NO319686B1 - Renset og isolert polynukleotidsekvens, biologisk funksjonell DNA-vektor, vertscelle, fremgangsmate for fremstilling av et protocadherinpolypeptid, antistoffmateriale, hybridomcellelinje, anvendelse av protocadherin-PC3-fragment terapeutisk, en terapeutisk intervensjon samt antistoffmateriale eller protocadherin-PC3-fragment ifolge oppfinnelsen for anvendelse i en terapeutisk fremgangsmate. - Google Patents

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse angår renset og isolert polynukleotidsekvens, boiologisk funksjonell DNA-vektor, vertscelle, fremgangsmåte for fremstilling av et protocadherinpolypeptid, antistoffmateriale, hybridomcellelinje, anvendelse av protocadherinantistoffmaterialet eller et protocadherin-PC3-fragment terapeutisk, en terapeutisk intervensjon samt antistoffmateriale eller protocadherin-PC3-fragment ifølge oppfinnelsen for anvendelse i en terapeutisk fremgangsmåte. Nærmere bestemt angår oppfinnelsen nye adhesjonsproteiner, betegnet protocadheriner, og polynukleotidsekvenser som koder for protocadherinene.

Bakgrunn

In vivo spiller intercellulær adhesjon en viktig rolle på en rekke områder, inkludert morfogenese og organdan-nelse, leukocyttekstravasasjon, tumormetastase og invasjon og dannelsen av celleforbindelser. Célle-celleadhesjon er dessuten avgjørende for opprettholdelse av vevsintegritet.

Intercellulær adhesjon formidles av spesifikke cel-leoverflateadhesjonsmolekyler. Celleadhesjonsmolekyler er blitt klassifisert i minst fire familier, inkludert immun-globulinsuperfamilien, integrinsuperfamilien, selektinfatnilien og cadherinsuperfamilien. Alle celletyper som danner faste vev, uttrykker noen medlemmer av cadherinsuperfamilien, hvilket tyder på at cadheriner er involvert i selektiv adhesjon av de fleste celletyper.

Cadheriner er generelt beskrevet som glykosylerte, komplette membranproteiner inneholdende et N-terminalt, ekstracellulært domene (de N-terminale 113 aminosyrer i domenet synes å være direkte involvert i binding) bestående av fem underdomener som er kjennetegnet ved sekvenser unike for cadheriner, et hydrofobt, membranomspennende domene og et C-terminalt, cytoplasmatisk domene som reagerer med celle-skjelettet gjennom kateniner og andre celleskjelettassosierte proteiner. Noen cadheriner mangler imidlertid et cytoplasmatisk domene og synes å virke i celle-celleadhesjon ved en annen mekanisme enn cadheriner som inneholder et cytoplasmatisk domene. Det cytoplasmatiske domene er nødvendig for den adhe-sive funksjon av det ekstracellulære domene i cadheriner som inneholder et cytoplasmisk domene. Binding mellom to medlemmer av cadherinfamilien uttrykt på forskjellige celler, er homofil (dvs. at et medlem av cadherinfamilien bindes til cadheriner av dets egen eller en nært beslektet underklasse) og Ca<2+->avhengig. For nylige oversikter over cadheriner, se Takeichi, Annu. Rev. Biochem., 59:237-252 (1990) og Takeichi, Science, 251:1451-1455 (1991).

De første cadheriner som ble beskrevet (E-cadherin i museepitelceller, L-CAM i fuglelever, uvomorulin i museblas-tocysten og CAM 120/80 i humane epitelceller), ble identifisert ved deres medvirkning i CA<2+->avhengig celleadhesjon og deres unike, immunologiske karakteristika og vevslokalisering. Med den senere immunologiske identifisering av N-cadherin som ble funnet å ha en annerledes vevsfordeling enn E-cadherin, viste det seg at en ny familie av Ca<2*->avhengige celle-celleadhesjonsmolekyler var oppdaget. ;Den molekylære kloning av genene som koder for E-cadherin [se Nagafuchi et al., Nature, 329:341-343 (1987)], N-cadherin [Hatta et al., J. Cell. Biol. 105:873-881 (1988)] og P-cadherin [Nose et al.,. EMBO J., 5:3655-3661 (1987)], til-veiebrakte strukturelt bevis for at cadherinene omfattet en familie av celleadhesjonsmolekyler. Kloning av L-CAM [Gallin et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 84:2808-2812 (1987)] og uvomorulin [Ringwald et al., EMBO J., 5:3647-3653 (1986)] av-slørte at de var identiske med E-cadherin. Sammenligninger mellom aminosyresekvensene av E-, N- og P-cadheriner viste et nivå av aminosyrelikhet på ca. 45-58% blant de tre underklasser. Liaw et al., EMBO J., 9:2701-2708 (1990) beskriver anvendelse av PCR med degenererte oligonukleotider basert på konserverte områder av E-, N- og P-cadherinene for å amplifi-sere N- og P-cadherin fra et bovint, mikrovaskulært endotel-celle-cDNA. ;Isoleringen ved hjelp av PCR av åtte ytterligere cadheriner ble rapportert i Suzuki et al., Cell Regulation, 2:261-270 (1991). Senere ble flere andre cadheriner beskrevet, inkludert R-cadherin [Inuzuka et al., Neuron, 7:69-79 (1991)], ;M-cadherin [Donalies, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 55:8024-8028 ;(1991)], B-cadherin [Napolitano, J. Cell. Biol., 113:893-905 ;(1991)] og T-cadherin [Ranscht, Neuron, 7:391-402 (1991)]. ;Proteiner fjernt beslektet med cadheriner, slik som desmoglein [Goodwin et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 173:1224-1230 (1990) og Koch et al., Eur. J. Cell Biol., 53:1-12 (1990)] og desmocolliner [Holton et al., J. Cell Science, ;97:239-246 (1990)], er dessuten beskrevet. De ekstracellulære domener av disse molekyler er strukturelt beslektet med de ekstracellulære domener av typiske cadheriner, men hver av disse har et unikt, cytoplasmatisk domene. Mahoney et al., Cell, 57:853-868 (1991) beskriver et tumorsuppresjonsgen fra Drosophila, betegnet fat, som også koder for et cadherinbe-slektet protein. Fat-tumorsuppressoren omfatter 34 cadherinlignende subdomener etterfulgt av fire EGF-lignende gjentakel-ser, et transmembrandomene og et nytt, cytoplasmatisk domene. ;Identifiseringen av disse cadherinbeslektede proteiner er bevis for at det eksisterer en stor superfamilie kjennetegnet ved et cadherin-ekstracellulært domenemotiv. ;Undersøkelser av vevsekspresjonen av de forskjellige cadherinbeslektede proteiner avslører at hver underklasse av molekyler har et unikt vevsfordelingsmønster. E-cadherin er f.eks. funnet i epitelceller, mens N-cadherin er funnet i ner-veceller og muskelceller. Ekspresjon av cadherinbeslektede proteiner synes også å bli romlig og tidsmessig regulert under utvikling, fordi individuelle proteiner synes å bli uttrykt av spesifikke celler og vev på spesifikke utviklingstrinn [for oversikt, se Takeichi (1991), supra] . Både den ektopiske ekspresjon av cadherinbeslektede proteiner og inhiberingen av nativ ekspresjon av cadherinbeslektede proteiner hindrer dannelsen av normal vevsstruktur [Detrick et al., Neuron, 4:493-506 (1990); Fujimori et al., Development, 110:97-104 (1990); ;Kintner, Cell, 59:225-236 (1992)]. ;Det unike tidsmessige og vevsekspresjonsmønster for de forskjellige cadheriner og cadherinbeslektede proteiner er spesielt signifikant ved vurdering av den rolle hver underklasse av proteiner kan spille in vivo i normale tilfeller (f.eks. opprettholdelse av tarmepitelbarrieren) og i unormale tilfeller {f.eks. tumormetastase eller inflammasjon). Forskjellige underklasser eller kombinasjoner av underklasser av cadherinbeslektede proteiner er sannsynligvis ansvarlige for forskjellige tilfeller av celle-celleadhesjoner hvori terapeutisk påvisning og/eller intervensjon kan være ønskelig. Autoantistoffer fra pasienter med pemphigus vulgaris, en auto-immun hudsykdom kjennetegnet ved dannelse av blemmer forår-saket av tap av celleadhesjon, reagerer f.eks. med et cad-herinbeslektet beslektet protein som gir direkte støtte for adhesjonsfunksjon av cadheriner in vivo [Amagai et al., Cell, 67:869-877 (1991)]. Undersøkelser har også antydet at cadheriner og cadherinbeslektede proteiner kan ha regulatoriske funksjoner i tillegg til adhesiv aktivitet. Matsunaga et al., Nature, 334:62-64 (1988), rapporterer at N-cadherin har neu-rittutvekstfremmende aktivitet. Drosophila fat-tumorsuppres-sorgenet synes å regulere cellevekst og undertrykke tumorinva-sjon, slik som mammalsk E-cadherin [se Mahoney et al., supra; Frixen et al., J. Cell. Biol., 113:173-185 (1991); Chen et al., J. Cell. Biol., 114:319-327 (1991); og Vleminckx et al., Cell, 6"6:107-119 (1991)]. Terapeutisk intervensjon i de regulatoriske aktiviteter av cadherinbeslektede proteiner uttrykt i spesifikke vev, kan således være ønskelig. ;Det foreligger således et fortsatt behov i teknikken for identifisering og karakterisering av ytterligere cadherinbeslektede proteiner som deltar i celle-celleadhesjon og/eller regulering. I den utstrekning at cadherinbeslektede proteiner kan danne basis for utviklingen av terapeutiske og diagnost-iske midler, er det dessuten essensielt at genene som koder for proteinene, klones. Informasjon om DNA-sekvensene og aminosyresekvensene som koder for de cadherinbeslektede proteiner, ville gi mulighet for storskalaproduksjon av proteinene ved hjelp av rekombinante teknikker og for identifisering av vevene/cellene som naturlig produserer proteinene. En slik sekvensinformasjon ville også tillate fremstilling av antistoffmaterialer eller andre nye bindingsmolekyler som er spesifikt reaktive med de cadherinbeslektede proteiner som kan være nyttige ved modulering av de naturlige ligand/antiligand-bindingsreaksjoner som proteinene er involvert i. ;Oppsummering av oppfinnelsen ;Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en renset og isolert polynukleotidsekvens, kjennetegnet ved at den koder for det humane protocadherin pc3 som angitt i SEQ ID nr: 110. ;Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre en biologisk funksjonell DNA-vektor, kjennetegnet ved at den omfatter en DNA-sekvens ifølge oppfinnelsen. ;Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre en vertscelle, kjennetegnet ved at den er transformert eller transfektert med en DNA-sekvens ifølge oppfinnelsen på en måte som tillater ekspresjon i vertscellen av et protocadherinpolypeptid. ;Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre en fremgangsmåte for fremstilling av et protocadherinpolypeptid, kjennetegnet ved trinnene med dyrkning av en vertscelle ifølge oppfinnelsen i et egnet næringsmedium og isolering av protocadherinpolypeptidet fra cellen eller fra cellevekst-mediet. ;Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre renset og isolert, humant protocadherin pc3-polypeptid som angitt i SEQ ID nr: 110. ;Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre et antistoffmateriale, kjennetegnet ved at det er spesifikt for humant protocadherin pc3 som angitt i SEQ ID nr: 110. ;Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre hybridomcellelinje, kjennetegnet ved at den produserer et monoklonalt antistoff ifølge oppfinnelsen. ;Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre protocadherinantistoffmateriale ifølge oppfinnelsen for anvendelse i en terapeutisk intervensjon av celle-celle-adhesjon og/eller regulatoriske aktiviteter av humant protocadherin pc3 omfattende at nevnte protocadherin bringes i kontakt med nevnte antistoffmateriale. ;Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre protocadherin pc3-fragment omfattende ett eller flere ekstracellulære domener av pc3 for anvendelse i en terapeutisk intervensjon av celle-celle-adhesjon og/eller regulatoriske aktiviteter av humant protocadherin pc3 som angitt i SEQ. ID. nr. : 110, omfattende at nevnte protocadherin bringes i kontakt med nevnte protocadherinfragment. ;Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre antistoffmateriale ifølge oppfinnelsen som er spesifikt for humant protocadherin pc3 for anvendelse i en terapeutisk fremgangsmåte for modulering av bindingsaktiviteten av humant protocadherin pc3, omfattende at nevnte protocadherin bringes i kontakt med nevnte antistoffmateriale. ;Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre protocadherin pc3-fragment, omfattende ett eller flere ekstracellulære domener av humant protocadherin pc3 med SEQ. ID. nr. 110 for anvendelse i en terapeutisk fremgangsmåte for modulering av bindingsaktiviteten av humant protocadherin pc3, omfattende at nevnte protocadherin bringes i kontakt med nevnte protocadherinfragment. ;I ett av dens aspekter tilveiebringer foreliggende oppfinnelse rensede og isolerte polynukleotider (f.eks. DNA og RNA, både sense- og antisense-tråder) som koder for de nye celleadhesjonsmolekyler betegnet heri som protocadheriner, inkludert protocadherin-pc3, protocadherin-pc4 og protocadherin-pc5. Foretrukne polynukleotidsekvenser ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer genomiske og cDNA-sekvenser, så vel som helt eller delvis syntetiserte DNA-sekvenser, og biologiske kopier derav (dvs. kopier av sekvensene fremstilt in vi tro). Foreliggende oppfinnelse angår også biologisk aktive vektorer som omfatter polynukleotidsekvensene. ;Spesielt illustrerende protocadherin-polynukleotidsekvenser er innføyelsene i plasmidene pRC/RSV-pc42 og pRC/RSV-pc43 som ble deponert hos American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 den 16. desember 1992, og ble gitt ATCC aksesjonsnr. 69162, henholdsvis 69163. ;Den vitenskapelige verdi av informasjonen tilført gjennom beskrivelsene av DNA og aminosyresekvensene ifølge foreliggende oppfinnelse, er innlysende. Kjennskap til sekvensen av et partielt eller komplett DNA som koder for et protocadherin, muliggjør f.eks. isolering, ved hjelp av standard DNA/DNA-hybridiserings- eller PCR-teknikker, av fullstendige cDNA-eller genomiske DNA-sekvenser som koder for proteinet (eller varianter derav), og i tilfellet med genomiske DNA-sekvenser, proteinet som spesifiserer protocadherinspesifikke, regulatoriske sekvenser, slik som promotere, enhancere og lignende. Alternativt kan DNA-sekvenser ifølge foreliggende oppfinnelse syntetiseres kjemisk ved hjelp av konvensjonelle teknikker. Hybridiserings- og PCR-teknikker tillater også isolering av DNA som koder for heterologe typer av proteiner som er homologe med de spesifikt illustrerte protocadheriner heri. ;Ifølge et annet aspekt av foreliggende oppfinnelse blir vertsceller, spesielt eukaryotiske og prokaryotiske celler, stabilt transformert eller transfektert med polynukleotidsekvensene ifølge oppfinnelsen på en måte som tillater ekspresjon av protocadherinpolypeptider i cellene. Vertsceller som uttrykker protocadherinpolypeptidprodukter, ved dyrkning i et egnet dyrkningsmedium, er spesielt anvendelige for storskalaproduksjon av protocadherinpolypeptider, fragmenter og varianter, hvilket derved muliggjør isolering av de ønskede polypeptidprodukter fra cellene eller fra dyrkningsmediet for cellene. ;De nye protocadherinproteinprodukter ifølge foreliggende oppfinnelse kan erholdes som isolater fra naturlige vevskilder, men fremstilles fortrinnsvis ved hjelp av rekombinante prosedyrer som involverer vertscellene ifølge foreliggende oppfinnelse. Produktene kan erholdes i helt eller delvis glykosylerte, helt eller delvis deglykosylerte eller uglyko-sylerte former, avhengig av den utvalgte vertscelle eller den rekombinante produksjonsprosess og/eller bearbeidelse etter isolering. ;Protocadherinvarianter ifølge foreliggende oppfinnelse kan omfatte polypeptidanaloger hvori én eller flere av de spesifiserte aminosyrer er fjernet eller erstattet, eller hvori én eller flere ikke-naturlig innkodede aminosyrer er tilsatt: (1) uten tap, og fortrinnsvis med forhøyelse, av én eller flere av de biologiske aktiviteter eller immunologiske karakteristika som er spesifikke for et protocadherin,- eller (2) med spesifikk utslettelse av en spesiell ligand/anti-ligand-bindingsfunksjon. Foreliggende oppfinnelse angår også antistoffmaterialer (f.eks. monoklonale og polyklonale antistoffer, kimære og humaniserte antistoffer, antistoffdomener inkludert Fab, Fab', F(ab')2, Fv eller enkle, variable domener, og enkeltkjedede antistoffer) som er spesifikke for protocadherinene ifølge foreliggende oppfinnelse. Antistoffmaterialer kan utvikles ved anvendelse av isolerte, naturlige, rekombinante eller syntetiske protocadherinpolypeptidprodukter eller vertsceller som uttrykker slike produkter på deres overflater. Antistoffmaterialene kan anvendes ved rensing av protocadherinpolypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse, for bestemmelse av vevsekspresjon av polypeptider og som antagonister for protocadherinenes ligand/antiligand-bindingsaktiviteter. Spesielt illustrerende, monoklonale antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse er de protocadherin-43-spesifikke, mono-klonale antistoffer produsert av hybridomcellelinjen med betegnelse 38I2C som ble deponert hos ATCC den 2. desember 1992 og gitt ATCC- ;aksesjonsnr. HB 11207. ;Et stort antall andre aspekter og fordeler ved foreliggende oppfinnelse vil fremgå ved betraktning av den følg- ;ende, detaljerte beskrivelse, med referanse til figurene hvori figur 1A-C er en oppstilling av protocadherinsyresekvenser ifølge foreliggende oppfinnelse sammen med aminosyresekvensene for N-cadherin og Drosophila fat-tumorsuppressoren. ;Detaljert beskrivelse ;Foreliggende oppfinnelse illustreres ved hjelp av de følgende eksempler hvori eksemplene 1, 2 og 3 beskriver isolering av protocadherinpolynukleotidsekvenser ved hjelp av PCR. Eksempel 3 beskriver også den kromosomale lokalisering av flere protocadheringener ifølge foreliggende oppfinnelse. Eksempel 4 beskriver isolering av ytterligere protocadherinpolynukleotidsekvenser ifølge foreliggende oppfinnelse ved hjelp av DNA/DNA-hybridisering. Eksempel 5 viser konstruksjon av ekspresjonsplasmider som inkluderer polynukleotider som koder for protocadherin-42 eller protocadherin-43, og transfeksjon av L-celler med plasmidene. Dannelsen av antistoffer mot protocadherin-42 og protocadheriri-43 er beskrevet i eksempel 6. Eksempel 7 viser resultatene av immunanalyser av transfekterte L-celler for ekspresjon av protocadherin-42 eller protocadherin-43. Eksempel 8 beskriver celleaggregeringsegenskapene for L-celler transfektert med protocadherin-42, protocadherin-43 eller et kimært protocadherin-43/E-cadherinmolekyl. Kalsi-umbindingsegenskapene for pc43 er beskrevet i eksempel 9. Resultatene av analyser av forskjellige vev og cellelinjer for ekspresjon av protocadherin-42 og protocadherin-43 ved hjelp av Northern blot, Western blot og in situ-hybridisering er henholdsvis vist i eksemplene 10, 11 og 12. Eksempel 13 beskriver immunutfellingseksperimenter som identifiserer et 12 0 kDa-protein som utfelles sammen med protocadherin-43. ;Eksempel 1 ;Polymerasekjedereaksjonen (PCR) ble anvendt for å isolere nye rotte-cDNA-fragmenter som koder for cadherinbeslektede polypeptider. ;Utforming av PCR- primere ;To områder med konservert aminosyresekvens, ett fra midten av det tredje, ekstracellulære cadherin-subdomene (EC-3) og det andre fra C-terminalen av det fjerde, ekstracellulære subdomene (EC-4), ble identifisert ved sammenligning mellom de publiserte aminosyresekvenser for L-CAM (Gallin et al., supra), E-cadherin (Nagafuchi et al., supra), muse-P-cadherin (Nose et al., supra), uvomorulin (Ringwald et al., supra), kylling-N-cadherin (Hatta et al., supra), muse-N-cadherin [Miyatani et al., Science, 245:631-635 (1989)] og humant P-cadherin [Shimoyama et al., J. Cell. Biol., 109:1787-1794 ;(1989)], og de tilsvarende, degenererte oligonukleotider som henholdsvis er oppført nedenfor med IUPAC-IUB biokjemisk nomenklatur, ble utformet for anvendelse som PCR-primere. ;Primer 1 (sekvens-ID nr. 1) ;5' AARSSNNTNGAYTRYGA 3' ;Primer 2 (sekvens-ID nr. 2) ;3' TTRCTRTTRCGNGGNNN 5' ;De degenererte oligonukleotider ble syntetisert ved anvendelse av Applied Biosystems modell 380B DNA-syntetiseringsapparat (Foster City, California). ;Kloning av cDNA- sekvenser ved hjelp av PCR ;PCR ble utført på lignende måte som beskrevet i Suzuki et al., Cell Regulation, 2-.261-270 (1991), på et rottehjerne-cDNA-preparat. Totalt RNA ble fremstilt fra rottehjerne ved hjelp av guanidinisotiocyanat/cesiumkloridmetoden beskrevet i Maniatis et al., s. 196 i Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1982). Hjerne-poly (A)+-RNA ble deretter isolert ved anvendelse av et "FastTrack"-sett (Invitrogen, San Diego, California), og cDNA ble fremstilt ved anvendelse av et cDNA-syntesesett (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indiana-polis, Indiana). PCR-reaksjonen ble innledet ved tilsetning av 2,5 enheter Taq-DNA-polymerase (Boehringer Mannheim Biochemicals) til 100 ng templat-cDNA og 10 ug av hver primer, hvoretter det ble utført 35 reaksjonssykluser med denaturering ved 94°C i 1,5 minutter, annealering ved 45°C i 2 minutter og poly-merisering ved 72°C i 3 minutter. To hovedbånd med størrelse på ca. 450 basepar (bp) og 130 bp ble funnet når produktene fra PCR-reaksjonen ble underkastet agarosegelelektroforese. 450 bp-båndet tilsvarte den forventede lengde mellom de to primerseter som tilsvarer midten av det tredje, ekstracellulære cadherin-subdomene (EC-3) og karboksylterminalen av det fjerde, ekstracellulære cadherin-subdomene (EC-4), men 130 bp-båndet kunne ikke forutsis ut fra noen av de tidligere identifiserte cadherinsekvenser. 4 50 bp- og 130 bp-båndene ble ekstrahert ved hjelp av en fryse- og tinemetode. De resulterende fragmenter ble fosforylert ved 5'-enden med T4-polynuk-leotidkinase og subklonet ved hjelp av en butt-ende-ligering i Sma I-setet av M13mpl8 (Boehringer Mannheim Biochemicals) i en butt-ende-ligering for sekvensanalyse. Sekvensering av fragmentene ble utført ved hjelp av dideoksynukleotidkjedeavslut-ningsmetoden ved hjelp av et "Sequenase"-sett (United States Biochemicals, Cleveland, Ohio). DNA- og aminosyresekvens ble analysert ved anvendelse av Beckman Microgenie-programmet (Fullerton, California). ;Analyse av cDNA- sekvenser ;19 nye, partielle cDNA-kloner ble isolert. DNA-sekvensene og de utledede aminosyresekvenser for klonene (inkludert sekvenser som tilsvarer PCR-primerne) er oppført som føl-ger: RAT-123 (sekvens-ID nr. 3, henholdsvis 4), RAT-212 (sekvens-ID nr. 5 og 6), RAT-214 (sekvens-ID nr. 7 og 8) RAT-216 (sekvens-ID nr. 9 og 10), RAT-218 (sekvens-ID nr. 11 og 12), RAT-224 (sekvens-ID nr. 13 og 14), RAT-312 (sekvens-ID nr. 15 og 16), RAT-313 (sekvens-ID nr. 17 og 18), RAT-314 (sekvens-ID nr. 19 og 20), RAT-315 (sekvens-ID nr. 21 og 22), RAT-316 (sekvens-ID nr. 23 og 24), RAT-317 (sekvens-ID nr. 25 og 26), RAT-321 (sekvens-ID nr. 27 og 28), RAT-323 (sekvens-ID nr. 29 og 30), RAT-336 (sekvens-ID nr. 31 og 32), RAT-352 (sekvens-ID nr. 33 og 34), RAT-411 (sekvens-ID nr. 35 og 36), RAT-413 (sekvens-ID nr. 37 og 38) og RAT-551 (sekvens-ID nr. 39 og 40) . ;De utledede aminosyresekvenser for cDNA-klonene er homologe med, men forskjellige fra, de kjente cadheriner. De hittil beskrevne cadheriner har ytterst konserverte, korte aminosyresekvenser i det tredje, ekstracellulære subdomene (EC-3) inkludert konsensussekvensen D-Y-E eller D-F-E lokalisert i det midtre området av subdomenet, og konsensussekvensen D-X-N-E-X-P-X-F (sekvens-ID nr. 41) eller D-X-D-E-X-P-X-F (sekvens-ID nr. 42) i enden (Hatta et al., supra), mens de tilsvarende sekvenser for andre subdomener, med unntak av det femte, ekstracellulære subdomene (EC-5), er henholdsvis D-R-E og D-X-N-D-N-X-P-X-F (sekvens-ID nr. 43). I motsetning til dette inkluderer de utledede aminosyresekvenser for de nye kloner som tilsvarer ekstracellulære cadherin-subdomener, sekvensen D-Y-E eller D-F-E i én ende, men har sekvensen D-X-N-D-N-X-P-X-F istedenfor D-X-N-E-X-P-X-F eller D-X-D-E-X-P-X-F i den andre ende. Polypeptidene som kodes for av de partielle kloner, er homologe med tidligere identifiserte cadheriner, men viste ikke signifikant homologi med noen andre sekvenser i Genbank. De partielle cDNA synes derfor å omfatte en ny underklasse av cadherinbeslektede molekyler. ;Eksempel 2 ;Forskjellige cDNA-fragmenter som er strukturelt lignende rotte-cDNA beskrevet i eksempel 1, ble isolert fra humane, muse- og Xenopus-hjerne-cDNA-preparater, og fra Drosophila og C. elegans fullstendige cDNA-preparater ved hjelp av PCR ved anvendelse av primerne 1 og 2 som beskrevet i eksempel 1. DNA-sekvensene og de utledede aminosyresekvenser for de resulterende PCR-fragmenter (inkludert sekvenser som tilsvarer PCR-primerne) er oppført som følger: MOUSE-321 (sekvens-ID nr. 44 og 45), MOUSE-322 (sekvens-ID nr. 46 og 47), MOUSE-324 (sekvens-ID nr. 48 og 49), MOUSE-326 (sekvens-ID nr. 50 og 51), HUMAN-11 (sekvens-ID nr. 52 og 53), HUMAN-13 (sekvens-ID nr. 54 og 55), HUMAN-21 (sekvens-ID nr. 56 og 57), HUMAN-24 (sekvens-ID nr. 58 og 59), HUMAN-32 (sekvens-ID nr. 60 og 61) , HUMAN-42 (sekvens-ID nr. 62 og 63), HUMAN-43 (sekvens-ID nr. 64 og 65), HUMAN-212 (sekvens-ID nr. 66 og 67), HUMAN-213 (sekvens-ID nr. 68 og 69), HUMAN-215 (sekvens-ID nr. 70 og 71), HUMAN-223 (sekvens-ID nr. 72 og 73), HUMAN-410 (sekvens-ID nr. 74 og 75), HUMAN-443 (sekvens-ID nr. 76 og 77), XENOPUS-21 (sekvens-ID nr. 78 og 79), XENOPUS-23 (sekvens-ID nr. 80 og 81), XENOPUS-25 (sekvens-ID nr. 82 og 83), XENOPUS-31 (sekvens-ID nr. 84 og 85), DR0S0PHILA-12 (sekvens-ID nr. 86 og 87), DROSOPHILA-13 (sekvens-ID nr. 88 og 89), DR0S0PHILA-14 (sekvens-ID nr. 90 og 91) og C. ELEGANS-41 (sekvens-ID nr. 92 og 93). Sammenligning av de utledede aminosyresekvenser indikerer signifikant likhet mellom sett av disse kloner. Det er spesielt tre sett av kloner som synes å være kryss-artshomo-loge: RAT-218, MOUSE-322 og HUMAN-43; RAT-314, MOUSE-321 og HUMAN-11; og MOUSE-326 og HUMAN-42. ;Eksempel 3 ;For å bestemme den fullstendige struktur av de nye proteiner definert ved hjelp av PCR-produktene, ble to uforkortede, humane cDNA som tilsvarer de partielle cDNA HUMAN-42 og HUMAN-43, isolert. ;Isolering av uforkortede, humane cDNA ;Et humant fosterhjerne-cDNA-bibliotek (Stratagene, La ;Jolla, California) i AZapII-vektoren ble screenet ved hjelp av plakk-hybridiseringsmetoden [beskrevet i Ausubel et al., red., Current Protocols in Molecular Biology, avsnitt 6.1.1 til 6.1.4 og 6.2.1 til 6.2.3, John Wiley & Sons, New York (1987)] med <32>P-merkede HUMAN-42 og HUMAN-43 DNA-fragmenter. De positive kloner ble plakkrenset, og ved anvendelse av et hjelper-virus ble innføyelsene utskåret ved hjelp av en in vivo-ut-skjæringsmetode i form av et "Bluescript SK(+)"-plasmid. De innføyde sekvenser ble deretter subklonet i M13-vektoren (Boehringer Mannheim, Biochemicals) for sekvensering. Flere overlappende cDNA-kloner ble isolert hvor hver probe inklud-erte to cDNA som inneholdt de antatte, fullstendige kodings-sekvenser for to nye proteiner, betegnet protocadherin-42 (pc42) og protocadherin-43 (pc43). DNA-sekvensene og de utledede aminosyresekvenser for pc42 er fremlagt i henholdsvis sekvens-ID nr. 94 og 95, mens DNA-sekvensene og de utledede aminosyresekvenser for pc43 er fremlagt i henholdsvis sekvens-ID nr. 96 og 97. ;En beskrivelse av kloningen av protocadherinsekvenser ifølge foreliggende oppfinnelse ble publisert i Sano et al., ;The EMBO Journal, 12(6):2249-2256 (1993) etter innsendelse av prioritetssøknaden. Den utledede aminosyresekvens for pc43 ble tidligere presentert på møtet av 9. desember 1991 til American Society for Cell Biology. Et sammendrag av presentasjonen er publisert som Suzuki et al., J. Cell. Biol., 115:72a (Abstract 416) (9. desember 1991). ;Analyse av uforkortede, humane kloner ;Sammenligning mellom de uforkortede cDNA-sekvenser for pc42 og pc43 og sekvensene for de forskjellige DNA-fragmenter opprinnelig erholdt ved hjelp av PCR, avslører at MOUSE-326 og HUMAN-42 tilsvarer en del av det fjerde, ekstracellulære subdomene (EC-4) av pc42, og RAT-314, MOUSE-321 og HUMAN-11 tilsvarer en del av det tredje, ekstracellulære subdomene (EC-3) av pc43, og RAT-218, MOUSE-322 og HUMAN-43 tilsvarer en del av det femte, ekstracellulære domene (EC-5) av pc43. ;De totale strukturer av pc42 og pc43 er lignende strukturen av typiske cadheriner, men de nye molekyler har også særskilte trekk. Begge protocadherin-cDNA-sekvenser inneholder antatte translasjonsinnledningsseter, og translaterte aminosyresekvenser starter med typiske signalsekvenser, men klonene mangler prosekvensene som er til stede i alle kjente cadherinforløpere. cDNA koder for proteiner med et stort N-terminalt, ekstracellulært domene og et forholdsvis kort, C-terminalt, cytoplasmatisk domene forbundet med en transmem-bransekvens. De ekstracellulære domener av pc42 og pc43 har forskjellig lengde, og pc42 inneholder syv subdomener som er svært like det typiske, ekstracellulære cadherin-subdomene, mens pc43 har seks slike subdomener. Størrelsene av de protocadherin-cytoplasmatiske domener er lignende de typiske cadheriner, men sekvensene oppviser ingen signifikant homolog! med sekvensene av kjente cadheriner eller cadherinbeslektede proteiner. ;Aminosyreidentitetsbestemmelser mellom ekstracellulære subdomener av human pc42 og pc43, og av muse-N-cadherin (sekvens-ID nr. 98) (presentert som et eksempel på et "typisk" cadherin) og det attende, ekstracellulære subdomene av Drosophila fat-tumorsuppressor (EC-18, sekvens-ID nr. 99) (det attende, ekstracellulære subdomene av fat er et prototypisk fat-subdomene) er vist i tabell 1 nedenfor, hvori f.eks. "N-EC-1 x pc42" indikerer at det første, ekstracellulære subdomene av N-cadherin ble sammenlignet med det ekstracellulære subdomene av pc42 angitt på den horisontale akse. Aminosyreidentitetsverdiene mellom de ekstracellulære subdomener av pc42 og pc43, og N-cadherin EC-1 til EC-5 og Drosophila fat EC-18 er for det meste mindre enn 40%. Disse iden-titetsverdier er sammenlignbare med verdiene mellom subdomenene av andre cadherin-underklasser. Høyere identitetsver-dier indikerer imidlertid at pc42 og pc43 er nærmere beslektet med fat enn N-cadherin. ;Aminosyreidentitetsbestemmelser mellom ekstracellulære subdomener av human p42 og pc43 er vist i tabell 2 nedenfor . ;Identitetsverdiene mellom respektive EC-1-, EC-2-, EC-3-, EC-4-, EC-5-subdomener og de siste subdomener av pc42 og pc43 er generelt høyere verdier enn verdier erholdt for sammenligninger mellom protocadherinene og N-cadherin. Disse resultater antyder at pc42 og pc43 er mer nær beslektet med hverandre enn med klassiske cadheriner. ;Figur 1A-C viser en oppstilling av de utledede aminosyresekvenser av de ekstracellulær subdomener av pc42 (EC-1 til EC-7), pc43 {EC-1 til EC-6), muse-N-cadherin (EC-1 til EC-5) og Drosophila fat EC-18. En sekvens på en linje i figur IA fortsetter på den samme linje i figur IB og 1C. Mellomrom ble innført for å maksimalisere homologi. Aminosyrerestene angitt med store bokstaver på "motiv"-linjen, er til stede i mer enn halvparten av subdomenene av N-cadherin, pc42, pc43 og Drosophila fat. Aminosyrerestene angitt med små bokstaver på motiv-linjen, er mindre godt konservert i human pc42, pc43 og Drosophila fat. Figur 1A-C viser at mange karakteristiske aminosyrer for andre ekstracellulære cadherin-domenegjentakelser er konservert i pc42- og pc43-sekvensene, inkludert cadherin-sek-vensmotivene DXD, DRE og DXNDNXPXF (sekvens-ID nr. 43), to glysinrester og én glutaminsyrerest. Pc42 og pc43 deler dessuten unike trekk sammenlignet med N-cadherin. Flere aminosyrer på spesifikke seter er konservert mellom pc42 og pc43, slik som DXDXGXN- (sekvens-ID nr. 100) protocadherinsekvensmotivet nær aminoterminalen av pc42- og pc43-subdomenene, og AXDXGXP- ;{sekvens-ID nr. 101) sekvensmotivet nær karboksylterminalen av subdomenene. Begge protocadheriner deler dessuten områder som ikke oppviser signifikant homologi med det typiske cadherin-motiv (av N-cadherin) nær karboksylterminalen av EC-1, midt mellom EC-2 og EC-4, og ved karboksylterminalen av den siste gjentakelse. En cysteinrest er lokalisert i en lignende posi-sjon i midten av EC-4 i pc42 og pc43. De ekstracellulære subdomener av pc42 og pc43 er generelt mer lik EC-18 i fat enn de ekstracellulære subdomener i N-cadherin. ;Mulig alternativ spleising ;Sekvensanalyse av forskjellige overlappende protocadherin-cDNA-kloner avslørte at noen kloner inneholdt unike sekvenser ved 3<1->enden selv om 5<1->endesekvensene var identiske med andre kloner. Sekvensene som danner grensene for 3<1->ende-områdene, er overensstemmende med konsensus-sekvensen for mRNA-spleising, hvilket antyder at disse kloner kan tilsvare alternativt spleisede mRNA. DNA og'de avledede aminosyresekvenser av ett mulig produkt av alternativ spleising av pc42-mRNA er pppført i sekvens-ID nr. 102 og 103. DNA og de avledede aminosyresekvenser av to mulige produkter fra alternativ spleising av pc43-mRNA er vist i henholdsvis sekvens-ID nr. 104 og 105, og sekvens-ID nr. 106 og 107. ;Kromosomlokalisering ;Den kromosomale lokalisering av protocadherin 413-genet (sekvens-ID nr. 37) og av pc42- og pc43-genene ble bestemt ved hjelp av konvensjonelle metoder. ;Kort beskrevet ble C3H/HeJ-gld- og Mus spretus-(Spania)mus og [ (C3H/HeJ-grId x Mus spretus) Ft x C3H/HeJ-gld] interarts-tilbakekrysningsmus avlet og opprettholdt som tidligere beskrevet i Seldin et al., J. Exp. Med., 167:688-693 ;(1988). Mus spretus ble valgt som den andre forelder ved krys-ningen på grunn av den relative letthet for påvisning av in-formative restriksjonsfragmentlengdevarianter (R.FLV) sammenlignet med krysninger ved anvendelse av konvensjonelle, innav-lede laboratoriestammer. Genbinding ble bestemt ved segrega-sj onsanalyse. ;Genomisk DNA isolert fra museorganer ved hjelp av standardteknikker, ble spaltet med restriksjonsendonukleaser, og 10 ug prøver ble underkastet elektroforese i 0,9% agarose-geler. DNA ble overført til "Nytran"-membraner (Schleicher Sc Schuell, Inc., Keene, NH), hybridisert med den passende probe ved 65°C og vasket under strenge betingelser, alt som tidligere beskrevet i Maniatis et al., supra. For å lokalisere pc42-genet ble det anvendt en musesekvensprobe som tilsvarer nukleotidene 1419 til 1906 av sekvens-ID nr. 94, og for pc43 ble det anvendt en rottesekvensprobe som tilsvarer nukleotidene 1060 til 1811 av sekvens-ID nr. 96. For å lokalisere protocadherin 413-genet ble det anvendt en probe som inklu-derte sekvensen oppført i sekvens-ID nr. 37. Andre kloner anvendt som prober i denne undersøkelse og RFLV anvendt for å påvise anonyme DNA-steder, var alle beskrevet tidligere [kromosom 7, DNA-segment, Washington 12 { D7Wasl2) ; para-tyreoidhormonet (Pth) ; kalsitonin ( Calc) ; hemoglobin, j3-kjede ( Hbb) ; metallotionein-I (Aft-I) ; adeninfosforibosyltransferase ( Aprt) ; veksthormonreseptor (Gnr); prostaglandin E-reseptor EP2-subtype ( Ptgerep2); dihydrofolatreduktase-2 { Dhfr2); fibroblastvekstfaktor a ( Fgfa); og glukokortikoidreseptor-1 ( Grl- l) l. ;Sammenligning mellom haplotypefordelingen av protocadheringener og genene bestemt for steder gjennom hele muse-genomet, tillot hvert gen å bli kartlagt til spesifikke områder av musekromosomer. Sannsynligheten for binding var >99%, og indikert tilordning av både pc42-genet og pc43-genet var kromosom 18. Tilordningen av protocadherin 413-genet var kromosom 7. Området av kromosom 18 som pc42- og pc43-genene ble kartlagt til, tilsvarer ataxia (ax)lokaliteten [Burt, Anat. Ree, 195:61-69 (1980) og Lyon, J. Hered., 45:77-80 (1955)] og "twirler"{ Tw)lokaliteten [Lyon, J. Embryo1. Exp. Morphol., 5:105-116 (1958)1, mens området for kromosom 7 som protocadherin 413-genet ble kartlagt til, tilsvarer "shaker"(sh-2)-lokaliteten [Kikuchi et al., Acta Oto-Laryngol., 50:287-303 ;(1965) og Lord et al., Am. Nat., 53:453-442 (1929)]. Disse lokaliteter er blitt angitt som involvert i arvelig nervesyk-dom hos mus. Dette resultat er overensstemmende med in situ-hybridiseringsresultater (se eksempel 12) som viser at pc42 og pc43 blir sterkt uttrykt i hjernen og spesielt i cerebellum. ;Eksempel 4 ;To ytterligere nye, humane protocadherin-cDNA og én ytterligere ny rotte-protocadherin-cDNA ble isolert ved anvendelse av rotte-protocadherinfragmenter beskrevet i eksempel l som prober. ;Innledningsvis ble rotteklonen RAT-214 (sekvens-ID nr. 7) anvendt som en probe for å screene et rottehjerne-cDNA-bibliotek (Stratagene, La Jolla, CA). Det siste vasketrinn ble utført to ganger ved 50°C i 0,1X SSC med 0,1% SDS i 15 minutter. Det ble identifisert forskjellige kloner som inneholdt partielle cDNA-innføyeIser som koder for beslektede protocadherin-aminosyresekvenser. Nukleotidsekvensen av én ny rotteklon betegnet nr. 6-2, er oppført i sekvens-ID nr. 108. De første 15 nukleotider av sekvens-ID nr. 108 er sekvensen av en linker og er ikke en del av rotte nr. 6-2-klonen. ;Et humant rottehjerne-cDNA-bibliotek erholdt fra Stratagene, ble screenet med det 0,7 kbp Pstl-fragment av klon nr. 6-2. Fragmentene synes å kode for EC-2 og EC-3 i rotte-protocadherinet. Etter screening av ca. 2xl0<6> fager ble det isolert 11 positive kloner. Sekvensering av klonene identifiserte et nytt, uforkortet, humant protocadherin-cDNA betegnet humant pc3. Nukleotidsekvensen og utledet aminosyresekvens av humant pc3 er oppført i sekvens-ID nr. 109 og 110. ;Det 0,7 kbp PstI-fragment av rotteklon nr. 6-2 ble også anvendt til en ny screening av Stratagene-rottehjerne-cDNA-biblioteket for uforkortede rotte-cDNA-kloner. En klon inneholdende en innføyelse som koder for et uforkortet, nytt protocadherin-cDNA, ble isolert. DNA-sekvensen og utledet aminosyresekvens av innføyelsen er oppført i sekvens-ID nr. 111 og 112. Det uforkortede rotte-cDNA ble betegnet pc5 fordi det ikke synes å være homologen av den humane pc3-klon, basert på en sammenligning av sekvensene. ;Det 0,8 kbp Eco RI-Pst I-fragment av partielt rotte-cDNA, betegnet nr. 43 (sekvens-ID nr. 113), som var erholdt ved screening av Stratagene-rottehjerne-cDNA-biblioteket med en probe som tilsvarer det humane pc43-cytoplasmatiske domene, ble samtidig anvendt for å undersøke Stratagene-humant-cDNA-biblioteket med hensyn til uforkortede, humane protocadherin-cDNA. Fragmentet synes å kode for EC-3 gjennom begynnelsen av EC-6 av klon nr. 43. Én spesielt identifisert klon koder for et nytt, humant protocadherin betegnet humant pc4. Nukleotidsekvensen og utledede aminosyresekvenser av den humane pc4-klon er oppført i sekvens-ID nr. 114 og 115. Aminosyresekven-sen som kodes for av pc4-klonen, synes å begynne i midten av EC-2 i pc4 og fortsetter gjennom protocadherinets cytoplasmatiske hale. ;Eksempel 5 ;De uforkortede, humane cDNA som koder for pc42 og pc43, ble uttrykt i L-celler (ATCC CCL 1) ved anvendelse av pRC/RSV-ekspresjonsvektoren (Invitrogen, San Diego, California) . cDNA ble isolert fra "Bluescript SK(+)"-klonene beskrevet i eksempel 2 ved spaltning med Sspl, etterfulgt av butt-ending med DNA-polymerase og spaltning med Xbal (for pc42), eller ved dobbel spaltning med Spel og EcoRV (for pc43) . pRC/RSV-ekspresjonsvektoren ble spaltet med Hindlll, etterfulgt av butt-ending og ny spaltning av Xbal for inn-føyelse av pc42-sekvenser, eller ved spaltning med Xbal etterfulgt av butt-ending og ny spaltning med Spel for innføyelse av pc43-sekvenser. De isolerte protocadherin-DNA ble ligert i den lineariserte pRC/RSV-vektor'. Det resulterende pc42-ekspre-sjonsplasmid betegnet pRC/RSV-pc42 (ATCC 69162) og pc43-eks-presjonsplasmid betegnet pRC/RSV-pc43 (ATCC 69163), ble renset ved CsCl-gradientsentrifugering og transfektert i L-celler ved hjelp av en Ca-fosfatmetode. ;Pc42- og pc43-transfektantene var morfologisk like med foreldrecellene. Northern blot-analyse av L-celler transfektert med pc42- eller pc43-DNA-sekvenser, viste at de transfekterte celler uttrykte mRNA med en størrelse forventet å kode for det spesielle protocadherin. ;Eksempel 6 ;Polyklonale kaninantistoffer spesifikke for pc42 og pc43, ble frembrakt, så vel som et monoklonalt museantistoff spesifikt for pc43. ;Fremstilling av polyklonale antistoffer for pc42 og pc43 ;Hver av DNA-sekvensene som koder for deler av det ekstracellulære domene av pc42 og pc43, ble fusjonert med en sekvens som koder for et maltosebindingsprotein og uttrykt i bakterier. Nærmere bestemt ble DNA som tilsvarer EC-4 til EC-7 i pc42 og EC-3 til EC-5 i pc43, fremstilt ved hjelp av PCR og subklonet i den korrekte avlesningsramme i flerkloningssetet av pMAL-ekspresjonsvektoren (New England Biolabs, Beverly, Massachusetts) som inneholder sekvenser som koder for maltosebindingsprotein umiddelbart oppstrøms for flerkloningssetet. De resulterende plasmider ble deretter innført i B. coli NM522-celler (Invitrogen, San Diego, California) ved hjelp av en ett-trinns transformasjonsmetode. Ekspresjon av fusjonsproteinene ble indusert ved tilsetning av IPTG, og fusjonsproteinene ble renset fra celleekstrakter ved hjelp av amylose-resin-affinitetskromatografi (New England Biolabs) som beskrevet av produsenten. Fusjonsproteinene ble anvendt for immunisering av kaniner uten ytterligere rensing. ;Polyklonale antistoffer ble fremstilt i kaniner ved immunisering på fire subkutane steder med 500 ug renset fusjonsprotein i Freunds komplette adjuvans. Etterfølgende im-muniseringer med 100 ug av fusjonsproteinet ble utført i Freunds ukomplette adjuvans. Immunsera ble passert gjennom "Sepharose" koblet til maltosebindingsprotein (New England Biolabs), og polyklonale antistoffer ble renset fra immunsera ved anvendelse av "Sepharose"-affinitetskolonner preparert ved reaksjon av det rensede fusjonsprotein med CNBr-"Sepharose" ;(Pharmacia). Reaktiviteten av de polyklonale sera med renset pc42-fusjonsprotein og pc42-transfekterte celleekstrakter (beskrevet i eksempel 5) ble bekreftet. ;Fremstilling av monoklonale antistoffer spesifikke for pc43 ;Pc43-fusjonsproteinet (inneholdende EC-3- til EC-5-subdomenene av pc43) ble anvendt for å frembringe monoklonale antistoffer i mus i overensstemmelse med metoden ifølge Ken-nett, Methods in Enzymol., 58:345-359 (1978). Kort beskrevet, ble mus immunisert med pc43-fusjonsproteinet (100 ug) på to subkutane steder. Milten fra musen med den høyeste titer ble fusjonert med NSl-myelomcellelinjen. De resulterende hybridom-supernatanter ble screenet i en ELISA-test for reaktivitet med pc43-fusjonsproteinet og med maltosebindingsprotein. Fusjons-brønnene med den høyeste reaktivitet overfor de pc43-ekstracellulære domener ble subklonet. Hybridomcellelinjen betegnet 38I2C (ATCC HB 11207), produserte et IgGi-subtype monoklonalt antistoff spesifikt for pc43. Reaktiviteten av det monoklonale antistoff produsert av hybridomcellelinje 38I2C overfor pc43, ble bekreftet ved immunblotting av pc43 L-celle-transfektantene beskrevet i eksempel 5. Det 3812C-monoklonale antistoff er spesifikt for humant pc43. ;Eksempel 7 ;L-celler transfektert med DNA-sekvenser som koder for pc42 og pc43 som fremstilt i eksempel 5, ble analysert for ekspresjon av protocadherinene ved hjelp av immunblot og immunfluorescensmikroskopi. ;Immunblotanalyse ;Celleekstrakter av pc42- og pc43-transfektanter ble underkastet SDS-PAGE og deretter blottet elektroforetisk på en PVDF-membran (Millipore, Bedford, Massachusetts). Membranene ble inkubert med 5% skummet melk i Tris-bufret saltløsning (TBS) i to timer og deretter med henholdsvis enten pc42-polyklonalt serum eller pc43-monoklonalt antistoff i 1 time. Membranene ble vasket tre ganger (i 5 minutter pr. vask) med TBS inneholdende 0,05% "Tween 20" og inkubert med henholdsvis alkalisk fosfatase-konjugert anti-kanin IgG-antistoff eller anti-muse-IgG-antistoff (Promega, Madison, Wisconsin) i den samme buffer i 1 time. Etter vask av membranene med TBS inneholdende 0,05% "Tween 20", ble reaktive bånd visualisert ved anvendelse av Western blå-oppløsning (Promega). ;Anti-pc42-polyklonale antistoffer farget et bånd med molekylvekt på ca. 170 kDa i pc42-transfekterte celler, men ikke i L-stamceller. Det pc43-spesifikke, monoklonale antistoff (38I2C) og polyklonale antistoffer farget to nærliggende bånd med molekylvekt på ca. 150 kDa i pc43-transfekterte celler. Pc43-antistoffene farget ikke bånd i L-stamceller. De indikerte molekylvekter ved farging av båndene med pc42- og pc43-antistoffene er betydelig høyere enn molekylvektene som ble forutsagt fra de utledede aminosyresekvenser. Denne uover-ensstemmelse i molekylvekt er vanlig blant forskjellige cadherinbeslektede proteiner og kan tilskrives glykosyleringen og/eller cadherinspesifikke, strukturelle egenskaper. Pc42-antistoffene farget også mindre bånd som kan være proteolyt-iske nedbrytningsprodukter. ;Når transfekterte celler ble behandlet med trypsin og celleekstrakter ble fremstilt, underkastet SDS/PAGE og immun-blottet med det passende antistoff, ble pc42- og pc43-polypeptidene uttrykt av de transfekterte celler, funnet å være ytterst sensitive overfor proteolyse og ble lett spaltet ved behandling med 0,01% trypsin. I motsetning til de klassiske cadheriner ble imidlertid disse proteiner ikke beskyttet mot spaltning i nærvær av 1-5 mM Ca<2+>. ;Immunfluorescensmikroskopi ;Transfekterte celler ble dyrket på et dekkglass på ;forhånd belagt med fibronektin, og ble fiksert med 4% paraformaldehyd i 5 minutter ved romtemperatur, eller med kald metan-ol på is i 10 minutter etterfulgt av 4% paraformaldehydfikser-ing. Etter vask med TBS ble cellene inkubert med TBS inneholdende 1% BSA i 30 minutter, og deretter med anti-pc42-polyklonalt antistoff eller anti-pc43-monoklonalt antistoff i TBS inneholdende 1% BSA, i 1 time. Dekkglassene ble deretter vasket med TBS inneholdende 0,01% BSA og inkubert med henholdsvis FITC-konjugert anti-kanin-antistoff eller anti-muse-antistoff (Cappel, Durham, North Carolina) i 60 minutter ved romtemperatur. Cellene ble vasket på nytt med TBS inneholdende 0,01% BSA og underkastet fluorescensmikroskopi. Både pc42-spesifikke og pc43-spesifikke, polyklonale antistoffer farget periferien av transfekterte celler som uttrykker protocadherinproteinene, hovedsakelig ved celle-celle-kontaktstedene. Antistoffene farget ikke L-stamcellene, og kanin-preimmunsera farget heller ;ikke pc4 2- og p43-transfektantene. ;Eksempel 8 ;Celleaggregeringsegenskapene for de transfekterte L-celler som uttrykker protocadherinproteiner, ble undersøkt. Transfekterte L-celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles-medium (DMEM) (Gibco, Grand Island, New York) supplert med 10% bovint fosterserum ved 37°C i 5% C02. Celler dyrket nær konfluens, ble behandlet med 0,01% trypsin i nærvær av 1 mM EGTA i 25 minutter på et rotasjonsristeapparat ved 37°C og oppsamlet ved sentrifugering. Cellene ble vasket tre ganger med Ca<2+->fri HEPES-bufret saltløsning (HBS) etter tilsetning av soyabønne-trypsininhibitor og ble resuspendert i HBS inneholdende 1% BSA. Celleaggregeringsundersøkelsen [Urushihara et al., Dev. Biol., 70:206-216 (1979)] ble utført ved inkubasjon av de resuspenderte celler i en 1:1 blanding av DMEM og HBS inneholdende 1% BSA, 2 mM CaCl2 og 20 ug/ml ;deoksyribonuklease, på et rotasjonsristeapparat ved 37°C i 3 0 minutter til ;6 timer. ;Pc42- og pc43-transfektantene oppviste ingen signifikant celleaggregeringsaktivitet under inkubasjonsperioder kortere enn 1 time. Dette står i motsetning til celleaggreger-ingen som forekommer med klassiske cadheriner i lignende eksperimenter (Nagafuchi et al., supra, og Hatta et al., supra). Forlenget inkubasjon av transfekterte celler (mer enn ;1-2 timer) resulterte imidlertid i gradvis reaggregering av cellene i mindre aggregater. Lignende resultater ble erholdt når enkle cellesuspensjoner av transfekterte celler ble preparert ved trypsinbehandling i nærvær av Ca<a+.> Ingen reaggregering ble observert under de samme betingelser når utransfek-terte L-celler eller L-celler transfektert med pRC/RSV-vektor alene, ble testet. Når pc43-transfektanter merket med DiO (Molecular Probes, Eugene, OR) ble inkubert med umerkede pc4 2-transfektanter i celleaggregeringsanalysen, var aggregering av merkede og umerkede celler nesten innbyrdes utelukkende, hvilket indikerer at protocadherinbinding er homofil. ;I betraktning av det faktum at de protocadherin-cytoplasmatiske domener ikke oppviser noen tilsynelatende hotnologi med cadherindomener, ble eksperimenter utført for å bestemme hvorvidt forskjellen i cytoplasmatiske domener kunne forklare forskjellen i den observerte celleaggregeringsaktivitet i cadherin- og protocadherintransfektanter. Det cytoplasmatiske' domene av pc43 ble erstattet med det cytoplasmatiske domene av E-cadherin, og aggregering av celler transfektert med den kimære konstruksjon, ble analysert. ;"Bluescript SK(+)"-klonen beskrevet i eksempel 2 som inneholdt den fullstendige kodingssekvens for pc43, ble spaltet med EcoRV og deretter delvis spaltet med Xbal for å fjerne sekvensen som tilsvarer det cytoplasmatiske domene, og plas-mid-DNA ble renset ved agarosegelelektroforese. cDNA som tilsvarer det cytoplasmatiske domene av muse-E-cadherin, ble syntetisert ved hjelp av PCR ved anvendelse av muse-cDNA fremstilt fra muselunge-mRNA som et templat og spesifikke primere tilsvarende et område nær N-terminalen av den cytoplasmatiske domenesekvens eller området inneholdende stoppkodonet for muse-E-cadherin (Nagafuchi et al., supra). En Xbal-sekvens ble inkludert i 5'-enden av oppstrøms-primeren. Det E-cadherin-cytoplasmatiske domene-cDNA ble deretter subklonet i den ;lineariserte pc43-"Bluescript"-klon. DNA inneholdende den resulterende, fullstendige, kimære sekvens, ble utskåret med Spel og EcoRV og ble subklonet i det Spel-buttede Xbal-sete av ekspresjonsvektoren pRc/RSV-vektor. Til slutt ble L-celler transfektert med den resulterende konstruksjon ved hjelp av en ;kalsiumfosfatmetode. Etter screening med G418 i ca. 10 dager ble transfektantene farget med FITC-merket 38I2C-anti-pc43-antistoff og underkastet FACS-analyse. En del av de høymerkede celler ble isolert og klonet. Transfektanter oppviste en mor-fologi lignende L-stamceller, og det uttrykte protein ble lokalisert på celleperiferien ved anvendelse av pc43-antistoff for immunfluorescensmikroskopi. ;Celleaggregeringsaktivitet av de kimære transfektanter ble analysert som følger. De kimære pc43-transfektanter ble merket med DiO i 20 minutter ved romtemperatur. De resulterende celler ble behandlet med trypsin i nærvær av l mM EGTA, og en enkeltcellesuspensjon ble preparert. Cellene ble deretter blandet med en annen type av umerkede transfektanter og inkubert på et rotasjonsristeapparat i 2 timer. Resultatene ble undersøkt med en fluorescens- og en fasekontrastmikro-skopapparatur. Antistoffinhibering av celleaggregering ble undersøkt ved inkubasjon av transfektantene i nærvær av polyklonalt anti-pc43-antistoff (100 ng/ml) i standardanalyse-mediet. ;I celleaggregeringsundersøkelsen oppviste de kimære pc43-transfektanter en tydelig Ca<2*->avhengig celleaggregering innen 40 minutters inkubasjon. Celleaggregering ble inhibert ved tilsetning av pc43-spesifikt, polyklonalt antistoff.

Eksempel 9

Prosedyrene ifølge Maruyama et al., J. Biochem., 95:511-519 (1984) ■, ble anvendt for å bestemme kalsiumbindings-egenskapene til pc43 ved Western blot-analyse i nærvær eller fravær av kalsium-45. Pc43-fusjonsproteinet beskrevet i eksempel 6 inneholdende pc43-subdomener EC-3 til EC-5, ble sammenlignet med kalsiumbindingsproteinet kalmodulin. Prøver av renset pc43-fusjonsprotein ble underkastet SDS/PAGE og elektroforetisk overført til PVDF-membran. Binding av <4S>Ca<2+> til pc43-fusjonsproteinet ble påvist ved autoradiografi og ble bestemt å være nesten like effektiv som binding av 4<S>Ca<2+> til kalmodulin. I motsetning til dette var det ingen binding av kalsium til renset maltosebindingsprotein som mangler det pc43-ekstracellulære domene. Pc43-subdomenene EC-3 til EC-5 inneholder sekvenser som er svært homologe med de antatte Ca<2±->bindings-motivene funnet i E-cadherin. [Se Ringwald et al., EMBO J., 5:3647-3653 (1987)].

Eksempel 10

Ekspresjonen av mRNA som koder for pc42 og pc43, ble analysert i forskjellige vev og cellelinjer ved hjelp av Northern blot.

Totalt RNA ble fremstilt ved hjelp av guanidinisotio-cyanatmetoden, og poly(A)+-RNA ble isolert ved anvendelse av et "FastTrack"-sett (Invitrogen). RNA-preparater ble underkastet elektroforese i en 0,8% agarosegel under denaturerende betingelser og overført til et nitrocellulosefilter ved anvendelse av en kapillærmetode. Northern blot-analyser ble utført i overensstemmelse med metoden ifølge Thomas, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 77:5201-5205 (1980). Den siste vask ble utført i 0,2X standard salt-sitratløsning inneholdende 0,1% natrium-dodecylsulfat, ved 65°C i 10 minutter.

Protocadherin- mRNA- ekspresjon i vev fra voksne rotter

Totale mRNA-preparater av rottevev inkludert hjerne, hjerte, lever, lunge, hud, nyre og muskel, ble separert elektroforetisk under denaturerende betingelser (10 ug mRNA/felt) og overført til nitrocellulosefiltre. Filtrene ble hybridisert med <32>P-merkede cDNA-fragmenter MOUSE-326 (som tilsvarer EC-4 av humant pc42) og RAT-218 (som tilsvarer EC-5 av humant pc43). mRNA for begge protocadheriner ble i høy grad uttrykt i hjerne. Pc42-proben påviste et hovedbånd med størrelse 7 kb og et mindre bånd med størrelse 4 kb som muligens representerer produktene av alternativ spleising. Pc43-proben hybridiserte med et hovedbånd med størrelse 5 kb og med mindre bånd med mindre størrelser.

Utviklingsekspresjon av protocadherin- mRNA i rottehjerne

For å undersøke den utviklingsmessige regulering av mRNA-ekspresjon av protocadherinene ble hjerne-mRNA fra rotter på embryoniske dager 17 og 20, neonatale dager 5 og 11 og fra voksne rotter, preparert og underkastet Northern blot-analyse som beskrevet ovenfor for andre rottevev. p-aktin ble anvendt som en intern standard. mRNA-niv&er for pc42- og pc43-proteiner økte under embryonisk utvikling av hjernen sammenlignet med p-aktinekspresjon.

Protocadherin- mRNA- ekspresjon i humane cellelinjer

Flere neuron- og gliacellelinjer (inkludert human SK-N-SH-neuroblastom-, human U-251-gliom- og muse-Neuro-2a-neuro-blastomcellelinjer) ble analysert ved hjelp av Northern blot ved anvendelse av <32>P-merking for ekspresjon av pc42- og pc43-mRNA. Humane cellelinjer ble probet med HUMAN-42-cDNA-fragmenter (som tilsvarer EC-4 av humant pc42) og HUMAN-43-cDNA-fragmenter {som tilsvarer EC-5 av humant pc4 3), mens musecel-lelinjen ble probet med MOUSE - 3 2 6 - cDNA-fragment er (som tilsvarer EC-4 av humant pc42) og RAT-322-cDNA-fragmenter (som tilsvarer EC-5 av humant pc43). SK-N-SH-humane neuroblastomceller og U251-humane gliomceller ble funnet å uttrykke pc43-mRNA, og Neuro-2a-museneuroblastomceller ble funnet å uttrykke pc42-mRNA.

Eksempel 11

Ekspresjon av pc43-protein i forskjellige vev, eks-trakter og celler ble analysert ved hjelp av Western blot og immunfluorescensmikroskopi.

Ekspresjon i hjertemuskelekstrakter fra rotte

En ikke-ionisk detergentekstrakt av rotte ble preparert ved nedfrysing av et hjerte i flytende nitrogen etter

fjerning, pulverisering i en morter, kort oppmaling i en poly-tron i 0,5% "Nonidet P40" i [10 mM PIPES (pH 6,8), 50 mM NaCl, 2 50 mM NH4S04, 3 00 mM sukrose, 3 mM MgCl2] og mikrosentrifuger-ing i 15 minutter. Prøver ble separert ved hjelp av SDS/PAGE

og elektroforetisk overført til nitrocellulose (Towbin et al., PNAS 75:4350-4354, 1979). To pc43-proteinbånd med molekylvekter på 150 kDa og 140 kDa ble påvist med kanin-polyklonale antistoffer mot pc43 ved hjelp av immunblotmetoden beskrevet i eksempel 7.

Ekspresjon i vevsseksjoner og celler

For å bestemme lokaliseringen av protocadherinene i forskjellige vev ble vev fra mennesker og voksne rotter fjernet, inkubert i 30% sukrose i PBS i 30 minutter ved 4°C, inne-sluttet i OCT-forbindelse ("Tissue-Tek", Elkhart, Indiana) i fryseformer og hurtig nedfrosset. 6 mikroseksjoner ble avkuttet og plassert på dekkglass. Glassene ble deretter vasket med PBS og fiksert i 3% p-formaldehyd i 5 minutter. For å permea-bilisere vevsseksjonene ble glassene nedsenket i aceton ved

-20°C i 10 minutter og lufttørket. Seksjonene ble blokkert med 2% geiteserum og 1% BSA i PBS i 30 minutter og deretter inkubert med kanin-anti-pc43-polyklonale antisera i 1 time ved

romtemperatur. Seksjonene ble skylt 3 ganger i PBS inneholdende 0,1% BSA og inkubert med et biotinylert anti-kanin (Vector Laboratories, Burlingame, California) i 1% BSA i PBS i 30 minutter. Etter skylling 3 ganger ble streptavidin konjugert med FITC {Vector Laboratories), tilsatt i 30 minutter og på nytt vasket 3 ganger. For kolokaliseringsundersøkelser ble en passende mengde primært antistoff anvendt sammen med et TRITC-konjugert, sekundært antistoff.

A. Muskel

Immunlokalisering av pc43 i rottehjertemuskel viser at pc43 er lokalisert i et gjentakende mønster som er i overensstemmelse med at pc43 er assosiert med sarkomerene. Sar-komerer er gjentatte, kontraktile enheter mellom fascia ad-herens i skjelettmuskel og hjertemuskel. Kolokalisering med cytoskjelettproteiner viser at pc43 er til stede på endene av sarkomerene i Z-linjene som er assosiert med desmin og aktin-bindingsproteinet vinculin, og alfa-aktinin. De tynne mikro-filamenter i F-aktin er forbundet med de tykke myosinfila-menter mellom Z-linjene. I motsetning til dette er N-cadherin lokalisert i endene av hjertemyocytter ved fascia adherens-forbindelsene på seter for mykocytt:myocytt-kontakt, Lokaliseringen av pc43 i hjertemuskel antyder at pc43 kan spille en rolle ved muskelkontraksjon i forankringen av det kontraktile apparat til plasmamembranen.

Lignende lokalisering for pc43 ble observert i rot-teskjelettmuskel. Ultrastrukturundersøkelser har vist at dystrofin, genproduktet som mangler ved Duchenne-muskulær dys-trofi, er en komponent av sarkolemma [Porter et al., J. Cell. Biol., 117:997-1005 (1992)]. Sarkolemma er forbundet med det kontraktile apparat ved M- og Z-linjene hvor pc 43 er lokalisert .

B. Hj erne

Reaktivitet av anti-pc43-polyklonalt antistoff og monoklonalt antistoff 38I2C overfor frosne seksjoner av henholdsvis rotte- og humant cerebellum, viser at hovedsetene for pc43-ekspresjon er lokalisert i Purkinje-celler og granulcel-lelaget som inneholder et stort antall små neuroner.

C. Placenta

Sterk reaktivitet av monoklonalt antistoff 38I2C med humane syncytiotrofoblaster ble også observert ved utvikling av placenta på et tidlig stadium {5-7-ukers svangerskap). Ekspresjon synes å minske gradvis når stadiet utviklet seg, hvilket indikerer at pc43 kan være involvert ved implanta-sjonen av befruktede egg i placenta. D. Neuroblastom- og astrocytomceller Immuncytokjemisk lokalisering av pc43 i Sk-N-SH-neuroblastomceller og UW28-astrocytomceller ved anvendelse av anti-pc43-antistoffer avslører en punktvis celleoverflatefor-deling av pc43, og i noen celler foreligger det en lokalisering ved spissene av utvidelser av neuronale fotutvekster. Ved seter for celle-cellekontakt mellom UW28-astrocytomceller er pc43 organisert i en serie med parallelle linjer. Linjene starter ved kontaktstedet og strekker seg ca. 5 mikron. F-aktinmikrofilamenter ble identifisert med rhodamin-falloidin (Molecular Probes, Eugene, Oregon, som beskrevet av produsenten) som viser at mikrofilamentene i cellen synes å ende i de pc43-lineære strukturer som strekker seg fra kanten av cellen på steder for cellekontakt.

Immunblottingsundersøkelser med pc43-spesifikke antistoffer viser at et protein med en molekylvekt på 140 kDa gjenkjennes i humane Sk-N-SH-neuroblastomceller og i UW28-astrocytomceller.

E. Osteoblaster

Immuncytokjemisk lokalisering av pc43 ved anvendelse av monoklonalt antistoff 38I2C i "tow" humane, osteogene sarkomcellelinjer [SaOS (ATCC HTB 85) og MG-63 (ATCC CRL 1427)] og i kulturer av normale, humane, trabekulære osteoblaster [kultursystem beskrevet i Civitelli et al., J. Clin. Invest., 91:1888-1896 (1993)] viste at pc43 uttrykkes i osteoblaster på en lignende måte som observert i UW28-astrocytomceller. Ved steder for celle-cellekontakt er pc43 organisert i en serie av parallelle linjer som synes å tilsvare aktinspenn-ingsfibrene. I noen celler synes dessuten pc43 å være lokalis-

ert ved spissene av celleutvékster som er i kontakt med hverandre. Northern blot-analyse tilveiebringer ytterligere bevis for at pc4 3 uttrykkes i normale, humane, trabekulære osteoblaster. En pc43-spesifikk DNA-probe hybridiserte til et hovedbånd på 5 kb i prøver av poly-A-mRNA isolert fra normale, humane, trabekulære osteoblaster.

Eksempel 12

In situ-hybridiseringseksperimenter ved anvendelse av protocadherin-spesifikke RNA-prober ble utført på frysesnitt av rottevev.

Sense- og antisense-<35>S-riboprober ble dannet ved anvendelse av standardprosedyren beskrevet av Promega (Madi-

son, Wisconsin). Et ca. 400 bp EcoRI-Xbal-fragment av MOUSE-

326 cDNA-klonen ble anvendt som en pc42-spesifikk probe. Dette fragment koder for midten av EC-3 til enden av EC-4 av pc42.

Et ytterligere 700 bp Smal-fragment av RAT-218-cDNA-klonen ble anvendt som en pc43-spesifikk probe. Fragmentet koder for en-

den av EC-3 til enden av EC-5 av pc43.

Vev fra voksne rotter ble innhøstet og umiddelbart omsluttet med OCT-forbindelse ("Tissue-Tek") i fryseformer og hurtig nedfrosset i et bad med 95% etanol/tørris. De frosne blokker ble lagret ved -80°C inntil de ble kuttet. Det ble avkuttet vevssnitt med tykkelse 6 mikron ved anvendelse av en kryostat (Reichert-Jung, modell nr. 2800 "Frigocut N", Leica,

Inc., Gilroy, California). Kuttede vevssnitt ble lagret ved

-80°C.

Den anvendte in situ-protokoll var en variasjon av protokollen beskrevet av Angerer et al., Methods in Enzymo-logy, 152:649-660 (1987). Alle løsninger ble behandlet med dietylpyrokarbonat (DEPC, Sigma, St. Louis, Missouri) for å fjerne RNase-kontaminering. Vevssnittene ble først fiksert i 4% paraformaldehyd ved 4°C i 20 minutter. For å fjerne overskudd av paraformaldehyd og stoppe vevsfikseringen ble strimlene vasket i PBS (fosfatbufret saltløsning), denaturert i en gradert serie av alkoholer (70, 95, 100%) og deretter tørket. For å hindre at vevet løsnet fra glasstrimmelen under in situ-prosedyren ble vevssnittene behandlet i en poly-L-lysinløsning (Sigma) ved romtemperatur i 10 minutter. For å denaturere alt RNA i vevet ble snittene plassert i en løsning av 70% formamid/2x SSC (0,15 M NaCl/0,3 M Na-sitrat, pH 7,0) ved 70°C i 2 minutter, hvoretter de ble skylt i avkjølt 2x SSC, dehydrert i en gradert serie av alkoholer og deretter tørket. Etter tørking ble snittene prehybridisert i hybridiseringsbuffer [50% formamid/50 mM DTT (ditiotreitol)/0,3 M NaCl/20 mM Tris, pH 8,0/5 mM EDTA/1X Denhardts (0,02% "Ficoll" type 400/0,02% polyvinylpyrrolidon/0,02% BAS)/10% dekstransulfat] ved den endelige hybridiseringstemperatur i ca. 4 timer. Etter pre-hybridisering ble ca. 1 x IO<6> cpm av den egnede riboprobe tilsatt til hvert snitt. Snittene ble vanligvis hybridisert ved 45°C over natten (12-16 timer). For å sikre at den observerte hybridisering var spesifikk ble i noen eksperimenter hybridis-eringsstringensen økt ved å forhøye hybridiseringstemperaturen til 50°C. Fordi eksperimentene ved både 45°C og 50°C ga sammenlignbare resultater, var den anvendte standard hybridiseringstemperatur 45°C.

For å fjerne overskudd av ikke-hybridisert probe ble snittene underkastet en serie vasketrinn. Snittene ble først skylt i 4X SSC for å fjerne hovedmengden av hybridiseringsløs-ningen og proben. Deretter ble det utført en 15 minutters vask i 4X SSC/50 mM DTT ved romtemperatur. Vaskinger ved økte stringenser ble også benyttet. En 40 minutters vask i 50% formamid/2X SSC/50 mM DTT ble utført ved 60°C. Fire siste vaskinger ved romtemperatur ble utført i 10 minutter hver: to i 2X SSC og to i 0,1X SSC. De vaskede strimler ble dehydrert i en gradert serie av alkoholer og tørket.

For å visualisere den hybridiserte probe ble strimlene dyppet i "Kodak NTB211 nukleær emulsjon (International Biotechnology, New Haven, Connecticut) som var fortynnet 1:1 i dH20. Når de var tørre, ble strimlene lagret ved 4°C i lystette bokser for den passende eksponeringstid. In si tu-strimlene ble uavhengig betraktet av to personer og bedømt som positive eller negative med hensyn til hybridiseringssignal.

Alle in situ-hybridiseringsundersøkelser ble utført på rottevev. Fordi resultater fra Northern blot-eksperimenter (se eksempel 9) indikerte at både pc42 og pc43 ble uttrykt i voksen hjerne, ble in situ-hybridiseringsundersøkelser utført for å lokalisere ekspresjonen av disse molekyler til spesifikke hjernecelletyper. Den observerte hybridisering i den normale, voksne rottehjerne var spesifikk (ingen bakgrunns-hybridisering ble observert med sense-probene) og ble lokalisert til spesifikke områder i hjernen. Det samlede ekspresjons-mønster observert for pc42 og pc43, var meget likt, og hoved-forskjellen var ekspresjonsnivået. Pc43 synes å bli uttrykt ved et lavere nivå enn pc42. Begge molekyler uttrykkes i ger-minalcellene og pyramidecellene i hippocampus, Purkinje-celler i cerebellum og neuroner i grå masse. Pc42 uttrykkes dessuten i gliaceller i den hvite masse, men i motsetning til ekspresjonen av pc43 i gliomcellelinjer (som beskrevet i eksempel 9) ble ekspresjon av pc43 i normale gliaceller ikke observert. I ryggmargen uttrykkes begge protocadheriner i motorneuronene i den grå masse, og pc42 uttrykkes i gliacellene i den hvite masse.

Når ekspresjon av begge protocadherinmolekyler ble analysert i hjerne og ryggmarg fra rotter med EAE (eksperi-mentell, allergisk encefalomyelitt) [Vandenbark et al., Cell. Immunol., 12:85-93 (1974)], ble de samme strukturer som beskrevet ovenfor, funnet å være positive. Ekspresjon av pc42 ble dessuten observert i de leukocyttiske infiltrater i EAE-vevene. Ekspresjon av pc42 i leukocytter ble bekreftet ved in situ-hybridiseringsanalyse av to leukocyttiske cellelinjer, RBL-1 og y3.

Ekspresjon av både protocadherin-42 og -43 ble observert i den utviklende hjerne av rottefostere på alle de testede, embryologiske dager (E15-E19). Protocadherin-43 ble dessuten observert i det utviklende rottehjerte ved alle de testede, embryologiske dager (E13-E19). Dette funn er overensstemmende med de immunhistokjemiske resultater som viser protocadherin- 4 3 -ekspresjon i voksent hjerte.

For å bestemme mulige roller for protocadheriner ved utviklingen av nervesystemet ble ekspresjonsprofiler av protocadherinmedlemmer i utviklende rottehjerne og voksen rottehjerne også undersøkt ved in situ-hybridisering. En serie av koronale, sagittale og horisontale snitt av rottehjerner ved postnatale dager 0, 6, 14, 30 (PO til P30) og ved 3 måneder (ung voksen) ble hybridisert med merkede cRNA-prober som tilsvarer forskjellige protocadheriner ifølge foreliggende oppfinnelse, inkludert pc42, pc43, RAT-212, RAT-411 og RAT-418. I utviklende hjerne ble RAT-411 uttrykt ved høye nivåer i neuroner i luktekolben, dvs. mitralceller og periglomerulær-celler. Ekspresjonen av RAT-411-mRNA var forbigående; ekspresjon fremkom ved PO, toppet seg ved P6, avtok ved P14 og var upåviselig ved P30 og i voksen hjerne. Hos voksne ble pc43-mRNA funnet å bli uttrykt hovedsakelig i Purkinje-celler i cerebellum. Ekspresjonen av pc43-mRNA i Purkinje-celler ble observert fra begynnelsen av Purkinje-celledifferensiering rundt P6. Andre protocadherinmedlemmer ble uttrykt ved meget lave nivåer i forskjellige områder av utviklende og voksne hjerner. Disse resultater indikerer at protocadherinmedlemmer blir forskjellig uttrykt under utviklingen av sentralnervesys-temet og antyder at RAT-411 og pc43 har spesielle roller under utviklingen av henholdsvis luktekolbeneuroner og Purkinje-celler.

Eksempel 13

Konvensjonelle immunutfellinger ved anvendelse av pc43-spesifikke, polyklonale antistoffer og monoklonalt antistoff 38I2C ble utført for å identifisere proteiner som rea-gerte med pc43 i L-celletransfektanter.

pc43- og kimære pc43-transfektanter ble metabolsk merket ved inkubasjon av cellene i Dulbeccos modifiserte Eagles-medium inneholdende [<35>S]-metionin (50 uCi/ml) over natten. Etter vask ble transfektantene lysert med PBS inneholdende "Triton X 100" og inkubert med anti-pc43-antistoff. Im-munkompleksene ble deretter oppsamlet ved anvendelse av pro-

tein A-11 Sepharose "-kuler. De resulterende kuler ble vasket fem ganger med en vaskebuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, inneholdende 0,5 M NaCl, 0,1% ovalbumin, 0,5% NP-40, 0,5% "Triton X 100" og 1 mM EDTA) ved romtemperatur. Protein ble separert ved hjelp av SDS-PAGE og underkastet autoradiografi.

Det kimære pc43 ble utfelt sammen med 105 kDa- og et 95 kDa-bånd som sannsynligvis tilsvarer henholdsvis a- og £-kateniner, fordi anti-a-katenin- og anti-p-katenin-antistoffer farget sammenlignbare bånd. På den annen side ble pc43 utfelt sammen med et 120 kDa-bånd.

Claims (18)

1. Renset og isolert polynukleotidsekvens, karakterisert ved at den koder for det humane protocadherin pc3 som angitt i SEQ ID nr: 110.

2. Polynukleotidsekvens ifølge krav l, karakterisert ved at den er en DNA-sekvens.

3. DNA-sekvens ifølge krav 2, karakterisert ved at den er en cDNA-sekvens.

4 . DNA-sekvens ifølge krav 2, karakterisert ved at den er en genomisk DNA-sekvens .

5. DNA-sekvens ifølge krav 2, karakterisert ved at den er helt eller delvis kjemisk syntetisert.

6. Polynukleotidsekvens ifølge krav l, karakterisert ved at den omfatter sekvensen ifølge sekvens-ID nr. 109 som koder for humant protocadherin pc3.

7. Biologisk funksjonell DNA-vektor, karakterisert ved at den omfatter en DNA-sekvens ifølge krav 2.

8 . Vektor ifølge krav 7, karakterisert ved at DNA-sekvensen er opera-tivt bundet til en ekspresjonskontroll-DNA-sekvens.

9. Vertscelle, karakterisert ved at den er transformert eller transfektert med en DNA-sekvens ifølge krav 2 på en måte som tillater ekspresjon i vertscellen av et protocadherinpolypeptid.

10. Fremgangsmåte for fremstilling av et protocadherinpolypeptid, karakterisert ved trinnene med dyrkning av en vertscelle ifølge krav 9 i et egnet næringsmedium og isolering av protocadherinpolypeptidet fra cellen eller fra cel-levekstmediet.

11. Renset og isolert, humant protocadherin pc3-polypep-tid som angitt i SEQ ID nr: 110.

12. Antistoffmateriale, karakterisert ved at det er spesifikt for humant protocadherin pc3 som angitt i SEQ ID nr: 110.

13. Antistoffmateriale ifølge krav 12, karakterisert ved at det er et monoklonalt antistoff.

14. Hybridomcellelinje, karakterisert ved at den produserer et monoklonalt antistoff ifølge krav 13.

15. Protocadherinantistoffmateriale ifølge krav 12 eller ■13 for anvendelse i en terapeutisk intervensjon■av celle-celleadhesjon og/eller regulatoriske aktiviteter av humant protocadherin pc3 omfattende at nevnte protocadherin bringes i kontakt med nevnte antistoffmateriale.

16. Protocadherin pc3-fragment omfattende ett eller flere ekstracellulære domener av pc3 for anvendelse i en terapeutisk intervensjon av celle-celle-adhesjon og/eller regulatoriske aktiviteter av humant protocadherin pc3 som angitt i SEQ. ID. nr.-. 110, omfattende at nevnte protocadherin bringes i kontakt med nevnte protocadherinfragment.

17. Antistoffmateriale ifølge krav 12 eller 13 som er spesifikt for humant protocadherin pc3 for anvendelse i en terapeutisk fremgangsmåte for modulering av bindingsaktiviteten av humant protocadherin pc3, omfattende at nevnte protocadherin bringes i kontakt med nevnte antistoffmateriale.

18. Protocadherin pc3-fragment, omfattende ett eller flere ekstracellulære domener av humant protocadherin pc3 med SEQ. ID. nr. 110 for anvendelse i en terapeutisk fremgangsmåte for modulering av bindingsaktiviteten av humant protocadherin pc3, omfattende at nevnte protocadherin bringes i kontakt med nevnte protocadherinfragment.