DE69232986T2

DE69232986T2 - TGF-BETA TYP III REZEPTOR, DAFüR KODIERENDE CDNS UND DEREN VERWENDUNG

Info

Publication number: DE69232986T2
Application number: DE69232986T
Authority: DE
Inventors: Y. Lin; F. Lodish; Xiao-Fan Wang; A. Weinberg
Original assignee: Whitehead Institute for Biomedical Research
Current assignee: Whitehead Institute for Biomedical Research
Priority date: 1991-10-31
Filing date: 1992-10-30
Publication date: 2003-12-11
Anticipated expiration: 2012-10-31
Also published as: ES2191007T3; US6046157A; US20080234216A1; JP2006055164A; EP0610427B1; JPH07501212A; US6201108B1; US20050260579A1; CA2122491A1; US6086867A; AU3057892A; EP0610427A1; DE69232986D1; EP1149908A1; JP4124815B2; US20060247198A1; US6010872A; HK1040744A1; WO1993009228A1; JP4185512B2

Description

Hintergrund

Transformierender Wachstumsfaktor beta (TGF-β) ist ein Mitglied einer Familie von strukturell verwandten Cytokinen, die eine Vielfalt von Reaktionen hervorrufen, einschließlich Wachstum, Differenzierung und Morphogenese in vielen verschiedenen Zelltypen (Roberts, A. B. und M. B. Sporn, In: Peptide Growth Factors and Their Receptors, Springer-Verlag, Heidelberg, S. 421-472 (1990); Massague, J., Annu. Rev. Cell. Biol. 6: 597- 641 (1990)). In Vertebraten sind mindestens 5 verschiedene Formen von TGF-β, bezeichnet als TGF-β1 bis TGF-β5, identifiziert worden; sie teilen alle einen hohen Grad (60%-80%) an Aminosäuresequenzidentität. Obwohl TGF-β1 anfänglich aufgrund seiner Fähigkeit, von der Verankerung unabhängiges Wachstum normaler Nierenzellen der Ratte zu induzieren, charakterisiert wurde, sind seine Wirkungen auf die meisten Zelltypen antimitogen (Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990); Andres, J. L. et al., J. Cell. Biol. 109: 3137-3145 (1989)). Er ist stark wachstumshemmend für viele Zelltypen, einschließlich sowohl normaler als auch transformierter epithelialer, endothelialer, Fibroblasten-, neuronaler, lymphoider und hematopoetischer Zellen. Zusätzlich spielt TGF-β eine zentrale Rolle in der Regulation der Bildung extrazellulärer Matrix und von Zellmatrix-Adhäsionsprozessen.
Trotz seiner weitverbreiteten Wirkungen auf den Zellphänotyp und die Zellphysiologie ist wenig über die biochemischen Mechanismen bekannt, die es TGF-β Familienmitgliedern ermöglichen, diese verschiedenen Reaktionen hervorzurufen. Drei verschiedene hochaffine Zelloberflächen-TGF-β-bindende Proteine, benannt Typ I, II und III, sind durch Inkubation von Zellen mit radiomarkiertem TGF-β1, Crosslinking gebundenen TGF-β1 an Zelloberflächenmoleküle und Analyse der markierten Komplexe durch Polyacrylamidgelelektrophorese identifiziert worden (Massague, J. und B. Like, J. Biol. Chem. 260: 2636-2645 (1985); Cheifetz, S. et al., J. Biol. Chem. 261: 9972-9978 (1986)). Die Bindungskonstanten betragen etwa 5-50 pM für Typ I und II Rezeptor und 30-300 pM für den Typ III-Rezeptor (Boyd, F. T. und J. Massague, J. Biol. Chem. 264: 2272-2278 (1989)).
Die Typ I und II-Rezeptoren, mit geschätztem Molekulargewicht von 53 beziehungsweise 70-100 Kilodalton, sind N-glycosylierte Transmembranproteine, die in vielerlei Hinsicht ähnlich sind. Jeder dieser Rezeptoren besitzt eine unterschiedliche Affinität für jedes Mitglied der TGF-β-Familie von Liganden (Boyd, F. T. und J. Massague, J. Biol. Chem. 264: 2272-2278 (1989)). Im Gegensatz dazu zeigt der Typ III-Rezeptor vergleichbare Affinitäten für alle TGF-β-Isotypen; der Typ III-Rezeptor ist der am häufigsten vorkommende Zelloberflächenrezeptor für TGF-β in vielen Zellinien (mehr als 200,000 pro Zelle) und ist ein integrales Membranproteoglycan. Er ist stark durch Glycosaminoglycan (GAG)-Gruppen modifiziert und wandert heterogen in der Gelelektrophorese als Proteine von 280 bis 330 Kilodalton. Nach Deglycosylierung mit Heparitinase und Chondrontinase wandert der Proteinkern als ein 100-110 Kilodalton-Protein. Die TGF-β-Bindungsstelle liegt in diesem Proteinkern, da nicht-glycosylierte Formen dieses Rezeptors, die in in der GAG-Synthese defekten Zellmutanten hergestellt werden, Liganden mit vergleichbaren Affinitäten zu denen des natürlichen Rezeptors binden können (Cheifetz, S. und J. Massague, J. Biol. Chem. 264: 12025-12028 (1989)). Eine variante Form von Typ III-Rezeptor wird von einigen Zelltypen als ein lösliches Molekül abgegeben, dem offensichtlich ein Membrananker fehlt. Diese lösliche Variante wird in geringen Mengen im Serum und in der extrazellulären Matrix gefunden.
Der Typ III-Rezeptor, auch Betaglycan genannt, besitzt eine von der der Typ I- und Typ II-Rezeptoren unterschiedliche biologische Funktion. Einige mutante Lungenepithelzellen des Nerzes (Mv1Lu), die auf den Verlust der TGF-β-Ansprechbarkeit selektiert wird, exprimieren Typ I-Rezeptoren nicht mehr; andere, ähnlich selektiert, verlieren die Expression sowohl der Typ I- als auch II-Rezeptoren. Alle diese Varianten exprimieren jedoch weiterhin den Typ III-Rezeptor (Boyd, F. T. und J. Massague, J. Biol. Chem. 264: 2272-2278 (1989); Laiho, M. et al., J. Biol. Chem. 265: 18518-18524 (1990)). Das hat zu dem Vorschlag geführt, dass die Typ I- und II-Rezeptoren Signal-transduzierende Moleküle sind, während der Typ III-Rezeptor eine andere Funktion ausüben könnte, wie die Konzentrierung des Liganden vor der Präsentation an die entsprechenden Signaltransduzierenden Rezeptoren. Die sekretierte Form des Typ III-Rezeptors andererseits kann als ein Reservoir- oder Beseitigungssystem für bioaktives TGF-β fungieren.
Zusätzliche Information über jeden dieser TGF-β-Rezeptortypen würde unser Verständnis ihrer Rollen verstärken und es, wenn gewünscht, möglich machen, ihre Funktionen zu verändern.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Isolierung, Sequenzierung und Charakterisierung der den TGF-β-Typ III-Rezeptor aus Säugern codierenden DNA. Sie betrifft auch den codierten TGF-β-Typ III-Rezeptor sowie seine lösliche Form; Anwendungen der Rezeptor-codierenden Gene und der Rezeptoren selbst; für den TGF-β-Typ III-Rezeptor spezifische Antikörper. Insbesondere betrifft sie die den TGF-β-Typ III-Rezeptor aus Ratte und Mensch codierende DNA und Homologe davon.
Insbesondere liefert die vorliegende Erfindung TGF-β-Typ III-Rezeptor aus Vertebraten codierende DNA, wobei die DNA aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus:
(a) einer DNA, die die Nucleotidsequenz aus Fig. 1 umfasst;
(b) einer DNA, die die Nucleotidsequenz der in dem Plasmid enthaltenen cDNA umfasst, das unter der ATCC-Hinterlegungsnummer 75127 hinterlegt ist;
(c) einer DNA, die einen Teil der Nucleotidsequenz der DNA aus (a) oder (b) umfasst, der eine Aminosäuresequenz codiert, die ausreicht, um die TGF-β- Bindungsfähigkeit zu erhalten;
(d) einer DNA, die einen Teil der Nucleotidsequenz der DNA von (a) oder (b) umfasst und einen löslichen TGF-β-Rezeptor des Typ III codiert;
(e) einer DNA, die eine Aminosäuresequenz codiert, die in Fig. 1 dargestellt ist oder durch die in dem Plasmid enthaltene cDNA codiert wird, das unter der ATCC- Hinterlegungsnummer 75127 hinterlegt ist;
(f) einer DNA, die einen Teil der in Fig. 1 dargestellten Aminosäuresequenz codiert oder einen Teil der Aminosäuresequenz codiert, die durch die in dem Plasmid enthaltene cDNA codiert wird, das unter der ATCC-Hinterlegungsnummer 75127 hinterlegt ist, wobei der Teil ausreicht, um die TGF-β-Bindungsfähigkeit zu erhalten;
(g) einer DNA, die einen Teil der Aminosäuresequenz codiert, die in Fig. 1 dargestellt ist oder durch die in dem Plasmid enthaltene cDNA codiert wird, das unter der ATCC-Hinterlegungsnummer 75127 hinterlegt ist, und die einen löslichen TGF-β-Typ III-Rezeptor codiert;
(h) einer DNA, die die Sequenz der in dem Plasmid enthaltenen cDNA besitzt, das unter der ATCC-Hinterlegungsnummer 75127 hinterlegt ist; und
(i) einer DNA, die unter stringenten Bedingungen mit der in dem Plasmid enthaltenen cDNA hybridisiert, das unter der ATCC-Hinterlegungsnummer 75127 hinterlegt ist, und die einen TGF-β-Typ III-Rezeptor, einen Teil davon, der die TGF-β- Bindungsfähigkeit erhält, oder einen löslichen TGF-β-Typ III-Rezeptor codiert.
Die den TGF-β-Rezeptor codierende DNA der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um äquivalente TGF-β-Typ III-Rezeptorgene aus anderen Quellen unter Verwendung von beispielsweise bekannten Hybridisierungs-basierten Verfahren oder der Polymerasekettenreaktion zu identifizieren. Das Typ III-Rezeptorgen oder seine jeweiligen codierten Produkte können verwendet werden, um die Effekte von TGF-β zu verändern (z. B. durch Veränderung der Rezeptivität von Zellen auf TGF-β oder durch Störung der Bindung von TGF-β an seinen Rezeptor), wie seine Effekte auf die Zellproliferation oder das Zellwachstum, die Zelladhäsion und den Zellphänotyp. Zum Beispiel kann das TGF-β-Typ III-Rezeptorgen oder ein verkürztes Gen, das weniger als den gesamten Rezeptor codiert (z. B. löslichen TGF-β-Typ III-Rezeptor oder die TGF-β-Typ III-Bindungsstelle), einem Individuum verabreicht werden, in dem TGF-β-Effekte verändert werden sollen. In einer anderen Ausführungsform kann der TGF-β-Typ III-Rezeptor, eine lösliche Form davon (z. B. eine Form, der der Membrananker fehlt) oder eine aktive Bindungsstelle des TGF-β-Typ III- Rezeptors einem Individuum verabreicht werden, um die Effekte von TGF-β zu verändern.
Aufgrund der vielen Rollen, die TGF-β im Körper besitzt, macht die Verfügbarkeit der hier beschriebenen TGF-β-Rezeptoren es möglich, die TGF-β-Funktion unter Verwendung von in vivo als auch in vitro Verfahren weiter zu bewerten und seine Effekte zu verändern (verstärken oder verringern).
Der Gegenstand der Erfindung basiert auf der Isolierung und Sequenzierung der DNA von Vertebraten, insbesondere aus Säugern, die TGF-β-Typ III-Rezeptor codiert, die Expression der codierten Produkte und die Charakterisierung der exprimierten Produkte. Wie beschrieben, wurde eine Vollängen cDNA, die TGF-β-Typ III-Rezeptor codiert, aus einer cDNA-Genbank isoliert, die aus einer vaskulären glatten Muskelzellinie der Ratte hergestellt wurde, und eine Vollängen cDNA, die TGF-β-Typ III-Rezeptor codiert, ist aus einer menschlichen cDNA-Genbank isoliert worden. Das menschliche Homolog des Typ III-Gens ist auch cloniert worden. Eine Hinterlegung der menschlichen TGF-β-Typ III-cDNA im Plasmid pBSK wurde unter den Bedingungen des Budapester Vertrags bei der American Type Culture Collection (10/21/91) unter der Hinterlegungsnummer 75127 gemacht. Alle Einschränkungen bezüglich der Verfügbarkeit des hinterlegten Materials werden bei Erteilung eines US-Patentes auf der Grundlage des Gegenstandes der Anmeldung unwiderruflich wegfallen.

Isolierung und Charakterisierung des TGF-β-Typ III-Rezeptors

Wie hier beschrieben, wurden zwei getrennte Strategien zur Isolierung der cDNA des TGF-β-Typ III-Rezeptors verfolgt. In einem Ansatz wurden monoclonale Antikörper gegen das Typ III-Rezeptorprotein erzeugt und verwendet, um den Rezeptor zu reinigen, der dann der Mikrosequenzierung unterzogen wurde (siehe Beispiel 1). Mikrosequenzierung mehrerer Peptide, die aus der partiellen Proteolyse des gereinigten Rezeptors resultieren, ergab vier Oligopeptidsequenzen, die verwendet wurden, um degenerierte Oligonucleotide herzustellen. Die degenerierten Oligonucleotide wurden entweder als Primer in einer Clonierungsstrategie unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) oder als Sonden zum Absuchen von cDNA-Genbanken verwendet. Obwohl diese Strategie sich nicht als produktiv erwies, waren die Oligopeptidsequenzen zur Bestätigung der Identität der Rezeptorclone, die mittels der zweiten Strategie isoliert wurden, nützlich.
Im zweiten Ansatz zur Isolierung TGF-β-Rezeptor codierender Clone wurde eine Expressionsclonierungsstrategie in COS-Zellen verwendet; direkte Sichtbarmachung der Rezeptor-positiven Zellen wurde verwendet, um Rezeptor-cDNAs zu isolieren (siehe Beispiel 2). In diesem Ansatz wurde eine cDNA-Genbank aus A-10-Zellen, einer vaskulären glatten Muskelzellinie der Ratte, die alle drei TGF-β-Rezeptoren (Typ I, II und III) exprimiert, hergestellt. COS-Zellen, transfiziert mit cDNA-Komponenten dieser Genbank in einem Vektor, der den Cytomegalovirus (CMV)-Transkriptionspromotor und den SV40-Ursprung der Replikation trägt, wurden abgesucht, um Zellen zu identifizieren, die wesentlich höhere als normale Mengen an TGF-β-Rezeptor exprimieren. Ein Transfektant, der solche hohen Mengen an TGF-β-Bindungsprotein exprimiert, wurde identifiziert, und der ursprüngliche Pool von Expressionskonstrukten, von dem er stammte, wurde in Subpools aufgeteilt die einer zweiten Runde des Absuchens unterzogen wurden. Zwei weitere Runden der sib- Selektion resultierten in der Isolierung eines cDNA-Clons (R3-OF) mit einem 2.9 kb-Insert, das grosse Mengen TGF-β-bindender Proteine in etwa 10% der Zellen, in das es eingeführt worden war, induzierte. Die Spezifität der TGF-β-Bindung wurde dadurch bestätigt, dass gezeigt wurde, dass die Zugabe eines 200fachen Überschusses unmarkierten Kompetitors TGF-β1 die Bindung von ¹²&sup5;I-TGF-β an transfizierte Zellen stark reduzierte.
Die R3-OF-cDNA codierte einen offenen Leserahmen von 817 Aminosäuren, aber sie enthielt kein Stopcodon. R3-OF wurde als eine Sonde verwendet, um eine Vollängen-cDNA aus einer 208F-Genbank der Ratte zu isolieren. Der resultierende Clon, R3-OFF, ist 6 kb lang und codiert ein Protein von 853 Aminosäuren, die mit dem Clon R3-OF colinear sind. Die Nucleotidsequenz von R3-OFF ist in Fig. I zusammen mit der translatierten Aminosäuresequenz gezeigt.
Eine Charakterisierung des von R3-OFF codierten Rezeptors wurde durchgeführt, wie in Beispiel 3 beschrieben. Die Ergebnisse zeigten drei verschiedene TGF-β-bindende Proteinarten von TGF-β auf der Oberfläche schein-transfizierter COS-Zellen, was mit von anderen berichteten Ergebnissen übereinstimmt (Massague, J. et al., Ann. NY Acad. Sci. 593: 59-72 (1990)). Diese beinhalteten die zwei Typ I- und II-Rezeptoren mit niedrigerem Molekulargewicht (65 und 85 kD) und das Typ III-Proteoglycan mit höherem Molekulargewicht, das als eine diffuse Bande von 280-330 kD wandert. Die enzymatische Entfernung des Proteoglycans ergab ein Kernprotein von etwa 100 kD. Die Bindung an alle drei Rezeptortypen ist in der Art spezifisch, dass sie durch einen 200fachen Überschuss an unmarkiertem TGF-β1 kompetitiert wurde.
Die Transfektion der isolierten cDNA verursachte eine zweifache Erhöhung in der Expression des Typ III-Rezeptors. Wenn ein Zellysat, das von mit dem Clon R3-OFF transfizierten COS-Zellen stammt, mit deglycosylierenden Enzymen behandelt wurde, veränderte sich die heterogene 280-330 kD Bande in einen Proteinkern, der zusammen mit dem in parentalen A10 Zellen nachweisbaren Typ III-Proteinkern wanderte. Bedeutsamerweise wanderte der rekombinante Proteinkern unterschiedlich zu dem endogenen COS-Zellen Typ III-Proteinkern.
Diese Beobachtungen wurden bestätigt und unter Verwendung stabil transfizierter Zellen, die die Typ III-cDNA exprimieren, erweitert. L6-Skelettmuskelmyoblasten der Raffe exprimieren keine nachweisbare Typ III mRNA und keinen endogenen Oberflächen-Typ III- Rezeptor (Massague et al., 1986; Segarini et al., 1989). Diese Zellen wurden mit der isolierten cDNA im Vektor pcDNA-neo transfiziert. Zellclone, die diesen Clon stabil sowohl in der Hin- als auch der Rückorientierung in Bezug auf den CMV-Promotor exprimieren, wurden isoliert und durch einen Ligandenbindungstest analysiert.
Einführung entweder des Vollängen-Clons R3-OFF oder des Teilclons R3-OF in der Hinorientierung resultierte in der Expression des Typ III-Rezeptors. L6-Zellen, die mit den cDNA-Clonen in der Rückorientierung transfiziert waren, exprimierten das Protein nicht. Bedeutsamerweise ist die scheinbare Größe des Proteinkerns des Typ III-Rezeptors in Zellen, die mit dem R3-OF-Clon transformiert wurden, kleiner als die von mit R3-OFF transformierten Zellen, was mit dem Unterschied in ihren aus ihrer Nucleinsäuresequenz vorausgesagten Größen der Proteinkerne übereinstimmt.
Überraschenderweise war die Bindung von radiomarkiertem Liganden an den Typ II- Rezeptor 2.5fach in Zellen, die die Typ III-cDNA exprimieren, erhöht. Die Bindung an den Typ I-Rezeptor war unverändert. Diese scheinbar spezifsche Hochregulation der Ligandenbindung an den Typ II-Rezeptor war in allen der bisher analysierten 15 stabil transfizierten L6-Zellinien offensichtlich. Darüber hinaus scheint dieser Effekt genauso gut durch den Vollängen-Clon oder, wenn ein verkürzter Clon (R3-OF), dem die cytoplasmatische Domäne von TGF-β-Typ III-Rezeptor fehlt, exprimiert wird, vermittelt zu werden.
Die Expression der Typ III-Rezeptor mRNA wurde durch Northern Blot-Analyse und RNA-Blot-Analyse bestimmt. Northern-Gel-Analyse zeigte, dass die Typ III-Rezeptor- mRNA als eine einzelne 6 kb-Message in mehreren Geweben der Ratte exprimiert wird. RNA-Dot Blot-Analyse mehrerer verschiedener Gewebekulturzellinien wurde auch durchgeführt. Zellen der Maus (MEL und YH16) scheinen eine kleinere (5.5 kb) Message für die Typ III mRNA als die aus Schwein, Ratte und Mensch zu exprimieren. In allen diesen Zellen stimmt die Expression oder Abwesenheit der Typ III mRNA mit der Expression oder Abwesenheit nachweisbarer Zelloberflächen-Typ III-Rezeptoren überein, mit der bemerkenswerten Ausnahme der Retinoblastoma-Zellinien (Y79, Weri-1; Weri-24 und Weri- 27). Diesen Zellen fehlt eine nachweisbare Oberflächenexpression des Typ III-Rezeptors, was einen früheren Bericht bestätigt (Kimchi, A. et al., Science 240: 196-198 (1988)). Es ist bemerkenswert, dass die Typ III-Rezeptor-mRNA in diesen Zellen in vergleichbarer Menge mit anderen Zellen, die tatsächlich Typ III-Rezeptorproteine in leicht nachweisbarer Menge exprimieren, exprimiert wird. Es scheint, dass die TGF-β-Typ III-Rezeptorexpression, die in normalen Retinoblasten (AD12) substantiell ist, in diesen Retinoblastomatumorzellen herunterregulierrt wurde, vielleicht durch Transkriptionsmechanismen.
Der volle Leserahmen der Nucleotidsequenz zusammen mit flankierenden Sequenzen des Vollängen cDNA-Clons R3-OFF wurde bestimmt und ist in Fig. 1 dargestellt. Der Leserahmen codiert ein Protein von 853 Aminosäureresten, der mit der 100 kD Größe, die für den vollständig deglycosylierten TGF-β1-Typ III-Rezeptor beobachtet wurde, vereinbar ist. Die Identität des Rezeptors als TGF-β-Typ III wurde durch die Suche nach Segmenten des möglichen Transkriptionsprodukts, das die durch Mikrosequenzierung des isolierten Typ III- Rezeptors bestimmten Peptidsequenzen einschloss, bestätigt (Siehe Beispiel 1). Wie in Fig. 1 angedeutet, stimmen zwei Segmente des abgeleiteten Proteins (unterstrichen und kursiv, Reste 378-388 und 427-434) genau mit den Aminosäuresequenzen von zwei Peptiden (I und III), die durch direkte biochemische Analyse des gereinigten Typ III-Rezeptors bestimmt wurden, überein.
Weitere Analyse zeigte, dass das TGF-β-Typ III-Bindungsprotein eine ungewöhnliche Struktur für einen Cytokin-Rezeptor besitzt. Hydropathie-Analyse zeigt, dass das Protein eine N-terminale Signalsequenz, gefolgt von einem langen, hydrophilen N-terminalen Bereich, einschließt. Ein 27 Reste-Bereich starker Hydrophobizität (unterstrichen in Fig. 1, Reste 786-812) gegen den C-Terminus hin stellt die einzige mögliche Transmembrandomäne dar. Das legt nahe, dass fast die ganze N-terminale extrazelluläre Domäne des Rezeptors in der Plasmamembran nahe seines C-Terminus verankert ist. Ein relativ kleiner C-terminaler Schwanz von 41 Resten stellt die cytoplasmatische Domäne dar.
Die Analyse verwandter Sequenzen liefert wenige Anhaltspunkte bezüglich der Funktion des TGF-β-Typ III-Proteins. Nur ein weiteres bisher beschriebenes Gen, ein in hohen Mengen von endothelialen Zellen exprimiertes und Endoglin genanntes Glycoprotein, enthält eine verwandte Aminosäuresequenz. Die am meisten homologen Bereiche zwischen den Sequenzen des Typ III-Rezeptors und Endoglin (74%) fallen primär in die putativen Transmembran- und die cytoplasmatischen Domänen. Ähnlich zur allgemeinen Struktur des Typ III-Rezeptors ist Endoglin ein Glycoprotein, das eine große hydrophile N-terminale Domäne enthält, die vermutlich extrazellulär ist, gefolgt von einer vermutlichen Transmembrandomäne und einem kurzen cytoplasmatischen Schwanz von 47 Aminosäureresten. Die biologische Rolle von Endoglin ist zur Zeit noch unklar, obwohl es vorgeschlagen worden ist, dass es in der Zell-Zell-Erkennung über Interaktionen einer "RGD"-Sequenz in seiner Ektodomäne mit anderen Adhäsionsmolekülen beteiligt sein könnte. Im Gegensatz zum TGF-β-Typ III-Rezeptor trägt Endoglin keine CAG-Gruppen.

Isolierung des TGF-β-Typ II-Rezeptors

Die den Typ II-TGF-β-Rezeptor codierende cDNA wurde auch mittels Expressionsclonierung in COS-Zellen isoliert. Eine Vollängen cDNA (Clon mit der Bezeichnung 3FF) wurde durch Hybridisierung mit hoher Stringenz aus einer menschlichen HepG2-Zellen-cDNA-Genbank isoliert (Siehe Beispiel 6). Die Analyse zeigte, dass die entsprechende Message eine 5 kb Message ist, die in verschiedenen Zellinien und Geweben exprimiert wird. Sequenzanalyse zeigte, dass die cDNA einen offenen Leserahmen besitzt, der ein 572 Aminosäurereste Kernprotein codiert. Die Nucleotidsequenz des Vollängen Typ II-TGF-β-Rezeptor cDNA-Clons 3FF ist in Fig. 2 gezeigt; die Aminosäuresequenz ist in Fig. 3 dargestellt.
Das Protein mit 572 Aminosäureresten besitzt eine einzige vermutliche Transmembrandomäne, mehrere Consensus-Glycosylierungsstellen und eine mögliche intrazelluläre Serin/Threoninkinasedomäne. Die vorausgesagte Größe des codierten Proteinkerns ist ~60 kD, was für einen Typ I-TGF-β-Rezeptor zu groß ist. Dagegen zeigen Kreuzverbindungs-Experimente mit iodiniertem TGF-β-Rezeptor und COS-Zellen, die transient mit Clon 3FF transfiziert sind, eine Überexpression eines Proteins von etwa 70-80 kD, was der Größe der Typ II-TGF-β-Rezeptoren entspricht. Folglich codiert Clon 3FF ein Protein, das TGF-β spezifisch bindet und eine exprimierte Proteingröße von 70-80 kD besitzt, beides charakteristisch für den Typ II-TGF-β-Rezeptor.

Verwendungen der clonierten TGF-β-Rezeptoren und verwandter Produkte

Zum ersten Mal, als Ergebnis der hier beschriebenen Arbeit, sind DNAs, die zwei der drei hochaffinen Zelloberflächen-TGF-β-Rezeptoren codieren, isoliert, ihre Sequenzen und Expressionsmuster bestimmt und die codierten Proteine charakterisiert worden. Die Expression des TGF-β-Typ III-Rezeptors in Zellen, die normalerweise den Rezeptor nicht exprimieren, gefolgt von Ligandenbindungstest, bestätigte, dass die clonierte Typ III- Rezeptor codierende DNA (d. h. entweder der Vollängen-Clon R3-OFF oder der Teilclon R3- OF) den Rezeptor codierte. Zusätzlich resultierte die hier beschriebene Arbeit in dem überraschenden Befund, dass die Bindung von TGF-β an Typ II-Rezeptoren in Zellen, die die Typ III-DNA exprimieren, 2.5fach erhöht wurde.
Zusätzlicher Einblick in die Rolle von TGF-β-Typ III-Rezeptor und seiner Interaktion mit TGF-β-Typ II-Rezeptor ist ein Ergebnis der beschriebenen Arbeit. Zum Beispiel ist die. Rolle von TGF-β-Typ III-Rezeptor unklar, aber es ist vorgeschlagen worden, dass er eine äußerst ungewöhnliche Funktion der Anziehung und Konzentrierung von TGF-βs für eine mögliche Übergabe an nahe benachbarte signaltransduzierende Rezeptoren ausübt. Während die meisten Cytokine an einen einzigen Zelloberflächenrezeptor binden, binden Mitglieder der TGF-β-Familie mit größerer oder geringerer Affinität an drei verschiedene Zelloberflächenproteine. Das hat die Frage aufgeworfen, warum diese drei Rezeptoren von den meisten Zelltypen exprimiert werden, und ob sie verschiedene Funktionen ausüben. Bisher erhaltene Hinweise legen nahe, dass der Typ III-Rezeptor von denen der Typen I und II ziemlich unterschiedliche Funktionen ausüben kann. Folglich wird Typ III wesentlich durch GAGs verändert, während die Typen I und II primär die N-gebundenen (und vielleicht Ogebundenen) Seitenketten, die für die meisten Wachstumsfaktorrezeptoren charakteristisch sind, zu tragen scheinen. Zusätzlich zeigen verschiedene Zellen, die auf ihre Fähigkeit, TGF- β-induzierter Wachstumshemmung zu widerstehen, selektiert wurden, die Abwesenheit von Typ I und Typ II-Rezeptoren, während sie weiterhin Typ III-Rezeptoren exprimieren. Zusammen haben diese Daten einige dazu veranlasst vorzuschlagen, dass die Typ I- und II- Rezeptoren selbst signaltransduzierende Rezeptoren darstellen, während der hier beschriebene Typ III-Rezeptor ein andere verschiedene Rolle in der Zelle spielt.
Es bleibt möglich, dass der Typ III-Rezeptor eine äußerst ungewöhnliche Funktion der Anziehung und Konzentrierung von TGF-βs auf der Zelloberfläche für eine mögliche Übergabe an nahe benachbarte signaltransduzierende Rezeptoren ausübt. Solch eine Funktion hätte es noch nie für einen Protein-Rezeptor gegeben, obwohl gezeigt worden ist, dass Heparinsulfat basisches FGF durch Bindung an diesen Wachstumsfaktor vor der Assoziation von FGF an seinen Rezeptor aktiviert (Yayon, A. et al., Cell 64: 841-848 (1991)). Nebenbei gesagt kann der Typ III-Rezeptor, da er auch große Mengen Heparansulfat-Seitenketten enthält, auch basisches FGF binden und seinem Rezeptor präsentieren.
Hinweise, die mit der Rolle für den Typ III-Rezeptor übereinstimmen, kommen von der hier beschriebenen Arbeit mit L6-Myoblastenzellen der Ratte. Wie vorstehend beschrieben, ist die Bindung von radiomarkiertem TGF-β an den Typ II-Rezeptor in Typ III- Rezeptor überexprimierenden L6-Zellen bei Vergleich mit der in parentalen Zellen beobachteten mehrfach erhöht. Weitere Beurteilung der TGF-β-Typ III-Funktion und Interaktion mit Typ II- und Typ I-Rezeptoren wird erforderlich sein, um diese Fragen zu beantworten, und sie können mit den hier beschriebenen Materialien und Verfahren durchgeführt werden.
TGF-β-Rezeptoren, sowohl Typ III als auch Typ II, können in anderen Arten identifiziert werden, indem die ganze oder ein Teil der den zu identifzierbaren Rezeptor codierenden DNA als eine Sonde und hier beschriebene Verfahren verwendet werden. Zum Beispiel können die ganze oder ein Teil der TGF-β-Typ III-Rezeptor codierenden DNA- Sequenz (gezeigt in Fig. 1) oder die ganze oder ein Teil der TGF-β-Typ II-Rezeptor codierenden DNA-Sequenz (gezeigt in Fig. 2) verwendet werden, um äquivalente Sequenzen in anderen Tieren zu identifzieren. Verwendete stringente Bedingungen können nach Bedarf verändert werden, um äquivalente Sequenzen in anderen Arten zu identifizieren. Wenn eine mögliche TGF-β-Rezeptor Typ III oder Typ II-codierende Sequenz identifiziert worden ist, kann mittels bekannter Verfahren bestimmt werden, ob sie den entsprechenden Rezeptortyp codiert, wie hier für die Überprüfung, dass das cDNA-Insert des Vollängen- Clons R3-OFF und das cDNA-Insert des Teilclons R3-OF den Typ III-Rezeptor codieren, beschrieben. Zum Beispiel kann auf diese Weise isolierte DNA in einer geeigneten Wirtszelle, die keine Rezeptor-mRNA oder den Oberflächenrezeptor (z. B. L6- Skelettmuskelmyoblasten der Ratte) exprimiert, exprimiert werden und durch Ligandenbindungstest (TGF-β-Bindung), wie hier beschrieben, analysiert werden.
Auch können als eine Folge der hier beschriebenen Arbeit für den clonierten TGF-β- Typ III- oder den clonierten TGF-β-Typ II-Rezeptor spezifische Antikörper (polyclonal oder monoclonal) mittels bekannter Verfahren produziert werden. Solche Antikörper und den Antikörper produzierende Wirtszellen (z. B. Hybridomazellen) sind auch Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Für den clonierten TGF-β-Rezeptor spezifische Antikörper können verwendet werden, um Wirtszellen zu identifizieren, die isolierte DNA, von der angenommen wird, dass sie einen TGF-β-Rezeptor codiert, exprimieren. Zusätzlich können Antikörper verwendet werden, um TGF-β-Aktivität zu blockieren oder zu hemmen. Zum Beispiel können für den clonierten TGF-β-Typ III-Rezeptor spezifische Antikörper verwendet werden, um die Bindung von TGF-β an den Rezeptor zu blockieren. Sie können einem Individuum verabreicht werden, für das eine Verringerung der TGF-β-Bindung wünschenswert ist, wie in einigen fibrotischen Krankheiten (z. B. der Haut, Niere und Lunge). Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann zur Diagnose von Störungen verwendet werden, die abnormale Bindung von TGF-β and TGF-β-Typ III-Rezeptoren, wie fibrotische Krankheiten, einschließen. Abnormale Bindung von TGF-β an TGF-β-Typ III-Rezeptor an einer Zelloberfläche können gemessen werden, was in einem Testbindungswert resultiert, der mit einem geeigneten Kontrollbindungswert verglichen wird. Kontrollbindungswerte können mit Kontrollzellen, von denen bekannt ist, dass sie abnormale Bindung von TGF-β an seine Rezeptoren zeigen, oder Kontrollzellen, die normale Zellen sind (z. B. deutliche TGF-β- Bindung an den TGF-β-Rezeptor liegt innerhalb physiologischer Level), erhalten werden. Kontrollwerte werden durch Bestimmen des Ausmaßes, in dem TGF-β den geeigneten Rezeptor bindet (z. B. TGF-β-Typ III-Rezeptor), erhalten; solche Werte können zu dem Zeitpunkt erhalten werden, zu dem der Testbindungswert bestimmt wird, oder sie können zuvor bestimmt werden (z. B. ein zuvor bestimmter Standard). Ein zum Kontrollbindungswert ähnlicher Testbindungswert, der aus abnormalen Zellen erhalten wird, zeigt abnormale Bindung von TGF-β an den TGF-β-Typ III-Rezeptor. Ein zum Kontrollbindungswert ähnlicher Testbindungswert, der aus normalen Zellen erhalten wird, zeigt normale Bindung von TGF-β an TGF-β-Typ III-Rezeptor.
TGF-β-Typ III-Rezeptor codierende DNA und RNA sind jetzt verfügbar. Wie hier verwendet, schließt der Begriff den entsprechenden TGF-β-Rezeptor codierende DNA oder RNA jede Oligodeoxynucleotid- oder Oligodeoxyribonucleotidsequenz ein, die nach Expression in der Herstellung eines TGF-β-Rezeptors mit den funktionalen Charakteristika des TGF-β-Rezeptors resultiert. Das heißt, die vorliegende Erfindung schließt DNA und RNA ein, die nach Expression in einer geeigneten Wirtszelle einen TGF-β-Typ III-Rezeptor produziert, der eine Affinität für TGF-β besitzt, die ähnlich zu der des TGF-β-Typ III- Rezeptors auf natürlich vorkommenden Zelloberflächen ist (z. B. zeigt er vergleichbare Affinitäten für alle TGF-β-Isotypen). Die DNA oder RNA kann in einer geeigneten Wirtszelle produziert oder synthetisch (z. B. durch eine Amplifikationstechnik wie PCR) oder chemisch produziert werden.
Die vorliegende Erfindung schließt auch den isolierten TGF-β-Typ III-Rezeptor, der von der Nucleotidsequenz des Vollängen R3-OFF codiert wird, den isolierten TGF-β-Typ III- Rezeptor, der von der Nucleotidsequenz des Teilclons R3-OF codiert wird, und TGF-β-Typ III-Rezeptor, der TGF-β-Isotypen mit im wesentlichen derselben Affinität bindet, ein. Der isolierte TGF-β-Typ III-Rezeptor kann mittels rekombinanter Techniken, wie hier beschrieben, produziert oder aus Quellen isoliert, in denen er natürlicherweise vorkommt, oder chemisch synthetisiert werden. Wie hier verwendet, schließt der Begriff clonierter TGF- β-Typ III-Rezeptor den entsprechenden wie hier beschriebenen identifizierten Rezeptor und TGF-β-Typ III-Rezeptor ein (z. B. aus anderen Arten), der im wesentlichen dieselbe Affinität für TGF-β-Isotypen wie die entsprechenden Rezeptoren besitzt.
Wie vorher beschrieben binden Zellen, in denen der clonierte TGF-β Typ-III-Rezeptor exprimiert ist, TGF-β im wesentlichen auf dieselbe Art wie Zellen, auf denen der Typ III- Rezeptor natürlich vorkommt. Weitere Analysen von Ligandeninteraktionen mit dem clonierten TGF-β Typ III-Rezeptor, basierend auf Stellen-gerichteter Mutagenese von sowohl TGF-β als auch dem Rezeptor, können durchgeführt werden, um für die Bindung wichtige Reste zu identifizieren. Zum Beispiel kann DNA mit der Sequenz von Fig. 1 durch Addition, Deletion oder Substitution von wenigstens einem Nucleotid verändert werden, um eine modifizierte DNA-Sequenz herzustellen, die einen modifizierten clonierten TGF-β Typ III- Rezeptor codiert. Die funktionalen Charakteristika des modifizierten Rezeptors (z. B. seine TGF-β-Bindungsfähigkeit und Assoziation der Bindung mit Effekten, die normalerweise aus der Bindung resultieren) können mit hier beschriebenen Verfahren festgelegt werden. Die Veränderung des clonierten TGF-β Typ III-Rezeptors kann durchgeführt werden, um zum Beispiel eine Form des TGF-β Typ III-Rezeptors herzustellen, hier als löslicher TGF-β- Rezeptor bezeichnet, die nicht membrangebunden ist und seine Fähigkeit behält, die TGF-β- Isotypen mit einer Affinität zu binden, die im wesentlichen dieselbe ist wie die des natürlich vorkommenden Rezeptors. Solch ein TGF-β Typ III-Rezeptor konnte mit bekannten genetischen oder synthetischen Techniken hergestellt werden; er konnte keinen im natürlich vorkommenden TGF-β Typ II-Rezeptor vorhandenen Transmembranbereich oder nur einen kleinen Teil dieses Bereiches (d. h. klein genug, um nicht mit seiner löslichen Beschaffenheit zu interferieren) einschließen. Zum Beispiel kann er die Aminosäuren 1 bis 785 der TGF-β Typ III-Sequenz von Fig. 1 oder einen Teil dieser Sequenz einschließen, die ausreichen, um die TGF-β-Bindungsfähigkeit zu erhalten (z. B. Aminosäuren 24-785, die nicht die in den ersten 23 Aminosäuren vorhandene Signalpeptidspaltungsstelle einschließen). Ein löslicher TGF-β-Typ II-Rezeptor (z. B. einer, der nicht die Transmembran- oder cytoplasmatischen Domänen einschließt) kann auch hergestellt werden. Zum Beispiel kann er die Aminosäuren 1 bis einschließlich 166 von Fig. 3 oder einen ausreichenden Teil davon, um im wesentlichen dieselbe TGF-β-Bindungsfähigkeit wie die von TGF-β Typ II-Rezeptor zu erhalten, einschließen.
Der TGF-β Typ III-Rezeptor der vorliegenden Erfindung kann für therapeutische Zwecke verwendet werden. Wie vorstehend beschrieben, vermittelt die TGF-β-Familie von Proteinen eine breite Vielfalt von zellulären Aktivitäten, einschließlich der Regulation des Zellwachstums, der Regulation der Zelldifferenzierung und der Kontrolle des Zellmetabolismus. TGF-β kann für die Zellfunktion wesentlich sein, und die meisten Zellen synthetisieren TGF-β und besitzen TGF-β-Zelloberflächenrezeptoren. Abhängig vom Zelltyp und der Umgebung variieren die Effekte von TGF-β: die Proliferation kann angeregt oder gehemmt werden, die Differenzierung kann induziert oder unterbrochen werden, und Zellfunktionen können angeregt oder unterdrückt werden. TGF-β ist von embryonalen Stadien an durch das Erwachsenenleben hindurch vorhanden und kann auf diese Weise diese Schlüsselprozesse durch das Leben hindurch beeinflussen. Die Ähnichkeiten eines einzelnen TGF-β (z. B. TGF-β1) über die Arten hinweg und von Zelle zu Zelle sind beträchtlich. Zum Beispiel sind die Aminosäuresequenz eines einzelnen TGF-β und die Nucleotidsequenz des Gens, das es unabhängig von der Quelle codiert, im wesentlichen identisch durch alle Arten hindurch. Das legt weiter nahe, dass TGF-β eine kritische Rolle in wesentlichen Prozessen besitzt.
Genauer ist gezeigt worden, dass TGF-β antiinflammatorische und Immunsuppressionsfähigkeiten besitzt, eine wichtige Rolle in der Knochenbildung spielt (durch Erhöhen der Osteoblastenaktivität), Krebszellproliferation in Kultur hemmt und die Proliferation von Drüsenzellen der Prostata kontrolliert. Als eine Folge besitzt es potentielle therapeutische Anwendungen in der Veränderung bestimmter Antworten des Immunsystems (und möglicherweise in der Modifikation immunvermittelter Krankheiten); in der Behandlung von systemischer Knochenkrankheit (z. B. Osteoporose) und Bedingungen, in denen Knochenwachstum verstärkt werden soll (z. B. Reparatur gebrochener Knochen) und in der Kontrolle von Wachstum und Metastasierung von Krebszellen. Zusätzlich scheint TGF-β eine Rolle in der Entscheidung, ob einige Zelltypen sich der Mitose unterziehen oder nicht, zu spielen. In dieser Hinsicht kann TGF-β eine wichtige Rolle in der Gewebereparatur spielen. Einige Krankheiten oder Bedingungen scheinen eine geringe Produktion oder chronische Überproduktion von TGF-β zu beinhalten. (Zum Beispiel legen Ergebnisse von Tierstudien nahe, dass es eine Korrelation zwischen der Überproduktion von TGF-β und Krankheiten, die durch Fibrose in der Lunge, Niere, Leber oder in viral vermittelter Immunsuppression charakterisiert sind, gibt.)
Offensichtlich besitzt TGF-β Schlüsselrollen in Prozessen des Körpers und zahlreichen damit zusammenhängenden möglichen klinischen oder therapeutischen Anwendungen in der Wundheilung, Krebs, Immuntherapie und Knochentherapie. Verfügbarkeit von TGF-β-Rezeptorgenen, den codierten Produkten und Verfahren zu ihrer Verwendung in vitro und in vivo liefern eine zusätzliche Möglichkeit, die TGF-β-Aktivität und den Effekt im Körper zu kontrollieren oder zu regulieren. Zum Beispiel kann der Typ III- Rezeptor, codiert von den Typ III-Rezeptorgenen des Erfindungsgegenstandes, entsprechend verwendet werden, um die Effekte von TGF-β zu verändern (z. B. um den Effekt von TGF-β im Körper zu verstärken oder seine Effekte (ganz oder teilweise) zu hemmen oder zu verringern. Es ist auch möglich, einem Individuum, bei dem TGF-β an den TGF-β Typ III- Rezeptor gebunden wurde, löslichen TGF-β Typ III-Rezeptor zu verabreichen. Die vorliegende Erfindung liefert sowohl einen TGF-β-Agonisten und einen TGF-β-Antagonisten. Für diese Zwecke kann DNA, die den ganzen TGF-β Typ III-Rezeptor codiert, der codierte Typ III-Rezeptor oder eine lösliche Form des Rezeptors verwendet werden. In einer anderen Ausführungsform können Antikörper oder andere Liganden, die auf diesen Sequenzen basierend entworfen wurden oder spezifisch für diese sind, für diesen Zweck verwendet werden.
Die Kenntnis der Aminosäuresequenzen des TGF-β Typ III-Rezeptors macht es möglich, seine Struktur besser zu verstehen und Verbindungen zu entwerfen, die mit der Bindung des Rezeptor mit TGF-β interferieren. Es macht die Identifizierung bestehender Verbindungen und den Entwurf neuer Verbindungen, die Typ III-Rezeptorantagonisten sind, möglich.
Zellen, die den Typ III-Rezeptor der vorliegenden Erfindung exprimieren, können verwendet werden, um Verbindungen auf ihre Fähigkeit, mit der TGF-Bindung an die Rezeptoren zu interferieren (ganze oder teilweise Blockierung), abzusuchen. Zum Beispiel können Zellen, die nicht TGF-β Typ III-Rezeptor exprimieren (z. B. L6 Skelettmuskelmyoblasten der Ratte), aber derart durch Einfügen der Typ III-cDNA in einen geeigneten Vektor verändert worden sind, dass sie den Rezeptor exprimieren, zu diesem Zweck verwendet werden. Eine zu bewertende Verbindung wird zum Beispiel zu Gewebekulturschalen, enthaltend Typ III exprimierende Zellen, zusammen mit markiertem TGF-β hinzugefügt. Als eine Kontrolle wird dieselbe Konzentration an markiertem TGF-β zu den Gewebekulturschalen, enthaltend denselben Typ von Zellen, hinzugefügt. Nach ausreichender Zeit zur Bindung von TGF-β an den Rezeptor wird die Bindung von markiertem TGF-β an die Zellen mittels bekannter Verfahren (z. B. mit einem Gammazähler) bestimmt, und das Ausmaß, zu welchem sie in Anwesenheit und Abwesenheit der zu bewertenden Verbindung auftrat, wird bestimmt. Ein Vergleich der zwei Werte zeigt, ob die Testverbindung die TGF-β-Bindung an den Rezeptor blockierte (d. h. weniger Bindung in Anwesenheit der Verbindung als in ihrer Abwesenheit ist ein Zeichen, dass die Testverbindung die Bindung von TGF-β an den TGF-β Typ III-Rezeptor blockiert hat).
In einer anderen Ausführungsform können eine Zellinie, die den TGF-β-Rezeptor exprimiert, oder Zellen, die mikroinjizierte TGF-β-Rezeptor-RNA exprimieren, verwendet werden, um Verbindungen auf ihre Fähigkeit, TGF-β-Bindung an seinen Rezeptor zu blockieren, zu testen. In dieser Ausführungsform wird eine zu testende Verbindung zu Gewebekulturschalen, enthaltend die Zellen der Zellinie, die mikroinjizierte TGF-β-Rezeptor- RNA exprimieren, zusammen mit TGF-β hinzugefügt. Als eine Kontrolle wird TGF-β allein zu derselben Art von Zellen, die mikroinjizierte Endothelin-Rezeptor-RNA exprimieren, hinzugefügt. Nach ausreichender Zeit zur Bindung von TGF-β an den Rezeptor wird das Ausmaß, zu dem die Bindung auftrat, sowohl in Anwesenheit als auch in Abwesenheit der zu testenden Verbindung gemessen. Ein Vergleich der zwei Werte zeigt, ob die Verbindung die TGF-β-Bindung an den Rezeptor blockierte. Der TGF-β Typ III-Rezeptor der vorliegenden Erfindung kann auch verwendet werden, um TGF-β-ähnliche Substanzen zu identifizieren, um TGF-β zu reinigen und um TGF-β-Bereiche zu identifizieren, die für die Bindung an die entsprechenden Rezeptoren verantwortlich sind. Zum Beispiel kann der Typ III-Rezeptor in einem Affinitäts-basierten Verfahren verwendet werden, um Substanzen zu identifizieren, die den Rezeptor in einer zu TGF-β ähnlichen Weise binden.
Die Erfindung wird jetzt durch die folgenden Beispiele veranschaulicht werden, die in keiner Weise beabsichtigen, einschränkend zu sein.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 ist die DNA-Sequenz (SEQ ID Nr. 1) und die translatierte Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 2) des Typ III TGF-β-Rezeptor cDNA-Clons R3-OFF (volle Insertgröße 6 kb), in der der offene Leserahmen mit flankierenden Sequenzen des Clons gezeigt werden. Die Transmembrandomäne wird durch eine einzelne Unterstreichung gekennzeichnet. Peptidsequenzen des gereinigten Typ III-Rezeptors, im Text erwähnt, die der abgeleiteten Sequenz entsprechen, sind kursiv und unterstrichen. Mögliche N-gebundene Glycosylierungsstellen sind durch # angezeigt, und extrazelluläre Cysteine durch &. Eine Consensus-Proteinkinase C-Phosphorylierungsstelle ist durch $ angezeigt. Die letzte nicht vom Vektor codierte Aminosäure von Clon R3-OF (2.9 kb) ist durch @ angezeigt. Eine Consensus-Proteoglycananheftungsstelle ist durch +++ angezeigt. Andere mögliche Glycosaminoglycananheftungsstellen sind durch + angezeigt. Das Stopcodon im Leserahmen stromaufwärts (-42 bis -44) wird durch eine gewellte Linie angezeigt. Die Signalpeptidspaltungsstelle, vorausgesagt von Heijne's Algorithmus (von Heijne, G., Nucl. Acid. Res. 14: 4683-4690 (1986)) wird durch einen Pfeil angezeigt.
Fig. 2 ist die Nucleotidsequenz des Vollängen-Typ II TGF-β-Rezeptor cDNA-Clons 3FF, isoliert aus einer menschlichen HepG2-Zellen cDNA-Genbank (volle Insertlänge 5 kb) (SEQ ID Nr. 3). Die cDNA besitzt einen offenen Leserahmen, der ein Protein mit 572 Aminosäureresten codiert.
Fig. 3 ist die Aminosäuresequenz des Vollängen-Typ II TGF-β-Rezeptors (SEQ ID Nr. 4).

BEISPIELE

Material und Methoden, die in den Beispielen 1-5 verwendet wurden, werden nachstehend beschrieben.

Material

Das Folgende ist eine Beschreibung von Materialien, die in der hier beschriebenen Arbeit verwendet wurden.
Rekombinantes menschliches TGF-β1 wurde von Rik Derynck von Genentech zur Verfügung gestellt. COS-M6 Zellen wurden von Brian Seed vom Massachusetts General Hospital und Alejandro Aruffo von Bristol-Myers-Squibb zur Verfügung gestellt. Heparitinase wurde von Tetsuhito Kojima und Robert Rosenberg vom MIT zur Verfügung gestellt. LLC-PK&sub1; Zellen waren ein Geschenk von Dennis Ausiello vom Massachusetts General Hospital. YH-16 Zellen waren ein Geschenk von Edward Yeh vom Massachusetts General Hospital. 3-4 Zellen waren ein Geschenk von Eugene Kaji vom Whitehead Institute for Biomedical Research. Alle anderen Zellinien wurden von ATCC erhalten und wie vom Lieferanten angegeben gezüchtet, außer wenn anders angegeben.

Expressionsclonierung

Konstruktion einer cDNA-Genbank und Herstellung von Plasmidpools

10 ug polyadenylierter mRNA wurden aus A10 Zellen mittels der Proteinase K/SDS- Methode hergestellt (Gonda et al., Molec. Cell. Biol. 2: 617-624 (1982)). Doppelsträngige cDNA wurde synthetisiert und mit nicht-palindromischen BstXI-Adaptoren verbunden, wie von Seed, B. und A. Aruffo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3365-3369 (1987) beschrieben. Die mit Adaptoren versehene cDNA wurde nach der Größe auf einem 5 bis 20% Kaliumacetatgradienten fraktioniert, und Inserts größer als 1 kb wurden mit dem Plasmidvektor pcDNA-1 ligiert und in E. coli MC1061/P3 elektroporiert, was eine primäre Genbank mit einem Titer von > 10&sup7; Rekombinanten ergab. Ein Teil der cDNA wurde als Pools von ~1 · 10&sup4; rekombinanten Bakterienkolonien, die auf 15 cm Petrischalen mit Luria- Nährlösungsagar, enthaltend 7.5 mg/ml Tetracyclin und 12.5 mg/ml Ampicillin, wuchsen, plattiert. Die Zellen wurden von den Platten in 10 ml Luria-Nährlösung abgekratzt, und Glycerolstammlösungen von vereinigten Bakterien wurden bei -70ºC gelagert. Die verbleibenden Bakterien wurden verwendet, um Plasmid-DNA mittels alkalischer Lyse- Miniprepmethode (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed. Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1939)) zu reinigen.

COS-Zell-Transfektionen und Bindungstest

Plasmidpools (jeweils ~1 · 10&sup4; Clone darstellend) wurden in COS-M6 (Subclon von COS-7 Zellen) durch DEAE-Dextran/Chloroquin-Methode, beschrieben von Seed, B. und A. Aruffo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3365-3369 (1987), transfiziert. 48 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen mit 50 pM ¹²&sup5;I-TGF-β1 (100 bis 2(10 Ci/mmol) für 4 Stunden bei 4ºC inkubiert, die autoradiographische Analyse der transfizierten Zellen wurden unter Verwendung einer NT-B2 photographischen Emulsion (Kodak), im wesentlichen wie beschrieben (Gearing, D. P. et. al., EMBO J. 8: 3667-3676 (1989)), durchgeführt. Nach Entwicklung der Objektträger wurden die Zellen luftgetrocknet und mit Mountingmedium und einem Glasdeckgläschen aufgezogen. Die Objektträger wurden unter einem Olympus OM-T1 invertierten Phasenkontrastmikroskop unter Verwendung eines Präparier- Transilluminators für Dunkelfeldbeleuchtung analysiert.

Unterteilung des positiven Pools

Von 86 abgesuchten Pools wurde ein Pool (#13) als positiv identifiziert, und eine Glycerolstammlösung von diesem Pool entsprechenden Bakterien wurde titriert, und 25 Pools von 1000 Clonen wurden hergestellt, und Miniprep-Plasmid aus diesen Pools wurde wie vorstehend beschrieben in COS-Zellen transfiziert. Mehrere positive Pools von 1000 wurden identifiziert, und einer wurde als 25 Platten von 100 Kolonien wieder plattiert. Ein Replikat wurde von dieser positiven Platte gemacht und geerntet. Wenn ein positiver Pool identifziert wurde, wurden einzelne Kolonien von der entsprechenden Mutterplatte gepickt und über Nacht in 3 ml Flüssigkultur wachsen gelassen. Ein zweidimensionales Gitter, das die 100 Clone darstellt, wurde erzeugt, und ein einzelner Clon, R3-OF, wurde isoliert.

Clonierung von R3-OFF

Eine 208F Fibroblasten-Genbank der Ratte in Lambda ZAP II (Stratagene) wurde bei hoher Stringenz mit dem Clon R3-OF-Insert abgesucht, und mehrere Clone mit ~6 kb Inserts wurden isoliert, einer davon mit der Bezeichnung R3-OFF.

DNA-Sequenzierung und Sequenzanalyse

Doppelsträngige DNA wurde mit der Didesoxykettenabbruchmethode mit Sequenase- Reagenzien (United States Biochemicals) sequenziert. Vergleich der Sequenz mit den Datenbanken wurde mit BLAST (Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)) durchgeführt.

Iodierung von TGF-β

TGF-β1 wurde mit dem Chloramin-T-Verfahren, wie beschrieben, iodiert (Cheifetz, S. und J. L. Andres, J. Biol. Chem. 263: 16984-16991 (1988)).

Chemisches Kreuzverbinden

Transfizierte COS-Zellen, gewachsen auf 10 cm Schalen, oder subkonfluente L6 oder A10 Zellen, gewachsen auf 3.5 cm Schalen, wurden mit ¹²&sup5;I-TGF-β1 in Bindungpuffer (Frebs-Ringer, gepuffert mit 20 mM Hepes, pH 7.5, 5 mM MgSO&sub4;, 0.5% BSA) inkubiert, viermal mit eiskaltem Bindungspuffer ohne BSA gewaschen und für 15 Minuten mit Bindungspuffer ohne BSA, enthaltend 60 ng/ml Disuccinimidylsuberat bei 4ºC unter konstantem Schütteln inkubiert. Kreuzverbindung wurde durch Zugabe von 7% Sucrose in Bindungspuffer beendet. Die Zellen wurden abgeschabt, gesammelt und durch Zentrifugation pelletiert, dann resuspendiert in Lysepuffer (10 mM Tris, pH 7.4, 1 mM EDTA, pH 8.0, 1% Triton-X 100, 10 ug/ml Pepstatin, 10 ug/ml Leupeptin, 10 ug/ml Antipain, 100 ug/ml Benzamidinhydrochlorid, 100 ug/ml Sojabohnen-Trypsininhibitor, 50 ug/ml Aprotinin und 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid). Solubilisiertes Material wurde durch 7% SDS-PAGE analysiert und der autoradiographischen Analyse durch Auflegen auf einen X-AR-Film (Kodak) bei -70ºC unterzogen.

Enzymatische Spaltung

Spaltung solubilisierter TGF-β-Rezeptoren mit Chondroitinase und Heparitinase wurde wie beschrieben durchgeführt (Cheifetz, S. und J. L. Andres, J. Biol. Chem. 263: 1 6984- 16991 (1988); Segarini, P. R. und S. M. Seyedin, J. Biol. Chem. 263: 8366-8370 (1988)).

Herstellung stabiler Zellinien

L6-Myoblasten wurden 1 : 10 in 10 cm Schalen geteilt und am folgenden Tag mit der Calciumphosphatmethode (Chen, C. und H. Okayama, Molec. Cell. Biol. 7: 2745-2752 (1987)) mit den Clonen R3-OF oder R3-OFF in den Vorwärts- und Rückwärtsorientierungen im Vektor pcDNA-neo (Invitrogen) transfiziert. Die Zellen wurden der Selektion in Anwesenheit von G418 (Geneticin, GIBCO) für mehrere Wochen unterzogen, bis einzelne Kolonien mit dem bloßen Auge sichtbar wurden. Diese Clone wurden isoliert und amplifiziert.

RNA-Blot-Analysen

Polyadenylierte RNA aus Rattengewebe wurde mit der Lithiumchlorid/Harnstoff- Methode (Auffrey, C. und F. Raugeon, Eur. J. Biochemistry 107: 303-313 (1980)) hergestellt, gefolgt von Oligo-dT-Cellulose-Chromatographie (Aviv und Leder, 1972). Polyadenylierte mRNA aus Zellinien wurde mit der Proteinase K/SDS-Methode (Gonda, T. J. et al., Molec. Cell. Biol. 2: 617-624 (1982)) hergestellt. Proben von mRNA wurden durch Elektorphorese auf 1% Agarose-2.2 M Formaldehydgelen aufgetrennt, auf Nylonmembranen (Biotrns, ICN) aufgetrennt und mit dem 2.9 kb Insert von Clon Re-OF, markiert mit ³²P durch zufälliges Primen als Sonde (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), inkubiert. Die Hybridisierungen wurden bei 42ºC in Hybridisierungspuffer, enthaltend 50% Formamid, über Nacht durchgeführt, und die Blots wurden bei 55ºC in 0.2 · SSC, 0.1% SDS vor der Exposition auf X-AR-Film bei -70ºC gewaschen.

Beispiel 1. Herstellung von Anti-Typ III-Rezeptorprotein-Antikörper und Mikrosequenzierung von Peptiden, die aus partieller Proteolyse von gereinigtem Typ III-Rezeptor resultieren

Anfänglich wurden zelluläre Proteoglycane aus menschlicher Placenta gereinigt und dann der enzymatischen Deglycosylierung mit Heparitinase und Chondroitinase unterzogen. Proteinkerne im Molekulargewichtsbereich von 100-130 Kilodalton wurden weiter mittels präparativer Gelelektrophorese gereinigt; diese sollten den Typ III-Rezeptor enthalten. Dieses teilweise gereinigte Material wurde als ein Immunogen in Mäusen verwendet. Nach Absuchen von 850 Hybridomalinien, die aus immunisierten Mäusen entwickelt wurden, wurde gefunden, dass drei Linien Antikörper produzieren, die eine deglycosylierte Polypeptidart von 100-120 kD spezifisch erkennen und immunpräzipitieren. Diese Art konnte durch Inkubation von ganzen Zellen mit ¹²&sup5;I-TGF-β, gefolgt von kovalentem Crosslinking radiomarkiert werden. Ihre Größe stimmt mit der des Proteinkerns, der zuvor für den Typ III- Rezeptor berichtet wurde, überein (Massague, J., Annu. Rev. Cell. Biol. 6: 597-641 (1990)).
Monoclonaler Antikörper 94 wurde verwendet, um den Typ III-Rezeptor aus Rattenleber durch Affinitätschromatographie zu reinigen. Der gereinigte Rezeptor wurde der partiellen Proteolyse unterzogen, und die resultierenden Peptide wurden mittels Hochdruckflüssigchromatographie aufgetrennt. Mehrere Peptide wurden der Mikrosequenzierung unterzogen und ergaben die folgenden Oligopeptidsequenzen:
Peptid I: ILLDPDHPPAL (SEQ ID Nr. 5)
Peptid II: QAPFPINFMIA (SEQ ID Nr. 6)
Peptid III: QPIVPSVQ (SEQ ID Nr. 7)
Peptid IV: FYVEQGYGR (SEQ ID Nr. 8)
Diese Peptidsequenzen wurden verwendet, um degenerierte Oligonucleotide herzustellen, die entweder als Primer in einer Clonierungsstrategie mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) oder als Sonden zum Absuchen von cDNA-Genbanken dienten. Während diese Strategie nicht produktiv war, erwiesen sich die Oligopeptide als nützlich zur Überprüfung der Rezeptorclone, die durch die zweite, alternative Strategie isoliert wurden (siehe Beispiel 2).

Beispiel 2. Expressionsclonierung der Typ III-Rezeptor-cDNA

Eine Expressionsclonierungsstrategie in COS-Zellen (ein Verfahren, dass einen Vorteil aus der beträchtlichen Amplifikation einzelner cDNAs in transfizierten COS-Zellen zieht) wurde als eine alternative Vorgehensweise verwendet, um TGF-β-Rezeptorclone zu isolieren. Solch eine Amplifikation wird durch das SV40 große T-Antigen vermittelt, das von den COS-Zellen exprimiert wird und mit einem SV40-Replikationsursprung im cDNA- Vektor interagiert (Gearing, D. et al., EMBO J. 8: 3667-3676 (1989); Lin, H. Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 3185-3189 (1991a); Lin, H. Y. et al., Science, im Druck (1991); Mathews, L. S. und Vale, W. W., Cell 65: 973-982 (1991)).
Die Strategie schloss die Herstellung einer cDNA-Genbank aus A10 Zellen ein, einer vaskulären glatten Muskulaturzellinie der Ratte, die alle hochaffinen TGF-β-Rezeptoren exprimiert. Die resultierenden cDNAs wurden in den Vektor pcDNA-1 eingefügt, der den transkriptionalen Promotor CMV und den SV40-Replikationsursprung trägt. Die resultierende Genbank wurde dann in Pools von jeweils 10,000 unabhängigen Rekombinanten geteilt, und DNA aus jedem Pool wurde in 1.5 · 10&sup6; COS-7 Zellen, gewachsen auf Glasschälchen, mittels DEAE-Dextran-Transfektionsverfahren transfiziert (Aruffo, A. und Seed, B., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 84: 8573-8577 (1987); Gearing, D. et al., EMBO J. 8: 3667-3676 (1989); Mathews, L. S. und Vale, W. W., Cell 65: 973-982 (1991)). Die transfizierten Zellen wurden für 48-60 Stunden wachsen gelassen und dann radiomarkiertem TGF-β1 für 4 Stunden ausgesetzt. Nach dieser Behandlung wurden die diese Zellen tragenden Glasträger intensiv gewaschen und fixiert. Diese Träger wurden in flüssige photographische Emulsion eingetaucht und mittels Dunkelfeldmikroskopie untersucht. Während alle bisher mittels dieses Verfahrens clonierten Rezeptorgene nicht nachweisbare oder niedrige stabile Mengen der Expression in COS-Zellen besitzen, wurden wir durch die Tatsache behindert, dass untransfizierte COS-Zellen schon wesentliche Mengen an Typ III TGF-β-Rezeptor exprimieren. Solche Expression, geschätzt auf etwa 2 · 10&sup5; Rezeptormoleküle pro Zelle, kann gut ein unakzeptables hohes Niveau von Hintergrundbindung erzeugt haben. Da das Nachweisverfahren jedoch die Sichtbarmachung radiomarkierter Ligandenbindung auf einzelnen Zellen beinhaltet, wurde jedoch gehofft, dass die Identifzierung gelegentlicher Zellen, die im wesentlichen höhere Mengen an Vektor-codiertem Rezeptor exprimieren, möglich sein könnte. Diese Hoffnung wurde in den anfänglichen Experimenten bestätigt.
Nach Absuchen von fast 1 Million cDNA-Clonen auf diese Weise wurde ein Glasträger, der 20 positive Transfektanten enthielt, identifiziert. Der ursprüngliche Pool der Expressionskonstrukte, von dem ein solcher Transfektant stammte, wurde in 25 Subpools von jeweils 1000 Clonen geteilt, und diese wurden einer zweiten Runde des Absuchens unterzogen. Zwei weitere Runden der sib-Selektion resultierten in der Isolierung eines cDNA- Clons (R3-OF) mit einem 2.9 kb Insert, der hohe Mengen an TGF-β-bindenden Proteinen in etwa 10% der COS-Zellen, in die er transfiziert worden war, induzierte.
Die Spezifität dieser Bindung wurde dadurch beurteilt, dass gezeigt wurde, dass die Zugabe eines 200fachen Überschusses an unmarkiertem TGF-β-Kompetitor die Bindung von ¹²&sup5;I-TGF-β an transfizierte Zellen stark verringerte. Unter Berücksichtigung einer Transfektionseffizienz von 10% und des hohen Hintergrunds endogener Rezeptorexpression berechneten wir, dass die Menge an gesamter ¹²&sup5;I-TGF-β-Bindung an jeden Glasträger von Zellen, die mit diesem cDNA-Clon (Fig. 1C) transfiziert waren, nur 2mal über der mit Kontrolltransfektanten beobachteten Menge lag (Daten nicht gezeigt). Dennoch war diese geringe Erhöhung der Ligandenbindung ausreichend, um seltene Transfektanten in einem großen Feld von Zellen, die diese Hintergrundsmenge des Rezeptors exprimierten, zu identifizieren.
Die R3-OF cDNA codierte einen offenen Leserahmen von 836 Aminosäureresten, von denen die 18 ganz 3' liegenden von Vektorsequenz codiert wurden, was klar zeigt, dass der Clon R3-OF ein unvollständiges cDNA-Insert war, das frühzeitig am Alanin 818 festlegenden Codon endete (Fig. 4). R3-OF wurde als eine Sonde verwendet, um eine Vollängen cDNA aus einer 208F Lambda-Phagen-Genbank zu isolieren. Dieser Clon, R3-OFF genannt, war 6 kb lang und codierte ein Protein von 853 Aminosäuren; seine Sequenz war colinear mit der des Clons R3-OF.

Beispiel 3. Charakterisierung des Produkts des Vollängen-Clons R3-OFF

Die Charakterisierung des Produkts des Vollängen-Clons R3-OFF wurde durchgeführt, um zu bestimmen, welchen der drei TGF-β-Rezeptoren es darstellte. Dafür wurden COS-Transfektanten mit radiomarkiertem TGF-β inkubiert, chemischer Crosslinker wurde zugegeben, und die markierten Rezeptoren wurden durch Polyacrylamid- Gelelektrophorese aufgetrennt.
Markierung von Zelloberflächen-TGF-β-Rezeptoren auf diese Weise resultierte im Nachweis der drei verschiedenen Arten auf der Oberfläche von COS-Zellen, wie intensiv von anderen untersucht (Massague, J. et al., Ann. NY. Acad. Sci. 593: 59-72 (1990)). Diese schlossen die Typ I- und II-Rezeptoren mit niedrigerem Molekulargewicht (65 und 85 kD) und das Typ III-Proteoglycan mit höherem Molekulargewicht, das als eine diffuse Bande von 280-330 kD wanderte, ein. Enzymatische Behandlung des Proteoglycans mit Chondroitinase und Heparitinase ergab ein Kernprotein von etwa 100 kD. Bindung an alle drei Rezeptortypen war spezifisch, derart, dass sie durch einen 200fachen Überschuss an unmarkiertem TGF-β1 kompetitiert wurde.
Transfektion der R3-OFF cDNA verursachte eine zweifache Erhöhung in der Expression des Typ III-Rezeptors. Wenn ein Zellysat, das aus COS-Zellen stammte, die mit dem Clon R3-OFF transfiziert waren, mit deglycosylierenden Enzymen behandelt wurde, wurde die heterogene 280-330 kD Bande in einen Proteinkern umgewandelt, der mit dem in untransfizierten A10 Zellen beobachteten Typ III-Proteinkern zusammen wanderte. Bedeutsamerweise wandert der rekombinante Proteinkern unterschiedlich vom endogenen COS-Zell-Typ III-Proteinkern.
Diese Beobachtungen wurden bestätigt und in Experimenten mit stabil transfizierten Zellen, die die R3-OFF cDNA exprimieren, ausgebaut. L6 Skelettmuskelmyoblasten der Ratte exprimieren normalerweise keine nachweisbare Typ III mRNA oder endogenen Typ III- Rezeptor (bestimmt durch radiomarkierten Ligandenbindungstest). Solche Zellen wurden mit isolierter cDNA im Vektor pcDNA-neo transfiziert. Zellclone, die diesen Clon stabil sowohl in der Hin- als auch der Rückrichtung in Bezug auf den CMV-Promotor exprimierten, wurden isoliert und im Ligandenbindungstest analysiert.
Die Einführung von entweder dem Vollängen-Clon R3-OFF oder dem partiellen Clon R3-OF in der Hinrichtung führte zu der erneuten Expression des Typ III-Rezeptors. L6- Zellen, die mit der cDNA in der Rückrichtung transfiziert waren, exprimierten dieses Protein nicht. Die offensichtliche Größe des Proteinkerns des Typ III-Rezeptors in Zellen, die mit dem R3-OF Clon transfiziert wurden, ist kleiner als die von R3-OFF transfizierten Zellen exprimiertem, was mit dem Unterschied in den Größen der Proteinkerne übereinstimmt, die von den entsprechenden Nucleinsäuresequenzen vorausgesagt wurden (Fig. 1).
Unerwarteterweise ist die Menge an radiomarkiertem Ligand, der an den Typ II- Rezeptor über Crosslinking verbunden ist, 2.5fach in Zellen erhöht, die die Typ III cDNA exprimieren, während die Menge an über Crosslinking an den Typ I-Rezeptor gebundenem unverändert blieb. Diese offensichtlich spezifische Hochregulation der Ligandenbindung an den Typ II-Rezeptor konnte mit allen bis jetzt analysierten 15 stabil transfizierten L6 Zellinien nachgewiesen werden. Dieser Effekt scheint durch den verkürzten Clon R3-OF, dem die cytoplasmatische Domäne fehlt, als auch durch den Vollängen Clon R3-OFF vermittelt zu sein.

Beispiel 4. Expression des Typ III-Rezeptors

Northern Blot-Analyse zeigte, dass die Typ III-Rezeptor mRNA als eine einzige 6 kb Message in mehreren Rattengeweben exprimiert wird. Die Menge an mRNA-Expression in der Leber war geringer als in anderen Geweben, ein Ergebnis, das aus früheren Studien verschiedener Gewebe unter Verwendung von radiomarkiertem TGF-β1 erwartet wurde.
Basierend auf dieser Information scheint es, dass Clon R3-OFF mit einem ~6 kb cDNA-Insert einen Vollängen Typ III cDNA-Clon der Ratte darstellt.
Zellen aus Maus (MEL und YH16) scheinen eine kleinere (~5.5 kb) Message für die Typ III mRNA als solche des Schweins, der Ratte und des Menschen zu exprimieren. In allen diesen Zellen stimmt die Expression oder Abwesenheit der Typ III mRNA mit der Expression oder Abwesenheit nachweisbarer Zelloberflächen-Typ III-Rezeptor überein, mit der bemerkenswerten Ausnahme der Retinoblastoma-Zellinien (Y79, Weri-1, Weri-24 und Weri- 27). Es ist zuvor gezeigt worden, dass diese Zellen keine nachweisbare Oberflächenexpression von Typ III-Rezeptor besitzen, ein Ergebnis, das durch unsere eigene nicht veröffentlichte Arbeit bestätigt wird. Es ist bemerkenswert, dass die Typ III-Rezeptor mRNA in diesen Zellen in einer vergleichbaren Menge mit der anderer Zellen, die in der Tat Typ III-Rezeptorproteine in leicht nachweisbaren Mengen exprimieren, exprimiert wird. In diesem Augenblick können wir nur schließen, dass die TGF-β-Rezeptor III-Expression, die in normalen Retinoblasten (AD12) substantiell ist, in diesen Retinoblastomatumorzellen herunterreguliert wurde, vielleicht durch posttranskriptionale Mechanismen.

Beispiel 5. Sequenzanalyse der Vollängen Typ III cDNA

Der Vollängen cDNA-Clon (R3-OFF), beschrieben in Beispiel 4, wurde der Sequenzanalyse unterzogen. Der volle Leserahmen zusammen mit den flankierenden Sequenzen ist in Fig. 1 dargestellt. Dieser Leserahmen codiert ein Protein von 853 Aminosäureresten, das mit dem für den beobachteten vollständig deglycosylierten TGF-β Typ III-Rezeptor 100 kD vereinbar ist.
Zwei Abschnitte der abgeleiteten Proteinsequenz (unterstrichen und kursiv, Reste 378- 388 und 427-434) stimmen genau mit den früher aus direkter biochemischer Analyse des gereinigten Rezeptorproteins bestimmten überein. Das versicherte weiter die Identität dieses isolierten cDNA-Clons als den den Typ III-Rezeptor der Ratte codierenden.
Dieses TGF-β-Bindungsprotein besitzt eine ungewöhnliche Struktur für einen Cytokin-Rezeptor. Hydropathieanalyse zeigt eine N-terminale Signalsequenz, gefolgt von einem langen, hydrophilen N-terminalen Bereich (Kyte, J. und R. F. Doolittle, J. Mol. Biol. 157: 105-132 (1982)). Ein Bereich mit 27 Resten starker Hydrophibizität (unterstrichen, Reste. 786-812) gegen den C-Terminus stellt die einzelne mögliche Transmembrandomäne dar. Das legt nahe, dass fast der ganze Rezeptor aus einer N-terminalen extrazellulären Domäne besteht, die in der Plasmamembran nahe seines C-Terminus verankert ist. Ein relativ kurzer C-terminaler Schwanz von 41 Resten stellt die mögliche cytoplasmatische Domäne dar.
Der Clon R3-OF wurde auch analysiert und er wurde als eine verkürzte Version von R3-OFF identifiziert, mit einem identischen offenen Leserahmen, aber dessen letzter codierter Rest Alanin 818 ist (Fig. 1).
In R3-OFF gibt es 6 Consensus N-gebundene Glycosylierungsstellen und 15 Cysteine (angezeigt in Fig. 1). Es gibt mindestens eine Consensus Glycosaminoglycananheftungsstelle an Serin 535 (Bernfield, M. und K. C. Hooper, Ann. N.Y. Acad. Sci im Druck (1991)) und mehrere Ser-Gly-Reste, die mögliche Stellen für die GAG-Verknüpfung sind. Eine Consensus Proteinkinase C ist auch an Rest 817 vorhanden.
Nur ein anderes bis jetzt beschriebenes Gen, ein Glycoprotein, das in hohen Mengen von endothelialen Zellen exprimiert und Endoglin genannt wird (Gougos und Letarte, 1990), enthält eine verwandte Aminosäuresequenz. Insgesamt gibt es ~30% Identität mit dem Typ III-Rezeptor über die ganze Länge der 645 Aminosäurereste von Endoglin. Die am meisten homologen Bereiche zwischen den Sequenzen des Typ III-Rezeptors und Endoglin (74% Identität) fallen zuerst in die mögliche Transmembran- und cytoplasmatische Domänen. Ähnlich zu der gesamten Struktur von Typ III-Rezeptor ist Endoglin ein Glycoprotein, das eine große hydrophile und vermutlich extrazelluläre N-terminale Domäne, gefolgt von einer möglichen Transmembrandomäne und einem kurzen cytoplasmatischen Schwanz von 47 Aminosäureresten, enthält. Die biologische Rolle von Endoglin ist unklar, obwohl es vorgeschlagen wurde, dass sie Zell-Zell-Erkennung über Interaktionen einer "RGD"-Sequenz auf seiner Ectodomäne mit anderen Adhäsionsmolekülen einschließt. Anders als der TGF-β Typ III-Rezeptor trägt Endoglin keine GAG-Gruppen.

Claims

1. Isolierte DNA, die einen von einem Vertebraten abstammenden TGF-β- Rezeptor des Typs III codiert, wobei die DNA ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

(a) einer DNA, die die Nucleotidsequenz aus Fig. 1 umfasst;

(b) einer DNA, die die Nucleotidsequenz der in dem Plasmid enthaltenen cDNA umfasst, das unter der ATCC-Hinterlegungsnummer 75127 hinterlegt ist;

(c) einer DNA, die einen Teil der Nucleotidsequenz der DNA aus (a) oder (b) umfasst, der eine Aminosäuresequenz codiert, die ausreicht, um die TGF- β-Bindungsfähigkeit zu erhalten;

(d) einer DNA, die einen Teil der Nucleotidsequenz von (a) oder (b) umfasst und einen löslichen TGF-β-Rezeptor des Typs III codiert;

(e) einer DNA, die eine Aminosäuresequenz codiert, die in Fig. 1 dargestellt ist oder durch die in dem Plasmid enthaltene cDNA codiert wird, das unter der ATCC-Hinterlegungsnummer 75127 hinterlegt ist;

(f) einer DNA, die einen Teil der in Fig. 1 dargestellten Aminosäuresequenz codiert oder einen Teil der Aminosäuresequenz codiert, die durch die in dem Plasmid enthaltene cDNA codiert wird, das unter der ATCC- Hinterlegungsnummer 75127 hinterlegt ist, wobei der Teil ausreicht, um die TGF-β-Bindungsfähigkeit zu erhalten;

(g) einer DNA, die einen Teil der Aminosäuresequenz codiert, die in Fig. 1 dargestellt ist oder durch die in dem Plasmid Enthaltene cDNA codiert wird, das unter der ATCC-Hinterlegungsnummer 75127 hinterlegt ist, und die einen löslichen TGF-β-Rezeptor des Typs III codiert;

(h) einer DNA, die die Sequenz der in dem Plasmid enthaltenen cDNA besitzt, das unter der ATCC-Hinterlegungsnummer 75127 hinterlegt ist; und

(i) einer DNA, die unter stringenten Bedingungen mit der in dem Plasmid enthaltenen cDNA hybridisiert, das unter der ATCC-Hinterlegungsnummer 75127 hinterlegt ist, und die einen TGF-β-Rezeptor des Typs III, einen Teil davon, der die TGF-β-Bindungsfähigkeit erhält, oder einen löslichen TGF- β-Rezeptor des Typs III codiert.

2. DNA nach Anspruch 1, die von einem Säuger stammt.

3. DNA nach Anspruch 1 oder 2, die eine menschliche oder murine DNA ist.

4. Wirtszelle, die die DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 3 umfasst.

5. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, das durch die DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 3 codiert wird, umfassend das Züchten der Wirtszelle nach Anspruch 4 und Isolieren des hergestellten Polypeptids.

6. Isoliertes Polypeptid, das durch eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3 codiert oder durch das Verfahren nach Anspruch 5 hergestellt wird.

7. Antikörper, der spezifisch ein Polypeptid nach Anspruch 6 erkennt.

8. Arzneimittel, umfassend eine DNA nach den Ansprüchen 1 bis 3, ein Polypeptid nach Anspruch 6 oder einen Antikörper nach Anspruch 7.

9. Verwendung einer DNA nach den Ansprüchen 1 bis 3 oder eines Polypeptids nach Anspruch 6 für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Entzündungen, zur Erhöhung der Osteoblastenaktivität, zur Kontrolle der Proliferation von Drüsenzellen der Prostata, zur Änderung der Antwort des Immunsystems, zur Modifikation von durch das Immunsystem vermittelten Erkrankungen, zur Behandlung einer systemischen Knochenerkrankung, zur Behandlung von Zuständen, in denen eine Verbesserung des Knochenwachstums notwendig ist, zur Kontrolle des Wachstums und der Metastasierung von Krebszellen, zur Gewebewiederherstellung, oder zur Behandlung von fibrotischen Erkrankungen.

10. Verwendung des Antikörpers nach Anspruch 7 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer fibrotischen Erkrankung.

11. Verwendung nach Anspruch 9 oder 10, wobei die fibrotische Erkrankung eine Erkrankung der Haut, der Niere oder der Lunge ist.

12. In-vitro-Verfahren zur Änderung der Empfänglichkeit von Zellen für TGF-β oder zur Beeinflussung der Bindung von TGF-β an seinen Rezeptor unter Verwendung einer DNA nach den Ansprüchen 1 bis 3, eines Polypeptids nach Anspruch 6 oder eines Antikörpers nach Anspruch 7.

13. In-vitro-Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Beeinflussung das Blockieren oder Hemmen der TGF-β-Aktivität zur Folge hat.

14. Verfahren zur Messung der Fähigkeit einer Verbindung, die TGF-β-Bindung an den TGF-β-Rezeptor des Typs III zu beeinflussen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

(a) Kombinieren von:

(1) Säugerzellen, die die DNA nach den Ansprüchen 1 bis 3 oder ein Polypeptid nach Anspruch 6 exprimieren;

(2) markiertem TGF-β; und

(3) einer zu messenden Verbindung;

(b) Halten des Produkts von (a) unter Bedingungen, die ausreichen, dass das TGF-β an den TGF-β-Rezeptor bindet;

(c) Bestimmen des Ausmaßes der Bindung von TGF-β an TGF-β-Rezeptoren in Anwesenheit der zu messenden Verbindung; und

(d) Vergleichen der in (c) durchgeführten Bestimmung mit dem Ausmaß, zu dem die Bindung von TGF-β an den TGF-β-Rezeptor in Abwesenheit der zu messenden Verbindung auftritt;

wobei, wenn die Bindung von TGF-β an den TGF-β-Rezeptor in Anwesenheit der zu messenden Verbindung in einem geringeren Ausmaß auftritt als in Abwesenheit der zu messenden Verbindung, die zu messende Verbindung die TGF-β-Bindung an TGF-β-Rezeptoren beeinflusst.