CN101492673B

CN101492673B - 非洲爪蟾xpapc基因启动子及其组织特异性增强子

Info

Publication number: CN101492673B
Application number: CN2008100330862A
Authority: CN
Inventors: 丁小燕; 王金虎; 娄鑫
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority date: 2008-01-25
Filing date: 2008-01-25
Publication date: 2012-01-11
Anticipated expiration: 2028-01-25
Also published as: CN101492673A

Abstract

本发明属于分子生物学领域，公开了非洲爪蟾XPAPC基因启动子，其具有SEQ ID NO：1中所示的核酸序列或序列片段。本发明还公开了含有所述启动子的表达载体。本发明还公开了利用所述的启动子表达目的基因的方法。本发明的启动子包含了指导XPAPC在从原肠早期到尾芽期特异表达所需的调控元件，从而可用于研究在胚胎发育期间特定基因(如XPAPC)的表达调控情况以及其它因素对特定基因的表达。

Description

非洲爪蟾XPAPC基因启动子及其组织特异性增强子

技术领域

本发明属于分子生物学领域，更具体地，本发明涉及非洲爪蟾非洲爪蟾轴旁原钙粘连蛋白基因(Xenopus Paraxial Protocadherin(XPAPC))启动子及其用途。

背景技术

细胞生物的早期发育中，原肠运动是最基本的形态发生事件之一。通过原肠运动中精细调控的大规模细胞迁移和重排，胚胎的体轴得以建立，即将形成的三个胚层的边界也得以确定。非洲爪蟾Xenopus laevis作为两栖动物的代表被广泛地使用来研究原肠运动中细胞的运动和分子机制。通过使用各种显微成像技术，非洲爪蟾胚胎原肠运动中的细胞迁移已经被详细地观察和描述。然而，关于这些运动的动力来源和调控这些运动的分子机制还所知不多。

在非洲爪蟾胚胎中，包括原钙粘连蛋白(Protocadherin)、整联蛋白(integrins)和纤连蛋白(fibronectin)在内的结构分子都参与原肠运动中的细胞迁移。非洲爪蟾的Xenopus Paraxial Protocadherin(XPAPC)基因是一个原钙粘连蛋白基因，它在进行原肠运动的胚胎中首先表达在Spemann组织者(Spemann organizer)，随后表达在轴旁中胚层。先前的研究表明XPAPC在原肠运动中能促进汇聚伸展运动(convergent extension，CE)，此外，XPAPC也参与中胚层和内胚层之间的组织分离(tissue separation)、体节形成(somitogenesis)以及器官发生(organogenesis)。与其它的粘附分子类似，XPAPC作为细胞结构分子的同时也作为信号通路的成员参与生物学事件。最近的研究工作揭示XPAPC通过与非经典Wnt信号通路相互作用以及下调细胞内C-cadherin分子的粘附能力来调控细胞的粘附能力和迁移。此外，Chung等人最近发现XPAPC与FGF信号通路的下游基因ANR5在原肠运动中存在具有生物学意义的相互作用。然而除了Wnt5a和Lim1被研究证实能激活XPAPC的表达之外，关于XPAPC的表达调控机制仍然是一个有待研究的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供非洲爪蟾近轴原钙粘连蛋白基因(XPAPC)的启动子及其用途。

本发明的另一目的在于提供含有所述启动子的表达载体和宿主细胞。

在本发明的第一方面，提供一种分离的核酸(启动子)序列，所述核酸序列选自下组：

(1)具有SEQID NO：1中所示的核酸序列；

(2)具有SEQ ID NO：1中第(50±49)-(4724±49)位所示序列的核酸序列(较佳是由SEQ ID NO：1第(50±49)-(4724±49)位所示序列组成的核酸序列)；或

(3)与(1)或(2)限定的核酸序列有95％以上(优选99％以上)相同性且具有指导目的基因表达功能的核酸序列。

在另一优选例中，(2)项中，具有SEQ ID NO：1中第(20±19)-(4754±19)位所示序列的核酸序列。更优选的，是由SEQID NO：1中第(20±19)-(4754±19)位所示序列组成的核酸序列。

在另一优选例中，(2)项中，具有SEQ ID NO：1中第(10±9)-(4764±9)位所示序列的核酸序列。较佳是由SEQ ID NO：1中第(10±9)-(4764±9)位所示序列组成的核酸序列。

在本发明的第二方面，提供一种载体，所述的载体含有所述的核酸序列，作为启动子元件。

在另一优选例中，所述的载体还含有与所述的核酸序列可操作地连接的目的基因序列。

在另一优选例中，所述的目的基因是外源基因。

在另一优选例中，所述的目的基因序列位于所述核酸序列的下游，且是与所述的核酸序列直接邻近的编码基因的序列。

在另一优选例中，所述的核酸序列与目的基因序列的间隔是0-100bp(优选的，为0-50bp；更优选的，为0-20bp)。

在另一优选例中，所述的目的基因包括(但不限于)：轴旁原钙粘连蛋白基因(Paraxial Protocadherin(PAPC)、荧光素酶基因、荧光蛋白基因。

在另一优选例中，所述的轴旁原钙粘连蛋白基因(Paraxial Protocadherin(PAPC)是非洲爪蟾近轴原钙粘连蛋白基因(Xenopus Paraxial Protocadherin(XPAPC))。

在本发明的第三方面，提供一种细胞(优选遗传工程化的细胞)，所述的细胞含有所述的载体。

在本发明的第四方面，提供所述的核酸序列的用途，所述的核酸序列用于作为启动子元件，指导目的基因的表达。

在另一优选例中，所述的核酸用于指导目的基因按照轴旁原钙粘连蛋白基因体内表达方式表达。

在另一优选例中，所述的目的基因包括(但不限于)：轴旁原钙粘连蛋白基因(Paraxial Protocadherin(PAPC))、荧光素酶基因、荧光蛋白基因。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了XPAPC上游DNA序列的分子克隆和转录活性分析。

(A)不同XPAPC启动子缺失构建体的荧光素酶活性。

(B)检测XPAPC基因组序列是否存在内含子。

图2显示了转基因胚胎中启动子驱动的GFP mRNA的表达在空间和时间特异性上重演内源性XPAPC的表达。

(A-E)内源性XPAPC mRNA在各期(St)的表达。

(F-J)pFL GFP在同时期转基因胚胎中的表达。

其中，(A-B和F-G)背面朝上，从植物极看；

其中，(C和H)神经轴胚前面朝上，背面观；

其中，(D和I)神经轴胚前面在左侧，侧面观；

其中，(E和J)蝌蚪的侧面观，前面在左侧。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，首次从爪蟾基因组中分离到一种核酸，该核酸位于非洲爪蟾近轴原钙粘连蛋白基因(XPAPC基因)的上游，将其作为启动子元件，可指导目的基因(如报告基因)的表达。所述的核酸包含了指导XPAPC在从原肠早期到尾芽期特异表达所需的调控元件，从而可用于研究在胚胎发育期间特定基因(如XPAPC)的表达调控情况以及其它因素对特定基因的表达。在此基础上完成了本发明。

如本文所用，所述的“启动子”或“启动子区(域)”是指一种核酸序列，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’端)，能够引导核酸序列转录为mRNA。一般地，启动子或启动子区提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。在本文中，所述的启动子或启动子区包括启动子的变体，其通过插入或删除调控区域，进行随机或定点突变等来获得。

如本文所用， “分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，所述的“可操作地连接”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。

启动子及其指导的基因表达

本发明人在研究过程中，首次从XPAPC基因的上游克隆到一段可良好地指导外源基因表达的核酸(启动子)，利用该启动子来指导报告基因的表达，可良好地模拟XPAPC的内源表达情况。在本发明的实施例中，本发明人证明了利用所述启动子指导的GFP的表达能够完全模拟内源XPAPC的表达，说明该片段包含了指导XPAPC在从原肠早期到尾芽期特异表达所需的所有调控元件，从而改变了目前现有技术中具体体内对XPAPC基因有调控作用的核酸序列未知的现状。

因此，本发明提供一种分离的核酸(启动子)，所述的核酸具有：SEQ ID NO：1所示的序列，或具有SEQ ID NO：1中第(50±49)-(4724±49)位所示的核苷酸序列，所述的核酸可作为指导目的基因表达的启动子元件。

此外，本发明还包括上述核酸的一些具有相同功能的变异体。包括：序列与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：1中第(50±49)-(4724±49)位所示的序列有95％以上(优选99％)同源性且具有指导目的基因表达功能的核酸。

本发明的启动子可以被可操作地连接到目的基因上，该目的基因相对于启动子而言可以是外源(异源)的。所述的目的基因通常可以是任何核酸序列(如一种结构性核酸序列)；所述的目的基因优选编码具有特定功能的蛋白，例如某些具有重要特性或功能的蛋白；或者所述目的基因是在转录或表达后可以发挥指示作用的基因，如报告基因。

例如，所述的目的基因包括但不限于：非洲爪蟾轴旁原钙粘连蛋白基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因。

本发明的启动子还可以被可操作地连接到被改进的目的基因序列上，该目的基因相对于启动子是外源(异源)的。所述的目的基因可以被改进来产生各种期望的特性。例如，目的基因可以被改进来增加必需氨基酸的含量，提高氨基酸序列的翻译，改变翻译后的修饰(如磷酸化位点)，将翻译产物转运到细胞外，改善蛋白的稳定性，插入或删除细胞信号等。

此外，启动子和目的基因可以设计成下调特定基因。这一般是通过将启动子连接到目的基因序列上来实现，该序列以反义反向被引导。本领域的普通技术人员熟悉这种反义技术。任何核酸序列可以以这种方式被调节。

本发明的启动子还可用于指导外源基因的表达，研究中胚层发育以及内耳发育过程中重要分子的功能、发育缺陷动物模型的建立以及发育缺陷的基因治疗等。

本发明的启动子和目的基因序列可被包含在重组载体中。

所述的重组载体一般包括(从5’到3’方向)：引导目的基因转录的启动子，和目的基因。如果需要，所述的重组载体还可以包括3’转录终止子，3’多聚核苷酸化信号，其它非翻译核酸序列，转运和靶向核酸序列、抗性选择标记、增强子或操作子。

用于制备重组载体的方法是本领域技术人员所熟知的。术语“表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可以被采用的。优选的，所述的表达载体是真核表达载体。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含有本发明所述的启动子和/或目的基因序列的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，所述的标记基因如二氢叶酸还原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性等。

重组载体中除了含有本发明的启动子，还可含有一种或多种其它启动子。所述的其它启动子例如是：组织特异性的、组成型的或诱导型的。

作为本发明的一种实例，所述的载体是pGL3-Basic，其本身含有编码荧光素酶基因的序列。通过改造，即利用pGL3-Basic上的多克隆位点，可将本发明的启动子区域构建到荧光素酶编码基因的前面，转化宿主细胞，启动子将激活荧光素酶编码基因的表达，所述启动受到启动子区各顺式作用元件的调控，模拟了基因在体内被激活转录的状况。

包含上述适当的启动子和目的基因的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，或转化入受精卵或胚胎内，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，酵母，动物的组织细胞等。受精卵或胚胎可以是两栖类动物的受精卵或胚胎，例如是非洲爪蟾的受精卵或胚胎。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子或宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

重组DNA转化受精卵或胚胎的方法也是本领域已知的，通常可采用显微注射技术。例如可按照Kroll KL等(1996).Transgenic Xenopus embryos fromsperm nuclear transplantations reveal FGF signaling requirements duringgastrulation.Development 122：3173-3183所描述的方法进行转基因操作。用作转基因的质粒可预先进行线形化。

在本发明的实例中，在所述的启动子的指导下，可以使荧光素酶(Luciferase)基因和绿色荧光蛋白(GFP)基因良好地表达。因此可见，本发明的启动子在基因表达调控的研究中具有重要的应用价值。

在本发明的实例中，将全长的XPAPC启动子荧光素酶分析质粒中荧光素酶的编码序列用绿色荧光蛋白的编码序列替换后，得到了用于制备转基因爪蟾胚胎的报告质粒。本发明人制备了不同时期的转基因爪蟾胚胎并用反应GFP表达的探针进行了原位杂交实验。结果表明，在不同时期的转基因爪蟾胚胎，XPAPC启动子可指导的GFP的表达模式与内源的XPAPC表达模式非常相似，这说明本发明人得到的XPAPC启动子中包含了知道XPAPC在爪蟾胚胎早期表达所需要的所有重要顺式作用元件。

本发明的主要优点在于：

揭示一种可指导目的基因表达的启动子，利用本发明的启动子可以研究在胚胎发育期间特定基因(如XPAPC)的表达调控情况以及其它因素(如一些信号通路)对特定基因的表达。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1胚胎培养和转基因方法

非洲爪蟾胚胎培养操作：受精卵的培养如Fang PF等(2004)，Multiplesignaling pathways control Tbx6 expression during Xenopus myogenesis.Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai)36：390-396中所描述的，分期依照Nieuwkoop和Faber(Normal Table of Xenopus Laevis，Garland Publishing，1994)中所述。

非洲爪蟾转基因胚胎制备：按照Kroll KL等(1996).Transgenic Xenopusembryos from sperm nuclear transplantations reveal FGF signalingrequirements during gastrulation.Development 122：3173-3183所描述的方法进行转基因操作，获得了转基因的胚胎。用作转基因的质粒用SmaI消化以线形化。每个质粒都进行了3轮独立的转基因操作。

实施例2 XPAPC 5’上游调控序列的克隆

由于非洲爪蟾的基因组序列还未被测序完毕，本发明人通过独特设计克隆了XPAPC的上游调控序列，具体如下：

基因组DNA分离：取2g成年雄性爪蟾新鲜肝脏组织，放入研钵加入液氮研磨充分，用酚/氯仿法抽提两遍，取上清用乙醇沉淀，75％乙醇洗一遍，干燥，溶解在去离子水中，分光光度计定量。

连接：取1μg基因组DNA用10 U的EcoR I消化过夜，取消化后1μg基因组DNA与50mM PCR接头用T4 DNA连接酶16℃连接过夜，后用乙醇沉淀回收，溶解在20μl去离子水中。

PCR采用的引物如下：

AP1(SEQ ID NO：2)：5’-GTAATACGACTCACTATAGGC-3’；

AP2(SEQ ID NO：3)：5’-ACAATAGGGCACGCGTGGT-3’；

GSP1(SEQ ID NO：4)：5’-CAACACTGCAATTACAGTGCCAGGGGGTTCTTCTTC-3’；

GSP2(SEQ ID NO：5)：5’-GAGAAGCAGCATCTTGAAGAATCAAAGTTGCACC-3’。

AP1和AP2的引物基于基因组步行(Genome Walker)接头系统。

两轮接头PCR(Adaptor PCR)分离增XPAPC 5’上游序列：

第一轮，采用50μl体系，用量如下：

10×缓冲液 5μl；

dNTP 250μl；

GSP1 10pM；

AP1 10pM；

连接了接头的消化后基因组DNA 100ng；

LA Taq聚合酶 2.5U；

去离子水补足至 50μl。

PCR程序：

变性 94℃ 3分钟；

第一步10个循环：变性 94℃ 30秒；

退火 70℃ 30秒；

延伸 72℃ 5分钟；

第二步30个循环：变性 94℃ 30秒；

退火 60℃ 1分钟；

延伸 72℃ 5分钟；

最后延伸 72℃ 10分钟。

第二轮PCR：将第一轮PCR产物稀释100倍按以下比例加样，用量如下：

10 ×缓冲液(加Mg²⁺) 5μl；

dNTP 250μl；

GSP2 10pM；

AP2 10pM；

第一轮PCR产物稀释100倍 100ng；

LA Taq聚合酶 2.5U；

去离子水补足至50μl。

用第一轮相同程序进行PCR。

将第二轮PCR的产物用1％琼脂糖胶分离，鉴定发现4.3kb处有单一条带，割胶回收，装入T-easy载体(Promega)，测序。

结果，长度为4914bp的DNA片段被克隆，如SEQ ID NO：4所示。将其与已公开的Xenopus PAPC基因的5’区域(参见Kim SH等(1998)，The role ofparaxial protocadherin in selective adhesion and cell movements of themesoderm during Xenopus gastrulation.Development 125：4681-4690)有143bp的重叠。

实施例3含启动子及报告基因的载体的构建

前述获得的PCR扩增片段常规方法纯化后，通过常规PCR方法获得SEQ IDNO：1中第1-4773位序列且两端携带XhoI/HindIII酶切位点的片段，插入到XhoI/HindIII消化的PGL3-Basic(Promega，自带荧光素酶编码基因)中，得到p-4773Luc构建体。

本发明人还利用XbaI/HindIII酶切消化p-4773Luc，将其中的荧光素酶基因去除，回收经加工的质粒；同时将绿色荧光蛋白(GFP)的编码序列(GFP编码序列是从pCS2-GFP质粒(获自Ralph Rupp实验室)上用XbaI和HindIII切下)装入到经前述经加工的载体中，得到转基因所用质粒p-4773GFP。

本发明人还构建了由SEQ ID NO：1中第1-2920位序列构成的片段，采用前述相同方法将该序列分别装入PGL3-Basic和绿色荧光蛋白(GFP)报告质粒中的，从而获得测试质粒p-2920Luc和p-2920GFP。

上述构建的荧光素酶报告质粒将被用于确定报告基因的活性，而绿色荧光蛋白报告质粒将被用于进行爪蟾转基因胚胎实验。

实施例4启动子的转录调控分析

为进行荧光素酶分析，将含有25pg不同荧光素酶测试质粒和25pg内标报告基因pRL-SV40(购自Promega)的2nl溶液(溶剂为DEPC水)注射进四细胞期胚胎的动物极。

为了分析所得到的XPAPC 5’上游序列是否具有转录活性，将前述构建的p-4773Luc、p-2920Luc载体、PGL3-Basic空载体(各25pg，2nl)和内参对照pRL-SV40(25pg，2nl)分别注射到四细胞期的爪蟾胚胎动物极中，在第8.5期左右分离动物极帽，然后培养至12.5期，检测报告基因的荧光素酶活性。荧光素酶分析用Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega)进行。

结果见图1A，显示XPAPC 5’上游序列片段有转录活性。

在真核生物中，内含子(intron)，特别是第一个内含子，也有可能参与基因表达的调控。为了检测XPAPC的基因组序列中是否存在内含子，本发明人进行了基因组PCR。

结果如图1B所示，在加入了特异结合于XPAPC开放阅读框(open readingframe)起始位置和终止位置的引物(上游：TTG TTT TAA ATG ACT GCAGGT CTG GAA GGA(SEQ ID NO：6)；下游：CAG TTC CCA TTT TCT GGACCC TTG TTG A(SEQ ID NO：7))的PCR反应中，仅有一条长度为3.6kb的片段可以被扩增。通过将这个片段进行DNA测序表明XPAPC基因组序列与其他的一些原钙粘蛋白一样不包含内含子。

为了检测所得到的XPAPC 5’上游调控序列是否能指导报告基因GFP在非洲爪蟾胚胎中的表达，本发明人利用SmaI将包含上游调控序列的质粒p-4773GFP(pFL-GFP)线性化，转入到爪蟾胚胎中，然后通过原位杂交检测报告基因GFP在胚胎发育过程中的表达情况，并检测未转化胚胎的内源性XPAPC的表达情况。XPAPC和GFP的转录用整体原位杂交的方法分别用XPAPC或GFP探针检测。

mRNA模板的准备依照文献Fang PF等(2004)，Multiple signalingpathways control Tbx6 expression during Xenopus myogenesis. ActaBiochim Biophys Sin(Shanghai)36：390-396中所描述的。胚胎的原位杂交利用地高辛(DIG)-标记的XPAPC或GFP探针(XPAPC探针参照Kim SH等，The roleof paraxial protocadherin in selective adhesion and cell movements ofthe mesoderm during Xenopus gastrulation.Development 125：4681-4690.中所描述的；GFP探针系将pCS2-GFP线性化后，用T7 RNA聚合酶体外转录得到)，依照Harland RM. 1991.In situ hybridization：an improvedwhole-mount method for Xenopus embryos.Methods Cell Biol 36：685-695中所记载的进行。杂交胚胎用漂白液(含1％过氧化氢的0.5×SSC和5％甲酰胺)荧光灯下处理。

结果发现，在非洲爪蟾胚胎中，XPAPC最早从原肠运动开始前一个半小时的囊胚晚期开始表达(9.5期(St9.5))。在这个时期，应用整体胚胎原位杂交可以在背方边缘带检测到XPAPC的表达(图2A)。在原肠胚的早期(10期)，XPAPC的表达扩展到整个边缘带并且呈现出背方多而腹方少的模式(图2B)。随着原肠运动的进行，XPAPC在背方中线的表达随着轴中胚层(脊索，notochord)开始发育而下调。当中胚层皮层在13期被完全内卷后，XPAPC mRNA在前方的表达有一条清晰的边界将头部和躯干中胚层分开(图2C)。一旦体节形成(somitogenesis)开始，XPAPC的表达将在成熟的体节中下调而条带状的表达会向胚胎后方移动(图2D)，这样的循环直到体节形成结束才停止，此后XPAPC的表达维持在尾部的尖端上(24期)(图2E)。除了在中胚层的表达以外，从17期开始，XPAPC也在头部两侧即将形成耳蜗的位置表达(图2D)，其后随着耳蜗的发育和内卷，XPAPC的表达也更加局限在耳蜗的区域，当耳杯形成以后，XPAPC会表达在杯状结构的内部(图2E)。

在进行了转基因操作而将线性化的pFL-GFP报告质粒整合到基因组中的爪蟾胚胎中，GFP的表达模式不管是在原肠运动中的中胚层还是在发育的耳蜗之中，都与内源的XPAPC表达非常相似(图2F到J)。说明具有SEQ ID NO：1中第1-4773位序列的启动子包含了指导XPAPC在从原肠早期到尾芽期特异表达所需的调控元件。

此外，本发明人通过类似的方法，利用p-2920GFP质粒，验证发现SEQ IDNO：1中第1-2920位序列的启动子可以指导GFP表达，但表达与内源的XPAPC表达不同，这是由于该序列中缺乏某些调控元件造成的。

此外，本发明人通过类似的方法，验证了由SEQ ID NO：1中第3-4769位序列构成的核酸也具有类似于第1-4773位序列的活性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>非洲爪蟾XPAPC基因启动子及其组织特异性增强子

<130>080302

<160>7

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>4914

<212>DNA

<213>非洲爪蟾(Xenopus laevis)

<400> 1

tagcaagaag gcaggggagg cagttcgggg agatgagtca ccccgaagaa cagaagattt 60

gtcgacgggc gactaatctt ccagaattgc agcatgtgtc tcagccctta cagagtcggt 120

gaccaacccc cgcacccccc ctccccaaag ctactttaga aggtgaaaca ggaaacttta 180

aactttaata ttaaaaaaac agtcgcacat agaaaataga aagtaattga aaaaagtctt 240

tatttctggt aaactatctg gaaccaactg aagttaaaaa aaagtgttgg aaggtaaaca 300

gcccttttaa tgcatcagcc ataattgcat caggcgcatc atggtgggca aaaaaacatg 360

gtgcagggcg gacaaaataa atggtggctt gtgttgtgtt gaccttgcac tggaaaatga 420

accctagatg tattgttatt actaatatta agcacatgtt gctgtagaat tactagcaga 480

aagtacagag aacattaatt caagttcaga ccgatagaag atggacaaga ccttactcaa 540

gggagcttac agtctagatg attaatcctc ttggtgccaa cagtgtgtac agtaaaaacg 600

tgttaaacag ttaatcagct ccgccagctt gtttctaagc atttctaagt agctgccaaa 660

tttcttatta ggttgttatt cccattatgc tttaaacctt aaaaatccaa tgttctggtc 720

taatgtaaaa ggaaagtatc tctgtcactt gtttttaaga caacactctg ccctgtgggt 780

gactattgtc ccttttcgtg accgcacatt gcaagaaact ccctaccaaa ctgtgcaagt 840

ggaacaaatt gccattcctt catgtgtcta ggtgccaagt ttgttgccta agtgtttttt 900

ctaaatagac tggccttttg ggtgttttct ggacattatc tctaagaagg accatttaat 960

taaatgacgg aaggatttgc accaaaagac ttggacaatg catacaccat atggaaaaat 1020

gtaagctcac atggagcaaa tgttgtacaa cttactctcg atatttgtct gatattaaat 1080

ctgggtcaaa tgttcgtaaa aaatcatctc tctctacaac aaattctgca gaatacattg 1140

ggcttgctag ttctcctacc atgggcttgt tgtacattta ggaaaggctt tggggtattt 1200

aataccattt gttcaacaag taggccttgt atcctagttg aaatatagac attgtggcta 1260

ataagacctg aggcactagg gatataatta cctattcagt tctaattgat gatcttaaga 1320

agggtactct aatcaatgca gtgttttgtg tactcaagtg aatagccttg taatggacga 1380

ggacctcctc ctgccttgaa tgggaaattg taagtcttat tcttttagta gttgtttatt 1440

aggattgtct acacacactt ccacccactc attctgtaca aatatacaca tataagcaca 1500

agttatattt attgccatgc ctaaatgctt gtctgtttct atattacaga ctgtgtattg 1560

gctataatta aagggaatgt tgattttttt tatcagggtt ttttttcaga gcggcactgt 1620

ttatgcattg tgtttgttgt gcaatccaca gatgtcaggc actgggctat actagtcgtt 1680

ggagacaaaa ggtagacagc aggcaaatac aacatttaag gcaatgccat agggacaatt 1740

atgcttgaac tgcattagtg attatcactg acctgcaacg ctttccatcc aagttgatgg 1800

gatgcaactt ctagtacttg tgtgccatgc ataggggtaa aacaacagtg gaagcagacc 1860

ctgtgactgc tgaagagccc ccagagtttt aggggtctag tggagcagta attaataagc 1920

gctttcaata tatacttttg aaaattgtct tattctgagg ttcagtgaac cataaaatga 1980

ttttcatgac tcaataactt ctagtccagt ggccatgcac tgttttgctg catatggagc 2040

atggactaat tttgcgctgt atagctgttc ttctattcca tttccaatta aagtattgac 2100

ctgcacgtgg catgtgtatt tggtaatact ggtatgggaa cccttaccca gaacctgtta 2160

tccagatagt tccgatttac aggaaggcca tgttccatag actccatttt atctaaataa 2220

tccagatttt tatcaactat ttcctttatc tctgtaaggt tacagacaca cgctaagatt 2280

cagggagatt tagtcacctc ttcttcggac gactaatctc cccgaaaagc cttcctgccg 2340

gctagaatct gaatcgctgg caggatgata agcggaccaa cttgttttca gaagtcgccc 2400

aacgttgcct cacaaggaga ctttgggcaa ttttggaaaa caaatcgttc cgagtgccac 2460

tctgccggtg atttagattt tagccggcgg aaaggctttt cggggagatt agtcgccgga 2520

agaagaggcg ataaatctcc ccgaatctta gcgtgtgctc ttaccctaat aataaaatag 2580

tagcttgtac ttgatccaaa ctaagatata attaatcctt attgaaggca aatccaagct 2640

attgggttta ttaaatgttt acatgatttt ctagtatact taaggtatga agatccaaat 2700

tacggaaaaa tcagttaccc agaaaacccc aggtcccgag cattatgtat agcattctat 2760

atagcaggaa tattgcatac ctgcatatac aacttaaacc catcatataa aaataaaaaa 2820

tgtgtatctc cttgtgtatc ctttcattag atggagtgtg aattgtaatt aaccccttaa 2880

ctcttggcat gtttttctac aggaaacaaa ctgcaatacg atcatataac acaggcagcc 2940

tcaccacatc ctaccttcaa agctcacagg atatgttaat gtccatgtca ttggcaccaa 3000

aggatttatg ttgagcagag cagagacacc attgtctctt cttaaataaa cactattagc 3060

tgtggaatga aattagcaca ggataaattg ctctttaatt aaaaatttca attactataa 3120

atcaacatac tgcagtgggg ctaaagttat acactgtacc ctgcccctga aagtcagact 3180

actgacatat acatatttat atttttatta ttatatttat ctctatctta cttaaattta 3240

ggtgcacatt tattcttgct tttttggcac aggtaacaaa catttctaaa gttactaatc 3300

atttttgtac attgctaccc atttacccaa cgacaattat tgctggttca gtaagtaaga 3360

taagacttac attcaaagca tataagatta gttaaccaga aacccattaa ccagaaagtt 3420

cagaattaca ggaaggccat ctcccataga gtctatttta ataaaataat gtacattttt 3480

aaaaatgatt tccttttttt ctattataat aacacagtag cttatacttg atccttacta 3540

agacataatt aatcctattg gtagtgatgg gagaaattgg ggcattttgc ttcgccgaaa 3600

aatgtgcgaa tttcccgcga aacggcaaaa attcgcaaaa cggcgttggc gtccattttt 3660

ggcgccagac atcaaaaaat tcgcccatca ctacctattg ggtttattta atgtttaaag 3720

gattttttag ttgaccaaat cacagaaaga cccccttatc tggaaaacca caggttcatg 3780

agcattctgg ataacaggtc ccatacctgt acagtgaaaa tatttcaggg catttgtcct 3840

gtgcctctat aatcagagga gcccagaaaa atgtacaaag gacatataac gttgcttacc 3900

tattgttaaa tattttcaat agggatgtca gcagtttaag ctcttgcaga atcgtgtcag 3960

gtgattctgg gagttgtagt tcaataacag ctagagaaca gctaattaga accccctgat 4020

accctcccaa cttcattgca ttaaaaggat cccattcttc tcttcctatg cccctgttaa 4080

ggtaaacatt tttatccaat ctagcaccat tatggggttt tatataaaga tctaccttat 4140

gaatccccat aaatatgaca actaacaaaa aataggtaca gatgactgtt tttattttga 4200

gacttatagt aaacattttt atccaatcta gcacaattat ggggttttat ttaatgatct 4260

tccttatgaa tccccataaa tatgaccagt cacaaataat gtgtatggat gtttttagtt 4320

tgagactgtt aatattatac atttttagtt acaattcaag acaatgttat agactgtatg 4380

aacagagtat tatattctat caaatgtggt aaaaaatgaa aagcataata aattacatag 4440

taaaaaataa ggtatatcag aatatttctt taatttaatg aaattgtttt agtaacaaat 4500

attttgtttg ttgttcccac tcaagaatga ttctctgcat tgcgcttgct tctttatgaa 4560

acactgattt aaaatgaaac attgtcataa aatataacag tttgttggac ttccaagtga 4620

gacctatttg atgacagtct cattagctct gccccagtgc tcctttgtct ctggggaaag 4680

ggattggcta gaagtaagtt catttacata tcctctggga atataacctg ggggcagaga 4740

tggaaccaag cagacaaaca ggatcattcc tacagagatg aactccttga gattgtttta 4800

aatgactaca ggtctggaag gattcacatt gccacactgt ttctaggcag gaaaaaactg 4860

caagtttcaa ctttgttttt ggtgcaactt tgattcttca agatgctgct tctc 4914

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>2

gtaatacgac tcactatagg c 21

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>3

acaatagggc acgcgtggt 19

<210>4

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>4

caacactgca attacagtgc cagggggttc ttcttc 36

<210>5

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>5

gagaagcagc atcttgaaga atcaaagttg cacc 34

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>6

ttgttttaaa tgactgcagg tctggaagga 30

<210>7

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>7

cagttcccat tttctggacc cttgttga 28

Claims

1.一种分离的启动子，其特征在于，所述启动子选自下组：

(1)SEQ ID NO：1中所示的核酸；或

(2)SEQ ID NO：1中第1-4773位或第3-4769位所示的核酸。

2.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求1所述的启动子。

3.如权利要求2所述的载体，其特征在于，所述的载体还含有与所述的启动子可操作地连接的目的基因序列。

4.如权利要求3所述的载体，其特征在于，所述的启动子与目的基因序列的间隔是0-100bp。

5.如权利要求3所述的载体，其特征在于，所述的目的基因包括：轴旁原钙粘连蛋白基因、荧光素酶基因、或荧光蛋白基因。

6.一种细胞，其特征在于，所述的细胞含有权利要求2所述的载体。

7.权利要求1所述的启动子的用途，其特征在于，所述的启动子用于指导目的基因的表达。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的启动子用于指导目的基因按照轴旁原钙粘连蛋白基因体内表达方式表达。

9.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的目的基因包括：轴旁原钙粘连蛋白基因、荧光素酶基因、或荧光蛋白基因。