CN114317676A

CN114317676A - T4 rna连接酶活性的检测方法

Info

Publication number: CN114317676A
Application number: CN202011080485.1A
Authority: CN
Inventors: 蔡统聪; 商桂; 杜翔斐; 贺婷
Original assignee: Guangdong Fapon Biotech Co Ltd
Current assignee: Guangdong Fapon Biotech Co Ltd
Priority date: 2020-10-10
Filing date: 2020-10-10
Publication date: 2022-04-12

Abstract

本发明提出了一种T4 RNA连接酶活性的检测方法。该方法包括：将第一RNA单链与第二核酸单链在待测T4 RNA连接酶的作用下发生连接反应，以便获得第一单链模板；以所述第一单链模板为模板，使第三核酸单链在逆转录酶的作用下沿着5’到3’方向进行延伸，以便获得第二单链模板；以所述第二单链模板为模板，进行荧光定量PCR反应，以便获得荧光反应的CT值；基于预先设置的酶浓度与CT值的对应关系，确定待测T4 RNA连接酶的活性。

Description

T4 RNA连接酶活性的检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及T4 RNA连接酶活性的检测方法。

背景技术

T4 RNA Ligase，即T4 RNA连接酶，是一种ATP-依赖的可以催化单链RNA、单链DNA或单核苷酸分子间或分子内5'-P末端与3'-OH末端之间形成磷酸二酯键的酶。T4 RNALigase对于RNA之间的连接效率最高，DNA与RNA之间的连接效率次之，而DNA之间的连接效率最低，因此也被认为是一种ssRNA ligase。

T4 RNA Ligase主要用于RNA和RNA之间的连接，连接时需要5'磷酸基团和3'羟基的存在。T4 RNA Ligase不仅可以进行RNA分子间的连接，也可以进行RNA分子(最短8个碱基)的环化连接。

T4 RNA Ligase也可以用于RNA和单核苷酸之间的连接，单核苷酸必须为5'和3'均磷酸化的形式，此时常用于RNA的3'末端标记。T4 RNA Ligase也可以用于DNA和RNA之间的连接。当DNA提供5'磷酸基团，RNA提供3'羟基时，连接效率较高；当DNA提供3'羟基，RNA提供5'磷酸基团时，连接效率非常低。

T4 RNA Ligase也可以用于DNA和DNA之间的连接，但连接效率非常低。主要用于DNA的环化连接，例如5'RACE中的cDNA环化。DNA和DNA之间的连接尽管可以进行，但比较困难。

T4 RNA Ligase催化连接反应过程如下。首先，T4 RNA Ligase与ATP发生反应，产生中间产物T4 RNA Ligase-AMP，并释放焦磷酸；接着，AMP从中间产物T4 RNA Ligase-AMP中转移至核酸的5’磷酸末端，形成腺苷酰化核酸中间产物；最后，在T4 RNA Ligase的催化下，另一核酸的3’羟基进攻腺苷酰化核酸中间产物的5’磷酸末端，形成3’-5’磷酸二酯键，并释放出AMP。

T4 RNA Ligase主要用于RNA的连接以及RNA的修饰等RNA相关方面的应用，在NGS领域中，在小分子RNA建库的相关建库技术中，也应用到T4 RNA Ligase。

常规的酶活检测方法为使用放射性同位素进行酶活标定，通过检测1nmol的5′-[32P]rA16转化成磷酸盐不溶物所需要的酶量定义为1个酶活单位。但常规标准的T4 RNALigase测活方法但受标记物质量所限，操作过程中易产生放射性污染，且步骤多、周期长，难以实现高通量、自动化。

因此，T4 RNA连接酶活性的检测方法仍需要进一步开发和改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明提出了一种无放射性污染、对环境的要求低、操作步骤简单快速、试剂成本低，而灵敏度高的T4RNA连接酶活性的检测方法。

本发明提出了一种T4 RNA连接酶活性的检测方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将第一RNA单链与第二核酸单链在待测T4 RNA连接酶的作用下发生连接反应，以便获得第一单链模板，所述第二核酸单链的5’端具有磷酸化修饰，所述第二核酸单链的3’端具有封闭基团；以所述第一单链模板为模板，使第三核酸单链在逆转录酶的作用下沿着5’到3’方向进行延伸，以便获得第二单链模板，所述第三核酸单链为单链DNA，所述第三核酸单链的至少一部分与所述第二核酸单链完全互补；以所述第二单链模板为模板，进行荧光定量PCR反应，以便获得荧光反应的CT值；基于预先设置的酶浓度与CT值的对应关系，确定待测T4 RNA连接酶的活性。如前所述，根据本发明实施例的检测方法，相比于现有技术，无放射性污染、对环境的要求低、操作步骤简单快速、试剂成本低，而灵敏度更高，且该方法建立了T4 RNA Ligase的活性和CT值的定量关系，通过测定CT值，来反应T4 RNA Ligase的活性，克服了传统方法无法准确定量的缺陷，测量结果更准确。

根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述第三核酸单链包括5’端片段和3’端片段，所述第三核酸单链的3’端片段与所述第二核酸单链完全互补，第三核酸单链的5’端片段的长度至少为1bp。发明人发现，当所述第三核酸单链的3’端片段与所述第二核酸单链完全互补，第三核酸单链的5’端片段的长度至少为1bp，即当第三核酸单链的3‘端与第二核酸单链完全互补，但5’端存在不互补的突出区段时，在该突出区段上设计引物，可进一步提高检测的准确性。

根据本发明的实施例，所述第三核酸单链的5’端片段的长度为50～100bp。发明人发现，所述第三核酸单链的5’端片段的长度为50～100bp，可更进一步提高检测的准确性。

根据本发明的实施例，所述第二核酸单链为RNA或DNA单链。根据本发明实施例的检测方法，可通过RNA和RNA的连接效率或RNA和DNA单链的连接效率间接反应待测T4 RNALigase的活性。

根据本发明的实施例，所述封闭基团为氨基或双脱氧基团。进而封闭第二核酸单链的3’端，避免连接后发生环化反应。

根据本发明的实施例，逆转录反应后，进一步包括利用RNA酶(例如RnaseH、RnaseA等至少一种)对逆转录反应产物进行消化处理，以便获得所述第二单链模板。进而将第一单链模板消化掉，获得第二单链模板，便于后续荧光定量正向引物和结合，进一步提高酶活测定的准确度。其中，RNA酶处理可以在荧光定量PCR反应前也可以在反应中。

根据本发明的实施例，所述荧光定量PCR反应中，设置有第一引物和第二引物；第一引物与所述第二单链模板靠近3’端的片段互补，第二引物与所述第二单链模板靠近5’端的片段相同。优选地，所述第一引物不与所述第三核酸单链互补。在荧光定量PCR反应中，如果起始连接反应中，第一RNA单链与第二核酸单链连接成功，则可逆转录形成第二单链模板，第一引物则可与第二单链模板的3’端互补配对，延伸出互补链，扩增出双链DNA产物；而如果起始连接反应中，第一RNA单链与第二核酸单链没有连接成功，则第三核酸单链无法逆转录出第二单链模板，第一引物也就无法与第二单链模板互补配对，同时第一引物也无法与第三核酸单链互补配对，不能扩增出双链DNA产物。

根据本发明的实施例，第二引物与第三核酸单链靠近5’端的片段相同，将引物设计在第三核酸单链的突出区段上，可进一步提高检测准确性。以上所述的靠近5’端或3’端的片段是指序列中位置上靠近这两端的核酸片段，但不要求所述片段必须起始或终止于所述序列的5’端或3’端。

根据本发明的实施例，所述荧光定量PCR反应中，还设置有荧光探针。

根据本发明的实施例，所述第一RNA单链具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

rGrUrUrCrArGrArGrUrUrCrUrArCrArGrUrCrCrGrArCrGrArUrC(SEQ ID NO:1)。

根据本发明的实施例，所述第二核酸单链具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

AGATGTACAGATAAGCGTCTG(SEQ ID NO:2)。

根据本发明的实施例，所述第三核酸单链具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。

GCTCTCACATTATACGAACACGTCAACTACGTCGAGCTGCTCGTACTCTAGTGTAGAATGTACGCAGACGCTTATCTGTACATCT(SEQ ID NO:3)。

根据本发明的实施例，所述荧光定量PCR反应中，第一引物具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，第二引物具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。

GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC(SEQ ID NO:4)。

GCTCTCACATTATACGAACACGTC(SEQ ID NO:5)。

根据本发明的实施例，所述荧光定量PCR反应中，荧光探针具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。

CGTCGAGCTGCTCGTACTCTAGTGTAGA(SEQ ID NO:6)。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种T4 RNA连接酶活性的检测试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括以上实施方式所述的第一RNA单链、第二核酸单链、第三核酸单链。

根据本发明的实施例，还包括以上实施方式所述的第一引物，第二引物和任选地荧光探针。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1是根据本发明实施例的检测方法中的连接反应示意图；

图2是根据本发明实施例的检测方法中的逆转录反应示意图；

图3是根据本发明实施例的检测方法中的荧光定量PCR反应示意图；

图4是根据本发明实施例1的不同T4 RNA Ligase的酶量与CT值的对应曲线图；以及

图5是根据本发明对比例1的不同T4 RNA Ligase的酶量与CT值的对应曲线图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

本发明提出了一种T4 RNA连接酶活性的检测方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将第一RNA单链与第二核酸单链在待测T4 RNA连接酶的作用下发生连接反应，以便获得第一单链模板，所述第二核酸单链的5’端具有磷酸化修饰，所述第二核酸单链的3’端具有封闭基团；以所述第一单链模板为模板，使第三核酸单链在逆转录酶的作用下沿着5’到3’方向进行延伸，以便获得第二单链模板，所述第三核酸单链为单链DNA，所述第三核酸单链的至少一部分与所述第二核酸单链完全互补；以所述第二单链模板为模板，进行荧光定量PCR反应，以便获得荧光反应的CT值；基于预先设置的酶浓度与CT值的对应关系，确定待测T4 RNA连接酶的活性。

根据本发明的实施例，上述检测方法的连接反应中，参考图1，以人工合成的第二核酸单链(以单链DNA为例，图中标记为DNA-1#)、第一RNA单链(图中标记为RNA)为底物，并在第二核酸单链的5’端进行磷酸化修饰，3’端进行氨基化修饰，在反应体系中加入ATP和梯度稀释的T4 RNA Ligase，反应后的DNA-1#的5’末端与RNA的3’端羟基连接形成一条杂合模板即第一单链模板，该第一单链模板作为下一步逆转录的模板。参考图2，在逆转录体系中，连接后的RNA+DNA-1#模板(即第一单链模板)中的DNA序列完全与第三核酸单链(图中标记为DNA-2#)3’端片段互补配对(类似引物)，在逆转录酶的作用下，生成与RNA互补的DNA序列，最终生成一条完整的可用于荧光定量PCR的DNA模板即第二单链模板。参考图3，荧光定量PCR反应中，例如可采用RnaseH降解杂合链中的RNA，同时对逆转录过程所获得的第二单链模板扩增DNA双链产物，标定出酶活，图中上游引物为第一引物，下游引物为第二引物。

根据本发明实施例的上述检测方法，相比于现有技术，无放射性污染、对环境的要求低、操作步骤简单快速、试剂成本低，而灵敏度更高，且该方法建立了T4 RNA Ligase的活性和CT值的定量关系，通过测定CT值，来反应T4 RNA Ligase的活性，克服了传统方法无法准确定量的缺陷，测量结果更准确。

根据本发明的实施例，参考图2，所述第三核酸单链包括5’端片段和3’端片段，所述第三核酸单链的3’端片段与所述‘第二核酸单链完全互补，第三核酸单链的5’端片段的长度至少为1bp。需要说明的是，本申请所述的第三核酸单链的3’端片段是指靠近第三核酸单链3’端的核酸序列段，本申请所述的第三核酸单链的5’端片段是指靠近第三核酸单链5’端的核酸序列段，第三核酸单链从5‘端到3’端，依次为5’端片段和3’端片段，5’端片段和3’端片段共同构成了第三核酸单链。发明人发现，当所述第三核酸单链的3’端片段与所述‘第二核酸单链完全互补，第三核酸单链的5’端片段的长度至少为1bp，即当第三核酸单链与‘第二核酸单链存在不互补的突出区段时，在该突出区段(参考图2，此时互补区段可看作第三核酸单链的3’端片段，突出区段可看作第三核酸单链的5’端片段)上设计引物，可进一步提高检测的准确性。同时发明人还意外地发现，突出片段还有利于降低荧光定量PCR体系的背景信号，且有利于获得更好的扩增曲线，同时对于不同酶活单位的T4 RNA Ligase有更好的区分度。

根据本发明的实施例，逆转录反应后，进一步包括利用RNA酶(例如RnaseH、RnaseA等至少一种)对逆转录反应产物进行消化处理，以便获得所述第二单链模板。进而将第一单链模板消化掉，获得第二单链模板，便于后续荧光定量正向引物和结合，进一步提高酶活测定的准确度，其中RNA酶处理可以在荧光定量PCR反应前也可以在反应中。

根据本发明的实施例，所述荧光定量PCR反应中，设置有第一引物和第二引物；第一引物与第二单链模板上靠近3’端的片段互补，第二引物与第二单链模板上靠近5’端的片段相同。优选地，第一引物不与第三核酸单链互补。需要说明的是，第一引物和第二引物为DNA序列。在荧光定量PCR反应中，如果起始连接反应中，第一RNA单链与第二核酸单链连接成功，则可逆转录形成第二单链模板，第一引物则可与第二单链模板的3’端互补配对，延伸出互补链，扩增出双链DNA产物；而如果起始连接反应中，第一RNA单链与第二核酸单链没有连接成功，则第三核酸单链无法逆转录出第二单链模板，第一引物无法与第三核酸单链互补配对，不能扩增出双链DNA产物。因此，可通过最终扩增出的双链DNA产物的量，反映起始连接反应的效率，也就建立了双链DNA产物的量与T4 RNA连接酶酶活之间的关系，而双链DNA产物的量可通过荧光PCR反应的CT值体现，进而可通过荧光PCR反应中的CT值直观地反映T4 RNA连接酶酶活。进一步优选地，第二引物与第三核酸单链靠近5’端的片段相同，将引物设计在第三核酸单链的突出区段上，可进一步提高检测准确性。

需要说明的是，本申请所述的“第一RNA单链”、“第二核酸单链”以及“第三核酸单链”不受具体序列限制。

根据本发明的具体实施例，所述第一RNA单链具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

rGrUrUrCrArGrArGrUrUrCrUrArCrArGrUrCrCrGrArCrGrArUrC(SEQ ID NO:1)。

根据本发明的具体实施例，所述第二核酸单链具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

AGATGTACAGATAAGCGTCTG(SEQ ID NO:2)。

根据本发明的具体实施例，所述第三核酸单链具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。

根据本发明的具体实施例，所述荧光定量PCR反应中，第一引物具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，第二引物具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC(SEQ ID NO:4)。

GCTCTCACATTATACGAACACGTC(SEQ ID NO:5)。

CGTCGAGCTGCTCGTACTCTAGTGTAGA(SEQ ID NO:6)。

根据本发明的实施例，在荧光定量PCR体系中加入第一引物、第二引物以及探针，通过荧光定量PCR形成扩增曲线，再通过CT值与酶量形成的正相关关系，用对照酶(检测时会使用一个已知酶活性的对照酶，并将其进行梯度稀释成不同的酶浓度，可用不同酶浓度表示不同酶活)不同酶活的扩增曲线与待检酶活的CT值进行比较，预先设置的酶活与CT值的对应关系，当待测酶稀释到与对照酶的CT值对应上时，则判断待检酶样品与对照酶具有相同的酶活单位，由此标定出未知T4 RNA Ligase的连接酶活性。

根据本发明的实施例，在荧光定量PCR体系中，产物dsDNA的相对量是利用荧光探针(5’端含有荧光染料修饰，3’端含有荧光淬灭基团)，通过荧光法测得的，并且dsDNA的相对量是以荧光强度表示的。

本发明还提出一种T4 RNA连接酶活性的检测试剂盒，包括以上实施方式所述的第一RNA单链、第二核酸单链、第三核酸单链。

下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。

实施例1荧光法测定T4 RNA Ligase活性方法的建立

本实施例的T4 RNA ligase活性检测方法通过以一段RNA和一段DNA作为底物，在不同酶活单位的T4 RNA ligase条件下，RNA和DNA连接成不同量的RNA+DNA产物，最终通过另一条DNA链的作用下，与RNA+DNA产物的DNA区域进行互补配对，并在逆转录酶的作用下，将RNA区域逆转录成DNA，最终检测逆转录后全长的DNA链，通过CT值来判断T4 RNA ligase的酶活单位。

1.1RNA+DNA-1#模板的制备

通过宝生物公司合成了ssRNA和ssDNA-1#，其中，ssRNA和ssDNA-1#的序列如SEQID NO:1和SEQ ID NO:2所示，其中，ssDNA-1#模板的5‘端具有磷酸化，3’端连接有氨基用于封闭。

ssRNA：

5′-rGrUrUrCrArGrArGrUrUrCrUrArCrArGrUrCrCrGrArCrGrArUrC-3′-OH(SEQ IDNO:1)。

ssDNA-1#：

P-5’-AGATGTACAGATAAGCGTCTG-3’-NH2(SEQ ID NO:2)。

将ssRNA和ssDNA-1#在下表所示的反应体系中进行连接反应，连接反应条件为25℃1h，65℃15min，12℃维持，以使得ssRNA的3’端与ssDNA-1#的5’端相连，获得RNA+DNA-1#模板。

DNA、RNA连接反应体系如表1。

表1：

组分	浓度	体积(ul)
			T4 RNA Ligase buffer	10×	1
ATP	10mM	1
			ssRNA	1μM	1
ssDNA-1#	1μM	1
			RNasin	40U/μl	0.25
PEG-8000	50％	2
			T4 RNA Ligase	10U/μl	2
DEPC水	—
			终体积	10μl

1.2逆转录通过宝生物公司合成ssDNA-2#：

5’-GCTCTCACATTATACGAACACGTCAACTACGTCGAGCTGCTCGTACTCTAGTGTAGAATGTACGCAGACGCTTATCTGTACATCT-3’(SEQ ID NO:3)。

在连接反应后体系(含RNA+DNA-1#模板)中加入ssDNA-2#进行逆转录反应，逆转录体系如下表所示，逆转录反应条件为50℃20min，70℃15min，12℃维持。

逆转录体系如表2所示。

表2：

组分	浓度	体积(μl)
			RT buffer	5×	10
dNTP	25mM	0.2
			ssDNA-2#	1μM	1
reverse transcriptase	200U/μl	0.4
			RNasin	40U/μl	0.25
连接反应后体系	—	10
			DEPC水	—
终体积	50μl

1.3荧光定量反应：

取逆转录后产物进行荧光定量反应。

逆转录后是部分为RNA+DNA杂合链的不完全双链DNA，后续扩增只需要延伸后全长的ssDNA-2#，因此，需要采用RNase H和RNase A对逆转录后产物进行消化处理。

通过宝生物公司合成以下序列：

正向引物(第一引物)为：5′-GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC-3′；

反向引物为(第二引物)：5’-GCTCTCACATTATACGAACACGTC-3’；

探针为：FAM-5’-CGTCGAGCTGCTCGTACTCTAGTGTAGA-3’-BHQ1

荧光定量体系如表3所示。

表3：

组分	浓度	体积(μl)
			Hotstart taq Buffer	5×	10
dNTP	25mM	0.4
			正向引物	10μM	1
反向引物	10μM	1
			探针	20μM	0.2
Hotstart Taq	5U/μl	0.5
			RNase H	5U/μl	0.5
RNase A	100ng/μl	0.5
			Solution I	10×	5
逆转录产物	—	5
			ddH<sub>2</sub>O	—
终体积	50μl

荧光PCR条件如表4所示。

表4：

对比例1

第三核酸单链的5’端是否存在不与第二核酸单链互补的突出片段对T4 RNALigase检测效果的比较。

1.1RNA+DNA-3#模板的制备

发明人通过宝生物合成了ssRNA和ssDNA-3#，其中，ssRNA和ssDNA-3#的序列如SEQID NO:1和SEQ ID NO:7所示，其中，ssDNA-3#模板的5‘端具有磷酸化，3’端连接有氨基。

ssRNA：

ssDNA-3#：

P-5’-AGATGTACAGATAAGCGTCTGCGTACATTCTACACTAGAGTACGAGCAGCTCGACGTAGTTGACGTGTTCGTATAATGTGAGAGC-3’-NH2(SEQ ID NO:7)。

将ssRNA和ssDNA-3#在下表所示的反应体系中进行连接反应，连接反应条件为25℃1h，65℃15min，12℃维持，以使得ssRNA的3’端与ssDNA-3#的5’端相连，获得RNA+DNA-3#模板。

DNA、RNA连接反应体系如表5所示。

表5：

1.2逆转录

通过宝生物公司合成ssDNA-2#：

5-GCTCTCACATTATACGAACACGTCAACTACGTCGAGCTGCTCGTACTCTAGTGTAGAATGTACGCAGACGCTTATCTGTACATCT-3’(SEQ ID NO:3)。

将连接反应后体系(含RNA+DNA-3#模板)加入ssDNA-2#进行逆转录反应，逆转录体系如下表所示，逆转录反应条件为50℃20min，70℃15min，12℃维持。

逆转录体系如表6所示。

表6：

1.3荧光定量反应

取逆转录后产物进行荧光定量反应。

通过宝生物公司合成以下序列：

正向引物(第一引物)为：5′-GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC-3′；

反向引物(第二引物)：5’-GCTCTCACATTATACGAACACGTC-3’；

探针为：FAM-5’-CGTCGAGCTGCTCGTACTCTAGTGTAGA-3’-BHQ1

荧光定量体系如表7所示。

表7：

荧光PCR条件如表8所示。

表8：

试验例、T4 RNA Ligase样品梯度酶活扩增曲线

样品处理：

取对照T4 RNA Ligase 5μl加入45μl的ddH₂O中，进行连续3个10倍梯度稀释，形成3个标准品梯度；

连接反应、逆转录反应和荧光定量PCR分别按照实施例1或对比例1操作。

每个稀释度设置2个复孔。

实施例1的检测结果如图4所示，对比例1的检测结果如图5所示。

CT值结果如表9所示。

表9：

T4 RNA Ligase的酶量(酶的稀释倍数，此处用酶的浓度-稀释倍数反映酶活)与CT值成相关关系，且CT值呈现酶浓度依赖性，随着酶量浓度降低CT值变大。当使用与ssDNA-2#完全互补配对ssDNA-3#时，即第三核酸单链的5’端不存在不与第二核酸单链互补的突出片段，不同酶活单位的T4 RNA Ligase荧光值定量扩增曲线ΔCT值差异不如含突出区段的片段明显，且不含突出片段的对比例1扩增曲线基线明显“上漂”，相较于对比例1，实施例1更有利于获得“S”型的曲线以及更好的区分度。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims

1.一种T4 RNA连接酶活性的检测方法，其特征在于，包括：

将第一RNA单链与第二核酸单链在待测T4 RNA连接酶的作用下发生连接反应，以便获得第一单链模板，所述第二核酸单链的5’端具有磷酸化修饰，所述第二核酸单链的3’端具有封闭基团；

以所述第一单链模板为模板，使第三核酸单链在逆转录酶的作用下沿着5’到3’方向进行延伸，以便获得第二单链模板，所述第三核酸单链为单链DNA，所述第三核酸单链的至少一部分与所述第二核酸单链完全互补；

以所述第二单链模板为模板，进行荧光定量PCR反应，以便获得荧光反应的CT值；

基于预先设置的酶浓度与CT值的对应关系，确定待测T4 RNA连接酶的活性。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第三核酸单链包括5’端片段和3’端片段，所述第三核酸单链的3’端片段与所述第二核酸单链完全互补，第三核酸单链的5’端片段的长度至少为1bp；

优选地，所述第三核酸单链的5’端片段的长度为50～100bp。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二核酸单链为RNA或DNA单链。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述封闭基团为氨基或双脱氧基团。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR反应中，设置有第一引物和第二引物；第一引物与所述第二单链模板靠近3’端的片段互补，第二引物与所述第二单链模板靠近5’端的片段相同；

优选地，所述第一引物不与所述第三核酸单链互补；

优选地，所述第二引物与所述第三核酸单链靠近5’端的片段相同；

任选地，进一步设置有荧光探针。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，逆转录反应后，进一步包括利用RNA酶对逆转录反应产物进行消化处理，以便获得所述第二单链模板。

7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述第一RNA单链具有SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列；

任选地，所述第二核酸单链具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

优选地，所述第三核酸单链具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR反应中，第一引物具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，第二引物具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，

任选地，荧光探针具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。

9.一种T4 RNA连接酶活性的检测试剂盒，其特征在于，包括第一RNA单链、第二核酸单链、第三核酸单链，所述第一RNA单链、第二核酸单链、第三核酸单链如权利要求1-8任一项所限定的。

10.根据权利要求9所述的检测试剂盒，其特征在于，进一步包括第一引物，第二引物和任选地荧光探针，所述第一引物，第二引物和任选地荧光探针如权利要求1-8任一项所限定的。