DE68921515T2

DE68921515T2 - DNS-Sequenzierung.

Info

Publication number: DE68921515T2
Application number: DE68921515T
Authority: DE
Inventors: Charles C Richardson; Stanley Tabor
Original assignee: Harvard University
Current assignee: Harvard University
Priority date: 1988-07-12
Filing date: 1989-07-06
Publication date: 1995-07-13
Anticipated expiration: 2009-07-07
Also published as: JPH02154699A; DK342289A; HUT52543A; US5122345A; ES2015853A4; DK342289D0; AU3798689A; DE68921515D1; JP2870696B2; EP0351138A3; NO892825D0; CN1039845A; DD284052A5; US4962020A; CA1340851C; GR900300159T1; IL90850A0; NO892825L; EP0351138A2; DE351138T1

Description

Hintergrund der Erfindung

Die Erfindung betrifft die Sequenzierung von DNA und insbesondere automatisierte Verfahren zum Sequenzieren von DNA.
Die DNA-Sequenzierung wird im allgemeinen entsprechend dem Verfahren nach Sanger et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74:5463. 1977) ausgeführt und beinhaltet die enzymatische Synthese einzelner DNA-Stränge ausgehend von einer einsträngigen DNA-Matrize und einem Primer. Wie in Fig. 1 dargestellt, werden vier getrennte Synthesen durchgeführt. Eine einsträngige Matrize wird zusammen mit einem Primer bereitgestellt, der mit der Matrize hybridisiert. Der Primer wird unter Verwendung von DNA-Polymerase verlängert und jede Reaktion terminiert an einer spezifischen Base (Guanin, G; Adenin, A; Thymin, T; oder Cytosin, C) mittels des Einbaus eines geeigneten kettenterminierenden Wirkstoffes, beispielsweise eines Dideoxinucleotids. Die gegenwärtig für dieses Sequenzierungsverfahren verwendeten Enzyme sind: das große Fragment der Escherichia coli-DNA- Polymerase I ("Klenow"-Fragment), die Reversetranscriptase, die Taq-Polymerase und eine modifizierte Form der DNA- Polymerase des Bakteriophagen T7.
Wie ferner in Fig. 1 gezeigt, führen die vier DNA- Synthesereaktionen zur Bildung von vier Serien von DNA- Produkten, wobei jedes Produkt ein definiertes und ein variables Ende hat. Das definierte Ende beginnt mit dem Primermolekül. Das variable Ende endet mit einem kettenterminierenden Wirkstoff, das für die Nukleotidbase spezifisch ist (entweder G, A, T oder C) , an dem die Synthesereaktionen enden. Die vier unterschiedlichen Serien von Produkten werden jeweils anhand ihres Molekulargewichts in vier getrennte Bahnen in einem hochauflösenden Polyacrylamidgel separiert, um vier Serien von Banden zu bilden, wobei jede Bande in dem Gel nacheinander einem speziellen Nukleotid in der DNA-Sequenz entspricht. Somit identifizieren die relativen Positionen der Banden die Positionen der gegebenen Nukleotidbasen in der DNA-Sequenz. Im allgemeinen sind die DNA-Produkte markiert, damit die erzeugten Banden leicht zu erkennen sind. Wie in Fig. 1 gezeigt, sind die Intensitäten der Banden innerhalb einer einzelnen Bahn im allgemeinen nicht einheitlich, da die Bandenintensität unmittelbar von der Gesamtanzahl oder Konzentration der DNA-Produkte mit demselben Molekulargewicht innerhalb einer speziellen Bahn abhängig ist und diese Anzahl von Produkt zu Produkt variiert, auch dann, wenn sie nahezu dasselbe Molekulargewicht haben, und selbst, wenn sie dasselbe kettenabbrechende Agens enthalten.
Unter Verwendung der oben beschriebenen Methodik wurden automatisierte Systeme zur DNA-Sequenzanalyse entwickelt. Ein Instrument, das von EG&G hergestellt ist, verwendet eine ³²P-Markierung und eine DNA-Polymerase, wobei die erhaltenen DNA-Produkte durch Gelelektropherese getrennt werden. Toneguzzo et al., 6. Biotechniques 460, 1988. Ein ³²P-Detektor am Ende des Gels tastet die Radioaktivität ab, wenn sie durch den Boden des Gels hindurchgelangt. Für jede Matrize, die sequenziert werden soll, sind vier Synthesereaktionen erforderlich, ebenso wie vier Bahnen in jedem Gel, wobei jeweils eine getrennte Bahn für Produkte verwendet wird, die durch einen spezifischen kettenabbrechenden Wirkstoff abgeschlossen sind, wie dies beispielsweise in Fig. 1 gezeigt ist.
Kanbara et al. haben gemäß 6 Biotechnology 816, 1988, den oben beschriebenen ³²P-markierten Primer durch einen fluoreszens-markierten Primer ersetzt. Die fluoreszenzmarkierten Produkte werden mit einem Laser am unteren Ende des Gels angeregt und die Fluoreszenz wird mit einem CRT- Monitor erfaßt. Auch dieses Verfahren erfordert vier Synthesereaktionen und vier Bahnen in dem Gel für jede zu sequenzierende Matrize.
Applied Biosystems stellt ein Gerät her, bei dem vier unterschiedliche Primer verwendet werden, von denen jeder mit einem unterschiedlichen fluoreszierenden Marker markiert ist. Smith et al., 13 Nuc. Acid. Res. 2399, 1985 und 321 Nature 674, 1986. Jeder Primer wird in einer anderen Reaktion, die eines der vier Dideoxynukleotide enthält, verwendet. Nachdem die vier Reaktionen ausgeführt wurden, werden die Produkte zusammengegeben und man läßt sie in einer einzigen Bahn auf dem Gel laufen. Ein Laser am Fuß des Gels wird dazu verwendet, die fluoreszierenden Produkte zu erkennen, nachdem sie durch das Gel durchgedrungen oder mittels Elektrophorese passiert haben. Dieses System benötigt vier getrennte Reassoziierungsreaktionen und vier getrennte Synthesereaktionen für jede Matrize, jedoch lediglich eine einzige Bahn in dem Gel. Die Computer- Analyse der Sequenz wird dadurch vereinfacht, weil alle vier Banden in einer einzigen Bahn enthalten sind.
DuPont liefert ein Gerät, bei dem eine unterschiedlich fluoreszierende Markierung an jedes der vier Didesoxynukleosid-Triphosphate angeheftet ist. Prober et al., 238 Science 336, 1987. Es wird ein einziger Reassoziierungsschritt, eine einzige Polymerasereaktion (die jedes der vier markierten Didesoxynukleosid-Triphosphate enthält) und eine einzige Bahn in dem Sequenzierungsgel benötigt. Die vier unterschiedlich fluoreszierenden Marker der DNA-Produkte werden getrennt erfaßt, wenn sie bei der Elektropherese durch das Gel wandern.
Englert et at. beschreiben in dem US-Patent 4 707 237 (1987) ein mehrkanaliges Elektrophorese-Gerät mit Detektormitteln, die sich im wesentlichen über die gesamte Breite des Gels erstreckem, um die markierten DNA-Produkte zu erfassen, wenn sie an den Detektormitteln in vier getrennten Bahnen vorbeiwandern, wobei der Kanal oder die Bahn identifiziert wird, in der die Probe lokalisiert ist. Vorzugsweise werden Radioisotopenmarkierungen verwendet.
Den zur DNA-Sequenzanalyse gegenwärtig verwendeten Verfahren ist es inhärent, daß sie entweder radioaktiv oder fluoreszierend markierte DNA-Produkte durch ein Gelpermationsverfahren trennen, beispielsweise mittels eines Polyacrylamids oder einer anderen Gelelektrophorese, und sodann die Lage der Orte relativ zueinander längs der Wanderungsachse oder -bewegung durch das Gel erfassen. Die Genauigkeit dieses Verfahrens wird teilweise durch die Gleichmäßigkeit der Signale in den Banden bestimmt, die näherungsweise mit demselben Abstand durch das Gel hindurchwandern. Unterschiede oder Variationen in den Signalintensitäten zwischen benachbarten Banden verursachen eine Reihe von Problemen. Zunächst vermindern sie die Empfindlichkeit des Verfahrens, das durch die Fähigkeit begrenzt ist, fene Banden zu erkennen, die das schwächste Signal enthalten. Zweitens rufen sie Schwierigkeiten hervor, wenn es darum geht, festzustellen, ob eine Bande mit einem schwachen Signal ein echtes Signal infolge des Einbaus eines kettenterminierenden Wirkstoffs oder ein Artifakt infolge der Pausenstelle in der DNA ist, an der die Polymerase dissoziiert hat. Drittens vermindern sie die Genauigkeit bei der Bestimmung der DNA-Sequenz zwischen dicht benachbarten Banden, da das starke Signal der einen Bande das schwache Signal des Nachbars überdecken kann.

Zusammenfassung der Erfindung

Alle oben genannten Schwierigkeiten werden durch die vorliegende Erfindung überwunden, gemäß der näherungsweise die gleichen Mengen von DNA-Produkten mit ähnlichem Molekulargewicht bei einer Sequenzierungsreaktion hergestellt werden, womit benachbarte Banden in dem Sequenzierungsgel innerhalb derselben Bahn näherungsweise dieselbe Intensität zeigen.
Die Fähigkeit, benachbarte Banden mit nahezu derselben Intensität herzustellen, ist hilfreich, da es möglich wird, die Ergebnisse jeder Sequenzierungsreaktion leichter und mit größerer Sicherheit abzulesen. Da die DNA-Produkte einer Seuqnezierungsreaktion mit einem spezifischen kettenterminierenden Wirkstoff Banden bilden, die näherungsweise dieselbe Intensität haben wie die Nachbarbanden, stellt die Bandenintensität selbst eine spezielle Markierung der Serie von Banden dar, die so gebildet sind. Die Abzahl der DNA-Produkte mit näherungsweise demselben Molekulargewicht, die mit einem gegebenen kettenterminierenden Agens hergestellt sind, variiert in Abhängigkeit von der Konzentration des kettenterminierenden Agens. Somit werden durh Verwendung unterschiedlicher Konzentrationen für jedes der vier kettenterminierenden Agenzien bei der Synthese die DNA-Produkte, die eines der kettenterminierenden Agenzien einbauen, von anderen DNA-Produkten mit näherungsweise dem gleichen Molekulargewicht, die ein anderes kettenterminierendes Agens einbauen, insofern unterschieden, als sie in der Anzahl oder Menge differieren; folglich können die Banden der DNA-Produkte hinsichtlich des kettenterminierenden Wirkstoffes einfach durch die Intensität verglichen mit der Intensität der Nachbarbanden unterschieden werden. Als Folge davon können zwei oder mehr Serien von DNA-Produkten, von denen jedes ein anderes kettenterminierendes Agens enthält, in einer einzigen Bahn einer Gelpermeation unterzogen und durch die Intensität jeder Bande, verglichen mit der Intensität der Nachbarbanden identifiziert, d.h. voneinander unterschieden werden. Darüber hinaus brauchen die Synthesen der DNA- Produkte, die unterschiedliche kettenterminierende Agenzien einbauen, nicht mehr in getrennten Behältern getrennt ausgeführt zu werden, sondern sie können gleichzeitig in einem gemeinsamen Behälter durchgeführt werden und dieselbe Markierung, beispielsweise eine Radioisotopenmarkierung, eine fluoreszierende Markierung u.dgl. kann, falls gewünscht, bei allen kettenterminierenden Wirkstoffen, verwendet werden, was das Verfahren vereinfacht, anstatt für jedes Agens eine getrennte Markierung zu verwenden.
Es ist jedoch zu beachten, daß es eine allmähliche Abnahme der Intensität in allen Banden der DNA-Produkte gibt, wenn sie durch das Gel wandern, wobei jene, die das kürzeste Stück gewandert sind, eine geringere Intensität zeigen als jene, die die weiteste Strecke zurückgelegt haben. Nichtsdestoweniger ist die relative Intensität jeder Bande, verglichen mit den Nachbarbanden, an jeder Stelle längs der Wanderungsachse überall näherungsweise die gleiche. Diese Bewahrung der relativen Intensität über die gesamte Wanderstrecke ermöglicht die vorliegende Erfindung.
Unter "benachbarten Banden" sind jene in derselben Bahn zu verstehen, die innerhalb eines Bereiches von 20-30 mm entweder vor oder hinter der betrachteten Bande liegen, jeweils gemessen längs der Wanderungsachse. Im allgemeinen enthalten benachbarte Banden DNA-Produkte, die sich von dem in der betrachteten Bande um nicht mehr als zwanzig Basen unterscheiden (d.h. die Masse unterscheidet sich um nicht mehr als ca. 6000 Dalton.
Generell gesehen zielt die Erfindung auf eine bei DNA-Sequenzierungsreaktionen verwendbare DNA-Polymerase, die bei einer Sequenzierungsreaktion dazu führt, daß DNA- Produkte mit geringfügig unterschiedlichem Molekulargewicht in näherungsweise gleichen Mengen erzeugt werden. Deswegen führen solche DNA-Produkte, wenn sie mit Hilfe einer Gelmatrix voneinander getrennt werden, zu Banden, die näherungsweise die gleiche Intensität aufweisen wie die benachbarten bzw. angrenzenden Banden. Ohne sich an eine spezielle Theorie zu binden, vermuten die Erfinder, daß diese Gleichförmigkeit in der Indensität eine Folge der Polymerase ist, die nicht zwischen Normalen Nukleosid- Triphosphaten und kettenabbrechenden Agenzien, wie Didesoxynukleosid-Triphosphaten, unterscheidet.
In einem ersten Aspekt zielt die Erfindung auf ein Verfahren zum Sequenzieren eines DNA-Strangs mittels des Einbaus eines geeigneten kettenabbrechenden Wirkstoffs, beispielsweise eines Didesoxynukleosid-Triphosphates.
Gemäß einem ersten Aspekt zielt die Erfindung auf ein Verfahren zum Sequenzieren eines DNA-Stranges mit den Schritten:
Bereitstellen des DNA-Strangs,
den Strang mit einem Primer reassoziieren lassen, wobei der Primer in der Lage ist, mit dem Strang zu hybridisieren, um eine reassoziierte Mischung zu erhalten, und
Inkubieren der reassoziierten Mischung mit einem Desoxyribonucleosid-Triphosphat, einer DNA-Polymerase und einem ersten kettenabbrechenden Agens, dadurch gekennzeichnet, daß die Inkubation in Anwesenheit von zweiwertigen oder dreiwertigen Mangan- oder von Eisenkationen unter Bedingungen ausgeführt wird, die die Polymerase veranlassen, den Primer zu verlängern, um eine erste Serie von ersten DNA-Produkten zu erhalten, die sich in der Länge des verlängerten Primers unterscheiden, wobei jedes erste DNA-Produkt das kettenabbrechende Agens an seinem verlängerten Ende aufweist und für im wesentlichen alle DNA-Produkte, die sich in der Länge um 1 bis 20 Basen unterscheiden, die Menge an jedem ersten DNA-Produkt etwa die gleiche ist.
Vorzugsweise beinhaltet das Verfahren ferner die Schritte:
Trennen der ersten DNA-Produkte vermittels Gelpermeation nach dem Molekulargewicht, um eine erste Serie von Banden zu erhalten, wobei jede erste Serie von Banden eines der ersten DNA-Produkte mit einem speziellen Molekulargewicht repräsentiert und die Dichte aller benachbarter Banden der ersten Serie für alle Banden der ersten Serie im wesentlichen die gleiche ist, und Bestimmung der Position jeder Bande der ersten Serie.
Mit "im wesentlichen allen" ist gemeint, daß wenigstens 9 von 10 (oder 19 von 20) benachbarten Banden näherungsweise dieselbe Intensität aufweisen. D.h. nur gelegentlich haben Banden eine abweichende Intensität. Diese abweichende Intensität rührt von Artefakten her. Ein Beispiel ist die Kompression von zwei oder mehr DNA-Produkten mit unterschiedlichem Molekulargewicht innerhalb einer Bande. Die Ergebnisse von zwei derartigen Kompressionen sind in Fig. 2 gezeigt, in der Artefaktenbanden mit einem Stern markiert sind. Unter näherungsweise gleich ist zu verstehen, daß die Bandenintensität um höchstens den Faktor 2, bevorzugt um höchstens den Faktor 1,2 variiert. Gelpermeation soll alle vorhandenen Polyacrylamidgele, die zum DNA-Sequenzieren verwendet werden, umfassen sowie andere Mechanismen zum Separieren von DNA-Produkten nach ihrem Molekulargewicht.
Bei einem Ausführungsbeispiel wird die Herstellung von benachbarten Banden mit näherungsweise gleicher Intensität durch Inkubieren einer DNA-Polymerase in einer Lösung erreicht, die Mangan oder Eisenionen enthält.
Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel umfaßt das Verfahren ferner die Schritte, wonach ein zweiter kettenabbrechender Wirkstoff der reassoziierten Mischung mit einer anderen Konzentration als der des ersten kettenabbrechenden Wirkstoffs zugegeben wird, wobei die DNA-Polymerase die Produktion einer zweiten Serie von zweiten DNA- Produkten bewirkt, die an ihrem verlängerten Ende das zweite kettenabbrechende Agens tragen, während die Anzahl an jedem der zweiten DNA-Produkte näherungsweise die gleiche für alle DNA-Produkte ist, die sich in der Länge um 1 bis 20 Basen unterscheiden, während die Anzahl von im wesentlichen allen ersten und allen zweiten DNA-Produkten, die sich in der Länge um 1 bis 20 Basen unterscheiden, deutlich verschieden ist. Höchst bevorzugt bilden die zweiten Serien der zweiten DNA-Produkte eine zweite Serie von Banden, wenn sie mittels Gelpermeation nach dem Molekulargewicht getrennt werden, wobei die Intensität von im wesentlichen allen benachbarten Banden der zweiten Serie innerhalb dieser Serie näherungsweise die gleiche und die Intensität von im wesentlichen allen Banden der ersten Serie deutlich und erkennbar von der Intensität der benachbarten Banden der zweiten Serien abweicht, und wobei das Verfahren ferner den Schritt beinhaltet, die Position und die Intensität jeder Bande zu bestimmen, die für eine spezielle Bande der Serien repräsentativ ist.
Unter deutlich unterschiedlich ist zu verstehen, daß eine Bande einer Serie von einer benachbarten Bande (d.h. einer Bande, die sich in der Länge um 1 bis 20 Basen unterscheidet) in der anderen Serie unterschieden werden kann. Das bedeutet, ein Gerät, das die Anzahl der DNA- Produkte mit einem spezifischen Molekulargewicht mißt, die beiden Serien von DNA-Produkten voneinander unterscheiden kann.
Bei einem anderen bevorzugten Ausführungsbeispiel beinhaltet es das Verfahren, daß zwei kettenabbrechende Wirkstoffe bereitgestellt werden, wobei die DNA-Polymerase die Produktion einer zweiten und einer dritten Serie von zweiten und dritten DNA-Produkten bewirkt, wobei die Anzahl an jedem der zweiten und jedem der dritten DNA-Produkte näherungsweise die gleiche für alle DNA-Produkte ist, die sich in der Länge um 1 bis 20 Basen unterscheiden, während die Anzahl von im wesentlichen allen ersten, allen zweiten und allen dritten DNA-Produkten, die sich in der Länge um 1 bis 20 Basen unterscheiden, deutlich verschieden ist. Höchst bevorzugt bilden jede zweite und dritte Serien mit zweiten und dritten DNA-Produkten unterschiedliche Serien von Banden, wenn sie mittels Gelpermeation nach dem Molekulargewicht getrennt werden, wobei die Intensität von im wesentlichen allen benachbarten Banden der zweiten Serie innerhalb der zweiten Serie näherungsweise die gleiche ist, die Intensität von im wesentlichen allen benachbarten Banden der dritten Serie innerhalb der dritten Serie näherungsweise die gleiche ist, und die Intensität von im wesentlichen allen Banden unterschiedlicher Serien deutlich unterschiedlich ist; und wobei das Verfahren ferner den Schritte beinhaltet, die Position und die Intensität jeder Bande zu bestimmen, wobei die Intensität für eine spezielle Bande der Serien repräsentativ ist.
Bei noch einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel ist gemäß dem Verfahren vorgesehen, der reassoziierten Mischung vier unterschiedliche Desoxyribonukleosid- Triphosphate und vier unterschiedliche kettenabbrechende Agenzien zuzugeben, wobei die DNA-Polymerase die Produktion einer zweiten, dritten und vierten Serie von zweiten, dritten und vierten DNA-Produkten hervorruft und die Anzahl jeweils an zweiten, dritten und vierten DNA-Produkten für im wesentlichen alle DNA-Produkte, die sich in der Länge um 1 bis 20 Basen unterscheiden, näherungsweise die gleich ist, während die Anzahl von im wesentlichen allen ersten, allen zweiten, allen dritten und allen vierten DNA-Produkten, die sich in der Länge um 1 bis 20 Basen untercheiden, deutlich unterschiedlich ist. Höchst bevorzugt erzeugt jede zweite, dritte und vierte Serie Serien von zweiten, dritten und vierten Banden, wenn sie durch Gelpermeation nach dem Molekulargewicht getrennt werden, wobei die Intensität von im wesentlichen allen benachbarten Banden der zweiten Serie oder im wesentlichen allen benachbarten Banden der dritten Serie oder im wesentlichen allen benachbarten Banden der vierten Serie innerhalb jededer Serie näherungsweise die gleiche ist und wobei die Intensität von im wesentlichen allen benachbarten Banden in unterschiedlichen Serien deutlich unterschiedlich ist; höchst bevorzugt beinhaltet das neue Verfahren die Schritte der Ermittlung der Position und der Intensität jeder Bande, die für eine spezielle Bande der Serie repräsentativ ist.
Bei anderen bevorzugten Ausführungsbeispielen wird die reassoziierte Mischung mit Mangan oder Eisenionen versehen, wobei die Ionen bewirken, daß die Polymerase nicht mehr nach einem kettenabbrechenden Wirkstoff unterscheidet; die DNA-Produkte werden nach ihrem Molekulargewicht in weniger als vier Bahnen in einem Gel getrennt; die Intensität jeder Bande wird mittels eines gelablesenden Gerätes gemessen; die DNA-Polymerase wird aus den T7- Typ DNA-Polymerasen, dem großen Fragment der E. coli-DNA- Polymerase I und der Taq-Polymerase ausgesucht; das kettenabbrechende Agens ist ein Didesoxynukleosid-Triphosphat.
Bei verwandten Aspekten zielt die Erfindung auf ein Verfahren zum Sequenzieren eines DNA-Strangs, wobei die Schritte vorgesehen sind, entweder a) die DNA-Polymerase bereitzustellen und die Polymerase und den DNA-Strang in einer Lösung zu inkubieren, die Manganionen oder Eisenionen und ein kettenabbrechendes Agens enthält oder b) eine DNA-Polymerase bereit zustellen, die im wesentlichen nicht hinsichtlich der kettenabbrechenden Agenzien unterscheidet.
Bei einem weiteren verwandten Aspekt zielt die Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung einer DNA-Polymerase zur DNA-Sequenzierung einschließlich dem Schritt des Mischens der DNA-Polymerase mit einer Lösung, die Mangan- oder Eisenionen enthält.
Bei einem weiteren Aspekt zielt die Erfindung auf eine Lösung, die eine T7-Typ-DNA-Polymerase oder eine Taq- Polymerase, Mangan- oder Eisenionen enthält. Vorzugsweise liegen die Ionen in einer Konzentration zwischen 0,005 bis 10 mmol vor.
In einem weiteren Aspekt zielt die Erfindung auf eine Zusammenstellung zum Sequenzieren von DNA, wobei eine DNA- Polymerase ein kettenabbrechendes Agens und Mangan- oder Eisenionen enthalten sind.
Bei bevorzugten Ausführungsbeispielen ist die Polymerase eine T7-Typ-DNA-Polymerase, das große Fragment der E. coli-DNA-Polymerase I oder die Taq-Polymerase; der kettenabbrechende Wirkstoff ist ein Didesoxynukleotid; und die Zusammenstellung enthält ferner ein Desoxynukleosid- Triphosphat.
Bei einem anderen Aspekt zielt die Erfindung auf ein Verfahren zum automatisierten Sequenzieren, wobei vorgesehen ist, eine Polymerase zu verwenden, die im wesentlichen nicht hinsichtlich des kettenabbrechenden Agens unterscheidet und die die Herstellung einer Serie von DNA- Produkten bewirkt, die sich in ihrem Molekulargewicht unterscheiden und mit demselben kettenabbrechenden Agens enden, wobei die DNA-Produkte im wesentlichen benachbarte Banden erzeugen, die alle näherungsweise dieselbe Intensität haben.
Mit im wesentlichen nicht unterscheidend ist gemeint, daß die kettenabbrechenden Agenzien einheitlich längs der Länge der DNA eingebaut werden, unabhängig von der DNA- Sequenz. Mit näherungsweise gleich ist gemeint, daß die Intensität sich höchstens um den Faktor 2 bis 3 unterscheidet.
Bei einem anderen Aspekt zielt die Erfindung auf ein Gerät zur automatischen DNA-Sequenzierung mit einem Reaktor zum Herstellen wenigstens zweier Serien von DNA-Produkten aus einem einzelnen Primer und einem DNA-Strang, wobei jedes DNA-Produkt einer Serie sich hinsichtlich des Molekulargewichtes unterscheidet und an einem Ende ein kettenabbrechendes Agens trägt; mit Separierungsmitteln zum Trennen der DNA-Produkte, um eine Serie von Banden herzustellen, wobei die Intensität von im wesentlichen allen benachbarten Banden einer Serie im wesentlichen die gleiche ist und die Intensität im wesentlichen aller benachbarter Banden in einer anderen Serie unterschiedlich ist; mit Bandenlesemitteln zum Erkennen der Position und der Intensität jeder Bande nach der Separation; und Computermitteln zur Ermittlung der DNA-Sequenz des DNA-Strangs unmittelbar aus der Position und der Intensität der Banden.
Bei bevorzugten Ausführungsbeispielen enthält der Reaktor Mangan- oder Eisenionen und eine T7-Typ-DNA-Polymerase.
Bei einem anderen Aspekt zielt die Erfindung auf eine Lösung oder eine Zusammenstellung, die Pyrophosphatase, DNA-Polymerase, ein kettenabbrechendes Agens oder dITP enthält; sowie auf ein Verfahren zur DNA-Sequenzierung einschließlich dem Bereitstellen der Pyrophosphatase in der Sequenzierungsreaktion. Die Verwendung von Pyrophosphatase bei der Sequenzierungsreaktion verringert die Menge an Pyrophosphat und verbessert die Gleichförmigkeit der Intensität der Bandenintensität bei benachbarten Banden.
Bei jedem der obigen Aspekte können die Mangan- oder Eisenionen in Anwesenheit von Chelat, beispielsweise Citrat oder Isocitrat verwendet werden. Es wird angenommen, daß diese Chelate ein genauer zu steuerndes Maß an gewünschten Ionen in einer DNA-Sequenzierungsreaktion ergeben.
In einem letzten Aspekt zielt die Erfindung auf eine ΔLys 118 bis Arg 145 T7-DNA-Polymerase und eine DNA, die diese Polymerase codiert. Diese Polymerase hat keine erkennbare Exonukleaseaktivität.
Wir haben Umstände herausgefunden, unter denen DNA- Polymerasen modifiziert werden können, um ihre Fähigkeit zu verändern, ein kettenabbrechendes Agens an dem verlängerten Ende eines DNA-Primers in der Anwesenheit einer DNA-Matrize einzubauen. Diese Fähigkeit ermöglicht es, daß die DNA-Sequenzierung bei geringeren Konzentrationen an kettenabbrechenden Agenzien ausgeführt werden kann, womit die Kosten einer DNA-Sequenzierungsreaktion deutlich vermindert werden. Ferner haben wir herausgefunden, daß DNA-Polymerasen mit dieser Eigenschaft in einem Sequenzierungsgel benachbarte Banden erzeugen, die näherungsweise einheitliche Intensität zeigen. D.h. die Polymerase unterscheidet nicht mehr in einem größeren Ausmaß zwischen dem Einbau kettenabbrechender Agenzien und normaler Desoxynukleosid-Triphosphaten. Wir haben gezeigt, daß wenigstens drei Polymerasen auf diese Weise modifiziert werden können einschließlich einer modifizierten T7-DNA-Polymerase und dem großen Fragment der E.coli-DNA-Polymerase I und der Taq-Polymerase. Andere Polymerasen, die zu diesen Polymerasen homolog sind, funktionieren ebenfalls bei der Erfindung.
Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht darin, daß die Konzentration jedes der gegebenen kettenabbrechenden Agenzien, das bei der Sequenzierungsreaktion verwendet wird, leicht zu berechnen ist, da die Bandenintensität unmittelbar mit der Konzentration des betreffenden kettenabbrechenden Agens verknüpft und für alle diese Agenzien gleich ist.
Die modifizierten Polymerasen gemäß der Erfindung sind speziell bei deren Sequenzierungsreaktionen brauchbar, da nur eine einzige Sequenzierungsreaktion, die alle vier kettenabbrechenden Agenzien, die vier unterschiedlichen Konzentrationen enthält, notwendig ist. Somit können für jede spezielle DNA-Matrize weniger als vier unterschiedliche DNA-Sequenzierungsreaktionen verwendet werden.
Merkmale und Vorteile der Erfindung erschließen sich aus der nachfolgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsbeispiele und der Ansprüche.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsbeispiele

Die Zeichnungen werden zunächst kurz erläutert.

Figuren:

Fig. 1 zeigt eine schematische Veranschaulichung der DNA-Sequenzierung mittels des Verfahrens nach Sanger et al., aaO.
Fig. 2 bis sind graphische Veranschaulichungen der relativen Bandenintensitäten sechs unterschiedlicher Sequenzierungsgels, die mit einem DNA-Sequenzierungssystem 370A von Applied Biosystems gescannt wurden, und zwar jede von einer einzigen Gelbahn, die eine Sequenzierungsreaktionsmischung enthält, die unter Verwendung einer genetisch modifizierten T7-DNA-Polymerase in Anwesenheit verschiedener Mischungen von Mangan oder Magnesium und verschiedenen Didesoxynukleosiden erhalten wurden.
Bei allen Figuren handelt es sich bei der sequenzierten DNA um mGP1-2 (codiert für T7-RNA-Polymerase, Tabor et al., Proc. Nat, Acad. Sci. USA, 84:4767, 1987), während der Primer der fam-Primer vom Applied Biosystems war. In allen Fällen ist das unbearbeitete (rohe) Ergebnis mit dem fam-Primer gezeigt. Der Start und das Ende jedes Ausgangsergebnisses sind angedeutet. Zusätzlich sind die Positionen unter Bezugnahme auf ihre entsprechenden Positionen in der Wildform der T7-DNA gezeigt (Dunn et al., J. Mol. Biol. 8:452, 1983). Die Punkte in jeder Kurve, die mit einem Stern markiert sind, kennzeichnen Kompressionsbereiche, bei denen wenigstens zwei DNA-Produkte unterschiedlichen Molekulargewichts an diesselbe Position in dem Gel wandern. Kompressionen werden ganz allgemein von Tabor et al., in Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 84:4767; 198beschrieben.
Fig. 8 zeigt einen Graphen zur Veranschaulichung der optimalen Konzentration von Magnesium und Mangan für die DNA-Polymeraseaktivität einer genetisch modifizierten T7- DNA-Polymerase in Anwesenheit von 4,0 mM Isocitrat bzw. dessen Fehlen.
Fig. 9 zeigt einen Graphen unter Veranschaulichung der Wirkung unterschiedlicher Konzentrationen von Isocitrat in Anwesenheit von 10mM Magnesium oder Mangan bei der DNA-Polymeraseaktivität genetisch modizifizierten T7-DNA- Polymerase.
Fig. 10 zeigt eine schematische Karte von pGP5-8, einem Plasmid, das für eine genetisch modifizierte T7-DNA- Polymerase kodiert, bei der die Aminosäuren Lys 118 bis Arg 145 fehlen und die keine Exonukleaseaktivität hat.
Fig. 11 zeigt eine schematische Darstellung eines automatischen Sequenzierungsgerätes gemäß der Erfindung.

DNA-Polymerase

DNA-Polymerasen, die in Verbindung mit dieser Erfindung verwendbar sind, umfassen Polymerasen, die zu einer Klasse homologer Polymerasen gehören, die T7-Typ DNA- Polyermasen (beispielsweise T7, T3, ΦI, ΦII, H, W31, gh-1, Y, A1122 oder SP6), das große Fragment der E. coli-DNA- Polymerase I und die Tag-Polymerase enthalten. Unter homologen Polymerasen soll ein Enzym verstanden sein, das zwischen Didesoxynukleosid-Triphospaten und Desoxynukleosid-Triphosphat in Anwesenheit von Mangan unterscheidet; jedoch ist die Unterscheidungsfähigkeit bei Didesoxynokleosid-Triphosphaten vermindert, wenn das Magnesium durch Mangan ersetzt ist. Diese Polymerasen werden bei einer DNA-Sequenzierungsreaktion unter Bedingungen verwendet, bei denen sie benachbarte Banden mit näherungsweise gleichmäßiger Intensität erzeugen (mit einer 1,5- bis 2- fachen Änderungen der Intensität), wenn die DNA-Produkte der Sequenzierungsreaktion durch ein Gel laufen. Mit benachbart ist gemeint, daß Banden beeinhaltet sind, die DNA-Produkte representieren, die sich in ihrem Molekulargewicht um 6000, d.h. 20 Basen unterscheiden. Der tatsächliche Wert dieser Intensität nimmt über die Länge des Gels ab, wie dies unten beschrieben und in den Fig. gezeigt ist. Die Bandenintensität entspricht der Anzahl der DNA- Produkte innerhalb einer bestimmten Bande. Markierungen wie Fluorophore und Radioisotope werden verwendet, um eine leicht erkennbare Bande der Intensität zu erzeugen, die die Anzahl dieser DNA-Produkte wiedergibt. Somit haben bei dieser Erfindung benachbarte Banden, die aus einer Sequenzierungsreaktion mit einem kettenabbrechenden Agens stammen, näherungsweise diesselbe Anzahl von DNA-Produkten und somit eine gleichförmige Bandenintensität. Die Sequenzierungsbedingungen beeinhalten die Inkubation der Polymerase in Anwesenheit von spezifischen divalenten oder trivalten Kationen, wie Mangan (II und III) Ferro- und Ferri-Ionen; monovalente und divalente Kationen, die keine erkennbare Wirkung haben oder für die DNA Synthese schädlich sind, sind: K, Na, Ba, Be, Ca, Ce, Cr, Co, Cu, Ni, Si und Zn. Die Anionen sind unbedeutend, bespielsweise Chlorid, Acetat und Sulfat sind geeignet. Unter diesen Umständen ist der Bedarf nach kettenabbrechenden Agenzien, wie Didesoxynukleosiden um wenigstens das 1000-fache für Enzyme wie das große Fragment der E. coli-DNA-Polymerase I und der Taq-Polymerase und um etwa das 10-fache für eine modifizierte T7-Polymerase vermindert. Ein Chelator kann ebenfalls in dieser Lösung verwendet werden, um die Regulierung der Konzentration verfügbaren divalenten Metallionen zu unterstützen. Beispielsweise können Citrat oder Isocitrat verwendet werden. Es wird angenommen, daß diese Chelate das Maß beispielsweise der freien Manganionen auf einer Konzentration zwischen 10 und 100 uM über einen weiten Bereich von Mangankonzentrationen halten, d.h. der Chelator wirkt als Puffer.
Die DNA-Polymerasen dieser Erfindung unterscheiden über die Länge der DNA-Matrize nicht zwischen Didesoxynukleosid-Analogen und Desoxinukleosiden. D.h. in Anwesenheit von Mangan oder Eisen sind diese Polymerasen nicht in der Lage, zwischen einem Nukleotid, das eine 3'-Hydroxylgruppe trägt, von einem anderen zu unterscheiden, das diese Gruppe nicht hat (d.h. zwei Wasserstoffatome an der 3'-Stelle der Ribose). Gleichwohl unterscheiden diese Polymerase hinsichtlich anderer Modifikationen an anderen Positionen des Nukleosids und zwar selbst bei Vorhandensein von Mangan oder Eisen. Beispielsweise unterscheiden die Polymerasen zwischen einigen Didesoxynokliosid-Analogen, die flureszierende Gruppen angeheftet haben, verglichen mit Desoxynukleosiden. Dennoch unterscheidet die Polymerase nicht in unterschiedlichem Maß in der Nachbarschaft oder nahen Nukleotiden beim Vorhandensein bzw. Fehler der Modifikationen gegenüber den Didesoxynukleosiden. Während sie somit stark zwischen diesen Analogen unterscheiden, weshalb sie höhere Konzentrationen bei der DNA-Sequenzierungsreaktion benötigt verglichen mit unmodifizierten Didesoxynukleosiden bleibt die Intensität benachbarter Banden gleichwohl einheitlich. Beispielsweise gibt es eine zehnfache Unterscheidung zwischen Didesoxy- ITP (ddITP) verglichen mit Didesoxy-GTP (ddGTP) in Anwesenheit von Mangan. Jedoch haben alle diese in einer Sequenzierungsreaktion erzeugten Banden die gleiche Intensität bei ddITP, weil es keine differenzierende Unterscheidung über die Länge der DNA-Matrize gibt.
Die erfindungsgemäßen Polymerasen liefern somit eine einheitliche Wirksamkeit beim Einbau der kettenabbrechenden Agenzien, selbst wenn sie hinsichtlich der Gesamtinkorporation unterscheidend sind.
Kettenabbrechende Agenzien, die bei der Erfindung verwendbar sind, sind Didesoxynukleoside mit einer 2',3- Didesoxystruktur. Andere Agenzien, die bei der Erfindung einzusetzen sind, sind jene, die in der Lage sind, eine DNA-Sequenzierungsreaktion an einer spezifischen Base abzubrechen und zwischen denen unter den obigen Bedingungen von der Polymerase nicht unterschieden wird.
Um festzustellen, ob eine spezielle DNA-Polymerase in Verbindung an speziellen kettenabbrechenden Agens oder anderen Komponenten der Sequenzierungsreaktionsmischung im Sinne der Erfindung gebrauchbar ist, wird eine Standardsequenzierungsreaktion ausgeführt, wie dies unten beschrieben und in den Figuren gezeigt ist und es wird der Umfang der Bandenbildung und die Gleichförmigkeit der benachbarten Banden in einem Sequenzierungsgel überprüft. Wenn die Polymerasereaktion dreimal nicht um wenigstens 20 Basen verlängert, ist sie unter den verwendeten Bedingungen nicht einsetzbar. Eine Gleichförmigkeit angrenzender Banden, die innerhalb eines Bereiches, die gleich oder besser als der Faktor 2 ist, ist bei der Erfindung auch insbesondere, wenn die Gleichförmigkeit in einem Bereich zwischen dem Faktor 1 und 1,5 liegt. In ählicher Weise wird die optimale Kationenkonzentration oder anderer möglicher Kationen, die bei der Erfindung gebrauchbar sind, durch Verwendung dieser Sequenzierungsreaktion unter unterschiedlichen Bedingungen verwendet. Beispielsweise werden die Kationen in einem Bereich zwischen 0,005 und 100mM untersucht. Ein Beispiel für ein derartiges Experiment ist wie folgt:
Die DNA Synthese wird unter Verwendung eines 17-mer Primers mit der Sequenz 5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3' (New England Biolabs Katalog Nr. 1211) gemessen, der mit ³²P an seinem 5' Ende markiert ist und mit einer einsträngigen mGP1-2 DNA reassozierieren Tabor et al., Proc. Nat. Acad. Sci, USA 84:476(1987) und Tabor et al., J. Biol. Chem. 262:16212 (1987). Jede andere Matrize ist für diese Reaktion in gleicher Weise brauchbar. Diese Primer-Matrize wird bei einer Reaktion verwendet, die eine DNA-Polymerase in Anwesenheit eines Bereiches einer Konzentration von Ionen eines Metalls enthält. Die Reaktionen werden in Anwesenheit einer gegebenen Konzentration aller vier Deoxynukleotide (dNTPS, 20-200 uM) und über einen Bereich von Konzentrationen eines Dideoxynukleotid (ddNTP), in diesem Beispiel ddGTP zwischen 10-500 uM) ausgeführt. Die DNA-Produkte werden dann mittels Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert, wobei die DNA-Synthese als Verlängerungen der vom Primer produzierten Banden in dem Gel erkannt werden, die Verlängerungen mit unterschiedlichen Molekulargewichten darstellen.
Bei einem speziellen Beispiel intiert jede Reaktionsmischung (10ul) 0,1 ug ³²P-Primer-Matrize 40 mM Tris-HCl mit einem pH-Wert von 7,5, 5 mM Dithiothreithol (DTT) 5 uM bis 20 mM Ionen eines Metalls, 10 bis 500 4dNTPs, 1 bis 500 uM ddNTPs und zwei Einheiten einer DNA-Polymerase. Die Inkubation erfolgt 15 Minuten lang bei 37º C. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 10 ul von 90prozentigem Formamide, 50mM EDTA und 0,1% Bromphenolblau gestoppt.
Die erhaltenen Proben wurden auf 75º C zwei Minuten lang erwärmt und zwar unmittelbar bevor sie auf ein Polyacrylamidgel (8% Acrylamid, 0,3% Bisacrylamid) in 7M Harnstoff und 100 mM Tris-Borat beim pH-Wert von 8,9 aufgegeben wurden. Die Elektrophorese erfolgt bei 2000 Volt über zwei Stunden. Das Gel wurde zur Autoradiographie in 50 % Methanol, 10% Essigsäure 30 Minuten lang fixiert, getrocknet und belichtet. Die Bahnintensität in jeder Bahn des erhaltenen Films wurde durch Abtasten jeder Bahn mit einem Densitometer bestimmt. Das verwendete Densitometer war ein Zweistrahlaufzeichnungsinstrument Modell MkIIIC (Joyce, Loebl & Co., Ltd., Gateshead-on-tyne, II, England). Jedes geeignete Densitometer im Abtasten von Gelen ist ebenfalls verwendbar. Alternativ kann die Gleichförmigkeit der erhaltenen Banden durch Abtasten der DNA- Produkte bestimmt werden, wenn sie in dem Gel durch Elektrophorese wandern.
Die Fähigkeit eines Enzyms, ein gegebenes ddNTP verglichen mit dem entsprechenden dNTP zu inkorporieren wird als Verhältnis zwischen dem benötigten ddNTP zu dem dNTP gemessen, das gestattet, daß die DNA-Synthese in einem festen Bereich endet, was dadurch erkannt wird, daß Banden erzeugt werden, die nicht größer sind als ein festes Molekulargewicht. D.h. die bei der Reaktion produzierten Banden enden innerhalb eines spezifierten Bereiches des Sequenzierungsgels. Wenn somit ein Enzym zehnmal stärker zwischen einem gegebenen ddNTP verglichen mit einem anderen Enzym ist ein zehnmal größeres Verhältnis zwischen ddNTP und dNTP notwendig, um Banden zu bekommen, die an den entsprechenden Stellen in demselben Bereich des Gels aufhören.

Mangan (Mn)

Nachstehend folgt eine Serie von Beispielen für die Verwendung einer modifizierten TDNA-Polymerase oder des großen Fragments der E. coli DNA-Polymerase 1, bei deren Asequenzierungsreaktionen, wobei Mn in dem Sequenzierungspuffer erhalten ist. Diese Beispiele sind hinsichtlich der Erfindung nicht beschränkend und sie werden lediglich gegeben, um dem Fachmann Richtlinien zur Verwendung der DNA-Polymerasen gemäß der Erfindung an die Hand zu geben. Wie oben beschrieben, können Fachleute leicht andere Umstände festlegen, unter denen DNA-Polymerasen gemäß der Erfindung hergestellt werden können, die die hier beschriebenen Eigenschaften hinsichtlich der Gleichförmigkeit beim Einbau des kettenabbrechenden Agens und der Verwendung bei einer Sequenzierungsreaktion haben.
Die speziell modifizierte TDNA-Polymerase, die bei den nachstehenden Beispielen eingesetzt wurde, war genetisch modifiziert, so daß sie keine erkennbare Exonukleaseaktivität mehr zeigte. Diese genetisch modifizierte DNA- Polymerase wird als ΔLys 118-Arg 145 (A 28) bezeichnet, da im Aminosäurebereich zwischen Lys 118 bis Arg 145 aus der TDNA-Polymerase entfernt ist. Das Gen, das für diese Polymerase codiert, wurde in einem Plasmid pGP5-8 als Variante des Plasmids pGP5-E konstruiert, das von Tabor et al., in dem US-Patent Nr. 4 795 699 beschrieben ist.
Gemäß Figur 10 enthält pGP5-8 pACYC17geschnitten an den Stellen BamHI und HincII, TDNA zwischen den Basen 566bis 6166, die Φ 1.1A und Φ 1.1B enthalten und TDNA Basen 14306 bis 16869, die das Gen 5 mit der Modifikation nach Fig. 10 enthalten. pGP5-8 wurde construiert, indem zunächst das 34 mer, 5'CCGGCAAGTTGCCCGGGATGCTCGAGGAGCAAGGG 3' synthetisiert wurde. Dieses Oligonukleotid wurde als Primer für eine DNA-Synthese mit der einsträngigen DNA von M13 mGP-2 verwendet, die einen Einsatz hält, der das TGen 5 codiert, wie dies bei Tabor et el., aaO beschrieben ist. Die DNA-Synthese und die Selektion der Mutanten wurde, wie von Tabor et el., aaO geschrieben, ausgeführt. Nach der Konstruktion der gewünschten Mutation in mGP5-2 wurde die entsprechende Region des TGen 5, das die 84 bp Auslassung enthält, in das pGP5-5 eingesetzt, in dem ein Eco-Ri bis HpaI Fragment, das die TDNA zwischen den Positionen 14306 und 15610 enthält, isoliert wurde, einschließlich der Region, die die 84 bp Auslassung enthält und es wurde in eine vergleichbare Region von pGP5-5 eingebunden. Es wurde bestätigt, daß das pGP5-8 Derivat enthält, weil die Stellen SmaI und XhoI vorhanden sind, die durch die Mutagenese erzeugt werden und indem eine DNA Sequenzanalyse dieses Bereiches, der die 84 bp Auslassung enthält, ausgeführt wurde. pGB5-8 wurde in dem Stamm K38/pTrx-3 transformiert, um den Stamm K38/pTrx-3/pGP5-8 zu erzeugen. Die Induktion von K38/pTrx-37pGP5-8 und die Reinigung der genetisch geänderten TDNA-Polymerase wurde unter Verwendung derselben Prozedur ausgeführt, wie sie für den Anlagenstamm K38/pTrx-3/pGPs-5 von Tabor et el., aaO beschrieben ist. Da diese Polymerase keine erkennbare Exonukleaseaktivität zeigt, ist, wie von Tabor et el., aaO beschrieben, eine chemische Modifikation vor ihrer Verwendung bei der DNA Sequenzierungsreaktion nicht erforderlich. Die genetische modifizierte TDNA-Polymerase, die in den untenstehenden Beispielen verwendet wurde, war eine Präparation mit einer Aktivität von 1000 Einheiten/ml.

Beispiel 1: DNA Sequenzierungsreaktion unter Verwendung von Mengen

Standardmethoden für die DNA Sequenzierungsreaktino wurden zur Sequenzierung von DNA in Anwesenheit von Mn verwendet. Für TDNA-Polymerese sind die allgemeinen Sequenzierungsschritte im einzelnen von Tabor et el., aaO beschrieben. Kurz gesagt sind die Schritte und Bedingungen wie folgt:

A. Reassozierungsreaktion

Für die Reassozierungsreaktion wurden die folgende Lösung hergestellt:
Zu sequenzierende DNA (z.Bsp. mGP1-2 DNA) in 10 mM Tris-HCL pH-Wert 7,5; 0,1 mM ED- TA, 2ug/7ul ul
5x SegBuf (200 mM Tris-HCL, pH-Wert 7,5; 5 mM MnCl&sub2;, 250 mM NaCl 2
Primer (New England Biolabs 17-mer, Katalog-Nr. 1210, 0,5 pm/ul 1
10 ul
Diese Lösung wurde 2 Minuten lang auf 65 ºC erwärmt und dann auf Raumtemperatur langsam abgekühlt.

B. Markierungsreaktion

Für die Markierungsreaktion wurde die folgende Lösung hergestellt.
Reassozierungsreaktionsmischung 10 ul
Dithiothreitol 0,1 M 1
[³&sup5;S]dATP, New England Nuclear NEG-034H 1 dTTP, dCTP 1.5 uM jeweils 2
Genetisch modifizierte T7DNA-Polymerase, 1 Einheit/u1
(Lys118-Arg 145, wie oben beschrieben) 2
16ul
Diese wurde bei Raumtemperatur 5 Minuten lang inkubiert.

C. Terminierungsreaktion

Bei den Terminierungsreaktionen wurden 4 Reaktionsmischungen wie folgt hergestellt:
Die Terminierungsmischungen wurden bei 37º C 2 Minuten lang inkubiert und dann wurden 3ul Aliquote der vollständigen Markierungsreaktion zu jeder Terminierungsmischung hinzugegeben. Die erhaltene Mischung wurde 5 Minuten lang bei 37º C inkubiert.
Die Terminierungsreaktion wurde mit 5 ul von 90% Formamid, 20 mM EDTA, 0,2% Bromophenol-Blau, Xylen-Cyenol, pH-Wert 8,0 abgebrochen. Die erhaltenen Proben wurden 2 Minuten lang auf 75º C aufgewärmt und auf eine Polyacrylamidgel (8% Acrylamid, 0,3% Bisacrylamid) in 7M Harnstoff, 100 mM Trisborat, pH-Wert 8,9 aufgegeben und sodann bei 2000 Volt durch Elektrophorese wandern gelassen. Des Gel wurde in 50% Methanol, 10% Essigsäure 30 Minuten lang fixiert, getrocknet und dazu verwendet, durch Autoradiagrafie einen Film zu belichten.
Das belichtete Gel wurde entwickelt und es wurde die Intensität der radioektiven Banden in jeder Bahn durch Abtastung jeder Behn mit einem Densitometer (Joyce, Loebl & Co., Ltd., Modell-Nr. MkIIIC) bestimmt.
Wenn man dasselbe Beispiel in Anwesenheit von Magnesium an Stelle von Mangang ablaufen läßt liefern die unterstrichenen Basen bei den nachstehenden Triplets eine um den Faktor 2-5 größere Intensität als die benachbarten Basen sobald diese Triplets auftreten: TCT AAG, GCA, CCT. Bei dem eben beschriebenen Beispiel haben jedoch die Banden, die den übrigen Basen allen eben aufgeführten Triplets entsprechen, dieselben Intensitäten, die sich um höchstens 20% voneinander unterscheiden.

Beispiel 2: Sequenzierungsreaktion unter Verwendung von Mengen, 2X ddGTP und 1X ddCTP, um zwischen G und C mittels relativer Bandenintensität zu unterscheiden.

Bei diesem Beispiel wurde nur ein Gefäß verwendet, um die Sequenzierungsreaktion durchzuführen, um die Sequenz von zwei Typen von Basen (nämlich C und G) in einer DNA- Matrize zu bestimmen. Die Schritte waren die folgenden:
Für die Reessoziierungsreaktion wurde die folgende Lösung zubereitet: mGP1-2 DNA (2,7 mM in 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5; 0,1 mM EDTA) 5X SeqBuf Primer (ABI fam-Primer, 0,4 pm/ul)
Diese Lösung wurde 2 Minuten lang auf 65º C erwärmt und langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. Der Fam-Primer wurde mit einer fluoreszierenden Markierung markiert, die erkannt werden kann, wenn sie durch ein Sequenzierungsgel wandert, wobei das DNA-Sequenzierungssystem ABI Modell 370 A verwendet wurde.
Für die Verlängerungsreektion wurde die folgende Lösung zubereitet: Reassoziierungsreaktionsmischung Dithiothreitol 0,1 M
Diese Lösung wurde 2 Minuten lang bei 37º C inkubiert, 1,5 ul genetisch modifizierte T7-DNA-Polymerase ( 28), wurde mit 1 Einheit/ 1 hinzugegeben und es wurde die Lösung 10 Minuten lang bei 37º C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 5 ul von 100 mM EDTA mit einem pH-Wert von 8,0 gestoppt.
Die erhaltenen Fragmente wurden wie folgt präzipitiert: Es wurden 3,5 ul 3M Natriumecetet und 100 ul 100% Ethanol hinzugegeben. Nach einer 10-minütigen Inkubation auf Eis wurde die Mischung 30 Minuten lang bei 4º C in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert. Das Pellet wurde mit 500 ul 70% Ethanol gewaschen und wiederum 5 Minuten lang zentrifugiert. Der Uberstend wurde dekantiert und des Pellet durch mehrere Minuten andauerndes Zentrifugieren unter Vakuum getrocknet. Die Probe wurde dann in 5 ul 90%- iges Formamid und 50 mM EDTA pH-Wert 8,0 erneut suspendiert und 2 Minuten lang auf 75º C erwärmt und auf ein DNA- Sequenzierungssystem Modell ABI 370A aufgegeben.

xxxxxxxxxxxxxxxxxx

Somit kann mittels lediglich einer einzigen Sequenzierungsreaktion, bei der lediglich eine Markierung für alle DNA-Produkte verwendet wurde, die DNA-Sequenz aller G's und C's bestimmt werden. Die Peakhöhe vermindert sich längs der Länge des Gels, da die Produkte mit größerem Molekulargewicht in kleineren Mengen vorhanden sind. Jedoch liegt die Differenz zwischen dem benachbarten G und einem C innerhalb etwa des zweifachen längs des Gels, während sie bei einem Paar benachbarter G's oder einem Paar C's näherungsweise gleichförmig ist (sie variiert um das 1,1- bis 1,4-fache), wobei die Abnahme der Intensität für jede zusätzliche Position längs der Sequenz korriert ist. Beispielsweise in Fig. 4 nimmt das Signal um den Faktor 2 für eine gegebene Serie von Banden bei einer Periode von näherungsweise 60 Basen ab. Somit gibt es eine 1,16%-ige Abnahme bei jeder weiteren Position längs der Matrize in dem Beispiel (da Chi 1,0116 für Chi&sup6;&sup0;=2 gilt).
Es ist wichtig, zwischen Banden, deren Intensität zufolge unterschiedlicher Wirksamkeit des Kettenabbruchs innerhalb benachbarter Banden und zwei oder mehr Banden unterscheiden, die während der Elektropherese zusammenwandern. Das letzte Ereignis wird als Kompression bezeichnet und stellt einen Artifakt der Gelelektropherese dar und nicht der DNA-Sequenzierungsreaktion selbst; und wird nicht durch die Verwendung von Mengen eliminiert. Ein Beispiel einer solchen Kompression ist in Fig. 4 durch einen Stern (*) markiert Wenn man weiß, daß eine solche Kompression das Zusemmenwandern von 2 DNA-Produkten repräsentiert, wie dies in Fig. 4 zu sehen ist, dann ist diese Bande eine genaue Markierung einer Bande mit der zweifachen Intensität. In einer Kompressionsregion kann die genaue Sequenz nicht bestimmt werden. Um diese Sequenz zu ermitteln, ist es notwendig, entweder die Sequenz in der umgekehrten Richtung zu bestimmen oder 2) das Sequenzierungsgel unter stärkeren Denaturierungsbedingungen laufen zu lassen, d.h. höherer Temperatur oder durch Zugabe von 50% Formamid oder 3) ein Nukleotidanalogon, beispielsweise dITP oder deazaGTP an Stelle von dGTP einzusetzen. Kompressionen sind die Folge von stabilen Haarnadelformationen in der DNA unter den Bedingungen der Gelelektrophorese; der Einbau dieser Nukleotidanalogen destabilisiert die meisten dieser Haernadeln.
Kompressionen infolge von Haarnadelstrukturen können im Grunde genommen beliebige Längen haben, abhängig von den Ausmaßen und der Stärke der Haarnadel. Somit enthalten die Verwendung von Mn alle benachbarten Banden näherungsweise die gleiche Anzehl von DNA-Produkten mit demselben Molekulargewicht, jedoch haben sie infolge von Kompressionen nicht notwendigerweise eine vergleichbare Bandintensität.
Wie in Fig. 2 gezeigt, wurde das oben beschriebene Verfahren gerade mit ddGTP in Anwesenheit von Mengen bei einer 1 mM-Konzentration verwendet. Jede Bande in dem erhaltenen Gel wird in Fig. 2 durch einen Peak präsentiert. Die Intensität einer Bande wird durch die Höhe jedes Peak wiedergegeben. Bei Mengen ist die Intensität benachbarter Banden und somit die Peakhöhe näherungsweise einförmig längs des Gels und unterscheidet sich zwischen benachbarten Banden um weniger als 5 oder 10%.
Das Ergebnis, wie es in Fig. 3 gezeigt ist, veranschaulicht dasselbe Experiment, das im Gegensatz dazu in Anwesenheit von Magnesium an Stelle von Mengen durchgeführt wurde. Die Intensität von Nachbarbanden und somit die Peakhöhe variiert hier bis zum 10-fachen.
Gemäß Fig. 5, bei der alle vier Dideoxynukleotide mit gleichen Konzentrationen (0,75 uM Endkonzentration für jedes ddNTP, wie in Beispiel 2) in der Sequenzierungsreaktion in Anwesenheit von Mengen verwendet wurden, sind benachbarte Banden und zugehörige Peaks näherungsweise gleichförmig, wobei sie um nicht mehr als etwa das 1,5- fache variieren und wiederum in ihrer absoluten Intensität zu DNA-Produkten mit höherem Molekulargewicht abnehmen. In Anwesenheit von Magnesium und allen vier Dideoxynukleotiden mit gleicher Konzentration variiert im Gegensatz dazu, wie in Fig. 6 gezeigt, die Intensität benachbarter Banden erheblich.
Durch Variation der Konzentration für jedes ddNTP bei einer Sequenzierungsreaktion kann die vollständige Nukleotidsequenz eines DNA-Strangs bestimmt werden. Ein Beispiel für eine derartige Prozedur ist in Fig. gezeigt, bei der die Konzentration für jedes ddNTP in 30%-Schritten variiert: ddGTP (4,5 uM; 2,2x), ddATP (3,0 uM; 1,7x), ddTTP (2 M; 1,3x) und ddCTP (1,4 uM; 1,0x). Die aus diesem Graphen ermittelte DNA-Sequenz ist unter der zweiten Linie der Figur dargestellt. Es wurden nur 6 Fehler (veranschaulicht durch ein "v") verglichen mit der tatsächlichen DNA-Sequenz gemacht. Diese Fehler können durch Verwendung größerer Abstufungen bei den ddNTP's beseitigt werden (beispielsweise 1xddCTP, 2xddTTP, 4xddATP und 8xddGTP). In ähnlicher Weise kann durch Messung der Peakbereiche an Stelle der Peakhöhe das Ergebnis genauer gemacht werden. Computerprogramme, um solche Peakbereiche zu messen, sind für bestehende DNA-Sequenzierungsmaschinen bereits geschrieben.
Gemäß Fig. 8 beträgt die optimale Mangankonzentration bei einer Sequenzierungsreaktion 1 mM, wenn ein Chelator, wie Zitret oder Isozitretor, fehlt, verglichen mit 20 mM für Magnesium. Wenn 40 mM Isozitrat in der Reaktion vorhanden ist, wird die Polymereseaktivität bei Anwesenheit von Mangan um des 4-fache stimuliert und die optimale Mangankonzentration liegt bei 5 bis 20 mM.
Gemäß Fig. 9 liegt bei einer Mangankonzentration von 10 mM die optimale Konzentration vin Isozitrat bei 40 mM, was zu einer 4-fachen Stimulation der der Polymereseaktivität führt. Bei einer Magnesiumkonzentration von 10 mM wirkt jede beliebige Menge von Isozitrat inhibierend auf die Polymerase. Diese Ergebnisse wurden beim Durchführen von Polymerasereaktionen, wie sie unten beschrieben sind, in Anwesenheit von verschiedenen Chelator und Ionenkonzentrationen erhalten. Im einzelnen enthielten die Reaktionen (200 ul) 40 mM Tris-HCl mit einem PH-Wert von 7,5: 5 mM Dithiothreitol; 0,5 mM denaturierte Kälberthymus DNA; 0,3 mM dGTP, dATP, dCTP und [³H]dTTP (20 cpm/pm); 50 ug/ml BSA und die angegebenen Konzentrationen von MgCl&sub2;, MnCl&sub2; oder Natrimisozitrat. Die Reaktionen begannen mit der Zugabe vonO,1 Einheiten genetisch modifizierter T7-DNA-Polymerese Lys118-Arg145). Die Inkubation erfolgte 30 Minuten lang bei 37º C. Die Reaktionen wurde durch die Zugabe von 3 ml von 1N HC1 und O,1 M Natriumpyrophosphat gestoppt und es wurde die säureunlösliche Radioaktivität gemessen. Eine Einheit der DNA-Polymerase katalisiert den Einbau von 10 nmol des gesamten Nukleotids in eine säureunlösliche Form innerhalb von 30 Minuten unter den Testbedingungen (Tabor et el. J. Biol. Chem. 262, 16212 (1987)).

Pyrophosphatase

Wenn chemisch modifizierte TDNA-Polymerase zur DNA- Sequenzierung verwendet wird, verschwinden bestimmte Fragmente bei verlängerter Inkubation (Tabor und Richardson, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84:4767, 1987). Wir bezeichnen die Stellen, an denen dies geschieht, als "Löcher", da dieser Prozeß eine Lücke in dem Sequenzierungsgel hervorruft. Die Löcher treten häufiger auf, wenn dITP an Stelle von dGTP verwendet wird.
Die Degradation spezieller Fragmente ist ein offensichtliches Problem beim Ablesen von DNA-Sequenzierungsgels. Das Fehlen eines Fragments wird beim Ablesen der Sequenz entweder vollkommen vermißt, was zu einer Auslassung in der bestimmten Sequenz führt oder es wird ein Loch beobachtet, das nur als unbekannte Base an dieser Stelle interpretiert werden kann.
Die gegenwärtige Lösung für dieses Problem besteht darin, die Reaktionszeiten kurz zu halten. Aus zwei Gründen ist dies unbefriedigend. Erstens macht es die Durchführung der Reaktionen technisch schwieriger, da man gezwungen ist, sehr schnell zu arbeiten, um die Reaktionen bald nachdem sie begonnen haben, zu stoppen. Wichtiger ist, daß einige Banden extrem empfindlich für die Dedredation sind und selbst nach sehr kurzen Reaktionszeiten verschwinden.
Wir haben eine genetisch geänderte Form der TDNA- Polymerase ( 28, wie oben beschrieben) konstruiert, die kein erkennbares Maß einer Exonukleaseaktivität (< 10&supmin;des Maßes des Enzyms in der Wildform, oder > 10000 mal niedriger als bei der chemisch modifizierten TDNA-Polymerase). Wir vermuteten, daß, da die Löcher bei längerer Inkubation auftreten, sie vermutlich eine Folge der Exonukleaseaktivität sind und somit nicht auftreten, wenn diese genetisch modifizierte Form der TDNA-Polymerase verwendet wurde. Jedoch verschwinden die oben erwähnten radioaktiven Fragmente noch mit derselben Rate, wenn entweder chemisch oder genetisch modifizierte TDNA-Polymerase verwendet wird.
Wir haben festgestellt, daß dieser Verlust von speziellen Banden eine Folge der Pyrophosphorolyseaktivität der Polymerase ist. Diese Aktivität ergibt sich nicht aus der Exonukleaseaktivität der DNA-Polymerase, sondern wegen der Umkehr der Polymereseaktivität: In Anwesenheit von Pyrohosphat (PPi) fügt die Polymerese PPi an des Endnukleotid an, des an dem 3'-Ende der Kette lokalisiert ist, wobei in diesem Falle ein Dideoxynukleosid 5'-Triphosphat freigesetzt wird. Siehe hierzu allgemein Deutscher et el. J. Biol. Chem. 244:3019, 1969; und Kornberg, DNA Replication, Seiten 125-126, veröffentlicht bei Freemen & Co., SF. Diese Reaktion bewirkt die Beseitigung des Blocks an dem 3' Ende, was es der Synthese gestattet, längs der Matrize weiter abzuleufen. Normalerweise akkumuliert PPi in einer DNA-Synthesereaktionsmischung, da es ein Produkt der Polymerasionsreaktion ist. Die Stelle der Pyrophosphorolyse ist von der DNA-Sequenz abhängig und somit werden die oben beschriebenen Löcher nur an speziellen Stellen erzeugt.
Um mit diesem Problem fertig zu werden, muß die Pyrophosphorylysereaktion verhindert werden. Ein Weg, die Pyrophosphorylyse zu unterbinden, besteht darin, das Pyrophosphat eufzubrechen, wenn es in der Polymerasereaktion erzeugt wird, indem das Enzym Pyrophosphetase zugegeben wird. Andere Lösungen sehen die Änderung des Pyrophosphats durch andere enzymatische Reaktionen vor oder verhindern die Pyrophosphorlysereaktion durch Zugabe von Analogen, die diese Aktivität der DNA-Polymerase inhibieren. Wir haben herausgefunden, daß die Zugabe selbst von puren Mengen dieses Enzyms (ein tausendstel im molaren Verhältnis zu den DNA-Polymerasemolekülen) zu den Sequenzierungsreaktionen die spezielle Klasse von oben erwähnten Fragmenten vollständig stabilisiert und die Produktion von Löchern eliminiert. Bei Anwesenheit sowohl der genetisch geänderten Form der TDNA-Polymerase ( 28) und Pyrophosphatase sind alle Banden selbst bei längerer Inkubation (bis zu 2 Stunden) stabil.
Bei der automatisierten Sequenzierung unter Verwendung der Differenzbandintensität ist es kritisch, daß die Intensität jeder Bande vollständig durch das Verhältnis von ddNTP zu dNTP bestimmt wird. Pyrophosphorolyse erzeugt Mehrdeutigkeiten infolge der Verminderung der Intensität einiger Banden. Somit ist die Zugabe von Pyrophosphatase bei dieser Sequenzierungsprozedur besonders brauchbar.
Pyrophosphetase sollte immer dann zugegeben werden, wenn chemisch oder genetisch modifizierte TDNA-Polymerase oder andere Polymerasen zur Sequenzierung verwendet werden, und zwar mindestens in einer Menge, die ausreicht, um die Hydrolyse des PPi mit einer Geschwindigkeit zu katalysieren, die die Akkumulation von PPi auf ein Level verhindert, der zur Pyrophosphorolyse führt. Dies trifft insbesondere zu, wenn dITP an Stelle von dGTP verwendet wird, wobei ein Auftreten von Löchern wegen der Pyrophosphorlysereaktion in einem größeren Umfang auftrifft.

Beispiel 3: Protokoll bei der Verwendung von Pyrophosthatase in Sequenzierungsreaktionen

Bei diesem Beispiel wurde nach einem normalen Sequenzierungsprotokoll gearbeitet. Die einzige Abwendung bestand darin, daß anorganische Hefepyrophosphatase (yeast inorganic pyrophosphatase) verwendet wurde. Die Quelle für die Phosphatase ist nicht von Bedeutung, jedoch haben wir in diesem Falle Sigma yeast inorganic pyrophosphatase Katalog-Nummer I-4503 ohne weitere Reinigung oder weitere Reinigung einer FPLC Mono Q-Säule und Worthinton east inorganic pyrophosphatase ohne weitere Reinigung verwendet. Die Pyrophosphatese wurde zu der modifizierten TDNA- Polymerase vor der Zugabe der Polymerase zu der Markierungsreaktion zugegeben. Typischerweise wurden zwei Einheiten (0,25 ug) zu Polymerase pro Sequenzierungsreaktionssatz verwendet und 0,001 Einheiten der yeast inorganic pyrophosphatese (4 ng). Ein weiter Bereich Pyrophosphataseaktivität funktioniert erfolgreich: 0,01 ng bis zu 1 ug von Hefepyrophosphatese pro Sequenzierungsreaktion wurden erfolgreich getestet.
Bei der Reassoziierungsreaktion wurde beispielsweise die folgende Lösung zubereitet: mGP1-2 DNA (in 10 mM Tris-HCl pH-Wert 7,5; 0,1 mM EDTA) 5X SeqBuf Primer (New England Biolabs-17mer) 0,5 pm/ul Cat #1211)
Diese Lösung wurde 2 Minuten lang auf 65º C erwärmt und langsam auf Raumtemperatur abgekühlt.
Für die Merkierungsreaktion wurde die folgende Lösung zubereitet: Reassoziierungsreaktionsmischung Dithiothreitol 0,1 M &sub3;&sub5;S dATP, New England Nuclear NEG-034H 3 dNTP (1,5 uM jedes dTTP, dCTP, 3 uM dITP) Enzymmischung (siehe unten) Enzymmischung: Genetisch modifizierte TDNA-Polymerase, Lys118-Arg145 Yeast inorgenic pyrophgosphatase in 20 mM Tris-HCl PH-Wert 7,5; 10 mM β-mercaptoethanol, 50 ug/ml Kälberalbuminserum. 1 Einheit/ul
Diese Lösung wurde bei Raumtemperatur 5 Minuten lang inkubiert.
Für die Terminierungsreaktion wurden die vier Reaktionsmischungen zubereitet:
?????
Diese Terminierungsmischungen wurden bei 37º C 2 Minuten lang inkubiert und zu jeder Terminierungsmischung wurden 3 ul Aliquoten der Markierungsrekation hinzugegeben. Die erhaltenen Lösungen wurden bei 37º C 60 Minuten lang inkubiert.
Jede Terminierungsreaktion wurde mit 5 ul 90§-igem Formemid, 20 mM EDTA; 0,2% Bromphenolblau; Xylencyanol; pH-Wert 8,0 gestoppt.
Die erhaltenen Proben wurden 2 Minuten lang auf 75º C aufgeheizt und auf ein Polyacrylamidgel (8% Polyecrylamid, 0,3% Bisacrylemid) in 7M Harnstoff; 100 mM Trisborat, pH- Wert 8,9 aufgegeben und mit 2000 Volt 2 Stunden lang elektrophoretisch behandelt. Das Gel wurde in 50%-igem Methanol und 10%iger Essigsäure 30 Minuten lang fixiert, getrocknet und dazu verwendet, einen Film mittels Audiorediografie zu belichten.

Gerät

Gemäß Fig. 11 weist des Gerät 100, das für die automatisierte DNA-Sequenzierung geeignet ist, einen Reaktor 102 auf, der die oben erwähnten Reagenzien 104, beispielsweise DNA-Polymerese, Mengen oder Eisenionen, Chelatoren und Pyrophosphatase enthält. Das Gerät ist außerdem mit einer Gelbox 106 versehen, um die DNA-Produkte entpsrechend ihrem Molekulargewicht zu trennen und es enthält eine Geleseeinrichtung 108, um die DNA-Produkte zu erfassen, wenn sie das Gel passieren (durch gestrichelte Pfeile 107) veranschaulicht. Ferner ist eine Computereinrichtung 110 vorgesehen, um die Intensität der Banden der DNA- Produkte und die Position der Banden relativ zueinander zu berechnen. Wenn die DNA-Produkte in einer Bahn laufen, dann sind die Computereinrichtungen in der Lage, die DNA- Sequenz aus der Bandenintensität und der Position zu berechnen. Für diese Funktion werden Standardcomputerprogramme verwendet.
Andere Ausführungsbeispiele liegen innerhalb der Patentansprüche.

Claims

1. Verfahren zum Sequenzieren eines DNA-Strangs mit den Schritten:

Bereitstellen des DNA-Strangs,

den Strang mit einem Primer reassoziieren lassen, wobei der Primer in der Lege ist, mit dem Strang zu hybridisieren, um eine reassoziierte Mischung zu erhalten, und

Inkubieren der reassoziierten Mischung mit einem Desoxiribonucleosidtriphosphat, einer DNA-Polymerase und einem ersten kettenabbrechenden Agens, dadurch gekennzeichnet, daß die Inkubation in Anwesenheit von zweiwertigem oder dreiwertigem Mengen oder von Eisenionen unter Bedingungen ausgeführt wird, die die Polymerase veranlassen, den Primer zu verlängern, um eine erste Serie von ersten DNA-Produkten zu erhalten, die sich in der Länge des verlängerten Primers unterscheiden, wobei jedes erste DNA-Produkt das kettenabbrechende Agens an seinem verlängerten Ende aufweist und für im wesentlichen alle DNA- Produkte, die sich in der Länge um 1 bis 20 Basen unterscheiden, die Menge an jedem ersten DNA-Produkt etwa die gleiche ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, das ferner die Schritte aufweist:

Trennen der ersten DNA-Produkte vermittels Gelpermea tion nach dem Molekulargewicht, um eine erste Serie von Banden zu erhalten, wobei jede erste Serie von Banden eines der ersten DNA-Produkte mit einem speziellen Molekulargewicht repräsentiert und die Dichte aller benachbarter Banden der ersten Serie für alle Banden der ersten Serie im wesentlichen die gleiche ist, und

Bestimmung der Position jeder Bande der ersten Serie.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein bis drei zusätzliche unterschiedliche kettenabbrechende Agentien der reassoziierten Mischung zugegeben werden, daß sich die Konzentration jedes kettenabbrechenden Agens von der jedes anderen kettenabbrechenden Agens unterscheidet, daß die DNA-Polymerase die Herstellung von ein bis drei zusätzlichen Serien von zusätzlichen DNA- Produkten bewirkt, daß jedes DNA-Produkt jeder weiteren Serie eines der zusätzlichen kettenabbrechenden Agentien an seinem verlängerten Ende trägt und daß die Menge von allen zusätzlichen DNA-Produkten mit demselben kettenabbrechenden Agens für alle Längen innerhalb eines Bereiches von 20 Basen die gleiche ist und sich deutlich von der Menge aller DNA-Produkte unterscheidet, die unterschiedliche kettenabbrechenden Agentien enthalten und sich in anderen Serien befinden, jedoch dasselbe Molekulargewicht aufweisen.

4. Verfahren nach Anspruch 3 mit den weiteren Schritten:

Trennen aller DNA-Produkte mittels Gelpermeation nach dem Molekulargewicht, um insgesamt jeweils zwei bis vier Serien von Banden zu erzeugen, wobei jede Bande einer Serie ein DNA-Produkt mit demselben kettenabbrechenden Agens wie jede andere Bande in den Serien repräsentiert und dasselbe Molekulargewicht aufweist, wobei die Dichte jeder benachbarten Bande innerhalb derselben Serie ungefähr die gleiche ist und deutlich unterschiedlich von der Dichte jeder benachbarten Bande einer anderen Serie, und

Bestimmung der Lage und der Dichte jeder Bande jeder Serie.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Polymerase T-7-Typ- DNA-Polymerasen, große Fragment der DNA-Polymerase I von E. coli oder die Taq-Polymerase ist.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das kettenabbrechende Agens ein Dideoxinukleosidtriphosphat ist.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die reassoziierte Mischung mit einem Chelator versehen ist.

8. Zusammenstellung zur Verwendung beim Sequenzieren von DNA, mit Zugabe von DNA-Polymerase und einem kettenabbrechenden Agens, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen DNA-Sequenzierungspuffer enthält, der zweiwertiges oder dreiwertiges Mengen oder Eisenkationen und entweder einen Chelator oder eine Pyrophosphatase oder beides enthält.

9. Zusammenstellung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerase eine T7-Typ DNA-Polymerase, das Klenow-Fragment oder eine Taq-Polymerase ist und daß das kettenabbrechende Agens ein Dideoxinukleosidtriphosphat ist.

10. Verwendung einer Pufferlösung, die eine DNA- Polymerase, ein kettenabbrechendes Agens und zweiwertiges oder dreiwertiges Mengen oder Eisenionen bei der Kettenverlängerungs/Terminierungs-Reaktion eines Verfahrens zum DNA-Sequenzieren enthält.

11. Verwendung einer Pufferlösung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerase eine T7-Typ DNA-Polymerase, ein Klenow-Fragment oder eine Taq-Polymerase ist.

12. Verwendung einer Pufferlösung nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß das kettenabbrechende Agens ein Dideoxinukleosidtriphosphat ist.

13. Verwendung einer Pufferlösung nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer ferner entweder einen Chelator oder eine Pyrophosphatase oder beides enthält.