jedoch die Bindungen zwischen den Bestandteilen des Affinitätspaares nicht beeinträchtigen. Dieser Schritt ist obligatorisch, falls das Ziel-Polynucleotid vor der Einfangreaktion nicht denaturiert wurde. Bei Durchführung der Denaturierung vor der Einfangreaktion ist dieser Schritt vorteilhaft, jedoch nicht obligatorisch, um sicherzustellen, daß Zielmoleküle denaturiert werden, die sich vielleicht während des Einfangschrittes aneinandergelagert haben. Eine Ausnahme ist natürlich der Fall, wenn Verknüpfungseinheit und Verknüpfungsstelle komplementäre Nucleinsäure- Stränge sind. jn diesem Fall muß vor der Verknüpfung eine Denaturierung stattfinden, da die Bindung an den Träger sonst verloren gehen würde.

(c) Sequenzierungsreaktion

Erfindungsgemäß kann die Bestimmung der Sequenz der isolierten amplifizierten Polynucleotid-Fragmente unter Anwendung des Kettenabbruch-Verfahrens durchgeführt werden. Das Verfahren basiert auf der Verwendung von Desoxynucleotid-Analogen, die durch ein Polynucleotid synthetisierendes Enzym nach dem Zufallsprinzip in einen länger werdenden Polynucleotid-Strang eingebaut werden, wobei es zu einem spezifischen Kettenabbruch kommt. Ein Kettenabbruch kann auch durch Verwendung sehr niedriger Konzentrationen eines der Desoxynucleosidtriphosphate erreicht werden.
Die erforderlichen Bestandteile der Kettenabbruch-Sequenzierungsreaktion sind ein Sequenzierungsprimer, ein Polynucleotid synthetisierendes Enzym, die zum Kettenabbruch führenden Didesoxynudeotide, Desoxynudeotide und eine nachweisbare Markierung. Erfindungsgemäß werden zur Sequenzierung des immobilisierten Ziel-Polynucleotids verschiedene Standard-Laborprotokolle angewendet. Die Reihenfolge der Zugabe der Bestandteile der Sequenzierungsreaktion kann unterschiedlich sein und hängt von der verwendeten Affinitätsmatrix sowie dem ausgewählten Protokoll ab.
Wie in Figur 2 gezeigt kann sich der Sequenzierungsprimer von dem in der RRR-Amplifikationsreaktion verwendeten Primer unterscheiden oder kann gleich sein. Wenn er sich vom Amplifikationsprimer unterscheidet, kann er sich im Ziel-Nucleinsäurepolymer vollständig zwischen dem interessierenden Bereich und dem 3'-Ende des Amplifikationsprimers (A) befinden, oder er kann den Amplifikationsprimer teilweise so überlappen, daß sich sein 3'-Ende mindestens an ein Nucleotid, vorzugsweise jedoch an mehr als drei Nucleotide des 5'-Endes des Ziel-Nucleinsäurepolymers anlagert (B). Der Sequenzierungsprimer kann sich ebenfalls ganz im Bereich des Amplifikationsprimers befinden (C) oder kann zum Amplifikationsprimer gleich sein (D).
Die Wahl eines Sequenzierungsprimers hängt vom Zweck der Analyse ab. Ein Primer, der sich vom RRR-Primer unterscheidet, erhöht die Spezifität der Sequenzierungsreaktion, da die Sequenzierung falscher Fragmente, die möglicherweise bei der RRR produziert wurden, vermieden wird. Ein Sequenzierungsprimer, der sich vom Amplifikationsprimer unterscheidet, ist daher bevorzugt. Andererseits benötigt man zur Herstellung eines solchen Primers vorher mehr Informationen über die Sequenz des amplifizierten Fragments.
Die Markierung zum Nachweis der bei der Sequenzierungsreaktion hergestellten Fragmente kann unter Verwendung eines markierten Sequenzierungsprimers eingeführt werden. Die Markierung kann sich am 5'- Ende oder innerhalb des Primers befinden. Die Markierung kann ein Isotop, wie ³²P, eine Fluoreszenz-Gruppe, eine beliebige andere nachweisbare Markierung oder eine Gruppe sein, die eine Stelle zur späteren Verknüpfung einer nachweisbaren Markierung bereitstellt. Die Markierung kann auch unter Verwendung von Desoxynudeotiden eingeführt werden, die mit einem Isotop, wie z.B. ³&sup5;S oder ³²P, einem Fluoreszenzfarbstoff oder anderen nachweisbaren Markierungen versehen sind. Die Markierungseinheit wird in einer solchen Menge eingebaut, daß sie im wesentlichen in alle der synthetisierten Nucleinsäuren, selbst in sehr kurze Fragmente, eingebaut wird.
Die das Polynucleotid-Fragment tragende Matrix wird in einer geeigneten Lösung suspendiert, die den Sequenzierungsprimer enthält. Im Vergleich zum Ziel-Polynucleotid wird der Primer vorzugsweise in gleicher molaren Konzentration oder im Überschuß zugegeben. In Abhängigkeit von der Größe und Menge des verwendeten Primers läßt man den Primer bei einer geeigneten Temperatur und über einen ausreichend langen Zeitraum an das Ziel-Polynucleotid anlagern. Man sollte beachten, daß zwei verschiedene Sequenzierungsprimer verwendet werden, wenn beide Stränge eines Ziel- Polynucleotids modifiziert und an unterschiedliche Affinitätsmatrizen gebunden werden, die sich physisch voneinander trennen lassen und dann als eine Matrix behandelt werden.
Bei Verwendung einer Affinitätsmatrix, die sich portionieren läßt, z.B. Gelkörner, ist es zweckmäßig, die Probe nach Anlagerung des Primers in vier Teile für die einzelnen Sequenzierungsreaktionen aufzuteilen. Bei Verwendung einer Affinitätsmatrix, die sich nicht teilen läßt, z.B. eine Mikrotitrationsplatte, werden im Affinitätseinfang-Schritt vier parallele Reaktionsgemische hergestellt. Die schrittweise Durchführung der vier Reaktionen am gleichen Träger ist auch möglich, indem das Produkt jeder Reaktion vor Durchführung der nächsten Reaktion eluiert wird. In bestimmten Fällen erhält man ausreichend Informationen, wenn nur eine, zwei oder drei Reaktionen durchgeführt werden. Wenn beispielsweise bekannt ist, daß ein genetischer Schaden von einer Punktmutation an einer einzigen spezifischen Stelle herrührt, die normalerweise ein C-Rest ist, kann es ausreichend sein, nur die C-Reaktionen durchzuführen, da es an diesem Punkt nicht erforderlich ist, die tatsächliche Identität eines Nucleinsäurerestes, der kein C-Rest ist, zu kennen. Relevant ist nur, daß der Rest kein C-Rest ist.
Nach Anlagerung werden ein Polynucleotid synthetisierendes Enzym, z.B. die DNA-Polymerase 1 von E. coli oder die T7-DNA-Polymerase, und Gemische zugegeben, die die zum Kettenabbruch führenden Didesoxynudeotide, Desoxynudeotide und, bei Verwendung nichtmarkierter Primer, markierte Desoxynudeotide in einem geeigneten Verhältnis enthalten, wobei dieses Verhältnis von dem verwendeten Enzym und der Größe des Zielmoleküls abhängt. Zur Erzielung einer im wesentlichen vollständigen Größen- Verteilung der Fragmente läßt man die Polymerisatiosreaktion über einen ausreichend langen Zeitraum bei einer Temperatur ablaufen, die vom Enzym und den verwendeten Bedingungen abhängt. Schließlich wird eine Chase- Reaktion mit Desoxynudeotiden durchgeführt, um die Synthese der Polynucleotid-Stränge zu vervollständigen, bei denen es nicht zum Abbruch gekommen ist. Die Reaktion wird danach beendet.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann in dieser Phase die Affinitätsmatrix zur Entfernung der Bestandteile der Sequenzierungsreaktion gewaschen werden. Die Zusammensetzung des Gemisches kann somit auch verändert werden, um die günstigsten Bedingungen für die Analyse der synthetisierten Fragmente zu erhalten. Falls beide Stränge modifiziert und an zwei unterschiedliche Affinitätsmatrizen gebunden wurden, werden die Matrizen in dieser Phase physisch getrennt, z.B. mit Hilfe eines Magnetfeldes. Die Ziel-DNA wird einzelsträngig gemacht und die synthetisierten Fragmente der vier Sequenzierungsreaktionen werden durch Elektrophorese oder ein anderes geeignetes Verfahren getrennt. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die Affinitätsmatrix vor Elektrophorese entfernt werden. Wenn die Affinitätsmatrix aus Mikroteilchen besteht, kann sie zur Durchführung des Elektrophorese-Schrittes zusammen mit der Probe in die Geltaschen aufgetragen werden. Bei der weiteren Probenverarbeitung ist das ein Vorteil. Im Elektrophorese-Schritt wird die Größenverteilung der Fragmente analysiert. Je nach der verwendeten Markierung kann das Nachweisverfahren unterschiedlich sein. Bei Isotopen wird das Gel durch Fixieren und Trocknen präpariert und dann nach Standard-Verfahren einem Röntgenfilm ausgesetzt. Bei Fluoreszenz-Markierungen werden die Fragmente unter Verwendung eines für diesen Zweck entwickelten automatischen Geräts nachgewiesen. Die Größenverteilung der durch die Sequenzierungsreaktion hergestellten Polynucleotid-Fragmente erzeugt ein Muster, das als "Sequenzierungsleiter" bezeichnet wird und die Nucleotidsequenz des Ziel- Polynucleotids wiedergibt.
Reagenzien, die zur praktischen Umsetzung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden, können in Form eines Kits verpackt werden. Beispielsweise können Kits hergestellt werden, die verpackte Kombinationen von einem oder zwei Amplifikationsprimern sowie Verknüpfungseinheiten, die entsprechenden festen Träger und einen Sequenzierungsprimer umfassen. Es können auch Kits hergestellt werden, die weiterhin ein Referenzmittel zum Vergleich der ermittelten Sequenz des Nucleinsäurepolymers mit der Sequenz eines Standards umfassen. Beispiele für Referenzmittel umfassen Packungsbeilagen, die die aus der Sequenzierung des Standards erhaltene Sequenzierungsleiter zeigen, oder eine Probe des Standards selbst. Bei Lieferung des Standards besitzt dieser vorteilhafterweise eine mit ihm verknüpfte Verknüpfungseinheit, so daß er in gleicher Weise wie das Zielmolekül sequenziert werden kann.
Die Anordnung der Reagenzien in den Behältern des Kits hängt von den enthaltenen spezifischen Reagenzien ab. Natürlich kann jedes Reagenz in einem Einzelbehälter verpackt werden, jedoch sind auch verschiedene Kombinationen möglich. Wenn beispielsweise die verwendete Verknüpfungseinheit und Verknüpfungsstelle unter den Bedingungen der RRR-Reaktion nicht miteinander binden, können beide in einem Einzelbehälter bereitgestellt werden. Das könnte z.B. der Fall sein, wenn eine Bindungseinheit verwendet wird.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele, die den Schutzumfang der Erfindung nicht beschränken sollen, genauer erläutert.

Beispiel 1

Bestimmung der Nucleotidsequenz eines an Avidin-Mikroteilchen immobilisierten, biotinylierten DNA-Fragments des Cytomegalovirus

Synthese der Primer

Die Primer wurden in der DNA-Synthesevorrichtung 381A von Applied Biosystems mit Hilfe des Methoxyphosphoramidit-Verfahrens synthetisiert. Die Primer (als 25A und 25B bezeichnet) waren 25-mere mit der folgenden Nucleotidsequenz:
Als letzter Schritt in der Synthese wurde an den Primer 25A unter Verwendung des Reagenz Aminolink II (Applied Biosystems, P/N 400808) eine 5'-terminale Aminogruppe angefügt. Die Aminogruppe wurde mit Sulfo-NHS- biotin (Pierce Chemical Co.) biotinyliert. Das biotinylierte Oligonucleotid wurde mittels HPLC auf einer Umkehrphasen-C-18-Säule gereinigt.

Die Ziel-DNA

Bei der Ziel-DNA handelte es sich um ein Fragment des langen, nur einmal vorkommenden Bereichs des Cytomegalovirus (CMV)-Genoms an Position 0,30 - 0,35 der Karte, d.h. um das 12,2 kb große Hind IIIL-Fragment der AD-169-CMV- DNA (ATC VR-538), das in den Vektor pAT153 doniert wurde. Das Zielplasmid wurde mit dem Restriktionsenzym Eco RI linearisiert. Die Primer flankieren einen 115 bp großen Bereich im CMV-Hind IIIL-Fragment.

Primerverlängerungsreaktion - Amplifikation

In ein 165 Basenpaar-Fragment der CMV-DNA wurde Biotin durch 25 Amplifikations zyklen mittels der wiederholten Replikationsreaktion (RRR) unter Verwendung des 5'-biotinylierten Primers 25a und des nichtmodifizierten Primers 25B eingeführt. Die Amplifikation wurde mit 3 x 10&sup5; Molekülen des linearisierten CMV- Hind IIIL-Fragments, jeweils 100 pMolen der einzelnen Primer und den vier Mononucleosidtriphosphaten (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) in einer Konzentration von jeweils 200 µM in 100 µl einer Lösung aus 10 mM Tris-HCL, pH-Wert 8,35, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl&sub2; und 0,1 mg/ml Gelatine in 0,5 ml-Eppendorf-Röhrchen unter einer Schicht aus viskösem Paraffin durchgeführt. Die Ziel-DNA wurde im Reaktionsgemisch 5 Minuten aufgekocht, um sie einzelsträngig zu machen. Danach wurden 2 Einheiten DNA-Polymerase von Thermus aquaticus (New England Biolabs) zugegeben. Die Teströhrchen wurden dann über 25 Zyklen wie folgt weiterbehandelt: 1-minütige Primer-Anlagerung bei 55ºC, 3-minütige Primer- Verlängerung bei 72ºC, Denaturierung der Matrize 1 Minute, 15 Sekunden bei 95ºC.

Einfangen der biotinylierten, amplifizierten DNA an Avidin-beschichteten Polvstyrol-Teilchen

25 µl einer Probe, die etwa 10¹&sup0; Moleküle, d.h. 0,02 pMole des amplifizierten DNA-Fragments enthielt, das doppelsträngig war und in einem Strang in 5'- Position Biotin enthielt, wurden aus dem Reaktionsgemisch durch 1-stündige Inkubation mit 5 µl einer 5%-igen Lösung von Avidin-beschichteten Polystyrol-Teilchen (0,8 µm, Pandex Laboratories) bei Raumtemperatur gewonnen. Die Gelkörner wurden durch 3-minütige Zentrifugation in einer Eppendorf-Zentrifuge gewonnen und dreimal gewaschen, indem sie mit 1 ml 0,1% Triton -X-100 enthaltender phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH-Wert 7,5, auf einem Vortex-Gerät verwirbelt und anschließend wie vorstehend beschrieben zentrifugiert wurden. Die gebundene DNA wurde durch eine 15-minütige Behandlung mit 200 µl 0,15 M NaOH bei 37ºC denaturiert, die Teilchen wurden gesammelt und zweimal mit 1 ml 0,1%-igem Triton -X-100 sowie zum Schluß einmal mit 1 ml 0,01%-igem Triton -X-100 gewaschen.

Sequenzierung des immobilisierten DNA-Fragments

Die das DNA-Fragment tragenden Mikroteilchen wurden in 10 µl einer Lösung suspendiert, die 40 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 20 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl, 100 µg/ml Rinderserum-Albumin sowie 0,06-0,08 pMole des Primers 25B enthielt. Man ließ den Primer 10 Minuten bei 55ºC und danach 30 Minuten bei 37ºC anlagern. Danach wurden 2 µl ³&sup5;S-markiertes DCTP (600 Ci/mmol; Amersham) und 1 µl (5 Einheiten) DNA-Polymerase von E. coli (Klenow- Fragment; Boehringer Mannheim) zugegeben. Die Suspension wurde für die Einzel-Sequenzierungsreaktionen auf vier Teströhrchen, d.h. jeweils 25 µl, verteilt. 2 µl des Gemisches aus Desoxynudeotiden und Didesoxynudeotiden wurden zugegeben, wobei die folgenden Endkonzentrationen erhalten wurden:
A-Reaktion: 125 µM dGTP, dTTP, 16 µM dATP, 250 µM ddATP
C-Reaktion: 125 µM dGTP, dTTP, dATP, 20 µM ddCTP
G-Reaktion: 125 µM dTTP, dATP, 16 µM dGTP, 200 µM ddGTP
T-Reaktion:125 µM dGTP, dATP, 16 µm dTTP, 500 µM ddTTP.
Man ließ die Reaktion 20 Minuten bei Raumtemperatur ablaufen. Dann wurden 2 µl einer Lösung, die die vier dNTPS in einer Konzentration von jeweils 2 mM enthielt, zugegeben und man ließ die Chase-Reaktion 20 Minuten bei Raumtemperatur ablaufen. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 4 µl einer Lösung aus 95%-Formamid, 20 mM EDTA, 0,05% Bromphenolblau und 0,05% Xylolcyanol beendet. Die Proben wurden 3 Minuten bei 98ºC erhitzt. Die Teströhrchen wurden zentrifugiert und 3 µl des Überstandes wurden auf ein 80%-iges Polyacrylamid-Sequenzierungsgel aufgetragen. Die Proben wurden einer Elektrophorese unterworfen. Das Gel wurde entfernt, fixiert und nach Standardverfahren einem Röntgenfilm ausgesetzt. Nach Entwicklung wurden deutliche Sequenzierungsleitern festgestellt.

Beispiel 2

Das gesamte Verfahren wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt, wobei allerdings die Proben aus der Sequenzierungsreaktion direkt auf das Gel aufgetragen wurden, ohne daß die Mikroteilchen vorher entfernt wurden. Es wurden Sequenzierungsleitern erhalten, die identisch mit den in Beispiel 1 waren.

Beispiel 3

Bei diesem Beispiel wurden in den Sequenzierungsreaktionen ³²P- markierte Primer verwendet. Das Verfahren wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt, allerdings mit den folgenden Ausnahmen:
Der Sequenzierungsprimer (25B) wurde unter Verwendung von gamma- ³²P-ATP und Polynucleotidkinase nach einem Standardverfahren markiert. Pro Markierungsreaktion wurden 2 pMole Oligonucleotid-Primer und 14 pMole gamma-³²P-ATP (> 5000 Ci/mmol; Amersham) verwendet. Es wurden Primer mit spezifischen Aktivitäten von 10&sup7;cpm/pmol erhalten.
Zur Sequenzierungsreaktion wurden die Mikroteilchen, die etwa 0,02 pMole des amplifizierten DNA-Fragments trugen, in den Sequenzierungspuffer (vgl. Beispiel 1) suspendiert, der 0,1 pMole des markierten Primers 25B enthielt. Die Primeranlagerungs-Reaktion wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt. Danach wurde 1 µl (5 Einheiten) DNA-Polymerase zugegeben und die Suspension wurde in vier Teile, jeweils 2,5 µl, aufgeteilt. 2 µl des Gemisches aus Desoxynudeotiden und Didesoxynudeotiden wurden zugegeben, wobei die folgenden Endkonzentrationen erhalten wurden:
A-Reaktion: 125 µM dCTP, dGTP, dTTP, 16 µM dATP und 250 µM ddATP
C-Reaktion: 125 ijm dATP, dGTP, dTTP, 16 µM dCTP und 80 uM ddCTP
G-Reaktion: 125 µM dATP, dCTP, dTTP, 16 µM dGTP und 200 µM ddGTP
T-Reaktion: 125 µM dATP, dCTP, dGTP, 16 µM dTTP und 500 µM ddTTP.
Sowohl die Kettenabbruch- und Chase-Reaktionen als auch die Analyse der hergestellten Fragmente wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Wie in diesem Beispiel wurden auch deutliche Sequenzierungsleitem erhalten.

Beispiel 4

Bei diesem Beispiel waren der verwendete RRR-Primer (Amplifikationsprimer) und der Sequenzierungsprimer nicht identisch. Der Sequenzierungsprimer befand sich 78 Basen vom Amplifikationsprimer entfernt in Richtung des biotinylierten 5'-Endes des amplifizierten Fragments.
Die PCR-Amplifikation wurde mit dem biotinylierten Primer 25A und einem als 25C bezeichneten 25-mer Primer mit der folgenden Sequenz durchgeführt: 5'-CAG GGT CAC TGA CAA CAG CCG CCC T. Die Primer 25A und 25C flankieren eine 209 bp große Sequenz im CMV-Genom.
Die Amplifikations- und Einfangreaktionen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Der Primer 25B wurde mit ³²P markiert und unter den in Beispiel 3 beschriebenen Bedingungen als Sequenzierungsprimer verwendet. Die erhaltene Sequenz war identisch mit der Sequenz, die in Beispiel 3 erhalten wurde.

Beispiel 5

Alle Verfahren mit Ausnahme des Affinitätseinfang-Schrittes wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Bei diesem Beispiel wurden magnetische Gelkörner als Affinitätsmatrix verwendet. Die Gelkörner hatten einen Durchmesser von 2 µm und besaßen einen paramagnetischen Kern mit einer kugelförmigen Polystyrolhülle, die mit Streptavidin beschichtet war. Die Gelkörner (Dynabead 280-Streptavidin) wurden von Dynal, Norwegen, bezogen. Vor Verwendung wurden die Gelkörner einmal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen.
Wie in Beispiel 1 wurden 25 µl der Probe, die das amplifizierte DNA- Fragment enthielt, analysiert. 5 µl einer 4%-igen Suspension der magnetischen Gelkörner in PBS wurden zugegeben und man ließ die Einfangreaktion 30 Minuten bei 37ºC in Eppendorf-Röhrchen auf einem Rotations-Mischgerät ablaufen. Die Gelkörner wurden durch 1-minütige Anwendung eines Standard-Labormagneten von der Lösung abgetrennt und die Lösung wurde verworfen. Die Gelkörner wurden dreimal mit 1 ml PBS gewaschen, indem sie mit einem Vortex-Gerät verwirbelt und danach wie vorstehend beschrieben mit einem Magneten abgetrennt wurden. Die gebundene DNA wurde durch 15-minütige Behandlung mit 200 µl 0,15 M NaOH bei 37ºC denaturiert. Die Gelkörner wurden gesammelt und zweimal mit PBS sowie einmal mit 40 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 20 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl gewaschen. Die Sequenzierung des immobilisierten DNA-Fragments wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.

Beispiel 6

Die RRR-Amplifikations- und Einfangverfahren wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Bei diesem Beispiel wurde der beim Denaturierungsschritt gewonnene zweite Strang des amplifizierten DNA- Fragments sequenziert.
Der 0,15 M NaOH-Überstand von 200 µl, der den von der Mfinitätsmatrix eluierten DNA-Strang enthielt, wurde durch Zugabe von 20 µl 1,5 M Essigsäure und 12 µl 3 M Natriumacetat (pH 7) neutralisiert. Die DNA wurde mit Ethanol präzipitiert und in 10 µl Sequenzierungspuffer (vgl. Beispiel 1) gelöst, der den Sequenzierungsprimer enthielt. Das Sequenzierungsverfahren wurde unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen durchgeführt. Es wurden wiederum deutliche Sequenzierungsleitern erhalten.

Beispiel 7

Nachweis eines genetischen Polymorphismus von Apolipoprotein E durch Sequenzieren immobilisierter Apolipoprotein E-DNA-Fragmente
Dieses Beispiel dient zur Veranschaulichung der Zweckmäßigkeit des erfindungsgemäß beanspruchten Verfahrens für die Diagnose genetischer Krankheiten. Das Verfahren wurde zur Analyse der genetischen Variation von Apolipoprotein E (apo E) angewendet. Dieses Protein spielt im Lipoprotein- Stoffwechsel eine wichtige Rolle. In der Population existieren drei weitverbreitete Isoformen von apo E (E2, E3 und E4), die von drei verschiedenen Allelen (&epsi;2, &epsi;3 und &epsi;4) codiert werden. Die genetische Variation dieser Allele ist auf Einzelbasen-Austausche an den Aminosäure-Positionen 112 und 158 zurückzuführen. Durch diesen genetischen Polymorphismus von apo E lassen sich mindestens 10% der individuellen Schwankungen der Serum- Cholesterin-Menge erklären. Er besitzt daher große klinische Bedeutung.

Synthese der Primer

Auf der DNA-Synthesevorrichtung 381A von Applied Biosystems wurden vier Primer (P1 - P4) synthetisiert. Die Nucleotidsequenzen der Primer und ihre Position (als Nucleotid-Nummer angegegeben) auf dem Apolipoprotein-E- Gen (Apo E) sind wie folgt:
Mit dem Reagenz Aminolink II (Applied Biosystems) wurde eine 5'- Aminogruppe an den Primer P2 angefügt. Die Aminogruppe wurde unter Verwendung von Sulfo-NHS-biotin (Pierce Chemical Co.) biotinyliert und mittels Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Der Sequenzierungsprimer (P3) wurde mit [gamma-³²P]dATP und T4-Polynucleotidkinase bis zu einer spezifischen Aktivität von 4 x 10&sup6; cpm/pm markiert.

DNA-Proben

Von Patienten mit bekanntem Apo E-Phänotyp, die in der Upid Outpatient Clinic of the University Central Hospital of Helsinki behandelt wurden, wurden Venenblut-Proben gewonnen. DNA wurde aus Leukozyten nach Standardverfahren extrahiert.

Amplifikation

Die DNA (100 ng pro Probe) wurde mit den Primern P1 und P4 (Endkonzentration 1 µM) in 100 µl einer Lösung aus jeweils 0,2 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 20 mM Tris-HCL, pH-Wert 8,8, 15 mM (NH)&sub4;SO&sub4;, 1,5 mM MgCl&sub2;, 0,1% Tween 20, 0,1 mg/ml Gelatine sowie 2,5 Einheiten DNA-Polymerase von Thermus aquaticus (Promega) in einem Gerät mit gesteuerten Temperaturzyklen für DNA (Perkin-Elmer/Cetus) über 25 Zyklen von jeweils 1 Minute bei 96ºC und 2 Minuten bei 65ºC amplifiziert. Ein kleines Aliquot (3 µl einer 1:100-Verdünnung) dieses ersten Amplifikationsgemisches wurde in eine zweite Amplifikation überführt. Die zweite Amplifikation wurde unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen durchgeführt und durch ein Paar von Primern gesteuert, deren Positionen zwischen denen der ersten Primer lagen, wobei einer davon biotinyliert wurde (biotinylierter Primer P2 sowie P3).

Affinitäts-Einfangen der biotinylierten Apo E-DNA an Avidinbeschichteten Polystyrol-Teilchen

Ein Aliquot des zweiten Amplifikationsgemisches von 25 µl wurde mit 0,15 M NaCl enthaltendem 20 mM Na-phosphat-Puffer, pH-Wert 7,5 (PBS) auf 50 µl verdünnt. Danach wurden 5 µl einer 5%-igen (Gew./Vol.) Suspension Avidinbeschichteter Polystyrol-Teilchen (0,8 µm, Baxter Healthcare Corp.) zugegeben. Die Proben wurden 1 Stunde bei 20ºC gehalten. Die Teilchen wurden durch 2-minütige Zentrifugation in einer Eppendorf-Zentrifuge gesammelt und zweimal mit 1 ml einer Lösung aus 15 mM NaCl und 1,5 mM Na-citrat sowie zweimal mit 1 ml 0,1% Tween 20 in PBS durch Verwirbeln auf einem Vortex- Gerät gewaschen. Die Teilchen wurden zweimal mit 0,15 M NaOH 15 Minuten bei 37ºC behandelt und anschließend zweimal mit 0,1% Tween 20 in 50 mM NaCl, 40 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, sowie zum Schluß mit 0,01% Tween 20 in 50 mM NaCl, 40 mM Tris-HCL, pH-Wert 7,5, gewaschen.

Nucleotidseguenzierung des immobilisierten DNA-Fragments

Die Teilchen, die die DNA-Matrize trugen, wurden in 10 µl einer Lösung aus 50 mM NaCl, 20 mM MgCl&sub2;, 40 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, suspendiert, die 0,5 - 1 pMole des Sequenzierungsprimers P2 oder P3 enthielt. Man erhitzte die Teströhrchen 2 Minuten bei 65ºC und ließ sie dann langsam auf Raumtemperatur abkühlen. 1 µl 0,1 M Dithiothreitol, 2,5 µl H&sub2;O und 2 µl (3,25 Einheiten) T7-DNA-Polymerase (Sequenase , United States Biochemical Corp.) wurden zugegeben und die Teströhrchen wurden 3 Minuten bei 22ºC gehalten. Jeweils ein Aliquot (3,5 µl) des Reaktionsgemisches wurde in vier Teströhrchen überführt, die 2,5 µl des Kettenabbruch-Gemisches (80 µM dNTP, 8 µM ddNTP für die A- und T-Reaktionen; 320 µM dNTP, 8 µM ddNTP für die C- und G-Reaktionen) enthielten. Die Teströhrchen wurden 6 Minuten bei 42ºC inkubiert und die Reaktion wurde durch Zugabe von 4 µl einer Lösung beendet, die 95% Formamid, 20 mM EDTA, 0,05% Bromphenolblau und 0,05% Xylolcyanol enthielt. Die Proben wurden 2 Minuten auf 80ºC erhitzt und dann wurden die Teilchen 2 Minuten abzentrifugiert. Die Produkte der Kettenabbruch-Reaktionen wurden auf ein 6%-iges Sequenzierungsgel aufgetragen. Nach Durchführung der Elektrophorese wurde das Gel nach Standardverfahren weiterverarbeitet. Die richtigen Allele wurden anhand der erhaltenen Sequenzierungsleitern bestimmt. Bei heterozygoten Proben konnten beide Allele dadurch bestimmt werden, daß sich an der Position der Nucleotidvariation Sequenzierungsleitern überlagerten.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung der Sequenz eines Ziel-Nucleinsäurepolymers, umfassend:

(a) Kombinieren einer das Ziel-Nucleinsäurepolymer enthaltenden Probe mit einem Gemisch aus Nucleosidtriphosphaten, einer Nucleinsäurepolymerase und ersten und zweiten Amplifikationsprimern, wobei jeder Amplifikationsprimer ein Oligonucleotid mit einem Bereich umfaßt, der zu einem unterschiedlichen Strang des Ziel-Nucleinsäurepolymers komplementär ist und damit hybridisieren kann und als ein Primer zur Nucleinsäurepolymerisation durch die Nucleinsäurepolymerase wirksam ist, zur Bildung eines Amplifikationsgemisches, wobei der erste Amplifikationsprimer außerdem eine erste, an das Oligonucleotid gebundene Verknüpfungseinheit umfaßt;

(b) wiederholte Durchführung von Zyklen mit dem Amplifikationsgemisch zwischen einem ersten Zustand, unter dem DNA-Polymerisation eintritt, und einem zweiten Zustand, unter dem eine Denaturierung der doppelsträngigen DNA zu einzelsträngiger DNA eintritt, wobei die Anzahl von Zyklen zur Herstellung von Kopien des Ziel-Nucleinsäurepolymers in einer zur Verwendung in einem DNA-Sequenzierungsverfahren geeigneten Menge ausreichend ist, zur Bildung einer amplifizierten Probe, die Kopien der an die Verknüpfungs einheit gebundenen Ziel-Nucleinsäuresequenz umfaßt;

(c) Zugabe mehrerer erster Träger zu der amplifizierten Probe, wobei jeder eine feste Matrix und eine erste Verknüpfungsstelle umfaßt, die über die erste Verknüpfungseinheit einen Strang des Ziel-Nucleinsäurepolymers immobilisieren kann;

(d) Aufeinanderwirkenlassen der ersten Verknüpfungsstellen mit den ersten Verknüpfungseinheiten, so daß die Kopien der Ziel-Nucleinsäure in der amplifizierten Probe auf den ersten Trägern immobilisiert werden;

(e) Abtrennen der immobilisierten Nucleinsäuren von dem Amplifikationsgemisch;

(f) Denaturieren der amplifizierten Nucleinsäureprobe zur Bildung einzelsträngiger Nucleinsäuren; und

(g) Bestimmung der Sequenz der immobilisierten einzelsträngigen Nucleinsäuren.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt der Denaturierung der amplifizierten Probe vor der Immobilisierung der Kopien der Ziel-Nucleinsäure auf dem Träger durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Sequenz der einzelsträngigen immobilisierten Nucleinsäuren unter Verwendung eines Kettenabbruchverfahrens bestimmt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die erste Verknüpfungseinheit und die erste Verknüpfungsstelle Bestandteile eines Affinitiätspaars sind.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Affinitätspaar ausgewählt ist aus Biotin/Avidin, Biotin/Streptavidin, poly-dA/poly-dT, poly-dG/poly-dC, Hapten/Antikörper oder Metall/Chelat.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der zweite Amplifikationsprimer eine zweite Verknüpfungseinheit umfaßt, die sich von der ersten Verknüpfungseinheit unterscheidet.

7. Verfahren nach Anspruch 6, außerdem umfassend den Schritt der Zugabe mehrerer zweiter Träger zu der amplifizierten Probe, die eine Trägermatrix und eine zweite Verknüpfungsstelle umfassen, die einen Strang des Ziel- Nucleinsäurepolymers über die zweite Verknüpfungseinheit immobilisieren kann.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei die zweite Verknüpfungseinheit und die zweite Verknüpfungsstelle Bestandteile eines Affinitätspaars sind.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Affinitätspaar ausgewählt ist aus Biotin/Avidin, Biotin/Streptavidin, poly-dA/poly-dT, poly-dG/poly-dC, Hapten/Antikörper oder Metall/Chelat.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, wobei die ersten und zweiten Träger gleichzeitig in der amplifizierten Probe vorhanden sind und so ausgewählt sind, daß sie physisch voneinander getrennt werden können.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei einer der ersten und zweiten Träger magnetisch ist.

12. Verfahren nach Anspruch 10, wobei einer oder beide ersten und zweiten Träger Eintauchstäbe sind.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das Verfahren der Sequenzbestimmung folgende Schritte umfaßt:

Kombinieren der einzelsträngigen immobilisierten Nucleinsäuren mit einem Sequenzierungsprimer und einem Sequenzierungsgemisch, das Nucleosidtriphosphate umfaßt, ein Kettenabbruchnucleotid, ein Polynucleotid synthetisierendes Enzym und eine Markierungseinheit, die während der Nucleinsäuresynthese eingebaut wird;

Ablaufenlassen der Polymerisation über einen Zeitraum, der ausreicht, um genügend Kettenabbruchereignisse geschehen zu lassen, damit die Sequenz bestimmt werden kann, zur Bildung einer teilweise polymerisierten Probe;

Zugabe eines Reagenzes zur Vervollständigung der Reaktion, das ein Gemisch aus Nucleosidtriphosphaten umfaßt, zu der teilweise polymerisierten Probe;

Ablaufenlassen der Polymerisation in dem Reagens zur Vervollständigung der Reaktion über eine Zeitdauer, die ausreichend ist, um die DNA-Synthese im wesentlichen abzuschließen;

Abtrennen der vollständig polymerisierten Probe von dem Reagens zur Vervollständigung der Reaktion;

Freisetzen der polymerisierten Nucleinsäuren von dem Träger;

Denaturieren der polymerisierten Nucleinsäuren, um diese einzelsträngig zu machen;

Analysieren der Größe der einzelsträngigen Nucleinsäure polymere zur Bestimmung der Sequenz des Ziel-Nucleinsäurepolymers.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Sequenzierungsprimer ein Oligonucleotid ist, das ausgewählt ist aus Oligonudeotiden, die zu mindestens einem Bereich des Amplifikationsprimers komplementär sind, und Oligonudeotiden, die zu einem Bereich des Ziel-Nucleinsäurepolymers komplementär sind, der zwischen dem 3'-Ende des Amplifikationsprimers und einem gewünschten Bereich in dem Ziel-Nucleinsäurepolymer liegt.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, außerdem umfassend die Schritte der Inkubation des Amplifikationsgemisches bei einer Temperatur, die so ausgewählt ist, daß sie das Aneinanderlagern der Nucleinsäuren vor jedem Polymerisationsschritt fördert.

16. Kit zur Verwendung bei der Bestimmung der Sequenz eines Ziel-Nucleinsäurepolymers, umfassend eine verpackte Kombination aus

(a) einem ersten Amplifikationsprimer, der ein Oligonucleotid umfaßt, das zu einem Bereich des Ziel- Nucleinsäurepolymers komplementär ist und damit hybridisieren kann, und der als ein Primer für eine enzymatische Nucleinsäurepolymerisation wirksam ist, und einer ersten Verknüpfungseinheit;

(b) mehreren ersten Trägern, die jeweils eine feste Matrix umfassen und mindestens eine Verknüpfungsstelle, die die Amplifikationssonde über die erste Verknüpfungseinheit immobilisieren kann; und

(c) einem Sequenzierungsprimer, wobei der Sequenzie rungsprimer ein Oligonucleotid ist ausgewählt aus Oligonudeotiden, die zu mindestens einem Bereich des Amplifikationsprimers komplementär sind, und Oligonudeotiden, die zu einem Bereich des Ziel- Nucleinsäurepolymers komplementär sind, der zwischen dem 3'-Ende des Amplifikationsprimers liegt und einem gewünschten Bereich des Ziel-Nucleinsäurepolymers.

17. Kit nach Anspruch 16, wobei die Verknüpfungseinheit und die Verknüpfungsstelle Bestandteile eines Affinitätspaars sind.

18. Kit nach Anspruch 17, wobei das Affinitätspaar ausgewählt ist aus Biotin/Avidin, Biotin/Streptavidin, poly- dA/poly-dT, poly-dG/poly-dC, Hapten/Antikörper oder Metall/Chelat.

19. Kit nach einem der Ansprüche 16 bis 18, wobei die Verknüpfungseinheit keine direkte Bindung mit der Verknüpfungsstelle bildet, außerdem eine Bindungseinheit umfassend, die so ausgewählt ist, daß sie eine Bindung zwischen der Verknüpfungseinheit und der Verknüpfungsstelle bilden kann.

20. Kit nach einem der Ansprüche 16 bis 19, wobei der Sequenzierungsprimer außerdem eine nachweisbare Markierung umfaßt.

21. Kit nach einem der Ansprüche 16 bis 20, außerdem umfassend ein Referenzmittel zum Vergleich der bestimmten Sequenz des Ziel-Nucleinsäurepolymers mit der Sequenz eines Standards.

22. Kit nach Anspruch 21, wobei das Referenzmittel eine Packungsbeilage ist, die die durch die Sequenzierung des Standards erhaltene Sequenzierungsleiter zeigt.

23. Kit nach Anspruch 21, wobei das Referenzmittel eine Standardprobe des Standards ist.

24. Kit nach einem der Ansprüche 16 bis 19 oder 21 bis 23, wobei das Oligonucleotid des Amplifikationsprimers zu einem Bereich des Ziel-Nucleinsäurepolymers komplementär ist, der von einem Zielorganismus stammt, und damit hybridisiert.

25. Kit nach einem der Ansprüche 16 bis 24, außerdem umfassend einen zweiten Amplifikationsprimer, der ein Oligonucleotid umfaßt, das zu einem Bereich des zweiten Strangs des Ziel-Nucleinsäurepolymers komplementär ist und damit hybridisiert und als ein Primer zur enzymatischen Nucleinsäurepolymerisation wirksam ist, und eine sich von der ersten Verknüpfungseinheit unterscheidende zweite Verknüpfungseinheit; und mehrere zweite Träger, jeweils eine festere Matrix umfassend und mindestens eine Verknüpfungsstelle, die das Oligonucleotid der Amplifikationssonde über die zweite Verknüpfungseinheit immobilisieren kann.

26. Kit nach Anspruch 25, wobei die Verknüpfungseinheit und die Verknüpfungsstelle Bestandteile eines Affinitätspaars sind.

27. Kit nach Anspruch 25 oder 26, wobei das Affinitätspaar ausgewählt ist aus Biotin/Avidin, Biotin/Streptavidin, poly-dA/poly-dT, poly-dG/poly-dC, Hapten/Antikorper oder Metall/Chelat.

28. Kit nach einem der Ansprüche 25 bis 27, außerdem umfassend ein Referenzmittel zum Vergleich der bestimmten Sequenz des Ziel-Nucleinsäurepolymers mit der Sequenz eines Standards.

29. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15 zur Bestimmung mindestens einer potentiellen Nucleinsäurevariation in dem Ziel-Nucleinsäurepolymer.

30. Verfahren nach Anspruch 29 für gerichtsmedizinische Analysen oder für die Analyse von erblichen Prädispositionen oder Krankheiten.

31. Verfahren nach Anspruch 29 oder 30, wobei die Nucleotid variation eine somatische Mutation ist.

32. Verfahren nach Anspruch 29 oder 30 zur Auswahl von Zellen und Stämmen oder Arten zur Züchtung von Pflanzen und Tieren oder zur Auswahl von Mikroorganismen, die einen gewünschten Genotyp zeigen.

33. Kit nach einem der Ansprüche 16 bis 28 zur Verwendung in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 32.