JPH06505962A - Ｔ−カドヘリン接着分子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｔ−カドヘリン 発明の背景 本発明は細胞表面分子、より詳細にはカドヘリンファミリーの新しい細胞接着分 子であるＴ−カドヘリンに関する。

カドヘリン類は発生中および成体の生物において、Ｃａ”依存性のメカニズムに より接着の相互作用を媒介する貫膜糖タンパク質のファミリーである（Ｔａｋｅ ｉｃｈｉ、　１９８８および１９９０、総説）。カドヘリン類は共通の原型とな る遺伝子から発生したことが示唆されている。遺伝子の複製により、異種の配列 を有する構造上関連した分子コアミ＋７−が形成され得た。カドヘリン類はそれ らの全長の構造が共通しており、そこでは細胞外領域において１つのシグナルペ プチド、１つのプレペプチドおよび５つの関連する細胞外ドメインが細別され、 ならびにそれに引き続いて、高度に保存された−続きの貫膜ドメインおよび細胞 質アミノ酸が伴われ、これが細胞骨格のネットワークとの結合を与えるものであ ると示唆されている。

シグナルペプチドおよびプレペプチドは直ちに開裂され、成熟タンパク質には存 在しない。カドヘリンファミリーの数種のメンバーは特徴付けられている。Ｎ− カドヘリンは発生中の神経系で見出され、インビトロで神経線維の成長の強力な 媒介物であることが示されている。神経組織に加えて、Ｎ−カドヘリンは心臓お よび骨格筋ならびに水晶体細胞でも発現される。Ｅ−カドヘリン（マウスでラボ モルリンとしても知らレテいる）は上皮細胞の構成成分であり、Ｐ−カドヘリン は胎盤で見出される。

本出願の主題であるＴ−カドヘリンは、細胞外領域の全体的なカドヘリン構造を 共有するが、細胞質の保存配列を欠く、カドヘリンファミリーの新規なメンバー である。従って、Ｔ−カドヘリンの機能の新しい様式が提案され、その様式では 、Ｔ−カドヘリンは細胞骨格との直接の結合を通してではな（、より高度な膜の 移動性およびその細胞外リガンドへの迅速なアクセスを通して、接着細胞の特性 を調節する。Ｔ−カドヘリンの発現パターンは、発生中の胚での神経線維の成長 パターンの確立における主要な役割を示唆する。さらに、Ｔ−カドヘリンは、上 皮体部が遷移して皮膚前節および硬節を形成するときに分節パターン中で同定さ れる、最初の分子的に特徴付けられたポリペプチドである。最終的にを髄を生じ る体節性硬節の片方中のみでの発現によると、Ｔ−カドヘリンがを椎動物の胚の 分節において主要な役割を果たすことが示唆される。

分節は、屈曲性を与えおよび個体に背を曲げる能力を与えるを柱の重要な特性で ある。■−カドヘリンはまた筋肉細胞および血管においても同定される。筋肉で は、Ｔ−カドヘリンは細胞の分化および機能に関連し得る。Ｔ−カドヘリンは血 管でも見出されている。

神経線維の成長を調節し指示する分子の同定は、神経再生の研究にとって重要で ある。切断された後、ニューロンは退化するか、あるいは重度の萎縮状態に陥る 。これらの傷害されたニューロンの回復の予後は非常に悪い。従って、Ｔ−カド ヘリン細胞接着分子のような分子の使用は、軸策を再成長させそれらの対応する 標的細胞を神経再支配するために軸策を導（ように二ニーロンに作用し得る。結 局、これは発作または神経系への外傷による不能状態からの軽減に通じる。

従って、胚の発生の調節あるいは傷害された二ニーロンの回復に関連する細胞表 面接着分子の同定および特徴付けの必要が、これらの分子を検出し利用する方法 を含めて存在する。

本発明はこの必要性を満たし、それに関連する利点も与える。

発明の要旨 本発明は、実質的に精製されたＴ−カドへリンポリペプチドおよびＴ−カドへリ ンポリペプチドをコードする単離された核酸を提供する。種々の形態のＴ−カド ヘリンには応答するが、Ｎ−１Ｅ−またはＰ−カドヘリンには応答性のない抗体 も提供される。本発明は、被験体中の種々の形態のＴ−カドヘリンを検出する方 法、および有効量のＴ−カドヘリンにより細胞接着を増加させることからなる、 腫瘍細胞の移動を阻害する方法を提供する。さらに、傷害されたニューロンを修 復する方法を提供する。この方法は、傷害されたニューロンを治療上有効な用量 のＴ−カドヘリンで処置することを包含する。

図面の簡単な説明 図１は、Ｔ−カドヘリン１（２６６ｃＤＮＡ）およびＴ−カドヘリン２（１２１ Ｚ　ｃＤＮＡ）の構造的配列をカドヘリンのコンセンサス構造で示す。

図２は、Ｔ−カドヘリンのヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示す。図２ａ は、Ｔ−力ドへリン１の配列である。図２ｂは、Ｔ−力ドへリン２の配列を示す 。

図３は、Ｔ−カドヘリン１（２６６ｃＤＮＡ）のアミノ酸配列を、関連するタン パク質であるＮ−カドヘリン、Ｌ−ＣＡＭ、　Ｅ−カドヘリンおよびＰ−カドヘ リンとともに示す。

図４は、Ｔ−カドヘリンの抗血清を用いて３日齢のヒナから単離した種々の組織 のイムノプロ・ットである。９０．１１０および１２０　ｋＤの分子量を有する ポリペプチドは神経組織で検出されるが、９０および１１０　ｋＤのみのポリペ プチドは非神経組織で検出される。レーン１、を髄；レーン２、中脳；レーン３ 、小脳；レーン４、皮質；レーン５、［ｉ；レーン６、網膜；レーン７、筋肉； レーン８、心臓；レーン９、腎臓；レーン１０、肝臓；レーン１１、肺。

図５３は、Ｔ−カドヘリンの抗血清を用いたウェスタンプロ・ノティングによる ホスファチジルイノシトールホスホリンく−ゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）処理後の、培 養ニューロンからのＴ−カドヘリン放出を示す。Ｔ−カドヘリンはＰＩ−ＰＬＣ 処理後に、上清中に放出される（レーン６）。この放出はＺｎＣｌ２での処理に より阻害される（レーン９）。図５ｂは、ＰＩ−ＰＬＣによる培養ニュロンカ） ら放出後の３Ｈ−エタノールアミンで標識したＴ−カドヘリンの免疫沈降である 。分子量９０および１２０　ｋＤの２つのポリペプチドがＰＩ−ＰＬＣによって 放出され、Ｔ−カドヘリンの抗血清で沈降される（レーン２）。

図６は、Ｔ−カドヘリン１のＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔｌ制限フラグメント（１゜７６ 　ｋｂ）に対応するＴ−カドヘリンのｃＤＮＡの一部分でプローブした脳組織の ＲＮＡプロットである。プローブは７．５および９．５ｋｂの２つのｍＲＮＡ種 を検出する。

図７は、Ｔ−カドヘリンｍＲＮＡのリボヌクレアーゼ防御アッセイを示す。試料 は畔化したヒナからの、ＢＲ＝脳、Ｍ＝筋肉、Ｌ■＝肝臓、Ｈ＝心臓、Ｋ＝腎臓 、ＬＵ＝肺、ＲＴ＝網膜である。Ｎ＝実施例５に記載のような培養した交感神経 。を髄Ｈ／Ｈ３７および２４期。を髄Ｈ／Ｈ２４期はＤ＝背側鎖域、■＝腹側領 域およびＦＰ＝底板領域に分離した。ＳＯＭ＝体節。

図８は、発生中の神経系におけるＴ−カドヘリンの発現の免疫組織化学分析であ る。検査した組織は：（ａ）体部■／Ｈ２３期；（ｂ）発生中のを髄、パネル１ ％Ｈ／Ｈ２０期、パネル２．１１７１１２４期およびパネル３、Ｈ／Ｈ３２期： （Ｃ）血管；および（ｄ）筋肉。

図９は、Ｔ−カドヘリンが同種親和性の細胞接着を媒介することを示す。非標識 Ｔ−カドヘリンでトランスフェクトした細胞およびＣ５ＦＥ標識した対照細胞の 同数を混合して凝集させた。

図９８は、生じた凝集の位相差光学顕微鏡写真である。図９ｂは、同じ視野での 蛍光光学顕微鏡写真である。凝集はＴ−カドヘリンでトランスフェクトした細胞 のみを含んで形成され、それゆえ、その結合は同種親和性である。線（Ｂａｒ） 　＝　５０μ■。

図１０は、Ｔ−カドヘリンでトランスフェクトした細胞の凝集パーセントを示す 。凝集アッセイは実施例ＸｒＶに記載のようカラシンＤあるいは１重ｇ／ｍｌの ７コダゾールで処理した。数値は記載のように測定された凝集パーセントを表す 。結果は平均上標準偏差である。各測定はｎの数の回数を、各３重に行った。（ ＊）ｎ＝１２、（＋）ｎ＊２、および（◆）ｎ・３゜図１１は、凝集した細胞中 のＴ−カドヘリンの表面分布を示す。

図１１３は、トランスフェクトした細胞の位相差光学顕微鏡写真である。図１１ ｂは、同じ視野での同じ凝集の蛍光光学顕微鏡写真を示す。

発明の詳細な説明 Ｔ−カドヘリン（”Ｔ−ｃａｄ”　；　Ｔ＝切り形の）は細胞接着分子のカドヘ リンファミリーのメンバーの１つである。Ｔ−カドヘリンは胚の発生あるいは傷 害されたニューロンの回復に関連し得、それゆえ、神経の再生に有用である。Ｔ −カドヘリンは神経系で、ならびに心臓、骨格筋、血管、ならびに消化管および 皮膚を裏打ちする筋肉において発現される。血管中のＴ−カドヘリンの高度の発 現は、高度に血管新生した腫瘍の発達に重要であり得る。

Ｔ−カドヘリンは、他のカドヘリン類の全てではないがい（つかの構造上の特徴 を共有する。構造上の類似はアミノ酸レベルにまで及び、Ｔ−カドヘリンの細胞 外部分はＮ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、Ｐ−カドヘリンおよびＬ−ＣＡＭの 細胞外ドメインと３５〜４７％の同一性を示し；４７％のアミノ酸同一性を有す るＮ−カドヘリンと最も密接に関連がある。本発明で同定されたＴ−カドヘリン の２つの形態は、カドヘリンファミリーの他の全てのメンバーで見られる細胞質 の部分を欠いている。本明細書でＴ−ｃａｄ　１と呼ぶＴ−カドヘリンの１つの 形態は、グリコジルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合によって膜に固 定されていると思われる。このような結合の生化学的証拠は、Ｔ−カドヘリンが ホスファチジルイノシトール特異的なホスホリパーゼＣによって細胞の原形質膜 から放出され得、放射標識したエタノールアミンをＧＰＩ結合に組込み得ること を示すことによって得られる。Ｔ−ｃａｄ　２と呼ぶＴ−カドヘリンのもう一方 の形態は、疎水性ドメインのための配列をその後に５つの細胞質アミノ酸を伴っ て含むことが、ｃＤＮＡによって予測される。このｃＤＮＡのＣＯ３−細胞への 予備的なトランスフェクションから、この形態もＧＰＩ−結合であるらしい。こ れらのデータは、特にそれらの提案された細胞骨格との関連で、周知のカドヘリ ン類とは異なるＴ−カドヘリンの膜結合の証拠を提供する。要約すると、Ｔ−カ ドヘリンは細胞接着分子のカドヘリンファミリーのメンバーの１つであるが、周 知のカドヘリン類とは原形質膜への固定において異なる。

２つの密接に関連するがＴ−カドヘリンの異なる形態であるＴ−ｃａｄ　１およ びＴ−ｃａｄ　２をコードするｃＤＮＡが単離された（図２ａおよび図２ｂ）。

両方の形態の細胞外の部分は同一で、カドヘリンファミリーに特有な構造上の特 徴を含む。この２つの形態はＣ０ＯＨ末端領域で異なっており、その領域でＴ− ｃａｄ　２のｃＤＮＡは５つの追加のアミノ酸をコードする（図３）。細胞質ド メインの欠損は、細胞膜内でのこれらの分子に対しより大きな移動性牽与え、こ うして接着細胞の特性を調節する。

Ｔ−カドヘリンの両方の形態をコードするＲＮＡ転写物を、それぞれの形態に特 異的なりボヌクレアーゼ防御プローブを用いて検出した。Ｔ−カドヘリンの異な る形態は発生上一時的に、および組織特異的な様式で調節され得るという証拠が ある。

本明細書で用いる「Ｔ−カドヘリン」あるいはｒ　Ｔ−ｃａｄＪは、図２３およ び図２ｂのアミノ酸配列を実質的に有するポリペプチドを指し、これらはＴ−ｃ ａｄに応答性の抗体と交叉反応するが、Ｎ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、Ｐ− カドヘリンおよびＬ−ＣＡＭに応答性の抗体とは交叉反応しない。Ｔ−ｃａｄ　 １およびＴ−ｃａｄ　２の細胞外、貫膜および切り形の細胞内ドメインを含むポ リペプチドを提供する。その免疫応答性を破壊しない配列の小さな改変も、特許 請求されるタンパク質の定義の中に含まれる。

示されたＴ−ｃａｄ　１およびＴ−ｃａｄ　２のＴ−カドヘリンのｃＤＮＡのオ ープンリーディングフレームは、予測された分子量が７６、０１８および７６、 ６２７ダルトンである、それぞれ６９０および６９５のアミノ酸タンパク質をコ ードする。

限定された改変がＴ−カドヘリンの生物学的機能を破壊せずに作られ得ること、 および完全な一次構造の一部のみが活性を生じるのに必要とされ得ることが理解 される。−次アミノ酸配列の小さな改変は、実質的に同等あるいは増強された機 能を有するタンパク質を生じ得る。

本明細書で用いる「Ｔ−カドヘリン」は、図２３および図２ｂに示される配列と 実質的に等しいアミノ酸配列を有する細胞接着ポリペプチドを指し、胚の神経系 の発達および傷害されたニューロンの回復に関連し得る。本明細書で用いる「Ｔ −カドヘリン」はまた、ポリペプチドの所望の活性を有する細胞接着ポリペプチ ドの活性なフラグメントを指す。

Ｔ−カドへリンの状態を述べるために用いるときの「実質的に精製された」とは 、実質的に他のタンパク質を含まないタンパク質、およびその天然の環境でＴ− カドヘリンと通常に関連するあるいはともに生成する分子を意味する。

本明細書で用いる「コードする核酸」とは、アミノ酸が特定するタンパク質中の 対応するアミノ酸の順序を与える、遺伝子の一部ヌクレオチド配列を指す。カド ヘリン核酸配列の例は図２３および図２ｂに示される。

本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸（ＤＮＡ。

ＲＮＡ、またはｃＤＮＡ）を提供する。核酸は天然の宿主中で発現され得るか、 あるいは発現され得ない。これらの核酸を含むベクターもまた提供される。多数 のクローニングベクターが当業者に周知であり、適切なりローニングベクターの 選別が選択問題となる。［形質転換した宿主細胞］は、組換えＤＮＡ技術を用い て構築され細胞に導入されたベクターを有する細胞を指す。宿主細胞はこのよう なベクターで形質転換されおよび組換えポリペプチドを発現するために使用され 得る。適切なベクターが使用される限り、宿主細胞は哺乳動物、酵母、昆虫また は細菌の細胞であり得る。組換え発現の方法は当該分野で周知であり、参考とし て本明細書に援用されるＭａｎｉａｔｉｓらのＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮ Ｇ：　Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ　（１９８２）を参照ノコと。

従って、組換えポリペプチドおよびそれらの生成方法も提供される。

本明細書で開示されるベクターおよび方法は、原核および真核生物の広い範囲を 包含する宿主細胞での使用に適している。「細胞」あるいは「宿主細胞」は特定 の被験細胞のみでなく、このような細胞の子孫を指すことが理解される。本発明 は、その中に含まれるＤＮＡ配列を発現可能なベクターを提供し、このＤＮＡ配 列はそれらの発現を生じさせ得る他の配列と作動可能に連結される。これらの発 現ベクターは宿主生物中でエビソームとして、あるいは染色体ＤＮＡの必須部分 として複製されなければならない。

さらに、当業者が現在用いる組換えＤＮＡ手法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ Ｒ）すなわちオリゴヌクレオチド合成を組み合わせたＤＮＡ配列を容易に複製さ せる反応を含む。ＤＮＡセグメントはＰＣＨによって、わずか１本の遺伝子コピ ーから始まり指数関数的に増幅し得る。この手法では、変性させたＤＮＡ試料を 、新しい相補鎖のＤＮＡポリメラーゼ依存性合成を指示する２つのオリゴヌクレ オチドブライマーとともにインキユベートする。

複数回の合成サイクルで、各サイクルはそれぞれ標的配列をおおよそ倍化させる 。２５回の増幅サイクルの後、標的配列の量は約１０６倍に増加する。ポリメラ ーゼ連鎖反応を用いる最初のｃＤＮＡ鎖の増幅を、Ｔ−カドヘリンの両方の形態 を検出するために用いた。ＰＣＲ技術は米国特許第４．６８３．１９５号、　４ ，８００，１５９号、　４，７５４，０６５号および４．６８３．２０２号の主 題であり、これら全ては本明細書に参考として援用される。図２ａおよび図２ｂ に示されるｃＤＮＡあるいは配列のいかなる部分も、当該分野で周知のように、 ＰＣＲで所望の配列を増幅しおよび適当なベクターへクローニングすることによ って、目的のクローニングおよび発現のために複製され得る。

細胞中の核酸あるいはタンパク質の存在の検出方法は、細胞中の核酸と核酸プロ ーブとのハイブリダイゼーシヨン、およびポリクローナルあるいはモノクローナ ル抗体による細胞染色を含む。このような技術は当業者に周知の方法で達成され る。

■−カドヘリンに対するポリクローナル抗体は当該分野で周知の手順に従って調 製された。この抗体の特異性を、神経細胞および体部を含む種々の組織について 免疫組織化学および免疫プロッティングを行うことにより検査した。

あるいは、抗Ｔ−カドヘリン抗体は、合成ペプチドあるいは当該分野で周知のよ うに図２８および図２ｂに示される配列から調製される組換えタンパク質のフラ グメントを用いて動物を免疫することによって調製され得る。

モノクローナル抗体は、当該分野で周知のように、Ｔ−カドヘリンあるいは合成 ペプチド、あるいはその組換えタン／ｆり質フラグメントを含む物質で動物を免 疫し、その後抗体産生ハイブリドーマ細胞を単離することにより調製される。（ 例として、ＨａｒｌｏｔおよびＬａｎｅ、　ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：　Ａ　ＬＡ ＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、 　１９８８および本明細書で弓１用された参考文献を参照のこと。これらすべて は本明細書で参考として援用されている。）抗Ｔ−カドヘリン抗体を、Ｔ−カド ヘリンが局在する組織の部分について免疫蛍光分析を行って選５３１ｊする。抗 体による同定は免疫プロ・ツテイングおよび免疫沈降により確かめられ、上記の ように主として９０　ｋＤのポリペプチドを示す。適当なハイブリドーマは、精 製されたＴ−カドヘリンあるいはＴ−カドヘリンフラグメントと反応性力（ある 。Ｔ−カドヘリンフラグメントは、上記のように、原核あるｔｔ＋を真核の発現 ベクターにより図２３および図２ｂｌこ示すＴ−カドへ１ノンｃＤＮＡを発現す ることによって調製される。

被験体中のＴ−カドヘリンを検出する方法もまた提供される。

Ｔ−カドヘリンは、標識抗体のような免疫学的技術を用０ることによって細胞試 料中で検出される。標識の選択を含むこのような方法は当業者に周知である（Ｈ ａｒｌｏｔおよびＬａｎｅｂ上記）。簡単にいうと、被験体の組織試料をまず、 Ｔ−カドへ１ノンζこ特異的な抗体に曝す。抗体の結合の後、適切に標識され抗 Ｔ−カドヘリン抗体に特異的な第２の抗体を、前もってＴ−カドヘリン抗体とイ ンキユベートした試料喜こ曝す。次に、この第２抗体は可視化あるいは定量され 、Ｔ−カドへ１ノンの存在力（検出される。

Ｔ−カドヘリン遺伝子でトランスフェクトされたＣＨ〇−細胞を用いた凝集試験 の結果は、■−カドへ１ノンカイ細胞の接着１こ関連することを示す。結果は図 ９、図１０および図１１に示される。

細胞と細胞とが接触する領域でのＴ−カドヘリンの高い濃度は、この分子が密に 詰まった凝集箇所で細胞を互いに他に接着させることを示す。

腫瘍細胞はその接着性を失う傾向があり、このことにより細胞の移動性およびそ の結果として転移を生じることは周知である。直接的にあるいは遺伝子的治療に より、このような細胞中のＴ−カドヘリン濃度を増加させることによって、腫瘍 細胞の移動を防ぎ正常な接着を回復するように細胞を誘導し得る。

本発明はまた、発作あるいは外傷のために受けた損傷を含む、被験体の傷害され たニューロンを修復する方法も提供する。傷害された二ニーロンの領域へのＴ− カドヘリンの投与は、その軸策を再成長させ、およびその標的細胞を神経再支配 するように軸策を導くようにニューロンに作用する。

下記の実施例は例示するのみであって、本発明を限定することを意図するもので はない。それらは使用され得る代表的なものであり、代りに、当業者に周知の他 の手法も使用され得る。

実施例■ Ｔ−力ドヘ響ンの Ｔ−カドヘリンを、ヒナの交感神経および胚の脳の、デタージェント抵抗性膜骨 格構造中にコンカナＩｔリンＡ結合糖タン／ｆり質として同定した。膜骨格構造 を、１３〜１６日目のニワトリ胚の脳から緩衝液Ａ　（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／　 ＨＣＩ、　ｐＨ７，６，２ｍＭ　ＣａＣｌ２、５％　Ｎｏｎｆｄｅｎｔ　Ｐ２Ｏ ，２ｍＭジチオトレイトール、１　ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、５０ μＭロイペプチン（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）、５μＭペプスタチン（ｐｅｐｓｔａ ｔｉｎ＞、４　ｎｇ／ｍｌアプロチニン（ａｐｒｏｔｌｎｉｎ））中で非イオン 性のデタージェント抵抗性ポリペプチド複合体として単離した。Ｔ−カドヘリン の９０　ｋＤのフラグメントを、上記のように調製用ＳＤＳゲル電気泳動（Ｌａ ｅｍｍｌｉｓ　Ｎａｔｕｒｅ　２２７：６８０−６８５　（１９７０））によっ て複合体から分離した。Ｔ−カドヘリンは免疫グロブリンの超遺伝子ファミリー の１３０　ｋＤの細胞接着分子であるコンタクチン（ｃｏｎｔａｅｔｉｎ）の次 に、この複合体の主要なコンカナバリンＡ結合糖タンパク質である（　Ｒａｎ５ ｃｈｔら、Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｔ、　９９：１８０３−１８１１３　（１９ ８４））　ａ還元および非還元条件下での５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上のＴ−カドヘ リンの移動は密接に類似しており、これは鎖内のジスルフィド結合がほとんどか あるいは全く存在しないことを示している。Ｔ−カドヘリン、コンタクチン、ア クチンおよび約１５個の他のポリペプチドを含むタンパク質複合体を、分画遠心 法およびイオン交換クロマトグラフィーにより濃縮した。単離されたタンパク質 複合体は異なる塩条件で種々のデタージエントを用いる抽出に抵抗性があり；従 って、個々の成分は変性条件下でのみ複合体から解離し得る。Ｔ−カドヘリンは 、ＳＤＳ調製用ゲル電気泳動により精製し得、ｓｏ　ｇの出発材料から約５０μ ｇの収率を得る。

実施例■ ンパク　ミクロシーフェンシング 脳のポリペプチド複合体（ＢＰＣ）に含まれるタンパク質は、当業者に周知の方 法により調製用５ＤＳ−ＰＡＧＥで分離され、および電気泳動的に２フツ化ポリ ビニリデン膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、　Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、　ＭＡ）に転移 させた。９０　ｋＤのＴ−カドヘリンポリペプチドを、転移したタンパク質をク ーマシーブリリアントブルーＲ２５０で染色することにより同定し、切り出して 直接的に配列決定した。転移の条件およびプロセシングはＭａｔｓｕｄａｉｒａ ｂ　Ｐ、、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｔ　２６２：１００３５−１００３８　（ １９８７）に記載の通りであった。

実施例■ Ｔ−カドへ１ン　゛の　およびアフ　ニテ　−デタージェント抵抗性のポリペプ チド複合体を、調製用５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動によりその個々の成分に分 離した。９０　ｋＤのＴ−カドヘリンフラグメントをクーマシーブルー染色した いくつかのゲルから切り出し、電気溶出してエキソセルロース（ｅｘｏｃｅｌｌ ｕｌｏｓｅ）ＧＦ５（Ｐｉｅｒｃｅ、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、　ＩＬ）で脱塩した 。ニューシーラント白色ウサギを、７０インド完全アジ１バント（１：１）中１ ００μｇの９０　ｋＤ　Ｔ−カドヘリンポリペプチドの筋肉内および皮下注射に より免疫した。このウサギを、フロイント不完全アジュバント中同量のタンパク 質で、４週間の間隔をあけて３回追加免疫した。最後の追加免疫は、リン酸緩衝 生理食塩水（ＰＢＳ）中５０−１００μｇのタンパク質を静脈注射することによ り行った。血液を注射より７−１０日後に採取した。抗血清をウシ肝アセトン粉 末上で吸収させた。

いくつかの実験で、アフィニティー精製した抗血清を用いた。アフィニティー精 製は、ポリビニリデン膜（Ｍｉ　１１１ｐｏｒｅ）上への電気泳動的転移により 固定化したＴ−カドヘリンで行った。

このポリペプチド複合体を５ＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ポリビニリデン膜に転移 させた（Ｔｏｖｂｉｎら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ　ＵＳ Ａ　７６：３Ｓ６−３７５　（１９７９））。転移したタンパク質を、メタノー ル：酢酸：水（２０：１０ニア０）中１％アミドブラックを用いた染色により検 出した。９０　ｋＤのＴ−カドへリンペプチドのバンドを膜から切り出し、ＴＢ ＳＴ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣＩ　ｐＨ８，０，１５０＋ｍＭ　ＮａＣ１およ び０゜０５％トゥイーン２０）中４％非脂肪粉乳で３０−６０分間ブロックした 。

Ｔ−カドヘリンの細片を抗Ｔ−カドヘリン抗血清（ＴＢＳＴ中１：５０）ととも に室温で２時間インキュベートした。ＴＢＳＴ中での洗浄に続いて、結合した抗 Ｔ−カドヘリン抗血清を細片から６００μｌの０．１Ｍグリシン、ｐＨ２，５で ５分間溶出し、直ちに中性化した。

この方法を５回繰り返して、十分な量の精製抗体を得た。

神経組織のホモジネートの免疫プロットで、この抗血清は９０　ｋＤの主要なタ ンパク質成分を認識した。さらに、１１ｏおよび１２０　ｋＤのタンパク質の種 もこの抗血清で検出した（図４）。

１１０　ｋＤのポリペプチドは恐らくプレペプチドを有するＴ−カドヘリンに相 当し、それは、Ｔ−カドヘリンｅＤＮＡでＣＯ３−細胞をトランスフェクトした 後で９０および１１０　ｋＤの両方の種が得られるからである。１２０　ｋＤの タンパク質は　３Ｈ−エタノールアミンで標識した後Ｔ−カドヘリン抗血清で免 疫沈降し、これはこのタンパク質もまた膜にＧＰＩ−結合していることを示す。

従って、１２０　ｋＤのポリペプチドは恐らく、神経系に特異的な形態のＴ−カ ドヘリンである。神経組織と対照的にＴ−カドヘリン抗血清は、非神経系組織の 試料中では９ｏおよび１１０　ｋＤのタンパク質種のみを認識する。９０　ｋＤ のタンパク質の１７個のＮＨ２末端アミノ酸のミクロシーフェンシング、および ｃＤＮＡ配列から概念的に翻訳したこのタンパク質の配列のマツピングは、９０ 　ｋＤのタンパク質がアミノ酸残基１１７位（図２ａおよび図２ｂ）で始まり、 シグナルおよびプレペプチドを除外するＴ−カドヘリンのフラグメントであるこ とを示す。

実施例■ 脳、網膜、筋肉、肝臓、心臓および腎臓を含む種々の組織を緩衝液Ａ（実施例■ を参照）中でホモジネートし、５ＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。分離したタンパク 質を電気泳動的に２７フ化ポリビニリデン膜に転移した。マーカーレーンをメタ ノール：酢酸：　ｌＴ２Ｏ（２０：１０ニア０）中０．１％アミドブラックで別 々に染色し、色素の入っていない同じ溶液中で脱色した。免疫プロッティングの ために、非特異的結合部位を上記のようにブロックし、プロットを抗Ｔ−カドヘ リン抗血清（非精製および精製抗血清の両方に対して１：１５０）で６０分間イ ンキュベートした。ＴＢＳＴ中での洗浄に続いて、結合した抗体を、１μＣｉ／ ｍｌの１２５１のヤギ抗ウサギ免疫グロブリン（ＩＣＮ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｌｓ　Ｉｎｃ、、Ｃｏ５ｔａ　Ｍｅｓａ、　ＣＡ）で検出し、その後、Ｃｒｏｎ ｅｘ　Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ　Ｐｌｕｓスクリーンを用いるオートラジオグラフィ ーを行った。いくつかの実験では、プロットを、アルカリホスファターゼ複合体 化ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル リン酸（ＢＣＩＰ）およびニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）を酵素基質（ Ｐｒｏｔｏｂｌｏｔ％Ｐｒｏｇｅ＋ｓａ％Ｍａｄｉｓｏｎ、　Ｗｌ）として、あ るいはＥＣＬウェスタンブロッティング検出システム（Ａ＋ｍｅｒｓｈａｍ　Ｃ ｏｒｐｏｒａｔＩｏｎｓ　ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ、　ＩＬ）を使 用して、反応させた。

（以下余白） 実施例Ｖ ニューロンのホスホ１パーゼ 交感神経節を、Ｌ１５培地中の１０日口のニワトリ胚から切り出した。神経節を ＰＢＳ中０．２５％トリプシンで３０分間消化後分離し、ラミニン（１Ｈｗ＋１ ｎｉｎ）でコートした培養ディツシュ（５Ｈｇ／■ｌ。

Ｔｅ１ｉｏｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｌａ　Ｊｏｌ ｌａ、ＣＡ）中のＬ１５培地に１．４〜１．８Ｘ１０’細胞７６０璽冒培養デイ ツシユの密度でプレートした。培養培地を、透析した１０％ウシ胎児血清、０． ５％メチルセルロース、２ｍＭグルタミン、０．６ｇ／ｌグルコース、神経成長 因子および、抗生物質で補足した。神経線維の伸長成長を４８時間の培養期間後 に観察した。

ホスホリパーゼ消化のために、４８時間培養物を広範囲にわたってＰＢＳで洗浄 した。培養物をＰＬＣ−緩衝液中（１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、５ ０μＭロイペプチン、５μＭペプスタチン、４Ｈｇ／■ｌアプロチニン、および ５μｇ／ｍｌα２−マクログロブリンを含有するＰＢＳ）ホスホイノシトールに 特異的な５０７１１ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ，Ｄｒ、　Ｍ、　Ｌｏｗ、 　Ｃｏ１ｕ＋５ｂｉａ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋからの寄贈 ）とともに、３７℃で６０分間インキコベートした。放出された物質を集め、遠 心分離によって細胞残査を取り除き、および限外濾過によって１０倍に濃縮した 。

神経細胞のラミニン基質をはがし、ＰＬＣ−緩衝液で洗浄して、２００μｌＨ− 緩衝液（１０＋ｔＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣＩ、　ｐｔｌ　７．．５．２ＨＭ　ＣａＣ ｌ２．２駕Ｎｏｎ１ｄｅｎｔ−Ｐ２Ｏ，０，２５ｖ＋Ｍジチオトレイトール、お よび上記のようにプロテアーゼ阻害剤としてフッ化フェニルメチルスルホニル、 ロイペプチン、ペプスタチン、アプロチニン）中でホモジネートした。デタージ ェントー可溶性および不溶性の物質を、１００，０００ｇ、　４℃で、４５分間 遠心分離することによって分離した。対照試料はＰＬＣ−緩衝液だけを標準とし ；２つの実験ではホスホイノシトール特異性ホスホリパーゼによる消化の間、５ ｍＭ　ＺｎＣｌ２を含めて行った。

ＰＩ−ＰＬＣで処理した培養物の放出された成分および細胞性成分は５ＯＳ−Ｐ ＡＧＥで分離し、ウェスタンプロットにより分析した。

対照試料（無添加）において、Ｔ−力ドヘワンは細胞のデタージェント可溶性、 および不溶性分画中に確認された。Ｔ−カドヘリンは、６０分の培養期間後の上 清には検出されなかった。

対照的に、細胞をＰＩ−ＰＬＣで処理した場合、実質的にすべてのＴ−カドヘリ ンが６０分後後上清中放出された。この放出を細胞のＺｎＣｌ２、すなわちＰＩ −ＰＬＣ阻害剤による処理によって阻害した。

Ｔ−カドヘリンは長期の培養期間（２１８時間）にわたって培養培地中に分泌さ れる。培養培地中でＴ−カドヘリンは高度に可溶性な形態だけでなく、培養上清 が１００．０００ｇで３時間の遠心分離によってベレット化される細胞外マトリ ックス成分の不溶性複合体とも関連して生じる。

実施例■ ３Ｈ−エ　ノールアミンでの　およびフルオログラフィー交感神経ニューロンの 培養物を４８時間増殖させ、次に補足したＬ１５培地中で１８時間、３Ｈ−エタ ノールアミン（１００μＣｉ／＋＋１；比活性１９−２４Ｃｉ／ｍｍｏｌ　（Ａ ｍｅｒｓｈａｍ、　ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）　）で標識し た。標識培養物を下記のようにホスファチジルイノシトール特異性ホスホリパー ゼＣで処理し、あるいは分析のために直ちに処理した。細胞をＨ−緩衝液（１０ 鵬Ｍ　Ｔｒｉｓ／ＨＣＬ、　ｐＨ７，５，２ｍＭ　ＣａＣｌ２．２％Ｎｏｎ１ｄ ｅｎｔ−Ｐ２Ｏ，０，２５ｍＭジチオトレイトール、およびプロテアーゼ阻害剤 ：　１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、５０■Ｍロイペプチン、５μＭペ プスタチン、　４Ｈｇ／ｍｌアプロチニン）中で溶解し、タンパク質を５ＤＳ− ＰＡＧＥで分離した。ゲルをクーマシーブリリアントブルーＲ２５０で染色し、 水中で脱色させ平衡化した。フルオログラフィー処理のため、ゲルをジメチルス ルホキシド（ＤＭＳＯ）中で３０分間平衡化し、次に２．５−ジフェニルオキサ ゾール（ＰＰ０）を２０％含有するＤＭＳＯで６０分間処理した。ゲルを広範囲 に水で洗浄後、乾燥し、前感光されたＫｏｄａｋ　ＸＡＲ−５フイルムに４−１ ２週間露光した。

実施例■ 免交沈！ Ｔ−カドヘリンを、３■−エタノールアミン標識した交感神経ニューロンの培養 物から免疫沈降した。標識化期間の後、実施例■のように培養物を完全に洗浄し 、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣＩ、ｐＨ７゜０．１５０ｍＭ　ＮａＣ１，１％デオ キシコール酸、１％　Ｎｏｎ１ｄｅｎｔ−Ｐ２Ｏ，０，２％ドデシル硫酸ナトリ ウム、１■Ｍフッ化フェニルメチルスルホニル、５０μＭロイペプチン、５μＭ ペプスタチン、４μｇ／ｍｌアプロチニン、および１簡Ｍジチオトレイトールを 含有する、１５０ｍＭ　ＮａＣ１で溶解した。溶解産物を、１６，０００ｇ、　 ４℃で３０分間溶性のタンパク質プールから抗Ｔ−カドヘリン抗血清（１：５０ ）を使って４℃で６０分間複合体化した。抗原／抗体複合体を、固定した黄色ブ ドウ球菌（Ｐａｎｓｏｒｂｉｎ、　Ｃａ１ｂｉｏｃｈｅ＋＊、　Ｌａ　Ｊｏｌｌ ａ。

ＣＡ）で沈降させた。沈降物を、５％、１０％、および２０％ショ糖層を通して ３０００ｇで２０分間遠心分離することによって洗浄した。

沈降物を５ＯＳ−ＰＡＧＥ負荷緩衝液（Ｍａｎｉａｔｉｓら、上記）に再懸濁し 、上記のように５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、その後フルオログラフィーを行った 。

実施例■ 免良風凰化ヱ Ｔ−カドヘリンの局在を、間接的な免疫蛍光性技術を用いて検査した。２〜８日 間の胚発生期のニワトリ胚を、ＨａｍｂｕｒｇｅｒおよびＨａｍｉｌｔｏｎ　（ Ｊ、　Ｍｏｒｐｈ、　８８：４９−１９２（１９５１））　（Ｈ＆Ｈ）の分類基 準を用いて段階づけた。動物を、その大きさに依存してＰＬＰＡ固定液（１００ ｍＭ　Ｎｇ−過ヨウ素酸塩、７５ｍＭリシン、３％パラホルムアルデヒドを含有 するＰＢＳ）　、あるいは４％パラホルムアルデヒドだけに１−３時間液浸する ことによって固定した。組織は５％および１０％ショ糖を含有するＰＢＳ中に８ −１２時間連続液浸することによって凍結保存し、Ｔｉ５ｓｕｅ−Ｔｅｋ　（Ｍ ｉｌｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｈｋｈａｒｔ、ＩＮ）に包埋し、−７０ ℃で凍結した。厚さ１５μｍの連続切片を、低温保持装置上で切断し、ゼラチン ／クロマラム（ｃｈｒｏｍａｌｕｗ）　（１％ゼラチン１０．４％クロマラム） でコートしたスライドガラス上で収集した。切片を、室温で３−４時間、ウサギ 抗Ｔ−カドヘリン（１：１００）で染色した。結合抗体を、ＦＩＴＣあるいはＴ ＲＩＴＣ複合体化ヤギ抗ウサギＩつＧ　（１：１５０．　ＣａｐｐｅｌＬａｂｏ ｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、　、Ｗｅｓｔｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）で検出した。

抗体の希釈はＧＳＴ−ＰＢＳ　（１０％正常ヤギ血清および０．０２％Ｔｒｉｔ ｏｎ−ｘ１００を含有するＰＢＳ）中で行い、各々のインキュベーション工程後 ＰＢＳのみで洗浄した。染色した切片は急速な漂白を予防するために２％１．４ −ジアゾアビシクロ−（２，２，２）−オクタン（Ａｌｄｒｉｃｈ、　Ｍｉｌｗ ａｕｋｅｅ、　Ｗｌ）を含有するイムノマウント（ｌＨｕｎｏｍ。

ｕｎｔ）で封入した。

２０期（図８ｂ、　パネル１）　（ＩＩ＆Ｈ）の発生段階にあるを髄では、運動 性ニューロンは、分化および軸索伸長において初期の段階にある。背側および背 向側部位から底板部位に投射する文運性軸索は、中間標的として機能する底板に 対して突起の伸長を開始させる。発生のこの段階において、Ｔ−カドヘリンは運 動性ニューロンの神経細胞体および神経線維、および底板を含有する腹側感覚上 皮細胞上で発現するのが見出された。

他のニューロンあるいはその前駆体は、この初期の段階では染色されなかった。

２４期（図８ｂ、　パネル２）では、大部分の文運性軸索は、を髄の腹側の中央 線を交差し底板の腹側隆線を貫いて投射している。この段階において、Ｔ−カド ヘリンの染色強度は、底板部位中で著しく増加する。比較的弱い染色は、神経管 の他の領域で検出された。Ｔ−カドヘリン発現のパターンは、以前の段階の底板 上皮細胞、およびこの領域で交差する文運性軸索の部分を含む。このパターンは 、文運性軸索がこの部分だけ底板と接触して抗Ｔ−カドヘリンにより染色される ことを示唆する。より年長の動物では、底板領域で染色がほとんどないがあるい は全く検出されないので、底板領域での発現は一過性のものであった。

運動性ニューロンは、体部性硬節の腹側領域を中間標的として選択しく　Ｋｅｙ ｎｅｓおよび５ｔｅｒｎ、　Ｎａｔｕｒｅ　３１０ニア８６−７８９　（１９８ ４））、こうして神経投射の分節パターンが確立される。２２−２３期ニワトリ 胚の冠状切片において、Ｔ−カドヘリンは後部体部細胞の表面上に著しい分節パ ターンで発現した（図８ａパネル１）。前部体部領域と交差するを髄神経束は、 抗コンタクチン、抗体によって隣接する切片中で同定された（図８３パネル２） 。

Ｔ−カドヘリン発現の分節パターンは、神経提細胞が体部領域に入り込むのと同 じくらい早くに観察された。

実施例■ Ｔ−カドヘリンをコード　るｃＤＮＡクローンの石１３１３日胚ワトリ脳から生 成したｃＤＮＡライブラリー（Ｒａｎｓｃｈｔ、Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、１０ ７：１５６１−１５７３（１９８８））を、■−カドヘリンをコードするｃＤＮ Ａクローンについてスクリーニングした。

１３日胚のニワトリ脳からのλｇｔｌ１発現ライブラリーのニトロセルロースレ プリカフィルターを、アフィニティ精製した抗Ｔ−カドヘリン抗血清（１：４０ ）でスクリーニングした。スクリーニングは、本質的にＭａｎｉａｔｉｓによっ て記され、本明細書に参考として援用されている。アルカリホスファターゼ複合 体化ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホ スフェート（ＢＣＩＰ）　、およびニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）基質 （Ｐｒｏｔｏｂｏｌｏｔ、　Ｐｒｏｇｅｍａ）を検出システムとして使用した。

最初のスクリーニングでは、１つのクローンを７Ｘ１０５個の増幅物、および８ Ｘ１Ｇ’個の非増幅組換え体から分離した。このクローンは、二つの分類基準に よって真正のＴ−カドヘリン転写物であることを示した。

１　）　ｃＤＮＡは、抗Ｔ−カドヘリン抗血清によって認識される融合タンパク 質をコードしていた。組換え融合タンパク質による抗血清のアフィニティ精製に より、脳ホモジネート中の９０ｋＤのタンパク質に対する特異的抗体がウェスタ ンプロ・ノドで選択された。さらにアフイニテイ精製した抗血清は、２２−２３ 期のニワトリ胚の後部体部区域の切片を間接的免疫蛍光法により染色した。

２）選択されたｅＤＮＡがＴ−カドヘリン転写を表すという決定的証拠は、９０ ｋＤタンパク質のＮＨ２末端のミクロシーフェンシングによって得られたアミノ 酸配列と、概念的に翻訳されたｃＤＮＡ配列との比較により得られた。９０ｋＤ ポリペプチドの１７個のＮＨ２末端アミノ酸は、概念的にｃＤＮＡ配列から翻訳 されたタンｉ＜り質のオーブンリーディングフレーム中の、アミノ酸１１７位〜 １３３位までに認められた（図２ａおよび２ｂを参照のこと）。

実施例Ｘ のＴ−カドヘリンｃＤＮＡクローンの Ｔ−カドヘリンに対するさらに１６個のｃＤＮＡクローンは、ヒナ脳のλｇｔｌ ｏ　（増幅された）およびλｇｔｔｔ　（増幅されな（１）の両方のライブラリ ーを、ニックトランスレージ冒ン標識したＴ−ｃａｄ　２制限フラグメントでス クリーニングすることによって単離した（Ｍａｎｉａｔｉｓら〜上記キットはＢ ｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製、Ｇａｉｔｈ ｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ）。これらの制限フラグメントは、初めに単離したクロ ーンのヌクレオチド４４０位−１５５９位を構成し、９０ｋＤタンパク賃のＮＨ ２末端をコードしているコーディング配列を含有していた。ファージプラークを ハイボンドナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ、　ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　Ｈｅｉｇｈ ｔｓ、　ＩＬ）に二重に移した。フィルターを１．５Ｍ　ＮａＣ１１０，５Ｍ　 ＮａＯＨで２分間、３Ｍ　Ｌａ−アセテートｐＨ５，２、および２０　ｘ　５Ｓ ＰＥ　（３Ｍ　ＮａＣ１，０，２Ｍ　ＮａＨ２ＰＯａＸＨ２０，０，０２Ｍ　Ｎ ａ２　ＥＤＴＡ、ｐＨ７，４）に５分間連続的に通して処理し、乾燥し、６０分 間真空オーブンで焼いた。プレハイブリダイゼーシ胃ンを、５０％脱イオン化ボ ルムアミド、５ｘＳＳＰＥ、　１　ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔｓおよび１００μｇ／ ｍｌサケ精子ＤＮＡ中で４２℃で、２−４時間行った。ハイブリダイゼーション を、２Ｘ　１０６ｃｐａ＋／フイルターでプローブと同一条件下で一晩行った。

フィルターを高緊縮条件下テ洗浄しく０．２　ｘ　５ＳＰＥ１０．２％ＳＤＳ、 　６８℃）　、Ｋｏｄａｋ　ＸＡＲ−５フイルムに一晩露光した。

すべてのクローンは、内部ヌクレオチド配列内の制限部位を共有したが、長さは １〜３．８ｋｂまで多様であった。すべてのクローンのＥｃｏＲＩ制限フラグメ ントを、ブルースクリプトＫＳ＋ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｌａ　Ｊ ｏｌｌａ、ＣＡ）中にサブクローン化し、二本鎖ＤＮＡを鋳型として用いてヌク レオチド配列決定のために使用した。内部ＥｃｏＲ１部位にわたる配列は、ラム ダｃＤＮＡ鋳型から得た。最長の（３，８ｋｂ）　ｃＤＮＡクローンの一つであ るクローン２６６　（＝Ｔ−ｃａｄ　１）のヌクレオチド配列、およびｃＤＮＡ １２１２（＝Ｔ−ｃａｄ　２）を図２８および２ｂに示した。

いくつかのｃＤＮＡクローンを、ヒト胎芽脳のλｇｔｌｌライブラリー（Ｃ１ｏ ｎｔｅｅｈ）から単離した。１つのクローンは、図２のアミノ酸２３位から開始 するヒトＴ−カドヘリンのコーディング配列（アミノ最末端を欠く）を含有する 。ヒナＴ−カドヘリンとヒトＴ−カドヘリンの相同性は、おおよそ８０％である 。

実施例ＸＩ 組錘ユ皿 全ての細胞性ＲＮＡを、岬化したヒナからグラニジラムイソチオシアネート法（ Ｍａｎｉａｔｉｓら、上記）によって単離した。簡単にいうと、組織のダラム当 り４〜６ｍｌの４Ｍグアニジウムチオシアネー１−　（ＧＴＣ）緩衝液（９４， ４ｇ　ＧＴＣ，３Ｍ酢酸ナトリウム１゜６７１、ｐｎａ、ｏ、０．５％サルコシ ル、２００μｌアンチフオームＡ。

５００μｍ　１　Ｎａ０Ｂ、　ＤＥＰＣ処理した蒸留水で２００ｍ１までとし、 最終濃度０．１Ｍの２−メルカプトエタノールを使用する直前に添加する）中で 、氷上でホモジネートした。ホモジネートをＳＷ　４０遠心管（Ｂｅｃｋｍａｎ 、　Ｃａｒｌｓｂａｄ、　ＣＡ）中の、５．７Ｍ　ＣｓＣ１溶液４〜５ｍｌ上に 積層した。ＣｓＣ１溶液は次の方法で調製した：　９５．９７ｇ　ＣｓＣ１、３ Ｍ酢酸ナトリウム０．８３＋＊ｌ　ｐＨ６，０、ＤＥＰＣ−蒸留水で１００ｍ１ にし濾過滅菌する。遠心管をＧＴＣ緩衝液で平衡化し、および試料を超遠心分離 機（５ｏｒｖａｌｌ、　Ｎｅｖｔｏｖｎ、　ＣＴ）を用い新液およびＣｓＣ１溶 液を吸い出し、ＲＮＡベレットをおおっているＣｓＣ１溶液を約１ｍｌ残した。

遠心管の内壁を１〜２ｍｌのＧＴＣ緩衝液ですすいでＣｓＣ１層を含む緩衝液を 慎重に取り除いた。遠心管を熱した剃刀で底から１−２ｃｓを切り、ＲＮＡのベ レットを一２０℃のエタノール４００μｌですすぎ、乾燥し、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴ Ａ　（ＴＥ；　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　１０諺Ｍ、、ｐＨ７，６、ＥＤＴＡ　１＋ｅ Ｍ）に再懸濁した。再懸濁したＲＮＡを、等量のフェノール／クロロホルムで２ 回抽出することによって精製し、次にエタノール沈澱させ上記のように洗浄した 。ＲＮＡを、２６０ｒｖ　（１のＯＤ２６ｇ　＝　５０ｍ１／ｍｌ）での吸光度 によって定量した。純度は２６０ｒｖと２８０ｒｖの吸光度を比較し、吸光度比 を決定することで検査した（ＲＮＡに対してＯＤ　２６０／２８０≧２．０）。

ＲＮＡ試料を、次の使用までエタノール沈澱物として一７０℃で保存した。発生 初期のニワトリ胚の組織からＲＮＡをＭａｎｉａｔｉｓｓ上記に記されているよ うにリチウム沈澱によって調製した。Ｔ−カドヘリンｃＤＮＡでプローブしたと ころ、おおよそ９．５と７．５ｋｂの２つの転写物を検出した。

実施例Ｘ■ 旺Ｕ丑Ｉ ■−カドヘリンプレペプチドおよび３°非翻訳領域をコードするＲＮＡ転写物を 、■−カドヘリンｃＤＮＡのインビトロでの転写によって生成した。プレペプチ ドのプローブのための鋳型（Ｔ−ｃａｄｌ、Ｔ−ｃａｄ　２共通）は、ブルース クリプト　ＫＳ”中にクローン化したλｇｔｌｌ　Ｔ−ｃａｄ　２からの２７４ ｂｐのＥｃｏＲＩ制限フラグメントであった（図２ｂ）。フラグメントをポリリ ンカー領域中でＨｉｎｄｌｌｌを使った消化によって線状化した。Ｔ−ｃａｄ　 １の特異的３°末端プローブは、Ｔ−ｃａｄ　１クローンの３°最末端から１． ５ｋｂの非翻訳配列を５ｔｕｌ／Ｓ■ａ！で制限消化することによって取り除き 、および平−滑末端を最連結することにより生成した。１６８ｂｐの鋳型は、５ ｆａｌでＴ−ｃａｄ　Ｉ　ＤＮＡを線状化することによって得た。Ｔ−ｃａｄ　 ２に対する特異的３゛末端鋳型は、ブルースクリプト　ＫＳ１中にその２．１ｋ ｂ　ＥｃｏＲＩ制限フラグメントをクローニングすること、およびＨｐａｌによ るｃＤＮＡフラグメントの消化によって生成した。ニワトリβ−アクチンｃＤＮ Ａ　（Ｄｒ、Ｄ、Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、　Ｊｏｈｎｓ　Ｈｏｐｋｉｎｓ　Ｕｎｉ ｖｅｒｓｉｔｙ、　Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、　ＭＤの厚意によって提供された）を 対照として使用した。β−アクチンｃＤＮＡをＫｐｎｌおよびＨｉｎｄｌｌｌで 消化し、ＳＰＹ　２転写ベクター（Ｍｅｌｔｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ ｓ　Ｒｅｓ、１３ニア０３５−７０５６　（１９８４））中にクローン化した。

ＤＮＡをＰｖｕｌｌでの消化により線状化した。鋳型をＴ７　ＲＮＡポリメラー ゼおよび３２Ｐ−ｒＵＴｐ存在中で、Ｍｅｌｔｏｎｘ上記によって記述された条 件下に、アンチセンス配向で翻訳した。プローブをポリアクリルアミドゲル上で 精製した。全体のプローブの１％アリコー１４、ｌｉ々の組織からの全てのＲＮ Ａ　２−１０Ｍｇに、８０％ホルムアミド、４００５Ｍ　ＮａＣ１，４ｍＭ　Ｐ ＩＰＢＳおよび１ｍＭ　ＥＤＴＡ中で４５℃で一晩ハイブリダイズした。ハイブ リダイズしないＲＮＡを、室温でＲＮａｓｅ　ＡおよびＴ１で６０分間消化した 。ＲＮＡのハイブリッドを、ポリアクリルアミドゲル上で分離し、Ｋｏｄａｋ　 ＸＡＲ−５フイルムに露光後分析した。

プレペプチドプローブで防御されたフラグメントを示す全組織は、さらに３°フ ラグメントで防御されたフラグメントをも示し、このことは、Ｔ−カドヘリンの ホスホイノシトール結合形態をコードするｍＲＮＡがこの組織中に存在すること を示す。

脳、心臓、網膜、培養された交感神経ニューロン、３７と２４期のを髄（特に底 板）および体筒は、防御されたフラグメントを示した。

本発明は、現実好ましい実施態様を参照して記述しているが、本発明の精神から 逸脱することなしに様々な改変がなされ得ることを理解すべきである。従って、 本発明は下記の請求項によってのみ、限定される。

実施例ｘｍ ベク　−およびＣｌ０−　のトランスフェクション全長のＴ−カドへリンプラス ミドＤＮＡを生成するために、実施例■によって同定したＴ−カドヘリンｃＤＮ Ａ−２６６をＥｃｏＲＩでの部分的消化（ｏ、　ｏ６２５Ｕ／μｇ　ＤＮＡを３ ０分間）によってλｇｔｌｌから遊離させ、製造者の指示に従ってブルースクリ プトｌ［ｓ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｏ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）中にサブ クローン化した。真核生物での発現のために、Ｔ−カドヘリンのコーディング領 域を含有するプラスミドｐｃＤ−Ｔｃａｄを生成した。Ｔ−カドヘリンのＤＮＡ フラグメントをＮｏｔｌおよびＳｔｕ目こよる消化でブルースクリプトから切り 出し、真核生物の発現ベクターｐｃＤＮＡ１　（ｒｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）のＥａｇｌ／ＥｃｏＲ’ｌｌポリリンカ一部位に連結した 。

Ｃｌ０−ＤＧ４４細胞を、ｐｃＤ−Ｔｃａｄおよび周知のネオマイシン抵抗性を 有するプラスミドｐｓＶ２ｎｅｏ　（Ａｓｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｔｉ５ｓｕ ｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）でリン酸カルシウム共沈によって トランスフ４クトした。細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、　Ｔｉ５ｓｕｅ　 Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、　Ｔｕｌａｒｅ、　ＣＡ）　、さら にｌｘ　ＨＴ補足物（Ｓｉｔ＋＋＋ａ）、２ｉ＋Ｍ　Ｌ−グルタミン、１ｍＭピ ルビン酸ナトリウム、および非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）を含有するａｌｐｈ ａ−ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ　ＭＥＭ　（Ｇｉｂｃｏ、　Ｇａｌｔｈｅｒｓｂｕｒ ｇ、　ＭＤまたはＳｉｇ＋＊ａ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｔｓ、　ＭＯ）中で増殖し、 ４．５ｘ　１０５７６ｃｍディツシュ密度でプレートした。培養１６時間後、５ μｇのリン酸カルシウムで沈降したｐｃＤ−ＴｃａｄまたはｐｃＤＮＡ１ベクタ ープラス１μｇのｐｓＶ２ｎｅｏプラスミドを新鮮な培養培地に添加した。さら に２４時間培養後、細胞を１０ｅ＋＊デイツシユに１：３に分割し、Ｇ４１８　 （ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ、　Ｇｉｂｃｏ）を１６７＋ｓｌの最終濃度で添加した。

１２−１５日後、０４１８−耐性コロニーをクローニングチャンバーを用いて単 離し、抗Ｔ−カドヘリン抗血清を使って間接免疫蛍光法によりＴ−カドヘリンの 細胞表面発現を検査した。いくつかのコロニーを分離し、うち１つをＴ−カドヘ リンを最高レベルで発現している細胞について蛍光活性化細胞選別により濃縮し た。これらの細胞をすべての凝集実験に使用した。対照として、ＣＨＯ−細胞を ｐｃＤＮＡｌおよびｐｓＶ２ｎｅｏベクターの双方でトランスフェクトし、Ｇ４ １Ｂ耐性コロニーからの細胞をゲノムＤＮＡ中のｐｃＤＮＡｌの組込みについて サザンプロット分析により検査した。１つのｐｃＤＮ＾ｌ陽性コロニーを対照と して選抜した。対照のＣｌ０−細胞は、間接免疫蛍光法およびウェスタンプロッ ト分析によるとＴ−カドヘリンを発現しない。

実施例ＸＩＶ 籠１ｌ−Ｌ１工 凝集アッセイのために、トランスフェクトされたＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を、１ｍ Ｍ　ＣａＣｌ２を含有するハンクス液（ＨＢＳＳ；　Ｇｉｂｃｏ）　５ｍｌで２ 回洗浄し、０．０１４％トリプシンおよび０．９ｍＭ　ＣａＣｌ２を含有するＨ ＥＰＥＳで緩衝したＨＢＳＳ　（ＨＨＢＳＳ）　２５５Ｍ中に、３７℃で２０分 間インキュベートすることによって懸濁した。反応をＨＨＢＳＳ中に等量の０． ０２％大豆トリプシンインヒビターを添加することによって停止し、細胞を洗浄 し、１■ｇ／■ｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＨＨＢＳＳ中に４℃ で再懸濁した。再懸濁した細胞を、バックグラウンドの凝集を増加させ得るあら ゆる残査ＤＮＡを除去するために、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２および５０１ｔ　ｇ／ｍ ｌのＤＮａｓｅ　Ｉとともに３７℃で３０分間インキュベートした。ＢＳＡを加 えたＨＨＢＳＳ中の細胞（ＩＸＩＯ５）を、０．５■ｌ容量のＬｉｎｂｒｏ非コ ート２４ウェルディツシュ中で３７”Ｃでインキュベートし、９０ｒｐｍで３０ 分間回転振盪した。凝集は１１Ｍ　ＣａＣｌ２の添加によって開始し、ＩＩＨＢ ＳＳ中に５％グルタルアルデヒド（最終濃度２．５％）を５（１０８ｍ添加する ことによって停止した。凝集物を穏やかに混合し、粒子数を１００μ開口のコル ターモデルＺ、で測定した。凝集パーセントラ、Ｎｔが時間＝３０分間での粒子 数、Ｎ９が開始粒子数を表す、式Ｎθ−Ｎｔ／Ｎｉ！Ｘ　１００％によって決定 した。細胞を２４ウエルデイツシニに分別する前に、細胞生存をトリパンブルー 排除によって測定した。

細胞は凝集前にホスファチジルイノシトール−特異性ホスホリパーゼＣ（ＰＩ− ＰＬＣ）で処理し、ＰＩ−ＰＬＣの４０ｔｔ１をＤＮａｓｅ　Ｉと３θ分間イン キュベートする前に添加した。細胞骨格崩壊剤が使用されるそれらの実験のため に、サイトカラシンＤ　（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅ＋ｅ）　、ノコダゾール（Ｃａｌ ｂｉｏｃｈｅｍ）　、あるいはＤＭＳＯ（Ｓ１ｇ＋ｓａ）のいずれかをＤＮａｓ ｅ　Ｅとともに添加して、細胞を３７℃で３０分間インキュベートした。次に凝 集アッセイを、記述したように行った。

混合実験のために、細胞を１０ｐＭカルボキシフルオレセインジアセテートスク シニミルエステル（ＣＦＳＥ；　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ、　Ｉｎｃ 、、　Ｊｕｎｃｔｉｏｎ　Ｃ１ｔｙ、　ＯＲ）とともに３７℃で３０分間インキ ュベートすることによって標識した。この標識化は、通常培地中の単層の細胞に トリプシン処理より前か、あるいは後に行った。細胞を上記のようにトリプシン 処理し、総量５００μｌのＨＨＢＳＳ、１ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ、　１＋＊Ｍ　Ｃ ａＣｌ２中で細胞型ごとに１−２Ｘ１０５細胞でインキュベートした。生存細胞 の写真を、Ｚｅｉｓｓ　Ａｘｉ。

ｖｅｒｔ　４０５Ｍ上の温めたく３７℃）顕微鏡ステージを用いて撮った。

結果を図９および１０に示す。

図９３と９ｂは、Ｔ−カドヘリンが同種親和性細胞の接着を媒介することを示し ている。図９ａはいくつかの凝集を示す位相差光学顕微鏡写真である。図９ｂは 同じ視野での標識化非トランスフェクト細胞の蛍光光学顕微鏡写真である。図９ ８と９ｂとの比較は、非トランスフェクト細胞が単一細胞のままであり非接着性 であるのに対し、Ｔ−カドヘリン遺伝子でトランスフェクトした細胞は凝集傾向 にあることを示す。

図１０は、種々の対照と比較した、Ｔ−カドヘリンでトランスワエクトした細胞 の凝集パーセントを示す。結果は対照細胞およびＰＩ−ＰＬＣ処理細胞と比較し て、Ｔ−カドヘリントランスフェクシ璽ン細胞において凝集が有意に高いことを 示す。

細胞凝集に続いて起こる、Ｔ−カドヘリンの表面分布を測定するために、細胞を 処理し上記のように凝集させた。１０分後、ホルムアルデヒドを３％添加し、細 胞を１０分間回転振盪した。

細胞をＰＢＳで慎重に洗浄し、抗Ｔ−カドヘリン抗血清を含有するＰＢＳ　（１ ：１００）中に再懸濁して、穏やかに往復振盪しながら室温で４０分間インキュ ベートした。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＦＩＴＣ複合体化ヤギＦ（ａｂ’）ａ 抗つサギＩｇＧを１＝５０に希釈して４０分間インキュベートした。細胞を洗浄 し、実験のためにＰＢＳ中に再懸濁した。

結果を図１１に示す。図１１ａは、凝集後のＴ−カドヘリンの表面分布の位相差 光学顕微鏡写真を示す。図１１ｂは同じ視野での凝集の蛍光光学顕微鏡写真を示 す。Ｔ−カドヘリンは細胞−細胞接触の領域に集中している。これらの結果は、 Ｔ−カドヘリンが細胞を互いに他に接着するよう誘導することを示している。

Ｆｆｇｕｒｅ　１ −〜　Ｏｒ−０？　ＯＱＦ　Ｏ９ロ９　０？　Ｏｆ　ｏｗ　ｃｏｗ　Ｏｆへ　の １　のへ　ｒ＋の　１ω　ｖｅ−ｗｗ　ｌ”ｌさ　〜ローＦＩＯψ−〜　ｎ　マ ー　い−ψ−−へ　のへ　１７Ｎ上２ニーＬ＋Ｊ　ＣＬ　１−２−ＬＬＩｌ　ｌ −２−ωｌ　ｌ−２−ＬＬＩ　ＣＬ　←ｚ−ｕ、＋ａ−ｓｐ　ｍｂ　ｃｂｌ　ｃ ｔｘ　ａｔ　ｒｔ　ｍｕ　ｈｒ　ｋｌ　ＩＩ　１ｕＦＩＧ、４ Ｆｉｇｕｒｅ　ＳＡ Ｆｌｇｕｒｅ　５Ｂ ＦＩＧ、６ Ｆ１ｇｕｒ＠７ Ｃａｔ　ＩＩＩ　ＬＩ　Ｎ　Ｋ　Ｌａｌ　ＲＩ　ＮＥＷＳ＠１１−一−−・−− ・−−一 ７−７）ｓへりソ　フンタクナン ＦＩＧ、８Ｂ−Ｉ　ＦＩＧ、８Ｂ−２ＦＩＧ、８Ｂ−３ＦＩＧ、８Ｃ ＦＩＧ、８Ｄ ＦＩＧ、９Ａ　ＦＩＧ、９Ｂ １１％ 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成５年４月２６日胃

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｔ−カドヘリンを含む実質的に精製したポリペプチド。
2. ２．前記Ｔ−カドヘリンが、グリコシルホスファチジルイノシトール結合を細胞 膜中に有し細胞質ドメインを有しないＴ−ｃａｄ１を含む、請求項１に記載の実 質的に精製したポリペプチド。
3. ３．前記Ｔ−カドヘリンがＴ−ｃａｄ２を含む、請求項１に記載の実質的に精製 したポリペプチド。
4. ４．請求項２あるいは３に記載のポリペプチドをコードする、単離した核酸配列 。
5. ５．Ｔ−カドヘリンに特異的に応答するがＮ−、Ｅ−あるいはＰ−カドヘリンに は応答しない抗体。
6. ６．前記抗体がポリクローナルである、請求項５に記載の抗体。
7. ７．前記抗体がモノクローナルである、請求項５に記載のの抗体。
8. ８．被験体中のＴ−カドヘリンの存在を検出する方法であって、請求項５に記載 の抗体に該被験体からの試料を接触させる工程およびＴ−カドヘリンと試薬との 結合を検出する工程を包含し、結合の存在がＴ−カドヘリンの存在を示す、方法 。
9. ９．ハイブリダイゼーションを起こさせるための、請求項４に記載の核酸部分に 十分に相補的な核酸配列を含有する、核酸プローブ。
10. １０．被験体中のＴ−カドヘリンの存在を検出する方法であって、請求項９に記 載のプローブを該被験体からの核酸を含有する試料に接触させる工程および該プ ローブの該核酸への結合を測定する工程を包含し、ハイブリダイゼーションの存 在がＴ−カドヘリンの存在を示す、方法。
11. １１．請求項４に記載の核酸を含有する発現ベクターであって、形質転換した宿 主細胞中でＴ−カドヘリンを発現可能なベクター。
12. １２．請求項１１に記載のベクターを適切な宿主細胞中に含有する、形質転換し た宿主細胞。
13. １３．請求項１１に記載の形質転換した宿主細胞によって産生されるポリペプチ ド。
14. １４．腫瘍細胞の移動を阻害する方法であって、有効量のＴ−カドヘリンにより 腫瘍細胞の接着を増加させることを包含する、方法。
15. １５．Ｔ−カドヘリンと結合するリガンドあるいは試薬の治療的に有効な用量に よりＴ−カドヘリンが腫瘍中で阻害される、請求項１４に記載の方法。
16. １６．前記リガンドあるいは試薬が、Ｔ−カドヘリンに応答するがＮ−、Ｅ−あ るいはＰ−カドヘリンには応答しない抗体である、請求項１５に記載の方法。
17. １７．前記試薬が、Ｔ−カドヘリンをコードしＮ−、Ｅ−あるいはＰ−カドヘリ ンをコードしないオリゴヌクレオチドあるいはｃＤＮＡである、請求項１５に記 載の方法。
18. １８．被験体の傷害されたニューロンを修復する方法であって、治療的に有効な 用量のＴ−カドヘリンを用いて傷害されたニューロンを処置することを包含する 、方法。