RU2710720C2

RU2710720C2 - Варианты субтилазы и кодирующие их полинуклеотиды

Info

Publication number: RU2710720C2
Application number: RU2017123330A
Authority: RU
Inventors: Мигель Дуарте Гильерме Перейра ТОСКАНО; МАРИЯ Леонардо ДЕ
Original assignee: Новозимс А/С
Priority date: 2014-12-04
Filing date: 2015-12-03
Publication date: 2020-01-10
Also published as: US11591585B2; CN107075493A; EP3227444B1; CN107075493B; CA2963331A1; MX2017006695A; US10683491B2; BR112017011854A2; US20200263157A1; RU2017123330A; US20170335307A1; WO2016087617A1; RU2017123330A3; EP3690037A1; EP3227444A1

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии. Представлены вариант субтилазы, содержащий замены S9E+Q206L+L262E, и другие изменения. Также отражены моющие композиции для стирки и композиции для мытья посуды с использованием указанных субтилаз. Описан способ получения варианта субтилазы, включающий культивирование клетки-хозяина, содержащей полинуклеотид, кодирующий указанный вариант субтилазы в питательной среде в условиях, подходящих для экспрессии этого варианта с дальнейшим его извлечением из среды. 9 н. и 8 з.п. ф-лы, 1 ил., 16 табл., 8 пр.

Description

Ссылка на перечень последовательностей

Данная заявка содержит перечень последовательностей в машиночитаемой форме, который включен в данный документ с помощью ссылки.

Предпосылки изобретения

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к вариантам субтилазы, подходящим для применения, например, в чистящих или моющих композициях, таких как моющие композиции для стирки и композиции для мытья посуды, в том числе композиции для автоматизированного мытья посуды. Настоящее изобретение также относится к выделенным последовательностям ДНК, кодирующим варианты, векторам экспрессии, клеткам-хозяевам, а также к способам получения и применения вариантов по настоящему изобретению.

Описание уровня техники

В производстве моющих средств на протяжении многих лет в моющих составах применяются ферменты. Ферменты, применяемые в таких составах, включают амилазы, целлюлазы, липазы, маннозидазы и протеазы, а также другие ферменты или их смеси. С точки зрения коммерческой значимости наиболее важными ферментами являются протеазы.

Все большее число протеаз, используемых в коммерческих целях, представляют собой варианты природных протеаз дикого типа, полученные с помощью белковой инженерии Everlase^®, Relase^®, Ovozyme^®, Polarzyme^®, Liquanase^®, Liquanase Ultra^® и Kannase^® (Novozymes A/S), Purafast^®, Purafect OXP^®, FN3^® и FN4^® (Genencor International, Inc.). Кроме того, в уровне техники описаны многие варианты протеазы, как например в WO 91/00345 (Novozymes A/S) и WO 94/23053 (Novozymes A/S) описаны, например, мутации в положении 262. Варианты являются подходящими для применения, например, в чистящих или моющих композициях.

Было описано множество применимых вариантов субтилазы, многие из которых обеспечивают улучшенную активность, стабильность и растворимость в различных моющих средствах.

Однако различные факторы привносят дополнительные преимущества при улучшении протеаз. Моющие условия, такие как температура и рН, со временем изменяются, а многие пятна по-прежнему трудно полностью удалить в обычных моющих условиях. Кроме того, в условиях мытья может происходить инактивация ферментов (например, из-за значений pH, температуры или нестабильности хелатирования), что приводит к снижению моющей способности во время цикла мытья. Таким образом, несмотря на интенсивные исследования в разработке протеаз, остается потребность в новых и улучшенных протеазах, которые характеризуются улучшенной стабильностью, в частности улучшенной стабильностью при мытье и/или стабильностью при хранении, и предпочтительно аналогичной или улучшенной моющей способностью по сравнению с исходной субтилазой.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к вариантам субтилазы, обладающим протеазной активностью и содержащим замены X9E+X206L+X262E, например S9E+Q206L+L262E, где положения соответствуют положениям полипептида под SEQ ID NO: 2.

Настоящее изобретение дополнительно относится к полинуклеотидам, кодирующим варианты субтилазы; композициям, предпочтительно моющим композициям, включающим в себя вариант субтилазы; к применению композиций в процессе очистки, а также способам получения варианта субтилазы и удаления пятна с поверхности.

Краткое описание графических материалов

На фигуре 1 представлено выравнивание аминокислотных последовательностей субтилизина 309 (SEQ ID NO: 1) и субтилизина BPN' (SEQ ID NO: 2) с использованием алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman и Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453).

Определения

Термин "аллельный вариант" означает любую из двух или более альтернативных форм гена, занимающих один и тот же хромосомный локус. Аллельное разнообразие возникает в естественных условиях вследствие мутации и может приводить к полиморфизму в пределах популяций. Генные мутации могут быть в неструктурном гене (без изменений в кодируемом полипептиде) или могут кодировать полипептиды с измененными аминокислотными последовательностями. Аллельный вариант полипептида представляет собой полипептид, кодируемый аллельным вариантом гена.

Термин "cDNA" означает молекулу ДНК, которую можно получить с помощью обратной транскрипции из зрелой сплайсированной молекулы mRNA, полученной из эукариотической или прокариотической клетки. В cDNA отсутствуют интронные последовательности, которые могут присутствовать в соответствующей геномной ДНК. Исходный, первичный РНК-транскрипт является предшественником mRNA, который подвергается процессингу в ходе ряда стадий, в том числе сплайсинга, перед тем как станет зрелой сплайсированной mRNA.

Термин "кодирующая последовательность" означает полинуклеотид, который непосредственно определяет аминокислотную последовательность варианта. Пределы кодирующей последовательности обычно определяются открытой рамкой считывания, которая начинается со стартового кодона, такого как ATG, GTG или TTG, и заканчивается стоп-кодоном, таким как TAA, TAG или TGA. Кодирующая последовательность может представлять собой геномную ДНК, cDNA, синтетическую ДНК или их комбинацию.

Термин "регуляторные последовательности" означает последовательности нуклеиновой кислоты, необходимые для экспрессии полинуклеотида, кодирующего вариант по настоящему изобретению. Каждая регуляторная последовательность может быть нативной (т. е. из того же гена) или чужеродной (т. е. из другого гена) относительно полинуклеотида, кодирующего вариант, или нативной или чужеродной по отношению друг к другу. Такие регуляторные последовательности включают в себя без ограничения лидерную последовательность, последовательность полиаденилирования, пропептидную последовательность, промотор, последовательность сигнального пептида и терминатор транскрипции. Как минимум, регуляторные последовательности включают в себя промотор, а также сигналы остановки транскрипции и трансляции. В регуляторных последовательностях могут быть предусмотрены линкеры с целью введения специфических сайтов рестрикции, способствующих лигированию контрольных последовательностей с кодирующей областью полинуклеотида, кодирующего вариант.

Термин ''моющий компонент'' в данном документе определен как такой, который означает типы химических веществ, которые могут использоваться в моющих композициях. Примерами моющих компонентов являются поверхностно-активные вещества, гидротропы, компоненты моющих средств, дополнительные компоненты моющих средств, комплексообразователи или комплексообразующие средства, отбеливающая система или отбеливающие компоненты, полимеры, средства для окрашивания тканей, кондиционеры для тканей, пенообразователи, подавители образования мыльной пены, диспергирующие средства, ингибиторы переноса красителя, флуоресцентные отбеливающие средства, отдушка, оптические осветлители, бактерициды, фунгициды, средства для суспендирования загрязнений, грязеотталкивающие полимеры, средства против переосаждения, ингибиторы или стабилизаторы ферментов, активаторы ферментов, антиоксиданты и солюбилизаторы. Моющая композиция может состоять из одного или нескольких моющих компонентов любого типа.

Термин "моющая композиция" предусматривает, если не указано иное, все формы моющих композиций, такие как гель, гранулят, жидкость, паста, порошок, спрей или таблетка, в том числе жидкие средства, предназначенные для тяжелого режима работы (HDL), жидкие моющие средства для тонких тканей, жидкие и/или твердые моющие средства для стирки и моющие средства для тонких тканей; чистящие составы для твердых поверхностей, например, стекла, древесины, керамики и металлических поверхностей стоек и окон; средства для очистки ковров; средства для очистки духовых шкафов; освежители тканей; мягчители тканей; средства для предварительного замачивания и стирки текстильных изделий, а также моющие средства для мытья посуды, такие как средства для ручного мытья посуды, средства для мытья посуды, предназначенные для легкого режима работы, средства для машинного мытья посуды; моющие средства широкого применения или предназначенные для тяжелого режима работы, моющие средства широкого применения в форме жидкости, геля или пасты, жидкие средства для очистки и дезинфекции, в том числе типы атибактериальных средств для ручной стирки, бруски мыла для очистки, ополаскиватели для рта, очищающие средства для зубов и полости рта, шампуни для машин или ковров, средства для очистки ванной комнаты; шампуни и ополаскиватели для волос; гели для душа, пены для ванн; очистители для металла, а также вспомогательные средства для очистки, такие как отбеливающие добавки и "средства для удаления пятен в форме стика" или типы средств для предварительной обработки.

В дополнение к содержащемуся варианту субтилазы по настоящему изобретению, моющий состав может содержать один или несколько дополнительных ферментов (таких как амилазы, каталазы, целлюлазы (например, эндоглюканазы), кутиназы, галогенпероксигеназы, липазы, маннаназы, пектиназы, пектин-лиазы, пероксидазы, протеазы, ксантаназы и ксилоглюканазы, или любую их смесь) и/или компонентов, таких как поверхностно-активные вещества, компоненты моющих средств, комплексообразователи или комплексообразующие средства, отбеливающая система или отбеливающие компоненты, полимеры, кондиционеры для тканей, пенообразователи, подавители образования мыльной пены, красители, отдушка, ингибиторы потускнения, оптические осветлители, бактерициды, фунгициды, средства для суспендирования загрязнения, антикоррозионные средства, ингибиторы или стабилизаторы ферментов, активаторы ферментов, трансфераза(-зы), гидролитические ферменты, оксидоредуктазы, виды синьки и флуоресцентные красители, антиоксиданты и солюбилизаторы.

Термин "мытье посуды" относится ко всем способам мытья посуды, например вручную или автоматизированному мытью посуды. Мытье посуды предусматривает без ограничения очистку всех видов посудных изделий, таких как тарелки, чашки, стаканы, миски, всех видов столовых приборов, таких как ложки, ножи, вилки и сервировочные принадлежности, а также керамики, пластмасс, таких как меламинсодержащие, металлов, фарфора, стекла и акрилопластов.

Термин "композиция для мытья посуды" относится ко всем видам композиций для очистки твердых поверхностей. Настоящее изобретение не ограничивается каким-либо определенным типом композиции для мытья посуды или каким-либо определенным моющим средством.

Термин "экспрессия" включает любую стадию, задействованную в получении варианта, в том числе без ограничения транскрипцию, посттранскрипционную модификацию, трансляцию, посттрансляционную модификацию и секрецию.

Термин "вектор экспрессии" означает линейную или кольцевую молекулу ДНК, которая содержит полинуклеотид, кодирующий вариант, и функционально связана с регуляторными последовательностями, которые обеспечивают ее экспрессию.

Термин "очистка твердой поверхности'' определен в данном документе как очистка твердых поверхностей, причем твердые поверхности могут включать полы, столы, стены, потолки и т. д., а также поверхности твердых объектов, например автомобилей (мойка автомобилей) и посуды (мытье посуды). Мытье посуды предусматривает без ограничения очистку тарелок, чашек, стаканов, мисок и столовых приборов, таких как ложки, ножи, вилки, сервировочные принадлежности, керамики, пластмасс, таких как меламинсодержащие, металлов, фарфора, стекла и акрилопластов.

Термин ''клетка-хозяин'' означает любой тип клеток, который является восприимчивым к трансформации, трансфекции, трансдукции или подобным процедурам с помощью конструкции нуклеиновой кислоты или вектора экспрессии, содержащих полинуклеотид по настоящему изобретению. Термин "клетка-хозяин" охватывает любого потомка исходной клетки, который не является идентичным исходной клетке вследствие мутаций, происходящих в ходе репликации.

Термин "улучшенное свойство" означает характеристику, связанную с вариантом субтилазы, которая является улучшенной по сравнению с исходной субтилазой. Такие улучшенные свойства включают без ограничения моющую способность, протеазную активность, профиль активности при различных температурах, термостабильность, профиль активности при различных значениях pH, pH-стабильность, субстратную/кофакторную специфичность, улучшенные поверхностные свойства, субстратную специфичность, специфичность к продукту, повышенную стабильность, улучшенную стабильность в условиях хранения и химическую стабильность.

Термин "стабильность" включает стабильность при хранении и стабильность при применении, например во время процесса мытья, и отображает стабильность варианта субтилазы в соответствии с настоящим изобретением в зависимости от времени, например, сколько активности сохраняется, когда вариант субтилазы находится в растворе, в частности в моющем растворе. Стабильность зависит от многих факторов, например, значения pH, температуры, моющей композиции, например, количества компонента моющих средств, поверхностно-активных веществ и т. д. Термин "улучшенная стабильность" или "повышенная стабильность" в данном документе определяют как вариант субтилазы, проявляющий повышенную стабильность в растворе относительно стабильности исходной субтилазы. Термины "улучшенная стабильность" и "повышенная стабильность" включают "улучшенную химическую стабильность", "стабильность моющего средства" или "улучшенную стабильность моющего средства''.

Термин "улучшенная химическая стабильность" в данном документе определяют как вариант субтилазы, проявляющий сохранение ферментативной активности после периода инкубирования в присутствии химического вещества или химических веществ, либо встречающихся в естественных условиях, либо синтетических, что уменьшает ферментативную активность исходного фермента. Улучшенная химическая стабильность может быть также следствием вариантов, которые являются более способными катализировать реакцию в присутствии таких химических веществ. В конкретном аспекте настоящего изобретения улучшенная химическая стабильность представляет собой улучшенную стабильность в моющем средстве, в частности в жидком моющем средстве. Термин "стабильность моющего средства" или "улучшенная стабильность моющего средства" представляет собой, в частности, улучшенную стабильность протеазной активности, когда вариант субтилазы по настоящему изобретению смешивают с жидким моющим составом и затем хранят при температуре от 15 до 50°C, например, 20°C, 30°C или 40°C.

Термин "улучшенная термическая активность" означает вариант, проявляющий измененный профиль активности в зависимости от температуры при определенной температуре относительно профиля активности в зависимости от температуры исходной формы. Значение термической активности представляет собой меру эффективности варианта в усилении катализа реакции гидролиза в диапазоне температур. Более термоактивный вариант приведет к повышению усиления скорости гидролиза субстрата композицией фермента, уменьшая тем самым требуемое время и/или уменьшая требуемую концентрацию активности фермента. В качестве альтернативы, вариант со сниженной активностью при различных температурах будет усиливать ферментативную реакцию при температуре более низкой, чем при температурном оптимуме для исходной формы, определенном профилем активности в зависимости от температуры исходной формы.

Термин "улучшенная моющая способность" определяют в данном документе как вариант субтилазы в соответствии с настоящим изобретением, проявляющий улучшенную моющую способность относительно моющей способности исходной протеазы, например с помощью повышенного удаления пятен. Термин "моющая способность" включает моющую способность при стирке, а также, например, при мытье посуды. Моющую способность можно определить количественно как описано для определения "моющей способности" в данном документе.

Термин "выделенный" означает вещество в форме или среде, которые не встречаются в естественных условиях. Неограничивающие примеры выделенных веществ предусматривают (1) любое не встречающееся в естественных условиях вещество, (2) любое вещество, в том числе без ограничения любой фермент, вариант, нуклеиновая кислота, белок, пептид или кофактор, которые по меньшей мере частично отделены от одного или нескольких, или всех, встречающихся в естественных условиях составляющих, с которыми они связаны в естественных условиях; (3) любое вещество, модифицированное человеком, по сравнению с таким веществом, встречающимся в природе, или (4) любое вещество, модифицированное с помощью увеличения количества вещества по сравнению с другими компонентами, с которыми оно связано в естественных условиях (например, несколько копий гена, кодирующего вещество; применение более сильного промотора, чем промотор, связанный в естественных условиях с геном, кодирующим вещество). Выделенное вещество может присутствовать в образце в виде ферментативного бульона.

Термин ''стирка" относится как к стирке в домашних условиях, так и к промышленной стирке, и означает процесс обработки текстильных изделий и/или тканей раствором, содержащим моющую композицию по настоящему изобретению. Например, процесс стирки можно осуществлять с применением например домашней или промышленной стиральной машины, или можно осуществлять вручную.

Термин "зрелый полипептид" означает полипептид в его конечной форме, после трансляции и любых посттрансляционных модификаций, таких как процессинг N-концевой части, усечение C-концевой части, гликозилирование, фосфорилирование, аутокаталитическая активация и т. д. В одном аспекте зрелый полипептид представляет собой аминокислоты от 1 до 269 в SEQ ID NO: 1 и от 1 до 275 в SEQ ID NO: 2. Из уровня техники известно, что клетка-хозяин может вырабатывать смесь из двух или более различных зрелых полипептидов (т. е. с другой C-концевой и/или N-концевой аминокислотой), экспрессируемых одним и тем же полинуклеотидом.

Термин ʺпоследовательность, кодирующая зрелый полипептидʺ означает полинуклеотид, который кодирует зрелый полипептид, обладающий протеазной активностью.

Термин "мутант" означает полинуклеотид, кодирующий вариант.

Термин "конструкция нуклеиновой кислоты" означает либо одно-, либо двухцепочечную молекулу нуклеиновой кислоты, выделенную из встречающегося в естественных условиях гена, или модифицированную для того, чтобы она содержала сегменты нуклеиновых кислот в таком порядке, который в иных случаях не может существовать в естественных условиях, или являющуюся синтетической, которая содержит одну или несколько регуляторных последовательностей.

Термин "функционально связанный" означает конфигурацию, при которой регуляторная последовательность размещена в соответствующем положении относительно кодирующей последовательности полинуклеотида так, что регуляторная последовательность управляет экспрессией кодирующей последовательности.

Термин "исходная" означает протеазу, в которой произведено изменение с целью получения вариантов фермента по настоящему изобретению. Будет понятно, что в данном контексте термин ''имеющая идентичную аминокислотную последовательность'' относится к последовательности со 100% идентичностью. В конкретном варианте осуществления исходной является протеаза, по меньшей мере на 60% идентичная, например по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 81%, по меньшей мере на 82%, по меньшей мере на 83%, по меньшей мере на 84%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичная полипептиду под SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11.

В данном документе термин "протеаза" определяют как фермент, который гидролизирует пептидные связи. Он включает в себя любой фермент, принадлежащий к группе ферментов EC 3.4 (в том числе каждый из их тринадцати подклассов). Номер EC ссылается на Номенклатуру ферментов 1992 из NC-IUBMB, Academic Press, Сан-Диего, Калифорния, в том числе дополнения 1-5, опубликованные соответственно в Eur. J. Biochem. 1223: 1-5 (1994); Eur. J. Biochem. 232: 1-6 (1995); Eur. J. Biochem. 237: 1-5 (1996); Eur. J. Biochem. 250: 1-6 (1997); и Eur. J. Biochem. 264: 610-650 (1999). Наиболее широко используемыми протеазами в производстве моющих средств, как например для стирки и мытья посуды, являются сериновые протеазы или сериновые пептидазы, которые представляют собой подгруппу протеаз, характеризующихся наличием серина в активном участке, который образует ковалентный аддукт с субстратом. Кроме того, субтилазы (и сериновые протеазы) характеризуются наличием в активном участке двух аминокислотных остатков, кроме серина, а именно остатка гистидина и остатка аспарагиновой кислоты. Субтилаза относится к подгруппе сериновой протеазы в соответствии с Siezen et al., 1991, Protein Engng. 4: 719-737 и Siezen et al., 1997, Protein Science 6: 501-523. Субтилазы могут быть разделены на 6 подразделов, т. е. семейство субтилизина, семейство термитазы, семейство протеиназы K, семейство пептидазы-лантибиотика, семейство кексина и семейство пиролизина. Термин ''протеазная активность'' означает протеолитическую активность (EC 3.4). Протеазы, применяемые в моющих средствах, в основном представляют собой эндопептидазы (EC 3.4.21). Существует несколько типов протеазной активности. Тремя главными типами активности являются: трипсиноподобный, где расщепление амидных субстратов происходит после Arg или Lys в P1, химотрипсиноподобный, где расщепление происходит после одной из гидрофобных аминокислот в P1, и эластазоподобный с расщеплением после Ala в P1. Для целей настоящего изобретения протеазную активность определяют в соответствии с анализом активности Suc-AAPF-pNA, описанным ниже в разделе материалы и способы. В одном аспекте варианты субтилазы по настоящему изобретению характеризуются по меньшей мере 20%, например, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 100% ферментативной активностью зрелого полипептида исходного фермента. В одном определенном аспекте варианты субтилазы по настоящему изобретению характеризуются по меньшей мере 20%, например, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 100% ферментативной активностью полипептида под SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11.

Термин "протеазная активность" означает протеолитическую активность (EC 3.4). Протеазы по настоящему изобретению представляют собой эндопептидазы (EC 3.4.21). Существует несколько типов протеазной активности. Тремя главными типами активности являются: трипсиноподобный, где расщепление амидных субстратов происходит после Arg или Lys в P1, химотрипсиноподобный, где расщепление происходит после одной из гидрофобных аминокислот в P1, и эластазоподобный с расщеплением после Ala в P1. Для целей настоящего изобретения протеазную активность определяют в соответствии с процедурой, описанной ниже в разделе "Материалы и способы". Варианты субтилазы по настоящему изобретению предпочтительно характеризуются по меньшей мере 20%, например, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% и по меньшей мере 100% протеазной активностью полипептида под SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11.

Родство между двумя аминокислотными последовательностями или между двумя нуклеотидными последовательностями описывается параметром "идентичность последовательностей". Для целей настоящего изобретения идентичность последовательности для двух аминокислотных последовательностей определяют с использованием алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman и Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), который реализован в программе Needle из пакета программ EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), предпочтительно версии 5.0.0 или более поздней. Применяемыми параметрами являются: штраф за открытие гэпа, составляющий 10, штраф за продление гэпа, составляющий 0,5, и матрица замен EBLOSUM62 (версия BLOSUM62 для EMBOSS). Выходные данные в Needle, помеченные как "самая длинная идентичность" (полученные с применением опции nobrief), применяют в качестве процента идентичности и рассчитывают следующим образом:

(идентичные остатки x 100)/(длина выравниваемого участка - общее число гэпов в выравниваемом участке).

Для целей настоящего изобретения идентичность последовательностей для двух дезоксирибонуклеотидных последовательностей может быть определена с использованием алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, supra), который реализован в программе Needle из пакета программ EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), предпочтительно версии 5.0.0 или более поздней. Применяемыми параметрами являются штраф за открытие гэпа, составляющий 10, штраф за продление гэпа, составляющий 0,5, и матрица замен EDNAFULL (версия NCBI NUC4.4 для EMBOSS). Выходные данные в Needle, помеченные как "самая длинная идентичность" (полученные с применением опции nobrief), применяют в качестве процента идентичности и рассчитывают следующим образом:

(идентичные дезоксирибонуклеотиды x 100)/(длина выравниваемого участка - общее число гэпов в выравниваемом участке)

Условия различной жесткости определены ниже.

Термин "условия очень низкой жесткости" означает для зондов длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов предварительную гибридизацию и гибридизацию при 42°C в 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 микрограммах/мл разрезанной и денатурированной ДНК из молок лососевых, а также 35% формамиде после стандартных процедур Саузерн-блоттинга в течение 12-24 часов. В конце материал-носитель промывают три раза, каждый раз в течение 15 минут, с применением 2X SSC, 0,2% SDS при 60°C.

Термин "условия низкой жесткости" означает для зондов длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов предварительную гибридизацию и гибридизацию при 42°C в 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 микрограммах/мл разрезанной и денатурированной ДНК из молок лососевых, а также 35% формамиде после стандартных процедур Саузерн-блоттинга в течение 12-24 часов. В заключение, материал-носитель промывают три раза, каждый раз в течение 15 минут, с применением 1X SSC, 0,2% SDS при 60°C.

Термин "условия умеренной жесткости" означает для зондов длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов предварительную гибридизацию и гибридизацию при 42°C в 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 микрограммах/мл разрезанной и денатурированной ДНК из молок лососевых, а также 35% формамиде после стандартных процедур Саузерн-блоттинга в течение 12-24 часов. В заключение, материал-носитель промывают три раза, каждый раз в течение 15 минут, с применением 1х SSC, 0,2% SDS при 65°C.

Термин "условия умеренно высокой жесткости" означает для зондов длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов предварительную гибридизацию и гибридизацию при 42°C в 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 микрограммах/мл разрезанной и денатурированной ДНК из молок лососевых, а также 35% формамиде после стандартных процедур Саузерн-блоттинга в течение 12-24 часов. В заключение, материал-носитель промывают три раза, каждый раз в течение 15 минут, с применением 0,5X SSC, 0,2% SDS при 65°C.

Термин "условия высокой жесткости" означает для зондов длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов предварительную гибридизацию и гибридизацию при 42°C в 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 микрограммах/мл разрезанной и денатурированной ДНК из молок лососевых, а также 35% формамиде после стандартных процедур Саузерн-блоттинга в течение 12-24 часов. В заключение, материал-носитель промывают три раза, каждый раз в течение 15 минут, с применением 0,3X SSC, 0,2% SDS при 65°C.

Термин "условия очень высокой жесткости" означает для зондов длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов предварительную гибридизацию и гибридизацию при 42°C в 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 микрограммах/мл разрезанной и денатурированной ДНК из молок лососевых, а также 35% формамиде после стандартных процедур Саузерн-блоттинга в течение 12-24 часов. В заключение, материал-носитель промывают три раза, каждый раз в течение 15 минут, с применением 0,15X SSC, 0,2% SDS при 65°C.

Термин "практически чистый вариант" означает препарат, который содержит не более 10%, не более 8%, не более 6%, не более 5%, не более 4%, не более 3%, не более 2%, не более 1% и не более 0,5% по весу другого полипептидного материала, с которым он связан в естественных условиях или при получении с помощью методик рекомбинантных ДНК. Предпочтительно вариант является по меньшей мере на 92% чистым, например, по меньшей мере на 94% чистым, по меньшей мере на 95% чистым, по меньшей мере на 96% чистым, по меньшей мере на 97% чистым, по меньшей мере на 98% чистым, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5% чистым и на 100% чистым по весу от всего полипептидного материала, присутствующего в препарате. Варианты по настоящему изобретению предпочтительно присутствуют в практически чистой форме. Это может быть достигнуто, например, путем получения варианта с помощью хорошо известных рекомбинантных способов или с помощью классических способов очистки.

Термин "практически чистый полинуклеотид" означает, что полинуклеотидный препарат не содержит других посторонних или нежелательных нуклеотидов и имеет форму, подходящую для применения в системах для получения полипептидов методами генной инженерии. Таким образом, практически чистый полинуклеотид содержит не более 10%, не более 8%, не более 6%, не более 5%, не более 4%, не более 3%, не более 2%, не более 1% и не более 0,5% по весу другого полипептидного материала, с которым он связан в естественных условиях или при получении с помощью методик рекомбинантных ДНК. Тем не менее, практически чистый полинуклеотид может включать в себя встречающиеся в естественных условиях 5'- и 3'- нетранслируемые области, такие как промоторы и терминаторы. Предпочтительно, чтобы практически чистый полинуклеотид являлся по меньшей мере на 90% чистым, например, по меньшей мере на 92% чистым, по меньшей мере на 94% чистым, по меньшей мере на 95% чистым, по меньшей мере на 96% чистым, по меньшей мере на 97% чистым, по меньшей мере на 98% чистым, по меньшей мере на 99% чистым и по меньшей мере на 99,5% чистым по весу. Полинуклеотиды по настоящему изобретению предпочтительно присутствуют в практически чистой форме.

Термин "текстильное изделие" означает любой текстильный материал, в том числе пряжу, промежуточные продукты из пряжи, волокна, нетканые материалы, природные материалы, синтетические материалы, а также ткани, изготовленные из данных материалов, такие как предметы одежды, сорта материи и другие изделия. При использовании терминов "ткань" или "предмет одежды" предусматривается, что они предназначены также для охватывания более общего термина "текстильные изделия".

Термин "вариант" означает полипептид, обладающий протеазной активностью, содержащий изменение, т. е. замену, вставку и/или делецию в трех или более (например, нескольких) положениях. Замена означает замещение аминокислоты, занимающей определенное положение, другой аминокислотой; делеция означает удаление аминокислоты, занимающей определенное положение, и вставка означает добавление одной или нескольких (например, некоторого количества) аминокислот, например, 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот, рядом с и непосредственно после аминокислоты, занимающей определенное положение. Термин "вариант субтилазы" означает вариант исходной субтилазы, т. е. вариант субтилазы представляет собой субтилазу, которая содержит изменения, т. е. замену, вставку и/или делецию в трех или более (например, нескольких) положениях по сравнению с исходной субтилазой.

Термин "моющая способность" используют как способность фермента удалять пятна, присутствующие на подлежащем очистке объекте, например при мытье, таком как стирка или очистка твердых поверхностей. Улучшение моющей способности можно определить количественно с помощью расчета так называемого значения интенсивности (Int), определенного в анализе AMSA, как описано в примере 3.

Термин "субтилаза дикого типа" означает протеазу, экспрессируемую организмом, встречающимся в естественных условиях, таким как бактерия, археи, дрожжи, гриб, растение или животное, встречающиеся в природе. Примером субтилазы дикого типа является субтилизин BPN', т. е. аминокислоты от 1 до 275 в SEQ ID NO: 2.

Условные обозначения для указания вариантов

Для целей настоящего изобретения субтилизин BPN' (последовательность аминокислот 1-275 в SEQ ID NO: 2 (Siezen et al., 1991, Protein Eng. 4: 719-737)) применяют для определения соответствующего аминокислотного остатка в другой протеазе. Аминокислотную последовательность другой протеазы выравнивают со зрелым полипептидом, раскрытым в SEQ ID NO: 2, и на основании выравнивания номер положения аминокислоты, соответствующий любому аминокислотному остатку в полипептиде, раскрытом в SEQ ID NO: 2, определяют с использованием алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman и Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), который реализован в программе Needle из пакета программ EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), предпочтительно версии 5.0.0 или более поздней. Применяемыми параметрами являются: штраф за открытие гэпа, составляющий 10, штраф за продление гэпа, составляющий 0,5, и матрица замен EBLOSUM62 (версия BLOSUM62 для EMBOSS).

Идентификацию соответствующего аминокислотного остатка в другой протеазе можно определить с помощью выравнивания последовательностей нескольких полипептидов с использованием нескольких компьютерных программ, в том числе без ограничения MUSCLE (сравнение нескольких последовательностей по log‐ожиданию; версия 3.5 или более поздняя; Edgar, 2004, Nucleic Acids Research 32: 1792-1797), MAFFT (версия 6.857 или более поздняя; Katoh и Kuma, 2002, Nucleic Acids Research 30: 3059-3066; Katoh et al., 2005, Nucleic Acids Research 33: 511-518; Katoh и Toh, 2007, Bioinformatics 23: 372-374; Katoh et al., 2009, Methods in Molecular Biology 537: 39-64; Katoh и Toh, 2010, Bioinformatics 26:1899-1900) и EMBOSS EMMA, в которой применяется ClustalW (1.83 или более поздняя; Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680), с использованием их соответствующих параметров до умолчанию.

Если другой фермент отличается от зрелого полипептида под SEQ ID NO: 2 так, что с помощью традиционного сравнения на основании последовательностей невозможно обнаружить их родство (Lindahl и Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613-615), то можно применять другие алгоритмы попарного сравнения последовательностей. Большей чувствительности поиска на основании последовательности можно достичь с использованием программ поиска, в которых используются вероятностные представления семейств полипептидов (профилей) для поиска по базам данных. Например, программа PSI-BLAST создает профили с помощью процесса итеративного поиска по базам данных и способна к выявлению отдаленных гомологов (Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Еще большей чувствительности можно достичь, если семейство или суперсемейство для данного полипептида имеет одного или нескольких представителей в базах данных структуры белков. В программах, таких как GenTHREADER (Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815; McGuffin и Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881), используется информация из ряда источников (PSI-BLAST, данные прогнозирования вторичной структуры, профили структурного выравнивания и потенциалы сольватации) в качестве данных, вводимых в нейронную сеть, с помощью которой предсказывают структурную укладку для запрашиваемой последовательности. Подобным образом способ согласно Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903-919 можно применять для выравнивания последовательности неизвестной структуры с моделями суперсемейств, присутствующими в базе данных SCOP. В свою очередь, эти выравнивая можно применять для создания моделей гомологии для полипептида, и точность таких моделей можно оценивать с помощью ряда инструментов, разработанных для данной цели.

Для белков с известной структурой доступны несколько инструментов и ресурсов для отыскания и создания структурных выравниваний. Например, суперсемейства белков в SCOP были выравнены по структуре, и результаты этих выравниваний находятся в открытом доступе, а также доступны для загрузки. Структуры двух или более белков можно выравнивать с применением ряда алгоритмов, таких как выравнивание на основе матрицы расстояний (Holm и Sander, 1998, Proteins 33: 88-96) или комбинаторного удлинения (Shindyalov и Bourne, 1998, Protein Engineering 11: 739-747), и выполнение таких алгоритмов можно дополнительно использовать для составления запросов в отношении представляющей интерес структуры в базах данных структуры с целью нахождения возможных структурных гомологов (например, Holm и Park, 2000, Bioinformatics 16: 566-567).

При описании вариантов по настоящему изобретению нижеописанная номенклатура адаптирована для простоты упоминания. Используется принятая IUPAC однобуквенная или трехбуквенная аббревиатура для аминокислот.

Замены. В отношении аминокислотной замены используют следующую номенклатуру: исходная аминокислота, положение, заменяющая аминокислота. Соответственно, замену треонина в положении 226 на аланин обозначают как "Thr226Ala" или "T226A". Несколько мутаций разделяют знаками сложения ("+"), например, выражения "Gly205Arg+Ser411Phe" или "G205R+S411F" представляют собой соответственно замены в положениях 205 и 411 глицина (G) на аргинин (R) и серина (S) на фенилаланин (F). "X" перед положением означает, что любая исходная аминокислота в данном положении может быть заменена. Например, X9E означает, что любой аминокислотный остаток в положении 9, отличающийся от E, заменен на E; X206L означает, что любой аминокислотный остаток в положении 206, отличающийся от L, заменен на L; и X262E означает, что любой аминокислотный остаток в положении 262, отличающийся от E, заменен на E.

Делеции. В отношении делеции аминокислот используют следующую номенклатуру: исходная аминокислота, положение, *. Соответственно делецию глицина в положении 195 обозначают как "Gly195*" или "G195*". Несколько делеций разделяют знаками сложения ("+"), например, "Gly195*+Ser411*" или "G195*+S411*".

Вставки. Вставку дополнительного аминокислотного остатка, такого как например лизин, после G195 можно обозначить как Gly195GlyLys или G195GK. В качестве альтернативы вставку дополнительного аминокислотного остатка, такого как лизин, после G195 можно обозначить как *195aK. Когда вставляют более одного аминокислотного остатка, такого как например Lys и Ala, после G195 это можно обозначить как Gly195GlyLysAla или G195GKA. В таких случаях вставленный(-ные) аминокислотный(-ные) остаток(-ки) можно нумеровать также с помощью добавления строчных букв к номеру положения аминокислотного остатка, предшествующего вставленному(-ным) аминокислотному(-ным) остатку(-кам), как в данном примере: *195aK *195bA. Так, в вышеуказанном примере последовательности 194-196 будут иметь следующий вид:

194 195 196

субтилизин 309 A - G - L

194 195 195a 195b 196

вариант A - G - K - A - L

В случаях, когда замена и вставка происходят в одном положении, это можно обозначить как S99SD+S99A, или кратко S99AD. Такую же модификацию можно также обозначить как S99A+*99aD.

В случаях, когда вставляют аминокислотный остаток, идентичный существующему аминокислотному остатку, ясно, что возникает вырождение в номенклатуре. Например, если глицин вставляют после глицина в примере выше, то это будет обозначено как G195GG или *195GaG. Точно такое же изменение можно также обозначать как A194AG или *194aG для изменения из

194 195 196

субтилизина 309 A - G - L

на

194 195 195a 196

вариант A - G - G - L

194 194a 195 196

Такие случаи будут очевидны специалисту, и таким образом обозначение G195GG, а также соответствующие обозначения для данного типа вставок, предназначены включать такие эквивалентные вырожденные обозначения.

Множественные изменения. Варианты, содержащие множественные изменения, разделены знаками сложения ("+"), например, "Arg170Tyr+Gly195Glu" или "R170Y+G195E" представляют собой замену аргинина и глицина в положениях 170 и 195 соответственно на тирозин и глутаминовую кислоту. В качестве альтернативы, множественные изменения могут быть разделены пробелом или запятой, например, соответственно A170Y G195E или A170Y, G195E.

Различные изменения. Если различные изменения могут вводиться в какое-либо положение, то эти различные изменения разделяют запятой, например, "Arg170Tyr,Glu" представляет собой замену аргинина в положении 170 на тирозин или глутаминовую кислоту. Следовательно, "Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala" обозначает следующие варианты:

"Tyr167Gly+Arg170Gly", "Tyr167Gly+Arg170Ala", "Tyr167Ala+Arg170Gly", и "Tyr167Ala+Arg170Ala".

В качестве альтернативы, различные изменения или необязательные замены можно обозначать в скобках, например, Arg170[Tyr, Gly] или Arg170{Tyr, Gly}, либо кратко R170 [Y,G] или R170 {Y, G}.

Подробное описание изобретения

В одном варианте осуществления вариант субтилазы характеризуется улучшенной стабильностью, в частности улучшенной стабильностью при хранении, по сравнению с исходной субтилазой. В предпочтительном варианте осуществления вариант субтилазы характеризуется улучшенной стабильностью, в частности улучшенной стабильностью при хранении, и такой же или улучшенной моющей способностью по сравнению с исходной субтилазой.

В другом варианте осуществления вариант субтилазы представляет собой

a) полипептид, последовательность которого по меньшей мере на 60%, но менее чем на 100% идентична аминокислотной последовательности исходной субтилазы;

b) полипептид, кодируемый полинуклеотидом, который гибридизуется в условиях низкой жесткости, условиях средней жесткости, условиях умеренно высокой жесткости, условиях высокой жесткости или условиях очень высокой жесткости с

(i) последовательностью, кодирующей зрелый полипептид исходной субтилазы или

(ii) полноразмерной последовательностью, комплементарной (i); или

с) полипептид, который кодируется полинуклеотидом, последовательность которого по меньшей мере на 60%, но менее чем на 100% идентична кодирующей последовательности зрелого полипептида исходной субтилазы.

В одном варианте осуществления последовательность варианта субтилазы по меньшей мере на 65%, но менее чем на 100% идентична последовательности исходной субтилазы. В одном варианте осуществления последовательность варианта субтилазы по меньшей мере на 70%, но менее чем на 100% идентична последовательности исходной субтилазы. В одном варианте осуществления последовательность варианта субтилазы по меньшей мере на 75%, но менее чем на 100% идентична последовательности исходной субтилазы. В одном варианте осуществления последовательность варианта субтилазы по меньшей мере на 80%, но менее чем на 100% идентична последовательности исходной субтилазы. В одном варианте осуществления последовательность варианта субтилазы по меньшей мере на 85%, но менее чем на 100% идентична последовательности исходной субтилазы. В одном варианте осуществления последовательность варианта субтилазы по меньшей мере на 90%, но менее чем на 100% идентична последовательности исходной субтилазы. В одном варианте осуществления последовательность варианта субтилазы по меньшей мере на 93%, но менее чем на 100% идентична последовательности исходной субтилазы. В одном варианте осуществления последовательность варианта субтилазы по меньшей мере на 95%, но менее чем на 100% идентична последовательности исходной субтилазы. В одном варианте осуществления последовательность варианта субтилазы по меньшей мере на 96%, но менее чем на 100% идентична последовательности исходной субтилазы. В одном варианте осуществления последовательность варианта субтилазы по меньшей мере на 97%, но менее чем на 100% идентична последовательности исходной субтилазы. В одном варианте осуществления последовательность варианта субтилазы по меньшей мере на 98%, но менее чем на 100% идентична последовательности исходной субтилазы.

В одном варианте осуществления вариант имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60% идентична SEQ ID NO: 1, например по меньшей мере на 60%, например по меньшей мере на 70%, например по меньшей мере на 80%, например по меньшей мере на 90%, например по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 1.

В другом варианте осуществления вариант имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60% идентична SEQ ID NO: 2, например по меньшей мере на 60%, например по меньшей мере на 70%, например по меньшей мере на 80%, например по меньшей мере на 90%, например по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 2.

В другом варианте осуществления вариант имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60% идентична SEQ ID NO: 3, например по меньшей мере на 60%, например по меньшей мере на 70%, например по меньшей мере на 80%, например по меньшей мере на 90%, например по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 3.

В другом варианте осуществления вариант имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60% идентична SEQ ID NO: 4, например по меньшей мере на 60%, например по меньшей мере на 70%, например по меньшей мере на 80%, например по меньшей мере на 90%, например по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 4.

В другом варианте осуществления вариант имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60% идентична SEQ ID NO: 5, например по меньшей мере на 60%, например по меньшей мере на 70%, например по меньшей мере на 80%, например по меньшей мере на 90%, например по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 5.

В другом варианте осуществления вариант имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60% идентична SEQ ID NO: 6, например по меньшей мере на 60%, например по меньшей мере на 70%, например по меньшей мере на 80%, например по меньшей мере на 90%, например по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 6.

В другом варианте осуществления вариант имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60% идентична SEQ ID NO: 7, например по меньшей мере на 60%, например по меньшей мере на 70%, например по меньшей мере на 80%, например по меньшей мере на 90%, например по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 7.

В другом варианте осуществления вариант имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60% идентична SEQ ID NO: 8, например по меньшей мере на 60%, например по меньшей мере на 70%, например по меньшей мере на 80%, например по меньшей мере на 90%, например по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 8.

В другом варианте осуществления вариант имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60% идентична SEQ ID NO: 9, например по меньшей мере на 60%, например по меньшей мере на 70%, например по меньшей мере на 80%, например по меньшей мере на 90%, например по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 9.

В другом варианте осуществления вариант имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60% идентична SEQ ID NO: 10, например по меньшей мере на 60%, например по меньшей мере на 70%, например по меньшей мере на 80%, например по меньшей мере на 90%, например по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 10.

В другом варианте осуществления вариант имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60% идентична SEQ ID NO: 11, например по меньшей мере на 60%, например по меньшей мере на 70%, например по меньшей мере на 80%, например по меньшей мере на 90%, например по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 11.

В одном аспекте общее число изменений в исходной субтилазе составляет от 3 до 30, предпочтительно от 3 до 20, более предпочтительно от 3 до 15, еще более предпочтительно от 3 до 10, наиболее предпочтительно от 3 до 8 изменений. В другом аспекте общее число изменений в исходной субтилазе составляет 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 изменений.

Варианты субтилазы по настоящему изобретению могут дополнительно содержать одну или несколько дополнительных изменений. Изменения аминокислот могут быть незначительными, то есть являться консервативными аминокислотными заменами или вставками, которые не оказывают значительного влияния на укладку и/или активность белка; небольшими делециями, как правило, размером 1-30 аминокислот; небольшими удлинениями на амино- или карбокси-конце, такими как метиониновый остаток на амино-конце; небольшим линкерным пептидом размером до 20-25 остатков; или небольшим удлинением, которое облегчает очистку с помощью изменения суммарного заряда, или другой функциональной группой, такой как полигистидиновый тракт, антигенный эпитоп или связывающий домен.

Примерами консервативных замен являются замены в пределах групп основных аминокислот (аргинин, лизин и гистидин), кислых аминокислот (глутаминовая кислота и аспарагиновая кислота), полярных аминокислот (глутамин и аспарагин), гидрофобных аминокислот (лейцин, изолейцин и валин), ароматических аминокислот (фенилаланин, триптофан и тирозин) и небольших аминокислот (глицин, аланин, серин, треонин и метионин). Аминокислотные замены, которые в целом не изменяют специфическую активность, известны из уровня техники и описаны, например, в H. Neurath and R.L. Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, New York. Обычные замены представляют собой Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, и Asp/Gly.

В качестве альтернативы, изменения аминокислот имеют такой характер, что физико-химические свойства полипептидов изменяются. Например, изменения аминокислот могут улучшать термоустойчивость полипептида, изменять субстратную специфичность, изменять pH-оптимум и т. п.

Незаменимые аминокислоты в полипептиде можно идентифицировать в соответствии с процедурами, известными из уровня техники, такими как сайт-направленный мутагенез или аланин-сканирующий мутагенез (Cunningham и Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). В последней методике отдельные мутации, заключающиеся в замене на аланин, вводят в каждый остаток в молекуле и полученные в результате мутантные молекулы исследуют в отношении протеазной активности с целью идентификации аминокислотных остатков, которые являются определяющими для активности молекулы. См. также Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. Активный сайт для ферментативного или другого биологического взаимодействия можно определять также с помощью физического анализа структуры, которую определяют с помощью таких методик, как ядерный магнитный резонанс, кристаллография, дифракция электронов или фотоаффинное мечение в сочетании с мутацией аминокислот предполагаемого контактирующего сайта. См., например, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. В отношении BPN' (SEQ ID NO: 2) для протеазной активности фермента необходима каталитическая триада, содержащая аминокислоты S221, H64 и D32.

В одном варианте осуществления вариант субтилазы содержит X9E+X206L+X262E и дополнительно содержит X76D (например, N76D).

В одном варианте осуществления или любом из вышеуказанных вариантов осуществления вариант субтилазы дополнительно содержит X9E+X206L+X262E и одно или несколько изменений, выбранных из группы, состоящей из X3T (например S3T), X4I (например V4I), X15T (например A15T), X24G (например S24G), X24R (например S24R), X27R (например K27R), *36D, X43A (например N43A), X43C (например N43C), X43L (например N43L), X43R (например N43R), X43W (например N43W), X68A (например V68A), X72A (например I72A), X72V (например I72V), X78D (например S78D), X87R (например N87R), X87S (например N87S), *97E, X98S (например A98S), X99A (например S99A), X99D (например S99D), X99A (например S99A), X99D (например S99D), X99E (например S99E), X99G (например S99G), *99D, X101D (например S101D), X101E (например S101E), X101G (например S101G), X101I (например S101I), X101K (например S101K), X101L (например S101L), X101M (например S101M), X101N (например S101N), X101R (например S101R), X103A (например S103A), X104F (например V104F), X104I (например V104I), X104N (например V104N), X104Y (например V104Y), X106A (например S106A), X114V (например A114V), X115T (например G115T), X115W (например G115W), X118R (например G118R), X118V (например G118V), X120D (например H120D), X120I (например H120I), X120N (например H120N), X120T (например H120T), X120V (например H120V), X123S (например N123S), X128A (например S128A), X128L (например S128L), X128S (например S128S), X129D (например P129D), X129N (например P129N), X129Q (например P129Q), X130A (например S130A), X147W (например V147W), X149C (например V149C), X149N (например V149N), X158E (например A158E), X160D (например G160D, X160P (например G160P), X161C (например S161C), X161E (например S161E), X162L (например I162L), X163A (например S163A), X163D (например S163D), X167A (например Y167A), X170S (например R170S), X182C (например Q182C), X182E (например Q182E), X185C (например N185C), X185E (например N185E), X188C (например S188C), X188D (например S188D), X188E (например S188E), X191N (например Q191N), X194P (например A194P), X195E (например G195E), X199M (например V199M), X204D (например N204D), X204V (например N204V), X205I (например V205I), X209W (например Y209W), X212A (например S212A), X212D (например S212D), X212G (например S212G), X212N (например S212N), X216I (например S216I), X216T (например S216T), X216V (например S216V), X217C (например L217C), X217D (например L217D), X217E (например L217E), X217M (например L217M), X217Q (например L217Q), X217Y (например L217Y), X218D (например N218D), X218E (например N218E), X218T (например N218T), X222C (например M222C), X222R (например M222R), X222S (например M222S), X225A (например P225A), X232V (например A232V), X235L (например K235L), X236H (например Q236H), X245K (например Q245K), X245R (например Q245R), X252K (например N252K), X255C (например T255C), X255E (например T255E), X256A (например S256A), X256C (например S256C), X256D (например S256D), X256V (например S256V), X256Y (например S256Y), X259D (например S259D), X260E (например T260E), X260P (например T260P), X261C (например N261C), X261E (например N261E), X261F (например N261F), X261L (например N261L), X261M (например N261M), X261V (например N261V), X261W (например N261W), X261Y (например N261Y), и X274A (например T274A), где каждое положение соответствует положению полипептида под SEQ ID NO: 2.

Настоящее изобретение относится к вариантам субтилазы, предпочтительно вариантам протеазы исходной протеазы, последовательность которых по меньшей мере на 60%, например по меньшей мере на 70%, например по меньшей мере на 75%, например по меньшей мере на 80%, например по меньшей мере на 85%, например по меньшей мере на 90%, например по меньшей мере на 95% или на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 1, где варианты субтилазы по сравнению с SEQ ID NO: 1 содержат замены X9E+X206L+X262E, например S9E+Q206L+L262E, где положения соответствуют положениям полипептида под SEQ ID NO: 2. Как упоминалось, SEQ ID NO: 2, используемая для нумерации выравнивания, можно найти на фиг. 1 и специалист в данной области техники может легко выровнять другую исходную субтилазу, кроме SEQ ID NO: 1, и найти соответствующие аминокислоты в SEQ ID NO: 2.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что трехкратная замена X9E+X206L+X262E обеспечивает субтилазе повышенную стабильность. Следовательно один вариант осуществления настоящего изобретения относится к вариантам субтилазы, которые по сравнению с исходной субтилазой и/или по сравнению с субтилазой под SEQ ID NO: 1 содержат три мутации X9E+X206L+X262E (пронумерованные в соответствии с SEQ ID NO: 2), и которые характеризуются повышенной стабильностью в моющем средстве по сравнению с исходной субтилазой, например по сравнению с SEQ ID NO: 1. Конкретный предпочтительный вариант осуществления относится к вариантам субтилазы, содержащим, по сравнению с SEQ ID NO: 1, замены X9E+X206L+X262E (пронумерованные в соответствии с SEQ ID NO 2) и характеризующимся по меньшей мере на 5%, например по меньшей мере на 10%, например по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 100%, по меньшей мере на 110%, по меньшей мере на 120%, по меньшей мере на 130%, по меньшей мере на 140%, по меньшей мере на 150%, по меньшей мере на 160%, по меньшей мере на 170% большей остаточной активностью, чем исходная субтилаза и/или субтилаза под SEQ ID NO: 1 при измерении через 47 часов при 60°C в жидком моющем средстве с pH 8, как описано в примерах 4 и 5 настоящей заявки. Другой предпочтительный вариант осуществления относится к вариантам субтилазы, содержащим, по сравнению с SEQ ID NO: 1, замены X9E+X206L+X262E (пронумерованные в соответствии с SEQ ID NO: 2), которые характеризуются коэффициентами улучшения периода полужизни t½ относительно исходного или относительно SEQ ID NO: 1 (субтилизин 309), который составляет более 1 и предпочтительно по меньшей мере 2, например по меньшей мере 5, например по меньшей мере 10, например по меньшей мере 50, по меньшей мере 100, по меньшей мере 200, по меньшей мере 300, по меньшей мере 400, по меньшей мере 500, по меньшей мере 600, по меньшей мере 800, по меньшей мере 1000, по меньшей мере 1500, по меньшей мере 2000, по меньшей мере 2500, по меньшей мере 3000, по меньшей мере 3500, по меньшей мере 4000, по меньшей мере 4500, по меньшей мере 5000, по меньшей мере 5500, по меньшей мере 6000, по меньшей мере 6500, по меньшей мере 7000, по меньшей мере 7500, по меньшей мере 8000, по меньшей мере 8500, по меньшей мере 9000, по меньшей мере 9500 или по меньшей мере 10000 или больше. Вычисление коэффициентов улучшения периода полужизни t½ описано в примере 4 настоящей заявки.

Другой предпочтительный вариант осуществления относится к вариантам субтилазы, содержащим, по сравнению с SEQ ID NO: 1, замены X9E+X206L+X262E (пронумерованные в соответствии с SEQ ID NO: 2), где варианты субтилазы характеризуются по меньшей мере на 10%, например по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 35%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55% по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95% большей остаточной активностью по сравнению с исходной, или по сравнению с SEQ ID NO 1. Вычисление остаточной активности или t½ описано в примере 4 данного документа.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к вариантам субтилазы, которые по сравнению с исходной субтилазой и/или по сравнению с субтилазой под SEQ ID NO: 1 содержат три мутации X9E+X206L+X262E (пронумерованные в соответствии с SEQ ID NO: 2), и которые характеризуются повышенной стабильностью в моющем средстве по сравнению с исходной субтилазой, например по сравнению с SEQ ID NO: 1, и которые характеризуются такой же или улучшенной моющей способностью по сравнению с исходной субтилазой, например по сравнению с SEQ ID NO: 1. Варианты по настоящему изобретению могут содержать дополнительные стабилизирующие и/или повышающие способность мутации, такие как N43R, G61E, N76D, S161E, G160D, G160P, S161E, N182E, N185E, S188E, A194P, N204D, V205I, Y209W или S212G. В одном варианте осуществления, и в соответствии с любым из вышеуказанных вариантов осуществления, вариант по настоящему изобретению содержит следующие замены по сравнению с

SEQ ID NO 1; S9E+Q206L+L262E, S9E+N76D+Q206L+L262E, S9E+N76D+Q206L+Y209W+L262E, S9E+G61E+N76D+Q206L+L262E, S9E+N43R+N76D+Q206L+L262E, S9E+N43R+N76D+Q206L+Y209W+L262E, S9E+N76D+Q206L+Y209W+S212G+L262E, S9E+N76D+Q206L+V205I+Y209W+L262E, S9E+N76D+N204D+Q206L+Y209W+L262E, S9E+N76D+S188E+Q206L+Y209W+L262E, S9E+N76D+N185E+Q206L+Y209W+L262E, S9E+N76D+N182E+Q206L+Y209W+L262E, S9E+N76D+S161E+Q206L+Y209W+L262E, S9E+N76D+G160P+Q206L+Y209W+L262E, S9E+N76D+G160D+Q206L+Y209W+L262E; S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E или S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+L262E, где варианты характеризуются улучшенной стабильностью по сравнению с протеазой под SEQ ID NO 1.

В соответствии с одним вариантом осуществления и/или любым из вышеуказанных вариантов осуществления вариант субтилазы по настоящему изобретению выбран из группы, состоящей из:

S9E+N43R+N76D+S188E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E+*275aH+

*275bH;

S9E+N43R+N76D+A158E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+

L262E;

S9E+N43R+N76D+A158E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+

L262E+*275aH+*275bH

S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E;

S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+

S216V+L262E;

S9E+N43R+N76D+A158E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E;

S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+

L262E+*275aH+*275bH;

S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S212G+

S216V+L262E;

S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S212G+

S216V+L262E+*275aH+*275bH;

S9E+N43R+N76D+A158E+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+

S216V+L262E+*275aH+*275bH;

S9E+N43R+N76D+G160P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E;

S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E;

S9E+N43R+N76D+G160P+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+

L262E;

S9E+N43R+N76D+G160P+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+

L262E+*275aH+*275bH;

S9E+N43R+N76D+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+

S216V+L262E;

S9E+N43R+N76D+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+

S216V+L262E+*275aH+*275bH;

S9E+N43R+N76D+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E;

S9E+N43R+N76D+G160P+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E;

S9E+N43R+N76D+N117H+A194P+Q206L+Y209W+N238H+S259D+T260A+L262E;

S9E+N43R+N76D+N185E+S188E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E;

S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S216V+S259D+N261W+L262E;

S9E+N43R+N76D+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E;

S9E+N43R+N76D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+

L262E;

S9E+N43R+N76D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+

L262E+*275aH+*275bH;

S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S259D+N261W+L262E;

S9E+N43R+N76D+S78H+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E;

S9E+N43R+N76D+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S259D+N261W+

L262E;

S9E+N76D+V205I+Q206L+Y209W+N261W+L262E;

S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+

S216V+L262E+*275aH+*275bH;

S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+

L262E;

S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+

S212G+L262E+*275aH+*275bH;

S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S216V+L262E;

S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+

S212G+L262E;

S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+

S216V+L262E;

S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+

L262E;

S9E+N43R+N76D+A158E+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+

S216V+L262E;

S9E+N43R+N76D+G115W+A194P+Q206L+Y209W+L217M+S259D+L262E;

S9E+N43R+N76D+G115W+A194P+Q206L+Y209W+S216T+S259D+L262E;

S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+

S212G+S216V+L262E +*275aH+*275bH;

S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E+

*275aH+*275bH;

S9E+N43R+N76D+A158E+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E;

S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S259D+

N261W+L262E;

S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+T255E+S256D+S259D+T260E+N261W+

L262E;

S3V+S9R+N76D+H120V+Q182E+N185E+S188E+V205I+Q206L+Y209W+S216V+

S256D+N261W+L262E;

S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+

Q206L+Y209W+S212G +S216V+N238H+L262E;

S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+G160D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+

Y209W+S212G+S216V+N238H+L262E;

S9E+N43R+I72A+N76D+Q141H+S145H+R149H+A158E+G159P+A194P+L262E;

W6L+S9E+N43R+A72I+N76D+G115W+H120V+P129D+A158E+G160P+Q182E+

N185E+S188E+Q191N+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+T255E+

S256D+S259D+T260E+N261W+L262E;

S9E+G20H+T22H+S24H+N43R+N76D+G160D+S161E+A194P+N204D+V205I+

Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E;

S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+H120D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+

V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+N238H+L262E+*275aR;

S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+H120D+A158E+G160P+S161E+A194P+Q206L+

Y209W+N238H+S259D+L262E+*275aR;

S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+P129D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+

S212G+S216V+N238H+S256D+T260A+L262E;

S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+

Q206L+Y209W+S212G+S216V+N238H+L262E;

S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+A158E+G160P+S161E+A194P+Q206L+Y209W+

N238H+S259D+L262E;

S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+G160D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+

Y209W+S212G+S216V+N238H+L262E;

S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+G160D+S161E+A194P+Q206L+Y209W+N238H+

S259D+L262E;

S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+A194P+G195E+N204D+V205I+Q206L+Y209W+

S212G+S216V+N238H+L262E;

S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+A194P+G195E+N204D+V205I+Q206L+Y209W+

S212G+S216V+N238H+L262E+*275aR;

S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+

S216V+N238H+S256D+T260A+L262E;

S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+A194P+Q206L+Y209W+N238H+S259D+T260A+

L262E;

S9E+N43R+G61E+N76D+Q206L+L262E;

S9E+N43R+I72A+N76D+G115W+H120V+P129D+A158E+G160P+Q182E+N185E+

S188E+Q191N+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+T255E+S256D+

S259D+T260E+N261W+L262E;

S9E+N43R+I72A+N76D+G115W+H120V+P129D+Q182E+N185E+S188E+Q191N+

A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+T255E+S256D+S259D+T260E+

N261W+L262E;

S9E+N43R+I72A+N76D+Q182E+N185E+S188E+Q191N+A194P+N204D+V205I+

Q206L+Y209W+S212G+S216V+T255E+S256D+S259D+T260E+N261W+L262E;

S9E+N43R+N76D+Y91H+N117H+A194P+G195E+N204D+V205I+Q206L+Y209W+

S212G+S216V+N238H+L262E;

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A158E+G160P+S161E+A194P+Q206L+Y209W+

S259D+L262E;

S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+L262E;

S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+L262E;

S9E+N43R+N76D+Q182E+N185E+S188E+Q191N+A194P+Q206L+Y209W+S259D+ L262E;

S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+

S212G+S216V+L262E;

S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+

S212G+S216V+L262E+*275bH+*275aH;

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+G160D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+

Y209W+S212G+S216V+L262E+*275bH *275aH;

S9E+N43R+N76D+*99aE+P131*+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E;

S9E+N43R+N76D+G115W+H120V+P129D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E;

S9E+N43R+N76D+G115W+H120V+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E;

S9E+N43R+N76D+G115W+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E;

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+

Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E;

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+

Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275aH+*275bH;

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+

Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275aR;

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A158E+G160P+S161E+A194P+Q206L+Y209W+

N238H+S259D+L262E+*275aH+*275bH;

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A158E+G160P+S161E+A194P+Q206L+Y209W+

S259D+L262E;

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+G160D+S161E+S163G+A194P+N204D+V205I+

Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E;

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+G160D+S161E+S163G+A194P+N204D+V205I+

Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275aH+*275bH;

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+G160D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+

Y209W+S212G+S216V+L262E;

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+G160D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+

Y209W+S212G+S216V+L262E+*275aH+*275bH;

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+G160D+S161E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+

L262E;

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+G160D+S161E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+

L262E+*275aH+*275bH;

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+

S216V+S256D+T260A+L262E;

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+

S216V+S256D+L262E;

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+

S216V+T260A+L262E;

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+

S216V+L262E;

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+

S216V+L262E+*275aH+*275bH;

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+T260A+L262E+

*275aR;

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E;

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E+*275aH+

*275bH;

S9E+N43R+N76D+P129D+A194P+G195E+Q206L+Y209W+S259D+L262E;

S9E+N43R+N76D+P129D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+

S256D+T260A+L262E;

S9E+N43R+N76D+P129D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+

S256D+T260A+L262E+*275aH+*275bH;

S9E+N43R+N76D+P129D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E;

S9E+N43R+N76D+P131*+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E;

S9E+N43R+N76D+Q137H+S141H+R145H+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+

V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E;

S9E+N43R+N76D+Q137H+S141H+R145H+G160D+S161E+A194P+N204D+V205I+

Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E;

S9E+N43R+N76D+Q137H+S141H+R145H+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+

S212G+S216V+L262E;

S9E+N43R+N76D+Q137H+S141H+R145H+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E;

S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E+

*275aH+*275bH;

S9E+N43R+N76D+G160D+S161E+S163G+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+

S212G+S216V+L262E;

S9E+N43R+N76D+G160D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+

S216V+L262E;

S9E+N43R+N76D+G160D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+

S216V+L262E+*275aH+*275bH;

S9E+N43R+N76D+G160D+S161E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E;

S9E+N43R+N76D+G160D+S161E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E+*275aH+

*275bH;

S9E+N43R+N76D+Q191N+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E;

S9E+N43R+N76D+A194P+G195E+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+

S256D+T260A+L262E;

S9E+N43R+N76D+A194P+G195E+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+

S256D+L262E;

S9E+N43R+N76D+A194P+G195E+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+

T260A+L262E;

S9E+N43R+N76D+A194P+G195E+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+

L262E;

S9E+N43R+N76D+A194P+G195E+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+

L262E+*275aH+*275bH;

S9E+N43R+N76D+A194P+G195E+Q206L+Y209W+S259D+L262E+*275aR;

S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+T255E+

S256D+S259D+N261W+L262E;

S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S256D+

S259D+T260E+N261W+L262E;

S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S256D+

S259D+N261W+L262E;

S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S256D+

T260A+L262E+*275aH+*275bH;

S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S256D+

T260A+L262E+*275aR;

S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S256D+

L262E;

S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S259D+

N261W+L262E;

S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+T260A+

L262E;

S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+N261W+

L262E;

S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+S259D+

N261W+L262E;

S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E;

S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E;

S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+

L262E;

S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+

L262E+*275aH+*275bH;

S3V+N76D+H120V+Q182E+N185E+S188E+V205I+Q206L+Y209W+S216V+S256D+

N261W+L262E;

S9E+N43R+G61E+N76D+G115W+H120V+A194P+Q206L+S259D+L262E;

S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E;

S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+M222S+L262E;

S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+S256D+S259D+N261W+L262E;

S9E+N18S+N43R+N76D+G115W+H120V+A194P+V205I+Q206L+S259D+L262E;

S9E+N43R+N76D+G115W+H120V+A194P+V205I+Q206L+S259D+L262E;

S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+ L262E;

S9E+N43R+N76D+S188E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E;

S9E+N76D+G115W+G160P+Q182E+V205I+Q206L+Y209W+S256D+T260E+N261W+ L262E

S9E+N43R+N76D+H120T+A194P+Q206L+S256D+S259D+N261W+L262E;

S9E+N43R+N76D+H120T+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E;

S9E+N76D+G160P+Q182E+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E;

S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+S259D+N261W+L262E;

S9E+N76D+Q182E+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E;

S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+S259D+N261W+L262E+*275aH;

S9E+N43R+N76D+Q182E+N185E+S188E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E;

S9E+N43R+N76D+N185E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E;

S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+N261M+L262E;

S9E+N43R+I72A+N76D+A194P+Q206L+S259D+L262E;

S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+S259D+L262E;

S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+S259D+ N261W+L262E;

S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+ L262E+*275aH+*275bH;

S3V+N76D+H120V+Q182E+N185E+S188E+V205I+Q206L+Y209W+S216V+ S256D+N261W+L262E;

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A158E+G160P+S161E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E;

S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E;

S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E;

S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E;

S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S212G+S259D+L262E;

S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S212G+L262E;

S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+T255E+S256D+S259D+T260E+N261W+

L262E;

S9E+N43R+N76D+A194P N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E;

S9E+N43R+N76D+N185E+S188E+Q191N+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E;

S9E+N43R+N76D+Q182E+N185E+S188E+Q191N+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E

S9E N43R N76D N185E S188E Q191N A194P Q206L Y209W S259D L262E

S9E+N43R+N76D+G115W+H120V+P129D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E;

S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+

S212G+S216V+L262E;

S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+

S212G+S216V+L262E+*275bH+*275 aH;

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+G160D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+

Y209W+S212G+S216V;

S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+T260A+L262E;

S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E;

S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E;

S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E+*275aH+*275bH;

S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+S259D+L262E;

S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+L262E;

S9E+G61E+N76D+N117H+H120D+G160D+S161E+S163G+Q206L+L262E+*275aH+

*275bH;

S9E+G61E+N76D+P129D+Q206L+S256D+T260A+L262E+*275aH+*275bH;

S9E+G61E+N76D+P129D+Q206L+T260A+L262E;

S9E+G61E+N76D+P129D+Q206L+L262E+*275aH+*275bH;

S9E+G61E+N76D+Q137H+S141H+R145H+A158E+G160P+S161E+Q206L+L262E;

S9E+G61E+N76D+Q137H+S141H+R145H+N204D+Q206L+Y209W+L262E+*275aR;

S9E+G61E+N76D+Q137H+S141H+R145H+Q206L+L262E;

S9E+G61E+N76D+A158E+G160P+S161E+Q206L+L262E;

S9E+G61E+N76D+A158E+G160P+S161E+Q206L+L262E+*275aH+*275bH;

S9E+G61E+N76D+N204D+Q206L+Y209W+L262E;

S9E+G61E+N76D+N204D+Q206L+Y209W+L262E+*275aH+*275bH;

S9E+G61E+N76D+Q206L+Y209W+S256D+L262E;

S9E+G61E+N76D+Q206L+S256D+L262E;

S9E+G61E+N76D+Q206L+L262E;

S9E+G61E+N76D+Q206L+L262E+*275aH+*275bH;

S9E+N76D+Q206L+Y209W+N261W+L262E;

S9E+N76D+Q206L+Y209W+L262E; and

S9E+N76D+Q206L+L262E.

Предпочтительные варианты включают варианты, содержащие следующие мутации по сравнению с SEQ ID NO 1 (пронумерованные в соответствии с SEQ ID NO 2):

S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+L262E;

S9E+N43R+ N76D+V205I+ Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E

;S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+T255E+S256D+S259D+T260E+N261W+L262E;

S9E+N43R+N76D+Q182E+N185E+S188E+Q191N+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E;

S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+L262E;

S9E+N43R+N76D+N185E+S188E+Q191N+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E;

S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E+*275bH+*275aH;

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A158E+G160P+S161E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+

L262E;

S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+

S216V+L262E;

S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+

S216V+L262E+*275bH+*275aH;

S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+G160D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+

S212G+S216V+L262E+*275bH *275aH;

S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+

L262E;

S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E;

S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+L262E;

S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E+

*275aH+*275bH или

S3V+N76D+H120V+Q182E+N185E+S188E+V205I+Q206L+Y209W+S216V+S256D+N261W+

L262E.

Варианты субтилазы могут состоять из 150-350, например, 175-330, 200-310, 220-300, 240-290, 260-280 или 269, 270, 271, 272, 273, 274 или 275 аминокислот.

В одном варианте осуществления вариант субтилазы характеризуется улучшенной стабильностью, в частности улучшенной стабильностью при мытье, по сравнению с исходной субтилазой. В предпочтительном варианте осуществления вариант субтилазы характеризуется улучшенной стабильностью, в частности улучшенной стабильностью при хранении, и такой же или улучшенной моющей способностью по сравнению с исходной субтилазой.

В одном варианте осуществления вариант субтилазы характеризуется улучшенной стабильностью, в частности улучшенной стабильностью при мытье, и такой же или улучшенной моющей способностью по сравнению с исходной субтилазой, при этом стабильность при мытье измеряют с использованием "анализа стабильности при мытье", а моющую способность измеряют с использованием анализа автоматического тестирования механического усилия (AMSA), как описано в примере 3.

Исходная протеаза

Исходная протеаза или протеаза-предшественник может представлять собой любую субтилазу или еще более предпочтительно любой субтилизин, определенный ниже.

Ферменты, расщепляющие амидные связи в белковых субстратах, классифицируют как протеазы или (взаимозаменяемо) пептидазы (см. Walsh, 1979, Enzymatic Reaction Mechanisms. W.H. Freeman and Company, San Francisco, глава 3).

Сериновые протеазы

Сериновая протеаза является ферментом, который катализирует гидролиз пептидных связей, и в активном участке которых присутствует обязательный остаток серина (White, Handler и Smith, 1973 "Principles of Biochemistry," Fifth Edition, McGraw-Hill Book Company, NY, pp. 271-272).

Бактериальные сериновые протеазы имеют молекулярный вес в диапазоне от 20000 до 45000 Дальтон. Они ингибируются диизопропилфторфосфатом. Они гидролизуют доступные концевые сложноэфирные связи и по своей активности сходны с эукариотическим химотрипсином, который является также сериновой протеазой. Более узкий термин, щелочная протеаза, охватывающий подгруппу, отображает высокий pH-оптимум некоторых из сериновых протеаз, от pH 9,0 до 11,0 (для обзора см. Priest, 1977, Bacteriological Rev. 41: 711-753).

Субтилазы

Подгруппа сериновых протеаз, условно обозначенных субтилазами, была предложена в Siezen et al., 1991, Protein Eng. 4:719-737 и Siezen et al., 1997, Protein Science 6:501-523. Их определяют с помощью анализа гомологичности более чем 170 аминокислотных последовательностей сериновых протеаз, ранее называемых субтилизин-подобными протеазами. Субтилизин ранее часто определяли как сериновую протеазу, продуцируемую грамположительными бактериями или грибами, и согласно Siezen et al сегодня представляет собой подгруппу субтилаз. Было идентифицировано широкое разнообразие субтилаз, и были определены аминокислотные последовательности многих субтилаз. Для более подробного описания таких субтилаз и их аминокислотных последовательностей сделана ссылка на Siezen et al. (1997).

Субтилизины

Подгруппой субтилаз являются субтилизины, которые представляют собой сериновые протеазы из семейства S8, в частности из подсемейства S8A, как определено в базе данных MEROPS (merops.sanger.ac.uk/cgi-bin/famsum?family=S8).

Субтилизин BPN' и субтилизин 309 имеют соответственно номера согласно MEROPS S08.034 и S08.003.

Исходная субтилаза

Термин "исходная субтилаза" описывает субтилазу, определенную в соответствии с Siezen et al., 1997, Protein Science 6: 501-523. Дополнительные подробности см. в описании "Субтилазы" выше. Исходная субтилаза может представлять собой также субтилазу, выделенную из природного источника, в которой произведены последующие изменения (такие как замена(-ны) боковой(-ых) цепи(-ей) аминокислоты(-лот), замена(-ы), делеция(-ции) и/или вставка(-ки)), при этом свойства субтилазы сохраняются. Кроме того, исходная субтилаза может представлять собой субтилазу, которая была получена с помощью методики перестановки в ДНК, такой как описана в Ness et al., 1999, Nature Biotechnology, 17: 893-896.

В качестве альтернативы термин "исходная субтилаза" может быть назван "субтилазой-предшественником" и использоваться для описания исходной протеазы, в которую вносили мутации с целью получения варианта по настоящему изобретению. Предпочтительно, исходная субтилаза относится к подгруппам субтилизинов.

Одна подгруппа субтилаз, I-S1 или "истинные" субтилизины, включает в себя "классические" субтилизины, такие как субтилизин 168 (BSS168), субтилизин BPN', субтилизин Carlsberg (ALCALASE®, Novozymes A/S) и субтилизин DY (BSSDY). BPN' представляет собой субтилизин BPN' из B. amyloliquefaciens, субтилизин BPN' имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2. Дополнительная подгруппа субтилаз, I-S2 или высокощелочные субтилизины, была идентифицирована Siezen et al (supra). Подгруппа протеаз I-S2 описана в качестве высокощелочных субтилизинов и включает в себя ферменты, такие как субтилизин PB92 (BAALKP) (MAXACAL®, Genencor International Inc.), субтилизин 147 (BLS147) (ESPERASE®, Novozymes A/S), щелочную эластазу YaB (BSEYAB) и субтилизин 309 (SAVINASE®, Novozymes A/S), имеющие аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1.

Для справки в таблице 1 ниже представлен список некоторых сокращений названий для различных субтилаз, упомянутых в данном документе. Для дополнительных сокращений см. Siezen et al. (1991 и 1997).

Таблица 1. Сокращенные названия различных субтилаз

Организм	Фермент	Сокращен-ное название	Последователь-ность
Bacillus subtilis 168	субтилизин I168,apr	BSS168	SEQ ID NO: 3
Bacillus amyloliquefaciens	субтилизин BPN' (NOVO)	BASBPN	SEQ ID NO: 2
Bacillus subtilis DY	субтилизин DY	BSSDY	SEQ ID NO: 4
Bacillus licheniformis	субтилизин Carlsberg	BLSCAR	SEQ ID NO: 5
Bacillus lentus	субтилизин 309	BLSAVI	SEQ ID NO: 1
Bacillus lentus	субтилизин 147	BLS147	SEQ ID NO: 6
Bacillus alcalophilus PB92	субтилизин PB92	BAPB92	SEQ ID NO: 7
Bacillus YaB	щелочная эластаза YaB	BYSYAB	SEQ ID NO: 8
Bacillus sp. NKS-21	субтилизин ALP I	BSAPRQ	SEQ ID NO: 9
Bacillus sp. G-825-6	субтилизин Сендай	BSAPRS	SEQ ID NO: 10
Thermoactinomyces vulgaris	Термитаза	TVTHER	SEQ ID NO: 11

Гомологичные последовательности субтилаз

В целях настоящего изобретения гомология между двумя аминокислотными последовательностями описывается в данном контексте параметром "идентичность", причем степень идентичности между двумя аминокислотными последовательностями определена с применением алгоритма Нидлмана-Вунша, как описано выше. Выходные данные при обычной процедуре, кроме аминокислотного выравнивания, представляют расчет "процента идентичности" между двумя последовательностями.

Основываясь на данном описании, специалист в данной области техники легко определит подходящие гомологичные субтилазы, которые могут быть модифицированы в соответствии с настоящим изобретением.

Исходная протеаза может представлять собой полипептид, последовательность которого по меньшей мере на 60% идентична последовательности полипептида под SEQ ID NO: 1, например, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100%, который обладает протеазной активностью. В одном аспекте аминокислотная последовательность исходной формы отличается не более 10 аминокислотами, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 от полипептида под SEQ ID NO: 1. В другом аспекте исходная форма содержит или состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 1.

Исходная протеаза может представлять собой полипептид, последовательность которого по меньшей мере на 60% идентична последовательности полипептида под SEQ ID NO: 2, например, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100%, который обладает протеазной активностью. В одном аспекте аминокислотная последовательность исходной формы отличается не более 10 аминокислотами, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 от полипептида под SEQ ID NO: 2. В другом аспекте исходная форма содержит или состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 2.

Исходная протеаза может представлять собой полипептид, последовательность которого по меньшей мере на 60% идентична последовательности полипептида под SEQ ID NO: 3, например, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100%, который обладает протеазной активностью. В одном аспекте аминокислотная последовательность исходной формы отличается не более 10 аминокислотами, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 от полипептида под SEQ ID NO: 3. В другом аспекте исходная форма содержит или состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 3.

Исходная протеаза может представлять собой полипептид, последовательность которого по меньшей мере на 60% идентична последовательности полипептида под SEQ ID NO: 4, например, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100%, который обладает протеазной активностью. В одном аспекте аминокислотная последовательность исходной формы отличается не более 10 аминокислотами, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 от полипептида под SEQ ID NO: 4. В другом аспекте исходная форма содержит или состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 4.

Исходная протеаза может представлять собой полипептид, последовательность которого по меньшей мере на 60% идентична последовательности полипептида под SEQ ID NO: 5, например, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100%, который обладает протеазной активностью. В одном аспекте аминокислотная последовательность исходной формы отличается не более 10 аминокислотами, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 от полипептида под SEQ ID NO: 5. В другом аспекте исходная форма содержит или состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 5.

Исходная протеаза может представлять собой полипептид, последовательность которого по меньшей мере на 60% идентична последовательности полипептида под SEQ ID NO: 6, например, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100%, который обладает протеазной активностью. В одном аспекте аминокислотная последовательность исходной формы отличается не более 10 аминокислотами, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 от полипептида под SEQ ID NO: 6. В другом аспекте исходная форма содержит или состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 6.

Исходная протеаза может представлять собой полипептид, последовательность которого по меньшей мере на 60% идентична последовательности полипептида под SEQ ID NO: 7, например, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100%, который обладает протеазной активностью. В одном аспекте аминокислотная последовательность исходной формы отличается не более 10 аминокислотами, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 от полипептида под SEQ ID NO: 7. В другом аспекте исходная форма содержит или состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 7.

Исходная протеаза может представлять собой полипептид, последовательность которого по меньшей мере на 60% идентична последовательности полипептида под SEQ ID NO: 8, например, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100%, который обладает протеазной активностью. В одном аспекте аминокислотная последовательность исходной формы отличается не более 10 аминокислотами, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 от полипептида под SEQ ID NO: 8. В другом аспекте исходная форма содержит или состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 8.

Исходная протеаза может представлять собой полипептид, последовательность которого по меньшей мере на 60% идентична последовательности полипептида под SEQ ID NO: 9, например, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100%, который обладает протеазной активностью. В одном аспекте аминокислотная последовательность исходной формы отличается не более 10 аминокислотами, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 от полипептида под SEQ ID NO: 9. В другом аспекте исходная форма содержит или состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 9.

Исходная протеаза может представлять собой полипептид, последовательность которого по меньшей мере на 60% идентична последовательности полипептида под SEQ ID NO: 10, например, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100%, который обладает протеазной активностью. В одном аспекте аминокислотная последовательность исходной формы отличается не более 10 аминокислотами, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 от полипептида под SEQ ID NO: 10. В другом аспекте исходная форма содержит или состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 10.

Исходная протеаза может представлять собой полипептид, последовательность которого по меньшей мере на 60% идентична последовательности полипептида под SEQ ID NO: 11, например, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100%, который обладает протеазной активностью. В одном аспекте аминокислотная последовательность исходной формы отличается не более 10 аминокислотами, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 от полипептида под SEQ ID NO: 11. В другом аспекте исходная форма содержит или состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 11.

Полипептид может представлять собой гибридный полипептид, в котором область одного полипептида слита с N-концом или C-концом области другого полипептида.

Исходную субтилазу можно получить из микроорганизмов любого рода. В контексте настоящего изобретения термин "полученный из", который используется в данном документе, применительно к данному источнику будет означать, что исходная форма, кодируемая полинуклеотидом, продуцируется источником или штаммом, в который был введен полинуклеотид из источника. В одном аспекте исходная форма секретируется внеклеточно.

Исходная форма может представлять собой бактериальную протеазу. Например, исходная форма может представлять собой полипептид грамположительных бактерий, такой как протеаза Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus или Streptomyces, или полипептид грамотрицательных бактерий, такой как протеаза Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella или Ureaplasma.

В одном аспекте исходная форма представляет собой протеазу Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis или Bacillus thuringiensis.

Штаммы данных видов являются легкодоступными неограниченному кругу лиц во многих коллекциях культур, таких как Американская коллекция типовых культур (ATCC), Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур GmbH (DSMZ), Центральное бюро плесневых культур (CBS) и Коллекция патентованных культур Службы сельскохозяйственных исследований, Северный региональный исследовательский центр (NRRL).

Исходную форму можно идентифицировать и получить из других источников, в том числе микроорганизмов, выделенных из природной среды (например, почвы, компостов, воды и т. д.), или образцов ДНК, полученных непосредственно из природных материалов (например, почвы, компостов, воды и т. д.), с использованием вышеупомянутых зондов. Методики выделения микроорганизмов и ДНК непосредственно из естественных мест обитания хорошо известны из уровня техники. Полинуклеотид, кодирующий исходную форму, можно затем получить подобным образом с помощью скрининга библиотеки геномной ДНК, или cDNA другого микроорганизма, или образца смешанной ДНК. После того как полинуклеотид, кодирующий исходную форму, выявили зондом(-ами), полинуклеотид можно выделить или клонировать с помощью методик, которые хорошо известны специалисту в данной области техники (см., например, Sambrook et al., 1989, supra).

Получение вариантов

Настоящее изобретение также относится к способам получения варианта субтилазы, обладающего протеазной активностью, предусматривающим:

(a) введение в исходную субтилазу замен X9E+X206L+X262E, где положение соответствует положению SEQ ID NO: 2 и

(b) извлечение варианта.

Варианты можно получить с использованием любой процедуры мутагенеза, известной из уровня техники, такой как сайт-направленный мутагенез, конструирование синтетических генов, конструирование полусинтетических генов, случайный мутагенез, шаффлинг и т. д.

Сайт-направленный мутагенез представляет собой методику, в которой одну или несколько (например, некоторое количество) мутаций вводят в один или несколько определенных сайтов в полинуклеотиде, кодирующем исходную форму.

Сайт-направленный мутагенез можно проводить in vitro с помощью ПЦР, включающей использование олигонуклеотидных праймеров, содержащих требуемую мутацию. Сайт-направленный мутагенез можно также осуществлять in vitro с помощью кассетного мутагенеза, включающего расщепление рестрикционным ферментом по сайту в плазмиде, содержащей полинуклеотид, кодирующий исходную молекулу, и последующего лигирования олигонуклеотида, содержащего мутацию, в полинуклеотид. Обычно рестрикционный фермент, который расщепляет плазмиду и олигонуклеотид, является одним и тем же, обеспечивая возможность лигирования друг с другом липких концов плазмиды и вставки. См., например, Scherer и Davis, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4949-4955; и Barton et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 7349-4966.

Сайт-направленный мутагенез можно проводить также in vivo с помощью способов, известных из уровня техники. См., например, US 2004/0171154; Storici et al., 2001, Nature Biotechnol. 19: 773-776; Kren et al., 1998, Nat. Med. 4: 285-290; и Calissano и Macino, 1996, Fungal Genet. Newslett. 43: 15-16.

В настоящем изобретении можно использовать любую процедуру сайт-направленного мутагенеза. Доступны многие коммерческие наборы, которые можно использовать для получения вариантов.

Конструирование синтетического гена включает в себя in vitro синтез молекулы полинуклеотида, предназначенной для кодирования представляющего интерес полипептида. Синтез гена можно осуществлять с использованием многих методик, таких как мультиплексная технология на основе микрочипов, описанная в Tian et al. (2004, Nature 432: 1050-1054), и схожие технологии, где олигонуклеотиды синтезированы и собраны на фотопрограммируемых микрофлюидных чипах.

Одну или несколько аминокислотных замен, делеций и/или вставок можно осуществлять и исследовать с помощью известных способов мутагенеза, рекомбинации и/или шаффлинга с последующей подходящей процедурой скрининга, например таких, как раскрыты в Reidhaar-Olson и Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie и Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; или WO 95/22625. Другие способы, которые можно применять, включают ПЦР, допускающую ошибки, фаговый дисплей (например, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; US 5,223,409; WO 92/06204) и мутагенез, целенаправленно воздействующий на область (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).

Способы мутагенеза/шаффлинга можно объединять со способами автоматизированного скрининга с высокой пропускной способностью для выявления активности клонированных, подвергнутых мутагенезу полипептидов, экспрессируемых клетками-хозяевами (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). Подвергнутые мутагенезу молекулы ДНК, которые кодируют активные полипептиды, можно извлекать из клеток-хозяев и быстро секвенировать с применением стандартных способов из уровня техники. Такие способы предусматривают возможность быстрого определения важности отдельных аминокислотных остатков в полипептиде.

Конструирование полусинтетического гена проводят с помощью объединения аспектов конструирования синтетических генов, и/или сайт-направленного мутагенеза, и/или случайного мутаганеза, и/или шаффлинга. Полусинтетическая конструкция характеризуется процессом, в котором используют фрагменты полинуклеотида, которые синтезируют в сочетании с методиками ПЦР. Таким образом, определенные области генов можно синтезировать de novo, в то время как другие области можно амплифицировать с использованием сайт-специфических мутагенных праймеров, тогда как остальные области можно подвергнуть ПЦР, допускающей ошибки, или ПЦР, не допускающей ошибки. Затем подпоследовательности полинуклеотидов можно подвергнуть шаффлингу.

Полинуклеотиды

Настоящее изобретение относится также к полинуклеотидам, кодирующим вариант по настоящему изобретению.

Конструкции нуклеиновых кислот

Настоящее изобретение относится также к конструкциям нуклеиновой кислоты, содержащим полинуклеотид, кодирующий вариант по настоящему изобретению, функционально связанный с одной или несколькими регуляторными последовательностями, которые управляют экспрессией кодирующей последовательности в подходящей клетке-хозяине в условиях, подходящих для регуляторных последовательностей.

С полинуклеотидом можно производить действия с помощью ряда способов с целью обеспечения экспрессии варианта. Манипуляция с полинуклеотидом до его вставки в вектор может быть желательной или необходимой, в зависимости от вектора экспрессии. Методики модификации полинуклеотидов, в которых применяют способы рекомбинантных ДНК, хорошо известны из уровня техники.

Регуляторная последовательность может представлять собой промотор, полинуклеотид, который узнается клеткой-хозяином для экспрессии полинуклеотида. Промотор содержит последовательности, регулирующие транскрипцию, которые опосредуют экспрессию варианта. Промотор может представлять собой любой полинуклеотид, который проявляет транскрипционную активность в клетке-хозяине, в том числе мутантные, усеченные и гибридные промоторы, и может быть получен из генов, кодирующих внеклеточные или внутриклеточные полипептиды, либо гомологичные, либо гетерологичные по отношению к клетке-хозяину.

Примерами подходящих промоторов для управления транскрипцией конструкций нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению в бактериальной клетке-хозяине, являются промоторы, полученные из гена альфа-амилазы Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), гена альфа-амилазы Bacillus licheniformis (amyL), гена пенициллиназы Bacillus licheniformis (penP), гена мальтогенной амилазы Bacillus stearothermophilus (amyM), гена левансахаразы Bacillus subtilis (sacB), генов xylA и xylB Bacillus subtilis, гена cryIIIA Bacillus thuringiensis (Agaisse и Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107), lac-оперона E. coli, trc-промотора E. coli (Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315), гена агаразы Streptomyces coelicolor (dagA) и гена прокариотической бета-лактамазы (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), а также tac-промотора (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25). Кроме того, промоторы описаны в "Useful proteins from recombinant bacteria" в Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94 и в Sambrook et al., 1989, supra. Примеры тандемных промоторов раскрыты в WO 99/43835.

Регуляторная последовательность может представлять собой также терминатор транскрипции, который распознается клеткой-хозяином с терминацией транскрипции. Терминаторная последовательность функционально связана с 3'-концом полинуклеотида, кодирующего вариант. Можно использовать любой терминатор, который функционирует в клетке-хозяине.

Предпочтительные терминаторы для бактериальных клеток-хозяев получают из генов щелочной протеазы Bacillus clausii (aprH), альфа-амилазы Bacillus licheniformis (amyL) и рибосомной РНК Escherichia coli (rrnB).

Регуляторная последовательность может представлять собой также область, стабилизирующую mRNA, расположенную ниже промотора и выше кодирующей последовательности гена, который повышает экспрессию гена.

Примеры подходящих областей, стабилизирующих mRNA, получены из гена cryIIIA Bacillus thuringiensis (WO 94/25612) и гена SP82 Bacillus subtilis (Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3465-3471).

Регуляторная последовательность может представлять собой также кодирующую область сигнального пептида, которая кодирует сигнальный пептид, связанный с N-концом варианта, и направляет вариант по секреторному пути клетки. 5'конец кодирующей последовательности полинуклеотида может по своей природе содержать последовательность, кодирующую сигнальный пептид, связанную в естественных условиях в трансляционной рамке считывания с сегментом кодирующей последовательности, которая кодирует вариант. В качестве альтернативы, 5'-конец кодирующей последовательности может содержать последовательность, кодирующую сигнальный пептид, которая является чужеродной по отношению к кодирующей последовательности. Чужеродная последовательность, кодирующая сигнальный пептид, может требоваться в тех случаях, когда кодирующая последовательность в естественных условиях не содержит последовательность, кодирующую сигнальный пептид. В качестве альтернативы, чужеродной последовательностью, кодирующей сигнальный пептид, можно просто заменить природную последовательность, кодирующую сигнальный пептид, с целью повышения секреции варианта. Однако можно использовать любую последовательность, кодирующую сигнальный пептид, которая направляет экспрессируемый вариант по секреторному пути в клетке-хозяине.

Эффективные последовательности, кодирующие сигнальный пептид, для бактериальных клеток-хозяев представляют собой последовательности, кодирующие сигнальный пептид, полученные из генов мальтогенной амилазы Bacillus NCIB 11837, субтилизина Bacillus licheniformis, бета-лактамазы Bacillus licheniformis, альфа-амилазы Bacillus stearothermophilus, нейтральных протеаз Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM) и prsA Bacillus subtilis. Кроме того сигнальные пептиды описаны в Simonen и Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

Регуляторная последовательность может представлять собой также кодирующую последовательность пропептида, которая кодирует пропептид, расположенный на N-конце варианта. Получаемый в результате полипептид известен как профермент или про-полипептид (или, в некоторых случаях, зимоген). Про-полипептид обычно неактивен и может быть превращен в активный полипептид с помощью каталитического или автокаталитического отщепления пропептида от про-полипептида. Последовательность, кодирующую пропептид, можно получить из генов щелочной протеазы Bacillus subtilis (aprE), нейтральной протеазы Bacillus subtilis (nprT), лакказы Myceliophthora thermophila (WO 95/33836), аспарагиновой протеиназы Rhizomucor miehei и альфа-фактора Saccharomyces cerevisiae.

В случае, если присутствуют последовательности как сигнального пептида, так и пропептида, последовательность пропептида расположена рядом с N-концом варианта, а последовательность сигнального пептида расположена рядом с N-концом последовательности пропептида.

Также может быть желательным добавление регуляторных последовательностей, которые регулируют экспрессию варианта относительно роста клетки-хозяина. Примерами регулирующих систем являются такие системы, которые вызывают включение или выключение экспрессии гена в ответ на химический или физический стимул, в том числе на наличие соединения, осуществляющего регуляцию. Регуляторные системы в прокариотических системах включают в себя системы операторов lac, tac и trp.

Векторы экспрессии

Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным векторам экспрессии, содержащим полинуклеотид, кодирующий вариант по настоящему изобретению, промотор, а также сигналы остановки транскрипции и трансляции. Различные нуклеотидные и регуляторные последовательности можно объединять вместе с получением рекомбинантного вектора экспрессии, который может включать в себя один или несколько соответствующих сайтов рестрикции для обеспечения возможности вставки или замены полинуклеотида, кодирующего вариант, в таких сайтах. В качестве альтернативы, полинуклеотид можно экспрессировать с помощью вставки полинуклеотида или конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей полинуклеотид, в подходящий вектор для экспрессии. При создании вектора экспрессии кодирующую последовательность располагают в векторе таким образом, чтобы кодирующая последовательность была функционально связана с подходящими регуляторными последовательностями для экспрессии.

Рекомбинантный вектор экспрессии может представлять собой любой вектор (например, плазмиду или вирус), который можно удобным образом подвергать процедурам рекомбинантной ДНК и который может обеспечивать экспрессию полинуклеотида. Как правило, выбор вектора будет зависеть от совместимости вектора с клеткой-хозяином, в которую должен быть введен вектор. Вектор может представлять собой линейную или замкнутую кольцевую плазмиду.

Вектор может представлять собой автономно реплицирующийся вектор, т. е. вектор, который существует в виде внехромосомного объекта, репликация которого не зависит от хромосомной репликации, например, плазмиду, внехромосомный элемент, мини-хромосому или искусственную хромосому. Вектор может содержать любые средства для обеспечения саморепликации. В качестве альтернативы, при введении в клетку-хозяина вектор может интегрироваться в геном и реплицироваться вместе с хромосомой(-ами), в которую(-ые) он был интегрирован. Более того, можно применять один вектор или плазмиду, либо два или более векторов или плазмид, которые в совокупности содержат общую ДНК, которую необходимо ввести в геном клетки-хозяина или транспозон.

Вектор предпочтительно содержит один или несколько селектируемых маркеров, которые позволяют легко проводить отбор трансформированных, трансфицированных, трансдуцированных или подобных клеток. Селектируемый маркер представляет собой ген, продукт которого обеспечивает устойчивость к биоцидам или вирусам, устойчивость к тяжелым металлам, прототрофность для ауксотрофов и т. п.

Примерами бактериальных селектируемых маркеров являются dal-гены Bacillus licheniformis или Bacillus subtilis, или маркеры, которые придают устойчивость к антибиотикам, такую как устойчивость к ампициллину, хлорамфениколу, канамицину, неомицину, спектиномицину или тетрациклину.

Вектор предпочтительно содержит элемент(-ы), который(-ые) обеспечивает(-ют) интеграцию вектора в геном клетки-хозяина или автономную репликацию вектора в клетке, независимо от генома.

Интеграция вектора в геном клетки-хозяина может зависеть от последовательности полинуклеотида, кодирующей вариант, или любого другого элемента вектора для интеграции в геном с помощью гомологичной или негомологичной рекомбинации. В качестве альтернативы вектор может содержать дополнительные полинуклеотиды для управления интеграцией с помощью гомологичной рекомбинации в геном клетки-хозяина в точном местоположении(-ях) в хромосоме(-ах). Для повышения возможности интеграции в точном местоположении, интегрируемые элементы должны содержать достаточное количество нуклеиновых кислот, как например, от 100 до 10000 пар оснований, от 400 до 10000 пар оснований и от 800 до 10000 пар оснований, последовательность которых в высокой степени характеризуется идентичностью соответствующей последовательности-мишени для увеличения вероятности гомологичной рекомбинации. Интегрирующие элементы могут представлять собой любую последовательность, которая является гомологичной последовательности-мишени в геноме клетки-хозяина. Кроме того, интегрируемые элементы могут представлять собой некодирующие или кодирующие полинуклеотиды. С другой стороны, вектор можно интегрировать в геном клетки-хозяина с помощью негомологичной рекомбинации.

Для автономной репликации вектор может дополнительно содержать точку начала репликации, что обеспечивает возможность автономной репликации вектора в рассматриваемой клетке-хозяине. Точка начала репликации может представлять собой любой плазмидный репликатор, опосредующий автономную репликацию, который функционирует в клетке. Термины "точка начала репликации" или "плазмидный репликатор" означают полинуклеотид, который обеспечивает возможность репликации плазмиды или вектора in vivo.

Примерами бактериальных точек начала репликации являются точки начала репликации плазмид pBR322, pUC19, pACYC177 и pACYC184, обеспечивающие возможность репликации в E. coli, а также pUB110, pE194, pTA1060 и pAMß1, обеспечивающие возможность репликации в Bacillus.

Для повышения продуцирования варианта в клетку-хозяина можно ввести более чем одну копию полинуклеотида по настоящему изобретению. Увеличения числа копий полинуклеотида можно достичь с помощью интеграции по меньшей мере одной дополнительной копии последовательности в геном клетки-хозяина или с помощью внедрения амплифицируемого селектируемого маркерного гена с полинуклеотидом, причем клетки, содержащие амплифицированные копии селектируемого маркерного гена, и следовательно дополнительные копии полинуклеотида, можно отбирать с помощью культивирования клеток в присутствии подходящего средства для отбора.

Процедуры, применяемые для лигирования вышеописанных элементов для конструирования рекомбинантных векторов экспрессии по настоящему изобретению, хорошо известны специалисту в данной области техники (см., например, Sambrook et al., 1989, supra).

Клетки-хозяева

Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным клеткам-хозяевам, содержащим полинуклеотид, кодирующий вариант по настоящему изобретению, функционально связанный с одной или несколькими регуляторными последовательностями, которые управляют продуцированием варианта по настоящему изобретению. Конструкция или вектор, содержащие полинуклеотид, вводят в клетку-хозяина так, чтобы конструкция или вектор сохранялись в виде интегрированного в хромосому элемента или в виде самореплицирующегося внехромосомного вектора, как описано ранее. Термин "клетка-хозяин" охватывает любого потомка исходной клетки, который не является идентичным исходной клетке вследствие мутаций, происходящих в ходе репликации. Выбор клетки-хозяина будет в значительной степени зависеть от гена, кодирующего вариант, и его источника.

Клетка-хозяин может представлять собой любую клетку, пригодную при рекомбинантном получении варианта, например, прокариота или эукариота.

Прокариотическая клетка-хозяин может представлять собой клетку любой грамположительной или грамотрицательной бактерии. Грамположительные бактерии включают без ограничения Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus и Streptomyces. Грамотрицательные бактерии включают без ограничения Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella и Ureaplasma.

Бактериальная клетка-хозяин может представлять собой любую клетку Bacillus, в том числе без ограничения клетки Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis и Bacillus thuringiensis.

Бактериальная клетка-хозяин может представлять собой также любую клетку Streptococcus, в том числе без ограничения клетки Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis и Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

Бактериальная клетка-хозяин может также представлять собой любую клетку Streptomyces, в том числе без ограничения клетки Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus и Streptomyces lividans.

Введение ДНК в клетку Bacillus можно осуществлять с помощью трансформации протопластов (см., например, Chang и Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115), трансформации компетентных клеток (см., например, Young и Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823-829, или Dubnau и Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209-221), электропорации (см., например, Shigekawa и Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751) или конъюгации (см., например, Koehler и Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278). Введение ДНК в клетку E. coli можно осуществлять с помощью трансформации протопластов (см., например, Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) или электропорации (см., например, Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). Введение ДНК в клетку Streptomyces можно осуществлять с помощью трансформации протопластов, электропорации (см., например, Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405), конъюгации (см., например, Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585) или трансдукции (см., например, Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6289-6294). Введение ДНК в клетку Pseudomonas можно осуществлять с помощью электропорации (см., например, Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397) или конъюгации (см., например, Pinedo и Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57). Введение ДНК в клетку Streptococcus можно осуществлять с помощью естественной компетентности (см., например, Perry и Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297), трансформации протопластов (см., например, Catt и Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207), электропорации (см., например, Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804) или конъюгации (см., например, Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436). Тем не менее, можно применять любой известный из уровня техники способ введения ДНК в клетку-хозяина.

Способы получения

Настоящее изобретение относится также к способам получения варианта, включающим: (a) культивирование клетки-хозяина по настоящему изобретению в условиях, подходящих для экспрессии варианта, и (b) извлечение варианта.

Клетки-хозяева культивируют в питательной среде, подходящей для продуцирования варианта, с использованием способов, известных из уровня техники. Например, клетку можно культивировать с помощью культивирования во встряхиваемой колбе или при мелкомасштабной или крупномасштабной ферментации (в том числе непрерывной, периодической, подпитываемой или твердофазной ферментации) в лабораторных или промышленных ферментерах, осуществляемой в подходящей среде и в условиях, обеспечивающих возможность экспрессии и/или выделения варианта. Культивирование осуществляют в подходящей питательной среде, содержащей источники углерода и азота, а также неорганические соли, с применением процедур, известных из уровня техники. Подходящие среды доступны от коммерческих поставщиков или могут быть получены в соответствии с опубликованными композициями (например, в каталогах Американской коллекции типовых культур). Если вариант секретируется в питательную среду, то вариант можно извлечь непосредственно из среды. Если вариант не секретируется, то его можно извлечь из клеточных лизатов.

Вариант можно выявить с использованием способов, известных из уровня техники, которые являются специфическими для вариантов с протеазной активностью. Данные способы выявления включают без ограничения применение специфичных антител, образование продукта ферментативной реакции или исчезновение субстрата фермента. Например, для определения активности варианта можно использовать ферментный анализ.

Вариант можно извлечь с использованием способов, известных из уровня техники. Например, вариант можно извлечь из питательной среды с помощью общепринятых процедур, в том числе без ограничения сбора, центрифугирования, фильтрования, экстракции, распылительной сушки, испарения или осаждения.

Вариант можно очистить с помощью ряда процедур, известных из уровня техники, в том числе без ограничения хроматографии (например, ионообменной, аффинной, гидрофобной хроматографии, хроматофокусирования и гель-хроматографии), электрофоретических процедур (например, препаративного изоэлектрического фокусирования), дифференциальной растворимости (например, осаждение сульфатом аммония), SDS-PAGE или экстракции (см., например, Protein Purification, Janson и Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989) с получением практически чистых вариантов.

В альтернативном аспекте вариант не извлекают, а вместо этого используют в качестве источника варианта клетку-хозяина по настоящему изобретению, экспрессирующую вариант.

Композиции

Настоящее изобретение относится также к композиции, содержащей вариант субтилазы по настоящему изобретению. В одном варианте осуществления композиция представляет собой моющую композицию.

Выбор дополнительных компонентов находится в компетенции специалиста в данной области, и предусматривает общепринятые ингредиенты, в том числе иллюстративные неограничивающие компоненты, изложенные ниже. При уходе за тканью, выбор компонентов может предусматривать учет типа ткани, подлежащей очистке, типа и/или степени загрязнения, температуры, при которой должна происходить очистка, а также состава моющего продукта.

В конкретном варианте осуществления моющая композиция содержит вариант субтилазы по настоящему изобретению и один или несколько моющих компонентов, таких как поверхностно-активные вещества, гидротропы, компоненты моющих средств, дополнительные компоненты моющих средств, комплексообразователи или комплексообразующие средства, отбеливающая система или отбеливающие компоненты, полимеры, средства для окрашивания тканей, кондиционеры для тканей, пенообразователи, подавители образования мыльной пены, диспергирующие средства, ингибиторы переноса красителя, флуоресцентные отбеливающие средства, отдушка, оптические осветлители, бактерициды, фунгициды, средства для суспендирования загрязнения, грязеотталкивающие полимеры, средства против переосаждения, ингибиторы или стабилизаторы ферментов, активаторы ферментов, антиоксиданты и солюбилизаторы.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения вариант субтилазы по настоящему изобретению можно добавлять к моющей композиции в количестве, соответствующем 0,01-200 мг белка-фермента на литр моющей жидкости, предпочтительно 0,05-50 мг белка-фермента на литр моющей жидкости, в частности 0,1-10 мг белка-фермента на литр моющей жидкости.

Например, композиция для применения в автоматической посудомоечной машине (ADW) может включать 0,0001%-50%, например 0,001%-30%, например 0,01%-20%, например 0,5-15% белка-фермента по весу композиции.

Например, композиция для применения при получении гранул для стирки может включать 0,0001%-50%, например 0,001%-20%, например 0,01%-10%, например 0,05%-5% белка-фермента по весу композиции.

Например, композиция для применения в жидкости для стирки может включать 0,0001%-10%, например 0,001-7%, например 0,1%-5% белка-фермента по весу композиции.

Ферменты, такие как вариант субтилазы по настоящему изобретению, можно стабилизировать с применением общепринятых стабилизирующих средств, например полиола, такого как пропиленгликоль или глицерин, сахара или сахароспирта, молочной кислоты, борной кислоты или производного борной кислоты, например ароматического сложного эфира борной кислоты, или производного фенилбороновой кислоты, например 4-формилфенилбороновой кислоты, и при этом композицию можно составить, как описано например в WO 92/19709 и WO 92/19708, или варианты в соответствии с настоящим изобретением можно стабилизировать с применением пептидных альдегидов или кетонов, таких как описанные в WO 2005/105826 и WO 2009/118375.

Вариант по настоящему изобретению может также быть включен в моющие составы, раскрытые в WO 97/07202, которая включена в данный документ с помощью ссылки.

Варианты субтилазы по настоящему изобретению могут быть составлены в жидкие композиции для стирки, такие как жидкие композиции для стирки, содержащие:

a) по меньшей мере 0,01 мг активного варианта субтилазы на литр моющего средства;

b) от 2 вес. % до 60 вес. % по меньшей мере одного поверхностно-активного вещества;

c) от 5 вес. % до 50 вес. % по меньшей мере одного компонента моющих средств.

Моющая композиция может быть составлена в гранулированное моющее средство для стирки. Такое моющее средство может содержать:

a) по меньшей мере 0,01 мг варианта активной протеазы на грамм композиции;

b) анионное поверхностно-активное вещество, предпочтительно от 5 вес. % до 50 вес. %;

c) неионное поверхностно-активное вещество, предпочтительно от 1 вес. % до 8 вес. %;

d) компонент моющих средств, предпочтительно от 5 вес. % до 40 вес. %, и предпочтительно такой, как карбонаты, цеолиты, фосфатный компонент моющих средств, компоненты моющих средств, связывающие кальций, или комплексообразующие средства.

Хотя нижеупомянутые компоненты разделены на категории согласно общему названию в соответствии с конкретной функциональной возможностью, это не должно быть истолковано как ограничение, поскольку компонент может включать дополнительные функциональные возможности, что будет понятно специалисту в данной области техники.

Поверхностно-активные вещества

Моющая композиция может содержать одно или несколько поверхностно-активных веществ, которые могут быть анионными, и/или катионными, и/или неионными, и/или полуполярными, и/или цвиттер-ионными, или их смесью. В конкретном варианте осуществления моющая композиция включает смесь одного или нескольких неионных поверхностно-активных веществ и одного или нескольких анионных поверхностно-активных веществ. Поверхностно-активное вещество(-а) обычно присутствует(-ют) в количестве от приблизительно 0,1% до 60% по весу, например, от приблизительно 1% до приблизительно 40%, или от приблизительно 3% до приблизительно 20%, или от приблизительно 3% до приблизительно 10%. Поверхностно-активное вещество(-а) выбирают исходя из требуемого применения для очистки, и при этом предусматривается(-ются) любое(-ые) общепринятое(-ые) поверхностно-активное вещество(-а), известное(-ые) из уровня техники. Что касается применения в моющих средствах, то можно применять любое поверхностно-активное вещество, известное из уровня техники. Поверхностно-активные вещества снижают поверхностное натяжение в моющем средстве, что обеспечивает поднятие пятна, подлежащего очищению, и его растворение, а затем смывание.

При их включении моющее средство обычно будет содержать от приблизительно 1% до приблизительно 40% по весу, например от приблизительно 5% до приблизительно 30%, в том числе от приблизительно 5% до приблизительно 15% или от приблизительно 20% до приблизительно 25% анионного поверхностно-активного вещества. Неограничивающие примеры анионных поверхностно-активных веществ включают сульфаты и сульфонаты, в частности линейные алкилбензолсульфонаты (LAS), изомеры LAS, разветвленные алкилбензолсульфонаты (BABS), фенилалкансульфонаты, альфа-олефинсульфонаты (AOS), олефинсульфонаты, алкенсульфонаты, алкан-2,3-диилбис(сульфаты), гидроксиалкансульфонаты и дисульфонаты, алкилсульфаты (AS), такие как додецилсульфат натрия (SDS), сульфаты жирных спиртов (FAS), сульфаты первичных спиртов (PAS), эфирсульфаты спиртов (AES, или AEOS, или FES, также известные как этоксисульфаты спиртов или эфирсульфаты жирных спиртов); вторичные алкансульфонаты (SAS), сульфонаты парафина (PS), сульфонаты сложных эфиров, сложные эфиры глицерина и сульфонированных жирных кислот, метиловые сложные эфиры жирных альфа-сульфокислот (альфа-SFMe или SES), в том числе сульфонат сложного метилового эфира (MES), алкил- или алкенилянтарную кислоту, додеценил/тетрадеценил янтарную кислоту (DTSA), жирнокислотные производные аминокислот, сложные диэфиры и моноэфиры сульфоянтарной кислоты или мыло, а также их комбинации.

При их включении моющее средство обычно будет содержать от приблизительно 0% до приблизительно 10% по весу катионного поверхностно-активного вещества. Неограничивающие примеры катионных поверхностно-активных веществ включают четвертичный алкилдиметилэтаноламин (ADMEAQ), бромид цетилтриметиламмония (CTAB), хлорид диметилдистеариламмония (DSDMAC) и алкилбензилдиметиламмоний, алкильные соединения четвертичного аммония, алкоксилированные соединения четвертичного аммония (AQA) и их комбинации.

При их включении моющее средство обычно будет содержать от приблизительно 0,2% до приблизительно 40% по весу неионного поверхностно-активного вещества, например от приблизительно 0,5% до приблизительно 30%, в частности, от приблизительно 1% до приблизительно 20%, от приблизительно 3% до приблизительно 10%, как например, от приблизительно 3% до приблизительно 5% или от приблизительно 8% до приблизительно 12%. Неограничивающие примеры неионных поверхностно-активных веществ включают этоксилаты спиртов (AE или AEO), пропоксилаты спиртов, пропоксилированные жирные спирты (PFA), алкиловые сложные эфиры алкоксилированных жирных кислот, такие как алкиловые сложные эфиры этоксилированных и/или пропоксилированных жирных кислот, алкилфенолэтоксилаты (APE), нонилфенолэтоксилаты (NPE), алкилполигликозиды (APG), алкоксилированные амины, моноэтаноламиды жирных кислот (FAM), диэтаноламиды жирных кислот (FADA), моноэтаноламиды этоксилированных жирных кислот (EFAM), моноэтаноламиды пропоксилированных жирных кислот (PFAM), амиды полигидроксиалкильных жирных кислот или N-ацил-N-алкильные производные глюкозамина (глюкамиды, GA или глюкамид жирной кислоты, FAGA), кроме того продукты, доступные под торговым названием SPAN и TWEEN, а также их комбинации.

При их включении моющее средство обычно будет содержать от приблизительно 0% до приблизительно 10% по весу полуполярного поверхностно-активного вещества. Неограничивающие примеры полуполярных поверхностно-активных веществ включают аминоксиды (AO), такие как алкилдиметиламиноксид, N-(кокоалкил)-N,N-диметиламиноксид и N-(таллоу-алкил)-N,N-бис(2-гидроксиэтил)аминоксид, алканоламиды жирных кислот и алканоламиды этоксилированных жирных кислот, а также и их комбинации.

При их включении моющее средство обычно будет содержать от приблизительно 0% до приблизительно 10% по весу цвиттерионного поверхностно-активного вещества. Неограничивающие примеры цвиттерионных поверхностно-активных веществ включают бетаин, алкилдиметилбетаин, сульфобетаин и их комбинации.

Компоненты моющих средств и дополнительные компоненты моющих средств

Моющая композиция может содержать приблизительно 0-65% по весу, как например, от приблизительно 5% до приблизительно 45% моющего компонента детергента или дополнительного моющего компонента детергента, или их смеси. В моющем средстве для мытья посуды содержание компонента моющих средств составляет обычно 40-65%, в частности 50-65%. Компоненты моющих средств и комплексообразователи смягчают, например воду для мытья, с помощью удаления ионов металла из жидкости. Компонент моющих средств и/или дополнительный компонент моющих средств могут представлять собой, в частности, комплексообразующее средство, которое образует растворимые в воде комплексы с Ca и Mg. Любой компонент моющих средств и/или дополнительный компонент моющих средств, известные из уровня техники, можно применять в моющих средствах для стирки. Неограничивающие примеры компонентов моющих средств включают цеолиты, дифосфаты (пирофосфаты), трифосфаты, такие как трифосфат натрия (STP или STPP), карбонаты, такие как карбонат натрия, растворимые силикаты, такие как метасиликат натрия, слоистые силикаты (например, SKS-6 от Hoechst), этаноламины, такие как 2-аминоэтан-1-ол (MEA), диэтаноламин (DEA, также известный как иминодиэтанол), триэтаноламин (TEA, также известный как 2,2',2"-нитрилотриэтанол) и карбоксиметилинулин (CMI), а также и их комбинации.

Моющая композиция может также содержать 0-20% по весу, как например от приблизительно 5% до приблизительно 10%, дополнительного моющего компонента детергента или их смесь. Моющая композиция может включать дополнительный компонент моющих средств отдельно или в сочетании с компонентом моющих средств, например, компонентом моющих средств на основе цеолита. Неограничивающие примеры дополнительных компонентов моющих средств включают гомополимеры полиакрилатов или их сополимеры, такие как поли(акриловая кислота) (PAA) или сополимер (акриловой кислоты/малеиновой кислоты) (PAA/PMA). Дополнительные неограничивающие примеры включают цитрат, комплексообразователи, такие как аминокарбоксилаты, аминополикарбоксилаты, а также фосфонаты и алкил- или алкенилянтарную кислоту. Дополнительные конкретные примеры включают 2,2',2''-нитрилотриуксусную кислоту (NTA), этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA), диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTPA), иминодиянтарную кислоту (IDS), этилендиамин-N,N'-диянтарную кислоту (EDDS), метилглициндиуксусную кислоту (MGDA), глутаминовую кислоту-N,N-диуксусную кислоту (GLDA), 1-гидроксиэтан-1,1-дифосфоновую кислоту (HEDP), этилендиаминтетра-(метиленфосфоновую кислоту) (EDTMPA), диэтилентриаминпентакис(метиленфосфоновую кислоту) (DTPMPA или DTMPA), N-(2-гидроксиэтил)иминодиуксусную кислоту (EDG), аспарагиновую кислоту-N-моноуксусную кислоту (ASMA), аспарагиновую кислоту-N,N-диуксусную кислоту (ASDA), аспарагиновую кислоту-N-монопропионовую кислоту (ASMP), иминодиянтарную кислоту (IDA), N-(2-сульфометил)-аспарагиновую кислоту (SMAS), N-(2-сульфоэтил)-аспарагиновую кислоту (SEAS), N-(2-сульфометил)-глутаминовую кислоту (SMGL), N-(2-сульфоэтил)-глутаминовую кислоту (SEGL), N-метилиминодиуксусную кислоту (MIDA), α-аланин-N, N-диуксусную кислоту (α-ALDA), серин-N, N-диуксусную кислоту (SEDA), изосерин-N, N-диуксусную кислоту (ISDA), фенилаланин-N, N-диуксусную кислоту (PHDA), антраниловую кислоту-N, N-диуксусную кислоту (ANDA), сульфаниловую кислоту-N, N-диуксусную кислоту (SLDA), таурин-N, N-диуксусную кислоту (TUDA) и сульфометил-N, N-диуксусную кислоту (SMDA), N-(2-гидроксиэтил)-этилидендиамин-N, N', N'-триацетат (HEDTA), диэтанолглицин (DEG), диэтилентриамин-пента(метиленфосфоновую кислоту) (DTPMP), аминотрис(метиленфосфоновую кислоту) (ATMP), а также их комбинации и соли. Дополнительные иллюстративные компоненты моющих средств и/или дополнительные компоненты моющих средств описаны, например, в WO 2009/102854 и US 5977053

Варианты субтилазы по настоящему изобретению также могут быть составлены в композицию для мытья посуды, предпочтительно композицию для автоматизированного мытья посуды (ADW), содержащую:

a) по меньшей мере 0,01 мг варианта активной протеазы в соответствии с настоящим изобретением и

b) 10-50 вес. % компонента моющих средств, предпочтительно выбранного из лимонной кислоты, метилглицин-N,N-диуксусной кислоты (MGDA) и/или глутаминовой кислоты-N,N-диуксусной кислоты (GLDA), и их смеси, а также

c) по меньшей мере один отбеливающий компонент.

Отбеливающие системы

Моющее средство может содержать 0-50% по весу, например от приблизительно 0,1% до приблизительно 25% отбеливающей системы. Отбеливающие системы устраняют обесцвечивание, часто с помощью окисления, и многие отбеливатели также обладают сильными бактерицидными свойствами, а также используются для дезинфекции и стерилизации. Для использования в моющих средствах для стирки можно применять любую отбеливающую систему, известную из уровня техники. Компоненты подходящей отбеливающей системы включают катализаторы отбеливания, фотоотбеливатели, активаторы отбеливания, источники пероксида водорода, такие как перкарбонат натрия и пербораты натрия, предварительно образованные перкислоты и их смеси. Подходящие предварительно образованные перкислоты включают без ограничения пероксикарбоновые кислоты и соли, перугольные кислоты и соли, перимидокислоты и соли, пероксимоносерные кислоты и соли, например Oxone (R), а также их смеси. Неограничивающие примеры отбеливающих систем включают отбеливающие системы на основе пероксида, которые могут содержать например неорганическую соль, в том числе соли щелочных металлов, такие как натриевые соли пербората (обычно моно- или тетрагидраты), перкарбоната, персульфата, перфосфата, персиликатные соли в комбинации с активатором отбеливания, образующим перкислоту. В данном документе термин активатор отбеливания означает соединение, которое реагирует с пероксидным отбеливателем, таким как пероксид водорода, с образованием перкислоты. Перкислота, полученная таким образом, представляет собой активированное отбеливающее вещество. Подходящие активаторы отбеливания для применения согласно данному документу включают активаторы, принадлежащие к классу сложных эфиров, амидов, имидов или ангидридов. Подходящими примерами являются тетраацетилендиамин (TAED), 4-[(3,5,5-триметилгексаноил)окси]бензолсульфонат натрия (ISONOBS), дипероксидодекановая кислота, 4-(додеканоилокси)бензолсульфонат (LOBS), 4-(деканоилокси)бензолсульфонат, 4-(деканоилокси)бензоат (DOBS), 4-(нонаноилокси)бензолсульфонат (NOBS) и/или раскрытые в WO 98/17767. Конкретное семейство активаторов отбеливания, представляющее интерес, раскрыто в EP 624154, и наиболее предпочтительным в данном семействе является ацетилтриэтилцитрат (ATC). ATC или короткоцепочечный триглицерид, такой как триацетин, имеет преимущество, заключающееся в том, что он является экологически безопасным, так как в конце концов разрушается до лимонной кислоты и спирта. Кроме того, ацетилтриэтилцитрат и триацетин характеризуются хорошей гидролитической стабильностью в продукте при хранении и являются эффективными активаторами отбеливания. Наконец, ATC обеспечивает хорошие свойства компонента, усиливающего моющее действие, в добавке для стирки. В качестве альтернативы, отбеливающая система может содержать пероксикислоты, например, амидного, имидного или сульфонового типа. Отбеливающая система может дополнительно содержать перкислоты, такие как 6-(фталимидо)пероксигексановая кислота (PAP). Отбеливающая система может дополнительно содержать катализатор или усилитель отбеливания.

Некоторые неограничивающие примеры катализаторов отбеливания, которые могут быть использованы в композициях по настоящему изобретению, включают катализаторы на основе оксалата марганца, ацетата марганца, марганца-коллагена, кобальта-амина и катализаторы на основе триазациклононана марганца (MnTACN); особенно предпочтительными являются комплексы марганца с 1,4,7-триметил-1,4,7-триазациклононаном (Me3-TACN) или 1,2,4,7-тетраметил-1,4,7-триазациклононаном (Me4-TACN), в частности Me3-TACN, такой как двухъядерный комплекс марганца [(Me3-TACN)Mn(O)3Mn(Me3-TACN)](PF6)2 и [2,2',2''-нитрилотрис(этан-1,2-диилазанилилиден-κN-метанилилиден)трифенолат-κ3O]марганец(III). Катализаторы отбеливания могут также представлять собой другие соединения металлов, такие как комплексы железа или кобальта.

В некоторых вариантах осуществления отбеливающий компонент может представлять собой органический катализатор, выбранный из группы, состоящей из органических катализаторов со следующей формулой:

(iii) и их смеси; где каждый R¹ независимо представляет собой разветвленную алкильную группу, содержащую от 9 до 24 атомов углерода, или неразветвленную алкильную группу, содержащую от 11 до 24 атомов углерода, предпочтительно каждый R¹ независимо представляет собой разветвленную алкильную группу, содержащую от 9 до 18 атомов углерода, или неразветвленную алкильную группу, содержащую от 11 до 18 атомов углерода, более предпочтительно каждый R¹ независимо выбран из группы, состоящей из 2-пропилгептила, 2-бутилоктила, 2-пентилнонила, 2-гексилдецила, н-додецила, н-тетрадецила, н-гексадецила, н-октадецила, изо-нонила, изо-децила, изо-тридецила и изо-пентадецила. Другие иллюстративные отбеливающие системы описаны, например, в WO 2007/087258, WO 2007/087244, WO 2007/087259 и WO 2007/087242. Например, подходящие фотоотбеливатели могут представлять собой сульфированный фталоцианин цинка.

Гидротропы

Гидротроп представляет собой соединение, которое солюбилизирует гидрофобные соединения в водных растворах (или, в противоположном случае, полярные соединения в неполярной среде). Как правило, гидротропы имеют как гидрофильный, так и гидрофобный характеры (так называемые амфифильные свойства, которые известны у поверхностно-активных веществ), тем не менее, молекулярная структура гидротропов обычно не способствует спонтанной аутоагрегации, см., например, обзор Hodgdon and Kaler, 2007, Current Opinion in Colloid & Interface Science 12: 121-128. Гидротропы не проявляют критическую концентрацию, выше которой происходит аутоагрегация, обнаруживаемую у поверхностно-активных веществ и липидов, образующих мицеллярные, ламеллярные или другие хорошо определенные мезофазы. Между тем, у многих гидротропов наблюдают процесс агрегации непрерывного типа, при этом размеры агрегатов растут по мере увеличения концентрации. Тем не менее, многие гидротропы изменяют фазовое поведение, устойчивость и коллоидные свойства систем, содержащих вещества полярного и неполярного характера, в том числе смеси воды, масла, поверхностно-активных веществ и полимеров. Гидротропы обычно применяют в отраслях, начиная от фармацевтики, личной гигиены, пищевой промышленности и заканчивая применениями в технике. Применение гидротропов в моющих композициях обеспечивает получение, например, более концентрированных составов поверхностно-активных веществ (например, в процессе уплотнения жидких моющих средств с помощью удаления воды), не вызывая нежелательного явления, такого как разделение фаз или высокая вязкость.

Моющее средство может содержать 0-5% по весу, например от приблизительно 0,5 до приблизительно 5% или от приблизительно 3% до приблизительно 5% гидротропа. В моющих средствах можно применять любой гидротроп, известный из уровня техники. Неограничивающие примеры гидротропов включают бензолсульфонат натрия, п-толуолсульфонат натрия (STS), ксилолсульфонат натрия (SXS), кумолсульфонат натрия (SCS), кумолсульфонат натрия, аминоксиды, спирты и полигликолевые эфиры, гидроксинафтоат натрия, гидроксинафталинсульфонат натрия, этилгексилсульфат натрия и их комбинации.

Полимеры

Моющее средство может содержать 0-10% по весу, как например, 0,5-5%, 2-5%, 0,5-2% или 0,2-1% полимера. Для применения в моющих средствах можно использовать любой полимер, известный из уровня техники. Полимер может выполнять функцию дополнительного компонента моющих средств, который упомянут выше, или может препятствовать переосаждению, обеспечивать защиту волокон, отталкивание грязи, ингибирование переноса красителя, очистку от жира и/или антивспенивающие свойства. Некоторые полимеры могут иметь более чем одно из вышеупомянутых свойств и/или более чем один из нижеприведенных мотивов. Иллюстративные полимеры включают (карбоксиметил)целлюлозу (CMC), поли(виниловый спирт) (PVA), поли(винилпирролидон) (PVP), поли(этиленгликоль) или поли(этиленоксид) (PEG), этоксилированный поли(этиленимин), карбоксиметилинулин (CMI) и поликарбоксилаты, такие как PAA, PAA/PMA, полиаспарагиновую кислоту и сополимеры лаурилметакрилата/акриловой кислоты, гидрофобно модифицированную CMC (HM-CMC) и кремнийогранические соединения, сополимеры терефталевой кислоты и олигомерные гликоли, сополимеры поли(этилентерефталата) и поли(оксиэтилентерефталата) (PET-POET), PVP, поли(винилимидазол) (PVI), поли(винилпиридин-N-оксид) (PVPO или PVPNO) и поливинилпирролидон-винилимидазол (PVPVI). Дополнительные иллюстративные полимеры включают сульфированные поликарбоксилаты, полиэтиленоксид и полипропиленоксид (PEO-PPO), а также этоксисульфат дикватерния. Другие иллюстративные полимеры раскрыты например в WO 2006/130575. Также предусматриваются соли вышеупомянутых полимеров.

Средства для окрашивания тканей

Моющие композиции по настоящему изобретению могут включать также средства для окрашивания тканей, такие как красители или пигменты, которые при составлении моющих композиций могут откладываться на ткани при контакте ткани с моющей жидкостью, содержащей моющие композиции, и следовательно они изменяют тон ткани с помощью поглощения/отражения видимого света. Флуоресцентные отбеливающие средства излучают по меньшей мере некоторое количество видимого света. Напротив, средства для окрашивания тканей изменяют тон поверхности, поскольку они поглощают по меньшей мере часть видимой части спектра. Подходящие средства для окрашивания тканей включают красители и конъюгаты краситель-глина, а также они могут включать пигменты. Подходящие красители включают в себя низкомолекулярные красители и полимерные красители. Подходящие низкомолекулярные красители включают низкомолекулярные красители, выбранные из группы, состоящей из красителей, относящихся при классификации по цветовому индексу (C.I.) к Direct Blue, Direct Red, Direct Violet, Acid Blue, Acid Red, Acid Violet, Basic Blue, Basic Violet и Basic Red или их смеси, например как описано в WO 2005/003274, WO 2005/003275, WO 2005/003276 и EP 1876226 (включены в данный документ с помощью ссылки). Моющая композиция предпочтительно содержит от приблизительно 0,00003 вес. % до приблизительно 0,2 вес. %, от приблизительно 0,00008 вес. % до приблизительно 0,05 вес. % или даже от приблизительно 0,0001 вес. % до приблизительно 0,04 вес. % средства для окрашивания тканей. Композиция может содержать от 0,0001 вес. % до 0,2 вес. % средства для окрашивания тканей, причем может быть особенно предпочтительным, если композиция присутствует в форме пакета с единичной дозой. Подходящие средства для окрашивания также раскрыты например в WO 2007/087257 и WO 2007/087243.

Дополнительные ферменты

Моющая добавка, а также моющая композиция, могут содержать один или несколько (дополнительных) ферментов, таких как амилаза, арабиназа, карбогидраза, целлюлаза (например, эндоглюканаза), кутиназа, галактаназа, галогенпероксигеназа, липаза, маннаназа, оксидаза, например, лакказа и/или пероксидаза, пектиназа, пектин-лиазы, протеаза, ксиланаза, ксантаназа и ксилоглюканаза.

В целом, свойства выбранного фермента(-ов) должны быть совместимы с выбранным моющим средством (т. е. pH-оптимум, совместимость с другими ферментативными и неферментативными ингредиентами и т. д.), при этом фермент(-ы) должен(-ны) присутствовать в эффективных количествах.

Целлюлазы

Подходящие целлюлазы включают целлюлазы бактериального или грибного происхождения. Предусматриваются мутанты, которые являются химически модифицированными или полученными с помощью белковой инженерии. Подходящие целлюлазы включают целлюлазы из родов Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, например целлюлазы грибов, полученные из Humicola insolens, Myceliophthora thermophila и Fusarium oxysporum, раскрытые в US 4,435,307, US 5,648,263, US 5,691,178, US 5,776,757 и WO 89/09259.

Особенно подходящими целлюлазами являются щелочные или нейтральные целлюлазы, обладающие преимуществами сохранения цвета. Примерами таких целлюлаз являются целлюлазы, описанные в EP 495257, EP 531372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Другими примерами являются варианты целлюлазы, такие как описанные в WO 94/07998, EP 531315, US 5,457,046, US 5,686,593, US 5,763,254, WO 95/24471, WO 98/12307 и PCT/DK98/00299.

Примеры целлюлаз, характеризующихся эндо-бета-1,4-глюканазной активностью (EC 3.2.1.4), описаны в WO 02/99091.

Другие примеры целлюлаз предусматривают целлюлазы семейства 45, описанные в WO 96/29397, и в особенности их варианты, имеющие замену, вставку и/или делецию в одном или нескольких положениях, соответствующих следующим положениям в SEQ ID NO: 8 из WO 02/99091: 2, 4, 7, 8, 10, 13, 15, 19, 20, 21, 25, 26, 29, 32, 33, 34, 35, 37, 40, 42, 42a, 43, 44, 48, 53, 54, 55, 58, 59, 63, 64, 65, 66, 67, 70, 72, 76, 79, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 91, 93, 95, 95d, 95h, 95j, 97, 100, 101, 102, 103, 113, 114, 117, 119, 121, 133, 136, 137, 138, 139, 140a, 141, 143a, 145, 146, 147, 150e, 150j, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160c, 160e, 160k, 161, 162, 164, 165, 168, 170, 171, 172, 173, 175, 176, 178, 181, 183, 184, 185, 186, 188, 191, 192, 195, 196, 200 и/или 20, предпочтительно выбранным из P19A, G20K, Q44K, N48E, Q119H или Q146 R.

Коммерчески доступные целлюлазы включают Celluzyme™ и Carezyme™ (Novozymes A/S), Clazinase™ и Puradax HA™ (Genencor International Inc.), а также KAC-500(B)™ (Kao Corporation).

Протеазы

Композиция может содержать одну или несколько дополнительных протеаз, в том числе протеазы бактериального, грибного, растительного, вирусного или животного происхождения, например растительного или микробного происхождения. Микробное происхождение является предпочтительным. Предусматриваются мутанты, которые являются химически модифицированными или полученными с помощью белковой инженерии. Это может быть щелочная протеаза, например сериновая протеаза или металлопротеаза. Сериновая протеаза может быть, например, представителем семейства S1, таким как трипсин, или семейства S8, таким как субтилизин. Протеазы, относящиеся к металлопротеазам, могут например представлять собой термолизин, например из семейства M4, или другую металлопротеазу, например из семейств M5, M7 или M8.

Примерами металлопротеаз являются нейтральная металлопротеаза, описанная в WO 2007/044993 (Genencor Int.), например металлопротеазы, полученные из Bacillus amyloliquefaciens.

Подходящие коммерчески доступные ферменты-протеазы включают в себя продаваемые под торговыми названиями Alcalase®, Duralase^Tm, Durazym^Tm, Relase®, Relase® Ultra, Savinase®, Savinase® Ultra, Primase®, Polarzyme®, Kannase®, Liquanase®, Liquanase® Ultra, Ovozyme®, Coronase®, Coronase® Ultra, Neutrase®, Everlase® и Esperase® (Novozymes A/S), продаваемые под торговым названием Maxatase®, Maxacal®, Maxapem®, Purafect®, Purafect Prime®, Purafect MA®, Purafect Ox®, Purafect OxP®, Puramax®, Properase®, FN2®, FN3®, FN4®, Excellase®, Eraser®, Opticlean® и Optimase® (Danisco/DuPont), Axapem^TM (Gist-Brocades N.V.), BLAP (последовательность, представленная на фигуре 29 в US 5352604) и их варианты (Henkel AG), а также KAP (субтилизин Bacillus alkalophilus) от Kao.

Липазы и кутиназы

Подходящие липазы и кутиназы включают таковые бактериального или грибного происхождения. Предусматриваются химически модифицированные или полученные с применением белковой инженерии мутантные ферменты. Примеры включают липазу из Thermomyces, например из T. lanuginosus (ранее называемый Humicola lanuginosa), которая описана в EP 258068 и EP 305216, кутиназу из Humicola, например H. insolens (WO 96/13580), липазу из штаммов Pseudomonas (некоторые из них сейчас переименованы в Burkholderia), например, P. alcaligenes или P. pseudoalcaligenes (EP 218272), P. cepacia (EP 331376), P. sp. штамм SD705 (WO 95/06720 и WO 96/27002), P. wisconsinensis (WO 96/12012), липазы GDSL-типа Streptomyces (WO 2010/065455), кутиназу из Magnaporthe grisea (WO 2010/107560), кутиназу из Pseudomonas mendocina (US 5389536), липазу из Thermobifida fusca (WO 2011/084412), липазу из Geobacillus stearothermophilus (WO 2011/084417), липазу из Bacillus subtilis (WO 2011/084599), а также липазу из Streptomyces griseus (WO 2011/150157) и S. pristinaespiralis (WO 2012/137147).

Другими примерами являются варианты липазы, такие как описанные в EP 407225, WO 92/05249, WO 94/01541, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/30744, WO 95/35381, WO 95/22615, WO 96/00292, WO 97/04079, WO 97/07202, WO 00/34450, WO 00/60063, WO 01/92502, WO 2007/87508 и WO 2009/109500.

Предпочтительные коммерческие продукты на основе липаз включают Lipolase^TM, Lipex™; Lipolex^TM и Lipoclean^TM (Novozymes A/S), Lumafast (первоначально от Genencor) и Lipomax (первоначально от Gist-Brocades).

Другими примерами являются липазы, иногда называемые ацилтрансферазами или пергидролазами, например, ацилтрансферазы с гомологией к липазе А Candida antarctica (WO 2010/111143), ацилтрансфераза из Mycobacterium smegmatis (WO 2005/056782), пергидролазы из семейства CE 7 (WO 2009/067279) и варианты пергидролазы M. Smegmatis,, в частности вариант S54V, используемый в коммерческом продукте Gentle Power Bleach от Huntsman Textile Effects Pte Ltd (WO 2010/100028).

Амилазы

Подходящие амилазы, которые можно применять совместно с вариантами субтилазы по настоящему изобретению, могут представлять собой альфа-амилазу или глюкоамилазу и могут быть бактериального или грибного происхождения. Предусматриваются мутанты, которые являются химически модифицированными или полученными с помощью белковой инженерии. Например, амилазы предусматривают альфа-амилазы, полученные из Bacillus, например специального штамма Bacillus licheniformis, более подробно описанного в GB 1296839.

Подходящие амилазы включают амилазы под SEQ ID NO: 2 в WO 95/10603 или их варианты, последовательность которых на 90% идентична последовательности под SEQ ID NO: 3. Предпочтительные варианты описаны в WO 94/02597, WO 94/18314, WO 97/43424 и SEQ ID NO: 4 из WO 99/19467, такие как варианты с заменами в одном или нескольких из следующих положений: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 178, 179, 181, 188, 190, 197, 201, 202, 207, 208, 209, 211, 243, 264, 304, 305, 391, 408, и 444.

Различные подходящие амилазы включают амилазы под SEQ ID NO: 6 из WO 02/10355 или их варианты, последовательность которых на 90% идентична последовательности под SEQ ID NO: 6. Предпочтительными вариантами последовательности под SEQ ID NO: 6 являются варианты, имеющие делецию в положениях 181 и 182, а также замену в положении 193.

Другие амилазы, которые являются подходящими, представляют собой гибридную альфа-амилазу, содержащую остатки 1-33 альфа-амилазы, полученной из B. amyloliquefaciens, приведенные в SEQ ID NO: 6 из WO 2006/066594, и остатки 36-483 альфа-амилазы B. licheniformis, приведенные в SEQ ID NO: 4 из WO 2006/066594, или варианты, последовательность которых на 90% идентична их последовательности. Предпочтительными вариантами данной гибридной альфа-амилазы являются варианты, имеющие замену, делецию или вставку в одном или нескольких из следующих положений: G48, T49, G107, H156, A181, N190, M197, I201, A209 и Q264. Наиболее предпочтительными вариантами гибридной альфа-амилазы, содержащими остатки 1-33 альфа-амилазы, полученной из B. amyloliquefaciens, приведенными в SEQ ID NO: 6 из WO 2006/066594, и остатки 36-483 из последовательности под SEQ ID NO: 4 являются варианты, имеющие следующие замены:

M197T;

H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S; или

G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S.

Другие подходящие амилазы представляют собой амилазы, характеризующиеся последовательностью под SEQ ID NO: 6 из WO 99/19467 или их варианты, последовательность которых на 90% идентична последовательности под SEQ ID NO: 6. Предпочтительными вариантами последовательности под SEQ ID NO: 6 являются варианты, имеющие замену, делецию или вставку в одном или нескольких из следующих положений: R181, G182, H183, G184, N195, I206, E212, E216 и K269. Особенно предпочтительными амилазами являются амилазы, имеющие делецию в положениях R181 и G182 или положениях H183 и G184.

Дополнительными амилазами, которые можно применять, являются амилазы под SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 7 из WO 96/23873, или их варианты, последовательность которых на 90% идентична последовательности под SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 7. Предпочтительными вариантами последовательности под SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 7 являются варианты, имеющие замену, делецию или вставку в одном или нескольких из следующих положений: 140, 181, 182, 183, 184, 195, 206, 212, 243, 260, 269, 304 и 476, с использованием SEQ ID 2 из WO 96/23873 для нумерации. Более предпочтительными являются варианты, которые имеют делецию в двух положениях, выбранных из 181, 182, 183 и 184, такие как 181 и 182, 182 и 183, или положения 183 и 184. Наиболее предпочтительными вариантами амилазы под SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 7 являются варианты, имеющие делецию в положениях 183 и 184 и замену в одном или нескольких из положений 140, 195, 206, 243, 260, 304 и 476.

Другие амилазы, которые можно применять, представляют собой амилазы под SEQ ID NO: 2 из WO 2008/153815, SEQ ID NO: 10 из WO 01/66712 или их варианты, последовательность которых на 90% идентична последовательности под SEQ ID NO: 2 из WO 2008/153815 или на 90% идентична последовательности под SEQ ID NO: 10 из WO 01/66712. Предпочтительными вариантами последовательности под SEQ ID NO: 10 из WO 01/66712 являются варианты, имеющие замену, делецию или вставку в одном или нескольких из следующих положений: 176, 177, 178, 179, 190, 201, 207, 211 и 264.

Следующими подходящими амилазами являются амилазы под SEQ ID NO: 2 из WO 2009/061380 или их варианты, последовательность которых на 90% идентична последовательности под SEQ ID NO: 2. Предпочтительными вариантами последовательности под SEQ ID NO: 2 являются варианты, имеющие усечение C-конца и/или замену, делецию или вставку в одном или нескольких из следующих положений: Q87, Q98, S125, N128, T131, T165, K178, R180, S181, T182, G183, M201, F202, N225, S243, N272, N282, Y305, R309, D319, Q320, Q359, K444 и G475. Более предпочтительными вариантами под SEQ ID NO: 2 являются варианты, имеющие замену в одном или нескольких из следующих положений: Q87E,R, Q98R, S125A, N128C, T131I, T165I, K178L, T182G, M201L, F202Y, N225E,R, N272E,R, S243Q,A,E,D, Y305R, R309A, Q320R, Q359E, K444E и G475K, и/или делецию в положении R180 и/или S181, или T182 и/или G183. Наиболее предпочтительными вариантами амилазы под SEQ ID NO: 2 являются варианты, имеющие следующие замены:

N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K;

N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K;

S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K; или

S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K,

где варианты усечены до C-концу и необязательно дополнительно содержат замену в положении 243 и/или характеризуются делецией в положении 180 и/или положении 181.

Следующими подходящими амилазами являются амилазы под SEQ ID NO: 1 из WO 2013/184577 или их варианты, последовательность которых на 90% идентична последовательности под SEQ ID NO: 1. Предпочтительными вариантами последовательности под SEQ ID NO: 1 являются варианты, имеющие замену, делецию или вставку в одном или нескольких из следующих положений: K176, R178, G179, T180, G181, E187, N192, M199, I203, S241, R458, T459, D460, G476 и G477. Более предпочтительными вариантами под SEQ ID NO: 1 являются варианты, имеющие замену в одном или нескольких из следующих положений: K176L, E187P, N192FYH, M199L, I203YF, S241QADN, R458N, T459S, D460T, G476K и G477K, и/или делецию в положении R178 и/или S179, или T180 и/или G181. Наиболее предпочтительные варианты амилазы под SEQ ID NO: 1 содержат замены:

E187P+I203Y+G476K

E187P+I203Y+R458N+T459S+D460T+G476K

и необязательно дополнительно содержат замену в положении 241, и/или делецию в положении 178 и/или положении 179.

Следующими подходящими амилазами являются амилазы под SEQ ID NO: 1 из WO 2010/104675 или их варианты, последовательность которых на 90% идентична последовательности под SEQ ID NO: 1. Предпочтительными вариантами последовательности под SEQ ID NO: 1 являются варианты, имеющие замену, делецию или вставку в одном или нескольких из следующих положений: N21, D97, V128 K177, R179, S180, I181, G182, M200, L204, E242, G477 и G478.

Более предпочтительными вариантами под SEQ ID NO: 1 являются варианты, имеющие замену в одном или нескольких из следующих положений: N21D, D97N, V128I K177L, M200L, L204YF, E242QA, G477K и G478K, и/или делецию в положении R179 и/или S180, или в I181 и/или G182. Наиболее предпочтительные варианты амилазы под SEQ ID NO: 1 содержат замены N21D+D97N+V128I и необязательно дополнительно содержат замену в положении 200, и/или делецию в положении 180 и/или положении 181.

Другие подходящие амилазы представляют собой альфа-амилазу под SEQ ID NO: 12 из WO 01/66712 или вариант, последовательность которого на 90% идентична последовательности под SEQ ID NO: 12. Предпочтительными вариантами амилазы являются варианты, имеющие замену, делецию или вставку в одном или нескольких из следующих положений в SEQ ID NO: 12 из WO 01/66712: R28, R118, N174; R181, G182, D183, G184, G186, W189, N195, M202, Y298, N299, K302, S303, N306, R310, N314; R320, H324, E345, Y396, R400, W439, R444, N445, K446, Q449, R458, N471, N484. Особенно предпочтительные амилазы включают варианты, имеющие делецию в D183 и G184, и имеющие замены в R118K, N195F, R320K и R458K, а также вариант, дополнительно имеющий замены в одном или нескольких положениях, выбранных из группы: M9, G149, G182, G186, M202, T257, Y295, N299, M323, E345 и A339, при этом наиболее предпочтительным является вариант, который дополнительно имеет замены во всех положениях.

Другими примерами являются варианты амилазы, например варианты, описанные в WO 2011/098531, WO 2013/001078 и WO 2013/001087. Коммерчески доступными амилазами являются Duramyl^TM, Termamyl^TM, Fungamyl^TM, Stainzyme ^TM, Stainzyme Plus^TM, Natalase^TM, Liquozyme X и BAN^TM (от Novozymes A/S) и Rapidase^TM, Purastar^TM/Effectenz^TM, Powerase, Preferenz S1000, Preferenz S100 и Preferenz S110 (от Genencor International Inc./DuPont).

Пероксидазы/оксидазы

Подходящие пероксидазы/оксидазы включают таковые растительного, бактериального или грибкового происхождения. Предусматриваются мутанты, которые являются химически модифицированными или полученными с помощью белковой инженерии. Примеры пригодных пероксидаз включают пероксидазы из Coprinus, например из C. cinereus, и их варианты, описанные в WO 93/24618, WO 95/10602 и WO 98/15257.

Коммерчески доступные пероксидазы включают Guardzyme™ (Novozymes A/S).

Фермент(-ы) моющих средств может(могут) быть включен(-ы) в моющую композицию с помощью добавления отдельных добавок, содержащих один или несколько ферментов, или с помощью добавления комбинированной добавки, содержащей все данные ферменты. Моющую добавку по данному изобретению, т. е. отдельную добавку или комбинированную добавку, можно составить, например, в виде гранулята, жидкости, взвеси и т. д. Предпочтительными составами моющих добавок являются грануляты, в частности непылящие грануляты, жидкости, в частности стабилизированные жидкости, или взвеси.

Непылящие грануляты можно получать, например, как раскрыто в US 4106991 и 4661452, и на них можно наносить покрытие с применением способов, известных из уровня техники. Примерами восковидных покрывающих материалов являются поли(этиленоксидные) продукты (полиэтиленгликоль, PEG) со средними значениями молярного веса 1000-20000; этоксилированные нонилфенолы, содержащие 16-50 этиленоксидных звеньев; этоксилированные жирные спирты, в которых спирт содержит от 12 до 20 атомов углерода и в которых присутствует от 15 до 80 этиленоксидных звеньев; жирные спирты; жирные кислоты; а также моно-, и ди-, и триглицериды жирных кислот. Примеры пленкообразующих покрывающих материалов, подходящих для нанесения с помощью методик с использованием псевдоожиженного слоя, приведены в GB 1483591. Жидкие ферментные препараты можно, например, стабилизировать с помощью добавления полиола, такого как пропиленгликоль, сахара или сахароспирта, молочной кислоты или борной кислоты в соответствии с общепризнанными способами. Защищенные ферменты можно получать в соответствии со способом, раскрытым в EP 238216.

Вспомогательные материалы

Также можно применять любые моющие компоненты, известные из уровня техники для применения в моющих средствах для стирки. Другие необязательные моющие компоненты включают в себя антикоррозионные средства, средства против усадки, средства против переосаждения грязи, средства, препятствующие сминанию, бактерициды, связующие, ингибиторы коррозии, разрыхлители/разрыхляющие средства, красители, стабилизаторы ферментов (в том числе борная кислота, бораты, CMC и/или полиолы, например пропиленгликоль), кондиционеры для тканей, в том числе глины, наполнители/технологические добавки, флуоресцентные отбеливающие средства/оптические осветлители, пенообразователи, регуляторы пенообразования (образования мыльной пены), отдушки, средства для суспендирования загрязнения, смягчители, подавители образования мыльной пены, ингибиторы потускнения и средства, способствующие впитыванию влаги, либо отдельно, либо в комбинации. Для применения в моющих средствах для стирки можно применять любой ингредиент, известный из уровня техники. Выбор таких ингредиентов находится в компетенции специалиста в данной области.

Диспергирующие средства. Моющие композиции по настоящему изобретению могут содержать также диспергирующие средства. В частности, порошкообразные моющие средства могут содержать диспергирующие средства. Подходящие растворимые в воде органические материалы включают гомо- или сополимерные кислоты или их соли, в которых поликарбоновая кислота содержит по меньшей мере два карбоксильных радикала, отделенных друг от друга не более чем двумя атомами углерода. Например, подходящими диспергирующими средствами являются описанные в Powdered Detergents, Surfactant science series volume 71, Marcel Dekker, Inc.

Средства, ингибирующие перенос красителя. Моющие композиции по настоящему изобретению могут включать также одно или несколько средств, ингибирующих перенос красителя. Подходящие полимерные средства, ингибирующие перенос красителя, включают без ограничения полимеры поливинилпирролидона, полимеры полиамин-N-оксида, сополимеры N-винилпирролидона и N-винилимидазола, поливинилоксазолидоны и поливинилимидазолы, или их смеси. Если они присутствуют в представленной композиции, то средства, ингибирующие перенос красителя, могут присутствовать при уровнях содержания от приблизительно 0,0001% до приблизительно 10%, от приблизительно 0,01% до приблизительно 5% или даже от приблизительно 0,1% до приблизительно 3% по весу композиции.

Флуоресцентное отбеливающее средство. Моющие композиции по настоящему изобретению предпочтительно будут содержать также дополнительные компоненты, которые могут придавать подлежащим очистке изделиям цветовой оттенок, такие как флуоресцентное отбеливающее средство или оптические осветлители. Если он присутствует, то содержание отбеливателя предпочтительно составляет от приблизительно 0,01% до приблизительно 05%. В композиции по настоящему изобретению может применяться любое флуоресцентное отбеливающее средство, подходящее для применения в моющей композиции для стирки. Наиболее часто применяемые флуоресцентные отбеливающие средства представляют собой средства, относящиеся к классам производных диаминостильбен-сульфоновой кислоты, производные диарилпиразолина и производные бисфенилдистирила. Примеры флуоресцентных отбеливающих средств типа производных диаминостильбен-сульфоновой кислоты включают натриевые соли: 4,4'-бис-(2-диэтаноламино-4-анилино-s-триазин-6-иламино)стильбен-2,2'-дисульфоната; 4,4'-бис-(2,4-дианилино-s-триазин-6-иламино)стильбен-2,2'-дисульфоната; 4,4'-бис-(2-анилино-4(N-метил-N-2-гидроксиэтиламино)-s-триазин-6-иламино)стильбен-2,2'-дисульфоната, 4,4'-бис-(4-фенил-2,1,3-триазол-2-ил)стильбен-2,2'-дисульфоната; 4,4'-бис-(2-анилино-4(1-метил-2-гидроксиэтиламино)-s-триазин-6-иламино)стильбен-2,2'-дисульфоната и 2-(стильбил-4"-нафто-1,2':4,5)-1,2,3-тризол-2"-сульфоната. Предпочтительными флуоресцентными отбеливающими средствами являются Tinopal DMS и Tinopal CBS, поставляемые компанией Ciba-Geigy AG, Базель, Швейцария. Tinopal DMS представляет собой натриевую соль 4,4'-бис-(2-морфолино-4 анилино-s-триазин-6-иламино)стильбендисульфоната. Tinopal CBS представляет собой динатриевую соль 2,2'-бис-(фенилстирил)дисульфоната. Предпочтительными являются также флуоресцентные отбеливающие средства, коммерчески доступные в виде Parawhite KX, поставляемого Paramount Minerals and Chemicals, Мумбай, Индия. Другие флуоресцентные вещества, подходящие для применения в настоящем изобретении, включают 1-3-диарилпиразолины и 7-алкиламинокумарины. Уровни содержания подходящего флуоресцентного осветителя включают нижние уровни от приблизительно 0,01, от 0,05, от приблизительно 0,1 или даже от приблизительно 0,2 вес. % до верхних уровней 0,5 или даже 0,75 вес. %.

Грязеотталкивающие полимеры. Моющие композиции по настоящему изобретению могут также включать один или несколько грязеотталкивающих полимеров, которые способствуют устранению загрязнений с тканей, таких как хлопок и ткани на основе полиэстера, в частности для удаления гидрофобных загрязнений с тканей на основе полиэстера. Грязеотталкивающими полимерами могут являться, например, неионные или анионные полимеры на основе терефталата, поливинилкапролактам и родственные сополимеры, виниловые привитые сополимеры, сложный полиэфир-полиамиды, см. например главу 7 в Powdered Detergents, Surfactant science series volume 71, Marcel Dekker, Inc. Другим типом грязеотталкивающих полимеров являются амфифильные алкоксилированные жироудаляющие полимеры, содержащие сердцевинную структуру и множество алкоксилатных групп, прикрепленных к данной сердцевинной структуре. Сердцевинная структура может содержать полиалкилениминовую структуру или полиалканоламиновую структуру, которые подробно описаны в WO 2009/087523 (включена в данный документ с помощью ссылки). Более того, статистические привитые сополимеры являются подходящими грязеотталкивающими полимерами. Подходящие привитые сополимеры более подробно описаны в WO 2007/138054, WO 2006/108856 и WO 2006/113314 (включены в данный документ с помощью ссылки). Другими грязеотталкивающими полимерами являются замещенные полисахаридные структуры, особенно замещенные целлюлозные производные, такие как модифицированные производные целлюлозы, как например описанные в EP 1867808 или WO 03/040279 (обе из которых включены в данный документ с помощью ссылки). Подходящие целлюлозные полимеры включают целлюлозу, эфиры целлюлозы, сложные эфиры целлюлозы, амиды целлюлозы и их смеси. Подходящие целлюлозные полимеры включают анионно-модифицированную целлюлозу, неионно-модифицированную целлюлозу, катионно-модифицированную целлюлозу, цвиттерионно-модифицированную целлюлозу и их смеси. Подходящие целлюлозные полимеры включают метилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу, этилцеллюлозу, гидроксиэтилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, сложный эфир карбоксиметилцеллюлозы и их смеси.

Средства против переосаждения. Моющие композиции по настоящему изобретению могут также включать одно или несколько средств против переосаждения, таких как карбоксиметилцеллюлоза (CMC), поливиниловый спирт (PVA), поливинилпирролидон (PVP), полиоксиэтилен и/или полиэтиленгликоль (PEG), гомополимеры акриловой кислоты, сополимеры акриловой кислоты и малеиновой кислоты, а также этоксилированные полиэтиленимины. Полимеры на основе целлюлозы, описанные выше как грязеотталкивающие полимеры, могут функционировать также в качестве средств против переосаждения.

Другие подходящие вспомогательные материалы включают без ограничения средства против усадки, средства, препятствующие сминанию, бактерициды, связующие средства, носители, красители, стабилизаторы ферментов, мягчители тканей, наполнители, регуляторы пенообразования, гидротропы, отдушки, пигменты, подавители образования мыльной пены, растворители и структурообразующие компоненты для жидких моющих средств и/или средства, обеспечивающие эластичность структуры.

Состав моющих продуктов

Моющая композиция по настоящему изобретению может быть представлена в любой удобной форме, например, бруска, гомогенной таблетки, таблетки с двумя или более слоями, пакета с одним или несколькими отделениями, обычного или уплотненного порошка, гранулы, пасты, геля или обычной, плотной или концентрированной жидкости. Существует много форм моющего состава, таких как слои (одна и та же или различные фазы), пакеты, а также формы для автоматического дозирующего устройства.

Пакеты могут быть выполнены как с одним, так и с множеством отделений. Они могут иметь любую форму, вид и материал, который является подходящим для удерживания композиции, например не давая возможности композиции высвободиться из пакета до контакта с водой. Пакет изготовлен из водорастворимой пленки, в которой заключен внутренний объем. Внутренний объем может быть разделен на отделения пакета. Предпочтительными пленками являются полимерные материалы, предпочтительно полимеры, которые имеют форму пленки или листа. Предпочтительные полимеры, сополимеры или их производные выбраны из полиакрилатов и водорастворимых coполимеров акрилата, метилцеллюлозы, карбоксиметилцеллюлозы, декстрина натрия, этилцеллюлозы, гидроксиэтилцеллюлозы, гидроксипропилметилцеллюлозы, мальтодекстрина, полиметакрилатов, наиболее предпочтительно из coполимеров поливинилового спирта и гидроксипропилметилцеллюлозы (HPMC). Предпочтительно количество полимера в пленке, например PVA, составляет по меньшей мере приблизительно 60%. Предпочтительный средний молекулярный вес обычно составляет от приблизительно 20000 до приблизительно 150000. Пленки могут представлять собой также смесь композиций, которая содержит гидролитически разлагаемые и водорастворимые полимерные смеси, такие как полилактид и поливиниловый спирт (известный под торговым названием M8630, продаваемый Chris Craft In. Prod. of Gary, Индиана, США), а также пластификаторы, такие как глицерин, этиленглицерин, пропиленгликоль, сорбит и их смеси. Пакеты могут содержать твердую моющую композицию для стирки, или часть компонентов, и/или жидкую чистящую композицию, или часть компонентов, разделенные водорастворимой пленкой. Камера для жидких компонентов может отличаться по составу от камер, содержащих твердые вещества. См. например US 2009/0011970.

Ингредиенты моющего средства могут быть отделены физически один от другого с помощью отделений в водорастворимых пакетах или в различных слоях таблеток. Таким образом можно избежать негативного взаимодействия между компонентами при хранении. Различные профили растворимости каждого из отделений также могут обеспечивать задержку растворения выбранных компонентов в моющем растворе.

Моющее средство в виде жидкости или геля, которое не является единичной дозой, может быть водным, как правило содержащим от по меньшей мере 20% по весу и до 95% воды, например, до приблизительно 70% воды, до приблизительно 65% воды, до приблизительно 55% воды, до приблизительно 45% воды, до приблизительно 35% воды. В водную жидкость или гель могут быть включены другие типы жидкостей, в том числе без ограничения алканолы, амины, диолы, эфиры и полиолы. Моющее средство в виде водной жидкости или геля может содержать 0-30% органического растворителя. Моющее средство в виде жидкости или геля может быть неводным.

Бруски мыла для стирки

Ферменты по настоящему изобретению можно добавлять в бруски мыла для стирки и использовать для ручной стирки белья, тканей и/или текстильных изделий. Термин брусок мыла для стирки охватывает бруски средства для стирки, бруски мыла, бруски c комбинацией средств, бруски синтетического моющего средства и бруски моющего средства. Типы брусков обычно отличаются по типу поверхностно-активного вещества, которое они содержат, и при этом термин брусок мыла для стирки охватывает бруски, содержащие мыла из жирных кислот и/или синтетические мыла. Брусок мыла для стирки характеризуется физической формой, которая при комнатной температуре представляет собой твердое вещество, а не жидкость, гель или порошок. Термин твердое вещество определяют как физическую форму, которая со временем не подвергается значительным изменениям, т. е. если твердый объект (например, брусок мыла для стирки) поместить в контейнер, то этот твердый объект не изменяет форму с заполнением контейнера, в который он помещен. Брусок представляет собой твердое вещество, как правило в форме прямоугольного бруска, но может представлять собой твердое вещество другой формы, такой как круглая или овальная.

Брусок мыла для стирки может содержать один или несколько дополнительных ферментов, ингибиторы протеазы, такие как пептидные альдегиды (или гидросульфитный аддукт, или полуацетальный аддукт), борную кислоту, борат, буру и/или производные фенилбороновой кислоты, такие как 4-формилфенилбороновая кислота, одно или несколько мыл или синтетических поверхностно-активных веществ, полиолы, такие как глицерин, соединения для регулирования pH, такие как жирные кислоты, лимонную кислоту, уксусную кислоту, и/или муравьиную кислоту, и/или соль одновалентного катиона и органического аниона, где одновалентный катион может представлять собой, например, Na⁺, K⁺ или NH₄ ⁺, и при этом органический анион может представлять собой, например, формиат, ацетат, цитрат или лактат, таким образом, соль одновалентного катиона и органического аниона может представлять собой например формиат натрия.

Брусок мыла для стирки также может содержать комплексообразующие вещества, такие как EDTA и HEDP, отдушки и/или другой тип наполнителей, поверхностно-активные вещества, например, анионные синтетические поверхностно-активные вещества, компоненты моющих средств, полимерные грязеотталкивающие средства, комплексообразователи моющего средства, стабилизирующие средства, наполнители, красители, красящие вещества, ингибиторы переноса красителя, алкоксилированные поликарбонаты, подавители образования мыльной пены, структурообразующие средства, связующие средства, средства для выщелачивания, активаторы отбелки, средства для удаления глинистой грязи, средства против переосаждения, полимерные диспергирующие средства, отбеливатели, мягчители тканей, отдушки и/или другие соединения, известные из уровня техники.

Брусок мыла для стирки можно обрабатывать с помощью обычного оборудования для изготовления брусков мыла для стирки, например без ограничения, мешалок, шнек-прессов, например, двухступенчатого вакуумного шнек-пресса, экструдеров, устройств для резки, устройств для клеймения, туннельных охладителей и упаковочных устройств. Настоящее изобретение не ограничивается получением брусков мыла для стирки с помощью какого-либо одного способа. Предварительно полученную смесь по настоящему изобретению можно добавлять к мылу на различных стадиях процесса. Например, можно получать предварительно полученную смесь, содержащую мыло, фермент, необязательно один или несколько дополнительных ферментов, ингибитор протеазы, а также соль одновалентного катиона и органического аниона, а затем смесь обрабатывать с помощью шнек-пресса. Фермент и необязательные дополнительные ферменты можно добавлять одновременно с ингибитором протеазы, например в жидкой форме. Кроме стадии смешивания и стадии обработки с помощью шнек-пресса процесс дополнительно может включать стадии размалывания, экструдирования, разрезания, штампования, охлаждения и/или упаковывания.

Гранулированные моющие составы

Гранулированное моющее средство может быть составлено, как описано в WO 2009/092699, EP 1705241, EP 1382668, WO 2007/001262, US 6,472,364, WO 2004/074419 или WO 2009/102854. Другие моющие составы описаны в WO 2009/124162, WO 2009/124163, WO 2009/117340, WO 2009/117341, WO 2009/117342, WO 2009/072069, WO 2009/063355, WO 2009/132870, WO 2009/121757, WO 2009/112296, WO 2009/112298, WO 2009/103822, WO 2009/087033, WO 2009/050026, WO 2009/047125, WO 2009/047126, WO 2009/047127, WO 2009/047128, WO 2009/021784, WO 2009/010375, WO 2009/000605, WO 2009/122125, WO 2009/095645, WO 2009/040544, WO 2009/040545, WO 2009/024780, WO 2009/004295, WO 2009/004294, WO 2009/121725, WO 2009/115391, WO 2009/115392, WO 2009/074398, WO 2009/074403, WO 2009/068501, WO 2009/065770, WO 2009/021813, WO 2009/030632, WO 2009/015951, WO 2011/025615, WO 2011/016958, WO 2011/005803, WO 2011/005623, WO 2011/005730, WO 2011/005844, WO 2011/005904, WO 2011/005630, WO 2011/005830, WO 2011/005912, WO 2011/005905, WO 2011/005910, WO 2011/005813, WO 2010/135238, WO 2010/120863, WO 2010/108002, WO 2010/111365, WO 2010/108000, WO 2010/107635, WO 2010/090915, WO 2010/033976, WO 2010/033746, WO 2010/033747, WO 2010/033897, WO 2010/033979, WO 2010/030540, WO 2010/030541, WO 2010/030539, WO 2010/024467, WO 2010/024469, WO 2010/024470, WO 2010/025161, WO 2010/014395, WO 2010/044905, WO 2010/145887, WO 2010/142503, WO 2010/122051, WO 2010/102861, WO 2010/099997, WO 2010/084039, WO 2010/076292, WO 2010/069742, WO 2010/069718, WO 2010/069957, WO 2010/057784, WO 2010/054986, WO 2010/018043, WO 2010/003783, WO 2010/003792, WO 2011/023716, WO 2010/142539, WO 2010/118959, WO 2010/115813, WO 2010/105942, WO 2010/105961, WO 2010/105962, WO 2010/094356, WO 2010/084203, WO 2010/078979, WO 2010/072456, WO 2010/069905, WO 2010/076165, WO 2010/072603, WO 2010/066486, WO 2010/066631, WO 2010/066632, WO 2010/063689, WO 2010/060821, WO 2010/049187, WO 2010/031607, и WO 2010/000636.

Способы применения

Настоящее изобретение также направлено на способы применения вариантов субтилазы в соответствии с настоящим изобретением или их композиций для стирки текстильного изделия и тканей, такой как стирка/полоскание в домашних условиях и стирка/полоскание в промышленных условиях.

Изобретение также направлено на способы применения вариантов в соответствии с настоящим изобретением или их композиций для очистки твердых поверхностей, таких как полы, столы, стены, крыши и т. п., а также поверхностей твердых объектов, таких как машины (мойка машин) и посуда (мытье посуды).

Варианты субтилазы по настоящему изобретению можно добавлять в моющую композицию, и следовательно они становятся ее частью. Таким образом, один аспект настоящего изобретения относится к применению варианта субтилазы в процессе очистки, таком как стирка и/или очистка твердой поверхности.

Моющую композицию по настоящему изобретению можно составить, например, в виде моющей композиции для ручной или машинной стирки, включающей композицию добавок для стирки, подходящую для предварительной обработки испачканных тканей и выполаскивания добавленной композиции мягчителя тканей, или ее можно составить в виде моющей композиции для применения в обычных процессах очистки твердых поверхностей в домашнем хозяйстве, или ее можно составить для операций ручной и машинной мойки посуды.

В конкретном аспекте настоящее изобретение обеспечивает моющую добавку, содержащую полипептид по настоящему изобретению, как описано в данном документе.

Процесс очистки или процесс ухода за текстильным изделием может представлять собой, например, процесс стирки, процесс мытья посуды или очистки твердых поверхностей, таких как керамическая плитка в ванной комнате, полы, верхние поверхности столов, сточные трубы, раковины и умывальники. Например, процессы стирки могут представлять собой как стирку в домашних условиях, так и стирку в промышленных условиях. Кроме того, настоящее изобретение относится к процессу стирки тканей и/или одежды, где процесс включает обработку тканей моющим раствором, содержащим моющую композицию и по меньшей мере один вариант протеазы по настоящему изобретению. Процесс очистки или процесс ухода за текстильным изделием можно осуществлять, например, в процессе машинного мытья или в процессе ручного мытья. Моющий раствор может представлять собой, например, водный моющий раствор, содержащий моющую композицию.

За последние несколько лет наблюдается повышенный интерес к замене компонентов в моющих средствах, которые получены из нефтепродуктов, на возобновляемые биологические компоненты, такие как ферменты или полипептиды, без снижения моющей способности. Если изменяют компоненты моющих композиций, то для достижения похожей или улучшенной моющей эффективности по сравнению с традиционными моющими композициями необходимые новые ферментативные активности или новые ферменты, характеризующиеся альтернативными и/или улучшенными характеристиками по сравнению с обычно применяемыми ферментами моющих средств, такими как протеазы, липазы и амилазы.

Изобретение дополнительно относится к применению вариантов субтилаз по настоящему изобретению в способах удаления белковых пятен. Белковые пятна могут представлять собой пятна, такие как пятна от продуктов питания, например, детского питания, кожного жира, какао, яйца, крови, молока, чернила, травы или их комбинации.

Способ стирки

Настоящее изобретение относится к способу очистки ткани, посуды или твердых поверхностей с использованием моющей композиции, содержащей вариант протеазы по настоящему изобретению.

Предпочтительный вариант осуществления относится к способу очистки, при этом способ предусматривает стадии: приведение в контакт объекта с моющей композицией, содержащей вариант протеазы по настоящему изобретению, в условиях, подходящих для очистки объекта. В предпочтительном варианте осуществления моющую композицию применяют в процессе стирки или мытья посуды.

Еще один вариант осуществления относится к способу удаления пятен с ткани или посуды, который предусматривает приведение в контакт ткани или посуды с композицией, содержащей протеазу по настоящему изобретению, в условиях, подходящих для очистки объекта.

Также предусматриваются композиции и способы обработки тканей (например, для расшлихтовки текстильного изделия) с применением одной или нескольких протеаз по настоящему изобретению. Протеазу можно использовать в любом способе обработки ткани, хорошо известном из уровня техники (см. например US 6077316). Например, в одном аспекте гриф и внешний вид ткани улучшены с помощью способа, включающего приведение ткани в контакт с протеазой в растворе. В одном аспекте ткань обрабатывают раствором под давлением.

Моющие композиции по настоящему изобретению подходят для применений, связанных со стиркой и твердыми поверхностями, в том числе для мытья посуды. Соответственно, настоящее изобретение включает способ стирки ткани или мытья посуды. Способ включает в себя стадии приведения ткани/посуды, подлежащих очистке, в контакт с раствором, содержащим моющую композицию в соответствии с настоящим изобретением. Ткань может включать любые ткани, поддающиеся стирке, в нормальных условиях применения потребителем. Посуда может включать любую посуду, такую как глиняная посуда, столовые приборы, керамика, пластмассы, такие как меламинсодержащие, металлы, фарфор, стекло и акрил. Раствор предпочтительно характеризуется значением pH от приблизительно 5,5 до приблизительно 11,5. Композиции можно использовать в растворе при концентрациях от приблизительно 100 ppm, предпочтительно 500 ppm, до приблизительно 15000 ppm. Как правило, значения температуры воды находятся в диапазоне от приблизительно 5°C до приблизительно 95°C, в том числе приблизительно 10°C, приблизительно 15°C, приблизительно 20°C, приблизительно 25°C, приблизительно 30°C, приблизительно 35°C, приблизительно 40°C, приблизительно 45°C, приблизительно 50°C, приблизительно 55°C, приблизительно 60°C, приблизительно 65°C, приблизительно 70°C, приблизительно 75°C, приблизительно 80°C, приблизительно 85°C и приблизительно 90°C. Как правило, соотношение воды к ткани составляет от приблизительно 1:1 до приблизительно 30:1.

Фермент(-ы) моющей композиции по настоящему изобретению можно стабилизировать с использованием общепринятых стабилизирующих средств и ингибиторов протеазы, например, полиола, такого как пропиленгликоль или глицерин, сахара или сахароспирта, различных солей, таких как NaCl; KCl; молочной кислоты, муравьиной кислоты, борной кислоты или производного борной кислоты, например ароматического сложного эфира борной кислоты, или производного фенилбороновой кислоты, например 4-формилфенилбороновой кислоты, или пептидных альдегидов, например, ди-, три- или тетрапептидных альдегидов или аналогов альдегидов (либо формы B1-B0-R, где R представляет собой H, CH3, CX3, CHX2, либо CH2X (X=галоген), при этом B0 представляет собой аминокислотный остаток (предпочтительно с необязательно замещенной алифатической или ароматической боковой цепью) и B1 состоит из одного или нескольких аминокислотных остатков (предпочтительно одного, двух или трех), необязательно содержащих N-концевую защитную группу, или как описано в WO 2009/118375, WO 98/13459), или ингибитора протеазы белкового типа, такого как RASI, BASI, WASI (двухфункциональные ингибиторы альфа-амилазы/субтилизина риса, ячменя и пшеницы), или CI2, или SSI. Композицию можно составить, как описано, например, в WO 92/19709, WO 92/19708 и US 6472364. В некоторых вариантах осуществления ферменты, применяемые в данном документе, стабилизируют с помощью присутствия водорастворимых источников ионов цинка(II), кальция(II) и/или магния(II) в готовых композициях, которые обеспечивают данные ионы ферментам, а также ионы других металлов (например, бария(II), скандия(II), железа(II), марганца(II), алюминия(III), олова(II), кобальта(II), меди(II), никеля(II) и оксованадия(IV).

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления предложенные в данном документе моющие композиции обычно составляют так, чтобы во время использования в водных чистящих операциях вода для мытья характеризовалась значением рН от приблизительно 5,0 до приблизительно 11,5, или в альтернативных вариантах осуществления даже от приблизительно 6,0 до приблизительно 10,5. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления гранулированные или жидкие продукты для стирки составляют так, чтобы они характеризовалась значением рН от приблизительно 6 до приблизительно 8. Методы регулирования рН при рекомендованных уровнях использования включают применение буферов, щелочей, кислот и т. д., и хорошо известны специалистам в данной области техники.

Настоящее изобретение дополнительно описано с помощью следующих примеров, которые не следует толковать как ограничивающие объем настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ

Анализ активности Suc-AAPF-pNA

Протеолитическую активность можно определить c помощью способа, в котором в качестве субстрата применяют Suc-AAPF-PNA. Suc-AAPF-PNA является аббревиатурой для N-сукцинил-аланин-аланин-пролин-фенилаланин-p-нитроанилида, и представляет собой блокированный пептид, который можно расщепить эндопротеазами. После расщепления высвобождается свободная молекула PNA, которая имеет желтый цвет и вследствие этого может быть измерена с помощью спектрофотометрии видимой части спектра при длине волны 405 нм. Субстрат Suc-AAPF-PNA производится Bachem (№ согласно кат. L1400, растворенный в DMSO).

Образец протеазы, подлежащий анализу, разбавляли в буфере для определения остаточной активности (100 мМ Трис, pH 8,6). Анализ осуществляли с помощью переноса 30 мкл разбавленных образцов фермента в 96-луночный микротитрационный планшет и добавления 70 мкл рабочего раствора субстрата (0,72 мг/мл в 100 мМ Трис, pH 8,6). Раствор перемешивали при комнатной температуре и поглощение измеряли каждые 20 секунд в течение 5 минут при OD 405 нм.

Наклон (поглощение в минуту) кривой поглощения в зависимости от времени прямо пропорционален активности рассматриваемой протеазы при заданном наборе условий. Образец протеазы разбавляли до уровня, при котором наклон являлся линейным.

Пример 1. Получение и экспрессия вариантов субтилизина 309

Далее в общих чертах приведены мутация и введение кассеты экспрессии в Bacillus subtilis. Все манипуляции с ДНК проводили с помощью ПЦР (например, Sambrook et al.; Molecular Cloning; Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Рекомбинантные конструкции B. subtilis, кодирующие варианты субтилизина 309, использовали для инокулирования встряхиваемых колб, содержащих обогащенную среду (например, 100 г/л сахарозы (Danisco № по кат. 109-0429), 40 г/л корки сои (соевой муки), 10 г/л Na₂HPO₄·12H₂O (Merck № по кат. 6579), 0,1 мл/л замены - Dowfax63N10 (Dow). Как правило, культивирование занимало 4 дня при 30°C со встряхиванием при 220 об/мин.

Пример 2. Очищение вариантов субтилизина 309

Культуральный бульон центрифугировали при 26000 x g в течение 20 минут и надосадочную жидкость осторожно сливали от осадка. Надосадочную жидкость фильтровали через фильтрационную единицу Nalgene 0,2 мкм для того, чтобы удалить остаток клеток-хозяев Bacillus. Значение pH 0,2 мкм фильтрата регулировали до pH 8 с помощью 3 M Трис-основания и фильтрат с доведенным pH наносили на колонку MEP Hypercel (Pall Corporation), уравновешенную в 20 мМ Трис/HCl, 1 мМ CaCl₂, pH 8,0. После промывания колонки с равновесным буфером, колонку подвергали ступенчатому элюированию с 20 мМ CH₃COOH/NaOH, 1 мМ CaCl₂, pH 4,5. Фракции из колонки анализировали в отношении протеазной активности с использованием анализа Suc-AAPF-pNA при значении pH 9 и пиковые фракции объединяли. Значение pH объединения из колонки MEP Hypercel регулировали до pH 6 с помощью 20% (об./об.) CH₃COOH или 3 M Трис-основания, и объединение с доведенным pH разбавляли деионизированной водой до такой же удельной проводимости, как 20 мМ MES/NaOH, 2 мМ CaCl₂, pH 6,0. Разбавленное объединение наносили на колонку SP-Sepharose® Fast Flow (GE Healthcare), уравновешенную в 20 мМ MES/NaOH, 2 мМ CaCl₂, pH 6,0. После промывания колонки с равновесным буфером вариант протеазы элюировали с линейным градиентом NaCl (0 --> 0,5 M) в таком же буфере за пять объемов колонки. Фракции из колонки анализировали в отношении протеазной активности с использованием анализа Suc-AAPF-pNA при pH 9, и активные фракции анализировали с помощью SDS-PAGE. Фракции, в которых наблюдали только одну полосу на геле SDS-PAGE, окрашенном Coomassie, объединяли в качестве очищенного препарата и применяли в дальнейших экспериментах.

Пример 3. Моющая способность вариантов субтилизина 309

Моющую способность вариантов субтилизина 309 при стирке оценивали с использованием анализа автоматического тестирования механического усилия (AMSA), при котором можно изучать моющую способность многих растворов фермент-моющее средство при небольших объемах. Планшет AMSA содержал множество лунок для исследуемых растворов и крышку, которая крепко сжимала текстильное изделие, подлежащее мытью, против отверстий лунок. Во время мытья планшет, исследуемые растворы, текстильное изделие и крышку энергично встряхивали для обеспечения контакта с текстильным изделием, и механическое усилие применяли постоянным периодическим колебательным способом. Для подробного описания см. WO 02/42740, в частности параграф "Special method embodiments" на страницах 23-24.

Эксперименты по стирке проводили при условиях эксперимента, указанных в таблице 2.

Таблица 2

Доза моющего средства	2,0 г/л
Объем исследуемого раствора	160 мкл (20 мкл фермента +140 мкл моющего средства)
pH	8,4
Время мытья	20 минут
Температура	20°C
Жесткость воды	12 dH

Модельное моющее средство и исследуемые материалы были такими, как описано в таблице 3.

Таблица 3. Композиция модельных моющих средств и исследуемых материалов

Blue moon Lavender	Коммерчески доступный
Исследуемый материал	C-05 (кровь/молоко/чернила на хлопке) PC-03 (шоколадное молоко с углеродной сажей на полиэстере/хлопке, 65/35)

Исследуемые материалы получали в Центре материалов для испытаний (Center For Testmaterials) BV, 3133 KT Влардинген, Нидерланды.

Жесткость воды регулировали до значения 12 dH с помощью добавления в исследуемую систему CaCl₂, MgCl₂ и NaHCO₃ (Ca²⁺:Mg²⁺= 2:1:4.5). После мытья текстильные изделия промывали в водопроводной воде и высушивали.

Моющую способность измеряли как яркость цвета выстиранного текстильного изделия. Яркость также можно выражать как интенсивность света, отраженного от образца при освещении белым светом. Если образец загрязнен, то интенсивность отраженного света ниже, чем у чистого образца. Следовательно, интенсивность отраженного света можно использовать для измерения моющей способности.

Измерения цвета проводили с помощью планшетного сканера Kodak iQsmart (Kodak, Midtager 29, DK-2605 Бреннбю, Дания), который применяли для фиксации изображения выстиранного текстильного изделия.

Для получения значения интенсивности света со сканированных изображений, значения 24-битного пиксельного изображения преобразовывали в значения для красного, зеленого и синего цвета (RGB). Значение интенсивности (Int) рассчитывали с помощью сложения всех значений RGB в качестве векторов, а затем с помощью учета длины результирующего вектора:

.

Результаты показаны в таблице 4. Результаты приведены в качестве относительной характеристики по сравнению с субтилизином 309 (SEQ ID NO: 1) и среднего значения концентраций двух ферментов 30 и 60 нМ двух разных образцов. Значение RP ниже 0,8 считалось хуже, 0,8-1,2 считалось таким же, 1,2 или выше считалось лучшим, чем у субтилизина 309 (SEQ ID NO: 1).

Таблица 4. Относительная характеристика AMSA вариантов по сравнению с субтилизином 309.

Мутации	RP на C-05	RP на PC-03	Среднее значение RP
S9E+N43R+G61E+N76D+Q206L+L262E	1,09	1,19	1,14
S9E+N43R+I72A+N76D+G115W+H120V+P129D+A158E+G160P+ Q182E+N185E+S188E+Q191N+A194P+N204D+V205I+Q206L+ Y209W+S212G+S216V+T255E+S256D+S259D+T260E+N261W+ L262E	1,10	1,17	1,14
S9E+N43R+N76D+G115W+H120V+P129D+A194P+Q206L+Y209W+ S259D+L262E	1,06	1,06	1,06
S9E+N43R+N76D+G115W+H120V+A194P+Q206L+Y209W+S259D+ L262E	1,02	1,01	1,01
S9E+N43R+N76D+G115W+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E	0,99	1,01	1,00
S9E+N43R+N76D+Q137H+S141H+R145H+A194P+N204D+V205I+ Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E	1,05	1,03	1,04
S9E+N43R+N76D+Q191N+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E	1,01	0,92	0,96
S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+ S216V+S256D+S259D+T260E+N261W+L262E	1,42	1,44	1,43
S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+ S216V+S256D+S259D+N261W+L262E	1,01	0,88	0,94
S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+ S216V+N261W+L262E	1,09	0,79	0,94
S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+ S216V+L262E	1,02	0,92	0,97
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+ L262E	1,02	0,98	1,00
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E	0,82	0,84	0,83
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S212G+S259D+L262E	1,08	0,86	0,97
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S212G+L262E	0,87	0,98	0,92
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+T255E+S256D+S259D+ T260E+N261W+L262E	1,18	1,19	1,19
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+ L262E	1,26	1,26	1,26
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E	1,00	0,91	0,96
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E	1,12	1,14	1,13
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E+275aH+ 275bH	1,15	1,05	1,10
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+T255E+S256D+S259D+ T260E+N261W+L262E	1,18	1,19	1,19
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+ L262E	1,26	1,26	1,26
S9E+N43R+N76D+Q182E+N185E+S188E+Q191N+A194P+Q206L+ Y209W+S259D+ L262E	0,96	0,95	0,95
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+L262E	1,18	1,14	1,16
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+S259D+L262E	1,03	0,92	0,98
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+L262E	1,00	1,05	1,02
S9E+G61E+N76D+Q206L+L262E	1,17	1,29	1,23
S9E+G61E+N76D+L262E	1,10	0,87	0,98
S9E+N76D+Q206L+Y209W+L262E	1,04	1,36	1,20
S9E+N76D+Q206L+L262E	1,14	1,29	1,21
S9E+N76D+L262E	0,99	0,89	0,94

Пример 4. Ускоренный анализ стабильности при хранении

Стабильность при хранении вариантов протеазы в жидком моющем средстве оценивали с использованием ускоренного анализа с инкубированием при 60°C в течение не менее 48 часов.

Культуральную надосадочную жидкость, содержащую 25-75 мкг/мл активной протеазы, разбавляли в 1, 2, 4 и 8 раз с использованием 0,01% Triton X-100. Для каждого варианта включали 2 лунки с каждым разбавлением. В лунке микротитрационного планшета смешивали 30 мкл разбавленного образца протеазы с 270 мкл модельного моющего средства O (Nunc U96 PP 0,5 мл) с применением стержневого магнита (на пипеточной станции Zephyr (Caliper LifeSciences) в течение 30 мин.). Затем 20 мкл данной смеси переносили в другой микротитрационный планшет (Nunc U96 PP 0,5 мл с добавленными стержневыми магнитами) и смешивали с 80 мкл 100 мМ Трис с pH 8,6 (по меньшей мере 5 мин. на Zephyr). Переносили 30 мкл данного разбавления в Nunc F 96-MTP, и после добавления 70 мкл раствора субстрата изначальную активность образца, не подвергнутого усилию, определяли с помощью измерения поглощения при 405 нм каждые 20 с в течение 5 мин. (на SpectraMax Plus). После герметизации планшет с моющим средством инкубировали при 60°C в термомиксере Eppendorf (без встряхивания). После 1, 4, 23 и 47 часов инкубирования отбирали образцы объемом 20 мкл и остаточную активность образца, подвергнутого усилию, измеряли как с исходной активностью, так и с активностью усилия.

Предполагалось, что снижение активности во время инкубирования с моющем средством являлось экспоненциальным. Периоды полужизни (T½) определяли по линейной регрессии Log(активность) по сравнению с временем инкубации (0, 1,4, 23 и 47 часов), и коэффициенты улучшения периода полужизни (T½ IF) рассчитывали как период полужизни варианта протеазы относительно периода полужизни SEQ ID NO: 1. Это означает, что T½ для Savinase (субтилизин 309) составляет 1.

Таблица 5. Композиция моющего средства

Модель O

LAS, (C10-C13) алкилбензолсульфоновая кислота 3,8%
AES, AEOS, лаурилэфирсульфат натрия 8%
AEO, этоксилат спирта 4%
Мыло, лауриновая кислота 1,0%
Двухводный трехзамещенный цитрат натрия 2%
Гидроксид натрия 0,6%
CaCl₂, 2H₂O 0,02%
Катон, консервант 0,1%
Триэтаноламин 0,4%
Деионизированная вода до 100%
(количества в процентах по весу (вес.))

Таблица 6. Ускоренная стабильность при хранении приводит к модели O. T½ IF: коэффициенты улучшения периода полужизни относительно стандарта субтилизина 309 или субтилизина 309+N76D

Мутации	T½ IF относительно Savinase+N76D	T½ IF относительно Savinase
Субтилизин 309	0,23±0,01	1±0,06
Субтилизин 309+N76D	1,0±0,1	4,4±0,6
S9E	0,8±0,1	3,4±0,6
S9E+N43R+N76D+G115W+H120V+P129D+A194P+ Q206L+Y209W+S259D+L262E	290±160	1300±700
S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+ Y209W+S212G+S216V+L262E	230±100	1000±400
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+ L262E	210±110	900±500
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S212G+ S259D+L262E	240±110	850±390
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E	230±110	825±370
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E	220±180	760±620
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S212G+ L262E	225±120	785±415
S9E+N43R+N76D+99aE+P131+A194P+Q206L+ Y209W+S259D+L262E	730±400	2550±1400
S9E+N43R+N76D+P131*+A194P+Q206L+Y209W+ S259D+L262E	380±145	1320±500
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+L262E	180±110	620±375
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+S259D+L262E	110±20	380±70
S9E+N43R+G61E+N76D+Q206L+L262E	80±15	290±55
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+L262E	110±20	390±70
S9E+G61E+N76D+Q206L+L262E	50±20	220±80
S9E+N76D+L262E	19±4	84±15
N76D+L262E	10±2	44±9
L262E	1,1±0,1	4,7±0,6

Пример 5. Ускоренный анализ стабильности при хранении

Стабильность при хранении вариантов протеазы в жидком моющем средстве оценивали с использованием ускоренного анализа с инкубированием при 60°C в течение не менее 48 часов в моющем средстве CNS (Национальный стандарт Китая). В ином случае эксперимент проводили при таких же условиях, как в примере 4.

Таблица 7. Композиция моющего средства

CNS pH 8

LAS, (C10-C13) алкилбензолсульфоновая кислота 8%
AES, AEOS, лаурилэфирсульфат натрия 4%
AEO9, этоксилат спирта 4%
TEA (триэтаноламин) 0,5%
Цитрат Na 0,5%
Гидроксид натрия 1%
CaCl₂, 2H₂O 0,01%
Деионизированная вода до 100%
(количества в процентах по весу (вес.))

В данном эксперименте стабильность исследовали в CNS (Национальный стандарт Китая) и результаты в таблице 8 выражали как T½ IF: коэффициенты улучшения периода полужизни относительно субтилизина 309 или субтилизина 309+N76D, как описано в примере 4.

1: T½ IF > 1000;

2: 500 ≤ T½ IF ≤ 1000;

3: 50 ≤ T½ IF < 500.

Таблица 8. Ускоренная стабильность при хранении приводила к CNS колонки A=T½ IF относительно субтилизина 309+N76D, колонки B=T½ IF относительно субтилизина 309.

Мутации	A	B
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E	1	1
S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+N238H+L262E	2	1
S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+G160D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+N238H+L262E	2	1
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+275aH+275bH	1	1
S9E+N43R+N76D+G160D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+275aH+275bH	1	1
S9E+G20H+T22H+S24H+N43R+N76D+G160D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E	3	2
S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E	1	1
S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+G160D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E	1	1
S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+G160D+S161E+S163G+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E	1	1
S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+G160D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+275aH+275bH	1	1
S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+G160D+S161E+S163G+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+275aH+ 275bH	2	1
S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275aR	1	1
S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S256D+L262E	1	1
S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+T260A+L262E	1	1
S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S256D+T260A+L262E	1	1
S9E+N43R+N76D+P129D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S256D+T260A+L262E	1	1
S9E+N43R+N76D+A194P+G195E+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S256D+L262E	2	1
S9E+N43R+N76D+A194P+G195E+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+T260A+L262E	1	1
S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S256D+T260A+L262E+275aH+275bH	1	1
S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E	1	1
S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+A194P+G195E+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+N238H+L262E+*275aR	2	1
S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+275aH+275bH	1	1
S9E+N43R+N76D+Y91H+N117H+A194P+G195E+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+N238H+L262E	3	1
S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+A194P+G195E+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+N238H+L262E	1	1
S9E+G61E+N76D+Q206L+L262E	3	3
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E	3	1
S9E+N43R+N76D+G115W+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E	3	1
S9E+N43R+N76D+G115W+H120V+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E	2	1
S9E+N43R+N76D+Q191N+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E	3	2
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+ L262E	1	1
S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+ S216V+L262E	2	1
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+T255E+S256D+S259D+T260E+N261W+L262E	3	1
S9E+N43R+N76D+G115W+H120V+P129D+A194P+Q206L+ Y209W+S259D+L262E	2	1
S9E+N43R+N76D+Q182E+N185E+S188E+Q191N+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E	2	1
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+L262E	2	1
S9E+N76D+Q206L+L262E	3	3
S9E+N76D+Q206L+Y209W+L262E	3	2
S9E+N43R+I72A+N76D+G115W+H120V+P129D+A158E+G160P+ Q182E+N185E+S188E+Q191N+A194P+N204D+V205I+Q206L+ Y209W+S212G+S216V+T255E+S256D+S259D+T260E+N261W+ L262E	3	2
S9E+N76D+Q206L+Y209W+N261W+L262E	3	2
S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+ S216V+N261W+L262E	1	1
S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+ S216V+S259D+N261W+L262E	1	1
S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+ S216V+S256D+S259D+N261W+L262E	1	1
S9E+G61E+N76D+Q137H+S141H+R145H+Q206L+L262E	3	3
S9E+G61E+N76D+Q206L+L262E+275aH+275bH	3	3
S9E+N43R+N76D+Q137H+S141H+R145H+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E	3	2
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E+275aH+275bH	3	2
S9E+N43R+N76D+Q137H+S141H+R145H+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E	1	1
S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+T255E+S256D+S259D+N261W+L262E	1	1
S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+ S216V+S256D+T260E+S259D+N261W+L262E	1	1
S9E+N43R+N76D+G160D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E	1	1
S9E+N43R+N76D+G160D+S161E+S163G+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E	1	1
S9E+N43R+N76D+Q137H+S141H+R145H+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E	1	1
S9E+N43R+N76D+Q137H+S141H+R145H+G160D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E	1	1
S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+275aH+ 275bH	1	1
S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+H120D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+N238H+ L262E+*275aR	2	1
S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S256D+L262E	1	1
S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+T260A+L262E	2	1
S9E+N43R+N76D+A194P+G195E+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S256D+T260A+L262E	1	1
S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S256D+T260A+L262E+*275aR	2	1
S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+N238H+S256D+T260A+L262E	2	1
S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+P129D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+N238H+S256D+T260A+L262E	1	1
S9E+N43R+N76D+P129D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S256D+T260A+L262E+275aH+275bH	1	1
S9E+N43R+N76D+A194P+G195E+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E	1	1
S9E+N43R+N76D+A194P+G195E+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+275aH+275bH	1	1
S9E+N43R+N76D+G160D+S161E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E	3	1
S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+A158E+G160P+S161E+A194P+Q206L+Y209W+N238H+S259D+L262E	3	1
S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+G160D+S161E+A194P+Q206L+Y209W+N238H+S259D+L262E	3	1
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E+275bH+275aH	3	1
S9E+N43R+N76D+G160D+S161E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E+275aH+275bH	2	1
S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A158E+G160P+S161E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E	3	1
S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+G160D+S161E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E	2	1
S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A158E+G160P+S161E+A194P+Q206L+Y209W+N238H+S259D+L262E+275aH+275bH	2	1
S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+G160D+S161E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E+275aH+275bH	3	1
S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+H120D+A158E+G160P+S161E+A194P+Q206L+Y209W+N238H+S259D+L262E+*275aR	3	2
S9E+N43R+N76D+A194P+G195E+Q206L+Y209W+S259D+L262E+*275aR	3	2
S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E	3	1
S9E+N43R+N76D+P129D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E	3	1
S9E+N43R+N76D+P129D+A194P+G195E+Q206L+Y209W+S259D+L262E	2	1
S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E+275aH+275bH	3	2
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+T260A+L262E	3	1
S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+T260A+L262E+*275aR	3	2
S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+A194P+Q206L+Y209W+N238H+S259D+T260A+L262E	2	1
S9E+G61E+N76D+Q206L+Y209W+S256D+L262E	3	2
S9E+G61E+N76D+A158E+G160P+S161E+Q206L+L262E	3	3
S9E+G61E+N76D+Q137H+S141H+R145H+A158E+G160P+S161E+Q206L+L262E	3	2
S9E+G61E+N76D+A158E+G160P+S161E+Q206L+L262E+275aH+275bH	3	3
S9E+G61E+N76D+N117H+H120D+G160D+S161E+S163G+Q206L+L262E+275aH+275bH	3	3
S9E+G61E+N76D+Q206L+S256D+L262E	3	3
S9E+G61E+N76D+P129D+Q206L+T260A+L262E	3	3
S9E+G61E+N76D+P129D+Q206L+S256D+T260A+L262E+275aH+275bH	3	3
S9E+G61E+N76D+N204D+Q206L+Y209W+L262E	3	1
S9E+G61E+N76D+Q137H+S141H+R145H+N204D+Q206L+Y209W+L262E+*275aR	3	2
S9E+G61E+N76D+P129D+Q206L+L262E+275aH+275bH	3	3
S9E+G61E+N76D+N204D+Q206L+Y209W+L262E+275aH+ 275bH	3	1

Пример 6. Моющая способность AMSA вариантов субтилизина 309 sp.

Моющую способность вариантов субтилизина 309 тестировали с применением жидкого моющего средства для стирки на трех разных технических пятнах с использованием анализа автоматического тестирования механического усилия (AMSA).

С помощью AMSA можно изучать моющую способность при стирке многих растворов фермент-моющее средство с небольшим объемом. Планшет AMSA содержал множество лунок для исследуемых растворов и крышку, которая крепко сжимала текстильное изделие, подлежащее мытью, против отверстий лунок. Во время мытья планшет, исследуемые растворы, текстильное изделие и крышку энергично встряхивали для обеспечения контакта с текстильным изделием, и механическое усилие применяли постоянным периодическим колебательным способом. Для подробного описания см. WO 02/42740, в частности параграф "Special method embodiments" на страницах 23-24.

Таблица 9. Модельные моющие средства и исследуемые материалы были следующими:

Blue Moon Deep Clean	Коммерчески доступное моющее средство
Исследуемый материал	C-05 кровь/молоко/чернило на хлопке PC-03 шоколадное молоко/сажа EMPA117 EH кровь/молоко/чернило на хлопке/сильно нагретом полиэстере

Исследуемые материалы подучали из EMPA Testmaterials AG, Mövenstrasse 12, CH-9015 Санкт-Галлен, Швейцария, а также из Центра материалов для испытаний BV, P.O. Box 120, 3133 KT Влардинген, Нидерланды.

Измерения цвета проводили с помощью специализированного планшетного сканера (Kodak iQsmart, Kodak, Midtager 29, DK-2605 Бреннбю, Дания), который использовали для фиксации изображения выстиранного текстильного изделия.

.

Эксперименты проводили с применением процедуры мытья за один цикл, с моющей композицией и образцами, описанными в таблице 10, и условиями эксперимента, указанными в таблице 10 ниже.

Таблица 10. Условия эксперимента для экспериментов по стирке

Доза моющего средства	Blue Moon Deep Clean 2 г/л
Объем исследуемого раствора	160 мкл
pH	Без изменений
Время мытья	20 минут
Температура	20°C
Жесткость воды	12°dH
Концентрация протеазы	30 или 60 нм
Образец ткани	C-05 кровь/молоко/чернило на хлопке PC-03 шоколадное молоко/сажа EMPA117 EH кровь/молоко/чернило на хлопке/сильно нагретом полиэстере

Жесткость воды регулировали до значения 12°dH с помощью добавления в исследуемую систему CaCl₂, MgCl₂ и NaHCO₃ (Ca²⁺:Mg²⁺:CO₃ ^-=2:1:4.5). После мытья текстильные изделия прополаскивали в водопроводной воде и высушивали.

Таблица 11. Относительная характеристика вариантов субтилизина 309, по сравнению с моющим средством, с субтилизином 309 (SEQ ID NO 1) при 20°C

	PC-03		C-05
Концентрация протеазы	30 нМ	60 нМ	30 нМ	60 нМ
Субтилизин 309 (SEQ ID NO 1)	1	1	1	1
S9E+N43R+N76D+S188E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E+275aH+ 275bH	1,1	1,2	0,9	1
S9E+N43R+N76D+A158E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+ L262E	1,2	1	0,9	0,9
S9E+N43R+N76D+A158E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+ L262E+275aH+275bH	1,1	1,1	1,1	1,2
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E	1,5	1,7	1,3	1,2
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+ S216V+L262E	1,2	1,1	0,9	1
S9E+N43R+N76D+A158E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E	1	1,2	1,1	0,9
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+ L262E+275aH+275bH	1,4	1,5	1	0,9
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S212G+ S216V+L262E	1,3	1,2	1	1
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S212G+ S216V+L262E+275aH+275bH	1,2	1,2	0,9	1,1
S9E+N43R+N76D+A158E+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+ S216V+L262E+275aH+275bH	1	1	0,8	1
S9E+N43R+N76D+G160P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E	1,5	1,6	1,3	1,1
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E	0,9	1	0,8	0,9
S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E	1,1	1,2	1	1
S9E+N43R+N76D+G160P+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+ L262E	0,8	1	1,1	1
S9E+N43R+N76D+G160P+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+ L262E+275aH+275bH	1,2	1,1	0,8	1,1
S9E+N43R+N76D+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+ S216V+L262E	1	0,8	0,9	1
S9E+N43R+N76D+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+ S216V+L262E+275aH+275bH	1,1	1	1,1	1,1
S9E+N43R+N76D+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E	1,3	1,6	1,2	1,2
S9E+N43R+N76D+G160P+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E	1,6	1,6	1,4	1,2
S3V+N76D+H120V+Q182E+N185E+S188E+V205I+Q206L+Y209W+S216V+S256D+N261W+L262E	1,1	1,2	0,9	0,9
S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+ L262E+275aH+275bH	0,9	1	0,9	0,9
S9E+N43R+N76D+N117H+A194P+Q206L+Y209W+N238H+S259D+T260A+L262E	0,9	1	0,9	0,9
S9E+N43R+N76D+N185E+S188E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E	1	1,1	0,9	1
S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S216V+S259D+N261W+L262E	1,6	1,6	1,5	1,2
S9E+N43R+N76D+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E	1,3	1,4	1,1	1
S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E	1	1,1	0,9	1
S9E+N43R+N76D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+ L262E	1,3	0,9	1	0,9
S9E+N43R+N76D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+ L262E+275aH+275bH	1,2	1	0,9	1,1
S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S259D+N261W+L262E	1,6	1,6	1,4	1,3
S9E+N43R+N76D+S188E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E	1	1	0,9	0,9
S9E+N76D+Q182E+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E	0,8	1	0,9	0,9
S9E+N43R+N76D+S78H+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E	0,9	0,9	0,9	0,9
S9E+N43R+N76D+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S259D+N261W+ L262E	1,7	1,7	1,6	1,2
S9E+N76D+V205I+Q206L+Y209W+ N261W+L262E	0,9	1,1	1	1

Результаты в таблице 11 показывают, что варианты субтилизина 309 обладают улучшенной или такой же характеристикой моющей способности по сравнению с субтилизином 309 на шоколаде/молоке (PC-03, C-03) при 20°C.

Таблица 12. Относительная характеристика протеазы вариантов субтилизина 309 из Bacillus sp. по сравнению с моющим средством с субтилизином 309 (SEQ ID NO 1) при 20°C на пятнах EMPA117 EH кровь/молоко/чернило на хлопке/полиэстере.

Концентрация протеазы	30 нМ	60 нМ
Концентрация протеазы	30 нМ	60 нМ	Субтилизин 309 (SEQ ID NO 1)	1	1
S9E+N43R+N76D+S188E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+ L262E+275aH+275bH	1	1
S9E+N43R+N76D+A158E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+ S212G+S216V+L262E	1,2	1,1
S9E+N43R+N76D+A158E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+ S212G+S216V+L262E+275aH+275bH	1,3	1,2
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+ N261W+L262E	1,3	1,3
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+A194P+N204D+V205I+Q206L+ Y209W+S212G+S216V+L262E	1,3	1,3
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+ Q206L+Y209W+S216V+L262E+275aH+275bH	1,2	1,1
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+ Q206L+Y209W+L262E	1,1	1,1
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+ Q206L+Y209W+S212G+L262E+275aH+275bH	1	1
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+ Q206L+Y209W+S212G+L262E	1,1	1,1
S9E+N43R+N76D+A158E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+ N261W+L262E	1,2	1,2
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+ Q206L+Y209W+S212G+L262E+275aH+275bH	1,2	1,1
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+ Q206L+Y209W+S216V+L262E	1,1	1,1
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+V205I+Q206L+ Y209W+S212G+S216V+L262E	1,2	1,2
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+V205I+Q206L+ Y209W+S212G+S216V+L262E+275aH+275bH	1,3	1,2
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+ Q206L+Y209W+S216V+L262E	1	1,1
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+V205I+Q206L+Y209W+ S259D+N261W+L262E	1	1,1
S9E+N43R+N76D+A158E+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+ Y209W+S212G+S216V+L262E	1,1	1,1
S9E+N43R+N76D+A158E+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+ Y209W+S212G+S216V+L262E+275aH+275bH	1,2	1,2
S9E+N43R+N76D+G160P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E	1,3	1,3
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S216V+L262E	0,9	0,9
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E	0,9	1
S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E	1,1	1
S9E+N43R+N76D+G115W+A194P+Q206L+Y209W+L217M+S259D+L262E	1	1
S9E+N43R+N76D+G115W+A194P+Q206L+Y209W+S216T+S259D+L262E	1	1
S9E+N43R+N76D+G160P+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+ S212G+S216V+L262E	1,2	1,1
S9E+N43R+N76D+G160P+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+ S212G+S216V+L262E+275aH+275bH	1,1	1,1
S9E+N43R+N76D+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+ Y209W+S212G+S216V+L262E	1,2	1,2
S9E+N43R+N76D+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+ Y209W+S212G+S216V+L262E+275aH+275bH	1,2	1,1
S9E+N43R+N76D+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E	1,3	1,3
S9E+N43R+N76D+G160P+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+ N261W+L262E	1,4	1,4
S3V+N76D+H120V+Q182E+N185E+S188E+V205I+Q206L+Y209W+S216V+S256D+N261W+L262E	0,9	1
S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+ S256D+N261W+L262E+275aH+275bH	1	1
S9E+N43R+N76D+N117H+A194P+Q206L+Y209W+N238H+S259D+T260A+L262E	1,1	1
S9E+N43R+N76D+N185E+S188E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E	1,1	1,1
S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S216V+S259D+N261W+L262E	1,3	1,2
S9E+N43R+N76D+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E	1,3	1,2
S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+ N261W+L262E	1,2	1,1
S9E+N43R+N76D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+ S212G+S216V+L262E	1,3	1,2
S9E+N43R+N76D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+ S212G+S216V+L262E+275aH+275bH	1,3	1,2
S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S259D+N261W+L262E	1,3	1,2
S9E+N43R+N76D+S188E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+ L262E	1,1	1,1
S9E+N76D+Q182E+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E	1	1
S9E+N43R+N76D+S78H+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+ L262E	0,8	0,9
S9E+N43R+N76D+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+ S259D+N261W+L262E	1,4	1,3
S9E+N76D+V205I+Q206L+Y209W+N261W+L262E	0,9	1

Результаты в таблице 12 показывают, что варианты субтилизина 309 обладают улучшенной или такой же характеристикой моющей способности по сравнению с субтилизином 309 EMPA117 EH кровь/молоко/чернило на хлопке/сильно нагретом полиэстере при 20°C.

Пример 7. Исследование вариантов субтилизина 309 при мытье в малом масштабе

Моющую способность протеазы из Bacillus sp. исследовали с применением жидкого моющего средства для стирки на одном техническом пятне, с применением системы мытья в малом масштабе.

Анализ при мытье в малом масштабе исследовали с помощью способа, в котором загрязненное текстильное изделие непрерывно поднимали и опускали в исследуемый раствор, а затем ополаскивали.

Таблица 13. Эксперименты по мытью проводили при условиях эксперимента, указанных ниже:

Моющее средство	Коммерчески доступное моющее средство Tixan - YPE
Доза моющего средства	2 г/л
pH	Без изменений (т. е. не регулировали)
Жесткость воды	8,4°dH.
Конц. фермента	Пример 20-40-80 нм
Объем исследуемого раствора	50 мл
Исследуемый материал	EMPA117 EH кровь/молоко/чернило на хлопке/сильно нагретом полиэстере
Температура	25°C
Время мытья	20 мин. замачивания+18 мин. основного мытья
Время полоскания	10 мин.
Исследуемая система	Загрязненное текстильное изделие непрерывно поднимали и опускали в исследуемый раствор 50 раз за минуту (рабочее время 0,29 с, нерабочее время 0,29 с, время поднятия 0,17 с). Исследуемые растворы содержали в аналитических стаканах, объемом 125 мл. После промывания текстильные изделия непрерывно поднимали и опускали в водопроводную воду 50 раз за минуту (рабочее время 0,5 с, нерабочее время 5 с, время поднятия 0,5 с).

Исследуемые материалы подучали из EMPA Testmaterials AG, Mövenstrasse 12, CH-9015 Санкт-Галлен, Швейцария.

Затем текстильные изделия высушивали на воздухе и моющую способность измеряли по яркости цвета этих текстильных изделий. Яркость можно выражать также как значение отражения (R), которое является мерой света, отраженного или испускаемого из исследуемого материала при освещении белым светом. Значение отражения (R) текстильных изделий измеряли при 460 нм с применением спектрофотометра Zeiss MCS 521 VIS. Измерения проводили в соответствии с протоколом производителя.

Вычисление эффекта фермента проводили с помощью измерений, проведенных в промытых ферментами образцах, и вычитания результатов измерений, проведенных при мытье без фермента для каждого пятна, ΔRem_{фермент}.

Эксперименты проводили, как описано в анализе при мытье в малом масштабе для способа стирки с моющей композицией и образцами, описанными в таблице 13, и экспериментальными условиями, указанными в таблице 14 ниже.

Таблица 14. Условия эксперимента для экспериментов по стирке в малом масштабе

Доза моющего средства	YPE, 2 г/л
Объем исследуемого раствора	50 мл
pH	Без изменений
Время мытья	20 мин. замачивания+18 мин. основного мытья
Температура	25°C
Жесткость воды	8,4°dH
Концентрация протеазы	20-40-80 нМ
Образец ткани	EMPA117 EH (Кровь/молоко/чернило на хлопке/сильно нагретом полиэстере)

Жесткость воды регулировали до значения 8,4°dH с помощью добавления в исследуемую систему CaCl₂, MgCl₂ и NaHCO₃ (Ca²⁺:Mg²⁺:CO₃ ^-=2:1:4.5). После мытья текстильные изделия прополаскивали в водопроводной воде и высушивали.

Таблица 15. Относительная характеристика протеазы вариантов субтилизина 309 из Bacillus sp. по сравнению с моющим средством с субтилизином 309 (SEQ ID NO 1) при 25°C

Концентрация протеазы	20 нМ	40 нМ	80 нМ
Субтилизин 309 (SEQ ID NO 1)	1,0	1,0	1,0
S9E+N43R+N76D+A158E+A194P+N204D+V205I+ Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E	1,1	1,3	1,1
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+V205I+Q206L+ Y209W+S259D+N261W+L262E	1,1	1,5	1,5
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+A194P+N204D+ V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E	1,1	1,2	1,3
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E+ 275aH+275bH	0,9	1,1	1,1
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+ N204D+V205I+Q206L+Y209W+L262E	0,8	1,0	1,1
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+275aH+275bH	0,8	0,9	1,3
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+L262E	1,0	1,2	1,4
S9E+N43R+N76D+A158E+A194P+V205I+Q206L+ Y209W+S259D+N261W+L262E	0,9	1,3	1,5
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+L262E+ 275aH+275bH	0,7	0,9	1,0
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+ N204D+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E	1,1	1,2	1,3
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+ Q206L+Y209W+S259D+L262E+275aH+275bH	0,9	0,8	1,1
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+ V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E	1,2	1,2	1,3
S9E+N43R+N76D+A158E+S161E+V205I+Q206L+ Y209W+S259D+N261W+L262E	0,8	1,2	1,4
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+V205I+ Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E	0,7	1,1	1,1
S9E+N43R+N76D+A158E+S161E+A194P+N204D+ V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E	1,0	1,2	1,1
S9E+N43R+N76D+G160P+V205I+Q206L+Y209W+ S259D+N261W+L262E	1,1	1,3	1,3
S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+ Y209W+S212G+S216V+S259D+N261W+L262E	1,1	1,1	1,1
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+L262E	1,1	1,1	1,1
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+L262E	0,9	0,9	1,0
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+T255E+S256D+S259D+T260E+N261W+L262E	1,1	1,1	1,2
S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S259D+ N261W+L262E	1,1	1,3	1,2
S9E+N43R+N76D+G115W+H120V+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E	0,9	1,0	1,1
S9E+N43R+N76D+G115W+H120V+P129D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E	0,8	1,0	0,9
S9E+N43R+N76D+G160P+A194P+N204D+V205I+ Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E	1,3	1,4	1,2
S9E+N43R+N76D+G160P+S161E+A194P+N204D+ V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E	1,1	1,4	1,3
S9E+N43R+N76D+G160P+S161E+A194P+N204D+ V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+ 275aH+275bH	1,4	1,5	1,5
S9E+N43R+N76D+N204D+V205I+Q206L+Y209W+ S259D+N261W+L262E	1,0	1,1	1,4
S9E+N43R+N76D+G160P+S161E+V205I+Q206L+ Y209W+S259D+N261W+L262E	1,1	1,2	1,3
S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+ Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E+275aH+275bH	1,0	1,1	1,1
S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S216V+ S259D+N261W+L262E	0,8	1,0	1,2
S9E+N43R+N76D+S161E+V205I+Q206L+Y209W+ S259D+N261W+L262E	0,9	1,0	1,5
S9E+N43R+N76D+P131*+A194P+Q206L+Y209W+ S259D+L262E	1,5	1,4	1,4
S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+ Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E+275aH+ 275bH	0,9	1,0	1,2
S9E+N43R+N76D+S161E+A194P+N204D+V205I+ Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+275aH+ 275bH	0,9	1,2	1,2
S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+ S259D+N261W+L262E	1,0	1,2	1,5
S9E+N43R+N76D+N204D+V205I+Q206L+Y209W+ S212G+S216V+S259D+N261W+L262E	1,1	1,2	1,3

Результаты в таблице 15 показывают, что варианты субтилизина 309 проявляли улучшенную или такую же моющую способность по сравнению с субтилизином 309 (SEQ ID NO 1) в отношении крови/молока/чернила при 25°C.

Пример 8. Ускоренный анализ стабильности при хранении

Стабильность при хранении вариантов протеазы в жидком моющем средстве оценивали с использованием ускоренного анализа с инкубированием при 58°C, pH 9, в течение не менее 48 часов в моющем средстве CNS (Национальный стандарт Китая).

CNS pH 9

LAS, (C10-C13) алкилбензолсульфоновая кислота 8%
AES, AEOS, лаурилэфирсульфат натрия 4%
AEO9, этоксилат спирта 4%
TEA (триэтаноламин) 0,5%
Цитрат Na 0,5%
Гидроксид натрия 1%
EDTA 0,001%
Деионизированная вода до 100%
(количества в процентах по весу (вес.))

В ином случае эксперимент проводили при таких же условиях, как в примере 4 и 5.

Результаты в таблице 16 выражены как T½ IF: Коэффициенты улучшения периода полужизни относительно субтилизина 309 (SEQ ID NO 1), как описано в примере 4.

1: T½ IF > 1000;

2: 500 ≤ T½ IF ≤ 1000;

3: 50 ≤ T½ IF < 500.

Таблица 16. Ускоренная стабильность при хранении приводила к CNS относительно субтилизина 309.

Мутации
S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S216V+S259D+N261W+L262E	2
S9E+N43R+N76D+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S259D+N261W+L262E	1
S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S259D+N261W+L262E	2
S9E+N43R+N76D+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E	2
S9E+N43R+N76D+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E	2
S9E+N43R+N76D+G160P+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E	2
S9E+N43R+N76D+G160P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E	2
S9E+N43R+N76D+A158E+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E	2
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E	2
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E	2
S9E+N43R+N76D+A158E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E	2
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+L262E+275aH+275bH	1
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+L262E+275aH+275bH	2
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E+275aH+275bH	1
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+275aH+275bH	1
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+275aH+275bH	2
S9E+N43R+N76D+A158E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+275aH+275bH	2
S9E+N43R+N76D+A158E+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+275aH+275bH	2
S9E+N43R+N76D+G160P+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+275aH+275bH	1
S9E+N43R+N76D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+275aH+275bH	1
S9E+N43R+N76D+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+275aH+275bH	1
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+275aH+275bH	1
S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E	1
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+L262E	1
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+L262E	1
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E	1
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E	1
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E	1
S9E+N43R+N76D+A158E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E	1
S9E+N43R+N76D+A158E+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E	1
S9E+N43R+N76D+G160P+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E	1
S9E+N43R+N76D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E	1
S9E+N43R+N76D+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E	1
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+275aH+275bH	1
S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E	1
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+275aH+275bH	1
S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E	2
S9E+N43R+N76D+G115W+A194P+Q206L+Y209W+L217M+S259D+L262E	3
S9E+N43R+N76D+G115W+A194P+Q206L+Y209W+S216T+S259D+L262E	2
S9E+N43R+N76D+S188E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E	2
S9E+N43R+N76D+S78H+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E	2
S9E+N43R+N76D+N117H+A194P+Q206L+Y209W+N238H+S259D+T260A+L262E	3
S9E+N43R+N76D+N185E+S188E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E	3
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E	3
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S216V+L262E	3
S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E+275aH+275bH	3
S3V+N76D+H120V+Q182E+N185E+S188E+V205I+Q206L+Y209W+S216V+S256D+N261W+L262E	1
S3V+S9R+N76D+H120V+Q182E+N185E+S188E+V205I+Q206L+Y209W+S216V+S256D+N261W+L262E	2
S9E+N43R+N76D+S188E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E+275aH+275bH	2
S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E	3
S9E+N76D+V205I+Q206L+Y209W+N261W+L262E	3
S9E+N76D+Q182E+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E	2
*35aD+N76D+H120D+G195E+K235L	3
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+275aH+275bH	1
S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E	1
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E	1
S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+N238H+L262E	2
S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+G160D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+N238H+L262E	2

Claims

1. Вариант субтилазы, содержащий замены S9E+Q206L+L262E, где

(a) положения соответствуют положениям полипептида с последовательностью SEQ ID NO:2;

(b) вариант обладает протеазной активностью; и

(c) последовательность варианта по меньшей мере на 90%, но менее чем на 100% идентична последовательности полипептида с последовательностью SEQ ID NO:1.

2. Вариант по п.1, последовательность которого по меньшей мере на 95%, но менее чем на 100% идентична последовательности полипептида с SEQ ID NO:1.

3. Вариант субтилазы, содержащий замены S9E+N76D+Q206L+L262E, где

(а) положения соответствуют положениям полипептида с последовательностью SEQ ID NO:2;

4. Вариант субтилазы, содержащий замены S9E+Q206L+L262E, и одно или несколько изменений, выбранных из группы, состоящей из N43R, I72A, G115W, H120D, H120V, P129D, A158E, G160D, G160P, S161E, Q182E, N185E, S188E, Q191N, A194P, G195E, N204D, V205I, Y209W, S212G, S216T, S216V, L217M, T255E, S256D, S259D, T260E и N261W, где

5. Вариант субтилазы полипептида SEQ ID NO:1, где

(c) последовательность варианта по меньшей мере на 90%, но менее чем на 100% идентична последовательности полипептида с последовательностью SEQ ID NO:1; и

где вариант содержит набор изменений, выбранный из группы, состоящей из:

• S9E+N43R+N76D+S188E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E+*275aH+*275bH;

• S9E+N43R+N76D+A158E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E;

• S9E+N43R+N76D+A158E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275aH+*275bH;

• S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E;

• S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E;

• S9E+N43R+N76D+A158E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E;

• S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+L262E+*275aH+*275bH;

• S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E;

• S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275aH+*275bH;

• S9E+N43R+N76D+A158E+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275aH+*275bH;

• S9E+N43R+N76D+G160P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E;

• S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E;

• S9E+N43R+N76D+G160P+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E;

• S9E+N43R+N76D+G160P+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275aH+*275bH;

• S9E+N43R+N76D+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E;

• S9E+N43R+N76D+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275aH+*275bH;

• S9E+N43R+N76D+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E;

• S9E+N43R+N76D+G160P+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E;

• S9E+N43R+N76D+N117H+A194P+Q206L+Y209W+N238H+S259D+T260A+L262E;

• S9E+N43R+N76D+N185E+S188E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E;

• S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S216V+S259D+N261W+L262E;

• S9E+N43R+N76D+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E;

• S9E+N43R+N76D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E;

• S9E+N43R+N76D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275aH+*275bH;

• S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S259D+N261W+L262E;

• S9E+N43R+N76D+S78H+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E;

• S9E+N43R+N76D+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S259D+N261W+L262E;

• S9E+N76D+V205I+Q206L+Y209W+N261W+L262E;

• S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E+*275aH+*275bH;

• S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+L262E;

• S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+L262E+*275aH+*275bH;

• S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S216V+L262E;

• S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+L262E;

• S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E;

• S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E;

• S9E+N43R+N76D+A158E+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E;

• S9E+N43R+N76D+G115W+A194P+Q206L+Y209W+L217M+S259D+L262E;

• S9E+N43R+N76D+G115W+A194P+Q206L+Y209W+S216T+S259D+L262E;

• S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E +*275aH+*275bH;

• S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E+*275aH+*275bH;

• S9E+N43R+N76D+A158E+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E;

• S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S259D+N261W+L262E;

• S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+T255E+S256D+S259D+T260E+N261W+L262E;

• S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G +S216V+N238H+L262E;

• S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+G160D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+N238H+L262E;

• W6L+S9E+N43R+A72I+N76D+G115W+H120V+P129D+A158E+G160P+Q182E+N185E+S188E+Q191N+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+T255E+S256D+S259D+T260E+N261W+L262E;

• S9E+G20H+T22H+S24H+N43R+N76D+G160D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E;

• S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+H120D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+N238H+L262E+*275aR;

• S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+H120D+A158E+G160P+S161E+A194P+Q206L+Y209W+N238H+S259D+L262E+*275aR;

• S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+P129D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+N238H+S256D+T260A+L262E;

• S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+N238H+L262E;

• S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+A158E+G160P+S161E+A194P+Q206L+Y209W+N238H+S259D+L262E;

• S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+G160D+S161E+A194P+Q206L+Y209W+N238H+S259D+L262E;

• S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+A194P+G195E+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+N238H+L262E;

• S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+A194P+G195E+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+N238H+L262E+*275aR;

• S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+N238H+S256D+T260A+L262E;

• S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+A194P+Q206L+Y209W+N238H+S259D+T260A+L262E;

• S9E+N43R+G61E+N76D+Q206L+L262E;

• S9E+N43R+I72A+N76D+G115W+H120V+P129D+A158E+G160P+Q182E+N185E+S188E+Q191N+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+T255E+S256D+S259D+T260E+N261W+L262E;

• S9E+N43R+I72A+N76D+G115W+H120V+P129D+Q182E+N185E+S188E+Q191N+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+T255E+S256D+S259D+T260E+N261W+L262E;

• S9E+N43R+I72A+N76D+Q182E+N185E+S188E+Q191N+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+T255E+S256D+S259D+T260E+N261W+L262E;

• S9E+N43R+N76D+Y91H+N117H+A194P+G195E+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+N238H+L262E;

• S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A158E+G160P+S161E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E;

• S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+L262E;

• S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+L262E;

• S9E+N43R+N76D+Q182E+N185E+S188E+Q191N+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E;

• S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E;

• S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275bH+*275aH;

• S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+G160D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275bH *275aH;

• S9E+N43R+N76D+*99aE+P131*+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E;

• S9E+N43R+N76D+G115W+H120V+P129D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E;

• S9E+N43R+N76D+G115W+H120V+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E;

• S9E+N43R+N76D+G115W+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E;

• S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E;

• S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275aH+*275bH;

• S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275aR;

• S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A158E+G160P+S161E+A194P+Q206L+Y209W+N238H+S259D+L262E+*275aH+*275bH;

• S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A158E+G160P+S161E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E;

• S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+G160D+S161E+S163G+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E;

• S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+G160D+S161E+S163G+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275aH+*275bH;

• S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+G160D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E;

• S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+G160D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275aH+*275bH;

• S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+G160D+S161E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E;

• S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+G160D+S161E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E+*275aH+*275bH;

• S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S256D+T260A+L262E;

• S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S256D+L262E;

• S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+T260A+L262E;

• S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E;

• S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275aH+*275bH;

• S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+T260A+L262E+*275aR;

• S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E;

• S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E+*275aH+*275bH;

• S9E+N43R+N76D+P129D+A194P+G195E+Q206L+Y209W+S259D+L262E;

• S9E+N43R+N76D+P129D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S256D+T260A+L262E;

• S9E+N43R+N76D+P129D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S256D+T260A+L262E+*275aH+*275bH;

• S9E+N43R+N76D+P129D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E;

• S9E+N43R+N76D+P131*+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E;

• S9E+N43R+N76D+Q137H+S141H+R145H+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E;

• S9E+N43R+N76D+Q137H+S141H+R145H+G160D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E;

• S9E+N43R+N76D+Q137H+S141H+R145H+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E;

• S9E+N43R+N76D+Q137H+S141H+R145H+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E;

• S9E+N43R+N76D+G160D+S161E+S163G+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E;

• S9E+N43R+N76D+G160D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E;

• S9E+N43R+N76D+G160D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275aH+*275bH;

• S9E+N43R+N76D+G160D+S161E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E;

• S9E+N43R+N76D+G160D+S161E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E+*275aH+*275bH;

• S9E+N43R+N76D+Q191N+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E;

• S9E+N43R+N76D+A194P+G195E+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S256D+T260A+L262E;

• S9E+N43R+N76D+A194P+G195E+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S256D+L262E;

• S9E+N43R+N76D+A194P+G195E+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+T260A+L262E;

• S9E+N43R+N76D+A194P+G195E+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E;

• S9E+N43R+N76D+A194P+G195E+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275aH+*275bH;

• S9E+N43R+N76D+A194P+G195E+Q206L+Y209W+S259D+L262E+*275aR;

• S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+T255E+S256D+S259D+N261W+L262E;

• S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S256D+S259D+T260E+N261W+L262E;

• S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S256D+S259D+N261W+L262E;

• S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S256D+T260A+L262E+*275aH+*275bH;

• S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S256D+T260A+L262E+*275aR;

• S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S256D+L262E;

• S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S259D+N261W+L262E;

• S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+T260A+L262E;

• S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+N261W+L262E;

• S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+L262E;

• S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E;

• S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E;

• S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+L262E;

• S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E+*275aH+*275bH;

• S9E+N43R+G61E+N76D+G115W+H120V+A194P+Q206L+S259D+L262E;

• S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E;

• S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+M222S+L262E;

• S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+S256D+S259D+N261W+L262E;

• S9E+N18S+N43R+N76D+G115W+H120V+A194P+V205I+Q206L+S259D+L262E;

• S9E+N43R+N76D+G115W+H120V+A194P+V205I+Q206L+S259D+L262E;

• S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+ L262E;

• S9E+N43R+N76D+S188E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E;

• S9E+N76D+G115W+G160P+Q182E+V205I+Q206L+Y209W+S256D+T260E+N261W+ L262E;

• S9E+N43R+N76D+H120T+A194P+Q206L+S256D+S259D+N261W+L262E;

• S9E+N43R+N76D+H120T+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E;

• S9E+N76D+G160P+Q182E+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E;

• S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+S259D+N261W+L262E;

• S9E+N76D+Q182E+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E;

• S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+S259D+N261W+L262E+*275aH;

• S9E+N43R+N76D+Q182E+N185E+S188E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E;

• S9E+N43R+N76D+N185E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E;

• S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+N261M+L262E;

• S9E+N43R+I72A+N76D+A194P+Q206L+S259D+L262E;

• S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+S259D+L262E;

• S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+S259D+ N261W+L262E;

• S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+ L262E+*275aH+*275bH;

• S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A158E+G160P+S161E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E;

• S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E;

• S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E;

• S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E;

• S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S212G+S259D+L262E;

• S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S212G+L262E;

• S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+T255E+S256D+S259D+T260E+N261W+L262E;

• S9E+N43R+N76D+A194P N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E;

• S9E+N43R+N76D+N185E+S188E+Q191N+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E;

• S9E+N43R+N76D+Q182E+N185E+S188E+Q191N+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E+S9E+N43R+N76D+N185E+S188E+Q191N+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E;

• S9E+N43R+N76D+G115W+H120V+P129D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E;

• S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+T260A+L262E;

• S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E;

• S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E;

• S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E+*275aH+*275bH;

• S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+S259D+L262E;

• S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+L262E;

• S9E+G61E+N76D+N117H+H120D+G160D+S161E+S163G+Q206L+L262E+*275aH+*275bH;

• S9E+G61E+N76D+P129D+Q206L+S256D+T260A+L262E+*275aH+*275bH;

• S9E+G61E+N76D+P129D+Q206L+T260A+L262E;

• S9E+G61E+N76D+P129D+Q206L+L262E+*275aH+*275bH;

• S9E+G61E+N76D+Q137H+S141H+R145H+A158E+G160P+S161E+Q206L+L262E;

• S9E+G61E+N76D+Q137H+S141H+R145H+N204D+Q206L+Y209W+L262E+*275aR;

• S9E+G61E+N76D+Q137H+S141H+R145H+Q206L+L262E;

• S9E+G61E+N76D+A158E+G160P+S161E+Q206L+L262E;

• S9E+G61E+N76D+A158E+G160P+S161E+Q206L+L262E+*275aH+*275bH;

• S9E+G61E+N76D+N204D+Q206L+Y209W+L262E;

• S9E+G61E+N76D+N204D+Q206L+Y209W+L262E+*275aH+*275bH;

• S9E+G61E+N76D+Q206L+Y209W+S256D+L262E;

• S9E+G61E+N76D+Q206L+S256D+L262E;

• S9E+G61E+N76D+Q206L+L262E;

• S9E+G61E+N76D+Q206L+L262E+*275aH+*275bH;

• S9E+N76D+Q206L+Y209W+N261W+L262E;

• S9E+N76D+Q206L+Y209W+L262E; and

• S9E+N76D+Q206L+L262E.

6. Вариант по любому из пп.1-5, который характеризуется улучшенной стабильностью при хранении в жидкой моющей композиции по сравнению с субтилазой с последовательностью SEQ ID NO:1.

7. Вариант по п.6, у которого по меньшей мере на 25% улучшена стабильность при хранении в жидкой моющей композиции для стирки по сравнению с SEQ ID NO:1.

8. Вариант по любому из пп.1-7, который характеризуется улучшенными моющими способностями при стирке по сравнению с SEQ ID NO:1.

9. Вариант по любому из пп.1-8, у которого общее число изменений по сравнению с SEQ ID NO:1 составляет от 3 до 20.

10. Вариант по любому из пп.1-9, который состоит из 240-290 аминокислот.

11. Жидкая моющая композиция, содержащая:

a) по меньшей мере 0,01 мг варианта субтилазы по любому из пп.1-10 на литр моющего средства,

b) от 2 вес.% до 60 вес.% по меньшей мере одного поверхностно-активного вещества, и

c) от 5 вес.% до 50 вес.% по меньшей мере одного компонента моющих средств.

12. Моющая композиция по п.11, которая дополнительно содержит один или несколько дополнительных ферментов, выбранных из группы, состоящей из амилазы, каталазы, целлюлазы, кутиназы, галогенпероксигеназы, липазы, маннаназы, пектиназы, пектин-лиазы, пероксидазы, протеазы, ксантаназы и ксилоглюканазы, или любой их смеси.

13. Моющая композиция по п.11 или 12 в форме геля или обычной, плотной или концентрированной жидкости.

14. Моющая композиция в форме таблетки, порошка или гранулы, содержащая:

a) по меньшей мере 0,01 мг варианта субтилазы по любому из пп.1-10 на грамм композиции,

b) от 5 вес.% до 50 вес.% по меньшей мере одного анионного поверхностно-активного вещества,

c) от 1 вес.% до 8 вес.% по меньшей мере одного неионного поверхностно-активного вещества,

d) от 5 вес.% до 40 вес.% по меньшей мере одного компонента моющих средств.

15. Применение варианта субтилазы по любому из пп.1-10 или композиции по любому из пп.11-14 для стирки.

16. Применение варианта субтилазы по любому из пп.1-10 или композиции по любому из пп.11-14 для мытья посуды или для очистки твердых поверхностей, таких как полы, столы, стены или поверхность машины.

17. Способ получения варианта субтилазы по любому из пп.1-10, включающий:

(a) культивирование клетки-хозяина, содержащей полинуклеотид, кодирующий вариант субтилазы по любому из пп.1-10, в питательной среде в условиях, подходящих для экспрессии этого варианта; и

(b) извлечение варианта из среды.