CN103194476A - 鸡pcdh1基因部分片段的克隆、表达及多克隆抗体的制备 - Google Patents

Abstract

发明涉及protocadherin1(pcdh1)基因的部分序列在制备多克隆抗体和表达检测中的应用，具体而言，是对鸡pcdh1基因的部分序列进行了PCR扩增，插入到表达载体，并通过在大肠杆菌E.coliBL21中原核表达和融合蛋白亲和纯化，把纯化的蛋白与弗氏完全佐剂混合乳化后通过足垫等部位多点注射免疫SD大鼠,快速地产生针对目的抗原的特异性抗体。利用该方法快速制作的免疫血清，对不同发育阶段鸡胚中的pcdh1基因的表达情况进行检测，说明利用本方法制作的针对pcdh1蛋白部分肽段的多抗有望成为pcdh1基因蛋白表达检测的有效工具。

Description

鸡pcdh1基因部分片段的克隆、表达及多克隆抗体的制备

技术领域

本发明涉及一种多克隆抗体制作技术，具体而言，就是利用设计的特定引物，通过相应手段原核表达和纯化目的蛋白，免疫动物制作免疫血清，进而通过实验阐明本抗血清用作pcdh1基因蛋白表达检测的可行性。

背景技术

原钙粘蛋白（Protocadherins，pcdh）是一种带有亲同种抗原粘附活性的跨膜蛋白，是钙粘蛋白超家族中最大的亚群。pcdh主要在中枢神经系统中表达，迄今为止已经发现大约有60多种pcdh在大脑中表达。现有的研究表明，pcdh对神经元突触的发育有直接的影响。pcdh分子不仅可以作为粘附分子加强神经突触的连接，而且还可以作为受体在信号转导过程中起到一定作用。此外，pcdh参与细胞迁移和细胞分选，神经元回路和神经突触的建立以及细胞存活和细胞生长抑制。一些pcdh基因的突变已经与一些人类疾病联系在了一起。比如，pcdh12功能的缺失会导致动脉管壁的结构和功能发生改变，通过启动子的高度甲基化使pcdh17沉默表达会导致pcdh17肿瘤抑制活性的消失，说明pcdh17的表达可以抑制食管癌的发生；临床研究表明pcdh21等位突变可导致隐形视网膜色素变性；pcdh19的突变或者缺失会造成女性患家族性的癫痫；Koppelman等发现pcdh1是气道高反应的易感基因，又有研究表明pcdh1是引发哮喘的并且在呼吸道上皮组织表达的一个新的易感基因。虽然目前我们对pcdh的功能有了一定的了解，但是有些pcdh在胚胎发育及病理过程中的时空表达及作用机制仍然不清楚。

本发明所述以鸡源pcdh1（GeneBank收录号NM_001045827）为研究对象，建立制备其多克隆抗体的方法以及制备鸡源pcdh1的多克隆抗体和用于其表达检测，迄今未见相关报道。 

本发明目的在于，通过克隆、异源表达和纯化pcdh1特定肽段的融合蛋白，作为抗原免疫动物，制作pcdh1多克隆抗体，利用此抗体检测鸡pcdh1基因在各种生理病理条件下的表达，进而提供一种pcdh1的表达检测试剂用于基础及医疗实践。

发明内容

本发明首先根据鸡pcdh1基因（GeneBank收录号NM_001045827）的序列，先用Globplot2.3软件分析pcdh1的跨膜区，然后再用DNAStar 引物设计软件设计pcdh1膜内区段引物：

    上游引物5’-GGGATCCTCCTGCCTGGCCCTGTGGTTCCTCT-3，

    下游引物5’-GGAATTCCTCGGGGCCAGCCAGCAGTTCATA-3’； 

上游引物和下游引物分别添加BamHI 和 EcoRI酶切位点（下划线所示）。

从一周左右的鸡胚脑组织中提取总RNA，RT-PCR反转录合成cDNA，再以cDNA为模板PCR扩增膜外目的片段。将目的片段连入表达载体，筛选阳性重组质粒。

本发明目的之一在于提供一种鸡源pcdh1特异性多克隆抗体。

本发明的目的之二在于提供制备该克隆抗体的方法。

本发明的目的之三在于提供克隆表达该pcdh1肽段的序列引物，该引物还可以用于RT-PCR来检测该基因的mRNA表达水平。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种鸡源pcdh1特异性多克隆抗体，其特征在于所述的特异性多克隆抗体是将pcdh1氨基酸序列的第33位到204位氨基酸残基组成的多肽特异性结合。

上述的特异性多克隆抗体是将pcdh1第33位到204位氨基酸残基对应的cDNA序列构建到原核表达质粒pGEX-2TK中，得到重组质粒pGEX-2TK-pcdh101，再将该重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到可溶表达带有鸡源pcdh1第33位到204位氨基酸残基的多肽融和蛋白。

上述的特异性多克隆抗体是将多肽融和蛋白作为抗原免疫动物而获得。

一种制备上述的鸡源pcdh1特异性多克隆抗体的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

a.对pcdh1氨基酸序列进行了蛋白跨膜结构预测，其中第1到239位氨基酸为胞外段结构；

b.用PCR扩增处于胞外段第33到204位氨基酸残基对应的cDNA，重组入pGEX-2TK中，构建成pGEX-2TK-pcdh101载体；

c.将载体转化到E.coli BL21(DE3)中，原核可溶表达表达得到包含目的DCFI多肽的可溶性融合蛋白；

d.将融合蛋白为抗原免疫动物燥，得到以上述制备的蛋白，按照多抗免疫方案进行动物免疫，得到特异性多克隆抗体。

利用Western Blot技术对制备得到的多克隆抗体进行特异性评测。同时利用制备的上述多克隆抗体能够检测到鸡胚组织pcdh1蛋白的表达。

制备的多克隆抗体也检测到了pcdh1的蛋白表达变化，说明制备的多克隆抗体可以用来检测鸡胚不同时期pcdh1的表达水平。

本发明为此提供了以下的生物学实验：

1）pcdh1基因的RT-PCR检测实验；

2）Western blotting方法检测鸡胚组织中pcdh 1的表达水平。

本发明的优点与积极效果在于，设计合成了克隆鸡pcdh1第33位到204位氨基酸残基的引物，并且此引物可以用于RT-PCR检测pcdh1基因的mRNA表达水平；制作了针对鸡pcdh1蛋白的鼠源多克隆抗体，实验证明此抗体可用于Western blot检测pcdh1的蛋白表达水平。

附图说明

图1 pcdh1基因pcdh101片段PCR扩增产物的0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。其中：

泳道M. DNA marker；

泳道1. pcdh101 PCR扩增片断；              

缩写：bp，base pair。

图2 重组表达载体的PCR及酶切检测。其中：

泳道1. PCR扩增pET32a-pcdh101 产生的目的片断pcdh101； 

泳道2. BamH I和EcoR I 双酶切pET32a-pcdh101； 

泳道3. pET32a-pcdh101； 

泳道4. PCR扩增pGEX-2TK-pcdh101 产生的目的片断pcdh101；

泳道5. BamH I 和EcoR I双酶切pGEX-2TK-pcdh101；

泳道6. pGEX-2TK-101；

缩写：bp，base pair；M，DNA marker。

图3 GST-PCDH101融合蛋白的SDS-PAGE 电泳检测。其中：

泳道1. 未诱导的含pGEX-2TK-pcdh101质粒的大肠杆菌BL21全蛋白；

泳道2. 诱导的含pGEX-2TK-pcdh101质粒的大肠杆菌BL21全蛋白； 

泳道3. 未诱导的含pGEX-2TK-pcdh101质粒的大肠杆菌BL21裂解沉淀； 

泳道4. 诱导的含pGEX-2TK-pcdh101质粒的大肠杆菌BL21裂解沉淀； 

泳道5. 未诱导的含pGEX-2TK-pcdh101质粒的大肠杆菌BL21裂解上清； 

泳道6. 诱导的含pGEX-2TK-pcdh101质粒的大肠杆菌BL21裂解上清。

图4 SDS-PAGE 分析 (His)₆-101 融合蛋白和纯化蛋白。其中：

泳道1. 未诱导的含pET32a-pcdh101质粒的BL21总蛋白；

泳道2. IPTG诱导的含pET32a-pcdh101质粒的大肠杆菌BL21全蛋白； 

泳道3. IPTG诱导的含pET32a-pcdh101质粒的大肠杆菌BL21沉淀； 

泳道4、5. IPTG诱导的含pET32a-pcdh101质粒的大肠杆菌BL21上清； 

泳道6. 纯化的(His)₆-PCDH101融合蛋白。 

图5 SDS-PAGE 分析重组 GST-PCDH101 融合蛋白。其中：

泳道1. 未诱导的含pGEX-2TK-pcdh101质粒的大肠杆菌BL21全蛋白； 

泳道2. IPTG未诱导的含pGEX-2TK-pcdh101质粒的大肠杆菌BL21全蛋白； 

泳道3、4. 纯化的GST-PCDH101 融合蛋白(星号标示目的蛋白)；M，蛋白marker。

图6 Western blot 分析抗体特异性。其中：

泳道1. 37℃ IPTG诱导的BL21全蛋白（含pET32a-pcdh 1701质粒）；

泳道2. 纯化的 (His)₆-pcdh101 融合蛋白；

泳道3. 纯化的 GST-pcdh101 融合蛋白。

图7 Western blot 分析pcdh1在鸡胚不同发育阶段及不同部位的表达情况。其中：

泳道1. 发育 6.5天的鸡胚脊索； 

泳道2、3、4分别是发育6.5天、7.5天、8.5天鸡胚胎中pcdh1的表达。

图8 pcdh1基因在各个时期的mRNA水平RT-PCR半定量分析。 

实施例 

以下实施例仅为帮助所属领域技术人员更好的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

（1）引物设计及载体的构建

先用Globplot2.3软件分析pcdh1的跨膜区，然后再用DNAStar引物设计软件设计pcdh1膜内区段引物：

上游引物5’-GGGATCCTCCTGCCTGGCCCTGTGGTTCCTCT-3，

下游引物5’-GGAATTCCTCGGGGCCAGCCAGCAGTTCATA-3’； 

上游引物和下游引物分别添加BamHI 和 EcoRI酶切位点（下划线所示）。

用发育一周左右的鸡胚脑组织提取总RNA，RT-PCR反转录合成cDNA。再以cDNA为模板PCR扩增膜内目的片段，电泳结果如图1所示。将目的片段连入T载体测序验证无误后再分别插入表达载体pGEX-2TK和pET32a中构建成pGEX-2TK-pcdh101和pET32a-pcdh101表达质粒，酶切鉴定结果如图2所示。

（2）重组载体在大肠杆菌中的诱导和表达和纯化

将经测序正确的重组质粒pGEX-2TK-pcdh101和pET32a-pcdh101表达质粒分别转入E.coli BL21，在含羧苄的LB培养基中进行筛选培养。挑取单克隆至含羧苄LB培养基中，37℃培养过夜。以1:50的比例接种于含羧苄LB培养基中，于37℃培养至对数期（A₅₅₀为0.5-1.0）时，加入IPTG至终浓度0.1mmol/L，21℃继续培养6-7h。离心收集菌体，PBS洗涤两次，超声波破碎，12000rpm离心10min，收集上清。用Glutathione-sepharose 4B柱亲和层析纯化GST-PCDH1融合蛋白。SDS-PAGE电泳检测，考马斯亮蓝R-250染色30min，乙醇-冰醋酸脱色后观察，结果如图3~5所示。

(3)免疫大鼠

取10周左右的大鼠3只，腹腔注射戊巴比妥（75mg/kg），每只断尾取100μL外周血样本作为免疫前血清。每只大鼠脚垫注射200μL乳剂（含200μg目的蛋白，用等量的生理盐水和弗氏完全佐剂乳化）。两周后，每只取100μL的外周血检测血清抗体的浓度，然后用相同剂量的乳剂加强免疫。强化免疫一周后，用乙醚将大鼠深度麻醉，通过股大腿静脉收集所有的血液，37℃孵育30min,使血清分离出来，然后1000rmp，4℃，离心20min，收集血清，将血清每20μL分装，储存于-80℃。

（4）间接ELISA检测

用纯化的(His)₆-PCDH1包被酶标板，每孔100μL，4℃过夜，（(His)₆-PCDH1用pH9.6，0.05M的碳酸盐包被缓冲液稀释成1-10μg）。弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液PBST洗涤3次，每次轻敲板壁。用PBST（含有1%的Tween20）配制的5%的脱脂奶粉（每孔200μL）37℃封闭2h。将按一定比例稀释的血清加入酶标板中37℃孵育2-3h（每孔100μL），PBST洗涤3-5次，将HRP标记的山羊抗大鼠（1:5000）加入各孔，每孔100μL，37℃孵育1h，PBST洗涤3-5次，每孔加100μL的TMB底物显色液，作用5-10min，用2M的浓硫酸终止反应（每孔100μL），450nm下测定OD值。结果表明在稀释度大于1:5000时仍能很好的发挥作用。

（5）Western Bloting检测抗体特异性

分别取37℃IPTG诱导的E.coliBL21全蛋白（含pET32a-pcdh 1701质粒）、纯化的 (His)₆- pcdh 101 融合蛋白及纯化的 GST-pcdh101 融合蛋白作加入一定量的5×上样Buffer煮沸5min进行SDS-PAGE电泳，分离胶浓度10%，200mA转膜3h至PVDF膜上，用5%的脱脂奶粉（g/ml，含1%Tween20的TBST配制）室温封闭2-3h，用TBST稀释的一抗（(His)₆-PCDH1，1:500）室温孵育2-3h或者4℃过夜，TBST洗涤3次，每次10min，用TBST稀释的二抗（HRP标记的山羊抗大鼠，1:5000）室温孵育1h，TBST洗涤3次，每次10min。然后用ECL发光试剂进行发光，在暗示进行曝光，显影、定影后观察，结果如图6所示，表明此多克隆抗体具有较好的特异性。

（6）鸡胚不同发育时期pcdh 1的表达检测

用匀浆器对E6.5的鸡胚的躯干，E6.5、E7.5、E8.5的鸡胚的鸡脑进行研碎，12000rmp、4℃离心5min，分离上清，加入一定量的5×上样Buffer煮沸5min进行SDS-PAGE电泳。200mA转膜3h至PVDF膜上，用5%的脱脂奶粉（g/ml，含1%Tween20的TBST配制）室温封闭2-3h，用TBST稀释的一抗（(His)₆-PCDH1，1:500）室温孵育2-3h或者4℃过夜，TBST洗涤3次，每次10min，用TBST稀释的二抗（HRP标记的山羊抗大鼠，1:5000）室温孵育1h，TBST洗涤3次，每次10min。然后用ECL发光试剂进行发光，在暗示进行曝光，显影、定影后观察，实验结果如图6-7所示，表明此多抗可以灵敏和有效检测鸡胚中pcdh 1蛋白的表达。

（7）鸡胚中pcdh1基因mRNA表达水平的半定量RT-PCR检测

用TRIzol提取不同发育时期(E4, E4.5, E5.5, E6.5, E7.5, E9, E10, E11.5, E12, E13)鸡胚脑的总RNA，用Fermentas RevertAid First Strand Synhesis Kit反转录cDNA，GAPDH作为阳性对照和内参，GAPDH 引物序列为：

上游：5’-GGGCTCATCTGAAGGGTGGTGCTA-3’

下游：5’-GTGGGGGAGACAGAAGGGAACAGA-3’

目的基因pcdh1用前边所述的引物来检测：

上游引物5’-GGGATCCTCCTGCCTGGCCCTGTGGTTCCTCT-3，

下游引物5’-GGAATTCCTCGGGGCCAGCCAGCAGTTCATA-3’； 

PCR结果用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图8所示。

Claims (5)

1.一种鸡pcdh1特异性多克隆抗体的制备方法，其特征是包括如下步骤：

(1) 根据鸡pcdh1基因，设计并合成引物： 

上游引物5’-GGGATCCTCCTGCCTGGCCCTGTGGTTCCTCT-3’，

下游引物5’-GGAATTCCTCGGGGCCAGCCAGCAGTTCATA-3’； 

通过RT-PCR扩增鸡pcdh1基因片段，其全长为516 bp；

(2) 将步骤(1)获得的pcdh1基因片段连入表达载体pGEX-2TK中，将连接产物转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，筛选得到重组表达质粒pGEX-2TK-pcdh101；

(3) 将步骤(2)获得的表达鸡pcdh1基因片段的重组表达质粒转化到大肠杆菌E.coli BL21中，用LB液体培养基，21℃培养至对数生长期后，诱导；

(4) 将诱导后的菌体在4℃下离心收集，用去离子水和PBS分别清洗，加入溶菌酶并超声裂解破碎，离心破碎后的菌液，收集上清；

(5) 使用Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化融合蛋白；

(6) 把纯化后的融合蛋白作为抗原，采用常规多克隆抗体制备方法制备抗血清。

2.根据权利要求1所述的一种鸡pcdh1特异性多克隆抗体的制备方法，其特征在于步骤(3)中，所述诱导为：21℃，加入0.1 M IPTG培养6-7小时。

3.根据权利要求1所述的一种鸡pcdh1特异性多克隆抗体的制备方法，其特征在于步骤(5)所述融合蛋白是谷胱甘肽-S转移酶与鸡pcdh1基因编码序列的第33位到204位氨基酸残基融合表达的蛋白。

4.权利要求1-3任一方法所制备的鸡pcdh1特异性多克隆抗体在检测鸡pcdh1基因表达中的用途。

5.根据权利要求1所述的一种鸡pcdh1特异性多克隆抗体的制备方法，其特征在于步骤(1)中，所述引物在检测鸡pcdh1基因mRNA表达水平中的应用。

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