JP2001054393A - 新規タンパク質およびそのｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】新規タンパク質およびその用途の提供。 【解決手段】本発明は、GABAトランスポーター活性を有
するのタンパク質またはその塩などに関する。 【効果】本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたは
それらの塩、およびそれらをコードするＤＮＡは、抗体
および抗血清の入手、本発明のタンパク質の発現系の構
築、同発現系を用いたGABAトランスポーターの活性を測
定する系の構築と医薬品候補化合物のスクリーニング、
GABAトランスポーターの立体構造にもとづいたドラッグ
デザインの実施、遺伝子診断におけるプローブやＰＣＲ
プライマーを作成するための試薬、トランスジェニック
動物の作製または遺伝子予防・治療剤等の医薬などとし
て用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、配列番号：１で表
わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のア
ミノ酸配列を有するタンパク質（好ましくは、GABAトラ
ンスポーター活性を有するタンパク質：以下、本発明の
タンパク質と略記する場合がある）またはその塩および
それをコードするＤＮＡなどに関する。

【０００２】

【従来の技術】抑制性神経伝達物質であるγ-アミノ酪
酸（GABA）は、GABA作動性神経から遊離された後、神経
終末およびグリア細胞にあるGABAトランスポーターの働
きにより細胞外液中から取り除かれる。このGABAトラン
スポーターによる能動的な取り込み機構が神経伝達終了
を決定する最も重要な機構である。GABAトランスポータ
ーには、４種類のサブタイプ（GAT-1、GAT-2、GAT-3、B
GT-1）の存在が知られ、GAT-1とGAT-3は脳、網膜に、GA
T-2はほとんどすべての臓器に、BGT-1は腎臓、脳に分布
している。GAT-1遺伝子はマウス（Gene Bank accession
No.M92378）、ラット（Gene Bank accession No.M3300
3）、ヒト（Gene Bank accession No.X54673）から、GA
T-2遺伝子はマウス（Gene Bank accessionNo.L0466
3）、ラット（Gene Bank accession No.M95762）から、
GAT-3遺伝子はマウス（Gene Bank accession No.L0466
2）、ラット（Gene Bank accession No.M95763）から、
BGT-1遺伝子はマウス（Gene Bank accession No.M9763
2）、イヌ（Gene Bank accession No.M80403）からそれ
ぞれクローニングされているが、ヒトGAT-2遺伝子は、
これまで知られていない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、(i)配列番
号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的
に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質（好ましく
は、GABAトランスポーター活性を有するタンパク質）、
その部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエス
テル、またはそれらの塩、(ii)該配列番号：１で表わさ
れるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ
酸配列を有するタンパク質（好ましくは、GABAトランス
ポーター活性を有するタンパク質）またはその部分ペプ
チドをコードするＤＮＡ、(iii)該ＤＮＡを含有する組
換えベクター、(iv)該組換えベクターを保持する形質転
換体、(v)該配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と
同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタン
パク質（好ましくは、GABAトランスポーター活性を有す
るタンパク質）またはその塩の製造法、(vi)該配列番
号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的
に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質（好ましく
は、GABAトランスポーター活性を有するタンパク質）、
その部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエス
テルまたはそれらの塩に対する抗体、(vii)該配列番
号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的
に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質（好ましく
は、GABAトランスポーター活性を有するタンパク質）の
GABAトランスポーター活性を変化させる化合物またはそ
の塩のスクリーニング方法、(viii)該スクリーニング方
法を用いて得られる化合物またはその塩、および(ix)該
化合物またはその塩を含有してなる医薬などを提供する
ことを目的とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
を重ねた結果、マウスやラットのGAT-2と高い相同性を
有するヒト由来のGABAトランスポータータンパク質をコ
ードするｃＤＮＡを単離し、全塩基配列を解析した後、
細胞で発現させることに成功した。そして、本発明者ら
は、これらの知見に基づいて、さらに研究を重ねた結
果、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、
（１）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一も
しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク
質またはその塩、（２）GABAトランスポーター活性を有
する上記（１）記載のタンパク質またはその塩、（３）
上記（１）記載のタンパク質の部分ペプチドもしくはそ
のアミドもしくはそのエステルまたはその塩、（４）上
記（１）記載のタンパク質または上記（３）記載の部分
ペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有す
るＤＮＡ、（５）配列番号：２で表わされる塩基配列を
有する上記（４）記載のＤＮＡ、（６）上記（４）記載
のＤＮＡを含有する組換えベクター、（７）上記（６）
記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体、
（８）上記（７）記載の形質転換体を培養し、上記
（１）記載のタンパク質または上記（３）記載の部分ペ
プチドを生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴
とする上記（１）記載のタンパク質またはその塩、また
は上記（３）記載の部分ペプチドもしくはそのアミドも
しくはそのエステルまたはその塩の製造法、（９）上記
（１）記載のタンパク質もしくはその塩、または上記
（３）記載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくは
そのエステルまたはその塩に対する抗体、（１０）上記
（１）記載のタンパク質またはその塩、または上記
（３）記載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくは
そのエステルまたはその塩を用いてGABAトランスポータ
ー活性を測定することを特徴とするGABAトランスポータ
ー活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスク
リーニング方法、（１１）上記（１）記載のタンパク質
またはその塩、または上記（３）記載の部分ペプチドも
しくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を
用いることを特徴とする上記（１）記載のタンパク質ま
たはその塩、または上記（３）記載の部分ペプチドもし
くはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩のGA
BAトランスポーター活性を促進または阻害する化合物ま
たはその塩のスクリーニング方法、（１２）上記（１）
記載のタンパク質またはその塩、または上記（３）記載
の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステ
ルまたはその塩を含有してなるGABAトランスポーター活
性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリー
ニング用キット、（１３）上記（１）記載のタンパク質
またはその塩、または上記（３）記載の部分ペプチドも
しくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を
含有してなる上記（１）記載のタンパク質またはその
塩、または上記（３）記載の部分ペプチドもしくはその
アミドもしくはそのエステルまたはその塩のGABAトラン
スポーター活性を促進または阻害する化合物またはその
塩のスクリーニング用キット、（１４）上記（１０）記
載のスクリーニング方法または上記（１２）記載のスク
リーニング用キットを用いて得られる、GABAトランスポ
ーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩、
（１５）上記（１１）記載のスクリーニング方法または
上記（１３）記載のスクリーニング用キットを用いて得
られる、上記（１）記載のタンパク質またはその塩、ま
たは上記（３）記載の部分ペプチドもしくはそのアミド
もしくはそのエステルまたはその塩のGABAトランスポー
ター活性を促進または阻害する化合物またはその塩、
（１６）上記（１０）記載のスクリーニング方法または
上記（１２）記載のスクリーニング用キットを用いて得
られる、GABAトランスポーター活性を促進または阻害す
る化合物またはその塩を含有してなる医薬、（１７）上
記（１１）記載のスクリーニング方法または上記（１
３）記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、
上記（１）記載のタンパク質またはその塩、または上記
（３）記載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくは
そのエステルまたはその塩のGABAトランスポーター活性
を促進または阻害する化合物またはその塩を含有してな
る医薬、（１８）不安症、痙攣、てんかん、精神分裂
病、脳血管障害、脳性麻痺、痙性脊髄麻痺、変形性脊椎
症、脊髄小脳変性症、多発性硬化症に伴う痙性麻痺、緊
張型頭痛、腰痛症、頸肩腕症候群の予防・治療剤であ
る、上記（１）記載のタンパク質またはその塩、上記
（３）記載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくは
そのエステルまたはその塩のGABAトランスポーター活性
を阻害する化合物またはその塩を含有してなる医薬、お
よび（１９）痴呆症の予防・治療剤である、上記（１）
記載のタンパク質またはその塩、上記（３）記載の部分
ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまた
はその塩のGABAトランスポーター活性を促進する化合物
またはその塩を含有してなる医薬などに関する。

【０００５】より具体的には、（２０）タンパク質が、
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列、配列番号：
１で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好
ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜９個程
度、さらに好ましくは数個（１または２個））のアミノ
酸が欠失したアミノ酸配列、配列番号：１で表わされ
るアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜
３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好
ましくは数個（１または２個））のアミノ酸が付加した
アミノ酸配列、配列番号：１で表わされるアミノ酸配
列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程
度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは
数個（１または２個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置
換されたアミノ酸配列、またはそれらを組み合わせた
アミノ酸配列を含有するタンパク質である上記（１）記
載のタンパク質またはその塩、（２１）上記（１）記載
のタンパク質もしくはその塩または上記（３）記載の部
分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルも
しくはその塩と試験化合物とを接触させた場合とさせな
かった場合との比較を行なうことを特徴とする上記（１
０）または（１１）記載のスクリーニング方法、（２
２）上記（１）記載のタンパク質を含有する細胞に試験
化合物を接触させた場合とさせなっかた場合との比較を
行なうことを特徴とするGABAトランスポーター活性を変
化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（２３）上記（７）記載の形質転換体を培養することに
よって該形質転換体の細胞膜に発現した上記（１）記載
のタンパク質に試験化合物を接触させた場合とさせなっ
かた場合との比較を行なうことを特徴とする上記（１）
記載のタンパク質のGABAトランスポーター活性を変化さ
せる化合物またはその塩のスクリーニング方法、（２
４）上記（２１）〜上記（２３）記載のスクリーニング
方法で得られる、上記（１）記載のタンパク質のGABAト
ランスポーター活性を変化させる化合物またはその塩、
（２５）上記（２１）〜上記（２３）記載のスクリーニ
ング方法で得られる、上記（１）記載のタンパク質の機
能を変化させる化合物またはその塩を含有することを特
徴とする不安症、痙攣、てんかん、精神分裂病、脳血管
障害、脳性麻痺、痙性脊髄麻痺、変形性脊椎症、脊髄小
脳変性症、多発性硬化症に伴う痙性麻痺、緊張型頭痛、
腰痛症、頸肩腕症候群の予防・治療剤、（２６）上記
（９）記載の抗体と、被検液とを接触させることを特徴
とする被検液中の上記（１）記載のタンパク質またはそ
の塩、または上記（３）記載の部分ペプチドもしくはそ
のアミドもしくはそのエステルまたはその塩の定量法、
および（２７）上記（９）記載の抗体を含有することを
特徴とする不安症、痙攣、てんかん、精神分裂病、脳血
管障害、脳性麻痺、痙性脊髄麻痺、変形性脊椎症、脊髄
小脳変性症、多発性硬化症に伴う痙性麻痺、緊張型頭
痛、腰痛症、頸肩腕症候群痴呆症の予防・治療剤などを
提供する。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明のタンパク質は、配列番
号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的
に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質である。本
発明のタンパク質は、例えば、ヒトや温血動物（例え
ば、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツ
ジ、ウシ、サルなど）のあらゆる細胞（例えば、脾細
胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メ
サンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮
細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪
細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細
胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基
球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨
細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは
間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしく
はガン細胞など）や、またはそれらの細胞が存在するあ
らゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁頭
核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、視床下核、大
脳皮質、延髄、小脳、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、
尾状核、脳染、黒質）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎
臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮
膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心
臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、末梢血球、前立腺、
睾丸、精巣、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など
に由来するタンパク質であってもよく、また合成タンパ
ク質であってもよい。配列番号：１で表わされるアミノ
酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例え
ば、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と約９５％
以上、好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミノ
酸配列などが挙げられる。本発明の配列番号：１で表わ
されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含
有するタンパク質としては、例えば、配列番号：１で表
わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を
有し、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的
に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。

【０００７】「実質的に同一」とはタンパク質の活性、
例えば、輸送体活性（GABAトランスポーター活性）、生
理的な特性などが、実質的に同じことを意味する。アミ
ノ酸の置換、欠失、付加あるいは挿入はしばしばポリペ
プチドの生理的な特性や化学的な特性に大きな変化をも
たらさないが、こうした場合その置換、欠失、付加ある
いは挿入を施されたタンパク質は、そうした置換、欠
失、付加あるいは挿入のされていないものと実質的に同
一であるとされるであろう。該アミノ酸配列中のアミノ
酸の実質的に同一な置換物としては、たとえばそのアミ
ノ酸が属するところのクラスのうち他のアミノ酸類から
選ぶことができる。非極性（疎水性）アミノ酸として
は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロ
リン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン
などが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としてはグリ
シン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、ア
スパラギン、グルタミンなどが挙げられる。陽電荷をも
つ（塩基性）アミノ酸としてはアルギニン、リジン、ヒ
スチジンなどが挙げられる。負電荷をもつ（酸性）アミ
ノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などがあ
げられる。また、実質的に同質とは、それらの活性が性
質的に（生理化学的に、または薬理学的に）同質である
ことを示す。したがって、その活性が同等であることが
好ましいが、これらの活性の程度やタンパク質の分子量
などの量的要素は異なっていてもよい。輸送体活性の測
定は、自体公知の方法に準じて行なうことができるが、
例えば、後述するスクリーニング方法に従って測定する
ことができる。また、本発明のタンパク質としては、
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列中の１または２
個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは
１〜９個程度、さらに好ましくは数個（１または２
個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番
号：１で表わされるアミノ酸配列に１または２個以上
（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜９
個程度、さらに好ましくは数個（１または２個））のア
ミノ酸が付加したアミノ酸配列、配列番号：１で表わ
されるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましく
は、１〜３０個程度、より好ましくは１〜９個程度、さ
らに好ましくは数個（１または２個））のアミノ酸が他
のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはそれら
を組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質など
も用いられる。さらに、本発明のタンパク質には、上記
したタンパク質において、Ｎ末端のメチオニン残基のア
ミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどの
Ｃ_2-6アルカノイル基などのＣ_1-6アシル基など）で保護
されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したＧ
ｌｎがピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸
の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ
基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基な
ど）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチルな
どのＣ_2-6アルカノイル基などのＣ_1-6アシル基など）で
保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる
糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。本
発明のタンパク質の部分ペプチド（以下、部分ペプチド
と略記する場合がある）としては、前記した本発明のタ
ンパク質の部分ペプチドであれば何れのものであっても
よいが、例えば、本発明のタンパク質のうち、細胞膜の
外に露出している部位などが用いられる。

【０００８】具体的には、配列番号：１で表されるアミ
ノ酸配列を有するタンパク質の部分ペプチドとしては、
［図１］で示される疎水性プロット解析において、細胞
外領域（親水性（Hydrophilic）部位）であると分析さ
れた部分を含むペプチドである。また、疎水性（Hydrop
hobic）部位を一部に含むペプチドも同様に用いること
ができる。個々のドメインを別個に含むペプチドも用い
得るが、複数のドメインを同時に含む部分のペプチドで
も良い。また、本発明の部分ペプチドは、上記アミノ酸
配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程
度、より好ましくは１〜９個程度、さらに好ましくは数
個（１または２個））のアミノ酸が欠失し、または、そ
のアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜
３０個程度、より好ましくは１〜９個程度、さらに好ま
しくは数個（１または２個））のアミノ酸が付加し、ま
たは、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好まし
くは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜９個程度、
さらに好ましくは数個（１または２個））のアミノ酸が
他のアミノ酸で置換されていてもよい。また、本発明の
部分ペプチドはＣ末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯ
Ｈ）またはカルボキシレート（−ＣＯＯ^-）であるが、
前記した本発明のタンパク質のごとく、Ｃ末端がアミド
（−ＣＯＮＨ₂）またはエステル（−ＣＯＯＲ）(Ｒは上
記と同意義を示す)であってもよい。さらに、本発明の
部分ペプチドには、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基
が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が
結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども
含まれる。本発明の部分ペプチドは抗体作成のための抗
原として用いることができるので、必ずしもGABAトラン
スポーター活性を有する必要はない。

【０００９】本発明のタンパク質またはその部分ペプチ
ドの塩としては、とりわけ生理学的に許容される酸付加
塩が好ましい。この様な塩としては、例えば無機酸（例
えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、ある
いは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマ
ル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リン
ゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンス
ルホン酸）との塩などが用いられる。本発明のタンパク
質またはその塩は、前述したヒトや哺乳動物の細胞また
は組織から自体公知の精製方法によって製造することも
できるし、後述する本発明のタンパク質をコードするＤ
ＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製
造することができる。また、後述のタンパク質合成法ま
たはこれに準じて製造することもできる。ヒトや哺乳動
物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物
の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出
を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン
交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組
み合わせることにより精製単離することができる。本発
明のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩は、自体公
知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明のタン
パク質を適当なペプチダーゼで切断することによって製
造することができる。ペプチドの合成法としては、例え
ば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。
すなわち、本発明のタンパク質を構成し得る部分ペプチ
ドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が
保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的
のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や
保護基の脱離としては、例えば、以下の〜に記載さ
れた方法が挙げられる。 M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド シン
セシス (Peptide Synthesis), Interscience Publisher
s, New York (1966年) SchroederおよびLuebke、ザ ペプチド(The Peptide),
Academic Press, New York (1965年) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株)
（1975年） 矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タン
パク質の化学IV、 205、(1977年） 矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合
成、広川書店

【００１０】また、反応後は通常の精製法、例えば、溶
媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマ
トグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明の部分
ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得ら
れる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法あ
るいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換するこ
とができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あ
るいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に
変換することができる。本発明のタンパク質をコードす
るＤＮＡとしては、前述した本発明のタンパク質をコー
ドする塩基配列を含有するものであればいかなるもので
あってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライ
ブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記し
た細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡ
のいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクター
は、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファ
ージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細
胞・組織よりtotalＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製し
たものを用いて直接Reverse Transcriptase Polymerase
Chain Reaction（以下、ＲＴ-ＰＣＲ法と略称する）に
よって増幅することもできる。具体的には、本発明のタ
ンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番
号：２で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、または
配列番号：２で表わされる塩基配列とハイストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本
発明のタンパク質と実質的に同質の活性（例、GABAトラ
ンスポーター活性など）を有するタンパク質をコードす
るＤＮＡであれば何れのものでもよい。配列番号：２で
表わされる塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡとし
ては、例えば、配列番号：２で表わされる塩基配列と約
９０％以上、好ましくは約９５％以上、より好ましくは
約９８％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮ
Ａなどが用いられる。ハイブリダイゼーションは、自体
公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキ
ュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J.
Sambrook etal., Cold Spring Harbor Lab. Press, 198
9）に記載の方法などに従って行なうことができる。ま
た、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説
明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好
ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なう
ことができる。ハイストリンジェントな条件とは、例え
ば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約
１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは
約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が
約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。よ
り具体的には、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列
を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配
列番号：２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡなどが
用いられる。本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡ
としては、前述した本発明の部分ペプチドをコードする
塩基配列を含有するものであればいかなるものであって
もよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリ
ー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞
・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいず
れでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バク
テリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミド
などいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織
よりｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Reverse
TranscriptasePolymerase Chain Reaction（以下、ＲＴ
-ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもでき
る。具体的には、本発明の部分ペプチドをコードするＤ
ＮＡとしては、例えば、配列番号：２で表わされる塩基
配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、ま
たは配列番号：２で表わされる塩基配列とハイストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有
し、本発明のタンパク質と実質的に同質の活性（例、GA
BAトランスポーター活性など）を有するタンパク質をコ
ードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用
いられる。配列番号：２で表わされる塩基配列ハイブリ
ダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２で
表わされる塩基配列と約９５％以上、好ましくは約９８
％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなど
が用いられる。ハイブリダイゼーションの方法およびハ
イストリンジェントな条件は前記と同様のものが用いら
れる。本発明のタンパク質またはその部分ペプチド（以
下、本発明のタンパク質と略記する）を完全にコードす
るＤＮＡのクローニングの手段としては、（１）本発明
のタンパク質の部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライ
マーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または
（２）適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のタ
ンパク質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片
もしくは合成ＤＮＡを標識したものとのハイブリダイゼ
ーションによって選別すること、などが挙げられる。ハ
イブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー
・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambro
ok et al., Cold Spring Harbor Lab.Press, 1989）に
記載の方法などに従って行なうことができる。また、市
販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に
記載の方法に従って行なうことができる。

【００１１】ＤＮＡの塩基配列の変換（欠失・付加・置
換）は、公知のキット、例えば、Mutan^TM-G（宝酒造
（株））、Mutan^TM-K（宝酒造（株））などを用いて、G
apped duplex法やKunkel法などの自体公知の方法あるい
はそれらに準じる方法に従って行なうことができる。ク
ローン化された本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ
は目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消
化したり、リンカーを付加したりして使用することがで
きる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとし
てのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドン
としてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよ
い。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当
な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもでき
る。本発明のタンパク質の発現ベクターは、例えば、
（イ）本発明のタンパク質をコードするＤＮＡから目的
とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適
当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結するこ
とにより製造することができる。ベクターとしては、大
腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２
５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミ
ド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母
由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λフ
ァージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワ
クシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイル
スなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭ
Ｖ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用い
られる。本発明で用いられるプロモーターとしては、遺
伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーター
であればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿
主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０
プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメ
ガロウイルス）プロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモータ
ーなどが挙げられる。これらのうち、ＣＭＶプロモータ
ー、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿
主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモータ
ー、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰ
_Lプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどが、宿主がバ
チルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰ
Ｏ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が
酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロ
モーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターな
どが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘド
リンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好まし
い。発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハ
ンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナ
ル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ
４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有している
ものを用いることができる。選択マーカーとしては、例
えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称す
る場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐
性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐ^rと略称
する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎ
ｅｏと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げら
れる。また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列
を、本発明のタンパク質のＮ端末側に付加する。宿主が
エシェリヒア属菌である場合は、PhoＡ・シグナル配
列、OmpＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌
である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチ
リシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合
は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列な
ど、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シ
グナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗
体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。この
ようにして構築された本発明のタンパク質をコードする
ＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造
することができる。宿主としては、例えば、エシェリヒ
ア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細
胞などが用いられる。

【００１２】エシェリヒア属菌の具体例としては、エシ
ェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１
〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー
（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６０巻，１６０
(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクレイック・アシッズ・
リサーチ，（Nucleic Acids Research），９巻，３０９
(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキ
ュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biolog
y）〕，１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１
〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４
１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティック
ス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕などが用
いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・
サチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン，
２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャーナ
ル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemis
try），９５巻，８７(１９８４)〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２
Ｒ^-，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１
２、シゾサッカロマイセス ポンベ（Schizosaccharomy
ces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピ
キア パストリス（Pichia pastoris）などが用いられ
る。昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶ
の場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera fru
giperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの中腸由
来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh Five
^TM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞またはEstigmen
a acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍ
ＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N；Ｂ
ｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例
えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１細胞（以
上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（In Vivo）,13, 21
3-217,(1977)）などが用いられる。昆虫としては、例え
ば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャ
ー（Nature），３１５巻，５９２(１９８５)〕。動物細
胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖero，チ
ャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と
略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細
胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-）細胞と略記），
マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ
細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞、HEK２９３細胞、
Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ３Ｔ３細胞、Ｓｐ−２細胞など
が用いられる。これらの中でも、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ
（ｄｈｆｒ^-）細胞、HEK２９３細胞、ＬＭ細胞などが好
ましい。エシェリヒア属菌を形質転換するには、例え
ば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー
（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６９巻，２１１
０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１０７(１９
８２)などに記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラ
ー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecula
r ＆ General Genetics），１６８巻，１１１(１９７
９)などに記載の方法に従って行なうことができる。

【００１３】酵母を形質転換するには、例えば、メソッ
ズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymolog
y），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシ
ージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Na
tl. Acad. Sci. ＵＳＡ），７５巻，１９２９(１９７
８）などに記載の方法に従って行なうことができる。昆
虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ
／テクノロジー（Bio/Technology）,6, 47-55(1988)）
などに記載の方法に従って行なうことができる。発現ベ
クターの動物細胞への導入方法としては、例えば、リン
酸カルシウム法〔Graham, F. L. and van der Eb, A.
J.ヴィロロジー（Virology） 52, 456-467（1973）〕、
電気穿孔法〔Nuemann, E. et al. エンボ・ジャーナル
（EMBO J.） 1, 841-845（1982）〕等が挙げられる。こ
のようにして、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ
を含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を
得ることができる。なお、動物細胞を用いて、本発明の
タンパク質を安定に発現させる方法としては、上記の動
物細胞に導入された発現ベクターが染色体に組み込まれ
た細胞をクローン選択によって選択する方法がある。具
体的には、上記の選択マーカーを指標にして形質転換体
を選択する。さらに、このように選択マーカーを用いて
得られた動物細胞に対して、繰り返しクローン選択を行
なうことにより本発明のタンパク質の高発現能を有する
安定な動物細胞株を得ることができる。また、ｄｈｆｒ
遺伝子を選択マーカーとして用いた場合、ＭＴＸ濃度を
徐々に上げて培養し、耐性株を選択することにより、ｄ
ｈｆｒ遺伝子とともに、本発明のタンパク質をコードす
るＤＮＡを細胞内で増幅させて、さらに高発現の動物細
胞株を得ることもできる。上記の形質転換体を本発明の
タンパク質をコードするＤＮＡが発現可能な条件下で培
養し、本発明のタンパク質を生成、蓄積せしめることに
よって、本発明のタンパク質またはその塩を製造するこ
とができる。宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌で
ある形質転換体を培養する際、培養に使用される培地と
しては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体
の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せ
しめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デ
キストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源として
は、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチ
ープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆
粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機
物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナ
トリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、
酵母抽出液、ビタミン類、生長促進因子などを添加して
もよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。エシェリヒ
ア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコー
ス、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Miller），ジ
ャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラ
ー・ジェネティックス（Journal of Experiments in Mo
lecular Genetics），４３１−４３３，Cold Spring Ha
rbor Laboratory, New York１９７２〕が好ましい。こ
こに必要によりプロモーターを効率よく働かせるため
に、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤
を加えることができる。宿主がエシェリヒア属菌の場
合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行な
い、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。

【００１４】宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約
３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気
や撹拌を加えることもできる。宿主が酵母である形質転
換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホー
ルダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L. ら、
プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Pr
oc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），７７巻，４５０５(１
９８０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bi
tter, G. A. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・
ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），８
１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐ
Ｈは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２
０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて
通気や撹拌を加える。宿主が昆虫細胞または昆虫である
形質転換体を培養する際、培地としては、Grace's Inse
ct Medium（Grace, T.C.C.,ネイチャー（Nature）,195,
788(1962)）に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を
適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．
２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７
℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加
える。宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、
培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含
むＭＥＭ培地〔サイエンス（Science），１２２巻，５
０１(１９５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Viro
logy），８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ １６４
０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカ
ル・アソシエーション（The Journal of the American
Medical Association）１９９巻，５１９(１９６
７)〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサ
イエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン
（Proceeding ofthe Society for the Biological Medi
cine），７３巻，１(１９５０)〕などが用いられる。ｐ
Ｈは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃
〜４０℃で約１５〜７２時間行ない、必要に応じて通気
や撹拌を加える。以上のようにして、形質転換体に本発
明のタンパク質を発現させることができる。上記培養物
から本発明のタンパク質を分離精製するには、例えば、
下記の方法により行なうことができる。本発明のタンパ
ク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、
培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを
適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／ま
たは凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊した
のち、遠心分離やろ過により本発明のタンパク質の粗抽
出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿
素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤や、トリト
ンＸ−１００^TMなどの界面活性剤が含まれていてもよ
い。

【００１５】このようにして得られた抽出液中に含まれ
る本発明のタンパク質の精製は、自体公知の分離・精製
法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの
公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの
溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過
法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換
クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、ア
フィニティークロマトグラフィーなどの特異的新和性を
利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの
疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等
電点の差を利用する方法などが用いられる。かくして得
られる本発明のタンパク質が遊離体で得られた場合に
は、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって
塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自
体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体
または他の塩に変換することができる。なお、組換え体
が産生する本発明のタンパク質を、精製前または精製後
に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に
修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去すること
もできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシ
ン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、
プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられ
る。かくして生成する本発明のタンパク質またはその塩
は、特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなどに
より測定することができる。本発明のタンパク質、その
部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体は、本発明
のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩を認
識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクロ
ーナル抗体の何れであってもよい。本発明のタンパク
質、その部分ペプチドまたはそれらの塩（以下、本発明
のタンパク質と略記する）に対する抗体は、本発明のタ
ンパク質を抗原として用い、自体公知の抗体または抗血
清の製造法に従って製造することができる。

【００１６】〔モノクローナル抗体の作製〕 （ａ）モノクロナール抗体産生細胞の作製 本発明のタンパク質は、哺乳動物に対して投与により抗
体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤と
ともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるた
め、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントア
ジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に
１回ずつ、計２〜１０回程度行なわれる。用いられる哺
乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモ
ット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギが挙げられるが、
マウスおよびラットが好ましく用いられる。モノクロー
ナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免疫された
温血動物、例えば、マウスから抗体価の認められた個体
を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を
採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異
種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクロ
ーナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができ
る。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化
した本発明のタンパク質と抗血清とを反応させたのち、
抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行な
うことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケー
ラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Nature)、２
５６巻、４９５頁（１９７５年）〕に従い実施すること
ができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレン
グリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げら
れるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。骨髄腫細胞と
しては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、Ａ
Ｐ−αなどの温血動物の骨髄腫細胞などが挙げられる
が、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産
生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率
は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくは、
ＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度
の濃度で添加され、約２０〜４０℃、好ましくは約３０
〜３７℃で約１〜１０分間インキュベートすることによ
り効率よく細胞融合を実施できる。モノクローナル抗体
産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が
使用できるが、例えば、本発明のタンパク質抗原を直接
あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプ
レート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射
性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細
胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫
グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加
え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方
法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着さ
せた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物
質や酵素などで標識した本発明のタンパク質を加え、固
相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが
挙げられる。

【００１７】モノクローナル抗体の選別は、自体公知あ
るいはそれに準じる方法に従って行なうことができる
が、通常はＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、
チミジン）を添加した動物細胞用培地などで行なうこと
ができる。選別および育種用培地としては、ハイブリド
ーマが生育できるものならばどのような培地を用いても
良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の
牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％
の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））
またはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０
１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養
温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃であ
る。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間
〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なう
ことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上
記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。

【００１８】（ｂ）モノクロナール抗体の精製 モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナ
ル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法
〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気
泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着
法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相またはプロテ
インＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗
体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精
製法〕に従って行なうことができる。 〔ポリクローナル抗体の作製〕本発明のポリクローナル
抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法にした
がって製造することができる。例えば、免疫抗原（本発
明のタンパク質抗原）自体、あるいはそれとキャリアー
タンパク質との複合体をつくり、上記のモノクローナル
抗体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行ない、該免疫
動物から本発明のタンパク質に対する抗体含有物を採取
して、抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。
哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリ
アータンパク質との複合体に関し、キャリアータンパク
質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キ
ャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が
効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋
させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサ
イログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモシアニ
ン等を重量比でハプテン１に対し、約０.１〜２０、好
ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられ
る。また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種
々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒ
ドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオー
ル基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等
が用いられる。縮合生成物は、温血動物に対して、抗体
産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とと
もに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるた
め、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントア
ジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週
毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なうことができ
る。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された哺
乳動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取する
ことができる。抗血清中のポリクローナル抗体価の測定
は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定でき
る。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクロ
ーナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精
製法に従って行なうことができる。本発明のタンパク
質、その部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはその
エステルまたはそれらの塩、およびそれらをコードする
ＤＮＡは、抗体および抗血清の入手、本発明のタンパク
質の発現系の構築、同発現系を用いたGABAトランスポー
ターの活性を測定する系の構築と医薬品候補化合物のス
クリーニング、GABAトランスポーターの立体構造にもと
づいたドラッグデザインの実施、遺伝子診断におけるプ
ローブやＰＣＲプライマーを作成するための試薬、トラ
ンスジェニック動物の作製または遺伝子予防・治療剤等
の医薬などとして用いることができる。特に、本発明の
タンパク質の発現系を用いたGABAトランスポーター活性
測定系を用いることによって、ヒトや哺乳動物に特異的
なGABAトランスポーター活性を変化させる化合物をスク
リーニングすることができ、該化合物を各種疾病の予防
・治療剤などとして使用することができる。

【００１９】本発明のタンパク質、部分ペプチドもしく
はそのアミドもしくはそのエステルまたはそれらの塩
（以下、本発明のタンパク質と略記する場合がある）、
本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードす
るＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場合があ
る）、本発明のタンパク質を発現する細胞および本発明
のタンパク質に対する抗体（以下、本発明の抗体と略記
する場合がある）の用途について、以下に具体的に説明
する。

【００２０】（１）本発明のタンパク質の活性を変化さ
せる化合物のスクリーニング方法 本発明のタンパク質を用いるか、または本発明のタンパ
ク質の発現系を構築し、該発現系を用いたGABAトランス
ポーター活性測定系を用いることによって、本発明のタ
ンパク質のGABAトランスポーター活性を変化させる化合
物（例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合
物、合成化合物、発酵生産物など）またはその塩を効率
よくスクリーニングすることができる。このような化合
物には、本発明のタンパク質のGABAトランスポーター活
性を増強する化合物、あるいは本発明のタンパク質のGA
BAトランスポーター活性を阻害させる化合物などが含ま
れる。すなわち、本発明は、本発明のタンパク質に試験
化合物を接触させた場合とさせなっかた場合との比較を
行なうことを特徴とする本発明のタンパク質の機能（具
体的には、 GABAトランスポーター活性）を変化させる
化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
より具体的には、本発明は、本発明のタンパク質と試験
化合物とを接触させた場合とさせなかった場合との比較
を行なうことを特徴とするスクリーニング方法、本発明
のタンパク質を含有する細胞に試験化合物を接触させた
場合とさせなっかた場合との比較を行なうことを特徴と
する本発明のタンパク質の機能（具体的には、 GABAト
ランスポーター活性）を変化させる化合物またはその塩
のスクリーニング方法、および

【００２１】本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培
養することによって該形質転換体の細胞膜に発現した本
発明のタンパク質に試験化合物を接触させた場合とさせ
なっかた場合との比較を行なうことを特徴とする本発明
のタンパク質の機能（具体的には、 GABAトランスポー
ター活性）を変化させる化合物またはその塩のスクリー
ニング方法を提供する。本発明のタンパク質が得られる
以前は、例えば、GABAトランスポーター活性を変化させ
る化合物をスクリーニングする場合、まずラットなどの
GABAトランスポータータンパク質を含む細胞、組織を用
いて候補化合物を得て（一次スクリーニング）、その後
に該候補化合物が実際にヒトのGABAトランスポーターの
活性を変化させる化合物であるか否かを確認する試験
（二次スクリーニング）が必要であった。細胞、組織を
そのまま用いれば他の輸送体タンパク質も混在するため
に、目的とするGABAトランスポータータンパク質の活性
を変化させる化合物を実際にスクリーニングすることは
困難であった。しかしながら、例えば、本発明のヒト由
来タンパク質を発現する細胞を用いることによって、一
次スクリーニングの必要がなくなり、GABAトランスポー
ター活性を変化させる化合物を効率良くスクリーニング
することができる。

【００２２】本発明のスクリーニング方法の具体的な説
明を以下にする。まず、本発明のスクリーニング方法に
用いる本発明のタンパク質としては、前記した本発明の
タンパク質を含有するものであれば何れのものであって
もよいが、本発明のタンパク質を含有する哺乳動物の臓
器の細胞が好適である。しかし、特にヒト由来の臓器は
入手が極めて困難なことから、スクリーニングに用いら
れるものとしては、ヒト由来のタンパク質を発現させた
細胞などが適している。本発明のタンパク質を発現させ
た細胞を構築するには、前述の方法が用いられるが、本
発明のＤＮＡを哺乳細胞や昆虫細胞で発現することによ
り行なうことが好ましい。目的とするタンパク質部分を
コードするＤＮＡ断片には相補ＤＮＡが用いられるが、
必ずしもこれに制約されるものではない。例えば、遺伝
子断片や合成ＤＮＡを用いてもよい。本発明のタンパク
質をコードするＤＮＡ断片を宿主動物細胞に導入し、そ
れらを効率よく発現させるためには、該ＤＮＡ断片を昆
虫を宿主とするバキュロウイルスに属する核多角体病ウ
イルス（nuclear polyhedrosis virus；ＮＰＶ）のポリ
ヘドリンプロモーター、ＳＶ４０由来のプロモーター、
レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロ
モーター、ヒトヒートショックプロモーター、サイトメ
ガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどの
下流に組み込むのが好ましい。発現に用いる細胞は本発
明のタンパク質の発現が確認できるものであれば、いか
なる細胞であってもよいが、好ましくは、GABAトランス
ポーター活性の低い細胞が用いられる。発現したGABAト
ランスポーターの量と質の検査はそれ自体公知の方法で
行うことができる。例えば、標識化したGABAの細胞内へ
の取り込み活性の測定の方法（ジャーナル・バイオロジ
カル・ケミストリー（The Journal of Biological Chem
istry） ,第267巻,第29号,21098〜21104頁（1992
年））、標識化したGABA取り込み阻害化合物の細胞への
結合活性の測定の方法(ブレイン・リサーチ(Brain Rese
arch),第647巻,231〜241頁(1994年))に従って行なうこ
とができる。より具体的には、まず、本発明のタンパク
質を含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養す
る。GABAの取り込みに適当なバッファーに交換した後、
試験化合物及び標識化したGABAを添加して一定時間イン
キュベートさせ、GABAの取り込みに適当なバッファーで
洗浄する。その後、細胞に取り込まれた標識化したGABA
の量を測定することによりスクリーニングできる。

【００２３】試験化合物としては、例えば、ペプチド、
タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産
物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが用
いられ、これら化合物は新規な化合物であってもよい
し、公知の化合物であってもよい。本発明のタンパク質
の活性を阻害する化合物は、例えば、不安、けいれん、
てんかん、精神分裂病、脳血管障害や、脳性麻痺、痙性
脊髄麻痺、変形性脊椎症、脊髄小脳変性症、多発性硬化
症などに伴う痙性麻痺、緊張型頭痛、腰痛症、頸肩腕症
候群などに対する安全で低毒性な医薬として有用であ
る。一方、本発明のタンパク質の活性を促進する化合物
は、例えば、アルツハイマーを含む痴呆症などに対する
安全で低毒性な医薬として有用である。また、本発明の
タンパク質は浸透圧調節作用を有するため、本発明のタ
ンパク質の活性を促進または阻害する化合物は、腎尿管
結石時の利尿、脳腫瘍時の脳圧降下、緑内障の眼圧降
下、脳浮腫の予防・治療剤、脳圧、眼圧亢進状態の是正
剤、乏尿、浮腫頭蓋内圧亢進、頭蓋内浮腫の治療剤、脳
外科手術後の後療法剤、急性腎不全時の乏尿もしくは無
尿の予防・治療剤として用いることができる。本発明の
スクリーニング用キットは、本発明のタンパク質（好ま
しくは本発明のタンパク質発現細胞（具体的には、後述
の実施例５で用いられるＬＭ（ＴＫ⁻細胞等）を含有す
るものである。

【００２４】本発明のスクリーニング用キットの例とし
ては、次のものが挙げられる。 〔スクリーニング用試薬〕 測定用緩衝液 ＧＡＢＡ取り込み用Buffer(150mM NaCl、20mM HEPES、1
mM CaCl₂、10mM Glucose、5mM KCl、1mM MgCl₂、pH7.4
に調製) [³H]-GABA 本発明のタンパク質標品 本発明のタンパク質発現細胞 本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キ
ットを用いて得られる化合物またはその塩を上述の医薬
組成物（予防・治療剤）として使用する場合、常套手段
に従って実施することができる。例えば、錠剤、カプセ
ル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶
液、懸濁液剤などとすることができる。このようにして
得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒト
や哺乳動物（例えば、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、
ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非
経口的に投与することができる。該化合物またはその塩
の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどによ
り差異はあるが、例えば、不安、てんかん、精神分裂病
などの治療の目的で本発明のタンパク質に対する阻害剤
を経口投与する場合、一般的に成人（６０ｋｇとして）
においては、一日につき該阻害剤を約０.１ｍｇ〜１０
０ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましく
は約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場
合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患など
によっても異なるが、例えば、不安、てんかん、精神分
裂病などの治療の目的で本発明のタンパク質に対する阻
害剤を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）に投与
する場合は、一日につき該阻害剤を約０．０１〜３０ｍ
ｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ま
しくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与す
るのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当た
りに換算した量を投与することができる。

【００２５】（１a）GABAトランスポーター活性を変化
させる化合物のスクリーニング方法 本発明のタンパク質を用いるか、または本発明のタンパ
ク質の発現系を構築し、該発現系を用いたGABAトランス
ポーター活性測定系を用いるとともに、適宜、他のGABA
トランスポーター活性を有するタンパク質（GAT-1、GAT
-3、BGT-1など）の発現系を用いたGABAトランスポータ
ー活性測定系を用いて、それぞれの活性を比較すること
によって、GABAトランスポーターの特定のサブタイプに
特異的なGABAトランスポーター活性を変化させる化合物
（例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合
物、合成化合物、発酵生産物など）またはその塩を効率
よくスクリーニングすることができる。すなわち、本発
明は、本発明のタンパク質を用いてGABAトランスポータ
ー活性を測定することを特徴とするGABAトランスポータ
ー活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスク
リーニング方法を提供するものである。このような化合
物には、本発明のタンパク質のGABAトランスポーター活
性を増強し、他のタブタイプ（GAT-1、GAT-3、BGT-1な
ど）のGABAトランスポーター活性を増強しない（または
阻害しない）化合物、あるいは本発明のタンパク質のGA
BAトランスポーター活性を増強せず（または阻害せ
ず）、他のタブタイプ（GAT-1、GAT-3、BGT-1など）のG
ABAトランスポーター活性を増強する化合物などが含ま
れる。特に、本発明のタンパク質の発現系を用いたGABA
トランスポーター活性測定系と、GAT-1またはGAT-3タン
パク質の発現系を用いたGABAトランスポーター活性測定
系を組み合わせて用いることが好ましい。他のタブタイ
プ（GAT-1、GAT-3、BGT-1など）発現系を用いたGABAト
ランスポーター活性測定系は、本発明の蛋白質の発現系
を用いたGABAトランスポーター活性測定系と同様の方法
により構築することができる。

【００２６】このようにして得られたGABAトランスポー
ター活性を阻害する化合物は、例えば、不安、けいれ
ん、てんかん、精神分裂病、脳血管障害や、脳性麻痺、
痙性脊髄麻痺、変形性脊椎症、脊髄小脳変性症、多発性
硬化症などに伴う痙性麻痺、緊張型頭痛、腰痛症、頸肩
腕症候群などに対する安全で低毒性な医薬として有用で
ある。一方、 GABAトランスポーター活性を促進する化
合物は、例えば、アルツハイマーを含む痴呆症などに対
する安全で低毒性な医薬として有用である。また、本発
明のタンパク質は浸透圧調節作用を有するため、GABAト
ランスポーター活性を促進または阻害する化合物は、腎
尿管結石時の利尿、脳腫瘍時の脳圧降下、緑内障の眼圧
降下、脳浮腫の予防・治療剤、脳圧、眼圧亢進状態の是
正剤、乏尿、浮腫頭蓋内圧亢進、頭蓋内浮腫の治療剤、
脳外科手術後の後療法剤、急性腎不全時の乏尿もしくは
無尿の予防・治療剤として用いることができる。本発明
のスクリーニング用キットは、本発明のタンパク質（好
ましくは本発明のタンパク質発現細胞および他のタブタ
イプ（GAT-1、GAT-3、BGT-1など）タンパク質（好まし
くは、他のタブタイプ（GAT-1、GAT-3、BGT-1など）タ
ンパク質発現細胞（具体的には、後述の実施例５で用い
られるＬＭ（ＴＫ^-細胞等））を含有するものである。

【００２７】本発明のスクリーニング用キットの例とし
ては、次のものが挙げられる。 〔スクリーニング用試薬〕 測定用緩衝液 GABA取り込み用Buffer(150mM NaCl、20mM HEPES、1mM C
aCl₂、10mM Glucose、5mM KCl、1mM MgCl₂、pH7.4に調
製) [³H]-GABA 本発明のタンパク質標品および他のタブタイプ（GAT-
1、GAT-3、BGT-1など）タンパク質標品 本発明のタンパク質発現細胞および他のタブタイプ（GA
T-1、GAT-3、BGT-1など）タンパク質 該スクリーニング方法をまたはスクリーニング用キット
を用いて得られる化合物またはその塩を上述の医薬組成
物として使用する場合、常套手段に従って実施すること
ができる。例えば、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、
マイクロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁液剤などとする
ことができる。このようにして得られる製剤は安全で低
毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラ
ット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル
など）に対して経口的または非経口的に投与することが
できる。該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、
投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例え
ば、不安、てんかん、精神分裂病などの治療の目的で本
発明のタンパク質に対する阻害剤を経口投与する場合、
一般的に成人（６０ｋｇとして）においては、一日につ
き該阻害剤を約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約
１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ
投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回
投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、
例えば、不安、てんかん、精神分裂病などの治療の目的
で本発明のタンパク質に対する阻害剤を注射剤の形で通
常成人（６０ｋｇとして）に投与する場合は、一日につ
き該阻害剤を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約
０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０
ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。
他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与
することができる。

【００２８】（２）本発明のタンパク質、その部分ペプ
チドまたはそれらの塩の定量 本発明の抗体は、本発明のタンパク質を特異的に認識す
ることができるので、被検液中の本発明のタンパク質の
定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使
用することができる。すなわち、本発明は、例えば、
（ｉ）本発明の抗体と、被検液および標識化された本発
明のタンパク質とを競合的に反応させ、該抗体に結合し
た標識化された本発明のタンパク質の割合を測定するこ
とを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質の定量
法、（ii）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体お
よび標識化された本発明の抗体とを同時あるいは連続的
に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定
することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質の
定量法を提供する。上記（ii）においては、一方の抗体
が本発明のタンパク質のＮ端部を認識する抗体で、他方
の抗体が本発明のタンパク質のＣ端部に反応する抗体で
あることが好ましい。本発明のタンパク質に対するモノ
クローナル抗体（以下、本発明のモノクローナル抗体と
称する場合がある）を用いて本発明のタンパク質の測定
を行なえるほか、組織染色等による検出を行なうことも
できる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いて
もよく、また、抗体分子のＦ(ａｂ')₂ 、Ｆａｂ'、ある
いはＦａｂ画分を用いてもよい。本発明のタンパク質に
対する抗体を用いる測定法は、特に制限されるべきもの
ではなく、被測定液中の抗原量（例えば、本発明のタン
パク質量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複
合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これ
を既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線
より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いて
もよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメト
リック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、
感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いる
のが特に好ましい。標識物質を用いる測定法に用いられ
る標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍
光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素と
しては、例えば、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹³¹Ｉ〕、〔³Ｈ〕、〔
¹⁴Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比
活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシ
ダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファター
ゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用い
られる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミ
ン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられ
る。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノー
ル誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられ
る。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオ
チン−アビジン系を用いることもできる。抗原あるいは
抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、ま
た通常、タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化す
るのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体
としては、例えば、アガロース、デキストラン、セルロ
ースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリル
アミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等が用
いられる。サンドイッチ法においては不溶化した本発明
のモノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反
応）、さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗
体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識
剤の活性を測定することにより被検液中の本発明のタン
パク質量を定量することができる。１次反応と２次反応
は逆の順序に行なっても、また、同時に行なってもよい
し時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶
化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、
サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体
あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類
である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２
種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。本発明のサン
ドイッチ法による本発明のタンパク質の測定法において
は、１次反応と２次反応に用いられる本発明のモノクロ
ーナル抗体は本発明のタンパク質の結合する部位が相異
なる抗体が好ましく用いられる。即ち、１次反応および
２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用い
られる抗体が、本発明のタンパク質のＣ端部を認識する
場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部
以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。本発
明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定シ
ステム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいは
ネフロメトリーなどに用いることができる。競合法で
は、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的
に反応させたのち、未反応の標識抗原（Ｆ）と、抗体と
結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、
Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を
定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用
い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に
対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体
として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可
溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固
相化法とが用いられる。イムノメトリック法では、被検
液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対し
て競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるい
は、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応さ
せ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に
結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれ
かの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗
原抗体反応の結果、生じた不溶性の沈降物の量を測定す
る。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか
得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザー
ネフロメトリーなどが好適に用いられる。これら個々の
免疫学的測定法を本発明の測定方法に適用するにあたっ
ては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。そ
れぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通
常の技術的配慮を加えて本発明のタンパク質の測定系を
構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細につ
いては、総説、成書などを参照することができる〔例え
ば、入江 寛編「ラジオイムノアッセイ〕（講談社、昭
和４９年発行）、入江 寛編「続ラジオイムノアッセ
イ〕（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素
免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治
ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５
７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３
版）（医学書院、昭和６２年発行）、「メソッズ・イン
・エンジモノジー（Methods in ENZYMOLOGY）」 Vol. 70
(Immunochemical Techniques(Part A))、 同書 Vol. 73
(Immunochemical Techniques(PartB))、 同書 Vol. 74
(Immunochemical Techniques(Part C))、 同書 Vol. 84
(Immunochemical Techniques(Part D:Selected Immunoa
ssays))、 同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(P
art E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassa
y Methods))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniq
ues(Part I:HybridomaTechnology and Monoclonal Anti
bodies))(以上、アカデミックプレス社発行)など参
照〕。以上のように、本発明の抗体を用いることによっ
て、本発明のタンパク質を感度良く定量することができ
る。

【００２９】（３）中和抗体 本発明の抗体のうち本発明のタンパク質の細胞外領域に
結合し、本発明のタンパク質の機能（例えば、GABAトラ
ンスポーター活性）を抑制できる中和抗体は、不安、け
いれん、てんかん、精神分裂病、脳血管障害や、脳性麻
痺、痙性脊髄麻痺、変形性脊椎症、脊髄小脳変性症、多
発性硬化症などに伴う痙性麻痺、緊張型頭痛、腰痛症、
頸肩腕症候群などの治療・予防剤として使用することが
出来る。本発明の抗体は、そのままで、あるいは摂取促
進のための補助剤などの生理学的に認められる担体とと
もに製剤化し、ヒトまたは温血動物に投与できる。

【００３０】（４）アンチセンスＤＮＡ 本発明のＤＮＡに相補的に結合し、該ＤＮＡの発現を抑
制することができるアンチセンスＤＮＡは、生体内にお
ける本発明のタンパク質またはＤＮＡの機能を抑制する
ことができるので、不安、けいれん、てんかん、精神分
裂病、脳血管障害や、脳性麻痺、痙性脊髄麻痺、変形性
脊椎症、脊髄小脳変性症、多発性硬化症などに伴う痙性
麻痺、緊張型頭痛、腰痛症、頸肩腕症候群などの治療・
予防剤として使用することができる。上記アンチセンス
ＤＮＡを上記の治療・予防剤として使用する場合、本発
明のアンチセンスＤＮＡを単独あるいはレトロウイルス
ベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスア
ソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクター
に挿入した後、常套手段に従ってヒトまたは温血動物に
投与することができる。本発明のアンチセンスＤＮＡ
は、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤など
の生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子
銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによっ
て投与できる。本発明のタンパク質またはその部分ペプ
チドをコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記
する場合がある）に実質的に相補的な塩基配列を有する
アンチセンスＤＮＡとしては、本発明のＤＮＡに実質的
に相補的な塩基配列を有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得
る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスＤ
ＮＡであってもよい。本発明のＤＮＡに実質的に相補的
な塩基配列とは、例えば、本発明のＤＮＡに相補的な塩
基配列（すなわち、本発明のＤＮＡの相補鎖）の全塩基
配列あるいは部分塩基配列と約９５％以上、好ましくは
約９８％以上の相同性を有する塩基配列などが挙げられ
る。特に、本発明のＤＮＡの相補鎖の全塩基配列うち、
本発明のタンパク質またはその部分ペプチドのＮ末端部
位をコードする部分の塩基配列（例えば、開始コドン付
近の塩基配列など）の相補鎖と約９５％以上、好ましく
は約９８％以上の相同性を有するアンチセンスＤＮＡが
好適である。これらのアンチセンスＤＮＡは、公知のＤ
ＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。

【００３１】（５）本発明のタンパク質をコードするＤ
ＮＡを有する非ヒト動物の作製 本発明のＤＮＡを用いて、本発明のタンパク質を発現す
るトランスジェニック非ヒト動物を作製することができ
る。非ヒト動物としては、哺乳動物（例えば、ラット、
マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サ
ルなど）など（以下、動物と略記する）が挙げれるが、
特に、マウス、ラットなどが好適である。本発明のＤＮ
Ａを対象動物に転移させるにあたっては、該ＤＮＡを動
物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合した遺
伝子コンストラクトとして用いるのが一般に有利であ
る。例えば、マウス由来の本発明のＤＮＡを転移させる
場合、これと相同性が高い動物由来のプロモーターであ
って、本発明のＤＮＡを動物細胞で発現させうる各種プ
ロモーターの下流に結合した遺伝子コンストラクトを、
例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションする
ことによって本発明のタンパク質を高産生するＤＮＡ転
移動物を作出できる。このプロモーターとしては、例え
ば、ウイルス由来プロモーター、メタロチオネイン等の
ユビキアスな発現プロモーターも使用しうる。受精卵細
胞段階における本発明のＤＮＡの転移は、対象動物の胚
芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保され
る。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明
のタンパク質が存在することは、作出動物の子孫が全て
その胚芽細胞及び体細胞の全てに本発明のタンパク質を
有することを意味する。遺伝子を受け継いだこの種の動
物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の
タンパク質を有する。本発明のＤＮＡ転移動物は、交配
により遺伝子を安定に保持することを確認して、該ＤＮ
Ａ保有動物として通常の飼育環境で飼育継代を行うこと
ができる。さらに、目的ＤＮＡを保有する雌雄の動物を
交配することにより、導入遺伝子を相同染色体の両方に
持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交
配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するよう
に繁殖継代することができる。本発明のＤＮＡが転移さ
れた動物は、本発明のタンパク質が高発現させられてい
るので、本発明のタンパク質に作用する薬剤のスクリー
ニング用の動物などとして有用である。本発明のＤＮＡ
転移動物を、組織培養のための細胞源として使用するこ
ともできる。例えば、本発明のＤＮＡ転移マウスの組織
中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するか、あるいは
遺伝子により発現された本発明のタンパク質が存在する
組織を分析することにより、本発明のタンパク質につい
て分析することができる。本発明のタンパク質を有する
組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを
使用して、例えば、脳や末梢組織由来のような一般に培
養困難な組織からの細胞の機能を研究することができ
る。また、その細胞を用いることにより、例えば、各種
組織の機能を高めるような医薬の選択も可能である。ま
た、高発現細胞株があれば、そこから、本発明のタンパ
ク質を単離精製することも可能である。

【００３２】本明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
Commission on Biochemical Nomenclature による略号
あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであ
り、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体
があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すもの
とする。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸 ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム Ｇｌｙ ：グリシン Ａｌａ ：アラニン Ｖａｌ ：バリン Ｌｅｕ ：ロイシン Ｉｌｅ ：イソロイシン Ｓｅｒ ：セリン Ｔｈｒ ：スレオニン Ｃｙｓ ：システイン Ｍｅｔ ：メチオニン Ｇｌｕ ：グルタミン酸 Ａｓｐ ：アスパラギン酸 Ｌｙｓ ：リジン Ａｒｇ ：アルギニン Ｈｉｓ ：ヒスチジン Ｐｈｅ ：フェニルアラニン Ｔｙｒ ：チロシン Ｔｒｐ ：トリプトファン Ｐｒｏ ：プロリン Ａｓｎ ：アスパラギン Ｇｌｎ ：グルタミン ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸 Ｍｅ ：メチル基 Ｅｔ ：エチル基 Ｂｕ ：ブチル基 Ｐｈ ：フェニル基 ＴＣ ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキ
サミド基

【００３３】また、本明細書中で繁用される置換基、保
護基および試薬を下記の記号で表記する。 Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルフォニル ＣＨＯ ：ホルミル Ｂｚｌ ：ベンジル Cl₂Bzl ：２，６−ジクロロベンジル Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル Ｚ ：ベンジルオキシカルボニル Ｃｌ−Ｚ ：２−クロロベンジルオキシカルボニ
ル Ｂｒ−Ｚ ：２−ブロモベンジルオキシカルボニ
ル Ｂｏｃ ：ｔ−ブトキシカルボニル ＤＮＰ ：ジニトロフェニル Ｔｒｔ ：トリチル Ｂｕｍ ：ｔ−ブトキシメチル Ｆｍｏｃ ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカル
ボニル ＨＯＢｔ ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール ＨＯＯＢｔ ：３,４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ
−４−オキソ−１,２,３−ベンゾトリアジン ＨＯＮＢ ：1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-
ジカルボキシイミド ＤＣＣ ：Ｎ、Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボ
ジイミド

【００３４】本願明細書の配列表の配列番号は、以下の
配列を示す。 ［配列番号：１］以下の実施例３で得られたヒトGAT2遺
伝子がコードする本発明タンパク質コードするアミノ酸
配列を示す。 ［配列番号：２］以下の実施例３で得られたヒトGAT2遺
伝子がコードする塩基配列を示す。 ［配列番号：３］以下の実施例１で用いられたプライマ
ーHGA2Uの塩基配列を示す。 ［配列番号：４］以下の実施例１で用いられたプライマ
ーHGA2Lの塩基配列を示す。 ［配列番号：５］以下の実施例２で用いられたプライマ
ーHGA2-198Lの塩基配列を示す。 ［配列番号：６］以下の実施例２で用いられたプライマ
ーHGA2-247Lの塩基配列を示す。 ［配列番号：７］以下の実施例２で用いられたプライマ
ーHGA2-1665Uの塩基配列を示す。 ［配列番号：８］以下の実施例２で用いられたプライマ
ーHGA2-1613Uの塩基配列を示す。 ［配列番号：９］以下の実施例２で用いられたプライマ
ーAP-1の塩基配列を示す。 ［配列番号：１０］以下の実施例２で用いられたプライ
マーAP-2の塩基配列を示す。 ［配列番号：１１］以下の実施例３で用いられたプライ
マーHGA2-U2の塩基配列を示す。 ［配列番号：１２］以下の実施例３で用いられたプライ
マーHGA2-L2の塩基配列を示す。

【００３５】後述の実施例４で得られたプラスミドpMCM
V-hGAT2を保持する形質転換体エシェリヒア コリ（Esc
herichia coli) DH5α／pMCMV-hGAT2は、１９９９年６
月２日から日本国茨城県つくば市東１−１−３、通商産
業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に
寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６７３９として、１９９９年
４月２８日から日本国大阪府大阪市十三本町２−１７−
８５、財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦ
Ｏ １６２８６として寄託されている。

【００３６】

【実施例】以下の実施例に記載の遺伝子操作法は、成書
（Maniatisら、モレキュラー・クローニング、Cold Spr
ing Harbor Laboratory、1989年）に記載されている方
法もしくは試薬の添付プロトコールに記載されている方
法に従った。

【００３７】実施例１ ヒトGAT2遺伝子の部分的クロー
ニング ヒトGAT2遺伝子の部分的なクローニングは、ヒト網膜cD
NA(東洋紡,QUICK-Clone cDNA)を鋳型とし、Bordenらが
報告（J.Biol.Chem. 267,21098-21104 (1992)）してい
るラットGAT2遺伝子の塩基配列を参考に作製したプライ
マーセット HGA2U 5'-GGT GGG ATG GAT AAC AGG GTC TCG GGA ACG [配列番号：3] HGA2L 5'-CCC TAG CAG TTA GAC TCC AGT TCT GTG AGC [配列番号：4] を用いたPCR法により行った。PCR 反応は AmpliWax PCR
Gem 100（宝酒造）を用いた Hot Start法で行った。下
層混液として、10 x LA PCR Buffer 2ml、2.5mM dNTP
溶液 3ml、25mM MgCl₂ 2ml、プライマー溶液（[配列番
号3]及び [配列番号4]）各2.5ml、滅菌蒸留水8mlを混合
した。上層混液としては、鋳型としてヒト網膜cDNA(1 n
g/ml)を1ml、10x LA PCR Buffer 3ml、2.5mM dNTP 溶液
1ml、25mM MgCl₂ 3ml、TaKaRa LA TaqDNA po1ymerase
（宝酒造） 0.5ml、滅菌蒸留水 21.5mlを混合した。調
製した下層混液に AmpliWax PCR Gem 100（宝酒造）を
1 個添加し、70℃ で 5分間、氷中で5分間処理後、上層
混液を加え PCRの反応液を調製した。反応液の入ったチ
ューブをサーマルサイクラー（パーキンエルマー社）に
セットした後、95℃で2分間処理した。さらに、98℃で1
0秒間、60℃で30秒間、72℃で2分間のサイクルを 45 回
繰り返した後、72℃で8分間処理した。得られたPCR産物
をアガロースゲル(1%)電気泳動し、GAT2遺伝子を含む1.
8kbのDNA断片をゲルから回収した後、pT7Blue vector
(宝酒造)に挿入することによりプラスミドpT7-GAT2を作
製した。pT7-GAT2のPCR断片部分の塩基配列を確認した
ところ、ラットGAT2遺伝子と類似した配列を有してい
た。

【００３８】実施例２ ヒトGAT2遺伝子の5'及び3'領域
のクローニング 実施例1で得られたPCR断片の配列の5'及び3'領域部分は
ラットGAT2遺伝子の配列である。よって、ヒトGAT2遺伝
子の5'及び3'領域をクローニングするため、網膜及び腎
臓cDNA(東洋紡,Marathon Ready cDNA)を 鋳型とし、pT7
-GAT2の塩基配列を参考に作製した特異的プライマーセ
ット HGA2-198L 5'-GCA CCT CCC CCA TTT TTG TAG CAG [配列番号：5] HGA2-247L 5'-GAC AGG AAT GCC ACA GGT AAA GAG [配列番号：6] HGA2-1665U 5'-CTC TAC AGA CTC GGA ACC CTC AAG [配列番号：7] HGA2-1613U 5'-CCT GGG CTG GCT CCT GGC TCT GTC [配列番号：8] 及びMarathon Ready cDNAに添付されているプライマー
セット AP-1 5'-CCA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC [配列番号：9] AP-2 5'-ACT CAC TAT AGG GCT CGA GCG GC [配列番号：10] を用いたRACE（Rapid Amp1ification of cDNA End）法
によるnested PCR法で行った。5'領域の1回目のPCR 反
応は AmpliWax PCR Gem 100（宝酒造）を用いた Hot St
art法で行った。下層混液として、10x pyrobest DNA po
lymerase Buffer 2ml、2.5mM dNTP溶液 3ml、プライマ
ー溶液(HGA2-247L[配列番号：6]及びAP-1[配列番号：
9])各 1ml、滅菌蒸留水 13mlを混合した。上層混液とし
ては、鋳型としてヒト網膜及び腎臓cDNAを5ml、10x pyr
obest DNA polymerase Buffer 3ml、2.5mM dNTP溶液 1m
l、pyrobest DNA polymerase（宝酒造） 0.5ml、滅菌蒸
留水 20.5mlを混合した。調製した下層混液に AmpliWax
PCR Gem 100（宝酒造）を 1個添加し、70℃ で 5分
間、氷中で5分間処理後、上層混液を加えPCRの反応液を
調製した。反応液の入ったチューブをサーマルサイクラ
ー（パーキンエルマー社）にセットした後、94℃で2分
間処理した。さらに、94℃で5秒間、72℃で3分間を5サ
イクル、94℃で5秒間、70℃で3分間を5サイクル、94℃
で5秒間、68℃で3分間を25サイクル行った。次いで、得
られたPCR産物を鋳型としたnested PCRを行った。すな
わち、下層混液として、10x LA PCR Buffer 2ml、2.5mM
dNTP溶液 3ml、25mM MgCl₂ 2ml、プライマー溶液(HGA2
-198L[配列番号：5]及びAP-2[配列番号：10])各 1ml、
滅菌蒸留水 11mlを混合した。上層混液としては、鋳型
として5'領域のHGA2-247L及びAP-1のPCR産物を1ml、10x
LA PCR Buffer 3ml、2.5mM dNTP溶液 1ml、25mM MgCl₂
3ml、TaKaRa LA Taq DNA po1ymerase（宝酒造） 0.5m
l、滅菌蒸留水 21.5mlを混合した。調製した下層混液に
AmpliWax PCR Gem 100（宝酒造）を1個添加し、70℃で
5分間、氷中で5分間処理後、上層混液を加え PCRの反応
液を調製した。反応液の入ったチューブをサーマルサイ
クラー（パーキンエルマー社）にセットした後、94℃で
2分間処理した。さらに、94℃で5秒間、72℃で3分間を5
サイクル、94℃で5秒間、70℃で3分間を5サイクル、94
℃で5秒間、68℃で3分間を25サイクル行った。3'領域の
1回目のPCR反応は AmpliWax PCR Gem 100（宝酒造）を
用いた Hot Start法で行った。下層混液として、10x py
robest DNA polymerase Buffer 2 ml、2.5mM dNTP溶液
3ml、プライマー溶液(HGA2-1613U[配列番号：8]及びAP-
1[配列番号：9])各 1ml、滅菌蒸留水 13mlを混合した。
上層混液としては、鋳型としてヒト網膜及び腎臓cDNAを
5 ml、10x pyrobest DNA polymerase Buffer 3ml、2.5m
M dNTP溶液 1ml、pyrobest DNA polymerase（宝酒造）
0.5ml、滅菌蒸留水 20.5mlを混合した。調製した下層混
液に AmpliWax PCR Gem 100（宝酒造）を 1 個添加し、
70℃で5分間、氷中で5分間処理後、上層混液を加えPCR
の反応液を調製した。反応液の入ったチューブをサーマ
ルサイクラー（パーキンエルマー社）にセットした後、
94℃で2分間処理した。さらに、94℃で5秒間、72℃で3
分間を5サイクル、94℃で5秒間、70℃で3分間を5サイク
ル、94℃で5秒間、68℃で3分間を25サイクル行った。次
いで、得られたPCR産物を鋳型としたnested PCRを行っ
た。すなわち、下層混液として、10x pyrobest DNA pol
ymerase Buffer 2ml、2.5mMdNTP溶液 3ml、プライマー
溶液(HGA2-1665U[配列番号：7]及びAP-2[配列番号：1
0])各 1ml、滅菌蒸留水 13mlを混合した。上層混液とし
ては、鋳型として3'領域のHGA2-1613U及びAP-1のPCR産
物を1ml、10x pyrobest DNA polymerase Buffer 3ml、
2.5 mM dNTP溶液 1ml、pyrobest DNA polymerase（宝酒
造） 0.5ml、滅菌蒸留水 24.5mlを混合した。調製した
下層混液に AmpliWax PCR Gem 100（宝酒造）を1個添加
し、70℃で5分間、氷中で5分間処理後、上層混液を加え
PCRの反応液を調製した。反応液の入ったチューブをサ
ーマルサイクラー（パーキンエルマー社）にセットした
後、94℃で2分間処理した。さらに、94℃で5秒間、72℃
で3分間を5サイクル、94℃で5秒間、70℃で3分間を5サ
イクル、94℃で5秒間、68℃で3分間を25サイクル行っ
た。得られたそれぞれのPCR産物のダイレクトシーケン
スを行った結果、ラットGAT2遺伝子の5'及び3'領域と類
似した配列を有していた。 実施例３ ヒトGAT2遺伝子全長のクローニング ヒトGAT2遺伝子全長のクローニングは、ヒト腎臓QUICK-
Clone cDNA(東洋紡)とヒト網膜及び腎臓Marathon Ready
cDNA(東洋紡)の異なる3種類の鋳型を用いて、実施例2
で得られた5'及び3'領域の塩基配列を参考に作製した特
異的プライマーセット HGA2-U2 5'-GGC AGC GCT AGC AGG TCT GGC AGC AGC TT
C ACT AAG [配列番号：11] HGA2-L2 5'-TCA CCA GTC GAC GGC ACA CAG GCA CCA TC
C AAG GGC[配列番号：12] によりPCR法を行った。PCR反応はAmpliWax PCR Gem 100
（宝酒造）を用いたHot Start法で行った。ヒト腎臓QUI
CK-Clone cDNA(東洋紡)を鋳型とした場合、下層混液と
して、10x pyrobest DNA polymerase Buffer 2ml、2.5m
M dNTP溶液3ml、プライマー溶液（[配列番号11]及び
[配列番号12]）各1ml、滅菌蒸留水13mlを混合した。上
層混液としては、鋳型1ml、10x pyrobest DNA polymera
se Buffer 3ml、2.5mM dNTP溶液1ml、pyrobest DNA pol
ymerase（宝酒造）0.5ml、滅菌蒸留水24.5mlを混合し
た。調製した下層混液に AmpliWax PCR Gem 100（宝酒
造）を1個添加し、70℃で5分間、氷中で5分間処理後、
上層混液を加え PCRの反応液を調製した。ヒト網膜及び
腎臓Marathon Ready cDNA (東洋紡)を鋳型とした場合、
下層混液として、10x pyrobest DNA polymerase Buffer
2ml、2.5mM dNTP溶液3ml、プライマー溶液各1ml、滅菌
蒸留水13mlを混合した。上層混液としては、鋳型を5m
l、10x pyrobest DNA polymerase Buffer 3ml、2.5mM d
NTP溶液1ml、pyrobest DNA polymerase（宝酒造）0.5m
l、滅菌蒸留水20.5mlを混合した。調製した下層混液に
AmpliWax PCRGem 100（宝酒造）を1個添加し、70℃で5
分間、氷中で5分間処理後、上層混液を加え PCRの反応
液を調製した。反応液の入ったチューブをサーマルサイ
クラー（パーキンエルマー社）にセットした後、95℃で
2分間処理した。さらに、98℃で10秒間、60℃で30秒
間、72℃で2分間のサイクルを45回繰り返した後、72℃
で8分間処理した。それぞれの得られたPCR産物をアガロ
ースゲル(1%)電気泳動し、ヒト GAT2遺伝子を含む1.8kb
のDNA断片をゲルから回収した後、pT7Blue vector(宝酒
造)に挿入することによりヒト腎臓QUICK-Clone cDNA由
来のpT7-hGAT2 No.1-11、ヒト腎臓Marathon Ready cDNA
由来のpT7-hGAT2 No.3-6及びヒト網膜Marathon Ready c
DNA由来のpT7-hGAT2 No.4-13を作製した。3種類の異な
る鋳型由来のPCR断片部分の塩基配列は、すべて一致し
たことからヒトGAT2遺伝子[配列番号：2]を取得したこ
とを確認した。

【００３９】実施例４ ヒトGAT2発現用プラスミドの作
製 プラスミドpMCMVneoの5.6Kb NheI-SalI断片と実施例3
記載のプラスミドpT7-hGAT2 No.4-13のヒトGAT2遺伝子
を含む1.8Kb NheI-SalI断片を連結し、プラスミドpMCMV
-hGAT2を作製した。プラスミドpMCMV-hGAT2を用いて大
腸菌Escherichia coli DH5α株を形質転換してEscheric
hia coli DH5α／pMCMV-hGAT2を得た。実施例５ ヒトG
AT2発現用プラスミドのLM(TK^-)細胞への導入と発現細胞
の取得10% ウシ胎児血清(ライフテックオリエンタル)を
含むDMEM培地（ライフテックオリエンタル）を用いてテ
ィッシュカルチャーフラスコ750ml（コーニング）で生
育させたLM(TK^-)細胞を0.5g/Lトリプシン-0.2g/L EDTA
(ライフテックオリエンタル)処理によりで剥がした後、
細胞をPBS(ライフテックオリエンタル)で洗浄して遠心
(1000rpm,5分)し、PBSで懸濁した。次に、ジーンパルサ
ー（バイオラッド社）を用いて、下記の条件に従って、
DNAを細胞に導入した。即ち、0.4cmギャップのキュベッ
トに8×10⁶細胞と10mgの発現用プラスミドpMCMV-hGAT2
を加え、電圧0.25kV、キャパシタンス960mF下でエレク
トロポレーションした。その後、10% ウシ胎児血清を含
むDMEM培地に細胞を移し、24時間培養し、再び細胞を剥
がして遠心し、次に、ジェネティシン(ライフテックオ
リエンタル)を500mg/mlに加えた10% ウシ胎児血清を含
むDMEM培地で懸濁し、10⁴細胞/mlとなるように希釈して
96ウェルプレート（ベクトンディキンソン）に播種し
て、37℃の炭酸ガスインキュベーター中で培養すること
によりジェネティシン耐性形質転換株を得た。ついで、
GAT2発現を以下の方法で確認した。すなわち、得られた
形質転換株を96ウェルプレート（コーニング）で培養し
た後、GABA取り込み用Buffer(150mM NaCl、20mM HEPE
S、1mM CaCl₂、10mM Glucose、5mM KCl、1mM MgCl₂、pH
7.4に調製)に置換し、50nM [³H]-GABA添加により、[³H]
-GABAが取り込まれる細胞株、hGAT2/LM(TK^-)を選択した
（図２）。

【００４０】

【配列表】 [Sequence Listing] <110> Takeda Chemical Industries, Ltd. <120> Novel Protein and its DNA <130> B00121 <150> JP 11-163924 <151> 1999-06-10 <160> 12 <210> 1 <211> 602 <212> PRT <213> Human <400> 1 Met Asp Ser Arg Val Ser Gly Thr Thr Ser Asn Gly Glu Thr Lys Pro 1 5 10 15 Val Tyr Pro Val Met Glu Lys Lys Glu Glu Asp Gly Thr Leu Glu Arg 20 25 30 Gly His Trp Asn Asn Lys Met Glu Phe Val Leu Ser Val Ala Gly Glu 35 40 45 Ile Ile Gly Leu Gly Asn Val Trp Arg Phe Pro Tyr Leu Cys Tyr Lys 50 55 60 Asn Gly Gly Gly Ala Phe Phe Ile Pro Tyr Leu Val Phe Leu Phe Thr 65 70 75 80 Cys Gly Ile Pro Val Phe Leu Leu Glu Thr Ala Leu Gly Gln Tyr Thr 85 90 95 Ser Gln Gly Gly Val Thr Ala Trp Arg Lys Ile Cys Pro Ile Phe Glu 100 105 110 Gly Ile Gly Tyr Ala Ser Gln Met Ile Val Ile Leu Leu Asn Val Tyr 115 120 125 Tyr Ile Ile Val Leu Ala Trp Ala Leu Phe Tyr Leu Phe Ser Ser Phe 130 135 140 Thr Ile Asp Leu Pro Trp Gly Gly Cys Tyr His Glu Trp Asn Thr Glu 145 150 155 160 His Cys Met Glu Phe Gln Lys Thr Asn Gly Ser Leu Asn Gly Thr Ser 165 170 175 Glu Asn Ala Thr Ser Pro Val Ile Glu Phe Trp Glu Arg Arg Val Leu 180 185 190 Lys Ile Ser Asp Gly Ile Gln His Leu Gly Ala Leu Arg Trp Glu Leu 195 200 205 Ala Leu Cys Leu Leu Leu Ala Trp Val Ile Cys Tyr Phe Cys Ile Trp 210 215 220 Lys Gly Val Lys Ser Thr Gly Lys Val Val Tyr Phe Thr Ala Thr Phe 225 230 235 240 Pro Tyr Leu Met Leu Val Val Leu Leu Ile Arg Gly Val Thr Leu Pro 245 250 255 Gly Ala Ala Gln Gly Ile Gln Phe Tyr Leu Tyr Pro Asn Leu Thr Arg 260 265 270 Leu Trp Asp Pro Gln Val Trp Met Asp Ala Gly Thr Gln Ile Phe Phe 275 280 285 Ser Phe Ala Ile Cys Leu Gly Cys Leu Thr Ala Leu Gly Ser Tyr Asn 290 295 300 Lys Tyr His Asn Asn Cys Tyr Arg Asp Cys Ile Ala Leu Cys Phe Leu 305 310 315 320 Asn Ser Gly Thr Ser Phe Val Ala Gly Phe Ala Ile Phe Ser Ile Leu 325 330 335 Gly Phe Met Ser Gln Glu Gln Gly Val Pro Ile Ser Glu Val Ala Glu 340 345 350 Ser Gly Pro Gly Leu Ala Phe Ile Ala Tyr Pro Arg Ala Val Val Met 355 360 365 Leu Pro Phe Ser Pro Leu Trp Ala Cys Cys Phe Phe Phe Met Val Val 370 375 380 Leu Leu Gly Leu Asp Ser Gln Phe Val Cys Val Glu Ser Leu Val Thr 385 390 395 400 Ala Leu Val Asp Met Tyr Pro His Val Phe Arg Lys Lys Asn Arg Arg 405 410 415 Glu Val Leu Ile Leu Gly Val Ser Val Val Ser Phe Leu Val Gly Leu 420 425 430 Ile Met Leu Thr Glu Gly Gly Met Tyr Val Phe Gln Leu Phe Asp Tyr 435 440 445 Tyr Ala Ala Ser Gly Met Cys Leu Leu Phe Val Ala Ile Phe Glu Ser 450 455 460 Leu Cys Val Ala Trp Val Tyr Gly Ala Lys Arg Phe Tyr Asp Asn Ile 465 470 475 480 Glu Asp Met Ile Gly Tyr Arg Pro Trp Pro Leu Ile Lys Tyr Cys Trp 485 490 495 Leu Phe Leu Thr Pro Ala Val Cys Thr Ala Thr Phe Leu Phe Ser Leu 500 505 510 Ile Lys Tyr Thr Pro Leu Thr Tyr Asn Lys Lys Tyr Thr Tyr Pro Trp 515 520 525 Trp Gly Asp Ala Leu Gly Trp Leu Leu Ala Leu Ser Ser Met Val Cys 530 535 540 Ile Pro Ala Trp Ser Leu Tyr Arg Leu Gly Thr Leu Lys Gly Pro Phe 545 550 555 560 Arg Glu Arg Ile Arg Gln Leu Met Cys Pro Ala Glu Asp Leu Pro Gln 565 570 575 Arg Asn Pro Ala Gly Pro Ser Ala Pro Ala Thr Pro Arg Thr Ser Leu 580 585 590 Leu Arg Leu Thr Glu Leu Glu Ser His Cys 595 600 <210> 2 <211> 1806 <212> DNA <213> Human <400> 2 ATGGATAGCA GGGTCTCAGG CACAACCAGT AATGGAGAGA CAAAACCAGT GTATCCAGTC 60 ATGGAAAAGA AGGAGGAAGA TGGCACCCTG GAGCGGGGGC ACTGGAACAA CAAGATGGAG 120 TTTGTGCTGT CAGTGGCTGG GGAGATCATT GGCTTAGGCA ACGTCTGGAG GTTTCCCTAT 180 CTCTGCTACA AAAATGGGGG AGGTGCCTTC TTCATCCCCT ACCTCGTCTT CCTCTTTACC 240 TGTGGCATTC CTGTCTTCCT TCTGGAGACA GCACTAGGCC AGTACACTAG CCAGGGAGGC 300 GTCACAGCCT GGAGGAAGAT CTGCCCCATC TTTGAGGGCA TTGGCTATGC CTCCCAGATG 360 ATCGTCATCC TCCTCAACGT CTACTACATC ATTGTGTTGG CCTGGGCCCT GTTCTACCTC 420 TTCAGCAGCT TCACCATCGA CCTGCCCTGG GGCGGCTGCT ACCATGAGTG GAACACAGAA 480 CACTGTATGG AGTTCCAGAA GACCAACGGC TCCCTGAATG GTACCTCTGA GAATGCCACC 540 TCTCCTGTCA TCGAGTTCTG GGAGCGGCGG GTCTTGAAGA TCTCTGATGG GATCCAGCAC 600 CTGGGGGCCC TGCGCTGGGA GCTGGCTCTG TGCCTCCTGC TGGCCTGGGT CATCTGCTAC 660 TTCTGCATCT GGAAGGGGGT GAAGTCCACA GGCAAGGTGG TGTACTTCAC GGCCACATTT 720 CCTTACCTCA TGCTGGTGGT CCTGTTAATT CGAGGGGTGA CGTTGCCTGG GGCAGCCCAA 780 GGAATTCAGT TTTACCTGTA CCCAAACCTC ACGCGTCTGT GGGATCCCCA GGTGTGGATG 840 GATGCAGGCA CCCAGATATT CTTCTCCTTC GCCATCTGTC TTGGGTGCCT GACAGCCCTG 900 GGCAGCTACA ACAAGTACCA CAACAACTGC TACAGGGACT GCATCGCCCT CTGCTTCCTC 960 AACAGCGGCA CCAGCTTTGT GGCCGGCTTT GCCATCTTCT CCATCCTGGG CTTCATGTCT 1020 CAGGAGCAGG GGGTGCCCAT TTCTGAGGTG GCCGAGTCAG GCCCTGGCCT GGCTTTCATC 1080 GCTTACCCGC GGGCTGTGGT GATGCTGCCC TTCTCTCCTC TCTGGGCCTG CTGTTTCTTC 1140 TTCATGGTCG TTCTCCTGGG ACTGGATAGC CAGTTTGTGT GTGTAGAAAG CCTGGTGACA 1200 GCGCTGGTGG ACATGTACCC TCACGTGTTC CGCAAGAAGA ACCGGAGGGA AGTCCTCATC 1260 CTTGGAGTAT CTGTCGTCTC CTTCCTTGTG GGGCTGATCA TGCTCACAGA GGGCGGAATG 1320 TACGTGTTCC AGCTCTTTGA CTACTATGCG GCCAGTGGCA TGTGCCTCCT GTTCGTGGCC 1380 ATCTTCGAGT CCCTCTGTGT GGCTTGGGTT TACGGAGCCA AGCGCTTCTA CGACAACATC 1440 GAAGACATGA TTGGGTACAG GCCATGGCCT CTTATCAAAT ACTGTTGGCT CTTCCTCACA 1500 CCAGCTGTGT GCACAGCCAC CTTTCTCTTC TCCCTGATAA AGTACACTCC GCTGACCTAC 1560 AACAAGAAGT ACACGTACCC GTGGTGGGGC GATGCCCTGG GCTGGCTCCT GGCTCTGTCC 1620 TCCATGGTCT GCATTCCTGC CTGGAGCCTC TACAGACTCG GAACCCTCAA GGGCCCCTTC 1680 AGAGAGAGAA TCCGTCAGCT CATGTGCCCA GCCGAGGACC TGCCCCAGCG GAACCCAGCA 1740 GGACCCTCGG CTCCCGCCAC CCCCAGGACC TCACTGCTCA GACTCACAGA GCTAGAGTCT 1800 CACTGC 1806 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 GGTGGGATGG ATAACAGGGT CTCGGGAACG 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 CCCTAGCAGT TAGACTCCAG TTCTGTGAGC 30 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 GCACCTCCCC CATTTTTGTA GCAG 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 GACAGGAATG CCACAGGTAA AGAG 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 CTCTACAGAC TCGGAACCCT CAAG 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 CCTGGGCTGG CTCCTGGCTC TGTC 24 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 CCATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGC 27 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 ACTCACTATA GGGCTCGAGC GGC 23 <210> 11 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 GGCAGCGCTA GCAGGTCTGG CAGCAGCTTC ACTAAG 36 <210> 12 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 TCACCAGTCG ACGGCACACA GGCACCATCC AAGGGC 36

【００４１】

【発明の効果】本発明のタンパク質またはその塩、その
部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステル
またはその塩、およびそれらをコードするＤＮＡは、抗
体および抗血清の入手、本発明のタンパク質の発現系の
構築、同発現系を用いたGABAトランスポーターの活性を
測定する系の構築と医薬品候補化合物のスクリーニン
グ、GABAトランスポーターの立体構造にもとづいたドラ
ッグデザインの実施、遺伝子診断におけるプローブやＰ
ＣＲプライマーを作成するための試薬、トランスジェニ
ック動物の作製または遺伝子予防・治療剤等の医薬など
として用いることができる。

【００４２】

【図面の簡単な説明】

【図1】実施例で得られた、本発明のヒト由来タンパク
質のアミノ酸配列をもとに作成した、疎水性プロットを
示す。

【図2】本発明のタンパク質を発現させたhGAT2/LM(TK^-)
細胞にナトリウムイオンと塩素イオンを含むバッファー
中で[³H]-GABAを添加した後、取り込まれたラベル体の
増加量を測定した結果を示す。左側のグラフはhGAT2/LM
(TK^-)は、本発明のヒト由来タンパク質を発現させたLM
(TK^-)細胞を示し、右側のグラフはMock/LM(TK^-)は、プ
ラスミドpMCMVneoを導入したLM(TK^-)細胞を示す。左側
の数字は、hGAT2/LM(TK^-)細胞にナトリウムイオンと塩
素イオンを含むバッファー中で50nM [³H]-GABAを添加し
た後、ラベル体の取り込み量を測定した結果を示す。デ
ータは平均値±標準誤差として表した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 25/04 Ａ６１Ｐ 25/08 25/08 25/18 25/18 25/22 25/22 25/28 25/28 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 16/18 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と
   同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタ
   ンパク質またはその塩。
2. 【請求項２】GABAトランスポーター活性を有する請求項
   １記載のタンパク質またはその塩。
3. 【請求項３】請求項１記載のタンパク質の部分ペプチド
   もしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその
   塩。
4. 【請求項４】請求項１記載のタンパク質または請求項３
   記載の部分ペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮ
   Ａを含有するＤＮＡ。
5. 【請求項５】配列番号：２で表わされる塩基配列を有す
   る請求項４記載のＤＮＡ。
6. 【請求項６】請求項４記載のＤＮＡを含有する組換えベ
   クター。
7. 【請求項７】請求項６記載の組換えベクターで形質転換
   された形質転換体。
8. 【請求項８】請求項７記載の形質転換体を培養し、請求
   項１記載のタンパク質または請求項３記載の部分ペプチ
   ドを生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とす
   る請求項１記載のタンパク質またはその塩、または請求
   項３記載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそ
   のエステルまたはその塩の製造法。
9. 【請求項９】請求項１記載のタンパク質もしくはその
   塩、または請求項３記載の部分ペプチドもしくはそのア
   ミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体。
10. 【請求項１０】請求項１記載のタンパク質またはその
    塩、または請求項３記載の部分ペプチドもしくはそのア
    ミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いてGABAト
    ランスポーター活性を測定することを特徴とするGABAト
    ランスポーター活性を促進または阻害する化合物または
    その塩のスクリーニング方法。
11. 【請求項１１】請求項１記載のタンパク質またはその
    塩、または請求項３記載の部分ペプチドもしくはそのア
    ミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いることを
    特徴とする請求項１記載のタンパク質またはその塩、ま
    たは請求項３記載の部分ペプチドもしくはそのアミドも
    しくはそのエステルまたはその塩のGABAトランスポータ
    ー活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスク
    リーニング方法。
12. 【請求項１２】請求項１記載のタンパク質またはその
    塩、または請求項３記載の部分ペプチドもしくはそのア
    ミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有してなる
    GABAトランスポーター活性を促進または阻害する化合物
    またはその塩のスクリーニング用キット。
13. 【請求項１３】請求項１記載のタンパク質またはその
    塩、または請求項３記載の部分ペプチドもしくはそのア
    ミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有してなる
    請求項１記載のタンパク質またはその塩、または請求項
    ３記載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはその
    エステルまたはその塩のGABAトランスポーター活性を促
    進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング
    用キット。
14. 【請求項１４】請求項１０記載のスクリーニング方法ま
    たは請求項１２記載のスクリーニング用キットを用いて
    得られる、GABAトランスポーター活性を促進または阻害
    する化合物またはその塩。
15. 【請求項１５】請求項１１記載のスクリーニング方法ま
    たは請求項１３記載のスクリーニング用キットを用いて
    得られる、請求項１記載のタンパク質またはその塩、ま
    たは請求項３記載の部分ペプチドもしくはそのアミドも
    しくはそのエステルまたはその塩のGABAトランスポータ
    ー活性を促進または阻害する化合物またはその塩。
16. 【請求項１６】請求項１０記載のスクリーニング方法ま
    たは請求項１２記載のスクリーニング用キットを用いて
    得られる、GABAトランスポーター活性を促進または阻害
    する化合物またはその塩を含有してなる医薬。
17. 【請求項１７】請求項１１記載のスクリーニング方法ま
    たは請求項１３記載のスクリーニング用キットを用いて
    得られる、請求項１記載のタンパク質またはその塩、ま
    たは請求項３記載の部分ペプチドもしくはそのアミドも
    しくはそのエステルまたはその塩のGABAトランスポータ
    ー活性を促進または阻害する化合物またはその塩を含有
    してなる医薬。
18. 【請求項１８】不安症、痙攣、てんかん、精神分裂病、
    脳血管障害、脳性麻痺、痙性脊髄麻痺、変形性脊椎症、
    脊髄小脳変性症、多発性硬化症に伴う痙性麻痺、緊張型
    頭痛、腰痛症、頸肩腕症候群の予防・治療剤である、請
    求項１記載のタンパク質またはその塩、請求項３記載の
    部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステル
    またはその塩のGABAトランスポーター活性を阻害する化
    合物またはその塩を含有してなる医薬。
19. 【請求項１９】痴呆症の予防・治療剤である、請求項１
    記載のタンパク質またはその塩、請求項３記載の部分ペ
    プチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたは
    その塩のGABAトランスポーター活性を促進する化合物ま
    たはその塩を含有してなる医薬。