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ES2909899T3 - Métodos para detectar inactivación de la ruta de recombinación homóloga (BRCA1/2) en tumores humanos - Google Patents

Métodos para detectar inactivación de la ruta de recombinación homóloga (BRCA1/2) en tumores humanos Download PDF

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ES2909899T3
ES2909899T3 ES14809384T ES14809384T ES2909899T3 ES 2909899 T3 ES2909899 T3 ES 2909899T3 ES 14809384 T ES14809384 T ES 14809384T ES 14809384 T ES14809384 T ES 14809384T ES 2909899 T3 ES2909899 T3 ES 2909899T3
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cancer
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brca1
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Elodie Manie
Marc-Henri Stern
Tatiana Popova
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Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Institut Curie
Original Assignee
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Institut Curie
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Abstract

Un método para predecir deficiencia en la ruta de la recombinación homóloga (RH) del ADN en un paciente que padece cáncer, que comprende (1) cuantificar el número de reordenamientos en el ADN genómico de una muestra tumoral obtenida de dicho paciente, en donde el número de reordenamientos corresponde al número, por genoma, de puntos de rotura que dan como resultado segmentos de al menos 3 megabases; y (2) determinar si dicha muestra tumoral comprende células que tienen una mutación genética en al menos un gen de la ruta de la RH seleccionado del grupo que consiste en BRCA1, BRCA2, PALB2/FANCN, BRIP1/FANCJ, BARD1, RAD51 y parálogos de RAD51 que son RAD51B, RAD51C, RAD51D, XRCC2 y XRCC3.

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos para detectar inactivación de la ruta de recombinación homologa (BRCA1/2) en tumores humanos Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
La presente solicitud reivindica prioridad respecto a la solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° de serie 61/913.637, presentada el 9 de diciembre de 2013.
Sector de la técnica
La invención se refiere a métodos para detectar una predisposición a desarrollar cáncer y a métodos para tratar el cáncer.
Estado de la técnica
El cáncer es una clase de enfermedad en la que un grupo de células muestra los rasgos de crecimiento incontrolado (crecimiento y división más allá de los límites normales), invasión (intrusión y destrucción de tejidos adyacentes) y, a veces, metástasis (diseminación a otras ubicaciones del cuerpo a través de la linfa o la sangre). Los cánceres se pueden clasificar de acuerdo con el órgano, tejido y tipo de célula a partir del cual se originan las células cancerosas: pulmón, colon, hígado, piel, etc.
El cáncer representa una de las principales causas de muerte en el mundo. El éxito del tratamiento se basa en el diagnóstico de la enfermedad en etapas muy tempranas y en la elección de terapias adaptadas. Se ha identificado una pluralidad de factores de riesgo (relacionados con el estilo de vida, genéticos, etc.) para determinados tipos de cánceres.
Como solo un ejemplo, los carcinomas de mama de tipo basal (BLC, del inglés "basal-like breast carcinomas") se describen en general como carcinomas ductales de grado elevado, que tienen el llamado fenotipo triple negativo (TNBC) (ausencia del receptor de estrógeno [RE], receptor de progesterona [RP] y sobreexpresión de HER2/ERBB2) y se caracterizan por los marcadores expresados por las células basales/mioepiteliales normales de la glándula mamaria (tales como las citoqueratinas 5/6, 14, 17 y EGFR (para revisión12).
Existe una necesidad insatisfecha en la materia de métodos para detectar deficiencia en la recombinación homóloga y/o deficiencia en BRCA, así como para diagnosticar un pronóstico particular o la probabilidad de respuesta a un tratamiento particular, en carcinomas de mama de tipo basal, luminal y que sobreexpresan HER2 y otros cánceres. Popova et al. (Cancer Research, 2012, 72(21), 5454-5462) y la solicitud internacional publicada con la referencia WO2013/182645 divulgan métodos para detectar la inactivación de la ruta de recombinación homóloga de ADN en tumores.
Objeto de la invención
La invención se define mediante las reivindicaciones.
Los inventores han descubierto que la detección de roturas cromosómicas a gran escala, de manera especial al menos un determinado número de roturas, puede detectar deficiencia en la recombinación homóloga (RH), independientemente del mecanismo de inactivación.
Por lo tanto, en un aspecto, la invención se refiere a un método para detectar deficiencia en la ruta de recombinación homóloga (RH) del ADN en un paciente que padece cáncer, que comprende cuantificar el número de reordenamientos en el ADN genómico (por ejemplo, transiciones a gran escala (LST, del inglés "Large Scale Transitions")) de una muestra tumoral obtenida de dicho paciente, en donde el número de reordenamientos corresponde al número (por ejemplo, por genoma) de puntos de rotura que dan como resultado segmentos de al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 megabases. Los métodos de acuerdo con la invención comprenden además una etapa para determinar si la muestra tumoral comprende células que tienen una mutación genética en al menos un gen de la ruta de la RH seleccionado del grupo que consiste en BRCA1, BRCA2, PALB2/FANCN, BRIP1/FANCJ, BARD1, RAD51 y parálogos de RAD51 que son RAD51B, RAD51C, RAD51D, XRCC2 y XRCC3.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para predecir el estado de los genes BRCA1 y BRCA2 en una célula cancerosa. El método comprende determinar, en una o más células cancerosas, el número total de reordenamientos (por ejemplo, LST) en al menos un par de cromosomas humanos, en donde el número de reordenamientos corresponde al número (por ejemplo, por genoma) de puntos de rotura que dan como resultado segmentos de al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 megabases; y diagnosticar una mayor probabilidad de una deficiencia en el gen BRCA1 o BRCA2 en una célula que tiene un número total de reordenamientos que es mayor que un número de referencia.
En otro aspecto, la presente invención presenta un método para evaluar en las células cancerosas de un paciente la presencia de reordenamientos (por ejemplo, LST) en el ADN genómico de una muestra tumoral obtenida de un paciente. El método comprende (a) detectar el número de reordenamientos en el ADN genómico de una muestra tumoral obtenida de dicho paciente, en donde el número de reordenamientos corresponde al número (por ejemplo, por genoma) de puntos de rotura que dan como resultado segmentos de al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 megabases, y (b) identificar que el paciente tiene células cancerosas con el reordenamiento.
En otro aspecto, la presente invención presenta un método para detectar deficiencia en la RH (a veces denominada en el presente documento estado de deficiencia en la RH) en las células cancerosas de un paciente. El método comprende (a) detectar un número de reordenamientos (por ejemplo, LST) en el ADN genómico de una muestra tumoral obtenida de dicho paciente, en donde el número de reordenamientos corresponde al número (por ejemplo, por genoma) de puntos de rotura que dan como resultado segmentos de al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 megabases, y (b) diagnosticar que el paciente tiene células cancerosas con el estado de deficiencia en la RH.
En otro aspecto, la presente invención presenta un método para evaluar las células cancerosas de un paciente en cuanto a la presencia de una mutación genética dentro de un gen de una ruta de la RH. El método comprende (a) detectar un número de reordenamientos (por ejemplo, LST) en el ADN genómico de una muestra tumoral obtenida de dicho paciente, en donde el número de reordenamientos corresponde al número (por ejemplo, por genoma) de puntos de rotura que dan como resultado segmentos de al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 megabases, y (b) identificar que el paciente tiene células cancerosas con la mutación genética.
En otro aspecto, la presente invención presenta un método para realizar un análisis de diagnóstico de una célula cancerosa de un paciente. El método comprende (a) detectar un número de reordenamientos (por ejemplo, LST) en el ADN genómico de una muestra tumoral obtenida de dicho paciente, en donde el número de reordenamientos corresponde al número (por ejemplo, por genoma) de puntos de rotura que dan como resultado segmentos de al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 megabases, y (b) diagnosticar que el paciente tiene células cancerosas con un reordenamiento genómico distintivo.
En otro aspecto, la presente invención presenta un método para realizar un análisis de diagnóstico de una célula cancerosa de un paciente. El método comprende (a) detectar un número de reordenamientos (por ejemplo, LST) en el ADN genómico de una muestra tumoral obtenida de dicho paciente, en donde el número de reordenamientos corresponde al número (por ejemplo, por genoma) de puntos de rotura que dan como resultado segmentos de al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 megabases, y (b) diagnosticar que el paciente tiene células cancerosas con un estado de deficiencia en la RH.
En otro aspecto, la presente invención presenta un método para realizar un análisis de diagnóstico de una célula cancerosa de un paciente. El método comprende (a) detectar un número de reordenamientos (por ejemplo, LST) en el ADN genómico de una muestra tumoral obtenida de dicho paciente, en donde el número de reordenamientos corresponde al número (por ejemplo, por genoma) de puntos de rotura que dan como resultado segmentos de al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 megabases, y (b) diagnosticar que el paciente tiene células cancerosas con una mutación genética dentro de un gen de una ruta de la RH.
En otro aspecto, la presente invención presenta un método para realizar un análisis de diagnóstico de una célula cancerosa de un paciente para determinar si es probable que el paciente con cáncer responda a un régimen de tratamiento del cáncer que comprende administrar radiación o un fármaco seleccionado del grupo que consiste en agentes que dañan el ADN, antraciclinas, inhibidores de topoisomerasa I e inhibidores de PARP. El método comprende (a) detectar un número de reordenamientos (por ejemplo, LST) en el ADN genómico de una muestra tumoral obtenida de dicho paciente, en donde el número de reordenamientos corresponde al número (por ejemplo, por genoma) de puntos de rotura que dan como resultado segmentos de al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 megabases, y (b) diagnosticar al paciente como susceptible de responder al régimen de tratamiento contra el cáncer.
En otro aspecto, la presente invención presenta un método para diagnosticar que un paciente tiene células cancerosas que tienen un reordenamiento (por ejemplo, una LST) en el ADN genómico de una muestra tumoral. El método comprende (a) detectar un número de reordenamientos (por ejemplo, LST) en el ADN genómico de una muestra tumoral obtenida de dicho paciente, en donde el número de reordenamientos corresponde al número (por ejemplo, por genoma) de puntos de rotura que dan como resultado segmentos de al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 megabases, y (b) diagnosticar que el paciente tiene células cancerosas con el reordenamiento en el ADN genómico de una muestra tumoral.
En otro aspecto, la presente invención presenta un método para diagnosticar que un paciente tiene células cancerosas con un estado de deficiencia en la RH. El método comprende (a) determinar que el paciente comprende una o más células cancerosas que tienen el estado de deficiencia en la RH, en donde la presencia de más de un número de referencia de reordenamientos (por ejemplo, LST) en el ADN genómico de la muestra tumoral indica que las células cancerosas tienen el estado de deficiencia en la RH, y (b) diagnosticar que el paciente tiene células cancerosas con el estado de deficiencia en la RH.
La presente invención presenta un método para diagnosticar que un paciente tiene células cancerosas con una mutación genética dentro de un gen de una ruta de la RH. El método comprende (a) determinar que el paciente comprende una o más células cancerosas que tienen la mutación genética, detectar una serie de reordenamientos (por ejemplo, LST) en el ADN genómico de una muestra tumoral obtenida de dicho paciente, en donde la presencia de más de un número de referencia de reordenamientos en el ADN genómico de la muestra tumoral indica que las células cancerosas tienen el estado de deficiencia en la RH, y (b) diagnosticar que el paciente tiene células cancerosas con la mutación genética.
En otro aspecto, la presente invención presenta un método para diagnosticar a un paciente como candidato para un régimen de tratamiento contra el cáncer que comprende un inhibidor de PARP y/o un agente alquilante. El método comprende (a) determinar que el paciente comprende una o más células cancerosas que tienen la mutación genética, detectar una serie de reordenamientos (por ejemplo, LST) en el ADN genómico de una muestra tumoral obtenida de dicho paciente, en donde la presencia de más de un número de referencia de reordenamientos en el ADN genómico de la muestra tumoral indica que las células cancerosas tienen el estado de deficiencia en la RH, y (b) diagnosticar, basándose al menos en parte en la presencia del reordenamiento de ADN genómico, el paciente como probable que responda al régimen de tratamiento contra el cáncer.
La divulgación se relaciona con un inhibidor de PARP y/o un agente alquilante para su uso en un método para tratar el cáncer en un paciente en donde dicho cáncer está relacionado con una deficiencia en la ruta de la RH y en donde dicho método comprende la etapa que consiste en predecir la deficiencia en el ruta de la RH como se describe anteriormente. El método comprende determinar, en una célula cancerosa del paciente con cáncer, el número de reordenamientos (por ejemplo, LST) en al menos un par de cromosomas humanos de una célula cancerosa, en donde el número de reordenamientos corresponde al número (por ejemplo, por genoma) de puntos de rotura que dan como resultado segmentos de al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 megabases; y correlacionar el número total que es mayor que un número de referencia con una mayor probabilidad de que el paciente con cáncer responda al régimen de tratamiento contra el cáncer. En algunas realizaciones, los pacientes son pacientes sin tratamiento previo. Un agente que daña el ADN puede ser un fármaco de quimioterapia a base de platino, una antraciclina puede ser epirrubincina o doxorrubicina, un inhibidor de la topoisomerasa I puede ser la campotecina, topotecán o irinotecán, el inhibidor de PARP puede ser iniparib, olaparib o velapirib.
La invención también se refiere a un método para predecir la eficacia de un tratamiento en un paciente que padece cáncer, en donde dicho tratamiento comprende un inhibidor de PARP y/o un agente alquilante, y en donde dicho método comprende la etapa que consiste en predecir la deficiencia en la ruta de la RH como se describe anteriormente. El método comprende determinar, en una o más células cancerosas del paciente con cáncer, el número de reordenamientos (por ejemplo, LST) en al menos un par de cromosomas humanos de una célula cancerosa, en donde el número de reordenamientos corresponde al número (por ejemplo, por genoma) de puntos de rotura que dan como resultado segmentos de al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 megabases; y correlacionar el número total que es mayor que un número de referencia con una mayor probabilidad de que el paciente con cáncer responda al régimen de tratamiento contra el cáncer. Un agente que daña el ADN puede ser un fármaco de quimioterapia a base de platino, una antraciclina puede ser epirrubincina o doxorrubicina, un inhibidor de la topoisomerasa I puede ser la campotecina, topotecán o irinotecán. El inhibidor de PARP puede ser iniparib, olaparib o velapirib. En algunas realizaciones, los pacientes son pacientes sin tratamiento previo.
En otro aspecto, esta divulgación presenta el uso de una pluralidad de oligonucleótidos capaces de hibridar con una pluralidad de regiones polimórficas de ADN genómico humano en una célula cancerosa, la fabricación de un kit de diagnóstico útil para determinar el número total de reordenamientos (por ejemplo, LST) en al menos un par de cromosomas humanos, en donde el número de reordenamientos corresponde al número (por ejemplo, por genoma) de puntos de rotura que dan como resultado segmentos de al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 megabases; y para detectar (a) una mayor probabilidad de una deficiencia en el gen BRCA1 o BRCA2 en la célula cancerosa, (b) una mayor probabilidad de una deficiencia en la RH en la célula cancerosa o (c) una mayor probabilidad de que un paciente con cáncer responda al régimen de tratamiento contra el cáncer que comprende un agente que daña el ADN, una antraciclina, un inhibidor de la topoisomerasa I, radiación o un inhibidor de PARP. La célula cancerosa puede ser una célula de cáncer de ovario o de mama.
En otro aspecto, la divulgación proporciona un producto del programa informático incorporado en un medio legible por ordenador que, cuando se ejecuta en un ordenador, proporciona instrucciones para detectar la presencia o ausencia de reordenamientos (por ejemplo, LST) en el ADN genómico de una muestra tumoral obtenida de un paciente, en donde el número de reordenamientos corresponde al número (por ejemplo, por genoma) de puntos de rotura que dan como resultado segmentos de al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 megabases. El producto del programa informático puede incluir otras instrucciones. La célula cancerosa puede ser una célula de cáncer de ovario, de mama o de esófago. El agente que daña el ADN puede ser un fármaco de quimioterapia a base de platino, la antraciclina puede ser epirrubincina o doxorrubicina, el inhibidor de la topoisomerasa I puede ser campotecina, topotecán o irinotecán, o el inhibidor de PARP puede ser iniparib, olaparib o velapirib.
En otro aspecto, la divulgación presenta un sistema para determinar el número de reordenamientos (por ejemplo, LST) en el ADN genómico de una muestra tumoral obtenida de dicho paciente, en donde el número de reordenamientos corresponde al número (por ejemplo, por genoma) de puntos de rotura que dan como resultado segmentos de al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 megabases. El sistema comprende, o consiste de manera esencial en, (a) un analizador de muestras configurado para producir una pluralidad de señales sobre el ADN genómico de al menos un par de cromosomas humanos de la célula cancerosa y (b) un subsistema informático programado para calcular, basándose en la pluralidad de señales, el número de reordenamientos en el ADN genómico de una muestra tumoral. El subsistema informático se puede programar para comparar el número de reordenamientos en el ADN genómico de una muestra tumoral con un número de referencia para determinar (a) la probabilidad de una deficiencia en los genes BRCA1 y/o BRCA2 en la célula cancerosa, (b) la probabilidad de una deficiencia en la RH en la célula cancerosa o (c) la probabilidad de que el paciente con cáncer responda al régimen de tratamiento contra el cáncer que comprende un agente que daña el ADN, una antraciclina, un inhibidor de la topoisomerasa I, radiación o un inhibidor de PARP. El sistema puede comprender un módulo de salida configurado para mostrar la probabilidad de (a), (b) o (c). El sistema puede comprender un módulo de salida configurado para mostrar una recomendación para el uso del régimen de tratamiento contra el cáncer. Las regiones indicadoras de reordenamiento se pueden determinar en al menos dos, cinco, diez o 21 pares de cromosomas humanos. La célula cancerosa puede ser una célula de cáncer de ovario, de mama, pulmón o de esófago. El agente que daña el ADN puede ser un fármaco de quimioterapia a base de platino, la antraciclina puede ser epirrubincina o doxorrubicina, el inhibidor de la topoisomerasa I puede ser campotecina, topotecán o irinotecán, o el inhibidor de PARP puede ser iniparib, olaparib o velapirib.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un kit de diagnóstico. El kit comprende, o consiste de manera esencial en, al menos 500 oligonucleótidos capaces de hibridar con una pluralidad de regiones polimórficas de ADN genómico humano; y un producto del programa informático proporcionado en el presente documento. El producto del programa informático se puede incorporar en un medio legible por ordenador que, cuando se ejecuta en un ordenador, proporciona instrucciones para detectar reordenamientos en el ADN genómico de una muestra tumoral obtenida de un paciente, en donde el número de reordenamientos corresponde al número (por ejemplo, por genoma) de puntos de rotura que dan como resultado segmentos de al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 megabases.
Descripción de las figuras
Figura 1. Contenido de cromosomas y estado de BRCA1 en BLC. A. La distribución del contenido cromosómico en el conjunto de BLC mostró dos modos, lo que evidencia 2 poblaciones de tumores con diferente estado de ploidía. B. Los tumores casi diploides (<50 cromosomas) y los tumores sobrediploides (>50 cromosomas) mostraron diferentes proporciones de tumores con BRCA1 inactivado comprobado. t S corresponde a no BRCA1.
Figura 2. Inestabilidad genómica en BLC sobrediploides según lo estimado por el número total de roturas y por LST. El número de LST discriminó claramente los BLC sin BRCAl de los BLC con inactivación comprobada de BRCA1 (valor de p <0,001, prueba de Wilcoxon). El número total de roturas fue significativamente menos diferente entre la comparación de no BRCAl frente a BRCA1 y meBRCA1 (valor de p <0,03, prueba de Wilcoxon) y no fue discriminatoria. BRCA1: mutación germinal de BRCA1; meBRCA1: metilación del promotor BRCA1; esporádico = no BRCAl: ausencia de evidencia de inactivación de BRCA1.
Figura 3. La ploidía tumoral y el número de transiciones a gran escala (LST) son discriminativos de la inactivación de BRCA1 en los conjuntos experimentales (izquierda) y de validación (derecha). Panel superior: el número de LST por tumor se indica en relación con las categorías de ploidía. Los valores de corte de casi diploides y casi tetraploides se indican mediante una barra. Los estados conocidos de BRCA1 y BRCA2 se indican para las mutaciones germinales ("BRCA1" y "BRCA2"), la metilación del promotor de BRCA1 ("meBRCA1") y las mutaciones en los tumores ("tumBRCA1"). Los tumores sin evidencia de inactivación de BRCA1/2 se denominan "no BRCA". Las pruebas exactas de Fisher se indican a continuación en las tablas de contingencia; BRCA1 se refiere a todos los BLC con BRCA1 inactivados probados, no BRCAl se refiere a BLC sin evidencia de inactivación de BRCA1.
Figura 4. Evaluaciones genómicas y funcionales de BRCAness en estirpes celulares de tipo basal. A. Las estirpes celulares con fenotipo de tipo basal muestran características discriminatorias de BRCAness similares a los BLC primarios. El estado conocido de BRCA1 y BRCA2 se indica para las mutaciones germinales ("BRCA1" y "BRCA2") y la metilación del promotor de BRCA1 ("meBRCA1"). Las estirpes celulares sin evidencia de inactivación de BRCA1/2 se describen como "no BRCA1/2". B. La formación de focos RAD51 8 horas después de la irradiación con 10 Gy ilustra la recombinación homóloga (RH) activa en estirpes celulares que no BRCAl y, a la inversa, la RH deficiente en estirpes celulares con BRCA1 o BRCA2 mutados. Los focos de 53BP1 en el mismo experimento se muestran como un control para la respuesta al daño del ADN. Barras de escala, 20 pm). Se indica el número de LST y el estado de BRCA1/2: mut, mutado; me, metilación del promotor; ts, tipo silvestre.
Figura 5. Curvas de supervivencia para tumores de ovario con LST_elevadas y LST_bajas. El valor de p se estimó mediante la estadística de la prueba de rangos logarítmicos.
Figura 6. Curvas de supervivencia sin acontecimientos para tumores de ovario con LST elevadas y LST bajas. El valor de p se estimó mediante la estadística de la prueba de rangos logarítmicos.
Figura 7. LST_10 Mb en estirpes celulares tumorales. Se indica la ploidía calculada (pseudodiploide 2 N, pseudotetraploide 4 N). Triángulo: estado de BRCA1/2 de tipo silvestre o desconocido; cuadrado: estirpes celulares mutadas en BRCA2.
Figura 8. Diagrama de flujo computacional. Se ilustra un diagrama de flujo de un proceso computacional ilustrativo para identificar reordenamientos de ADN genómico.
Figura 9. Diagrama de flujo del proceso. Se ilustra un diagrama de flujo de un proceso ilustrativo para evaluar el genoma de una célula (por ejemplo, una célula cancerosa) para un reordenamiento de ADN genómico.
Figura 10. Diagrama de un dispositivo informático. Se ilustra un diagrama de un ejemplo de un dispositivo informático y un dispositivo informático móvil que se pueden utilizar para implementar las técnicas descritas en el presente documento.
Figura 11. Distribución del número de LST en la cohorte de descubrimiento. Se ilustra un diagrama que muestra la distribución numérica en una cohorte de descubrimiento de 456 carcinomas de mama (399 tumores luminales y 57 con amplificación de HER2). El eje X corresponde al número de LST detectadas en el perfil genómico del tumor. El eje Y corresponde al número de casos. La flecha corresponde al corte entre los casos que sin DRH y con DRH como se definió previamente en TNBC. Figura 11A. 317 tumores casi diploides. Figura 11b .
139 tumores casi tetraploides.
Figura 12. Estado del tumor para evaluación de la DRH. Se ilustran cuatro ejemplos de tumores con mutaciones germinales en BRCA2 aclaradas por el estado de LST en los que se muestra el contorno del perfil genómico con el número de LST correspondiente. De arriba a abajo, (i) un caso con estado LSTelevada, estado de retención de heterocigosidad (RDH) de BRCA2 en el tumor y una mutación somática perjudicial del segundo alelo en BRCA2; (ii) un caso con estado LSTelevada, RDH de BRCA2, sin mutación somática en BRCA2 y metilación del promotor de RAD51C (se muestra el perfil de pirosecuenciación); (iii) un caso con estado LSTbaja, RDH en el locus BRCA2 y no se encontró ninguna mutación adicional; (iv) un caso con estado LSTbaja, pérdida de heterocigosidad (PDH) del locus BRCA2 y la pérdida del alelo mutado (se muestra el electroforegrama).
Descripción detallada de la invención
Métodos para predecir una deficiencia en la ruta de recombinación homologa del ADN
En un aspecto, la invención se refiere a un método para detectar deficiencia en la ruta de recombinación homóloga (RH) del ADN en un paciente que padece cáncer, que comprende cuantificar el número de reordenamientos (por ejemplo, LST) en el ADN genómico de una muestra tumoral obtenida de dicho paciente, en donde el número de reordenamientos corresponde al número (por ejemplo, por genoma) de puntos de rotura que dan como resultado segmentos de al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 megabases.
Un reordenamiento puede ser una transición a gran escala (LST). Una LST se refiere a cualquier transición del número de copias somáticas (por ejemplo, punto de rotura) a lo largo de un cromosoma que se encuentra entre dos regiones de al menos una longitud mínima (por ejemplo, al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 o más megabases) después de filtrar regiones más cortas que una longitud máxima ( por ejemplo, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4 o más megabases). Por ejemplo, si después de filtrar regiones de menos de 3 megabases, la célula somática tiene un número de copias de 1:1 para, por ejemplo, al menos 10 megabases y después una transición de punto de rotura a una región de, por ejemplo, al menos 10 megabases con número de copias de 2:2, se trata de una LST. Una forma alternativa de definir el mismo fenómeno es como una región LST, que es una región genómica con un número de
4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 megabases) limitada por puntos de rotura (por ejemplo, transiciones) donde el número de copias cambia para otra región también de al menos esta longitud mínima. Por ejemplo, si después de filtrar regiones de menos de 3 megabases, la célula somática tiene una región de al menos 10 megabases con un número de copias de 1:1 limitada en un lado por una transición de punto de rotura a una región de, por ejemplo, al menos 10 megabases con número de copias de 2:2, y limitada en el otro lado por una transición de punto de rotura a una región de, por ejemplo, al menos 10 megabases con un número de copias de 1:2, entonces se trata dos LST. Hay que tener en cuenta que esto es más amplio que el desequilibrio alélico porque dicho cambio en el número de copias no se consideraría desequilibrio alélico (porque las proporciones de copias 1:1 y 2:2 son las mismas, por ejemplo, no hay cambios en la proporción de copias). LST y su uso para determinar la DRH se describen en detalle en Popova etal., Ploidy and large-scale genomic instability consistently identify basal-like breast carcinomas with BRCA1/2 inactivation, CANCER RES. (2012) 72:5454-5462.
Normalmente, el método de la invención comprende la etapa de comparar el número de reordenamientos (por ejemplo, por genoma) con una referencia, en donde un número de reordenamientos (por ejemplo, por genoma) mayor que dicha referencia es indicativo de deficiencia en la RH.
Como se utiliza en el presente documento, el término "paciente" indica un mamífero, tal como un roedor, un felino, un canino, un bovino, un equino, una oveja, un porcino o un primate. Preferentemente, un paciente de acuerdo con la invención es un ser humano.
Los inventores han inventado métodos, sistemas, etc. para detectar la deficiencia en BRCA, la deficiencia en la RH, la probabilidad de respuesta al tratamiento, etc. en pacientes cuyas células (por ejemplo, células tumorales) tienen un genoma que contiene un mayor número de puntos de rotura que las células o tumores de pacientes de control (por ejemplo, pacientes que padecen cánceres que no albergan dicha deficiencia en BRCA, la deficiencia en la RH, etc.).
De manera más específica, los inventores han demostrado que los puntos de rotura en cuestión son aquellos que dan como resultado segmentos de ADN genómico de al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 megabases (a menudo denominados en el presente documento "transiciones a gran escala" o "LST"). De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, los puntos de rotura que dan como resultado segmentos más pequeños no se tienen en cuenta. En algunas realizaciones, la ubicación de los puntos de rotura a lo largo del genoma no es importante en la detección y los puntos de rotura con la concentración local no se correlacionan con el estado de recombinación homóloga. En dichas realizaciones, es el número de puntos de rotura en todo el genoma el que se puede utilizar para detectar la deficiencia en la RH.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "ruta de recombinación homóloga (RH) de ADN" tiene su significado general en la materia. Se refiere a la ruta celular a través de la cual se reparan las roturas de ADN bicatenario (RBC) mediante un mecanismo llamado recombinación homóloga. Dentro de las células de mamífero, el ADN está continuamente expuesto a daños que surgen de fuentes exógenas, tales como la radiación ionizante, o de fuentes endógenas, tales como los subproductos de la replicación celular. Todos los organismos han desarrollado diferentes estrategias para hacer frente a estas lesiones. Una de las formas más perjudiciales de daño en el ADN es la RBC. En células de mamífero, hay dos rutas principales para reparar RBC: la recombinación homóloga (RH) y unión de extremos no homólogos (UENH). La RH es el mecanismo más preciso para reparar RBC porque utiliza una copia inalterada del ADN de la cromátida hermana o el cromosoma homólogo como matriz para reparar la rotura.
Las células (por ejemplo, células cancerosas) identificadas con reordenamientos de ADN genómico (porejemplo, LST) de acuerdo con la presente divulgación se pueden clasificar como que tienen una mayor probabilidad de tener una deficiencia en la r H y/o que tienen una mayor probabilidad de tener un estado deficiente en uno o más genes en la ruta de la RH. Por ejemplo, las células cancerosas identificadas con un aumento de reordenamientos de ADN genómico se pueden clasificar como que tienen una mayor probabilidad de tener un estado deficiente en la RH. En algunos casos, las células cancerosas identificadas con un aumento de reordenamientos de ADN genómico se pueden clasificar como que tienen una mayor probabilidad de tener un estado deficiente para uno o más genes en la ruta de la RH. Como se utiliza en el presente documento, estado deficiente de un gen significa la secuencia, estructura, expresión y/o actividad del gen o su producto es/son deficiente(s) en comparación con lo normal. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, baja o nula expresión de ARNm o proteína, mutaciones perjudiciales, hipermetilación, actividad atenuada (por ejemplo, actividad enzimática, capacidad de unirse a otra biomolécula), etc. Como se utiliza en el presente documento, el estado deficiente para una ruta (por ejemplo, la ruta de la RH) significa que al menos un gen en esa ruta (por ejemplo, BRCA1) tiene un estado deficiente. Los ejemplos de mutaciones altamente perjudiciales incluyen mutaciones de cambio de marco, mutaciones del codón de parada y mutaciones que conducen a cortes y empalmes de ARN alterados. El estado deficiente en un gen en la ruta de la RH puede dar como resultado una actividad de la RH deficiente o reducida en las células (por ejemplo, células cancerosas).
Los ejemplos de genes en la ruta de la RH incluyen, sin limitación, los genes enumerados en la tabla 1, y BRCA1, BRCA2, PALB2/FANCN, BRIP1/FANCJ, BARD1, RAD51 y parálogos de RAD51 (RAD51B, RAD51C, RAD51D, XRCC2 y XRCC3) son proteínas que son importantes para la reparación de roturas de ADN bicatenario por la ruta de la RH. Cuando el gen de cualquiera de dichas proteínas es, por ejemplo, mutado o subexpresado, el cambio puede conducir a errores en la reparación del ADN que eventualmente pueden provocar cáncer. Aunque todavía no se han encontrado mutados de forma recurrente en tumores humanos, otros genes de la ruta de la RH pueden estar potencialmente desregulados en los cánceres, tales como FANCA, FANCB, FANCC, FANCD2, FANCE, FANCG, FANCI, FANCL, FANCM, FAN1, SLX4/FANCP o ERCC1.
Tabla 1. Genes seleccionados de la ruta de la RH
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continuación
Figure imgf000008_0001
Los ejemplos de mutaciones genéticas que pueden estar presentes dentro de un gen de la ruta de la RH incluyen, sin limitación, los enumerados en la tabla 2.
Tabla 2. Posibles mutaciones enéticas dentro de enes seleccionados de la ruta de la RH.
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Por lo tanto, la expresión "deficiencia en la ruta de la RH", como se utiliza en el presente documento, se refiere a una condición en la que una o más de las proteínas implicadas en la ruta de la RH para reparar el ADN es deficiente o está inactiva.
Las proteínas implicadas en la ruta de la RH pueden abarcar, pero sin limitación, la inactivación de al menos uno de los siguientes genes: BRCA1, BRCA2, PALP2/FANCN, BRIP1/FANCJ, BARD1, RAD51, parálogos de RAD51 (RAD51B, RAD51C, RAD51D, XRCC2 y XRCC3), FANCA, FANCB, FANCC, FANCD2, FANCE, FANCG, FANCI, FANCL, FANCM, FAN1, SLX4/FANCP y ERCC1, y los genes enumerados en las tablas 1 y 2.
A menos que se indique otra cosa, tal como se utiliza en el presente documento, las expresiones "deficiencia en la ruta de la RH" o "deficiencia tumoral en la ruta de la RH" se utilizan indistintamente. Es decir, en general, la invención se refiere a la detección de deficiencias en células tumorales y, por lo tanto, se debe suponer de manera automática que cualquier discusión se extiende a las células tumorales.
Como se utiliza en el presente documento, el término "inactivación", cuando se refiere a un gen, puede significar cualquier tipo de deficiencia de dicho gen. Esto incluye, pero sin limitación, mutaciones germinales en la secuencia codificante, mutaciones somáticas en la secuencia codificante, mutaciones en el promotor y metilación del promotor.
En una realización de la invención, la deficiencia en la ruta de la RH es una mutación en BRCA1. En la materia ya se han descrito varias mutaciones en BRCA1 y se sabe que están asociadas con determinados tipos de cáncer, tales como el cáncer de mama y de ovario55. En otra realización de la invención, la deficiencia en la ruta de la RH es una mutación en BRCA256. En aún otra realización de la invención, la deficiencia en la ruta de la RH es una hipermetilación del promotor BRCA157.
Como se utiliza en el presente documento, el término "cáncer" tiene su significado general en la materia. Se refiere a la afección patológica en los mamíferos que se caracteriza por un crecimiento celular no regulado.
Los ejemplos de cáncer pueden incluir, pero sin limitación, tumores sólidos o un carcinoma. Preferentemente, el tumor sólido se selecciona de cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer renal, melanoma maligno metastásico o invasivo, tumor cerebral, cáncer de vejiga, cáncer de cabeza y cuello, y cáncer de hígado. El carcinoma incluye de vejiga, mama, colon, riñón, hígado, pulmón, ovario, páncreas, estómago, cuello del útero, tiroides o carcinoma de piel, que incluye carcinoma epidermoide. Sin embargo, la presente invención también contempla tumores hematopoyéticos tales como leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de linfocitos B, linfoma de linfocitos T, linfoma de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin, linfoma de células pilosas, linfoma de Burkitt, leucemias mielógenas agudas y crónicas, y leucemia promielocítica.
En una realización, dicho cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de cabeza y cuello, y melanoma.
En una realización preferida, dicho cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de cuello del útero, cáncer de páncreas y cáncer de pulmón.
En una realización más preferida, dicho cáncer es un cáncer de mama. El cáncer de mama puede ser carcinoma de mama de tipo basal, luminal o con sobreexpresión de HER2.
La muestra tumoral adecuada para llevar a cabo el método de la invención puede ser cualquier muestra física de un paciente que contenga células cancerosas. Esto puede incluir, pero sin limitación, una biopsia obtenida del tejido u órgano enfermo (o incluso del órgano completo si dicho órgano se ha extirpado) del paciente que padece cáncer.
Cuantificación del número de reordenamientos
La etapa de cuantificar el número de reordenamientos (por ejemplo, LST) en el ADN genómico de una muestra se puede realizar mediante cualquier método adecuado en la materia.
Tal como se menciona anteriormente, los inventores han demostrado que los puntos de rotura en cuestión son aquellos que dan como resultado segmentos de ADN genómico de al menos 3 megabases. De hecho, los puntos de rotura preferidos comprendidos entre 9 y 11, aún más preferiblemente aproximadamente 10 megabases, se han descrito en los ejemplos a continuación, pero se obtuvieron resultados similares con valor de corte entre 3 megabases y 20 megabases. De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, los puntos de rotura que dan como resultado segmentos inferiores a estos puntos de corte no se tienen en cuenta.
El experto en la materia puede seleccionar fácilmente técnicas para cuantificar los reordenamientos genómicos (por ejemplo, LST) y filtrar los puntos de rotura que dan como resultado segmentos de ADN genómico de menos de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 megabases. En general, dichas técnicas medirán el número de copias en una pluralidad de loci a través del genoma para identificar las transiciones del número de copias entre regiones genómicas de un determinado tamaño (por ejemplo, LST). Los métodos adecuados para cuantificar los reordenamientos incluyen, pero sin limitación, los descritos en Le Scouarnec & Gribble, HEREDITY (2012) 108:75-85.
En algunas realizaciones, se puede utilizar un ensayo basado en matrices para cuantificar el número de copias y las LST en una muestra. Dichas matrices pueden comprender sondas de ácido nucleico capaces de detectar genotipos (por ejemplo, número de copias) en una pluralidad de loci genómicos. Dichos loci pueden ser loci polimórficos conocidos tales como polimorfismos mononucleotídico (SNP, del inglés "Single/Simple Nucleotide Polymorphisms"). En algunos casos, la matriz se puede configurar para su uso en hibridación genómica comparativa (HGC). Los ejemplos de matrices de SNP útiles de acuerdo con la invención incluyen la matriz de SNP 300K Illumina (Human Hap300-Duo) y la matriz Affymetrix SNPChip6.0. En el caso de la matriz Illumina, los datos sin procesar pueden procesarse (por ejemplo, señales específicas de alelo procesadas en la relación Log R y la frecuencia del alelo B) para su uso en la invención con el algoritmo tQN. En el caso de la matriz Affymetrix, los archivos de células se pueden procesar mediante Genotyping Console 3.0.2. Los perfiles Log2Ratio y Allele Difference resultaron del análisis del número de copias y de la PDH realizado con el archivo de modelo de referencia HapMap270 (GenomeWideSNP_6.hapmap270.na29) proporcionado por Affymetrix.
En algunas realizaciones, la etapa de cuantificar LST se lleva a cabo mediante técnicas de secuenciación, que incluyen, pero sin limitación, la secuenciación de próxima generación utilizando bibliotecas emparejadas o lecturas más largas. (58) Por ejemplo, el ADN genómico de una muestra de células (por ejemplo, una muestra de células cancerosas) se puede extraer y, opcionalmente, fragmentar. Se puede utilizar cualquier método adecuado para extraer y, opcionalmente, fragmentar el ácido nucleico genómico que incluye, sin limitación, kits comerciales tales como QIAamp™ DNA Mini Kit (Qiagen™), MagNA™ Pure DNA Isolation Kit (Roche Applied Science™) y GenElute™ Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit (Sigma-Aldrich™). Una vez extraído, se puede realizar una secuenciación dirigida o no dirigida para determinar los genotipos de la muestra (por ejemplo, el número de copias) en una pluralidad de loci. Por ejemplo, se puede realizar la secuenciación del genoma completo, del transcriptoma completo o del exoma completo para determinar los genotipos en millones o incluso en miles de millones de pares de bases (por ejemplo, los pares de bases pueden ser "loci" a evaluar).
En algunas realizaciones, la secuenciación dirigida de loci polimórficos conocidos (por ejemplo, SNP y secuencias circundantes) se puede realizar como alternativa al análisis de micromatrices. Por ejemplo, el ADN genómico se puede enriquecer para aquellos fragmentos que contienen un locus (por ejemplo, ubicación de SNP) para ser analizados con kits diseñados para este fin (por ejemplo, Agilent SureSelect™, Illumina TruSeq Capture™ y Nimblegen SeqCap EZ Choice™). Por ejemplo, el a Dn genómico que contiene los loci a analizar se puede hibridar con fragmentos de ARN de captura biotinilados para formar complejos de ARN biotinilado y ADN genómico. Como alternativa, pueden utilizarse sondas de captura de ADN dando como resultado la formación de híbridos de ADN biotinilado y ADN genómico. Se pueden utilizar perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina y una fuerza magnética para separar los complejos de ARN biotinilado y ADN genómico de aquellos fragmentos de a Dn genómico que no están presentes en un complejo de ARN biotinilado y ADN genómico. Los complejos de ARN biotinilado y ADN genómico obtenidos se pueden tratar para eliminar el ARN capturado de las perlas magnéticas, dejando así fragmentos de ADN genómico inalterados que contienen un locus a analizar. Estos fragmentos de ADN genómico inalterado que contienen los loci a analizar se pueden amplificar utilizando, por ejemplo, técnicas de PCR. Los fragmentos de a Dn genómico amplificado se pueden secuenciar utilizando una tecnología de secuenciación de alto rendimiento o una tecnología de secuenciación de próxima generación tal como Illumina HiSeq™, Illumina MiSeq™, Life Technologies SoLID™ o Ion Torrent™, o Roche 454™.
También se pueden utilizar técnicas informáticas para determinar la presencia de reordenamientos de ADN genómico (por ejemplo, LST). Por ejemplo, se pueden utilizar algoritmos tales como los descritos en otros lugares para detectar reordenamientos utilizando información de matrices de SNP (Nannya et al., Cáncer Res. (2005) 65:6071-6079 (2005)). Estos algoritmos a menudo no tienen en cuenta explícitamente la contaminación de las muestras tumorales con tejido benigno. Cf. Solicitud internacional publicada con la referencia WO2011/106541 de Abkevich et al.; Goransson et al., PLoS One (2009) 4(6):e6057. Esta contaminación suele ser lo suficientemente elevada como para dificultar la detección de reordenamientos. Los métodos analíticos mejorados de acuerdo con la presente invención para identificar reordenamientos, incluso a pesar de la contaminación, incluyen aquellos incorporados en productos de programas informáticos de ordenador como se describe a continuación.
En algunos casos, se puede utilizar un proceso de selección para seleccionar loci (por ejemplo, loci de SNP) para evaluarlos utilizando un ensayo configurado para identificar reordenamientos genómicos (por ejemplo, ensayos basados en matrices de SNP y ensayos basados en secuenciación). Por ejemplo, se puede seleccionar cualquier ubicación de SNP humano para su inclusión en un ensayo basado en matrices de SNP o un ensayo basado en secuenciación configurado para identificar reordenamientos genómicos dentro del genoma de las células. En algunos casos, se pueden evaluar 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,075, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5 millones o más de ubicaciones de SNP presentes en el genoma humano para medir el número de copias en todo el genoma, incluyendo en algunas realizaciones aquellos SNP que (a) no están presentes en el cromosoma Y, (b) no son SNP mitocondriales, (c) tienen una frecuencia de alelo menor de al menos aproximadamente el cinco por ciento en los caucásicos, (d) tienen una frecuencia de alelo menor de al menos aproximadamente el uno por ciento en tres razas que no sean caucásicas (por ejemplo, china, japonesa y yoruba) y/o (e) no tienen una desviación significativa del equilibrio de Hardy Weinberg en ninguna de las cuatro razas. En algunos casos, se pueden seleccionar más de 100.000, 150.000 o 200.000 SNP humanos que cumplen los criterios (a) a (e). De los SNP humanos que cumplen los criterios (a) a (e), un grupo de SNP (por ejemplo, los 100.000 SNP principales) se pueden seleccionar de modo que los SNP tengan un grado elevado de frecuencia alélica en una población de interés (por ejemplo, caucásicos), cubran el genoma humano de manera relativamente uniforme (por ejemplo, al menos un s Np cada aproximadamente 25 kb a aproximadamente 500 kb) y no estén en desequilibrio de enlace con otro SNP seleccionado en la población en cuestión. En algunos casos, se pueden seleccionar aproximadamente 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130 mil o más SNP (por ejemplo, esta cantidad de SNP según estos criterios) e incluirlos en un ensayo configurado para identificar reordenamientos genómicos en un genoma humano. Por ejemplo, se pueden seleccionar entre aproximadamente 70.000 y aproximadamente 90.000 (por ejemplo, aproximadamente 80.000) SNP para el análisis con un ensayo basado en matrices de SNP, y se pueden seleccionar entre aproximadamente 45.000 y aproximadamente 55.000 (por ejemplo, aproximadamente 54.000) SNP para el análisis con un ensayo basado en secuenciación.
Tal como se describe en el presente documento, se puede evaluar una muestra celular para determinar si el genoma de las células de la muestra contiene un reordenamiento de ADN genómico (por ejemplo, LST). Se puede evaluar cualquier tipo de muestra adecuado. Por ejemplo, se puede evaluar una muestra que contiene células cancerosas para determinar si el genoma de las células cancerosas contiene un reordenamiento de ADN genómico. Los ejemplos de muestras que contienen células cancerosas que se pueden evaluar como se describe en el presente documento incluyen, sin limitación, muestras de biopsia de tumores (por ejemplo, muestras de biopsia de tumor de mama), muestras de tejido fijadas en formalina e incluidas en parafina (FFPE, del inglés "formalin-fixed, paraffin-embedded") que contienen células cancerosas, biopsias con aguja gruesa, aspirados con aguja fina y muestras que contienen células cancerosas desprendidas de un tumor (por ejemplo, sangre, orina u otros líquidos corporales). Para las muestras de tejido fijadas en formalina e incluidas en parafina, la muestra se puede preparar mediante extracción de ADN utilizando un kit de extracción de ADN genómico optimizado para tejido FFPE, incluidos, pero sin limitación, los descritos anteriormente (por ejemplo, QuickExtract™ FFPE DNA Extraction Kit (Epicentre™) y QIAamp™ DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen™)).
En algunos casos, las técnicas de disección con láser se pueden realizar en una muestra de tejido para minimizar el número de células no cancerosas dentro de una muestra de células cancerosas a evaluar. En algunos casos, se pueden utilizar métodos de purificación basados en anticuerpos para enriquecer las células cancerosas y/o eliminar las células no cancerosas. Los ejemplos de anticuerpos que se podrían utilizar para el enriquecimiento de células cancerosas incluyen, sin limitación, anti-EpCAM, anti-TROP-2, anti-c-Met, proteína de unión antifolato, anti-N-cadherina, anti-CD318, antígeno de células madre anti-antimesencemal, anti-Her2, anti-MUCl, anti-EGFR, anticitoqueratinas (por ejemplo, la citoqueratina 7, la citoqueratina 20, etc.), anticaveolina-1, anti-PSA, anti-CA125 y anticuerpos antiproteína tensioactiva.
Cualquier tipo de célula cancerosa se puede evaluar utilizando los métodos y materiales descritos en el presente documento. Por ejemplo, células de cáncer de mama, células de cáncer de ovario, células de cáncer de hígado, células de cáncer de esófago, células de cáncer de pulmón, células de cáncer de cabeza y cuello, células de cáncer de próstata, las células de cáncer de colon, rectal o colorrectal y las células de cáncer de páncreas se pueden evaluar para determinar si el genoma de las células cancerosas tiene un reordenamiento de ADN genómico. En algunas realizaciones, las células cancerosas son células cancerosas primarias o metastásicas de cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de pulmón o cáncer de esófago.
Cuando se evalúa el genoma de las células cancerosas para un reordenamiento genómico (por ejemplo, un LST), se pueden evaluar uno o más (por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22 o 23) pares de cromosomas. En algunos casos, el genoma de las células cancerosas se evalúa para un reordenamiento genómico utilizando uno o más (por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23) pares de cromosomas.
En algunos casos, puede ser útil excluir determinados cromosomas de este análisis. Por ejemplo, en el caso de las hembras, un par a evaluar puede incluir el par de cromosomas sexuales X; mientras que, en el caso de los machos, se puede evaluar un par de cualquier cromosoma autosómico (por ejemplo, cualquier par que no sea el par de cromosomas sexuales X e Y).
En algunas realizaciones, un número de referencia (por ejemplo, número de referencia de LST) procede previamente de una población de referencia en cuestión. Dichas poblaciones de referencia pueden incluir pacientes (a) con el mismo cáncer que el paciente que se está analizando, (b) con el mismo subtipo de cáncer, (c) con un cáncer que tenga características genéticas u otras características clínicas o moleculares similares, (d) que respondieron a un tratamiento en particular, (e) que no respondieron a un tratamiento en particular, (f) que aparentemente están sanos (por ejemplo, no tienen cáncer o al menos no tienen el cáncer del paciente examinado), etc. El número de referencia (o longitud, valor o puntuación) puede ser (a) representativo del número (o valor o puntuación) encontrado en la población de referencia en su conjunto, (b) un promedio (media, mediana, etc.) del número (valor o puntuación) encontrado en la población de referencia en su conjunto o en una subpoblación particular, (c) representativo del número (valor o puntuación) (por ejemplo, un promedio tal como la media o la mediana) encontrado en los terciles, cuartiles, quintiles, etc. de la población de referencia clasificada por (i) su número respectivo (valor o puntuación) o (ii) la característica clínica que se encontró que tenían (por ejemplo, fuerza de respuesta, pronóstico (incluido el tiempo hasta la muerte específica por cáncer), etc.).
Evaluación de la ploidía
En una realización, el método de la invención comprende además una etapa en donde se evalúa la ploidía de la muestra tumoral además de determinar la presencia de LST, para la evaluación de la RH.
Como se utiliza en el presente documento, el término "ploidía" tiene su significado entendido en la materia. Se refiere al número medio de copias de cada locus en el genoma.
Normalmente, una célula sana (y, por lo tanto, una muestra de tejido sano) es diploide, por ejemplo, contiene dos copias/dos alelos de cada locus. Determinados tipos de cáncer pueden presentar la duplicación del genoma completo durante la progresión del cáncer, lo que da como resultado células tumorales sobrediploides (tetraploides o más) (Ref 40). Por lo tanto, las muestras tumorales se pueden dividir en tumores diploides o tumores casi diploides por un lado y tumores sobrediploides por el otro.
Los inventores han detectado genomas tumorales casi diploides en más del 75 % de los casos con inactivación de BRCA1 (por mutación o por metilación del promotor). Por lo tanto, los métodos, sistemas, etc. de la invención se pueden utilizar para detectar la deficiencia en la RH en tumores que se ha encontrado que son diploides o casi diploides (por ejemplo, en carcinoma de mama de grado elevado).
Normalmente, un tumor o célula tumoral se considera "diploide o casi diploide" si el genoma de dicho tumor o célula porta en promedio menos de 50 cromosomas y/o si tiene un índice de ADN cercano a 1. Normalmente, un tumor o célula tumoral se considera "sobrediploide" si su genoma porta más de o igual a 50 cromosomas y/o tiene un índice de ADN superior a 1,2.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "índice de ADN" representa la relación entre el contenido de ADN de la célula tumoral y el contenido de ADN de una célula normal.
El experto en la materia puede evaluar la ploidía de una muestra tumoral de acuerdo con cualquier técnica convencional en la materia. Las técnicas adecuadas para evaluar la ploidía pueden incluir, pero sin limitación, medir la cantidad de ADN por célula, por ejemplo, mediante la clasificación de células activadas por fluorescencia. En esta técnica, el ADN se marca mediante la incorporación de un agente intercalante tal como el bromuro de etidio o DAPI. A continuación, las células se clasifican de acuerdo con la intensidad de la fluorescencia, que es proporcional a la cantidad de ADN en cada célula.
Una técnica adecuada para evaluar la ploidía también puede incluir el cariotipado. Los cariotipos convencionales se pueden obtener mediante la tinción de los cromosomas (con colorantes tales como Giemsa) y el recuento del número de cromosomas de cada tipo en una célula.
Una técnica adecuada para evaluar la ploidía también puede incluir el cariotipado virtual utilizando matrices tales como la matriz de HGC o la matriz de polimorfismo mononucleotídico (matriz de SNP). Las matrices en sí mismas pueden ser de todo el genoma (sondas distribuidas por todo el genoma) o dirigidas (sondas para regiones genómicas que se sabe que están implicadas en una enfermedad específica) o una combinación de ambas. Asimismo, las matrices utilizadas para el cariotipado pueden utilizar sondas no polimórficas, sondas polimórficas (por ejemplo, que contienen SNP) o una combinación de ambas. Las sondas no polimórficas solo pueden proporcionar información del número de copias, mientras que las matrices de SNP pueden proporcionar tanto el número de copias como el estado de pérdida de heterocigosidad (PDH) en un ensayo. Las matrices de SNP de oligonucleótidos disponibles comercialmente pueden ser de fase sólida (Affymetrix, Santa Clara, CA, EE. UU.) o a base de perlas (Illumina, San Diego, CA, EE. UU.). A pesar de la diversidad de plataformas, en última instancia, se utiliza ADN genómico de células rotas para recrear un cariotipo de resolución elevada por ordenador. El producto final aún no tiene un nombre coherente y se ha denominado cariotipo virtual, cariotipo digital, alelocariotipo molecular y cariotipo molecular. Otros términos utilizados para describir las matrices utilizadas para el cariotipado incluyen SOMA (micromatrices de oligonucleótidos de SNP) y CMA (micromatrices de cromosomas). Una técnica adecuada para evaluar la ploidía también puede incluir la secuenciación de próxima generación. Están disponibles métodos de alto rendimiento para secuenciar el genoma o la región codificante completa. Los enfoques de secuenciación profunda del genoma completo o del exoma pueden, en algunas realizaciones, generar perfiles del número de copias y de desequilibrio alélico similares o incluso más precisos que las matrices de SNP.
De acuerdo con una realización de la invención, la etapa de evaluación de la ploidía de la muestra tumoral se realiza mediante una técnica seleccionada del grupo que consiste en FACS, cariotipado y matriz de SNP.
En una realización, tanto la etapa de evaluar la ploidía como la etapa de cuantificar el número de reordenamientos a gran escala se realizan mediante matriz de SNP.
En una realización preferida, tanto la etapa de evaluar la ploidía como la etapa de cuantificar el número de reordenamientos a gran escala se realizan mediante matriz de SNP, seguida de análisis por GAP.
La Genome Alteration Print (GAP) es una herramienta bioinformática desarrollada por Popova et al. (Biología del genoma, 2009, 10:R128) para la detección automática de números absolutos de copias segmentarias y del estado del genotipo en perfiles complejos del genoma del cáncer medidos con matrices de SNP. Este método funciona bien incluso con datos de mala calidad, bajo contenido tumoral y genomas tumorales muy reorganizados.
Comparaciones de reordenamientos
En una realización de la invención, el método comprende la etapa de comparar el número de reordenamientos (por ejemplo, LST) con una referencia y diagnosticar la deficiencia en la RH en una célula que tiene un número de reordenamientos que dan como resultado segmentos de al menos 3 megabases (o al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20) mayores que dicha referencia.
Normalmente, la referencia puede tener diferentes valores. Por lo tanto, en una realización preferida, el método comprende la etapa de comparar el número de reordenamientos (por ejemplo, LST) en el ADN genómico con una referencia, en donde dicha referencia tiene un primer valor (referencia 1) y en donde dicha referencia tiene un segundo valor (referencia 2).
Normalmente, la referencia 1 (según lo determinado utilizando segmentos de al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 megabases de tamaño, dependiendo el valor de referencia del tamaño del segmento elegido) puede ser de 15 transiciones a gran escala (LST) (por ejemplo, por genoma) o 16, 17, 18, 19 o 20 o más LST (por ejemplo, por genoma).
Normalmente, el valor de la referencia puede variar, dependiendo de cómo se defina el número de reordenamientos o LST. Por lo tanto, en una realización de la invención, la referencia 1 se define de la siguiente manera: si el número de LST se define como el número de reordenamientos que dan como resultado segmentos de al menos 6 megabases, la referencia puede ser de 17, 18 o 19; si el número de LST se define como el número de reordenamientos que dan como resultado segmentos de al menos 7 megabases, la referencia puede ser de 15, 16 o 17; si el número de LST se define como el número de reordenamientos que dan como resultado segmentos de al menos 8 megabases, la referencia puede ser de 14; si el número de LST se define como el número de reordenamientos que dan como resultado segmentos de al menos 9 megabases, la referencia puede ser de 11, 12, 13 o 14; si el número de LST se define como el número de reordenamientos que dan como resultado segmentos de al menos 10 megabases, la referencia puede ser de 11.
Normalmente, la referencia 2 (según lo determinado utilizando segmentos de más de 10 megabases, dependiendo el valor de referencia del tamaño del segmento elegido) puede ser de 20 transiciones a gran escala (LST) (por ejemplo, por genoma), preferentemente 21, incluso más preferentemente 22, 23, 24 o 25 LST (por ejemplo, por genoma).
Normalmente, el valor de la referencia 2 puede variar, dependiendo de cómo se defina el número de reordenamientos o LST. Por lo tanto, en una realización de la invención, la referencia 2 se define de la siguiente manera: si el número de LST se define como el número de reordenamientos que dan como resultado segmentos de al menos 6 megabases, la referencia puede ser de 32; si el número de LST se define como el número de reordenamientos que dan como resultado segmentos de al menos 7 megabases, la referencia puede ser de 27, 28 o 29; si el número de LST se define como el número de reordenamientos que dan como resultado segmentos de al menos 8 megabases, la referencia puede ser de 26; si el número de LST se define como el número de reordenamientos que dan como resultado segmentos de al menos 9 megabases, la referencia puede ser de 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25; si el número de LST se define como el número de reordenamientos que dan como resultado segmentos de al menos 10 megabases, la referencia puede ser de 18, 19, 20, 21,22.
Las referencias óptimas pueden depender del tamaño de las LST para llegar a una especificidad y sensibilidad óptimas de acuerdo con el tipo de tumor. Por ejemplo, las referencias óptimas para el carcinoma de mama pueden incluir 7/17/29, 8/14/26, 9/14/29 o 10/11/22, mientras que la referencia óptima en el carcinoma de ovario puede incluir 6/19/32 o 7/17/29 (número de LST/referencia 1/referencia 2).
De hecho, los inventores han desarrollado un proceso de 2 etapas para detectar la deficiencia en la RH mediante la clasificación de los pacientes de acuerdo con el número de transiciones a gran escala en el genoma del tumor (u opcionalmente de acuerdo con la ploidía del tumor).
Por lo tanto, la invención se refiere a un método que comprende las etapas de: determinar la ploidía del tumor; y comparar el número de reordenamientos (por ejemplo, LST) con una referencia, en donde un número de reordenamientos que dan como resultado segmentos de al menos 3 megabases superiores a dicha referencia es indicativo de deficiencia en la RH.
De manera ventajosa, el método de acuerdo con la invención es capaz de detectar deficiencia en la ruta de la RH con buena especificidad (pocos falsos positivos) y buena sensibilidad (pocos falsos negativos).
Métodos para predecir la eficacia de un tratamiento y métodos de tratamiento
El método descrito anteriormente tiene varias aplicaciones clínicas importantes y directas.
En primer lugar, el perfil genómico tumoral ahora se puede utilizar como criterio para pruebas y consejos genéticos. Esto es especialmente importante en ausencia de un contexto familiar de predisposición tumoral, una situación que se encuentra en hasta la mitad de los pacientes portadores de mutaciones53.
En segundo lugar, con la perspectiva terapéutica emergente que explota los defectos de la RH mediante el direccionamiento de rutas complementarias (por ejemplo, inhibidores de PARP (PARPi, del inglés "PARP inhibitors")13 y agentes alquilantes, que provocan daño en el ADN), la cuestión de los marcadores predictivos eficaces de BRCAness o deficiencia en la RH se vuelve importante16. La eficacia decepcionante de PARPi en BLC/TNBC no seleccionados54 apoya la necesidad de estratificar mejor a los pacientes, que podría implementarse fácilmente utilizando este marcador basado en matrices de SNP.
Debido a que es posible predecir si un paciente determinado padece un cáncer asociado con una deficiencia en la ruta de la recombinación homóloga del ADN, también es posible seleccionar la terapia adecuada para dicho paciente.
Tal como se describe en el presente documento, los pacientes que tienen células cancerosas identificadas con un reordenamiento de ADN genómico (por ejemplo, LST) se pueden clasificar como susceptibles de responder a un régimen de tratamiento contra el cáncer particular. Por ejemplo, los pacientes que tienen células cancerosas con un genoma que contiene un reordenamiento de ADN genómico se pueden clasificar como susceptibles de responder a un régimen de tratamiento contra el cáncer que incluye el uso de un agente que daña el ADN, un agente letal sintético (por ejemplo, un inhibidor de PARP), radiación o una combinación de los mismos. Preferentemente, los pacientes son pacientes sin tratamiento previo. Los ejemplos de agentes que dañan el ADN incluyen, sin limitación, fármacos de quimioterapia a base de platino (por ejemplo, cisplatino, carboplatino, oxaliplatino y picoplatino), antraciclinas (por ejemplo, epirrubicina y doxorrubicina), inhibidores de la topoisomerasa I (por ejemplo, campotecina, topotecán e irinotecán), reticulantes de ADN tales como mitomicina C y compuestos de triazeno (por ejemplo, dacarbazina y temozolomida). Los enfoques terapéuticos sintéticos letales generalmente implican la administración de un agente que inhibe al menos un componente fundamental de una ruta biológica que es especialmente importante para la supervivencia de una célula tumoral en particular. Por ejemplo, cuando una célula tumoral tiene una ruta de reparación homóloga deficiente (por ejemplo, según se determina de acuerdo con la presente invención), los inhibidores de poli ADP ribosa polimerasa (o fármacos de platino, inhibidores de reparación de roturas bicatenarias, etc.) puede ser especialmente potentes contra tales tumores porque dos rutas fundamentales para la supervivencia se obstruyen (una de manera biológica, por ejemplo, mediante la mutación BRCA1, y la otra de manera sintética, por ejemplo, mediante la administración de un fármaco contra la ruta). Los enfoques sintéticos letales para la terapia contra el cáncer se describen en, por ejemplo, O'Brien et al., Converting cancer mutations into therapeutic opportunities, EMBO MOL. MED. (2009) 1:297-299. Los ejemplos de agentes sintéticos letales incluyen, sin limitación, inhibidores de PARP o inhibidores de reparación de roturas bicatenarias en células tumorales deficientes en reparación homóloga, inhibidores de PARP en células tumorales deficientes en PTEN, metotrexato en células tumorales deficientes en MSH2, etc. Los ejemplos de inhibidores de PARP incluyen, sin limitación, olaparib, iniparib y veliparib. Los ejemplos de inhibidores de reparación de roturas bicatenarias incluyen, sin limitación, KU55933 (inhibidor de ATM) y NU7441 (inhibidor de ADN-PKcs). Los ejemplos de información que se pueden utilizar además de un reordenamiento positivo de ADN genómico para basar una clasificación de probabilidad de responder a un régimen de tratamiento contra el cáncer en particular incluyen, sin limitación, resultados de tratamientos anteriores, mutaciones en el ADN somático o de la línea germinal, perfiles de expresión de genes o proteínas (por ejemplo, estado de ER/PR/HER2, niveles de PSA), histología del tumor (por ejemplo, adenocarcinoma, carcinoma epidermoide, carcinoma seroso papilar, carcinoma mucinoso, carcinoma ductal invasivo, carcinoma ductal in situ (no invasivo), etc.), estadio de la enfermedad, grado del tumor o del cáncer (por ejemplo, bien, moderadamente o mal diferenciado (por ejemplo, Gleason, Bloom Richardson modificado), etc.), número de ciclos de tratamiento previos, etc. La mayor probabilidad de responder puede referirse, por ejemplo, a una mayor probabilidad de respuesta en comparación con cualquier paciente/población de referencia, o una mayor probabilidad de respuesta en comparación con un paciente/población de referencia específico.
Una vez clasificado como probable que responda a un régimen de tratamiento contra el cáncer en particular (por ejemplo, un régimen de tratamiento contra el cáncer que incluye el uso de un agente que daña el ADN, un inhibidor de PARP, radiación o una combinación de los mismos), el paciente con cáncer se puede tratar con dicho régimen de tratamiento contra el cáncer. En algunas realizaciones, los pacientes son pacientes sin tratamiento previo. Cualquier método adecuado para tratar el cáncer en cuestión se puede utilizar para tratar a un paciente con cáncer identificado por tener células cancerosas que tienen un reordenamiento de ADN genómico. Por ejemplo, los fármacos de quimioterapia a base de platino o una combinación de fármacos de quimioterapia a base de platino se pueden utilizar para tratar el cáncer como se describe en otra parte (véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 3.892.790, 3.904.663, 7.759.510, 7.759.488 y 7.754.684. En algunos casos, las antraciclinas o una combinación de antraciclinas se pueden utilizar para tratar el cáncer como se describe en otra parte (véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 3.590.028, 4.138.480, 4.950.738, 6.087.340, 7.868.040 y 7.485.707. En algunos casos, los inhibidores de la topoisomerasa I o una combinación de inhibidores de la topoisomerasa I se pueden utilizar para tratar el cáncer como se describe en otra parte (véase, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 5.633.016 y 6.403.563. En algunos casos, Los inhibidores de PARP o una combinación de inhibidores de PARP se pueden utilizar para tratar el cáncer como se describe en otra parte (véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 5.177.075, 7.915.280 y 7.351.701. En algunos casos, la radiación se puede utilizar para tratar el cáncer como se describe en otra parte (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.295.944). En algunos casos, una combinación que comprende diferentes agentes (por ejemplo, una combinación que comprende cualquiera de los fármacos de quimioterapia basados en platino, antraciclinas, inhibidores de la topoisomerasa I y/o inhibidores de PARP) con o sin tratamientos de radiación se puede utilizar para tratar el cáncer. En algunos casos, un tratamiento combinado puede comprender cualquiera de los agentes o tratamientos anteriores (por ejemplo, un agente que daña el ADN, un inhibidor de PARP, radiación o una combinación de los mismos) junto con otro agente o tratamiento, por ejemplo, un agente taxano (por ejemplo, docetaxel, paclitaxel y abraxano), un factor de crecimiento o un inhibidor del receptor del factor de crecimiento (por ejemplo, erlotinib, gefitinib, lapatinib, sunitinib, bevacizumab, cetuximab, trastuzumab y panitumumab) y/o un antimetabolito (por ejemplo, 5-fluorouracilo y metotrexato).
En algunos casos, los pacientes identificados que tienen células cancerosas con un genoma que carece de un reordenamiento de ADN genómico (por ejemplo, LST) se pueden clasificar, basándose en al menos en parte en un estado de reordenamiento de ADN genómico negativo, como menos propensos a responder a un régimen de tratamiento que incluye un agente que daña el ADN, un inhibidor de PARP, radiación o una combinación de los mismos. A su vez, dicho paciente se puede clasificar como probable de responder a un régimen de tratamiento contra el cáncer que incluye el uso de uno o más agentes de tratamiento contra el cáncer no asociados con la RH, tales como un agente taxano (por ejemplo, docetaxel, paclitaxel y abraxano), un factor de crecimiento o un inhibidor del receptor del factor de crecimiento (por ejemplo, erlotinib, gefitinib, lapatinib, sunitinib, bevacizumab, cetuximab, trastuzumab y panitumumab) y/o un agente antimetabolito (por ejemplo, 5-fluorouracilo y metotrexato). En algunas realizaciones, los pacientes son pacientes sin tratamiento previo. Una vez clasificado como probable que responda a un régimen de tratamiento contra el cáncer en particular (por ejemplo, un régimen de tratamiento contra el cáncer que incluye el uso de un agente de tratamiento contra el cáncer no asociado con la RH), el paciente con cáncer se puede tratar con dicho régimen de tratamiento contra el cáncer. Cualquier método adecuado para el cáncer que se está tratando se puede utilizar para tratar a un paciente con cáncer que se ha identificado que tiene células cancerosas que tienen un estado de reordenamiento de ADN genómico negativo. Los ejemplos de información que se pueden utilizar además de un estado de reordenamiento de ADN genómico negativo para basar una clasificación de probabilidad de responder a un régimen de tratamiento contra el cáncer en particular incluyen, sin limitación, resultados de tratamientos anteriores, mutaciones en el ADN somático o de la línea germinal, perfiles de expresión de genes o proteínas (por ejemplo, estado de ER/PR/HER2, niveles de PSA), histología del tumor (por ejemplo, adenocarcinoma, carcinoma epidermoide, carcinoma seroso papilar, carcinoma mucinoso, carcinoma ductal invasivo, carcinoma ductal in situ (no invasivo), etc.), estadio de la enfermedad, grado del tumor o del cáncer (por ejemplo, bien, moderadamente o mal diferenciado (por ejemplo, Gleason, Bloom Richardson modificado), etc.), número de ciclos de tratamiento previos, etc. La mayor probabilidad de responder puede referirse, por ejemplo, a una mayor probabilidad de respuesta en comparación con cualquier paciente/población de referencia, o una mayor probabilidad de respuesta en comparación con un paciente/población de referencia específico.
En un aspecto, la divulgación se relaciona con un inhibidor de PARP y/o un agente alquilante para su uso en un método para tratar el cáncer en un paciente, comprendiendo dicho método las etapas de: cuantificar el número de reordenamientos (por ejemplo, LST) en el ADN genómico de una muestra tumoral obtenida de dicho paciente, en donde el número de reordenamientos corresponde al número (por ejemplo, por genoma) de puntos de rotura que dan como resultado segmentos de al menos 3 megabases, preferentemente al menos 4 megabases, aún más preferentemente al menos 5, 6, 7, 89, 10, 11 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 megabases; comparar dicho número de reordenamientos con una referencia predeterminada; y administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de PARP y/o un agente alquilante, si dicho paciente tiene un número de reordenamientos superior a dicha referencia.
Dicha referencia también puede diferir dependiendo del tamaño mínimo de los segmentos tomados en cuenta para determinar el número de reordenamientos (o "LST").
Por una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un agente que aumenta el nivel de desoxiuridina se entiende una cantidad suficiente para tratar el cáncer, con una relación beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento médico. Se entenderá, sin embargo, que el uso diario total de un agente que aumenta el nivel de desoxiuridina lo decidirá el médico tratante dentro del alcance del buen juicio médico. La dosis terapéuticamente eficaz específica para cualquier sujeto en particular que la necesite dependerá de una variedad de factores que incluyen otros marcadores de predisposición al cáncer, factores de riesgo relacionados con el estilo de vida y la actividad del agente específico que aumenta el nivel de desoxiuridina a utilizar, la edad, el peso corporal, el estado de salud general, el sexo y la alimentación del sujeto, el tiempo de administración, la ruta de administración, la duración del tratamiento; los fármacos utilizados en combinación o coincidentes y factores similares bien conocidos en las materias médicas.
Una vez tratado durante un período de tiempo determinado (por ejemplo, entre uno y seis meses), el paciente se puede evaluar para determinar si el régimen de tratamiento tiene efecto o no. Si se detecta un efecto beneficioso, el paciente puede continuar con el mismo régimen de tratamiento contra el cáncer o uno similar. Si se detecta un efecto beneficioso mínimo o nulo, entonces se pueden hacer ajustes al régimen de tratamiento contra el cáncer. Por ejemplo, se puede aumentar la dosis, la frecuencia de administración o la duración del tratamiento. En algunos casos, se pueden añadir antineoplásicos adicionales al régimen de tratamiento o se puede reemplazar un antineoplásico particular con uno o más antineoplásicos diferentes. El paciente que se está tratando puede continuar siendo controlado según corresponda, y se pueden realizar cambios en el régimen de tratamiento contra el cáncer según corresponda.
Se cree que un tratamiento que provoque roturas bicatenarias en el ADN (tales como los agentes alquilantes) o un tratamiento que inhiba la ruta alternativa de reparación del ADN (tal como los PARPi) será más eficaz si el tumor es deficiente en la ruta de la RH.
Además, los inventores han demostrado que el número de LST es un buen factor pronóstico de la respuesta al tratamiento con un agente alquilante tal como el cisplatino (véase el ejemplo 3).
Por lo tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para predecir la eficacia de un tratamiento en un paciente que padece cáncer, en donde dicho tratamiento comprende un PARPi y/o un agente alquilante, y en donde dicho método comprende la etapa que consiste en predecir la deficiencia en la ruta de la RH como se describe anteriormente.
La divulgación también se refiere a un PARPi y/o a un agente alquilante para su uso en un método para tratar un cáncer en un paciente en donde dicho cáncer está relacionado con una deficiencia en la ruta de la RH.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "inhibidor de PARP" tiene su significado general en la materia. Se refiere a un compuesto que es capaz de inhibir la actividad de la enzima poliADP ribosa polimerasa (PARP, del inglés "polyADP ribose polymerase"), una proteína que es importante para reparar roturas monocatenarias ('muescas' en el ADN). Si dichas muescas persisten sin reparar hasta que se replica el ADN (que debe preceder a la división celular), entonces la replicación en sí hará que se formen roturas bicatenarias. Los fármacos que inhiben PARP hacen que se formen múltiples roturas bicatenarias de esta manera, y en tumores con mutaciones en BRCA1, BRCA2 o PALB2, estas roturas bicatenarias no se pueden reparar de manera eficaz, lo que lleva a la muerte de las células.
Normalmente, el inhibidor de PARP de acuerdo con la invención se puede seleccionar del grupo que consiste en iniparib, olaparib, rocaparib, CEP 9722, MK 4827, BMN-673 y 3-aminobenzamida.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "agente alquilante" o "antineoplásico alquilante" tiene su significado general en la materia. Se refiere a compuestos que unen un grupo alquilo al a Dn . Normalmente, el agente alquilante de acuerdo con la invención se puede seleccionar de complejos de platino tales como cisplatino, carboplatino y oxaliplatino, clormetina, clorambucilo, melfalán, ciclofosfamida, ifosfamida, estramustina, carmustina, lomustina, fotemustina, estreptozocina, busulfano, pipobromano, procarbazina, dacarabazina, tiotepa y temozolomida.
La divulgación también se refiere a una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de PARP y/o un agente alquilante para su uso en un método para tratar el cáncer en un paciente, en donde dicho cáncer está relacionado con una deficiencia en la ruta de la RH.
En dichas composiciones farmacéuticas para administración oral, sublingual, subcutánea, intramuscular, intravenosa, transdérmica, local o mucosa, el principio activo, solo o en combinación con otro principio activo, se puede administrar en una forma de administración unitaria, como una mezcla con soportes farmacéuticos convencionales, a animales y seres humanos. Las formas de administración unitarias adecuadas comprenden formas de administración oral, tales como comprimidos, cápsulas de gel, polvos, gránulos y suspensiones o soluciones orales, formas de administración sublingual y oral, aerosoles, implantes, formas de administración subcutánea, transdérmica, tópica, intraperitoneal, intramuscular, intravenosa, subdérmica, transdérmica, intratecal e intranasal y formas de administración rectal.
Preferentemente, las composiciones farmacéuticas contienen vehículos que son farmacéuticamente aceptables para una formulación que puede inyectarse. Estos pueden ser en particular soluciones salinas isotónicas, estériles, (fosfato monosódico o disódico, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio y similares o mezclas de dichas sales) o composiciones secas, especialmente liofilizadas que tras la adición, dependiendo del caso, de agua esterilizada o solución salina fisiológica, permiten la constitución de las soluciones inyectables.
Además de los compuestos formulados para administración parenteral, tal como inyección intravenosa o intramuscular, otras formas farmacéuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, comprimidos u otros sólidos para administración oral; formulaciones liposomales; cápsulas de liberación controlada; y cualquier otra forma usada en la actualidad.
En una realización, el inhibidor de PARP y/o agente alquilante se administra en combinación con otro agente activo.
Normalmente, el inhibidor de PARP y el otro agente activo se pueden formular por separado. Como alternativa, se pueden formular juntos en una composición farmacéutica.
En una realización, el inhibidor de PARP y/o el agente alquilante se administra a un paciente que se somete a radioterapia y/o cirugía para extirpar el tumor.
Tal como se describe en el presente documento, la presente invención también proporciona métodos para evaluar pacientes en busca de células (por ejemplo, células cancerosas) que tengan un genoma que contenga un reordenamiento de ADN genómico (por ejemplo, una LST). En algunas realizaciones, los pacientes son pacientes sin tratamiento previo. Por ejemplo, uno o más médicos o profesionales médicos pueden determinar si un paciente contiene células cancerosas que tienen un genoma que contiene un reordenamiento de ADN genómico. En algunos casos, uno o más médicos o profesionales médicos pueden determinar si un paciente contiene células cancerosas que tienen un genoma que contiene un reordenamiento de ADN genómico mediante la obtención de una muestra de células cancerosas del paciente y la evaluación del genoma de las células cancerosas de la muestra de células cancerosas para determinar la presencia o ausencia de un reordenamiento de ADN genómico como se describe en el presente documento.
En algunos casos, uno o más médicos o profesionales médicos pueden obtener una muestra de células cancerosas de un paciente y proporcionar esa muestra a un laboratorio de pruebas que tenga la capacidad de evaluar el genoma de las células cancerosas de la muestra de células cancerosas para proporcionar una indicación sobre la presencia o ausencia de un reordenamiento de ADN genómico como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, los pacientes son pacientes sin tratamiento previo. En dichos casos, uno o más médicos o profesionales médicos pueden determinar si un paciente contiene células cancerosas que tienen un genoma que contiene un reordenamiento de ADN genómico cuando recibe la información sobre la presencia o ausencia de un reordenamiento de ADN genómico directa o indirectamente del laboratorio de pruebas. Por ejemplo, un laboratorio de pruebas, después de evaluar el genoma de las células cancerosas en busca de presencia o ausencia de un reordenamiento de ADN genómico como se describe en el presente documento, puede proporcionar a un médico o profesional médico, o dar acceso a, un registro médico o informe escrito, electrónico u oral que proporciona una indicación sobre la presencia o ausencia de un reordenamiento de ADN genómico para un paciente en particular que se está evaluando. Dicho registro médico o informe escrito, electrónico u oral puede permitir que uno o más médicos o profesionales médicos determinen si un paciente en particular que se está evaluando contiene células cancerosas que tienen un genoma que contiene un reordenamiento de ADN genómico.
Una vez que un médico o profesional médico o un grupo de médicos o profesionales médicos determina que un paciente en particular que se está evaluando contiene células cancerosas cuyo genoma contiene un reordenamiento de ADN genómico (por ejemplo, LST), el médico o profesional médico (o grupo) puede clasificar a ese paciente como portador de células cancerosas cuyo genoma contiene la presencia de un reordenamiento de ADN genómico. En algunas realizaciones, los pacientes son pacientes sin tratamiento previo. En algunos casos, un médico o profesional médico o un grupo de médicos o profesionales médicos puede diagnosticar a un paciente que se ha determinado que tiene células cancerosas cuyo genoma contiene la presencia de un reordenamiento de ADN genómico como que tiene células cancerosas que probablemente sean deficientes en la RH. Dicho diagnóstico se puede basar únicamente en una determinación de que un paciente en particular que se está evaluando contiene células cancerosas que tienen un genoma que contiene un reordenamiento de ADN genómico o se puede basar, al menos en parte, en una determinación de que un paciente en particular que se está evaluando contiene células cancerosas que tienen un genoma que contiene un reordenamiento de ADN genómico. Por ejemplo, un paciente que se determina que tiene células cancerosas cuyo genoma contiene la presencia de un reordenamiento de ADN genómico se puede diagnosticar como probablemente deficiente en la RH en función de la combinación de un estado de reordenamiento de ADN genómico positivo y un estado deficiente en uno o más genes supresores de tumores (por ejemplo, BRCA1/2, RAD51C), antecedentes familiares de cáncer o la presencia de factores de riesgo conductuales (por ejemplo, tabaquismo).
En algunos casos, un médico o profesional médico o un grupo de médicos o profesionales médicos puede diagnosticar a un paciente que se ha determinado que tiene células cancerosas cuyo genoma contiene la presencia de un reordenamiento de ADN genómico (por ejemplo, una LST) que tiene células cancerosas que probablemente contienen mutaciones genéticas en uno o más genes en la ruta de la RH. En algunas realizaciones, los pacientes son pacientes sin tratamiento previo. Dicho diagnóstico se puede basar únicamente en la determinación de que un paciente en particular que se está evaluando contiene células cancerosas que tienen un genoma que contiene un reordenamiento de ADN genómico o se puede basar, al menos en parte, en la determinación de que un paciente en particular que se está evaluando contiene células cancerosas que tienen un genoma que contiene un reordenamiento de ADN genómico. Por ejemplo, un paciente que se determina que tiene células cancerosas cuyo genoma contiene la presencia de un reordenamiento de ADN genómico se puede diagnosticar que tiene células cancerosas que probablemente contengan mutaciones genéticas en uno o más genes en la ruta de la RH en función de la combinación de un estado positivo de reordenamiento de ADN genómico y antecedentes familiares de cáncer, o la presencia de factores de riesgo conductuales (por ejemplo, tabaquismo).
En algunos casos, un médico o profesional médico o un grupo de médicos o profesionales médicos puede diagnosticar a un paciente que se ha determinado que tiene células cancerosas cuyo genoma contiene la presencia de un reordenamiento de ADN genómico (por ejemplo, una LST) que tiene células cancerosas que probablemente respondan a un régimen de tratamiento contra el cáncer en particular. En algunas realizaciones, los pacientes son pacientes sin tratamiento previo. Dicho diagnóstico se puede basar únicamente en la determinación de que un paciente en particular que se está evaluando contiene células cancerosas que tienen un genoma que contiene un reordenamiento de ADN genómico o se puede basar, al menos en parte, en la determinación de que un paciente en particular que se está evaluando contiene células cancerosas que tienen un genoma que contiene un reordenamiento de ADN genómico. Por ejemplo, un paciente que se determina que tiene células cancerosas cuyo genoma contiene la presencia de un reordenamiento de ADN genómico se puede diagnosticar como probable que responda a un régimen de tratamiento contra el cáncer en particular basado en la combinación de la presencia del reordenamiento de ADN genómico y el estado deficiente en uno o más genes supresores de tumores (por ejemplo, BRCA1/2, RAD51), antecedentes familiares de cáncer o la presencia de factores de riesgo conductuales (por ejemplo, tabaquismo). Tal como se describe en el presente documento, un paciente que se determina que tiene células cancerosas cuyo genoma contiene la presencia de un reordenamiento de ADN genómico se puede diagnosticar como probable que responda a un régimen de tratamiento contra el cáncer que incluye el uso de un fármaco de quimioterapia a base de platino tal como el cisplatino, carboplatino, oxaliplatino o picoplatino, una antraciclina tal como la epirrubicina o la doxorrubicina, un inhibidor de topoisomerasa I tal como camptotecina, topotecán o irinotecán, un inhibidor de PARP, radiación, una combinación de los mismos o una combinación de cualquiera de los anteriores con otro antineoplásico. En algunas realizaciones, los pacientes son pacientes sin tratamiento previo. La mayor probabilidad de responder puede referirse, por ejemplo, a una mayor probabilidad de respuesta en comparación con cualquier paciente/población de referencia, o una mayor probabilidad de respuesta en comparación con un paciente/población de referencia específico.
Una vez que un médico o profesional médico o un grupo de médicos o profesionales médicos determina que un paciente en particular que se está evaluando contiene células cancerosas cuyo genoma carece de un reordenamiento de ADN genómico (por ejemplo, una LST), el médico o profesional médico (o grupo) puede clasificar a ese paciente como portador de células cancerosas cuyo genoma contiene una ausencia de reordenamiento de ADN genómico. En algunas realizaciones, los pacientes son pacientes sin tratamiento previo. En algunos casos, un médico o un profesional médico o un grupo de médicos o profesionales médicos pueden diagnosticar a un paciente que se ha determinado que tiene células cancerosas que contienen un genoma que carece de la presencia de un reordenamiento de ADN genómico como que tiene células cancerosas que probablemente tengan RH funcional. En algunos casos, un médico o profesional médico o un grupo de médicos o profesionales médicos puede diagnosticar a un paciente que se ha determinado que tiene células cancerosas que contienen un genoma que carece de la presencia de un reordenamiento de ADN genómico como que tiene células cancerosas que probablemente no contengan mutaciones genéticas en uno o más genes en la ruta de la RH. En algunos casos, un médico o un profesional médico o grupo de médicos o profesionales médicos puede diagnosticar a un paciente que se ha determinado que tiene células cancerosas que contienen un genoma que carece de la presencia de un reordenamiento de ADN genómico o que contiene un mayor número de reordenamientos de ADN genómico que cubren todo el cromosoma como que tiene células cancerosas que tienen menos probabilidades de responder a un fármaco de quimioterapia a base de platino tal como cisplatino, carboplatino, oxalaplatino o picoplatino, una antraciclina tal como la epirrubincina o la doxorrubicina, un inhibidor de topoisomerasa I tal como camptotecina, topotecán o irinotecán, un inhibidor de PARP o radiación y/o más probabilidades de responder a un régimen de tratamiento contra el cáncer que incluye el uso de un agente de tratamiento contra el cáncer no asociado con la RH tal como uno o más agentes de taxano, factor de crecimiento o inhibidores del receptor del factor de crecimiento, agentes antimetabolitos, etc. En algunas realizaciones, los pacientes son pacientes sin tratamiento previo. La mayor probabilidad de responder puede referirse, por ejemplo, a una mayor probabilidad de respuesta en comparación con cualquier paciente/población de referencia, o una mayor probabilidad de respuesta en comparación con un paciente/población de referencia específico.
Tal como se describe en el presente documento, la presente invención también proporciona métodos para realizar un análisis de diagnóstico de una muestra de ácido nucleico (por ejemplo, una muestra de ácido nucleico genómico o una muestra de ácido nucleico genómico amplificado) de un paciente con cáncer para determinar si las células cancerosas del paciente tienen un genoma que contiene un reordenamiento de ADN genómico (por ejemplo, una LST). En algunas realizaciones, los pacientes son pacientes sin tratamiento previo. Por ejemplo, uno o más técnicos de laboratorio o profesionales de laboratorio pueden detectar la presencia o ausencia de un reordenamiento de ADN genómico en el genoma de las células cancerosas del paciente o la presencia o ausencia de un reordenamiento de ADN genómico en el genoma de las células cancerosas del paciente. En algunos casos, uno o más técnicos de laboratorio o profesionales de laboratorio pueden detectar la presencia o ausencia de un reordenamiento de ADN genómico o la presencia o ausencia de un reordenamiento de ADN genómico en el genoma de las células cancerosas del paciente mediante (a) la recepción de una muestra de células cancerosas obtenida del paciente, la recepción de una muestra de ácido nucleico genómico obtenida de células cancerosas obtenidas del paciente, o la recepción de una muestra de ácido nucleico genómico enriquecida y/o amplificada obtenida de células cancerosas obtenidas del paciente y (b) la realización de un análisis (por ejemplo, un ensayo basado en matrices de SNP o un ensayo basado en secuenciación) utilizando el material recibido para detectar la presencia o ausencia de un reordenamiento de ADN genómico. En algunos casos, uno o más técnicos de laboratorio o profesionales de laboratorio pueden recibir una muestra para ser analizada (por ejemplo, una muestra de células cancerosas obtenida del paciente, una muestra de ácido nucleico genómico obtenida de células cancerosas obtenidas del paciente o una muestra de ácido nucleico genómico enriquecida y/o amplificada obtenida de células cancerosas obtenidas del paciente) directa o indirectamente de un médico o profesional médico. En algunas realizaciones, los pacientes son pacientes sin tratamiento previo.
Una vez que un técnico de laboratorio o profesional de laboratorio o grupo de técnicos de laboratorio o profesionales de laboratorio detecta la presencia de un reordenamiento de ADN genómico (por ejemplo, una LST) como se describe en el presente documento, el técnico de laboratorio o el profesional de laboratorio (o grupo) puede identificar al paciente cuyas células cancerosas se detectaron con un reordenamiento de ADN genómico como células cancerosas que tienen un estado de reordenamiento de ADN genómico positivo. Por ejemplo, uno o más técnicos de laboratorio o profesionales de laboratorio pueden identificar a un paciente que tiene células cancerosas que se detectó que tenían un reordenamiento de ADN genómico como células cancerosas que tienen un reordenamiento de ADN genómico mediante la asociación de ese reordenamiento de ADN genómico o el resultado (o resultados o un sumario de resultados) del análisis diagnóstico realizado con el correspondiente nombre del paciente, registro médico, identificador simbólico/numérico o una combinación de los mismos. En algunos casos, un técnico de laboratorio o un profesional de laboratorio o grupo de técnicos de laboratorio o profesionales de laboratorio puede identificar a un paciente que tiene células cancerosas que se detectó que tenían un reordenamiento de ADN genómico como células cancerosas potencialmente deficientes en la RH mediante la asociación del reordenamiento de ADN genómico, el estado de la RH potencialmente deficiente o el resultado (o resultados o un sumario de resultados) del análisis diagnóstico realizado con el correspondiente nombre del paciente, registro médico, identificador simbólico/numérico o una combinación de los mismos. Dicha identificación se puede basar únicamente en la detección de la presencia de un reordenamiento de ADN genómico o se puede basar, al menos en parte, en la detección de la presencia de un reordenamiento de ADN genómico. Por ejemplo, un técnico de laboratorio o profesional de laboratorio puede identificar a un paciente que tiene células cancerosas que se detectó que tenían un reordenamiento de ADN genómico como que tiene células cancerosas potencialmente deficientes en la RH en función de una combinación de un reordenamiento de ADN genómico y los resultados de otras pruebas genéticas y bioquímicas realizadas en el laboratorio de pruebas. En algunas realizaciones, los pacientes son pacientes sin tratamiento previo.
En algunos casos, un técnico de laboratorio o un profesional de laboratorio o grupo de técnicos de laboratorio o profesionales de laboratorio puede identificar a un paciente que tiene células cancerosas que se detectó que tenían un reordenamiento de ADN genómico (por ejemplo, una LST) como que tiene células cancerosas que potencialmente contienen una mutación genética en uno o más genes en la ruta de la RH mediante la asociación del reordenamiento de ADN genómico, la posible presencia de una mutación genética en uno o más genes en la ruta de la RH o el resultado (o resultados o un sumario de resultados) del análisis diagnóstico realizado con el correspondiente nombre del paciente, registro médico, identificador simbólico/numérico o una combinación de los mismos. Dicha identificación se puede basar únicamente en la detección de la presencia de un reordenamiento de ADN genómico o se puede basar, al menos en parte, en la detección de la presencia de un reordenamiento de ADN genómico. Por ejemplo, un técnico de laboratorio o profesional de laboratorio puede identificar a un paciente que tiene células cancerosas que se detectó que tenían un reordenamiento de ADN genómico como que tiene células cancerosas que potencialmente contienen una mutación genética en uno o más genes en la ruta de la RH en función de una combinación de un reordenamiento de ADN genómico y los resultados de otras pruebas genéticas y bioquímicas realizadas en el laboratorio de pruebas. En algunas realizaciones, los pacientes son pacientes sin tratamiento previo.
En algunos casos, un técnico de laboratorio o profesional de laboratorio o grupo de técnicos de laboratorio o profesionales de laboratorio puede identificar a un paciente que tiene células cancerosas que se detectó que tienen un reordenamiento de ADN genómico (por ejemplo, una LST) como que tiene células cancerosas que probablemente respondan a un régimen de tratamiento contra el cáncer en particular mediante la asociación del reordenamiento de ADN genómico, un estado de RH potencialmente deficiente, una posible presencia de un estado deficiente en uno o más genes en la ruta de la RH o el resultado (o resultados o un sumario de resultados) del análisis de diagnóstico realizado con el correspondiente nombre del paciente, registro médico, identificador simbólico/numérico o una combinación de los mismos. Dicha identificación se puede basar únicamente en la detección de la presencia de un reordenamiento de ADN genómico o se puede basar, al menos en parte, en la detección de la presencia de un reordenamiento de ADN genómico. Por ejemplo, un técnico de laboratorio o profesional de laboratorio puede identificar a un paciente que tiene células cancerosas que se detectó que tenían un reordenamiento de ADN genómico como que tiene células cancerosas que probablemente respondan a un régimen de tratamiento contra el cáncer en particular basado en una combinación de un reordenamiento de ADN genómico y los resultados de otras pruebas genéticas y bioquímicas realizadas en el laboratorio de pruebas. En algunas realizaciones, los pacientes son pacientes sin tratamiento previo. La mayor probabilidad de responder puede referirse, por ejemplo, a una mayor probabilidad de respuesta en comparación con cualquier paciente/población de referencia, o una mayor probabilidad de respuesta en comparación con un paciente/población de referencia específico.
Una vez que un técnico de laboratorio o profesional de laboratorio o grupo de técnicos de laboratorio o profesionales de laboratorio detecta la ausencia de un reordenamiento de ADN genómico (por ejemplo, una LST), el técnico de laboratorio o profesional de laboratorio (o grupo) puede identificar al paciente cuyas células cancerosas se detectaron sin un reordenamiento de ADN genómico como que tiene células cancerosas con un estado de reordenamiento de ADN genómico negativo. Por ejemplo, uno o más técnicos de laboratorio o profesionales de laboratorio pueden identificar a un paciente que tiene células cancerosas que se detectó que carecían de un reordenamiento de ADN genómico como que tienen células cancerosas con un estado de reordenamiento de ADN genómico negativo mediante la asociación de ese estado de reordenamiento de ADN genómico negativo o el resultado (o resultados o un sumario de resultados) del análisis diagnóstico realizado con el correspondiente nombre del paciente, registro médico, identificador simbólico/numérico o una combinación de los mismos. En algunos casos, un técnico de laboratorio o profesional de laboratorio o grupo de técnicos de laboratorio o profesionales de laboratorio puede identificar a un paciente que tiene células cancerosas que se detectó que carecían de un reordenamiento de ADN genómico como que tiene células cancerosas con RH potencialmente inalterada mediante la asociación del estado de reordenamiento de ADN genómico negativo, el estado de la RH potencialmente inalterada o el resultado (o resultados o un sumario de resultados) del análisis diagnóstico realizado con el correspondiente nombre del paciente, registro médico, identificador simbólico/numérico o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, los pacientes son pacientes sin tratamiento previo.
En algunos casos, un técnico de laboratorio o profesional de laboratorio o grupo de técnicos de laboratorio o profesionales de laboratorio puede identificar a un paciente que tiene células cancerosas que se detectó que carecían de un reordenamiento de ADN genómico (por ejemplo, una LST) como que tiene células cancerosas con genes potencialmente inalterados de la ruta de la r H mediante la asociación del estado de reordenamiento de ADN genómico negativo, la posible ausencia de mutaciones genéticas en genes de la ruta de la RH o el resultado (o resultados o un sumario de resultados) del análisis diagnóstico realizado con el correspondiente nombre del paciente, registro médico, identificador simbólico/numérico o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, los pacientes son pacientes sin tratamiento previo.
En algunos casos, un técnico de laboratorio o profesional de laboratorio o grupo de técnicos de laboratorio o profesionales de laboratorio puede identificar a un paciente que tiene células cancerosas que se detectó que carecían de un reordenamiento de ADN genómico (por ejemplo, una LST) como que tiene células cancerosas que tienen menos probabilidades de responder a un tratamiento en particular (por ejemplo, un fármaco de quimioterapia a base de platino tal como el cisplatino, carboplatino, oxalaplatino o picoplatino, una antraciclina tal como la epirrubincina o la doxorrubicina, un inhibidor de topoisomerasa I tal como camptotecina, topotecán o irinotecán, un inhibidor de PARP tal como iniparib, olaparib o velapirib, o radiación) y/o es más probable que responda a un régimen de tratamiento contra el cáncer en particular (por ejemplo, un régimen de tratamiento contra el cáncer que incluye el uso de un agente de tratamiento contra el cáncer no asociado con la RH) mediante la asociación del estado de reordenamiento de ADN genómico negativo, un estado de la RH potencialmente inalterado, una posible ausencia de mutaciones genéticas en genes de la ruta de la RH o el resultado (o resultados o un sumario de resultados) del análisis diagnóstico realizado con el correspondiente nombre del paciente, registro médico, identificador simbólico/numérico o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, los pacientes son pacientes sin tratamiento previo. La mayor probabilidad de responder puede referirse, por ejemplo, a una mayor probabilidad de respuesta en comparación con cualquier paciente/población de referencia, o una mayor probabilidad de respuesta en comparación con un paciente/población de referencia específico.
Una vez que un técnico de laboratorio o profesional de laboratorio o grupo de técnicos de laboratorio o profesionales de laboratorio detecta la presencia de un reordenamiento de ADN genómico (por ejemplo, una LST), el técnico de laboratorio o profesional de laboratorio (o grupo) puede identificar al paciente cuyas células cancerosas se detectaron con un reordenamiento de ADN genómico que cubre todo el cromosoma como probable que tenga células cancerosas con un estado de BRCA1, BRCA2 y/o RAD51C inalterado o la ruta de la RH inalterada. Por ejemplo, uno o más técnicos de laboratorio o profesionales de laboratorio pueden identificar a un paciente que tiene células cancerosas que se detectó que tenían un reordenamiento de ADN genómico como probable que tenga células cancerosas con un estado de BRCA1 y BRCA2 inalterado mediante la asociación de la presencia de un mayor número de reordenamientos de ADN genómico que cubren el cromosoma completo o el resultado (o resultados o un sumario de resultados) del análisis diagnóstico realizado con el correspondiente nombre del paciente, registro médico, identificador simbólico/numérico o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, los pacientes son pacientes sin tratamiento previo.
Los resultados de cualquier análisis de acuerdo con la invención a menudo se comunicarán a los médicos, asesores genéticos y/o pacientes (u otras partes interesadas tales como investigadores) en una forma transmisible que se pueda comunicar o transmitir a cualquiera de las partes anteriores. Dicha forma puede variar y puede ser tangible o intangible. Los resultados se pueden incorporar en informes descriptivos, diagramas, fotografías, gráficos, imágenes o cualquier otra forma visual. Por ejemplo, se pueden utilizar gráficos o diagramas que muestren información sobre el genotipo o un reordenamiento de ADN genómico (o el estado de DRH) para explicar los resultados. Los informes y las formas visuales se pueden registrar en un medio tangible tal como papeles, medios legibles por ordenador tales como disquetes, discos compactos, memoria flash, etc., o en un soporte intangible, por ejemplo, un medio electrónico en forma de correo electrónico o sitio web en Internet o intranet. Además, los resultados también se pueden grabar en forma de sonido y transmitir a través de cualquier medio adecuado, por ejemplo, líneas de cable analógicas o digitales, cables de fibra óptica, etc., a través del teléfono, fax, teléfono móvil inalámbrico, teléfono con internet y similares.
Por lo tanto, la información y los datos sobre el resultado de una prueba se pueden generar en cualquier parte del mundo y transmitir a una ubicación diferente. Como ejemplo ilustrativo, cuando un ensayo se lleva a cabo fuera de los Estados Unidos, se puede generar la información y los datos sobre el resultado de una prueba, emitir en una forma transmisible como se describe anteriormente y después importarlos a los Estados Unidos. En consecuencia, la presente divulgación también abarca un método para producir una forma de información transmisible sobre un reordenamiento de ADN genómico para al menos una muestra de paciente. El método comprende las etapas de (1) determinar un reordenamiento de a Dn genómico de acuerdo con los métodos de la presente invención; y (2) incorporar el resultado de la etapa de determinación en una forma transmisible. La forma transmisible es un producto de dicho método.
A modo ilustrativo, pero sin limitación, una realización descrita en este documento es un método para predecir la respuesta de un paciente con cáncer a un régimen de tratamiento contra el cáncer que comprende un agente que daña el ADN, una antraciclina, un inhibidor de la topoisomerasa I, radiación y/o un inhibidor de PARP, comprendiendo dicho método: (1) detectar una serie de reordenamientos (por ejemplo, LST) en el ADN genómico de una muestra tumoral obtenida de dicho paciente, en donde el número de reordenamientos corresponde al número (por ejemplo, por genoma) de puntos de rotura que dan como resultado segmentos de al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 megabases; y (2) correlacionar dicho número total que es mayor que un número de referencia con una mayor probabilidad de que dicho paciente con cáncer responda a dicho régimen de tratamiento contra el cáncer. De acuerdo con el párrafo anterior, se entiende que esta descripción de esta realización incluye una descripción de dos realizaciones relacionadas, por ejemplo, un método para predecir la respuesta de un paciente con cáncer a un régimen de tratamiento contra el cáncer que comprende un agente que daña el ADN, una antraciclina, un inhibidor de la topoisomerasa I, radiación y/o un inhibidor de PARP, comprendiendo dicho método: (1) detectar una serie de reordenamientos en el ADN genómico de una muestra tumoral obtenida de dicho paciente, en donde el número de reordenamientos corresponde al número (por ejemplo, por genoma) de puntos de rotura que dan como resultado segmentos de al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 megabases; y (2)(a) concluir que dicho paciente tiene una mayor probabilidad de que dicho paciente con cáncer responderá a dicho régimen de tratamiento contra el cáncer basándose al menos en parte en un número total que es mayor que un número de referencia; o (2)(b) comunicar que dicho paciente tiene una mayor probabilidad de que dicho paciente con cáncer responderá a dicho régimen de tratamiento contra el cáncer basándose al menos en parte en un número total que es mayor que un número de referencia.
En cada realización descrita en este documento que implica la correlación de un resultado de análisis o ensayo particular (por ejemplo, número total de reordenamientos mayor que un número de referencia, etc.) con cierta probabilidad (por ejemplo, aumentada, no aumentada, disminuida, etc.) de alguna característica clínica (por ejemplo, respuesta a un tratamiento particular, muerte específica por cáncer, etc.), o adicional o alternativamente concluir o comunicar dicha característica clínica basada al menos en parte en dicho resultado de análisis o ensayo particular, dicha correlación, conclusión o comunicado puede comprender asignar un riesgo o probabilidad de que ocurra la característica clínica basándose, al menos en parte, en el resultado del análisis o ensayo en particular. En algunas realizaciones, dicho riesgo es un porcentaje de probabilidad de que ocurra el acontecimiento o resultado. En algunas realizaciones, al paciente se le asigna a un grupo de riesgo (porejemplo, riesgo bajo, riesgo intermedio, riesgo elevado, etc.). En algunas realizaciones, "riesgo bajo" es cualquier porcentaje de probabilidad inferior al 5 %, al 10 %, al 15 %, al 20 %, al 25 %, al 30 %, al 35 %, al 40 %, al 45 % o al 50 %. En algunas realizaciones, "riesgo intermedio" es cualquier porcentaje de probabilidad superior al 5 %, al 10 %, al 15 %, al 20 %, al 25 %, al 30 %, al 35 %, al 40 %, al 45 % o al 50 % e inferior al 15 %, al 20 %, al 25 %, al 30 %, al 35 %, al 40 %, al 45 %, al 50 %, al 55 %, al 60 %, al 65 %, al 70 % o al 75 %. En algunas realizaciones, "riesgo elevado" es cualquier porcentaje de probabilidad superior al 25 %, al 30 %, al 35 %, al 40 %, al 45 %, al 50 %, al 55 %, al 60 %, al 65 %, al 70 %, al 75 %, al 80 %, al 85 %, al 90 %, al 95 % o al 99 %.
Como se utiliza en el presente documento, "comunicar" una pieza particular de información significa dar a conocer dicha información a otra persona o transferir dicha información a una cosa (por ejemplo, un ordenador). En algunos métodos de la invención, se comunica el pronóstico de un paciente o la probabilidad de respuesta a un tratamiento en particular. En algunas realizaciones, se comunica la información utilizada para llegar a dicho pronóstico o predicción de respuesta (por ejemplo, un reordenamiento de ADN genómico de acuerdo con la presente invención, etc.). Esta comunicación puede ser auditiva (por ejemplo, verbal), visual (por ejemplo, escrita), electrónica (por ejemplo, datos transferidos de un sistema informático a otro), etc. En algunas realizaciones, comunicar una clasificación de cáncer (por ejemplo, pronóstico, probabilidad de respuesta, tratamiento apropiado, etc.) comprende generar un informe que comunica la clasificación del cáncer. En algunas realizaciones, el informe es un informe en papel, un informe auditivo o un registro electrónico. En algunas realizaciones, el informe se muestra y/o se almacena en un dispositivo informático (por ejemplo, dispositivo portátil, ordenador de sobremesa, dispositivo inteligente, sitio Web, etc.). En algunas realizaciones, la clasificación de cáncer se comunica a un médico (por ejemplo, se proporciona al médico un informe que comunica la clasificación). En algunas realizaciones, la clasificación de cáncer se comunica a un paciente (por ejemplo, se proporciona al paciente un informe que comunica la clasificación). La comunicación de una clasificación de cáncer también se puede lograr transfiriendo información (por ejemplo, datos) que incorpora la clasificación a un servidor informático y permitiendo que un intermediario o usuario final acceda a dicha información (por ejemplo, viendo la información tal como se muestra en el servidor, descargando la información en forma de uno o más archivos transferidos desde el servidor al dispositivo intermediario o del usuario final, etc.).
Siempre que una realización de la invención comprenda concluir algún hecho (por ejemplo, el pronóstico de un paciente o la probabilidad de respuesta de un paciente a un régimen de tratamiento particular), esto puede incluir en algunas realizaciones un programa informático que concluye dicho hecho, normalmente después de realizar un algoritmo que aplica información sobre reordenamientos de acuerdo con la presente invención.
En cada realización descrita en el presente documento que implica una serie de reordenamientos de ADN genómico (por ejemplo, LST), la presente invención abarca una realización relacionada que implica un valor de prueba o puntuación (por ejemplo, puntuación de DRH, etc.) procedente de, que incorpora y/o, al menos hasta cierto punto, que refleja dicho número o longitud. En otras palabras, no es necesario utilizar los números de reordenamiento desnudos en los diversos métodos, sistemas, etc. de la invención; se puede utilizar un valor de prueba o puntuación procedente de dichos números. Por ejemplo, una realización de la invención proporciona un método para tratar un cáncer en un paciente, que comprende: (1) detectar una serie de reordenamientos en el ADN genómico de una muestra tumoral obtenida de dicho paciente, en donde el número de reordenamientos corresponde al número (por ejemplo, por genoma) de puntos de rotura que dan como resultado segmentos de al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 megabases; (2) proporcionar un valor de prueba procedente del número de dichos reordenamientos; (3) comparar dicho valor de prueba con uno o más valores de referencia procedentes del número de dichos reordenamientos en una población de referencia (por ejemplo, media, mediana, terciles, cuartiles, quintiles, etc.); y (4)(a) administrar a dicho paciente un fármaco contra el cáncer, o recomendar, recetar o iniciar un régimen de tratamiento que comprenda quimioterapia y/o un agente letal sintético basado, al menos en parte, en dicha etapa de comparación que revele que el valor de la prueba es mayor (por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces mayor; al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 desviaciones convencionales mayores) que al menos uno de dichos valores de referencia; o (4)(b) recomendar, prescribir o iniciar un régimen de tratamiento que no comprenda quimioterapia y/o un agente letal sintético basado, al menos en parte, en dicha etapa de comparación que revele que el valor de la prueba no es mayor (por ejemplo, no más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces mayor; no más de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 desviaciones convencionales mayores) que al menos uno de dichos valores de referencia. La invención abarca, haciendo los cambios necesarios, realizaciones correspondientes en las que el valor de prueba o la puntuación se utiliza para determinar el pronóstico del paciente, la probabilidad de respuesta del paciente a un régimen de tratamiento particular, la probabilidad del paciente o de la muestra del paciente de tener una deficiencia en BRCA1, BRCA2, RAD51C o la RH, etc.
La presente divulgación proporciona sistemas informáticos. La figura 8 muestra un proceso ilustrativo mediante el cual un sistema informático (o un programa informático (por ejemplo, software) que contiene instrucciones ejecutables por ordenador) puede identificar un reordenamiento de ADN genómico a partir de datos de genotipo como se describe en el presente documento. El proceso comienza en la casilla 1500, donde se recopilan los siguientes datos mediante el sistema informático; (1) intensidades de señal normalizadas específicas de la muestra para ambos alelos de cada locus y (2) conjunto de parámetros específicos del ensayo (específicos para diferentes matrices de SNP y para el enfoque basado en secuencias) definidos en función del análisis de un gran número de muestras con perfiles de NCEA conocidos. Tal como se describe en el presente documento, se puede utilizar cualquier ensayo adecuado, tal como un ensayo basado en matrices de SNP o un ensayo basado en secuenciación, para evaluar los loci a lo largo de un cromosoma en busca de reordenamientos. En algunos casos, se puede utilizar un sistema que incluye un detector de señales y un ordenador para recoger datos (por ejemplo, señales fluorescentes o resultados de secuenciación) con respecto a la naturaleza de la pluralidad de los loci (por ejemplo, intensidades de señal normalizadas específicas de muestra para ambos alelos de cada locus). En la casilla 1510, los números de copias específicos de alelo (NCEA) se reconstruyen en cada locus (por ejemplo, cada SNP). Los NCEA son los números de copias de alelos tanto paternos como maternos. En la casilla 1530, se utiliza una función de probabilidad para determinar si está presente un reordenamiento de ADN genómico. Esto puede ser de manera conceptual análogo a un algoritmo descrito anteriormente diseñado para reconstruir el número total de copias (en lugar del NCEA) en cada locus (por ejemplo, SNP). Véase la solicitud internacional publicada con la referencia WO2011/106541 de Abkevich et al. La función de probabilidad se puede maximizar sobre el NCEA de todos los loci, nivel de contaminación con tejido benigno, número total de copias promediado sobre todo el genoma y nivel de ruido específico de la muestra. En la casilla 1540, se determina un reordenamiento de ADN genómico con uno de los NCEA (paterno o materno) siendo cero. En algunas realizaciones, el proceso informático comprende además una etapa de indagar o determinar si un paciente no ha recibido tratamiento previo.
La figura 9 muestra un proceso ilustrativo mediante el cual un sistema informático puede determinar la presencia o ausencia de un reordenamiento de ADN genómico. El proceso comienza en la casilla 300, donde el sistema informático recopila datos sobre la naturaleza de una pluralidad de loci a lo largo de un cromosoma. Tal como se describe en el presente documento, se puede utilizar cualquier ensayo adecuado, tal como un ensayo basado en matrices de SNP o un ensayo basado en secuenciación, para evaluar los loci a lo largo de un cromosoma. En algunos casos, se puede utilizar un sistema que incluye un detector de señales y un ordenador para recoger datos (por ejemplo, señales fluorescentes o resultados de secuenciación) con respecto a la naturaleza de la pluralidad de loci. En la casilla 310, el sistema informático evalúa los datos relativos a la naturaleza de una pluralidad de loci así como la ubicación o relación espacial de cada locus para determinar la presencia de un reordenamiento de ADN genómico. En la casilla 320, se evalúan los datos relativos a los reordenamientos de ADN genómico detectados mediante la determinación de la presencia de un reordenamiento de ADN genómico. En la casilla 330, el sistema informático formatea un resultado que proporciona una indicación de la presencia o ausencia de un reordenamiento de ADN genómico. Una vez formateado, el sistema informático puede presentar el resultado a un usuario (por ejemplo, un técnico de laboratorio, médico o profesional médico). Tal como se describe en el presente documento, la presencia o ausencia de un reordenamiento de ADN genómico se puede utilizar para proporcionar una indicación sobre el estado de la RH probable de un paciente, una indicación sobre la probable presencia o ausencia de mutaciones genéticas en genes de la ruta de la Rh y/o una indicación sobre posibles regímenes de tratamiento contra el cáncer.
La figura 10 es un diagrama de un ejemplo de un dispositivo informático 1400 y un dispositivo informático móvil 1450, que se pueden utilizar con las técnicas descritas en el presente documento. El dispositivo informático 1400 está destinado a representar varias formas de ordenadores digitales, tal como ordenadores portátiles, de mesa, estaciones de trabajo, asistentes digitales personales, servidores, servidores blade, ordenadores centrales y otros ordenadores adecuados. El dispositivo informático 1450 está destinado a representar varias formas de dispositivos móviles, tales como asistentes digitales personales, teléfonos móviles, teléfonos inteligentes y otros dispositivos informáticos similares. Los componentes que se muestran aquí, sus conexiones y relaciones, y sus funciones, tienen el propósito de ser solo ilustrativos y no pretenden limitar las implementaciones de las invenciones descritas y/o reivindicadas en este documento.
El dispositivo informático 1400 incluye un procesador 1402, memoria 1404, un dispositivo de almacenamiento 1406, una interfaz de alta velocidad 1408 que se conecta a la memoria 1404 y a los puertos de expansión de alta velocidad 1410, y una interfaz de baja velocidad 1415 que se conecta a la vía de baja velocidad 1414 y al dispositivo de almacenamiento 1406. Cada uno de los componentes 1402, 1404, 1406, 1408, 1410 y 1415, están interconectados mediante varias vías y pueden montarse en una placa base común o de otras maneras, según corresponda. El procesador 1402 puede procesar instrucciones para ejecución dentro del dispositivo informático 1400, que incluye instrucciones almacenadas en la memoria 1404 o en el dispositivo de almacenamiento 1406 para mostrar información gráfica para una IGU en un dispositivo externo de entrada/salida, tal como la pantalla 1416 acoplada a la interfaz de alta velocidad 1408. En otras implementaciones, se pueden utilizar múltiples procesadores y/o múltiples vías, según sea adecuado, junto con múltiples memorias y tipos de memoria. Además, se pueden conectar varios dispositivos informáticos 1400, proporcionando cada dispositivo porciones de las operaciones necesarias (por ejemplo, como un banco servidor, un grupo de servidores blade o un sistema multiprocesador).
La memoria 1404 almacena información dentro del dispositivo informático 1400. En una implementación, la memoria 1404 es una unidad o unidades de memoria volátil. En otra implementación, la memoria 1404 es una unidad o unidades de memoria no volátil. La memoria 1404 también puede ser otra forma de medio legible por ordenador, tal como un disco magnético u óptico.
El dispositivo de almacenamiento 1406 es capaz de proporcionar almacenamiento masivo para el dispositivo informático 1400. En una implementación, el dispositivo de almacenamiento 1406 puede ser o contener un medio legible por ordenador, tal como un dispositivo de disquete, un dispositivo de disco duro, un dispositivo de disco óptico o un dispositivo de cinta, una memoria flash u otro dispositivo de memoria en estado sólido similar o una matriz de dispositivos, que incluye los dispositivos en una red de área de almacenamiento u otras configuraciones. Un producto de programa informático puede incorporarse de manera tangible en un soporte de información. El producto del programa informático también puede contener instrucciones que, cuando se ejecuta, realizan uno o más métodos, tales como los descritos en el presente documento. El portador de información es un medio legible por ordenador o máquina, tal como la memoria 1404, el dispositivo de almacenamiento 1406, la memoria en el procesador 1402 o una señal propagada.
El controlador de alta velocidad 1408 gestiona las operaciones intensivas de ancho de banda para el dispositivo informático 1400, mientras que el controlador de baja velocidad 1415 gestiona operaciones de menos intensivas de ancho de banda. Dicha asignación de funciones es sólo ilustrativa. En una implementación, el controlador de alta velocidad 1408 está acoplado a la memoria 1404, la pantalla 1416 (por ejemplo, a través de un procesador de gráficos o acelerador) y a los puertos de expansión de alta velocidad 1410, que pueden aceptar varias tarjetas de expansión (no se muestra). En la implementación, el controlador de baja velocidad 1415 está acoplado al dispositivo de almacenamiento 1406 y al puerto de expansión de baja velocidad 1414. El puerto de expansión de baja velocidad, que puede incluir varios puertos de comunicación (por ejemplo, USB, Bluetooth, Ethernet o Ethernet inalámbrico) se puede acoplar a uno o más dispositivos de entrada/salida, tal como un teclado, un dispositivo señalador, un escáner, un lector óptico, un detector de señales fluorescentes o un dispositivo de red tal como un conmutador o enrutador, por ejemplo, a través de un adaptador de red.
El dispositivo informático 1400 puede implementarse en varias formas diferentes, como se muestra en la figura. Por ejemplo, puede implementarse como un servidor convencional 1420 o varias veces en un grupo de dichos servidores. También puede implementarse como parte de un sistema de servidor en bastidor 1424. Además, puede implementarse en un ordenador personal tal como un ordenador portátil 1422. Como alternativa, los componentes del dispositivo informático 1400 pueden combinarse con otros componentes en un dispositivo móvil (no mostrado), tal como el dispositivo 1450. Cada uno de dichos dispositivos puede contener uno o más dispositivos informáticos 1400, 1450, y un sistema completo puede estar formado por múltiples dispositivos informáticos 1400, 1450 que se comunican entre sí.
El dispositivo informático 1450 incluye un procesador 1452, memoria 1464, un dispositivo de entrada/salida tal como una pantalla 1454, una interfaz de comunicación 1466 y un transceptor 1468, entre otros componentes (por ejemplo, un escáner, un lector óptico, un detector de señales fluorescentes). El dispositivo 1450 también puede estar provisto de un dispositivo de almacenamiento, tal como una unidad de microdisco u otro dispositivo, para proporcionar almacenamiento adicional. Cada uno de los componentes 1450, 1452, 1464, 1454, 1466 y 1468, están interconectados mediante varias vías, y varios de los componentes pueden montarse en una placa base común o de otras maneras, según corresponda.
El procesador 1452 puede ejecutar instrucciones dentro del dispositivo informático 1450, que incluye instrucciones almacenadas en la memoria 1464. El procesador puede implementarse como un conjunto de chips que incluyen procesadores analógicos y digitales separados y múltiples. El procesador puede proporcionar, por ejemplo, para la coordinación de los otros componentes del dispositivo 1450, tal como el control de las interfaces de usuario, aplicaciones ejecutadas por el dispositivo 1450 y comunicación inalámbrica por el dispositivo 1450.
El procesador 1452 puede comunicarse con un usuario a través de la interfaz de control 1458 y la interfaz de pantalla 1456 acoplada a una pantalla 1454. La pantalla 1454 puede ser, por ejemplo, una pantalla TFT LCD (pantalla de cristal líquido de transistores de película delgada) o una pantalla OLED (diodo orgánico emisor de luz) u otra tecnología de pantalla adecuada. La interfaz de pantalla 1456 puede comprender un circuito adecuado para hacer que la pantalla 1454 presente información gráfica y de otro tipo a un usuario. La interfaz de control 1458 puede recibir comandos de un usuario y convertirlos para enviarlos al procesador 1452. Además, se puede proporcionar una interfaz externa 1462 en comunicación con el procesador 1452, para permitir la comunicación de área cercana del dispositivo 1450 con otros dispositivos. La interfaz externa 1462 puede proporcionar, por ejemplo, para la comunicación por cable en algunas implementaciones, o para la comunicación inalámbrica en otras implementaciones, y también se pueden utilizar múltiples interfaces.
La memoria 1464 almacena información dentro del dispositivo informático 1450. La memoria 1464 puede implementarse como uno o más de un medio o medios legibles por ordenador, una unidad o unidades de memoria volátil o una unidad o unidades de memoria no volátil. La memoria de expansión 1474 también se puede proporcionar y conectar al dispositivo 1450 a través de la interfaz de expansión 1472, que puede incluir, por ejemplo, una interfaz de tarjeta SIMM (Single In Line Memory Module, módulo unitario de memoria en línea). Dicha memoria de expansión 1474 puede proporcionar espacio de almacenamiento adicional para el dispositivo 1450 o también puede almacenar aplicaciones u otra información para el dispositivo 1450. Por ejemplo, la memoria de expansión 1474 puede incluir instrucciones para llevar a cabo o complementar los procesos descritos en el presente documento, y también puede incluir información segura. Por lo tanto, por ejemplo, la memoria de expansión 1474 puede proporcionarse como un módulo de seguridad para el dispositivo 1450 y puede programarse con instrucciones que permitan el uso seguro del dispositivo 1450. Además, las aplicaciones seguras se pueden proporcionar a través de las tarjetas SIMM, junto con información adicional, tal como colocar información de identificación en la tarjeta SIMM de manera que no se pueda piratear.
La memoria puede incluir, por ejemplo, memoria flash y/o memoria NVRAM, como se indica a continuación. En una implementación, un producto de programa informático se incorpora de manera tangible en un soporte de información. El producto de programa informático contiene instrucciones que, cuando se ejecuta, realizan uno o más métodos, tales como los descritos en el presente documento. El portador de información es un medio legible por ordenador o máquina, tal como la memoria 1464, memoria de expansión 1474, memoria en el procesador 1452 o una señal propagada que puede recibirse, por ejemplo, en el transceptor 1468 o en la interfaz externa 1462.
El dispositivo 1450 puede comunicarse de forma inalámbrica a través de la interfaz de comunicación 1466, que puede incluir circuitos de procesamiento de señales digitales cuando sea necesario. La interfaz de comunicación 1466 puede proporcionar comunicaciones en varios modos o protocolos, tales como llamadas de voz GSM, mensajería SMS, EMS o MMS, CDMA, TDMA, PDC, WCDMA, CDMA2000 o GPRS, entre otros. Dicha comunicación puede ocurrir, por ejemplo, a través del transceptor de radiofrecuencia 1468. Además, puede ocurrir una comunicación de corto alcance, tal como el uso de un Bluetooth, WiFi u otro transceptor similar (no se muestra). Además, el módulo receptor GPS (Sistema de Posicionamiento Global) 1470 puede proporcionar datos inalámbricos adicionales relacionados con la navegación y la ubicación al dispositivo 1450, que se puede utilizar según corresponda por las aplicaciones que se ejecutan en el dispositivo 1450.
El dispositivo 1450 también puede comunicarse de forma audible utilizando el códec de audio 1460, que puede recibir información hablada de un usuario y convertirla en información digital utilizable. El códec de audio 1460 también puede generar un sonido audible para un usuario, tal como a través de un altavoz, por ejemplo, en un auricular del dispositivo 1450. Dicho sonido puede incluir sonido de llamadas telefónicas de voz, puede incluir sonido grabado (por ejemplo, mensajes de voz, archivos de música, etc.) y también puede incluir sonido generado por aplicaciones que operan en el dispositivo 1450.
El dispositivo informático 1450 puede implementarse en varias formas diferentes, como se muestra en la figura. Por ejemplo, puede implementarse como un teléfono móvil 1480. También se puede implementar como parte de un teléfono inteligente 1482, asistente digital personal u otro dispositivo móvil similar.
Varias implementaciones de los sistemas y técnicas descritas en el presente documento se pueden realizar en circuitos electrónicos digitales, circuitos integrados, ASIC (circuitos integrados para aplicaciones específicas) especialmente diseñados, soporte físico del ordenador, firmware, programa informático y/o combinaciones de los mismos. Estas diversas implementaciones pueden incluir la implementación en uno o más programas informáticos que son ejecutables y/o interpretables en un sistema programable que incluye al menos un procesador programable, que puede ser de propósito especial o general, acoplados para recibir datos e instrucciones de, y para transmitir datos e instrucciones a, un sistema de almacenamiento, al menos un dispositivo de entrada y al menos un dispositivo de salida.
Estos programas informáticos (también conocidos como programas, software, aplicaciones de programas informáticos o código) incluyen instrucciones de máquina para un procesador programable, y pueden implementarse en un lenguaje de programación de alto nivel procedimental y/u orientado a objetos, y/o en lenguaje ensamblador/máquina. Como se utiliza en el presente documento, las expresiones "medio legible por máquina" y "medio legible por ordenador" se refieren a cualquier producto de programa informático, aparato y/o dispositivo (por ejemplo, discos magnéticos, discos ópticos, memoria y dispositivos lógicos programables (PLD, del inglés "Programmable Logic Devices")) utilizados para proporcionar instrucciones de máquina y/o datos a un procesador programable, que incluyen un medio legible por máquina que recibe instrucciones de máquina como una señal legible por máquina. La expresión "señal legible por máquina" se refiere a cualquier señal utilizada para proporcionar instrucciones y/o datos de máquina a un procesador programable.
Para permitir la interacción con un usuario, los sistemas y técnicas descritos en el presente documento pueden implementarse en un ordenador que tenga un dispositivo de visualización (por ejemplo, un monitor CRT (tubo de rayos catódicos) o LCD (pantalla de cristal líquido)) para mostrar información al usuario y un teclado y un dispositivo señalador (por ejemplo, un ratón o una bola de control) mediante el cual el usuario puede proporcionar información a la computadora. También se pueden utilizar otros tipos de dispositivos para permitir la interacción con un usuario; por ejemplo, la retroalimentación proporcionada al usuario puede ser cualquier forma de retroalimentación sensorial (por ejemplo, retroalimentación visual, retroalimentación auditiva o retroalimentación táctil); y la entrada del usuario se puede recibir en cualquier forma, incluyendo acústica, voz o entrada táctil.
Los sistemas y técnicas descritos en el presente documento pueden implementarse en un sistema informático que incluya un componente posterior (por ejemplo, como un servidor de datos), o que incluya un componente intermedio (por ejemplo, un servidor de aplicaciones), o que incluya un componente frontales ( por ejemplo, una computadora cliente que tiene una interfaz gráfica de usuario o un navegador web a través del cual un usuario puede interactuar con una implementación de los sistemas y técnicas descritas en el presente documento), o cualquier combinación de dichos componentes posteriores, intermedios o frontales. Los componentes del sistema pueden estar interconectados mediante cualquier forma o medio de comunicación de datos digitales (por ejemplo, una red de comunicación). Los ejemplos de redes de comunicación incluyen una red de área local ("LAN", del inglés "local area network"), una red de área amplia ("WAN", del inglés "wide area network") e Internet.
El sistema informático puede incluir clientes y servidores. Un cliente y un servidor generalmente están alejados entre sí y normalmente interactúan a través de una red de comunicación. La relación de cliente y servidor surge en virtud de los programas informáticos que se ejecutan en los respectivos ordenadores y tienen una relación cliente-servidor entre sí.
En algunos casos, un sistema informático proporcionado en el presente documento puede configurarse para incluir uno o más analizadores de muestras. Un analizador de muestras puede configurarse para producir una pluralidad de señales en el ADN genómico de al menos un par de cromosomas humanos de una célula cancerosa. Por ejemplo, un analizador de muestras puede producir señales que pueden interpretarse de una manera que identifique la naturaleza homocigota o heterocigota de los loci a lo largo de un cromosoma. En algunos casos, un analizador de muestras se puede configurar para llevar a cabo una o más etapas de un ensayo basado en matrices de SNP o un ensayo basado en secuenciación y se puede configurar para producir y/o capturar señales de dichos ensayos. En algunos casos, un sistema informático proporcionado en el presente documento se puede configurar para incluir un dispositivo informático. En dichos casos, el dispositivo informático se puede configurar para recibir señales de un analizador de muestras. El dispositivo informático puede incluir instrucciones ejecutables por ordenador o un programa informático (por ejemplo, software) que contiene instrucciones ejecutables por ordenador para llevar a cabo uno o más de los métodos o etapas descritas en el presente documento. En algunos casos, dichas instrucciones ejecutables por ordenador pueden instruir a un dispositivo informático para analizar señales de un analizador de muestras, de otro dispositivo informático, de un ensayo basado en matrices SNP o de un ensayo basado en secuenciación. El análisis de dichas señales puede llevarse a cabo para determinar genotipos, homocigosidad en determinados loci, regiones de homocigosidad, el número de reordenamientos de ADN genómico, para determinar si una muestra es o no positiva para un reordenamiento de ADN genómico, para determinar el número de reordenamientos de ADN genómico en al menos un par de cromosomas humanos, para determinar la probabilidad de una deficiencia en los genes BRCA1 y/o BRCA2, para determinar la probabilidad de una deficiencia en la RH, para determinar la probabilidad de que un paciente con cáncer responda a un régimen de tratamiento contra el cáncer en particular (por ejemplo, un régimen que incluye un agente que daña el ADN, una antraciclina, un inhibidor de la topoisomerasa I, radiación, un inhibidor de PARP o una combinación de los mismos) o para determinar una combinación de estos elementos.
En algunos casos, un sistema informático proporcionado en el presente documento puede incluir instrucciones ejecutables por ordenador o un programa informático (por ejemplo, software) que contiene instrucciones ejecutables por ordenador para formatear un resultado que proporciona una indicación sobre un reordenamiento de ADN genómico, el tamaño de un reordenamiento de ADN genómico, el número de reordenamientos de ADN genómico que tienen un tamaño particular o intervalo de tamaños, si una muestra es o no positiva para un reordenamiento de ADN genómico, el número de reordenamientos de ADN genómico en al menos un par de cromosomas humanos, una probabilidad de una deficiencia en los genes BRCA1 y/o BRCA2, una probabilidad de una deficiencia en la RH, una probabilidad de que un paciente con cáncer responda a un régimen de tratamiento contra el cáncer en particular (por ejemplo, un régimen que incluye un agente que daña el ADN, una antraciclina, un inhibidor de la topoisomerasa I, radiación, un inhibidor de PARP o una combinación de los mismos) o una combinación de estos elementos. En algunos casos, un sistema informático proporcionado en el presente documento puede incluir instrucciones ejecutables por ordenador o un programa informático (por ejemplo, software) que contiene instrucciones ejecutables por ordenador para determinar un régimen de tratamiento contra el cáncer deseado para un paciente en particular basado, al menos en parte, en la presencia o ausencia de un reordenamiento de ADN genómico.
En algunos casos, un sistema informático proporcionado en el presente documento puede incluir un dispositivo de preprocesamiento configurado para procesar una muestra (por ejemplo, células cancerosas) de modo que se pueda realizar un ensayo basado en matrices de SNP o un ensayo basado en secuenciación. Los ejemplos de dispositivos de preprocesamiento incluyen, sin limitación, dispositivos configurados para enriquecer las poblaciones celulares de células cancerosas en lugar de células no cancerosas, dispositivos configurados para lisar células y/o extraer ácido nucleico genómico, y dispositivos configurados para enriquecer una muestra de fragmentos de ADN genómico particulares.
La presente divulgación también proporciona kits para evaluar muestras (por ejemplo, células cancerosas) como se describe en el presente documento. Por ejemplo, este documento proporciona kits para evaluar las células cancerosas en busca de un reordenamiento de ADN genómico (por ejemplo, una LST) en al menos un par de cromosomas humanos. Un kit provisto en el presente documento puede incluir sondas SNP (por ejemplo, una matriz de sondas SNP para llevar a cabo un ensayo basado en matrices SNP descrito en el presente documento) o cebadores (por ejemplo, cebadores diseñados para secuenciar regiones SNP a través de un ensayo basado en secuenciación) en combinación con un producto de programa informático que contiene instrucciones ejecutables por ordenador para llevar a cabo uno o más de los métodos o etapas descritas en el presente documento (por ejemplo, instrucciones ejecutables por ordenador para determinar la presencia de un reordenamiento de ADN genómico que tiene un tamaño particular o intervalo de tamaños). En algunos casos, un kit proporcionado en el presente documento puede incluir al menos 500, 1000, 10.000, 25.000 o 50.000 sondas de SNP capaces de hibridar con regiones polimórficas de ADN genómico humano. En algunos casos, un kit proporcionado en el presente documento puede incluir al menos 500, 1000, 10.000, 25.000 o 50.000 cebadores capaces de secuenciar regiones polimórficas de ADN genómico humano. En algunos casos, un kit proporcionado en el presente documento puede incluir uno o más ingredientes para realizar un ensayo basado en matrices de SNP o un ensayo basado en secuenciación. Los ejemplos de dichos otros ingredientes incluyen, sin limitación, tampones, nucleótidos para secuenciación, enzimas (por ejemplo, polimerasas), etc. Este documento también proporciona el uso de cualquier número adecuado de los materiales proporcionados en el presente documento en la fabricación de un kit para llevar a cabo uno o más de los métodos o etapas descritas en el presente documento. Por ejemplo, este documento proporciona el uso de una colección de sondas de SNP (por ejemplo, una colección de 10.000 a 100.000 sondas de SNP) y un producto de programa informático proporcionado en el presente documento en la fabricación de un kit para evaluar las células cancerosas para detectar la presencia de un reordenamiento de ADN genómico. Como otro ejemplo, este documento proporciona el uso de una colección de cebadores (por ejemplo, una colección de 10.000 a 100.000 cebadores para secuenciar regiones SNP) y un producto de programa informático proporcionado en el presente documento en la fabricación de un kit para evaluar las células cancerosas para detectar la presencia de un reordenamiento de ADN genómico.
La invención se describirá adicionalmente a través de los siguientes ejemplos y figuras, que no pretenden limitar el alcance de la protección definida por las reivindicaciones.
Ejemplos
EJEMPLO 1
Materiales y métodos
Pacientes y tumores
Se reunió una serie de BLC de grado 3 indiferenciados de pacientes que se sometieron a cirugía en el Institut Curie. De acuerdo con las regulaciones francesas, se informó a los pacientes de la investigación y no expresaron oposición. El material biológico de alta calidad estaba disponible en el biobanco del Institut Curie para 85 muestras de tumores (algunas muestras se describieron anteriormente).28-30. Esta serie se enriqueció con tumores surgidos en pacientes portadores de mutaciones en BRCA1 perjudiciales (35 tumores).
Inmunohistoquímica
La inmunotinción se realizó en secciones de tejido de 4 pm como se describió anteriormente:2829 ER, PR y ERBB2 (Novocastra), EGFR y KRT8/18 (Zymed, Invitrogen), KRT5/6 (Dako) y KRT14 (Biogenex). La positividad para cada marcador se determinó de acuerdo con pautas estandarizadas.31 La negatividad se definió como la ausencia total de tinción para la expresión de ER y PR, y como una tinción inferior a 2+ para ERBB2.
El fenotipo de tipo basal se definió de acuerdo con criterios morfológicos, fenotípicos y/o moleculares que incluyen i) grado alto (graduación de Elston-Ellis) y márgenes elevados, ii) fenotipo triple negativo y expresión de KRT5/6/14/17 o EGFR evaluada mediante inmunohistoquímica.32
Estado de metilación del promotor de BRCA1
La metilación del promotor de BRCA1 se evaluó mediante PCR específica de metilo (MSP, del inglés "methyl-specific PCR") después de la conversión de bisulfito como se describió anteriormente,33 con modificaciones menores (las secuencias de los cebadores y los protocolos están disponibles previa solicitud).
Estado de la mutación BRCA1
La preselección de mutaciones del gen BRCA1 se realizó mediante análisis de mutación de desajuste mejorado (EMMA (del inglés "Enhanced Mismatch Mutation Analysis", Fluigent34; EMMALYS software P/N: 5331254102). Para perfiles EMMA anormales, los exones BRCA1 en cuestión se secuenciaron con didesoxinucleótidos (BigDye Terminator V1.1, Applied Biosystems, Foster City, CA), de acuerdo con protocolos convencionales (las secuencias de los cebadores y los protocolos están disponibles previa solicitud). Las secuencias se examinaron con Seqscape V2.5 (Applied Biosystems).
Análisis de datos transcriptómicos
Los datos transcriptómicos se obtuvieron en la plataforma Affymetrix U133plus2 del Institut Curie de acuerdo con el protocolo convencional. La normalización se realizó con el algoritmo BrainArray35. El agrupamiento no supervisado se realizó en función de la característica intrínseca36.
Procesamiento de los perfiles genómicos
El perfil genómico de 85 BLC se realizó utilizando dos plataformas: Illumina (Illumina SNP HapMap 300K Duo, 33 casos) y Affymetrix (Affymetrix SNP Chip 6.0, 52 casos).
Plataforma Illumina: El perfil genómico de las muestras tumorales se realizó mediante un proveedor de servicios (Integragen, Evry, Francia) en matrices de SNP Illumina 300K (Human Hap300-Duo). Se procesaron los archivos de datos sin procesar mediante BeadStudio 3.3 en configuraciones convencionales utilizando datos de respaldo proporcionados por Illumina (HumanHap300v2_A). Las señales específicas de alelo (X e Y en la notación de BeadStudio) se procesaron en la relación Log R y la frecuencia del alelo B mediante el algoritmo tQN.37
Plataforma Affymetrix: La hibridación se realizó en el Institut Curie en una matriz Affymetrix SNPChip6.0. Se procesaron los archivos de células mediante Genotyping Console 3.0.2. Los perfiles Log2Ratio y Allele Difference resultaron del análisis del número de copias y de la p Dh realizado con el archivo de modelo de referencia HapMap270 (GenomeWideSNP_6.hapmap270.na29) proporcionado por Affymetrix.
Control de calidad: Se descartaron 20 matrices de SNP debido a: baja calidad de hibridación (3 matrices); bajo contenido tumoral y/o interpretación ambigua del perfil (17 matrices).
Número de copias segmentarias y detección de genotipos: Los datos de las matrices de SNP de Illumina y Affymetrix se extrajeron utilizando el método GAP descrito y validado anteriormente: se detectaron números de copias segmentarias, contenidos alélicos (recuentos de alelos principales) y contaminación celular normal; se optimizaron las segmentaciones con respecto al estado genómico detectado. 27
El reconocimiento del número absoluto de copias varió entre 0 y 8 copias, y a todos los segmentos que excedieron el nivel de 8 copias se les asignó el estado de 8 copias. Por lo tanto, se discriminaron 22 posibles genotipos segmentarios (número de copias/recuento de alelos principales): 1 copia A (o 1/1); 2 copias AA (2/2) y AB (2/1); 3 copias AAA (3/3), AAB (3/2); 4 copias AAAA (4/4), AAAB (4/3), AABB (4/2), etc...
Número de cromosomas: El número de cromosomas se estimó por la suma de los números de copias detectados en las regiones pericéntricas. El estado de la región pericéntrica de cada brazo cromosómico se definió por el segmento yuxtacentromérico correspondiente cuando este último contenía 500 SNP o más. Cuando no es medible, los valores faltantes se sustituyeron por el número de copias modal del brazo cromosómico considerado (3,4 ± 2,2 de 41 brazos cromosómicos por genoma se sustituyeron en la serie). El procedimiento de recuento de cromosomas se validó mediante la comparación de los números de cromosomas estimados frente a los números disponibles de los datos de cariotipo o SKY para 25 estirpes celulares de cáncer de mama {http://www.lgcstandards-atcc.org/}. La tasa de error fue inferior a 2 cromosomas por muestra (1,58 ± 2,3).
Recuentos de puntos de rotura: El número de puntos de rotura en cada perfil genómico se estimó en función del perfil de número de copias interpretable resultante y después de filtrar menos de 50 variaciones de SNP. Las pequeñas alteraciones intersticiales se definieron como alteraciones <3 Mb rodeadas por los segmentos con estado idéntico para el genotipo y el número de copias. Se eliminaron al estimar el número total de puntos de rotura. Las transiciones de estado a gran escala (LST) se calcularon después de suavizar y filtrar la variación de menos de 3 Mb de tamaño.
Compilación de conjuntos de validación
La serie de validación comprende 55 muestras que incluyen TNBC de una cohorte de mujeres jóvenes con cáncer de mama (17 casos); BLC con características medulares (8 casos) y un BLC surgido en un portador de la mutación en BRCA2; BLC BRCA1 de GEO GSE19177 (12 casos)38; tumores de tipo basal de GEO GSE32530 (4 casos)39; BLC BRCA1 del Institut Bergonié (5 casos).
Las estirpes celulares de tipo basal con perfil de matrices de SNP disponible comprendían 17 casos (15 casos hibridados en el Institute Curie y 2 casos se obtuvieron del sitio web del Wellcome Trust Sanger Institute Cancer Genome Project.
Resultados
Estado BRCA1 de los carcinomas de tipo basal (BLC)
Una serie de 65 carcinomas de mama de tipo basal bien caracterizados incluyó 23 tumores surgidos en pacientes que portaban mutaciones en BRCA1 perjudiciales (denominados en el presente documento BLC "BRCA1") y 42 BLC surgidos en pacientes sin evidencia de predisposición familiar de cáncer de mama/ovario o resultado negativo para mutaciones en BRCA1/2 (denominados en el presente documento "BLC esporádicos"). Los BLC esporádicos se analizaron para la metilación del promotor de BRCA1 y casi el 25 % resultaron positivos (11 de 41 analizados, denominados en el presente documento BLC "meBRCAT). No se encontró evidencia de metilación en los 31 casos restantes. El estado BRCA1 se confirmó por la expresión génica en 35 de los 36 casos analizados con datos transcriptómicos disponibles. Los BLC BRCA1 y meBRCA1 comprenden el grupo de tumores con inactivación de BRCA1 probada (34 casos), que además se compararon con el grupo de BLC presumiblemente no BRCAl (31 casos).
La casi diploidía en BLC tiene un valor previsto positivo del 75 % de inactivación de BRCA1
Con el fin de obtener información sobre las alteraciones genómicas específicas de los BLC, se realizó el perfil genómico utilizando matrices de SNP, que proporcionan dos medidas complementarias: variación del número de copias y desequilibrio alélico. La metodología Genome Alteration Print (GAP) para extraer matrices de SNP27 permitió obtener los perfiles de genotipos segmentarios (por ejemplo, números exactos de copias y contenidos alélicos: A, AB, AA, AAB, AAA,...) para cada muestra. Las características genómicas generales tales como el número de cromosomas, índice de ADN, el número de roturas cromosómicas y las proporciones del genoma en cada estado genómico se infirieron a partir de los perfiles de genotipo segmentario.
Los recuentos de cromosomas estimados por genoma mostraron una distribución bimodal (Figura 1, panel superior) similar a la demostrada para los genomas en varios tipos de cánceres40. Se consideró que los genomas tumorales que portaban menos de 50 cromosomas y con un índice de ADN cercano a 1 tenían una ploidía de dos y en adelante se denominaron "genomas casi diploides" (23 casos). Siguiendo la hipótesis de la duplicación del genoma completo durante la progresión del cáncer que explica el segundo modo en la distribución cromosómica40 se consideró que los genomas tumorales con más de 50 cromosomas y un índice de ADN superior a 1,2 tenían una ploidía de cuatro y, a partir de entonces, se denominaron "genomas sobrediploides" (42 casos).
Curiosamente, los 23 tumores casi diploides casi siempre portaban mutación germinal o inactivación epigenética de BRCA1 (20/23) a diferencia de los tumores sobrediploides, que se enriquecieron ligeramente en BLC no BRCAl (28/42) (Figura 1, panel inferior). Teniendo en cuenta el hecho de que la mutación germinal en BRCA1 es responsable de cerca del 10 % de los carcinomas de tipo basal41, se estimó que el valor previsto positivo del estado genómico casi diploide era del 75 %.
Los reordenamientos cromosómicos a gran escala discriminan carcinomas de tipo basal BRCA1 y no BRCA1
El número total de puntos de rotura detectados en el genoma del cáncer caracteriza el nivel de inestabilidad genómica. Sin embargo, la comparación global de tumores BRCA1 frente a no BRCAl no muestra ninguna diferencia significativa (valor de p = 0,28). En el subgrupo de 42 BLC sobrediploides, 14 tumores con BRCA1 inactivado mostraron un número total elevado de puntos de rotura (intervalo [57 - 224], 140,6 ± 45,7), mientras que 28 tumores no BRCAl mostraron una heterogeneidad significativa (intervalo [8-213], 101,2 ± 50,6) y se enriquecieron en los valores bajos en comparación con tumores BRCA1 (p <0,017, prueba de rangos de Wilcoxon). Sin embargo, una gran superposición en los números de punto de rotura impidió una demarcación precisa.
Para obtener una estimación sólida y discriminatoria de la inestabilidad genómica, se evaluó el número de transiciones de estado a gran escala (LST) mediante el cálculo de roturas cromosómicas entre regiones adyacentes de al menos 10 Mb (que comprenden ~3000 SNP en Affymetrix SNP6.0).
El número de LST en el subgrupo de tumores sobrediploides tuvo una distribución bimodal con una clara brecha entre dos modos (12,5 ± 4,9 y 35,5 ± 6,7) que separan 18 BLC no BRCAl de la mezcla que contiene 14 tumores con BRCA1 inactivado y 10 tumores sin ninguna mutación germinal en BRCA1 ni metilación del promotor de BRCA1 (Figura 2). En el subgrupo de 23 BLC casi diploides, que contenía principalmente tumores BRCA1, las LST tenían una distribución unimodal (28,0 ± 6,5) con dos tumores no BRCAl dentro de una desviación típica (24 y 28 LST) y un BLC no BRCAl por debajo de dos desviaciones típicas del promedio (12 LST). Curiosamente, todos los tumores con LST bajas no tenían evidencia de inactivación de BRCA1 y mostraron pocas roturas cromosómicas y un nivel elevado de aneuploidía (3 muestras) o alteraciones de tipo firestorm (16 muestras).
Para concluir, las LST reflejaron bien los patrones genómicos generales de los tumores, contrario al número total de puntos de rotura, y proporcionaron los valores discriminativos para la predicción del estado BRCA1.
Una regla de decisión de dos etapas detecta de manera coherente la inactivación de BRCA1 en BLC.
Basándose en las distribuciones de LST descritas anteriormente, se aplicaron dos referencias para la predicción de BRCAness, más de 15 LST por genoma en los casos casi diploides y más de 20 LST en los casos de sobrediploides, predicción de BRCAness con 100 % de sensibilidad (valor de p = 4 * 10-5, prueba de Fisher).
Además, todos los casos "falsos positivos" (en lo sucesivo llamados BLC "con aspecto de BRCA1") tenían una cantidad de LST similar al de los casos "verdaderos positivos" (con estado de BRCA1 inactivado demostrado), que en realidad cuestionaba su estado de falso positivo y podría evidenciar otros mecanismos de defectos de recombinación homóloga, incluidas mutaciones en BRCA1 o BRCA2. Dichas mutaciones se buscaron en 28 BLC esporádicos con material disponible, incluidos 13 casos con el patrón de aspecto de BRCA1. Se encontraron mutaciones en BRCA1 perjudiciales en seis casos, todos pertenecientes a tumores con aspecto de BRCA1 (valor de p = 0,02). Se encontraron mutaciones en BRCA2 perjudiciales en tres casos, todos pertenecientes a tumores con aspecto de BRCA1. Con estos hallazgos la especificidad alcanzó el 89 % (valor de p = 1,4 * 10-11, prueba de Fisher) en el conjunto experimental considerado de BLC (Figura 3A).
Se reunió una serie de validación de 55 BLC/TNBC, que incluían 15 casos con mutaciones germinales en BRCA1, 15 casos con metilación del promotor de BRCA1, 1 caso con una mutación germinal en BRCA2 y 24 casos esporádicos. Los datos de la matriz de SNP se procesaron utilizando el mismo flujo de trabajo. La predicción de la inactivación de BRCA1 mostró una sensibilidad del 100 % (se predijo que los 30 casos de BRCA1 inactivado serían con aspecto de BRCA1) y una especificidad del 80 % (se predijo que 11 casos serían con aspecto de BRCA1 sin aún evidencia de inactivación de BRCA1) (Figura 3B; valor de p = 1,7 * 10-6, prueba de Fisher). Cabe señalar que el tumor con BRCA2 mutado era casi diploide con un número de LST elevado, siguiendo claramente un patrón con aspecto de BRCA1.
Los sistemas modelo apoyaron las características discriminativas observadas en los tumores primarios
Se analizó una serie de 17 estirpes celulares de tipo basal, que incluían MDA-MB-436 y HCC1937 con mutaciones en BRCA142 y HCC38 con metilación del promotor de BRCA143. Los resultados obtenidos siguieron la tendencia encontrada en los tumores primarios: en primer lugar, la única estirpe celular casi diploide encontrada fue MDA-MB-436 con BRCA1 mutado; en segundo lugar, entre las estirpes celulares sobrediploides, HCC1937 y HCC38 portaron el mayor número de roturas cromosómicas a gran escala, lo que nuevamente es coherente con su estado de BRCA1 inactivado. Sin embargo, y como era de esperar teniendo en cuenta el establecimiento de la estirpe celular y el mantenimiento a largo plazo en cultivo, se encontró que el límite que separa las estirpes celulares no BRCA1 cambió a 23 LST (Figura 4). Una estirpe celular HCC1599 tenía un número de LST muy cercano al de las estirpes celulares con BRCA1 inactivado, mientras que no está asociada con mutación en BRCA1/244. Para aclarar la función de BRCA1 y de manera más precisa la ruta de la recombinación homóloga, los focos de RAD51 se midieron 8 horas después de las radiaciones ionizantes en estirpes celulares de BLC. Todas las estirpes celulares sin patrón con aspecto de BRCA1 tenían la acumulación esperada de focos de RAD51, mientras que no se observaron focos en estirpes celulares con patrón con aspecto de BRCA1, incluyendo HCC1599 (datos no mostrados).
En conclusión, los inventores han demostrado que es posible predecir una deficiencia tumoral en la ruta de la recombinación homóloga (RH) del ADN en un paciente que padece cáncer, mediante la cuantificación del número de reordenamientos en el ADN genómico de una muestra tumoral obtenida de dicho paciente, en donde el número de reordenamientos corresponde al número, por genoma, de puntos de rotura que dan como resultado segmentos de al menos 10 megabases.
Se obtuvieron resultados similares utilizando un valor de corte entre 3 megabases y 20 megabases para la definición de transiciones a gran escala.
EJEMPLO 2- Rendimiento del número de LST que predice BRCAness en todos los tipos de carcinomas de mama.
Se consideró la serie de 426 tumores de mama (carcinomas ductales invasivos que incluyen tumores HER2 positivos, luminales (por ejemplo, que expresan receptores de estrógeno o progesterona), carcinoma de mama de tipo basal/triple negativo (por ejemplo, que no expresa receptores hormonales y no sobreexpresa HER2) así como subtipos raros tales como carcinomas medulares o carcinomas micropapilares del Institut Curie). La serie se enriqueció con tumores con BRCA1 y BRCA2 mutados. Los puntos de corte en el número de LST que predicen BRCAness se infirieron en base a esta serie (Tabla 1). Las tasas de falsos positivos y verdaderos positivos (TFP y TVP) muestran la calidad del factor pronóstico de BRCAness basado en LST.
Tabla 1. Puntos de corte para la predicción de BRCAness del cáncer de mama basada en el número de LST
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EJEMPLO 3 - El número de LST es un buen factor pronóstico de la respuesta al tratamiento
Se procesaron dos conjuntos de datos disponibles públicamente del ensayo clínico del tratamiento con cisplatino de pacientes con tumores de mama triple negativos [base de datos GEO GSE28330] [59] y se calculó el número de LST_10 Mb para cada tumor con una buena calidad del perfil medido. Los perfiles genómicos se midieron mediante dos tipos de chip: Affymetrix Oncoscan 70K (Conjunto de datos 2) y Oncoscan 300K (Conjunto de datos 1). La información sobre el estado mutacional de BRCA1/2 estaba disponible para algunos tumores. La respuesta al tratamiento se midió mediante la puntuación de Miller-Payne, donde 4 y 5 se consideraron como "respuesta positiva", mientras que puntuaciones <4 se consideraron como "sin respuesta" [59] Los resultados resumidos y caso por caso se presentan en la tabla 2 y las tablas 3 a 5 (las comparaciones estadísticas se realizaron mediante la prueba exacta de Fisher). Para concluir, (i) casi todos los casos de BRCA1/2 inactivado conocidos (17/18) y 15 tumores con estado de BRCA1/2 de tipo silvestre o desconocido se clasificaron como LST_elevada (Tabla 3); (ii) la inactivación de BRCA1/2 no siempre significa respuesta a cisplatino (Tabla 4); (iii) LST_10 Mb es un mejor factor pronóstico de respuesta de cisplatino que el estado BRCA1/2 (Tabla 4 y 5).
Tabla 2. Resultados individuales
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(continuación)
Figure imgf000031_0001
(continuación)
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Tabla 3. Sumario de LST frente a BRCA1/2
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Tabla 4. Sumario de BRCA1/2 frente a Res uesta
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Tabla 5. Sumario de LST frente a Res uesta
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EJEMPLO 4 - LST en carcinoma de ovario
Las series de carcinoma de ovario de alto grado del Institut Curie se perfilaron mediante matrices de SNP (Affymetrix CytoScanHD). Todos los pacientes se trataron con quimioterapias que incluían sales de platino. Los genomas tumorales se anotaron como LST_elevadas (50 casos) y LST_bajas (20 casos) según LST_6 Mb con los valores de corte 19 y 32 LST para tumores casi diploides y casi tetraploides, respectivamente. La comparación de la supervivencia general y la supervivencia sin acontecimientos mostró un mejor resultado para los pacientes con tumores LST_elevadas, lo que indica mejor respuesta al tratamiento (Figuras 5 y 6).
EJEMPLO 5 - LST en estirpes celulares tumorales
Se analizaron series de estirpes de células tumorales con estado BRCA conocido y con datos de matrices de SNP disponibles. Se calculó LST_10 Mb y las muestras con LST elevadas se vincularon con la inactivación de BRCA2 en estirpes celulares de carcinoma de cuello uterino y páncreas. Dos estirpes celulares de pulmón sin mutaciones BRCA1/2 conocidas tienen un elevado nivel de LST, presumiblemente debido a la metilación de BRCA1 descrita en esta enfermedad [60] (Figura 7).
Esta validación del método en estirpes de células tumorales de diversos orígenes y estados de diferenciación indica que la medición de LST y la predicción de BRCAness se pueden aplicar en todo tipo de tumores.
EJEMPLO 6 - LST en tumores luminales y que sobreexpresan HER2
Este ejemplo demuestra el rendimiento elevado de la característica genómica LST para la detección de DRH en cánceres de mama y muestra su potencial como biomarcador para pruebas genéticas y estratificación de pacientes para ensayos clínicos que evalúan sales de platino e inhibidores de PARP.
Materiales y métodos
Pacientes y tumores
Cohorte de descubrimiento. Se reunió una serie de 456 carcinomas de mama invasivos con perfiles de matrices de SNP de elevada calidad utilizando una serie interna publicada para contener carcinomas de mama esporádicos y hereditarios de diferentes fenotipos (61-65). Esta serie contenía 57 tumores que sobreexpresan HER2 (HER2+) y 399 tumores luminales (es decir, que expresan receptores de estrógeno o progesterona o ambos) e incluyeron 43 cánceres de mama hereditarios recogidos de portadoras de mutaciones germinales (16 BRCA1 y 27 BRCA2) y 28 casos de pacientes con antecedentes familiares de cáncer de mama que dieron negativo para BRCA1/2.
Cohortes de validación. (i) Cohorte TCGA: se utilizaron 467 tumores con perfil de matrices de SNP de elevada calidad y resultados de secuenciación de exoma normal/tumoral disponibles en formato de llamada variante (flv) del conjunto de datos de carcinoma invasivo de mama del TCGA. (ii) Cohorte interna de TNBC: una serie de 104 TNBC enriquecidos en casos de BRCAi con mutación germinal. (iii) los datos disponibles públicamente de las cohortes de ensayos clínicos de cisplatino-1 y cisplatino-2: Se obtuvieron 54 TNBC con perfil de matriz Oncoscan (Affymetrix) de calidad adecuada del repositorio GEO público GSE28330 (66).
Procesamiento de matrices de SNP y evaluación de números de LST
Los datos de la matriz de SNP se procesaron utilizando la metodología GAP para obtener el número de copias (NC) absoluto y los perfiles de contenido alélico. Se extrajeron los contenidos alélicos en loci de genes BRCA1/2. Los loci BRCA1/2 se comprobaron en busca de eliminaciones homocigóticas. El índice de ADN se calculó como el NC promediado. La ploidía tumoral se fijó en 2 (tumores casi diploides) o 4 (tumores casi tetraploides), si el índice de ADN era inferior o superior a 1,3. Se llamó amplificación cuando el número de copias fue igual o mayor a 2 veces la ploidía tumoral. La DRH se predijo en función del número de transiciones de estado a gran escala (LST). En resumen, una LST se definió como un punto de rotura cromosómico (cambio en el número de copias o recuentos de alelos principales) entre regiones adyacentes, cada una de al menos 10 megabases (Mb) obtenidas después de suavizar y filtrar la variación del número de copias a pequeña escala (menos de 3 Mb). Se contó el número de LST para cada tumor. Se utilizaron dos valores de corte específicos de ploidía (15 y 20 para genomas casi diploides y casi tetraploides, respectivamente) para clasificar los tumores como "LSTelevada" (número de LST > valor de corte, DRH) o "LSTbaja" (número de LST < valor de corte, sin DRH).
Secuencia de los genes BRCA1 y BRCA2 en el ADN tumoral
Los genes BRCA1 (NM_007294.2) y BRCA2 (NM_000059.3) se seleccionaron mediante análisis de mutación de desajuste mejorado o mediante secuenciación paralela masiva. La validación de variantes se realizó mediante secuenciación de Sanger de acuerdo con protocolos convencionales. El análisis se realizó en la versión hg18 del genoma humano. La patogenia de las mutaciones de sentido alterado se evaluó utilizando los algoritmos de predicción (tales como phyloP, Grantham, align GVGD, SIFT, MaxEnt y NNSPLICE HSF) disponibles en el programa informático Alamut Visual versión 2.4 (Interactive Biosoftware, Rouen, Francia) y las bases de datos de predicción disponibles en LOVD (67) y UMD (68). Las mutaciones clasificadas como variante desconocida y de significado incierto no se consideraron patogénicas para los análisis. Se buscaron reordenamientos grandes mediante amplificación de sonda dependiente de unión múltiple utilizando el kit SALSA MLPA probemix P002 BRCA1/2 (MRC-Holanda).
Metilación de los promotores de BRCA1 y RAD51C
La metilación del promotor de BRCA1 se evaluó como se describió previamente (28). La metilación del promotor de RAD51C se evaluó mediante pirosecuenciación de acuerdo con el protocolo en (69)
Datos transcriptómicos
La expresión génica se analizó en matrices de expresión de genoma completo Affymetrix U133 Plus 2.0 y en Illumina Human WG-6 V3 BeadArrays, procesadas de acuerdo a los protocolos correspondientes. Los datos sin procesar para la plataforma Affymetrix se normalizaron mediante la normalización Brainarray CDF y GC-RMA. Los datos de expresión de Illumina se normalizaron utilizando Illumina BeadStudio con la configuración convencional. Todos los demás análisis se realizaron con el paquete de computación estadística R 2.15.1.
Subtipos moleculares en la cohorte TCGA
Para la subtipificación molecular de los carcinomas de mama invasivos TCGA, se utilizó el sumario de expresión génica de RPKM (lecturas por kilobase de transcripción por millón de lecturas mapeadas) a partir de datos de RNA-seq. El subtipo molecular triple negativo se identificó en función de la agrupación de tumores utilizando el conjunto de genes definido por Sorlie y Coll. (36). Los tumores HER2+ se identificaron en función de la expresión de ERBB2, teniendo en cuenta la puntuación de proliferación y el número de copias en el locus del gen. Las puntuaciones de proliferación se obtuvieron utilizando las puntuaciones del primer componente principal del análisis del conjunto de genes que contiene dianas E2F1. La sobreexpresión génica extrema o sobreexpresión moderada y el locus del gen amplificado indicó el subtipo HER2+. Se utilizó la anotación clínica del tumor TCGA para la confirmación. Las anotaciones discordantes comprendieron el 6 % (28/467).
Detección de la metilación del promotor de BRCA1 o RAD51C en la cohorte TCGA
Se extrajeron conjuntos de sondas relacionados con los genes BRCA1 y RAD51C de los conjuntos de datos TCGA de metilación de genes HumanMethylation27 y HumanMethylation450 (matrices Illumina Infinium Beadchip). Un valor elevado de la sonda cg04658354 y la disminución extrema en BRCA1 junto con una puntuación de proliferación elevada indicaron que la muestra tenía metilación del promotor de BRCA1. Las señales del conjunto de sondas de metilación de RAD51C eran irrelevantes para la característica medida y se ignoraron; la disminución extrema en RAD51C junto con una puntuación de proliferación elevada indicó que las muestras tenían metilación del promotor de RAD51C.
La llamada mutación perjudicial en TCGA
Se consideró cada variante de secuencia detectada en tumores mediante secuenciación del exoma junto con la frecuencia alélica alternativa (en la normalidad y en el tumor), el contenido alélico tumoral y la contaminación detectada a partir de matrices de SNP. Las mutaciones de sentido alterado clasificadas como variante desconocida y de significado incierto se consideraron no patogénicas.
Estadísticas
Los intervalos de confianza se calcularon utilizando el método exacto de Clopper-Pearson para proporciones.
Resultados
Un número elevado de LST identifica DRH en carcinomas de mama invasivos
Con el fin de evaluar la DRH en diferentes subtipos de carcinomas de mama, se reunió un conjunto de descubrimiento de 57 tumores HER2 amplificados y 399 luminales con perfiles de matrices de SNP de calidad elevada. Este conjunto contenía 43 cánceres de mama hereditarios recogidos de portadoras de mutaciones germinales (16 y 27 BRCA1 y BRCA2, respectivamente) y 28 de pacientes con antecedentes familiares de cáncer de mama que dieron negativo para BRCA1/2. La ploidía tumoral se infirió a partir de los perfiles de número de copias absoluto, identificando 317 tumores casi diploides y 139 casi tetraploides. Se evaluó el número de transiciones de estado a gran escala (LST) para cada tumor. Según los valores de corte específicos de ploidía definidos para TNBC (es decir, 15 y 20 LST para tumores casi diploides y casi tetraploides, respectivamente), los tumores se clasificaron como LSTelevada (55 casos, 27 casi diploides y 28 casi tetraploides) o como LSTbaja (401 casos, 290 casi diploides y 111 casi tetraploides). El estado de los genes BRCA1 y BRCA2 se investigaron en los grupos tanto de "LSTelevada" como de "LSTbaja", siguiendo la hipótesis de que la característica LST es un marcador sustituto de DRH, que define la DRH genómica (LSTelevada) o sin DRH (LSTbaja).
Exploración del origen de la DRH en tumores clasificados como LSTelevada
La mayoría de tumores LSTelevada en la cohorte de descubrimiento estaban relacionados con una mutación germinal en BRCA1 o BRCA2 conocida (36/55) y, de manera recíproca, la mayoría de los tumores con mutación germinal en BRCA1 o BRCA2 conocida se clasificaron como LSTelevada (16/16 casos BRCA1 y 20/27 BRCA2). El estado del segundo alelo del gen correspondiente se evaluó mediante resecuenciación y/o genotipado y se confirmó que estaba inactivado en la mayoría de los casos (13/16 y 19/20 casos para BRCA1 y BRCA2, respectivamente). El origen de la DRH se investigó en los 23 casos LSTelevada, que incluía 4 casos con mutaciones germinales en BRCA y retención de heterocigosidad (RDH) en el locus correspondiente, 2 casos con antecedentes familiares que dieron negativo para mutaciones en BRCA y 16 casos no probados para mutaciones. En un caso, el origen de la DRH se proporcionó mediante el perfil genómico que muestra una clara eliminación bialélica en el locus BRCA2. Se buscaron mutaciones en BRCA1 y BRCA2 mediante secuenciación paralela masiva o mediante un método de detección heterodúplex en 15 tumores con ADN tumoral disponible (14 no probados previamente y 1 con mutación germinal en BRCA2). En total, se encontraron 10 tumores y se validó que tuvieran alteración bialélica en BRCA: 7 casos con mutaciones perjudiciales en BRCA2 y 1 caso con una mutación de sentido alterado en BRCA1 (de significado desconocido), todos asociados con la pérdida del alelo de tipo silvestre correspondiente; 1 caso con dos mutaciones sin sentido en BRCA2, presumiblemente en trans; y 1 con mutación perjudicial somática en BRCA2 además de la germinal. En los cinco casos restantes se encontró mutación no perjudicial en BRCA o grandes reordenamientos de estos genes. La metilación del promotor de BRCA1 se buscó adicionalmente en 4 de estos casos con material disponible y se encontró positiva en un caso. Se demostró que la inactivación epigenética de RAD51C ocurre en algunos carcinomas de ovario serosos de grado elevado y se asocia con DRH (70), por lo tanto, la metilación del promotor de RAD51C también se consideró en esta cohorte de descubrimiento. Los dos únicos casos extremos de RAD51C disminuidos correspondieron a los 2 casos sin explicación de LSTelevada (2/326 con datos transcriptómicos disponibles) de los que se obtuvo una demostración directa de metilación del promotor de RAD51C. Curiosamente, uno de estos casos fue el tumor de un portador de la mutación en BRCA2 sin inactivación de BRCA2 debido a la retención del alelo tipo silvestre BRCA2 en el tumor. En conclusión, la gran mayoría de los 48 tumores LSTelevada ampliamente evaluados portaban una causa identificada de DRH (44/48, 92 %), incluidos 12 casos de novo sin antecedentes familiares (de 15 evaluados).
Exploración de la DRH en tumores clasificados como LSTbaja
La gran mayoría de los 401 tumores LSTbaja no tenían evidencia de mutaciones germinales en BRCA y no se encontró evidencia de disminución en RAD51C en este subgrupo. No obstante, el subgrupo LSTbaja contenía 2 casos con una clara eliminación bialélica en BRCA2 y 7 casos de portadores de mutación en BRCA2 (ninguno portador de mutación en BRCA1). El estado del segundo alelo BRCA2 se evaluó mediante resecuenciación y/o genotipificación. En dos casos, el locus BRCA2 mostró RDH y el cribado completo de BRCA2 del ADN tumoral no reveló mutaciones adicionales. En un caso, el locus BRCA2 mostró pérdida de heterocigosidad (PDH) debido a la pérdida del alelo mutado. En los 4 casos restantes, se confirmó la pérdida del alelo de tipo silvestre. Curiosamente, estos 4 casos eran tumores casi diploides con 12 o 13 LST, que estaban cerca del límite que define la DRH de 15 LST. Por consiguiente, se hizo un esfuerzo adicional para caracterizar los casos con un número de LST inmediatamente por debajo de los límites específicos de ploidía. Se investigaron diez casos con material disponible mediante secuenciación paralela masiva. Se encontraron dos casos mutados para BRCA2 (con PDH en el locus correspondiente): una mutación interruptora y una mutación de sentido alterado con significado desconocido. La metilación del promotor de BRCA1 se examinó en seis de estos casos límite y se encontró positiva en un caso. No se encontró evidencia de inactivación de BRCA1 o BRCA2 en los 7 tumores restantes. En conjunto, sólo se encontraron 8 casos con evidencia de inactivación de BRCA entre los 401 tumores LSTbaja, incluidos 6 tumores casi diploides con un número de LST cercano al límite que define la DRH genómica y 2 casos excepcionales con eliminaciones bialélicas en BRCA2 pero con un número de LST bajo (7 y 10) (Figura 11; Tabla 6).
Tabla 6: DRH en tumores de mama luminales HER2+ en la cohorte de descubrimiento
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continuación
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Por lo tanto, 44/55 (80 %) de tumores LSTelevada y 8/401 (2 %) LSTbaja se encontraron inactivados para BRCA1, BRCA2 o RAD51C en este gran conjunto de descubrimiento, incluyendo 11 casos LSTelevada con BRCA inactivado sin antecedentes familiares y, por el contrario, 3 casos LSTbaja en portadores de mutantes BRCA1 o BRCA2 con retención del correspondiente alelo de tipo silvestre en el tumor (Figura 12).
La característica LST identifica DRH en el conjunto de validación
Para validar los hallazgos, el subconjunto de 467 tumores con matrices de SNP, metilación y perfiles de expresión de calidad elevada, así como los datos de secuenciación tumoral/normal, se seleccionaron del conjunto de datos de carcinoma de mama invasivo TCGA. La gran diversidad de subtipos histológicos, tales como los carcinomas de tipo basal/triple negativos, mucinosos, lobulares, medulares y papilares incluidos en esta serie y la extensa caracterización molecular con datos completos de secuenciación disponibles representan las principales ventajas de esta serie. Los datos de TCGA se analizaron utilizando el mismo enfoque que el utilizado en el conjunto de descubrimiento que es la clasificación genómica de tumores en DRH (59 LSTelevada) y sin DRH (408 LSTbaja) completada por la evaluación del estado mutacional de los genes BRCA1/2 y por el nivel de expresión/metilación del promotor de BRCA1 y RAD51C.
El grupo LSTelevada contenía 59 casos totales divididos en: 16 casos con metilación del promotor de BRCA1; 14 casos con mutaciones perjudiciales en BRCA1 (9 casos) o BRCA2 (5 casos) junto con la pérdida del alelo de tipo silvestre del gen correspondiente (ambos respaldados por la frecuencia del alelo mutado adecuado en los datos de secuenciación del exoma y por la PDH en los perfiles genómicos); 1 caso con 2 mutaciones perjudiciales en BRCA2 (presumiblemente en trans); 4 casos con eliminaciones homocigóticas en BRCA1 (2 casos) o BRCA2 (2 casos); 3 casos con mutaciones de sentido alterado perjudiciales en BRCA1 y PDH; 3 casos con disminución en RAD51C presumiblemente debida a la metilación del promotor y 1 mutación germinal truncada en RAD51C con pérdida del alelo de tipo silvestre; y 17 casos sin explicación, incluido 1 caso con variante BRCA2 de significado desconocido y PDH. Para explicar estos casos LSTelevada inexplicables sin ninguna inactivación de BRCA1/2 ni RAD51C, se buscaron mutaciones perjudiciales asociadas con la PDH en un conjunto de genes implicados en la respuesta al daño del ADN, tales como BRIP1, PALB2, parálogos de RAD51, ATM, ATR y WRN. No se encontró inactivación de estos genes en los 17 casos LSTelevada sin explicación. Los pocos casos compatibles con inactivación bialélica de FANCM (1 caso), RAD51B (1 caso), WRN (1 caso) y ATM (6 casos) pertenecían al subgrupo LSTbaja. Un tumor con una mutación perjudicial de ATM también se inactivó para BRCA1, lo cuál es la explicación más probable para su estado LSTelevada. Se encontraron 36 casos amplificados en loci EMSY (c11orf30), que se ha descrito asociado con la función de BRCA2 (71). Sin embargo, sólo dos casos con amplificación de EMSY pertenecían al subgrupo LSTelevada, cada uno con inactivación de BRCA1 o BRCA2 (Tabla 7).
Tabla 7: DRH en la cohorte de validación TCGA en todos los subtipos principales de tumores de mama: ____________________________________ TNBC, luminal y HER2+____________________________________ LSTelevada LSTbaja
verdadero positivo falso positivo
DRH probada 14 Mutación EG en BRCA + con pérdida de 3 Mutación en BRCA + pérdida de alelo ts alelo ts
* Mutación en BRCA + sentido alterado
| Metilación del promotor de BRCA1
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ero negativo
DRH no 1 Mutación EG en BRCA + retención de 1 Mutación en BRCA + retención de alelo detectada alelo ts ts
Total
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* clasificada como perjudicial
** mutaciones de significado desconocido
ts: tipo silvestre; mutación: variante de secuencia perjudicial si no se especifica lo contrario; DRH Deficiencia en la recombinación homóloga.___________________________________________________________________________
El subgrupo LSTbaja contenía 5 casos con evidencia de modificaciones en BRCA1 y BRCA2, a saber, un caso con metilación de BRCA1 y 4 casos mutados con pérdidas del alelo de tipo silvestre correspondiente: una eliminación en el marco en BRCA2, una mutación interruptora en BRCA2 (Y3308*), una mutación de empalme en BRCA1 y una mutación con cambio de marco en BRCA2. No se encontró evidencia de DRH asociada a BRCA en los 403 casos restantes.
En conjunto, el estado LSTelevada se asoció con la causa identificada de DRH en el 73 % (43/59) de los casos; mientras que solo el 1,2 % (5/408) de los tumores clasificados como LSTbaja tenían modificaciones en los genes BRCA1/2. Por lo tanto, el rendimiento de la característica LST en toda la cohorte TCGA de carcinomas de mama invasivos fue del 73 % de sensibilidad y del 98 % de especificidad.
DRH en los principales subtipos histológicos de cáncer de mama
Se evaluó la incidencia y el origen de la DRH así como el rendimiento de la característica genómica LST en la predicción de la DRH para cada uno de los principales subtipos de cáncer de mama, a saber, tumores triple negativo, luminales y HER2+ (Tabla 8). Los análisis se realizaron de manera independiente en las cohortes de descubrimiento (interno) y TCGA. Se encontró que las tasas y las causas de la DRH eran similares en las cohortes TCGA y de descubrimiento, cuando se eliminaron los casos con antecedentes familiares de enfermedad de esta última (sin diferencias significativas por las pruebas de Fisher y Chi-cuadrado en las tasas y distribuciones). Por motivos de claridad, se describen además los resultados a partir de las cohortes combinadas (Tabla 8).
Tabla 8: Tasa ori en de la DRH en los subti os de^ cáncer de mama
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continuación
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TNBC. La DRH definida por la característica genómica LST se encontró a una tasa del 52 % (69/132, IC 95 %: 43­ 61 %). La mayoría de los casos de DRH se asociaron con la inactivación de BRCA1, ya sea mediante mutaciones/eliminaciones (24/69, 35 %) o mediante metilación del promotor (23/69, 33 %), y rara vez mediante inactivación de BRCA2 (9/69, 13 %) o metilación de RAD51C (3/69, 4 %). La predicción de la característica LST obtenida para TNBC correspondió a una sensibilidad del 85 % y una especificidad del 98 % (es decir, un solo caso falso negativo con metilación de BRCA1). La DRH inexplicada comprendió 10 casos (15 %), que podrían incluir casos con inactivación no detectada de genes de la RH.
Tumores de mama luminales. En los 661 tumores luminales, se detectó DRH genómica en casi el 5 % (30/661, IC 95 %: 3-6 %) de los casos. La causa más frecuente de DRH fueron mutaciones bialélicas y/o eliminaciones en BRCA2 (12/30, 40 %), después inactivación de BRCA1 (8/30, 26 %) principalmente por metilación del promotor (6 de los 8 casos) y metilación del promotor de RAD51C (2/30, 7 %). Los resultados obtenidos para los tumores de mama luminales por la característica LST correspondieron a una sensibilidad del 74 % y una especificidad del 99 %. La DRH inexplicada ("falsos positivos") comprendió 8 casos, que incluía variantes de BRCA con significado desconocido y mutaciones perjudiciales en BRCA2 sin pérdida de alelo de tipo silvestre. Dos casos falsos negativos en realidad no eran incompatibles con la función de BRCA1/2 inalterada: una combinación de mutaciones perjudiciales de sentido alterado e interruptoras (con baja frecuencia alélica, posiblemente clonales) en BRCA1 y una variante de BRCA2 con consecuencia clínica desconocida (Y3308*). Sin embargo, 5 casos falsos negativos tenían inactivación comprobada de BRCA (2 eliminaciones homocigóticas en BRCA2 y 3 mutaciones perjudiciales con PDH) a pesar de la ausencia de DRH genómica
Tumores de mama HER2. Entre los 112 tumores que sobreexpresan HER2, se detectó DRH genómica en 10 casos (10/112, 9 %), incluyendo 3 casos con mutaciones perjudiciales en BRCA2 (2 casos) y metilación del promotor de BRCA1 (1 caso) (3/112 casos probados de DRH, IC 95 %: 1-8 %). El rendimiento de la característica LST en tumores HER2+ tiene una sensibilidad bastante baja (3/10, 33 %) debido a la rareza de los tumores HER2+ con DRH y la proporción elevada de falsos positivos. La mayoría de los falsos positivos (5/7) representaron los casos con un número de LST ligeramente por encima del umbral para la llamada d Rh . La comparación del número de LST en tumores HER2+ de grado elevado y tumores luminales de grado elevado demostró un nivel general más elevado de LST en tumores HER2+, lo que puede explicar la tasa elevada de los llamados falsos positivos. Una mutación de sentido alterado en BRCA1, una mutación de sentido alterado en BRCA2 y una pequeña eliminación en el marco en BRCA2 (todas con significado desconocido y asociadas con la pérdida del alelo correspondiente de tipo silvestre) se clasificaron como LSTbaja, proporcionando una especificidad del 100 % del clasificador de LST en tumores HER2+.
La mayoría de los TNBC que responden al tratamiento preoperatorio con cisplatino tienen un número elevado de LST
La DRH está relacionada con la respuesta a la quimioterapia basada en platino. Birkbak et al. analizaron los perfiles de matrices de SNP de una serie de 79 pacientes con TNBc , incluidos 28 pacientes tratados con cisplatino antes de la cirugía (ensayo de cisplatino-1) y 51 pacientes tratados con cisplatino además de bevacizumab (ensayo de cisplatino-2) (59). El número de LST se calculó para 54 tumores con una calidad aceptable de perfiles genómicos y mostró 33 tumores LSTelevada y 21 LSTbaja. La comparación entre el número de LST y la respuesta al tratamiento preoperatorio con cisplatino mostró que la gran mayoría de los que respondieron (evaluados por los investigadores como 4-5 en la puntuación de respuesta de Miller-Payne) se clasificaron como DRH que mostraban un número de LST elevado (18/33 frente a 1/21, valor de p <0,0001, prueba exacta de Fisher); la respuesta completa patológica (RCp) ocurrió para 11 tumores, todos clasificados como LSTelevada (valor de p<0,003, prueba exacta de Fisher) (Tabla 9).
T l 4: R l i l in n l n rn n v n TNB
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Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Un método para predecir deficiencia en la ruta de la recombinación homologa (RH) del ADN en un paciente que padece cáncer, que comprende
(1) cuantificar el número de reordenamientos en el ADN genómico de una muestra tumoral obtenida de dicho paciente, en donde el número de reordenamientos corresponde al número, por genoma, de puntos de rotura que dan como resultado segmentos de al menos 3 megabases; y
(2) determinar si dicha muestra tumoral comprende células que tienen una mutación genética en al menos un gen de la ruta de la RH seleccionado del grupo que consiste en BRCA1, BRCA2, PALB2/FANCN, BRIP1/FANCJ, BARD1, RAD51 y parálogos de RAD51 que son RAD51B, RAD51C, RAD51D, XRCC2 y XRCC3.
2. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el cáncer se selecciona de cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, carcinoma de cabeza y cuello y melanoma, preferentemente cáncer de mama, aún más preferentemente carcinoma de mama de tipo basal, luminal o que sobreexpresa HER2.
3. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el número de puntos de rotura que dan como resultado segmentos de al menos 3 megabases por genoma se cuantifica mediante la cuantificación del número de variaciones del número de copias por genoma.
4. Un método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la cuantificación del número de variaciones del número de copias por genoma se lleva a cabo mediante matriz de hibridación genómica comparativa (HGC) o matriz de polimorfismo mononucleotídico (SNP).
5. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además la etapa de evaluar la ploidía de la muestra tumoral, preferentemente mediante un método seleccionado del grupo que consiste en clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), hibridación in situ fluorescente (FISH) y matriz de polimorfismo mononucleotídico (matriz de SNP).
6. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde el número de reordenamientos en el ADN genómico se compara con una referencia.
7. Un método para predecir una deficiencia en la ruta de la recombinación homóloga (RH) del ADN en un paciente con cáncer, que comprende las etapas que consisten en:
- determinar la ploidía de la muestra tumoral;
- cuantificar el número de reordenamientos en el ADN genómico de una muestra tumoral obtenida de dicho paciente;
- comparar el número de reordenamientos por genoma con una referencia, en donde un número de reordenamientos que dan como resultado segmentos de al menos 3 megabases superiores a dicha referencia es indicativo de deficiencia en la RH,
- determinar si dicha muestra tumoral comprende células que tienen una mutación genética en al menos un gen de la ruta de la RH seleccionado del grupo que consiste en BRCA1, BRCA2, PALB2/FANCN, BRIP1/FANCJ, BARD1, RAD51 y parálogos de RAD51 que son RAD51B, RAD51C, RAD51D, XRCC2 y XRCC3.
8. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la etapa de cuantificar el número de reordenamientos en el ADN genómico de una muestra tumoral obtenida de dicho paciente y/o la etapa de evaluar la ploidía de la muestra tumoral se realiza mediante matriz de SNP.
9. Un método para predecir la eficacia de un tratamiento en un paciente con cáncer, en donde dicho tratamiento comprende un inhibidor de PARP y/o un agente alquilante, y en donde dicho método comprende la etapa que consiste en predecir una deficiencia en la ruta de la recombinación homóloga (RH) del ADN en dicho paciente de acuerdo con el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
10. Un método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde dicho inhibidor de PARP y/o agente alquilante se selecciona del grupo que consiste en iniparib, olaparib, rucaparib, CEP 9722, MK 4827, BMN-673, 3-aminobenzamida, complejos de platino tales como cisplatino, carboplatino y oxaliplatino, clormetina, clorambucilo, melfalán, ciclofosfamida, ifosfamida, estramustina, carmustina, lomustina, fotemustina, estreptozocina, busulfano, pipobromano, procarbazina, dacarabazina, tiotepa y temozolomida.
11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10, en donde el cáncer se selecciona de cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, carcinoma de cabeza y cuello y melanoma, preferentemente cáncer de mama, aún más preferentemente carcinoma de mama de tipo basal, luminal o que sobreexpresa HER2.
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