CN109402153B - 一种蛋白质标签载体的构建及其表达与检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蛋白质标签载体的构建及其表达与检测方法，涉及生物标记技术领域，本发明以果蝇卵巢生殖细胞特异性高表达的nos基因为实例，开发了一种细胞内源性的蛋白质标记技术，即基于末位外显子标记的蛋白质标签技术；首先，借助于分子克隆技术，构建nos基因最后一个外显子嵌合有GFP标签序列转基因载体；其次，借助于果蝇成熟的转基因技术，制备出携带此转基因载体的果蝇，通过检测其卵巢细胞内nos基因表达产物GFP荧光的表达与否，此技术为模式生物果蝇基因的表达模式研究提供了便利，为哺乳动物基因的表达及定位的研究提供借鉴。
Description
技术领域
本发明涉及生物标记技术领域，特别是指一种蛋白质标签载体的构建及其表达与检测方法。
背景技术
RNA剪接过程是从mRNA前体分子中切除被称为内含子的非编码区，并使基因中被称为外显子的编码区拼接形成成熟mRNA的过程。它是真核细胞基因表达中非常重要的一个生物过程，通过RNA剪接，可以产生许多具有功能的，带有编码信息的mRNA，它对生物的发育及进化至关重要。RNA剪接体负责RNA剪接过程，具体来说，是在mRNA初始转录产物(Precursor mRNA，简称pre-mRNA)外显子和内含子交界处切断RNA，然后将外显子依次连接起来，切去内含子，构成一条完整的mRNA。研究表明，真核细胞pre-mRNA的剪接位点存在一定的序列保守性，内含子5'端(供体位点)和3'端(受体位点)的碱基几乎都是GT和AG，因此称为GT-AG法则。已有的研究大多集中在剪接位点的序列识别机理、剪接的体外重构以及剪接调控等方面。
GFP蛋白称为绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)，由下村修等人1962年在水母中发现，其由GFP基因编码。该蛋白在蓝色波长光线激发下会发出绿色荧光，正是此特点，使得GFP蛋白作为标签蛋白在生命科学领域被广泛使用。GFP介导的融合蛋白标签技术是20世纪末兴起的一种基于报告基因的重组DNA技术，此标签技术可应用于体内基因表达水平的检测、蛋白质的细胞内原位示踪与定位、目标蛋白的纯化以及增强重组蛋白质的可溶性及稳定性等。基因nanos(简称为nos)非常保守，广泛存在于线虫、家蚕、斑马鱼、爪蟾、小鼠和人类等许多物种中。nos对于个体发育、生殖细胞的维持以及原始生殖细胞迁移与决定等都发挥着重要的调控作用。在果蝇中，nos基因高表达于早期胚胎细胞、原始生殖细胞、成熟生殖器官卵巢和精巢中。
基于对mRNA剪接原理、GFP蛋白质标签技术、分子克隆技术及成熟的果蝇转基因技术的研究，发明人发现果蝇基因的表达模式一般是先将GFP与靶基因编码序列的融合序列，放在靶基因启动子后面构建成果蝇转基因载体；然后通过显微注射手段得到转基因果蝇，以示踪靶蛋白的表达模式与亚细胞定位。存在以下问题：其一，靶基因有效的启动子长度存在不确定性。启动子设计得过短可能无效，不表达GFP融合蛋白，设计得过长扩增时存在难度。其二，基因工程手段构建的转基因载体整合入果蝇基因组后，其融合基因的表达是对内源靶基因的模仿，与体内原位表达存在或多或少的差异。其三，靶基因的编码序列需要从特异组织中提取总mRNA，然后进行反转录获得cDNA，最后通过基因扩增获得。整个过程相比较于本专利开发的技术，耗时耗力，且成本提高。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提出一种蛋白质标签载体的构建及其表达与检测方法，用于克服上述现有技术中的全部或者部分不足。
基于上述目的本发明提供的一种蛋白质标签载体的构建方法，包括如下步骤：
(1)果蝇nos基因3'UTR-AS序列的扩增，得nos3'UTR-AS，且其碱基序列为SEQ IDNO.1；
(2)pattB-nosP-3'UTR-AS过渡载体的构建；
(3)act5c基因ATG上游4550bp序列的扩增，得扩增前的碱基序列为SEQ ID NO.2；
(4)pattB-act5cP-3'UTR-AS过渡载体的构建；
(5)nosE3D-I3-E4C和GFP序列的扩增，其中GFP的碱基序列为SEQ ID NO.3；
(6)nosE3D-I3-E4C-GFP序列的扩增；
(7)pattB-act5cP-nosMLExon-GFP载体的构建，其中nosMLExon的碱基序列为SEQID NO.4。
在一些可选实施例中，所述3'UTR-AS序列为果蝇nos基因末位外显子3'非翻译区序列3'UTR，及其下游100bp附加序列AS。
在一些可选实施例中，所述步骤(2)在构建过程中，需要在nos3'UTR-AS中带上限制性内切酶Sbf1或Age1、Kpn1、Asc1、Not1和Xba1的酶切位点，且Kpn1、Asc1、Not1为预埋酶切位点。
在一些可选实施例中，所述步骤(3)为以野生型果蝇的基因为模板进行扩增。
在一些可选实施例中，所述步骤(4)为通过重组PCR技术扩增。
在一些可选实施例中，所述步骤(6)采用搭桥法扩增，即设计两对引物，先分别扩增nosE3D-I3-E4C和GFP，再以nosE3D-I3-E4C和GFP为模板，利用两模板之间的重叠部分搭桥扩增，一次插入载体中。
在一些可选实施例中，所搭桥法扩增过程中，也可以在nosE3D-I3-E4C和GFP中分别引入限制性酶切位点，分别插入过渡载体进行扩增。
在一些可选实施例中，所述步骤(5)中nosE3D-I3-E4C序列的扩增无TAG终止密码子，扩增GFP序列时在其3'端引入TAG终止密码子。
从上面所述可以看出，本发明构建了“末位外显子-GFP融合序列”的转基因载体，借助于成熟的果蝇转基因技术，能够对靶基因(nos基因)的mRNA进行荧光标记；在不影响靶基因原位表达的情况下，利用靶基因的RNA剪接过程，自发地嵌入mRNA产物中，既能真实反映靶基因的表达水平和表达模式，又可反映靶蛋白的亚细胞定位，省时省力，一举多得。此技术为模式生物果蝇基因的表达模式研究提供了便利，为哺乳动物基因的表达及定位的研究提供借鉴。
本发明的另一目的是提供一种蛋白质标签载体表达方法和检测方法，将采用所述方法制备的蛋白质标签载体基因显微注射入果蝇的卵中，然后挑选出红眼转基因果蝇，建立转基因果蝇品系。
一种蛋白质标签载体检测方法，取制备的转基因果蝇的卵巢和精巢，进行免疫荧光染色，进行GFP的表达检测。
从上面所述可以看出，本发明构建了末位外显子标记的蛋白质标签的转基因重组载体，在嵌合基因剪接模型融入蛋白质标签，以GFP荧光定位证实了嵌合外显子-内含子-外显子-蛋白质标签(GFP)剪接模型加入了生物体内RNA剪接过程。
附图说明
图1为本发明实施例PCR扩增nos基因3'UTR-AS序列示意图，M、2000 DNA marker，1、在紫外光下980bp目的条带；
图2为本发明实施例重组质粒pattB-nosP-3'UTR-AS的PCR鉴定示意图，M、2000DNA marker，1-14、在紫外光下980bp目的条带，+为阳性对照，-为阴性对照；
图3为本发明实施例重组质粒pattB-nosP-3'UTR-AS的Sbf1和Xba1双酶切鉴定示意图，M、15000 DNA marker，1、2分别为1与2号阳性转化子的酶切条带；
图4为本发明实施例act5cP4.55k序列的扩增示意图，M、15000 DNA marker，1、在紫外光下4.55kb目的条带；
图5为本发明实施例重组质粒pattB-act5cP-3'UTR-AS的PCR鉴定示意图，M、2000DNA marker，+为阳性对照，1-11为在紫外光下420bp目的条带，-为阴性对照；
图6为本发明实施例重组质粒pattB-act5cP-3'UTR-AS的Sbf1和Kpn1双酶切鉴定示意图，M、15000 DNA marker，1、2分别为6、7号阳性转化子的酶切条带；
图7为本发明实施例PCR扩增GFP和nosE3D-I3-E4C序列示意图，M、2000 DNAmarker，1、2在紫外光下约714bp和394bp的目的条带；
图8为本发明实施例PCR扩增nosE3D-I3-E4C-GFP序列示意图，M、2000 DNAmarker，1在紫外光下约1108bp的目的条带；
图9为本发明实施例重组质粒ATB-act5cP4.5k-ATG-nosExonL-GFP-nos3'UTR的PCR鉴定示意图，M、2000 DNA marker，+为阳性对照，1-10为在紫外光下约1108bp目的条带，-为阴性对照；
图10为本发明实施例重组质粒pattB-act5cP-nosMLExon-GFP的Kpn1和Not1双酶切鉴定示意图，M、15000 DNA marker，1、2分别为1与3号阳性转化子的酶切条带；
图11为本发明实施例pattB-act5cP-nosMLExon-GFP转基因载体构建示意图；
图12为本发明实施例pattB-act5cP-nosMLExon-GFP果蝇转基因载体图；
图13为本发明实施例pattB-act5cP-nosMLExon-GFP转基因果蝇与对照组果蝇(Oregon)免疫组织化学(IHC)染色图，方形圈为GFP抗体染色，圆形圈为细胞核染色。
具体实施方式
需要说明的是，本发明实施例中涉及如下生物技术术语：
(1)末位外显子标记：首先，将基因组中某个基因(此处为nanos基因，称靶基因)“倒数第二个外显子(此处为nanos基因第3个外显子，Exon 3)下游部分序列”、“最后一个内含子(此处为nanos基因第3个内含子，Intron 3)”、“末位外显子(此处为nanos基因第4个外显子，Exon 4)及其下游100bp序列”扩增克隆出来，称为靶序列。然后，在此靶序列末位外显子内部编码序列后的终止密码子(如TAG)前面插入标签序列(如GFP)，得到改造后的靶序列。最后，将此改造后靶序列通过转基因载体的携带，整合入基因组，该序列可参与细胞内靶基因的RNA剪接及蛋白质翻译过程。最终，标签序列与靶基因序列的编码蛋白形成融合蛋白，可示踪靶蛋白表达及其亚细胞定位。
(2)外显子(Exon)：真核生物断裂基因的一部分，为编码序列。它在剪接后会被保存下来，并可在蛋白质生物合成过程中被表达为蛋白质。
(3)内含子(Intron)：真核生物断裂基因的一部分，可被转录，但在mRNA加工过程中被剪切掉。此处nanos基因包含4个外显子和3个内含子。
(4)蛋白质标签：利用DNA体外重组技术，将标签蛋白与靶蛋白编码序列连接在一起，作为转基因序列转化细胞。标签蛋白将与靶蛋白共表达，构成融合蛋白。此标签蛋白的存在有助于靶蛋白的检测、示踪和纯化等。
(5)“pattB-”型果蝇转基因载体：果蝇的一种定点插入型转基因载体。可携带外源基因定点插入果蝇的基因组。
(6)act5cP：指act5c基因的启动子。包括act5c基因起始密码子ATG上游4550bp(base pair)序列片段。act5c基因为管家基因，在真核细胞内广谱表达。
(7)果蝇nanos基因：缩写为nos。nos基因编码Nanos蛋白。果蝇nos基因可表达于早期胚胎细胞及卵巢的生殖系细胞中，卵巢内表达的Nos蛋白对于生殖细胞的分化发育至关重要。
(8)nosMLExon-GFP：为“nos-Modified Last Exon-GFP”缩写。是指改造过带有GFP标签序列的nos基因末位外显子。具体来说，此改造后序列从上游至下游依次包括：nos基因倒数第2个外显子(外显子3)下游序列(Exon 3-Downstream sequence，E3D)、末位内含子(第3个内含子)序列(Intron 3,I3)、末位外显子(第4个外显子)编码序列(Exon 4-Codingsequence，E4C)、GFP标签融合序列、末位外显子3'非翻译区序列(3'Un-TranslationalRegion,3'UTR)及其下游100bp(base pair)附加序列(Additional Sequence，AS)。全称为nosE3D-I3-E4C-GFP-3'UTR-AS。
(9)GFP蛋白：绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)，由下村修等人在水母中发现，其由GFP基因编码。该蛋白在蓝色波长光线激发下会发出绿色荧光。可作为标签蛋白使用，应用于体内基因表达的检测及蛋白质的亚细胞定位等。
(10)果蝇转基因载体与转基因果蝇：用于转化果蝇的DNA分子。多为共价、闭合、环状质粒DNA，可以整合到果蝇早期胚胎细胞的细胞核基因组DNA上。携带有转基因载体的果蝇称为转基因果蝇，此种果蝇通过转基因载体上带有的红眼挽救基因作为筛选转化果蝇的标记。
DNA Marker：DNA长度的标准参照片段。
DH5ɑ：一种能够摄入外源DNA的受体菌，是一种经诱变的菌株。
pattB-nosP：一种可以定点插入果蝇染色体上的载体。
PET28a：一种原核表达载体。
CIAP：一种酸性磷酸酶。可去除载体DNA片段的5'末端的磷酸基。
Amp+：抗氨苄青霉素抗性。
PCR：即聚合酶链式反应。利用DNA在体外摄氏95℃高温时变性会变成单链，低温(经常是60℃左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72℃左右)，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。
限制性内切酶：一种在特殊核甘酸序列处水解双链DNA的内切酶。
DNA连接酶：一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NADP水解提供的能量催化DNA链的5'-PO4与另一DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外)，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。
基因表达载体的构建：将目的基因与运载体结合的过程，实际上是不同来源的DNA重新组合的过程。如果以质粒作为运载体，首先要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现一个缺口，露出黏性末端。然后用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端(部分限制性内切酶可切割出平末端，拥有相同效果)。将切下的目的基因的片段插入质粒的切口处，首先碱基互补配对结合，两个黏性末端吻合在一起，碱基之间形成氢键，再加入适量DNA连接酶，催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键，从而将相邻的脱氧核糖核酸连接起来，形成一个重组DNA分子。这个重组的DNA分子也叫重组质粒。
IHC：即immunohistochemistry免疫组织化学，又称免疫细胞化学，指在抗体上结合荧光或可呈色的化学物质，利用免疫学原理中抗原和抗体间专一性的结合反应，检测细胞或组织中是否有目标抗原的存在，此方式不仅可以用来测知蛋白的表达量也可进行蛋白定位。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，结合图，对本发明进一步详细说明。
本发明实施例的一个目的是提供一种蛋白质标签载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)果蝇nos基因3'UTR-AS序列的扩增，得nos 3'UTR-AS，且其碱基序列为SEQ IDNO.1；
(2)pattB-nosP-3'UTR-AS过渡载体的构建；
(3)act5c基因ATG上游4550bp序列的扩增，得扩增前的碱基序列为SEQ ID NO.2；
(4)pattB-act5cP-3'UTR-AS过渡载体的构建；
(5)nosE3D-I3-E4C和GFP序列的扩增，其中GFP的碱基序列为SEQ ID NO.3；
(6)nosE3D-I3-E4C-GFP序列的扩增；
(7)pattB-act5cP-nosMLExon-GFP载体的构建，其中nosMLExon的碱基序列为SEQID NO.4。
具体步骤如下：
1、果蝇nos基因3'UTR-AS序列的扩增
设计合成一对特异性的引物(即H1，H2)，且在H1和H2中分别引入nos基因3'UTR-AS序列内部不出现的几种限制性内切酶的酶切位点Sbf1、Kpn1、Asc1、Not1和Xba1，其中Kpn1、Asc1和Not1为预先埋好的酶切位点，以便后续使用，其中，Sbf1也可换为Age1。
将两条引物加入PCR反应体系中，PCR扩增条件如下：95℃变性3mim进入循环，95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环后，72℃继续延伸5min，得到末端带有Sbf1、Kpn1、Asc1、Not1和Xba1酶切位点的980bp的目的片段(如图1)。
2、pattB-nosP-3'UTR-AS过渡载体的构建
将上述的980bp长度的PCR产物纯化后和pattB-nosP载体用限制性内切酶Sbf1和Xba1 37℃酶切1h，pattB-nosP载体酶切1h后再加入1μL的CIAP去磷，以防载体自连，37℃孵育30min，再用T4连接酶(16℃，过夜连接)将nos3'UTR-AS序列插入到pattB-nosP质粒中。将连接产物导入到大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中，在含有氨苄青霉素抗性(Amp+)的固体培养基中挑选阳性克隆，分别用PCR扩增(结果如图2)，另使用Sbf1和Xba1进行双酶切鉴定重组质粒(结果如图3)。
从图中可以看出：图2显示出一条980bp的片段，图3显pattB-nosP-3'UTR-AS质粒经Sbf1，Xba1双酶切后得到一条约980bp的小片段和一条10000bp左右的大片段。证明有980bp的外源片段插入到了质粒中，PCR和酶切结果均显示成功制备了pattB-nosP-3'UTR-AS质粒载体，将阳性克隆的菌液样品送至生物公司测序，将测序结果与目标序列进行比对。结果表明，插入到pattB-nosP载体中的nos3'UTR-AS 980bp长度的序列与目标序列完全一致。
3、act5c基因ATG上游4550bp序列(act5cP4.55k)的扩增
设计一对特异性的引物(即H3，H4)，在H3和H4中分别引入act5cP4.55k内部不出现的限制性酶切位点Sbf1和Kpn1，以果蝇基因组为模板，PCR扩增act5cP4.55k序列。PCR扩增条件如下：95℃变性3mim进入循环，95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸20s，35个循环后于72℃继续延伸5min，得到目的片段(如图3)。
其PCR结果如图4所示，图4显示出一条4.55kb的条带，与理论相符，证明得到了act5cP4.55 kb目的片段。
4、pattB-act5cP-3'UTR-AS过渡载体的构建
将上述扩增的4.55kb长度的PCR产物纯化后和pattB-nosP-3'UTR-AS载体用限制性内切酶Sbf1和Kpn1 37℃酶切1h，pattB-nosP-3'UTR-AS载体酶切1h后再加入1μL的CIAP，37℃孵育30min，再用T4连接酶(16℃，过夜连接)将act5cP4.55k片段插入到pattB-nosP-3'UTR-AS质粒中。将连接产物导入到大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中，在含有Amp+的固体培养基中挑选阳性克隆，分别用PCR扩增(结果如图5)，及使用Sbf1和Kpn1进行双酶切鉴定重组质粒(结果如图6)。
从图中可以看出：图5显示出一条420bp左右(act5cP4.55k片段内部的420bp的一段序列)的片段，图6显示pattB-act5cP-3'UTR-AS质粒经Sbf1，Kpn1双酶切后得到一条4.55kb的小片段和一条11000bp左右的大片段。证明有4.55kb的片段插入到了质粒中，PCR和酶切结果均显示成功制备了pattB-act5cP-3'UTR-AS质粒载体，将阳性克隆的菌液样品送至生物公司测序，将测序结果与目标序列进行比对。结果表明，插入到pattB-nosP-3'UTR-AS载体中的act5cP4.55k的序列正确。在插入act5cP4.55k和nosE3D-I3-E4C-GFP时，除先插入act5cP4.55k外，也可先插入nosE3D-I3-E4C-GFP，后插入act5cP4.55k也能实现本发明。
5、nosE3D-I3-E4C和GFP序列的扩增
设计合成两对特异性的搭桥引物(即H5，H6及H7，H8)，且在H5和H8中分别引入nosE3D-I3-E4C和GFP内部不出现的限制性内切酶的酶切位点Kpn1和Not1，另在H5 Kpn1后引入起始密码子ATG及预埋Asc1。
斜体加粗字表示终止密码子TAG。
分别以基因组和pLenti6.3-IRES-GFP质粒为模板，将两对引物分别加入此两个PCR反应体系中，扩增nosE3D-I3-E4C和GFP序列。PCR扩增条件如下：95℃变性3mim进入循环，95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸25s，35个循环后，72℃继续延伸5min，分别得到394bp末端带有Kpn1酶切位点和起始密码子ATG的nosExonL片段和714bp末端带有终止密码子TAG和酶切位点Not1的GFP序列(如图7)。
在搭桥法PCR扩增nosE3D-I3-E4C-GFP片段时，分别在nosE3D-I3-E4C和GFP中分别引入限制性酶切位点，分别插入过渡载体，也能实现本发明。
6、nosE3D-I3-E4C-GFP序列的扩增
分别以上述扩增得到的nosE3D-I3-E4C和GFP序列为模板，利用两片段间的重叠部分，加入搭桥引物H5、H8，扩增nosE3D-I3-E4C-GFP序列。PCR扩增条件如下：95℃变性3mim进入循环，95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸35s，35个循环后，72℃继续延伸5min，得到1108bp的nosE3D-I3-E4C-GFP目的序列(如图8)。
7、pattB-act5cP-nosMLExon-GFP载体的构建
将上述扩增得到的nosE3D-I3-E4C-GFP序列和构建的pattB-act5cP-3'UTR-AS质粒用限制性酶切酶Kpn1和Not1 37℃酶切1h，pattB-act5cP-3'UTR-AS质粒酶切1h后再加入1μL的CIAP，37℃孵育30min，再用T4连接酶(16℃，过夜连接)将nosE3D-I3-E4C-GFP序列插入到pattB-act5cP-3'UTR-AS质粒中。将连接产物导入到大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中，在含有Amp+的固体培养基中挑选阳性克隆，用PCR(如图9)和Kpn1，Not1双酶切鉴定重组质粒(如图10)。
从图中可以看出：图9显示出一条1108bp的片段，图10显示pattB-act5cP-nosMLExon-GFP质粒经Kpn1，Not1双酶切后得到一条约1108bp的小片段和一条大于10000bp的大片段，证明成功制备了果蝇表达载体pattB-act5cP-nosMLExon-GFP。将阳性克隆的菌液样品送至生物公司测序，将测序结果与目标序列比对，序列正确。
8、转基因果蝇制备及GFP基因的表达检测
按照已经发表文献中的方法(见文献：Bischof J,Maeda RK,Hediger M,KarchF,&Basler K.An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases[J].Proc Natl Acad Sci USA,2007,104(9)：3312-3317)，将上述构建的果蝇转基因载体(pattB-act5cP-nosMLExon-GFP)显微注射入果蝇的卵中，然后挑选出红眼转基因果蝇，建立转基因果蝇品系，见图11和图12。
按照文献1和2中的实验方法(文献1：陈冬生,王双,王剑,周利娟,陶小倩,&孙福玲.果蝇hsp83多克隆抗体的制备及鉴定.中国组织化学与细胞化学杂志,2016,25(5),454-459。文献2：朱翔翔,王双,王剑,曹治杰,刘须龙,&陈冬生.三种果蝇精巢生殖干细胞半衰期的研究.激光生物学报,2016,25(2),156-160)，分别取转基因果蝇的卵巢和精巢，进行免疫荧光染色，检测GFP的表达情况见图13。转基因果蝇免疫组织化学染色结果为GFP表达模式为nos基因表达模式，对照组无GFP表达，说明本发明所构建载体中nosMLExon-GFP参与果蝇体内RNA的剪接过程，并在一定程度上反映了nos基因的表达量。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
本发明的实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 安徽师范大学
<120> 一种蛋白质标签载体的构建及其表达与检测方法
<130> 2018-11-22
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 980
<212> DNA
<213> 果蝇（Drosophila melanogaster）
<400> 1
agagggcgaa tccagctctg gagcagaggc tctggcagct tttgcagcgt ttatataaca 60
tgaaatatat atacgcattc cgatcaaagc tgggttaacc agatagatag atagtaacgt 120
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<210> 2
<211> 4550
<212> DNA
<213> 果蝇（Drosophila melanogaster）
<400> 2
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acacaaatga tacttctaaa aaaaaatcat attcataaat gactctttcc atgaatggca 240
tcaactctga atcaaatctt tgcagatgca cctacttctc atttccactg tcacatcatt 300
tttccagatc tcgctgcctg ttatgtggcc cacaaaccaa gacacgtttt atggccatta 360
aagctggctg atcgtcgcca aacaccaaat acataatgaa tatgtacaca ttcgagaaag 420
aagcgatcaa agaagcgtct tcgggcggag taggagaatg cggaggagaa ggagaacgag 480
ctgatctagt atctctccac aatccaatgc caactgacca actggccata ttcggagcaa 540
tttgaagcca atttccatcg cctggcgatc gctccattct tggctatatg tttttcaccg 600
ttacccgggg ccattttcaa agactcgtcg gcaagataag attgtgtcac tcgctgtctc 660
tcttcatttg tcgaagaatg ctgaggaatt tcgcgatgac gtcggcgagt attttgaaga 720
atgagaataa tttgtattta tacgaaaatc agttagtgga attttctaca aaaacatgtt 780
atctatagat aattttgttg caaaatatgt tgactatgac aaagaactgg aattaagtgg 840
catattttgc attgctttcc gataatagtt gtatttttat aaagtaaagc gtttgtaaaa 900
taaatacctt taatgtattc tcattttctt atgtatttat aatggcaatg atgatactga 960
tgatatttta agatgatgcc agaccaaaag gcttgaattt ctgcgtcttt tgccgaacgc 1020
agtgcatgtg caattgttgt tttttggaat attcaatttt cggactgtcc gctttgattt 1080
cagtttcttg gcttattcaa aaagcaaagt aaagccaaaa aagcgagatg gcaataccaa 1140
atgcggcaaa acggtagtgg aaggaaaggg gtgcggggca gcggaaggaa gggtggggcg 1200
gggcgtggcg gggtctgtgg ctgggcgcga cgtcaccgac gttggagcca ctcctttgac 1260
catgtgtgcg tgtgtgtatt attcgtgtct cgccactcgc cggttgtttt tttcttttta 1320
tgctgcgctc tctctagcgc catctcgctt acgcatgctc aacgcaccgc atgttgccgt 1380
ttccttttat gcgtcatttt ggctcgaaat aggcaattat ttaaacaaag attagtcaac 1440
gaaaacgcta aaataaataa gtctacaata tggttactta ttgccatgtg tgtgcagcca 1500
acgatagcaa caaaagcaac aacacaggtg gctttccctc tttcactttt tgtttgcaag 1560
ccgcgtgcga gcaagacggc acgaccggca aacgcaatta cgctgacaaa gagcagacga 1620
agttttggcg aaaaacatca aggcgcctga tacgaatgca tttgcaataa caattgcgat 1680
atttaatatt gtttatgaag ctgtttgact tcaaaacaca caaaaaaaaa aataaaacaa 1740
attatttgaa agagaattag gaatcggacg cttatcgtta gggtaacaac aagaaatgct 1800
tactgagtca cagcctctgg aaaactgccg caagccagag agagagagaa aaagagggag 1860
agcagcttag accgcatgtg cttgtgtgtg aggcgtctct ctcttcgtct ctgttgcgca 1920
aacgcataga ctgcactgaa aaaatcgatt acctattttt tatgaatgaa tatttgcact 1980
attactattc aaaactatta agatagcaat cacattcaat agccaaatac tataccacct 2040
gagcgatgca acgaaatgat caatttgagc aaaaatgctg catatttagg acggcatcat 2100
tatagaaatg cttcttgctg tgtacttttc tctcgtctgg cagctgtttc gccgttattg 2160
ttaaaaccgg cttaagttag gtgtgttttc tacgactagt gaatgcccta ctagaagatg 2220
tgtgttgcac aaaatgtccc tggaataacc aatttgaagt gcagatagca gtaaacgtaa 2280
gctaatatga atattattta actgtaatgt tttaatatcg ctggacatta ctaataaacc 2340
cactataaac acatgtacat atgtatgttt tggcatacaa tgagtagttg gggaaaaaat 2400
gtgtaaaagc accgtgacca tcacagcata aagataacca gctgaagtat cgaatatgag 2460
taacccccaa attgaatcac atgccgcaac tgataggacc catggaagta cactcttcat 2520
ggcgatatac aagacacaca caagcacgaa cacccagttg cggaggaaat tctccgtaaa 2580
tgaaaaccca atcggcgaac aattcatacc catatatggt aaaagttttg aacgcgactt 2640
gagagcggag agcattgcgg ctgataaggt tttagcgcta agcgggcttt ataaaacggg 2700
ctgcgggacc agttttcata tcactaccgt ttgagttctt gtgctgtgtg gatactcctc 2760
ccgacacaaa gccgctccat cagccagcag tcgtctaatc cagagacacc aaaccgaaag 2820
acttaattta tatttattta attaatttta ataaaacaca ccaaatgtaa gtagctttcc 2880
ccttcccaac aacaaaacac catcgaacca ctcccaccaa gaaaaagcaa taatcgagaa 2940
aagccgcgga aaatgtgtga ttttttttgt aaacaaaaca tttttttatg tgccagtgct 3000
gaaagtgatc aaaaaatact agccacgagc taaagagtta ttgtattgac caaaactcca 3060
aaaataccca agtttggccc taaattgtca atcaaaatac caataggtcg aaagacatca 3120
aaattaacaa aaccagggtt tcaaatacca taactcaaga atcaggatta caactgcaga 3180
tttcaggata tatacataca aattatacga aattataaaa accaaagcaa ttcaatagcc 3240
ccaactcaaa tgttaggatc taatatagtg tttaaagcca agctcgctga tgtgggcgtg 3300
tcacgatttc acccaaagat atgccaaatt acgaattgca aatcaattcg ccaacacttt 3360
ctttttttcc cacgccctaa aacaccagat catccataaa tgtacataca tacagtatat 3420
gcatattata atctgtaaaa ctagatcagg ttcttgaaaa tagtgacgta ggcagccgtt 3480
ttggctgaag cagaaatttt tgccggtttt tcaaagttgt agttgcaaaa atggagaaaa 3540
ccttcgagca ttcgttcata tacacacact cacgcgcaaa ataacgagag agagtgtatg 3600
tgtgtgtgag agagcgaaag ccagacgacg gtttgctttt cgcctcgaaa catgaccata 3660
tatggtcaca aaacttggcc gccgcaattc aacacaccag cgctctcctt cgcacccata 3720
gcgaccatgg cgcggagcga gcgagatggc gagagcgagc gacgcctatg gcgacgtcga 3780
cgcaggcagc gattgaaaaa cgcagttaac tggcattcaa cattcaccag ccactttcag 3840
tcggtttatt ccagtcattc ctttcaaacc gtgcggtcgc ttagctcagc ctcgccactt 3900
gcgtttacag tagttttcac gccttgaatt tgttaaatcg aacaaaaagg taaagtttaa 3960
ctagctttga aaagtttcgt ggctcttaat tgttaaattt tctagagtgc gtttagtgtt 4020
tttttttttt tttattttgt aatgttaatt tcgggttcca attcgagttt taggcagccg 4080
ccattttaag ggcgcataca cacaggcaac tgtgctctct ttgcggcttt cttttgcacc 4140
ggcattcgtt aagtgtcgtc tagaagcttc tcccctccct tttcggcata ttcgtattgt 4200
ggttttaatt tttcggggcg gggccttcta ttttgtaact gttcttttaa tttcttatta 4260
caattcgatc gcaagtgaaa atcagttttc aatcggaaaa gtattttttt atgaaatttt 4320
ttttgtccaa gattaaaatt ttgtactaaa aaaacgtaca ttgcattgag tgatttttaa 4380
ttgtacacga aaaacaagtt agtttgttat gacaattgta ctttggtaga ccagcgcagt 4440
ccaaggaaac cacgcaaatt ctcagttttt tttttgccat ttctacatta ccaaataagg 4500
taaccaaaaa ctaatgggaa atccgcattc tttccattgc agcttacaaa 4550
<210> 3
<211> 714
<212> DNA
<213> 果蝇(Drosophila melanogaster)
<400> 3
gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc 60
gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc 120
aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc 180
gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca catgaagcag 240
cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc 300
aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg 360
aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag 420
ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc 480
atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac 540
cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac 600
ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg 660
ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta caag 714
<210> 4
<211> 421
<212> DNA
<213> 果蝇(Drosophila melanogaster)
<400> 4
ggtaccatgg gcgcgccaga atagtaaagt aacaataata acaacaacaa caaggtgtac 60
aagcgttaca acagcaaggc caaagaggtg agtggatctg atccaggatt cgcagaatta 120
aaacttgcaa aatatatttg ttatcttgtt tctccaacag atcagccgcc actgcgtctt 180
ttgtgagaat aacaacgaac cagaggcggt tatcaatagc cactcagtgc gagataactt 240
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ggactcggcg cacacgatta agtactgccc caagaagccg atcatcacca tggaggatgc 360
gatcaaggcg gaatcgttcc gcctagccaa gagcagttac tacaagcaac agatgaaggt 420
t 421
Claims (9)
1.一种蛋白质标签载体pattB-act5cP-nosMLExon-GFP的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）果蝇nos基因3'UTR-AS序列的扩增，得nos 3'UTR-AS，且其碱基序列为SEQ IDNO.1；
（2）pattB-nosP-3'UTR-AS过渡载体的构建：将步骤（1）得到的PCR产物纯化后和pattB-nosP载体用限制性内切酶进行酶切反应，然后再用T4连接酶将nos3'UTR-AS序列插入到pattB-nosP质粒中；
（3）act5c基因ATG上游4550 bp序列的扩增，得扩增后的碱基序列为SEQ ID NO.2；
（4）pattB-act5cP-3'UTR-AS过渡载体的构建：将步骤（3）得到的PCR产物纯化后和pattB-nosP-3'UTR-AS载体用限制性内切酶进行酶切反应，再用T4连接酶将act5cP4.55k片段插入到pattB-nosP-3'UTR-AS质粒中；
（5）nosE3D-I3-E4C和GFP序列的扩增，其中GFP的碱基序列为SEQ ID NO.3；
（6）nosE3D-I3-E4C-GFP序列的扩增；
（7）蛋白质标签载体pattB-act5cP-nosMLExon-GFP载体的构建：将nosE3D-I3-E4C-GFP序列插入到pattB-act5cP-3'UTR-AS质粒中，其中nosMLExon的碱基序列为SEQ ID NO.4。
2. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述3'UTR-AS序列为果蝇nos基因末位外显子3'非翻译区序列3'UTR，及其下游100 bp附加序列AS。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（2）在构建过程中，需要在nos3'UTR-AS中带上限制性内切酶Sbf1、Kpn1、Asc1、Not1和Xba1的酶切位点，且Kpn1、Asc1和Not1为预埋酶切位点，其中，Sbf1也可换为Age1。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（3）为以野生型果蝇的基因为模板进行扩增。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（6）采用搭桥法扩增，即设计两对引物，先分别扩增nosE3D-I3-E4C和GFP，再以nosE3D-I3-E4C和GFP为模板，利用两模板之间的重叠部分搭桥扩增，一次插入载体中。
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（6）采用搭桥法扩增，在nosE3D-I3-E4C和GFP中分别引入限制性酶切位点，分别插入过渡载体进行扩增。
7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（5）中nosE3D-I3-E4C序列的扩增无TAG终止密码子，扩增GFP序列时在其3'端引入TAG终止密码子。
8.一种蛋白质标签载体的表达方法，其特征在于，将采用权利要求1-7任一所述方法制备的蛋白质标签载体的编码基因显微注射入果蝇的卵中，然后挑选出红眼转基因果蝇，建立转基因果蝇品系。
9.一种蛋白质标签载体检测方法，其特征在于，取权利要求8建立的转基因果蝇的卵巢和精巢，进行免疫荧光染色，进行GFP的表达检测。
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Applications Claiming Priority (1)
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| CN201811418693.0A CN109402153B (zh) | 2018-11-26 | 2018-11-26 | 一种蛋白质标签载体的构建及其表达与检测方法 |
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2018
- 2018-11-26 CN CN201811418693.0A patent/CN109402153B/zh active Active
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