DE69125441T2

DE69125441T2 - Verfahren zum Gennachweis

Info

Publication number: DE69125441T2
Application number: DE1991625441
Authority: DE
Inventors: Koji Hashimoto; Yoshio Ishimori; Keiko Miwa
Original assignee: Toshiba Corp
Current assignee: Toshiba Corp
Priority date: 1990-09-28
Filing date: 1991-09-26
Publication date: 1997-11-06
Anticipated expiration: 2011-09-27
Also published as: EP0478319B1; EP0478319A1; DE69125441D1

Description

Diese Erfindung betrifft ein neues Gennachweisverfahren zum spezifischen Nachweis eines bestimmten Gens.
Eine in DNA gespeicherte genetische Information wird über mRNA als Protein oder Enzym exprimiert. Aufgrund der Wirkungen derartiger Proteine oder Enzyme werden verschiedenste zur Aufrechterhaltung der Vitalfunktionen nötige Verbindungen auf biologischem Wege synthetisiert und metabilisiert. So besteht Leben aus einem dynamischen Gleichgewichtssystem verschiedenster durch Gene gesteuerter Substanzen.
Es gibt fünfzig- bis hunderttausend menschliche Gene. Wenn einige von ihnen eine Anormalität oder eine Veränderung, z.B. einen Fehler oder eine Duplikation, aufweisen, verändem sich die Charakteristika, Arten und Mengen der synthetisierten Proteine, wodurch sich ein schlecht ausbalanciertes Biosystem ergibt, das Krankheiten verursachen kann. So können durch das Nachweisen bekannter pathogener Gene Krankheiten identifiziert oder verhindert werden. Diese auf den Genen selbst beruhende Diagnose wurde als Ergebnis der in jüngster Zeit fortschreitenden Technologie der Gentechnik entwickelt und wird als Gendiagnose bezeichnet.
Im Vergleich zu üblichen bekannten Diagnoseverfahren läßt sich die Gendiagnose wie im folgenden angegeben charakterisieren.
Betrachtet man die Mechanismen der Genexpression, so besteht Grund zu der Annahme, daß Genveränderungen vor fast allen biochemischen Veränderungen auftreten. Daher ermöglicht die Gendiagnose mittels Nachweis der genetischen Veränderung eine Diagnose oder Prognose vor der Entwicklung einer Phänotypisch erkennbaren Krankheit. Danach kann die Diagnose und Prognose vor der Entwicklung in der Latenzperiode oder im frühesten Stadium der Krankheit durchgeführt werden. Dies ist das primäre Charakteristikum. Als sekundäres Charakteristikum ist die mit Genkrankheiten in Verbindung stehende Gendiagnose unabhängig von den zu analysierenden Organen oder Geweben, da in einem Lebendkörper alle Gene gleich sind. Dies ist besonders wichtig bei der Diagnose in Feten. So wird aufgrund dieses sekundären Charakteristikums eine Diagnose einfach durch Entnehmen einer Probe von Fruchtwasser einer schwangeren Frau und Analysieren der im Fruchtwasser suspendierten Fetuszellen möglich.
Das üblicherweise angewandte Verfahren bei der Gendiagnose wird wie folgt zusammengefaßt.
Gene werden aus Proben extrahiert und bei Bedarf durch geeignete Restriktionsenzyme zerschnitten. Anschließend werden sie der Elektrophorese und dem Southern-Blotting unterzogen. Dann wird eine (gewöhnlich radioaktiv markierte) Necleinsäuresonde mit der zum nachzuweisenden Gen komplementären Basensequenz mit dem geblotteten Gen hybridisiert. Danach wird die hybridisierte Nucleinsäuresonde nachgewiesen, indem ein Röntgenfilm mit der von der markierten Sonde bei niedriger Temperatur emittierten Strahlung belichtet wird, wobei das Vorhandensein des Gens bestätigt wird.
Das genannte übliche bekannte Nachweisverfahren beschränkt wegen der Verwendung von Radioisotopen den Ort der Diagnose und sollte mit genügender Vorsicht bei der Handhabung der Reagenzien durchgeführt werden. Zur Verringerung derartiger Unbequemlichkeiten sind sichere, die Radioisotope ersetzenden Markierungssubstanzen in der Entwicklung. Mehrere Nachweisverfahren unter Verwendung von Sonden, wie die Avidin Biotin-Bindungsmethode oder ein Enzym- oder Fluoreszenzverfahren u.dgl., wurden bereits vorgeschlagen. Mit diesen Verfahren läßt sich jedoch keine höhere Empfindlichkeit als mit dem Verfahren des Einsatzes von Radioisotopen erreichen. Auch bei ihnen treten die Probleme der zum Nachweis des Gens erforderlichen langen Zeitspanne von 2 oder 3 Tagen und das komplizierte Vorgehen bei der Bestimmung auf.
Andererseits wird zur Quantifizierung eines in einer Probe vorhandenen bestimmten Antigens oder Antikörpers im allge meinen ein Radioimmunassay (RIA) angewandt. RIA erfordert jedoch spezielle Instrumente und für den Umgang mit Radioisotopen befähigte und autorisierte Personen, da auch dieses Verfahren ähnlich wie bei den oben genannten Gendiagnoseverfahren Radioisotope verwendet. Ferner sollte die Entfernung des Abfalls bei diesem Verfahren mit besonderer Sorgfalt erfolgen. Als weiteres analytisches Verfahren kann die Immunelektrophorese, bei welcher die Bestimmung sehr lange dauert und welche eine geringe Empfindlichkeit aufweist, verwendet werden, obwohl dieses Verfahren im Falle von nur Spuren der Testsubstanz enthaltenden Proben nicht anwendbar ist.
EP-A-245206 beschreibt ein Gennachweisverfahren, bei dem eine fluoreszierende interkalierende Substanz und ein Wellenleiter, z.B. eine optische Faser, angewandt werden. Der Einsatz einer Elektrode als Träger oder einer interkalierenden Substanz mit den Eigenschaften, Lumineszenz, Phosphoreszenz, Lichtabsorption u.dgl. werden in diesem Dokument jedoch nicht diskutiert.
EP-A-149 339 beschreibt ein Verfahren, bei welchem eine elektrochemisch aktive Mediator-gekoppelte oder Enzym-gekoppelte DNA-Sonde mit einer Proben-DNA in einer Lösung im vorhinein hybridisiert wird, worauf ein bei der Erzeugung des Mediators selbst entstehendes Signal oder die Enzymreaktion durch eine Elektrode gemessen wird. Dieses Verfahren unterscheidet sich von der vorliegenden Erfindung darin, daß eine DNA-Sonde mit einem Mediator oder Enzym modifiziert wird, wobei keine eine doppelsträngige Nucleinsäure erkennende Substanz verwendet wird. In diesem Dokument wird keine eine doppelsträngige Nucleinsäure erkennende Substanz erwähnt.
EP-A-244 326 beschreibt ein Gennachweisverfahren, bei dem eine DNA-Sonde auf der Oberfläche einer Elektrode fixiert ist, wobei die Sonde mit einer Proben-DNA hybridisiert und dann die Abweichung des Widerstandes oder der elektrischen Kapazität gemessen wird. Die Aufgabe der Messung mit der Elektrode unterscheidet sich von der vorliegenden Erfindung. Ferner erwähnt dieses Dokument eine eine doppelsträngige Nucleinsäure erkennende Substanz nicht.
GB-A-2 217 007 beschreibt ein Verfahren, das im Grunde nach dem gleichen Prinzip wie bei EP-A-149 339 arbeitet, mit Ausnahme davon, daß die die DNA-Sonde modifizierende Substanz eine elektrochemisch lichtemittierende Substanz ist. In diesem Dokument wird die Elektrode nur zum Anlegen eines Potentials, nicht zum Nachweis eines Signals verwendet. Das bei Anlegen eines Potentials von der elektrochemisch lichtemittierenden Substanz erzeugte Licht wird mit einem Lumineszenzdetektor nachgewiesen. Eine eine doppelsträngige Nucleinsäure erkennende Substanz wird weder diskutiert noch vorgeschlagen.
EP-A-135 159 beschreibt ein Verfahren zum speziellen Nachweis eines angestrebten Gens, bei dem eine DNA-Sonde zur Hybridisierung mit einer Proben-DNA auf einem Träger fixiert und dann mit einem eine doppelsträngige Nucleinsäure erken nenden Antikörper umgesetzt wird. Bei diesem Verfahren muß - da ein Antikörper selbst kein Signal erzeugen kann - zum Nachweis eine Enzym-Substrat-Reaktion oder eine immunologische Technik verwendet werden. Dieses Dokument enthält weder eine Diskussion noch einen Vorschlag bezüglich einer eine doppelsträngige Nucleinsäure erkennenden Substanz mit elektrochemischer Aktivität. Ferner kann bei diesem Verfahren der Träger - soweit er eine DNA-Sonde tragen kann - von beliebiger Art sein, jedoch keine Elektrode.
WO-A-9 604 244 beschreibt Metallkomplexe, welche als Antitumormittel verwendet werden können und welche interkalierende Verbindungen sind, während EP-A-109 767 eine modifizierte Elektrode beschreibt, wobei die Oberfläche der Elektrode mit einem "Elektronenmediator" überzogen ist. Die zum Überziehen der Elektrode verwendeten Substanzen sind speziell Redox/Adsorptionselektronenmediatoren. Diese Mediatoren müssen mit den Substanzen, die sie nachweisen, auf elektrochemische Weise reagieren, so daß alle Beispiele für Substanzen, die durch die Elektroden gemäß EP-A-109 767 nachgewiesen werden können, in der Natur an Elektronentransfersystemen beteiligte Substanzen sind. Derartige Substanzen umfassen NADH, NADPH, Cytochrom-C&sub3;, Cytochrom-C, Hämoglobin und Chlorophyll.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens, welches ausgezeichnete Sicherheit und bequeme Handhabung bietet und ein bestimmtes Gen mit hoher Empfindlichkeit in einer geringen Zeitspanne nachzuweisen vermag.
Demgemäß wird ein wie in den einzelnen Ansprüchen 1 bis 11 beanspruchtes Gennachweisverfahren bereitgestellt.
Diese Erfindung läßt sich nach der folgenden detaillierten Beschreibung in Zusammenhang mit den beiliegenden Zeichnungen vollständiger verstehen, wobei für die Zeichnungen gilt:
Fig. 1 ist das Schemadiagramm eines Beispiels für eine zur erfindungsgemäßen Verwendung geeignete automatische Gennachweisapparatur.
Fig. 2 ist die perspektivische Darstellung einer weiteren Ausführungsform des Reaktionsbades und einer Genprobenreinigungsapparatur der automatischen Gennachweisapparatur aus Fig. 1.
Fig. 3 ist die perspektivische Darstellung eines Beispiels für die Temperatursteuerung in der automatischen Gennachweisapparatur aus Fig. 1.
Fig. 4 ist ein Schemadiagramm für ein Beispiel der automatischen Gennachweisapparatur unter Nutzung von Elektrochemilumineszenz.
Erfindungsgemäß bedeutet der Ausdruck "doppelsträngige Nudeinsäure erkennende Substanz" eine Substanz, welche eine doppelsträngige Nucleinsäure erkennt und spezifisch an diese bindet. Derartige Substanzen sind beispielsweise interkalierende Mittel und doppelsträngige Nucleinsäure erkennende Biopolymere.
Die interkalierenden Mittel sind charakterisiert durch die Neigung, in doppelsträngige Nucleinsäure, wie doppelsträngige DNA, spezifisch zu interkalieren. Diese interkalieren den Mittel weisen in den Molekülen eine flache interkalierende Gruppe, wie beispielsweise eine Phenylgruppe, auf, die zwischen die Basenpaare der doppelsträngigen Nucleinsäure interkaliert, wobei sie an die doppelstrangige Nucleinsäure bindet. Die erfindungsgemäß verwendeten interkalierenden Mittel sind elektrochemisch aktiv oder weisen Chemilumineszenz auf. Durch die Bestimmung dieser Eigenschaften lassen sich die an eine doppelsträngige Nucleinsäure gebundenen interkalierenden Mittel nachweisen.
Für die vorliegende Erfindung geeignete - aber diese nicht beschränkende - elektrochemisch oder optisch aktive interkalierende Mittel sind Ethidium, Ethidiumbromid, Acridin, Aminoacridin, Acridinorange, Proflavin, Ellipticin, Actinomycin D, Daunomycin, Mitomycin C und dergleichen. Andere geeignete interkalierende Mittel sind in der veröffentlichten japanischen Patentanmeldung Nr. 62-282599 angegeben.
Über die interkalierenden Mittel, die während der genannten Oxidationsreduktions-Reaktion reversibel reagieren, hinaus kann die Bestimmung der elektrochemischen Veränderung mittels einer Elektrode über einen Metallkomplex, der als Zentralmetall eine Substanz mit der Fähigkeit, eine elektrisch reversible Oxidationsreduktions-Reaktion einzugehen, d.h. einen Metallinterkalator, aufweist, erfolgen. Derartige Metallinterkalatoren sind beispielsweise Tris(phenanthrolin)zinksalz, Tris(phenanthrolin)rutheniumsalz, Tris(phenanthrolin)kobaltsalz, Di(phenanthrolin)zinksalz, Di(phenanthrolin)rutheniumsalz, Di(phenanthrolin)kobaltsalz, Bipyridinkobaltsalz, Terpyridinplatinsalz, Phenanthrolinplatinsalz, Tris(bipyridyl)zinksalz, Tris(bipyridyl)rutheniumsalz, Tris(bipyridyl)kobaltsalz, Di(bipyridyl)zinksalz, Di(bipyridyl)rutheniumsalz, Di(bipyridyl)kobaltsalz und dergleichen. Obwohl die interkalierenden Mittel nicht auf die oben angegebenen beschränkt sind, sind die Komplexe, die oder deren Zentralmetalle Oxidationsreduktions-Potentiale aufweisen, die nicht unter denen der Nucleinsäuren liegen oder die von denen der Nucleinsäure überdeckt werden, weniger bevorzugt.
Bei Verwendung der interkalierenden Mittel mit der Fähigkeit zu einer elektrochemisch reversiblen Oxidationsreduktions- Reaktion ist die Bestimmung des Oxidationsreduktions-Stroms wiederholt möglich. Dadurch ist das Durchführen einer Potentialabtastung mehrere oder mehrere hundert Male und das Aufsummieren der erhaltenen Signalwerte möglich, wodurch eine Verstärkung der Signale und dadurch eine höhere Nachweisempfindlichkeit erreicht wird.
Beim Durchführen des Gennachweises unter Verwendung einer Elektrode kann auch ein Elektrochemilumineszenz zeigendes interkalierendes Mittel verwendet werden. Derartige interkalierende Mittel sind - jedoch nicht beschränkend - beispielsweise Luminol, Lucigenin, Pyren, Diphenylanthracen und Rubren. Die Elektrochemilumineszenz der genannten interkalierenden Mittel kann durch Verstärker, wie Luciferinderivate, z.B. Firefly-Luciferin und Dihydroluciferin, Phenole, z.B. Phenylphenol und Chlorphenol, und Naphthole verstärkt werden.
Die durch die Elektrochemilumineszenz hervorgerufenen optischen Signale können direkt aus der Lösung mittels beispielsweise eines Photozählers registriert werden. Alternativ kann auch eine optische Faserelektrode, die durch Ausbilden einer transparenten Elektrode an der Spitze einer optischen Faser hergestellt wird, zum indirekten Nachweis des Signals verwendet werden.
Da die Elektrodenreaktion oder die Veränderung des optischen Signals ausschließlich auf der Oberfläche des Trägers auftritt, kann der Nachweis ohne Schwierigkeiten ohne Entfernen von nicht umgesetzter Sonde oder nicht umgesetztem interkalierendem Mittel geführt werden.
Erfindungsgemäß wird die Reaktion der Nucleinsäuresonde und der einsträngigen Genprobe im allgemeinen in einer Lösung durchgeführt. Eine derartige Reaktion kann in Anwesenheit der genannten interkalierenden Mittel durchgeführt werden, oder die interkalierenden Mittel können nach Beendigung der Reaktion zugesetzt werden.
Da die meisten interkalierenden Mittel, wie bereits erwähnt, die optische Aktivität selbst aufweisen oder eine Elektrodenreaktion zeigen können, ist eine direkte Bestimmung mittels optischer oder elektrochemischer Verfahren möglich. Wenn diese interkalierenden Mittel zu dem an Substanzen, die direkt oder indirekt meßbare Signale erzeugen, gebunden sind, läßt sich durch die Bestimmung der Signale in Kombination mit den Signalen der interkalierenden Mittel eine höhere Nachweisempfindlichkeit erreichen.
Zu diesen Substanzen, die direkt oder indirekt nachweisbare Signale erzeugen, zählen beispielsweise Haptene, wie Biotin, Trinitrobenzolsulfonsäure und Dinitrobenzolsulfonsäure, fluoreszierende Substanzen, wie Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Phycocyanin und Rhodamin, lumineszierende Substanzen, wie Luminol, Lucigenin und Acridiumesterderivate sowie elektrodenaktive Substanzen, wie Ferrocen und Viologen. Bei Einsatz einer Substanz, deren Signal nicht direkt registriert werden kann, wie beispielsweise der genannten Haptene, werden enzymmarkierte Anti-Hapten-Antikörper, wie enzymmarkiertes Avidin, zur Bestimmung der optischen Parameter, wie Absorption, Fluoreszenz, Lumineszenz, Quenchen, Zirkulardichroismus und Fluoreszenzpolarisation, verwendet, oder es wird die Elektrodenaktivität bestimmt und damit in direkt das Gen nachgewiesen.
Obwohl gewöhnlich ein Molekül dieser Substanzen an ein Molekül eines interkalierenden Mittels gebunden ist, können mehrere Moleküle dieser Substanzen an ein Molekül des interkalierenden Mittels gebunden sein, wobei die Empfindlichkeit erhöht wird.
Die Menge der eine doppelstrangige Nucleinsäure erkennenden Substanz, die zugegeben werden soll, ist nicht besonders spezifiziert, obwohl im Hinblick auf die Effizenz zur Bindung aller gebildeten Doppelstränge ausreichende Mengen bevorzugt sind. Bei Zugabe im Überschuß wird die nicht umgesetzte Restmenge der doppelsträngige Nucleinsäure erkennenden Substanz vor der Bestimmung weggewaschen.
Für den Fall, daß die zugegebene Menge der doppeisträngige Nucleinsäure erkennenden Substanz klein und deren Konzentration gering ist, bleibt nach dem Binden der Erkennungssubstanz an die gebildete doppelsträngige Nucleinsäure nur eine geringe Menge der nicht umgesetzten Erkennungssubstanz im System zurück. Daher ist die eine doppelsträngige Nucleinsäure erkennende Substanz auf dem Träger relativ konzentriert. In diesem Zustand kann das Gen ohne Abwaschen der Proben-DNA, die mit der Nucleinsäuresonde nicht reagiert hat, oder der freien doppelsträngige Nucleinsäure erkennenden Substanz, die sich nicht an die gebildete doppelsträngige Nucleinsäure gebunden hat, nachgewiesen werden, wodurch die fortlaufenden Reaktionen von der Hybridisierung bis zum Nachweis des bestimmten Gens in einem einzigen System ermöglicht werden.
Erfindungsgemäß können unter Variation der angewandten Nucleinsäuresonde verschiedene Arten von Genen nachgewiesen werden. Geeignete Nucleinsäuresonden sind Sonden mit Basensequenzen, die zur Gesamtheit oder zu einem Teil der Basensequenz von in Nahrungsmitteln enthaltenen Mikroorganismen, Pflanzenviren oder -viroiden, Fische infizierenden pathogenen Mikroorganismen oder Viren, Menschen infizierenden und Infektionskrankheiten verursachenden pathogenen Mikroorga nismen oder Viren, Genkrankheiten verursachenden Genen, aktivierten Protoonkogenen und Minisatellitensequenzen komplementär sind.
Bei Verwendung einer Sonde mit einer zur Gesamtheit oder zu einem Teil der Basensequenz eines in einem Nahrungsmittel enthaltenen Mikroorganismus komplementären Basensequenz als Nucleinsäuresonde kann der im Nahrungsmittel enthaltene Mikroorganismus direkt nachgewiesen werden, wodurch die Lebensmittelgesundheitsüberwachung möglich wird. Derartige in Nahrungsmitteln enthaltene Mikroorganismen sind beispielsweise pathogene Escherichia coli, Staphylococcus sowie Salmonella.
Bei Verwendung einer Sonde mit einer zur Gesamtheit oder zu einem Teil der Basensequenz eines Pflanzenvirus oder -viroids komplementären Basensequenz als Nucleinsäuresonde kann das Pflanzenvirus oder das Pflanzenviroid, mit dem die Pflanzen infiziert sind, nachgewiesen werden, womit die Diagnose einer Infektion auf dem Gebiet der Landwirtschaft möglich wird. Beispiele für derartige Pflanzenviren oder -viroide sind der Tabakmosaikvirus und der Blumenkohlmosaikvirus.
Bei Verwendung einer Sonde mit einer zur Gesamtheit oder zu einem Teil der Basensequenz eines Fische infizierenden pathogenen Mikroorganismus oder Virus komplementären Basensequenz als Nucleinsäuresonde kann der pathogene Mikroorganismus oder das Virus, mit dem die Fische infiziert sind, nachgewiesen werden, womit die Diagnose einer Infektion auf dem Gebiet der Fischerei möglich wird. Beispiele für derartige, Fische infizierende pathogene Mikroorganismen oder Viren sind pathogene Vibrio.
Bei Verwendung einer Sonde mit einer zur Gesamtheit oder zu einem Teil der Basensequenz eines Menschen infizierenden und Infektionskrankheiten verursachenden pathogenen Mikroorganismus oder Virus komplementären Basensequenz als Nucleinsäuresonde ist die Diagnose einer Infektion möglich. Derartige Menschen infizierende und Infektionskrankheiten verursachende pathogene Mikroorganismen sind beispielsweise pathogene Streptococcus, Mycoplasma, Clostridium, Chlamydia, Salmonella, Herpes simplex und Cytomegalievirenus.
Bei Verwendung einer Sonde mit einer zur Gesamtheit oder zu einem Teil der Basensequenz eines eine Genkrankheit verursachenden Gens komplementären Basensequenz as Nucleinsäuresonde ist eine direkte Analyse der Genkrankheit möglich. Derartige Genkrankheiten verursachende Gene sind beispielsweise die Adenosin-Desaminase-Defizienz und Sichelzellen anamie verursachenden Gene.
Bei Verwendung einer Sonde mit einer zur Gesamtheit oder zu einem Teil der Basensequenz eines aktivierten Protoonkogens komplementären Basensequenz als Nucleinsäuresonde, ist eine Krebsdiagnose möglich. Derartige aktivierte Protoonkogene sind beispielsweise die in "Oncogene data book" (M. Shibuya, veröffentlicht von Shujun-Sha) angegebenen Onkogene.
Bei Verwendung einer Sonde mit einer zur Gesamtheit oder zu einem Teil der Basensequenz einer Minisatellitensequenz komplementären Basensequenz als Nucleinsäuresonde kann eine für genetische Untersuchungen, Individuenidentifizierungen und Vaterschaftstests geeignete DNA-Fingerprint-Methode durchgeführt werden. Derartige Minisatellitensequenzen sind beispielsweise die Myo-Sequenz, die Alu-Sequenz, die Per-6- Sequenz und die Per-Sequenz.
Obwohl die Länge der erfindungsgemäß verwendeten Nucleinsäuresonde nicht besonders spezifiziert ist und aus mehreren bis zu Hunderten von Monomeren bestehende einzelsträngige Nucleinsäuren verwendet werden können, sind Längen mit mehr als 10 und weniger als 100 Monomeren zur Steigerung des S/N- Verhältnisses und zur Erhöhung der Empfindlichkeit im Hinblick auf die im folgenden angegebene Tatsache bevorzugt.
Wie bereits angegeben, ist eine eine doppelsträngige Nucleinsäure erkennende Substanz eine Substanz, die eine doppelsträngige Nucleinsäure erkennt und spezifisch an diese bindet. Die eine doppelsträngige Nucleinsäure erkennende Substanz kann jedoch in seltenen Fällen an eine einzelsträngige Nucleinsäure binden. So kann sie an eine nicht umgesetzte Nucleinsäuresonde, die auf einem Träger immobilisiert ist, binden. Im Falle einer derartigen Bindung verkleinert sich das S/N-Verhältnis, wobei sich eine geringere Nachweisgenauigkeit ergibt. Demnach ist es bevorzugt, die Länge der Nudeinsäuresonde so weit zu minimieren, als der Nachweis des angestrebten Gens möglich ist.
In der vorliegenden Erfindung wird eine Nucleinsäuresonde auf einer Elektrode immobilisiert.
Die erfindungsgemäß verwendeten Elektroden können - jedoch nicht hierauf beschränkt - Elektroden aus Kohlenstoff, bei spielsweise Graphit, glasartigemr Kohlenstoff, pyrolytischem Graphit, Kohlepaste und Kohlefaser, Elektroden aus Edelmetallen, beispielsweise Platin, Platinschwarz, Gold, Palladium und Rhodium, Elektroden aus Oxiden, beispielsweise Titanoxid, Zinnoxid, Manganoxid und Bleioxid, Halbleiterelektroden aus beispielsweise Si, Ge, ZnO, CdS, TiO&sub2; und GaAs sowie Titan sein. Zur Steigerung der Stabilität der Elektroden, auf denen die Sonden immobilisiert sind, können diese Elektroden auch mit leitfähigen Polymeren überzogen sein. Auch monomolekulare Filme können zur Bedeckung der Elektroden verwendet werden.
Die Nucleinsäuresonden können auf den Oberflächen der Elektroden mittels kovalenter Bindung, Ionenbindung und physikalischer Adsorption immobilisiert sein.
Beispiele für das Vorgehen bei der Immobilisierung mittels kovalenter Bindung sind ein Verfahren, bei dem die Oberfläche des Trägers aktiviert und dann die Nucleinsäuresonde durch ein Vernetzungsmittel direkt oder indirekt immobilisiert wird, und eine Methode, bei der in die auf dem Träger zu immobilisierende Nucleinsäuresonde eine aktive funktionelle Gruppe eingeführt und die Sonde anschließend direkt oder indirekt immobilisiert wird. Die Aktivierung der Trägeroberfläche kann durch elektrolytische Oxidation in Gegenwart eines Oxidationsmittels oder durch Luftoxidation oder Oxidation mit einem Reagens sowie durch Überziehen mit einem Film erfolgen. Geeignete Vernetzungsmittel sind - jedoch nicht hierauf beschränkt - Silankuppler, beispielsweise Bromcyan und Gamma-Aminopropyltriethoxysilan, Carbodiimid und Thionylchlorid und dergleichen. Zur Einführung in die Nucleinsäuresonde geeignete funktionelle Gruppen können - jedoch nicht hierauf beschränkt - eine Aminogruppe, eine Carboxylgruppe, eine Hydroxylgruppe, eine Carbonylgruppe, eine Phosphatgruppe, eine Aldehydgruppe und eine Mercaptogruppe sein. Es können auch andere hochreaktive funktionelle Gruppen verwendet werden.
Bei der Aktivierung der Oberfläche des Trägers durch Oxidation wird auf der Oberfläche eine oxidierte Schicht gebildet. Die Nucleinsäuresonde bindet über diese oxidierte Schicht an das Substrat. Durch das Ausbilden einer dünneren oxidierten Schicht wird das S/N-Verhältnis für den Nachweis des Gens verbessert. Die Dicke der oxidierten Schicht beträgt zweckmäßigerweise nicht mehr als 500 Å, vorzugsweise nicht mehr als 100 Å.
Die Einführung der funktionellen Gruppe in das Nucleinsäureende kann mittels einer enzymatischen Reaktion oder unter Verwendung eines DNA-Synthesizers erfolgen. Für die enzyma tische Reaktion geeignete Enzyme können beispielsweise die terminale Desoxynucleotidyl-Transferase, poly(A)-Polymerase, Polynucleotid-Kinase, DNA-Polymerase, Polynucleotidadenylyl- Transferase und RNA-Ligase sein. Die Methoden einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR-Methode), "nick-Translation" und die "Random-Primer"-Methode können ebenfalls zur Einführung der funktionellen Gruppe angewandt werden.
Die funktionelle Gruppe kann in jeden Teil der Nucleinsäure, beispielsweise 3'- oder 5'-terminal, sowie an einer willkürlich ausgewählten Position eingeführt werden.
Die Nucleinsäuresonde mit der eingeführten funktionellen Gruppe kann als solche auf dem Träger durch eine Immobilisierungsreaktion immobilisiert werden. Die ursprünglich in der Nucleinsäure enthaltene Aminosäure kann jedoch manchmal statt der eingeführten funktionellen Gruppe als funktionelle Gruppe fungieren, da die Nucleinsäuresonde aus einem Einzelstrang besteht. Daher wird die ursprünglich in der Nucleinsäure enthaltene Aminosäure zur Immobilisierung der Sonde auf dem Träger verwendet, wodurch die Empfindlichkeit beeinflußt wird.
Die Immobilisierung über die ursprünglich in der Nucleinsäuresonde enthaltene Aminosäure kann beispielsweise durch das folgende Verfahren verhindert werden. Zunächst wird die Nucleinsäuresonde, in die die funktionelle Gruppe eingeführt wurde, mit der DNA-Kette mit der zur Sonde komplementären Basensequenz reassoziiert, wobei ein Doppelstrang erhalten wird. Dann wird die eingeführte funktionelle Gruppe zur Immobilisierung der doppelsträngigen Nucleinsäure an den Träger verwendet. Danach erfolgt eine thermische Denaturierung zur Ausbildung eines Einzelstrangs, wobei die DNA- Kette, in die die funktionelle Gruppe nicht eingeführt wurde, entfernt wird. Die Temperatur während der thermischen Denaturierung wird gewöhnlich bei 90 - 98 ºC gehalten.
Wenn der zur Immobilisierung der Nucleinsäuresonde verwendete Träger eine Elektrode ist, kann die Nucleinsäuresonde ohne Schwierigkeiten mit größerer Effizienz under Verwendung von physikalischer Adsorption immobilisiert werden. Die physikalische Adsorption der Nucleinsäuresonde auf der Elektrodenoberfläche kann beispielsweise wie folgt durchgeführt werden. Zunächst wird die Elektrodenoberfläche mit destilliertem Wasser und Alkohol unter Einsatz eines Ultraschallreinigers gewaschen. Dann wird die Elektrode in den die Nucleinsäuresonde enthaltenden Phosphatpuffer (pH-Wert: 7,0) gegeben, so daß die Sonde auf der Oberfläche des Substrats adsorbiert wird. Während dieses Verfahrens wird ein Potential von 0 bis +1,0 V, vorzugsweise 0 bis +0,1 V, zur Beschleunigung der Adsorption an die Elektrode angelegt. Dann wird die Elektrode mit der adsorbierten Nucleinsäure in die Nucleotide (ATP, CTP, GTP, TTP, DATP, DCTP, DGTP, DTTP u.dgl.) enthaltende Lösung gegeben und die Elektrodenoberfläche mit den Nucleotiden - vorzugsweise unter Anlegen eines Potentials von 0 bis 1,0 V - überzogen. Durch diese Behandlung kann eine nichtspezifische Adsorption der Nucleinsäureprobe oder der eine doppelsträngige Nucleinsäure erkennenden Substanz an der Elektrodenoberfläche verhindert werden. Eine nichtspezifische Adsorption kann auch durch den Einsatz von Netzmitteln, Fettsäuren oder Fetten verhindert werden.
Die Nucleinsäuresonde kann auch auf dem Träger unter Einsatz eines Einbettungsmittels, das in dem als ein Verfahren zur Immobilisierung von Enzymen bekannten Einbettungsverfahren verwendet wird, immobilisiert werden. Als Einbettungsmittel sind erfindungsgemäß - jedoch nicht auf diese beschränkt - Polyvinylchlorid und Polyacrylamid geeignet.
Die Nucleinsäuresonde kann auch auf der Elektrodenoberfläche über einen Film immobilisiert sein. Derartige Filme sind beispielsweise leitfähige Polymere, wie Polyacetylen, Polypyrrol, Polythiophen und Polyanilin, sowie Polyethylen, Polypropylen, Poly(vinylchlorid), Poly(vinylalkohol), Poly(methylmethacrylat), Poly(vinylidenfluorid), Cellulose und Lipidmembran. Es kann auch eine monomolekulare Schicht, wie eine LB-Membran, und eine Mehrfachschicht aus zwei oder mehr monomolekularen Schichten verwendet werden.
Die Immobilisierung der Nucleinsäure auf dem Film oder der Membran kann in einer ähnlichen Weise wie die Immobilisierung auf der Oberfläche des Trägers durchgeführt werden.
Bei der Immobilisierung der Nucleinsäuresonde auf dem Film oder der Membran mittels kovalenter Bindung kann eine funktionelle Gruppe in den Film oder die Membran statt in die Nucleinsäuresonde eingeführt werden. Die zur Einführung in den Film oder die Membran geeigneten funktionellen Gruppen können ähnlich den in die Nucleinsäuresonde eingeführten Gruppen sein. Durch Einführen der funktionellen Gruppe in den Film oder die Membran und anschließendes Umsetzen mit der Nucleinsäuresonde zur Immobilisierung kann die Sonde mit höherer Dichte immobilisiert werden und es kann im Vergleich zur Immobilisierung durch Einführen der funktionellen Gruppe in die Nucleinsäuresonde ein Träger mit mit größerer Stabilität (hierauf) immobilisierter Nucleinsäuresonde erhalten werden.
Für den Fall, daß der Träger, an dem die Nucleinsäuresonde über den Film oder die Membran immobilisiert ist, eine Elektrode ist, werden die Sonde und die Probe, wie bereits ausgeführt, unter Bestimmung des Membranpotentials vor und nach der Hybridisierung hybridisiert, wobei das Vorhandensein des angestrebten Gens nachgewiesen wird.
Ein Träger mit immobilisierter Nucleinsäuresonde neigt bei Verwendung des Trägers als solchem zur Gewährleistung nichtspezifischer physikalischer Adsorption, welche durch eine Probennucleinsäure und eine eine doppelsträngige Nucleinsäure erkennende Substanz verursacht wird. Eine derartige nichtspezifische Adsorption kann eine Verringerung der Empfindlichkeit verursachen. Sie kann durch Bedecken der Trägeroberfläche mit der Nucleinsäure mittels physikalischer Adsorption oder chemischer Bindung nach der Immobilisierung der Nucleinsäuresonde unterdrückt werden.
Beispiele für die zur Bedeckung der Oberfläche des Trägers verwendeten Nucleinsäuren sind Nucleoside, wie Adenosin, Thymidin, Guanosin und Cytidin, Nucleotide, wie Uridylsäure, Cytidylsäure, Adenylsäure und Guanylsäure, synthetische Oligonucleotide sowie aus der Natur gewonnene DNA, wie Lachssperma-DNA.
Obwohl die Länge und die Basensequenz der zur Bedeckung der Oberfläche des Trägers verwendeten Nucleinsäure nicht speziell beschränkt sind - sofern sie nicht die Umsetzung mit der auf der Oberfläche des Trägers immobilisierten Nucleinsäuresonde verursachen - ist eine einzelsträngige oder doppelsträngige Nucleinsaure mit 1 bis 100 bp bevorzugt.
Eine nichtspezifische Adsorption kann auch durch Überziehen des Trägers mit Substanzen, wie Netzmitteln, Fettsäuren und Fetten, unterdrückt werden. Ein Beispiel für eine derartige Substanz ist Stearylamin.
Beim erfindungsgemäßen Gennachweisverfahren sind die Verfahren zur Immobilisierung der Nucleinsäuresonde auf dem Träger nicht auf die genannten beschränkt. Es können in einem wei ten Bereich andere allgemein zur Immobilisierung von Biopolymeren, wie Proteinen, auf festen Phasen verwendete Verfahren zum Einsatz gelangen.
Die Menge der auf dem Träger zu immobilisierenden Nucleinsäuresonde ist nicht speziell beschränkt, obwohl eine höhere Dichte der immobilisierten Nucleinsäuresonde eine höhere Nachweisempfindlichkeit, d.h. ein höheres S/N-Verhältnis, ergibt. Die Dichte der immobilisierten Nucleinsäuresonde liegt allgemein in der Größenordnung von einem Mol/cm² oder darüber.
Die auf einer Elektrode immobilisierte Nucleinsäuresonde kann mengenmäßig durch Messen eines Oxidationsreduktionstroms oder eines optischen Signals der Nucleinsäure oder durch Messen eines Oxidationsreduktionsstroms oder eines optischen Signals einer spezifisch an die einzelsträngige Nucleinsäure bindenden, elektrochemisch oder optisch aktiven Substanz erfaßt werden. Daher wird dann, für den Fall, daß der Träger aus einer Elektrode besteht, der Oxidationsreduktionsstrom für die Nucleinsäure oder das interkalierende Mittel unter Einsatz eines Meßsystems aus beispielsweise einem Potentiostaten, Funktionsgenerator, Recorder und Computer zur mengenmäßigen Bestimmung der immobilisierten Nucleinsäure bestimmt. Mit diesen Verfahren läßt sich die auf der Oberfläche des Trägers immobilisierte Nucleinsäure mit weniger Schwierigkeiten in einer kürzeren Zeitspanne mit höherer Empfindlichkeit im Vergleich zu den üblichen bekannten Verfahren, die wegen der fehlenden Aktivität der Nucleinsäure selbst sehr kompliziert sind, mengenmäßig bestimmen. Der Oxidationsreduktionsstrom der Nucleinsäure kann der Oxidationsreduktionsstrom von Adenin, Thymin, Guanin oder Cytosin sein.
Erhält der Träger, auf dem die Nucleinsäuresonde immobilisiert ist, die Funktion eines Oszillators oder Rotators, so kann die Strömung in der Nähe der Oberfläche des Trägers "relativ" verstärkt werden, wodurch die Hybridisierungsreaktion erleichtert und die nichtspezifische Reaktion gehemmt wird und damit eine höhere Effizienz des Gennachweises erreicht wird. Die Oszillatorfunktion kann dem Träger durch Einsatz von mechanischer Schwingung, Ultraschall oder elektrischen oder magnetischen Aktionen vermittelt werden.
Als Testproben können Blut, wie peripheres venöses Blut, Leukozyten, Serum, Urin, Kot, Samen, Speichel, Kulturzellen, Gewebezellen, wie Zellen von verschiedenen Organen, und andere Materialien mit Nucleinsäuren verwendet werden.
Wenngleich die Extraktion von Nucleinsäuren aus einer Testprobe nach dem üblichen bekannten Verfahren durchgeführt wird, kann die genannte eine doppelsträngige Nucleinsäure erkennende Substanz zur Extraktion und Reinigung nach dem im folgenden beschriebenen Verfahren verwendet werden.
Zuerst wird die eine doppelsträngige Nucleinsäure erkennende Substanz auf einem geeigneten Träger immobilisiert und dieser dann mit einer Testprobe gemischt. Die in der Testprobe enthaltenen Zellen werden zur Freisetzung der Nucleinsäure aufgebrochen, wobei diese dann an die eine doppelsträngige Nucleinsäure erkennende Substanz gebunden wird. Danach wird der Träger von der Testprobe abgetrennt und die an die eine doppelstrangige Nucleinsäure erkennende Substanz gebundene Nucleinsäure vom Träger abgetrennt.
Hierfür geeignete Träger sind - jedoch nicht darauf beschränkt - Polymerträger, wie Latex, Polyethylen, Polystyrol und Polypropylen, Materialien aus Kohlenstoff, wie Aktivkohle, Metallpartikel, Keramikwerkstoffe und magnetische Stoffe, wie Magnetite, Samanum-Kobalt und Ferrit. Die For men der Träger sind nicht speziell beschränkt, jedoch werden Teilchen mit Größen im Bereich von 0,1 - 1000 µm, insbesondere von 1 - 100 µm, bevorzugt.
Die in den Testproben enthaltenen Zellen können nach dem Standardverf ahren aufgebrochen werden. Beispielsweise wird der Träger mittels äußerer Kräfte, wie durch Schütteln oder die Anwendung von Ultraschall, bewegt. Auch Nucleinsäureeluiermittel können zur Freisetzung der Nucleinsäure aus den Zellen verwendet werden. Derartige Nucleinsäureeluiermittel sind beispielsweise Lösungen mit Netzmitteln, wie SDS, Triton-X und Tween-20 (Triton und Tween sind eingetragene Warenzeichen), und Lösungen mit Saponin, EDTA oder Proteasen. Bei Einsatz dieser Lösungen zur Freisetzung der Nudeinsäure kann eine Inkubation bei Temperaturen nicht unter 37ºC die Umsetzung erleichtern.
Nach dem Binden der Nucleinsäure an die eine doppelsträngige Nucleinsäure erkennende Substanz, die auf dem Träger immobilisiert ist, wird der Träger mittels geeigneter Maßnahmen von der Testprobe abgetrennt. Der abgetrennte Träger wird zuerst zur Entfernung nicht nötiger Bestandteile mit einer Waschflüssigkeit (niedrige Salzkonzentration) und dann mit einem Nucleinsäureeluiermittel (hohe Salzkonzentration) zur Freisetzung der Nucleinsäure in die Lösung gewaschen. Bei Verwendung eines interkalierenden Mittels als der eine doppelsträngige Nucleinsäure erkennenden Substanz wird ein nichtpolares organisches Lösungsmittel als Nucleinsäureeluiermittel verwendet.
Wird für den Träger ein magnetisches Teilchen verwendet, kann die Bewegung und Abtrennung des Trägers günstigerweise unter Verwendung einer externen magnetischen Aktion, die ein einfacheres und schnelleres Verfahren ermöglicht, erfolgen.
Bei einem ziemlich geringen Gehalt des angestrebten Gens kann der Nachweis auch nach Amplifikation des Gens nach einem bekannten Verfahren erfolgen. Repräsentative Genamplifikationsverfahren sind Verfahren unter Einsatz von Enyzmen, beispielsweise die Polymerase-Kettenreaktions (PCR)-Methode. Für das Genamplifikationsverfahren geeignete Enzyme sind beispielsweise DNA-abhängige DNA-Polymerasen, wie DNA-Polymerase und Taq-Polymerase, DNA-abhängige RNA-Polymerasen, wie RNA-Polymerase I, RNA-abhängige RNA-Polymerasen, wie Q-Beta-Replikase. Unter den diese Enzyme verwendenden Methoden ist die Taq-Polymerase verwendende PCR-Methode eine ganz bequeme Methode, bei der die Amplifikation nur durch Steuern der Temperatur fortlaufend wiederholt werden kann.
Die so erhaltenen Proben (Nucleinsäurerohextrakt oder gereinigte Nucleinsäurelösung) werden zur Herstellung von Einzelsträngen thermisch bei einer Temperatur von 90 - 98ºC, vorzugsweise nicht unter 95 CC, denaturiert. Dann wird eine Elektrode mit (darauf) immobilisierter Nucleinsäuresonde oder eine optische Faser mit (darauf) immobilisierter Nude insäuresonde in die Lösung der einzelstrangigen Nucleinsäure gegeben und das Ganze bei einer Temperatur zwischen 37 und 72 ºC hybridisiert. Die optimale Hybridisierungstemperatur variiert in Abhängigkeit von Faktoren wie der Basensequenz und der Länge der verwendeten Sonde.
In derartigen Fällen ist die Reaktionsgeschwindigkeit im allgemeinen weniger zufriedenstellend als im Falle einer Reaktion in Lösung, da die Hybridisierungsreaktion in einer festen Phase erfolgt. Dieses Problem kann jedoch bei Einsatz einer Elektrode mit (darauf) immobilisierter Nucleinsäuresonde durch Anlegen eines Potentials an die Elektrodenoberfläche vor und/oder während der Hybridisierungsreaktion zur Beschleunigung der Reaktion beseitigt werden. Das anzulegende Potential ist vorzugsweise ein positives Potential oder es werden alternativ ein positives und negatives Potential angelegt. Das Potential wird kontinuierlich oder intermittierend gepulst angelegt. Vorzugsweise liegt das angelegte Potential im Bereich von 0 bis ± 2,0 V.
Bei der Hybridisierung kann nicht umgesetzte Nucleinsäure zusätzlich zum an die Nucleinsäuresonde gebundenen angestrebten Gen nichtspezifisch an der Elektrodenoberfläche adsorbieren. Diese nichtspezifische Adsorption kann das S/N- Verhältnis des Gennachweises reduzieren. Gewöhnlich ist die Nucleinsäure negativ geladen. Daher kann die nichtspezifisch adsorbierte Nucleinsäure durch Anlegen eines negativen Potentials an die Elektrode entfernt werden. Das hierfür anzulegende Potential liegt im Bereich von 0 bis 2,0 V, vorzugsweise 0 bis 1,5 V.
Die eine doppelsträngige Nucleinsäure erkennende Substanz kann der Testprobe entweder vor oder nach der Hybridisierung zugesetzt werden. Alternativ kann zuerst eine Lösung der eine doppelstrangige Nucleinsäure erkennenden Substanz hergestellt werden, in die die Elektrode oder optische Faser, auf der die Nucleinsäureprobe immobilisiert ist, nach der Hybridisierung gegeben werden kann. Da die meisten der eine doppelsträngige Nucleinsäure erkennenden Substanzen positiv geladen sind, kann die nichtspezifische Adsorption der erkennenden Substanz an den Träger durch Anlegen eines positiven Potentials in den Fällen, in denen der Träger eine Elektrode ist, unterdrückt werden.
Da die Elektrodenreaktion nur in der Nähe der Oberfläche der Elektrode erfolgt, kann ein Ansprechen des an die doppelsträngige Nucleinsäure gebundenen interkalierenden Mittels auf die Elektrode ausschließlich bei Auftreten der Hybridisierung erreicht werden. Bei Einsatz einer Elektrode mit (darauf) immobilisierter Nucleinsäuresonde kann ein Meß system aus Potentiostat, Funktionsgenerator und Recorder verwendet werden. Das Potential wird in der Nähe des Oxidationsreduktions-Potentials des interkalierenden Mittels eingestellt und dann abgetastet. Während des Abtastens wird der Oxidationsreduktionsstrom zur mengenmäßigen Bestimmung des nachzuweisenden Gens gemessen. Diese elektrochemische Messung kann in einer Testlösung oder in anderen Elekrolytlösungen erfolgen. Sie kann auch in hydrophilen oder hydrophoben Lösungsmitteln erfolgen.
Die Vorrichtungen mit einer auf einer Elektrode immobihsierten Nucleinsäuresonde, wobei die Immobilisierung der Nucleinsäuresonde an der Elektrode, wie oben ausgeführt, erfolgte, eignen sich als Gennachweissensoren. Zur wiederholten Verwendung derartiger Vorrichtungen als Gennachweissensoren ist eine Dissoziation der mit der immobilisierten Sonde hybridisierten Probe erforderlich. Die Dissoziation der Probe von der Sonde kann durch Behandlung mit Wärme, Basen, Säuren, Netzmitteln oder Ultraschall erfolgen. Die Wärmebehandlung kann durch Erwärmen der gebildeten doppelsträngigen Nucleinsäure auf 98ºC während 5 min zur Denaturierung der doppelsträngigen Nucleinsäure und anschließendes schnelles Kühlen erfolgen. Zur Alkalibehandlung werden eine Pufferlösung mit einem pH-Wert von 8,5 oder höher oder stark basische Lösungen, zur Säurebehandlung eine Pufferlösung mit einem pH-Wert von 4,5 oder niedriger oder stark saure Lösungen verwendet. Die bei der Behandlung mit Netzmitteln verwendeten Netzmittel können - jedoch nicht hierauf beschränkt - ionische oder neutrale Netzmittel, wie SDS, Triton-X und Tween 20, sein. Hierbei beträgt die Konzentration des Netzmittels vorzugsweise 0,1% oder mehr. Eine Ultraschallbehandlung kann durch Behandeln der Probe während einer Zeitspanne von einigen Sekunden bis zu mehreren Minuten mit Ultraschall der Frequenz 10 bis 100 kHz erfolgen.
Die erfindungsgemäßen Gennachweisverfahren werden in den folgenden Beispielen weiter beschrieben.

Beispiel 1

Gennachweis unter Verwendung einer Elektrode mit (darauf) immobilisierter Nucleinsäuresonde

a. Immobilisierung der Nucleinsäuresonde auf der Pt- Elektrodenoberfläche

Eine Platinelektrode wurde zur Luftoxidation der Elektrodenoberfläche bei einer hohen Temperatur behandelt. Nach Aktivierung der Oberfläche der Oxidschicht durch Bromcyan (CNBR) wurde die Immobilisierung durch Eintauchen der Elektrode in eine Lösung der thermisch denaturierten einzelsträngigen Nucleinsäuresonde (v-myc) durchgeführt.

b. Gennachweis unter Verwendung der Elektrode mit (darauf) immobilisierter Nucleinsäuresonde

Als Testprobe wurde pVM623, das durch Einfügen des v-myc- Fragments an der Stelle pst 1 von pUC 119 erhalten wurde, verwendet. Lineares pVM 623 wurde durch Verdauen mit Hind III erhalten und dann der thermischen Denaturierung bei 98ºC unterzogen. Die Elektrode mit der (darauf) immobilisierten Nucleinsäuresonde wurde in die Testprobe gegeben. Das Ganze wurde zur Reassoziation 15 min bei 70ºC inkubiert. Während dieses Vorgangs wurde Acridinorange, ein interkalierendes Mittel, das Spezifität gegenüber doppelstrangiger DNA aufweist und elektrochemisch aktiv ist, zugegeben.
Nach der Reassoziation wurde die Elektrodenreaktion bewirkt, wobei der zur mengenmäßigen Bestimmung des in der Testprobe enthaltenen v-myc erzeugte Oxidationsreduktionsstrom bestimmt wurde. Demzufolge konnte v-myc in der Größenordnung von pg (Pikogramm) nachgewiesen werden.

Beispiel 2

Gennachweis unter Verwendung der Elektrode mit darauf immobilisierter Nucleinsäuresonde und unter Verwendung eines Metallinterkalators als interkalierendem Mittel
Als Testprobe wurde pVM 623, das durch Einfügen des v-myc- Fragments an der Stelle Pst I von pUC 119 erhalten wurde, verwendet. Lineares pVM 623 wurde durch Verdauen mit Hind III erhalten und dann einer thermischen Denaturierung bei 98ºC unterzogen. Die Elektrode mit der (darauf) immobilisierten Nucleinsäuresonde wurde in die Testprobe gegeben. Das Ganze wurde 15 min bei 70ºC zur Reassoziation inkubiert. Während dieses Vorgangs wurde Tris(1,10-phenanthrolin)kobalt(III), ein interkalierendes Mittel, das Spezifität gegenüber doppelsträngiger DNA aufweist und elektrochemisch aktiv ist, zugegeben.
Nach der Reassoziation wurde zyklische Voltammetrie durchgeführt. Die bei 3omaligem Durchlauf erhaltenen Werte wurden für den Oxidationsreduktionsstrom aufsummiert. Danach konnte v-myc in der Größenordnung von pg nachgewiesen werden.

Referenzbeispiel 1

Mengenmäßige Bestimmung einer Nucleinsäuresonde auf einer BPPG-Elektrode

a. Einführung einer Aminogruppe in die Nucleinsäuresonde

Ein DNA-Markierkit, Chemiprobe (ORGENICS Ltd.), wurde zur Markierung des karzinogenen Gens v-myc (1,5 Kb) verwendet. In das Gen wurde anschließend (6-Aminohexyl)-DATP am 3'- Ende unter Verwendung von terminaler Desoxynudeotidyl-Transferase eingeführt.

b. Immobilisierung der Nucleinsäuresonde auf der Elektrodenoberfläche

Als Elektrode, auf der die Nucleinsäure immobilisiert werden soll, wurde eine Elektrode mit einer Basisfläche aus pyrolytischem Graphit (BPPG) verwendet. Diese Elektrode wurde zur Oxidation der Oberfläche bei 2,2 V in einer 10% Salpetersäure und 2,5% Kaliumchromat enthaltenden Lösung einer Elektrolyse unterzogen. Die Elektrode, deren Oberfläche oxidiert worden war, wurde dann 30 min bei 120ºC in eine unter Rückfluß erhitzte Lösung von 10% Gammaaminopropyltriethoxysilan in Toluol zur Silanbehandlung gegeben. Die Elektrode wurde mit Methanol gewaschen und dann 30 min lang in einer 1%igen Glutaraldehydlösung umgesetzt und nochmals gewaschen. Die Elektrode wurde in einer Lösung mit 1 µg/ml v-myc mit eingeführter Aminogruppe 30 min lang bei Raumtemperatur umgesetzt, wobei eine Elektrode mit (darauf) immobilisierter Nucleinsäuresonde hergestellt wurde.

c. Mengenmäßige Bestimmung der auf der Elektrodenoberfläche immobilisierten Nucleinsäuresonde

Unter Verwendung der so erhaltenen Elektrode mit der (darauf) immobilisierten Nucleinsäuresonde wurde in einer 1/15 M Phosphatpufferlösung (pH-Wert: 7,0) zyklische Voltammetrie durchgeführt. Hierbei wurde von der Elektrode, die 10 s lang oxidiert worden war, ein von Adenin erzeugter Oxidationsstrom von 1 µA gemessen, wohingegen von der Elektrode, die 60 s lang oxidiert worden war, ein Oxidationsstrom von 2 µA gemessen wurde. Die Bestimmung der Mengen an auf den Oberflächen dieser Elektroden immobilisierter Nucleinsäure unter Verwendung des Chemiprobe-Kits ergab 0,1 pmol/cm² bzw. 0,2 pmol/cm². Diese Ergebnisse zeigten, daß eine Korrelation zwischen den Oxidationsströmen der Nucleinsäuren und den Mengen der immobilisierten Nucleinsäuresonde besteht und daß die immobilisierte Nucleinsäuresonde auf der Basis der Elektrodenreaktion der Nucleinsäure mengenmäßig bestimmt werden kann.

Beispiel 3

Beschleunigung der Hybridisierung einer Nucleinsäureprobe mit einer auf der Elektrode immobilisierten Nucleinsäuresonde

Als Testprobe wurde pVM 623, das durch Einfügen des v-myc- Fragments an der Stelle Pst 1 von pUC 119 erhalten wurde, verwendet. Lineares pVM 623 wurde durch Verdauen mit Hind III erhalten und anschießend bei 98ºC der thermischen Denaturierung unterzogen. Dann wurde die BPPG-Elektrode mit darauf immobilisierter Nucleinsäuresonde in die Testprobe gegeben. Das Ganze wurde 15 min bei 70ºC zur Reassoziation inkubiert. Während dieses Vorgangs wurde an die Elektrode ein Potential von 0,1 V (vs SCE) angelegt.
Dann wurde Acridinorange, das Spezifität gegenüber doppelsträngiger DNA aufweist und elektrochemisch aktiv ist, zum Bewirken der Elektrodenreaktion zugegeben, wobei der erzeugte Oxidationsreduktionsstrom zur mengenmäßigen Bestimmung des in der Testprobe enthaltenen v-myc gemessen wurde. Hierbei konnte v-myc in der Größenordnung von pg nachgewiesen werden. Die zur Hybridisierung erforderliche Zeit, die üblicherweise etwa 30 min betrug, war auf etwa 10 min verringert.

Beispiel 4

Regeneration der Elektrode mit (darauf) immobilisierter Nucleinsäuresonde

a. Immobilisierung der Nucleinsäuresonde auf der Pt- Elektrodenoberfläche

Eine Platinelektrode wurde zur Luftoxidation der Elektrodenoberfläche bei hoher Temperatur behandelt. Nach Aktivierung der Oberfläche der Oxidschicht durch Bromcyan (CNBR) wurde die Immobilisierung durch Eintauchen der Elektrode in eine thermisch denaturierte einzelsträngige Nucleinsäuresonde (v-myc) enthaltende Lösung durchgeführt.

b. Gennachweis unter Verwendung der Elektrode mit darauf immobilisierter Nucleinsäuresonde

Als Testprobe wurde pVM 623, das durch Einführen des v-myc Fragments an der Stelle Pst 1 von pUC 119 erhalten wurde, verwendet. Lineares pVM 623 wurde durch Verdauen mit Hind III erhalten und dann bei 98ºC der thermischen Denaturierung unterzogen. Die Elektrode miü der (darauf) immobilisierten Nucleinsäuresonde wurde in die Testprobe gegeben. Das Ganze wurde zur Reassoziation 15 min lang bei 70ºC inkubiert. Während dieses Vorgangs wurde Acridinorange, ein interkalierendes Mittel, das Spezifität gegenüber doppelsträngiger DNA aufweist und elektrochemisch aktiv ist, zugegeben.
Nach der Reassoziation wurde die Elektrodenreaktion bewirkt, wobei der zur mengenmäßigen Bestimmung des in der Testprobe enthaltenen v-myc erzeugte Oxidationsreduktionsstrom bestimmt wurde. Hierbei konnte v-myc in der Größenordnung von pg nachgewiesen werden.

c. Regeneration der Elektrode mit (darauf) immobilisierter Nucleinsäuresonde

Durch 5-minütiges Erhitzen der Elektrode mit (darauf) immobilisierter Nucleinsäuresonde, die vorher zur Messung verwendet worden war, bei 98ºC wurde die Probe pVM 623 von der Oberfläche der Elektrode mit der (darauf) immobilisierten Nucleinsäuresonde abdissoziert. Die so regenerierte Elektrode konnte wiederholt (danach noch mindestens 5mal) zum Gennachweis wiederverwendet werden.

Beispiel 5

Gennachweis unter Verwendung eines interkalierenden Mittels, an das eine direkt oder indirekt nachweisbare Signale erzeugende Substanz gebunden ist.

a. Herstellung einer Elektrode mit (darauf) immobilisierter Nucleinsäuresonde

(6-Aminohexyl)-DATP wurde unter Verwendung von terminaler Desoxynucleotidyl-Transferase am 3'-Ende in synthetische Oligonucleotidsonde (20 mer) für ein karzinogenes Gen v-myc eingeführt.
Andererseits wurde eine Elektrode mit einer Basisfläche aus pyrolytischem Graphit (BPPG) zur Oxidation der Oberfläche der BPPG-Elektrode bei 2,2 V in einer 10% Salpetersäure und 2,5% Kaliumchromat enthaltenden Lösung einer Elektrolyse unterzogen. Die Elektrode wurde dann für 30 min bei 120ºC zur Silanbehandlung in eine unter Rückfluß erhitzte Lösung von 10% Gamma-APTES in Anilin gegeben. Nach dem Waschen der Elektrode mit Methanol wurde sie 30 min lang in 1%iger Glutaraldehydlösung umgesetzt und nochmals gewaschen.
Diese BPPG-Elektrode wurde in einer Lösung mit 1 µg/ml synthetischer Oligonucleotidsonde, die Spezifität gegenüber v-myc aufweist und in die eine Aminogruppe eingeführt wurde, min lang bei Raumtemperatur umgesetzt, wobei eine Elektrode mit der (darauf) immobilisierten Nucleinsäuresonde hergestellt wurde.

Als Testprobe wurde pVM 623, das durch Einfügen des v-myc- Fragments an der Stelle Pst I von pUC 119 erhalten wurde, verwendet. Lineares pVM 623 wurde durch Verdauen mit Hind III erhalten und dann bei 98ºC der thermischen Denaturierung unterzogen. Die BPPG-Elektrode mit der (darauf) immobilisierten Nucleinsäuresonde wurde in die Testprobe gegeben. Das Ganze wurde zur Reassoziation bei 70ºC inkubiert. Danach wurde an Ferrocen gebundenes Acridinorange in einer zum Erreichen einer Endkonzentration von 1 ijm ausreichenden Menge zugegeben. Nach dem Waschen wurde direkt die Elektrodenreaktion durchgeführt, wobei der Oxidationsreduktionsstrom zur mengenmäßigen Bestimmung des in der Probe enthaltenen v-myc gemessen wurde.
Wenn die Probe das angestrebte Gen nicht enthielt, wurde kein Oxidationsreduktionsstrom für Ferrocen nachgewiesen. Enthielt die Probe jedoch das angestrebte Gen, so konnte der Oxidationsreduktionsstrom nachgewiesen werden und letztendlich v-myc in der Größenordnung von pg. Da eine B/F-Trennung nicht erforderlich war, war der Nachweis innerhalb von 30 min durchgeführt.

Beispiel 6

Gennachweis unter Verwendung eines interkalierenden Mittels, an das eine direkt oder indirekt nachweisbare Signale erzeugende Substanz gebunden ist
Zuerst wurde die Elektrode mit (darauf) immobilisierter Nucleinsäuresonde ähnlich Beispiel 10 hergestellt und dann zur Verhinderung nichtspezifischer Adsorption der Proben-DNA in eine Lösung von Nucleotiden (dATP, dCTP, dGTP und dTTP) getaucht.
Als Testprobe wurde pVM 623, das durch Einfügen des v-myc- Fragments an der Stelle Pst I von pUC 119 erhalten wurde, verwendet. Lineares pVM 623 wurde durch Verdauen mit Hind III erhalten und anschließend bei 98ºC der thermischen Denaturierung unterzogen. Die BPPG-Elektrode mit (darauf) immobilisierter Nucleinsäuresonde wurde in die Testprobe gegeben. Das Ganze wurde zur Reassoziation bei 70ºC inkubiert. Während dieses Vorgangs wurde ein Potential von 0,1 V (vs SCE) an die Elektrode angelegt.
Nach der Reaktion wurde ein interkalierendes Mittel, das Spezifität gegenüber doppelsträngiger DNA aufweist und elektrochemisch aktiv ist, d.h. Tris(phenanthrolin)kobaltsalz, zugegeben. Nach der Bindung von Tris(phenanthrolin)kobaltsalz an die doppelsträngige Nucleinsäure wurde auf die Elektrode eine negative Ladung appliziert, um die nichtspezifisch bindenden Substanzen zu entfernen. Danach wurde der Oxidationsreduktionsstrom des interkalierenden Mittels zur mengenmäßigen Bestimmung des in der Testprobe enthaltenen v-myc gemessen. Hierbei konnte v-myc in der Größenordnung von pg nachgewiesen werden.

Referenzbeispiel 2

Immobilisierung auf der Elektrodenoberfläche über eine über die Nucleinsäuresonde eingeführte Aminogruppe

a. Herstellung der Nucleinsäuresonde, in die die Aminogruppe eingeführt wird

Zwei zur Amplifikation eines etwa 1,0-Kb-Fragments des karzinogenen Gens v-myc verwendete Starter (20 mer) wurden unter Einsatz eines DNA-Synthesizers (Applied biosystem, PCR-MATE EP) synthetisiert. Unter Einsatz von Aminolink 2 (Applied biosystem) wurde ferner bei einem der Starter am 5'-Ende eine Aminogruppe eingeführt.
Diese beiden synthetischen Starter wurden jeweils mit der Konzentration 100 µg/ml gemischt und 5 min bei 95ºC und danach 30 min bei 37ºC zur Reassoziation behandelt, wobei eine doppel strangige Nucleinsäuresonde erhalten wurde.

b. Immobilisierung der Nucleinsäuresonde auf der Elektrodenoberfläche

Als Elektrode, auf der die Nucleinsaure immobilisiert werden sollte, wurde eine Elektrode mit einer Basisfläche aus pyrolytischem Graphit (BPPG) verwendet. Diese Elektrode wurde zur Oxidation der Oberfläche bei 2,2 V in einer 10% Salpetersäure und 2,5% Kaliumchromat enthaltenden Lösung der Elektrolyse unterzogen. Die Elektrode, deren Oberfläche oxidiert worden war, wurde dann zur Silanbehandlung 30 min bei 120ºC in eine unter Rückfluß erhitzte Lösung von 10% Gamma- APTES in Anilin gegeben. Die silanbehandelte Elektrode wurde mit Methanol gewaschen, dann 30 min lang mit 1%iger Glutaraldehydlösung umgesetzt und nochmals gewaschen.
Diese BPPG-Elektrode wurde in einer Lösung mit 100 11,g/ml doppelstrangiger Nucleinsäuresonde, die in Stufe a hergestellt worden war, 30 min lang bei Raumtemperatur umgesetzt, wobei die doppelsträngige Nucleinsäure auf der Oberfläche der Elektrode immobilisiert wurde. Dann wurde die Elektrode weiterhin zur Entfernung der DNA-Kette ohne eingefügte funktionelle Gruppe 5 min lang bei 95ºC thermisch denaturiert, wobei eine Elektrode mit (darauf) immobilisierter Nucleinsäuresonde hergestellt wurde.

Beispiel 7

Gennachweis unter Verwendung einer Elektrode mit (darauf) über eine Lipidmembran immobilisierter Nucleinsäuresonde

a. Herstellung einer Elektrode mit (darauf) immobilisierter Nucleinsäuresonde

Unter Verwendung von Phosphatidylethanolamin wurde auf der Oberfläche einer Elektrode mit einer Basisfläche aus pyrolytischem Graphit (BPPG) eine Lipidmembran gebildet. Andererseits wurde unter Verwendung von terminaler Desoxynucleotidyl-Transferase (6-Aminohexyl)-DATP am 3'-Ende in das karzinogene Gen v-myc (1,5 Kb) eingeführt.
Nach dem Behandeln der Lipidmembran-modifizierten BPPG-Elektrode mit Glutaraldehyd wurde diese in der 1 µg/ml-Lösung von v-myc, in das die Aminogruppe eingeführt worden war, 30 min lang bei Raumtemperatur umgesetzt, wobei eine Elektrode mit (darauf) immobilisierter Nucleinsäuresonde hergestellt wurde.

Als Testprobe wurde das Plasmid pVM 623, das durch Einführen von v-myc (1,5 Kb) an der Stelle Pst I von pUC 199 erhalten wurde, verwendet.
Die Testprobe wurde bei 95ºC thermisch denaturiert. Dann wurde die in Stufe a hergestellte Elektrode mit (darauf) immobilisierter Nucleinsäure in die Probe gegeben, um bei 55ºC eine Hybridisierung zu bewirken. Die Messung des Membranpotentials der Elektrode mit der darauf immobilisierten Nucleinsäure begann vor dem Start der Hybridisierung. Das Membranpotential veränderte sich mit fortschreitender Hybridisierung und bildete etwa 2 h nach dem Start der Reaktion ein Plateau. So kann bei Verwendung der Elektrode mit (darauf) über die Membran immobilisierter Nucleinsäuresonde das Gen bei Überwachung der Hybridisierungsreaktion nachgewiesen werden. Hierbei konnte das angestrebte Gen in der Größenordnung von pg nachgewiesen werden.

Beispiel 8

Gennachweis unter Verwendung einer Elektrode, auf der eine Nucleinsäuresonde immobilisiert ist und die durch synthetische Oligonudeotide blockiert ist.

a. Herstellung einer Elektrode mit (darauf) immobilisierter Nucleinsäuresonde

(6-Aminohexyl)-DATP wurde unter Verwendung terminaler Desoxinucleotidyl-Transferase am 3'-Ende in eine synthetische Oligonucleotidsonde (20 mer) für ein karzinogenes Gen v-myc eingeführt.
Andererseits wurde zur Oxidation der Elektrodenoberfläche eine BPPG-Elektrode bei 2,2 V in einer 10% Salpetersäure und 2,5% Kaliumchromat enthaltenden Lösung der Elektrolyse un terzogen. Die Elektrode, deren Oberfläche oxidiert worden war, wurde dann zur Silanbehandlung 30 min lang bei 120ºC in eine unter Rückfluß erhitzte Lösung von 10% Gamma-APTES in Anilin gegeben. Die silanbehandelte Elektrode wurde mit Methanol gewaschen und dann 30 min lang in 1%iger Glutaraldehydlösung umgesetzt und nochmals gewaschen.
Diese Elektrode wurde 30 min lang bei Raumtemperatur in einer Lösung mit 1 µg/ml der Sonde, in die die Aminogruppe eingeführt worden war, umgesetzt, wobei eine Elektrode mit (darauf) immobilisierter Nucleinsäuresonde hergestellt wurde.
Diese Elektrode wurde zur Adsorption des synthetischen Nucleotids auf der Oberfläche der Elektrode in eine Lösung des synthetischen Nucleotids (20 mer) getaucht.

b. Gennachweis unter Verwendung einer Elektrode mit (darauf) immobilisierter Nucleinsäuresonde

Als Testprobe wurde pVM 623, das durch Einfügen des v-myc Fragments an der Stelle Pst I von pUC 119 erhalten wurde, verwendet. Lineares pVM 623 wurde durch Verdauen mit Hind III erhalten und dann bei 98ºC der thermischen Denaturierung unterzogen. Die in Stufe a hergestellte BPPG-Elektrode mit (darauf) immobilisierter Nucleinsäuresonde wurde in die Testprobe gegeben, die dann zur Reassoziation bei 70ºC inkubiert wurde. Dann wurde ein interkalierendes Mittel, Acridinorange, das spezifisch an doppelsträngige Nucleinsäure bindet und Elektrodenaktivität aufweist, zugegeben und anschließend die Elektrodenreaktion durchgeführt, wobei der erzeugte Oxidationsreduktionsstrom zur mengenmäßigen Bestimmung des in der Testprobe enthaltenen v-myc gemessen wurde.
Hierbei konnte v-myc in der Größenordnung von pg nachgewiesen werden. Das beobachtete S/N-Verhältnis war größer als das der Elektrode, deren Oberfläche nicht blockiert war.

Beispiel 9

Amplifikation und Nachweis des angestrebten Gens

a. Amplifikation des angestrebten Gens

Als Testprobe wurde pVM 623 (4,6 Kb), das durch Einfügen des v-myc-Fragments an der Stelle Pst I von pUC 119 erhalten wurde, verwendet. Lineares pVM 623 wurde durch Verdauen mit Hind III erhalten. Dann wurde die Konzentration auf 1 Femtomol (10&supmin;¹&sup5; mol) eingestellt. Die Probe wurde der PCR unter den im folgenden angegebenen Bedingungen als einem Zyklus unterzogen. Der Zyklus wurde 30mal zur Amplifikation des 1-Kb-Fragments von v-myc wiederholt.
Denaturierung: 94ºC während 1 min
Starterreassoziation: 55ºC während 1 min
DNA-Elongation: 72ºC während 1 min

Die durch PCR amplifizierte Probe wurde bei 98ºC thermisch denaturiert. Die BPPG-Elektrode mit darauf immobilisierter Nucleinsäuresonde wurde in die Probe gegeben. Das Ganze wurde dann zur Reassoziation 15 min lang bei 70ºC inkubiert. Während dieses Vorgangs wurde Acridinorange, ein interkaherendes Mittel, das Spezifität gegenüber doppelsträngiger Nucleinsäure und Elektrodenaktivität aufweist, zur Probe gegeben. Dann wurde die Elektrodenreaktion ausgeführt, wobei der erzeugte Oxidationsreduktionsstrom zur mengenmäßigen Bestimmung des in der Probe enthaltenen v-myc gemessen wurde. Hierbei konnte das Vorhandensein von v-myc bestätigt werden.

Beispiel 10

Gennachweis mit Hemmung einer nichtspezifischen Adsorption von Nucleinsäuren an einer Elektrode mit (darauf) immobilisierter Nucleinsäuresonde

Als Testprobe wurde pVM 623, das durch Einführen des v-myc Fragments an der Stelle Pst I von pUC 119 erhalten wurde, verwendet. Lineares pVM 623 wurde durch Verdauen mit Hind III erhalten und dann bei 98ºC der thermischen Denaturierung unterzogen. Die BPPG-Elektrode mit (darauf) immobilisierter Nucleinsäuresonde wurde in die Testprobe gegeben. Das Ganze wurde zur Reassoziation bei 70ºC inkubiert. Nach der Reassoziation wurde zur Entfernung von auf der Elektrodenoberfläche nichtspezifisch und physikalisch adsorbierter DNA an die Elektrode ein Potential von -1,5 V (vs SCE) angelegt.
Dann wurde Acridinorange, ein interkalierendes Mittel, das Spezifität gegenüber doppelsträngiger DNA und Elektrodenaktivität aufweist, zugegeben und anschließend die Elektrodenreaktion durchgeführt. Der erzeugte Oxidationsreduktions strom wurde zur mengenmäßigen Bestimmung des in der Probe enthaltenen v-myc gemessen. Hierbei konnte v-myc in der Größenordnung von pg mit einem im Vergleich zu üblichen bekannten Ergebnissen verbesserten S/N-Verhältnis nachgewiesen werden.

Beispiel 11

Als Testprobe wurde pVM 623, das durch Einführen des v-myc- Fragments an der Stelle Pst I von pUC 119 erhalten wurde, verwendet. Lineares pVM 623 wurde durch Verdauen mit Hind III erhalten und dann bei 98ºC der thermischen Denaturierung unterzogen. Eine BPPG-Elektrode, auf der die zu v-myc zu 50% homologe Nucleinsäuresonde (20 mer) immobilisiert ist, und eine Elektrode, auf der die Nucleinsäuresonde für v-myc immobilisiert ist, wurden in der Testprobe plaziert. Das Ganze wurde zur Reassoziation bei 70ºC inkubiert.
Dann wurde Acridinorange, ein interkalierendes Mittel, das Spezifität gegenüber doppelsträngiger DNA und Elektrodenaktivität aufweist, zugegeben und anschließend die Elektrodenreaktion durchgeführt. Der erzeugte Oxidationsreduktionsstrom wurde zur mengenmäßigen Bestimmung des in der Probe enthaltenen v-myc gemessen.
Nach dieser Elektrodenreaktion wurde zur Entfernung der Nucleinsäure mit geringerer Homologie an die Elektrode ein Potential von -1,0 V (vs SEC) angelegt. Danach wurde Acridinorange in ähnlicher Weise wie im vorhergehenden zugegeben. Anschließend wurde die Elektrodenreaktion durchgeführt, wobei der erzeugte Oxidationsreduktionsstrom gemessen wurde. Die Ergebnisse zeigten, daß der über das interkalierende Mittel nachgewiesene Oxidationsreduktionsstrom bei Verwendung der Probe mit 50%iger Homologie etwa 50% des bei Verwendung der Probe mit 100%iger Homologie beobachteten Stroms betrug. Damit ist geklärt, daß unter Verwendung dieses Verfahrens Genvarianten nachgewiesen werden können.

Referenzbeispiel 3

Extraktion einer Nucleinsäure unter Verwendung eines Trägers, auf dem eine doppelstrangige Nucleinsäure erkennende Substanz immobilisiert ist
Bei diesem Beispiel wurden als Träger Magnetitteilchen mit einer Teilchengröße von 10 µm und als eine doppelsträngige Nucleinsäure erkennende Substanz Aminoacridin verwendet.
Zuerst wurden die Magnetitteilchen sorgfältig mit PBS gewaschen und 2 h lang bei 120ºC in eine unter Rückfluß erhitzte Lösung von 10% 3-Aminopropyltriethoxysilan in Toluol gegeben. Dann wurde mit Methanol gewaschen. Danach wurde eine 1%ige Glutaraldehydlösung mit den Teilchen umgesetzt. Auf diese wurde anschließend Aminoacridin immobilisiert.
Humanleukozyten wurden als Testprobe verwendet. Die Leukozyten und die magnetischen Teilchen mit darauf immobilisiertem Aminoacridin wurden in einem Plastikgefäß gemischt und dieses durch einen Wirbelmischer kräftig gerührt, um gleichzeitig sowohl ein Aufbrechen der Zellen als auch ein Immobilisieren der Nucleinsäure auf dem Träger zu bewirken. Danach wurde ein Magnet zum externen Applizieren eines Magnetfeldes auf die Magnetitteilchen und dadurch Trennen der Teilchen angewandt. Die Teilchen wurden dreimal mit einer 200 mM NaCl enthaltenden 10 mM Trispufferlösung (pH-Wert: 7,0) gewaschen. Nach dem Waschen wurden die Teilchen in 70%iges Ethanol zum Eluieren der Nucleinsäure gegeben.
Die erhaltene Nucleinsäure wurde auf 1%igem Agarosegel der Elektrophorese unterworfen, wobei Nucleinsäurefragmente mit Kb oder größer, die mit einem Restriktionsenzym gespalten werden konnten, erhalten wurden. Das gesamte Verfahren konnte innerhalb von 1 h abgeschlossen werden.
Wie im Vorherigen genau angegeben, kann der Gennachweis unter Verwendung einer Nucleinsäuresonde erfindungsgemäß in geeigneter Weise innerhalb einer verkürzten Zeitspanne durchgeführt werden. Daher liefert die vorliegende Erfindung ein äußerst geeignetes Verfahren zum Nachweis eines bestimmten Gens auf dem Gebiet der Gendiagnose und Gentechnologie.
Eine erfindungsgemäße geeignete Gennachweisapparatur umfaßt:
einen Gennachweissensor mit einer auf der Oberfläche eines gegenüber physikalischen Änderungen empfindlichen Trägers immobilisierten Nucleinsäuresonde;
eine Transportvorrichtung zum Transportieren des Gennachweissensors;
ein Reaktionsgefäß zur Aufbewahrung einer Probelösung, die die zu einer einzeistrangige Form denaturierte Genprobe enthält, wobei im Reaktionsgefäß auf dem Gensensor durch Hybridisierung der Genprobe und der auf der Oberfläche des Gensensors immobilisierten Nucleinsäuresonde eine doppelsträngige Nucleinsäure gebildet wird;
eine Temperatursteuereinheit zur Steuerung der Temperatur der Probenlösung;
eine Waschvorrichtung zur Entfernung von nicht umgesetzter Genprobe durch Waschen des Gensensors nach der Hybridisierung der Nucleinsäuresonde mit der Genprobe; und
ein Nachweisgefäß zur Aufbewahrung einer doppelsträngige Nucleinsäure erkennenden Substanz, wobei die doppelsträngige Nucleinsäure erkennende Substanz mit der auf der Oberfläche des Gensensors im Nachweisgefäß gebildeten doppelsträngigen Nucleinsäure reagiert, wobei sich die doppelsträngige Nuleinsäure erkennende Substanz an die doppelsträngige Nucleinsäure bindet, so daß dadurch eine durch die gebundene doppelsträngige Nucleinsäure erkennende Substanz erzeugte physikalische Veränderung registriert wird.
Der in der Gennachweisapparatur verwendete Gensensor kann vorzugsweise entweder die Elektrode oder die optische Faser mit (darauf) immobilisierter Nucleinsäuresonde, die im vorhergehenden genannt wurde, sein. Dieser Gensensor kann fer ner mit der Funktion eines Rührers, indem er diesen in Form eines Paddels bildet oder mit der Funktion eines Temperatursensors ausgerüstet sein.
Die durch den Gensensor registrierten physikalischen Verän derungen, beispielsweise ein elektrochemisches oder optisches Signal, wurden direkt oder über entsprechende Kontrolleinheiten gemessen und dann mittels Computer weiter analysiert.
Im Reaktionsgefäß wurde eine die zu einem Einzelstrang denaturierte Genprobe enthaltende Probenlösung aufbewahrt. Als Probenlösung kann der durch Aufbrechen der Zellen erhaltene Rohextrakt der Nucleinsäuren als solcher oder nach der Reinigung verwendet werden. Eine Vorrichtung zur Herstellung einer Probenlösung, die derartige Roh- oder gereinigte Extrakte der Nucleinsäure bereiten kann, kann mit dem Reaktionsgefäß verbunden sein. Die in situ aus den Testzellen hergestellte Probenlösung kann in das Reaktionsgefäß gespeist werden, womit ein vollautomatischer Gennachweis vom Beginn der Herstellung der Probenlösung aus den Testzellen an möglich wird. Die Vorrichtung zur Herstellung der Probenlösung kann beispielsweise eine Einwegkartusche, die nach dem Ende der Messung gegen eine neue Kartusche ausgetauscht werden kann, sein. Bei Verwendung der frei ersetzbaren Kartusche kann die Probenlösung immer unter sauberen Bedingungen ohne Waschen hergestellt werden.
Die Gennachweisapparatur kann ferner mit einer Dissoziationseinheit, mittels derer auf der Oberfläche des Gensensors gebildete doppelsträngige Nucleinsäure in die auf der Gensensoroberfläche immobilisierte Nucleinsäuresonde und die zur Regenerierung des Gensensors entfernte freie einzelsträngige Genprobe dissoziiert wird, ausgerüstet werden. Eine derartige Dissoziationseinheit ist zum Zwecke der Automatisierung der Nachweisapparatur sehr erwünscht, da die Dissoziationseinheit die wiederholte Verwendung des Gensensors ermöglicht. Für die vorliegende Gennachweisapparatur sind als Dissoziationsmaßnahmen die genannten Behandlungen mit Wärme, Basen, Säuren, Netzmitteln und Ultraschall geeignet.
Ferner kann die Gennachweisapparatur einen oder mehrere Sensor(en) mit jeweils (darauf) immobilisierten unterschiedlichen Nucleinsäuresonden verwenden. Diese Gensensoren können auf einmal zur Bestimmung einer oder mehrerer Einzelheiten verwendet werden, oder einige der Gensensoren können für eine bestimmte Auswahl der nachzuweisenden Einzelheiten ausgelegt sein.
Ein Verfahren zum Gennachweis unter Verwendung der genannten Gennachweisapparatur wird im folgenden mit bezug auf die Zeichnungen beschrieben.
Fig. 1 ist die schematische Darstellung eines Beispiels für die automatische Gennachweisapparatur. Diese Apparatur umfaßt drei Gefäße, nämlich das Reaktionsgefäß 2, das Nachweisgefäß 9 und das Dissoziationsbehandlungsgefäß 11. Das Reaktionsgefäß 2 ist in der Temperatursteuereinheit 3 angebracht und mit dem Abfalltank 10 verbunden und läßt sich entlang der Schiene 4 in horizontaler Richtung bewegen. Das Reaktionsgefäß 2 ist mit der Genprobenreinigungseinheit 1 in einer bestimmten Position auf Schiene 4 verbunden. Der Gensensor 5 ist an der Transportvorrichtung 12 befestigt, durch die ein horizontaler Transport zur Position über dem jewei ligen Tank und ein vertikaler Transport in den jeweiligen Tank hinein erfolgt. Als Gensensor wird eine Elektrode mit darauf immobilisierter Nucleinsäuresonde verwendet. Die durch diese Elektrode registrierten elektrischen Signale werden über die Regeleinheit 6 zur Erfassung elektrischer Signale in den Computer 7 eingegeben, mit welchem die Signale analysiert werden.
Das Verfahren zum Gennachweis unter Verwendung dieser Apparatur verläuft wie folgt. Zuerst wird eine die nachzuweisende Nucleinsäure enthaltende Testzelle in die Genprobenreinigungseinheit 1 gegeben, in welcher eine Testlösung, die die in Einzeistränge denaturierten Genproben enthält, hergestellt wird. Die so hergestellte Probenlösung wird in das Reaktionsgefäß 2 gespeist, welches dann entlang Schiene 4 an die vorbestimmte Position transportiert wird. Nach dem horizontalen Transport des Gensensors 5 an die Position oberhalb des Reaktionsgefäßes 2 wird dieser in das Reaktionsgefäß geführt. Nach dem Eintauchen des Gensensors 5 in die Probenlösung im Reaktionsgefäß 2 wird die Temperatur der Probenlösung durch die Temperatursteuereinheit 3 in geeigneter Weise gesteuert. Dann werden die auf der Oberfläche des Gensensors immobilisierte Nucleinsäuresonde und die in der Probenlösung enthaltene Genprobe hybridisiert. Nach Beendigung der Hybridisierung wird der Gensensor 5 aus der Probenlösung genommen und zur Entfernung von nicht umgesetzter Nucleinsäuresonde mit aus dem Waschflüssigkeitsgefäß 8 zugeführter Flüssigkeit gewaschen und dann horizontal zur Position oberhalb des Nachweisgefäßes 9 transportiert. Nach der Entfernung des Gensensors 5 wird das Reaktionsgefäß 2 wieder an die Position gebracht, in der es mit der Genprobenreinigungseinheit 1 verbunden ist, und die (darin) enthaltene Probenlösung wird in den Abfalltank ausgetragen. Der zur Position oberhalb des Nachweisgefäßes 9 transportierte Gensensor 5 wird dann in das Nachweisgefäß 9 geführt. Im Nachweisgefäß 9 wird eine Lösung mit einer eine doppelsträngige Nuleinsäure erkennenden Substanz aufbewahrt. Die eine doppeltrangige Nucleinsäure erkennende Substanz erkennt die auf der Oberfläche des Gensensors 5, der in die Lösung getaucht ist, gebildete doppelsträngige Nucleinsäure und bindet an diese. Das durch die eine doppelsträngige Nucleinsäure erkennende an die Oberfläche gebundene Substanz erzeugte elektrochemische Signal wird durch den Gensensor 5 erfaßt und durch die Regeleinheit 6 zur Erfassung elektrischer Signale gesteuert und dann zur Analyse in den Computer 7 gegeben. Nach der Messung wird der Gensensor 5 aus dem Nachweisgefäß 9 entfernt und in das Dissoziationsbehandlungsgefäß 11 transportiert. Im Dissoziationsbehandlungsgefäß 11 werden die auf der Oberfläche des Gensensors 5 gebildeten Doppelstränge zur Regeneration des Gensensors 5 dissoziiert.
Das genannte Reaktionsgefäß 2 muß kein Einzelgefäß sein. Es kann auch, wie in Fig. 2 angegeben, eine Kombination aus einem oder mehreren kleinen Gefäßen 13 verwendet werden. Bei Verwendung von einem oder mehreren dieser kleinen Gefäße und einem oder mehreren Gensensoren 5 können eine oder mehrere Proben auf einmal gemessen werden. In diesem Fall können auch unabhängige kleine Tanks 13 mit der gleichen Anzahl von Genprobenreinigungseinheiten 1 zur gleichzeitigen Herstellung einer Vielzahl von Proben kombiniert werden, womit die Effizienz der Bestimmung gesteigert wird.
Die Messung kann auch ohne das Entfernen von nicht umgesetzten Nucleinsäureproben und eine doppelsträngige Nucleinsäure erkennenden Substanzen durchgeführt werden. In diesem Fall ist die Bereitstellung des Waschflüssigkeitstanks 8 und des Nachweisgefäßes 9 nicht nötig und das gesamte Verfahren zur Bestimmung kann im Reaktionsgefäß 2 durchgeführt werden.
Ferner kann das Reaktionsgefäß 2 eine mit einem Träger auf der Bodenfläche oder den Seitenflächen mit (darauf) immobilisierter Nucleinsäuresonde ausgestattete Einmal-Reaktionszelle sein. Im Hinblick auf die Verbindung zum Gehäuse der Nachweisapparatur eignet sich als Träger mit darauf immobilisierter Substanz vorzugsweise eine Elektrode mit darauf immobilisierter Nucleinsäuresonde, wenngleich auch andere genannte Träger mit darauf immobilisierter Substanz verwendet werden können. Es ist auch bevorzugt, den immobilisierten Träger so anzubringen, daß er zum Zwecke einer wiederholten Verwendung von der Reaktionszelle abgetrennt werden kann.
Der Gennachweis unter Verwendung dieser Reaktionszelle wird wie folgt durchgeführt. Zuerst wird eine die nachzuweisende Nucleinsäure enthaltende Probenlösung in die Reaktionszelle gegeben, welche zur Denaturierung der Nucleinsäure zum Einzelstrang erwärmt wird. Das Annealing wird dann bei einer geeignet gewählten Temperatur, welche von verwendeten Sonde abhängt, durchgeführt, wobei der Doppelstrang gebildet wird. Die doppelsträngige Nucleinsäure erkennende Substanz wurde zugegeben. Das direkt oder indirekt erzeugte Signal wird über den in der Reaktionszelle angebrachten Träger gemessen. In diesem Fall ist die Verwendung des genannten Gensensors nicht erforderlich.
Die Reaktionszelle wird aus der Nachweisapparatur entfernt und nach jeder Bestimmung verworfen. Daher ist der Gennachweis sehr verläßlich, ohne eine Kreuzkontaminierung oder ein Übertragen der Proben. Ferner kann die Messung mit weniger Schwierigkeiten und innerhalb kurzer Zeit durchgeführt werden, da die Zellen nicht gewaschen werden müssen.
Wie in Fig. 3 angegeben, enthält die Temperatursteuereinheit 3, die die Temperatur des Reaktionsgefäßes 2 steuert, das Thermostatbad 21, die Steuereinheit 22 zur Steuerung der Temperatur des Thermostatbades 21 und den Temperatursensor 23 zur Bestimmung der Temperatur der Probenlösung. In Fig. 3 besteht das im Thermostatbad 21 angebrachte Reaktionsgefäß 2 aus einem oder mehreren der genannten kleinen Gefäße 13. Eines der kleinen Gefäße 13 enthält eine Pufferlösung mit der gleichen Zusammensetzung wie die bei der Probenlösung verwendete Lösung. Der Temperatursensor 23 wird in die Pufferlösung eingeführt. Die Temperatur der Pufferlösung wird als die Temperatur der Probenlösung gemessen. Der Temperatursensor 23 ist mit der Steuereinheit 22 verbunden. Er mißt die Temperatur der Pufferlösung im Reaktionsgefäß 2 und sendet die Daten an die Steuereinheit 22. Nach dem Erhalt der Temperaturdaten vom Temperatursensor 23 berechnet und verarbeitet die Steuereinheit 22 die Daten. Sie steuert dann die Temperatur des Thermostatbades 21, womit die Temperatur der Probenlösung auf einem bestimmten konstanten Niveau gehalten wird. Diese Temperatursteuerung wird vorzugsweise im Bereich von ± 5 ºC durchgeführt.
Ein Beispiel für die automatische Gennachweisapparatur unter Verwendung von Elektrochemilumineszenz wird im folgenden beschrieben.
Fig. 4 ist die schematische Darstellung einer automatischen Gennachweisapparatur unter Verwendung von Elektrochemilumineszenz. Diese Apparatur enthält die Reaktionszelle 32, die sowohl die Funktion des Reaktions- als auch des Nachweisgefäßes in der in Fig. 1 angegebenen Nachweisapparatur aufweist, und das Waschgefäß 42. Wie bereits aufgeführt, ist die getrennte Bereitstellung eines Reaktionsgefäßes oder Nachweisgefäßes nicht erforderlich, da bei Verwendung von Elektrochemilumineszenz die Bestimmung ohne eine Entfernung von nicht umgesetzer Nucleinsäuresonde oder nicht umgesetztem interkalierendem Mittel durchgeführt werden kann. Auf der Bodenfläche der Reaktionszelle 32 befindet sich die Elektrode 33 mit darauf immobilisierter Nucleinsäuresonde. Ähnlich dem Reaktionsgefäß der in Fig. 1 angegebenen Nachweisapparatur ist die Reaktionszelle 32 der Temperatursteuereinheit 34 angepaßt. Die Reaktionszelle wird entlang Schiene 35 horizontal transportiert und an einer vorbestimmten Position der Schiene 35 mit der Genprobenreinigungsvorrichtung 31 verbunden. Die Bezugselektrode 36 ist zusammen mit dem Ende der optischen Faser 37 an der Transportvorrichtung 12* befestigt.
*nach Fig. 4 vermutlich: 43
Durch die Transportvorrichtung 12* werden die Bezugselektrode 36 und die optische Faser 37 horizontal und vertikal in jedes Gefäß transportiert. Die Referenzelektrode 36 ist zusammen mit der Elektrode 33 mit darauf immobilisierter Nucleinsäuresonde mit dem Funktionsgenerator/Potentiostat 38 verbunden. Das an diese Elektroden anzulegende Potential wird in geeigneter Weise durch den Computer 39 berechnet. Die auf der Oberfläche der Elektrode 33 mit darauf immobilisierter Nucleinsäuresonde erzeugte Elektrochemilumineszenz wird zur Verstärkung über die optische Faser 37 an den Photomultiplier 40 geschickt und dann durch den Photozähler 41 gemessen. Die Ergebnisse der Messung werden zur Analyse in den Computer 39 eingegeben.
Der Gennachweis unter Verwendung dieser Apparatur wird wie folgt durchgeführt. Zuerst werden - ähnlich wie im Fall der in Fig. 1 angegebenen Apparatur - die die nachzuweisende Nucleinsäure enthaltenden Testzellen in die Genprobenreinigungseinheit 31 gegeben und zu einer Probenlösung verarbeitet, die die zum Einzelstrang denaturierte Genprobe enthält. Die Lösung wird dann in die Reaktionszelle 32 übertragen. Dann wird die Temperatur der Probenlösung durch die Temperatursteuereinheit 34 in geeigneter Weise gesteuert und die auf der Oberfläche der Elektrode 33 immobilisierte Nucleinsäure mit der Genprobe in der Probenlösung hybridisiert. Während dieses Vorgangs wird ein interkalierendes Mittel mit der Fähigkeit, Elektrochemilumineszenz zu erzeugen, der Probenlösung zugesetzt. Alternativ kann das interkalierende Mittel der Testlösung vor der Hybridisierung zugesetzt werden. Danach wird die Reaktionszelle 32 entlang der Schiene 35 an eine vorbestimmte Position transportiert. Die Bezugselektrode 36 und die optische Faser 37 werden zum Eintauchen in die Probenlösung in die Reaktionszelle 32 transportiert. Zwischen der Bezugselektrode 36 und der Elektrode 33 mit (darauf) immobilisierter Nucleinsäure in der Reaktionszelle 32 wird dann zur Erzeugung von Elektrochemilumineszenz ein Potential angelegt. Das durch die Elektrochemilumineszenz erzeugte Licht wird zur Verstärkung über die optische Faser 37 in den Photomultiplier 40 geführt und dann durch den Photozähler 41 gemessen. Die Ergebnisse der Messung werden zur Analyse in den Computer 39 eingegeben. Nach der Messung werden die Bezugselektrode 36 und die optische Faser 37 aus der Reaktionszelle 32 entfernt und zum Waschen in das Waschgefäß 42 übertragen.

Beispiel 12

Gennachweis unter Verwendung der Gennachweisapparatur mit einer Elektrode mit (darauf) immobilisierter Nucleinsäuresonde

Die in Fig. 1 angegebene automatische Gennachweisapparatur wurde zum Nachweis des Gens verwendet. Als Testprobe wurde pVM 623, das durch Einführen des v-myc-Fragments in der Stelle Pst 1 von pUC 119 erhalten wurde, verwendet. Lineares pVM 623 wurde durch Verdauen mit Hind III erhalten und dann bei 98ºC der thermischen Denaturierung unterzogen. Die Elektrode mit (darauf) immobilisierter Nucleinsäuresonde wurde in die Testprobe gegeben. Diese wurde zur Reassoziation 15 min lang bei 70ºC inkubiert. Während dieses Verfahrens wurde Acridinorange, ein interkalierendes Mittel, das Spezifität gegenüber doppelsträngiger DNA aufweist und elektrochemisch aktiv ist, zugegeben.
Nach der Reassoziation wurde die Elektrodenreaktion durchge führt, wobei der erzeugte Oxidationsreduktionsstrom zur mengenmäßigen Bestimmung des in der Testprobe enthaltenen v-myc gemessen wurde. Hierbei konnte v-myc in der Größenordnung von pg nachgewiesen werden. Das gesamte Verfahren konnte innerhalb 1 h durchgeführt werden.

Referenzbeispiel 4

Gennachweis unter Verwendung der Gennachweisapparatur mit einer Elektrode mit (darauf) immobilisierter Nucleinsäuresonde mittels Elektrochemilumineszenz

Das Gen wurde unter Verwendung der in Fig. 4 angegebenen automatischen Gennachweisapparatur nachgewiesen. Als Testprobe wurde aus peripherem Humanblut erhaltene DNA unter Beimischung von pVM 623, das durch Einführen des v-myc-Fragments in der Stelle Pst I von pUC 119 erhalten und mit Hind III zur Linearisierung verdaut worden war, verwendet. Eine Reaktionszelle mit einer auf der Bodenfläche befindlichen BPPG-Elektrode mit (darauf) immobilisierter Nucleinsäuresonde wurde hergestellt. Dann wurde die Probe in diese Reaktionszelle gegeben und 5 min lang bei 98ºC thermisch denaturiert. Die Probe wurde zur Reassoziation 15 min lang bei 70ºC inkubiert. Während der Reassoziation wurde Lucigenin, das Spezifität gegenüber doppelsträngiger DNA aufweist und Elektrochemilumineszenz erzeugen kann, zugegeben.
Nach der Reassoziation wurde die elektrochemische Reaktion durchgeführt und hierbei das Lumineszenzlicht durch einen Photozähler gemessen. Danach konnte v-myc in der Größenordnung von pg nachgewiesen werden. Das gesamte Verfahren konn te innerhalb 1 h durchgeführt werden.

Beispiel 13

Gennachweis unter Verwendung einer Einzel-Reaktionszelle mit einer Elektrode mit darauf immobilisierter Nucleinsäuresonde

a. Herstellung der Reaktionszelle mit einer Elektrode mit darauf immobilisierter Nucleinsäuresonde

(6-Aminohexyl)-DATP wurde in das karzinogene Gen v-myc (1,5 Kb) im voraus am 3'-Ende unter Verwendung von terminaler Desoxynucleotidyl-Transferase eingeführt.
Als Elektrode mit (darauf) zu immobilisierender Nucleinsäure wurde ein Platinelektrode verwendet. Zuerst wurde die Platinelektrode zur Oxidation der Elektrodenoberfläche 12 h lang bei 180ºC erwärmt. Die Elektrode wurde zur Silanbehandlung 30 min lang bei 120ºC in eine unter Rückfluß erhitzte Lösung von 10% Gamma-Aminopropyltriethoxysilan in Anilin gegeben und dann gewaschen. Die Elektrode wurde ferner 30 min lang in 1%iger Glutaraldehydlösung umgesetzt und dann gewaschen Danach wurde die Elektrode 30 min lang bei Raumtemperatur in einer 1 µg/ml v-myc mit eingeführter Aminogruppe enthaltenden Lösung reagieren gelassen, wobei eine Elektrode mit (darauf) immobilisierter Nucleinsäuresonde hergestellt wurde. Dann wurde eine Reaktionszelle (5 x 5 x 10 mm), die auf der Bodenfläche mit der Elektrode mit darauf immobilisierter Nucleinsäuresonde versehen war, hergestellt.

b. Gennachweis unter Verwendung der Reaktionszelle mit einer Elektrode mit (darauf) immobilisierter Nucleinsäuresonde

Als Testprobe wurde das durch Umsetzen von pVM 623 (4,6 Kb), das durch Einführen des v-myc-Fragments an der Stelle Pst I von pUC 119 erhalten wurde, mit Hind III erhaltene Fragment verwendet. Eine das Segment enthaltene Lösung wurde in die in Stufe a hergestellte Reaktionszelle gegeben und 5 min lang bei 95ºC der thermischen Denaturierung unterzogen. Das Ganze wurde anschließend 30 min lang bei 72CC reassoziiert. Nach der Reaktion wurde zur Reaktionszelle Tris(1,10-phenanthrolin)osmium zugegeben und die durch Anlegen eines Potentials an die Elektrode erzeugte Elektrochemilumineszenz gemessen. Hierbei konnte v-myc in der Größenordnung von pg bestimmt werden.

Beispiel 14

Gennachweis unter Verwendung einer Einmal-Reaktionszelle mit einer Elektrode mit (darauf) immobilisierter Nucleinsäuresonde

a. Herstellung der Reaktionszelle mit einer Elektrode mit (darauf) immobilisierter Nucleinsäuresonde

(6-Aminohexyl)-DATP wurde in das karzinogene Gen v-myc (1,5 Kb) im voraus am 3'-Ende unter Verwendung von terminaler Desoxynucleotidyl-Transferase eingeführt.
Als Elektrode mit (darauf) zu immobilisierender Nucleinsäure wurde ein BPPG-Elektrode verwendet. Zuerst wurde diese BPPG Elektrode zur Oxidation der Elektrodenoberfläche in einer 10% Salpetersäure und 2,5% Kaliumchromat enthaltenden Lösung bei 2,2 V elektrolysiert. Die Elektrode wurde zur Silanbehandlung 30 min lang bei 120ºC in eine unter Rückfluß erhitzte Lösung von 10% Gamma-aminopropylethoxysilan in Anilin gegeben und dann mit Methanol gewaschen. Die Elektrode wurde ferner 30 min lang in einer 1%igen Glutaraldehydlösung umgesetzt und dann gewaschen. Die Elektrode wurde dann 30 min lang bei Raumtemperatur in einer 1 µg/ml v-myc mit eingeführter Aminogruppe enthaltenden Lösung umgesetzt, wobei eine Elektrode mit (darauf) immobilisierter Nucleinsäuresonde hergestellt wurde. Dann wurde eine Reaktionszelle (5 x 5 x 10 mm), die auf der Bodenfläche mit der Elektrode mit der darauf immobilisierten Nucleinsäuresonde versehen war, hergestellt.

b. Gennachweis unter Verwendung der Reaktionszelle mit mit (darauf) immobilisierter Nucleinsäuresonde

Als Testprobe wurde das durch Umsetzen von pVM 623 (4,6 Kb), das durch Einführen des v-myc-Fragments an der Stelle Pst 1 von pUC 119 erhalten wurde, mit Hind III erhaltene Fragment verwendet. Eine das Fragment enthaltende Lösung wurde in die in Stufe a hergestellte Reaktionszelle gegeben und 5 min lang bei 95ºC einer thermischen Denaturierung unterzogen. Das Ganze wurde anschließend 30 min lang bei 72 C reassoziiert. Nach der Reaktion wurde Tris(1,10-phenanthrolin)kobalt zur Reaktionszelle gegeben und das Oxidationsreduktionspotential durch zyklische Voltammetrie bestimmt. Hierbei konnte v-myc in der Größenordnung von pg bestimmt werden.
Wie voranstehend detailliert beschrieben, kann unter Verwendung der erfindungsgemäßen automatischen Gennachweisapparatur das Gen automatisch durch die genannten Verfahren bestimmt werden. Daher kann das Gen auf einfachere Weise in nerhalb einer kurzen Zeitspanne nachgewiesen werden.
Beim genannten Nachweisverfahren sind die Träger, z.B. eine Elektrode oder optische Faser, welche eine von einem interkalierenden Mittel erzeugte physikalische Veränderung, wie ein elektrochemisches oder optisches Signal, erfassen können, zur Bereitstellung eines Gennachweisverfahrens, das das Vorhandensein eines zu bestimmenden Gens mit größerer Sicherheit und in geeigneter Weise innerhalb einer kürzeren Zeitspanne nachweisen kann, zur Verwendung als Gensensor mit der (darauf) immobilisierten Nucleinsäuresonde versehen. Dieser Zweck kann auch bei Verwendung von Teilchen, auf deren Oberfläche die Nucleinsäuresonde immobilisiert ist, statt der Träger mit (darauf) immobilisierter Nucleinsäuresonde erreicht werden. So wird auf der Oberfläche der Teilchen die Nucleinsäuresonde mit der Genprobe zur Ausbildung des Doppelstrangs hybridisiert. An diesen bindet sich die doppelsträngige Nucleinsäure erkennende elektrochemisch oder optisch aktive Substanz. Anschließend wird die doppelsträngige Nucleinsäure erkennende Substanz elektrochemisch oder optisch durch einen Detektor erfaßt.
Die Teilchen, auf denen die Nucleinsäuresonde immobilisiert werden soll, können - jedoch nicht hierauf beschränkt - Latexperlen, Polystyrolperlen, Glasperlen, magnetische Teilchen u.dgl. sein. Der Durchmesser der verwendeten Teilchen liegt vorzugsweise im Bereich von 100 Å bis 1 mm.
Die anderen Bedingungen sind ähnlich wie in den Fällen der Verwendung von Trägern, wie die genannte Elektrode oder optische Faser mit (darauf) immobilisierter Nucleinsäuresonde.
In ähnlicher Weise kann auch ein Filter mit auf der Filteroberfläche immobilisierter Nucleinsäuresonde zum Nachweis des Gens verwendet werden. In diesem Fall sind beliebige Filter geeignet, so weit sich deren Natur mindestens bis 100ºC nicht ändert, wie beispielsweise die allgemein bei DNA-Southern-Blotting verwendeten Filter, wie Nitrocellulosefilter und Nylonfilter. Zur Immobilisierung der Nucleinsäuresonde auf diesen Filtern können die genannten Verfahren zur Immobilisierung der Nucleinsäure auf einen Träger unverändert verwendet werden.
Der Gennachweis kann unter Verwendung des Filters mit (darauf) immobilisierter Nucleinsäuresonde wie folgt durchgeführt werden.
Zuerst wird eine Nucleinsäure nach einem Standardverfahren aus einer Testprobe, z.B. peripherem venösem Blut oder verschiedenen Organzellen extrahiert und bei Bedarf gereinigt. Dann wird eine die erhaltene Nucleinsäureprobe enthaltende Hybridisierungsreaktionslösung hergestellt und die Reaktionslösung auf die Mehrschichtfiltervorrichtung aus einem oder mehreren Filtern einschließlich des Filters mit (darauf) immobilisierter Nucleinsäuresonde appliziert und die Probe in die Filtervorrichtung durchdringen gelassen. Eine doppelsträngige Nucleinsäure erkennende Substanz, insbesondere eine doppelsträngige Nucleinsäure erkennende Substanz, die selbst oder über eine andere Substanz optische Aktivität aufweist, war bereits vorher in der Hybridisierungsreaktionslösung enthalten. Nach hinreichendem Durchdringen der Reaktionslösung wird die Nucleinsäure bei 95ºC in einen Einzelstrang thermisch denaturiert, wobei dieser dann durch weiteres Erwärmen auf 37 - 72ºC mit der auf der Filteroberfläche immobilisierten Nucleinsäuresonde hybridisiert wird. Nach der Reaktion wird der Filter mit (darauf) immobilisierter Nucleinsäuresonde aus der Filtervorrichtung entfernt und dann gewaschen. Bei Vorhandensein des angestrebten Gens in der Nucleinsäureprobe wird auf dem Filter mit (darauf) immobilisierter Nucleinsäuresonde ein Doppelstrang ausgebildet und diese doppelsträngige Nucleinsäure an die eine doppelsträngige Nucleinsäure erkennende Substanz gebunden. Diese doppelstrangige Nucleinsäure erkennende Substanz verursacht die Veränderung des Signals, welches zur mengenmäßigen Bestimmung des angestrebten Gens gemessen wird. So kann, wenn die eine doppelsträngige Nucleinsäure erkennende Substanz optische Aktivität aufweist, die Veränderung des optischen Signals, beispielsweise Lumineszenz, Fluoreszenz, Reflexion, Fluoreszenzpolarisation, Quenchen, Zirkulardichroismus u.dgl., gemessen werden.
Die meisten Genkrankheiten treten auf, wenn eine spezielle Basensequenz fehlerhaft ist oder eine Kombination einer Mehrzahl spezieller Basensequenzen in einem Gen auftritt. So können die meisten Genkrankheiten nicht direkt durch Verwendung der Nucleinsäuresonde identifiziert werden. Daher werden nun die meisten Krankheiten unter Verwendung von Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP)-Analyse identifiziert. Diese RFLP-Methode beinhaltet eine Analyse des Musters der DNA-Fragmente und erfordert daher das Verfahren einer Trennung der DNA-Fragmente. Zur Zeit wird zur Trennung von DNA-Fragmenten nur Elektrophorese verwendet, wobei das Problem komplizierter Verfahren und einer langen Zeitdauer der Bestimmung auftritt.
Diese Analyse des Musters von DNA-Fragmenten kann günstigerweise innerhalb einer kurzen Zeitspanne bei Verwendung des erfindungsgemäßen Gennachweisverfahrens mit dem im folgenden beschriebenen Verfahren durchgeführt werden.
Zuerst wird DNA aus einem biologischen Material extrahiert und dann mit einem geeigneten Restriktionsenzym verdaut. Das geeignete Restriktionsenzym ist nicht speziell beschränkt und es kann allgemein jedes bei RFLP verwendete Enzym eingesetzt werden. Beispiele für geeignete Restriktionsenzyme sind AccI, AvaI, BamHI, EcoRI, HincI, HndIII und Pst I.
Die erhaltenen DNA-Fragmente werden dann auf der Basis der Molekulargewichte durch Säulenchromatographie, Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), beispielsweise FPLC (hergestellt von PHARMACIA Co. Ltd.), Kapillarelektrophorese, Gelelektrophorese u.dgl. getrennt. Die DNA-Fragmente können auch nach der Denaturierung durch beispielsweise Erhitzen auf 90 - 98ºC getrennt werden.
Die auf Basis der Molekulargewichte getrennten DNA-Fragmente werden dann mit der auf dem Träger immobilisierten Nucleinsäuresonde hybridisiert. Diese Hybridisierung kann in einem Durchflußsystem mit konstanter Strömungsrate oder in einer Reihe gleichvolumiger Fraktionen durchgeführt werden.
Bei der Hybridisierung in einem Durchflußsystem werden die Bedingungen, wie Temperatur und pH-Wert der beweglichen Phase, in Abhängigkeit von der Hybridisierungsreaktion geeignet ausgewählt. Die Zusammensetzung der beweglichen Phase ist nicht speziell beschränkt, obwohl eine Salzkonzentration von etwa 0 - 1 M, ein pH-Wert im neutralen Bereich und eine Temperatur im Bereich von 37 - 72 C bevorzugt sind. Zwar ist die Zugabe der doppelsträngige Nucleinsäure erkennenden Substanz zur Probenlösung im voraus erwünscht, aber es ist auch akzeptabel, daß ein Träger mit den auf der Oberfläche gebildeten Doppelsträngen in eine Lösung mit der doppelsträngige Nucleinsäure erkennenden Substanz gegeben wird. Als doppelsträngige Nucleinsäure erkennende Substanz kann jede beliebige im Vorhergehenden aufgeführte verwendet werden. Im Durchflußsystem wird die Zeitspanne (Retentionszeit) zwischen dem Einführen der Probelösung und der Erzeugung des direkten oder indirekten Signals der doppelsträngige Nucleinsäure erkennenden Substanz gemessen. Das Muster der DNA- Fragmente kann beispielsweise auf der Basis von RFLP erhalten werden.
Für den Fall, daß die Hybridisierung nach Erhalt der Fraktionen durchgeführt wird, wird jede Fraktion der Hybridisierung mit der auf dem Träger immobilisierten Nucleinsäuresonde unterzogen und dann die eine doppelsträngige Nucleinsäure erkennende Substanz zur Bestimmung des direkten oder indirekten Signals der eine doppelsträngige Nucleinsäure erkennenden Substanz zur Fraktion gegeben. Aus der Fraktionszahl der Fraktion, bei der das Signal erhalten wird, kann das Muster der DNA-Fragmente beispielsweise auf der Basis von RFLP erhalten werden.
Obwohl die vorliegende Erfindung, wie bereits ausgeführt, ein Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins eines Gens mit einer speziellen Basensequenz ist, ist mit dem vorliegenden Verfahren ferner die Abtrennung des Gens mit der speziellen Basensequenz möglich. Da insbesondere beim genannten Nachweisverfahren das angestrebte Gen mittels Hybridisierung mit der Nucleinsäuresonde auf einem Träger immobilisiert ist, kann das angestrebte Gen einfach durch Entfernen des Trägers aus der Testprobe von der Testprobe abgetrennt werden. Danach kann das angestrebte Gen durch Abdissoziieren des angestrebten Gens vom Träger durch geeignete Maßnahmen nach der Entfernung des Substrats allein abgetrennt werden.
Insbesondere kann diese Genabtrennung dadurch ausgeführt werden, daß zunächst die auf der Trägeroberfläche immobilisierte Nucleinsäuresonde mit dem angestrebten Gen zur Ausbildung einer doppelsträngigen Nucleinsäure hybridisiert wird, wobei dann an die doppelsträngige Nucleinsäure die vor oder nach der Hybridisierung zugegebene, doppelsträngige Nucleinsäure erkennende Substanz gebunden wird, und dann das Signal der an die doppelsträngige Nucleinsäure gebundenen, eine doppelsträngige Nucleinsäure erkennenden Substanz zur Bestätigung des Vorhandenseins des angestrebten Gens erfaßt wird. Dann wird der Träger, auf dem die Anwesenheit des angestrebten Gens bestätigt worden ist, zur Abtrennung des angestrebten Gens von der Testprobe aus der Testprobe entfernt und dann das angestrebte Gen mittels thermischer oder alkalischer Denaturierung vom Träger abdissoziiert. Bei diesem Genabtrennungsverfahren ist das Verfahren bis zu der Stufe des Nachweises des in der Testprobe enthaltenen angestrebten Gens ähnlich dem genannten Gennachweisverfahren.
Zur Abdissoziation des angestrebten Gens vom Träger kann der Träger bei einer Temperatur von 95 ºC oder höher in einer Pufferlösung erwärmt oder unter Verwendung von beispielsweise Natriumhydroxid alkalischen Bedingungen unterworfen werden. Nach diesem Verfahren wird das angestrebte Gen in Form eines Einzelstrangs abgetrennt.
Das so erhaltene Gen wird durch Synthetisieren einer komplementären Kette unter Einsatz eines Enzyms in einen Doppelstrang umgewandelt. Die Ausbeute kann durch Amplifikation unter Verwendung eines Enzyms gesteigert werden. Insbesondere kann die Ausbeute durch die PCR-Methode unter gleichzeitiger Ausbildung eines Doppelstrangs gesteigert werden. Durch Ausbildung eines Doppelstrangs, der dann über einen Linker in einen Vektor eingeführt wird, kann das angestrebte Gen effizient und ohne Schwierigkeiten geklont werden.

Beispiel 15

Indirekter Gennachweis durch RFLP-Analyse unter Verwendung einer Elektrode mit (darauf) immobilisierter Nucleinsäuresonde

Unter Verwendung einer Elektrode mit (darauf) immobilisierter Nucleinsäuresonde wurde die Einzelidentifizierung durch die DNA-Fingerprint-Methode wie folgt durchgeführt.
Zuerst wurden Leukozyten duch Dichtegradienten-Zentrifugation aus peripherem venösem Humanblut abgetrennt und die DNA nach einem Standardverfahren extrahiert. Dann wurde die erhaltene DNA mit einem Restriktionsenzym Hae III verdaut.
Andererseits wurde eine Myo-Sonde auf einer BPPG-Elektrode zur Herstellung einer Elektrode mit (darauf) immobilisierter Nucleinsäuresonde immobilisiert und die Elektrode am Auslaß der Säule eines Hochdruckflüssigkeitschromatographen (HPLC) angebracht. Die Probe wurde zur HPLC aufgegeben, wobei DNA mit der zur auf der Elektrodenoberfläche immobilisierten Sonde homologen Sequenz zeitweilig auf der Oberfläche zur Bildung eines Doppelstrangs festgehalten wurde, an welchen wiederum die eine doppelstrangige Nucleinsäure erkennende Substanz, z.B. ein interkalierendes Mittel, gebunden wurde, wodurch die Bestimmung des elektrochemischen Signals der die doppelsträngige Nucleinsäure erkennenden Substanz möglich wurde. Die erhaltenen Signale zeigen ein spezifisches Muster. Durch Analyse dieses Musters kann die Mustererkennung der Probe durchgeführt werden.
Nach thermischer Denaturierung des in genannter Weise erhaltenen DNA-Fragments bei 95ºC zum Erhalt eines Einzelstrangs wurde dieser zusammen mit einem interkalierenden Mittel, Acridinorange, zur Durchführung der Musteranalyse der DNA HPLC unterworfen. Während der Chromatographie wurde die Säule bei 75ºC gehalten.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigten diskrete Muster für die der Untersuchung unterzogenen Individuen. Damit war deutlich nachgewiesen, daß durch das vorliegende Gennachweisverfahren eine individuelle Identifizierung möglich ist.

Referenzbeispiel 5

Genabtrennung unter Verwendung einer Elektrode mit darauf immobilisierter Nucleinsäuresonde

Eine Lösung von aus E. coli, Stamm JM 109, extrahierter Chromosomen-DNA (10 µg/ml) mit Beimischung von mit Hind III verdautem pVM 623 (erhalten durch Einführen von v-myc in pUC 119, 1 µg/ml) wurde als experimentelles Modellsystem verwendet. Die Sequenz 5'-TGCAGTTCCGGTGGCTGATC-3' in v-myc wurde als Sonde für den Nachweis und die Abrennung verwendet.

a. Herstellung der BPPG-Elektrode mit darauf immobilisierter Nucleinsäuresonde

Die BPPG-Elektrode wurde zur Oxidation der Oberfläche in einer Lösung aus 2,5% Kaliumchromat und 10% Salpetersäure bei 2,2 V 10 s lang elektrolysiert. Die Elektrode wurde zur Silanbehandlung 30 min bei 120ºC in eine auf Rückfluß erhitzte Lösung von 10% Gamma-Aminopropyltriethoxysilan in Toluol gegeben. Durch diese Behandlung wurde eine Aminogruppe in die Elektrodenoberfläche eingeführt. Dann wurde die Elektrode zur Einführung einer Aldehydgruppe 1 h lang bei Raumtemperatur in einem 1% Glutaraldehyd enthaltenden 1/15 M Phosphatpuffer (pH-Wert: 7,0) stehen gelassen. Der genannte synthetische Primer wurde in einer Lösung mit 10 µg/ml in 10 mM Phosphatpuffer hergestellt. In diese Lösung wurde die mit Aldehyd behandelte Elektrode dann gegeben und 1 h lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. In dieser Stufe wurde der Primer auf der Elektrodenoberfläche immobilisiert.

b. Nachweis des angestrebten Gens

Die in Stufe a hergestellte BPPG-Elektrode mit darauf immobilisierter Nucleinsäuresonde wurde in eine Lösung von aus E. coli, Stamm JM 109, extrahierter Chromosomen-DNA (10 µg/ml) mit Beimischung von 1 µg/ml pVM 623, das unter Verwendung von Hind III in eine lineare Form überführt worden war, gegeben. Das Ganze wurde bei 55ºC hybridisiert. Ein interkalierendes Mittel, Acridinorange, wurde bis zur Konzentration 1 µm zugegeben. Dann wurde die Elektrodenreaktion gemessen.
Als Ergebnis wurden die für Acridinorange spezifischen Peaks erhalten, wodurch die Bildung der Doppelstränge auf der Elektrodenoberfläche angezeigt wurde.

c. Abtrennung des angestrebten Gens

Die Elektrode wurde aus der Probenlösung entfernt und bei 95ºC im Puffer erwärmt, um das angestrebte Gen in einer doppelstrangigen Form abzudissozieren. Dann wurden 5'-TGCAGTTCCGGTGGCTGATC-3' und 5'-CGACTCGGAAGAAGAACAAG-3', die Fragmente in v-myc, als Primer zur Durchführung von PCR verwendet. Die Länge zwischen den zu den beiden Primern komplementären Basensequenzen beträgt etwa 900 bp. Das durch PCR amplifizierte Gen wurde der Elektrophorese unterzogen, bei der das 900 bp entsprechende Band beobachtet wurde, wodurch die Abtrennung des pVM 623, das abgetrennt werden sollte, bestätigt wurde.
Zur Kontrolle wurde das gleiche Verfahren unter Verwendung von pUC 118 als angestrebtes Gen und der Basensequenz in pUC 118 als PCR-Primer durchgeführt. Bei der entsprechenden Position wurde kein Band beobachtet.

Beispiel 24

Gennachweis unter Verwendung einer Elektrode mit darauf immobilisierter Nucleinsäuresonde und Blockade durch Stearylamin

a. Herstellung der Elektrode mit darauf immobilisierter Nucleinsäuresonde

(6-Aminohexyl)-DATP wurde unter Verwendung von terminaler Desoxynucleotidyl-Transferase am 3'-Ende in eine synthetische Oligonucleotidsonde (20 mer) für ein karzinogenes Gen v-myc eingeführt.
Auf der anderen Seite wurde zur Oxidation der Elektrodenoberfläche eine BPPG-Elektrode bei 2,2 V in einer Lösung mit 10% Salpetersäure und 2,5% Kaliumchromat der Elektrolyse unterzogen. Die Elektrode, deren Oberfläche oxidiert worden war, wurde dann zur Silanbehandlung 30 min lang bei 120ºC in eine unter Rückfluß erhitzte Lösung von 10% Gamma-APTES in Anilin gegeben. Danach wurde die silanbehandelte Elektrode mit Methanol gewaschen, 30 min lang in einer 1%igen Glutaraldehydlösung umgesetzt und dann nochmals gewaschen.
Diese Elektrode wurde 30 min lang bei Raumtemperatur in einer 1 µg/ml der Sonde, in die eine Aminogruppe eingeführt war, enthaltenden Lösung umgesetzt, wobei eine Elektrode mit der (darauf) immobilisierten Nucleinsäuresonde hergestellt wurde.
Diese Elektrode wurde zur Adsorption von Stearylamin auf der Oberfläche der Elektrode in eine Stearylaminlösung eingetaucht, wobei eine nichtspezifische Adsorption der Probe unterdrückt wurde.

Als Testprobe wurde pVM 623, das durch Einführen des v-myc Fragments an der Stelle Pst I von pUC 119 erhalten wurde, verwendet. Lineares pVM 623 wurde durch Verdauen mit Hind III erhalten und dann bei 98ºC der thermischen Denaturierung unterzogen. Die in Stufe a hergestellte BPPG-Elektrode mit darauf immobilisierter Nucleinsäuresonde wurde in die Testprobe gegeben. Das Ganze wurde zur Reassoziation bei 70ºC inkubiert. Danach wurde ein interkalierendes Mittel, Acridinorange, das speziell an doppelsträngige Nucleinsäure bindet und Elektrodenaktivität aufweist, zugegeben und die Elektrodenreaktion durchgeführt, wobei der erzeugte Oxidationsreduktionsstrom zur mengenmäßigen Bestimmung des in der Probe enthaltenen v-myc gemessen wurde.
Hierbei konnte v-myc in der Größenordnung von pg nachgewiesen werden. Das beobachtete S/N-Verhältnis war größer als das der Elektrode, deren Oberfläche nicht blockiert war.

Claims

1. Gennachweisverfahren, bei welchem eine einzelsträngige Nucleinsäuresonde mit einer zu dem nachzuweisenden Gen komplementären Basensequenz mit einer zu einer einzelsträngigen Form denaturierten Genprobe zur Reaktion gebracht und danach die mit dem Gen hybridisierte Nucleinsäuresonde zur Bestätigung der Anwesenheit des Gens nachgewieseb wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Nucleinsäuresonde auf einer Elektrode immobilisiert wird;

eine eine doppelsträngige Nucleinsäure erkennende Substanz mit der Fähigkeit zur spezifischen Bindung an eine doppelsträngige Nucleinsäure und elektrochemischer Aktivität zu dem Reaktionssystem aus der Nucleinsäuresonde und der Genprobe zugegeben wird, wobei es sich bei der eine doppelstrangige Nucleinsäure erkennenden Substanz um ein interkalierendes Mittel handelt, und die eine doppelsträngige Nucleinsäure erkennende Substanz, welche an die durch Konjugation der Nucleinsäuresonde und des nachzuweisenden Gens gebildete doppelsträngige Nucleinsäure gebunden ist, auf elektrochemischem Wege unter Verwendung der obigen Elektrode bestimmt wird, wobei das Vorhandensein der mit dem nachzuweisenden Gen hybridisierten Nucleinsäuresonde nachgewiesen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei an die Elektrode vor und/oder nach der Hybridisierung der auf der Oberfläche der Elektrode immobilisierten Nucleinsäuresonde mit der zu einer einzelsträngigen Form denaturierten Genprobe ein Potential angelegt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei an die Elektrode nach der Hybridisierung der auf der Oberfläche der Elektrode immobilisierten Nucleinsäuresonde mit der zu einer einzeisträngigen Form denaturierten Genprobe ein Potential angelegt wird.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei dem interkalierenden Mittel um eine Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe Ethidium, Ethidiumbromid, Acridin, Aminoacridin, Acridinorange, Proflavin, Ellipticin, Actinomycin D, Daunomycin und Mitomycin C, handelt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei es sich bei dem interkalierenden Mittel um einen Metallkomplex mit einem Metall mit der Fähigkeit, eine elektrisch reversible Oxidations-Reduktions-Reaktion einzugehen, als zentralem Metall handelt und das Oxidations-Reduktions-Potential dieses Metalls unter dem Oxidations-Reduktions-Potential der Nucleinsäure liegt oder durch letzteres nicht abgedeckt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei es sich bei dem Metallkomplex um eine Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe Tris(phenanthrolin)zinksalz, Tris(phenanthrolin)rutheniumsalz, Tris(phenanthrolin)kobaltsalz, Di(phenthrolin)zinksalz, Di(phenanthrolin)rutheniumsalz, Di(phenanthrolin)kobaltsalz, Bipyridinkobaltsalz, Terpyridinplatinsalz, Phenanthrolinplatinsalz, Tris(bipyridyl)zinksalz, Tris(bipyridyl)rutheniumsalz, Tris(bipyridyl)kobaltsalz, Di(bipyridyl)zinksalz, Di(bipyridyl)rutheniumsalz und Di(bipyridyl)kobaltsalz handelt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei es sich bei der eine doppelsträngige Nucleinsäure erkennenden Substanz um ein interkalierendes Mittel, an das eine oder mehrere, durch die Elektrode direkt oder indirekt nachweisbare elektrische Signale erzeugende Substanz(en) gebunden ist (sind), handelt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Nucleinsäuresonde auf der Elektrode über eine in die Nucleinsäuresonde eingeführte Aminogruppe immobilisiert ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Nucleinsäuresonde auf der Elektrode über einen Film immobilisiert ist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Elektrode weiterhin mit Substanzen, ausgewählt aus der Gruppe Nucleinsäuren, Netzmittel, Fettsäuren und Fette bedeckt ist.

11. Gennachweisverfahren, bei welchem eine einzelsträngige Nucleinsäuresonde mit einer zu dem nachzuweisenden Gen komplementären Basensequenz mit einer zu einer einzelsträngigen Form denaturierten Genprobe zur Reaktion gebracht und danach die mit dem Gen hybridisierte Nucleinsäuresonde zur Bestätigung der Anwesenheit des Gens nachgewiesen wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Nucleinsäuresonde auf einer Elektrode immobilisiert wird;

zu dem Reaktionssystem aus der Nucleinsäuresonde und der Genprobe ein interkalierendes Mittel mit der Fähigkeit zur spezifischen Bindung an eine doppelsträngige Nucleinsäure und Elektrochemielumineszenzeigenschaften zugegeben wird, und

das interkalierende Mittel, das an die durch Konjugation der Nucleinsäuresonde und des nachzuweisenden Gens gebildete doppelsträngige Nucleinsäure gebunden ist, durch Bestimmung von durch die Elektrochemielumineszenz erzeugten optischen Signalen unter Verwendung eines getrennt von der Elektrode im Reaktionssystem vorhandenen Photodetektors bestimmt wird, wobei das Vorhandensein der mit dem nachzuweisenden Gen hybridisierten Nucleinsäuresonde bestimmt wird.