ES2205998B1 - Procedimiento para la deteccion del virus del amarilleo de las venas del pepino (cvyv). - Google Patents
Procedimiento para la deteccion del virus del amarilleo de las venas del pepino (cvyv).Info
- Publication number
- ES2205998B1 ES2205998B1 ES200102784A ES200102784A ES2205998B1 ES 2205998 B1 ES2205998 B1 ES 2205998B1 ES 200102784 A ES200102784 A ES 200102784A ES 200102784 A ES200102784 A ES 200102784A ES 2205998 B1 ES2205998 B1 ES 2205998B1
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- cvyv
- detection
- virus
- cucumber
- cucurbits
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Procedimiento para la detección del virus del amarillo de las venas del pepino (CVYV). El objeto de la presente invención es un procedimiento específico, sensible y rápido para la detección del Virus del amarilleo de las venas del pepino (CVYV) en plantas. El procedimiento comprende la preparación de una construcción genética que contiene un fragmento del genoma de CVYV, la preparación de una sonda de ácidos nucleicos a partir de dicha construcción genética y la hibridación de dicha sonda con extractos de ácidos nucleicos o con improntas de secciones de tejidos de las plantas a las que se aplica el procedimiento.
Description
Procedimiento para la detección del virus del
amarilleo de las venas del pepino (CVYV).
Biotecnología. Técnicas de hibridación molecular
para detección vírica.
El objeto de la presente invención es un
procedimiento específico, sensible y rápido para la detección del
Virus del amarilleo de las venas del pepino (CVYV) en
plantas. Además, la presente invención trata sobre la construcción
genética utilizada en dicho procedimiento.
CVYV es causante de epidemias graves en cultivos
de pepino y de otras cucurbitáceas en la cuenca mediterránea
oriental, originando pérdidas económicas de gran importancia. CVYV
tiene partículas con forma de varilla de 740-800 nm
de longitud y 15-18 nm de diámetro (Sela y col.,
1980). El virus se transmite de manera semi- persistente por la
mosca blanca Bemisia tabaci y también se puede transmitir
por inoculación mecánica. La gama de huéspedes de CVYV está
restringida a la familia de las cucurbitáceas (Mansour y
Al-Musa, 1993). Dos aislados del virus procedentes
de Israel (CVYV-Is) y de Jordania
(CVYV-Jor) han sido caracterizados recientemente
(Lecoq y col., 2000). Un análisis citológico de huéspedes infectados
por estos dos aislados ha mostrado la aparición de formaciones
típicas de la infección por virus de la familia Potiviridae
y, por lo tanto, se ha propuesto que CVYV pertenezca a dicha
familia. La caracterización de una secuencia de nucleótidos
correspondiente a un fragmento del genoma de
CVYV-Is ha confirmado esta idea (Lecoq y col. 2000).
Así, CVYV parece ser un miembro del género Ipomovirus,
dentro de la familia Potiviridae, y como otros miembros de
esta familia debe tener un genoma de RNA monocatenario y de
sentido mensajero. Sin embargo, la secuencia completa del genoma de
CVYV es todavía desconocida.
CVYV ha sido observado por primera vez en España
en el otoño de 2000 en cultivos protegidos de pepino de Almería
(Cuadrado y col., 2001). Desde este momento el virus se ha
extendido con gran rapidez en esta zona, primero en los cultivos de
pepino, y luego a cultivos de otras cucurbitáceas. Solamente en
esta zona las pérdidas económicas originadas por CVYV hasta la
fecha han sido muy grandes y, por lo tanto, se hace necesario el
diseño y uso de estrategias de control del virus que sean eficaces.
El control del virus mediante el control de su vector es una
estrategia que ya se ha revelado insuficiente en otros casos de
virus transmitidos por mosca blanca, de tal manera que es
imprescindible el uso de estrategias alternativas. Entre éstas se
cuenta con el manejo de determinadas prácticas culturales como el
uso de material de propagación libre de virus y el uso de
cultivares genéticamente resistentes al virus (Matthews, 1991). En
cualquier caso, para la implementación de estas estrategias de
control es imprescindible disponer de métodos de detección del
virus que sean específicos, sensibles y rápidos. La existencia de
métodos de detección con estas características puede facilitar
enormemente procesos como la certificación sanitaria de material
vegetal o el análisis de susceptibilidad al virus de entradas de
germoplasma de cucurbitaceas candidatas a ser portadoras de
resistencia genética a CVYV. Así, el objetivo de esta invención es
proporcionar un método de detección de CVYV que sea específico,
sensible y rápido. Existen numerosos métodos de detección de virus
de plantas. Entre los de uso más extendido están los basados en
técnicas serológicas, en particular los basados en la metodología
ELISA (Matthews, 1991). Para el funcionamiento de este tipo de
métodos es imprescindible disponer de anticuerpos específicos
contra el virus. En el caso de CVYV todavía no se han podido
obtener estos anticuerpos, probablemente por la dificultad que
entraña la purificación de partículas virales. Una alternativa a
las técnicas serológicas consiste en el uso de técnicas basadas en
la hibridación molecular. Para la detección de virus por
hibridación molecular es imprescindible disponer de construcciones
genéticas que contengan secuencias de nucleótidos homólogas al
genoma viral, ya que a partir de estas construcciones se sintetizan
las sondas que se utilizan para señalar la presencia o ausencia de
virus en muestras de plantas. La detección de virus por
hibridación molecular ha sido ampliamente utilizada, en particular
la hibridación sobre extractos de ácidos nucleicos totales de
plantas aplicados sobre membranas de nitrocelulosa o nylon
(Matthews, 1991). Sin embargo, la preparación de los extractos de
ácidos nucleicos de plantas exige cierta labor, y por eso
recientemente se han puesto a punto técnicas de hibridación
molecular sobre improntas de secciones de tejidos de plantas cuya
obtención sea sencilla (ver para un ejemplo Narváez y col., 2000).
Así pues, el objetivo de la presente invención consiste en
proporcionar un método de detección de CVYV basado en la hibridación
molecular. Este método debe ser funcional sobre extractos de ácidos
nucleicos de plantas y sobre improntas de secciones de tejidos de
plantas.
El objeto de la presente invención es un
procedimiento para la detección del Virus del amarilleo de las
venas del pepino (CVYV) en cucurbitáceas mediante técnicas de
hibridación molecular. El procedimiento se aplica a la detección de
CVYV, entre otras plantas, en pepino, melón y calabacín y comprende
los siguientes pasos:
- -
- preparación de una construcción genética que contiene un fragmento del genoma de CVYV.
- -
- preparación de una sonda de ácidos nucleicos a partir del plásmido obtenido en el paso anterior.
- -
- hibridación de la sonda con extractos de ácidos nucleicos o con improntas de secciones de tejidos de las plantas a las que se aplica el procedimiento.
Para la preparación de la construcción genética
que contiene un fragmento del genoma del CVYV se seleccionan dos
oligonucleótidos a partir de la secuencia de CVYV:
- -
- el oligonucleótido que se utiliza para la síntesis de la primera cadena del cDNA es el 5'-ACATTAGCGGCAAGTGTCTG-3' (MA163, SEQ ID NO 1) o cualquier oligonucleótido complementario en al menos el 95% de sus nucleótidos a la secuencia de CVYV-AILM (SEQ ID NO 3).
- -
- el oligonucleótido utilizado en la construcción de la segunda cadena del cDNA es el 5'-GTCAGCCGTCAACTGTGGTGG-3' (MA162, SEQ ID NO 2) o cualquier oligonucleótido incluido en la secuencia de nucleótidos de CVYV- AILM (SEQ ID NO 3) y que tenga con ésta una similitud de al menos el 95%.
La secuencia de nucleótidos así obtenida y
descrita por la presente invención y perteneciente al aislado viral
CVYV-AILM (SEQ ID NO 3) forma parte de la presente
invención. La cadena doble de cDNA obtenida mediante el uso de los
oligonucleótidos se somete a ligación y posterior inserción en un
vector de expresión, un plásmido entre otros, a partir de los
cuales se pueden sintetizar las sondas que se utilizarán
posteriormente en la identificación de la presencia o no de virus en
muestras de plantas.
En la presente invención se describe la
construcción del plásmido pLMCVYV, que contiene la secuencia SEQ ID
NO 3, y forma parte de la presente invención.
Para el desarrollo del método de detección de
CVYV en la presente invención se obtuvo una sonda de RNA
complementario (cRNA) al RNA viral por su mejor rendimiento con
respecto a otros tipos de sondas (Matthews, 1991) a partir del
plásmido pLMCVYV.
Los resultados, descritos en la presente
invención, de una detección de CVYV mediante hibridación con la
sonda anteriormente mencionada (cRNA) mostraron que aparecía señal
solamente en aquellas muestras procedentes de plantas que estaban
infectadas con CVYV, mientras que en las plantas sanas y en las
plantas infectadas por virus distintos de CVYV no apareció señal
(Fig. 2). Es decir, el método de detección es específico para
CVYV. Además, los resultados obtenidos en la presente invención
indican que la sensibilidad de este método de detección de CVYV es
de 6 pg (Fig. 3).
Por otro lado, este procedimiento de detección
del CVYV mediante hibridación en plantas cucurbitáceas se realizó,
en la presente invención, sobre extractos de ácidos nucleicos
totales de plantas y sobre improntas de secciones de tejidos de
plantas -en este último caso la obtención es mucho más sencilla–
observándose que dicha detección es específica de CVYV.
Figura
1
Bajo la representación diagramática del genoma de
potyvirus aparece un segmento gris (LMAM48) que indica el tamaño
(aproximadamente 1,5 kbp) y la situación en el genoma
(comprendiendo parte de los genes NIb y CP) del fragmento
clonado.
Figura
2
En la parte superior de la figura aparece
indicado el origen de las muestras que fueron incluidas en la
membrana en cuanto al huésped y al virus con el que éste había
sido inoculado (o no, para los controles sanos). A la derecha de la
figura aparece indicado el tipo de material que fue incluido en la
membrana, bien improntas de tejidos o bien extractos de ácidos
nucleicos.
Figura
3
En la parte superior de la figura aparece
indicada la cantidad de RNA viral transcrito (RNAt) que fue
incluida en cada muestra (o no, para los controles negativos). En
la parte derecha de figura aparece indicado el diluyente del RNAt
que fue usado en cada tratamiento.
El desarrollo de la invención ha implicado los
pasos que se enumeran a continuación. Para las técnicas de
Biología Molecular se ha seguido esencialmente a Sambrook y col.
(1989).
Durante el otoño de 2000 se muestrearon cultivos
protegidos de pepino en la provincia de Almería. En un cierto
número de invernaderos se detectaron plantas con los síntomas
característicos de infección por CVYV: amarilleo intenso de venas y
clorosis en hojas jóvenes y moteados cloróticos en frutos. Con
estas muestras se inocularon mecánicamente (Mathews, 1991) 3
plántulas de cada una de las siguientes especies: melón, pepino y
calabacín. Estas plantas se mantuvieron en cámara de cultivo con
ciclo de luz día/noche de 16/8 horas y temperaturas de 24°C día y
19°C noche. A los 10-15 días
post-inoculación se observó la reproducción de los
síntomas de clorosis y amarilleo intenso de venas de hojas en 2
plantas de melón, ninguna de pepino y 3 de calabacín. Sin embargo,
se pudo comprobar la presencia de CVYV en las dos plantas de melón
sintomáticas y también en todas las demás plantas (sintomáticas o
no) mediante un ensayo de RT-PCR (Cuadrado y col.
2000). A partir de una de las plantas de melón infectada por CVYV
se realizó una transmisión de virus utilizando mosca blanca
(López-Sesé y Gómez-Guillamón,
2000). El objetivo de este ensayo era conseguir un aislado de CVYV
que no contuviera otros virus distintos de CVYV que fueran de
transmisión mecánica. Esta transmisión se llevó a cabo utilizando
20, 10 y 5 moscas por planta. En el tratamiento de inoculación con
5 moscas se infectó nada más que una de las 5 plantas inoculadas.
Ello sugirió que la multiplicidad de la infección en este
tratamiento fue baja, y por tanto se ha tomado esta planta como
fuente de inóculo clonal de CVYV (Matthews, 1991). Al aislado
viral procedente de esta planta se le ha denominado
CVYV-A1LM.
Para el clonaje molecular de un DNA
complementario (cDNA) a un fragmento del genoma del virus, se
diseñaron oligonucleótidos cebadores a partir de la secuencia de
CVYV-Is publicada por Lecoq y col. (2000) que se
usaron en un experimento de RT- PCR. El oligonucleótido para la
síntesis de la primera cadena de cDNA fue 5' ACATTAGCGGCAAGTGTCTG
3' (MA163, SEQ ID NO 1), complementario a los nucleótidos 1531 a
1550 en la secuencia de Lecoq y col. (2000). Esta secuencia se
encuentra en el tercio 3' terminal del cistrón que codifica la
proteína de la cápsida (CP) del virus (Fig. 1). El oligonucleótido
utilizado en la construcción de la segunda cadena del cDNA fue
5'GTCAGCCGTCAACTGTGGTGG3' (MA162, SEQ ID NO 2), idéntico a los
nucleótidos 14 a 34 en la secuencia de Lecoq y col. (2000). Esta
segunda secuencia se encuentra en el cistrón que codifica la
proteína NIb del virus (Fig. 1). Como molde para la síntesis del
cDNA se utilizó un extracto de RNA de plantas infectadas por
CVYV-A1LM preparado utilizando el reactivo
TRI-reagent (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO,
USA) siguiendo las instrucciones del fabricante. La síntesis de la
primera cadena del cDNA se realizó utilizando 10 \mul de RNA de
plantas infectadas a una concentración de 1 \mug/\mul. A este
RNA se añadió 1 \mul de hidróxido de metil mercurio 0,1 M y se
mantuvo a temperatura ambiente 10 min. A continuación se añadieron
los reactivos siguientes: 1 \mul de
\beta-mercaptoetanol 1,4 M, 5 \mul del tampón
de transcriptasa reversa concentrado 5 veces (Boehringer Mannheim,
Mannheim, Alemania), 1 \mul de una mezcla de dNTPs 10mM, 50 Uds
de inhibidor de RNasas (Amersham Pharmacia Biotech, UK), 1 \mul
de DTT 100 mM, 1 \mul de transcriptasa reversa (Expand RT,
Boehringer) y 2 \mul del oligonucleótido MA163 (SEQ ID NO 1) a
una concentración de 100 ng/\mul, todo ello en un volumen final de
25 \mul. Esta mezcla se mantuvo a 37°C durante 1 h. A
continuación se procedió a la síntesis de la segunda cadena del
cDNA. A 1 \mul de la mezcla anterior se añadieron 5 \mul de
tampón de polimerasa Taq concentrado 10 veces (Bioline, Londres,
UK), 2 \mul de Cl_{2}Mg 25 mM, 1 \mul de dNTPs 10 mM, 0,5
\mul de los oligonucleótidos MA162 (SEQ ID NO 2) y MA163 (SEQ ID
NO 1) a una concentración de 100 ng/\mul y 1 \mul de polimerasa
Taq (BioTaq; Bioline), todo ello en un volumen final de 50 \mul.
Esta mezcla se sometió a los siguientes ciclos de PCR: un ciclo de
desnaturalización a 94°C durante 5 min, treinta ciclos de
desnaturalización a 94°C durante 30 s seguida de la hibridación de
los oligonucleótidos a 52°C durante 30 s seguida de la
polimerización del cDNA a 72°C durante 1 min, y un ciclo final de
polimerización a 72°C durante 7 min. El resultado del PCR se
comprobó por electroforesis de una alícuota en un gel de agarosa
teñido con bromuro de etidio. Tras transiluminación con luz
ultravioleta, en este gel se observó una banda del tamaño esperado
para el cDNA de CVYV (1,5 kpb; Fig. 1). Este cDNA se purificó por
extracción de un gel preparativo de agarosa que se había sometido a
electroforesis. La extracción se realizó utilizando una columna
Ultrafree-DA (Millipore, Bedford, MA, USA). El
cDNA así preparado se sometió a una reacción estándar de ligación
utilizando el kit pGEM-T vector System II (Promega,
Madison, WI, USA). Una alícuota de la reacción de ligación se
utilizó para transformar células de E. coli DH5\alpha. Los
transformantes se analizaron para determinar la presencia de un
inserto de 1,5 kpb y se seleccionaron dos colonias transformantes
con un inserto de este tamaño. Se preparó DNA plasmídico a partir
de ambas colonias que se usó para secuenciar el inserto de 1,5 kpb
en su totalidad para las dos colonias de bacterias transformantes.
Ambas secuencias resultaron idénticas entre sí (SEQ ID NO 3) y muy
similares (95% homología de secuencia de nucleótidos) a la
secuencia publicada de CVYV-Is (Lecoq y col.,
2000). El plásmido que contiene este inserto se ha denominado
pLMCVYV y forma parte de la presente invención.
La secuencia de nucleótidos obtenida para
CVYV-AlLM se puede traducir a aminoácidos
ininterrumpidamente en el marco de lectura +3. Un análisis
comparativo con secuencias de otros potyvirus ha revelado que esta
secuencia (SEQ ID NO 3, LMAM48) comprende una parte
3'-terminal del cistrón que codifica NIb del virus,
y una parte 5'-terminal del cistrón que codifica la
CP del virus (Fig. 1). En la región del cistrón de NIb existen 26
substituciones nucleotídicas con respecto a la secuencia de
CVYV-Is. Estas substituciones nucleotídicas resultan
en 2 substituciones de aminoácidos en la correspondiente proteína.
Asimismo, en la región del cistrón de la CP existen 47
substituciones nucleotídicas con respecto a la secuencia de
CVYV-Is que resultan en 9 substituciones
aminoacídicas. La secuencia de nucleótidos así obtenida y descrita
por la presente invención y perteneciente al aislado viral
CVYV-AILM (SEQ ID NO 3) forma parte de la presente
invención.
Para el desarrollo del método de detección de
CVYV se decidió preparar sondas de RNA complementario (cRNA) al RNA
viral por su mejor rendimiento con respecto a otros tipos de sondas
(Matthews, 1991). Para la preparación de estas sondas se procedió
como se describe a continuación. El plásmido pLMCVYV se linearizó
utilizando el enzima de restricción SphI. Para la reacción
de transcripción in vitro se utilizaron 10 \mul de este
DNA linearizado a una concentración de 100 ng/\mul a los que se
añadieron 20 \mul de tampón de transcripción concentrado 5 veces
(Amersham Pharmacia Biotech), 10 \mul de DTT 100 mM, 20 pi de una
mezcla de rNTPs 2,5 mM que contiene DIG-11- UTP
(Boehringer) en una concentración 1 mM, 50 Uds de inhibidor de
RNasas (Amersham Pharmacia Biotech) y 50 Uds de la transcriptasa
SP6 (Amersham Pharmacia Biotech), todo ello en un volumen final de
100 \mul. Esta mezcla se mantuvo a 37°C durante 1 h 30 min.
Transcurrido este tiempo se añadieron 10 Uds de DNasa libre de
RNasas (Boehringer) y se continuó la incubación durante otros 30
min. A continuación se añadieron a la mezcla 4 \mul de EDTA 0,5
M, 5 \mul de ClLi 8 M y 300 \mul de etanol puro, se mantuvo a
-20°C durante 3 h y el cRNA precipitado se concentró por
centrifugación. El precipitado seco se resuspendió en 50 \mul de
agua a los que se añadieron otros 50 \mul de tampón carbonato
de pH = 10,2 para proceder a la hidrólisis controlada del cRNA.
Esta mezcla se mantuvo a 60°C durante 56 minutos y, a continuación
se añadieron 5 \mul de ácido acético al 10%, 10 \mul de
acetato sódico 3 M y 250 \mul de etanol puro. Se mantuvo a -20°C
durante 3 h y el cRNA precipitado se concentró mediante
centrifugación. El precipitado seco se resuspendió en 100 \mul de
formamida al 50%.
Para la preparación de extractos de ácidos
nucleicos de plantas se procedió como sigue. Una pieza de lámina
foliar de 0,2 g se introdujo en un tubo eppendorf, se congeló por
inmersión en nitrógeno líquido y se molió con la ayuda de un buril.
Al tejido finamente molido se añadieron 400 \mul de tampón de
extracción (2% SDS, 100 mM Tris-HCl pH = 8,0, 10
mM EDTA) y el tubo se agitó fuertemente durante 1 min. Se añadieron
400 \mul de fenol (saturado en agua)/cloroformo, se volvió a
agitar fuertemente y se separaron fases mediante centrifugación.
La fase acuosa se pasó a un tubo eppendorf limpio y se ajustó a 2
M de ClLi. La mezcla se mantuvo a 4°C durante 16 h y el precipitado
se recogió por centrifugación. Este precipitado (ácidos nucleicos
totales enriquecidos en monocatenarios) se lavó con etanol al 75
%, se secó y se resuspendió en 100 \mul de agua. Para la
detección de CVYV en los extractos de ácidos nucleicos de plantas se
procedió como se describe a continuación. Un \mul del extracto
se aplicó sobre una membrana de nylon cargada positivamente
(Boehringer). Los ácidos nucleicos aplicados sobre la membrana se
fijaron mediante exposición a luz ultravioleta en un aparato
diseñado para tal propósito (Ultraviolet Crosslinker; Amersham Life
Sciences, UK). A continuación la membrana se sometió a un proceso
de prehibridación mediante incubación a 65°C en tampón de
prehibridación (5xSSC, 0,1% N-Laurilsarcosina, 50%
formamida, 0,02% SDS, 2% agente bloqueante[Boehringer]). Al
cabo de 2 h el tampón de prehibridación se retiró y se añadió el
tampón de hibridación (sonda preparada como se ha descrito
anteriormente diluida en tampón de prehibridación en la proporción
1:1000) en el que la membrana se incubó a 65°C. La relación entre
la superficie de la membrana y la cantidad de tampón de hibridación
o prehibridación fue de 0,1 ml por cm^{2}, con un mínimo de 10
ml por membrana. Al cabo de 16 h de hibridación, el tampón se
retiró y se guardó congelado a -20°C para ser utilizado en
experimentos posteriores. La membrana se sometió a un proceso de
lavado que consistió en una incubación de 15 min a temperatura
ambiente en 2xSSC y 0,1% SDS y dos incubaciones de 15 min a 65°C en
0,1xSSC y 0,1% SDS. Las tres incubaciones se realizaron con
agitación suave y con un volumen mínimo de tampón de lavado de 50
ml. La detección de la sonda hibridada al RNA viral presente en
los extractos de ácidos nucleicos se realizó por
quimioluminiscencia utilizando un kit de Boehringer y siguiendo las
instrucciones del fabricante.
Para la preparación de las improntas de secciones
de tejidos de plantas se procedió como sigue. Tallos, peciolos y
venas mayores de hojas de plantas se seccionaron con cuchilla.
Para evitar contaminaciones, cada sección se realizó con una
cuchilla estéril y distinta. Las secciones así preparadas se
aplicaron sobre una membrana de nylon cargada positivamente
(Boehringer) hasta que las gotas de savia exudadas se absorbieron.
Una vez realizadas estas aplicaciones, se mantuvo la membrana a
temperatura ambiente hasta que se secó. La fijación de ácidos
nucleicos a la membrana, prehibridación, hibridación, lavados y
detección de la sonda hibridada al RNA viral se llevaron a cabo en
este caso como se ha descrito en el apartado anterior.
La especificidad y la sensibilidad de este método
de detección de CVYV quedan ilustradas a continuación:
Para determinar la especificidad de este método
de detección se diseñó el siguiente experimento. Se inocularon con
el aislado CVYV-AlLM 3 plántulas de cada una de las
siguientes especies: melón, calabacín y pepino, así como 2 plantas
de cada una de las especies anteriores sólo con agua. Al cabo de 3
semanas, los síntomas de infección eran patentes en las plantas
inoculadas con virus mientras que no apareció ningún síntoma en
plantas inoculadas con agua. En este momento se realizaron
extracciones de ácidos nucleicos totales de estas plantas que se
aplicaron en membranas como se ha descrito más arriba. También se
incluyeron improntas de secciones de tejidos de estas plantas en
las membranas mencionadas, así como aplicaciones de extractos de
ácidos nucleicos e improntas de plantas infectadas con el Virus
del mosaico de la sandía-II, el Virus del
mosaico del pepino y el Virus del enanismo y amarilleo de las
cucurbitáceas. Estas membranas se procesaron siguiendo el
procedimiento objeto de la invención para la detección de CVYV.
Los resultados de este proceso mostraron que aparecía señal
solamente en aquellas muestras procedentes de plantas que estaban
infectadas con CVYV, mientras que en las plantas sanas y en las
plantas infectadas por virus distintos de CVYV no apareció señal
(Fig. 2). Es decir, el método de detección es específico para
CVYV.
Para determinar el umbral de sensibilidad de éste
método se llevó a cabo el experimento siguiente. Se preparó RNA
viral mediante transcripción in vitro a partir del plásmido
pLMCVYV. Para ello, el plásmido pLMCVYV se linearizó utilizando el
enzima de restricción PstI. Para la reacción de
transcripción in vitro se utilizaron 10 \mul de este DNA
linearizado a una concentración de 100 ng/\mul a los que se
añadieron 20 \mul de tampón de transcripción concentrado 5 veces
(Amersham Pharmacia Biotech), 10 \mul de DTT 100 mM, 20 \mul
de una mezcla de rNTPs 2,5 mM, 10 Uds de inhibidor de RNasas
(Amersham Pharmacia Biotech) y 50 Uds de la transcriptasa T7
(Promega), todo ello en un volumen final de 100 \mul. Esta
mezcla se mantuvo a 37°C durante 1 h 30 min. Transcurrido este
tiempo se añadieron 10 Uds de DNasa libre de RNasas (Boehringer) y
se continuó la incubación durante otros 30 min. A continuación se
añadieron a la mezcla 4 \mul de EDTA 0,5 M, 5 \mul de ClLi 8 M
y 300 \mul de etanol puro, se mantuvo a -20°C durante 3 h y el
RNA precipitado se concentró por centrifugación. La limpieza y la
concentración de este RNA se determinó por observación de geles de
agarosa teñidos con bromuro de etidio sobre los que se había
realizado la electroforesis de una alícuota del RNA. El RNA
cuantificado con precisión con respecto a estándares habituales
(Sambrook y col., 2001) se utilizó como sigue. A partir de una
solución concentrada a 0,6 \mug/\mul se hicieron diluciones en
agua y en un extracto de ácidos nucleicos de planta sana. El
factor de dilución fue 1:10. Un \mul de cada una de estas
diluciones se aplicó en una membrana, así como los
correspondientes diluyentes sin RNA viral. Esta membrana se
sometió al proceso de detección de CVYV descrito más arriba. Los
resultados de este experimento indicaron que la cantidad mínima de
RNA viral que se puede detectar con este método es de 6 pg (Fig
3).
Cuadrado, I.M., Janssen, D.,
Velasco, L., Ruiz, L. y Segundo E.
(2001). First report of Cucumber vein yellowing virus
in Spain. Plant Dis. 85:336.
Mansour A. y
Al-Musa A. (1993). Cucumber vein yellowing
virus; host range and virus vector relationships. J.
Phytopathology 137:73-78.
Matthews, R.E.F. (1991). Plant
Virology. Third Edition. Academic Press, Inc. NY.
Narváez, G., Skander, B.S.,
Ayllón, M.A., Rubio, L., Guerri, J. y
Moreno, P.(2000). A new procedure to differentiate
citrus tristeza virus isolates by hybridisation with
digoxigenin-labelled cDNA probes. J. Virol.
Methods 85:83-92.
Lecoq, H., Desbiez, C.,
Delécolle, B., Cohen, S. y Mansour, A.
(2000). Cytological and molecular evidence that the
whitefly-transmitted Cucumber vein yellowing
virus is a tentative member of the family Potyviridae. J.
Gen. Virol. 81:2289-2293.
Sambrook, J., Fritsch, E.F. y
Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: A laboratory
manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.
Sela, I., Assouline, I.,
Tanne, E., Cohen, S y Marco, S.
(1980). Isolation and characterization of a
rod-shaped, whitefly- transmissible, DNA
containing plant virus. Phytopathology 70:
226-228.
<110> CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES
CIENTÍFICAS
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PROCEDIMIENTO PARA LA DETECCIÓN DEL
VIRUS DEL AMARILLEO DE LAS VENAS DEL PEPINO (CVYV)
\vskip0.400000\baselineskip
<130> SECUENCIA DE UN FRAGMENTO DE CVYV
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 200102784
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2001-12-14
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VIRUS DEL AMARILLEO DE LAS VENAS DEL
PEPINO (CVYV)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacattagcgg caagtgtctg
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VIRUS DEL AMARILLEO DE LAS VENAS DEL
PEPINO (CVYV)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtcagccgtc aactgtggtg g
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1537
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VIRUS DEL AMARILLEO DE LAS VENAS DEL
PEPINO (CVYV)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (7)
1. Procedimiento para la detección del Virus del
amarilleo de las venas del pepino (CVYV) en cucurbitáceas
caracterizado porque se utilizan técnicas de hibridación
molecular.
2. Procedimiento para la detección del Virus del
amarilleo de las venas del pepino (CVYV) en cucurbitáceas según la
reivindicación 1, caracterizado porque comprende los
siguientes pasos:
- -
- preparación de una construcción genética, un plásmido entre otras, que contiene un fragmento del genoma de CVYV,
- -
- preparación de una sonda de ácidos nucleicos a partir del plásmido obtenido en el paso anterior, y
- -
- hibridación de la sonda con extractos de ácidos nucleicos o con improntas de secciones de tejidos de las plantas a las que se aplica el procedimiento.
3. Procedimiento para la detección del Virus del
amarilleo de las venas del pepino (CVYV) en cucurbitáceas según la
reivindicación 2, caracterizado porque para la preparación
de la construcción genética que contiene un fragmento del genoma de
CVYV se seleccionan dos oligonucleótidos a partir de la secuencia de
CVYV.
4. Procedimiento para la detección del Virus del
amarilleo de las venas del pepino (CVYV) en cucurbitáceas según la
reivindicación 3, caracterizado porque el oligonucleótido
que se utiliza para la síntesis de la primera cadena del cDNA es el
5'-ACATTAGCGGCAAGTGTCTG-3' (SEQ ID
NO 1) o cualquier oligonucleótido complementario en al menos el 95%
de sus nucleótidos a la secuencia de CVYV (SEQ ID NO 3).
5. Procedimiento para la detección del Virus del
amarilleo de las venas del pepino (CVYV) en cucurbitáceas según la
reivindicación 3, caracterizado porque el oligonucleótido
utilizado en la construcción de la segunda cadena del cDNA es el
5'-GTCAGCCGTCAACTGTGGTGG-3' (SEQ ID
NO 2) o cualquier oligonucleótido incluido en la secuencia de
nucleótidos de CVYV (SEQ ID NO 3) y que tenga con ésta una
similitud de al menos el 95%.
6. Procedimiento para la detección del Virus del
amarilleo de las venas del pepino (CVYV) en cucurbitáceas según las
reivindicaciones 3-5, caracterizado porque
la cadena doble de cDNA obtenida mediante el uso de los
oligonucleótidos se somete a ligación y posterior inserción en un
plásmido.
7. Procedimiento para la detección del Virus del
amarilleo de las venas del pepino (CVYV) en cucurbitáceas según las
reivindicación 6 caracterizado porque el plásmido resultante
contiene la secuencia SEQ ID NO 3.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200102784A ES2205998B1 (es) | 2001-12-14 | 2001-12-14 | Procedimiento para la deteccion del virus del amarilleo de las venas del pepino (cvyv). |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200102784A ES2205998B1 (es) | 2001-12-14 | 2001-12-14 | Procedimiento para la deteccion del virus del amarilleo de las venas del pepino (cvyv). |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2205998A1 ES2205998A1 (es) | 2004-05-01 |
| ES2205998B1 true ES2205998B1 (es) | 2005-08-16 |
Family
ID=32309590
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200102784A Expired - Fee Related ES2205998B1 (es) | 2001-12-14 | 2001-12-14 | Procedimiento para la deteccion del virus del amarilleo de las venas del pepino (cvyv). |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2205998B1 (es) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2974083T3 (es) * | 2015-10-06 | 2024-06-25 | Nunhems Bv | Plantas de sandía resistentes al virus del amarilleamiento de las venas del pepino (CVYV) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU622104B2 (en) * | 1987-03-11 | 1992-04-02 | Sangtec Molecular Diagnostics Ab | Method of assaying of nucleic acids, a reagent combination and kit therefore |
| IT1252295B (it) * | 1991-11-15 | 1995-06-08 | Schiapparelli Diagnostici Ismu | Metodo per rivelare acidi nucleici e relativo kit diagnostico |
-
2001
- 2001-12-14 ES ES200102784A patent/ES2205998B1/es not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| LECOQ, H. et al. "Cytological an molecular evidence that the whitefly-transmitted Cucumber vein yellowing virus is a tentative member of the family Potyviridae". Journal of General Virology. Septiembre 2000. Vol. 81, páginas 2289-2293. * |
| NARVÁEZ, G. et al. "A new procedure to differentiate citrus tristeza virus isolates by hybridisation with digoxigenin-labelled cDNA probes". Journal of Virology Methods. Marzo 2000. Vol. 85, nº 1-2, páginas 83-92. * |
| THOMSON, K.G. et al. "Identification of Zucchini yellow mosaic potyvirus by RT-PCR and analysis of sequence variability". Journal of Virology Methods. Sep. 1995. Vol. 55, Nº 1, páginas 83-96. * |
| WALSH, K. et al. "Detection of different strains of Potato virus Y and their mixed infections using competitive fluorescent RT-PCR". J. Virol. Methods. Feb. 2001. Vol. 91, nº 2, páginas 167-73. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2205998A1 (es) | 2004-05-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Aguilar et al. | Complete sequence of the Pepino mosaic virus RNA genome: Brief Report | |
| Nowotny et al. | Phylogenetic analysis of rabbit haemorrhagic disease and European brown hare syndrome viruses by comparison of sequences from the capsid protein gene | |
| ES2382446T3 (es) | Método de detección del virus de la gripe aviar H5 | |
| Hord et al. | Field survey of Cucumber mosaic virus subgroups I and II in crop plants in Costa Rica | |
| Tucker et al. | Molecular characterization of the 5′ non‐coding region of South African GBV‐C/HGV isolates: major deletion and evidence for a fourth genotype | |
| Shim et al. | Isolation and characterization of watermelon isolate of Cucumber green mottle mosaic virus (CGMMV-HY1) from watermelon plants with severe mottle mosaic symptoms | |
| Elvira-González et al. | A sensitive real-time RT-PCR reveals a high incidence of Southern tomato virus (STV) in Spanish tomato crops | |
| CN107201370B (zh) | 一种dna分子与重组病毒及它们的制备方法和用途 | |
| ES2205998B1 (es) | Procedimiento para la deteccion del virus del amarilleo de las venas del pepino (cvyv). | |
| Mandal et al. | Properties, diagnosis and management of Cucumber green mottle mosaic virus | |
| Zitikaitė et al. | Cucumber mosaic virus identification in pumpkin plants | |
| White et al. | The replication of a necrogenic cucumber mosaic virus satellite is temperature-sensitive in tomato | |
| Vaira et al. | Ophioviruses infecting ornamentals and a probable new species associated with a severe disease in freesia | |
| Chiemsombat et al. | Molecular taxonomy of a new potyvirus isolated from chilli pepper in Thailand | |
| Dobie et al. | Analysis of LaCrosse virus S mRNA 5'termini in infected mosquito cells and Aedes triseriatus mosquitoes | |
| US7202032B2 (en) | Method of detecting Norwalk-like virus (GI) | |
| US7351819B2 (en) | Method of detecting norwalk-like virus (GII) | |
| Kamenova et al. | Identification of tomato mosaic virus infection in jasmine | |
| ES2331550B1 (es) | Procedimiento para la deteccion simultanea de secuencias de virus mediante el uso de polisondas. | |
| CN102492702A (zh) | 一种β诺达病毒基因组全序列及其克隆方法 | |
| Chen et al. | Development of a concentration method for detection of tobacco mosaic virus in irrigation water | |
| WO2004001046A1 (es) | Método para generar resistencia frente al virus del amarilleo y enanismo de las cucurbitáceas (cysdv) en plantas, construcciones genéticas usadas y plantas resistentes a cysdv obtenidas mediante dicho método | |
| Lee et al. | Development of molecular detection of three species of seed-transmissible viruses useful for plant quarantine | |
| Monti et al. | Transgenic tomatoes expressing a cucumber mosaic virus satellite RNA: Field testing and analysis of satellite RNA spread | |
| Verma et al. | Detection and molecular characterization of a Tomato aspermy virus isolate infecting chrysanthemums in India |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EC2A | Search report published |
Date of ref document: 20040501 Kind code of ref document: A1 |
|
| FD2A | Announcement of lapse in spain |
Effective date: 20180803 |
|
| FD2A | Announcement of lapse in spain |
Effective date: 20180807 |