DE69706430T2

DE69706430T2 - Verfahren zur sequenzierung von dna

Info

Publication number: DE69706430T2
Application number: DE69706430T
Authority: DE
Inventors: Pal Nyren; Mostafa Ronaghi; Mathias Uhlen
Original assignee: Pyrosequencing AB
Current assignee: Qiagen GmbH
Priority date: 1996-09-27
Filing date: 1997-09-26
Publication date: 2002-05-02
Anticipated expiration: 2017-09-27
Also published as: GB9620209D0; EP0932700A1; US6210891B1; JP2001501092A; EP0932700B1; AU4391897A; WO1998013523A1; JP3510272B2; DE69706430D1

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Sequenzierung von DNS, das auf der Detektion des Baseneinbaus durch die Freisetzung von Pyrophosphat (PPi) beruht. Insbesondere betrifft die Erfindung ein "Echtzeit"-Sequenzierungsverfahren.
Die Sequenzierung von DNS ist ein wesentliches Werkzeug in der molekularen Genanalyse. Die Fähigkeit, DNS-Nukleotidsequenzen zu bestimmen, ist zunehmend wichtig geworden, da erste Anstrengungen unternommen wurden, die Sequenzen der großen Genome von Menschen und anderen höheren Organismen zu bestimmen. Die beiden am weitesten verbreiteten Verfahren zur DNS-Sequenzierung sind die enzymatische Kettenabbruchsmethode von Sanger und die chemische Spaltungstechnik von Maxam und Gilbert. Beide Verfahren beruhen auf der Gelelektrophorese, um DNS-Fragmente, die aus einem größeren DNS-Segment hergestellt wurden, entsprechend ihrer Größe aufzutrennen. Da der Elektrophoreseschritt ebenso wie die nachfolgende Detektion der getrennten DNS-Fragmente mühevolle Verfahren sind, wurden große Anstrengungen unternommen, diese Schritte zu automatisieren. Trotz der Tatsache, daß automatisierte Elektrophoreseeinheiten handelsüblich erhältlich sind, ist die Elektrophorese jedoch nicht für Genom-Projekte im großen Maßstab oder für klinische Sequenzierung geeignet, bei denen relativ kosteneffiziente Einheiten mit einem hohen Durchsatz erforderlich sind. Daher besteht ein großer Bedarf für nicht-elektrophoretische Verfahren zur Sequenzierung und es wurden mehrere alternative Strategien beschrieben, wie Rastertunnel-Elektronen- Mikroskopie (Driscoll et al., 1990, Nature, 346, 294-296), Sequenzierung durch Hybridisierung (Bains et al., 1988, J. Theo. Biol. 135, 308-307) und die Detektion einzelner Moleküle (Jeffet al., 1989, Biomol. Struct. Dynamics, 7, 301- 306), um die Nachteile einer Elektrophorese zu überwinden.
Techniken, die die schnelle Detektion eines einzelnen DNS- Basenwechsels ermöglichen, sind ebenfalls wichtige Werkzeuge in der genetischen Analyse. In vielen Fällen wäre die Detektion einer einzelnen Base oder von wenigen Basen eine große Hilfe in der genetischen Analyse, da mehrere genetische Krankheiten und bestimmte Krebsarten mit geringen Mutationen verbunden sind. Ein Kleinstsequenzierungsprotokoll, das auf einem Festphasenprinzip beruht, wurde bereits beschrieben (Hultman et al., 1988, Nucl. Acid. Res., 17, 4937-4946; Syvanen et al., 1990, Genomics, 8, 684-692). Dabei wurde der Einbau eines radiomarkierten Nukleotids gemessen und für die Analyse des drei-allelischen Polymorphismus des menschlichen Apolipoprotein-E-Gens verwendet. Jedoch sind radioaktive Verfahren für routinemäßige klinische Anwendungen nicht besonders geeignet und daher ist die Entwicklung eines einfachen, nicht-radioaktiven Verfahrens zur schnellen DNS-Sequenzanalyse ebenfalls von Interesse.
Verfahren zur Sequenzierung, die auf dem Konzept der Detektion von anorganischem Pyrophosphat (PPi) beruhen, das während einer Polymerasereaktion freigesetzt wird, wurden bereits beschrieben (WO 93/23564 und WO 89/09283). Für jedes Nukleotid, das zu einem wachsenden Nukleinsäurestrang während einer Polymerasereaktion hinzugefügt wird, wird ein Pyrophosphatmolekül freigesetzt. Es wurde herausgefunden, daß unter diesen Bedingungen freigesetztes Pyrophosphat enzymatisch detektiert werden kann, z. B. durch die Erzeugung von Licht bei der Luciferase-Luciferin-Reaktion. Derartige Verfahren ermöglichen, daß eine Base in einer Zielposition identifiziert wird und DNS einfach und schnell sequenziert wird, wobei die Notwendigkeit einer Elektrophorese und die Verwendung von schädlichen Radiomarkierungssubstanzen vermieden wird.
Jedoch sind die vorstehend erwähnten PPi-basierten Sequenzierungsverfahren nicht ohne Nachteile. Erstens wurde herausgefunden, daß dATP, das in der Sequenzierungsreaktion (Kettenverlängerung) verwendet wird, mit der nachfolgenden Luciferase-basierten Detektionsreaktion interferiert, indem es als Substrat für das Luciferaseenzym fungiert. Oftmals beschränkt diese Wechselwirkung die Einsetzbarkeit dieses Verfahrens im großen Ausmaß.
Zweitens stellen die vorstehend beschriebenen PPi-basierten Verfahren zwar eine Verbesserung bezüglich der Einfachheit und der Geschwindigkeit des Verfahrens dar, jedoch besteht weiterhin ein Bedarf für verbesserte Verfahren zur Sequenzierung, die eine schnelle Detektion und Bereitstellung der Sequenzinformation ermöglichen. Insbesondere besteht ein Bedarf für "Echtzeit"-Sequenzierungsverfahren, die es ermöglichen, daß die Sequenzinformation gleichzeitig mit oder sehr kurz nach der Sequenzierungs-, Kettenverlängerungsreaktion erhalten wird.
Wir schlagen nun ein neues modifiziertes PPi-basiertes Sequenzierungsverfahren vor, bei dem diese Probleme gelöst werden und das es ermöglicht, die Sequenzierungsreaktionen kontinuierlich in Echtzeit zu verfolgen, wobei ein Signal erzeugt und detektiert wird, sobald jedes Nukleotid eingebaut ist. Dies wird dadurch erreicht, daß ein dATP-Analogon anstelle von dATP selbst verwendet wird, das nicht mit der Luciferasereaktion interferiert und dadurch, daß die Kettenverlängerungs- und Detektions- oder Signalerzeugungsreaktionen im wesentlichen gleichzeitig durch den Einschluß der "Detektionsenzyme" in der Kettenverlängerungsreaktionsmischung erfolgt. Dies bedeutet eine Abweichung von dem Lösungsweg, wie er in den vorstehend vorgeschlagenen PPi- basierten Sequenzierungsverfahren berichtet wurde, bei dem zuerst die Kettenverlängerungsreaktion separat als erster Reaktionsschritt durchgeführt wird, gefolgt von einer separaten "Detektions"-Reaktion, bei der die Produkte der Verlängerungsreaktion anschließend der Luciferin-Luciferase basierten Signalerzeugungs-("Detektions")-Reaktion unterzogen werden.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Identifizierung einer Base in einer Zielposition in einer Einzelstrang-DNS-Sequenzprobe, wobei ein Ansatzprimer bzw. Verlängerungsprimer, der mit der Proben-DNS direkt benachbart zu der Zielposition hybridisiert, zur Verfügung gestellt wird und die Proben-DNS und der Ansatzprimer bzw. Verlängerungsprimer einer Polymerasereaktion in Gegenwart eines Desoxynukleotids oder eines Didesoxynukleotids unterzogen wird, wodurch das Desoxynukleotid oder das Didesoxynukleotid nur dann eingeführt wird und Pyrophosphat (PPi) freisetzt, wenn es zu der Base an der Zielposition komplementär ist, jede Freisetzung von PPi enzymatisch detektiert wird, verschiedene Desoxynukleotide oder Didesoxynukleotide entweder getrennten Aliquoten einer Probe- Primer-Mischung oder schrittweise der gleichen Probe- Primer-Mischung zugegeben und der Polymerasereaktion unterzogen werden, um anzuzeigen, welches Desoxynukleotid oder Didesoxynukleotid eingebaut wird, dadurch gekennzeichnet, daß das PPi-Detektionsenzym bzw. die PPi-Detektionsenzyme in dem Polymerasereaktionsschritt enthalten sind, und dadurch, daß anstelle von Desoxy- oder Didesoxyadenosintriphosphat (ATP) ein dATP- oder ein ddATP-Analogon verwendet wird, das dazu in der Lage ist, als ein Substrat für eine Polymerase zu wirken, aber nicht dazu in der Lage ist, als ein Substrat für das PPi-Detektionsenzym zu wirken.
Der Begriff des Didesoxynukleotids, wie er in dieser Anmeldung verstanden wird, umfaßt alle 2'-Desoxynukleotide, bei denen keine 3'-Hydroxygruppe vorhanden ist oder bei denen die 3'-Hydroxygruppe modifiziert ist und die daher, während sie in Gegenwart der Polymerase an den Primer addiert werden können, nicht in der Lage sind, an einer nachfolgenden Polymerisationsreaktion teilzunehmen.
PPi kann durch viele verschiedene Verfahren bestimmt werden und eine Anzahl von enzymatischen Verfahren sind in der Literatur beschrieben (Reeves et al., (1969), Anal. Biochem., 28, 282-287; Guillory et al., (1971), Anal. Biochem., 39, 170-180; Johnson et al., (1968), Anal. Biochem., 15, 273; Cook et al., (1978), Anal. Biochem., 91, 557-565; und Drake et al., (1979), Anal. Biochem., 94, 117-120).
Es ist bevorzugt, Luciferase und Luciferin in Kombination zu verwenden, um die Freisetzung von Pyrophosphat nachzuweisen, da die Menge an erzeugtem Licht im wesentlichen proportional zur Menge des freigesetzten Pyrophosphats ist, das umgekehrt direkt proportional zur Menge der eingebauten Base ist. Die Menge an Licht kann schnell mittels einer geeigneten lichtempfindlichen Vorrichtung, wie mit einem Luminometer, abgeschätzt werden.
Luciferin-Luciferase-Reaktionen zur Detektion der Freisetzung von PPi sind aus dem Stand der Technik bekannt. Insbesondere wurde ein Verfahren zur kontinuierlichen Verfolgung der Freisetzung von PPi, das auf den Enzymen ATP- Sulfurylase und Luciferase beruht, durch Nyrén und Lundin entwickelt (Anal. Biochem., 151, 504-509, 1985) und mit dem Begriff ELIDA (Enzymatic Luminometric Inorganic Pyrophosphate Detection Essay, Enzymatisches luminometrisches Detektionsassay für anorganisches Pyrophosphat) bezeichnet. Die Verwendung der ELIDA-Methode zur Detektion von PPi ist gemäß der vorliegenden Erfindung bevorzugt. Dieses Verfahren kann jedoch modifiziert werden, zum Beispiel durch die Verwendung einer thermostabileren Luciferase (Kaliyama et al., 1994, Biosci. Biotech. Biochem., 58, 1170-1171). Dieses Verfahren basiert auf den folgenden Reaktionen:
Die bevorzugten Detektionsenzyme, die an der PPi- Detektionsreaktion beteiligt sind, sind somit ATP- Sulfurylase und Luciferase.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die Detektionsenzyme in dem Polymerasereaktionsschritt enthalten, d. h. in dem Kettenverlängerungsreaktionsschritt. Daher werden die Detektionsenzyme der Reaktionsmischung für den Polymeraseschritt vorher oder gleichzeitig mit oder während der Polymerasereaktion zugefügt. Im Falle einer ELIDA- Detektionsreaktion kann die Reaktionsmischung für die Polymerasereaktion daher wenigstens ein Nukleotid (Desoxy- oder Didesoxy-), Polymerase, Luciferin, APS, ATP-Sulfurylase und Luciferase enthalten. Die Polymerasereaktion kann durch Zugabe der Polymerase oder besonders vorzugsweise durch Zugabe des Nukleotids eingeleitet werden und vorzugsweise liegen die Detektionsenzyme schon zu dem Zeitpunkt vor, an dem die Reaktion eingeleitet wird, oder sie können mit dem die Reaktion einleitenden Reagens hinzugefügt werden.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht somit die Detektion der PPi-Freisetzung während der Polymerasereaktion unter Erzeugung eines Echtzeit-Signals. Die Sequenzierungsreaktionen können kontinuierlich in Echtzeit verfolgt werden. Daher stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur schnellen Detektion der PPi-Freisetzung zur Verfügung. Es wurde geschätzt, daß die ELIDA-Reaktionen in weniger als zwei Sekunden stattfinden (Nyrén und Lundin, siehe oben). Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt ist die Umwandlung von PPi in ATP durch ATP-Sulfurylase, wobei die Luciferasereaktion schnell ist und schätzungsweise in weniger als 0,2 Sekunden abläuft. Die Einbaugeschwindigkeiten für Polymerasen wurden ebenfalls mittels verschiedener Verfahren geschätzt und es wurde gefunden, daß zum Beispiel im Falle der Klenow-Polymerase ein vollständiger Einbau einer Base in weniger als 0,5 Sekunden stattfinden kann. Die geschätzte Gesamtzeit zum Einbau einer Base und deren Detektion durch ELIDA beträgt daher etwa drei Sekunden. Daraus ist ersichtlich, daß sehr schnelle Reaktionszeiten möglich sind, die eine Echtzeitdetektion ermöglichen. Die Reaktionszeiten könnten weiter durch die Verwendung von thermostabileren Luciferasen verringert werden.
Ein weiteres Merkmal der Erfindung ist die Verwendung eines dATP - oder ddATP-Analogons, das nicht mit der enzymatischen PPi-Detektionsreaktion interferiert, aber das nichtsdestoweniger normal in eine wachsende DNS-Kette durch eine Polymerase eingebaut werden kann. Unter dem Begriff "normal eingebaut" wird verstanden, daß das Nukleotid mit einer normalen richtigen Basenpaarung eingebaut wird. In der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, bei der Luciferase das PPi-Detektionsenzym ist, sind die bevorzugten Analoga zur erfindungsgemäßen Verwendung die [1-Thio]triphosphat- (oder α-Thiotriphosphat-) Analoga von Desoxy- oder Didesoxy-ATP, vorzugsweise Desoxyadenosin-[1-thio]triphosphat, oder auch bekannt als Desoxyadenosin-α-thiotriphosphat (dATPαS). dATPαS kann ebenso wie das α-Thio-Analogon von dCTP, dGTP und dTTP von den New England Nuclear Laboratorien bezogen werden. Wie in dem nachstehenden Beispiel beschrieben ist, haben Experimente gezeigt, daß eine Substitution von dATP durch dATPαS einen effizienten Einbau durch die Polymerase mit einem niedrigen Hintergrundsignal aufgrund der Abwesenheit einer Wechselwirkung zwischen dATPαS und Luciferase ermöglicht. Das Signal-zu-Rausch-Verhältnis wird gemäß der vorliegenden Erfindung dadurch erhöht, daß ein Nukleotid-Analogon anstelle von dATP verwendet wird, das das Hintergrundrauschen eliminiert, das durch die Fähigkeit von dATP, als Substrat für Luciferase zu wirken, hervorgerufen wird. Insbesondere haben wir gefunden, daß ein effizienter Einbau mit der Polymerase erreicht wird, während das Hintergrundsignal aufgrund der Lichterzeugung durch das Luciferin-Luciferase-System aufgrund der dATP- Wechselwirkung wesentlich vermindert wird.
Dort, wo ATP in der Reaktionsmischung während oder nach der Kettenverlängerung vorhanden ist, beispielsweise als Verunreinigung oder als eine Kontamination des dATP, das als Quelle der einzubauenden Base zugefügt wird, wird es ebenso mit dem Pyrophosphat/Luciferin-System wechselwirken und ein falsches Lumineszenz-Anzeigesignal hervorrufen. Es kann daher vorteilhaft sein, ATP aus Reagenzlösungen vor der Zugabe zur Reaktionsmischung zu entfernen. Dies kann dadurch erreicht werden, daß die Lösung mit einem immobilisierten Enzym in Kontakt gebracht wird, das ATP in ein Produkt umsetzt, das kein Substrat mehr für Luciferase ist. Derartige Enzyme umfassen insbesondere Apyrase, welche ATP in AMP und zwei Phosphatmoleküle umsetzt. Das immobilisierte Enzym kann dann vor der Kettenverlängerung/Detektion entfernt werden. Es ist besonders vorteilhaft, magnetische Kügelchen wie Dynabeads® (erhältlich von Dynal AS, Oslo, Norwegen) als festen Träger zu verwenden, aufgrund der Leichtigkeit, mit der derartige Kügelchen aus den Lösungen durch den Einsatz eines Magneten entfernt werden können. Im allgemeinen wurde jedoch gefunden, daß derartige ATP-Entfernungsschritte gemäß der vorliegenden Erfindung nicht notwendig sind.
Um das Verfahren zyklisch zu wiederholen und dabei die Proben-DNS zu sequenzieren und ebenso die Trennung der Einzelstrang-DNS-Proben von ihren Komplementärsträngen zu erleichtern, ist es wünschenswert, daß die Proben-DNS immobilisiert ist oder mit Mitteln zur Verankerung auf einem festen Träger versehen ist. Darüber hinaus kann die Menge der zur Verfügung stehenden Proben-DNS klein sein und es kann daher wünschenswert sein, die Proben-DNS vor der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahren zu amplifizieren.
Die Proben-DNS kann beispielsweise in vitro durch PCR oder mittels Selbstandauernder-Sequenz-Replikation (3SR) in vivo durch Verwendung eines Vektors amplifiziert werden und, sofern gewünscht, auch durch eine Kombination aus in-vitro- und in-vivo-Amplifizierung. Welches Amplifizierungsverfahren auch immer verwendet wird, ist es erwünscht, daß die amplifizierte DNS immobilisiert oder mit Mitteln zur Verankerung auf einem festen Träger versehen wird. Beispielsweise kann ein PCR-Primer immobilisiert sein oder mit Mitteln zur Verankerung auf einem festen Träger versehen sein. Ebenso kann ein Vektor Mittel zur Verankerung auf einem festen Träger benachbart zur Insertionsstelle der Proben-DNS aufweisen, derart, daß die amplifizierte Proben-DNS und die Mittel zur Verankerung zusammen ausgeschnitten werden.
Die Immobilisierung der amplifizierten DNS kann als Teil der PCR-Amplifizierung selbst stattfinden, wobei einer oder mehrere Primer auf einem Träger verankert werden, oder alternativ dazu, einer oder mehrere der PCR-Primer eine funktionelle Gruppe tragen können, die eine nachfolgende Immobilisierung erlaubt, beispielsweise eine Biotin- oder Thiolgruppe. Die Immobilisierung durch das 5'-Ende eines Primers ermöglicht, daß der DNS-Strang, der aus diesem Primer hervorgeht, auf einem festen Träger verankert wird und sein vom Träger entferntes 3'-Ende für eine nachfolgende Hybridisierung mit dem Ansatz- bzw. Verlängerungsprimer und der Kettenverlängerung durch Polymerase zugänglich ist. Der feste Träger kann zweckmäßigerweise die Form von Vertiefungen in einer Mikrotiterplatte annehmen, die vorzugsweise im herkömmlichen 8 · 12 Format vorliegt, oder von aus Polystyrol hergestellten Eintauchstäbchen, die aktiviert sind, um die Primer-DNS (K. Almer, Dissertation, Royal Institute of Technology, Stockholm, Schweden, 1988) zu binden. Jedoch kann zweckmäßigerweise jeder feste Träger verwendet werden, einschließlich der großen Anzahl, die im Stand der Technik beschrieben sind, beispielsweise für Trennungs/Immobilisierungsreaktionen oder Festphasenassays. Somit kann der Träger auch Teilchen, Fasern oder Kapillarröhrchen umfassen, die beispielsweise aus Agarose, Cellulose, Alginaten, Teflon oder Polystyrol hergestellt sind. Magnetische Teilchen, beispielsweise die von der Firma Dynal AS (Oslo, Norwegen) hergestellten superparamagnetischen Kügelchen, sind ein bevorzugter Träger, da sie ohne weiteres aus der Reaktionsmischung isoliert werden können und dennoch gegenüber vielen anderen Trägerarten eine bessere Reaktionskinetik aufweisen.
Der feste Träger kann funktionelle Gruppen, wie Hydroxy-, Carboxyl-, Aldehyd- oder Aminogruppen oder andere Komponenten, beispielsweise Avidin oder Streptavidin, tragen, um darauf Primer zu verankern. Diese können im allgemeinen durch die Behandlung der Träger zur Verfügung gestellt werden, um eine Oberflächenbeschichtung eines Polymers bereitzustellen, das eine derartige funktionelle Gruppen trägt, beispielsweise Polyurethan zusammen mit einem Polyglycol, um Hydroxygruppen bereitzustellen, oder ein Cellulosederivat, um Hydroxygruppen bereitzustellen, ein Acrylsäure- oder Methacrylsäurepolymer oder -copolymer, um Carboxylgruppen bereitzustellen, oder ein aminoalkyliertes Polymer, um Aminogruppen bereitzustellen. Im US-Patent Nr. 4.654.267 ist die Einführung von vielen derartigen Oberflächenbeschichtungen beschrieben.
Die Assaytechnik ist sehr einfach und schnell, so daß sie die Automatisierung durch die Verwendung von Robotern vereinfacht, wobei eine große Anzahl von Proben schnell analysiert werden kann. Da die bevorzugte Detektion und Quantifizierung bzw. Mengenbestimmung auf einer luminometrischen Reaktion beruht, kann diese in einfacher Weise spektrophotometrisch verfolgt werden. Die Verwendung von Luminometern ist aus dem Stand der Technik bekannt und in der Literatur beschrieben.
Das erfindungsgemäße Echtzeit-Pyrophosphat-Detektionsverfahren eröffnet somit die Möglichkeit für einen automatisierten Zugang für nicht-elektrophoretische Festphasen- Sequenzierungsverfahren im großen Maßstab, die das kontinuierliche Messen des Verlaufs der Polymerisierungsreaktion mit der Zeit ermöglichen. Das erfindungsgemäße Verfahren weist auch den Vorteil auf, daß multiple Proben parallel gehandhabt werden können.
Die Ziel-DNS kann cDNS sein, die in der Probe aus RNS synthetisiert wurde, und das erfindungsgemäße Verfahren ist daher zur Diagnose auf der Grundlage der charakteristischen RNS anwendbar. Derartige vorbereitende Synthesen können durch eine vorbereitende Behandlung mit Umkehrtranskriptase bzw. reverse Transkriptase zweckmäßigerweise im selben System von Puffern und Basen von nachfolgenden PCR-Schritten - sofern verwendet - durchgeführt werden. Da das PCR- Verfahren ein Erwärmen zur Strangtrennung erfordert, wird die reverse Transkriptase im ersten PCR-Zyklus inaktiviert. Falls mRNS die Proben-Nükleinsäure ist, kann es vorteilhaft sein, die ursprüngliche Probe, beispielsweise eine Serumprobe, mit einem immobilisierten PolydT-Oligonukleotid zu behandeln, um die gesamte mRNS über terminale PolyA- Sequenzen wiederzufinden. Alternativ dazu kann eine spezifische Oligonukleotidsequenz verwendet werden, um die RNS über eine spezifische RNS-Sequenz wiederzufinden. Das Oligonukleotid kann dann als Primer für eine cDNS-Synthese, wie es beispielsweise in der WO 89/0982 beschrieben ist, dienen.
Vorteilhafterweise ist der Verlängerungsprimer bzw. Ansatzprimer hinreichend groß, um eine entsprechende Hybridisierung mit derjenigen Sequenz zu ermöglichen, die unmittelbar an der 5'-Stellung der Zielposition ist, jedoch noch hinreichend kurz ist, um eine unnötige chemische Synthese zu vermeiden. Dem Durchschnittsfachmann ist klar, daß die Größe des Verlängerungsprimers bzw. Ansatzprimers und die Stabilität der Hybridisierung bis zu einem gewissen Grad vom Verhältnis der Basenpaarungen A-T zu C-G abhängt, da in einer C-G-Paarung mehr Wasserstoffbindungen möglich sind. Ebenso zieht der Durchschnittsfachmann den Grad der Homologie zwischen dem Verlängerunsprimer bzw. Ansatzprimer zu anderen Teilen der amplifizierten Sequenz in Betracht und wählt den Strengegrad entsprechend aus. Anleitungen für derartige Routineexperimente können in der Literatur gefunden werden, beispielsweise in Molecular Cloning: A Laboratory Manual von Sambrook, J., Fritsch E. F. und Maniatis, T. (1989). Falls vier Aliquote verwendet werden, wird der Verlängerungsprimer bzw. Ansatzprimer vorzugsweise zugefügt, bevor die Probe in vier Aliquote geteilt wird, obgleich er auch separat jedem Aliquot einzeln zugefügt werden kann. Es sollte festgehalten werden, daß der Verlängerungsprimer bzw. Ansatzprimer mit dem PCR-Primer identisch sein kann, vorzugsweise ist er aber verschieden, um ein weiteres Unterscheidungsmerkmal in das System einzubringen.
Alternativ dazu kann ein Primer mit einem phosphorylierten 5'-Ende verwendet werden, der eine Schleife enthält und an sich selbst in das 3'-Ende des Einstrangtemplats zurückbindet. Wenn das 3'-Ende des Templats die als T (Templat) bezeichnete Sequenzregion aufweist, hat der Primer die folgende Sequenz, die am 5'-Ende beginnt: P-L-P'-T', wobei P ein spezifischer Primer ist (5 bis 30 Nukleotide), L ein Schleife ist (vorzugsweise 4 bis 10 Nukleotide), P' komplementär zur P ist (vorzugsweise 5 und 30 Nukleotide) und T' komplementär zur Templatsequenz am 3'-Ende (T) ist (wenigstens 4 Nukleotide). Dieser Primer kann anschließend mit dem Einstrangtemplat unter Verwendung von t4-DNS-Ligase oder eines ähnlichen Enzyms verknüpft werden. Dies ermöglicht eine kovalente Bindung zwischen dem Templat und dem Primer und daher wird somit die Möglichkeit vermieden, daß der hybridisierte Primer während des Reaktionsprotokolls ausgewaschen wird.
Die Polymerasereaktion in jedem Aliquot in Gegenwart des Verlängerungsprimers bzw. Ansatzprimers und Desoxynukleotids wird unter Verwendung einer Polymerase durchgeführt, die Didesoxynukleotide einbaut, beispielsweise T7- Polymerase, Klenow oder Sequenase Ver. 2.0 (USB U.S.A.). Jedoch ist es bekannt, daß viele Polymerasen eine Korrektur- oder Irrtumsabgleichfähigkeit haben, und daß 3'-Enden, die zur Kettenverlängerung zur Verfügung stehen, manchmal durch eines oder mehrere Nukleotide verdaut werden. Falls während des erfindungsgemäßen Verfahrens ein derartiger Verdau auftritt, nimmt der Grad an Hintergrundrauschen zu. Um dieses Problem zu vermeiden, kann eine nichtkorrekturfähige Polymerase, beispielsweise Klenow- Polymerase, die frei von Exonuclease ist (exo), verwendet werden. Andernfalls ist es wünschenswert, jedem Aliquot Fluoridionen oder Nukleotidmonophosphate hinzuzufügen, die den 3'-Verdau durch Polymerase unterdrücken.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es bevorzugt, eine DNS-Polymerase mit hoher Effizienz in jedem Verlängerungsschritt aufgrund der schnellen Zunahme des Hintergrundsignals zu verwenden, das dann auftritt, wenn sich Template akkumulieren, die nicht vollständig verlängert sind. Ebenso wird eine hohe Qualität bei jedem Schritt erwünscht, die dadurch erreicht werden kann, daß Polymerase mit Exonuklease-Aktivität verwendet wird. Jedoch hat dies den vorstehend erwähnten Nachteil, daß eine Zersetzung des Primers auftreten kann. Obgleich die Exonuklease-Aktivität der Klenow- Polymerase gering ist, haben wir gefunden, daß das 3'-Ende des Primers mit längeren Inkubationen in Abwesenheit von Nukleotiden abgebaut wird. Ein Bindungsmechanismus mit induzierter Anpassung während des Polymerisationsschrittes wählt sehr effizient zur Bindung der richtigen dNTP mit einem Verläßlichkeitsnettobeitrag von 10&sup5;-10&sup6; aus. Polymerasen mit defizitärer Exonuclease bzw. Exonuclease-freie Polymerase, beispielsweise (exo&supmin;) Klenow oder Sequenase 2.0, katalysierten den Einbau eines Nukleotids, der nur dann beobachtet wurde, wenn komplementäre dNTP vorhanden war, und bestätigten so die hohe Verläßlichkeit dieser Enzyme, selbst in Abwesenheit von korrekturlesender Exonuklease- Aktivität. Der Hauptvorteil in der Verwendung von (exo&supmin;)- Klenow-DNS-Polymerase gegenüber Sequenase 2.0 besteht in ihrer niedrigeren Km für Nukleotide, was eine hohe Nukleotideinbaugeschwindigkeit selbst bei niedrigen Nukleotidkonzentration ermöglicht. Es ist ebenso möglich, alle dNTPs mit Nukleotidanaloga oder nicht-natürlichen Nukleotiden, beispielsweise dNTPαS, zu ersetzen und derartige Analoga können vorzugsweise mit einer DNS-Polymerase, die eine Exonuklease-Aktivität aufweist, verwendet werden.
Bei vielen diagnostischen Anwendungen, beispielsweise bei genetischen Tests für Träger von Erbkrankheiten, enthält die Probe heterozygotisches Material, das heißt, daß die Hälfte der DNS an der Zielposition ein Nukleotid aufweist und die andere Hälfte ein anderes Nukleotid aufweist. Wenn in einem bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren vier Aliquote verwendet werden, zeigen somit zwei davon ein negatives Signal und zwei davon zeigen ein halbes positives Signals. Daraus ist ersichtlich, daß es wünschenswert ist, die Signalstärke bzw. -menge, die in jeder Probe detektiert wird, quantitativ zu bestimmen. Wenn sich zwei oder mehr gleiche Basen benachbart zum 3'-Ende des Primers befinden, ist es ebenfalls ersichtlich, daß ein größeres bzw. stärkeres Signal produziert wird. Im Falle einer homozygotischen Probe ist es offensichtlich, daß es drei negative und ein positives Signal geben wird, wenn diese in vier Aliquoten vorliegt.
Es ist ersichtlich, daß wenn die Zielbase unmittelbar bei der 3'-Stellung des Primers eine mit der in 3'-Stellung identische Base aufweist und die Polymerisation mit einem Desoxynukleotid (anstelle eines Didesoxynukleotids) durchgeführt wird, die Verlängerungsreaktion zwei Basen gleichzeitig hinzufügt, und es ist tatsächlich so, daß jede Sequenz von aufeinanderfolgenden identischen Basen in der Probe zum gleichzeitigen Einbau der entsprechenden Basen in den Primer führt. Jedoch ist die Menge an freigesetztem Pyrophosphat genau proportional zur Anzahl der eingebauten Basen, so daß es keine Schwierigkeit bereitet, derartige Wiederholungen zu detektieren.
Da der Primer mit dem vorstehend beschriebenen Verfahren durch eine einzige Base verlängert wird (oder eine Sequenz von identischen Basen), kann der verlängerte Primer in genau der gleichen Weise in einem wiederholt durchgeführten Verfahren zur Bestimmung der nächsten Base in der Sequenz dienen, um somit die Sequenzierung der gesamten Probe zu ermöglichen. Die Immobilisierung der Probe und des hybridisierten Primers erlaubt ein Auswaschen, um unerwünschte Desoxynukleotide abzutrennen, bevor mit dem nächsten Schritt fortgefahren wird.
Die vorliegende Erfindung stellt zwei Hauptverfahren zur Sequenzierung von immobilisierter DNS zur Verfügung.
A. Die Erfindung stellt ein erstes Verfahren zur Sequenzierung einer Proben-DNS zur Verfügung, wobei die Proben- DNS einer Amplifizierung unterzogen wird. Die amplifizierte DNS wird immobilisiert und anschließend einer Strangtrennung unterzogen, wobei, der nicht immobilisierte Strang entfernt wird und ein Verlängerungsprimer bzw. Ansatzprimer zur Verfügung gestellt wird, der an die immobilisierte DNS hybridisiert, die sich direkt benachbart zu dem Teil der zu sequenzierenden DNS befindet. Jedes von vier Aliquoten der immobilisierten Einzelstrang-DNS wird anschließend einer Polymerasereaktion in Gegenwart eines Desoxynukleotids unterzogen, wobei bei jedem Aliquot ein anderes Desoxynukleotid verwendet wird und wodurch nur das Desoxynukleotid, das komplementär zur Base in der Zielposition ist, eingebaut wird und wobei durch den Baseneinbau freigesetztes Pyrophosphat identifiziert wird, und wobei die immobilisierte Probe und der Primer anschließend von der Reaktionslösung getrennt werden und die eingebaute Base zu den nicht umgesetzten Aliquoten der Probe/Primer unter Polymerisierungsbedingungen hinzugefügt wird, um den Primer in allen Aliquoten durch die eingebaute Base zu verlängern, und wobei die immobilisierte Probe/Primer anschließend von der Reaktionslösung abgetrennt wird, und wobei der Prozeß wiederholt wird, um die Proben-DNS zu sequenzieren.
B. Die Erfindung stellt weiterhin ein zweites Verfahren zur Sequenzierung von Proben-DNS zur Verfügung, wobei die Proben-DNS einer Amplifizierung unterzogen wird, die amplifizierte DNS immobilisiert und anschließend einer Strangtrennung unterzogen wird, der nicht immobilisierte Strang entfernt wird und ein Verlängerungsprimer bzw. Ansatzprimer zur Verfügung gestellt wird, wobei dieser Primer mit der immobilisierten DNS direkt benachbart von dem zu sequenzierenden DNS-Teil hybridisiert. Die immobilisierte Einzelstrang-DNS wird anschließend einer Polymerasereaktion in Gegenwart eines ersten Desoxynukleotids unterzogen und das Ausmaß der Freisetzung an Pyrophosphat bestimmt, wobei, falls notwendig, die immobilisierte Probe und der Primer aus der Reaktionsmischung abgetrennt werden und die Reaktion durch schrittweise Zugabe eines zweiten, dritten und vierten Desoxynukleotids solange wiederholt wird, bis eine positive Freisetzung von Pyrophosphat den Einbau eines bestimmten Desoxynukleotids in den Primer anzeigt, wonach das Verfahren wiederholt wird, um den Primer mit einer Base auf einmal zu verlängern und um die Base zu bestimmen, die in jedem Reaktionsschritt unmittelbar bei der 3'-Stellung des verlängerten Primers ist.
Eine alternative Vorschrift für die Analyse besteht darin, ein Matrixformat zu verwenden, wobei die Proben über eine Oberfläche verteilt sind, beispielsweise ein mikrofabrizierter Chip, und wodurch ein geordneter Satz von Proben in zweidimensionaler Anordnung immobilisiert werden kann. Dadurch können viele Proben parallel analysiert werden. Unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens können viele immobilisierte Template analysiert werden, indem die Lösung, die die Enzyme und ein Nukleotid enthält, über die Oberfläche strömen gelassen wird und anschließend das Signal, das in jeder Probe erzeugt wird, detektiert wird. Dieses Verfahren kann anschließend wiederholt werden. Alternativ dazu können mehrere verschiedene Oligonukleotide, die zum Templat komplementär sind, über die Oberfläche verteilt werden, gefolgt von Hybridisierung des Templats. Der Einbau von Desoxynukleotiden oder Didesoxynukleotiden kann für jedes Oligonukleotid durch das Signal verfolgt werden, das durch die Verwendung der verschiedenen Oligonukleotide als Primer entsteht. Durch Kombination der Signale von verschiedenen Gebieten der Oberfläche kann eine sequenzbasierte Analyse über vier Polymerasereaktionszyklen unter Verwendung der verschiedenen Didesoxynukleotide durchgeführt werden.
Wie in unserer ebenfalls anhängigen Anmeldung WO 90/11369 beschrieben ist, kann auch eine zweistufige PCR (unter Verwendung von verschachtelten Primern) verwendet werden, um das Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu verbessern und damit die Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens zu erhöhen. Durch eine derartige vorläufige Amplifizierung wird die Konzentration von Ziel-DNS in Bezug auf andere DNS, die in der Probe vorhanden sein kann, enorm erhöht und durch eine zweite Amplifizierungsstufe mit wenigstens einem Primer, der für eine andere bzw. unterschiedliche Sequenz der Ziel-DNS spezifisch ist, wird das Signal aufgrund der Ziel- DNS relativ zum Hintergrundrauschen beträchtlich vergrößert.
Ungeachtet dessen, ob eine einstufige oder eine zweistufige PCR durchgeführt wird, ist die Effizienz der PCR unkritisch, da die Erfindung auf der bestimmten Differenz, in der sich die Aliquote unterscheiden, beruht. Wie vorstehend bemerkt wurde, ist es jedoch bevorzugt, eine anfängliche qualitative DIANA als Überprüfung der Anwesenheit oder der Abwesenheit von amplifizierter DNS durchzuführen.
Jede geeignete Polymerase kann verwendet werden, obgleich es bevorzugt ist, ein thermophiles Enzym wie Taq-Polymerase zu verwenden, um die wiederholten Temperaturzyklen durchführen zu können, ohne daß weitere Polymerase, beispielsweise Klenow-Fragmente, bei jedem PCR-Zyklus hinzugefügt werden muß.
PCR wurde vorstehend als bevorzugtes Verfahren zur anfänglichen Amplifizierung der Ziel-DNS diskutiert, obgleich der Fachmann weiß, daß andere Verfahren anstelle oder in Kombination mit PCR verwendet werden können. Eine neuartige Entwicklung bei Amplifizierungstechniken, die keinen Temperaturzyklus oder keine Verwendung einer thermostabilen Polymerase erfordern, ist eine selbstandauernde Sequenzreplikation (Self Sustained Sequence Replication, 3SR). 3SR ist auf retrovirale Replikation hin modelliert und kann auch für eine Amplifizierung verwendet werden (siehe zum Beispiel Gingeras, T.R. et al PNAS (USA) 87, 1874-1878 und Gingeras, T.R. et al PCR Methods and Applications Vol. 1, Seite 25-33).
Wie vorstehend ausgeführt ist, kann das Verfahren auch zur Identifizierung der Freisetzung von Pyrophosphat verwendet werden, wenn Didesoxynukleotid-Komponenten am Ende einer DNS-Kette eingebaut werden. WO 93/23562 betrifft ein Verfahren zur Identifizierung der Basen in einer einzelnen Zielposition in einer DNS-Sequenz (Minisequenzierung), wobei Proben-DNS einer Amplifizierung unterzogen wird, die amplifizierte DNS immobilisiert wird und anschließend einer Strangtrennung unterzogen wird, und wobei der nichtimmobilisierte Strang entfernt wird und ein Ansatzprimer bzw. Verlängerungsprimer, der an die immobilisierte DNS in unmittelbarer Nachbarschaft zur Zielposition hybridisiert, zur Verfügung gestellt wird, und jedes der vier Aliquote der immobilisierten Einzelstrang-DNS anschließend einer Polymerasereaktion in Gegenwart eines Didesoxynukleotids unterzogen wird, wobei bei jedem Aliquot ein verschiedenes Didesoxynukleotid verwendet wird und wobei nur das Didesoxynukleotid, das komplementär zur Base in der Zielposition ist, eingebaut wird, die vier Aliquote anschließend einer Verlängerung in Gegenwart aller vier Desoxynukleotide unterzogen werden, wobei in jedem Aliquot die DNS, die nicht mit dem Didesoxynukleotid reagiert hat, verlängert wird, um eine Doppelstrang-DNS zu bilden, während die Didesoxynukleotid-blockierte DNS als Einzelstrang-DNS zurückbleibt, gefolgt von einer Identifizierung der Doppelstrang- und/oder Einzelstrang-DNS, um anzuzeigen, welches Didesoxynukleotid eingebaut wurde und somit, welche Base sich in der Zielposition befindet. Es ist offensichtlich, daß die Freisetzung von Pyrophosphat in der die Kette abschließendes Didesoxynukleotid-Reaktion anzeigt, welche Base eingebaut wurde, aber die relativ große Menge an freigesetztem Pyrophosphat in der nachfolgenden Desoxynukleotid-Primer- Verlängerungsreaktion (die sogenannten Kabelreaktion) ergibt ein viel größeres Signal und ist daher viel empfindlicher.
Für gewöhnlich ist es wünschenswert, eine Kontrollreaktion ohne Didesoxynukleotide und eine sogenannte "Nullkontrolle", die eine Mischung aller vier Didesoxynukleotide enthält, durchzuführen.
In der WO 93/23562 ist der Begriff "Didesoxynukleotid" dahingehend definiert, daß 3'-geschützte 2'-Desoxynukleotide umfaßt sind, die alle in gleicher Art dahingehend wirken, daß sie eine weitere Kettenverlängerung verhindern. Wenn jedoch die 3'-Schutzgruppe beispielsweise durch Hydrolyse entfernbar ist, dann kann einer Kettenverlängerung (durch eine einzelne Base) das Entschützen in der 3'-Stellung folgen, so daß die verlängerte Kette für eine weitere Verlängerungsreaktion bereitsteht. Auf diese Weise kann eine Kettenverlängerung um jeweils eine Position auf einmal fortschreiten, ohne die Komplikationen, die, wie vorstehend erläutert ist, durch eine Sequenz identischer Basen hervorgerufen werden. Somit können die vorstehend benannten Verfahren A und B so modifiziert werden, daß die Base, die bei jedem Schritt zugefügt wird, ein 3'-geschütztes 2'-Desoxynukleotid ist, und nachdem die Base zugefügt wurde (und die Lichtemission detektiert wurde), die 3'-Schutzgruppe entfernt wird, um die Zugabe eines weiteren 3'-geschützten 2'- Desoxynukleotids zu ermöglichen. Geeignete Schutzgruppen umfassen Acylgruppen, wie Alkanolgruppen, beispielsweise Acetylgruppen oder sogar jede beliebige aus dem Stand der Technik bekannte Hydroxyschutzgruppe, wie sie beispielsweise in Protective Groups in Organic Chemistry, JFW McOnie, Plenum Press, 1973 beschrieben sind.
In der vorstehend beschriebenen Ausführungsform stellt die Erfindung ein einfaches und schnelles Verfahren zur Detektion einzelner Basenwechsel zur Verfügung. In einem bevorzugten Format werden erfolgreich zwei Techniken kombiniert: Festphasentechnologie (DNS, die an magnetische Kügelchen gebunden ist) und ein enzymatisches luminometrisches Detektionsassay (ELIDA). Das Verfahren kann sowohl zur Identifizierung als auch zur quantitativen Bestimmung selektiv amplifizierter DNS-Fragmente verwendet werden. Es kann ebenso zur Detektion von Einzelbasensubstitutionen und für eine Abschätzung des Heterozygositätsindex für ein amplifiziertes polymorphes Genfragment verwendet werden. Dies bedeutet, daß das Verfahren verwendet werden kann, um seltene Punktmutationen zu screenen, die sowohl für erworbene wie auch für vererbte Krankheiten verantwortlich sind, um DNS- Polymorphismen zu identifizieren und sogar um zwischen Arzneimittel-resistenten und Arzneimittel-empfindlichen Viren oder Bakterienstämmen zu differenzieren, ohne das Erfordernis einer Zentrifugation, Filtration, Extraktion oder Elektrophorese. Die Einfachheit des Verfahrens macht es für viele medizinische (Routineanalyse für ein weites Gebiet von vererbten Krankheiten bzw. Störungen) und kommerziellen Anwendungen geeignet.
Die nachstehend dargestellten positiven experimentellen Ergebnisse zeigen deutlich, daß das Verfahren auch für ein automatisches, nicht-elektrophoretisches Online-Festphasen- DNS-Sequenzierungsverfahren mit schrittweisem Einbau einzelner Desoxynukleotide verwendet werden kann. Nach einer Amplifizierung, Immobilisierung auf magnetischen Kügelchen, Erhitzen mit nachfolgender Abkühlung, um eine Einzelstrang- DNS zu ergeben, und Doppelstrangbildung des Primers kann das Templat/Primerfragment bei einem wiederholten Zyklus von dNTP-Inkubation und Waschen verwendet werden. Die Proben werden in einem ELIDA kontinuierlich überwacht. Da die DNS-Synthese von der Freisetzung von anorganischem Pyrophosphat (PPi) in einer Menge, die der Menge an eingebautem Nukleotid entspricht, begleitet ist, werden in dem ELIDA nur dann Signale beobachtet, wenn komplementäre Basen eingebaut werden. Aufgrund der Fähigkeit des Verfahrens, PPi quantitativ zu bestimmen, ist es möglich, den Einbau einer einzelnen Base von zwei oder mehreren gleichzeitigen Einbauten zu unterscheiden. Da das DNS-Templat vorzugsweise durch PCR erhalten wird, ist es relativ einfach, die Menge an DNS, die für ein derartiges Assay gebraucht wird, zu erhöhen.
Wie vorstehend erwähnt ist, eröffnen unsere Ergebnisse die Möglichkeit für eine neue Lösungsmöglichkeit zur nichtelektrophoretischen Festphasen-DNS-Sequenzierung im großen Maßstab, die auch eine kontinuierliche Bestimmung des Fortschreitens der Polymerisationsreaktion mit der Zeit ermöglicht. Für den Erfolg einer derartigen Lösungsmöglichkeit besteht aufgrund der schnellen Zunahme des Hintergrundsignals wenn sich Template akkumulieren, die nicht "in Phase" sind, Bedarf an einer hohen Effizienz der DNS-Polymerase. Diese neue Lösungsmöglichkeit hat mehrere Vorteile verglichen mit herkömmlichen Sequenzierungsverfahren. Erstens ist das Verfahren für die parallele Handhabung mehrerer Proben geeignet. Zweitens können relativ kostengünstige Instrumente eingesetzt werden. Darüber hinaus vermeidet das Verfahren die Verwendung von Elektrophorese und dadurch die Beladung von Proben und das Gießen von Gelen.
Vorteilhafterweise kann das erfindungsgemäße Verfahren mit dem Verfahren kombiniert werden, das in der WO 93/23563 beschrieben ist und wobei PCR verwendet wird, um Schleifenstrukturen einzuführen, die einen permanent angebundenen 3'-Primer am 3'-Ende eines interessanten DNS-Strangs zur Verfügung stellen. Beispielsweise wird in einem derartigen modifizierten Verfahren der Ansatzprimer bzw. Verlängerungsprimer als Teil der 3'-Endschleifenstruktur auf eine Zielsequenz eines Stranges einer Doppelstrang-DNS eingeführt, welche die Zielposition enthält, wobei die Zielsequenz eine Region A am 3'-Ende aufweist und optional eine DNS-Region B aufweist, die sich ausgehend von der 3'- Position der Region A erstreckt, wobei die Doppelstrang-DNS einer Polymerasekettenreaktion-(PCR)-Amplifizierung unterzogen wird, bei der ein erster Primer verwendet wird, der am 3'-Ende der Sequenz hybridisiert, die zur Zielsequenz komplementär ist, dieser erste Primer immobilisiert ist oder mit Mitteln zur Verankerung auf einem festen Träger versehen ist und ein zweiter Primer, der eine 3'-terminale Sequenz aufweist, die wenigstens mit einem Teil von A und/oder B der Zielsequenz hybridisiert, wobei er an seinem 5'-Ende eine Sequenz aufweist, die im wesentlichen mit A identisch ist, und wobei die Amplifizierung, die die Doppelstrang-Ziel-DNS produziert, die an dem 3'-Ende der Zielsequenz in der nachfolgenden Reihenfolge die Region A, eine Region, die in der Lage ist, eine Schleife zu bilden, und eine Sequenz A', die komplementär zur Sequenz A ist, aufweist, wonach die amplifizierte Doppelstrang-DNS in ihrer immobilisierten Form einer Strangtrennung unterzogen wird, wodurch der nicht-immobilisierte Zielstrang freigesetzt wird und die Region A' mit der Region A hybridisieren gelassen wird bzw. zur Hybridisierung gebracht wird, wodurch die Schleife gebildet wird. Das 3'-Ende der Region A' hybridisiert direkt benachbart zur Zielposition. Die Didesoxy- und/oder Verlängerungsreaktion verwenden den hybridisierten Teil als Primer. Experimente unter Verwendung dieses Prinzips wurden erfolgreich durchgeführt, wie in den Beispielen dargestellt ist,
Die Erfindung betrifft ebenfalls Kits bzw. Reaktionssätze zur Verwendung in erfindungsgemäßen Verfahren, die normalerweise wenigstens folgende Bestandteile umfassen:
(a) einen testspezifischen Primer, der mit der Proben-DNS hybridisiert, so daß die Zielposition direkt benachbart zu dem 3'-Ende des Primers ist;
(b) eine Polymerase
(c) Detektionsenzymmittel zur Identifizierung einer Pyrophosphatfreisetzung
(d) Desoxynukleotide, die anstelle von dATP ein dATP- Analogon enthalten, das dazu in der Lage ist, als ein Substrat für eine Polymerase zu wirken, aber nicht dazu in der Lage ist, als ein Substrat für das PPi-Detektionsenzym zu wirken, und
(e) wahlweise Didesoxynukleotide, wobei ddATP durch ein ddATP-Analogon ersetzt ist, das dazu in der Lage ist, als ein Substrat für eine Polymerase zu wirken, aber nicht dazu in der Lage ist, als ein Substrat für ein PPi-Detektionsenzym zu wirken.
Falls das Kit für eine Verwendung mit anfänglicher PCR- Amplifizierung verwendet wird, wird es normalerweise auch wenigstens folgende Bestandteile umfassen:
(i) ein Paar von PCR-Primern, wobei mindestens ein Primer Mittel aufweist, die eine Immobilisierung des Primers erlauben;
(ii) eine Polymerase, die bevorzugt hitzestabil ist, beispielsweise Taql-Polymerase;
(iii) Puffer für die PCR-Reaktion und
(iv) Desoxynukleotide.
Wenn eine Enzymmarkierung verwendet wird, um die PCR zu beurteilen, enthält das Kit vorteilhafterweise ein Substrat für das Enzym und andere Bestandteile eines Detektionssystems.
Die Erfindung wird nachstehend durch nicht-einschränkende Beispiele mit Bezug auf die Zeichnungen beschrieben, wobei:
Fig. 1 eine schematische Darstellung eines Echtzeit-DNS- Sequenzierungsverfahren zeigt. Die vier verschiedenen Nukleotide werden schrittweise zum immobilisierten Templat, das mit einem Primer hybridisiert ist, zugegeben. Das während der durch DNS-Polymerase katalysierten Reaktion freigesetzte PPi wird durch ATP-Sulfurylase- und Luciferase- Reaktionen detektiert. Die Höhe des Signals ist proportional zu der Anzahl der Basen, die eingebaut wurden. Nach jeder Basenzugabe wird ein Waschschritt durchgeführt. Diese Schritte werden in einem Zyklus wiederholt und die Sequenz des Templats wird davon abgeleitet;
Fig. 2 zeigt die Auswirkung von dATP und dATPαS auf die Luciferasereaktion. 0,1 nmol dATP und 8 nmol dATPαS wurden wie angegeben zugefügt und das Lumineszenzergebnis wurde detektiert.
Fig. 3 zeigt das Ausmaß der PPi-Synthese als Funktion der Templatkonzentration. Drei pmol (exo)-Klenow wurden mit ein oder zwei pmol E3PN/NUSPT wie angegeben inkubiert. Die Reaktionen wurde durch die Zugabe von 40 umol dCTP gestartet. Das freigesetzte PPi wurde mittels ELIDA detektiert;
Fig. 4 zeigt die Echtzeit-Detektion eines einfachen Baseneinbaus bei vier verschiedenen Templaten. 1,5 pmol angegebene Template wurden mit 3 pmol (exo&supmin;)-Klenow inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 40 umol der angegebenen Desoxynukleotide gestartet und das freigesetzte PPi wurde durch ELIDA detektiert;
Fig. 5 zeigt eine Echtzeit-DNS-Sequenzierung, die auf einem 291-Basen-langen mittels PCR generierten Einzelstrangtemplat durchgeführt wurde, das auf mit Streptavidin beschichteten Kügelchen immobilisiert war. Ungefähr 1 umol des Templats/Primers (NUSPT) wurden mit 3 pmol (exo&supmin;)- Klenow inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 40 umol des angegebenen Desoxynukleotids gestartet und das freigesetzte PPi wurde durch ELIDA detektiert. Zwischen jeder Nukleotid-Zugabe wurden die Kügelchen gewaschen. Die angegebenen ELIDA-Signale sind bezüglich des Verlusts an Kügelchen während der Waschvorgänge ausgeglichen. Die DNS- Sequenz nach dem Primer, wie sie durch halbautomatische Festphasen-DNS-Sequenzierung bestätigt wurde, ist in der Figur eingefügt;
Fig. 6 zeigt eine schematische Darstellung der Verwendung von PCR, um eine Schleifenstruktur mit einem der biotinylierten Primer zu erzeugen. Das PCR-Produkt wird immobilisiert und der nicht-biotinylierte Strang mit alkalischer Lösung eluiert. Der biotinylierte Strang wird hybridisiert, um eine Schleifenstruktur zu bilden. Die Schleifenstruktur wurde als Templat für eine Echtzeit-DNS-Sequenzierung verwendet, wie es in Fig. 1 dargestellt ist und in Beispiel 1 beschrieben ist;
Fig. 7 zeigt eine Echtzeit-DNS-Sequenzierung, die auf einer mit PCR erzeugten Schleifenstruktur durchgeführt wurde, die auf mit Streptavidin beschichteten paramagnetischen Kügelchen immobilisiert war. Ungefähr zwei pmol des Templats wurden mit 3 umol (exot-Klenow-DNS-Polymerase inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 40 umol des angegebenen Desoxynukleotids gestartet und die PPi-Freisetzung wurde durch ELIDA detektiert. Die Schleifenstruktur ist so gestaltet, daß die Zugabe eines extra A am 3'-Ende während der PCR-Reaktion möglich ist, da einige thermostabile DNS-Polymerasen, wie beispielsweise Taq-DNS- Polymerase, eine Endtransferase-Aktivität zeigen und ein zusätzliches nicht-templatabhängiges A an dem 3'-Ende hinzufügt; und
Fig. 8 zeigt eine schematische Zeichnung der Anordnung unter Verwendung eines Primers, der mit einem DNS-Fragment hybridisiert ist und auf einer mit Streptavidin beschichteten Kapillare immobilisiert ist.

Beispiel 1

Materialien und Methoden

Synthese und Aufreinigung von Oligonukleotiden

Die Oligonukleotide E2PN (55-mer: 5'CGACGATCTGAGGTCATAGCT- GTTTCCTGTGTGAACTGGCCGTCGTTTTACAACG3'), E3PN (35-mer: 5'GCTGGAATTCGTCAGACTGGCCGTCGTTTTACAAC3'), NUSPT (5'CTAA- AACGACGGCCAGT3'), RIT 203 (5'- AGCTTGGGTTCGAGGAGATCTTCCGGGTTACGGCGGAAGATCTCCTCGAGG), RIT 204 (5'- AGCTCCTCGAGGAGATCTTCCGCCGTAACCCGGAAGATCTCCTCGAACCCA), ROMO 205S (5'CGAGGAGATCTTCCGGGTTACGGCG), RIT 28, RIT 29, und USP (Hultman, T., Murby, M., Ståhl, S., Hornes, E., and Uhlén, M. (1990) Nucleic Acids Res. 18, 5107-5112) wurden durch Phosphoramiditchemie mit einen automatischen DNS- Syntheseapparat (Gene Assembler Plus, Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) synthetisiert. Die Aufreinigung wurde auf einer schnellen Protein-Flüssigchromatographie pepRPC- 5/5-Säule durchgeführt (Pharmacia, Biotech, Uppsala, Schweden).

In-vitro-Amplifizierung und Templatherstellung

Die PCT-Reaktionen wurden auf dem Multilinker von Plasmid pRIT 28 mit 7,5 umol allgemeinen Primern, RIT 28 und RIT 29 nach Hultman et al. (siehe oben) durchgeführt. Die PCR- Produkte wurden auf mit Streptavidin beschichteten superparamagnetischen Kügelchen Dynabeads® M280-Streptavidin oder M450-Strepatvidin (Dynal A.S., Oslo, Norwegen) immobilisiert. Die Herstellung von Einzelstrang-DNS und Hybridisierung auf Sequenzierungsprimern wurde wie früher beschrieben durchgeführt (Nyrén, P., Pettersson, B., and Uhlén, M. (1993) Anal. Biochem. 208, 171-175)

Echtzeit-DNS-Sequenzierung

Das Oligonukleotid E3PN und das vorstehend beschriebene PCR-Produkt wurden als Template für eine Echtzeit-DNS- Sequenzierung verwendet. Das Oligonukleotid E3PN wurde auf mit Streptavidin beschichteten superparamagnetischen Kügelchen (Dynabeads® M280-Streptavidin oder M450-Streptavidin) immobilisiert, wie es vorstehend beschrieben ist, und ein Primer wurde mit dem immobilisierten Templat hybridisiert. Die immobilisierten DNS-Fragmente wurden entweder mit einer modifizierten T7-DNS-Polymerase (Sequenase 2.0; U.S. Biochemical, Cleveland, OH, USA), Klenow-DNS-Polymerase (Pharmacia, Biotech, Uppsala, Schweden) oder Exonuclease defizitärer (exo&supmin;)-Klenow-DNS-Polymerase (Amersham, UK) inkubiert. Das Sequenzierungsverfahren wurde durch schrittweise Verlängerung des Primerstrangs nach sequenzieller Zugabe der verschiedenen Desoxynukleosidtriphosphate durchgeführt (Pharmacia, Biotech, Uppsala, Schweden). Das Waschen der immobilisierten DNS-Fragmente zwischen jeder Nukleotidzugabe wurde in zwei Schritten durchgeführt: zuerst mit einer Pufferlösung, die 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,25 M NaCl, 0,1% Tween 20 enthielt, und anschließend mit 10 mM Tris- Acetat (pH 7,5). Aufgrund des Nukleotideinbaus freigesetztes PPi wurde mittels ELIDA detektiert (Nyrén, P. (1987) Anal. Biochem. 167, 235-238). Die Lumineszenz wurde unter Verwendung eines LKB 1250 Luminometers, das an ein potentiometrisches Aufnahmegerät angeschlossen war, aufgezeichnet. Das Luminometer wurde kalibriert, um ein Signal von 10 mV für den internen Lichtstandard zu ergeben. Die Lumineszenz-Ausgabe wurde durch Zugabe einer bekannten Menge von ATP oder PPi kalibriert. Das Standardprobenvolumen betrug 0,2 ml und enthielt die folgenden Bestandteile: 0,1 M Tris- Acetat (pH 7,75), 2 EDTA, 10 mM Magnesiumacetat, 0,1% Rinderserumalbumin, 1 mM Dithiothreitol, 5 uM Adenosin-5'- phosphosulfat (APS), 0,4 mg/ml Polyvinylpyrrolidon (360 000), 100 ug/ml D-Luciferin (BioOrbit, Finnland), 4 ug/ml L-Luciferin (BioOrbit, Finnland), 0,3 U/ml ATP-Sulfurylase (ATP: Sulfat-Adenylyl-Transferase; EC 2.7.7.4) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA), aufgereinigte Luciferase (Sigma Chemical Co,, St. Louis, MO, USA) in einer Menge, die ein Signal von 200 mv für 0,1 uM ATP ergibt. Ein pmol des immobilisierten DNS-Fragments und 3 umol Polymerase wurden zu der vorstehend beschriebenen Lösung gegeben. Die Sequenzierungsreaktion wurde durch die Zugabe von 40 umol von einem der Nukleotide (Pharmacia, Biotech, Uppsala, Schweden) gestartet. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur durchgeführt. Wenn die Wirkung von dATP und dATPαS auf die Luciferasereaktion untersucht wurde, wurden sowohl APS als auch ATP-Sulfurylase aus der Probe entfernt.

Halbautomatisierte Festphasen-DNS-Seauenzierung

Die Sequenzdaten, die aus der Echtzeit-DNS-Sequenzierung erhalten wurden, wurden durch halbautomatisierte Festphasensequenzierung bestätigt (Hultman, T,, Bergh, S., Moks, T., und Uhlén, M., (1991) BioTechniques 10, 84-93).

Ergebnisse

Prinzip des Sequenzierungsverfahrens

Das Prinzip des Sequenzierungsverfahrens ist in Fig. 1 dargestellt. Ein spezifisches DNS-Fragment wird auf einem festen Träger immobilisiert (beispielsweise durch Biotin/Streptavidin-Kopplung) und nachfolgend in die Einzelstrangform überführt. Ein Sequenzierungsprimer wird mit der Einzelstrang-DNS hybridisiert und ein wiederholter Desoxynukleotid-Inkubations- und Waschzyklus wird durchgeführt. Die Synthese von DNS wird von einer Freisetzung von PPi in gleicher Molarität wie die des eingebauten Nukleotids begleitet. Dadurch können Echtzeitsignale durch ELIDA nur dann erhalten werden, wenn komplementäre Basen eingebaut werden. Beim ELIDA wird das so produzierte PPi durch ATP- Sulfurylase in ATP umgewandelt und die Menge von ATP wird anschließend durch den Luciferaseassay (Fig. 1) bestimmt. Ausgehend von den ELIDA-Ergebnissen kann die Sequenz nach dem Primer abgeleitet werden.

Wirkung von dATP und dATPαS auf das Luciferasesystem

Wir haben beobachtet, daß dATP mit dem Detektionssystem des Luciferase-Lumineszenz-Assays, wie er von Nyrén et al. (siehe oben) beschrieben wurde, interferiert. Diese Interferenz ist ein Hauptproblem, wenn das Verfahren dazu verwendet wird, einen Einzelbaseneinbau nachzuweisen. Mehrere Lösungsansätze, diese Hintergrundaktivität zu vermindern, wurden geprüft (die Daten dazu sind nicht gezeigt) und unter diesen wurde der größte positive Effekt dann erzielt, wenn natürliches dATP durch dATPαS ersetzt wurde. Fig. 2 zeigt die Ergebnisse der Verwendung von dATP und dATPαS während des Luciferase-Assays. Eine Zugabe von 0,1 nmol dATP verursachte eine sofortige Zunahme der Lichtemission gefolgt von einer langsamen Abnahme bis ein konstantes Niveau erreicht wurde. Die Zunahme des konstanten Niveaus der Lichtemission nach Zugabe von dATP entspricht 1-2% der Emission einer äquivalenten Zugabe von ATP. Dieser Effekt von dATP macht es unmöglich, eine Sequenzierungsreaktion durch Zugabe von dATP zu starten; stattdessen muß die Reaktion durch Zugabe von DNS-Polymerase gestartet werden. Das Signal-zu-Rausch-Verhältnis wird für dATP verglichen mit anderen Nukleotiden ebenfalls größer. Andererseits hatte die Zugabe von 8 nmol dATPαs (einer 80-fach höheren Menge als dATP) nur einen geringen Effekt auf die Luciferase ( Fig. 2). Aus Fig. 2 kann abgeleitet werden, daß dATPαS weniger als 0,05% so effizient als Substrat für Luciferase ist wie dATP. Gemäß diesen Ergebnissen ist es deshalb ein großer Vorteil, dATPαS anstelle von dATP zusammen mit einer DNS-Polymerase zu verwenden, die dieses Nukleotid akzeptiert.

Festphasentechnik

Mehrere verschiedene Parameter wurden in einem Modellsystem und unter Verwendung zweier verschiedener synthetischer DNS-Template optimiert. Um die Sequenzierung von mehreren Basen zu vereinfachen, wurde die DNS auf eine feste Phase immobilisiert. Hierbei haben wir zwei Arten von mit Streptavidin beschichteten superparamagnetischen Kügelchen von Dynal verwendet: M280 und M450. Beide Kügelchentypen weisen eine hohe Bindungskapazität auf. Wir haben gefunden, daß die größeren Kügelchen (M450) aufgrund ihrer höheren Sedimentationsgeschwindigkeit (die Daten sind nicht gezeigt) eine schnellere Waschprozedur ermöglichen. Um stumpfendige DNS-Polymeraseaktivität zu eliminieren (Clark, J.M. (1991) Gene, 104, 75-80), wurden Sequenzprimer ausgewählt, die mit wenigstens einer Base am 3'-Ende des Templats einen Doppelstrang ausbilden. In Fig. 3 ist ein Einzelbaseneinbau für zwei verschiedene Konzentrationen von Primer/Templat gezeigt. Die Reaktionen wurden durch Zugabe der nächsten richtigen Base (dCTP) gestartet und die Spuren zeigen die Freisetzung von PPi während des Einbaus der Base. Keine PPi-Freisetzung wurde dann beobachtet, wenn eine nichtkomplementäre Base zugefügt wurde (die Daten sind nicht gezeigt). In den nachfolgenden Experimenten wurde 1 umol Primer/Templat verwendet und die relevante Signaldifferenz aufgezeichnet (Fig. 3). Sowohl die Anfangsgeschwindigkeit als auch das Ausmaß während ELIDA gebildetem PPi sind proportional zur DNS-Konzentration innerhalb eines breiten Intervalls (Hultman et al., siehe oben). Die obere Grenze für den Assay beträgt 200 umol gebildetes PPi (1 uM) (Nyrén, P., und Lundin, A., (1985) Anal. Biochem. 151, 504-509). Die untere Grenze wird hauptsächlich durch das eingesetzte Volumen und durch Kontamination von PPi und ATP in den verschiedenen Lösungen bestimmt.

Effekt auf die DNS-Polymerasekonzentration

In der nächsten Reihe von Experimenten wurde der Effekt der Polymerasekonzentration auf das Sequenzierungsverfahren untersucht. Wir fanden heraus, daß es wichtig war, einen Überschuß an Polymerase gegenüber dem Primer/Templat zu verwenden, um sicher zu sein, daß sämtliche freien 3'-Enden verlängert wurden. Bei niedrigen Polymerasekonzentration wurde eine Zweiphasen-Kinetik (eine schnelle Phase gefolgt von einer langsameren Phase) beobachtet (die Daten sind nicht gezeigt). Die Amplitude der schnellen Phase ist stöchiometrisch zur Menge an vorliegendem Enzym und die langsame Phase entspricht der Geschwindigkeit des konstanten Einbaus. Die geschwindigkeitsbegrenzenden Schritte für die langsame Phase sind die Desoziierung der Polymerase von dem verlängerten Primer/Templat und die nachfolgende Bindung an einen nicht verlängerten Primer/Templat. Die Einbaugeschwindigkeit als Funktion der Nukleotidkonzentration wurde ebenfalls untersucht. Wir beobachteten einen Km von 0,2 uM bzw. 0,4 uM für Klenow bzw. Sequenase 2.0 für den Einbau einer Base (nicht gezeigte Daten). Die letzteren Ergebnisse entsprechen den Daten aus der Literatur (Van Draanen, N.A., Tucker, S.C., Boyd, F.L., Trotter, B.W. und Reardon, J. E. (1992) J. Biol. Chem. 267, 25019-25024).

Echtzeit-DNS-Sequenzierung

Verschiedene synthetische Template und ein PCR-Produkt wurden sequenziert, um die Durchführbarkeit des neuen Lösungsansatzes zu untersuchen. Die Verlängerung um eine Base bei drei verschiedenen Primer/Templaten ist in Fig. 4 gezeigt. Sowohl die Geschwindigkeit als auch das Ausmaß (Steigung und Höhe der Signale) des Nukleotideinbaus waren für alle drei getesteten Templattypen ähnlich. In Fig. 5 ist eine Echtzeit-DNS-Sequenzierung von 15 Basen eines 191 Basen langen Einzelstrang-PCR-Produktes gezeigt. Das Sequenzierungsverfahren wurde durch Zugabe von dATPαS gestartet. Beim ELIDA wurde keine PPi-Freisetzung aufgrund eines Baseneinbaus detektiert. Das kleine beobachtete Signal ist durch PPi-Kontamination in der Nukleotidlösung verursacht. Nach einem Waschschritt wurde dGTP zugefügt. Ein Signal, das dem Einbau einer Komponente entspricht, wurde beobachtet. Die nächste zugegebene Base war dCTP. Ein Signal, das dem Einbau von zwei identischen Komponenten entspricht, wurde nun detektiert. Die nachfolgende Zugabe von dTTP ergab kein Signal. Anschließend wurde wieder dATPαS zugefügt. Diesmal wurde der Einbau von zwei identischen Komponenten festgestellt. Der letztere detektierte Einbau bestätigte frühere Beobachtungen (Vosberg, H.P., und Eckstein, f. (1977) Biochemistry 16, 3633-3640), daß dATPαS durch Klenow-Polymerase wirksam in den Primer/Templat eingebaut wird. Ein Signal, das dem Einbau von einer Komponente entspricht, wurde nach der nächsten Zugabe beobachtet, wobei diese Zugabe dGTP war. Durch die Fortführung dieses zyklischen Verfahrens wurde weitere Information über die Sequenz erhalten. Es ist wichtig festzustellen, daß genug Nukleotide hinzugefügt werden müssen, um größere Verlängerungen zu ermöglichen, wenn eine große Anzahl von identischen Komponenten vorliegen. Die Sequenzierungsverfahren wurden mehrere Male auf dem gleichen Templat mit demselben Ergebnis wiederholt. Die Abnahme des Signals aufgrund des Verlusts und der Aggregation von Kügelchen während des Waschvorgangs (gemessen durch die Abnahme der optischen Dichte) wurde in Fig. 5 ausgeglichen. Der Verlust war geringer bei der Verwendung von M450-Kügelchen als bei der Verwendung von M280 Kügelchen. Die erhaltene Sequenz wurde durch halbautomatisierte Sanger-Festphasen-Sequenzierung bestätigt (die Daten sind nicht gezeigt).

Beispiel 2

Materialien und Methoden

Konstruktion des Hairpin-Vektors pRIT 28HP und Templatherstellung

Die Oligonukleotide RIT 203 und RIT 204 (dargestellt wie in Beispiel 1 beschrieben) wurden hybridisiert und an HindIII, ein vorher eingeschränktes Plasmid pRIT 28 (Hultman et al. 1990, siehe oben) gebunden (Pharmacia, Biotech, Uppsala, Schweden). Eine PCR-Reaktion wurde auf den Multilinker von Plasmid pRIT 28HP mit 7,5 umol Primerpaaren, RIT 29/ROMO 2055, 200 um dNTP, 20 mM Tris-HCl pH 8,7, 2 mM MgCl&sub2;, 0,1% Tween 20 und 1 Einheit AmpliTaq DNS-Polymerase (Perkin Elmer, Cetus, Emeryville, USA) durchgeführt, das einem Endvolumen von 50 ul entspricht. Das Temperaturprofil umfaßte einen 15 Sekunden langen Denaturierungsschritt bei 95ºC und einen 90 Sekunden langen Erhitzungs/Verlängerungsschritt bei 72ºC. Diese Schritte wurden 35 mal mit einem GeneAmp PCR-System, 9600 (Perkin Elmer, Emeryville, USA) wiederholt. Die biotinylierten PCR-Produkte wurden auf mit Streptavidin beschichteten superparamagnetischen Kügelchen (Dynabeads® M280-Streptavidin von Dynal A.S., Oslo, Norwegen) immobilisiert. Die Kügelchen wurden wie vom Hersteller beschrieben eingesetzt (Dynal A. S., Oslo, Norwegen). Eine Einzelstrang-DNS wurde erhalten, indem der Überstand nach Inkubation des immobilisierten PCR-Produkts in 0,1 M NaOH während 5 Minuten entfernt wurde. Die immobilisierten Einzelstrang-DNS wurde zuerst mit 1 · TE (Tris-HCl 10 mM, 1 mM EDTA, pH 7,5) gewaschen und bei 65ºC für 5 Minuten in 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 8 mM MgCl&sub2; hybridisiert, um eine Schleifenstruktur für die Echtzeit-DNS-Sequenzierung herzustellen.

Echtzeit-DNS-Sequenzierung auf einer Schleifenstruktur

Die so hergestellte auf superparamagnetischen Kügelchen immobilisierte Schleifenstruktur, wurde mit (exco)-Klenow- DNS-Polymerase inkubiert. Das Sequenzierungsverfahren wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.

Ergebnisse

Das Prinzip der Erzeugung einer Schleifenstruktur als Templat zur Verwendung bei einer Echtzeit-Sequenzierung ist in Fig. 6 gezeigt. Dieses Verfahren bedarf des Einsatzes von nur einem biotinylierten Primer, der dazu verwendet wird, das hybridisierte Amplifizierungsprodukt zu immobilisieren.
Der nicht-biotinylierte Strang wird entfernt, um so die Bildung der Schleifenstruktur zu ermöglichen. Die Ergebnisse der Verwendung der immobilisierten Schleifenstruktur sind in Fig. 7 für 12 aufeinanderfolgende Sequenzierungszyklen gezeigt. Durch dieses Verfahren konnte die Sequenz der ersten 10 Basen, die dem Schleifenprimer benachbart sind, bestimmt werden.
Die Sequenzierung kann unter Verwendung einer Kapillare als fester Träger durchgeführt werden und eine schematische Darstellung für den Versuchsaufbau unter Verwendung eines immobilisierten DNS-Fragments mit einem hybridisierten Primer (wie in Beispiel 1) ist in Fig. 8 gezeigt. Ein ähnlicher Aufbau kann für immobilisierte DNS-Fragmente mit Schleifenprimer verwendet werden.

Claims

1. Verfahren zur Identifizierung einer Base an einer Zielposition in einer Einzelstrang-DNS-Sequenzprobe, wobei ein Ansatz-Primer, der mit der Proben-DNS direkt benachbart zu der Zielposition hybridisiert, zur Verfügung gestellt wird, und die Proben-DNS und der Ansatz-Primer einer Polymerasereaktion in der Anwesenheit eines Desoxynukleotids oder eines Didesoxynukleotids unterzogen wird, wodurch das Desoxynukleotid oder das Didesoxynukleotid nur dann eingeführt wird und Pyrophosphat (PPi) freisetzt, wenn es zu der Base an der Zielposition komplementär ist, jede Freisetzung von PPi enzymatisch detektiert wird, verschiedene Desoxynukleotide oder Didesoxynukleotide entweder getrennten Aliquoten einer Probe-Primer-Mischung oder schrittweise der gleichen Probe-Primer-Mischung zugegeben und der Polymerasereaktion unterzogen werden, um anzuzeigen, welches Desoxynukleotid oder Didesoxynukleotid eingebaut wird, dadurch gekennzeichnet, daß das bzw. die PPi-Detektionsenzym bzw. PPi-Detektionsenzyme in dem Polymerasereaktionsschritt enthalten sind und dadurch, daß anstelle von Desoxy- oder Didesoxyadenosintriphosphat (ATP) ein dATP- oder ein ddATP- Analogon verwendet wird, das dazu in der Lage ist, als ein Substrat für eine Polymerase zu wirken, aber nicht dazu in der Lage ist, als ein Substrat für das PPi-Detektionsenzym zu wirken.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Freisetzung von PPi mittels einer Reaktion auf Luciferase-Luciferin-Basis detektiert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei eine PPi-Freisetzung unter Verwendung des enzymatischen luminometrischen anorganischen Pyrophosphat-Detektionsassays (ELIDA) detektiert wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das dATP- oder ddATP-Analogon Desoxyadenosin- -Thiotriphosphat (dATP S) ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das ferner die Verwendung des -Thio-Analogons von dCTP, dGTP und dTTP umfaßt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Proben-DNS immobilisiert ist oder mit Mitteln zur Verbindung mit einem festen Träger versehen ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Proben-DNS zuerst amplifiziert wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Ansatz-Primer eine Schleife enthält und an sich selbst und das 3'-Ende der Proben-DNS zurückbindet.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Proben-DNS einer Amplifikation unterzogen wird, die amplifizierte DNS immobilisiert wird und dann einer Strangtrennung unterzogen wird, der nicht immobilisierte Strang entfernt wird und ein Ansatz-Primer, der mit der immobilisierten DNS direkt benachbart zu der Zielposition hybridisiert, zur Verfügung gestellt wird, jedes von vier Aliquoten der immobilisierten Einzelstrang-DNS dann einer Polymerase- Reaktion in der Anwesenheit eines Didesoxynukleotids unterzogen wird, wobei bei jedem Aliquot ein anderes Didesoxynukleotid verwendet wird, wodurch nur das Didesoxynukleotid, das der Base in der Zielposition komplementär ist, eingeführt wird, die vier Aliquote dann einer Verlängerung in der Anwesenheit von allen vier Desoxynukleotiden unterzogen wird, wodurch bei jedem Aliquot die DNS, die nicht mit dem Didesoxynukleotid reagiert hat, verlängert wird, um eine Doppelstrang-DNS zu bilden, während die Didesoxy-blockierte DNS als Einfachstrang-DNS verbleibt, gefolgt von einer Identifikation der Doppelstrang- und/oder Einfachstrang- DNS, um anzuzeigen, welches Didesoxynukleotid eingeführt wurde und somit welche Base in der Zielposition vorhanden war.

10. Kit bzw. Reaktionssatz zur Verwendung bei einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9 mit

(a) einer Polymerase;

(b) Detektionsenzymmittel zur Identifizierung einer Pyrophosphatfreisetzung;

(c) Desoxynukleotiden, die anstelle von dATP ein dATP- Analogon enthalten, das dazu in der Lage ist, als ein Substrat für eine Polymerase zu wirken, aber nicht dazu in der Lage ist, als ein Substrat für das PPi- Detektionsenzym zu wirken, und

(d) einem testspezifischen Primer, der mit der Proben-DNS hybridisiert, so daß die Zielposition direkt benachbart zu dem 3'-Ende des Primers ist;

(e) wahlweise Didesoxynukleotiden, wobei ddATP durch ein ddATP-Analogon ersetzt ist, das dazu in der Lage ist, als ein Substrat für eine Polymerase zu wirken, aber nicht dazu in der Lage ist, als ein Substrat für das PPi-Detektionsenzym zu wirken.

11. Kit bzw. Reaktionssatz nach Anspruch 10 für eine Verwendung mit anfänglicher PCR-Amplifikation, das ferner folgendes aufweist:

(i) ein Paar von PCR-Primern, wobei mindestens ein Primer Mittel aufweist, die eine Immobilisierung des Primers erlauben

(ii) eine PCR-Polymerase, und

(iii) Desoxynukleotide.

12. Verfahren oder Kit bzw. Reaktionssatz nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Polymerase in dem Polymerasereaktionsschritt arm an bzw. frei von Exonuclease ist (exo&supmin;).

13. Verfahren oder Kit bzw. Reaktionssatz nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Verwendung mit einer Mehrzahl von DNS-Sequenzproben, wobei die DNS-Sequenzen in einem Assay- System auf einer festen Oberfläche angeordnet sind.