DE69129760T2

DE69129760T2 - T-cadherin-bindungsmolekül

Info

Publication number: DE69129760T2
Application number: DE69129760T
Authority: DE
Inventors: Barbara Del Mar Ca 92014 Ranscht
Original assignee: Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute
Current assignee: Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute
Priority date: 1990-10-30
Filing date: 1991-10-30
Publication date: 1999-03-25
Anticipated expiration: 2011-10-31
Also published as: US5811518A; US5837525A; AU8953191A; AU669474B2; DE69129760D1; US5585351A; JPH06505962A; CA2095115A1; ATE168131T1; EP0619841A4; EP0619841A1; US5863804A; WO1992008731A3; WO1992008731A2; EP0619841B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft Zelloberflächenmoleküle, genauer T- Cadherin, ein neues Zelladhäsionsmolekül der Cadherin-Familie.
Cadherine sind eine Familie von Transmembran-Glykoproteinen, die adhäsive Interaktionen im sich entwickelnden und adulten Organismus über ein Ca²&spplus;abhängigen Mechanismus vermitteln (Takeichi, 1988 und 1990, Übersichtsartikel). Es ist vorgebracht worden, daß die Cadherine aus einem gemeinsamen Vorläufergen entstanden sind. Genduplikation mag die Bildung einer auf struktureller Ebene verwandten Molekülfamilie mit heterogenen Sequenzen zur Folge gehabt haben. Cadherine haben eine gemeinsame allgemeine Struktur, die, im extrazellulären Bereich, unterteilt ist in ein Signalpeptid, ein Präpeptid und fünf verwandte extrazelluläre Domänen, und an die sich eine Transmembrandomäne und ein hochkonservierter Abschnitt zytoplasmatischer Aminosäuren anschließt, der darauf hindeutet, daß er eine Verbindung mit dem Zytosklelett-Netzwerk der Zelle zur Verfügung stellt. Das Signalpeptid und das Präpeptid werden leicht abgespalten und sind im reifen Protein nicht vorhanden. Verschiedene Mitglieder der Cadherin-Familie sind charakterisiert worden. N-Cadherin wird im Nervensystem während der Entwicklung gefunden, und es wurde gezeigt, daß es ein starker Mediator des Nervenfaserwachstums in vitro ist. Zusätzlich zum Nervengewebe wird N-Cadherin auch im Herz und Sklelettmuskel und in Linsenzellen exponiert. E-Cadherin (auch bekannt als Uvomorulin in der Maus) ist ein Bestandteil epithelialer Zellen, und P-Cadherin wird in der Plazenta gefunden.
T-Cadherin, das Gegenstand dieser Anmeldung ist, ist ein neues Mitglied der Cadherin-Familie, das die allgemeine Cadherin- Struktur im extrazellulären Bereich aufweist, bei dem aber die konservierten zytoplasmatischen Sequenzen fehlen. Daher wird ein neuer Modus der T-Cadherin-Funktion vorgeschlagen, bei dem T- Cadherin die adhäsiven Eigenschaften der Zelle nicht durch eine direkte Verbindung mit dem Zytosklelett reguliert, sondern durch höhere Membranmobilität und schnellen Zugang zu seinem extrazellulären Liganden. Das Muster der T-Cadherin-Expression legt eine Schlüsselrolle bei der Bildung des Musters des Nervenfaserwachstums in sich entwickelnden Embryos nahe. Außerdem ist T- Cadherin das erste auf molekularer Ebene charakterisierte Polypeptid, das in einem segmentalen Muster identifiziert wurde, da epitheliale Somiten den Übergang zur Bildung des Dermamyotoms und Sklerotoms vollziehen. Die Expression in nur einer Hälfte des somitischen Sklerotoms, die eventuell zu Wirbeln werden, legt nahe, daß T-Cadherin eine Schlüsselrolle in der Segmentierung des Wirbeltierembryos spielt. Segmentierung ist eine entscheidende Eigenschaft der Wirbelsäule, die Flexibilität gestattet und einem Individium die Möglichkeit eröffnet, den Rücken zu biegen. T-Cadherin wurde auch in Muskelzellen und Blutgefäßen identifiziert. Im Muskel mag T-Cadherin in Zelldifferenzierung und -funktion involviert sein. T-Cadherin wurde auch in Blutgefäßen gefunden.
Die Identifizierung von Molekülen, die das Nervenfaserwachstum regulieren und ihm eine Richtung geben, ist wichtig für die Untersuchung der Nervenregeneration. Nach einer Durchtrennung degenerieren Neuronen entweder oder bleiben in einem Stadium schwerer Atrophie. Die Prognose für die Erholung dieser geschädigten Neuronen ist sehr schlecht. Daher könnte die Verwendung von Molekülen, wie den T-Cadherin Zelladhäsionsmolekülen, Neuronen dahingehend beeinflussen, ihre Axone wieder wachsen zu lassen und die Axone anzuweisen, ihre entsprechenden Zielzellen zu reinnervieren. Dies könnte eventuell zu einer Erleichterung der schädigenden Auswirkungen von Schlaganfall oder Trauma auf das Nervensystem führen.
Daher gibt es ein Bedürfnis, zelluläre Oberflächen-Zelladhäsionsmoleküle, die in die Regulation der Entwicklung im Embryo oder der Erholung traumatisierter Neuronen involviert sein können, zu identifizieren und zu charakterisieren. Eingeschlosen dabei sind Methoden zur Detektion und Verwendung dieser Moleküle. Die vorliegende Erfindung erfüllt dieses Bedürfnis und weist außerdem damit im Zusammenhang stehende Vorteile auf.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung somit im wesentlichen gereinigte Polypeptide zur Verfügung, die als T-Cadherin bezeichnet werden, welche die allgemeine Cadherin-Struktur im extrazellulären Bereich enthalten, denen aber die zytoplasmatischen Sequenzen fehlen, und die in ihrer natürlichen Umgebung durch eine Glykosylphosphatidylinositolverbindung an der Zellplasmamembran verankert sind. Die Polypeptide kreuzreagieren ferner mit Antikörpern, die mit Polypeptiden reagieren, die die in Fig. 2a und 2b gezeigten Aminosäuresequenzen haben, welche aber nicht mit N-Cadherin, E-Cadherin, P-Cadherin und L-CAM reagieren.
Die Erfindung stellt ferner sowohl isolierte Nukleinsäuresequenzen zur Verfügung, die für diese Polypeptide kodieren und Sonden, die einen komplementären Abschnitt der kodierenden Sequenz umfassen, als auch Antikörper, die spezifisch mit T-Cadherin reagieren.
Ein Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins von T-Cadherin in einem Subjekt (Versuchsobjekt) wird zur Verfügung gestellt, bei dem man eine Probe aus dem Subjekt mit einem Anti-T-Cadherin- Antikörper oder einer Nukleinsäuresonde in Kontakt bringt und bei dem man die Bindung oder Hybridisierung des Reagens mit T- Cadherin detektiert oder bestimmt, wobei das Vorliegen einer Bindung oder Hybridisierung die Gegenwart von T-Cadherin anzeigt.
Die Erfindung betrifft außerdem sowohl einen Expressionsvektor, der die Nukleinsäuren umfaßt, die für T-Cadherin in einem Vektor kodieren, der in der Lage ist, T-Cadherin in einer transformierten Wirtszelle zu exprimieren, als auch transformierte Wirtszel len, die den Vektor und von den transformierten Wirtszellen produzierte Polypeptide umfassen.
Schließlich betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine wirksame Menge an T-Cadherin oder einem Oligonukleotid oder einer cDNA umfaßt, die für T-Cadherin aber nicht für N-, E-, P-Cadherin und L-CAM kodiert. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann zur Inhibition der Tumorzellmigration oder zum Reparieren traumatisierter Neuronen eines Subjekts verwendet werden.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt das strukturelle Alignment von T-Cadherin 1 (266 cDNA) und T-Cadherin 2 (1212 cDNA) mit der Cadherin-Konsensusstruktur.
Fig. 2 zeigt die Nukleotid- und vorhergesagte Aminosäuresequenz der T-Cadherine. Fig. 2a ist eine Abbildung der Sequenzen von T-Cadherin 1. Fig. 2b zeigt die Sequenzen für T-Cadherin 2.
Fig. 3 zeigt das Aminosäure-Alignment von T-Cadherin 1 (266 cDNA) mit den verwandten Proteinen N-Cadherin, L-CAM, E- Cadherin und P-Cadherin.
Fig. 4 ist ein Immunoblot von verschiedenen Geweben, die aus 3 Tage alten Hühnchen unter Verwendung von Antiserum für T-Cadherin isoliert wurden. Polypeptide, die eine Mr von 90, 110 und 120 kD haben, werden in neuronalem Gewebe detektiert, während nur die 90 und 110 kD Polypeptide in nicht-neuronalen Geweben detektiert werden. Bahn 1, Rückenmark; Bahn 2, Mittelhirn; Bahn 3, Cerebellum; Bahn 4, Cortex; Bahn 5, optisches Tektum; Bahn 6, Retina; Bahn 7, Muskel; Bahn 8, Herz; Bahn 9, Niere; Bahn 10, Leber; Bahn 11, Lunge.
Fig. 5a zeigt die Freisetzung von T-Cadherin durch kultivierte Neuronen nach Phosphatidylinositolphospholipase C (PI-PLC)-Behandlung mittels Western Blotting mit T-Cadherin-Antiserum. T- Cadherin wird nach PI-PLC-Behandlung in den Überstand freigesetzt (Bahn 6). Die Freisetzung wird durch Behandlung mit ZnCl&sub2; blockiert (Bahn 9). Fig. 5b ist eine Immunpräzipitation von mit ³H-Ethanolamin markiertem T-Cadherin nach Freisetzung mit PI-PLC aus kultivierten Neuronen. Zwei Polypeptide mit Mr 90 und 120 kD werden durch PI-PLC freigesetzt und mit T-Cadherin Antiserum präzipitiert (Bahn 2).
Fig. 6 ist ein RNA-Blot von Gehirngewebe, das mit einer Sonde aus einem T-Cadherin-cDNA-Abschnitt behandelt wurde, der dem T- Cadherin 1 EcoRI-PstI Restriktionsfragment (1,76 kb) entspricht. Die Sonde detektiert zwei mRNA-Spezies von 7,5 und 9,5 kb.
Fig. 7 zeigt einen RNase-Protektionsassay mit T-Cadherin-mRNA. Proben sind BR = Gehirn, M = Muskel, LI = Leber, H = Herz, K = Niere, LU = Lunge, RT = Retina von ausgebrüteten Hühnchen. N = kultivierte sympathische Neuronen wie in Beispiel 5. Rückenmark H/H Stadium 37 und 24. Rückenmark H/H Stadium 24 aufgeteilt in D = dorsal, V = ventral und FP = Floor Plate Region. SOM = Somiten.
Fig. 8 ist eine immunhistochemische Analyse der T-Cadherin-Expression im sich entwickelnden Nervensystem. Die untersuchten Gewebe sind: (a) Somiten H/H Stadium 23; (b) sich entwickelndes Rückenmark, Tafel 1, H/H Stadium 20, Tafel 2, H/H Stadium 24 und Tafel 3, H/H Stadium 32; (c) Blutgefäß; und (d) Muskel.
Fig. 9 zeigt, daß T-Cadherin homophile Zelladhäsion vermittelt. Eine gleiche Anzahl an unmarkierten, T-Cadherin-transfizierten und CSFE-markierten Kontrollzellen wurde gemischt, und man ließ sie aggregieren. Fig. 9a ist das Phasenkontrast-Photomikrogramm der resultierenden Aggregate. Fig. 9b ist das Fluoreszenz-Photomikrogramm desselben Feldes. Aggregate wurden gebildet, die nur T-Cadherin-transfizierte Zellen enthielten, daher ist die Bindung homophil. Balken = 50 um.
Fig. 10 zeigt die prozentuale Aggregation T-Cadherin-transfizierter Zellen. Aggregationsversuche wurden wie in Beispiel XIV beschrieben durchgeführt. Zellen wurden wie beschrieben mit PI- PLC, 1 ug/ml Cytochalasin D oder 1 ug/ml Nocodazol behandelt. Die Zahlen stellen die prozentuale Aggregation dar, die wie beschrieben bestimmt wurde. Die Resultate sind Durchschnittswerte ± Standardabweichung. Jeder Versuch wurde n-mal durchgeführt, jedesmal im Triplikat. (*) n = 12, (+) n = 2, und ( ) n = 3.
Fig. 11 zeigt die Oberflächenverteilung von T-Cadherin in aggregierten Zellen. Fig. 11a ist das Phasenkontrast-Photomikrogramm der transfizierten Zellen. Fig. 11b zeigt das Fluoreszenz-Photomikrogramm desselben Aggregats in demselben Feld.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

T-Cadherin ("T-Cad; " T-verkürzt) ist ein Mitglied der Cadherin- Familie von Zelladhäsionsmolekülen. T-Cadherin kann in die Entwicklung des Embryos oder die Erholung traumatisierter Neurone involviert sein und kann daher bei der Nervenregeneration nützlich sein. T-Cadherin wird sowohl im Nervensystem als auch im Herzen, im Skelettmuskel, in Blutgefäßen und in dem Muskel, der den Darm und die Haut einkleidet, exprimiert. Die hohe Expression von T-Cadherin in Blutgefäßen kann bei der Entwicklung hochvaskularisierter Tumore wichtig sein.
T-Cadherin besitzt einige aber nicht alle strukturellen Eigenschaften der anderen Cadherine. Die strukturelle Ähnlichkeit erstreckt sich auf der Aminosäureebene insoweit, als der extrazelluläre Teil von N-Cadherin 35 bis 47% Identität mit den extrazellulären Domänen von N-Cadherin, E-Cadherin, P-Cadherin und L- CAM zeigt; N-Cadherin mit 47% Aminosäureidentität ist am nächsten verwandt. Zwei Formen von T-Cadherin, die in der vorlie genden Erfindung identifiziert sind, fehlt der zytoplasmatische Anteil, der in allen anderen Mitgliedern der Cadherin-Familie gefunden wird. Eine Form des T-Cadherins, hier als T-Cad 1 bezeichnet, scheint mittels einer Glykosylphosphatidylinositol (GPI)-Verbindung an der Membran verankert zu sein. Biochemische Evidenz für eine solche Verbindung wurde erhalten, indem gezeigt wurde, daß T-Cadherin aus der zellulären Plasmamembran durch eine Phosphatidylinositol-spezifische Phospholipase C freigesetzt werden kann und radioaktiv markiertes Ethanolamin in die GPI-Verbindung einbauen kann. Bei der anderen Form des T-Cadherins, T-Cad 2, wird durch die cDNA vorausgesagt, daß sie Sequenzen für eine hydrophobe Domäne enthält, gefolgt von 5 zytoplasmatischen Aminosäuren. Aus vorbereitender Transfektion dieser cDNA in COS-Zellen ist es wahrscheinlich, daß diese Form auch GPI-verbunden ist. Diese Daten liefern den Beweis für eine Verbindung der T-Cadherine mit der Membran, die sich von anderen Cadherinen unterscheidet, insbesondere in deren vorgeschlagener Assoziation mit dem Zytoskelett. Zusammenfassend ist T-Cadherin · ein Mitglied der Cadherin-Familie von Zelladhäsionsmolekülen, das sich in seiner Verankerung an der Plasmamembran von bekannten Cadherinen unterscheidet.
Es wurden cDNAs isoliert, die für T-Cad 1 und T-Cad 2 kodieren, zwei eng verwandte aber verschiedene Formen von T-Cadherin ( Fig. 2a und 2b). Der extrazelluläre Teil beider Formen ist identisch und enthält strukturelle Merkmale, die für die Cadherin-Familie charakteristisch sind. Die zwei Formen unterscheiden sich in ihrer COOH-terminalen Region dadurch, daß die T- Cad 2 cDNA für fünf zusätzliche Aminosäuren kodiert (Fig. 3). Die Abwesenheit einer zytoplasmatischen Domäne kann eine größere Mobilität dieser Moleküle innerhalb der Zellmembran gestatten und daher die adhäsiven Zelleigenschaften modulieren.
RNA-Transkripte, die für beide Formen von T-Cadherin kodieren, wurden mittels RNAse-Protektions-Sonden detektiert, die für jede Form spezifisch sind. Es gibt einen Hinweis darauf, daß die verschiedenen Formen von T-Cadherin während der Entwicklung sowohl zeitlich als auch in gewebsspezifischer Weise reguliert sein können.
So wie hier verwendet, bezieht sich "T-Cadherin" oder "T-cad" auf Polypeptide, die in der extrazellulären Region die allgemeine Cadherin-Struktur enthalten, denen aber die zytoplasmatischen Sequenzen fehlen und die in ihrer natürlichen Umgebung durch eine Glykosylphosphatidylinositolverbindung an der zellulären Plasmamembran verankert sind. Die Polypeptide kreuzreagieren ferner mit Antikörpern, die mit Polypeptiden reagieren, die die in Fig. 2a und 2b angegebene Aminosäuresequenz haben, welche aber nicht mit N-Cadherin, E-Cadherin, P-Cadherin und L-CAM reagieren. Es werden Polypeptide zur Verfügung gestellt, die die extrazelluläre, Transmembran- und verkürzte zytoplasmatische Domäne von T-Cad 1 und T-Cad 2 umfassen. Kleinere Modifikationen der Sequenz, die nicht deren Immunreaktivität zerstören, fallen ebenfalls unter die Definition des beanspruchten Proteins.
Der vorgeschlagene offene Leserahmen der Cadherin cDNAs, T-Cad 1 und T-Cad 2, kodiert für Proteine mit 690 bzw. 695 Aminosäuren mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von 76 018 und 76 627 Dalton.
Es ist klar, daß beschränkte Modifikationen erfolgen können, ohne die biologische Funktion von T-Cadherin zu zerstören, und daß nur ein Teil der gesamten Primärstruktur für die Aktivität erforderlich sein kann. Kleinere Modifikationen der primären Aminosäuresequenz können zu Proteinen führen, die eine im wesentlichen äquivalente oder verstärkte Funktion haben.
So wie hier verwendet, bezieht sich "T-Cadherin" auf ein Zelladhäsionspolypeptid, das eine Aminosäuresequenz besitzt, die im wesentlichen zu der in Fig. 2a und 2b gezeigten äquivalent ist. "T-Cadherin" kann in die Entwicklung des embryonalen Nervensystems und in die Erholung traumatisierter Neuronen invol viert sein. So wie hier verwendet, bezieht sich "T-Cadherin" auch auf aktive Fragmente des Zelladhäsionspolypeptids, die die gewünschte Aktivität des Polypeptids haben.
Der Begriff "im wesentlichen gereinigt," bezeichnet, wenn er gebraucht wird, um den Zustand von T-Cadherin zu beschreiben, das im wesentlichen von den anderen normalerweise mit T-Cadherin in seiner natürlichen Umgebung assoziierten oder vorkommenden Proteinen und Molekülen freie Protein.
Der Begriff "Nukleinsäure-kodierend" bezieht sich, so wie er hier verwendet wird, auf die primäre Nukleotidsequenz eines Gens, das die Reihenfolge der entsprechenden Aminosäuren in dem Protein, das durch sie bestimmt wird, zur Verfügung stellt. Beispiele der Cadherin-Nukleinsäuresequenz sind in Fig. 2a und 2b dargestellt.
Die Erfindung stellt Nukleinsäuren (DNA, RNA oder cDNA) zur Verfügung, die für die erfindungsgemäßenen Polypeptide kodieren. Die Nukleinsäure kann oder kann nicht im natürlichen Wirt exprimiert sein. Vektoren, die diese Nukleinsäuren umfassen, werden auch zur Verfügung gestellt. Eine Vielzahl an Klonierungsvektoren ist dem Fachmann bekannt, die Auswahl eines geeigneten Klonierungsvektors ist eine Frage der Wahl. Der Begriff "transformierte Wirtszellen" bezieht sich auf Zellen, in die Vektoren eingeführt worden waren, die unter Verwendung rekombinanter DNA- Techniken konstruiert wurden. Wirtszellen können mit einem solchen Vektor transformiert sein und verwendet werden, um rekombinante Polypeptide zu exprimieren. Wirtszellen können Säuger-, Hefe-, Insekten- oder Bakterienzellen sein, solange der geeignete Vektor verwendet wird. Verfahren zur rekombinanten Expression sind dem Fachmann wohl bekannt, siehe Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (1982), das hier durch Bezugnahme eingeschlossen wird. So werden rekombinante Polypeptide und das Verfahren zu ihrer Herstellung ebenfalls zur Verfügung gestellt.
Die hier offenbarten Vektoren und Verfahren sind für die Verwendung in Wirtszellen geeignet, die einen weiten Bereich prokaryontischer und eukaryontischer Organismen einschließen. Es wird verstanden, daß "Zellen" oder "Wirtszellen" sich nicht nur auf eine bestimmte Einzelzelle, sondern auch auf die Nachkommen einer solcher Zelle bezieht. Die Erfindung stellt Vektoren zur Verfügung, die in der Lage sind, darin enthaltene DNA-Sequenzen zu exprimieren, in denen solche Sequenzen operativ mit anderen Sequenzen verbunden sind, die in der Lage sind, ihre Expression zu bewirken. Mit inbegriffen ist, daß diese Expressionsvektoren im Wirtsorganismus entweder als Episomen oder als integraler Bestandteil der chromosomalen DNA replizierbar sein müssen.
Zusätzlich schließen rekombinante DNA-Methoden, die gegenwärtig von den Fachleuten verwendet werden, die Polymerasekettenreaktion (PCR) ein, die, kombiniert mit der Synthese von Oligonukleotiden, eine leichte Reproduktion von DNA-Sequenzen erlaubt. Ein DNA-Segment kann mit Hilfe der PCR, ausgehend von sogar einer Einzelgenkopie, exponentiell amplifiziert werden. Bei diesem Vorgehen wird eine denaturierte DNA-Probe mit zwei Oligonukleotidprimern inkubiert, die die DNA-Polymerase-abhängige Synthese neuer komplementärer Stränge leiten. Jeder der multiplen Synthesezyklen führt zu einer annähernden Verdopplung der · Menge an Zielsequenz. Nach 25 Amplifizierungszyklen steigt die Menge an Zielsequenz ungefähr auf das 10&sup6;fache an. Amplifizierung der Erststrang-cDNAs unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion wurde verwendet, um beide Formen von T-Cadherin zu detektieren. Die PCR-Technologie ist Gegenstand der US-Patente Nr. 4 683 195; 4 800 159; 4 754 065 und 4 683 202, die alle durch Bezugnahme eingeschlossen sind. Die in den Fig. 2a und 2b gezeigten cDNAs, oder jeder Teil der Sequenz, kann für Klonierungs- und Expressionszwecke dadurch reproduziert werden, daß die gewünschte Sequenz mit PCR amplifiziert wird und in einen geeigneten Vektor kloniert wird, wie es im Stand der Technik wohlbekannt ist.
Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäure oder Protein in Zellen schließen die Hybridisierung einer Nukleinsäuresonde mit der Nukleinsäure einer Zelle und das Markieren einer Zelle mit polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern ein. Solche Techniken werden mit Hilfe von Verfahren durchgeführt, die dem Fachmann wohlbekannt sind.
Polyklonale Antikörper gegen T-Cadherin wurden nach Verfahren hergestellt, die im Stand der Technik wohlbekannt sind. Die Spezifität der Antikörper wurde mittels Immunhistochemie und Immunblotting verschiedener Gewebe einschließlich neuronaler Zellen und Somiten bestimmt.
Alternativ dazu können Anti-T-Cadherin-Antikörper hergestellt werden, indem man ein Tier mit synthetischen Peptiden oder rekombinanten Proteinfragmenten, die aus der in den Fig. 2a und 2b gezeigten Sequenz hergestellt sind, immunisiert, wie es im Stand der Technik wohlbekannt ist. Die Auswahl der Anti-T-Cadherin-Antikörper wird wie oben beschrieben durchgeführt.
Monoklonale Antikörper werden hergestellt, indem man ein Tier mit Material immunisiert, das T-Cadherin oder synthetische Peptide oder rekombinante Proteinfragmente davon enthält, gefolgt von der Isolierung Antikörper-produzierender Hybridomzellen, wie es im Stand der Technik wohlbekannt ist. (Siehe zum Beispiel Harlow and Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor, 1988, und die darin zitierten Referenzen, die alle durch Bezugnahme eingeschlossen sind). Anti-T-Cadherin-Antikörper werden ausgewählt, indem man eine Immunfluoreszenzanalyse von Gewebsabschnitten durchführt, in denen T-Cadherin lokalisiert ist. Die Identifikation der Antikörper wird durch Immunblotting und Immunpräzipitation bestätigt, welche das oben beschriebene prädominante 90 kD Polypeptid offenbart. Das geeignete Hybridom reagiert mit gereinigtem T-Cadherin oder T-Cadherin-Fragmenten. T-Cadherin-Fragmente können hergestellt werden, indem man die in den Fig. 2a und 2b dargestellten T-Cadherin-cDNAs in einem prokaryontischen oder eukaryontischen Expressionsvektor wie oben beschrieben exprimiert.
Verfahren zur Detektion von T-Cadherin in einem Subjekt werden ebenfalls zur Verfügung gestellt. T-Cadherin kann unter Verwendung immunologischer Techniken, wie z. B. markierter Antikörper, in einer Zellprobe detektiert werden. Solche Methoden einschließlich der Wahl des Markers sind dem Fachmann bekannt. (Harlow and Lane, a.a.O.). Kurz gesagt wird eine Gewebeprobe eines Subjekts zuerst einem Antikörper ausgesetzt, der für T- Cadherin spezifisch ist. Nach der Bindung des Antikörpers wird ein zweiter Antikörper der Probe ausgesetzt, der geeignet markiert ist und für den Anti-T-Cadherin-Antikörper spezifisch ist, wobei die Probe zuvor mit dem T-Cadherin-Antikörper inkubiert wurde. Der sekundäre Antikörper kann dann visualisiert oder quantifiziert werden und das Vorhandensein von T-Cadherin kann detektiert werden.
Die Resultate von Aggregationsstudien mit CHO-Zellen, die mit dem T-Cadherin-Gen transfiziert sind, zeigen, daß T-Cadherin mit der Zelladhäsion assoziiert ist. Die Resultate sind in den Fig. 9, 10 und 11 gezeigt. Die hohe Konzentration von T-Cadherin in den Bereichen des Zell-Zell-Kontaktes zeigt an, daß die Moleküle Zellen induzieren, aneinander zu einem dicht gepackten Aggregat zu adhärieren.
Es ist bekannt, daß Tumorzellen dazu tendieren, ihre Adhäsivität zu verlieren, was zu Zellmigration und eventueller Metastasenbildung führt. Durch Erhöhung der T-Cadherin-Konzentration in solchen Zellen, entweder direkt oder durch Gentherapie, können die Zellen induziert werden, eine normale Adhäsion wiederherzustellen, um Tumorzellmigration zu verhindern.
Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zum Reparieren traumatisierter Neurone eines Subjekts zur Verfügung, einschließlich Trauma aufgrund eines Schlaganfalles oder einer Verletzung. Verabreichung von T-Cadherin in der Region der traumatisierten Neuronen kann die Neuronen dahingehend beeinflussen, ihre Axone wieder wachsen zu lassen und die Axone zur Reinnervierung ihrer Zielzellen zu führen.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung illustrieren aber nicht beschränken. Obgleich sie für solche Verfahren typisch sind, die verwendet werden könnten, können andere dem Fachmann bekannte Verfahren alternativ verwendet werden.

BEISPIEL I

Isolierung von T-Cadherin

T-Cadherin wurde in dem Detergens-resistenten Membranskelett sympathischer Neuronen und dem embryonalen Gehirn des Hühnchens als ein Concanavalin A-bindendes Glykoprotein identifiziert. Das Membranskelett wurde als ein gegenüber nichtionischen Detergenzien resistenter Polypeptidkomplex in Puffer A (10 mM Tris/HCl, pH-Wert 7,6, 2 mM CaCl&sub2;, 5% Nonident P40, 2 mM Dithiothreitol, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 50 uM Leupeptin, 5 uM Pepstatin, 4 ng/ml Aprotinin) aus 13 bis 16 Tage alten Hühnchenembryo-Gehirnen isoliert. Das 90 kD-Fragment von T-Cadherin wurde von dem Komplex durch präparative SDS-Gelelektrophorese (Laemmli, Nature 227: 680-685 (1970)) wie oben beschrieben abgetrennt. Neben Contactin, einem 130 kD Zelladhäsionsmolekül der Immunglobulin-Supergenfamilie, ist T-Cadherin das bedeutendste Concanavalin A-bindende Glykoprotein des Komplexes (Ranscht et al., J. Cell Biol. 99: 1803-18113 (1984)). Die Migration von T-Cadherin in SDS-PAGE-Gelen unter reduzierenden und nichtreduzierenden Bedingungen ist sehr ähnlich, was nahelegt, daß wenige oder keine Disulfidbrücken zwischen den Ketten vorhanden sind. Proteinkomplexe, die T-Cadherin, Contactin, Actin und etwa 15 andere Polypeptide enthalten, wurden durch differentielle Zentrifugation und Ionenaustauschchromatographie angereichert. Die isolierten Proteinkomplexe widerstehen der Extraktion mit einer Vielzahl an Detergenzien unter verschiedenen Salzbedingungen; daher können die einzelnen Komponenten von den Komplexen nur unter denaturierenden Bedingungen dissoziiert werden. T-Cadherin kann durch präparative SDS-Gelelektrophorese mit einer Ausbeute von ungefähr 50 ug aus 50 g Ausgangsmaterial gereinigt werden.

BEISPIEL II

Proteirunikrosequenzierung

Proteine, die im Gehirn-Polypeptidkomplex (BPC) enthalten waren, wurden durch präparative SDS-PAGE aufgetrennt und elektrophoretisch auf eine Polyvinylidendifluoridmembran (Millipore, Burlington, MA) durch dem Fachmann wohlbekannte Methoden überführt. Das 90 kD T-Cadherin-Polypeptid wurde identifiziert, indem die transferierten Proteine mit Coomassie Brilliant Blue R250 angefärbt, ausgeschnitten und direkt sequenziert werden. Transferbedingungen und Vorgehensweise waren wie von Matsudaira, P., J. Biol. Chem. 262: 10035-10038 (1987) beschrieben.

BEISPIEL III

Herstellung und Affinitätsreinigung von Anti-T-Cadherin-Antiserum

Der Detergens-resistente Polypeptidkomplex wurde mittels präparativer SDS-PAGE-Gelelektrophorese in seine einzelnen Komponenten aufgetrennt. Das 90 kD T-Cadherin-Fragment wurde aus mehreren mit Coomassie Blue angefärbten Gelen herausgeschnitten, elektroeluiert und auf Exocellulose GF5 (Pierce, Rockford, IL) entsalzt. Ein New Zealand White-Kaninchen wurde mittels intramuskulärer und subkutaner Injektionen von 100 ug 90 kd T-Cadherin-Polypeptid in Freunds Complete Adjuvans (1 : 1) immunisiert. Das Kaninchen wurde dreimal in Intervallen von 4 Wochen mit einer identischen Menge an Protein in Freund's Incomplete Adjuvans geboostet. Die abschließenden Boosts erfolgten intrave nös mit 50 bis 100 ug Protein in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS). Blut wurde 7 bis 10 Tage nach den Injektionen gesammelt. Das Antiserum wurde auf Rinderleberacetonpulver absorbiert.
Für manche Experimente wurde Affinitäts-gereinigtes Antiserum verwendet. Affinitätsreinigung wurde mit T-Cadherin erreicht, das durch elektrophoretischen Transfer auf Polyvinylidenmembranen (Millipore) immobilisiert worden war. Der Polypeptidkomplex wurde mittels SDS-PAGE aufgetrennt und auf Polyvinylidenmembranen überführt (Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 356-375 (1979)). Proteine wurden auf dem Transfer mittels Anfärben mit 1% Amidoschwarz in Methanol: Essigsäure : Wasser (20 : 10 : 70) detektiert. Die 90 kD T-Cadherin-Peptidbande wurde aus der Membran herausgeschnitten und für 30 bis 60 Minuten mit 4% fettfreier Trockenmilch in TBST (10 mM Tris/HCl pH- Wert 8,0, 150 mM NaCl und 0,05% Tween 20) blockiert. Die T- Cadherin-Streifen wurden mit Anti-T-Cadherin-Antiserum (1 : 50 in TBST) für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Waschschritten in TBST wurde gebundenes Anti-T-Cadherin-Antiserum von den Streifen mit 600 ul 0,1 M Glycin, pH-Wert 2,5, für 5 Minuten eluiert und sofort neutralisiert. Die Prozedur wurde fünfmal wiederholt, um ausreichende Mengen an gereinigtem Antikörper zu erhalten.
Auf Immunoblots von Nervengewebe-Homogenaten erkannte dieses Antiserum eine hauptsächliche Proteinkomponente mit 90 kD. Zusätzlich wurden Proteinspezies mit 110 und 120 kD mit dem Antiserum detektiert (Fig. 4). Das 110 kD Polypeptid stellt wahrscheinlich T-Cadherin mit dem Präpeptid dar, da sowohl die 90 als auch die 110 kD Spezies nach Transfektion von COS-Zellen mit T-Cadherin cDNAs erhalten werden. Das 120 kD Protein wird mit dem T-Cadherin-Antiserum nach ³H-Ethanolamin-Markierung immunpräzipitiert, was zeigt, daß dieses Protein ebenfalls über eine GPI-Verbindung mit der Membran verbunden ist. Somit ist das 120 kD-Polypeptid wahrscheinlich eine für das Nervensystem spezifische Form von T-Cadherin. Im Gegensatz zu neuronalem Gewebe erkennt das T-Cadherin-Antiserum nur die 90 und 110 kD Proteinspezies in nicht-neuronalen Gewebeproben. Mikrosequenzierung der 17 NH&sub2;-terminalen Aminosäuren des 90 kD Proteins und Auffinden dieser Sequenz in einem Protein, das konzeptionell von der cDNA- Sequenz translatiert wurde, zeigen, daß das 90 kD Protein ein T- Cadherin-Fragment ist, das am Aminosäurerest 117 (Fig. 2a und 2b) beginnt und das Signal- und das Präpeptid nicht enthält.

BEISPIEL IV

Immunoblottingverfahren

Verschiedene Gewebe, einschließlich Gehirn, Retina, Muskel, Leber, Herz und Niere, wurden in Puffer A (siehe BEISPIEL 1) homogenisiert und mittels SDS-PAGE aufgetrennt. Aufgetrennte Proteine wurden elektrophoretisch auf eine Polyvinylidendifluoridmembran transferiert. Bahnen mit Marker wurden mit 0,1% Amidoschwarz in Methanol : Essigsäure : Wasser (20. 10. 70) getrennt angefärbt und in der identischen Lösung ohne den Farbstoff entfärbt. Zum Immunblotting wurden nicht-spezifische Bindungsstellen wie oben beschrieben blockiert, und die Blots wurden für 60 Minuten mit Anti-T-Cadherin-Antiserum (1. 150 für sowohl das nicht-gereinigte als auch das gereinigte Antiserum) inkubiert. Nach Waschschritten in TBST wurden gebundene Antikörper mit 1 uCl/ml ¹²&sup5;I Ziege-Anti-Kaninchen-Immunglobulin (ICN Biochemicals Inc., Costa Mesa, CA) detektiert, gefolgt durch eine Autoradiographie unter Verwendung von Cronex Lightning Plus Schirmen. In einigen Beispielen wurden die Blots zur Reaktion gebracht, indem man alkalische Phosphatase-konjugierte Ziege- Anti-Kaninchen-Immunglobuline und 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat (BCIP) und Nitroblau-Tetrazol (NBT) als Enzymsubstrate (Protoblot, Progema, Madison, WI) oder das ECL Western Blotting Detektionssystem (Amersham Corporation, Arlington Heights, IL) verwendete.

BEISPIEL V

Phospholipaseverdau kultivierter sympathischer Neurone Sympathische Ganglien wurden von 10 Tage alten Hühnchenembryos in L15 Medium abgetrennt. Die Ganglien wurden nach einem 30minütigen Verdau mit 0,25% Trypsin in PBS dissoziiert und in L15 Kulturmedium auf mit Laminin (5 ug/ml, Telios Pharmaceuticals, Inc., La Jolla, CA) beschichteten Kulturplatten bei einer Dichte von 1.4-1.8 · 10&sup6; Zellen/60 mm Kulturplatte ausplattiert. Das Kulturmedium wurde mit 10 % dialysiertem fötalem Kälberserum, 0,5% Methylcellulose, 2 mM Glutamin, 0,6 g/l Glucose, Nervenwachstumsfaktor und Antibiotika ergänzt. Ein extensives Nervenfaserwachstum wurde nach einer Kulturdauer von 48 Stunden beobachtet.
Für den Phospholipaseverdau wurden die 48 Stunden alten Kulturen extensiv mit PBS gewaschen. Die Kulturen wurden für 60 Minuten bei 37ºC mit 5 U/ml Phosphoinositol-spezifischer Phospholipase C (PI-PLC, eine Gabe von Dr. M. Low, Columbia University, New York) in PLC-Puffer (PBS, das 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 50 uM Leupeptin, 5 uM Pepstatin, 4 ng/ml Aprotinin und 5 ug/ml α&sub2;-Makroglobulin enthält) inkubiert. Das freigesetzte Material wurde gesammelt, durch Zentrifugation von Zelltrümmern befreit und mittels Ultrafiltration 10fach konzentriert. Die neuronalen Zellen wurden vom Lamininsubstrat abgelöst, mit PLC- Puffer gewaschen und in 200 ul H-Puffer (10 mM Tris/HCl, pH- Wert 7,5, 2 mM CaCl&sub2;, 2% Nonidet-P40, 0,25 mM Dithiothreitol und Proteaseinhibitoren Phenylmethylsulfonylfluorid, Leupeptin, Pepstatin, Aprotinin wie oben beschrieben) homogenisiert. Detergens-lösliches und unlösliches Material wurde durch Zentrifugation bei 100 000 g für 45 Minuten bei 4ºC separiert. Kontrollproben erhielten nur PLC-Puffer; bei zwei Experimenten wurde der Verdau mit der Phosphoinositol-spezifischen Phospholipase in Gegenwart von 5 mM ZnCl&sub2; durchgeführt.
Freigesetzte und zelluläre Komponenten der PI-PLC behandelten Kulturen wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und auf Western- Blots analysiert. In Kontrollproben (keine Zusätze) wurde T- Cadherin in der Detergens-löslichen und unlöslichen Fraktion der Zellen gefunden. T-Cadherin war im Überstand nach der 60minütigen Inkubationszeit nicht nachweisbar. Im Gegensatz dazu wurde bei Behandlung der Zellen mit PI-PLC praktisch das ganze T-Cadherin nach 60 Minuten in den Überstand freigesetzt. Diese Freisetzung wurde durch Behandlung der Zellen mit ZnCl&sub2; einem Inhibitor der PI-PLC, blockiert.
T-Cadherin wird über längere Kulturzeiten (≥ 18 Stunden) hinweg in das Kulturmedium sekretiert. Im Kulturmedium erscheint T- Cadherin sowohl in einer hochlöslichen Form als auch in Assoziation mit einem unlöslichen Komplex extrazellulärer Matrixkomponenten, der mittels Zentrifugation des Kulturüberstandes bei 100 000 g für 3 Stunden pelletiert wird.

BEISPIEL VI

Markieren mit ³H-Ethanolamin und Fluoroqraphie

Kulturen sympathischer Neurone ließ man für 48 Stunden wachsen und markierte dann für 18 Stunden mit ³H-Ethanolamin (100 uCi/ml; spezifische Aktivität 19-24 Ci/mmol (Amersham, Arlington Heights, IL) in ergänztem L15 Medium. Markierte Kulturen wurden entweder mit Phosphatidylinositol-spezifischer Phospholipase C wie oben beschrieben behandelt oder sofort für die Analyse bearbeitet. Die Zellen wurden in H-Puffer (10 mM Tris/HCl, pH- Wert 7,5, 2 mM CaCl&sub2;, 2% Nonidet-P40, 0,25 mM Dithiothreitol und Proteaseinhibitoren: 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 50 mM Leupeptin, 5 uM Pepstatin, 4 ng/ml Aprotinin) lysiert, und die Proteine wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt. Die Gele wurden mit Coomassie Brilliant Blue R250 angefärbt, entfärbt und in · Wasser äquilibriert. Zur Durchführung der Fluorographie wurden die Gele in Dimethylsulfoxid (DMSO) für 30 Minuten äquilibriert und dann für 60 Minuten mit 20%igem 2,5-Diphenyloxazol (PPO) in DMSO behandelt. Die Gele wurden nach extensivem Waschen in Wasser getrocknet und für 4-12 Wochen mit einem präsensitivierten Kodak XAR-5 Film belichtet.

BEISPIEL VII

Immunpräzipitation

T-Cadherin wurde aus ³H-Ethanolamin-markierten sympathischen neuronalen Kulturen immunpräzipitiert. Im Anschluß an eine wie in Beispiel IV entsprechende Markierungsdauer wurden die Kulturen gründlich gewaschen und mit 150 mM NaCl in 10 mM Tris/HCl, pH 7,0, 150 mM NaCl, 1% Deoxycholat, 1% Nonident-P40, 0,2% Natriumdodecylsulfat, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 50 uM Leupeptin, 5 uM Pepstatin, 4 ug/ml Aprotinin und 1 mM Dithiothreitol lysiert. Das Lysat wurde mittels Zentrifugation bei 16 000 g für 30 Minuten bei 4ºC geklärt. T-Cadherin wurde aus dem löslichen Proteinpool mit Anti-T-Cadherin-Antiserum (1 : 50) für 60 Minuten bei 4ºC komplexiert. Die Antigen/Antikörper- Komplexe wurden mit fixiertem Staphylococcus aureus (Pansorbin, Calbiochem, La Jolla, CA) präzipitiert. Die Präzipitate wurden mittels Zentrifugation bei 3000 g für 20 Minuten durch Schichten von 5%iger, 10%iger und 20%iger Sucrose gewaschen. Die Präzipitate wurden in SDS-PAGE Beladungspuffer (Maniatis et al., a.a.O.) resuspendiert und mittels SDS-PAGE gefolgt von Fluorographie wie oben beschrieben analysiert.

BEISPIEL VIII

Immunzytochemie

Die Lokalisierung des T-Cadherins wurde unter Verwendung indirekter Immunofluoreszenztechniken untersucht. Hühnerembryos zwischen Tag 2 und 8 der embryonalen Entwicklung wurden den Kriterien von Hamburger und Hamilton (J. Morph. 88: 49-192 (1951)) (H & H) entsprechend einem Stadium zugeordnet. Die Tiere wurden mittels Immersion in PLPA-Fixativ (100 mM Na-Periodat, 75 mM Lysin und 3% Paraformaldehyd in PBS) oder in 4%igem Paraformaldehyd alleine in Abhängigkeit von ihrer Größe für 1 - 3 Stunden fixiert. Das Gewebe wurde durch sukzessive Immersion in 5%iger und 10%iger Sucrose in PBS für 8 bis 12 Stunden kryoprotektiert, in Tissue-Tek (Miles Laboratories Elkhart, IN) eingebettet und bei -70ºC eingefroren. Serielle Schnitte von 15 um Dicke wurden auf einem Kryostaten geschnitten und auf Gelatine/Chromalaun (1% Gelatine/0,4% Chromalaun (chromalum) beschichteten Objektträgern gesammelt. Die Schnitte wurden für 3-4 Stunden bei Raumtemperatur mit Kaninchen-Anti-T-Cadherin (1 : 100) gefärbt. Gebundene Antikörper wurden mit FITC oder TRITC konjugiertem Ziege-Anti-Kaninchen-IgG (1 : 150, Cappel Laboratories, Inc., Westchester, PA) detektiert. Antikörperverdünnungen erfolgten in GST-PBS (10% normales Ziegenserum und 0,02% Triton-X100 in PBS), Waschschritte nach jeder Inkubation nur mit PBS. Angefärbte Schnitte wurden mit Immunomount aufgezogen, das 2% 1,4-Diazabicyclo-(2.2.2)-octan (Aldrich, [Milwaukee, WI) enthielt, um ein schnelles Ausbleichen zu verhindern.
Im sich entwickelnden Rückenmark bei Stadium 20 (Fig. 5b, Tafel 1) (H & H) befinden sich die Motorneuronen in ihrer frühen Phase der Differenzierung und Verlängerung der Axone. Kommissurale Axone, die von dorsolateralen und dorsomedialen Stellen zu der Floor Plate Region zeigen, begannen ihre Ausstülpungen in Richtung der Floor Plate zu erweitern, die als ihr Zwischenziel dient. In diesem Entwicklungsstadium wurde die Expression von T- Cadherin auf den Zellkörpern und Nervenfasern der Motorneurone und auf ventralen neuroepithelialen Zellen einschließlich der Floor Plate, gefunden. Andere Neuronen oder deren Vorläufer wurden in diesem frühen Stadium nicht angefärbt.
In Stadium 24 (Fig. 8b, Tafel 2) hat die Mehrzahl der kommisuralen Axone die ventrale Mittellinie des Rückenmarks gekreuzt und projizieren durch den ventralen Kamm der Floor Plate hin durch. In diesem Stadium war die Intensität der Färbung von T- Cadherin in der Floor Plate Region erstaunlich erhöht. Eine vergleichsweise geringe Anfärbung wurde in anderen Bereichen des Neuralrohrs detektiert. Das Muster der T-Cadherin-Expression schließt die Floor Plate epithelialen Zellen wie in früheren Stadien und ein Segment der kommisuralen Axone ein, da sie diesen Bereich kreuzen. Dieses Muster legt nahe, daß die kommisuralen Axone nur in dem Abschnitt durch Anti-T-Cadherin angefärbt werden, der sich in Kontakt mit der Floor Plate befindet. Die Expression in der Floor Plate Region war transient, da in älteren Tieren eine geringe oder keine Anfärbung im Floor Plate Bereich detektiert werden kann.
Motorneurone wählen als ihre intermediären Ziele die anteriore Region der somitischen Sklerotome aus (Keynes and Stern, Nature 310: 786-789 (1984)), und etablieren auf diese Weise ein segmentales Muster der Nervenprojektion. In koronalen Sektionen von Hühnerembryos des Stadiums 22-23 wurde T-Cadherin in einem erstaunlich segmentalen Muster auf der Oberfläche von posterioren somitischen Zellen exprimiert (Fig. 8a, Tafel 1). Die Faszikeln der Spinalnerven, die die anterioren somitischen Regionen kreuzen, wurden in einem benachbarten Abschnitt mit Anti-Contactin-Antikörpern (Fig. 8a, Tafel 2) identifiziert. Das segmentale Muster der T-Cadherin-Expression wurde beobachtet, sobald die Neuralleistenzellen in die Somitenbereiche einwanderten.

BEISPIEL IX

Identifizierung von für T-Cadherin kodierenden cDNA-Klonen

Eine cDNA-Bibliothek, die aus Hühnergehirn des embryonalen Tags 13 hergestellt wurde (Ranscht, J. Cell Biol. 107: 1561-1573 (1988)) wurde nach cDNA-Klonen, die für T-Cadherin kodieren, durchsucht. Nitrocellulosereplikafilter einer λgt11 Expressionsbibliothek aus Hühnergehirn des embryonalen Tags 13 wurden mit Affinitäts-gereinigtem Anti-T-Cadherin-Antiserum (1 : 40) durchsucht. Das Durchsuchen erfolgte im wesentlichen wie von Maniatis beschrieben, der hier durch Bezugnahme eingeschlossen wird. Alkalische Phosphatase-konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen- Immunglobulin und 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (BCIP) und Nitroblau-Tetrazol (NBT)-Substrate (Protoblot, Progema) wurden als Detektionssystem verwendet. Beim initialen Screenen wurde ein Klon von 7 · 10&sup5; amplifizierten und 8 · 10&sup4; unamplifizierten Rekombinanten isoliert. Dieser Klon stellte aufgrund zweier Kriterien einen wahres T-Cadherin-Transkript dar:
1) Die cDNA kodierte für ein Fusionsprotein, das durch Anti-T-Cadherin-Antiserum erkannt wurde. Affinitätsreinigung des Antiserums auf rekombinantem Fusionsprotein selektierte Antikörper, die für das 90 kD Protein in Gehirnhomoginaten auf Western-Blots spezifisch waren. Außerdem färbte das Affinitäts-gereinigte Antiserum in indirekter Immunfluoreszenz auf Sektionen von Hühnchenembryos des Stadiums 22-23 posteriore Somitensegmente.
2) Ein schlüssiger Beweis, daß die ausgewählte cDNA ein T-Cadherin-Transkript darstellte, wurde durch Vergleich der konzeptual translatierten cDNA-Sequenz mit der Aminosäuresequenz erhalten, die durch Mikrosequenzierung des NH&sub2;- Terminus des 90 kD Proteins erhalten wurde. Die 17 NH&sub2;- terminalen Aminosäuren des 90 kD Polypeptids stimmten mit den Aminosäuren 117 bis 133 im offenen Leserahmen des Proteins überein, das konzeptual von der cDNA-Sequenz translatiert wurde (siehe Fig. 2a und 2b).

BEISPIEL X

Isolierung weiterer T-Cadherin-cDNA-Klone

16 zusätzliche cDNA-Klone für T-Cadherin wurden isoliert, indem sowohl λgt10 (amplifiziert) und λgt11 (unamplifiziert) Bibliotheken von Hühnchengehirn mit T-Cad 2 Restriktionsfragmenten durchsucht wurden, die mittels Nick-Translation markiert waren (Maniatis et al., a.a.O., Kit von Bethesda Research Laboratories Gaithersburg, MD). Die Restriktionsfragmente umfaßten die Nukleotide 440-1559 des anfangs isolierten Klons und schlossen die kodierenden Sequenzen, die für den NH&sub2;-Terminus des 90 kD Proteins kodieren, ein. Phagenplaques wurden im Doppel auf Hybond- Nylonmembranen (Amersham, Arlington Heights, IL) transferiert. Die Filter wurden sukzessiv durch 1.5 M NaCl/O,5 M NaOH für 2 Minuten, 3 M Na-Acetat, pH-Wert 5,2 für 5 Minuten und 20 · SSPE (3 M NaCl, 0,2 M NaH&sub2;PO&sub4; · H&sub2;O, 0,02 M Na&sub2;-EDTA, pH- Wert 7,4) gezogen, getrocknet und für 60 Minuten in einem Vakuumofen gebacken. Die Prähybridisierung erfolgte bei 42ºC in 50% deionisiertem Formamid, 5 · SSPE, 1 · Denhardts und 100 ug/ml Lachssperma DNA für 2-4 Stunden. Hybridisierung erfolgte über Nacht unter identischen Bedingungen mit der Sonde bei 2 · 10&sup6; cpm/Filter. Die Filter wurden unter Bedingungen hoher Stringenz gewaschen (0,2 · SSPE/0,2% SDS bei 68ºC) und über Nacht auf Kodak XAR-5 Filmen belichtet.
Alle Klone hatten Restriktionsschnittstellen innerhalb ihrer internen Nukleotidsequenz gemeinsam, variierten aber in der Länge von 1 bis 3.8 kb. Von allen Klonen wurden EcoRI Restriktionsfragmente in den Bluescript KS+ Vektor (Stratagene, La Jolla, CA) subkloniert und für Nukleotidsequenzbestimmung unter Verwendung einer doppelsträngigen DNA als Template verwendet. Die Sequenz über die internen EcoRI Stellen hinweg wurde von cDNA-Templaten erhalten. Die Nukleotidsequenz des Klons 266 ( T-Cad 1), einem der längsten cDNA-Klone (3.8 kb) und die der cDNA 1212 ( = T-Cad 2) sind in den Fig. 2a und 2b gezeigt.
Verschiedene cDNA-Klone wurden von einer humanen λgt11 Embryogehirnbibliothek (Clontech) isoliert. Ein Klon enthält die kodierende Sequenz des humanen T-Cadherins, die bei Aminosäure 23 (das äußerste Aminoende fehlt) von Fig. 2 beginnt. Die Homologie zwischen Hühner-T-Cadherin und humanem T-Cadherin beträgt ungefähr 80%.

BEISPIEL XI

RNA-Isolierung

Die gesamte zelluläre RNA wurde von aus gebrüteten Hühnchen nach der Guanidinisothiocyanat-Methode isoliert (Maniatis et al., a.a.O.). Kurz gesagt, wurden die Gewebe auf Eis in 4 bis 6 ml 4 M Guanidinthiocyanat (GTC)-Puffer pro Gramm Gewebe homogenisiert (94,4 g GTC, 1,67 ml 3 M Natriumacetat, pH 6,0, 0,5% Sarkosyl, 200 ul Antifoam A, 500 ul 1 NaOH, zu 200 ml mit DEPC behandeltem dd H&sub2;O, 2-Mercaptoethanol in einer Endkonzentration von 0,1 M sollte kurz vor Gebrauch hinzugegeben werden). 4 bis 5 ml 5,7 M CsC&sub1;-Lösung werden mit dem Homogenat in einem SW 40 Zentrifugenröhrchen (Beckman, Carlsbad, CA) überschichtet. Die CsCl-Lösung wird wie folgt hergestellt: 95,97 g CsCl, 0,83 ml 3 M Natriumacetat pH 6,0, werden zu 100 ml mit DEPC-dd H&sub2;O aufgelöst und sterilfiltriert. Die Röhrchen werden mit GTC-Puffer ausbalanciert, und die Proben werden bei 32 000 U/min für 18 Stunden unter Verwendung einer Ultrazentrifuge (Sorvall, Newtown, CT) zentrifugiert. Nach der Zentrifugation werden der GTC-Puffer und die CsCl-Lösung abgesaugt, so daß ungefähr 1 ml der CsCl-Lösung übrig bleibt, die das RNA-Pellet bedeckt. Die Wände des Röhrchens werden mit 1 bis 2 ml des GTC-Puffers abgespült, und der Puffer wird einschließlich der CsCl-Schicht vorsichtig entfernt. Die Röhrchen werden 1 bis 2 cm oberhalb des Bodens mit einer heißen Rasierklinge abgeschnitten, und die RNA- Pellets werden mit 400 ul Ethanol einer Temperatur von -20ºC gespült, getrocknet und in Tris-EDTA (TE; 10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 1 mM EDTA) resuspendiert. Die resuspendierte RNA wird durch zweifache Extraktion mit einem gleichen Volumen an Phenol/Chloroform gereinigt, gefolgt von einer Ethanol-Präzipitation und Waschen, wie oben beschrieben. Die RNA wurde durch Absorption bei 260 nm quantifiziert (OD&sub2;&sub6;&sub0; von 1 = 50 ml/ml). Die Reinheit wurde durch Bestimmung des Absorptionsverhältnisses bei 260 nm gegenüber der Absorption bei 280 nm (OD 260/280 ≥ 2,0 für RNA) überprüft. Die RNA-Proben wurden als Ethanol-Präzipitate bei -70ºC bis zum weiteren Gebrauch gelagert. RNA wurde aus Geweben von Hühnchenembryonen aus einem frühen Entwicklungsstadium mittels Lithium-Präzipitation, wie bei Maniatis, a.a.O. beschrieben ist, präpariert. Bei der Sondierung mit T-Cadherin cDNA wurden zwei Transkripte mit ungefähr 9,5 und 7,5 kb detektiert.

BEISPIEL XII

RNase-Protektion

RNA-Transkripte, die für das T-Cadherin-Präpeptid und die 3'- untranslatierten Bereiche kodieren, wurden durch in vitro-Transkription von T-Cadherin cDNA hergestellt. Das Templat für die Präpeptidsonde (für T-Cad 1 und T-Cad 2 gleich) war ein 274 bp EcoRI Restriktionsfragment (Fig. 2b) aus λgt11 T-Cad 2, das in Bluescript KS+ kloniert war. Das Fragment wurde durch ein HindIII Verdau in der Polylinkerregion linearisiert. Eine spezifische Sonde des 3'-Endes von T-Cad 1 wurde durch Entfernen von 1.5 kb untranslatierter Sequenz vom äußersten 3'-Ende des Klons T-Cad 1 durch Restriktionsverdau mit StuI/SmaI und Religation der stumpfen Enden hergestellt. Ein 168 bp Templat wurde durch Linearisierung von T-Cad 1 DNA mit SfaI erhalten. Ein spezifisches Templat des 3'-Endes für T-Cad 2 wurde erzeugt, indem man sein 2.1 kb EcoRI Restriktions fragment in Bluescript KS&spplus; klonierte und das cDNA-Fragment mit HpaI verdaute. Hühnchen-β-Actin-cDNA (freundlicherweise von Dr. D. Cleveland, Johns Hopkins University, Baltimore, MD, zur Verfügung gestellt) wurde als Kontrolle verwendet. Die β-Actin-cDNA wurde mit KpnI und Hindill verdaut und in den SP72-Transkriptionsvektor (Melton et al., Nucleic Acids. Res. 13: 7035-7056 (1984)) kloniert. Die DNA wurde durch Verdau mit PvuII linearisiert. Die Template wurden in anti-sense-Orientierung in Gegenwart von T7 RNA-Polymerase und ³²P-rUTP unter Bedingungen transkribiert, wie sie von Melton, a.a.O., beschrieben sind. Sonden wurden über Polyacrylamidgele gereinigt. Ein 1%iges Aliquot der Gesamtsonde wurde über Nacht in 80 Formamid, 400 mM NaCl, 4 mM PIPES und 1 mM EDTA bei 45ºC mit 2 -10 ug Gesamt-RNA aus verschiedenen Geweben hybridisiert. Nicht-hybridisierte RNA wurde mit RNase A und RNase T1 für 60 Minuten bei Raumtemperatur verdaut. RNA-Hybride wurden mit Polyacrylamidgelen aufgetrennt und Belichtung von Kodak XAR-5 Filmen analysiert.
Alle Gewebe, die ein geschütztes Fragment mit der Präpeptidsonde zeigen, zeigten auch ein geschütztes Fragment mit dem 3'-Fragment, was beweist, daß die mRNA, die für die Phosphoinositol gebundene Form des T-Cadherins kodiert, in den Geweben existiert. Gehirn, Herz, Retina, kultivierte sympathische Neuronen, Rückenmark des Stadiums 37 und 24 (besonders Floor Plate) und Somiten zeigten geschützte Fragmente.
Obwohl die Erfindung unter Bezugnahme auf die gegenwärtig bevorzugte Ausführungsform beschrieben wurde, sollte es selbstverständlich sein, daß verschiedene Modifikationen erfolgen können, ohne sich vom Geist der Erfindung zu entfernen. Dementsprechend wird die Erfindung nur durch die folgenden Ansprüche limitiert.

BEISPIEL XIII

Expressionsvektoren und Transfektion von CHO-Zellen

Zur Herstellung eines Plasmids, das die Gesamtlänge der T-Cadherin-DNA enthält, wurde T-Cadherin-cDNA 266, die gemäß Beispiel IX infiziert worden ist, aus λgt11 durch partiellen Verdau mit EcoRI (0,0625 E/ug DNA für 30 Minuten) herausgelöst und in Bluescript KS (Stratagene, La Jolla, CA) laut Anweisung des Herstellers subkloniert. Zur Expression in Eukaryontenzellen wurde ein Plasmid, pcD-Tcad, das den kodierenden Bereich des T- Cadherin enthält, erzeugt. Ein T-Cadherin-DNA-Fragment wurde aus Bluescript durch Verdau mit NotI und StuI herausgeschnitten und · in die EagI/EcoRV Polylinkerstellen des eukaryontischen Expressionsvektors pcDNAI (Invitrogen, La Jolla, CA) ligiert.
CHO-DG44-Zellen wurden durch Calciumphosphat-Kopräzipitation mit pcD-Tcad und pSV2neo transfiziert, einem bekannten Plasmid, das eine Neomycinresistenz trägt (American Type Tissue Culture Collection). Zellen ließ man in alpha-formuliertem MEM (Gibco, Gaithersburg, MD oder Sigma, St. Louis, MO) wachsen, das 10% fötales Kälberserum (FCS, Tissue Culture Biologicals, Tulare, CA) plus 1X HT Supplement (Sigma), 2 mM L-Glutamin, 1 mH Natriumpyruvat und nicht-essentielle Aminosäuren (Gibco) enthielt, und plattierte bei einer Dichte von 4,5 · 10&sup5;/6 cm Schale aus. Nach 16 Stunden in Kultur wurden 5 ug Calciumphosphat-präzipitierter pcD-Tcad- oder pcDNAI-Vektor plus 1 ug pSV2neo-Plasmid in frischem Kulturmedium hinzugegeben. Nach weiteren 24 Stunden in Kultur wurden die Zellen 1 : 3 in 10 cm Schalen aufgeteilt, und G418 (Geneticin, Gibco) wurde bis zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml hinzugegeben. Nach 12-15 Tagen wurden G418 resistente Kolonien unter Verwendung von Klonierungskammern isoliert und auf die Zelloberflächenexpression von T-Cadherin mittels indirekter Immunofluoreszenz mit Anti-T-Cadherin-Antiserum untersucht. Verschiedene Kolonien wurden ausgewählt, und eine wurde durch Fluoreszenz-aktiviertes Zellsortieren hinsichtlich der Zellen angereichert, die den höchsten T-Cadherin-Anteil exprimieren. Diese Zellen wurden für alle Aggregationsexperimente verwendet. Als Kontrolle wurden CHO-Zellen sowohl mit dem pcDNAl- als auch mit den pSV2neo-Vektor transfiziert, und Zellen aus den G418 resistenten Kolonien wurden mittels Southernblot- Analyse daraufhin untersucht, ob sie pcDNAl in der genomischen DNA inkorporiert enthielten. Eine pcDNAl positive Kolonie wurde als Kontrolle ausgewählt. Kontroll-CHO-Zellen exprimieren T- Cadherin nicht, was durch indirekte Immunfluoreszenz und Westernblot-Analyse ermittelt wurde.

BEISPIEL XIV

Aggregationsversuche

Für Aggregationsversuche wurden die transfizierten CHO-DG44- Zellen zweimal mit 5 ml Hanks balanced salt solution (HBSS; Gibco) gewaschen, die 1 mM CaCl&sub2; enthielt, und durch Inkubation bei 37ºC für 20 Minuten in 25 mM HEPES gepufferten HBSS (HHBSS) suspendiert, das 0,014% Trypsin und 0,9 mM CaCl&sub2; enthielt. Die Reaktion wurde durch Zugabe eines gleichen Volumens an 0,02 Sojabohnentrypsininhibitor in HHBSS gestoppt, und die Zellen wurden gewaschen und bei 4ºC in HHBSS resuspentiert, das 1 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) enthielt. Resuspendierte Zellen wurden mit 1 mM MgCl&sub2; und 50 ug/ml DNase I für 30 Minuten bei 37ºC inkubiert, um jegliche verbliebene DNA zu entfernen, die die Hintergrundaggregation erhöhen könnte. Zellen (1 · 10&sup5;) in HHBSS plus BSA wurden in einem Volumen von 0,5 ml in unbeschichteten Linbro 24-Well-Schalen bei 37ºC inkubiert und bei 90 U/min für 30 Minuten rotiert. Die Aggregation wurde durch Zugabe von 1 mM CaCl&sub2; gestartet und wurde durch Zugabe von 500 ul 5%igem Glutaraldehyd in HHBSS (Endkonzentration 2,5%) gestoppt. Die Aggregate wurden vorsichtig gemischt, und die Zahl der Partikeln wurde mittels eines Coulter-Modells Zf mit einer 100 u Öffnung ermittelt. Die prozentuale Aggregation wurde mit Hilfe der Formel N&sub0;-Nt/N&sub0; · 100% ermittelt, wobei Nt die Partikelzahl bei der Zeit t = 30 Minuten war und N&sub0; die Partikelzahl zu Beginn war. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch Trypanblau-Ausschluß bestimmt, bevor die Zellen in die 24 Well-Schalen aliquotiert wurden.
Bei Zellen, die vor der Aggregation mit Phosphatidylinositolspezifischer Phospholipase C (PI-PLC) behandelt worden waren, wurden 40 ul an PI-PLC vor der 30minütigen Inkubation mit DNase I zugegeben. Bei den Experimenten, bei denen Zytosklelettzerstörende Agenzien verwendet wurden, wurde entweder Cytochalasin D (Calbiochem) oder Nocodazol (Calbiochem) oder DMSO (Sigma) zusammen mit der DNase I zugegeben, und die Zellen wurden bei 37ºC für 30 Minuten inkubiert. Die Aggregationsversuche wurden dann wie beschrieben durchgeführt.
Für Mischungsexperimente wurden die Zellen durch 30minütige Inkubation bei 37ºC mit 10 pM Carboxyfluoresceindiacetatsuccinimylester (CFSE; Molecular Probes, Inc., Junction City, OR) markiert. Diese Markierung wurde entweder vor der Trypsinbehandlung an einem Zellmonolayer in regulären Medien oder anschließend an die Trypsinbehandlung durchgeführt. Die Zellen wurden wie oben beschrieben mit Trypsin behandelt und bei 1-2 · 10&sup5;- Zellen pro Zelltyp in insgesamt 500 ul HHBSS, 1 mg/ml BSA, 1 mM CaCl&sub2; inkubiert. Lebende Zellen wurden unter Verwendung eines geheizten (37ºC) Mikroskopiertisches auf einem Zeiss Axiovert 405M photographiert. Die Resultate sind in Fig. 9 und 10 gezeigt.
Fig. 9a und 9b zeigen, daß T-Cadherin homophile Zelladhäsion vermittelt. Fig. 9a ist ein Phasenkontrast-Photomikrogramm, das verschiedene Aggregate zeigt. Fig. 9b ist ein Fluoreszenz-Photomikrogramm markierter, nicht-transfizierter Zellen in demselben Feld. Ein Vergleich der Fig. 9a und 9b zeigt, daß die nicht-transfizierten Zellen als Einzelzellen verbleiben und nicht-adhäsiv sind, während Zellen, die mit dem T-Cadherin-Gen transfiziert wurden, zum Aggregieren neigen.
Fig. 10 zeigt die prozentuale Aggregation T-Cadherin-transfizierter Zellen im Vergleich zu verschiedenen Kontrollen. Die Resultate zeigen, daß die Aggregation bei T-Cadherin-transfizierten Zellen signifikante höher ist als im Vergleich zu den Kontrollzellen und den PI-PLC behandelten Zellen.
Um die Oberflächenverteilung von T-Cadherin im Anschluß an die Zellaggregation zu bestimmen, wurden die Zellen behandelt, und man ließ sie wie oben beschrieben aggregieren. Nach 10 Minuten wurde Formaldehyd bis zu einer Konzentration von 3% hinzugege ben, und die Zellen wurden für 10 Minuten rotiert. Die Zellen wurden vorsichtig mit PBS gewaschen und in PBS resuspendiert, das Anti-T-Cadherin-Antiserum (1 : 100) enthielt und bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln für 40 Minuten inkubiert. Die Zellen wurde zweimal mit PBS gewaschen und mit FITC-konjugiertem Ziege F(ab')&sub2;-Anti-Kaninchen-IgG, das 1 : 50 verdünnt war, für 40 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen und für die Untersuchung in PBS resuspendiert.
Die Resultate sind in Fig. 11 gezeigt. Fig. 11a zeigt das Phasenkontrast-Photomikrogramm der Oberflächenverteilung von T- Cadherin nach Aggregation. Fig. 11b zeigt das Fluoreszenz-Photomikrogramm der Aggregate in demselben Feld. T-Cadherin scheint in Bereichen des Zell-Zell-Kontaktes konzentriert zu sein. Diese Resultate zeigen, daß T-Cadherin die Zellen zur Adhäsion untereinander anregt.

Claims

1. Im wesentlichen gereinigtes Polypeptid, bezeichnet als T- Cadherin, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid im extrazellulären Abschnitt die allgemeine Cadherin-Struktur enthält, ihm aber die zytoplasmatischen Sequenzen fehlen; wobei das Polypeptid in seiner natürlichen Umgebung durch eine Glykosylphosphatidylinositol-Verbindung in der Zellplasmamembran verankert ist; und wobei das Polypeptid mit Antikörpern kreuzreagiert, die mit Polypeptiden reagieren, die die in Fig. 2a und 2b angegebene Aminosäuresequenz haben, die aber nicht mit N-Cadherin, E-Cadherin, P-Cadherin und L-CAM reagieren.

2. Im wesentlichen gereinigtes Polypeptid nach Anspruch 1, bezeichnet als T-Cadherin 1, das die in Fig. 2a gezeigte Aminosäuresequenz hat.

3. Im wesentlichen gereinigtes Polypeptid nach Anspruch 1, bezeichnet als T-Cadherin 2, das die in Fig. 2b gezeigte Aminosäuresequenz hat.

4. Isolierte Nukleinsäuresequenz, die für die Polypeptide nach Anspruch 2 oder 3 kodiert.

5. Antikörper, die spezifisch mit den in den Fig. 2a und 2b gezeigten Polypeptidsequenzen, nicht aber mit N-Cadherin, E- Cadherin, P-Cadherin und L-CAM reagieren.

6. Antikörper nach Anspruch 5, wobei die Antikörper polyklonal sind.

7. Antikörper nach Anspruch 5, wobei die Antikörper monoklonal sind.

8. Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins von T-Cadherin in einem Subjekt, bei dem man eine Probe aus dem Subjekt mit dem Antikörper nach Anspruch 5 in Kontakt bringt und das Binden des Antikörpers an T-Cadherin detektiert, wobei das Vorliegen einer Bindung das Vorhandensein von T-Cadherin anzeigt.

9. Nukleinsäuresonde, die Nukleinsäuresequenzen umfaßt, die zu Abschnitten der Nukleinsäure nach Anspruch 4 hinreichend komplementär sind, um eine Hybridisierung zu ermöglichen.

10. Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins von T-Cadherin in einem Subjekt, bei dem man die Sonde nach Anspruch 9 mit einer Nukleinsäure enthaltenden Probe aus dem Subjekt in Kontakt bringt und das Binden der Sonde an die Nukleinsäure bestimmt, wobei das Vorliegen einer Hybridisierung das Vorhandensein von T-Cadherin anzeigt.

11. Expressionsvektor, der die Nukleinsäure nach Anspruch 4 umfaßt, wobei der Vektor in der Lage ist, T-Cadherin in einer transformierten Wirtszelle zu exprimieren.

12. Transformierte Wirtszelle, die den Vektor nach Anspruch 11 in einer geeigneten Wirtszelle umfaßt.

13. Polypeptide, die durch die transformierten Wirtszellen nach Anspruch 12 hergestellt sind.

14. Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine effektive Menge an T-Cadherin umfaßt, das wie in Anspruch 1 definiert ist oder eines Oligonukleotids umfaßt oder einer cDNA umfaßt, die für T-Cadherin kodiert, die aber nicht für N-, E-, P-Cadherin und L-CAM kodiert.

15. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 14 zur Inhibierung von Tumorzellmigration.

16. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 14 zum Reparieren traumatisierter Neurone eines Subjekts.