DE69736109T2

DE69736109T2 - Differenzierungsinhibitor

Info

Publication number: DE69736109T2
Application number: DE69736109T
Authority: DE
Inventors: Seiji Fuji-shi SAKANO; Akira Fuji-shi ITOH
Original assignee: Asahi Kasei Corp; Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Asahi Kasei Corp; Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1996-07-16
Filing date: 1997-07-11
Publication date: 2007-01-04
Anticipated expiration: 2017-07-12
Also published as: US20020049306A1; WO1998002458A1; US7138276B2; EP0913404A1; EP0913404A4; DE69736109D1; US20030032781A1; EP0913404B1; US6291210B1; CA2260365A1; JP3922726B2; US6638741B2; US20030022368A1; AU3459897A; CA2260365C; AU720930B2

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft eine neue bioaktive Substanz, welche die Differenzierung undifferenzierter Zellen unterdrückt.
Stand der Technik
Menschliches Blut und Lymphe enthalten verschiedene Typen von Zellen, und jede Zelle spielt wichtige Rollen. Zum Beispiel tragen die Erythrocyten Sauerstoff; die Plättchen besitzen eine hämostatische Wirkung; und die Lymphocyten verhindern eine Infektion. Diese verschiedenen Zellen stammen aus den hämatopoetischen Stammzellen im Knochenmark. Es wurde kürzlich aufgeklärt, dass die hämatopoetischen Stammzellen zu verschiedenen Blutzellen, Osteoklasten und Mastzellen, durch Stimulation mittels verschiedener Cytokine in vivo und durch Umweltfaktoren differenziert werden. Es wurde bei den Cytokinen gefunden, dass zum Beispiel Erythropoietin (EPO) für die Differenzierung zu Erythrocyten wirksam ist; dass der Granolocyten Kolonie stimulierende Faktor (granulocyte colony stimulating factor, G-CSF) für die Differenzierung zu Leukocyten wirksam ist; und dass der Plättchenwachstumsfaktor (platelet producing factor, Mpl-Ligand) für die Differenzierung zu Megakaryocyten wirksam ist, welche eine plättchenproduzierende Zelle ist, und die beiden ersten wurden bereits klinisch angewendet.
Die undifferenzierten Blutzellen werden im Allgemeinen in zwei Gruppen eingeteilt, die aus Blutvorläuferzellen, welche dazu bestimmt sind, zu spezifischen Reihen von Blutzellen zu differenzieren, und aus hämatopoetischen Stammzellen bestehen, welche eine Fähigkeit aufweisen, zu allen Reihen zu differenzieren, und die eine selbstreplizierende Aktivität aufweisen. Die Blutvorläuferzellen können durch verschiedene Kolonie-Assays identifiziert werden, jedoch wurde ein Verfahren zur Identifikation hämatopoetischer Stammzellen bisher nicht etabliert. Es wurde berichtet, dass der Stammzellenfaktor (SCF), Interleu kin-3 (IL-3), der Granulocyten-Makrophage Kolonie stimulierende Faktor (granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF), Interleukin-6 (IL-6), Interleukin-1 (IL-1), der Granulocyten-Kolonie stimulierende Faktor (G-CSF) und Onkostatin M bei diesen Zellen die Zelldifferenzierung und Proliferation stimulieren.
Versuche zur Vermehrung hämatopoetischer Stammzellen in vitro wurden untersucht, um die Transplantation von Knochenmark durch eine Therapie der Transplantation unter Anwendung hämatopoetischer Stammzellen oder durch eine Gentherapie zu ersetzen. Wenn jedoch hämatopoetische Stammzellen in Gegenwart der vorstehend erwähnten Cytokine kultiviert werden, verschwinden die Aktivitäten der Multidifferenzierung und die Aktivitäten der Selbstreplikation, welche ursprünglich bei den hämatopoetischen Stammzellen vorhanden waren, nach und nach, und sie verändern sich zu Blutvorläuferzellen, welche nach 5 Wochen der Kultivierung lediglich zu spezifischen Reihen differenzieren, und die multidifferenzierende Aktivität, welche eine der spezifischen Eigenschaften der hämatopoetischen Stammzellen ist, geht verloren (Wagner et al., Blood 86, 512–523, 1995).
Für die Proliferation der Blutvorläuferzellen ist ein einzelnes Cytokin nicht ausreichend, um sie zu bewirken, jedoch ist eine synergistische Wirkung mehrerer Cytokine von Bedeutung. Um die hämatopoetischen Stammzellen unter Aufrechterhaltung von spezifischen Eigenschaften der hämatopoetischen Stammzellen zu proliferieren, ist es infolge dessen nötig, Cytokine zuzugeben, welche die Differenzierung unterdrücken, zusammen mit denjenigen Cytokinen, welche die undifferenzierten Blutzellen proliferieren und differenzieren. Im Allgemeinen sind viele Cytokine bekannt, welche die Proliferation oder Differenzierung von Zellen stimulieren, jedoch ist eine geringe Zahl von Cytokinen bekannt, welche die Zelldifferenzierung unterdrücken. Zum Beispiel besitzt der Leukämie inhibierende Faktor (leukemia inhibitory factor, LIF) eine Wirkung auf die Proliferation von embryonalen Stammzellen der Maus ohne Diffe renzierung, er besitzt jedoch keine Wirkung gegenüber hämatopoetischen Stammzellen oder Blutvorläuferzellen. Der Transformations-Wachstumsfaktor (TGF-β) besitzt eine unterdrückende Wirkung bezüglich der Proliferation gegenüber verschiedenen Zellen, er besitzt jedoch keine spezifischen Wirkungen gegenüber den hämatopoetischen Stammzellen oder Blutvorläuferzellen.
Man glaubt, dass nicht nur Blutzellen, sondern auch undifferenzierte Zellen, insbesondere Stammzellen an der Geweberegeneration beteiligt sind. Diese Regeneration von Geweben und die Proliferation undifferenzierter Zellen in jedem Gewebe kann auf verschiedene Weise angewendet werden, indem auf die bekannten Referenzen Bezug genommen wird (Katsutoshi Yoshizato, Regeneration – A mechanism of regeneration, 1996, Yodosha Publ. Co.).
Notch ist ein Membranprotein vom Rezeptor-Typ, welches an der Regulation der Differenzierung von Nervenzellen beteiligt ist, die in Drosophila gefunden wird. Homologe von Notch werden in verschiedenen Arten von Tieren gefunden, die sich auf die Invertebraten und Vertebraten, einschließlich Nematoden (Lin-12), Xenopus laevis (Xotch), Maus (Motch) oder Mensch (TAN-1) erstrecken.
Die Liganden von Notch in Drosophila sind bekannt. Diese sind Drosophila Delta (Delta) und Drosophila Serrate (Serrate). Homologe des Notch-Liganden werden in verschiedenen Arten von Tieren gefunden, soweit sie ähnlich zum Notch-Rezeptor sind (Artavanis-Tsakonas et al., Science 268, 225–232, 1995).
Ein Homologes des humanen Notch, TAN-1, wird in großem Umfang in den Geweben in vivo gefunden (Ellisen et al., Cell 66, 649–661, 1991). Zwei Moleküle von Notch-Analogen, die von TAN-1 verschieden sind, wurden beschrieben (Artavanis-Tsakonas et al., Science 268, 225–232, 1995). Die Expression von TAN-1 wurde in CD34-positiven Zellen in Blutzellen durch PCR (Polymerase-Kettenreaktion) beobachtet (Milner et al., Blood 83, 2057–2062, 1994). In Bezug auf Menschen wurde jedoch die Genklonierung von humanem Delta und humanem Serrate, welche man für den Notch-Liganden hält, nicht beschrieben.
In Notch aus Drosophila wurde die Bindung mit dem Liganden studiert und in Einzelheiten untersucht, und es wurde gefunden, dass das Notch an den Liganden gebunden werden kann mit Ca⁺⁺ im bindenden Bereich, der eine wiederholte Aminosäuresequenz Nr. 11 und Nr. 12 in der Wiederholung derjenigen Aminosäuresequenz darstellt, die in ihrer Art der Wiederholung dem epidermalen Wachstumsfaktor (Epidermal Growth Factor, EGF) ähnlich ist (Fehon et al., Cell 61, 523–534, 1990; Rebay et al., Cell 67, 687–699, 1991 und ungeprüfte, veröffentlichte, japanische PCT-Anmeldung 7-503123). EGF-ähnliche Sequenzwiederholungen sind in Notch-Homologen und anderen Spezies konserviert. Infolge dessen wird derselbe Mechanismus bei der Bindung mit dem Liganden vermutet.
Eine Aminosäuresequenz, die DSL (Delta-Serrate-Lag-2) genannt wird und sich in der Nähe des Aminosäureendes befindet, und eine EGF-ähnliche, wiederholte Sequenz, wie sie im Rezeptor auftritt, sind in dem Liganden konserviert (Artavanis-Tsakonas et al., Science 268, 225–232, 1995). Eine EGF-ähnliche Sequenz wurde in Thrombomodulin (Jackman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8834–8838, 1986), dem Rezeptor für Lipoprotein niedriger Dichte (low density lipoprotein, LDL) (Russell et al., Cell 37, 577–585, 1984) und dem Blutkoagulationsfaktor (Furie et al., Cell 53, 505–518, 1988) gefunden, und man glaubt, dass sie wichtige Rollen bei der extrazellulären Koagulation und Adhäsion spielen.
Die Homologen der Vertebraten des klonierten Delta von Drosophila wurden im Huhn (C-Delta-1) und Xenopus laevis (X-Delta-1) gefunden, und es wurde berichtet, dass X-Delta-1 via Xotch auf die Erzeugung von Protoneuronen gewirkt hat (Henrique et al., Nature 375, 787–790, 1995 und Chitnis et al., Nature 375, 761–766, 1995).
Ein Homologes aus Vertebraten von Serrate aus Drosophila wurde in Ratten gefunden, wie zum Beispiel Jagged aus Ratten (Jagged) (Lindsell et al., Cell 80, 909–917, 1995). Nach Lindsell et al. wird mRNA von Jagged aus Ratten im Rückenmark von fötalen Ratten nachgewiesen. Als ein Ergebnis der Kokultur einer Myoblasten-Zelllinie, die dazu veranlasst wird, Notch aus Ratten im Überschuss zu exprimieren, mit einer Zelllinie zur Expression von Jagged aus Ratten wird die Unterdrückung der Differenzierung der Myoblasten-Zelllinie gefunden. Jedoch besitzt das Jagged aus Ratten keine Wirkung gegenüber der Myoblasten-Zelllinie ohne erzwungene Expression des Notch aus Ratten.
In Anbetracht der vorstehenden Berichte können Notch und sein Ligand an der Regulation der Differenzierung von Nervenzellen beteiligt sein, jedoch sind ihre Wirkungen gegenüber Zellen, einschließlich Blutzellen, insbesondere Primärzellen, ausgenommen manche Myoblastenzellen, unbekannt.
Probleme, die durch die Erfindung gelöst werden
Was undifferenzierte Zellen betrifft, ist die Proliferation zur Aufrechterhaltung ihrer Spezifitäten, wie vorstehend erwähnt, nicht etabliert. Die wesentlichen Gründe liegen darin, dass nicht genug Faktoren gefunden wurden, welche die Differenzierung von undifferenzierten Zellen unterdrücken. Das Problem der vorliegenden Erfindung liegt darin, eine Verbindung bereitzustellen, die von neuen Faktoren abstammt, welche die Differenzierung von undifferenzierten Zellen unterdrücken kann.
Mittel zur Lösung der Probleme
Wir haben eine Hypothese aufgestellt, dass Notch und sein Ligand eine Wirkung der differenzierenden Regulation nicht nur für neurogene Zellen, sondern auch für verschiedene undiffe renzierte Zellen aufweist. Im Falle einer klinischen Anwendung am Menschen weisen bisher bekannte Notch-Liganden aus unterschiedlichen Spezies, wie zum Beispiel vom Typ Huhn oder vom Typ Xenopus laevis, jedoch Probleme mit Spezies-Spezifitäten und Antigenizitäten auf. Infolge dessen ist es dringend erforderlich, einen bisher unbekannten, menschlichen Notch-Liganden zu erhalten. Wir hatten eine Idee, dass Liganden des humanen Notch (TAN-1, etc.), welches ein humanes Delta-Homologes (nachfolgend als humanes Delta bezeichnet) bzw. ein humanes Serrate-Homologes (nachfolgend als humanes Serrate bezeichnet) ist, gefunden werden können. Wir hatten ebenfalls eine Idee, dass diese Befunde ein Kandidat für ein Arzneimittel sein können, die für die differentielle Regulation von undifferenzierten Zellen nützlich sind. Und wir haben versucht, dasselbe herauszufinden.
Um humane Notch-Liganden zu finden, haben wir diejenigen Aminosäuresequenzen analysiert, welche in Tieren, die vom Menschen verschieden sind, konserviert sind, und haben versucht, durch PCR unter Verwendung gemischter Primer für die entsprechende DNA-Sequenz Gene zu finden. Als ein Ergebnis ausführlicher Studien waren wir bei der Isolierung von cDNAs erfolgreich, die für Aminosäuresequenzen von zwei neuen Molekülen, neues humanes Delta-1 und neues humanes Serrate-1, codieren, und haben die Expressionssysteme für das Protein mit verschiedenen Formen unter Verwendung dieser cDNAs hergestellt. Wir haben ebenfalls ein Reinigungsverfahren für die Proteine etabliert, welche gereinigt und isoliert wurden, und bereits eine Patentanmeldung (Internationale Veröffentlichung WO 97/19172) getätigt.
Darüber hinaus haben wir versucht, analoge Moleküle zu Delta und Serrate von Drosophila aus verschiedenen Vertebraten zu finden, die von humanem Delta und humanem Serrate (nachfolgend als humanes Delta-1 bzw. humanes Serrate-1 bezeichnet) verschieden sind, und die in der vorstehenden Patentanmeldung genannt sind.
Wir haben versucht, in der Datenbank für genetische Sequenzen zu suchen. Auf der Grundlage der genetischen Sequenz für humanes Serrate-1 (Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 5), welche zuerst von uns gefunden wurde, haben wir eine bestimmte Zahl von Genfragmenten (Länge von 200–350 bp) mit hoher Homologie für einen EST (Expressed Sequence Tag) gefunden, der eine Datenbank von Genfragmenten willkürlicher humaner cDNA-Sequenzen in der Gensequenz-Datenbank GenBank darstellt, indem die Recherchen-Software für Gensequenzen Genetyx/CD (Software Development Co.) verwendet wurde.
Diese Genfragmente von kurzer Länge wurden durch PCR kloniert, und diese Genfragmente wurden als Sonden verwendet, um die Klonierung von Genfragmenten mit größerer Länge aus humanen fötalen cDNA-Bibliotheken zu versuchen. Die somit isolierten längeren Genfragmente, deren Gensequenzen bestimmt wurden, wurden erneut mit der Gensequenz des humanen Serrate-1 verglichen. Als ein Ergebnis wurde ein Gen identifiziert, das eine verhältnismäßig hohe Homologie mit dem humanen Serrate-1 aufweist, und es wurde als humanes Serrate-2 bezeichnet. Das Serrate-2-Gen mit vollständiger Länge wurde erfolgreich isoliert.
Darüber hinaus wurden Expressionsvektoren dieses klonierten Serrate-2 konstruiert. Es wurden Reinigungsverfahren für diese Proteine ausgearbeitet, und dieses Protein wurde gereinigt und isoliert. Antikörper gegen das humane Serrate-2 wurden hergestellt, indem die Antigene des humanen Serrate-2 verwendet wurden, und ein Reinigungsverfahren für diese Antikörper wurde ausgearbeitet, und anschließend wurden die Wirkungen gegenüber undifferenzierten Blutzellen bestätigt. Die vorliegende Erfindung wurde dementsprechend vervollständigt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Polypeptid, welches die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 1, 2 oder 3 der Sequenzliste umfasst, und das Polypeptid, welches eine die Differenzierung unterdrückende Wirkung gegenüber undifferenzierten Zellen auf weist. Darüber hinaus betrifft sie das Polypeptid, wobei die undifferenzierten Zellen undifferenzierte Zellen mit Ausnahme der Zellen des Gehirns, des Nervensystems oder des Muskelsystems sind, und das Polypeptid, wobei die undifferenzierten Zellen undifferenzierte Blutzellen sind. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls das Polypeptid mit einer das Wachstum hemmenden Wirkung gegenüber endothelialen Gefäßzellen, eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche diese Polypeptide enthält, ein Zellkulturmedium, welches diese Polypeptide enthält, und das Zellkulturmedium zur Kultivierung undifferenzierter Blutzellen.
Die vorliegende Erfindung betrifft in näheren Einzelheiten eine DNA, welche für ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 1, 2 oder 3 der Sequenzliste umfasst, die DNA mit der DNA-Sequenz 90–731, die DNA-Sequenz 90–3254, oder die DNA-Sequenz 90–3725 der SEQ ID Nr. 4 der Sequenzliste. Die vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus eine rekombinante DNA, welche eine DNA umfasst, die für ein Polypeptid codiert, welches die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 1, 2 oder 3 umfasst, und welche DNA mit einer Vektor-DNA verbunden ist, die in einer Wirtszelle exprimiert werden kann, und eine Zelle, welche die rekombinante DNA umfasst und/oder eine Zelle, welche mit der rekombinanten DNA transformiert wurde.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids durch kultivierte Zellen, und die Isolierung der dadurch hergestellten Verbindungen, sowie einen Antikörper, welcher spezifisch das Polypeptid erkennt, das die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 1, 2 oder 3 der Sequenzliste aufweist.
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend in Einzelheiten erläutert.
Die Herstellung der cDNA, welche für die Genmanipulation notwendig ist, die Analyse der Expression durch einen Northern-Blot, das Screening durch Hybridisierung, die Herstellung der rekombinanten DNA, die Bestimmung der DNA-Basensequenz und die Herstellung der cDNA-Bibliothek, welche alle eine Reihe molekularbiologischer Experimente darstellen, können gemäß einer Beschreibung eines herkömmlichen Handbuchs für Experimente durchgeführt werden. Das vorstehende herkömmliche Handbuch für Experimente ist zum Beispiel Maniatis et al., Ed. Molecular Cloning, A laboratory manual, 1989, Eds., Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Eine neue Verbindung der vorliegenden Erfindung weist zumindest Polypeptide der SEQ ID Nr. 1–3 der Sequenzliste auf. Mutanten und Allele, welche natürlicherweise in der Natur auftreten, sind von dem Polypeptid der vorliegenden Erfindung umfasst, sofern die Polypeptide der SEQ ID Nr. 1, 2 oder 3 der Sequenzliste ihre Eigenschaften nicht verlieren. Die Modifikation und Substitution von Aminosäuren wird in Einzelheiten in der Patentveröffentlichung beschrieben, die im Namen von Benntt et al. (nationale, ungeprüfte Veröffentlichung WO 96/2645) angemeldet wurde, und sie können entsprechend dieser Beschreibung durchgeführt werden. Ein modifiziertes Polypeptid in der vorliegenden Erfindung bezeichnet das modifizierte Polypeptid, das durch diesen Aminosäureaustausch hergestellt wurde, und es wird als eine Aminosäuresequenz definiert, die eine Identität von mehr als 90% in ihrer Aminosäuresequenz aufweist.
Eine DNA-Sequenz, welche für Polypeptide der SEQ ID Nr. 1–3 der Sequenzliste codiert, ist in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 4 gezeigt, sowie ihre Aminosäuresequenz. In diesen DNA-Sequenzen können natürlicherweise isolierte, chromosomale DNA oder cDNA derselben die Möglichkeit aufweisen, in der DNA-Basensequenz infolge der Degeneration des genetischen Codes ohne eine Veränderung der Aminosäuresequenz, welche durch die DNA codiert wird, zu mutieren, auch wenn eine Mutation auf der Ebene der Aminosäure nicht erzeugt wird. Ein 5'-untranslatierter Bereich und ein 3'-untranslatierter Bereich sind nicht an der Bestimmung der Aminosäuresequenz des Polypeptids beteiligt, so dass DNA-Sequenzen aus diesen Bereichen leicht mutiert werden. Die Basensequenz, welche durch diese Degeneration des genetischen Codes erhalten wird, ist von der DNA der vorliegenden Erfindung umfasst.
Undifferenzierte Zellen in der vorliegenden Erfindung werden als Zellen definiert, welche durch eine spezifische Stimulation wachsen können, und als Zellen, welche zu Zellen mit spezifischen Funktionen als eine Folge der spezifischen Stimulationen differenziert werden können. Diese umfassen undifferenzierte Zellen des Gehirns und des Nervensystems, undifferenzierte Zellen des Muskelsystems und undifferenzierte Zellen von Blutzellen. Diese Zellen umfassen diejenigen Zellen mit einer Aktivität zur Selbstreplikation, welche Stammzellen genannt werden, und die Zelle, welche eine Fähigkeit besitzt, die Zellen dieser Linien zu erzeugen. Eine die Differenzierung unterdrückende Wirkung bezeichnet eine unterdrückende Wirkung in Bezug auf die autonome oder heteronome Differenzierung von undifferenzierten Zellen, und bezeichnet eine Wirkung zur Aufrechterhaltung des undifferenzierten Zustands. Die undifferenzierten Zellen des Gehirns und des Nervensystems können als diejenigen Zellen definiert werden, welche eine Fähigkeit besitzen, zu Zellen des Gehirns und des Nervensystems mit spezifischen Funktionen durch spezifische Stimulation zu differenzieren. Die undifferenzierten Zellen des Muskelsystems können als diejenigen Zellen definiert werden, welche die Fähigkeit aufweisen, zu Muskelzellen mit spezifischen Funktionen durch spezifische Stimulation zu differenzieren. Die undifferenzierten Zellen des Blutes in der vorliegenden Erfindung können als diejenige Gruppe von Zellen definiert werden, welche aus den Blutvorläuferzellen bestehen, die zu spezifischen Reihen von Blutzellen differenziert werden, welche mit einem Blutkolonie-Assay identifiziert werden, und als hämatopoetische Stammzel len, welche zu jeder Reihe differenzieren können und eine selbstreplizierende Aktivität aufweisen.
In der Sequenzliste stellt die Aminosäuresequenz in SEQ ID Nr. 1 eine Sequenz des aktiven Zentrums des humanen Serrate-2 der vorliegenden Erfindung dar, der das Signalpeptid fehlt, und sie entspricht den Aminosäuren Nr. 1 bis 217 der SEQ ID Nr. 3 der Aminosäuresequenz des reifen humanen Serrate-2 mit vollständiger Länge der vorliegenden Erfindung. Die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 2 stellt die Aminosäuresequenz der extrazellulären Domäne des humanen Serrate-2 der vorliegenden Erfindung dar, der das Signalpeptid fehlt, und sie entspricht den Aminosäuren Nr. 1 bis 1058 der SEQ ID Nr. 3 der Aminosäuresequenz des reifen humanen Serrate-2 mit vollständiger Länge der vorliegenden Erfindung. Die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 3 stellt die Aminosäuresequenz des reifen humanen Serrate-2 mit vollständiger Länge der vorliegenden Erfindung dar. Die Sequenz der SEQ ID Nr. 4 ist die gesamte Aminosäuresequenz des humanen Serrate-2 der vorliegenden Erfindung und der cDNA, welche für dieses codiert. Die Sequenz der SEQ ID Nr. 5 ist die gesamte Aminosäuresequenz des humanen Serrate-1, welches in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, und der cDNA, welche für dieses codiert.
Die linken und rechten Enden der Aminosäuresequenzen in der Sequenzliste weisen auf den Amino-Terminus (nachfolgend als N-Terminus bezeichnet) bzw. den Carboxyl-Terminus (nachfolgend als C-Terminus bezeichnet) hin, und die linken und rechten Enden der Nukleotidsequenzen sind der 5'-Terminus bzw. 3'-Terminus.
Die Klonierung des Gens für den humanen Notch-Liganden kann durch das folgende Verfahren durchgeführt werden. Während der Evolution der Organismen wurde ein Teil der Aminosäuresequenzen des humanen Notch-Liganden konserviert. Die DNA-Sequenzen, welche der konservierten Aminosäuresequenz entsprechen, werden konzipiert und als Primer für eine RT-PCR (Polymerase-Ketten reaktion mit reverser Transkription) verwendet; anschließend wird ein PCR-Templat von humanem Ursprung durch PCR-Reaktion vervielfältigt, und dadurch können Fragmente des humanen Notch-Liganden erhalten werden. Darüber hinaus wird ein RT-PCR-Primer durch Verwendung der Information über eine bekannte DNA-Sequenz für Homologe des Notch-Liganden aus anderen Organismen, die vom Menschen verschieden sind, hergestellt, und die bekannten Genfragmente können möglicherweise aus einem PCR-Templat dieser Organismen erhalten werden.
Um eine PCR zur Gewinnung von Fragmenten des humanen Notch-Liganden durchzuführen, wird eine PCR für eine DSL-Sequenz in Betracht gezogen, jedoch kann eine große Zahl von Kombinationsmöglichkeiten für eine DNA-Sequenz, welche einer in diesem Bereich konservierten Aminosäuresequenz entspricht, erwartet werden, und die Konzeption einer PCR ist schwierig. Als ein Ergebnis muss eine PCR einer EGF-ähnlichen Sequenz ausgewählt werden. Da eine EGF-ähnliche Sequenz in einer großen Zahl von Molekülen konserviert ist, ist die Gewinnung von Fragmenten und die Identifikation äußerst schwierig, wie vorstehend erklärt. Wir haben etwa 50 PCR-Primersätze konzipiert und hergestellt, zum Beispiel den Primersatz, der in Referenzbeispiel 1 gezeigten Sequenz; die PCR wurde mit diesen Primersätzen unter Verwendung des PCR-Templats einer cDNA durchgeführt, die aus einer Poly-A⁺-RNA von verschiedenen Geweben menschlichen Ursprungs hergestellt wurde, und mehr als 10 PCR-Produkte aus jedem Gewebe wurden subkloniert, und ebenso wurde eine Sequenzierung für mehr als 500 Typen durchgeführt. Ein Klon mit der gewünschten Sequenz von humanem Serrate-1 konnte identifiziert werden.
Wie in Referenzbeispiel 1 gezeigt, wird das erhaltene PCR-Produkt in den Klonierungsvektor kloniert, die Wirtszellen werden unter Verwendung des rekombinanten Plasmids, welches das PCR-Produkt enthält, transformiert, die Wirtszellen, welche das rekombinante Plasmid enthalten, werden in großem Maßstab kultiviert, das rekombinante Plasmid wird gereinigt und isoliert, die DNA-Sequenz des PCR-Produkts, welches in den Klonierungsvektor insertiert wurde, wird überprüft und es wird versucht, das Genfragment zu erhalten, welches eine Sequenz des humanen Serrate-1 aufweisen kann, indem sie mit der Sequenz von bekannten Serrate-Homologen aus anderen Spezies verglichen wird. Wir waren erfolgreich, ein Genfragment zu finden, welches einen Teil einer cDNA eines humanen Serrate-1 enthält, nämlich dieselbe Sequenz der DNA-Sequenz von 1272 bis 1737, welche in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 5 beschrieben ist. Wie in Referenzbeispiel 2 gezeigt, wird unter Verwendung des erhaltenen Genfragments für humanes Serrate-1 eine cDNA mit vollständiger Länge aus der humanen cDNA-Bibliothek erhalten. Wir haben ebenfalls versucht, eine Patentanmeldung mit diesen Erfindungen (WO 97/19172) vorzunehmen.
In der vorliegenden Erfindung können möglicherweise Liganden existieren, die von diesem humanen Serrate-1-Molekül verschieden sind, und Genfragmente, welche eine hohe Homologie in Bezug auf den Liganden mit der durch die Gensequenz codierten Aminosäuresequenz des humanen Serrate-1-Moleküls aufweisen, das heißt bezüglich der DNA-Sequenz von 409 bis 4062 in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 5, werden in der Datenbank der DNA-Sequenz gescreent. Das Screening wurde unter Verwendung der Recherchen-Software für Gensequenzen Genetyx/CD (Software Development Co.) mit der DNA/den Fragmenten von zufälligen humanen cDNA-Sequenzen einer Datenbank mit EST (Expressed Sequence Tag) von Genbank (Release 91, 1995) durchgeführt.
Vor kurzem hat das DNA-Sequenzierungsverfahren Fortschritte gemacht, und die Analyse der gesamten genomischen DNA und der vollständigen cDNA-Sequenz des Menschen, von Nematoden, von Arabidopsis thaliana Heynh. etc. wurde durch zufallsbedingte Sequenzierung von genomischer DNA und cDNA versucht (Genome Directory, Nature, 377, 3S, 1995). Im Falle der humanen cDNA waren das EST-Projekt von TIGR (The Institute for Genomic Research), das EST-Projekt der Washington University – Merck, das STS-Projekt der Colorado University an diesen Projekten beteiligt. Die teilweisen Basensequenzen der cDNA, welche von diesen Organisationen bereitgestellt wurden, sind in der DNA-Datenbank von Genbank und EMBL registriert und veröffentlicht. Gemäß der Genbank (Release 91 von Oktober 1995) betrug die gesamte registrierte Zahl von EST-Klonen etwa 330.000 Klone mit einer durchschnittlichen Länge von 346 bp.
Auf der Grundlage der Daten in dieser Datenbank werden die Gensequenzen oder Aminosäuresequenzen von bekannten oder klonierten neuen Molekülen durch eine Homologie-Recherche gesucht. Die Möglichkeit der Existenz von analogen oder ähnlichen Molekülen aus der Familie dieser Moleküle kann bekannt sein, und die Sequenzinformation der teilweisen DNA-Sequenz kann erhalten werden.
Zur Analyse kann eine im Handel erhältliche Software für die Analyse verwendet werden, oder die Analysesoftware, welche mit der Datenbank erhältlich ist, zum Beispiel BLAST von Genbank, kann verwendet werden. Wenn diese Software verwendet wird, kann die Analyse durchgeführt werden, indem man Zugang zum National Center of Biotechnology Information, USA, Institute of Chemistry, Kyoto University, Japan, über das WWW (world wide web) oder über E-Mail erhält.
Informationen über die Gensequenz von Genfragmenten (etwa 200–350 bp) mit hoher Ähnlichkeit zu dem gewünschten Gen können durch solche Verfahrensschritte erhalten werden. Die Information über das erhaltene Genfragment umfasst eine allgemeine Information über die Gensequenz, zusammen mit dem Klonnamen des Gens und die Organe oder Gewebe, aus denen das Gen extrahiert wurde. Bei den Informationen in Bezug auf die DNA-Sequenz sind dies meist Rohdaten, welche aus der DNA-Sequenz erhalten werden, und wenn die DNA-Sequenz unbekannt ist, wird sie mit einem N markiert und stellt eine unrichtige Information über die DNA-Sequenz dar. Infolge dessen sind diese Informationen über die DNA-Sequenz nicht immer genau.
Ausgehend von dieser Information über die Gensequenz nimmt man an, dass die DNA-Sequenz ohne Kennzeichnung durch N eine hochgradig wahrscheinliche Information über die DNA-Sequenz darstellt. Darüber hinaus werden die am meisten wahrscheinlichen DNA-Sequenzen innerhalb dieser DNA-Sequenzen verglichen und das DNA-Fragment mit einer bezeichnenden Homologie wird in diesem Bereich identifiziert (im Falle eines Gens mit 200 Basen ist eine Ähnlichkeit der DNA-Sequenz von mehr als 40% bevorzugt). Das dadurch identifizierte DNA-Fragment kann von der Firma Genom System Inc., USA, erhalten werden, falls der Name des Klons bekannt ist, und da der Ursprung der Organe offenbart und bekannt ist, kann es mittels PCR aus der cDNA von im Handel erhältlichen Organen zur Expression isoliert werden.
Die dadurch erhaltene Information über das Gen ist eine teilweise Information, und falls keine vollständige Information erhalten wird, ist eine Aminosäuresequenz mit vollständiger Länge, welche durch diese teilweise Sequenz des Gens codiert werden kann, nicht immer ein analoges, ähnliches Molekül, das in der ursprünglichen Homologie-Recherche verwendet wurde. Die genaue Information über das Molekül kann nicht gezeigt werden, es sei denn, durch diese Information. Wie nachfolgend gezeigt, haben wir eine Anzahl von Sonden hergestellt, die eine Homologie aufweisen, und wir haben eine Klonierung durch Plaque-Hybridisierung durchgeführt, jedoch codierten fast alle DNA-Fragmente nicht für die gewünschten Moleküle. Infolge dessen kann dieses Verfahren technisch verwendet werden, es ist jedoch keine einfache Technologie.
Wir haben Sonden von etwa 50 DNA-Fragmenten hergestellt, welche eine Ähnlichkeit mit der cDNA von humanem Serrate-1 in einer PCR-Reaktion zeigten. Schließlich wurde die Klonierung durch ein Verfahren zum Screening der Bibliothek durchgeführt, wie im Folgenden gezeigt. Als ein Ergebnis der Bestimmung der DNA-Sequenz stellt ein Gen, welches dadurch isoliert wurde, dass drei Arten von DNA-Sonden mit der Sequenz der SEQ ID Nr. 8, 9 und 10 verwendet wurden, welche auf der Grundlage der DNA-Sequenz der in der Genbank registrierten Klone (Reg. Nr. T08853, R50026 und R46751) hergestellt wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, ein DNA-Fragment dar, das für das humane Serrate-2-Molekül codiert.
Wenn darüber hinaus das so isolierte cDNA-Fragment als eine Sonde verwendet wird und die cDNA-Bibliothek der Organe für die Expression gescreent wird, kann dann das längere Gen mit der DNA-Sequenz oder das cDNA-Gen mit vollständiger Länge gescreent werden. Die Klonierung des Gens mit vollständiger Länge kann durch Isotopenmarkierung und Nicht-Isotopenmarkierung mit dem klonierten teilweisen Gen und durch Screening der Bibliothek durch Hybridisierung oder ein anderes Verfahren erfolgen. Die Isotopenmarkierung kann zum Beispiel durch Endmarkierung unter Verwendung von [³²P]-γ-ATP und T4-Polynukleotidkinase durchgeführt werden, oder andere Markierungsverfahren, wie zum Beispiel Nick-Translation oder ein Primerverlängerungs-Verfahren, können verwendet werden.
Darüber hinaus kann die Klonierung des Gens mit vollständiger Länge oder eines längeren Genfragments durch Verfahren zur Verlängerung der Gensequenz mit einem 5'-RACE oder 3'-RACE Verfahren erreicht werden, ohne die Bibliothek zu verwenden. In einem anderen Verfahren wird eine cDNA-Bibliothek von humanem Ursprung in den Expressionsvektor ligiert, in COS-7 oder anderen Zellen exprimiert, das Ligandenmolekül unter Verwendung des Proteins für den Notch-Rezeptor gesucht, und das gewünschte Gen durch Expressionsklonierung der isolierten cDNA des Liganden gescreent. Im Falle der Expressionsklonierung kann ein Fraktionierungsverfahren zur Zellsortierung, welches die Bindung mit einem Polypeptid verwendet, das eine Aminosäuresequenz von 4 bisher bekannten Notch-Molekülen enthält, wie zum Beispiel TAN-1, sowie ein Nachweisverfahren durch Filmemulsion unter Verwendung eines Radioisotops erwähnt werden.
In dieser Beschreibung wird ein Verfahren zur Gewinnung von Genen des humanen Serrate-2 erklärt, und verschiedene Verfah ren, die in dieser Erfindung deutlich gezeigt werden, einschließlich der PCR, durch welche die Klonierung des humanen Delta-1 und des humanen Serrate-1 durchgeführt wird, können verwendet werden, um neue Moleküle der Notch-Ligandenfamilie zu erhalten, welche noch nicht kloniert wurden. Zum Beispiel werden die konservierten Domänen durch Vergleich mit der Aminosäuresequenz oder mit der DNA-Sequenz von humanem Serrate-1 oder humanem Serrate-2 gefunden, und deren Klonierung erfolgt nach Durchführung einer PCR, und die Klonierung kann ebenfalls durch eine Suche nach einem EST auf der Basis von humanem Delta-1 oder humanem Serrate-2 durchgeführt werden. Dieses klonierte neue Molekül der Notch-Ligandenfamilie kann wie dasselbe humane Serrate-2 verwendet werden, wie in der vorliegenden Erfindung gezeigt, zum Beispiel für die Klonierung des Gens mit vollständiger Länge, die Herstellung eines Expressionsvektors, die Herstellung transformierter Zellen, die Herstellung des Proteins, die Herstellung des Antikörpers, oder das Screening nach bioaktiven Substanzen, und eine die Differenzierung unterdrückende Wirkung gegenüber Zellen kann erwartet werden.
Wie in Beispiel 2 gezeigt, werden diese drei Genfragmente mit einem Radioisotop markiert, um eine Hybridisierungssonde herzustellen; damit wird unter Verwendung einer cDNA als einer Screening-Bibliothek, die aus einem menschlichen, fötalen Gehirn stammt, ein Screening durchgeführt; die DNA-Sequenz der so erhaltenen Klone wird bestimmt, und es wird eine hohe Ähnlichkeit mit dem humanen Serrate-1 über die vollständige Länge der gesamten DNA-Nukleotidsequenz gefunden. Bei diesen Screenings kann eine vollständige Länge einer cDNA-Sequenz, welche für eine vollständige Länge einer Aminosäuresequenz codiert, nicht kloniert werden. Darüber hinaus wird eine DNA-Sonde auf der Basis der klonierten DNA-Sequenz hergestellt, und wiederum wird ein Screening durchgeführt; jedoch konnte die vollständige Länge des Gens nicht identifiziert werden. Schließlich wird eine Genklonierung, welche das Translations-Startcodon Met enthält, durch ein 5'-RACE-Verfahren durchgeführt; die DNA-Sequenz wird bestimmt und schließlich wird die cDNA, welche für die vollständige Länge der Gensequenz des humanen Serrate-2 codiert, erfolgreich kloniert. Die somit klonierte cDNA wurde ligiert, wie in Beispiel 2 gezeigt, und die cDNA, welche für die vollständige Länge dieses humanen Serrate-2 codiert, kann erhalten werden.
Beispiele für Plasmide, in welche die cDNA integriert wurde, sind zum Beispiel die von E. coli stammenden pBR322, pUC18, pUC19, pUC118 und pUC119 (Takara Shuzo Co., Japan), jedoch können andere Plasmide verwendet werden, falls sie sich in den Wirtszellen replizieren und vermehren können. Beispiele von Phagenvektoren, in welche die cDNA integriert wird, sind zum Beispiel λgt10 und λgt11, jedoch können andere Vektoren verwendet werden, falls sie in den Wirtszellen gezüchtet werden können. Die so erhaltenen Plasmide werden in geeignete Wirtszellen, wie zum Beispiel vom Genus Escherichia und vom Genus Bacillus, unter Verwendung des Calciumchlorid-Verfahrens transduziert. Beispiele für das vorstehende Genus Escherichia sind Escherichia coli K12HB101, MC1061, LE392 und JM109. Ein Beispiel für das vorstehend genannte Genus Bacillus ist Bacillus subtilis MI114. Der Phagenvektor kann in das vermehrte Escherichia coli durch ein in vitro Packverfahren eingeführt werden (Enquist und Sternberg, Meth. Enzymol., 89, 281, 1979).
Die klonierte DNA-Sequenz mit vollständiger Länge wurde mit der Datenbank (Genbank Release 93, 1996) verglichen, und es wurde gefunden, dass die gesamte Sequenz eine neue Sequenz ist, obwohl zum Teil die zuvor erwähnten drei EST-Klone und einige EST-Klondaten als identische Teilsequenzen existierten, die von den besagten drei EST-Klonen verschieden sind.
Darüber hinaus wurde die Aminosäuresequenz des humanen Serrate-2, das heißt die Aminosäuresequenzen der SEQ ID Nr. 1, 2 und 3, mit der Datenbank mit einer zuvor bekannten Aminosäuresequenz verglichen (SWISS-PROT Release 32, 1995 und Genbank CDS Release 93, 1996), und es wurde gefunden, dass es keine identische Aminosäuresequenz gibt, und dass es eine neue Sequenz ist. Gemäß einem Vergleich in der Aminosäuresequenz des humanen Serrate-1 und der Serrate-Homologen von anderen Organismen sind die Homologien mit dem humanen Serrate-1, Serrate aus Drosophila bzw. Jagged aus Ratten 53,1%, 34,3% bzw. 52,3%. Die Substanz der vorliegenden Erfindung ist von diesen Substanzen verschieden, und es ist eine neue Substanz mit einer neuen Aminosäuresequenz, und sie wurde zuerst von den vorliegenden Erfindern aufgeklärt.
Diese Aminosäuresequenz wurde in Bezug auf einen hydrophilen Teil und einen hydrophoben Teil gemäß einem Verfahren von Kyte-Doolittle (J. Mol. Biol. 157, 105, 1982) analysiert. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass in der Aminosäuresequenz, die in der SEQ ID Nr. 4 aufgelistet ist, die Aminosäuresequenz eines Vorläufers des Gens mit vollständiger Länge aus 1238 Aminosäureresten von -26 bis 1212 in der Aminosäuresequenz besteht, und in Bezug auf die Signalpeptid-Domäne schätzt man, dass sie der Aminosäure-Sequenz von 26 Aminosäureresten von Nr. -26 Methionin bis Nr. -1 Prolin entspricht; für die extrazelluläre Domäne schätzt man: 1055 Aminosäurereste von Nr. 1 Methionin bis Nr. 1055 Glycin; für die transmembranäre Domäne schätzt man: 24 Aminosäurereste von Nr. 1056 Leucin bis Nr. 1079 Tryptophan; und für die intrazelluläre Domäne schätzt man: Bereich von Nr. 1080 Threonin bis Nr. 1212 Glutamat. Diese Domänen werden als Aufbau einer Domäne aus der Aminosäuresequenz abgeschätzt, und das tatsächliche Vorliegen einer Form kann möglicherweise von der vorstehenden Struktur abweichen, und die am Aufbau beteiligten Aminosäuren einer jeden vorstehend definierten Domäne können möglicherweise um 5 bis 10 Positionen in der Aminosäuresequenz schwanken.
In dem Aminoterminus (N-Terminus) wurde die Identifikation des N-Terminus der Aminosäuresequenz der gereinigten Liganden-Polypeptide EXS2Fc und EXS2FLAG der vorliegenden Erfindung durchgeführt, wie in Beispiel 6 gezeigt, und es wurde gefunden, dass Methionin die Nr. 1 in den SEQ ID Nr. 1–3 war. In folge dessen erstreckt sich das Signalpeptid mindestens von -26 Methionin bis -1 Prolin in der SEQ ID Nr. 4.
Die Familienmoleküle des Notch-Liganden in Bezug auf die extrazelluläre Domäne weisen eine evolutionär konservierte, gemeinsame Sequenz auf, das heißt die DSL-Sequenz und eine wiederholte EGF-ähnliche Sequenz. Als ein Ergebnis des Vergleichs mit der Aminosäuresequenz des humanen Serrate-2 und des humanen Serrate-1 wird diese konservierte Sequenz aus der Aminosäuresequenz von Serrate-2 abgeschätzt. Die DSL-Sequenz entspricht nämlich den 43 Aminosäureresten von Nr. 172 Cystein bis Nr. 214 Cystein der Aminosäuresequenz in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 4.
Eine EGF-ähnliche Sequenz existiert mit 16 Wiederholungen, wobei sich diese in der Aminosäuresequenz in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 4 wie folgt erstrecken: die erste EGF-ähnliche Sequenz von Nr. 217 Cystein bis Nr. 247 Cystein; die zweite EGF-ähnliche Sequenz von Nr. 250 Cystein bis Nr. 278 Cystein; die dritte EGF-ähnliche Sequenz von Nr. 285 Cystein bis Nr. 318 Cystein; die vierte EGF-ähnliche Sequenz von Nr. 325 Cystein bis Nr. 356 Cystein; die fünfte EGF-ähnliche Sequenz von Nr. 363 Cystein bis Nr. 394 Cystein; die sechste EGF-ähnliche Sequenz von Nr. 401 Cystein bis Nr. 432 Cystein; die siebte EGF-ähnliche Sequenz von Nr. 439 Cystein bis Nr. 469 Cystein; die achte EGF-ähnliche Sequenz von Nr. 476 Cystein bis Nr. 507 Cystein; die neunte EGF-ähnliche Sequenz von Nr. 514 Cystein bis Nr. 545 Cystein; die zehnte EGF-ähnliche Sequenz von Nr. 563 Cystein bis Nr. 607 Cystein; die elfte EGF-ähnliche Sequenz von Nr. 614 Cystein bis Nr. 645 Cystein; die zwölfte EGF-ähnliche Sequenz von Nr. 652 Cystein bis Nr. 683 Cystein; die dreizehnte EGF-ähnliche Sequenz von Nr. 690 Cystein bis Nr. 721 Cystein; die vierzehnte EGF-ähnliche Sequenze von Nr. 729 Cystein bis Nr. 760 Cystein; die fünfzehnte EGF-ähnliche Sequenz von Nr. 767 Cystein bis Nr. 798 Cystein; die sechzehnte EGF-ähnliche Sequenz von Nr. 805 Cystein bis Nr. 836 Cystein.
Unter diesen Cystein-Resten gibt es zwei Cysteinreste zwischen der 9. EGF-ähnlichen Sequenz und der 10. EGF-ähnlichen Sequenz. Ebenso gibt es 6 Cysteinreste in Richtung des N-Terminus der DSL-Sequenz und 16 Cysteinreste in Richtung des C-Terminus in der 16. EGF-ähnlichen Sequenz. Diese Cysteinreste, einschließlich der EGF-ähnlichen Sequenz, sind in nahezu derselben Position wie bei dem humanen Serrate-1 konserviert.
Ein Teil der anhängenden Zuckerketten wird aus der Aminosäuresequenz des humanen Serrate-2 abgeschätzt und kann bei den Asparaginresten Nr. 127, 544, 593, 726 und 1032 in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 3 als einer möglichen Bindestelle einer N-glykosidischen Bindung für N-Acetyl-D-glucosamin liegen. Eine O-glykosidische Bindung von N-Acetyl-D-galactosamin wird für einen Teil der Sequenz angenommen, der reich an Serin- oder Threoninresten ist. Man glaubt, dass ein Protein, welches an eine Zuckerkette gebunden ist, im Allgemeinen in vivo stabil ist und eine starke physiologische Aktivität aufweist. Infolge dessen sind in der Aminosäuresequenz des Polypeptids mit einer Sequenz der Sequenzliste SEQ ID Nr. 2 oder 3 Polypeptide mit einer N-glykosidischen oder O-glykosidischen Bindung mit einer Zuckerkette von N-Acetyl-D-glucosamin oder N-Acetyl-D-galactosamin von der vorliegenden Erfindung umfasst.
Als ein Ergebnis der Studien über die Bindung von Notch aus Drosophila und seinen Liganden erstreckt sich der Aminosäurebereich, welcher für die Bindung von Notch mit dem Liganden von Notch aus Drosophila notwendig ist, vom N-Terminus zur DSL-Sequenz des reifen Proteins, in welchem das Signalpeptid entfernt wurde (ungeprüfte veröffentlichte japanische Patentanmeldung Nr. 7-503121). Darüber hinaus ergab als ein Ergebnis ähnlicher Studien eine Studie von Fitzgerald und Greenwald (Development 121, 4275–4282, 1995) unter Verwendung von Nematoden in ersichtlicher Weise, dass die vollständige Länge des zum Notch-Liganden ähnlichen Moleküls APX-1 vom Aminoterminus zur DSL-Domäne ausreichend lang war, um den Notch-ähnli chen Rezeptor zu aktivieren. Diese Tatsachen weisen darauf hin, dass eine Domäne, die für die Expression der Ligandenwirkung des humanen Serrate-2-Moleküls notwendig ist, eine neue Aminosäuresequenz der Sequenzliste SEQ ID Nr. 1 darstellt.
Der Nothern-Blot kann unter Verwendung einer DNA durchgeführt werden, die für einen Teil oder für die gesamte Gensequenz der SEQ ID Nr. 4 der Sequenzliste codiert. Infolge dessen kann ein Verfahren zum Nachweis der Expression dieser Gene erreicht werden, indem eine Hybridisierung oder eine PCR unter Verwendung der komplementären Nukleinsäure mit mehr als 12 Basen oder mehr als 16 Basen angewendet wird, vorzugsweise mit einer Nukleinsäure mit mehr als 18 Basen, die eine Nukleinsäuresequenz eines Teils der Sequenz der Sequenzliste SEQ ID Nr. 4 aufweist, das heißt eine Antisens-DNA oder eine Antisens-RNA, ihre methylierten, methylphosphorylierten, desaminierten oder thiophosphorylierten Derivate. Durch dasselbe Verfahren kann der Nachweis von Homologen des Gens aus anderen Organismen, wie zum Beispiel Mäusen, oder die Genklonierung erreicht werden.
Die weitere Klonierung von Genen im Genom, einschließlich des Menschen, kann erfolgen. Unter Verwendung dieser durch derartige Verfahren klonierten Gene, können weitere Funktionen des humanen Serrate-2 der vorliegenden Erfindung im Einzelnen aufgeklärt werden. Zum Beispiel können unter Verwendung moderner Genmanipulationsverfahren alle Verfahren, einschließlich transgener Mäuse, Mäuse, in denen ein Gen abgeschaltet wird (gene targeting mouse) oder doppelte Knockout-Mäuse, in denen Gene mit Bezug auf das Gen der vorliegenden Erfindung inaktiviert werden, verwendet werden. Falls Abnormitäten im Genom des vorliegenden Gens gefunden werden, kann eine Anwendung für die Gendiagnose oder die Gentherapie erfolgen.
Wie in Beispiel 3 beschrieben, wird eine Expression in normalen menschlichen Geweben in vielen Geweben beobachtet, und die Länge der exprimierten mRNA ist von einer Art, dass die mRNA etwa 5 kb Länge aufweist. Durch diese Mittel kann der Nachweis der Expression der mRNA dieses Moleküls für die Diagnose oder für den Nachweis eines malignen Tumors in einem Teil eines normalen Organs verwendet werden, in welchem die Expression dieser mRNA nicht beobachtet werden kann. Darüber hinaus kann durch Bezugnahme auf die (Expressions-)Muster der Organe, in denen eine Expression stattfindet, eine Verwendung des humanen Serrate-2, für das sich eine konkrete Verwendung in der vorliegenden Erfindung nicht ergibt, gefunden werden.
Eine Transformante, in welche der Vektor pUCSR-2, welcher cDNA enthält, die für die gesamte Aminosäuresequenz des humanen Serrate-2 der vorliegenden Erfindung codiert, in E. coli JM109 transformiert worden war, wurde im National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, MITI, of 1-1-3, Higasi, Tsukuba-shi, Ibaragi-ken, Japan, als E. coli JM109-pUCSR-2 hinterlegt. Das Datum der Hinterlegung war der 28. Oktober 1996 und die Hinterlegungsnummer ist FBRM BP-5727.
Die Expression und Reinigung verschiedener Formen des humanen Serrate-2 unter Verwendung einer cDNA, welche für die Aminosäuresequenz des humanen Serrate-2 codiert, das durch die vorstehenden Verfahren isoliert wurde, sind in den Referenzen bekannt (Kriegler, Gene Transfer and Expression – A Laboratory Manual, Stockton Press, 1990 und Yokota et al., Biomanual Series 4, Gene Transfer an Expression and Analysis, Yodosha Co., 1994). Eine cDNA, welche für die Aminosäuresequenz des isolierten humanen Serrate-2 codiert, wird vorzugsweise in einen Expressionsvektor ligiert, und das Protein wird in Wirtszellen von eukaryotischen Zellen, wie zum Beispiel tierischen Zellen und Insektenzellen, oder prokaryotischen Zellen, wie zum Beispiel Bakterien, hergestellt.
Bei der Expression des Moleküls der vorliegenden Erfindung kann die für das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codierende DNA das Translations-Startcodon am 5'-Terminus und das Translations-Stoppcodon am 3'-Terminus aufweisen. Dieses Translations-Startcodon und dieses Translations-Stoppcodon können vorzugsweise durch den Einsatz eines synthetischen DNA-Adapters hinzugefügt werden. Darüber hinaus wird für die Expression dieser DNA der Promotor stromaufwärts von der DNA-Sequenz verknüpft. Beispiele für den Vektor sind ein Plasmid, das aus Bacillus stammt, ein Plasmid, das aus Hefe stammt oder ein Bakteriophage, wie zum Beispiel der λ-Phage, oder ein tierisches Virus, wie zum Beispiel ein Retrovirus oder ein Vacciniavirus.
Beispiele für Promotoren, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind beliebige Promotoren; vorzugsweise werden solche Promotoren eingesetzt, die den bei der Genexpression verwendeten Wirtszellen entsprechen.
Für den Fall, dass die bei der Transformation verwendete Wirtszelle dem Genus Escherichia angehört, ist ein tac-Promotor, trp-Promotor und lac-Promotor bevorzugt, und für den Fall, dass der Wirt dem Genus Bacillus angehört, ist ein SP01-Promotor und SP02-Promotor bevorzugt, und für den Fall, dass die Wirtszelle Hefe ist, ist ein PGK-Promotor, GAP-Promotor oder ADH-Promotor bevorzugt.
Für den Fall, dass die Wirtszelle eine tierische Zelle ist, kann ein Promotor verwendet werden, der von SV40 stammt, ein Promotor eines Retrovirus', ein Metallothionin-Promotor und ein Hitzeschock-Promotor.
Die Expression des Polypeptids der vorliegenden Erfindung kann durch den Einsatz von lediglich der DNA erfolgen, die für die Aminosäuresequenz der Sequenzliste SEQ ID Nr. 1, 2 oder 3 codiert. Das Protein mit einer hinzugefügten spezifischen Funktion kann jedoch durch den Einsatz einer DNA hergestellt werden, zu der eine cDNA hinzugefügt wurde, die für ein bekanntes Antigenepitop codiert, um einen leichteren Nachweis des hergestellten Polypeptids zu ermöglichen, oder durch den Einsatz einer DNA, zu der eine cDNA hinzugefügt wurde, die für das Immunglobulin Fc codiert, um ein Multimer dieses humanen Serrate-2 zu bilden.
Wie in Beispiel 4 gezeigt, haben wir Expressionsvektoren hergestellt, welche wie folgt extrazelluläre Proteine exprimieren:

1) die DNA, die für die Aminosäuren von Nr. 1 bis 1055 in der Aminosäuresequenz der Sequenzliste SEQ ID Nr. 2 codiert,
2) die DNA, welche für ein chimäres Protein codiert, zu welchem am C-Terminus der Aminosäuren von Nr. 1 bis 1055 in der Aminosäuresequenz der Sequenzliste SEQ ID Nr. 2 ein Polypeptid mit 8 Aminosäuren hinzugefügt wurde, das heißt eine Aminosäuresequenz, bestehend aus Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys (nachfolgend als FLAG-Sequenz bezeichnet, Sequenzliste SEQ ID Nr. 22), und
3) die DNA, welche für ein chimäres Protein codiert, zu welchem am C-Terminus der Aminosäuren von Nr. 1 bis 1055 in der Aminosäuresequenz der Sequenzliste SEQ ID Nr. 2 eine Fc-Sequenz unterhalb des Gelenkbereichs des humanen IgG1 hinzugefügt wurde (siehe die internationale ungeprüfte Patentveröffentlichung WO 94/02053) um damit eine dimere Struktur mittels einer Disulfidbindung im Gelenkbereich zu besitzen, werden jeweils einzeln mit dem Expressionsvektor pMKITNeo ligiert (Maruyama et al., Japan Molecular Biology Soc. Meeting Preliminary lecture record, erhältlich von Dr. Maruyama in Tokyo Medical and Dental College) um Vektoren für die extrazelluläre Expression des humanen Serrate-1 herzustellen. Die Expressionsvektoren, welche das Protein mit vollständiger Länge exprimieren, können wie folgt hergestellt werden:
4) die DNA, welche für die Aminosäuren von Nr. 1 bis 1212 in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 3 codiert, und
5) die DNA, die für das chimäre Protein codiert, zu welchem ein Polypeptid mit der FLAG-Sequenz am C-Terminus der Aminosäuren von Nr. 1 bis 1212 in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 3 hinzugefügt wurde, werden jeweils einzeln mit dem Expressionsvektor pMKITNeo ligiert, um einen Vektor für die Expression des humanen Serrate-2 mit vollständiger Länge herzustellen. Die Transformante wird durch Verwendung des Expressionsplasmids hergestellt, welche die DNA enthält, die für das so konstruierte, humane Serrate-2 codiert.

Beispiele für den Wirt sind das Genus Escherichia, das Genus Bacillus, Hefe und tierische Zellen. Beispiele für tierische Zellen sind die Affenzellen COS-7 und Vero, chinesische Hamsterzellen CHO und die Seidenraupenzelle SF9.
Wie in Beispiel 5 gezeigt, werden die vorstehend erwähnten 5 Typen von Expressionsvektoren jeweils einzeln transduziert: das humane Serrate-2 wird in einer COS-7-Zelle exprimiert (erhältlich vom Institute of Physical and Chemical Research, Cell Development Bank, RCB0539); und die Transformanten, welche mit diesen Expressionsplasmiden transformiert wurden, können erhalten werden. Darüber hinaus kann das Polypeptid des humanen Serrate-2 durch Kultivierung der Transformanten unter bevorzugten Kulturbedingungen in einem Medium durch ein bekanntes Kulturverfahren hergestellt werden.
Das Polypeptid des humanen Serrate-2 kann aus der vorstehenden Kulturmasse isoliert und gereinigt werden, im Allgemeinen durch die folgenden Verfahren.
Zur Extraktion der Substanz aus kultivierten mikrobiellen Zellen oder Zellen werden mikrobielle Zellen oder Zellen durch ein bekanntes Verfahren, wie zum Beispiel die Zentrifugation nach der Kultivierung, gesammelt, in einer bevorzugten Pufferlösung suspendiert, die mikrobiellen Zellen oder Zellen werden mittels Ultraschall, Lysozym und/oder durch Einfrieren und Auftauen aufgebrochen, und der Rohextrakt des humanen Serrate-2-Proteins wird durch Zentrifugation oder Filtration gesammelt. Die Pufferlösung kann Protein-denaturierende Mittel, wie zum Beispiel Harnstoff und Guanidin-Hydrochlorid, oder grenzflächenaktive Mittel, wie zum Beispiel Triton-X, enthalten. Im Falle der Sekretion in die Kulturlösung wird die Kulturmasse durch ein bekanntes Verfahren, wie zum Beispiel die Zentrifugation, abgetrennt, um die mikrobiellen Zellen oder Zellen abzutrennen, und die Lösung des Überstands wird gesammelt.
Das so erhaltene humane Serrate-2, welches in den Zellextrakten oder Zellüberständen enthalten ist, kann durch ein bekanntes Proteinreinigungsverfahren gereinigt werden. Während des Reinigungsverfahrens kann zur Bestätigung des Vorliegens des Proteins im Falle der Fusionsproteine aus dem vorstehenden FLAG bzw. dem humanen IgGFc dieses durch einen Immunoassay unter Verwendung eines Antikörpers, der gegen das bekannte Antigenepitop gerichtet ist, nachgewiesen werden, und es kann gereinigt werden. Für den Fall, dass das fusionierte Protein nicht exprimiert wird, kann der gegen humanes Serrate-2 gerichtete Antikörper in Beispiel 7 für den Nachweis verwendet werden.
Ein nützlicheres Reinigungsverfahren ist eine Affinitätschromatographie unter Verwendung eines Antikörpers. Antikörper, die in diesem Fall verwendet werden, sind die in Beispiel 7 beschriebenen Antikörper. Für ein Fusionsprotein werden Antikörper verwendet, die gegen ein anderes Protein als das humane Serrate-2 gerichtet sind, zum Beispiel Antikörper gegen FLAG im Falle von FLAG, und gegen Protein G oder Protein A im Falle des humanen IgGFc, wie in Beispiel 6 gezeigt.
Die physiologischen Funktionen des so gereinigten humanen Serrate-2-Proteins oder des humanen Serrate-2 können durch verschiedene Assayverfahren identifiziert werden, zum Beispiel kann die physiologische Aktivität durch Assayverfahren unter Verwendung von Zelllinien und Tieren, wie zum Beispiel Mäusen und Ratten, durch Assayverfahren für die intrazelluläre Signaltransduktion, welche auf molekularbiologischen Mitteln und der Bindung an den Notch-Rezeptor und dergleichen beruhen, bestimmt werden.
Für diese Wirkung wird hauptsächlich eine Wirkung zur Unterdrückung der Zelldifferenzierung erwartet, und Wirkungen, wie zum Beispiel eine Stimulation der Geweberegeneration, können erwartet werden.
Wir haben nämlich gefunden, dass, wie in Beispiel 8 gezeigt ist, in den undifferenzierten Blutzellen aus Nabelschnurblut, in denen eine Fraktion aus CD34-positiven Zellen konzentriert ist, die Polypeptide der vorliegenden Erfindung eine unterdrückende Wirkung der koloniebildenden Wirkung gegenüber undifferenzierten Blutzellen aufweisen, welche eine Koloniebildung in Gegenwart von Cytokinen zeigen.
Wie darüber hinaus in Beispiel 9 gezeigt, haben wir gefunden, dass als ein Ergebnis der Zugabe des chimären Proteins aus humanem Serrate-2 und IgG1 zu einer Flüssigkultur in Gegenwart von Cytokinen das humane Serrate-2 eine Aktivität aufweist, die Anzahl der LTC-IC (Long-Term Culture-Initiating Cells) merklich herabzusetzen, welche die am häufigsten vorkommenden, undifferenzierten Blutstammzellen unter den undifferenzierten Zellen aus menschlichem Blut darstellen.
Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass das humane Serrate-2 die Differenzierung von undifferenzierten Blutzellen unterdrückt, und diese Wirkungen breiten sich von den Blutstammzellen auf die koloniebildenden Zellen aus. Weitere Arzneimittel, welche das Polypeptid der vorliegenden Erfindung enthalten, besitzen eine Schutzwirkung und eine Aufhebung der die Bildung von Knochenmark unterdrückenden Wirkung, welche als nachteilige Wirkungen von Antitumormitteln beobachtet werden.
Darüber hinaus haben wir, wie in Beispiel 10 gezeigt, eine Wirkung gegenüber Gefäßzellen studiert, für die eine Wirkung der Moleküle der vorliegenden Erfindung bis jetzt nicht bekannt war, ausgenommen Blutzellen, und wir haben gefunden, dass das Molekül der vorliegenden Erfindung eine Wirkung aufweist, das Wachstum humaner endothelialer Gefäßzellen zu unterdrücken. Infolge dessen umfasst die vorliegende Erfindung ein das Wachstum unterdrückendes Mittel für Gefäßzellen, und ein therapeutisches Mittel für Krankheiten (siehe Folkman und Klagsbrun, Science 235, 442–447, 1987), so dass eine Wirkung für die Unterdrückung der Gefäßbildung bei den Arzneimitteln erwartet wird, die ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 1–3 enthalten. Das Molekül der vorliegenden Erfindung kann für die Behandlung dieser Krankheiten verwendet werden.
In der pharmazeutischen Anwendung werden die Polypeptide der vorliegenden Erfindung mit der vorstehenden Form lyophilisiert, wobei vorzugsweise stabilisierende Mittel, wie zum Beispiel humanes Serumalbumin, zugegeben werden, und sie werden im gelösten oder suspendierten Zustand mit destilliertem Wasser für die Injektion verwendet, wenn sie zum Einsatz kommen. Zum Beispiel kann eine Zubereitung für die Injektion oder Infusion bei einer Konzentration von 0,1–1000 μg/ml bereitgestellt werden. Eine Mischung von 1 mg/ml der Verbindung der vorliegenden Erfindung und von 5 mg/ml Humanserumalbumin, aufgeteilt in Fläschchen, kann die Wirkung der besagten Verbindung über einen langen Zeitraum beibehalten. Für die Kultivierung und die Aktivierung der Zellen in vitro kann eine lyophilisierte Zubereitung oder eine flüssige Zubereitung des Polypeptids der vorliegenden Erfindung hergestellt werden und zu dem Medium gegeben oder in einem Kulturgefäß immobilisiert werden. Die Toxizität des Polypeptids der vorliegenden Erfin dung wurde getestet. Ein beliebiges Polypeptid, 10 mg/kg wurde intraperitoneal an Mäuse verabreicht, jedoch wurde kein Todesfall einer Maus beobachtet.
Die physiologische Aktivität des Polypeptids der vorliegenden Erfindung in vitro kann durch Verabreichung an Mäuse für ein Krankheitsmodell oder an Ratten und Affen mit einer ähnlichen Krankheit bewertet werden, und die Wiedererlangung physikalischer und physiologischer Funktionen, sowie abnormale Befunde können untersucht werden. Zum Beispiel werden im Falle einer Suche nach einer Abnormalität in Bezug auf hämatopoetische Zellen Modell-Mäuse mit einer Unterdrückung der Bildung des Knochenmarks durch Verabreichung von Antitumormitteln der FU-Reihe hergestellt, und die Zahl der Knochenmarkszellen, die Zahl der peripheren Blutzellen und die physiologischen Funktionen werden in der behandelten Gruppe und der nicht behandelten Gruppe der Mäuse untersucht. Darüber hinaus werden im Fall der Erforschung der in vitro Kultivierung und der Zucht der undifferenzierten hämatopoetischen Zellen, einschließlich der hämatopoetischen Stammzellen, die Knochenmarkszellen der Mäuse in Gruppen mit und ohne Zugabe der Verbindung der vorliegenden Erfindung kultiviert, und die kultivierten Zellen werden in Mäuse überführt, denen eine tödliche Dosis Strahlung verabreicht wurde. Das Ergebnis der Wiederherstellung wird anhand der Hinweise der Überlebensrate und der Schwankungen der Zahl der Blutzellen beobachtet. Diese Ergebnisse können auf den Menschen extrapoliert werden, und dementsprechend können nützliche und nutzbringende Daten für die Bewertung der pharmakologischen Aktivitäten der Verbindung der vorliegenden Erfindung erhalten werden.
Die Anwendungen der Verbindung der vorliegenden Erfindung für Arzneimittel umfassen Krankheiten mit einer abnormalen Differenzierung von Zellen, zum Beispiel Leukämie und maligne Tumore. Diese betreffen eine Zelltherapie, welche durch Kultivierung der vom Menschen stammenden Zellen in vitro unter Aufrechterhaltung ihrer ursprünglichen Funktionen oder unter Hin zufügung neuer Funktionen durchgeführt wird, und eine Therapie, welche durch Regeneration ohne Zerstörung der ursprünglich in den Geweben vorhandenen Funktionen durchgeführt wird, indem die Verbindung der vorliegenden Erfindung während der Regeneration nach der Verletzung des Gewebes verabreicht wird. Die Menge der Verabreichung kann je nach Art der Zubereitung unterschiedlich sein, und sie liegt im Bereich von 10 μg/kg bis 10 mg/kg.
Darüber hinaus kann eine starke physiologische Aktivität durch Expression eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung erreicht werden, welches ein Multimer bildet.
Humanes Serrate-2 mit einer Multimerstruktur kann durch ein Verfahren zur Expression eines chimären Proteins mit einem humanen IgG-Fc-Bereich, wie im Beispiel beschrieben, und durch Expression des Multimers mit einer Disulfidbindung innerhalb des Gelenkbereichs des Antikörpers, oder durch ein Verfahren zur Expression des chimären Proteins, in welchem der Erkennungsbereich des Antikörpers am C-Terminus oder N-Terminus exprimiert wird, und durch Umsetzung des Antikörpers, der spezifisch den Antikörper-Erkennungsbereich am C-Terminus oder N-Terminus erkennt, mit dem Polypeptid, das den extrazellulären Teil des so exprimierten humanen Serrate enthält, hergestellt werden.
Bei den anderen Verfahren kann ein Verfahren erwähnt werden, bei dem das fusionierte Protein, welches lediglich mit dem Gelenkbereich des Antikörpers verbunden ist, exprimiert wird und bei dem das Dimer durch Konstruktion einer Disulfidbrücke gebildet wird. Das Multimer des humanen Serrate-2 mit einer höheren spezifischen Aktivität als das Dimer kann erhalten werden. Dieses Multimer wird durch ein Fusionsprotein konstruiert, welches durch Expression des Peptids am C-Terminus, N-Terminus oder in einem anderen Bereich hergestellt wird. Das Protein wird in Form der Bildung einer Disulfidbindung hergestellt, ohne irgendeine weitere Aktivität des humanen Serra te-2 zu beeinflussen. Die Multimer-Struktur kann ebenso durch Anordnung einer Aminosäuresequenz der Sequenzliste SEQ ID Nr. 1 oder 2, die ein oder mehrere Peptide enthält, durch ein molekularbiologisches Verfahren in Reihe oder parallel exprimiert werden. Andere bekannte Verfahren zur Bereitstellung einer Multimerstruktur mit einem Dimer oder einer höheren Struktur können verwendet werden. Dementsprechend umfasst die vorliegende Erfindung beliebige Polypeptide, welche die Aminosäuresequenzen enthalten, die in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 1 oder 2 beschrieben sind, in der Form eines Dimers oder einer höher aggregierten Struktur, welche durch ein molekularbiologisches Verfahren hergestellt wurden.
Darüber hinaus kann bei dem anderen Verfahren ein Multimerisationsverfahren unter Verwendung eines chemischen Vernetzers erwähnt werden. Zum Beispiel kann Dimethylsuberimidat-Dihydrochlorid für die Vernetzung von Lysinresten, N-(γ-Maleimidbutyryloxy)succinimid als Vernetzer für Thiolgruppen von Cysteinresten, und Glutaraldehyd für die Vernetzung zwischen Aminogruppen erwähnt werden. Das Multimer mit einem Dimer oder einer höher aggregierten Struktur kann durch den Einsatz dieser Vernetzungsreaktionen synthetisiert werden. Dementsprechend umfasst die vorliegende Erfindung beliebige Polypeptide, die eine in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 1 oder 2 beschriebene Aminosäuresequenz enthalten, in der Form eines Dimers oder einer höher aggregierten Struktur, welche durch chemische vernetzende Mittel hergestellt wurden.
Bei der Anwendung für medizinische Zwecke, bei denen Zellen vermehrt, in vitro aktiviert und dem Körper erneut zugeführt werden, kann das humane Serrate-2 in der vorstehend beschriebenen Form unmittelbar dem Medium zugegeben werden, jedoch kann auch eine Immobilisierung erfolgen. Das Immobilisierungsverfahren umfasst die Anwendung einer Aminogruppe oder Carboxylgruppe in dem humanen Serrate-2, wobei geeignete Abstandshalter oder die vorstehend erwähnten Vernetzer verwendet werden, und der Ligand kann covalent an die Kulturgefäße gebunden werden. Dementsprechend umfasst die vorliegende Erfindung beliebige Polypeptide, welche die in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 1 oder 2 beschriebenen Aminosäuresequenzen enthalten, in einer solchen Form, dass sie auf einer festen Oberfläche vorliegen.
Das humane Serrate-2-Molekül bindet spezifisch an den Rezeptor, ein Molekül des Notch-Rezeptors. Zum Beispiel kann die Expression des Notch-Rezeptors durch die Verwendung eines Fusionsproteins aus dem vorstehend erwähnten extrazellulären Bereich des humanen Serrate-2 und des humanen IgGFc nachgewiesen werden. Notch ist bekanntlich an manchen Fällen von Leukämie beteiligt (Ellisen et al., Cell 66, 649–661, 1991). Dementsprechend kann das Polypeptid mit der in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 1 oder 2 beschriebenen Aminosäuresequenz für diagnostische Reagenzien in vitro oder in vivo verwendet werden.
Ein Antikörper, der spezifisch dieses humane Serrate-2 erkennt, kann wie in Beispiel 7 gezeigt hergestellt werden. Er kann ebenso durch verschiedene Verfahren hergestellt werden, die in der Referenz beschrieben sind (Antibodies – A laboratory manual, E. Harlow et al., Cold Spring Harbor Laboratory), sowie durch einen rekombinanten Antikörper, der in Zellen unter Verwendung eines Immunglobulin-Gens exprimiert wird, welches durch ein Verfahren der Genklonierung isoliert wurde. Diese Antikörper können für die Reinigung des humanen Serrate-2 verwendet werden. Der Nachweis und die Messung des humanen Serrate-2 der vorliegenden Erfindung kann durch den Einsatz des Antikörpers erfolgen, der spezifisch das in Beispiel 7 gezeigte, humane Serrate-2 erkennt, und er kann als ein diagnostisches Mittel für Krankheiten verwendet werden, wie zum Beispiel maligne Tumore, die mit einer abnormalen Zelldifferenzierung einhergehen.
Ausführungsformen der Erfindung
Die folgenden Beispiele erläutern die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, sie sind jedoch nicht so aufzufassen, als seien sie auf diese Beispiele beschränkt.
Referenzbeispiel 1
Herstellung einer Gensonde für humanes Serrate-1
Ein gemischter Primer, der einer Aminosäuresequenz entspricht, die in Serrate aus Drosophila und Jagged aus Ratten konserviert ist, das heißt ein Sens-Primer (Sequenzliste SEQ ID Nr. 6) und ein Antisens-Primer (Sequenzliste SEQ ID Nr. 7), wurden verwendet. Die in dieser Sequenz verwendeten Buchstaben bezeichnen jeweils eine äquivalente Mischung: das heißt S: C und G, Y: T und C, W: T und A, K: G und T, R: A und G und N: C, G, T und A.
Ein synthetisches Oligonukleotid wurde unter Verwendung eines automatischen DNA-Synthesegeräts nach dem Prinzip des Festphasenverfahrens hergestellt. Das verwendete automatische DNA-Synthesegerät war 391PCR-MATE von Applied Biosystems Inc., USA. Die Nukleotide, die Träger, an denen das 3'-Nukleotid immobilisiert wurde, die Lösungen und Reagenzien wurden entsprechend den Anleitungen derselben Firma verwendet. Das Oligonukleotid wurde von dem Träger abgelöst, nachdem die gewünschte Kupplungsreaktion beendet war und nachdem der Oligonukleotidträger, von welchem die Schutzgruppe am 5'-Terminus entfernt wurde, mit konzentriertem flüssigen Ammoniak bei Raumtemperatur für 1 Stunde behandelt wurde. Zur Entfernung der Schutzgruppen der Nukleinsäure und Phosphorsäure lies man die Reaktionslösung, welche Nukleinsäure enthielt, in konzentrierter Ammoniaklösung in einem verschlossenen Gefäß bei 55°C für mehr als 14 Stunden stehen. Jedes Oligonukleotid, von welchem der Träger und die Schutzgruppen entfernt wurden, wurde unter Verwendung einer OPC-Kartusche von Applied Biosystems Inc. gereinigt, und durch Verwendung von 2% Trifluoressigsäure detrityliert. Der Primer wurde in entionisiertem Wasser gelöst, um die Endkonzentration nach der Reinigung auf 100 pmol/μl einzustellen, und für die PCR verwendet. Die Synthese des Oligonukleotids wurde in derselben Weise durchgeführt.
Die Vervielfältigung mittels PCR wurde wie folgt durchgeführt.
1 μl einer gemischten cDNA-Lösung, die aus humanem fötalen Gehirn stammt (QUICK-Clone cDNA, Clontec Inc., USA), 5 μl 10 × Pufferlösung [500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl (pH 8,3), 15 mM MgCl₂, 0,01% Gelatine], 4 μl dNTP-Mischung (Takara Shuzo Co., Japan), 5 μl Sens-Primer DLTS1 (100 pmol/μl) und 5 μl Antisens-Primer DLTA2 (100 pmol/μl), die für das vorstehende Serrate-Homologe spezifisch sind, sowie 0,2 μl Taq DNA-Polymerase (AmpliTaq, Takara Shuzo Co., Japan, 5 U/μl) wurden dazu gegeben, und schließlich wurde entionisiertes Wasser zugegeben, um ein Gesamtvolumen von 50 μl einzustellen. Die PCR wurde für 5 Zyklen eines Zyklus' durchgeführt, der aus einer Behandlung bei 95°C für 45 Sekunden, bei 42°C für 45 Sekunden und bei 72°C für 2 Minuten bestand, darüber hinaus durch 35 Zyklen eines Zyklus', der aus einer Behandlung bei 95°C für 45 Sekunden, bei 50°C für 45 Sekunden und bei 72°C für 2 Minuten bestand, und schließlich lies man die Reaktionsmischung bei 72°C für 7 Minuten stehen. Ein Teil des PCR-Produkts wurde einer Elektrophorese mit einem 2% Agarosegel unterzogen, mit Ethidiumbromid (Nippon Gene Co., Japan) gefärbt, und unter ultraviolettem Licht beobachtet, um die Vervielfältigung von etwa 500 bp der cDNA zu bestätigen. Die Gesamtmenge des so erhaltenen PCR-Produkts wurde der Elektrophorese mit einem 2% Agarosegel unterzogen, das aus niedrig schmelzender Agarose hergestellt wurde (Gibco BRL Inc., USA), mit Ethidiumbromid gefärbt, eine Bande von etwa 500 bp wurde unter UV-Licht ausgeschnitten, destilliertes Wasser wurde im selben Volumen wie das Gel hinzugegeben, die Mischung wurde auf 65°C für 10 Minuten erhitzt, um das Gel vollständig zu lösen. Das gelöste Gel wurde bei 1500 UpM für 5 Minuten zentrifugiert, um die überstehende Lösung abzutrennen, nachdem ein gleiches Volumen von mit TE-Puffer gesättigtem Phenol (Nippon Gene Co., Japan) zugegeben wurde, und derselbe Trennungsschritt wurde nach der Zugabe einer mit TE-Puffer gesättigten Phenol:Chloroform-Lösung (1:1) sowie Chloroform durchgeführt. Die DNA wurde aus der schließlich erhaltenen Lösung durch Fällung mit Ethanol gewonnen.
Ein Vektor, pCRII-Vektor (Invitrogen Inc., USA, nachfolgend als pCRII bezeichnet), wurde verwendet. Der Vektor und die vorstehende DNA wurden in einem molaren Verhältnis von 1:3 gemischt, und die DNA wurde in den Vektor unter Verwendung von T4 DNA-Ligase (Invitrogen Inc., USA) ligiert. Der Vektor pCRII, in den die DNA integriert wurde, wurde der Gentransduktion in E. coli in Zellen, die in Bezug auf eine elektrische Entladung kompentent gemacht wurden (Invitrogen Inc., USA), unterzogen, und die Zellen wurden auf einer halbfesten Mediumplatte von L-Medium (Takara Shuzo Co., Japan), das 50 μg/ml Ampicillin (Sigma Corp., USA) enthielt, verteilt, und man lies sie bei 37°C für etwa 12 Stunden stehen. Die aufgetretenen Kolonien wurden willkürlich ausgewählt, in 2 ml flüssiges L-Medium überimpft, das dieselbe Konzentration an Ampicillin enthielt, und bei 37°C für etwa 18 Stunden geschüttelt. Die kultivierten Bakterienzellen wurden gewonnen, und das Plasmid wurde unter Verwendung eines „Wizard Miniprep" (Promega Inc., USA) gemäß der anhängenden Anleitung abgetrennt. Das Plasmid wurde durch das Restriktionsenzym EcoRI verdaut. Die Integration dieses PCR-Produkts wurde durch Herausschneiden von einer 400 bp großen DNA bestätigt. Die Basensequenz der eingebauten DNA in den überprüften Klon wurde durch ein DNA-Sequenzenzierungsgerät auf Fluoreszenzbasis (Model 373S, Applied System Inc., USA) bestimmt. Das klonierte Genfragment wurde mit der Aminosäuresequenz des Notch-Ligandenmoleküls, das heißt Serrate aus Drosophila und Jagged aus Ratten, verglichen, und eine signifikante analoge Sequenz wurde gefunden, und anschließend wurde die Sequenz als das cDNA-Fragment, welches für humanes Serrate-1 codiert, bestätigt.
Referenzbeispiel 2
Klonierung des humanen Serrate-1-Gens mit vollständiger Länge
Ein Screening der Klone mit einer cDNA mit vollständiger Länge wurde durch Hybridisierung mit einer cDNA-Bibliothek, die aus humaner Plazenta stammt (cDNA, die in λgt-11 insertiert ist, Clontec Inc., USA) in Plaques durchgeführt, die 1 × 10⁶ Plaques entsprachen. Erzeugte Plaques wurden auf einen Nylonfilter übertragen (Hybond N+, Amersham Inc., USA). Der Nylonfilter, auf den die Plaques übertragen wurden, wurde einer alkalischen Behandlung unterzogen [man lies ihn für 7 Minuten auf einem Filterpapier stehen, das mit einer Mischung von 1,5 M NaCl und 0,5 M NaOH getränkt war], gefolgt von zwei Neutralisierungsbehandlungen [man lies ihn für 3 Minuten auf einem Filterpapier stehen, das mit einer Mischung von 1,5 M NaCl, 0,5 M Tris-HCl (pH 7,2) und 1 mM EDTA getränkt war]. Anschließend wurde das Nylonfilter für 5 Minuten in einer 2-fach konzentrierten SSPE-Lösung [0,36 M NaCl, 0,02 M Natriumphosphat (pH 7,7) und 2 mM EDTA] gewaschen und an der Luft getrocknet. Anschließend lies man das Nylonfilter für 20 Minuten auf einem Filterpapier stehen, das mit 0,4 M NaOH getränkt war, und es wurde für 5 Minuten mit 5-fach konzentrierter SSPE-Lösung geschüttelt und gewaschen, und anschließend erneut an der Luft getrocknet. Das Screening wurde unter Verwendung des Filters mit einer humanen Serrate-1-Sonde durchgeführt, die mit dem Radioisotop ³²P markiert worden war.
Die zuvor hergestellte DNA-Sonde wurde mit ³²P wie folgt markiert. Ein DNA-Fragment wurde durch EcoRI aus dem Vektor pCRII ausgeschnitten, in welchen das mit den Primern für humanes Serrate erhaltene, gereinigte PCR-Produkt (etwa 500 bp) insertiert worden war, und die DNA-Fragmente wurden aus einem Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt isoliert. Das so erhaltene DNA-Fragment wurde mit dem DNA-Markierungskit (Megaprime DNA Labeling System, Amersham, USA) markiert. 5 μl Primerlösung und entionisiertes Wasser wurden zu 25 ng DNA gegeben, um ein Gesamtvolumen von 33 μl einzustellen, welches für 5 Minuten in einem kochenden Wasserbad behandelt wurde. 10 μl Reaktionspufferlösung, die dNTP enthielt, und 5 μl α-³²P-dCTP und 2 μl T4 DNA-Polynukleotidkinase-Lösung wurden dazu gegeben und bei 37°C für 10 Minuten im Wasserbad behandelt. Nachfolgend wurde die Mischung durch eine Sephadex-Säule (Quick Spin Column Sephadex G-50: Boehringer Mannheim Inc., Deutschland) gereinigt und anschließend für 5 Minuten in einem kochenden Wasserbad behandelt und für 2 Minuten für die weitere Verwendung auf Eis gekühlt.
Die Hybridisierung wurde wie folgt durchgeführt. Das vorstehend vorbereitete Filter wurde in eine Vorhybridisierungs-Lösung eingetaucht, die aus der SSPE-Lösung bestand, in welche die Endkonzentration eines jeden Bestandteils auf die 5-fache Konzentration eingestellt ist, 5-fach konzentrierte Denhardt-Lösung (Wako Pure Chemicals), 0,5% SDS (Natriumdodecylsulfat) und 10 μg/ml durch kochendes Wasser denaturiertes Lachssperma (Sigma Co.), bei 65°C für 2 Stunden geschüttelt, und anschließend wurde das Filter in die Hybridisierungs-Lösung eingetaucht, welche dieselbe Zusammensetzung wie die vorstehende Vorhybridisierungs-Lösung aufwies und die durch das vorstehend erwähnte Verfahren mit ³²P markierte Sonde enthielt, und bei 55°C für 16 Stunden geschüttelt, um die Hybridisierung durchzuführen.
Das Filter wurde durch Eintauchen in eine SSPE-Lösung, die 0,1% SDS enthielt, gewaschen, bei 55°C zweimal geschüttelt, und darüber hinaus vier mal bei 55°C in eine 10-fache Verdünnung der SSPE-Lösung eingetaucht, die 0,1% SDS enthielt. Das gewaschene Filter wurde der Autoradiographie unter Verwendung eines Verstärkerschirms unterzogen. Die Klone, welche einen stark belichteten Teil zeigten, wurden gesammelt, und die so erhaltenen Plaques wurden erneut verteilt und durch dasselbe vorstehend erwähnte Verfahren gescreent, um vollständig vereinzelte Klone abzutrennen.
Die so isolierten Phagenklone waren 22 Klone. Die Phagen von allen diesen Klonen wurden zu 1 × 10⁹ pfu (Plaque bildende Einheiten; plaque forming units) hergestellt, die Phagen-DNA wurde gereinigt, durch das Restriktionsenzym EcoRI verdaut und in den Vektor pBluescript (Stratagene Inc., USA) insertiert, der mit EcoRI in derselben Weise verdaut worden war. Die DNA-Sequenzen von beiden Enden dieser Klone wurden mittels eines DNA-Sequenzierungsgeräts analysiert. Zwei Klone von S16 und S20 waren die Klone, welche die DNA-Sequenz von Nr. 1 bis 1873 in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 5 enthielten. Die Klone S5 und S16 waren die Klone, welche die DNA-Sequenz von Nr. 990 bis 4005 in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 5 enthielten. Die Deletionsmutante dieser Klone wurde unter Verwendung eines Kilosequenz-Deletionskits (Takara Shuzo Co.) gemäß einer Beschreibung der anhängenden Anleitung hergestellt. Die cDNA-Basensequenz mit vollständiger Länge, welche für das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, wurde unter Verwendung eines DNA-Sequenzierungsgeräts (Applied Biosystems Inc.) sowohl aus der 5'-Richtung als auch aus der 3'-Richtung bestimmt.
Als ein Ergebnis wurde gefunden, dass etwa 100 bp in einem Bereich, der für den C-Terminus der Aminosäuresequenz codiert, nicht kloniert worden waren, und entsprechend wurde die Klonierung des Gens mit vollständiger Länge unter Verwendung des Gibco-BRL 3'-RACE Systemkits gemäß dem anhängenden Handbuch durchgeführt. Die cDNA-Klonierung wurde durch eine Poly A⁺-RNA (Clontech Corp.) von humanem Ursprung in 3'-Richtung durchgeführt, und die Gensequenz wurde bestimmt.
Die so klonierten drei Genfragmente in einem Plasmid, das eine DNA-Sequenz der SEQ ID Nr. 5 mit vollständiger Länge enthielt, wurden unter Verwendung der Schnittstelle für das Restriktionsenzym BglII bei der DNA-Sequenz Nr. 1293 in der SEQ ID Nr. 5 und der Schnittstelle für AccI bei Nr. 3943 zwischen die Schnittstellen für EcoRI und XbaI der Multiklonierungs-Schnittstelle von pUC18 insertiert, um pUCSR-1 herzustellen. Die Sequenz dieses Gens zusammen mit der Aminosäuresequenz ist in SEQ ID Nr. 5 gezeigt.
Beispiel 1
Herstellung einer Sonde durch PCR
Gensonden, die für das Screening verwendet wurden, das heißt das in den SEQ ID Nr. 8, 9 und 10 beschriebene Gen, wurden wie folgt erhalten. Diese Sequenzen entsprechen der Genbank Registrierungsnummer T08853, R50026 und R45751. Anschließend wurde eine Sonde mit der Gensequenz SEQ ID Nr. 8 als Y1 bezeichnet, eine Sonde mit der Gensequenz SEQ ID Nr. 9 wird als Y2 bezeichnet, und eine Sonde mit der Gensequenz SEQ ID Nr. 10 wird als Y4 bezeichnet.
Es wurde nämlich ein Gen der SEQ ID Nr. 8 mittels PCR unter Verwendung der Primer eines Oligonukleotids mit der SEQ ID Nr. 11 und 12 isoliert; ein Gen der SEQ ID Nr. 9 wurde mittels PCR unter Verwendung von Primern der Oligonukleotide mit der SEQ ID Nr. 13 und 14 isoliert; und ein Gen der SEQ ID Nr. 10 wurde mittels PCR unter Verwendung der Primer der Oligonukleotide mit der SEQ ID Nr. 15 und 16 isoliert.
Die Vervielfältigung mittels PCR wurde wie folgt durchgeführt. 1 μl einer gemischten cDNA-Lösung, die aus einem humanen fötalen Gehirn stammt (Quick-Clone cDNA, Clontec Inc., USA) wurde verwendet. 5 μl 10-fach Pufferlösung [500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl (pH 8,3), 15 mM MgCl₂, 0,01% Gelatine], 4 μl dNTP-Mischung (Takara Shuzo Co., Japan), jeweils 1 μl der vorstehend erwähnten Primer (20 pmol/μl) und 0,2 μl Taq DNA-Polymerase (Ampli-Taq, Takara Shuzo Co., Japan, 5 U/μl) wurden hierzu gegeben, und schließlich wurde entionisiertes Wasser zugegeben, um das Gesamtvolumen auf 50 μl einzustellen. Die PCR wurde mittels 40 Zyklen eines Zyklus' durchgeführt, der aus einer Behandlung bei 95°C für 1 Minute, bei 55°C für 5 Minuten und bei 72°C für 3 Minuten bestand, und schließlich lies man die Reaktionsmischung bei 72°C für 7 Minuten stehen. Ein Teil des PCR-Produkts wurde einer Elektrophorese mit einem 2% Agarosegel unterzogen, mit Ethidiumbromid (Nippon Gene Co., Japan) gefärbt und unter ultraviolettem Licht beobachtet, um die Vervielfältigung des Gens mit der gewünschten Größe zu bestätigen.
Die Gesamtmenge des so erhaltenen PCR-Produkts wurde der Elektrophorese mit einem 2% Agarosegel unterzogen, das mit einer Agarose von niedrigem Schmelzpunkt hergestellt worden war (Gibco BRL Inc., USA), das Gel wurde mit Ethidiumbromid gefärbt, die Banden wurden jeweils unter UV-Licht ausgeschnitten; es wurde destillertes Wasser im gleichen Volumen wie das Gel zugegeben, die Mischung wurde bei 65°C für 10 Minuten erhitzt, bis das Gel vollständig gelöst war. Das gelöste Gel wurde bei 15.000 UpM für 5 Minuten zentrifugiert, um eine Lösung des Überstands abzutrennen, nachdem ein gleiches Volumen von mit TE-Puffer gesättigtem Phenol (Nippon Gene Co., Japan) zugegeben wurde, und derselbe Trennungsschritt wurde nach der Zugabe einer mit TE-Puffer gesättigten Phenol:Chloroform Lösung (1:1) und Chloroform durchgeführt. Die DNA wurde aus der schließlich erhaltenen Lösung durch Fällung mit Ethanol gewonnen.
Ein Vektor, pCRII Vektor (Invitrogen Inc., USA, nachfolgend als pCRII bezeichnet), wurde verwendet. Der Vektor und die vorstehende DNA wurden im molaren Verhältnis von 1:3 gemischt, und die DNA wurde in den Vektor unter Verwendung von T4 DNA-Ligase (Invitrogen Inc., USA) ligiert. Der Vektor pCRII, in den die DNA integriert worden war, wurde der Gentransduktion in E. coli Zellen unterzogen, die in Bezug auf eine elektrische Entladung kompetent gemacht worden waren (Invitrogen Inc., USA), und die Zellen wurden auf einer halbfesten Mediumplatte mit L-Medium (Takara Shuzo Co., Japan), die 50 μg/ml Ampicillin (Sigma Corp., USA) enthielt, verteilt, und man lies sie bei 37°C für etwa 12 Stunden stehen. Die aufge tretenen Kolonien wurden zufällig ausgewählt, in 2 ml flüssiges L-Medium überimpft, das dieselbe Konzentration an Ampicillin enthielt, und durch Schütteln bei 37°C für etwa 18 Stunden kultiviert. Die kultivierten Bakterienzellen wurden gewonnen, und das Plasmid wurde unter Verwendung eines „Wizard Miniprep" (Promega Inc., USA) gemäß der anhängenden Anleitung abgetrennt. Das Plasmid wurde durch das Restriktionsenzym EcoRI verdaut. Der Einbau dieses PCR-Produkts wurde durch Ausschneiden der DNA mit der gewünschten Größe bestätigt. Die Basensequenz der eingebauten DNA in dem bestätigten Klon wurde durch DNA-Sequenzierung auf Fluoreszenzbasis (Model 3735, Applied System Inc., USA) bestimmt. Die Sequenz wurde mit der DNA-Sequenz verglichen, die zuvor in der Genbank registriert worden war. Die Isolierung eines Gens mit den DNA-Sequenzen SEQ ID Nr. 8, 9 und 10 wurde bestätigt.
Beispiel 2
Klonierung des humanen Serrate-2 Gens mit vollständiger Länge
Ein Screening der Klone mit einer cDNA von vollständiger Länge wurde durch Hybridisierung einer cDNA-Bibliothek, die aus humanem fötalen Gehirn stammt (cDNA, die in λgt-11 insertiert wurde, Clontech Inc.), in Plaques durchgeführt, die 1 × 10⁶ Plaques entsprachen. Die aufgetretenen Plaques wurden mit Alkali durch dasselbe Verfahren wie vorstehend in Referenzbeispiel 2 beschrieben fixiert. Unter Verwendung dieser Filter und unter Verwendung dreier Arten von Sonden, welche in Beispiel 1 isoliert und durch das in Referenzbeispiel 2 beschriebene Verfahren mit ³²P markiert worden waren, wurde das Screening jeweils einzeln durchgeführt, um die Klone zu erhalten.
Die isolierten Phagenklone waren: 2 Klone aus einem Fall, in dem Y1 als eine Sonde verwendet wurde; 6 Klone aus einem Fall, in dem Y2 als eine Sonde verwendet wurde; und 4 Klone aus einem Fall, in dem Y4 als eine Sonde verwendet wurde. Klone, die mit Y4 isoliert wurden, waren alle in den Klonen enthalten, die mit Y2 isoliert wurden. Alle Phagen dieser Klone wurden mit etwa 1 × 10⁹ pfu (Plaque bildende Einheiten; plaque forming units) hergestellt, und die Phagen-DNA wurde unter Verwendung eines „Wizard Lambda Preps" (Promega Inc.) gemäß der anhängenden Anleitung gereinigt, mit EcoRI verdaut, und anschließend in den Vektor pBluescript (Stratagene Inc.) oder pUC18 (Pharmacia Inc.) eingebaut, der mit EcoRI verdaut worden war.
Die vollständige DNA-Sequenz dieser Klone wurde mit einem DNA-Sequenzierungsgerät wie in Referenzbeispiel 2 beschrieben bestimmt, und ein Teil der identischen Sequenz wurde verglichen. Die Ergebnisse weisen auf folgendes hin: Klon Nr. 5 war ein Klon, der die DNA-Sequenz von Nr. 484 bis 2025 in der SEQ ID Nr. 4 enthielt; Klon Nr. 21 war ein Klon, der die DNA-Sequenz von Nr. 1882 bis 3537 in der SEQ ID Nr. 4 enthielt; und Klon Nr. 86 war ein Klon, der die DNA-Sequenz von Nr. 2455 bis 3955 in der SEQ ID Nr. 4 enthielt. Die verbleibenden Klone waren jene, die nur ein kurzes Insert enthielten, das aus einem Teil bestand, der mit den Sequenzen von jenen Klonen identisch war. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass als ein Ergebnis des Vergleichs mit der Aminosäure des humanen Serrate-1 der Bereich der für den N-Terminus codierenden Aminosäuresequenz nicht kloniert worden war. Infolge dessen wurde eine Sonde mit der DNA-Sequenz der SEQ ID Nr. 17 hergestellt, und das Screening wurde ein zweites mal durchgeführt, um die cDNA im 5'-Bereich zu klonieren. Eine Sonde wurde in derselben Weise wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt, es wurden nämlich die PCR-Primer mit einer DNA-Sequenz der SEQ ID Nr. 18 und 19 einer PCR unterzogen, wobei der Klon Nr. 5 als ein Templat verwendet wurde. Die verwendete Bibliothek wurde in derselben Weise wie beim ersten Screening hergestellt, und die Bedingungen waren dieselben wie bei dem vorstehend erwähnten Verfahren.
Die so isolierten Klone aus dem zweiten Screening waren sechs Klone. Phagen von allen diesen Klonen wurden mit etwa 1 × 10⁹ pfu (Plaque bildende Einheiten; plaque forming units) hergestellt, und mit „Wizard Lambda Preps" (Promega Inc.) gemäß der anhängenden Anleitung gereinigt, mit EcoRI verdaut und in den Vektor pUC18 insertiert, der ebenfalls mit EcoRI verdaut worden war. Die vollständige DNA-Sequenz dieser Klone wurde durch DNA-Sequenzierung wie in Referenzbeispiel 2 bestimmt. Als ein Ergebnis des Vergleichs mit einem Teil der identischen Sequenz wurde der Klon S43-1 erhalten, von dem man glaubt, dass er die am nächsten zum 5'-Ende gelegene DNA enthalte. Dieser Klon war ein Klon, der die DNA-Sequenz von Nr. 38 bis 1538 in der SEQ ID Nr. 4 enthielt. Die verbleibenden Klone waren Klone, welche lediglich ein kurzes Insert enthielten, das aus einem Teil besteht, der mit der Sequenz identisch ist, welche bereits in den anderen Klonen bestimmt oder beim ersten mal isoliert worden war.
Obwohl eine Sequenz von ATG, welche für das Translations-Startcodon Methionin codiert, bei den Klonen des zweiten Screenings nicht gefunden werden konnte, wurde eine weitere Klonierung der cDNA-Sequenz in 5'-Richtung durch das 5'-RACE-Verfahren durchgeführt. 5'-RACE wurde unter Verwendung eines 5'-RACE Systemkits (Gibco BRL Inc.) gemäß dem anhängenden Handbuch durchgeführt. Eine Klonierung der cDNA in 5'-Richtung des Gens unter Verwendung von Poly A⁺-RNA (Clontech Inc.), die aus menschlichem Herz stammt, wurde durchgeführt, und eine Gensequenz aus der DNA-Sequenz Nr. 1 bis Nr. 37 in der SEQ ID Nr. 4 wurde bestimmt.
Als ein Ergebnis wurde eine DNA-Sequenz in der SEQ ID Nr. 4, das heißt eine cDNA-Sequenz, welche für ein humanes Serrate-2 von vollständiger Länge codiert, bestimmt.
Um eine cDNA, welche für das Gen mit vollständiger Länge codiert, und um eine cDNA am 5'-Terminus zu erhalten, welche mit dem anderen Klon ligiert werden kann, wurde die folgende PCR für die Klonierung durchgeführt. Unter Verwendung des Oligonukleotids mit der DNA-Sequenz der SEQ ID Nr. 20 und des Oligonukleotids mit der DNA-Sequenz der SEQ ID Nr. 21 wurde die PCR gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren durch geführt, wobei der Klon S43-1 als ein Templat verwendet wurde. In ähnlicher Weise wurde es in pCRII subkloniert und die Gensequenz wurde bestimmt, um den Klon mit der DNA-Sequenz von Nr. 1 bis Nr. 503 in der SEQ ID Nr. 4 herzustellen. Dieser Klon wird als S2-5 bezeichnet.
Von den vorstehenden Klonen, das heißt das Gen S2-5, S43-1, Nr. 5, Nr. 21 und Nr. 86, wurden die Klone S2-5 und S43-1 an der Schnittstelle für das Restriktionsenzym SplI bei der DNA-Sequenz Nr. 217 in der SEQ ID Nr. 4 herangezogen; die Situation bei S43-1 und Nr. 5 war dieselbe wie an der Schnittstelle für KpnI bei Nr. 1453; die Situation bei Nr. 5 und Nr. 21 war dieselbe wie an der Schnittstelle für SacI bei Nr. 2016; und die Situation bei Nr. 21 und Nr. 86 war dieselbe wie an der Schnittstelle für BamHI bei Nr. 2991, und schließlich wurde die DNA mit der DNA-Sequenz der SEQ ID Nr. 4 zwischen die EcoRI Schnittstelle und die HindIII Schnittstelle der Multiklonierungs-Schnittstelle von pUC18 insertiert, um pUCSR-2 herzustellen.
Beispiel 3
Expression des humanen Serrate-2 in Organen
Um die Expression von mRNA des humanen Serrate-2 zu untersuchen, wurden Filter verwendet, auf die zuvor mRNA übertragen wurde, das heißt „Human Multiple Tissue Northern Blot", „Human Multiple Tissue Northern Blot II", „Human Multiple Tissue Northern Blot III" und „Human Fetal Multiple Tissue Northern Blot II" (Clontech Inc.), das heißt ein Northern-Blot mit verschiedenen humanen (fötalen) Geweben, und die Markierung mit ³²P wurde durch das vorstehend beschriebene Verfahren unter Verwendung des vorstehend erwähnten DNA-Markierungskits (Mega Prime DNA Labeling System, Amersham Inc.) mit einer DNA-Sonde mit der Sequenz der SEQ ID Nr. 17 durchgeführt, die in Beispiel 2 beschrieben ist, und die Expression wurde untersucht, wobei eine Hybridisierung gemäß der Beschreibung durchgeführt wurde, die als Gebrauchsanleitung den vorstehenden Filtern beigelegt ist.
Als ein Ergebnis betrug die Länge der exprimierten mRNA etwa 5 kb. Eine starke Expression in menschlichen erwachsenen Geweben wurde im Herz, dem Skelettmuskel, der Schilddrüse, dem Rückenmark und der Luftröhre gefunden, eine deutliche Expression wurde in der Bauchspeicheldrüse, der Vorsteherdrüse, den Hoden, dem Dünndarm, der Nebennierendrüse beobachtet, eine sehr schwache Expression wurde im Gehirn, dem Mutterkuchen, der Niere, dem Thymus, dem Eierstock, dem Magen und den Lymphknoten beobachtet, und keine Expression wurde in der Lunge, der Leber, der Milz, dem Dickdarm, den peripheren Lymphknoten und dem Knochenmark beobachtet. In den humanen fötalen Geweben wurde eine starke Expression in der fötalen Lunge beobachtet, eine deutliche Expression wurde im fötalen Gehirn und der fötalen Niere beobachtet, und keine Expression wurde in der fötalen Leber beobachtet.
Beispiel 4
Herstellung eines Expressionsvektors des humanen Serrate-2
Unter Verwendung des Gens, das aus der in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 4 beschriebenen DNA-Sequenz besteht, wurden Expressionsvektoren für das humane Serrate-2 und seines in den folgenden Punkten 1) bis 5) erwähnten chimären Proteins hergestellt.
1) Expressionsvektor des sekretorischen extrazellulären humanen Serrate-2
Die cDNA, welche für das Polypeptid der Aminosäuresequenz von Nr. 1 bis 1055 in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 2 codiert, wurde in den Expressionsvektor pMKITNeo (Maruyama et al., Preliminary Paper, Japan Molecular Biology Soc., 1991, erhältlich von Prof. Maruyama, Tokyo Medical and Dental Univ.) ligiert, der einen SRα-Promotor und ein Neomycin-Resistenzgen aufweist, um einen Expressionsvektor herzustellen.
Es wurde nämlich ein Vektor pUCSR-2, der eine DNA-Sequenz der SEQ ID Nr. 4 enthält, als Templat verwendet, und ein Oligonukleotid mit der Sequenz der SEQ ID Nr. 23 und ein Oligonukleotid mit der Sequenz der SEQ ID Nr. 24 wurden als Primer verwendet, und eine PCR wurde gemäß dem vorstehend erwähnten Verfahren durchgeführt. Das PCR-Produkt wurde in den Klonierungsvektor pCRII ligiert, die Gensequenz des PCR-Produkts wurde bestimmt, um eine DNA herzustellen, welche eine Gensequenz von Nr. 2986 bis 3254 der DNA-Sequenz der SEQ ID Nr. 4 aufweist, in welcher das Stoppcodon und die Schnittstelle für das Restriktionsenzym SalI am 3'-Ende angefügt wurden.
Ein etwa 3 kbp großes Genfragment, welches durch den Verdau von pUCSR-2 mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI erhalten wurde, ein etwa 250 bp großes Genfragment, welches durch Verdau des pCRII-Vektors mit den Restriktionsenzymen BamHI und SalI erhalten wurde, der Vektor, welcher das vorstehende PCR-Produkt als ein Insert enthielt, und ein etwa 4,3 kb großes Genfragment, welches durch Verdau des Vektors pMKITneo mit den Restriktionsenzymen EcoRI und XhoI erhalten wurde, und diese drei Genfragmente wurden gleichzeitig ligiert, um den Expressionsvektor zu erhalten, der ein Genfragment der DNA-Sequenz von Nr. 1 bis 3254 der SEQ ID Nr. 4 enthält. Der Expressionsvektor pMEXS2 für das sekretorische extrazelluläre humane Serrate-2-Protein (nachfolgend wird dieses Protein als EXS2 bezeichnet) wurde erhalten.
2) Expressionsvektor für das chimäre Protein des sekretorischen extrazellulären humanen Serrate-2 und FLAG
Die cDNA, welche für das chimäre Protein codiert, an welches die für die FLAG-Sequenz (SEQ ID Nr. 22) codierende cDNA am C-Terminus des Polypeptids von Nr. 1 bis 1055 der Aminosäuresequenz der Sequenzliste SEQ ID Nr. 2 angefügt worden war, wurde in den Expressionsvektor pMKITNeo ligiert, um den Expressionsvektor herzustellen.
Es wurde nämlich der Vektor pUCSR-2, der die DNA-Sequenz in der SEQ ID Nr. 4 enthält, als Templat verwendet, und das Oligonukleotid mit der Sequenz der SEQ ID Nr. 23 und das Oligonukleotid mit der Sequenz der SEQ ID Nr. 25 wurden als Primer verwendet, und die PCR wurde gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren durchgeführt. Das PCR-Produkt wurde in den Klonierungsvektor pCRII ligiert, die Gensequenz des PCR-Produkts wurde bestimmt, um eine DNA der Gensequenz von Nr. 2986 bis 3254 der DNA-Sequenz der SEQ ID Nr. 4 herzustellen, in welcher die für die FLAG-Sequenz codierende DNA am 3'-Ende (DNA-Sequenz der SEQ ID Nr. 22), das Stoppcodon und die Schnittstelle für das Restriktionsenzym SalI am 3'-Ende angefügt wurden.
Ein etwa 3 kbp großes Genfragment, welches durch Verdau des Vektors pUCSR-2 mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI erhalten wurde, ein etwa 300 bp großes Genfragment, das durch Verdau des Vektors pCRII mit den Restriktionsenzymen BamHI und SalI erhalten wurde, der Vektor, welcher das vorstehende PCR-Produkt als ein Insert enthielt, und ein etwa 4,3 kb großes Genfragment, das durch Verdau des Vektors pMKITneo mit den Restriktionsenzymen EcoRI und XhoI erhalten wurde, und diese drei Genfragmente wurden gleichzeitig ligiert (obwohl die Erkennungssequenz für die Restriktionsenzyme XhoI und SalI unterschiedlich ist, können sie aufgrund einer komplementären, endständigen Gensequenz ligiert werden), um den Expressionsvektor zu erhalten, der ein Genfragment der DNA-Sequenz von Nr. 1 bis 3254 in der SEQ ID Nr. 4 und ein Genfragment, das für die FLAG-Sequenz codiert, enthält. Ein Expressionsvektor pMEXS2FLAG für das chimäre Protein aus dem sekretorischen extrazellulären Serrate-2 und FLAG (nachfolgend wird dieses Protein als EXS2FLAG bezeichnet) wurde erhalten.
3) Expressionsvektor des chimären Proteins des sekretorischen, extrazellulären, humanen Serrate-2 und IgG1Fc
Eine cDNA, welche für das chimäre Protein codiert, an welches die cDNA am C-Terminus des Polypeptids mit der Aminosäuresequenz von Nr. 1 bis 1055 in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 2 angefügt worden war, welche angefügte cDNA für die Aminosäuresequenz des Fc-Bereichs unterhalb des Gelenkteils des humanen IgG1 codiert, wurde in den Expressionsvektor pMKITNeo ligiert, um den Expressionsvektor herzustellen.
Die Herstellung des Fusionsproteins mit dem Immunglobulin Fc-Protein wurde gemäß dem Verfahren von Zettlmeissl et al. (Zettlmeissl et al., DNA Cell Biol. 9, 347–354, 1990) durchgeführt. Ein Gen unter Verwendung genomischer DNA mit Introns wurde herangezogen, und dieses Gen wurde mittels PCR erhalten.
Humane, genomische DNA wurde als ein Templat verwendet. Das Oligonukleotid mit der Sequenz der Sequenzliste SEQ ID Nr. 28 mit der Schnittstelle für das Restriktionsenzym BamHI, und das Oligonukleotid mit der Sequenz der Sequenzliste SEQ ID Nr. 29 mit der Schnittstelle für das Restriktionsenzym XbaI wurden als Primer verwendet. Die PCR für die Gensequenz, welche für humanes IgG1Fc codiert, wurde unter Verwendung der Primer und der humanen genomischen DNA als Templat durchgeführt. Eine etwa 1,4 kbp große Bande wurde gereinigt, mit den Restriktionsenzymen BamHI und XbaI (Takara Shuzo Co., Japan) behandelt, und die Gene wurden durch Verwendung von T4 DNA-Ligase in den Vektor pBluescript ligiert, der in ähnlicher Weise mit Restriktionsenzymen behandelt worden war, um einen Subklon herzustellen. Später wurde die Plasmid-DNA gereinigt und sequenziert, um die Gensequenz zu bestätigen, und anschließend wurde diese Gensequenz als genomische DNA im Gelenkbereich der schweren Kette von humanem IgG1 bestätigt. (Für die Sequenz wird verwiesen auf Kabat et al., Sequence of Immunological Interest, NIH Publication Nr. 91–3242, 1991). Nachfolgend wird dieses Plasmid als pBShIgFc bezeichnet.
Ein Vektor pUCSR-2 mit der DNA-Sequenz der SEQ ID Nr. 4 wurde als Templat, und ein Oligonukleotid mit der Sequenz der SEQ ID Nr. 23 und ein Oligonukleotid mit der Sequenz der SEQ ID Nr. 26 wurden als Primer verwendet, und eine PCR wurde gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren durchgeführt. Das PCR-Produkt wurde in den Klonierungsvektor pCRII ligiert, die Gensequenz des PCR-Produkts wurde bestimmt, um eine DNA mit einer Gensequenz von Nr. 2986 bis 3254 der DNA-Sequenz in der SEQ ID Nr. 4 herzustellen, an welche die Schnittstelle für das Restriktionsenzym BglII am 3'-Ende angefügt worden war.
Ein etwa 250 bp großes Genfragment, welches durch den Verdau des pCRII-Vektors, der das vorstehende PCR-Produkt als ein Insert enthielt, mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI erhalten wurde, und welches für das vorstehend erwähnte, humane IgG1Fc codiert, wurde als ein Insert ligiert. In diesem Fall können die Schnittstellen von BamHI und BglII aufgrund der komplementären verdauten endständigen Gensequenz miteinander ligiert werden. Darüber hinaus kann dieser Teil durch diese Restriktionsenzyme nicht verdaut werden.
Ein etwa 1,5 kbp großes Genfragment, welches durch Verdau dieses Vektors mit den Restriktionsenzymen BamHI und NotI erhalten wurde, ein etwa 3 kbp großes Genfragment, welches durch Verdau des Vektors pUCSR-2 mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI erhalten wurde, und ein etwa 4,3 kbp großes Genfragment, das durch Verdau von pMKITNeo mit den Restriktionsenzymen EcoRI und NotI erhalten wurde, und diese drei Genfragmente wurden gleichzeitig ligiert (obwohl die Restriktionsenzyme XhoI und SalI unterschiedliche Erkennungssequenzen aufweisen, können sie aufgrund der komplementären verdauten endständigen Gensequenzen miteinander ligiert werden). Ein Expressionsvektor, welcher das Genfragment der DNA-Sequenz von Nr. 1 bis 3254 in der SEQ ID Nr. 4 und ein für humanes IgG1Fc codierendes Genfragment enthält, wurde erhalten. Der Expressionsvektor pMEXS2Fc des chimären Proteins aus dem sekretorischen extra zellulären humanen Serrate-2 und IgG1Fc wurde erhalten (nachfolgend wird dieses Protein als EXS2Fc bezeichnet).
4) Expressionsvektor des humanen Serrate-2-Proteins mit vollständiger Länge
Die cDNA, welche für das Polypeptid von Nr. 1 bis 1212 der Aminosäuresequenz in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 3 codiert, wurde in den Expressionsvektor pMKITNeo ligiert, um den Expressionsvektor herzustellen.
Es wurde nämlich ein 4 kbp großes Genfragment, welches durch Verdau des Vektors pUCSR-2 mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII ausgeschnitten wurde, in den Vektor pBluescript ligiert, welcher mit denselben Restriktionsenzymen verdaut worden war. Nachfolgend wurde ein 4 kbp großes Genfragment, das aus diesem Vektor durch Verdau mit den Restriktionsenzymen EcoRI und XhoI ausgeschnitten wurde, mit einem etwa 4,3 kbp großen Genfragment, das durch Verdau des Expressionsvektors pMKITNeo mit den Restriktionsenzymen EcoRI und NotI erhalten wurde, ligiert, um einen Expressionsvektor herzustellen, der das Genfragment der DNA-Sequenz von Nr. 1 bis 3955 in der SEQ ID Nr. 4 enthält. Ein Expressionsvektor für das humane Serrate-2-Protein mit vollständiger Länge (nachfolgend wird dieses Protein als FS2 bezeichnet) wurde erhalten.
5) Expressionsvektor für das chimäre Protein aus FLAG und humanem Serrate-2 mit vollständiger Länge
Die cDNA, welche für das chimäre Protein codiert, an welche die für die FLAG-Sequenz codierende cDNA (SEQ ID Nr. 22) am C-Terminus des Polypeptids von Nr. 1 bis 1212 der Aminosäuresequenz in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 3 angefügt worden war, wurde in den Expressionsvektor pMKITNeo ligiert, um den Expressionsvektor herzustellen.
Es wurde nämlich der Vektor pUCSR-2 mit der DNA-Sequenz der SEQ ID Nr. 4 als Templat verwendet, und die Oligonukleotide mit der Sequenz der SEQ ID Nr. 23 und das Oligonukleotid mit der Sequenz der SEQ ID Nr. 27 wurden als Primer verwendet, und die PCR wurde gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren durchgeführt. Das PCR-Produkt wurde in den Klonierungsvektor pCRII ligiert, die Gensequenz des PCR-Produkts wurde bestimmt, um eine DNA mit der Gensequenz von Nr. 2986 bis 3725 der DNA-Sequenz der SEQ ID Nr. 4 herzustellen, an welche die für die FLAG-Sequenz codierende DNA-Sequenz am 3'-Ende (DNA-Sequenz der SEQ ID NR. 22), das Stoppcodon und die Schnittstelle für das Restriktionsenzym SalI am 3'-Ende angefügt wurden.
Ein etwa 3 kbp großes Genfragment, welches durch Verdau des pUCSR-2 mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI erhalten wurde, ein etwa 700 bp großes Genfragment, welches durch Verdau des Vektors pCRII mit den Restriktionsenzymen BamHI und SalI erhalten wurde, der Vektor, welcher das vorstehende PCR-Produkt als ein Insert enthielt, und ein etwa 4,3 kbp großes Genfragment, das durch Verdau des Vektors pMKITNeo mit den Restriktionsenzymen EcoRI und XhoI erhalten wurde, und diese drei Genfragmente wurden gleichzeitig ligiert (obwohl die Erkennungssequenzen der Restriktionsenzyme XhoI und SalI unterschiedlich sind, können sie aufgrund der komplementären endständigen Gensequenz miteinander ligiert werden), um den Expressionsvektor zu erhalten, der das Genfragment der DNA-Sequenz von Nr. 1 bis 3725 der SEQ ID Nr. 4 und das für die FLAG-Sequenz codierende Genfragment enthielt. Der Expressionsvektor pMFS2FLAG für das chimäre Protein aus humanem Serrate-2 mit vollständiger Länge und FLAG (nachfolgend wird dieses Protein als FS2FLAG bezeichnet) wurde erhalten.
Beispiel 5
Expression und Gentransfer des Expressionsvektors für humanes Serrate-2 in Zellen
Die in Beispiel 4 hergestellten Expressionsvektoren werden in COS-7-Zellen transduziert (erhalten von RIKEN Cell Bank, Physical and Chemical Research Institute, Japan, RCB0539).
Die Zellkultur vor der Gentransduktion wurde durch Kultivieren in D-MEM-Medium (Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium, Gibco BRL Inc., USA) mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) durchgeführt. Einen Tag vor der Gentransduktion wurde das Medium der Zellen ausgetauscht, um die Zahl der Zellen auf 5 × 10⁷ Zellen/ml einzustellen, und die Zellen wurden über Nacht kultiviert. Am Tag der Gentransduktion wurden die Zellen durch Zentrifugation sedimentiert, durch Zentrifugieren zweimal mit PBS(–) gewaschen und die Zellen auf 1 × 10⁷ Zellen/ml in PBS(–), 1 mM MgCl₂ eingestellt, und der Gentransfer wurde durch Elektroporation unter Verwendung einer Gentransduktions-Vorrichtung „Gene-Pulsar" (BioRad Inc., USA) durchgeführt. 500 μl der vorstehenden Zellsuspension wurden in die Zelle für die Elektroporation gegeben (0,4 mm), der 20 μg des Expressionsvektors zugegeben wurden, und man lies sie in Eis für 5 Minuten stehen. Die Elektroporation wurde unter den Bedingungen von 3 μF und einer zweimaligen Entladung bei 450 V durchgeführt; während der zwei Elektroporationen lies man die Zellmischung bei Raumtemperatur für 1 Minute stehen. Nach 5-minütigem Stehen auf Eis wurden die Zellen in einem Kulturmedium verteilt, Durchmesser 10 cm, zu welchem zuvor 10 ml des vorstehend beschriebenen Mediums gegeben wurden, und die Zellen wurden bei 37°C in einem Inkubator mit 5% Kohlendioxid kultiviert.
Am nächsten Tag wurde die Lösung des Kulturüberstands entfernt, und die an der Kulturschale haftenden Zellen wurden zweimal mit 10 ml PBS(–) gewaschen, und 10 ml serumfreies D-MEM-Medium wurden zugegeben, und die Zellen wurden für 4 Tage kultiviert. Im Falle der Gentransduktion mit den Expressionsvektoren pMEXS2, pMEXS2FLAG und pMEXS2Fc wurde die Lösung des Kulturüberstands gewonnen und durch den Puffer PBS(–) durch Centricon 30 (Amicon Inc., USA) ersetzt, und gleichzeitig wurde die Lösung auf das 10-fache konzentriert, um eine Lösung des Überstands der Zellkultur zu erhalten.
Im Falle der Gentransduktion mit pMSF2 und pMFS2FLAG wurden die Zellen nach 4 Tagen Kultur mit 10 ml PBS(–) gewaschen. Die Zellen wurden mit einem Zellschaber (Corster Corp.) abgeschabt, 10 ml PBS(–) wurden erneut zugegeben, und die Zellen wurden bei 1500 UpM für 5 Minuten zentrifugiert und gewaschen. Die Zellpräzipitate wurden in 500 μl Puffer für den Zellaufschluss [50 mM Hepes (pH 7,5), 1% Triton X100, 10% Glycerin, 4 mM EDTA, 50 μg/ml Aprotinin, 100 μM Leupeptin, 25 μM Pepstatin A und 1 mM PMSF] suspendiert, und man lies sie in Eis für 20 Minuten stehen, und sie wurden bei 15.000 UpM für 20 Minuten zentrifugiert, um die Lösung des Überstands zu sammeln, und Zelllysate zu erhalten.
Unter Verwendung dieser Proben wurde die Expression des FLAGchimären und des Immunglobulin-chimären Proteins durch Western-Blot nachgewiesen. Es wurden nämlich konzentrierte Kulturüberstände oder Zelllysate der SDS-PAGE unterzogen, wobei ein Elektrophoresetank und ein Polyacrylamidgel für die SDS-PAGE (ein Gradientengel mit 5–15%, ACI Japan Inc., Japan) gemäß der Anleitung des Herstellers verwendet wurden. Die Proben wurden durch Behandlung in kochendem Wasser für 5 Minuten mit 2-Mercaptoethanol (2-ME) für die Reduktion hergestellt, und unter nicht-reduzierenden Bedingungen, ohne die vorstehende Behandlung vorzunehmen. Als ein Marker wurde ein „Rainbow Marker" (hohes Molekulargewicht, Amersham Inc.) verwendet. Die Lösungen für den Probenpuffer und den Elektrophoresepuffer wurden unter Bezugnahme auf die anhängende Gebrauchsanleitung hergestellt. Nachdem die SDS-PAGE beendet war, wurde das Acrylamidgel auf ein PVDF-Membranfilter (BioRad Inc., USA) un ter Verwendung einer „Mini Trans Blot Cell" (BioRad Inc.) übertragen.
Das so hergestellte Filter wurde über Nacht bei 4°C in „Blockace" (Dainippon Pharm. Co., Japan), TBS-T [20 mM Tris, 137 mM NaCl (pH 7,6) und 0,1% Tween 20] geschüttelt, um eine Blockierung zu erreichen. Gemäß der Erläuterung der anhängenden Gebrauchsanleitung für das „ECL Western Blot" Nachweissystem (Amersham Inc., USA) wurde wie folgt vorgegangen: für den Fall, dass das Protein ein FLAG-chimäres Protein war, wurde ein monoklonaler, gegen FLAG M2 gerichteter Antikörper aus der Maus (Eastman Kodak, USA) als Primärantikörper verwendet, und die mit Peroxidase markierten, gegen Maus-Immunglobuline gerichteten Antikörper aus dem Schaf (Amersham Inc., USA) wurden als Sekundärantikörper eingesetzt. Für den Fall, dass das Protein ein IgG1Fc-chimäres Protein war, wurden die mit Peroxidase markierten, gegen humane Immunglobuline gerichteten Antikörper aus dem Schaf (Amersham Inc., USA) eingesetzt. Die Reaktionszeit für die Antikörper betrug 1 Stunde bei Raumtemperatur, und in einem Intervall einer jeden Reaktion wurde ein Waschschritt durch Schütteln in TBS-T bei Raumtemperatur für 10 Minuten dreimal durchgeführt. Nach dem letzten Waschen wurde das Filter in die Reaktionslösung des „ECL Western Blot" Nachweissystems (Amersham Inc., USA) für 1 Minute eingetaucht und in Polyvinylidenchlorid-Wickelpapier eingewickelt, um den Röntgenfilm zu belichten.
Als ein Ergebnis wurden die Banden, welche das Protein zeigten, das durch Transduktion des Expressionsvektors pMEXS2FLAG erhalten wurde, im COS-Überstand bei etwa 135 kD durch den gegen FLAG M2 gerichteten Antikörper nachgewiesen; und die Herstellung des gewünschten Proteins EXS2FLAG wurde bestätigt, und die Zellen wurden mit dem Expressionsvektor pMEXS2FLAG transduziert. Schwankungen bezüglich des Molekulargewichts in Abhängigkeit von der Reduktionsbehandlung während der SDS-PAGE wurden nicht beobachtet. Etwa 20 kD Zuckerketten hängen den Molekülen als eine Folge des Vergleichs mit einem Molekulargewicht, das aus der Aminosäuresequenz abgeschätzt wurde, an.
Darüber hinaus wurde eine Bande mit einem Molekulargewicht von etwa 165 kD aus der Lösung des Überstands von COS-Zellen, die mit dem Expressionsvektor pMEXS2Fc gentransduziert wurden, auf einer SDS-PAGE mit einem, gegen humane Immunglobuline gerichteten Antikörper aus dem Schaf unter reduzierenden Bedingungen nachgewiesen. Eine Bande mit einem Molekulargewicht von etwa 330 kD wurde unter nicht reduzierenden Bedingungen nachgewiesen. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass das gewünschte Protein EXS2Fc produziert wurde, und infolge dessen konnten mit dem Expressionsvektor pMEXS2Fc transformierte Zellen erhalten werden. Da das Molekulargewicht des EXS2Fc unter reduzierenden Bedingungen etwa die Hälfte desjenigen unter nichtreduzierenden Bedingungen beträgt, nimmt man an, dass das EXS2Fc aus einem Dimer mit eine Disulfidbindung aufgebaut ist. Darüber hinaus gibt es eine weitere Bande mit einem Molekulargewicht, das etwa 40 kD größer ist als dasjenige, welches aus der Aminosäuresequenz berechnet wurde. Dies weist auf das Vorliegen einer Zuckerkette im Molekül hin.
Darüber hinaus wurde eine Bande mit einem Molekulargewicht von etwa 150 kD aus den Extrakten der COS-Zellen, die mit dem Expressionsvektor pMFS2FLAG gentransduziert wurden, auf einer SDS-PAGE mit einem gegen FLAG M2 gerichteten Antikörper unter reduzierenden Bedingungen nachgewiesen. Das Ergebnis weist darauf hin, dass die Herstellung des gewünschten Proteins FS2FLAG bestätigt wurde, und infolge dessen wurden Zellen, die mit dem Expressionsvektor pMFS2FLAG transformiert wurden, erhalten. Da das Molekulargewicht der Bande von FS2FLAG etwa 20 kDa größer als jenes der berechneten Aminosäuresequenz ist, können Zuckerketten im extrazellulären Bereich vorliegen.
Wie für ein Protein, das von dem chimären Protein verschieden ist, wurde der Nachweis durch Verwendung eines monoklonalen, gegen humanes Serrate-2 gerichteten Antikörpers aus der Maus und eines polyklonalen, gegen humanes Serrate-2 gerichteten Antikörpers aus dem Kaninchen als Primärantikörper im Western-Blot durchgeführt, welche in Beispiel 7 beschrieben wurden. Ebenso wurden als Sekundärantikörper ein gegen Maus-Immunglobuline gerichteter Antikörper aus dem Schaf (Amersham Inc.) oder ein mit Peroxidase markierter, gegen Kaninchen-Immunglobuline gerichteter Antikörper aus dem Schaf (Amersham Inc.) verwendet.
Als ein Ergebnis wurde eine Bande mit einem Molekulargewicht von etwa 135 kD in der Lösung des Überstands von COS-Zellen nachgewiesen, die mit dem Expressionsvektor pMEXS2 gentransduziert wurden. Dies weist darauf hin, dass das gewünschte Protein EXS2 hergestellt wurde, und mit dem Expressionsvektor pMEXS2 transformierte Zellen konnten erhalten werden. Es wurden keine Veränderungen des Molekulargewichts beobachtet, die durch eine Reduktionsbehandlung für die SDS-PAGE verursacht wurden. Eine Bande mit einem Molekulargewicht von etwa 150 kD wurde unter reduzierenden Bedingungen aus einem COS-Zellextrakt nachgewiesen, welche Zellen mit dem Expressionsvektor pMFS2 gentransduziert wurden. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass das gewünschte Protein FS2 hergestellt wurde, und infolge dessen konnten mit dem Expressionsvektor pMFS2 transformierte Zellen erhalten werden. Darüber hinaus ist in jedem Fall das Molekulargewicht der Bande etwa 20 kDa größer als das aus der Aminosäure berechnete Molekulargewicht. Dies weist auf das Vorliegen von Zuckerketten in dem Molekül im extrazellulären Bereich hin.
In den Kontrollexperimenten wurden die Zelllysate und die Lösung des Kulturüberstands der COS-7-Zellen, die mit dem Vektor pMKITNeo transformiert wurden, getestet. Es konnten keine Banden nachgewiesen werden, die mit dem gegen FLAG gerichteten Antikörper, dem gegen humane Immunglobuline gerichteten Antikörper, oder dem gegen humanes Serrate-2 gerichteten Antikörper reagierten.
Beispiel 6
Reinigung des sekretorischen, extrazellulären, humanen Serrate-2 chimären Proteins aus gentransduzierten Zellen
Ein Kulturüberstand von COS-7-Zellen, die mit dem Expressionsvektor pMEXS2FLAG oder pMEXS2Fc durch das Verfahren in Beispiel 5 transformiert worden waren, wurden in großem Maßstab hergestellt, und das chimäre Protein, das heißt EXS2FLAG oder EXS2Fc, wurde durch eine Affinitätssäule gereinigt.
Im Falle von EXS2FLAG wurden 2 Liter des Kulturüberstands, der durch das in Beispiel 5 beschriebene Verfahren erhalten wurde, durch eine Säule geleitet, die mit dem gegen FLAG M2 gerichteten Affinitätsgel (Eastman Kodak, USA) gepackt war. Das chimäre Protein wurde in der Säule durch eine Affinitätsreaktion des gegen FLAG gerichteten Antikörpers des Gels und der FLAG-Sequenz des chimären Proteins adsorbiert. Die Säule, deren Innendurchmesser 10 mm betrug (eine Wegwerfsäule, BioRad Inc., USA) wurde mit einer Packung von 5 ml des vorstehenden Gels eingesetzt. Ein Kreislaufsystem, bestehend aus einer Mediumflasche, einer Säule, einer peristaltischen Pumpe und einer Mediumflasche wurde installiert. Der Kreislaufbetrieb wurde mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min für 72 Stunden in Gang gesetzt. Anschließend wurde die Säule mit 35 ml PBS(–) gewaschen und mit 50 ml 0,5 M Tris-Glycin (pH 3,0) eluiert. Das Eluat von 25 Fraktionen zu je 2 ml wurde in einem Röhrchen (Falcon Inc. 2063) gesammelt, und jede Fraktion wurde durch 200 μl 0,5 M Tris-HCl (pH 9,5) neutralisiert, welche zuvor in jedes Röhrchen gegeben wurden.
Von jeder Eluatfraktion wurden 10 μl des EXS2FLAG, das durch das vorstehende Verfahren gereinigt wurde, einer Reduktionsbehandlung unterzogen, die in Beispiel 5 beschrieben ist, und eine SDS-PAGE-Elektrophorese mittels eines Gels mit einem Gradienten von 5–10% Polyacrylamid wurde durchgeführt. Nach Beendigung der Elektrophorese wurde eine Silberfärbung unter Verwendung eines „Wako Silberfärbungskits II" gemäß der Erläuterung der anhängenden Gebrauchsanleitung durchgeführt. Die Fraktionen Nr. 4 bis 8 zeigten nachweisbare Banden bezüglich des EXS2FLAG. Die Größe ist mit dem Ergebnis des Western-Blots mit dem gegen FLAG gerichteten Antikörper, der in Beispiel 5 erhalten wurde, identisch. Daher wurde gereinigtes EXS2FLAG erhalten.
Im Falle von EXS2Fc wurden 2 Liter Lösung des Kulturüberstands auf eine Säule mit Protein A Sepharose (Pharmacia Inc., Schweden) gemäß demselben Verfahren wie vorstehend beschrieben adsorbiert, um die Eluatfraktionen zu sammeln. Unter Verwendung eines Teils des Eluats wie im Falle von EXS2FLAG wurde eine Bestimmung der Eluatfraktion, eine Identifikation der Größe und ein Nachweis der Reinheit mittels SDS-PAGE-Elektrophorese und Silberfärbung im reduzierten Zustand durchgeführt. Daher wurden in den Eluatfraktionen Nr. 4 bis 15 Banden nachgewiesen. Deren Molekulargewicht ist mit dem Ergebnis von Beispiel 5 identisch. Somit wurde gereinigtes EXS2Fc erhalten.
Beispiel 7
Herstellung von Antikörpern, welche humanes Serrate-2 erkennen
EXS2FLAG, welches durch das Verfahren in Beispiel 6 gereinigt wurde, wurde als Immunogen verwendet, und Kaninchen wurden immunisiert. Nach dem Assay des Antikörpertiters wurde Vollblut gesammelt, und das Serum wurde erhalten. Ein polyklonaler, gegen humanes Serrate-2 gerichteter Antikörper aus dem Kaninchen wurde unter Verwendung eines „Econopack-Serum IgG Reinigungskits" (BioRad Inc., USA) mit Bezugnahme auf die anhängende Gebrauchsanweisung gereinigt.
EXS2FLAG, das durch ein in Beispiel 6 beschriebenes Verfahren gereinigt wurde, wurde als Immunogen verwendet, und monoklonale Maus-Antikörper wurden entsprechend der Erläuterung des Textbuches hergestellt. Das gereinigte HSFLAG wurde an Balb/c Mäuse (Nippon SLC Co., Japan) verabreicht, indem jede Maus mit 10 μg intrakutan und subkutan immunisiert wurde. Nach einer zweiten Immunisierung wurde ein erhöhter Serumtiter bestätigt, indem das Blut ophthalmologisch gesammelt wurde, und eine dritte Immunisierung wurde durchgeführt. Anschließend wurde die Milz der Mäuse gesammelt und mit Maus-Myelomzellen P3X63Ag8 (ATCC TIB9) unter Verwendung von Polyethylenglykol fusioniert. Ein Hybridom wurde durch HAT-Medium (Immunological and Biological Research Institute, Japan) selektiert, und die Hybridomstämme, welche Antikörper produzierten, die spezifisch die extrazelluläre Region des humanen Serrate-2 in dem Medium erkannten, wurden durch einen Enzymimmunassay isoliert. Die Hybridomstämme, welche monoklonale Mausantikörper produzieren, die spezifisch das humane Serrate-2 erkennen, wurden etabliert.
Monoklonale, gegen humanes Serrate-2 gerichtete Antikörper wurden gereinigt und durch eine „Mab Trap GII-Säule" (Pharmacia Inc., Schweden) hergestellt und gemäß der Erläuterung der Gebrauchsanleitung aus dem Überstand des so etablierten Hybridoms gereinigt.
Eine Affinitätssäule wurde unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers hergestellt. Die Herstellung der Affinitätssäule wurde gemäß der Erläuterung, die der mit CNBr aktivierten Sephadex 4B Säule (Pharmacia Inc., Schweden) beigeheftet war, durchgeführt. Die Effizienz der Kopplung betrug 99,6%. Eine Säule, 2 cm² × 1 cm, welche 2 ml Gel enthielt, wurde hergestellt.
Ein Überstand der kultivierten Zellen, welcher EXS2 enthielt, wurde auf die Säule aufgetragen. Die Lösung des Überstands wurde bei 20 ml/Stunde aufgetragen, anschließend wurden 15 ml PBS(–) mit derselben Fließgeschwindigkeit aufgetragen und die Säule wurde gewaschen. Schließlich wurden die Produkte durch eine Mischung von 0,1 M Natriumacetat und 0,5 M NaCl (pH 4,0) eluiert. Das Eluat, jeweils 1 ml pro Fraktion, wurde gesammelt und durch Zugabe von 200 μl 1 M Tris-HCl (pH 9,1) für jede Fraktion neutralisiert.
Die SDS-PAGE des gereinigten Proteins wurde unter reduzierenden Bedingungen gemäß dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren durchgeführt, gefolgt von einer Silberfärbung und einem Western-Blot zur Abschätzung des Molekulargewichts. Eine Bande von etwa 140 kDa wurde nachgewiesen. Infolge dessen konnte der Western-Blot mit den monoklonalen Antikörpern durchgeführt werden, und humanes Serrate-2 kann mittels einer Affinitätssäule gereinigt werden.
Beispiel 8
Wirkung des humanen Serrate-2-Proteins auf die Koloniebildung von undifferenzierten Blutzellen
Um die physiologische Wirkung von humanem Serrate-2 auf undifferenzierte Blutzellen zu beobachten, wurden CD34-positive Zellen in serumfreien halbfesten Medien in Gegenwart von EXS2Fc und bekannten Cytokinen beobachtet, und die Zahl der koloniebildenden Zellen wurde beobachtet.
CD34-positive Zellen aus humanem Nabelschnurblut oder humanem normalen Knochenmarksblut wurden aus den mononukleären Zellen isoliert, welche mit einer Siliziumdioxid-Lösung (Immunological and Biological Research Institute, Japan) gemäß der anhängenden Gebrauchsanleitung behandelt wurden, und aus der zellulären Fraktion mit niedriger Dichte (< 1,077 g/ml) durch densitometrische Zentrifugation mit einer Packung „Ficoll" (Pharmacia Inc., Schweden) fraktioniert.
Die Abtrennung von CD34-positiven Zellen wurde mit „Dynabeads M-45 CD34" oder „DETACH a BEADS CD34" (Dynal Inc., Norwegen) gemäß den anhängenden Gebrauchsanleitungen durchgeführt. Nach der Abtrennung wurde die Reinheit wie folgt gemessen. Die Zellen wurden mit dem FITC-markierten CD34-Antikörper HPCA2 (Beckton-Deckinson Inc., USA) gefärbt, und mit einem Fließ-Zytometer (FACS Calibur, Beckton-Deckinson, USA) untersucht. Eine Reinheit von mehr als 85% wurde für die weitere Verwendung bestätigt.
Die so isolierten CD34-positiven Zellen wurden homogen suspendiert, um 400 Zellen/ml des nachfolgend beschriebenen Mediums zu bilden, in einer Kulturschale von 35 mm Durchmesser (Falcon Inc., USA) verteilt und anschließend für 2 Wochen in einem Kohlendioxid-Inkubator bei 37°C unter 5% Kohlendioxid, 5 Sauerstoff, 90% Stickstoff und 100% Feuchtigkeit kultiviert. Die gebildeten Blutkolonien wurden unter dem Inversmikroskop gezählt.
Ein verwendetes Medium ist α-Medium (Gibco BRL, USA), das 2 entionisiertes Rinderserumalbumin (BSA, Sigma, USA), 10 μg/ml humanes Insulin (Sigma, USA), 200 μg/ml Transferrin (Sigma, USA), 10^–5 M 2-Mercaptoethanol (Nakarai Tesk Co., Japan), 160 μg/ml Sojabohnenlecithin (Sigma, USA), 96 μg/ml Cholesterin (Sigma, USA) und 0,9% Methylcellulose (Wako Pure Chemicals, Japan) enthielt.
Zu dem vorstehenden Medium, dem darüber hinaus Cytokine unter den folgenden Bedingungen zugegeben wurden, wurde das chimäre Protein des extrazellulären humanen Serrate-2 und Ig (EXS2Fc) mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml gegeben. Zur Kontrolle wurde humaner IgG1 (Athens Research and Technology Inc., USA) in derselben Konzentration gegeben, um die Wirkung des IgGFc-Bereichs zu beobachten.
Die Bedingungen für die Zugabe von Cytokinen waren wie folgt:
100 ng/ml humanes SCF, 10 ng/ml humanes IL-3, 100 ng/ml humanes IL-6, 2 U/ml Epo (Chugai Seiyaku Co., Japan) und 10 ng/ml humanes G-CSF (Chugai Seiyaku Co., Japan).
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Die Zahl der Kolonien/400 Zellen von CD 34⁺-Zellen sind gezeigt im Mittel von n = 3. Vier unterschiedliche CD34-positive Zellen, die aus humanem Nabelschnurblut stammen, wurden verwendet.
Tabelle 1
Wie in Tabelle 1 gezeigt, weist das humane Serrate-2 eine Wirkung gegenüber vier unterschiedlichen CD34-positiven Zellen auf, die aus humanem Nabelschnurblut stammen. Daher besitzt das humane Serrate-2 der vorliegenden Erfindung eine unterdrückende Wirkung für die Differenzierung undifferenzierter Blutzellen einschließlich der Blutzellen.
Beispiel 9
Wirkung des humanen Serrate-2 auf die undifferenzierten Blutzellen LTC-IC in Flüssigkultur
Um die physiologische Wirkung von humanem Serrate-2 auf undifferenzierte Blutzellen zu beobachten, wurden CD34-positive Zellen aus Nabelschnurblut für 2 Wochen in einem serumfreien Flüssigmedium in Gegenwart von EXS2Fc und bekannten Cytokinen kultiviert, und die Anzahl der LTC-IC, die man derzeit für die am meisten undifferenzierten Zellen hält, wurde beobachtet.
Die mononukleären CD34-positiven Zellen aus Nabelschnurblut, 100.000 bis 20.000 Zellen, welche durch das in Beispiel 8 beschriebene Verfahren abgetrennt worden waren, wurden in folgendem Medium für 2 Wochen kultiviert. Die Zahl der LTC-IC in drei experimentellen Gruppen, welche eine Gruppe vor der Kul tivierung, eine Gruppe von EXS2Fc und eine Kontrollgruppe umfasst, wurde bestimmt.
Das in der Flüssigkultur verwendete Medium war α-Medium, dem 2% BSA, 10 μg/ml humanes Insulin, 200 μg/ml Transferrin, 40 μg/ml Lipoprotein von niedriger Dichte, und 10^–5 M 2-Mercaptoethanol zugegeben wurden, dem darüber hinaus 100 ng/ml humanes SCF, 10 ng/ml humanes IL-3 und 100 ng/ml humanes IL-6 zugegeben wurden. 1 μg/ml EXS2Fc wurde zu dem vorstehenden Medium gegeben. In der Kontrollgruppe wurde humanes IgG1 in der gleichen Konzentration zugegeben.
Die Herstellung einer Schicht aus Stromazellen des humanen Knochenmarks, welche für die LTC-IC verwendet wurden, und der quantitative Assay für die Häufigkeit der LTC-IC durch ein Grenzverdünnungsverfahren wurden gemäß einem Verfahren von Sutherland et al. (Blood 74, 1563 ff, 1989 und Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3584 ff, 1990) durchgeführt.
Die mononukleären Zellen aus dem Knochenmark (1–2 × 10⁷ Zellen), welche in Beispiel 8 vor der Trennung und ohne die Behandlung mit gelöstem Siliziumdioxid erhalten worden waren, wurden in 5 ml LTC-Medium (MyeloCult, Stem Cell Technologies Inc., Kanada), dem 1 μM Hydrocortison (Upjohn Japan Co., Japan) zugegeben wurden, in einer T-25 Zellkulturflasche (Falcon Inc., USA) bei 37°C unter 5% Kohlendioxid und 100% Feuchtigkeit in einem Kohlendioxid-Inkubator kultiviert. Die Kultur wurde durchgeführt, bis die adhäsiven Zellschichten der Stromazellbildung mehr als 80% der Bodenfläche der Kulturflasche bedeckten. Die Ablösung der Zellschicht wurde durch eine Behandlung mit EDTA-Lösung (Cosmobio Co., Japan) durchgeführt. Die Zellen wurden in eine Platte mit 96 Vertiefungen plattiert (Beckton-Deckinson Inc., USA), etwa 2 × 10⁹ Zellen/Vertiefung, und die Rekultivierung wurde im selben Medium fortgeführt. Röntgenstrahlen (15 Gy), ein Peak mit 250 kV, wurden auf die wiederhergestellte Stromazellschicht eingestrahlt. Das Wachstum der Stromazellen wurde gestoppt, und die Blutzellen in den Stromazellen wurden entfernt. Die so hergestellten Stromazellen wurden als eine Stromazellschicht für die Experimente verwendet.
In dem Assay für LTC-IC wurde die Anzahl der Zellen in jeder Gruppe auf einen Bereich von 25–400 Zellen/Vertiefung in Bezug auf CD34-positive Zellen vor der Kultivierung, und 625–20.000 Zellen/Vertiefung für die Zellen nach der Kultivierung eingestellt, und die Zellen wurden durch einen sechsstufigen Verdünnungsschritt innerhalb dieser Bereiche verdünnt. Jeder Verdünnungsschritt der Zellen wurde mit der vorstehenden Stromazellschicht in der Platte mit 96 Vertiefungen kokultiviert, jeweils 16 Vertiefungen für einen Verdünnungsschritt. Die Kultur wurde in demselben Medium, das für die Stromazellbildung verwendet wurde, bei 37°C unter 5% Kohlendioxid und 100 Feuchtigkeit in einem Kohlendioxidgas-Inkubator für 5 Wochen durchgeführt. Die Zellen in Suspension sowie die adhäsiven Zellen nach der Kultivierung wurden in jeder Vertiefung gewonnen. Die gesammelten Zellen wurden auf ein halbfestes Kulturmedium übertragen, das aus α-Medium bestand, dem 0,9% Methylcellulose, 30% fötales Kälberserum (FCS, ICN Biomedical, Japan), 1% BSA, 10^–5 M 2-Mercaptoethanol, 100 ng/ml humanes SCF, 10 ng/ml humanes IL-3, 100 ng/ml humanes IL-6, 2 U/ml Epo und 10 ng/ml humanes G-CSF zugegeben wurden. Nach 2 Wochen der Kultivierung wurden koloniebildende Zellen in derselben Weise nachgewiesen, wie in Beispiel 8 beschrieben, und die Anzahl der Vertiefungen, in denen koloniebildende Zellen gefunden wurden, wurde nachgewiesen. Die Häufigkeit der LTC-IC wurde gemäß einem Verfahren von Taswell et al. (J. Immunol. 126, 1614 ff, 1981) auf der Grundlage der vorstehenden Daten berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2
Aus dem in Tabelle 2 gezeigten Ergebnis ist es ersichtlich, dass humanes Serrate-2 eine Wirkung gegen LTC-IC aufweist und ihre Anzahl reduziert.
Beispiel 10
Wirkung des humanen Serrate-2 auf das Wachstum von Gefäßendothelzellen
Die verwendeten Gefäßendothelzellen waren als passagierte Kulturen über vier Generationen von normalen humanen Endothelzellen der Aorta und normalen humanen Endothelzellen der Lungenarterie (Kurabo Inc., Japan).
Die Zellen wurden zu 500 Zellen/Vertiefung in einer Platte mit 96 Vertiefungen für die Gewebekultur (Falcon Inc., USA) in der Kultur der dritten Passage plattiert, und in einem Medium mit einem geringen Gehalt an Serum für das Wachstum der Gefäßendothelzellen (HuMedia-EG2, Kurabe Inc., Japan) kultiviert, das 100 ng/ml humanes rekombinantes EGF (Kurabo Inc., Japan) und 5 ng/ml humanes rekombinantes FGF-B enthielt. Das chimäre Protein aus extrazelluläre humanem Serrate-2 und IgGFc (EXS2Fc) wurde auf eine Endkonzentration von 1 μg/ml zugegeben. Zur Kontrolle wurde humanes IgG1 (Athens Research and Technology Inc., USA) mit derselben Konzentration zugegeben, um die Wirkung des IgGFc-Bereichs zu beobachten. Ein Kontrollexperiment wurde ohne die Zugabe des Proteins durchgeführt, ausgenommen HuMedia-EG2. Die Kultur wurde bei 37°C unter 5°C Kohlendioxid und 100% Feuchtigkeit für 3 Tage durchgeführt, und die Anzahl der Zellen wurde berechnet.
Die Messung der Zahl der Gefäßendothelzellen wurde durch Verwendung des „NR-Reagenz-Sets" (Kurabo Inc., Japan) durchge führt. Das Verfahren wurde von Borenfeund und Puerner (Journal of Tissue Culture Methods 9(1), 7–9, 1984) entwickelt, das heißt das Verfahren mit Neutralrot, welches dieses Pigment Neutralrot (3-Amino-7-dimethylamino-2-methylphenazin-Hydrochlorid) zur Lebendfärbung verwendet, und wobei das Pigment durch die Plasmamembran von lebenden Zellen hindurchtritt und im Lysosom angehäuft wird.
Die Absorption bei 540 nm wurde unter Verwendung eines Immunplatten-Lesegeräts (NJ-2000, Japan Intermed Inc., Japan) gemessen.
Die Ergebnisse zeigten, dass im Fall der Endothelzellen aus der Aorta die Absorption in der Kontrollgruppe eine optische Dichte (OD) von 0,21 ± 0,02 aufweist, die nahezu auf der gleichen Stufe derjenigen Gruppe liegt, der humanes IgG1 zugegeben wurde (0,20 ± 0,01), und in der Gruppe, der EXS2Fc zugegeben wurde, betrug sie 0,10 ± 0,02, ein Wert, der erheblich geringer war als die Kontrolle.
Im Fall der Endothelzellen aus der Lungenaorta zeigte die Kontrollgruppe 0,15 ± 0,01 und die Gruppe, der humanes IgG1 zugegeben wurde, zeigte nahezu das gleiche Niveau von 0,16 ± 0,02, während diejenige Gruppe, der EXS2Fc zugegeben wurde, ein erheblich geringeres Niveau von 0,07 ± 0,02 zeigte. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass EXS2Fc das Wachstum von Gefäßendothelzellen unterdrückt.
Wirkung der Erfindung
Das humane Serrate-2 der vorliegenden Erfindung besitzt eine Wirkung zur Regulation der Differenzierung von undifferenzierten Zellen, und kann als ein neues regulierendes Mittel zur Differenzierung von Zellen verwendet werden.
Sequenzliste

Claims

Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 1 der Sequenzliste.
Polypeptid gemäß Anspruch 1, umfassend die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 2 der Sequenzliste.
Polypeptid gemäß Anspruch 1, umfassend die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 3 der Sequenzliste.
Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, das eine die Differenzierung unterdrückende Wirksamkeit gegen undifferenzierte Zellen hat.
Polypeptid gemäß Anspruch 4, wobei die undifferenzierten Zellen die undifferenzierten Zellen sind, ausgenommen diesen des Gehirns und Nervensystems oder Muskelsystemzellen.
Polypeptid gemäß Anspruch 4, wobei die undifferenzierten Zellen undifferenzierte Blutzellen sind.
Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, das eine unterdrückende Wirksamkeit gegen die Proliferation von vaskulären Endothelzellen hat.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend das Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 und 2.
Zellkulturmedium, enthaltend das Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 und 2.
Zellkulturmedium gemäß Anspruch 9 zum Kultivieren von undifferenzierten Blutzellen.
DNA, kodierend ein Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 1 der Sequenzliste.
DNA gemäß Anspruch 11, umfassend die DNA-Sequenz 90–731 der SEQ ID Nr. 4 der Sequenzliste.
DNA, kodierend ein Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 2 der Sequenzliste.
DNA gemäß Anspruch 13, umfassend die DNA-Sequenz 90–3254 der SEQ ID Nr. 4 der Sequenzliste.
DNA, kodierend ein Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 3 der Sequenzliste.
DNA gemäß Anspruch 15, umfassend die DNA-Sequenz 90–3725 der SEQ ID Nr. 4 der Sequenzliste.
Rekombinante DNA, umfassend eine DNA, kodierend ein Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 1 der Sequenzliste, ligiert mit einer Vektor-DNA, die in der Wirtszelle exprimiert werden kann.
Rekombinante DNA, umfassend eine DNA, kodierend ein Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 2 der Sequenzliste, ligiert mit einer Vektor-DNA, die in der Wirtszelle exprimiert werden kann.
Rekombinante DNA, umfassend eine DNA, kodierend ein Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 3 der Sequenzliste, ligiert mit einer Vektor-DNA, die in der Wirtszelle exprimiert werden kann.
Zelle, umfassend und/oder transformiert durch die rekombinante DNA nach Anspruch 17.
Zelle, umfassend und/oder transformiert durch die rekombinante DNA nach Anspruch 18.
Zelle, umfassend und/oder transformiert durch die rekombinante DNA nach Anspruch 19.
Verfahren zur Herstellung des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend das Kultivieren von Zellen nach einem der Ansprüche 20 bis 22 in einem Medium und das Isolieren der Verbindung, die in der kultivierten Masse hergestellt wird.
Antikörper, der spezifisch das Polypeptid erkennt, das die Aminosäuresequenz von einer der SEQ ID Nr. 1 bis 3 der Sequenzliste besitzt.