CN109477127A

CN109477127A - 超热稳定的赖氨酸-突变型ssDNA/RNA连接酶

Info

Publication number: CN109477127A
Application number: CN201780016918.7A
Authority: CN
Inventors: 郑钰; 洪曼青
Original assignee: R Gene Co Ltd
Current assignee: R Gene Co Ltd; Rgene Inc
Priority date: 2016-03-14
Filing date: 2017-03-14
Publication date: 2019-03-15
Also published as: WO2017160788A3; EP3430154A4; WO2017160788A2; US20190062827A1; EP3430154A2; EP3430154B1

Abstract

本文提供了使用具有ssRNA连接酶和ssDNA连接酶活性两者的超热稳定的赖氨酸‑突变型ssDNA/RNA连接酶的组合物、系统和方法。在某些实施方案中，使用此类超热稳定的赖氨酸‑突变型ssDNA/RNA连接酶来将具有5'腺苷酸化端的第一单链核酸序列连接至第二单链核酸序列(例如，在至少75℃的温度下)以形成连接的核酸序列。在其他实施方案中，对所述连接的核酸序列进行测序。

Description

超热稳定的赖氨酸-突变型ssDNA/RNA连接酶

本申请要求2016年3月14日提交的美国临时申请序列号62/307,658的优先权，所述申请以引用的方式整体并入本文。

技术领域

本文提供了使用具有ssRNA连接酶和ssDNA连接酶活性两者的超热稳定的赖氨酸-突变型ssDNA/RNA连接酶的组合物、系统和方法。在某些实施方案中，使用此类超热稳定的赖氨酸-突变型ssDNA/RNA连接酶来将具有5'腺苷酸化端的第一单链核酸序列连接至第二单链核酸序列(例如，在至少75℃的温度下)以形成连接的核酸序列。在其他实施方案中，对所述连接的核酸序列进行扩增和/或测序。

背景技术

DNA或RNA连接酶是二价金属离子依赖性酶，其利用ATP或NAD+来催化具有3'-羟基和5'-磷酸的相邻多核苷酸末端之间的磷酸二酯键形成(Tomkinson等人,PNAS,2006；Silber等人,PNAS,1972)。取决于它们的物种起源，天然存在的DNA或RNA连接酶可具有许多独特的性质，例如底物特异性、序列和结构域组构、最佳反应条件如pH、辅因子依赖性、温度以及耐盐性等。它们的体外活性也已用于众多分子生物学方案中，从而使它们成为现代生物技术的重要工具。

所有已知的DNA和RNA连接酶经由涉及三个核苷酸基转移反应的共同途径进行催化(Lehman等人,Science,1974；Lindahl等人,Annu Rev Biochem,1992)。在ATP依赖性DNA或RNA连接酶的情况下，第一步骤(步骤1)涉及通过连接酶攻击ATP的α-磷酸，其导致焦磷酸的释放和连接酶-AMP中间体的形成。AMP与保守序列基序内的赖氨酸残基的氨基共价连接。在第二步骤(步骤2)中，将AMP核苷酸转移至5'-磷酸-封端的DNA或RNA链，以形成5’-App-DNA/RNA中间体。在第三且最终步骤(步骤3)中，通过3’-OH链攻击5’-App-DNA/RNA端将两种多核苷酸连接并释放AMP。

DNA连接酶催化双链DNA中的单链切口处形成磷酸二酯键。在体内，这种活性对于在DNA复制、DNA重组和DNA切除修复期间维持基因组完整性至关重要。其中，T4DNA连接酶已在体外广泛用于将双链断裂与粘性末端和平末端连接。RNA连接酶通常分类成至少两个广泛家族。Rnl1家族包括T4 RNA连接酶1(Rnl1)以及来自真菌、酵母和植物的tRNA连接酶。这些酶修复单链RNA中的断裂。Rnl2家族由噬菌体T4 RNA连接酶2(T4Rnl2)以及来自原生动物锥虫属和利什曼原虫属的RNA编辑连接酶代表(Ho和Shuman,PNAS,2002)代表。在体内，这些酶主要密封双链RNA中的切口。在体外，T4Rnl2及其突变体已显示连接单链RNA(Yin S等人,JBC,2003)，以及连接在单链RNA的3'端与单链DNA衔接子的5'-端之间(Viollet等人,2011,BMC Biotechnol)。

已经观察到单链RNA连接酶有时可接受单链DNA作为底物，尽管有时具有较低的连接效率。例如，T4 RNA连接酶1(T4Rnl1)已经长久已知并用于连接单链RNA(ssRNA)和ssDNA，其中效率较低(Lau等人,2001)。T4 RNA连接酶1家族中的同系物表现出单链DNA连接活性。例如，来自水管致黑栖热菌(Thermus scotoductus)噬菌体TS2126(其是T4Rnl1同系物)的热稳定的单链DNA连接酶可在约65℃的高温下连接ssDNA(Blondal等人,NAR,2005)并且由EpiCenter Biotechnologies作为CircLigase销售(WO2004/027056A2)。来自海洋红嗜热盐菌(Rhodothermus marinus)噬菌体RM378的另一种T4Rnl1同系物也据报道连接ssRNA和ssDNA两者(Blondal等人,NAR,2002)。由于其在相对高温(约65℃)下的独特ssDNA连接活性，CircLigase迅速发现其在许多应用中的应用，如用于高通量下一代测序的文库制备过程中(Gansauge MT,Nat.Protol.,2013)。

下一代测序(NGS)的进步已经以加速动力转化了生物医学和临床研究。在NGS文库制备工作流程中使用的最重要的酶家族之一是连接酶。连接步骤的重要性在于它将具有已知序列的短DNA片段或RNA衔接子连接至未知文库序列的末端，从而提供引发位点以促进下游步骤，如PCR或引物延伸。对于DNA测序应用，NGS文库制备工作流程中的连接步骤通常在双链文库核酸片段与双链衔接子之间发生，但也可能在单链核酸片段与5'-磷酸化单链衔接子之间发生。双链连接反应通常通过T4DNA连接酶催化，并且通常在环境温度或甚至更低(例如，16℃)温度下进行。单链DNA连接目前通过诸如CircLigase的酶催化，反应温度高达65℃(Gansauge MT,Nat.Protol.,2013)。在诸如小RNA测序的其他应用中，T4Rnl1和T4Rnl2突变体通常用于将单链DNA衔接子连接至单链RNA文库片段(通常在37℃或更低温度下)。

发明内容

在一些实施方案中，本文提供了连接单链核酸的方法，所述方法包括：a)在反应混合物中组合以下各项：i)超热稳定的赖氨酸-突变型ssDNA/RNA连接酶，所述连接酶是前体超热稳定的ssRNA连接酶的突变型式(例如，表2中所示的前体ssRNA连接酶，或其截短或突变型式)，其中所述前体超热稳定的ssRNA连接酶具有基序I EKx(D/N/H)G(SEQ ID NO:32)并且在至少75℃(例如，至少75℃…85℃…95℃…或100℃，或介于75℃至100℃之间)的温度下具有ssRNA连接酶活性，但不具有ssDNA连接酶活性，并且其中所述超热稳定的赖氨酸-突变型ssDNA/RNA连接酶在所述基序I中的K(赖氨酸)处具有氨基酸取代，并且在至少75℃(例如，至少75℃…85℃…95℃…或100℃，或介于75℃至100℃之间)的温度下具有ssRNA连接酶和ssDNA连接酶活性两者，ii)具有腺苷酸化(或当在所述反应混合物中时变得腺苷酸化)的5'端碱基的第一单链核酸序列，以及iii)具有3'端碱基的第二单链核酸序列；以及b)在至少75℃(例如，至少75℃…85℃…95℃…或100℃，或介于75℃至100℃之间)的温度下孵育所述反应混合物，以使得所述超热稳定的赖氨酸-突变型ssDNA/RNA连接酶将所述第一单链核酸序列的所述5'腺苷酸化端连接至所述第二单链核酸序列的所述3'端以形成连接的核酸序列。在某些实施方案中，所述孵育所述反应混合物是在至少85℃或至少95℃的温度下进行。在具体实施方案中，所述超热稳定的赖氨酸-突变型ssDNA/RNA连接酶是腺苷酸化缺陷型ATP依赖性连接酶(即，不能通过与ATP反应形成AMP-连接酶中间体的连接酶)。

在具体实施方案中，本文提供了系统和试剂盒，所述系统和试剂盒包含：a)超热稳定的赖氨酸-突变型ssDNA/RNA连接酶，所述连接酶是前体超热稳定的ssRNA连接酶的突变型式(例如，表2中所示的前体ssRNA连接酶，或其截短或突变型式)，其中所述前体超热稳定的ssRNA连接酶具有基序I EKx(D/N/H)G(SEQ ID NO:32)并且在至少75℃的温度下具有ssRNA连接酶活性，但不具有ssDNA连接酶活性，并且其中所述超热稳定的赖氨酸-突变型ssDNA/RNA连接酶在所述基序I中的所述K(赖氨酸)处具有氨基酸取代，并且在至少75℃的温度下具有ssRNA连接酶和ssDNA连接酶活性两者，b)具有腺苷酸化的5'端碱基的第一单链核酸序列；以及c)具有3'端碱基的第二单链核酸序列。在具体实施方案中，所述试剂盒和系统还包含第一容器和第二容器，并且其中所述超热稳定的赖氨酸-突变型ssDNA/RNA连接酶在所述第一容器中，并且所述第一单链核酸序列和/或所述第二单链核酸序列在所述第二容器中。

在某些实施方案中，本文提供了组合物，所述组合物包含：超热稳定的赖氨酸-突变型ssDNA/RNA连接酶，所述连接酶是前体超热稳定的ssRNA连接酶的突变型式(例如，表2中所示的前体ssRNA连接酶，或其截短或突变型式)，其中所述前体超热稳定的ssRNA连接酶具有基序I EKx(D/N/H)G(SEQ ID NO:32)并且在至少75℃的温度下(例如，在介于75℃至85℃或75℃至100℃之间的温度下)具有ssRNA连接酶活性，但不具有ssDNA连接酶活性，并且其中所述超热稳定的赖氨酸-突变型ssDNA/RNA连接酶在所述基序I中的所述K(赖氨酸)处具有氨基酸取代，并且在至少75℃的温度下(例如，在介于75℃至85℃或75℃至100℃之间的温度下)具有ssRNA连接酶和ssDNA连接酶活性两者。在具体实施方案中，所述组合物还包含以下中的至少一种：a)具有腺苷酸化的5'端碱基的第一单链核酸序列，以及b)具有3'端碱基的第二单链核酸序列。

在具体实施方案中，所述第一单链核酸序列的所述5'端碱基是DNA碱基，并且其中所述第二单链核酸序列的所述3'端碱基是RNA碱基或DNA碱基。在其他实施方案中，所述第一单链核酸序列的所述5'端碱基是DNA碱基或RNA碱基，并且其中所述第二单链核酸序列的所述3'端碱基是DNA碱基。在一些实施方案中，所述第一单链核酸序列中的所有或几乎所有碱基都是DNA碱基。在具体实施方案中，所述第二单链核酸序列中的所有碱基或几乎所有碱基都是DNA碱基。

在某些实施方案中，所述K(赖氨酸)的所述氨基酸取代是选自由以下各项组成的组的氨基酸：丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、半胱氨酸(C)、缬氨酸(V)、苏氨酸(T)以及甘氨酸(G)。在其他实施方案中，所述前体超热稳定的ssRNA连接酶是野生型超热稳定的ssRNA连接酶。在其他实施方案中，所述野生型超热稳定的ssRNA连接酶是来自选自由以下各项组成的组的物种：极端嗜热古生菌柯达克氏菌(Thermococcus kodakarensis)、超嗜热嗜压古菌(Pyrococcus,yayanosii)、掘越氏热球菌(Pyrococcus horikoshii)、深海火球菌(Pyrococcus abyssi)、强烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、丁酸栖高温菌(Hyperthermusbutylicus)、敏捷气热菌(Aeropyrum pernix)、海生葡萄状嗜热菌(Staphylothermusmarinus)、烟栖火叶菌(Pyrolobus fumarii)以及风产液菌(Aquifex aeolicus)。在另外的实施方案中，所述超热稳定的赖氨酸-突变型ssDNA/RNA连接酶由SEQ ID NO:1至11中所示的氨基酸序列中的一个编码。在其他实施方案中，所述超热稳定的赖氨酸-突变型ssDNA/RNA连接酶由与SEQ ID NO:1至11中所示的氨基酸序列中的一个具有至少85％、95％或99％(例如，至少85％…90％…95％…98％…99％…99.5％)序列同一性的氨基酸序列编码。在某些实施方案中，所述超热稳定的赖氨酸-突变型ssDNA/RNA连接酶由SEQ ID NO:1至11中所示的N-末端或C-末端截短的氨基酸序列编码(例如，其中所述SEQ ID NO在所述N或C末端缺失1至40个氨基酸，但仍具有与全长序列相同的连接酶活性)。

在某些实施方案中，所述超热稳定的赖氨酸-突变型ssDNA/RNA连接酶包含选自由以下各项组成的组的基序序列：EGx(D/N/H)G(SEQ ID NO:12)、EPx(D/N/H)G(SEQ ID NO:13)、EAx(D/N/H)G(SEQ ID NO:14)、EVx(D/N/H)G(SEQ ID NO:15)、ELx(D/N/H)G(SEQ IDNO:16)、E Ix(D/N/H)G(SEQ ID NO:17)、EMx(D/N/H)G(SEQ ID NO:18)、ECx(D/N/H)G(SEQID NO:19)、EFx(D/N/H)G(SEQ ID NO:20)、EYx(D/N/H)G(SEQ ID NO:21)、EWx(D/N/H)G(SEQID NO:22)、EHx(D/N/H)G(SEQ ID NO:23)、ERx(D/N/H)G(SEQ ID NO:24)、EQx(D/N/H)G(SEQID NO:25)、ENx(D/N/H)G(SEQ ID NO:26)、EEx(D/N/H)G(SEQ ID NO:27)、EDx(D/N/H)G(SEQID NO:28)、ESx(D/N/H)G(SEQ ID NO:29)、ETx(D/N/H)G(SEQ ID NO:30)以及Ex(D/N/H)G(SEQ ID NO:31)，赖氨酸的点缺失)；其中x是任何氨基酸。在具体实施方案中，x是与其他氨基酸相比具有小或更小侧链的氨基酸。

在具体实施方案中，所述第一单链核酸序列是测序衔接子(例如，下一代序列衔接子)。在一些实施方案中，所述第二单链核酸序列包含测序文库片段。在具体实施方案中，所述方法还包括：c)对所述连接的核酸序列进行测序。

在一些实施方案中，本文提供了方法，所述方法包括：a)在反应混合物中组合以下各项：i)来自强烈火球菌的单链RNA连接酶(PfuRn12，WP_014835129.1)(或其截短或突变型式)，ii)具有未腺苷酸化的5'端的单链核酸序列，以及iii)ATP分子；以及b)在使得所述PfuRn12腺苷酸化所述单链核酸序列的所述未腺苷酸化的5'端的条件下孵育所述反应混合物，从而产生具有腺苷酸化的5'端碱基的第一单链核酸序列。在具体实施方案中，所述孵育是在至少75℃(例如，至少75℃…85℃…95℃…或100℃；或介于75℃至85℃之间或介于75℃至100℃之间)的温度下进行。在其他实施方案中，所述反应混合物中的所述组合还包括：iv)具有3'端碱基的第二单链核酸序列，v)超热稳定的赖氨酸-突变型ssDNA/RNA连接酶，所述连接酶是前体超热稳定的ssRNA连接酶的突变型式，其中所述前体超热稳定的ssRNA连接酶具有基序I EKx(D/N/H)G(SEQ ID NO:32)并且在至少75℃的温度下具有ssRNA连接酶活性，但不具有ssDNA连接酶活性，并且其中所述超热稳定的赖氨酸-突变型ssDNA/RNA连接酶在所述基序I中的所述K(赖氨酸)处具有氨基酸取代并且在至少75℃的温度下具有ssRNA连接酶和ssDNA连接酶活性两者。在一些实施方案中，所述超热稳定的赖氨酸-突变型ssDNA/RNA连接酶将所述第一单链核酸序列的所述5'腺苷酸化端连接至所述第二单链核酸序列的所述3'端以形成连接的核酸序列。

在某些实施方案中，本文提供了组合物、试剂盒或系统，所述组合物、试剂盒或系统包含：a)来自强烈火球菌的单链RNA连接酶(PfuRn12，WP_014835129.1)(或其具有相同或类似活性的截短或突变型式)，以及b)超热稳定的赖氨酸-突变型ssDNA/RNA连接酶，所述连接酶是前体超热稳定的ssRNA连接酶的突变型式，其中所述前体超热稳定的ssRNA连接酶具有基序I EKx(D/N/H)G(SEQ ID NO:32)并且在至少75℃的温度下具有ssRNA连接酶活性，但不具有ssDNA连接酶活性，并且其中所述超热稳定的赖氨酸-突变型ssDNA/RNA连接酶在所述基序I中的所述K(赖氨酸)处具有氨基酸取代并且在至少75℃的温度下具有ssRNA连接酶和ssDNA连接酶活性两者。在其他实施方案中，所述组合物、试剂盒和系统还包含：c)具有未腺苷酸化的5'端的单链核酸序列。

附图描述

图1示出在不同浓度的ATP中野生型PhoRnl2(A和B)、PfuRnl2(C和D)、HbuRnl2(E和F)对5'磷酸化单链(ss)RNA和DNA的活性。(A)PhoRnl2对5'-磷酸化ssRNA的活性。泳道1，100uM ATP；泳道2，10uM ATP；泳道3，1uM ATP；泳道4，未添加ATP。pRNA，5'-磷酸化ssRNA；AppRNA，5'-腺苷酸化ssRNA；circRNA，环状ssRNA。(B)PhoRnl2对5'-磷酸化ssDNA的活性。泳道1，100uM ATP；泳道2，10uM ATP；泳道3，1uM ATP；泳道4，未添加ATP。pDNA，5’-磷酸化ssDNA；AppDNA，5’-腺苷酸化ssDNA。(C)PfuRnl2对5'-磷酸化ssRNA的活性。泳道1，100uMATP；泳道2，10uM ATP；泳道3，1uM ATP。(D)PfuRnl2对5'-磷酸化ssDNA的活性。泳道1，100uMATP；泳道2，10uM ATP；泳道3，1uM ATP。(E)HbuRnl2对5'-磷酸化ssRNA的活性。泳道1，100uMATP；泳道2，10uM ATP；泳道3，1uM ATP。(F)HbuRnl2对5'-磷酸化ssDNA的活性。泳道1，100uMATP；泳道2，10uM ATP；泳道3，1uM ATP。将所有反应物在90℃下孵育1小时，并在含有7M尿素的20％聚丙烯酰胺变性凝胶上解析。使用Sybr Gold对凝胶进行染色，并使用GEImageQuant LAS扫描仪进行可视化。

图2示出在有或无ATP的情况下野生型HbuRnl2对5'-腺苷酸化ssDNA的活性。泳道1，5'-腺苷酸化ssDNA与纯化的野生型HbuRnl2和100uM ATP的；泳道2，5'-腺苷酸化ssDNA与纯化的野生型HbuRnl2且无ATP；泳道3，仅5'-腺苷酸化ssDNA。将所有反应在90℃下孵育1小时，并在含有7M尿素的20％聚丙烯酰胺变性凝胶上解析。使用Sybr Gold对凝胶进行染色，并使用GE ImageQuant LAS扫描仪进行可视化。

图3示出突变型HbuRnl2K106A对5'-腺苷酸化ssDNA的活性。首先使用5'-腺苷酸化试剂盒(NEB#E2610)将磷酸化ssDNA腺苷酸化，并从反应中纯化产物(如泳道5中所示)。在10ul总反应体积中，反应缓冲液含有70mM Tris-HCl(pH＝7.6)、10mM MgCl₂、5mM DTT。泳道1，1ul 5'-腺苷酸化ssDNA与1ul HbuRnl2K106A，在90℃至孵育1小时。泳道2，1ul 5'-腺苷酸化ssDNA与1ul HbuRnl2K106A，在90℃下孵育1小时，然后加入1ul外切核酸酶I(NEB#M0293)并进一步在37℃下孵育1小时。泳道3，1ul 5'-腺苷酸化ssDNA与1ul MthRnl(NEB#E2610)，在65℃下孵育1小时。泳道4，1ul 5'-腺苷酸化ssDNA与1ul MthRnl(NEB#E2610)，在65℃下孵育1小时，然后加入1ul外切核酸酶I(NEB#M0293)并进一步在37℃下孵育1小时。所有反应均在含有7M尿素的20％聚丙烯酰胺变性凝胶上进行。

图4示出HbuRnl2赖氨酸106突变体的活性。对所有突变体进行His标记并使用Ni-NTA珠粒纯化。使用5'-腺苷酸化ssDNA测定纯化的突变体的ssDNA连接活性。将1ul纯化的HbuRnl2K106A突变体添加至含有70mM Tris-HCl、5mM DTT、5mM MnCl₂(pH 7.6@℃)和10pmol腺苷酸化ssDNA底物的10ul连接中。将反应物在90℃下孵育1小时，并在含有7M尿素的20％变性聚丙烯酰胺凝胶上解析。使用SYBR Gold对凝胶进行染色，并使用GEImageQuant LAS扫描仪进行扫描。在凝胶右侧标记环化的ssDNA条带。腺苷酸化条带的消失和环化条带的累积表明所述突变体的活性。1至18的泳道对应于突变体：1＝K106L；2＝K106I；3＝K106W；4＝K106M；5＝K106T；6＝K106X(点缺失)；7＝K106H；8＝K106G；9＝K106N；10＝K106Y；11＝K106V；12＝K106P；13＝K106C；14＝K106S；15＝K106E；16＝K106F；17＝K106R；18＝K106A。

图5示出突变体HbuRnl2K106A的反应温度分布图。使用温度梯度选项在Bio-radMyCycler中进行使用5'-腺苷酸化ssDNA的连接。所有反应均在含有7M尿素的20％聚丙烯酰胺变性凝胶上进行。使用Sybr Gold对凝胶进行染色，并使用GE Imager LAS进行扫描。通过ImageJ对凝胶图像进行分析。将环化ssDNA条带转换成数值，通过70℃下的值标准化，并相对于反应温度(X-轴)绘图。通过使用线性曲线拟合来拟合数据点。

图6示出使用HbuRnl2K106A的两个ssDNA片段之间的分子间连接。连接反应在10ul体积中进行，其中缓冲液含有70mM Tris-HCl(pH＝7.6)、10mM MgCl₂、5mM DTT、5mM Mn²⁺。每个反应含有2pmol短ssDNA(最下面的条带)和约20pmol 5'-腺苷酸化3'-NH2封闭的衔接子(中间两个条带的上面一个，下面条带是磷酸化衔接子，部分是由于不完全腺苷酸化所致)。另外，泳道1含有12％PEG8000，并且泳道2含有15％PEG8000。将两种反应物在90℃下孵育1小时，并在含有7M尿素的20％聚丙烯酰胺变性凝胶上解析。使用Sybr Gold对凝胶进行染色，并使用GE ImageQuant LAS扫描仪进行可视化。

图7示出基于示例性ssDNA连接的NGS文库制备。

图8示出PfuRnl2和HbuRnl2K106A作为混合物的用途。所有10ul反应均在70mMTris-HCl(pH＝7.6)、10mM MgCl₂、5mM DTT中进行。将反应物在90C下孵育1小时，并在含有7M尿素的20％聚丙烯酰胺变性凝胶上解析。使用Sybr Gold对凝胶进行染色，并使用GEImageQuant LAS扫描仪进行可视化。泳道3，仅5'-磷酸化DNA；泳道1，5'-磷酸化DNA与1ulPfuRnl2和1ul HbuRnl2K106A以及100uM ATP；泳道2，5'-磷酸化DNA与1ul PfuRnl2和1ulHbuRnl2K106A以及10uM ATP。

定义

在本申请中，ssDNA或ssRNA的5'-腺苷酸化端被称为“供体”端，并且ssDNA或ssRNA的3'-OH端被称为“受体”端。

具体实施方式

在某些实施方案中，所述超热稳定的赖氨酸-突变体是如以下表1中的SEQ ID No:1至11中所提供，或其N或C末端截短型式。

表1

超热稳定的赖氨酸-突变型ssDNA/RNA连接酶

在一些实施方案中，使用上文表1或下文表2中的序列来进行序列搜索(例如，使用BLAST)以发现来自其他物种的其他超热稳定的ssRNA连接酶(例如，通过发现具有30％…50％…60％或更高同源性的那些)。一旦鉴定了此类连接酶，就可定位此类序列中的基序I，并且可将这种基序I中的赖氨酸(K)突变为另一种氨基酸，优选丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、半胱氨酸(C)、缬氨酸(V)、苏氨酸(T)以及甘氨酸(G)。然后可例如使用与以下实施例1中相同的程序筛选此类候选酶的ssDNA和ssRNA活性(和热稳定性)。在此方面，可容易地完成发现和设计超热稳定的赖氨酸-突变型ssDNA/RNA连接酶。

在某些实施方案中，所述超热稳定的赖氨酸-突变型ssDNA/RNA连接酶用于测序方法中，如用于将衔接子连接至文库片段以用于随后的测序。例如，在一些实施方案中，本文提供的公开内容可用于第二代(也称为下一代(Next Generation或Next-Gen))、第三代(也称为下-下一代)或第四代(也称为N3-Gen)测序技术，包括但不限于，焦磷酸测序、边连接边测序、单分子测序、边合成边测序(SBS)、半导体测序、大规模平行克隆、大规模平行单分子SBS、大规模平行单分子实时、大规模平行单分子实时纳米孔技术等。Morozova和Marra在Genomics,92:255(2008)中提供了一些此类技术的综述，所述文献以引用的方式整体并入本文。

任何数量的DNA测序技术都是合适的，包括基于荧光的测序方法(参见，例如，Birren等人,Genome Analysis:Analyzing DNA,1,Cold Spring Harbor,N.Y.；其以引用的方式整体并入本文)。在一些实施方案中，本公开可用于所述领域中理解的自动测序技术。在一些实施方案中，本技术可用于分区扩增子的平行测序(PCT公布号：WO2006084132，其以引用的方式整体并入本文)。在一些实施方案中，所述技术可用于通过平行寡核苷酸延伸进行DNA测序(参见，例如，美国专利号5,750,341和美国专利号6,306,597，所述两者均以引用的方式并入本文)。所述技术可应用的测序技术的其他实例包括Church聚合酶克隆(polony)技术(Mitra等人,2003,Analytical Biochemistry 320,55-65；Shendure等人,2005Science 309,1728-1732；美国专利号6,432,360、美国专利号6,485,944、美国专利号6,511,803；其全部以引用的方式整体并入本文)、454picotiter焦磷酸测序技术(Margulies等人,2005Nature 437,376-380；US 20050130173；其以引用的方式整体并入本文)、Solexa单碱基添加技术(Bennett等人,2005,Pharmacogenomics,6,373-382；美国专利号6,787,308；美国专利号6,833,246；其以引用的方式整体并入本文)、Lynx大规模平行标记测序技术(Brenner等人(2000).Nat.Biotechnol.18:630-634；美国专利号5,695,934；美国专利号5,714,330；其全部以引用的方式整体并入本文)以及Adessi PCR集落技术(Adessi等人(2000).Nucleic Acid Res.28,E87；WO 00018957；其以引用的方式整体并入本文)。

下一代测序(NGS)方法具有大规模平行、高通量策略的共同特征，与老的测序方法相比，目标是降低成本(参见例如，Voelkerding等人,Clinical Chem.,55:641-658,2009；MacLean等人,Nature Rev.Microbiol.,7:287-296；各自以引用的方式整体并入本文)。NGS方法可大致分为通常使用模板扩增的那些方法和不使用模板扩增的那些方法。需要扩增的方法包括由Roche作为454技术平台(例如，GS 20和GS FLX)商业化的焦磷酸测序、LifeTechnologies/Ion Torrent、由Illumina商业化的Solexa平台、GnuBio以及由AppliedBiosystems商业化的支撑的寡核苷酸连接和检测(SOLiD)平台。非扩增方法(也称为单分子测序)通过Helicos BioSciences商业化的HeliScope平台以及分别由VisiGen,OxfordNanopore Technologies Ltd.和Pacific Biosciences商业化的新兴平台举例说明。

在焦磷酸测序中(Voelkerding等人,Clinical Chem.,55:641-658,2009；MacLean等人.,Nature Rev.Microbiol.,7:287-296；美国专利号6,210,891；美国专利号6,258,568；各自以引用的方式整体并入本文)，将模板DNA片段化、末端修复、连接至衔接子，并通过用带有与所述衔接子互补的寡核苷酸的珠粒捕获单个模板分子来进行原位克隆扩增。将带有单一模板类型的每个珠粒分隔成油包水微囊泡，并使用被称为乳液PCR的技术对模板进行克隆扩增。在扩增后使乳液破裂，并且在测序反应期间将珠粒沉积到用作流动池的皮量滴定板(picotitre plate)的各个孔中。四种dNTP试剂中的每一种的有序、迭代引入在流动池中在测序酶和发光报道分子如荧光素酶的存在下发生。如果将合适的dNTP添加至测序引物的3'端，则得到的ATP产生导致孔内的发光突发，使用CCD相机对其进行记录。有可能实现大于或等于400个碱基的阅读长度，并且可实现10⁶个序列读数，从而产生达5亿个碱基对(Mb)的序列。

在Solexa/Illumina平台中(Voelkerding等人,Clinical Chem.,55:641-658,2009；MacLean等人,Nature Rev.Microbiol.,7:287-296；美国专利号6,833,246；美国专利号7,115,400；美国专利号6,969,488；各自以引用的方式整体并入本文)，测序数据以较短长度读数的形式产生。在这种方法中，对单链片段化DNA进行末端修复以产生5'-磷酸化的平末端，然后进行Klenow介导的单个A碱基添加至所述片段的3'端。A-添加有助于添加T-突出端衔接子寡核苷酸，所述寡核苷酸随后用于捕获镶嵌有寡核苷酸锚的流动池表面上的模板-衔接子分子。所述锚用作PCR引物，但由于模板的长度及其与其他附近的锚寡核苷酸的接近，通过PCR的延伸导致分子的“拱悬”以与相邻的锚寡核苷酸杂交来在流动池表面上形成桥结构。这些DNA环变性并裂解。然后用可逆染料终止子对正向链进行测序。通过检测掺入后荧光来确定掺入核苷酸的序列，其中在下一个dNTP添加循环之前除去每种荧光体和嵌段。序列阅读长度在36个核苷酸至超过250个核苷酸的范围内，其中每个分析运行的总输出超过10亿个核苷酸对。

使用SOLiD技术对核酸分子进行测序(Voelkerding等人,Clinical Chem.,55:641-658,2009；MacLean等人,Nature Rev.Microbiol.,7:287-296；美国专利号5,912,148；美国专利号6,130,073；其各自以引用的方式整体并入本文)还涉及模板的片段化、与寡核苷酸衔接子的连接、与珠粒的连接以及通过乳液PCR进行的克隆扩增。在此之后，将带有珠粒的模板固定在玻璃流动池的衍生化表面上，并使与衔接子寡核苷酸互补的引物退火。然而，不是将所述引物用于3'延伸，而是用于提供5'磷酸基团以用于连接至含有两个探针特异性碱基、随后6个简并碱基和四种荧光体荧光标记中的一个的查询探针。在SOLiD系统中，查询探针在每个探针的3'端具有两个碱基的16种可能的组合，在5'端具有4个荧光体中的一个。每个探针的荧光体颜色以及个性特征对应于特定的颜色空间编码方案。多轮(通常7次)探针退火、连接和荧光体检测之后进行变性，且然后使用相对于初始引物偏移一个碱基的引物进行第二轮测序。以这种方式，可计算重构模板序列，并且模板碱基被查询两次，从而使得准确性提高。序列阅读长度平均为35个核苷酸，并且每个测序运行的总输出超过40亿个碱基。

在某些实施方案中，本文描述的技术可用于纳米孔测序(参见，例如，Astier等人,J.Am.Chem.Soc.2006年2月8日128(5):1705–10，其以引用的方式整体并入本文)。纳米孔测序背后的理论与纳米孔浸入导电流体并在其上施加电势(电压)时发生的情况有关。在这些条件下，可观察到由于离子通过纳米孔的传导而产生的微小电流，并且电流的量对纳米孔的尺寸极其敏感。当核酸的每个碱基穿过纳米孔时，这引起通过纳米孔的电流的大小的变化，其对于四种碱基中的每一个都是不同的，从而允许确定DNA分子的序列。

在某些实施方案中，本文描述的技术可用于Helicos BioSciences的HeliScope(Voelkerding等人,Clinical Chem.,55:641-658,2009；MacLean等人,NatureRev.Microbiol.,7:287-296；美国专利号7,169,560；美国专利号7,282,337；美国专利号7,482,120；美国专利号7,501,245；美国专利号6,818,395；美国专利号6,911,345；美国专利号7,501,245；各自以引用的方式整体并入本文)。模板DNA被片段化并在3'端聚腺苷酸化，其中最终的腺苷带有荧光标记。将变性的聚腺苷酸化模板片段连接至流动池表面上的聚(dT)寡核苷酸。通过CCD相机记录所捕获的模板分子的初始物理位置，且然后将标记裂解并洗掉。通过添加聚合酶和连续添加荧光标记的dNTP试剂来实现测序。掺入事件产生对应于dNTP的荧光信号，并且在每轮dNTP添加之前通过CCD相机捕获信号。序列阅读长度在25至50个核苷酸的范围内，其中每个分析运行的总输出超过10亿个核苷酸对。

Ion Torrent技术是基于在DNA的聚合期间释放的氢离子的检测的DNA测序方法(参见，例如，Science 327(5970):1190(2010)；美国专利申请公布号20090026082、20090127589、20100301398、20100197507、20100188073以及20100137143，其出于所有目的以引用的方式整体并入本文)。微孔含有待测序的模板DNA链。在微孔层下面是超灵敏的ISFET离子传感器。所有层都包含在CMOS半导体芯片中，类似于电子工业中使用的那种。当dNTP掺入正在生长的互补链中时，氢离子被释放，这触发了超灵敏的离子传感器。如果模板序列中存在均聚物重复，则将在单个循环中掺入多个dNTP分子。这导致相应数量的释放的氢和比例更高的电子信号。这种技术与其他测序技术的不同之处在于未使用修饰的核苷酸或光学器件。对于50个碱基读数，Ion Torrent测序仪的每碱基准确度是约99.6％，每次运行产生约100Mb至100Gb。读取长度是100至300个碱基对。长度为5个重复的均聚物重复的准确度是约98％。离子半导体测序的益处是快速的测序速度和较低的前期和操作成本。

本文公开的技术可用于由Stratos Genomics,Inc.开发的另一种核酸测序方法，并涉及Xpandomer的使用。这种测序方法通常包括提供通过模板指导的合成产生的子链。所述子链通常包括偶联在对应于靶核酸的全部或部分的连续核苷酸序列的序列中的多个亚基，其中各个亚基包含系链、至少一个探针或核碱基残基以及至少一个可选择性裂解的键。可选择性裂解的键被裂解以产生长度比子链的多个亚基更长的Xpandomer。Xpandomer通常包括系链和报道基因元件，以用于在对应于靶核酸的全部或部分的连续核苷酸序列的序列中解析遗传信息。然后检测Xpandomer的报道基因元件。关于基于Xpandomer的方法的另外细节描述于，例如，美国专利公布号20090035777中，其以引用的方式整体并入本文。

其他单分子测序方法包括使用VisiGen平台通过合成进行的实时测序(Voelkerding等人,Clinical Chem.,55:641–58,2009；美国专利号7,329,492；美国专利申请序列号11/671956；美国专利申请序列号11/781166；各自以引用的方式整体并入本文)，其中使用荧光修饰的聚合酶和荧光受体分子使固定的引发的DNA模板进行链延伸，从而在核苷酸添加后产生可检测的荧光共振能量转移(FRET)。

在某些实施方案中，本文提供了组合物、试剂盒和系统，所述组合物、试剂盒和系统包含由SEQ ID NO:1至11编码或由与SEQ ID NO:1至11具有实质同一性的序列编码的超热稳定的赖氨酸-突变型ssDNA/RNA连接酶。当应用于此类多肽时，术语“实质同一性”是指当使用默认空位权重如通过程序GAP或BESTFIT最佳比对时，两个肽序列共享至少80％序列同一性、或至少90％序列同一性、或至少95％序列同一性或更高(例如，95％…97％…或99％序列同一性)。在具体实施方案中，不相同的残基位置因保守氨基酸取代而不同。保守氨基酸取代是指具有相似侧链的残基的可互换性。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；并且具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。在一些实施方案中，保守氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸以及天冬酰胺-谷氨酰胺。在某些实施方案中，本文提供了与SEQ ID NO:1至11中所示的至少一部分氨基酸序列具有实质同一性。

实验

实施例1

突变型超热稳定的ssDNA/RNA连接酶

首先，在本领域的检索中鉴定了一系列超热稳定的RNA连接酶。以下表2中的此列表包括超嗜热古生菌物种，其中一些可耐受超过100℃的环境。

表2

*Pab1020先前已进行了研究并且显示具有ssRNA连接活性，但无ssDNA连接活性(Brooks等人,Protein Science,2008)。

来自表2的10种连接酶中的3种(PhoRnl2、PfuRnl2、HbuRnl2)使用优化的大肠杆菌密码子进行合成、表达并纯化，并且在高温(如在图1中90℃)下检查它们对单链RNA和DNA底物的活性。如图1中所示，使用5'-磷酸化ssRNA和5'-磷酸化ssDNA寡核苷酸作为底物，在ATP浓度滴定下测定了酶的活性。如图1A、1C和1E中所示，所有测试的酶可将5'-磷酸化ssRNA转变为5'-腺苷酸化ssRNA和环化ssRNA。在较高浓度的ATP下，连接反应在腺苷转移步骤(步骤2)后似乎停止，以使得累积更多的腺苷酸化产物。由于同一ssRNA分子内溶液中末端的接近，所以分子内连接比分子间连接更优选，以使得主要连接产物是环化ssRNA。这一证据支持所有酶都是活性超热稳定的ssRNA连接酶。

然而，关于对ssDNA的活性，尽管所有的酶都可将5'-磷酸化ssDNA转变为5'-腺苷酸化ssDNA，如图1B、1D和1F中所示，但在不同浓度的ATP下没有形成环化ssDNA，从而表明它们不具有ssDNA连接活性，这也与Pab1020研究一致(Brooks等人,Protein Science,2008)。在较高浓度的ATP下，5'-腺苷酸化ssDNA的累积较高，从而表明在腺苷转移步骤2之后类似的停止。在PfuRnl2的情况下，当ATP浓度高于10uM时，它能够腺苷酸化超过90％的ssDNA的5'-磷酸化末端。在相同条件下，另外两种酶表现出低得多的腺苷酸化效率(图1)。这种独特的性质使野生型PfuRnl2成为ssRNA和ssDNA的有用的超热稳定的5'-腺苷化酶。虽然本发明不限于任何特定的机制，并且对所述机制的理解对于实施本发明不是必需的，但基于这些结果，据信尽管这些酶可在ssDNA的5'-磷酸化末端上进行腺苷转移的步骤2，但它们不能完成ssDNA上连接的最后步骤。换言之，它们在本质上不是ssDNA连接酶。

接着，在有或没有ATP的条件下测试了RNA连接酶中的一种(HbuRnl2)对5'-腺苷酸化ssDNA的活性。如图2中所示，野生型HbuRnl2可在不存在ATP的情况下有效地使5'-腺苷酸化ssDNA去腺苷酸化(泳道2)。去腺苷酸化是连接反应中步骤2的逆过程，其中未腺苷酸化的酶将AMP从5'-腺苷酸化末端转移回至其催化性赖氨酸。在高浓度ATP存在下，未发生这种逆步骤2反应(图2，泳道1)。虽然本发明不限于任何特定的机制，并且对所述机制的理解对于实施本发明不是必需的，但通过结合以下观察结果：HbuRnl2、PfuRnl2和PhoRnl2可在ATP滴定下将不同比例的5'-磷酸化ssDNA腺苷酸化，假设逆步骤2反应可阻断连接反应向前移动。减少逆步骤2反应可推动反应向前以完成ssDNA上连接的步骤3。

在连接的步骤2中，腺苷基从连接酶中保守的基序I中的催化性赖氨酸转移至5'-磷酸化末端。催化性赖氨酸存在于保守基序EKx(D/N/H)G(SEQ ID NO:32)中。因此，尽管本发明不限于任何特定的机制，并且对所述机制的理解对于实施本发明不是必需的，但通过将基序I中的催化性赖氨酸突变为其他氨基酸，可阻断或减少步骤2逆反应，以使得可发生步骤3连接，所述步骤3连接是3’-OH端与5'-腺苷酸化端之间的连接。

接下来，选择HbuRnl2作为靶标，并且构建并纯化了突变型HbuRnl2K106A(SEQ IDNO:7)，并在步骤3连接中测定了其活性。如图3中所示，HbuRnl2K106A可通过将5'-腺苷酸化的ssDNA转变为环化ssDNA来催化分子内连接。在反应后，环化ssDNA对外切核酸酶I消化具有抗性，并在ExoI处理后保留在凝胶上(图3，泳道2)。作为对照和比较，还进行了在65℃下由野生型MthRnl催化的连接反应，并且结果显示了同一环化ssDNA(图3，泳道3和4)。总之，这些结果证实，尽管野生型HbuRnl2不具有ssDNA的步骤3连接活性，但通过突变HbuRnl2中的催化性赖氨酸，所述酶获得了连接ssDNA的5'-腺苷酸化末端和3'-OH末端的新的活性。

接下来，将HbuRnl2中的赖氨酸106改变为其他氨基酸，并测定了突变体的腺苷酸化ssDNA环化活性。如图4中所示，突变体K106T、K106G、K106V、K106C、K106S在腺苷酸化ssDNA环化以及K106A中具有活性。其他赖氨酸突变体在腺苷酸化ssDNA环化中无活性。

然后检查了HbuRnl2K106A的最佳反应温度范围。如图5中所示，在70℃至95℃的温度范围内测定了5'-腺苷酸化ssDNA环化活性。活性似乎从70℃适度地升高至90℃，并在90℃后达到平稳期。由于这个原因，生物化学测定在90℃下进行。此观察结果也与来自超嗜热古生菌的酶的来源一致，并且表明突变不会改变其超热稳定性。

由于ssDNA/RNA的固有灵活性和同一寡核苷酸的末端的接近性，所以通过连接进行的分子内环化以比分子间级联高得多的频率发生。这可能是TS2126连接酶被命名为“CircLigase”的部分原因(WO2004/027056A2)。ssDNA/RNA的环化可用于许多应用。例如，环化的寡核苷酸对外切核酸酶消化具有抗性，并且可用作扩增(如滚环扩增)板。然而，通常需要促进分子间ssDNA/RNA连接而不是分子内环化，例如，当想要将寡核苷酸衔接子连接至ssDNA/RNA文库时。

许多策略可用于促进ssDNA/RNA之间的分子间连接。例如，可修饰ssDNA/RNA的3'-OH末端，如通过使用NH₂基团或许多其他修饰基团，以使得OH基团不存在用于分子内连接发生。此外，可使用Mn²⁺和连接增强子，如PEG8000(Zhelkovsky A.,等人,BMC Biotechnology,2012，以引用的方式并入本文)。

在图6中，显示通过使用摩尔过量的5'-腺苷酸化的3'-NH₂修饰的衔接子，对于HbuRnl2K106A来说，不仅可能进行分子间连接，而且还可有效地接近>90％的完成。这种性质例如在许多应用中的衔接子连接中是有用的。

根据上述，确定突变体HbuRnl2K106A可催化两个ssRNA片段之间的连接，其中连接供体和受体两者均是RNA，并且它可催化两个ssDNA片段之间的连接，其中连接供体和受体两者均是DNA。进一步证明它可在ssRNA供体与ssDNA受体之间或在ssDNA供体与ssRNA受体之间连接(数据未显示)。这些性质对于许多应用是有用的。例如，用于小RNA克隆和测序的当前方案使用T4Rnl2及其突变体在37℃或更低温度下用于将5'-腺苷酸化ssDNA衔接子连接至ssRNA的3'-OH。可将HbuRnl2K106A用于相同的目的，但是在更高的温度下，具有最小化二级结构的优点。

根据上述，表明PfuRnl2可有效地腺苷酸化ssDNA的5'-磷酸化末端(图1)。如图8中所示，还可在一锅法反应中混合PfuRnl2和HbuRnl2K106A，以使得PfuRnl2可使5'-磷酸化末端腺苷酸化，并且HbuRnl2K106A可连接ssDNA的5'-腺苷酸化末端与3'-OH末端。因此，所述酶混合物可在高反应温度下进行连接反应的步骤1至步骤3。

实施例1的方法和材料

1.超热稳定的单链RNA/DNA连接酶的合成、诱变、表达和纯化

通过IDT(Integrated DNA Technologies,Coralville,Iowa)将所有基因合成为在N-末端具有优化的大肠杆菌密码子使用和6X-His-标签的双链DNA片段。然后使用GibsonAssembly(NEB#E2611)在T7启动子控制下将DNA插入表达载体pTXB1中。将表达构建体转化到表达T7的大肠杆菌菌株(NEB#C2566)中。为了在培养物中表达，使细胞在LB培养基中生长至OD约0.6，然后加入最终浓度为0.5mM的IPTG。通过在20℃下振荡过夜使诱导的培养物保持生长。

为了纯化，首先通过离心沉淀250ml诱导的细胞培养物。然后将细胞沉淀重新悬浮于含有20mM Tris(pH＝7.5)、150mM NaCl、1x FastBreak(Promega)、200ug/ml溶菌酶的缓冲液中，并进行超声处理。然后将细胞溶解产物在4℃下以15,000g离心20分钟。然后在Ni-NTA柱和肝素柱上依次纯化澄清的溶解产物。

用克隆的构建体进行定点诱变(例如，通过使用New England Biolabs的Q5诱变试剂盒)以将突变引入保守的赖氨酸残基。

实施例2

单链衔接子连接

超热稳定的ssDNA/RNA连接酶(例如，如SEQ ID NO:1至11中所描述)可用于下一代高通量测序的文库制备过程。目前，主要文库构建方法包括连接步骤，其中将双链文库片段连接至双链衔接子。存在基于单链连接的方法，但通过使用CircLigase，其最佳反应温度为约65℃(Gansauge MT,Nat.Protol.,2013)。

如图7A中所示，首先将大DNA片段化，例如，通过使用酶促方法或通过机械/超声剪切。取决于片段化方法，所述片段的末端可能需要使用例如T4聚核苷酸激酶的修复步骤。然后将片段化的DNA连接至具有5'-腺苷酸化末端和3'-NH₂末端的第一单链DNA衔接子。这种分子间连接由本文公开的ssDNA/RNA连接酶中的一种(如HbuRnl2K106A)催化，其可在Mn2+和PEG8000存在下在高温下进行。

在连接后，使用提纯，例如通过使用AMPure珠粒或本领域熟知的其他方法来回收与第一衔接子连接的所有片段。然后将回收的片段腺苷酸化，例如，通过使用高浓度ATP中的超热稳定的5'-腺苷酸PfuRnl2。然后，将5'-腺苷酸化的DNA片段与第二衔接子连接，例如，与常规5'-OH端和3'-OH端连接。这种连接反应由本文的突变型连接酶中的一种(如超热稳定的HbuRnl2K106A)催化。在连接后，将连接的DNA片段纯化并准备用于进一步的下游步骤，如经由聚合酶链式反应(PCR)或团簇产生。

使用本发明公开的方法、组合物和系统，存在基于单链连接的文库构建的许多优点。首先，可简化NGS样品制备的工作流程，而无需最终精处理步骤。其次，与先前的方案相比，由于高反应温度，可能存在更少的偏差，特别是对于文库中的长寡核苷酸段来说。第三，序列读数可级联以形成合成长读数并分配给不同的起始基因组DNA分子，假设通过剪切过程引入随机断点和相对深的测序覆盖率，以使得对大多数ssDNA片段进行测序(图7B)。

参考文献

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本说明书中提及的和/或下文列出的所有出版物和专利以引用的方式并入本文。本发明的所描述的方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员将显而易见，而不背离本发明的范围和精神。虽然已结合具体实施方案描述了本发明，但应理解，所要求保护的本发明不应不适当地限于此类具体实施方案。事实上，对于相关领域的技术人员来说显而易见的用于进行本发明的所描述模式的各种修改意图在本文描述的范围内。

Claims

1.一种连接单链核酸的方法，所述方法包括：

a)在反应混合物中组合以下各项：

i)超热稳定的赖氨酸-突变型ssDNA/RNA连接酶，所述连接酶是前体超热稳定的ssRNA连接酶的突变型式，

其中所述前体超热稳定的ssRNA连接酶具有基序I EKx(D/N/H)G(SEQ ID NO:32)并且在至少75℃的温度下具有ssRNA连接酶活性，但不具有ssDNA连接酶活性，并且

其中所述超热稳定的赖氨酸-突变型ssDNA/RNA连接酶在所述基序I中的所述K(赖氨酸)处具有氨基酸取代，并且在至少75℃的温度下具有ssRNA连接酶和ssDNA连接酶活性两者，

ii)具有腺苷酸化的5'端碱基的第一单链核酸序列，以及

iii)具有3'端碱基的第二单链核酸序列；以及

b)在至少75℃的温度下孵育所述反应混合物，以使得所述超热稳定的赖氨酸-突变型ssDNA/RNA连接酶将所述第一单链核酸序列的所述5'腺苷酸化端连接至所述第二单链核酸序列的所述3'端以形成连接的核酸序列。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述第一单链核酸序列的所述5'端碱基是DNA碱基，并且其中所述第二单链核酸序列的所述3'端碱基是RNA碱基或DNA碱基。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述第一单链核酸序列的所述5'端碱基是DNA碱基或RNA碱基，并且其中所述第二单链核酸序列的所述3'端碱基是DNA碱基。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述第一单链核酸序列中的所述碱基全部都是DNA碱基。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述第二单链核酸序列中的所述碱基全部都是DNA碱基。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述K(赖氨酸)的所述氨基酸取代是选自由以下各项组成的组的氨基酸：丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、半胱氨酸(C)、缬氨酸(V)、苏氨酸(T)以及甘氨酸(G)。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述前体超热稳定的ssRNA连接酶是野生型超热稳定的ssRNA连接酶。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述野生型超热稳定的ssRNA连接酶是来自选自由以下各项组成的组的物种：极端嗜热古生菌柯达克氏菌、超嗜热嗜压古菌、掘越氏热球菌、深海火球菌、强烈火球菌、丁酸栖高温菌、敏捷气热菌、海生葡萄状嗜热菌、烟栖火叶菌以及风产液菌。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述超热稳定的赖氨酸-突变型ssDNA/RNA连接酶由SEQ ID NO:1至11中所示的氨基酸序列中的一个编码。

10.如权利要求1所述的方法，其中所述超热稳定的赖氨酸-突变型ssDNA/RNA连接酶由与SEQ ID NO:1至11中所示的氨基酸序列中的一个具有至少95％序列同一性的氨基酸序列编码。

11.如权利要求1所述的方法，其中所述孵育所述反应混合物是在至少85℃的温度下进行。

12.如权利要求1所述的方法，其中所述孵育所述反应混合物是在至少95℃的温度下进行。

13.如权利要求1所述的方法，其中所述第一单链核酸序列是测序衔接子。

14.如权利要求1所述的方法，其中所述第二单链核酸序列包含测序文库片段。

15.如权利要求1所述的方法，其还包括c)对所述连接的核酸序列进行测序。

16.一种系统或试剂盒，其包含：

a)超热稳定的赖氨酸-突变型ssDNA/RNA连接酶，所述连接酶是前体超热稳定的ssRNA连接酶的突变型式，

b)具有腺苷酸化的5'端碱基的第一单链核酸序列；以及

c)具有3'端碱基的第二单链核酸序列。

17.如权利要求16所述的系统，其还包含第一容器和第二容器，并且其中所述超热稳定的赖氨酸-突变型ssDNA/RNA连接酶在所述第一容器中，并且所述第一单链核酸序列和/或所述第二单链核酸序列在所述第二容器中。

18.如权利要求16所述的系统，其中所述第一单链核酸序列的所述5'端碱基是DNA碱基，并且其中所述第二单链核酸序列的所述3'端碱基是RNA碱基或DNA碱基。

19.如权利要求16所述的系统，其中所述第一单链核酸序列的所述5'端碱基是DNA碱基或RNA碱基，并且其中所述第二单链核酸序列的所述3'端碱基是DNA碱基。

20.如权利要求16所述的系统，其中所述第一单链核酸序列中的所述碱基全部都是DNA碱基。

21.如权利要求16所述的系统，其中所述第二单链核酸序列中的所述碱基全部都是DNA碱基。

22.如权利要求16所述的系统，其中所述K(赖氨酸)的所述氨基酸取代是选自由以下各项组成的组的氨基酸：丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、半胱氨酸(C)、缬氨酸(V)、苏氨酸(T)以及甘氨酸(G)。

23.如权利要求22所述的系统，其中所述前体超热稳定的ssRNA连接酶是野生型超热稳定的ssRNA连接酶。

24.如权利要求23所述的系统，其中所述野生型超热稳定的ssRNA连接酶是来自选自由以下各项组成的组的物种：极端嗜热古生菌柯达克氏菌、超嗜热嗜压古菌、掘越氏热球菌、深海火球菌、强烈火球菌、丁酸栖高温菌、敏捷气热菌、海生葡萄状嗜热菌、烟栖火叶菌以及风产液菌。

25.如权利要求16所述的系统，其中所述超热稳定的赖氨酸-突变型ssDNA/RNA连接酶由SEQ ID NO:1至11中所示的氨基酸序列中的一个编码。

26.如权利要求16所述的系统，其中所述超热稳定的赖氨酸-突变型ssDNA/RNA连接酶由与SEQ ID NO:1至11中所示的氨基酸序列中的一个具有至少95％序列同一性的氨基酸序列编码。

27.如权利要求16所述的系统，其中所述第一单链核酸序列是测序衔接子。

28.如权利要求16所述的系统，其中所述第二单链核酸序列包含测序文库片段。

29.一种组合物，其包含：超热稳定的赖氨酸-突变型ssDNA/RNA连接酶，所述连接酶是前体超热稳定的ssRNA连接酶的突变型式，

其中所述前体超热稳定的ssRNA连接酶具有基序IEKx(D/N/H)G(SEQ ID NO:32)并且在至少75℃的温度下具有ssRNA连接酶活性，但不具有ssDNA连接酶活性，并且

其中所述超热稳定的赖氨酸-突变型ssDNA/RNA连接酶在所述基序I中的所述K(赖氨酸)处具有氨基酸取代，并且在至少75℃的温度下具有ssRNA连接酶和ssDNA连接酶活性两者。

30.如权利要求29所述的组合物，其还包含以下中的至少一种：

a)具有腺苷酸化的5'端碱基的第一单链核酸序列，以及

b)具有3'端碱基的第二单链核酸序列。

31.如权利要求29所述的组合物，其中所述K(赖氨酸)的所述氨基酸取代是选自由以下各项组成的组的氨基酸：丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、半胱氨酸(C)、缬氨酸(V)、苏氨酸(T)以及甘氨酸(G)。

32.如权利要求29所述的组合物，其中所述前体超热稳定的ssRNA连接酶是野生型超热稳定的ssRNA连接酶。

33.如权利要求32所述的组合物，其中所述野生型超热稳定的ssRNA连接酶是来自选自由以下各项组成的组的物种：极端嗜热古生菌柯达克氏菌、超嗜热嗜压古菌、掘越氏热球菌、深海火球菌、强烈火球菌、丁酸栖高温菌、敏捷气热菌、海生葡萄状嗜热菌、烟栖火叶菌以及风产液菌。

34.如权利要求29所述的组合物，其中所述超热稳定的赖氨酸-突变型ssDNA/RNA连接酶由SEQ ID NO:1至11中所示的氨基酸序列中的一个编码。

35.如权利要求29所述的组合物，其中所述超热稳定的赖氨酸-突变型ssDNA/RNA连接酶由与SEQ ID NO:1至11中所示的氨基酸序列中的一个具有至少95％序列同一性的氨基酸序列编码。

36.一种方法，其包括：

a)在反应混合物中组合以下各项：

i)来自强烈火球菌的单链RNA连接酶(PfuRn12)，以及

ii)具有未腺苷酸化的5'端的单链核酸序列，

iii)ATP分子；以及

b)在使得所述PfuRn12腺苷酸化所述单链核酸序列的所述未腺苷酸化的5'端的条件下孵育所述反应混合物，从而产生具有腺苷酸化的5'端碱基的第一单链核酸序列。

37.如权利要求36所述的方法，其中所述孵育是在至少75℃的温度下进行。

38.如权利要求36所述的方法，其中所述反应混合物中的所述组合还包括：iv)具有3'端碱基的第二单链核酸序列，v)超热稳定的赖氨酸-突变型ssDNA/RNA连接酶，所述连接酶是前体超热稳定的ssRNA连接酶的突变型式，其中所述前体超热稳定的ssRNA连接酶具有基序I EKx(D/N/H)G(SEQ ID NO:32)并且在至少75℃的温度下具有ssRNA连接酶活性，但不具有ssDNA连接酶活性，并且其中所述超热稳定的赖氨酸-突变型ssDNA/RNA连接酶在所述基序I中的所述K(赖氨酸)处具有氨基酸取代并且在至少75℃的温度下具有ssRNA连接酶和ssDNA连接酶活性两者。

39.如权利要求38所述的方法，其中所述超热稳定的赖氨酸-突变型ssDNA/RNA连接酶将所述第一单链核酸序列的所述5'腺苷酸化端连接至所述第二单链核酸序列的所述3'端以形成连接的核酸序列。

40.一种组合物、试剂盒或系统，其包含：

a)来自强烈火球菌的单链RNA连接酶(PfuRn12)，以及

b)超热稳定赖氨酸-突变型ssDNA/RNA连接酶，其是前体超热稳定的ssRNA连接酶的突变型式，其中所述前体超热稳定的ssRNA连接酶具有基序I EKx(D/N/H)G(SEQ ID NO:32)并且在至少75℃的温度下具有ssRNA连接酶活性，但不具有ssDNA连接酶活性，并且其中所述超热稳定的赖氨酸-突变型ssDNA/RNA连接酶在所述基序I中的所述K(赖氨酸)处具有氨基酸取代并且在至少75℃的温度下具有ssRNA连接酶和ssDNA连接酶活性两者。

41.如权利要求40所述的组合物，其还包含：c)具有未腺苷酸化的5'端的单链核酸序列。