CN102978202A - 一种肌肉特异表达猪igf1基因的过表达载体 - Google Patents
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Abstract
本发明为一种猪骨骼肌中特异过表达猪内源IGF1(C1：Ea)基因的安全型表达载体。该载体包含猪内源性序列sk-α-actinPromoter/IGF1(C1:Ea)/sk-α-actin3’UTR/SV40增强子串联组成的表达盒。本发明的表达载体在细胞水平上验证了骨骼肌特异sk-α-actin启动子在成肌细胞中能高效表达，在具有成肌分化潜能的PEF细胞中仅低水平表达而在其他类型细胞中不表达。本发明中构建的载体制备转基因小鼠，通过定量PCR和WesternBlot检测出转基因小鼠骨骼肌中IGF1基因的mRNA和蛋白表达水平分别为野生型小鼠的15倍和3.5倍，并且仅在骨骼肌中高效表达。
Description
技术领域
本发明涉及一种安全型骨骼肌特异表达猪类胰岛素生长因子1(insulin-like growth factor1,IGF1)基因的过表达载体。
背景技术
在研究基因功能及转基因动物生产过程中，人们常常借助真核表达载体来实现，例如pcDNA3.0系列载体。传统方法往往通过分子生物学手段将目的基因片段连接到病毒启动子（如CMV启动子）或异源性强启动子下游，以指导外源基因表达。该方法在基因表达及功能的研究中有着极其广泛的应用，但诸多研究暴露了该手段不足的一面：异源性基因序列导入宿主常引起基因组序列的紊乱，内源性基因表达异常，甚至改变宿主固有的特征表型；也常常引起人们对转基因伦理问题的争论。此外，病毒启动子序列或指导质粒DNA复制等原核拢余序列的引入，易引起转基因安全问题，须经长期的生物安全评价才能投入实际应用，既费时又耗费财力。同时，普遍性过表达外源基因常引起机体生长等的异常。因此，在利用转基因技术进行动物遗传改造时，同一物种的内源基因序列，以及组织表达的特异性是保证转基因动物安全性的基础。
发明内容
本发明提供了一种猪内源性骨骼肌特异sk-α-actin启动子驱动的表达框架，以及含有该表达框架的猪骨骼肌特异过表达猪IGF1基因安全型表达载体。
本发明所述的猪内源性骨骼肌特异sk-α-actin启动子驱动IGF1基因的表达盒，是由依次串联的sk-α-actin启动子（sk-α-actin Promoter）、猪IGF1（C1：Ea）基因、sk-α-actin 3’UTR和SV40增强子组成；该表达盒序列如SEQ ID No.1所示。
本发明所述骨骼肌特异过表达猪IGF1基因安全型表达载体，含有上述的猪内源性骨骼肌特异sk-α-actin启动子驱动表达盒，是通过EcoRV酶切位点克隆到转座子载体pT2-HB中而获得；该表达载体的序列如SEQ ID No.2所示。
本发明中所述猪内源性骨骼肌特异sk-α-actin启动子驱动IGF1基因的表达盒是由依次串联的sk-α-actin启动子、猪IGF1（C1：Ea）基因、sk-α-actin 3’UTR和SV40增强子组成；所述猪内源sk-α-actin启动子为克隆测序的2602个核苷酸序列；所述sk-α-actin 3’UTR为克隆测序的751个核苷酸序列；所述猪IGF1（C1：Ea）基因CDS全长为393个核苷酸序列，具有GENBANK号为NM 214256.1的自5′端第13－405位核苷酸序列;所述SV40增强子为242个核苷酸序列，从pGL3-control载体自+1第2201-2442位核苷酸序列克隆获得。
所述表达载体安全性体现在载体表达调控元件及目的基因均克隆自猪内源序列，以及转座子载体序列为脊椎动物所特有，表达载体的核苷酸序列见序列表。
本发明中的骨骼肌特异过表达猪IGF1(C1：Ea)基因的安全型表达载体，在细胞水平上验证了骨骼肌特异sk-α-actin启动子在成肌细胞中能高效表达，在具有成肌分化潜能的PEF细胞中仅低水平表达而在其他类型细胞中不表达；本发明中构建的载体制备转基因小鼠，通过定量PCR和Western Blot检测出转基因小鼠骨骼肌中IGF1基因的mRNA和蛋白表达水平分别为野生型小鼠的15倍和3.5倍，并且仅在骨骼肌中高效表达，为制备安全、骨骼肌特异表达目的基因的转基因猪模型提供了平台。
附图说明
图1：PCR扩增sk-α-actin Promoter产物电泳图；
图2：PCR扩增sk-α-actin 3’UTR产物电泳图；
图3：PCR扩增猪IGF1(C1：Ea)cDNA产物电泳图；
图4：PCR扩增SV40Enhancer产物电泳图；
图5：表达载体元件连接示意图；
图6：pT2/α-actin-IGF1质粒酶切产物电泳图；
图7：pT2/α-actin-IGF1质粒图谱；
图8：pT2/α-actin-△IGF1骨架驱动报告基因GFP在各组细胞中表达；
图9：pIGF1转基因鼠PCR检测外源基因；
图10：pIGF1转基因鼠SOUTHERN BLOT检测外源基因；
图11：荧光定量检测IGF1基因在转基因小鼠组织器官中的表达；
图12：Western Blot检测IGF1基因在转基因小鼠组织器官中的表达；
图13：Western Blot检测IGF1基因在转基因小鼠骨骼肌中的表达。
具体实施方式
下述实施例中提到的实验方法，如无特别说明均为常规方法。
实施例I、骨骼肌特异表达猪IGF1载体的构建
1、特异表达载体基本构件的获得
（1）猪sk-α-actin Promoter特异片段的制备
以长白猪基因组DNA为模板，按表1中列举的扩增sk-α-actin Promoter的引物扩增骨骼肌特异sk-α-actin启动子片段。反应体系为50μl，5μL 10×Buffer、4μL 2.5mM dNTP、1μL 20μM引物sk-α-actin Promoter F、1μL 20μM引物sk-α-actin Promoter R（引物序列见表1）、0.5μL5 U/μL高保真LA Tag聚合酶，2μl长白猪基因组DNA模板，加超纯水至50μL（高保真酶购自TaKaRa Code：DR002A）。PCR扩增程序：95℃10s，60℃3min，循环35次。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测（如图1所示）。
PCR产物用QIAGEN琼脂糖凝胶试剂盒回收纯化（操作步骤见试剂盒说明），将纯化产物连入PCR克隆载体pMD19-T Vector（TaKaRa Code：D102A）,按要求步骤操作转化DH5α感受态大肠杆菌（购自北京全式金公司，货号CD201）；菌液涂琼脂糖凝胶板，于37℃培养箱中培养过夜；挑单菌落接种于液体LB培养基中培养，部分菌液送公司测序（invitrogen北京分公司）。测序结果表明含有sk-α-actin Promoter的重组载体，提取质粒备用。
（2）猪sk-α-actin 3’UTR特异片段的制备
以长白猪基因组DNA为模板，按表1中列举的扩增sk-α-actin 3’UTR的引物扩增骨骼肌特异sk-α-actin 3’UTR片段。反应体系为50μl，5μL 10×Buffer、8μL 2.5mM dNTP、1μL 20μM引物sk-α-actin 3’UTR F、1μL 20μM引物sk-α-actin 3’UTR R(序列见表1)、0.5μL5U/μL高保真LA Tag聚合酶，2μl长白猪基因组DNA模板，加超纯水至50μL（高保真酶购自TaKaRaCode：DR002A）。PCR扩增程序：95℃10s，60℃1min，循环35次。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测（如图2所示）。
PCR产物用QIAGEN琼脂糖凝胶试剂盒回收纯化（操作步骤见试剂盒说明），将纯化产物连入PCR克隆载体pMD19-T Vector（TaKaRa Code：D102A）,按要求步骤操作转化DH5α感受态大肠杆菌（购自北京全式金公司，货号CD201）；菌液涂琼脂糖凝胶板，于37℃培养箱中培养过夜；挑单菌落接种于液体LB培养基中培养，部分菌液送公司测序（invitrogen北京分公司）。测序结果表明含有sk-α-actin 3’UTR的重组载体，提取质粒备用。
（3）猪IGF1(C1：Ea)cDNA的克隆
以长白猪肝脏组织cDNA为模板，按表1中列举的扩增IGF1(C1：Ea)的引物扩增Ⅰ类Ea特异剪接体形式的IGF1CDS片段（GENBANK登录号为NM 214256.1的自5′端第13－405位核苷酸序列）。反应体系为50μl，5μL 10×Buffer、4μL 2.5mM dNTP、1μL 20μM引物IGF1(C1：Ea)F、1μL 20μM引物IGF1(C1：Ea)R（引物序列见表1）、0.5μL5U/μL高保真LA Tag聚合酶，2μl长白猪肝脏组织cDNA模板，加超纯水至50μL（高保真酶购自TaKaRa Code：DR002A）。PCR扩增程序：95℃10s，60℃1min，循环35次。PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测（如图3所示）。
PCR产物用QIAGEN琼脂糖凝胶试剂盒回收纯化（操作步骤见试剂盒说明），将纯化产物连入PCR克隆载体pMD19-T Vector（TaKaRa Code：D102A）,按要求步骤操作转化DH5α感受态大肠杆菌（购自北京全式金公司，货号CD201）；菌液涂琼脂糖凝胶板，于37℃培养箱中培养过夜；挑单菌落接种于液体LB培养基中培养，部分菌液送公司测序（invitrogen北京分公司）。测序结果表明含有IGF1(C1：Ea)的重组载体，提取质粒备用。
（4）SV40Enhancer特异片段的制备
以pGL3-control载体（Promega Code：E1741）为模板，按表1中列举的扩增SV40 Enhancer的引物扩增特异的真核表达增强子片段（pGL3-control载体自+1第2201－2442位核苷酸序列）。反应体系为50μl，5μL 10×Buffer、4μL 2.5mM dNTP、1μL 20μM引物SV40 EnhancerF、1μL 20μM引物SV40 Enhancer R（引物序列见表1）、0.5μL5 U/μL高保真LA Tag聚合酶，20ng pGL3-control载体为模板，加超纯水至50μL（高保真酶购自TaKaRa Code：DR002A）。PCR扩增程序：95℃10s，60℃30s，循环35次。PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测（如图4所示）。
PCR产物用QIAGEN琼脂糖凝胶试剂盒回收纯化（操作步骤见试剂盒说明），将纯化产物连入PCR克隆载体pMD19-T Vector（TaKaRa Code：D102A）,按要求步骤操作转化DH5α感受态大肠杆菌（购自北京全式金公司，货号CD201）；菌液涂琼脂糖凝胶板，于37℃培养箱中培养过夜；挑单菌落接种于液体LB培养基中培养，部分菌液送公司测序（invitrogen北京分公司）。测序结果表明含有SV40Enhancer的重组载体，提取质粒备用。
2、pT2/α-actin-IGF1特异表达载体的构建
（1）非转座子表达载体pA-actin-IGF1的构建
以pGL3-control vector（Promega Code：E1741）为骨架载体，用KpnI/MluI双酶切将sk-α-actin Promoter从克隆T载体上切下，连入骨架载体KpnI/MluI酶切位点处，构建成pGL3-1中间载体；再用NcoI/HpaI双酶切将sk-α-actin 3’UTR/SV40 enhancer片段从克隆T载体上切下，连接入中间载体pGL3-1的NcoI/HpaI酶切位点处，构建成pGL3-2中间载体；然后用EcoRI/NcoI双酶切将IGF1从克隆T载体切下，连入中间载体pGL3-2的EcoRI/NcoI酶切位点处，构建成pA-actin-IGF1表达载体。（连接酶购自Promega Code：M1804）
（2）pT2/α-actin-IGF1表达载体的构建
用内切酶EcoRV将包含sk-α-actin Promoter/IGF1(C1:Ea)/sk-α-actin 3’UTR/SV40 enhancer串联组成的的表达盒（图5）(命名为α-actin-IGF1)从pA-actin-IGF1表达载体上切出，用
QIAGEN琼脂糖凝胶试剂盒回收纯化（操作步骤见公司试剂盒）；α-actin-IGF1表达盒的序列如SEQ ID No.1所示，
同时用EcoRV酶切两侧含正反向转座元件的转座子载体pT2-HB（由Hackett教授（Unibersity of Minnesota,USA）惠赠，Zongbin Cui,Aron M.Geurts,Geyi Liu,Christopher D.Kaufman,Perry B.Hackett.StructureFunction Analysis of the Inverted Terminal Repeats of theSleeping Beauty Transposon.Journal of Molecular Biology,318(5):1221-1235.该载体在Hackett教授的实验室网站http://www.cbs.umn.edu/labs/perry/plasmids/plasmid.html有详细的图谱及序列信息），将α-actin-IGF1表达盒(含有IGF1(C1：Ea))的纯化产物与酶切后的载体pT2-HB连接构建成pT2/α-actin-IGF1表达载体。pT2/α-actin-IGF1质粒酶切鉴定结果如图6所示，pT2/α-actin-IGF1质粒图谱如图7所示。
表1：本发明中用于扩增载体构件的引物
实施例II、本发明的含骨骼肌特异sk-α-actin启动子驱动GFP的细胞水平表达检验
1、冻存细胞的复苏与培养
pEGFP-N1质粒(购自Clontech货号为PT3027-5)、pT2/α-actin-GFP质粒用QIAGEN纯化试剂盒胶回收，产物终浓度调整为500ng/ul用于细胞转染。
从液氮中取出装有猪胎儿成纤维细胞PEF（中国农业科学院北京畜牧兽医研究所细胞工程实验室自行分离培养）、小鼠C2C12细胞和猪PK15细胞（购自中国科学院细胞库）的冻存小管，立即投入37-40℃的温水中快速晃动，直至冻存液完全融解；在1-2min内完成复温；将细胞悬液移入无菌的离心管，加入5mL培养液，轻轻吹匀；将细胞悬液800-1000rpm离心5min，弃上清；向含有细胞沉淀的离心管加入1mL完全培养基，轻轻吹匀，将细胞悬液转入细胞培养瓶，加入适量的完全培养基进行培养。
2、细胞转染与筛选
将猪胎儿成纤维细胞PEF、小鼠成肌细胞C2C12细胞系和猪肾细胞PK15细胞系分别分成三组（转染空白pT2-HB质粒对照组、转染pEGFP-N1质粒阳性对照组、转染pT2/α-actin-GFP质粒组），每组2个重复。
转染前24h，向每孔含10%胎牛血清（购自GIBCO公司，货号：21640-079）的500μLDMEM高糖培养基（购自GIBCO公司，货号：12100-046）的24孔板中按0.5-2×105个细胞/孔分别接种三种细胞系，使细胞在转染前达到约90%的汇合；用50μL的无血清、无抗生素的培养基分别稀释0.8μg待转染DNA，并温和的混匀；使用前将脂质体温和摇匀，将2μLlipefectaminTM-2000加入50μL的无血清、无抗生素的DMEM培养基并轻轻混匀，于室温孵育5min；5min后，分别将50μL的各组DNA稀释液加入50μL的脂质体稀释液，轻轻混匀并于室温放置20min；将100μL的DNA脂质体混合物加入到准备好的孔内，轻轻来回晃动培养板，将其置于37℃、饱和湿度、5%CO2的培养箱中培养，于4h后用完全培养基代替转染培养基，完全培养24-36h后于495nm波长下观察绿色荧光的瞬时表达强度。
3、转染细胞绿色荧光表达强度鉴定
以广谱表达的CMV启动子的报告基因表达载体pEGFP-N1为阳性对照组，pT2-HB质粒为空白对照组，pT2/α-actin-GFP为实验组，分别转染(a)成肌细胞C2C12、(b)猪胎儿成纤维细胞PEF和(c)猪肾细胞PK15，转染24h后，荧光显微镜下观察荧光。结果发现：以pT2-HB质粒为空白组的三种细胞系中均无绿色荧光表达，pT2/α-actin-GFP转染的成肌细胞C2C12中的荧光强度明显高于对照组；而在猪胎儿成纤维细胞PEF中，pT2/α-actin-GFP转染组的荧光强度则明显低于对照组；在高度分化的猪肾细胞PK15中，pT2/α-actin-GFP转染组完全没有荧光的表达。（如图8所示）。结果表明实验中构建的表达载体具有较高的细胞类型特异性，证实了本实验中克隆的启动子能够介导外源基因在体内肌肉中特异高效的表达。
实施例III、含猪IGF1表达载体制备的转基因小鼠的验证
1、表达猪IGF1转基因小鼠的制备
将环状pT2/α-actin-IGF1质粒与表达转座酶的质粒pCMV-SB11按1∶1等摩尔浓度混合，利用原核显微注射法制备转基因小鼠。
2、转基因小鼠的整合检测
分别利用针对sk-α-actin Promoter(P 1)、sk-α-actin 3’UTR(P2)和pIGF1全长(P3)检测引物（见表2）检测转基因小鼠基因组DNA中相应载体元件的整合。
检测1中获得的转基因小鼠后代中外源基因的整合情况。PCR反应体系为20μl，2μL10×Buffer、2μL 2.5mM dNTP、1μL 20μM引物F、1μL 20μM引物R、0.5μL5 U/μL高保真Tag聚合酶，100ng小鼠尾组织DNA，加超纯水至20μL。PCR扩增程序：95°C 5min；94°C 30s，60℃30s，72°C 1min，循环30次，最后72°C延伸5min。PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出分别能扩增出sk-α-actin Promoter、sk-α-actin 3’UTR及pIGF1基因的鼠为转基因阳性鼠(图9)(图中，blank：阴性对照，正常鼠DNA为模板；1-20：为部分转基因鼠扩增条带，上图可见5、7、15-18号鼠能扩增出预期条带)。
以表2中为检测整合载体元件及标记探针产物的引物（合成探针引物见表2），按照试剂盒操作说明书体系加样；PCR运行程序如下：95℃5min，94℃30S，60℃1min，72℃1min，30个循环后72℃延伸5min（探针标记试剂盒购自Roche公司，货号：11175033910）。
以PCR产物为探针进行southen杂交检测，杂交前在95℃变性5分钟后立即冰水中冷却备用；大量抽提小鼠尾组织DNA（动物基因组DNA提取试剂盒购自Roche公司，货号：11814770001），用EcoRV酶切基因组，于1%琼脂糖凝胶电泳分离各酶切片段，每孔上样5ug；然后使DNA原位变性后转移到带正电荷尼龙膜上。按照试剂盒操作说明进行预杂交、杂交及X-光片曝光检测杂交信号（购自Roche公司，货号：11745832910）。检测结果（图10）表明，PCR检测阳性鼠样，southern杂交检测相应鼠能检测出相应条带（图中，+：为含目标基因的质粒DNA,作为阳性对照；1-9号样品所代表的转基因鼠为目标基因整合小鼠；—：为野生型小鼠的基因组DNA,作为阴性对照）。
3、小鼠组织总RNA提取及cDNA的制备
从2中筛出的阳性转基因小鼠正常饲养至16周龄，屠宰取各组织器官用于提取RNA，按照天根动物组织总RNA提取试剂盒（货号：DP431）操作说明，提取各组织细胞总RNA；按照Ferment反转录试剂盒（货号：K0441），将提取的总RNA反转录成cDNA。
4、IGF1转基因小鼠荧光定量PCR检测
以3中制备的cDNA为模板，分别以IGF1及小鼠β-actin基因为内参（扩增方法如实施例I的步骤1（引物见表2）），进行荧光定量PCR测定IGF1的表达量，上样体系按照ABI定量试剂说明书上样,反应体系为20μl，10μL 2×Mixturer(购自TaKaRa公司，货号DRR041A)、1μL 20μM上游引物、1μL 20μM下游引物、1μL cDNA，加超纯水至20μL。PCR扩增程序：95°C 30s，95°C 5s，60℃ 34s，循环40次，最后72°C延伸5min。
荧光定量检测结果如图11所示，在进行IGF1表达水平检测时，以野生型小鼠（对照组）肝脏组织表达量为基准，转基因小鼠骨骼肌中IGF1的表达量是对照组的15倍，而其他组织中IGF1的表达量与对照组相应组织中的表达量相当，证实转外源IGF1表达盒能特异高效地在骨骼肌中过量表达。
表2转基因鼠筛选鉴定及定量引物
5、IGF1转基因小鼠Western blot检测
从2和4中筛出的阳性转基因小鼠样品中提取总蛋白（总蛋白抽提试剂盒购自Thermo公司，货号：78510），经蛋白电泳、转膜后，用抗人IGF1一抗进行杂交检测（抗人IGF1抗体购自Abcam公司，货号：ab106836），并进行常规压片、曝光检测杂交信号。
Western blot检测蛋白表达结果如图12、图13所示，外源IGF1蛋白表达谱显示在转基因小鼠骨骼肌中高表达，同时在心肌中也有微量表达，而在其他组织中无表达；转基因小鼠骨骼肌中IGF1表达与正常小鼠骨骼肌中IGF1的表达水平相比，明显高于正常小鼠，对灰度值量化比较，发现转基因小鼠骨骼肌中IGF1蛋白表达量约为正常小鼠的3.5倍。证实了转基因表达载体能在体内促进外源IGF1在骨骼肌中特异性地过量表达。
Claims (3)
1. 一种猪内源性骨骼肌特异sk-α-actin启动子驱动IGF1基因的表达盒，是由依次串联的sk-α-actin启动子、猪IGF1基因、sk-α-actin 3’UTR和SV40增强子组成；其序列如SEQ ID No.1所示。
2.一种骨骼肌特异过表达猪IGF1基因安全型表达载体，其特征在于含有权利要求1所述的猪内源性骨骼肌特异sk-α-actin启动子驱动表达盒；该表达载体的序列如SEQ ID No.2所示。
3.根据权利要求2所述的载体，其特征在于：是将权利要求1所述猪内源性骨骼肌特异sk-α-actin启动子驱动表达盒通过EcoRV酶切位点克隆到转座子载体pT2-HB中而获得。
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