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KR102583006B1 - 효소적으로 절단가능한 기를 갖는 항체 약물 접합체 (adc) - Google Patents

효소적으로 절단가능한 기를 갖는 항체 약물 접합체 (adc) Download PDF

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KR102583006B1
KR102583006B1 KR1020237018668A KR20237018668A KR102583006B1 KR 102583006 B1 KR102583006 B1 KR 102583006B1 KR 1020237018668 A KR1020237018668 A KR 1020237018668A KR 20237018668 A KR20237018668 A KR 20237018668A KR 102583006 B1 KR102583006 B1 KR 102583006B1
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안네-소피 레브스톡
베아트릭스 스텔테-루드비크
데니스 키르히호프
리사 디에츠
크리스토프 말레르트.
시모네 그레벤
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산드라 베른트
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스테파니 함머
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바이엘 악티엔게젤샤프트
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Abstract

본 발명은 개선된 특성을 갖는 신규 항체 약물 접합체 (ADC), 상기 ADC의 활성 대사물 및 그의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 상기 접합체의 용도, 및 질환, 특히 과다증식성 및/또는 혈관신생 질환, 예컨대, 예를 들어, 암 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 의약의 제조를 위한 상기 접합체의 용도에 관한 것이다.

Description

효소적으로 절단가능한 기를 갖는 항체 약물 접합체 (ADC){ANTIBODY DRUG CONJUGATES (ADCS) HAVING ENZYMATICALLY CLEAVABLE GROUPS}
도입 및 최신 기술
본 발명은 개선된 특성을 갖는 신규 결합제-약물 접합체 (ADC), 이들 ADC의 활성 대사물 및 그의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 이들 접합체의 용도, 및 질환, 특히 과다증식성 및/또는 혈관신생 장애, 예컨대, 예를 들어, 암 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 의약을 제조하기 위한 이들 접합체의 용도에 관한 것이다. 이러한 치료는 단독요법으로서 또는 그 밖에 다른 의약 또는 추가의 치료적 조치와 조합되어 실시될 수 있다. 본 발명에 따르면, 결합제는 바람직하게는 항체이다.
암은 대부분의 다양한 조직의 비제어된 세포 성장의 결과이다. 다수의 경우에서 새로운 세포는 기존 조직 내로 침투하거나 (침습성 성장), 또는 이들은 먼 기관으로 전이한다. 암은 매우 다양한 상이한 기관에서 발생하고, 종종 조직-특이적 과정을 갖는다. 따라서, 일반적 용어로서 "암"이라는 용어는 상이한 기관, 조직 및 세포 유형의 한정된 질환의 거대한 군을 기재한다.
일부 종양은 초기 단계에서 외과적 및 방사선요법 조치에 의해 제거될 수 있다. 전이된 종양은 대체로 단지 화학요법제에 의해 완화적으로 치료될 수 있다. 본원의 목적은 삶의 질의 개선 및 삶의 연장의 최적 조합을 달성하는 것이다.
결합제 단백질과 1종 이상의 약물 분자와의 접합체는, 특히 종양-연관 항원에 대하여 지시된 내재화 항체가 링커를 통해 세포독성제에 공유 부착된 항체 약물 접합체 (ADC)의 형태로 공지되어 있다. ADC의 종양 세포 내로의 도입 및 접합체의 후속 해리 후에, 세포독성제 그 자체 또는 그로부터 형성된 세포독성 대사물은 종양 세포 내에서 방출되고 그 안에서 직접적으로 및 선택적으로 그의 작용을 펼칠 수 있다. 이러한 방식으로, 통상적인 암 화학요법과 대조적으로, 정상 조직에 대한 손상이 유의하게 보다 좁은 한계 내로 방지된다 [예를 들어, 문헌 [J. M. Lambert, Curr. Opin. Pharmacol. 5, 543-549 (2005); A. M. Wu and P. D. Senter, Nat. Biotechnol. 23, 1137-1146 (2005); P. D. Senter, Curr. Opin. Chem. Biol. 13, 235-244 (2009); L. Ducry and B. Stump, Bioconjugate Chem. 21, 5-13 (2010)] 참조]. 따라서, WO2012/171020은 복수의 독성단 분자가 중합체 링커를 통해 항체에 부착된 ADC를 기재한다. 가능한 독성단으로서, WO2012/171020은 특히 물질 SB 743921, SB 715992 (이스피네시브), MK-0371, AZD8477, AZ3146 및 ARRY-520을 언급한다.
마지막으로 언급된 물질은 키네신 스핀들 단백질 억제제이다. 키네신 스핀들 단백질 (KSP, 또한 Eg5, HsEg5, KNSL1 또는 KIF11로 공지됨)은 양극성 유사분열 방추가 기능하는데 필수적인 키네신-유사 운동단백질이다. KSP의 억제는 유사분열 정지를 유도하고, 비교적 장기간에 걸쳐, 아폽토시스를 유도한다 (Tao et al., Cancer Cell 2005 Jul 8(1), 39-59). 제1 세포-침투 KSP 억제제인 모나스트롤의 발견 후에, KSP 억제제는 그 자체를 신규 화학요법제 부류로서 확립하였고 (Mayer et al., Science 286: 971-974, 1999), 이들은 다수의 특허 출원 (예를 들어 WO2006/044825; WO2006/002236; WO2005/051922; WO2006/060737; WO03/060064; WO03/040979; 및 WO03/049527)의 주제이다. 그러나, KSP는 단지 유사분열기 동안의 비교적 단기간 동안에만 활성이므로, KSP 억제제는 이러한 기간 동안 충분히 높은 농도로 존재하여야 한다. WO2014/151030은 특정 KSP 억제제를 포함하는 ADC를 개시한다. 그러나 최적 활성 프로파일을 가지고 있지 않은 효소적으로 절단가능한 링커를 또한 포함하는 KSP 억제제를 갖는 ADC가 이미 특허 출원 WO2015/096982 및 WO2016/096610에 개시되었다.
레구마인은 종양-연관 아스파라기닐 엔도펩티다제 (S. Ishii, Methods Enzymol. 1994, 244, 604; J. M. Chen et al. J. Biol. Chem. 1997, 272, 8090)이고, 소형의 세포독성 분자, 예를 들어 특히 독소루비신 및 에토포시드 유도체의 전구약물의 프로세싱에 이용되어 왔다 (W. Wu et al. Cancer Res. 2006, 66, 970; L. Stern et al. Bioconjugate Chem. 2009, 20, 500; K.M. Bajjuri et al. ChemMedChem 2011, 6, 54).
다른 리소솜 효소는, 예를 들어 카텝신 또는 글리코시다제, 예를 들어 β-글루쿠로니다제이며, 이들 또한 전구약물의 효소적 절단에 의한 활성 화합물의 방출에 이용되어 왔다. 생체내에서 효소적으로 절단가능한 기는 특히 2-8-올리고펩티드 기 또는 글리코시드이다. 펩티드 절단 부위는 문헌 [Bioconjugate Chem. 2002, 13, 855-869 및 Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 8 (1998) 3341-3346 및 또한 Bioconjugate Chem. 1998, 9, 618-626]에 개시되어 있다. 이들은, 예를 들어 발린-알라닌, 발린-리신, 발린-시트룰린, 알라닌-리신 및 페닐알라닌-리신 (임의로 추가의 아미드 기를 가짐)을 포함한다.
선행 기술은, 효소적으로 절단가능한 링커이지만, 예를 들어 상이한 세포들에 대한 그의 광범위한 활성에 관하여 최적 활성 프로파일을 가지고 있지 않은 그러한 링커를 갖는 다양한 항체-약물 접합체를 개시한다. 따라서, 본 발명의 목적은 비교적 낮은 농도에서의 투여 후 장기-지속되는 아폽토시스 작용을 나타내어 암 요법에 이익이 되는 보다 효과적인 화합물을 제공하는 것이다. 여기서, 한편으로는, ADC로부터 세포내 방출된 대사물의 프로파일이 중요한 역할을 한다. 빈번하게는, ADC로부터 형성된 대사물은 유출 펌프의 기질이고/거나 높은 세포 막 투과성을 갖는다. 두 현상은 종양 세포에서 짧은 체류 시간과 이에 따른 준최적 아폽토시스 작용에 기여할 수 있다.
따라서, 본 발명은 항체와의 회합시 효력 및 활성 스펙트럼에 관하여 특히 흥미로운 활성 프로파일을 갖는, 특정한 독성단-링커 조성을 갖는 결합제-약물 접합체 (ADC)를 제공한다. ADC 및 그의 대사물의 종양 선택성을 추가로 개선시키기 위해, 결합제 접합체에는 종양-연관 효소, 예컨대 레구마인 또는 카텝신에 의해 방출될 수 있는 펩티드 링커가 제공되었다. 따라서 종양 선택성은 단지 항체의 선택 뿐만 아니라, 추가적으로 펩티드 유도체의 효소적 절단에 의해, 예를 들어 종양-연관 효소, 예컨대 레구마인에 의해 결정된다. 또한, 종양 세포에서 본 발명에 따른 결합제-약물 접합체 (ADC)로부터 방출된 대사물은 특히 흥미로운 특성 프로파일에 의해 구별된다. 이들은 종양 세포로부터의 낮은 유출을 나타내어 종양에서의 높은 활성 화합물 전시로 이어진다. 따라서, 종양 세포에서 높은 활성이 달성되는 반면, 불량한 투과성으로 인해 단지 낮은 전신 세포독성 활성만이 존재하여 낮은 오프-타겟 독성을 유발한다.
본 발명에 따라 사용되는 키네신 스핀들 단백질 억제제는 효과에 필수적인 아미노 기를 갖는다. 이러한 아미노 기의 펩티드 유도체에 의한 변형으로, 키네신 스핀들 단백질에 관한 효과는 차단되고 따라서 세포독성 효과의 발생도 또한 억제된다. 이들 펩티드 유도체는 또한 항체에 대한 링커의 성분일 수 있다. 그러나, 이러한 펩티드 잔기 또는 펩티드 링커가 활성 화합물로부터 종양-연관 효소, 예컨대 레구마인 또는 카텝신에 의해 방출될 수 있는 경우에, 효과는 종양 조직에서 제어 방식으로 재확립될 수 있다. 종양에서 형성된 대사물의 특정한 특성 프로파일은 표적에서의 높은 효력에 불리하게 영향을 미치지 않는, 분자 내 아미노 기와 상이한 위치에서의 키네신 스핀들 단백질 억제제의 추가적 변형에 의해 보장된다.
또한, 본 발명에 따른 ADC의 구조는, 특정 실시양태의 경우, 놀랍게도 ADC의 물리화학적 및 약동학적 거동에 대해 어떠한 부정적 영향도 나타내지 않는 항체의 높은 로딩 (DAR, 약물-대-항체 비로 지칭됨)을 가능하게 한다.
놀랍게도, 본 발명에 이르러 화학식 (I)의 결합제-약물 접합체 및 그의 염, 용매화물 및 이들 용매화물의 염이 공지된 접합체와 비교하여 우수한 특성을 갖는다는 것이 발견되었다.
Figure 112023060817933-pat00001
여기서
X1은 N을 나타내고,
X2는 N을 나타내고,
X3은 C를 나타내거나;
또는
X1은 N을 나타내고,
X2는 C를 나타내고,
X3은 N을 나타내거나;
또는
X1은 CH 또는 CF를 나타내고,
X2는 C를 나타내고,
X3은 N을 나타내거나;
또는
X1은 NH를 나타내고,
X2는 C를 나타내고,
X3은 C를 나타내거나;
또는
X1은 CH를 나타내고,
X2는 N을 나타내고,
X3은 C를 나타내고,
R1은 수소 또는 메틸을 나타내고,
R2는 메틸, 에틸, -CH2-CH(CH3)2, -CH2-C(=O)OH 또는 이소프로필을 나타내고,
R3은 메틸, 에틸, -CH2-CH(CH3)2 또는 -CH2-C(=O)-NH2를 나타내고,
M은 다음 기:
#-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH2-NH-C(=O)-CH2-CH(##)-COOH,
#-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH2-NH-C(=O)-CH(##)-CH2-COOH,
#-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH2-W,
#-C(=O)-CH2-NH-C(=O)-CH2-CH(##)-COOH,
#-C(=O)-CH2-NH-C(=O)-CH(##)-CH2-COOH,
#-C(=O)-CH2-W,
#-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-(CH2)2-8-C(=O)-###,
#-C(=O)-(CH2)3-C(=O)-###,
#-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-(CH2)5-W,
#-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-(CH2)-## 또는
#-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-(CH2-CH2-O)1-8-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-##를 나타내고,
W는 기
Figure 112023060817933-pat00002
를 나타내고,
n은 1 내지 50의 수를 나타내고,
AK는 결합제 또는 그의 유도체, 바람직하게는 항체 또는 항원-결합 단편을 나타내고,
#는 화합물에 대한 결합을 나타내고,
##는 결합제의 시스테인 측쇄의 황 원자에 대한 결합을 나타내고,
###는 결합제의 리신 측쇄의 질소 원자에 대한 결합을 나타낸다.
X1은 CH를 나타내고,
X2는 C를 나타내고,
X3은 N을 나타내고,
R1은 수소 또는 메틸을 나타내고,
R2는 메틸, -CH2-CH(CH3)2, -CH2-C(=O)OH 또는 이소프로필을 나타내고,
R3은 메틸, -CH2-CH(CH3)2 또는 -CH2-C(=O)-NH2를 나타내고,
M은 다음 기:
#-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH2-NH-C(=O)-CH2-CH(##)-COOH,
#-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH2-NH-C(=O)-CH(##)-CH2-COOH,
#-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH2-W,
#-C(=O)-CH2-NH-C(=O)-CH2-CH(##)-COOH,
#-C(=O)-CH2-NH-C(=O)-CH(##)-CH2-COOH,
#-C(=O)-CH2-W,
#-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-(CH2)3-C(=O)-###,
#-C(=O)-(CH2)3-C(=O)-###,
#-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-(CH2)5-W,
#-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-(CH2)-## 또는
#-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-(CH2-CH2-O)4-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-##를 나타내고,
W는 기
Figure 112023060817933-pat00003
를 나타내고,
n은 1 내지 50의 수를 나타내고,
AK는 결합제 또는 그의 유도체, 바람직하게는 항체 또는 항원-결합 단편을 나타내고,
#는 화합물에 대한 결합을 나타내고,
##는 결합제의 시스테인 측쇄의 황 원자에 대한 결합을 나타내고,
###는 결합제의 리신 측쇄의 질소 원자에 대한 결합을 나타내는 것인,
화학식 (I)의 결합제-약물 접합체 및 그의 염, 용매화물 및 이들 용매화물의 염이 바람직하다.
R1은 수소 또는 메틸을 나타내고,
R2는 메틸 또는 이소프로필을 나타내고,
R3은 메틸 또는 -CH2-C(=O)-NH2를 나타내고,
M은 기 #-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-(CH2)3-C(=O)-###를 나타내고,
n은 1 내지 50의 수를 나타내고,
AK는 결합제 또는 그의 유도체, 바람직하게는 항체 또는 항원-결합 단편을 나타내고,
#는 화합물에 대한 결합을 나타내고,
###는 결합제의 리신 측쇄의 질소 원자에 대한 결합을 나타내는 것인,
화학식 (I)의 결합제-약물 접합체 및 그의 염, 용매화물 및 이들 용매화물의 염이 특히 바람직하다.
R1은 메틸을 나타내고,
R2는 메틸을 나타내고,
R3은 -CH2-C(=O)-NH2를 나타내고,
M은 기 #-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-(CH2)3-C(=O)-###를 나타내고,
n은 1 내지 50의 수를 나타내고,
AK는 결합제 또는 그의 유도체, 바람직하게는 항체 또는 항원-결합 단편을 나타내고,
#는 화합물에 대한 결합을 나타내고,
###는 결합제의 리신 측쇄의 질소 원자에 대한 결합을 나타내는 것인,
화학식 (I)의 결합제-약물 접합체 및 그의 염, 용매화물 및 이들 용매화물의 염이 매우 특히 바람직하다.
R1은 메틸을 나타내고,
R2는 메틸을 나타내고,
R3은 -CH2-C(=O)-NH2를 나타내고,
M은 기 #-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-(CH2)3-C(=O)-###를 나타내고,
n은 1 내지 20의 수를 나타내고,
AK는 결합제 또는 그의 유도체, 바람직하게는 항체 또는 항원-결합 단편을 나타내고,
#는 화합물에 대한 결합을 나타내고,
###는 결합제의 리신 측쇄의 질소 원자에 대한 결합을 나타내는 것인,
화학식 (I)의 결합제-약물 접합체 및 그의 염, 용매화물 및 이들 용매화물의 염이 특별히 바람직하다.
R1은 메틸을 나타내고,
R2는 메틸을 나타내고,
R3은 -CH2-C(=O)-NH2를 나타내고,
M은 기 #-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-(CH2)3-C(=O)-###를 나타내고,
n은 1 내지 20의 수를 나타내고,
AK는 항-CD123 항체, 항-CXCR5 항체, 항-B7H3 항체, 항-TWEAKR 항체, 항-Her2 항체 또는 항-EGFR 항체를 나타내거나, 또는 이들의 항원-결합 항체 단편을 나타내고,
#는 화합물에 대한 결합을 나타내고,
###는 항체 (AK) 또는 그의 항원-결합 항체 단편의 리신 측쇄의 질소 원자에 대한 결합을 나타내는 것인,
화학식 (I)의 결합제-약물 접합체 및 그의 염, 용매화물 및 이들 용매화물의 염이 선택된다.
R1은 메틸을 나타내고,
R2는 메틸을 나타내고,
R3은 -CH2-C(=O)-NH2를 나타내고,
M은 기 #-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-(CH2)3-C(=O)-###를 나타내고,
n은 1 내지 20의 수를 나타내고,
AK는 TPP-9476, TPP-8988, TPP-8987 및 TPP-6013으로 이루어진 군으로부터 선택된 항-CD123 항체를 나타내거나, TPP-9574 및 TPP-9580으로 이루어진 군으로부터 선택된 항-CXCR5 항체를 나타내거나, 항-B7H3 항체 TPP-8382를 나타내거나, TPP-7006 및 TPP-7007로 이루어진 군으로부터 선택된 항-TWEAKR 항체를 나타내거나, 항-Her2 항체 TPP-1015를 나타내거나, 항-EGFR 항체 TPP-981을 나타내거나, 또는 이들의 항원-결합 항체 단편을 나타내고,
#는 화합물에 대한 결합을 나타내고,
###는 항체 (AK) 또는 그의 항원-결합 항체 단편의 리신 측쇄의 질소 원자에 대한 결합을 나타내는 것인,
특히 화학식 (I)의 결합제-약물 접합체 및 그의 염, 용매화물 및 이들 용매화물의 염이 선택된다.
AK가 세포외 암 표적 분자에 특이적으로 결합하는 결합제를 나타내는 것인 상기 언급된 화학식의 결합제-약물 접합체가 바람직하다. 바람직한 실시양태에서, 결합제는 표적 세포 상의 그의 세포외 표적 분자에 결합한 후, 결합을 통해 표적 세포에 의해 내재화된다. 바람직하게는, 결합제는 항체 또는 항원-결합 단편이다.
본 발명의 바람직한 대상에서, 세포외 암 표적 분자는 암 표적 분자 EGFR, CD123, HER2, B7H3, TWEAKR 및 CXCR5로 이루어진 군으로부터 선택되고; CD123, CXCR5 및 B7H3이 특히 바람직하다.
본 발명의 바람직한 대상에서, 결합제 AK는 항-CD123 항체, 항-CXCR5 항체, 항-B7H3 항체, 항-TWEAKR 항체, 항-Her2 항체 또는 항-EGFR 항체, 또는 이들의 항원-결합 항체 단편이다.
AK (AK1, AK2)가 TPP-8382 (항 B7H3), TPP-6013 (항-CD123), TPP-8987 (항-CD123), TPP-8988 (항-CD123), TPP 9476 (항-CD123), TPP-9574 (항-CXCR5) 및 TPP 9580 (항-CXCR5)으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 또는 이들의 항원-결합 단편을 나타내는 것인 상기 언급된 화학식의 결합제-약물 접합체가 특히 바람직하다. 여기서, 항체 TPP-6013, TPP-8987, TPP-8988 및 TPP-9476 (각각의 경우에 항-CD123)이 바람직하다. 이들 항체의 정확한 구조 (서열)는 표: 항체의 단백질 서열, 이 표 뒤의 본문 및 서열 목록에서 찾아볼 수 있다.
AK가 TPP-8382 (항 B7H3), TPP-6013 (항-CD123), TPP-8987 (항-CD123), TPP-8988 (항-CD123), TPP 9476 (항-CD123), TPP-9574 (항-CXCR5) 및 TPP 9580 (항-CXCR5)으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체를 나타내는 것인 화학식 (I)의 결합제-약물 접합체가 특히 바람직하다. 여기서, 항체 (AK) TPP-6013, TPP-8987, TPP-8988 및 TPP-9476 (각각의 경우에 항-CD123)이 바람직하다.
도 1: 결합제-약물 접합체를 위한 바람직한 항체의 주석달린 서열. 제시된 것은 IgG의 중쇄 및 경쇄, 및 이들 항체의 VH 및 VL 영역의 단백질 서열이다. 서열 아래에, 중요한 영역은 주석달려 있다 (IgG 내의 VH 및 VL 영역, 및 CDR 영역 (H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3)).
도 2: 결합제-약물 접합체를 위한 바람직한 항체의 서열 및 표적 단백질의 서열의 서열 목록.
본 발명은 결합제 또는 그의 유도체와 1종 이상의 약물 분자와의 접합체이며, 약물 분자가 키네신 스핀들 단백질 억제제 (KSP 억제제)인 접합체를 제공한다.
비제한적으로 조합되어 사용될 수 있는, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 결합제, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 KSP 억제제 및 본 발명에 따라 사용될 수 있는 링커가 하기 기재되어 있다. 특히, 각각의 경우에 바람직하거나 또는 특히 바람직한 것으로서 나타내어진 결합제는 각각의 경우에 바람직하거나 또는 특히 바람직한 것으로서 나타내어진 KSP 억제제와 조합되어, 임의로 각각의 경우에 바람직하거나 또는 특히 바람직한 것으로서 나타내어진 링커와 조합되어 사용될 수 있다.
특히 바람직한 KSP-억제제 접합체 (결합제-약물 접합체)
본 발명에 따르면, AK (AK1, AK2)는 결합제 또는 그의 유도체 (바람직하게는 항체)를 나타내고, n은 1 내지 20, 바람직하게는 1 내지 8, 보다 바람직하게는 4 내지 8의 수를 나타내는 것인 KSP 억제제 접합체가 특히 바람직하다. AK1은 바람직하게는 KSP 억제제에 시스테인 잔기를 통해 결합된 항체를 나타내고; AK2는 바람직하게는 KSP 억제제에 리신 잔기를 통해 결합된 항체를 나타낸다. 본원에 사용된 결합제 또는 항체는 바람직하게는 본 설명에서 바람직한 것으로서 기재된 결합제 및 항체이다.
여기서, 하기 결합제-약물 접합체가 특히 바람직하다:
Figure 112023060817933-pat00004
Figure 112023060817933-pat00005
Figure 112023060817933-pat00006
Figure 112023060817933-pat00007
Figure 112023060817933-pat00008
Figure 112023060817933-pat00009
AK (AK1, AK2)가 세포외 암 표적 분자에 특이적으로 결합하는 결합제를 나타내는 것인 상기 언급된 화학식의 결합제-약물 접합체가 바람직하다. 바람직한 실시양태에서, 결합제는, 표적 세포 상의 그의 세포외 표적 분자에 결합한 후, 결합을 통해 표적 세포에 의해 내재화된다.
본 발명의 바람직한 대상에서, 세포외 암 표적 분자는 암 표적 분자 EGFR, CD123, Her2, B7H3, TWEAKR 및 CXCR5, 특히 CD123, CXCR5 및 B7H3으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 바람직한 대상에서, 결합제 AK (AK1, AK2)는 항-CD123 항체, 항-CXCR5 항체, 항-B7H3 항체, 항-TWEAKR 항체, 항-Her2 항체 또는 항-EGFR 항체, 또는 이들의 항원-결합 항체 단편이다.
AK (AK1, AK2)가 TPP-8382 (항 B7H3), TPP-6013 (항-CD123), TPP-8987 (항-CD123), TPP-8988 (항-CD123), TPP-9476 (항-CD123), TPP-9574 (항-CXCR5) 및 TPP-9580 (항-CXCR5)으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 또는 이들의 항원-결합 단편을 나타내는 것인 상기 언급된 화학식의 결합제-약물 접합체가 특히 바람직하다. 여기서, 항체 TPP-6013, TPP-8987, TPP-8988 및 TPP-9476 (각각의 경우에 항-CD123)이 바람직하다. 이들 항체의 정확한 구조 (서열)는 표: 항체의 단백질 서열, 이 표 뒤의 본문 및 서열 목록에서 찾아볼 수 있다.
KSP 억제제 - 링커-중간체 및 접합체의 제조
본 발명에 따른 접합체는 처음에 링커를 갖는 저분자량 KSP 억제제를 제공함으로써 제조된다. 이어서, 이러한 방식으로 수득된 중간체를 결합제 (바람직하게는 항체)와 반응시킨다.
리신 잔기에 커플링시키고 이후 항체와 커플링시키는 중간체의 경우, 반응은 하기와 같이 예시될 수 있다.
Figure 112023060817933-pat00010
상기 반응식에서, X1, X2, X3, R1, R2, R3 및 AK2는 화학식 (I)에 제공된 의미를 갖고, 여기서 R4는 메틸을 나타내고, n은 0 또는 1을 나타낸다.
빌딩 블록 A의 합성은 WO2015/096982에 기재되었다. 펩티드 유도체 B 및 C를 전형적인 펩티드 화학 방법에 의해 제조하였다. 중간체 C 및 D를 실온에서 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서 HATU를 사용하여 커플링시켰다. 후속적으로, 벤질옥시카르보닐 보호기 및 벤질 에스테르 둘 다를 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서 가수소분해적으로 제거하였다. 이어서, 완전히 탈보호된 중간체를 실온에서 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서 1,1'-[(1,5-디옥소펜탄-1,5-디일)비스(옥시)]디피롤리딘-2,5-디온과 반응시켜 ADC 전구체 분자 E를 수득하였다. 이어서 이러한 활성화된 에스테르를 챕터 B-5에 기재된 바와 같이 각각의 항체와 커플링시켰다.
시스테인 잔기에 커플링시키고 이후 항체와 커플링시키는 중간체의 경우, 반응은 하기와 같이 예시될 수 있다.
Figure 112023060817933-pat00011
상기 반응식에서, X1, X2, X3, R1, R2, R3 및 AK1은 화학식 (I)에 제공된 의미를 갖고, 여기서 R4는 메틸을 나타내고, n은 1을 나타낸다.
유사한 절차를 사용하여, n이 0을 나타내는 것인 화합물을 제조하는 것이 또한 가능하다.
빌딩 블록 A의 합성은 WO2015/096982에 기재되었다. 펩티드 유도체 B 및 C를 전형적인 펩티드 화학 방법에 의해 제조하였다. 중간체 C 및 D를 실온에서 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서 HATU를 사용하여 커플링시켰다. 후속적으로, 벤질옥시카르보닐 보호기 및 벤질 에스테르 둘 다를 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서 가수소분해적으로 제거하였다. 이어서, 완전히 탈보호된 중간체를 실온에서 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서 1-{6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}-1H-피롤-2,5-디온과 반응시켜 ADC 전구체 분자 E를 수득하였다. 이어서 이러한 말레이미드 유도체를 챕터 B-4에 기재된 바와 같이 각각의 항체와 커플링시켰다.
링커에 따라, 숙신이미드-연결된 ADC는 접합 후에 유리한 안정성 프로파일을 갖는 개방쇄 숙신아미드로 전환될 수 있다.
이 반응 (개환)은 pH 7.5 내지 9, 바람직하게는 pH 8에서, 25℃ 내지 37℃의 온도에서, 예를 들어 교반함으로써 실시될 수 있다. 바람직한 교반 시간은 8 내지 30시간이다.
시스테인 잔기에 커플링시키고 이후 항체와 커플링시킨 다음, 숙신이미드 고리의 개환이 이어지는 중간체의 경우, 반응은 하기와 같이 예시될 수 있다:
Figure 112023060817933-pat00012
상기 반응식에서, X1, X2, X3, R1, R2, R3 및 AK1은 화학식 (I)에 제공된 의미를 갖고, 여기서 R4는 메틸을 나타내고, n은 0 또는 1을 나타낸다.
빌딩 블록 A의 합성은 WO2015/096982에 기재되었다. 펩티드 유도체 B 및 C를 전형적인 펩티드 화학 방법에 의해 제조하였다. 중간체 C 및 D를 실온에서 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서 HATU를 사용하여 커플링시켰다. 후속적으로, 벤질옥시카르보닐 보호기 및 벤질 에스테르 둘 다를 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서 가수소분해적으로 제거하였다. 이어서, 완전히 탈보호된 중간체를 실온에서 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 1-{2-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-2-옥소에틸}-1H-피롤-2,5-디온과 반응시켜 ADC 전구체 분자 E를 수득하였다. 이어서 이러한 말레이미드 유도체를 챕터 B-4에 기재된 바와 같이 소규모 커플링 하에 또는 중규모 커플링 하에 각각의 항체와 커플링시켰다.
결합제
가장 넓은 의미에서, 용어 "결합제"는 결합제-약물 접합체에 의해 다루어지는 특정 표적 세포 집단에 존재하는 표적 분자에 결합하는 분자를 의미하는 것으로 이해된다. 용어 결합제는 그의 가장 넓은 의미로 이해되어야 하고, 예를 들어 렉틴, 특정 당 쇄에 결합할 수 있는 단백질 또는 인지질-결합 단백질을 또한 포함한다. 이러한 결합제는, 예를 들어 고분자량 단백질 (결합 단백질), 폴리펩티드 또는 펩티드 (결합 펩티드), 비-펩티드 (예를 들어 문헌 [Keefe AD., et al., Nat. Rev. Drug Discov. 2010; 9:537-550]에서 검토된 압타머 (US5,270,163), 또는 비타민) 및 모든 다른 세포-결합 분자 또는 물질을 포함한다. 결합 단백질은, 예를 들어 항체 및 항체 단편 또는 항체 모방체, 예를 들어 아피바디, 애드넥틴, 안티칼린, DARPin, 아비머, 나노바디 (문헌 [Gebauer M. et al., Curr. Opinion in Chem. Biol. 2009; 13:245-255; Nuttall S.D. et al., Curr. Opinion in Pharmacology 2008; 8:608-617]에서 검토됨)이다. 결합 펩티드는, 예를 들어 리간드/수용체 쌍의 리간드, 예컨대, 예를 들어 리간드/수용체 쌍 VEGF/KDR의 VEGF, 예컨대 리간드/수용체 쌍 트랜스페린/트랜스페린 수용체 또는 시토카인/시토카인 수용체의 트랜스페린, 예컨대 리간드/수용체 쌍 TNF알파/TNF알파 수용체의 TNF알파이다.
결합제는 결합 단백질일 수 있다. 바람직한 실시양태에서 결합제는 항체, 항원-결합 항체 단편, 다중특이적 항체 또는 항체 모방체이다.
문헌은 또한 결합제 및 특히 항체에 대한 유기 분자의 공유 커플링 (접합)의 다양한 옵션을 개시한다. 본 발명에 따라 바람직한 것은 항체의 시스테인 잔기의 1개 이상의 황 원자를 통한 및/또는 항체의 리신 잔기의 1개 이상의 NH 기를 통한 항체에의 독성단의 접합이다. 그러나, 유리 카르복실 기를 통해 또는 항체의 당 잔기를 통해 항체에 독성단을 결합시키는 것도 또한 가능하다.
가장 넓은 의미에서의 "표적 분자"는 표적 세포 집단에 존재하고 단백질 (예를 들어 성장 인자의 수용체) 또는 비-펩티드성 분자 (예를 들어 당 또는 인지질)일 수 있는 분자를 의미하는 것으로 이해된다. 바람직하게는 수용체 또는 항원이다.
용어 "세포외" 표적 분자는 세포의 외부에 위치하는, 세포에 부착되어 있는 표적 분자, 또는 세포의 외부에 위치하는 표적 분자의 일부를 기재하고, 즉 결합제는 무손상 세포 상에서 그의 세포외 표적 분자에 결합할 수 있다. 세포외 표적 분자는 세포 막에 고정되거나 또는 세포 막의 성분일 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 세포외 표적 분자를 확인하는 방법을 알고 있다. 단백질의 경우, 이는 막횡단 도메인(들) 및 막에서의 단백질의 배향을 결정하는 것에 의할 수 있다. 이들 데이터는 통상적으로 단백질 데이터베이스 (예를 들어 스위스프롯(SwissProt))에 기탁되어 있다.
용어 "암 표적 분자"는 동일한 조직 유형의 비-암 세포 상에서보다 1종 이상의 암 세포 종 상에서 더 풍부하게 존재하는 표적 분자를 기재한다. 바람직하게는, 암 표적 분자는 동일한 조직 유형의 비-암 세포와 비교하여 1종 이상의 암 세포 종 상에서 선택적으로 존재하며, 여기서 선택적으로는 동일한 조직 유형의 비-암 세포와 비교하여 암 세포 상에서의 적어도 2-배의 풍부화를 기재한다 ("선택적 암 표적 분자"). 암 표적 분자의 사용은 본 발명에 따른 접합체를 사용하여 암 세포의 선택적 요법을 가능하게 한다.
결합제는 결합을 통해 링커에 부착될 수 있다. 결합제는 결합제의 헤테로원자에 의해 연결될 수 있다. 부착에 사용될 수 있는 결합제의 본 발명에 따른 헤테로원자는 황 (한 실시양태에서 결합제의 술프히드릴 기를 통함), 산소 (본 발명에 따르면 결합제의 카르복실 또는 히드록실 기에 의함) 및 질소 (한 실시양태에서 결합제의 1급 또는 2급 아민 기 또는 아미드 기를 통함)이다. 이들 헤테로원자는 천연 결합제에 존재할 수 있거나, 또는 화학적 방법 또는 분자 생물학의 방법에 의해 도입된다. 본 발명에 따르면, 독성단에의 결합제의 부착은 표적 분자에 관한 결합제의 결합 활성에 대해 단지 경미한 효과를 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 연결은 표적 분자에 관한 결합제의 결합 활성에 대해 어떠한 효과도 갖지 않는다.
본 발명에 따른 용어 "항체"는 그의 가장 넓은 의미로 이해되고, 이뮤노글로불린 분자, 예를 들어 무손상 또는 변형된 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 또는 다중특이적 항체 (예를 들어 이중특이적 항체)를 포함한다. 이뮤노글로불린 분자는 바람직하게는 전형적으로 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 중쇄 (H 쇄) 및 2개의 경쇄 (L 쇄)인 4개의 폴리펩티드 쇄를 갖는 분자를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄의 가변 도메인 (VH로 약칭됨) 및 중쇄의 불변 도메인을 포함한다. 중쇄의 불변 도메인은, 예를 들어 3개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함할 수 있다. 각각의 경쇄는 가변 도메인 (VL로 약칭됨) 및 불변 도메인을 포함한다. 경쇄의 불변 도메인은 하나의 도메인 (CL로 약칭됨)을 포함한다. VH 및 VL 도메인은 또한 상보성 결정 영역 (CDR로 약칭됨)으로 지칭되는, 초가변성을 갖는 영역 및 낮은 서열 가변성을 갖는 영역 (프레임워크 영역, FR로 약칭됨)으로 추가로 세분될 수 있다. 전형적으로, 각각의 VH 및 VL 영역은 3개의 CDR 및 4개 이하의 FR로 구성된다. 예를 들어 아미노 말단에서 카르복시 말단으로 하기 순서이다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 항체는 임의의 적합한 종, 예를 들어 토끼, 라마, 낙타, 마우스 또는 래트로부터 수득될 수 있다. 한 실시양태에서, 항체는 인간 또는 뮤린 기원의 것이다. 항체는, 예를 들어 인간, 인간화 또는 키메라일 수 있다.
용어 "모노클로날" 항체는 실질적으로 동종인 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 즉 집단의 개별 항체는 그 중 소수일 수 있는 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 높은 특이성을 갖는 단일 항원 결합 부위를 인식한다. 용어 모노클로날 항체는 특정한 제조 방법을 지칭하지 않는다.
용어 "무손상" 항체는 경쇄 및 중쇄의 항원-결합 도메인 및 불변 도메인 둘 다를 포함하는 항체를 지칭한다. 불변 도메인은 자연 발생 도메인 또는 수많은 변형된 아미노산 위치를 갖는 그의 변이체일 수 있고, 또한 비-글리코실화될 수 있다.
용어 "변형된 무손상" 항체는 그의 아미노 말단 또는 카르복시 말단을 통해 공유 결합 (예를 들어 펩티드 결합)에 의해 항체 기원이 아닌 추가의 폴리펩티드 또는 단백질과 융합된 무손상 항체를 지칭한다. 게다가, 항체는 독성단에의 커플링을 용이하게 하기 위해 한정된 위치에서 반응성 시스테인이 도입되도록 변형될 수 있다 (문헌 [Junutula et al. Nat Biotechnol. 2008 Aug;26(8):925-32] 참조).
본원의 "아미노산 변형" 또는 "돌연변이"는 폴리펩티드 서열에서의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 의미한다. 본원에서 바람직한 아미노산 변형은 치환이다. 본원의 "아미노산 치환" 또는 "치환"은 단백질 서열 내의 주어진 위치에서의 아미노산의 또 다른 아미노산으로의 교환을 의미한다. 예를 들어, 치환 Y50W는 위치 50에서의 티로신이 트립토판으로 교환된 모 폴리펩티드의 변이체를 기재한다. 폴리펩티드의 "변이체"는 참조 폴리펩티드, 전형적으로 천연 또는 "모" 폴리펩티드에 대해 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 기재한다. 폴리펩티드 변이체는 천연 아미노산 서열 내의 특정한 위치에서 1개 이상의 아미노산 교환, 결실 및/또는 삽입을 가질 수 있다.
용어 "인간" 항체는 인간으로부터 수득될 수 있거나 또는 합성 인간 항체인 항체를 지칭한다. "합성" 인간 항체는 인간 항체 서열의 분석에 기초하여 합성 서열로부터 부분적으로 또는 전체적으로 인 실리코 수득가능한 항체이다. 인간 항체는, 예를 들어 인간 기원의 항체 서열의 라이브러리로부터 단리된 핵산에 의해 코딩될 수 있다. 이러한 항체의 예는 문헌 [Soederlind et al., Nature Biotech. 2000, 18:853-856]에서 찾아볼 수 있다. 이러한 "인간" 및 "합성" 항체는 또한 PNGaseF에 의한 탈글리코실화에 의해 또는 중쇄의 N297 (카바트 넘버링)의 임의의 다른 아미노산으로의 돌연변이에 의해 생산된 비-글리코실화 변이체를 포함한다.
용어 "인간화" 또는 "키메라" 항체는 비-인간 및 인간 부분의 서열로 이루어진 항체를 기재한다. 이들 항체에서, 인간 이뮤노글로불린 (수용자)의 서열의 일부는 비-인간 이뮤노글로불린 (공여자)의 서열 부분에 의해 대체된다. 다수의 경우에서, 공여자는 뮤린 이뮤노글로불린이다. 인간화 항체의 경우에, 수용자의 CDR의 아미노산은 공여자의 아미노산에 의해 대체된다. 때때로, 프레임워크의 아미노산은, 또한, 공여자의 상응하는 아미노산에 의해 대체된다. 일부 경우에 인간화 항체는 항체의 최적화 동안 도입된, 수용자에도 공여자에도 존재하지 않는 아미노산을 함유한다. 키메라 항체의 경우에, 공여자 이뮤노글로불린의 가변 도메인은 인간 항체의 불변 영역과 융합된다. 이러한 "인간화" 및 "키메라" 항체는 또한 PNGaseF에 의한 탈글리코실화에 의해 또는 중쇄의 N297 (카바트 넘버링)의 임의의 다른 아미노산으로의 돌연변이에 의해 생산된 비-글리코실화 변이체를 포함한다.
본원에 사용된 용어 상보성 결정 영역 (CDR)은 항원에의 결합에 요구되는 가변 항체 도메인의 아미노산을 지칭한다. 전형적으로, 각각의 가변 영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 지칭되는 3개의 CDR 영역을 갖는다. 각각의 CDR 영역은 카바트의 정의에 따른 아미노산 및/또는 코티아에 따라 정의된 초가변 루프의 아미노산을 포함할 수 있다. 카바트에 따른 정의는, 예를 들어 가변 경쇄 / 도메인 (VL)의 약 아미노산 위치 24 - 34 (CDR1), 50 - 56 (CDR2) 및 89 - 97 (CDR3) 및 가변 중쇄 / 도메인 (VH)의 31 - 35 (CDR1), 50 - 65 (CDR2) 및 95 - 102 (CDR3)로부터의 영역을 포함한다 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). 코티아에 따른 정의는, 예를 들어 가변 경쇄 (VL)의 약 아미노산 위치 26 - 32 (CDR1), 50 - 52 (CDR2) 및 91 -96 (CDR3) 및 가변 중쇄 (VH)의 26 - 32 (CDR1), 53 - 55 (CDR2) 및 96 - 101 (CDR3)로부터의 영역을 포함한다 (Chothia and Lesk; J Mol Biol 196: 901-917 (1987)). 일부 경우에, CDR은 카바트 및 코티아에 따라 정의된 CDR 영역으로부터의 아미노산을 포함할 수 있다.
중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체는 상이한 부류로 카테고리화될 수 있다. 무손상 항체의 5가지 주요 부류가 존재하고: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM, 이들 중 몇몇은 추가 하위부류 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 나뉘어질 수 있다. 중쇄의 불변 도메인은, 상이한 부류에 상응하여, [알파/α], [델타/δ], [엡실론/ε], [감마/γ] 및 [뮤/μ]로 지칭된다. 항체의 3차원 구조 및 서브유닛 구조 둘 다가 공지되어 있다.
용어 항체/이뮤노글로불린의 "기능적 단편" 또는 "항원-결합 항체 단편"은 항체/이뮤노글로불린의 항원 결합 도메인을 여전히 포함하는 항체/이뮤노글로불린의 단편 (예를 들어 IgG의 가변 도메인)으로 정의된다. 항체의 "항원 결합 도메인"은 전형적으로 항체의 1개 이상의 초가변 영역, 예를 들어 CDR, CDR2 및/또는 CDR3 영역을 포함한다. 그러나, 항체의 "프레임워크" 또는 "골격" 영역은 또한 항원에 대한 항체의 결합 동안 소정 역할을 할 수 있다. 프레임워크 영역은 CDR의 골격을 형성한다. 바람직하게는, 항원 결합 도메인은 적어도 가변 경쇄의 아미노산 4 내지 103 및 가변 중쇄의 아미노산 5 내지 109, 보다 바람직하게는 가변 경쇄의 아미노산 3 내지 107 및 가변 중쇄의 4 내지 111, 특히 바람직하게는 완전 가변 경쇄 및 중쇄, 즉 VL의 아미노산 1 - 109 및 VH의 1 내지 113 (WO97/08320에 따른 넘버링)을 포함한다.
본 발명의 "기능적 단편" 또는 "항원-결합 항체 단편"은, 비-결정적으로, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편, 디아바디, 단일 도메인 항체 (DAb), 선형 항체, 항체의 개별 쇄 (단일-쇄 Fv, scFv로 약칭됨); 및 예를 들어 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체, 예컨대 이중 및 삼중-특이적 항체를 포괄한다 (C. A. K Borrebaeck, editor (1995) Antibody Engineering (Breakthroughs in Molecular Biology), Oxford University Press; R. Kontermann & S. Duebel, editors (2001) Antibody Engineering (Springer Laboratory Manual), Springer Verlag). "다중특이적" 또는 "다중기능적" 항체 이외의 항체는 동일한 결합 부위를 갖는 것이다. 다중특이적 항체는 항원의 상이한 에피토프에 특이적일 수 있거나 또는 1종 초과의 항원의 에피토프에 특이적일 수 있다 (예를 들어, WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt, et al., 1991, J. Immunol. 14760 69; 미국 특허 번호 4,474,893; 4,7 14,68 1; 4,925,648; 5,573,920; 5,601,8 19; 또는 Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148 1547 1553] 참조). F(ab')2 또는 Fab 분자는 Ch1과 CL 도메인 사이에 발생하는 분자간 디술피드 상호작용의 수가 감소되거나 또는 달리 완전히 방지될 수 있도록 구축될 수 있다.
"에피토프"는 이뮤노글로불린 또는 T 세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정기를 지칭한다. 에피토프 결정기는 통상적으로 분자의 화학적으로 활성인 표면 기, 예컨대 아미노산 또는 당 측쇄 또는 그의 조합으로 이루어지고, 통상적으로 특이적 3차원 구조적 특성 및 또한 특이적 전하 특성을 갖는다.
"기능적 단편" 또는 "항원-결합 항체 단편"은 그의 아미노 말단 또는 카르복실 말단을 통해 공유 결합 (예를 들어 펩티드 연결)에 의해 항체 기원이 아닌 또 다른 폴리펩티드 또는 단백질과 융합될 수 있다. 게다가, 항체 및 항원-결합 단편은 독성단에의 커플링을 용이하게 하기 위해 한정된 위치에서 반응성 시스테인을 도입함으로써 변형될 수 있다 (문헌 [Junutula et al. Nat Biotechnol. 2008 Aug; 26(8):925-32] 참조).
폴리클로날 항체는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 모노클로날 항체는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다 (Koehler and Milstein, Nature, 256, 495-497, 1975). 인간 및 인간화 모노클로날 항체는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다 (Olsson et al., Meth Enzymol. 92, 3-16 또는 Cabilly et al. US 4,816,567 또는 Boss et al. US 4,816,397).
관련 기술분야의 통상의 기술자는, 예컨대, 예를 들어 트랜스제닉 마우스 (N Lonberg and D Huszar, Int Rev Immunol. 1995; 13(1):65-93) 또는 파지 디스플레이 기술 (Clackson et al., Nature. 1991 Aug 15;352(6336):624-8)에 의해 인간 항체 및 그의 단편을 제조하는 다양한 방법을 알고 있다. 본 발명의 항체는, 예를 들어 다수의 건강한 지원자로부터 컴파일링된 다수의 항체의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 항체 라이브러리로부터 수득될 수 있다. 항체는 또한 공지된 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다. 항체의 핵산 서열은 상용 서열분석에 의해 수득될 수 있거나 또는 공중 접근가능한 데이터베이스로부터 이용가능하다.
"단리된" 항체 또는 결합제는 세포의 다른 구성성분을 제거하기 위해 정제되었다. 진단 또는 치료 용도를 방해할 수 있는 세포의 오염 구성성분은, 예를 들어 효소, 호르몬, 또는 세포의 다른 펩티드성 또는 비-펩티드성 구성성분이다. 바람직한 항체 또는 결합제는 항체 또는 결합제에 대해 95 중량% 초과의 정도로 정제된 것이다 (예를 들어 로우리 방법, UV-Vis 분광분석법 또는 SDS 모세관 겔 전기영동에 의해 결정됨). 또한 아미노 말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 아미노산을 결정하는 것이 가능한 정도로 정제되거나, 또는 환원 또는 비-환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 결정된 동질성으로 정제된 (검출은 쿠마시 블루 염색에 의해 또는 바람직하게는 은 착색에 의해 결정될 수 있음) 항체이다. 그러나, 항체는 통상적으로 1개 이상의 정제 단계에 의해 제조된다.
용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합한다"는 미리 결정된 항원/표적 분자에 결합하는 항체 또는 결합제를 지칭한다. 항체 또는 결합제의 특이적 결합은 전형적으로 적어도 10-7 M (Kd 값으로서; 즉 바람직하게는 10-7 M 미만의 Kd 값을 갖는 것)의 친화도를 갖는 항체 또는 결합제, 미리 결정된 항원/표적 분자 또는 밀접하게 관련된 항원/표적 분자가 아닌 비-특이적 항원/표적 분자 (예를 들어 소 혈청 알부민 또는 카세인)에 대해서보다 미리 결정된 항원/표적 분자에 대해 적어도 2배 더 높은 친화도를 갖는 항체 또는 결합제를 기재한다. 항체 또는 결합제의 특이적 결합은 복수의 항원/표적 분자 (예를 들어 상이한 종들의 오르토로그)에 대한 항체 또는 결합제 결합을 배제하지 않는다. 항체는 바람직하게는 적어도 10-7 M (Kd 값으로서; 다시 말해서 바람직하게는 10-7 M보다 더 작은 Kd 값을 갖는 것), 바람직하게는 적어도 10-8 M, 보다 바람직하게는 10-9 M 내지 10-11 M 범위의 친화도를 갖는다. Kd 값은, 예를 들어 표면 플라즈몬 공명 분광분석법에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 항체-약물 접합체는 마찬가지로 이들 범위의 친화도를 나타낸다. 친화도는 바람직하게는 약물의 접합에 의해 실질적으로 영향을 받지 않는다 (일반적으로, 친화도는 한 자릿수 미만, 다시 말해서, 예를 들어 최대 10-8 M에서 10-7 M으로 감소함).
본 발명에 따라 사용된 항체는 또한 바람직하게는 높은 선택성에 대해 주목할 만하다. 높은 선택성은 본 발명의 항체가 독립적인 다른 항원, 예를 들어 인간 혈청 알부민에 대해서보다 표적 단백질에 대해 적어도 2배, 바람직하게는 5배 또는 보다 바람직하게는 10배 더 우수한 친화도를 나타내는 경우에 존재한다 (친화도는, 예를 들어 표면 플라즈몬 공명 분광분석법에 의해 결정될 수 있음).
또한, 사용된 본 발명의 항체는 바람직하게는 교차-반응성이다. (예를 들어 이종이식편 마우스에서의) 전임상 연구, 예를 들어 독성학적 또는 활성 연구를 용이하게 하고 더 잘 해석할 수 있기 위해, 본 발명에 따라 사용된 항체가 인간 표적 단백질에 결합할 뿐만 아니라 연구에 사용된 종에서의 종 표적 단백질에 결합하는 경우가 유리하다. 한 실시양태에서 본 발명에 따라 사용된 항체는, 인간 표적 단백질에 더하여, 적어도 1종의 추가의 종의 표적 단백질에 대해 교차-반응성이다. 독성학적 및 활성 연구를 위해 설치류, 개 및 비-인간 영장류의 패밀리의 종을 사용하는 것이 바람직하다. 바림직한 설치류 종은 마우스 및 래트이다. 바람직한 비-인간 영장류는 레서스 원숭이, 침팬지 및 긴-꼬리 마카크이다.
한 실시양태에서 본 발명에 따라 사용되는 항체는, 인간 표적 단백질에 더하여, 마우스, 래트 및 긴-꼬리 마카크 (마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis))로 이루어진 종의 군으로부터 선택된 적어도 1종의 추가의 종의 표적 단백질에 대해 교차-반응성이다. 인간 표적 단백질에 더하여 적어도 마우스 표적 단백질에 대해 교차-반응성인 본 발명에 따라 사용된 항체가 특히 바람직하다. 추가의 비-인간 종의 표적 단백질에 대한 친화도가 인간 표적 단백질에 대한 친화도보다 50배 이하, 보다 특히 10배 이하로 상이한 교차-반응성 항체가 바람직하다.
암 표적 분자에 대하여 지시된 항체
결합제, 예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 지시되는 표적 분자는 바람직하게는 암 표적 분자이다. 용어 "암 표적 분자"는 동일한 조직 유형의 비-암 세포 상에서보다 1종 이상의 암 세포 종 상에서 더 풍부하게 존재하는 표적 분자를 기재한다. 바람직하게는, 암 표적 분자는 동일한 조직 유형의 비-암 세포와 비교하여 1종 이상의 암 세포 종 상에서 선택적으로 존재하며, 여기서 선택적으로는 동일한 조직 유형의 비-암 세포와 비교하여 암 세포 상에서의 적어도 2-배의 풍부화를 기재한다 ("선택적 암 표적 분자"). 암 표적 분자의 사용은 본 발명에 따른 접합체를 사용하여 암 세포의 선택적 요법을 가능하게 한다.
항원, 예를 들어 암 세포 항원에 대해 특이적인 항체는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해, 그 또는 그녀에게 친숙한 방법 (예컨대 예를 들어 재조합 발현)에 의해 제조될 수 있거나 또는 (예를 들어 독일 머크 카게아아(Merck KGaA)로부터) 상업적으로 획득될 수 있다. 암 요법에서의 공지된 상업적으로 입수가능한 항체의 예는 에르비툭스(Erbitux)® (세툭시맙, 머크 카게아아), 아바스틴(Avastin)® (베바시주맙, 로슈(Roche)) 및 헤르셉틴(Herceptin)® (트라스투주맙, 제넨테크(Genentech))이다. 트라스투주맙은 세포-기반 검정에서 인간 표피 성장 수용체의 세포외 도메인에 고친화도 (Kd = 5 nM)로 결합하는 IgG1카파 유형의 재조합 인간화 모노클로날 항체이다. 항체는 CHO 세포에서 재조합적으로 생산된다. 모든 이들 항체는 또한 PNGase F에 의한 탈글리코실화에 의해 또는 중쇄의 N297 (카바트 넘버링)의 임의의 아미노산으로의 돌연변이에 의해, 이들 항체의 비-글리코실화 변이체로서 생산될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 표적 분자는 선택적 암 표적 분자이다.
특히 바람직한 실시양태에서, 표적 분자는 단백질이다.
한 실시양태에서, 표적 분자는 세포외 표적 분자이다. 바람직한 실시양태에서, 세포외 표적 분자는 단백질이다.
암 표적 분자는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 이들의 예가 하기 열거된다.
암 표적 분자의 예는 하기와 같다:
(1) EGFR (EGF 수용체, NCBI 참조 서열 NP_005219.2, NCBI 유전자 ID: 1956)
(2) 메소텔린 (스위스프롯 참조 Q13421-3), 아미노산 296-598에 의해 코딩되는 메소텔린. 아미노산 37-286은 거핵구 강화 인자를 코딩한다. 메소텔린은 GPI 앵커에 의해 세포 막에 고정되고 세포외에 국재화된다.
(3) 카르보안히드라제 IX (CA9, 스위스프롯 참조 Q16790), NCBI 유전자 ID: 768)
(4) C4.4a (NCBI 참조 서열 NP_055215.2; 동의어 LYPD3, NCBI 유전자 ID: 27076)
(5) CD52 (NCBI 참조 서열 NP_001794.2)
(6) Her2 (ERBB2; NCBI 참조 서열 NP_004439.2; NCBI 유전자 ID: 2064)
(7) CD20 (NCBI 참조 서열 NP_068769.2)
(8) 림프구 활성화 항원 CD30 (스위스프롯 ID P28908)
(9) 림프구 부착 분자 CD22 (스위스프롯 ID P20273; NCBI 유전자 ID: 933)
(10) 골수 세포 표면 항원 CD33 (스위스프롯 ID P20138; NCBI 유전자 ID: 945)
(11) 막횡단 당단백질 NMB (GPNMB, 스위스프롯 ID Q14956, NCBI 유전자 ID: 10457)
(12) 부착 분자 CD56 (스위스프롯 ID P13591)
(13) 표면 분자 CD70 (스위스프롯 ID P32970, NCBI 유전자 ID: 970)
(14) 표면 분자 CD74 (스위스프롯 ID P04233, NCBI 유전자 ID: 972)
(15) B-림프구 항원 CD19 (스위스프롯 ID P15391, NCBI 유전자 ID: 930)
(16) 표면 단백질 뮤신-1 (MUC1, 스위스프롯 ID P15941, NCBI 유전자 ID: 4582)
(17) 표면 단백질 CD138 (스위스프롯 ID P18827)
(18) 인테그린 알파V (NCBI 참조 서열: NP_002201.1, NCBI 유전자 ID: 3685)
(19) 기형암종-유래 성장 인자 1 단백질 TDGF1 (NCBI 참조 서열: NP_003203.1, NCBI 유전자 ID: 6997)
(20) 전립선-특이적 막 항원 PSMA (스위스프롯 ID: Q04609; NCBI 유전자 ID: 2346)
(21) 티로신 단백질 키나제 EPHA2 (스위스프롯 ID: P29317, NCBI 유전자 ID: 1969)
(22) 표면 단백질 SLC44A4 (NCBI 참조 서열: NP_001171515.1, NCBI 유전자 ID: 80736)
(23) 표면 단백질 BMPR1B (스위스프롯: O00238)
(24) 수송 단백질 SLC7A5 (스위스프롯: Q01650)
(25) 상피 전립선 항원 STEAP1 (스위스프롯: Q9UHE8, 유전자 ID: 26872)
(26) 난소 암종 항원 MUC16 (스위스프롯: Q8WXI7, 유전자 ID: 94025)
(27) 수송 단백질 SLC34A2 (스위스프롯: O95436, 유전자 ID: 10568)
(28) 표면 단백질 SEMA5b (스위스프롯: Q9P283)
(29) 표면 단백질 LYPD1 (스위스프롯: Q8N2G4)
(30) 엔도텔린 수용체 유형 B EDNRB (스위스프롯: P24530, NCBI 유전자 ID: 1910)
(31) 고리 핑거 단백질 RNF43 (스위스프롯: Q68DV7)
(32) 전립선 암종-연관 단백질 STEAP2 (스위스프롯: Q8NFT2)
(33) 양이온 채널 TRPM4 (스위스프롯: Q8TD43)
(34) 보체 수용체 CD21 (스위스프롯: P20023)
(35) B-세포 항원 수용체 복합체-연관 단백질 CD79b (스위스프롯: P40259, NCBI 유전자 ID: 974)
(36) 세포 부착 항원 CEACAM6 (스위스프롯: P40199)
(37) 디펩티다제 DPEP1 (스위스프롯: P16444)
(38) 인터류킨 수용체 IL20R알파 (스위스프롯: Q9UHF4, NCBI 유전자 ID: 3559)
(39) 프로테오글리칸 BCAN (스위스프롯: Q96GW7)
(40) 에프린 수용체 EPHB2 (스위스프롯: P29323)
(41) 전립선 줄기 세포-연관 단백질 PSCA (NCBI 참조 서열: NP_005663.2)
(42) 표면 단백질 LHFPL3 (스위스프롯: Q86UP9)
(43) 수용체 단백질 TNFRSF13C (스위스프롯: Q96RJ3)
(44) B-세포 항원 수용체 복합체-연관 단백질 CD79a (스위스프롯: P11912)
(45) 수용체 단백질 CXCR5 (CD185; 스위스프롯: P32302; NCBI 유전자 ID 643, NCBI 참조 서열: NP_001707.1)
(46) 이온 채널 P2X5 (스위스프롯: Q93086)
(47) 림프구 항원 CD180 (스위스프롯: Q99467)
(48) 수용체 단백질 FCRL1 (스위스프롯: Q96LA6)
(49) 수용체 단백질 FCRL5 (스위스프롯: Q96RD9)
(50) MHC 부류 II 분자 Ia 항원 HLA-DOB (NCBI 참조 서열: NP_002111.1)
(51) T-세포 단백질 VTCN1 (스위스프롯: Q7Z7D3)
(52) TWEAKR (FN14, TNFRSF12A, NCBI 참조 서열: NP_057723.1, NCBI 유전자 ID: 51330)
(53) 림프구 항원 CD37 (스위스프롯: P11049, NCBI 유전자 ID: 951)
(54) FGF 수용체 2; FGFR2 (NCBI 유전자 ID: 2263; 공식 기호: FGFR2). FGFR2 수용체는 상이한 스플라이스 변이체 (알파, 베타, IIIb, IIIc)로 발생한다. 모든 스플라이스 변이체는 표적 분자로서 작용할 수 있다.
(55) 막횡단 당단백질 B7H3 (CD276; NCBI 유전자 ID: 80381 NCBI 참조 서열: NP_001019907.1, 스위스프롯: Q5ZPR3-1)
(56) B 세포 수용체 BAFFR (CD268; NCBI 유전자 ID: 115650)
(57) 수용체 단백질 ROR 1 (NCBI 유전자 ID: 4919)
(58) 표면 수용체 CD123 (IL3RA; NCBI 유전자 ID: 3563; NCBI 참조 서열: NP_002174.1; 스위스-프롯: P26951)
(59) 수용체 단백질 신시틴 (NCBI 유전자 ID 30816)
(60) 아스파르테이트 베타-히드록실라제 (ASPH; NCBI 유전자 ID 444)
(61) 세포 표면 당단백질 CD44 (NCBI 유전자 ID: 960)
(62) CDH15 (카드헤린 15, NCBI 유전자 ID: 1013)
(63) 세포 표면 당단백질 CEACAM5 (NCBI 유전자 ID: 1048)
(64) 세포 부착 분자 L1-유사 (CHL1, NCBI 유전자 ID: 10752)
(65) 수용체 티로신 키나제 c-Met (NCBI 유전자 ID: 4233)
(66) notch 리간드 DLL3 (NCBI 유전자 ID: 10683)
(67) 에프린 A4 (EFNA4, NCBI 유전자 ID: 1945)
(68) 엑토뉴클레오티드 피로포스파타제/포스포디에스테라제 3 (ENPP3, NCBI 유전자 ID: 5169)
(69) 응고 인자 III (F3, NCBI 유전자 ID: 2152)
(70) FGF 수용체 3 (FGFR3, NCBI 유전자 ID: 2261)
(71) 폴레이트 히드롤라제 FOLH1 (NCBI 유전자 ID: 2346)
(72) 폴레이트 수용체 1 (FOLR1; NCBI 유전자 ID: 2348)
(73) 구아닐레이트 시클라제 2C (GUCY2C, NCBI 유전자 ID: 2984)
(74) KIT 원종양유전자 수용체 티로신 키나제 (NCBI 유전자 ID: 3815)
(75) 리소솜-연관 막 단백질 1 (LAMP1, NCBI 유전자 ID: 3916)
(76) 림프구 항원 6 복합체, 유전자좌 E (LY6E, NCBI 유전자 ID: 4061)
(77) 단백질 NOTCH3 (NCBI 유전자 ID: 4854)
(78) 단백질 티로신 키나제 7 (PTK7, NCBI 유전자 ID: 5754)
(79) 넥틴 세포 부착 분자 4 (PVRL4, NECTIN4, NCBI 유전자 ID: 81607)
(80) 막횡단 단백질 신데칸 1 (SDC1, NCBI 유전자 ID: 6382)
(81) SLAM 패밀리 구성원 7 (SLAMF7, NCBI 유전자 ID: 57823)
(82) 수송 단백질 SLC39A6 (NCBI 유전자 ID: 25800)
(83) SLIT- 및 NTRK-유사 패밀리 구성원 6 (SLITRK6, NCBI 유전자 ID: 84189)
(84) 세포 표면 수용체 TACSTD2 (NCBI 유전자 ID: 4070)
(85) 수용체 단백질 TNFRSF8 (NCBI 유전자 ID: 943)
(86) 수용체 단백질 TNFSF13B (NCBI 유전자 ID: 10673)
(87) 당단백질 TPBG (NCBI 유전자 ID: 7162)
(88) 세포 표면 수용체 TROP2 (TACSTD2, NCBI 유전자 ID: 4070)
(89) 갈라닌-유사 G 단백질-결합 수용체 KISS1R (GPR54, NCBI 유전자 ID: 84634)
(90) 수송 단백질 SLAMF6 (NCBI 유전자 ID: 114836)
본 발명의 바람직한 대상에서, 암 표적 분자는 암 표적 분자 EGFR, CD123, Her2, B7H3, TWEAKR 및 CXCR5, 특히 CD123, CXCR5 및 B7H3으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 추가의 특히 바람직한 대상에서, 결합제는 암 표적 분자 EGFR, CD123, Her2, B7H3, TWEAKR 및 CXCR5, 특히 CD123, CXCR5 및 B7H3으로 이루어진 군으로부터 선택된 세포외 암 표적 분자에 결합한다.
본 발명의 추가의 특히 바람직한 대상에서, 결합제는 암 표적 분자 EGFR, CD123, Her2, B7H3, TWEAKR 및 CXCR5, 특히 CD123, CXCR5 및 B7H3으로 이루어진 군으로부터 선택된 세포외 암 표적 분자에 특이적으로 결합한다. 바람직한 실시양태에서, 결합제는, 표적 세포 상의 그의 세포외 표적 분자에 결합한 후, 결합을 통해 표적 세포에 의해 내재화된다. 이는 면역접합체 또는 ADC일 수 있는 결합제-약물 접합체가 표적 세포에 의해 흡수되도록 한다. 이어서, 결합제는, 바람직하게는 세포내에서, 바람직하게는 리소솜에서 프로세싱된다.
한 실시양태에서 결합제는 결합 단백질이다. 바람직한 실시양태에서 결합제는 항체, 항원-결합 항체 단편, 다중특이적 항체 또는 항체 모방체이다.
바람직한 항체 모방체는 아피바디, 애드넥틴, 안티칼린, DARPin, 아비머 또는 나노바디이다. 바람직한 다중특이적 항체는 이중특이적 및 삼중특이적 항체이다.
바람직한 실시양태에서 결합제는 항체 또는 항원-결합 항체 단편, 보다 바람직하게는 단리된 항체 또는 단리된 항원-결합 항체 단편이다.
바람직한 항원-결합 항체 단편은 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편, 디아바디, DAb, 선형 항체 및 scFv이다. Fab, 디아바디 및 scFv가 특히 바람직하다.
특히 바람직한 실시양태에서 결합제는 항체이다. 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 항체 단편이 특히 바람직하다. 인간, 인간화 또는 키메라 항체 또는 그의 항원-결합 항체 단편이 추가로 특히 바람직하다.
암 표적 분자에 결합하는 항체 또는 항원-결합 항체 단편은 공지된 방법, 예컨대, 예를 들어 화학적 합성 또는 재조합 발현을 사용하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 제조될 수 있다. 암 표적 분자에 대한 결합제는 상업적으로 획득될 수 있거나 또는 공지된 방법, 예컨대, 예를 들어 화학적 합성 또는 재조합 발현을 사용하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 제조될 수 있다. 항체 또는 항원-결합 항체 단편을 제조하는 추가의 방법은 WO 2007/070538 (페이지 22 "항체" 참조)에 기재되어 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 어떻게 파지 디스플레이 라이브러리 (예를 들어 모르포시스 HuCAL 골드(Morphosys HuCAL Gold))와 같은 방법이 컴파일링되고 항체 또는 항원-결합 항체 단편을 발견하는데 사용될 수 있는지를 알고 있다 (WO 2007/070538, 페이지 24 ff 및 페이지 70의 AK 실시예 1, 페이지 72의 AK 실시예 2 참조). B 세포로부터의 DNA 라이브러리를 사용하여 항체를 제조하는 추가의 방법은, 예를 들어 페이지 26 (WO 2007/070538)에 기재되어 있다. 항체를 인간화하는 방법은 WO2007070538의 페이지 30-32 및 문헌 [Queen, et al., Pros. Natl. Acad. Sci. USA 8610029-10033,1989] 또는 WO 90/0786에 상세하게 기재되어 있다. 게다가, 일반적으로 단백질 및 특히 항체의 재조합 발현 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Berger and Kimrnel (Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, Inc.); Sambrook, et al., (Molecular Cloning A Laboratory Manual, (Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, N.Y.; 1989) Vol. 1-3); Current Protocols in Molecular Biology, (F. M. Ausabel et al. [Eds.], Current Protocols, Green Publishing Associates, Inc. / John Wiley & Sons, Inc.); Harlow et al., (Monoclonal Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (19881, Paul [Ed.]); Fundamental Immunology, (Lippincott Williams & Wilkins (1998)); 및 Harlow, et al., (Using Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)] 참조). 관련 기술분야의 통상의 기술자는 단백질/항체의 발현에 필요한 상응하는 벡터, 프로모터 및 신호 펩티드를 알고 있다. 통상적인 방법이 또한 WO 2007/070538 페이지 41-45에 기재되어 있다. IgG1 항체를 제조하는 방법은, 예를 들어 WO 2007/070538 페이지 74의 실시예 6 ff에 기재되어 있다. 항체의 그의 항원에 대한 결합 후 내재화의 결정을 가능하게 하는 방법은 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 예를 들어 WO 2007/070538 페이지 80에 기재되어 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상이한 표적 분자 특이성을 갖는 항체의 제조와 유사하게 카르보안히드라제 IX (Mn) 항체를 제조하는데 사용된, WO 2007/070538에 기재된 방법을 사용할 수 있다.
박테리아 발현
관련 기술분야의 통상의 기술자는 항체, 그의 항원-결합 단편 또는 그의 변이체가 박테리아 발현의 보조로 생산될 수 있는 방식을 알고 있다.
목적하는 단백질의 박테리아 발현에 적합한 발현 벡터는 적합한 번역 개시 및 번역 종결 신호 및 기능적 프로모터와 함께 기능적 리딩 프레임 내에서 목적하는 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 삽입에 의해 구축된다. 벡터는 숙주 내에서의 벡터의 보유 및, 원하는 경우에, 그의 증폭을 가능하게 하기 위해 1종 이상의 표현형 선택 마커 및 복제 기점을 포함한다. 형질전환에 적합한 원핵 숙주는 이. 콜라이(E. coli), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) 및 속 슈도모나스(Pseudomonas), 스트렙토미세스(Streptomyces) 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus)로부터의 다양한 종을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 박테리아 벡터는, 예를 들어 박테리오파지, 플라스미드 또는 파지미드에 기반할 수 있다. 이들 벡터는 상업적으로 입수가능한 플라스미드로부터 유래된 선택 마커 및 박테리아 복제 기점을 함유할 수 있다. 많은 상업적으로 입수가능한 플라스미드는 전형적으로 널리 공지된 클로닝 벡터 pBR322 (ATCC 37017)의 요소를 함유한다. 박테리아 시스템에서, 다수의 유리한 발현 벡터가 발현될 단백질의 의도된 용도에 기초하여 선택될 수 있다.
적합한 숙주 균주의 형질전환 및 적절한 세포 밀도로의 숙주 균주의 성장 후, 선택된 프로모터는 적합한 수단 (예를 들어 온도의 변화 또는 화학적 유도)에 의해 탈-재프라이밍/유도되고, 세포는 추가의 기간 동안 배양된다. 세포는 전형적으로 원심분리에 의해 수거되고, 필요한 경우 물리적 방식으로 또는 화학적 수단에 의해 소화되고, 생성된 미가공 추출물은 추가 정제를 위해 유지된다.
따라서, 본 발명의 추가 실시양태는 본 발명의 신규 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터이다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 자연적으로 정제된 산물, 화학적 합성으로부터 유래된 산물, 및 원핵 숙주, 예를 들어 이. 콜라이, 바실루스 서브틸리스, 살모넬라 티피무리움 및 속 슈도모나스, 스트렙토미세스, 및 스타필로코쿠스로부터의 다양한 종, 바람직하게는 이. 콜라이에서 재조합 기술에 의해 생산된 산물을 포함한다.
포유동물 세포 발현
관련 기술분야의 통상의 기술자는 항체, 그의 항원-결합 단편 또는 그의 변이체가 포유동물 세포 발현의 보조로 생산될 수 있는 방식을 알고 있다.
포유동물 세포 숙주에서의 발현을 위한 바람직한 조절 서열은 포유동물 세포에서 높은 발현으로 이어지는 바이러스 요소, 예컨대 다음으로부터 유래된 프로모터 및/또는 발현 증폭인자를 포함한다: 시토메갈로바이러스 (CMV) (예컨대 CMV 프로모터/인핸서), 원숭이 바이러스 40 (SV40) (예컨대 SV40 프로모터/인핸서), 아데노바이러스 (예를 들어 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (AdMLP)) 및 폴리오마. 항체의 발현은 구성적이거나 또는 조절될 수 있다 (예를 들어 Tet 시스템과 조합되어 소분자 유도제, 예컨대 테트라시클린의 첨가 또는 제거에 의해 유도될 수 있음).
바이러스 조절 요소 및 그의 서열에 대한 추가 설명에 대해서는, 예를 들어 U.S. 5,168,062 (Stinski), U.S. 4,510,245 (Bell et al.) 및 U.S. 4,968,615 (Schaffner et al.)를 참조한다. 재조합 발현 벡터는 마찬가지로 복제 기점 및 선택 마커를 포함할 수 있다 (예를 들어, U.S. 4,399,216, 4,634,665 및 U.S. 5,179,017 참조). 적합한 선택 마커는 벡터가 세포 내로 도입된 경우에 G418, 퓨로마이신, 히그로마이신, 블라스티시딘, 제오신/블레오마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 물질에 대한 저항성을 부여하는 유전자, 또는 숙주 세포의 영양요구성을 유도하는 선택 마커, 예컨대 글루타민 신테타제 (Bebbington et al., Biotechnology (N Y). 1992 Feb;10(2):169-75)를 포함한다.
예를 들어, 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자는 메토트렉세이트에 대한 저항성을 부여하고, neo 유전자는 G418에 대한 저항성을 부여하고, 아스페르길루스 테레우스(Aspergillus terreus)로부터의 bsd 유전자는 블라스티시딘에 대한 저항성을 부여하고, 퓨로마이신 N-아세틸트랜스퍼라제는 퓨로마이신에 대한 저항성을 부여하고, Sh ble 유전자 산물은 제오신에 대한 저항성을 부여하고, 히그로마이신에 대한 저항성은 이. 콜라이 히그로마이신 저항성 유전자 (hyg 또는 hph)에 의해 부여된다. 선택 마커, 예컨대 DHFR 또는 글루타민 신테타제는 또한 MTX 및 MSX와 함께 증폭 기술에 도움이 된다.
숙주 세포 내로의 발현 벡터의 형질감염은 전기천공, 뉴클레오펙션, 인산칼슘 침전, 리포펙션, 다가양이온-기반 형질감염, 예컨대 폴리에틸렌이민 (PEI)-기반 형질감염 및 DEAE-덱스트란 형질감염에 의한 것을 포함한 표준 기술의 보조로 실행될 수 있다.
항체, 그의 항원-결합 단편 또는 그의 변이체의 발현을 위한 적합한 포유동물 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 예컨대 CHO-K1, CHO-S, CHO-K1SV [문헌 [R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621]에 기재된 바와 같은 DHFR-선택 마커와 함께 사용되는, 문헌 [Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220 및 Urlaub et al., Cell. 1983 Jun;33(2):405-12]에 기재된 DHFR-CHO 세포, 및 문헌 [Fan et al., Biotechnol Bioeng. 2012 Apr;109(4):1007-15]에 상세설명된 바와 같은 다른 녹아웃 세포를 포함함], NS0 골수종 세포, COS 세포, HEK293 세포, HKB11 세포, BHK21 세포, CAP 세포, EB66 세포 및 SP2 세포를 포함한다.
항체, 그의 항원-결합 단편 또는 그의 변이체의 발현은 또한 일시적 또는 반-안정한 방식으로 발현 시스템, 예컨대 HEK293, HEK293T, HEK293-EBNA, HEK293E, HEK293-6E, HEK293 프리스타일, HKB11, Expi293F, 293EBNALT75, CHO 프리스타일, CHO-S, CHO-K1, CHO-K1SV, CHOEBNALT85, CHOS-XE, CHO-3E7 또는 CAP-T 세포 (예를 들어 문헌 [Durocher et al., Nucleic Acids Res. 2002 Jan 15;30(2):E9]과 같음)에서 실시될 수 있다.
일부 실시양태에서, 발현 벡터는 발현될 단백질이 숙주 세포가 성장 중인 세포 배양 배지 내로 분비되도록 구축된다. 항체, 그의 항원-결합 단편 또는 그의 변이체는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 단백질 정제 방법의 보조로 세포 배양 배지로부터 수득될 수 있다.
정제
항체, 그의 항원-결합 단편 또는 그의 변이체는 널리 공지된 방법의 보조로 재조합 세포 배양물로부터 수득 및 정제될 수 있고, 이의 예는 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 단백질 A 크로마토그래피, 단백질 G 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC), 친화성 크로마토그래피, 히드록시아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함한다. 고성능 액체 크로마토그래피 ("HPLC")가 마찬가지로 정제에 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Colligan, Current Protocols in Immunology, or Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001), 예를 들어 챕터 1, 4, 6, 8, 9, 10]을 참조한다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 변이체는 자연적으로 정제된 산물, 화학적 합성 방법으로부터의 산물 및 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 재조합 기술의 보조로 생산된 산물을 포함한다. 진핵 숙주는, 예를 들어, 효모 세포, 고등 식물 세포, 곤충 세포 및 포유동물 세포를 포함한다. 재조합 발현을 위해 선택된 숙주 세포에 따라, 발현된 단백질은 글리코실화 또는 비-글리코실화 형태일 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 항체는 (1) 예를 들어 로우리 방법, UV-vis 분광분석법 또는 SDS 모세관 겔 전기영동 (예를 들어 캘리퍼 랩칩(Caliper LabChip) GXII, GX 90 또는 바이오라드 바이오애널라이저(Biorad Bioanalyzer) 기기에 의함)에 의해 측정 시 95 중량% 초과, 및 보다 바람직한 실시양태에서 99 중량% 초과의 정도로, (2) N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기의 결정에 적합한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색의 보조로 환원 또는 비-환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 결정된 동질성의 정도로 정제된다.
통상적으로, 단리된 항체는 적어도 1개의 단백질 정제 단계의 보조로 수득된다.
항-CD123 항체
본 발명에 따르면, 항-CD123 항체를 사용하는 것이 가능하다.
표현 "항-CD123 항체" 또는 "CD123에 특이적으로 결합하는 항체"는 바람직하게는 진단 및/또는 치료 용도에 충분한 친화도를 갖는, 암 표적 분자 CD123 (IL3RA; NCBI-유전자 ID: 3563; NCBI 참조 서열: NP_002174.1; 스위스-프롯: P26951; 서열식별번호: 111)에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다. 특정한 실시양태에서, 항체는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM 또는 ≤ 0.001 nM의 해리 상수 (KD)로 CD123에 결합한다.
문헌 [Sun et al. (Sun et al., 1996, Blood 87(1)83-92)]은 IL-3Rα, CD123의 N-말단 도메인에 결합하는 모노클로날 항체 7G3의 생성 및 특성을 기재한다. 미국 특허 번호 6,177,078 (Lopez)은 항-CD123 항체 7G3에 관한 것이다. 이 항체의 키메라 변이체 (CSL360)가 WO 2009/070844에 기재되어 있고, 인간화 버전 (CSL362)이 WO 2012/021934에 기재되어 있다. 7G3 항체의 서열이 EP2426148에 개시되어 있다. 이 서열은 CDR 그라프팅에 의해 수득되는 인간화 항체에 대한 출발점을 구성한다.
세포 표면 항원 결합 후에, 특히 잘 내재화되는 항체는 문헌 [Kuo et al. (Kuo et al., 2009, Bioconjug Chem. 20(10):1975-82)]에 개시된 항-CD123 항체 12F1이다. 항체 12F1은 항체 7G3보다 더 높은 친화도로 CD123에 결합하고, 세포 표면 항원 결합 후에, 7G3보다 현저히 더 빠르게 내재화된다. 12F1에 기초한 이중특이적 scFv 면역융합 단백질이 WO 2013/173820에 개시되어 있다. 항체 TPP-6013은 12F1의 키메라 변이체이다.
본 발명은 특히 마우스로부터 기원하는 항체 7G3 (Sun et al., 1996, Blood 87(1):83-92) 및 12F1 (Kuo et al., 2009, Bioconjug Chem. 20(10):1975-82)로부터 유래된 항체 또는 그의 항원-결합 항체 단편 또는 그의 변이체를 갖는 접합체, 또는 마우스로부터 기원하는 항체 12F1 (Kuo et al., 2009, Bioconjug Chem. 20(10):1975-82)로부터 유래된 항체 또는 그의 항원-결합 항체 단편 또는 그의 변이체를 갖는 접합체에 관한 것이다.
뮤린 7G3 항체 및 뮤린 12F1 항체의 인간화 변이체는 인간 프레임워크 내로의 CDR 그라프팅 및 후속 최적화에 의해 생성되었으며, 본 발명과 관련하여 바람직한 예이다.
항-CD123 항체 TPP-9476, TPP-8988, TPP-8987 및 TPP-6013이 본 발명과 관련하여 특히 바람직하다.
항-CXCR5 항체
본 발명에 따르면, 항-CXCR5 항체를 사용하는 것이 가능하다.
표현 "항-CXCR5 항체" 또는 "CXCR5에 특이적으로 결합하는 항체"는 바람직하게는 진단 및/또는 치료 용도에 충분한 친화도를 갖는, 암 표적 분자 CXCR5 (NCBI 참조 서열: NP_001707.1; 서열식별번호: 112)에 결합하는 항체에 관한 것이다. 특정한 실시양태에서, 항체는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM 또는 ≤ 0.001 nM의 해리 상수 (KD)로 CXCR5에 결합한다.
CXCR5에 결합하는 항체 및 항원-결합 단편의 예는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 예를 들어 EP2195023에 기재되어 있다.
래트 항체 RF8B2 (ACC2153)에 대한 하이브리도마 세포를 DSMZ로부터 구입하고, 항체의 서열을 표준 방법에 의해 확인하였다. 이 서열은 CDR 그라프팅에 의해 수득되는 인간화 항체에 대한 출발점을 구성한다.
이 항체의 인간화 변이체는 배선 서열 내로의 CDR 그라프팅에 의해 생성되었다.
이들 항체 및 항원-결합 단편은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
항-CXCR5 항체 TPP-9574 및 TPP-9580이 본 발명과 관련하여 특히 바람직하다.
항-B7H3 항체
본 발명에 따르면, 항-B7H3 항체를 사용하는 것이 가능하다.
표현 "항-B7H3 항체" 또는 "B7H3에 특이적으로 결합하는 항체"는 바람직하게는 진단 및/또는 치료 용도에 충분한 친화도를 갖는, 암 표적 분자 B7H3 (NCBI 참조 서열: NP_001019907.1, 서열식별번호: 113)에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다. 특정한 실시양태에서, 항체는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM 또는 ≤ 0.001 nM의 해리 상수 (KD)로 B7H3에 결합한다.
B7H3에 결합하는 항체 및 항원-결합 단편의 예는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 예를 들어 WO201109400, EP1773884 및 WO2014061277에 기재되어 있다. EP2121008은 항-B7H3 항체 8H9 및 그의 CDR 서열을 기재한다.
이들 항체 및 항원-결합 단편은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
항-B7H3 항체의 바람직한 실시양태는 재조합 마우스 B7H3 (마우스 CD276; 유전자 ID: 102657) 및 인간 B7H3 (인간 CD276; 유전자 ID: 80381)을 발현하는 세포에 대해 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 스크리닝함으로써 수득되었다. 수득된 항체는 인간 IgG1 포맷으로 형질전환되었다. 항-B7H3 항체 TPP-8382는 바람직한 예이다.
항-B7H3 항체 TPP-8382가 본 발명과 관련하여 특히 바람직하다.
항-TWEAKR 항체
본 발명에 따르면, 항-TWEAKR 항체를 사용하는 것이 가능하다.
표현 "항-TWEAKR 항체" 또는 "TWEAKR에 특이적으로 결합하는 항체"는 바람직하게는 진단 및/또는 치료 용도에 충분한 친화도를 갖는, 암 표적 분자 TWEAKR (NCBI 참조 서열: NP_057723.1, 서열식별번호: 114)에 결합하는 항체에 관한 것이다. 특정한 실시양태에서, 항체는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM 또는 ≤ 0.001 nM의 해리 상수 (KD)로 TWEAKR에 결합한다.
TWEAKR에 결합하는 항체의 예는, 예를 들어 WO2009/020933(A2), WO2009/140177 (A2), WO 2014/198817 (A1) 및 WO 2015/189143 (A1)에 개시되어 있다. 이들 항체 및 항원-결합 단편은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
ITEM-4는 문헌 [Nakayama et al. (Nakayama, et al., 2003, Biochem Biophy Res Comm, 306:819-825)]에 기재된 항-TWEAKR 항체이다. CDR 그라프팅에 기초한 이러한 항체의 인간화 변이체는 문헌 [Zhou et al. (Zhou et al., 2013, J Invest Dermatol. 133(4):1052-62)] 및 WO 2009/020933에 기재되어 있다. 이들 항체 및 항원-결합 단편은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
항-TWEAKR 항체 TPP-7006 및 TPP-7007이 본 발명과 관련하여 특히 바람직하다. 이들은 항체 ITEM-4의 인간화 변이체이다. 이들 항체 및 항원-결합 단편은 본 발명과 관련하여 바람직하게 사용될 수 있다.
항-HER2 항체:
본 발명에 따르면, 항-HER2 항체를 사용하는 것이 가능하다.
표현 "항-HER2 항체" 또는 "HER2에 특이적으로 결합하는 항체"는 바람직하게는 진단 및/또는 치료 용도에 충분한 친화도를 갖는, 암 표적 분자 HER2 (NCBI 참조 서열: NP_004439.2, 서열식별번호: 115)에 결합하는 항체에 관한 것이다. 특정한 실시양태에서, 항체는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM 또는 ≤ 0.001 nM의 해리 상수 (KD)로 HER2에 결합한다.
암 표적 분자 Her2에 결합하는 항체의 예는 트라스투주맙 (제넨테크)이다. 트라스투주맙은 특히 유방암의 치료에 사용되는 인간화 항체이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 항-HER2 항체는 TPP-1015 (트라스투주맙 유사체)이다.
HER2에 결합하는 항체의 추가의 예는, 트라스투주맙 (INN 7637, CAS 번호 RN: 180288-69-1) 및 페르투주맙 (CAS 번호 380610-27-5)에 더하여, WO 2009/123894-A2, WO 200/8140603-A2 또는 WO 2011/044368-A2에 개시된 항체들이다. 항-HER2 접합체의 예는 트라스투주맙-엠탄신 (INN-번호 9295)이다. 이들 항체 및 항원-결합 단편은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
항-HER2 항체 TPP-1015 (트라스투주맙과 유사함)가 본 발명과 관련하여 특히 바람직하다.
항-EGFR 항체
본 발명에 따르면, 항-EGFR 항체를 사용하는 것이 가능하다.
표현 "항-EGFR 항체" 또는 "EGFR에 특이적으로 결합하는 항체"는 바람직하게는 진단 및/또는 치료 용도에 충분한 친화도를 갖는, 암 표적 분자 EGFR (NCBI 참조 서열: NP_005219.2, 서열식별번호: 116)에 결합하는 항체에 관한 것이다. 특정한 실시양태에서, 항체는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM 또는 ≤ 0.001 nM의 해리 상수 (KD)로 EGFR에 결합한다.
바람직한 실시양태에서, 항-EGFR 항체는 TPP-981, 세툭시맙, 파니투무맙, 니모투주맙으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특히 바람직한 실시양태에서, 항-EGFR 항체는 TPP-981이다.
EGFR 항체의 추가 실시양태는 하기와 같다:
ㆍ 젠맙 A/S(Genmab A/S)으로부터의 잘루투무맙 / 2F8 / 휴맥스-EGFr (WO 02/100348, WO 2004/056847, INN 번호 8605)
ㆍ 임클론 시스템 인크.(ImClone Systems Inc.) [일라이 릴리 앤 캄파니(Eli Lilly & Co)]로부터의 네시투무맙 / 11F8, 임클론 / IMC-11F8 (WO 2005/090407 (EP 01735348-A1, US 2007/0264253-A1, US 7,598,350, WO 2005/090407-A1), INN 번호 9083)
ㆍ 머크 카게아아 / 다케다(Takeda)로부터의 마투주맙 / 항-EGFR MAb, 머크 카게아아 / 항-EGFR MAb, 다케다 / EMD 72000 / EMD-6200 / EMD-72000 및 EMD-55900 / MAb 425 / 모노클로날 항체 425 (WO 92/15683, INN 번호 8103 (마투주맙))
ㆍ 글리카르트 바이오테크놀로지 아게(Glycart Biotechnology AG) (로슈 홀딩 아게(Roche Holding AG))로부터의 RG-7160 / GA-201 / GA201 / R-7160 / R7160 / RG7160 / RO-4858696 / RO-5083945 / RO4858696 / RO5083945 (WO 2010/112413-A1, WO 2010/115554)
ㆍ 글리코토프 게엠베하(Glycotope GmbH)로부터의 GT-MAB 5.2-GEX / 세투젝스 (WO 2008/028686-A2 (EP 01900750-A1, EP 01911766-A1, EP 02073842-A2, US 2010/0028947-A1)
ㆍ 이수 앱지스 인크(Isu Abxis Inc) (이수 케미칼 캄파니 리미티드(ISU Chemical Co Ltd)) / 스칸셀(Scancell)로부터의 ISU-101 (WO 2008/004834-A1)
ㆍ 루드윅 암 연구소(Ludwig Institute for Cancer Research) / 애보트(Abbott) / 라이프 사이언스 파마슈티칼스(Life Science Pharmaceuticals)로부터의 ABT-806 / mAb-806 / ch-806 / 항-EGFR 모노클로날 항체 806 (WO 02/092771, WO 2005/081854 및 WO 2009/023265)
ㆍ 심포겐 에이/에스(Symphogen A/S)로부터의 SYM-004 (2종의 키메라 IgG1 항체 (992 및 1024)로 이루어짐) (WO 2010/022736-A2)
ㆍ 이박스 코포레이션(IVAX Corp) (테바 파마슈티칼 인더스트리즈 리미티드(Teva Pharmaceutical Industries Ltd)) (듀크 대학교)로부터의 MR1-1 /MR1-1KDEL (특허: WO2001/062931-A2)
ㆍ 암젠(Amgen)/아브게닉스(Abgenix)로부터의 결실 돌연변이체 EGFRvIII에 대한 항체 (WO 2005/010151, US 7,628,986)
ㆍ 스칸셀 리미티드로부터의 SC-100 (WO 01/088138-A1)
ㆍ 브리스톨-마이어스 스큅(Bristol-Myers Squibb) (US) / 머크 카게아아 (DE) / 다케다 (JP)로부터의 MDX-447 / EMD 82633 / BAB-447 / H 447 / MAb, EGFR, 메다렉스(Medarex)/머크 카게아아 (WO 91/05871, WO 92/15683)
ㆍ 젠코르(Xencor)로부터의 항-EGFR-Mab (WO 2005/056606)
ㆍ 인넥서스 바이오테크놀로지 인크(InNexus Biotechnology Inc) 파마프로젝트 PH048638로부터의 DXL-1218 / 항-EGFR 모노클로날 항체 (암), 인넥서스.
항-카르보안히드라제 IX 항체
암 표적 분자 카르보안히드라제 IX에 결합하는 항체의 예는 WO 2007/070538-A2 (예를 들어 청구항 1 - 16)에 기재되어 있다.
항-C4.4a 항체:
C4.4a 항체 및 항원-결합 단편의 예가 WO 2012/143499 A2에 기재되어 있다. 항체의 서열은 WO 2012/143499 A2의 표 1에 제공되며, 여기서 각각의 행은 제1열에 열거된 항체의 가변 경쇄 또는 가변 중쇄의 각각의 CDR 아미노산 서열을 제시한다.
항-CD20 항체:
암 표적 분자 CD20에 결합하는 항체의 예는 리툭시맙 (제넨테크)이다. 리툭시맙 (CAS 번호: 174722-31-7)은 비-호지킨 림프종의 치료에 사용되는 키메라 항체이다. 이들 항체 및 그의 항원-결합 단편은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
항-CD52 항체:
암 표적 분자 CD52에 결합하는 항체의 예는 알렘투주맙 (겐자임)이다. 알렘투주맙 (CAS 번호: 216503-57-0)은 만성 림프구성 백혈병의 치료에 사용되는 인간화 항체이다. 이들 항체 및 그의 항원-결합 단편은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
항-메소텔린 항체:
항-메소텔린 항체의 예는, 예를 들어 WO2009/068204에 기재되어 있다. WO2009/068204에 개시된 모든 항체 및 항원-결합 단편은 본원에 개시된 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다. 보다 바람직하게는, WO2009/068204에 개시된 항체는 MF-T이다.
항-CD30 항체
암 표적 분자 CD30과 결합하고, 암, 예를 들어 호지킨 림프종의 치료에 사용될 수 있는 항체의 예는 브렌툭시맙, 이라투무맙 및 WO 2008/092117, WO 2008/036688 또는 WO 2006/089232에 개시된 항체들이다. 항-CD30 접합체의 예는 브렌툭시맙 베도틴 (INN 번호 9144)이다. 이들 항체 및 그의 항원-결합 단편은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
항-CD22 항체
암 표적 분자 CD22에 결합하고, 암, 예를 들어 림프종의 치료에 사용될 수 있는 항체의 예는 이노투주맙 및 에프라투주맙이다. 항-CD22 접합체의 예는 이노투주맙 오자가미신 (INN 번호 8574) 또는 항-CD22-MMAE 및 항-CD22-MC-MMAE (각각 CAS RN: 139504-50-0 및 474645-27-7)이다. 이들 항체 및 그의 항원-결합 단편은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
항-CD33 항체
암 표적 분자 CD33에 결합하고, 암, 예를 들어 백혈병의 치료에 사용될 수 있는 항체의 예는 겜투주맙 및 린투주맙 (INN 7580)이다. 항-CD33 접합체의 예는 겜투주맙-오자가미신이다. 이들 항체 및 항원-결합 단편은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
항-NMB 항체
암 표적 분자 NMB에 결합하고, 암, 예를 들어 흑색종 또는 유방암의 치료에 사용될 수 있는 항체의 예는 글렘바투무맙 (INN 9199)이다. 항-NMB 접합체의 예는 글렘바투무맙 베도틴 (CAS RN: 474645-27-7)이다. 이들 항체 및 그의 항원-결합 단편은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
항-CD56 항체
암 표적 분자 CD56에 결합하고, 암, 예를 들어 다발성 골수종, 소세포 폐 암종, MCC 또는 난소 암종의 치료에 사용될 수 있는 항체의 예는 로르보투주맙이다. 항-CD57 접합체의 예는 로르보투주맙 메르탄신 (CAS RN: 139504-50-0)이다. 이들 항체 및 항원-결합 단편은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
항-CD70 항체
암 표적 분자 CD70에 결합하고, 암, 예를 들어 비-호지킨 림프종 또는 신세포암의 치료에 사용될 수 있는 항체의 예는 WO 2007/038637-A2 및 WO 2008/070593-A2에 개시되어 있다. 항-CD70 접합체의 예는 SGN-75 (CD70 MMAF)이다. 이들 항체 및 항원-결합 단편은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
항-CD74 항체
암 표적 분자 CD74에 결합하고, 암, 예를 들어 다발성 골수종의 치료에 사용될 수 있는 항체의 예는 밀라투주맙이다. 항-CD74 접합체의 예는 밀라투주맙-독소루비신 (CAS RN: 23214-92-8)이다. 이들 항체 및 항원-결합 단편은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
항-CD19 항체
암 표적 분자 CD19에 결합하고, 암, 예를 들어 비-호지킨 림프종의 치료에 사용될 수 있는 항체의 예는 WO 2008/031056-A2에 개시되어 있다. 추가의 항체 및 항-CD19 접합체 (SAR3419)의 예는 WO 2008/047242-A2에 개시되어 있다. 이들 항체 및 그의 항원-결합 단편은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
항-뮤신 항체
암 표적 분자 뮤신-1에 결합하고, 암, 예를 들어 비-호지킨 림프종의 치료에 사용될 수 있는 항체의 예는 클리바투주맙 및 WO 2003/106495-A2, WO 2008/028686-A2에 개시된 항체들이다. 항-뮤신 접합체의 예는 WO 2005/009369-A2에 개시되어 있다. 이들 항체 및 그의 항원-결합 단편은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
항-CD138 항체
암 표적 분자 CD138에 결합하고, 암, 예를 들어 다발성 골수종의 치료에 사용될 수 있는 항체 및 그의 접합체의 예는 WO 2009/080829-A1, WO 2009/080830-A1에 개시되어 있다. 이들 항체 및 그의 항원-결합 단편은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
항-인테그린-알파V 항체
암 표적 분자 인테그린 알파V에 결합하고, 암, 예를 들어 흑색종, 육종 또는 암종의 치료에 사용될 수 있는 항체의 예는 인테투무맙 (CAS RN: 725735-28-4), 압식시맙 (CAS RN: 143653-53-6), 에타라시주맙 (CAS RN: 892553-42-3) 및 US 7,465,449, EP 719859-A1, WO 2002/012501-A1 및 WO2006/062779-A2에 개시된 항체들이다. 항-인테그린 알파V 접합체의 예는 인테투무맙-DM4 및 WO 2007/024536-A2에 개시된 다른 ADC이다. 이들 항체 및 그의 항원-결합 단편은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
항-TDGF1 항체
암 표적 분자 TDGF1에 결합하고, 암의 치료에 사용될 수 있는 항체의 예는 WO 02/077033-A1, US 7,318,924, WO 2003/083041-A2 및 WO 2002/088170-A2에 개시된 항체들이다. 항-TDGF1 접합체의 예는 WO 2002/088170-A2에 개시되어 있다. 이들 항체 및 그의 항원-결합 단편은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
항-PSMA 항체
암 표적 분자 PSMA에 결합하고, 암, 예를 들어 전립선 암종의 치료에 사용될 수 있는 항체의 예는 WO 97/35616-A1, WO 99/47554-A1, WO 01/009192-A1 및 WO2003/034903에 개시된 항체들이다. 항-PSMA 접합체의 예는 WO 2009/026274-A1 및 WO 2007/002222에 개시되어 있다. 이들 항체 및 항원-결합 단편은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
항-EPHA2 항체
암 표적 분자 EPHA2에 결합하고, 접합체의 제조 및 암의 치료에 사용될 수 있는 항체의 예는 WO 2004/091375-A2에 개시되어 있다. 이들 항체 및 항원-결합 단편은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
항-SLC44A4 항체
암 표적 분자 SLC44A4에 결합하고, 접합체의 제조 및 암, 예를 들어 췌장 또는 전립선 암종의 치료에 사용될 수 있는 항체의 예는 WO2009/033094-A2 및 US2009/0175796-A1에 개시되어 있다. 이들 항체 및 그의 항원-결합 단편은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
항-HLA-DOB 항체
암 표적 분자 HLA-DOB에 결합하는 항체의 예는 암, 예를 들어 비-호지킨 림프종의 치료에 사용될 수 있는 항체 Lym-1 (CAS RN: 301344-99-0)이다. 항-HLA-DOB 접합체의 예는, 예를 들어 WO 2005/081711-A2에 개시되어 있다. 이들 항체 및 그의 항원-결합 단편은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
항-VTCN1 항체
암 표적 분자 VTCN1에 결합하고, 접합체의 제조 및 암, 예를 들어 난소 암종, 췌장, 폐 또는 유방암의 치료에 사용될 수 있는 항체의 예는 WO 2006/074418-A2에 개시되어 있다. 이들 항체 및 그의 항원-결합 단편은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
항-FGFR2 항체
항-FGFR2 항체 및 항원-결합 단편의 예는 WO2013076186에 개시되어 있다. 항체의 서열은 WO2013076186의 표 9 및 표 10에 제시되어 있다. M048-D01 및 M047-D08로 지칭되는 항체로부터 유래된 항체, 항체의 항원-결합 단편 및 변이체가 바람직하다.
본 발명에 따른 결합제-약물 접합체를 위한 바람직한 항체 및 항원-결합 항체 단편
본 출원에서, 결합제-약물 접합체와 관련하여, 하기 표에 제시된 바와 같은 하기 바람직한 항체를 참조한다: TPP-981, TPP-1015, TPP-6013, TPP-7006, TPP-7007, TPP-8382, TPP-8987, TPP-8988, TPP-9476, TPP-9574 및 TPP-9580.
표: 항체의 단백질 서열:
Figure 112023060817933-pat00013
TPP-981, TPP-1015, TPP-6013, TPP-7006, TPP-7007, TPP-8382, TPP-8987, TPP-8988, TPP-9476, TPP-9574 및 TPP-9580은 중쇄의 가변 영역 (VH) 또는 경쇄의 가변 영역 (VL) 내에 상기 표에 명시된 CDR 서열 (H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3) 중 1개 이상을 포함하는 항체이다. 바람직하게는, 항체는 명시된 중쇄의 가변 영역 (VH) 및/또는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함한다. 바람직하게는, 항체는 중쇄 (IgG 중쇄)의 명시된 영역 및/또는 경쇄 (IgG 경쇄)의 명시된 영역을 포함한다.
TPP-981은 서열식별번호: 2에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR1 서열 (H-CDR1), 서열식별번호: 3에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR2 서열 (H-CDR2) 및 서열식별번호: 4에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR3 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄의 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 6에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR1 서열 (L-CDR1), 서열식별번호: 7에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR2 서열 (L-CDR2) 및 서열식별번호: 8에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR3 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-EGFR 항체이다.
TPP-1015는 서열식별번호: 12에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR1 서열 (H-CDR1), 서열식별번호: 13에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR2 서열 (H-CDR2) 및 서열식별번호: 14에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR3 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄의 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 16에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR1 서열 (L-CDR1), 서열식별번호: 17에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR2 서열 (L-CDR2) 및 서열식별번호: 18에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR3 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-HER2 항체이다.
TPP-6013은 서열식별번호: 22에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR1 서열 (H-CDR1), 서열식별번호: 23에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR2 서열 (H-CDR2) 및 서열식별번호: 24에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR3 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄의 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 26에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR1 서열 (L-CDR1), 서열식별번호: 27에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR2 서열 (L-CDR2) 및 서열식별번호: 28에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR3 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-CD123 항체이다.
TPP-7006은 서열식별번호: 32에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR1 서열 (H-CDR1), 서열식별번호: 33에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR2 서열 (H-CDR2) 및 서열식별번호: 34에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR3 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄의 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 36에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR1 서열 (L-CDR1), 서열식별번호: 37에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR2 서열 (L-CDR2) 및 서열식별번호: 38에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR3 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-TWEAKR 항체이다.
TPP-7007은 서열식별번호: 42에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR1 서열 (H-CDR1), 서열식별번호: 43에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR2 서열 (H-CDR2) 및 서열식별번호: 44에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR3 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄의 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 46에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR1 서열 (L-CDR1), 서열식별번호: 47에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR2 서열 (L-CDR2) 및 서열식별번호: 48에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR3 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-TWEAKR 항체이다.
TPP-8382는 서열식별번호: 52에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR1 서열 (H-CDR1), 서열식별번호: 53에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR2 서열 (H-CDR2) 및 서열식별번호: 54에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR3 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄의 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 56에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR1 서열 (L-CDR1), 서열식별번호: 57에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR2 서열 (L-CDR2) 및 서열식별번호: 58에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR3 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-B7H3 항체이다.
TPP-8987은 서열식별번호: 62에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR1 서열 (H-CDR1), 서열식별번호: 63에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR2 서열 (H-CDR2) 및 서열식별번호: 64에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR3 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄의 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 66에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR1 서열 (L-CDR1), 서열식별번호: 67에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR2 서열 (L-CDR2) 및 서열식별번호: 68에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR3 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-CD123 항체이다.
TPP-8988은 서열식별번호: 72에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR1 서열 (H-CDR1), 서열식별번호: 73에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR2 서열 (H-CDR2) 및 서열식별번호: 74에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR3 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄의 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 76에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR1 서열 (L-CDR1), 서열식별번호: 77에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR2 서열 (L-CDR2) 및 서열식별번호: 78에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR3 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-CD123 항체이다.
TPP-9476은 서열식별번호: 82에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR1 서열 (H-CDR1), 서열식별번호: 83에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR2 서열 (H-CDR2) 및 서열식별번호: 84에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR3 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄의 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 86에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR1 서열 (L-CDR1), 서열식별번호: 87에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR2 서열 (L-CDR2) 및 서열식별번호: 88에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR3 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-CD123 항체이다.
TPP-9574는 서열식별번호: 92에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR1 서열 (H-CDR1), 서열식별번호: 93에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR2 서열 (H-CDR2) 및 서열식별번호: 94에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR3 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄의 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 96에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR1 서열 (L-CDR1), 서열식별번호: 97에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR2 서열 (L-CDR2) 및 서열식별번호: 98에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR3 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-CXCR5 항체이다.
TPP-9580은 서열식별번호: 102에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR1 서열 (H-CDR1), 서열식별번호: 103에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR2 서열 (H-CDR2) 및 서열식별번호: 104에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR3 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄의 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 106에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR1 서열 (L-CDR1), 서열식별번호: 107에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR2 서열 (L-CDR2) 및 서열식별번호: 108에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR3 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-CXCR5 항체이다.
TPP-981은 바람직하게는 서열식별번호: 1에 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 영역 (VH) 및 서열식별번호: 5에 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-EGFR 항체이다.
TPP-1015는 바람직하게는 서열식별번호: 11에 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 영역 (VH) 및 서열식별번호: 15에 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-HER2 항체이다.
TPP-6013은 바람직하게는 서열식별번호: 21에 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 영역 (VH) 및 서열식별번호: 25에 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-CD123 항체이다.
TPP-7006은 바람직하게는 서열식별번호: 31에 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 영역 (VH) 및 서열식별번호: 35에 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-TWEAKR 항체이다.
TPP-7007은 바람직하게는 서열식별번호: 41에 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 영역 (VH) 및 서열식별번호: 45에 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-TWEAKR 항체이다.
TPP-8382는 바람직하게는 서열식별번호: 51에 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 영역 (VH) 및 서열식별번호: 55에 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-B7H3 항체이다.
TPP-8987은 바람직하게는 서열식별번호: 61에 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 영역 (VH) 및 서열식별번호: 65에 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-CD123 항체이다.
TPP-8988은 바람직하게는 서열식별번호: 71에 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 영역 (VH) 및 서열식별번호: 75에 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-CD123 항체이다.
TPP-9476은 바람직하게는 서열식별번호: 81에 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 영역 (VH) 및 서열식별번호: 85에 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-CD123 항체이다.
TPP-9574는 바람직하게는 서열식별번호: 91에 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 영역 (VH) 및 서열식별번호: 95에 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-CXCR5 항체이다.
TPP-9580은 바람직하게는 서열식별번호: 101에 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 영역 (VH) 및 서열식별번호: 105에 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-CXCR5 항체이다.
TPP-981은 바람직하게는 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 중쇄의 영역 및 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 경쇄의 영역을 포함하는 항-EGFR 항체이다.
TPP-1015는 바람직하게는 서열식별번호: 19에 제시된 바와 같은 중쇄의 영역 및 서열식별번호: 20에 제시된 바와 같은 경쇄의 영역을 포함하는 항-HER2 항체이다.
TPP-6013은 바람직하게는 서열식별번호: 29에 제시된 바와 같은 중쇄의 영역 및 서열식별번호: 30에 제시된 바와 같은 경쇄의 영역을 포함하는 항-CD123 항체이다.
TPP-7006은 바람직하게는 서열식별번호: 39에 제시된 바와 같은 중쇄의 영역 및 서열식별번호: 40에 제시된 바와 같은 경쇄의 영역을 포함하는 항-TWEAKR 항체이다.
TPP-7007은 바람직하게는 서열식별번호: 49에 제시된 바와 같은 중쇄의 영역 및 서열식별번호: 50에 제시된 바와 같은 경쇄의 영역을 포함하는 항-TWEAKR 항체이다.
TPP-8382는 바람직하게는 서열식별번호: 59에 제시된 바와 같은 중쇄의 영역 및 서열식별번호: 60에 제시된 바와 같은 경쇄의 영역을 포함하는 항-B7H3 항체이다.
TPP-8987은 바람직하게는 서열식별번호: 69에 제시된 바와 같은 중쇄의 영역 및 서열식별번호: 70에 제시된 바와 같은 경쇄의 영역을 포함하는 항-CD123 항체이다.
TPP-8988은 바람직하게는 서열식별번호: 79에 제시된 바와 같은 중쇄의 영역 및 서열식별번호: 80에 제시된 바와 같은 경쇄의 영역을 포함하는 항-CD123 항체이다.
TPP-9476은 바람직하게는 서열식별번호: 89에 제시된 바와 같은 중쇄의 영역 및 서열식별번호: 90에 제시된 바와 같은 경쇄의 영역을 포함하는 항-CD123 항체이다.
TPP-9574는 바람직하게는 서열식별번호: 99에 제시된 바와 같은 중쇄의 영역 및 서열식별번호: 100에 제시된 바와 같은 경쇄의 영역을 포함하는 항-CXCR5 항체이다.
TPP-9580은 바람직하게는 서열식별번호: 109에 제시된 바와 같은 중쇄의 영역 및 서열식별번호: 110에 제시된 바와 같은 경쇄의 영역을 포함하는 항-CXCR5 항체이다.
동위원소, 염, 용매화물, 동위원소 변형체
본 발명은 또한 본 발명의 화합물의 모든 적합한 동위원소 변형체를 포괄한다. 본 발명의 화합물의 동위원소 변형체는 본 발명의 화합물 내의 적어도 1개의 원자가 동일한 원자 번호를 갖지만 자연에서 통상적으로 또는 우세하게 발생하는 원자 질량과는 상이한 원자 질량을 갖는 또 다른 원자로 교환된 화합물을 의미하는 것으로 여기서 이해된다. 본 발명의 화합물에 혼입될 수 있는 동위원소의 예는 수소, 탄소, 질소, 산소, 인, 황, 플루오린, 염소, 브로민 및 아이오딘의 것, 예컨대 2H (중수소), 3H (삼중수소), 13C, 14C, 15N, 17O, 18O, 32P, 33P, 33S, 34S, 35S, 36S, 18F, 36Cl, 82Br, 123I, 124I, 129I 및 131I이다. 본 발명에 따른 화합물의 특정한 동위원소 변형체, 특히 1개 이상의 방사성 동위원소가 혼입된 것은, 예를 들어 체내 작용 메카니즘 또는 활성 성분 분포의 검사에 유익할 수 있고; 비교적 용이한 제조가능성 및 검출감도로 인해, 특히 3H 또는 14C 동위원소로 표지된 화합물은 이러한 목적에 적합하다. 또한, 동위원소, 예를 들어 중수소의 혼입은 화합물의 보다 큰 대사 안정성의 결과로서 특정한 치료 이익, 예를 들어 체내 반감기의 연장 또는 요구되는 활성 용량의 감소를 유도할 수 있고; 본 발명에 따른 화합물의 이러한 변형은 따라서 일부 경우에 또한 본 발명의 바람직한 실시양태를 구성할 수 있다. 본 발명에 따른 화합물의 동위원소 변형체는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의해, 예를 들어 하기 추가로 기재된 방법 및 작업 실시예에 기재된 절차에 의해 각각의 시약 및/또는 출발 화합물의 상응하는 동위원소 변형을 사용함으로써 제조될 수 있다.
본 발명과 관련하여 바람직한 염은 본 발명의 화합물의 생리학상 허용되는 염이다. 또한 그 자체로 제약 용도에 적합하지 않지만, 예를 들어 본 발명의 화합물의 단리 또는 정제에 사용될 수 있는 염이 포괄된다.
본 발명에 따른 화합물의 생리학상 허용되는 염은 무기 산, 카르복실산 및 술폰산의 산 부가염, 예를 들어 염산, 브로민화수소산, 황산, 인산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 톨루엔술폰산, 벤젠술폰산, 나프탈렌디술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 프로피온산, 락트산, 타르타르산, 말산, 시트르산, 푸마르산, 말레산 및 벤조산의 염을 포함한다.
본 발명에 따른 화합물의 생리학상 허용되는 염은 또한 통상적인 염기의 염, 예로서 및 바람직하게는 알칼리 금속 염 (예를 들어 나트륨 및 칼륨 염), 알칼리 토금속 염 (예를 들어 칼슘 및 마그네슘 염) 및 암모니아 또는 1 내지 16개의 탄소 원자를 갖는 유기 아민, 예로서 및 바람직하게는 에틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 에틸디이소프로필아민, 모노에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 디시클로헥실아민, 디메틸아미노에탄올, 프로카인, 디벤질아민, N-메틸피페리딘, N-메틸모르폴린, 아르기닌, 리신 및 1,2-에틸렌디아민으로부터 유래된 암모늄 염을 포함한다.
본 발명과 관련하여 용매화물은 용매 분자와의 배위에 의해 고체 또는 액체 상태의 복합체를 형성하는 본 발명의 화합물의 형태로서 기재된다. 수화물은 물과 배위가 이루어진 특정한 형태의 용매화물이다. 본 발명과 관련하여 바람직한 용매화물은 수화물이다.
치료 용도
본 발명에 따른 화합물을 사용하여 치료할 수 있는 과다증식성 질환은, 특히 암 및 종양 질환의 군을 포함한다. 본 발명과 관련하여, 이들은 특별히 하기 질환을 비제한적으로 의미하는 것으로 이해된다: 유방 암종 및 유방 종양 (관 및 소엽성 형태, 또한 상피내를 포함한 유방 암종), 호흡기도의 종양 (소세포 및 비소세포 암종, 기관지 암종), 뇌 종양 (예를 들어 뇌간 및 시상하부의 것, 성상세포종, 상의세포종, 교모세포종, 신경교종, 수모세포종, 수막종 및 신경외배엽 및 송과체 종양), 소화 기관의 종양 (식도, 위, 담낭, 소장, 대장, 직장의 암종 및 항문 암종), 간 종양 (특히 간세포성 암종, 담관암종 및 혼합 간세포성 담관암종), 두경부 영역의 종양 (후두, 하인두, 비인두, 구인두, 구순 및 구강 암종, 구강 흑색종), 피부 종양 (기저세포암종, 가시세포암종, 편평 세포 암종, 카포시 육종, 악성 흑색종, 비흑색종 피부암, 메르켈 세포 피부암, 비만 세포 종양), 결합 조직 종양 (특히 연부 조직 육종, 골육종, 악성 섬유 조직구종, 연골육종, 섬유육종, 혈관육종, 평활근육종, 지방육종, 림프육종 및 횡문근육종), 눈의 종양 (특히 안내 흑색종 및 망막모세포종), 내분비선 및 외분비선 종양 (예를 들어 갑상선 및 부갑상선의 것, 췌장 및 타액선 암종, 선암종), 요로의 종양 (방광, 음경, 신장, 신우 및 요관의 종양) 및 생식 기관 종양 (여성에서의 자궁내막, 자궁경부, 난소, 질, 외음부 및 자궁의 암종 및 남성에서의 전립선 및 고환의 암종). 이들은 또한 고체 형태로 및 순환 세포로서, 혈액, 림프계 및 척수의 증식성 혈액 질환, 예컨대 백혈병, 림프종 및 골수증식성 질환, 예를 들어 급성 골수성, 급성 림프모구성, 만성 림프구성, 만성 골수성 및 모발상 세포 백혈병, 및 AIDS-관련 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 피부 T 세포 림프종, 버킷 림프종 및 중추 신경계에서의 림프종을 포함한다.
인간에서 잘 특징화된 이들 질환은 또한 다른 포유동물에서 대등한 병인에 의해 발생할 수 있고, 마찬가지로 본 발명의 화합물에 의해 치료될 수 있다.
본원에 기재되고 CD123에 대하여 지시된 결합제- 또는 항체-약물 접합체 (ADC)는 바람직하게는 CD123-발현 장애, 예컨대 CD123-발현 암 질환의 치료에 사용될 수 있다. 전형적으로, 이러한 암 세포는 단백질 수준에서 (예를 들어 면역검정을 사용하여) 또는 RNA 수준에서 측정된 CD123의 측정가능한 양을 나타낸다. 이들 암 조직의 일부는 바람직하게는 동일한 환자에서 측정된 동일한 유형의 비-발암성 조직과 비교하여 상승된 수준의 CD123을 나타낸다. 임의로, CD123 함량은 본 발명에 따른 항체-약물 접합체 (ADC)를 사용한 암 치료의 시작 전에 측정된다 (환자 계층화). CD123에 대하여 지시된 결합제-약물 접합체 (ADC)는 바람직하게는 CD123-발현 장애, 예컨대 CD123-발현 암 질환, 예컨대 조혈 및 림프 조직의 종양 또는 조혈 및 림프 악성 종양의 치료에 사용될 수 있다. CD123 발현과 연관된 암 질환의 예는 골수성 질환, 예컨대 급성 골수성 백혈병 (AML) 및 골수이형성 증후군 (MDS)을 포함한다. 다른 유형의 암은 B-세포 급성 림프모구성 백혈병 (B-ALL), 모발상 세포 백혈병, 모구성 형질세포양 수지상 세포 신생물 (BPDCN), 호지킨 림프종, 미성숙 T-세포 급성 림프모구성 백혈병 (미성숙 T-ALL), 버킷 림프종, 여포성 림프종, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 외투 세포 림프종 (MCL)을 포함한다. 기재된 본 발명의 방법은 본 발명에 따른 항체-약물 접합체 (ADC)의 투여를 포함하는, CD123-발현 암을 앓고 있는 환자의 치료를 포함한다.
본 발명에 따른 화합물을 사용한 상기 언급된 암 질환의 치료는 고형 종양의 치료 및 그의 전이성 또는 순환 형태의 치료 둘 다를 포함한다.
본 발명과 관련하여, 용어 "치료" 또는 "치료하다"는 통상적인 의미로 사용되고 질환 또는 건강 이상을 퇴치하거나, 감소시키거나, 약화시키거나 또는 완화시키고, 이러한 질환에 의해, 예를 들어 암의 사건에서 손상된 생활 조건을 개선시키는 것을 목적으로 환자를 돌보고, 관리하고, 간호하는 것을 의미한다.
본 발명은 따라서 추가로 장애, 특히 상기 언급된 장애의 치료 및/또는 예방을 위한 본 발명의 화합물의 용도를 제공한다.
본 발명은 추가로 장애, 특히 상기 언급된 장애의 치료 및/또는 예방을 위한 의약의 제조를 위한 본 발명의 화합물의 용도를 제공한다.
본 발명은 추가로 장애, 특히 상기 언급된 장애의 치료 및/또는 예방 방법에서의 본 발명의 화합물의 용도를 제공한다.
본 발명은 추가로 유효량의 본 발명의 화합물 중 적어도 1종을 사용하는, 장애, 특히 상기 언급된 장애의 치료 및/또는 예방 방법을 제공한다.
본 발명의 화합물은 단독으로, 또는 필요한 경우에, 1종 이상의 다른 약리학적 활성 물질과 조합되어 사용될 수 있으며, 단 이러한 조합은 바람직하지 않고 허용되지 않는 부작용으로 이어지지 않는다. 따라서, 본 발명은 추가로, 특별히 상기 언급된 장애의 치료 및/또는 예방을 위한 본 발명의 화합물 중 적어도 1종 및 1종 이상의 추가의 약물을 포함하는 의약을 제공한다.
예를 들어, 본 발명의 화합물은 암 질환의 치료를 위해 공지된 항-과다증식성, 세포증식억제성, 세포독성 또는 면역요법 물질과 조합될 수 있다. 적합한 조합 약물의 예는 다음을 포함한다:
131I-chTNT, 아바렐릭스, 아비라테론, 아클라루비신, 아달리무맙, 아도-트라스트주맙 엠탄신, 아파티닙, 아플리베르셉트, 알데스류킨, 알렘투주맙, 알렌드론산, 알리트레티노인, 알트레타민, 아미포스틴, 아미노글루테티미드, 헥실-5-아미노레불리네이트, 암루비신, 암사크린, 아나스트로졸, 안세스팀, 아네톨 디티올에티온, 아네투맙 라브탄신, 안지오텐신 II, 항트롬빈 III, 아프레피탄트, 아르시투모맙, 아르글라빈, 삼산화비소, 아스파라기나제, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 악시티닙, 아자시티딘, 벨로테칸, 벤다무스틴, 베실레소맙, 벨리노스타트, 베바시주맙, 벡사로텐, 비칼루타미드, 비산트렌, 블레오마이신, 블리나투모맙, 보르테조밉, 부세렐린, 보수티닙, 브렌툭시맙 베도틴, 부술판, 카바지탁셀, 카보잔티닙, 칼시토닌, 폴린산칼슘, 레보폴린산칼슘, 카페시타빈, 카프로맙, 카르바마제핀, 카르보플라틴, 카르보쿠온, 카르필조밉, 카르모푸르, 카르무스틴, 카투막소맙, 셀레콕시브, 셀모류킨, 세리티닙, 세툭시맙, 클로람부실, 클로르마디논, 클로르메틴, 시도포비르, 시나칼세트, 시스플라틴, 클라드리빈, 클로드론산, 클로파라빈, 코비메티닙, 코판리십, 크리산타스파제, 크리조티닙, 시클로포스파미드, 시프로테론, 시타라빈, 다카르바진, 닥티노마이신, 다라투무맙, 다브라페닙, 다롤루타미드, 다사티닙, 다우노루비신, 데시타빈, 데가렐릭스, 데니류킨-디프티톡스, 데노수맙, 데프레오티드, 데슬로렐린, 덱스라족산, 디브로스피듐 클로라이드, 디안히드로갈락티톨, 디클로페낙, 도세탁셀, 돌라세트론, 독시플루리딘, 독소루비신, 독소루비신 + 에스트론, 드로나비놀, 두르발루맙, 에드레콜로맙, 엘립티늄 아세테이트, 엔도스타틴, 에노시타빈, 엔잘루타미드, 에파카도스타트, 에피루비신, 에피티오스타놀, 에포에틴-알파, 에포에틴-베타, 에포에틴-제타, 엡타플라틴, 에리불린, 에를로티닙, 에소메프라졸, 에스트라무스틴, 에토포시드, 에티닐 에스트라디올, 에베롤리무스, 엑세메스탄, 파드로졸, 펜타닐, 플루옥시메스테론, 플록수리딘, 플루다라빈, 플루오로우라실, 플루타미드, 폴산, 포르메스탄, 포사프레피탄트, 포테무스틴, 풀베스트란트, 가도부트롤, 가도테리돌, 가도테르산 메글루민 염, 가도베르세타미드, 가독세트산 이나트륨 염 (gd-EOB-DTPA 이나트륨 염), 질산갈륨, 가니렐릭스, 게피티닙, 겜시타빈, 겜투주맙, 글루카르피다제, 글루톡심, 고세렐린, 그라니세트론, 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 히스타민 디히드로클로라이드, 히스트렐린, 히드록시카르바미드, I-125 시드, 이반드론산, 이브리투모맙-티욱세탄, 이브루티닙, 이다루비신, 이포스파미드, 이마티닙, 이미퀴모드, 임프로술판, 인디세트론, 인카드론산, 인게놀 메부테이트, 인터페론-알파, 인터페론-베타, 인터페론-감마, 이오비트리돌, 이오벤구안 (123I), 아이오메프롤, 이필리무맙, 이리노테칸, 이트라코나졸, 익사베필론, 익사조밉, 란레오티드, 란소프라졸, 라파티닙, 라소콜린, 레날리도미드, 렌바티닙, 레노그라스팀, 렌티난, 레트로졸, 류프로렐린, 레바미솔, 레보노르게스트렐, 레보티록신-소듐, 리페그필그라스팀, 리수리드, 로바플라틴, 로무스틴, 로니다민, 마소프로콜, 메드록시프로게스테론, 메게스트롤, 멜라르소프롤, 멜팔란, 메피티오스탄, 메르캅토퓨린, 메스나, 메타돈, 메토트렉세이트, 메톡살렌, 메틸아미노레불리네이트, 메틸프레드니솔론, 메틸테스토스테론, 메티로신, 미파무르티드, 밀테포신, 미리플라틴, 미토브로니톨, 미토구아존, 미토락톨, 미토마이신, 미토탄, 미톡산트론, 모가물리주맙, 몰그라모스팀, 모피다몰, 모르핀 히드로클로라이드, 모르핀 술페이트, 나빌론, 나빅시몰스, 나파렐린, 날록손 + 펜타조신, 날트렉손, 나르토그라스팀, 네시투무맙, 네다플라틴, 넬라라빈, 네리드론산 산, 네투피탄트/팔로노세트론, 니볼루맙, 니볼루맙, 펜테트레오티드, 닐로티닙, 닐루타미드, 니모라졸, 니모투주맙, 니무스틴, 닌테다닙, 니트라크린, 니볼루맙, 오비누투주맙, 옥트레오티드, 오파투무맙, 올라파립, 올라라투맙, 오마세탁신 메페숙시네이트, 오메프라졸, 온단세트론, 오르고테인, 오릴로티모드, 오시메르티닙, 옥살리플라틴, 옥시코돈, 옥시메톨론, 오조가미신, p53 유전자 요법, 파클리탁셀, 팔보시클립, 팔리페르민, 팔라듐-103 시드, 팔로노세트론, 파미드론산, 파니투무맙, 파노비노스타트, 판토프라졸, 파조파닙, 페가스파르가제, 펨브롤리주맙, Peg-인터페론 알파-2b, 펨브롤리주맙, 페메트렉세드, 펜토스타틴, 페플로마이신, 퍼플루부탄, 퍼포스파미드, 페르투주맙, 피시바닐, 필로카르핀, 피라루비신, 픽산트론, 플레릭사포르, 플리카마이신, 폴리글루삼, 폴리에스트라디올 포스페이트, 폴리비닐피롤리돈 + 히알루론산나트륨, 폴리사카라이드-K, 포말리도미드, 포나티닙, 포르피머-소듐, 프랄라트렉세이트, 프레드니무스틴, 프레드니손, 프로카르바진, 프로코다졸, 프로프라놀롤, 퀴나골리드, 라베프라졸, 라코투모맙, 라듐-223 클로라이드, 라도티닙, 랄록시펜, 랄티트렉세드, 라모세트론, 라무시루맙, 라니무스틴, 라스부리카제, 라족산, 레파메티닙, 레고라페닙, 리세드론산, 레늄-186 에티드로네이트, 리툭시맙, 로가라티닙, 롤라피탄트, 로미뎁신, 로무르티드, 로니시클립, 사마륨 (153Sm) 렉시드로남, 사투모맙, 세크레틴, 실툭시맙, 시푸류셀-T, 시조피란, 소부족산, 소듐 글리시디다졸, 소니데깁, 소라페닙, 스타노졸롤, 스트렙토조신, 수니티닙, 탈라포르핀, 탈리모겐 라허파렙벡, 타미바로텐, 타목시펜, 타펜타돌, 타소네르민, 테세류킨, 테크네튬 (99mTc) 노페투모맙 메르펜탄, 99mTc-HYNIC-[Tyr3]-옥트레오티드, 테가푸르, 테가푸르 + 기메라실 + 오테라실, 테모포르핀, 테모졸로미드, 템시롤리무스, 테니포시드, 테스토스테론, 테트로포스민, 탈리도미드, 티오테파, 티말파신, 티로트로핀 알파, 티오구아닌, 토실리주맙, 토포테칸, 토레미펜, 토시투모맙, 트라벡테딘, 트라메티닙, 트라마돌, 트라스투주맙, 트레오술판, 트레티노인, 트리플루리딘 + 티피라실, 트라메티닙, 트릴로스탄, 트립토렐린, 트로포스파미드, 트롬보포이에틴, 우베니멕스, 발루비신, 반데타닙, 바프레오티드, 바탈라닙, 베무라페닙, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 빈플루닌, 비노렐빈, 비스모데깁, 보리노스타트, 이트륨-90 유리 마이크로비드, 지노스타틴, 지노스타틴 스티말라머, 졸레드론산, 조루비신.
또한, 본 발명의 화합물은, 예를 들어, 예로서 하기 표적: OX-40, CD137/4-1BB, DR3, IDO1/IDO2, LAG-3, CD40에 결합할 수 있는 결합제 (예를 들어 항체)와 조합될 수 있다.
결합제-약물 접합체 (ADC)의 비-세포-투과성 독성단 대사물이 적응 면역계의 세포에 대해 어떠한 손상 영향도 미치지 않아야 하므로, 본 발명은 또한 암 또는 종양의 치료에 사용하기 위한 암 면역요법과의 본 발명에 따른 결합제-약물 접합체 (ADC)의 조합을 제공한다. 세포독성 결합제-약물 접합체의 고유한 작용 메카니즘은 종양 세포의 세포 사멸의 직접적 촉발 및 이에 따라 면역 반응을 자극할 수 있는 종양 항원의 방출을 포함한다. 게다가, KSP 억제제 독성단 부류는 시험관내에서 면역원성 세포 사멸 (ICD)의 마커를 유도하는 것으로 나타나 있다. 따라서, 본 발명의 결합제-약물 접합체 (ADC)와 암 면역요법의 1종 이상의 치료 접근법 또는 암 면역요법의 분자 표적에 대하여 지시된 1종 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 항체와의 조합은 암 또는 종양을 치료하기 위한 바람직한 방법을 나타낸다. i) 암 면역요법의 치료 접근법의 예는 암 면역요법의 표적에 대하여 지시된 면역조정 모노클로날 항체 및 저분자량 물질, 백신, CAR T 세포, 이중특이적 T-세포-동원 항체, 종양용해 바이러스, 세포-기반 백신접종 접근법을 포함한다. ii) 면역조정 모노클로날 항체에 적합한 암 면역요법의 선택된 표적의 예는 CTLA-4, PD-1/PDL-1, OX-40, CD137, DR3, IDO1, IDO2, TDO2, LAG-3, TIM-3 CD40, ICOS / ICOSL, TIGIT; GITR/GITRL, VISTA, CD70, CD27, HVEM/BTLA, CEACAM1, CEACAM6, ILDR2, CD73, CD47, B7H3, TLR을 포함한다. 따라서, 본 발명에 따른 결합제-약물 접합체 (ADC)와 암 면역요법과의 조합은, 한편으로는, 약한 면역원성 특성을 갖는 종양을 더 면역원성이게 하고, 암 면역요법의 유효성을 증진시키고, 또한 장기-지속되는 치료 작용을 펼칠 수 있다.
추가로, 본 발명에 따른 화합물은 또한 방사선요법 및/또는 외과적 개입과 조합되어 사용될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 화합물과 다른 세포증식억제성, 세포독성 또는 면역요법적 활성제와의 조합을 사용하여 하기 목적이 추구될 수 있다.
ㆍ 개별 활성 성분을 사용한 치료와 비교하여, 종양의 성장을 저속화시키거나, 그의 크기를 감소시키거나, 또는 심지어 그를 완전히 제거하는데 있어서의 개선된 효능;
ㆍ 단독요법의 경우보다 더 낮은 투여량으로 사용되는 화학요법제의 사용 가능성;
ㆍ 개별 투여와 비교하여 보다 적은 부작용을 갖는, 보다 허용되는 요법의 가능성;
ㆍ 보다 광범위한 스펙트럼의 신생물성 장애의 치료 가능성;
ㆍ 요법에 대한 보다 높은 반응률의 달성;
ㆍ 현대 표준 요법과 비교하여 환자의 보다 긴 생존 시간.
추가로, 본 발명에 따른 화합물은 또한 방사선요법 및/또는 외과적 개입과 조합되어 사용될 수 있다.
본 발명은 추가로 적어도 1종의 본 발명의 화합물을 전형적으로 1종 이상의 불활성, 비독성, 제약상 적합한 부형제와 함께 포함하는 의약, 및 상기 언급된 목적을 위한 그의 용도를 제공한다.
본 발명의 화합물은 전신으로 및/또는 국부로 작용할 수 있다. 이러한 목적을 위해, 이들은 적합한 방식으로, 예를 들어 비경구로, 가능하게는 흡입으로 또는 임플란트 또는 스텐트로서 투여될 수 있다.
본 발명의 화합물은 이들 투여 경로에 적합한 투여 형태로 투여될 수 있다.
비경구 투여는 흡수 단계를 우회할 수 있거나 (예를 들어 정맥내로, 동맥내로, 심장내로, 척수내로 또는 요추내로) 또는 흡수를 포함할 수 있다 (예를 들어 근육내로, 피하로, 피내로, 경피로 또는 복강내로). 비경구 투여에 적합한 투여 형태는 용액, 현탁액, 에멀젼 또는 동결건조물 형태의 주사 및 주입을 위한 제제를 포함한다. 비경구 투여, 특히 정맥내 투여가 바람직하다.
일반적으로, 비경구 투여의 경우에 유효한 결과를 달성하기 위해 체중 기준 약 0.1 내지 20 mg/kg, 바람직하게는 약 0.3 내지 7 mg/kg의 양을 투여하는 것이 유리한 것으로 밝혀졌다.
그럼에도 불구하고, 일부 경우에는, 특히 체중, 투여 경로, 활성 성분에 대한 개별 반응, 제제의 성질, 또는 투여가 수행되는 시간 또는 간격의 함수로서, 언급된 양으로부터 벗어나는 것이 필요할 수 있다. 따라서, 일부 경우에는 상기 언급된 최소량 미만으로 관리하는 것이 충분할 수 있는 한편, 다른 경우에는 언급된 상한치를 초과해야만 한다. 보다 많은 양을 투여하는 경우에, 이는 하루에 걸쳐 여러 개별 용량으로 나뉘어지도록 권장될 수 있다.
실시예
하기 실시예는 본 발명을 예시한다. 본 발명은 이들 예로 제한되지 않는다.
달리 언급되지 않는 한, 하기 시험 및 실시예에서의 백분율은 중량 백분율이고; 부는 중량부이다. 액체/액체 용액에 대한 용매 비, 희석 비 및 농도 데이터는 각 경우에 부피 기준이다.
합성 경로:
작업 실시예에 대한 예로서, 하기 반응식은 작업 실시예로 이어지는 예시적인 합성 경로를 나타낸다:
반응식 1: 레구마인-절단가능 링커를 사용한 리신-결합된 ADC의 합성
Figure 112023060817933-pat00014
상기 반응식에서, X1, X2, X3, n 및 AK2는 화학식 (I)에 제공된 의미를 갖는다.
a) HATU, DMF, N,N-디이소프로필에틸아민, RT; b) H2, 10% Pd-C, 메탄올 1.5시간, RT; c) 1,1'-[(1,5-디옥소펜탄-1,5-디일)비스(옥시)]디피롤리딘-2,5-디온, N,N-디이소프로필에틸아민, DMF, RT에서 밤새 교반; d) PBS 중 AK2, 아르곤 하에 DMSO 중에 용해된 3-5 당량의 활성 에스테르의 첨가, RT에서 아르곤 하에 60분 동안 교반, DMSO 중에 용해된 또 다른 3-5 당량의 활성 에스테르의 첨가, RT에서 아르곤 하에 60분 동안 교반, 이어서 PBS 완충제 (pH 7.2)로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스(Sephadex)® G-25, 지이 헬스케어(GE Healthcare))에 의해 정제 및 이후 초원심분리에 의해 농축 및 PBS 완충제 (pH 7.2)를 사용하여 목적하는 농도 설정. 생체내 배치의 경우에, 임의로 멸균 여과가 이어진다.
반응식 2: 시스테인-연결된 ADC의 합성
Figure 112023060817933-pat00015
상기 반응식에서, X1, X2, X3, n 및 AK1은 화학식 (I)에 제공된 의미를 갖는다.
a) HATU, DMF, N,N-디이소프로필에틸아민, RT; b) 염화아연, 트리플루오로에탄올, 50℃, EDTA; c) HATU, DMF, N,N-디이소프로필에틸아민, RT; d) H2, 10% Pd-C, 메탄올 1.5시간, RT; e) 1-{6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}-1H-피롤-2,5-디온, N,N-디이소프로필에틸아민, DMF, RT에서 교반; f) PBS 중에 용해된 AK1, 아르곤 하에 PBS 완충제 중 3-4 당량의 TCEP의 첨가 및 RT에서 약 30분 교반, 이어서 DMSO 중에 용해된 5-10 당량의 화합물 E의 첨가, RT에서 약 90분 교반, 이어서 PBS 완충제 (pH 7.2)로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 의해 정제 및 이후 초원심분리에 의해 농축 및 PBS 완충제 (pH 7.2)를 사용하여 목적하는 농도 설정. 생체내 배치의 경우에, 임의로 멸균 여과가 이어진다.
반응식 3: 개환 숙신이미드를 통한 시스테인-연결된 ADC의 합성
Figure 112023060817933-pat00016
상기 반응식에서, X1, X2, X3, n 및 AK1은 화학식 (I)에 제공된 의미를 갖는다.
a) HATU, DMF, N,N-디이소프로필에틸아민, RT; b) 염화아연, 트리플루오로에탄올, 50℃, EDTA; c) HATU, DMF, N,N-디이소프로필에틸아민, RT; d) H2, 10% Pd-C, 메탄올 1.5시간, RT; e) 1-{2-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-2-옥소에틸}-1H-피롤-2,5-디온, N,N-디이소프로필에틸아민, DMF, RT에서 교반; f) PBS 중에 용해된 AK1, 아르곤 하에 PBS 완충제 중 3-4 당량의 TCEP의 첨가 및 RT에서 약 30분 교반, 이어서 DMSO 중에 용해된 5-10 당량의 화합물 E의 첨가, RT에서 약 90분 교반, 이어서 PBS 완충제 (pH 8)로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 의해 pH 8로 재완충, 이어서 RT에서 밤새 교반, 이어서 임의로 PBS 완충제 (pH 7.2)로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 의해 정제 및 이후 초원심분리에 의해 농축 및 PBS 완충제 (pH 7.2)를 사용하여 목적하는 농도 설정. 생체내 배치의 경우에, 임의로 멸균 여과가 이어진다.
A. 실시예
약어 및 두문자어:
Figure 112023060817933-pat00017
Figure 112023060817933-pat00018
Figure 112023060817933-pat00019
Figure 112023060817933-pat00020
HPLC 및 LC-MS 방법:
방법 1 (LC-MS):
기기: 워터스 액퀴티 SQD UPLC 시스템; 칼럼: 워터스 액퀴티 UPLC HSS T3 1.8 μ 50 x 1 mm; 이동상 A: 1 l의 물 + 0.25 ml의 99% 농도 포름산; 이동상 B: 1 l의 아세토니트릴 + 0.25 ml의 99% 농도 포름산; 구배: 0.0분 90% A → 1.2분 5% A → 2.0분 5% A; 오븐: 50℃; 유량: 0.40 ml/분; UV 검출: 208 - 400 nm.
방법 2 (LC-MS):
MS 기기 유형: 워터스 시냅트 G2S; UPLC 기기 유형: 워터스 액퀴티 I-CLASS; 칼럼: 워터스, BEH300, 2.1 x 150 mm, C18 1.7 μm; 이동상 A: 1 l의 물 + 0.01% 포름산; 이동상 B: 1 l의 아세토니트릴 + 0.01% 포름산; 구배: 0.0분 2% B → 1.5분 2% B → 8.5분 95% B → 10.0분 95% B; 오븐: 50℃; 유량: 0.50 ml/분; UV 검출: 220 nm
방법 3 (LC-MS):
MS 기기: 워터스 (마이크로매스) QM; HPLC 기기: 애질런트 1100 시리즈; 칼럼: 애질런트 조르박스 익스텐드-C18 3.0 x 50 mm 3.5 마이크로미터; 이동상 A: 1 l의 물 + 0.01 mol의 탄산암모늄, 이동상 B: 1 l의 아세토니트릴; 구배: 0.0분 98% A → 0.2분 98% A → 3.0분 5% A→ 4.5분 5% A ; 오븐: 40℃; 유량: 1.75 ml/분; UV 검출: 210 nm
방법 4 (LC-MS):
MS 기기 유형: 워터스 시냅트 G2S; UPLC 기기 유형: 워터스 액퀴티 I-CLASS; 칼럼: 워터스, HSST3, 2.1 x 50 mm, C18 1.8 μm; 이동상 A: 1 l의 물 + 0.01% 포름산; 이동상 B: 1 l의 아세토니트릴 + 0.01% 포름산; 구배: 0.0분 10% B → 0.3분 10% B → 1.7분 95% B → 2.5분 95% B; 오븐: 50℃; 유량: 1.20 ml/분; UV 검출: 210 nm
방법 5 (LC-MS):
기기: 워터스 액퀴티 SQD UPLC 시스템; 칼럼: 워터스 액퀴티 UPLC HSS T3 1.8 μ 50 x 1 mm; 이동상 A: 1 l의 물 + 0.25 ml의 99% 농도 포름산; 이동상 B: 1 l의 아세토니트릴 + 0.25 ml의 99% 농도 포름산; 구배: 0.0분 95% A → 6.0분 5% A → 7.5분 5% A; 오븐: 50℃; 유량: 0.35 ml/분; UV 검출: 210 - 400 nm.
방법 6 (LC-MS):
기기: 워터스 UPLC 액퀴티가 구비된 마이크로매스 쿼트로 프리미어; 칼럼: 써모 하이퍼실 골드 1.9 μ, 50 x 1 mm; 이동상 A: 1 l의 물 + 0.5 ml의 50% 농도 포름산; 이동상 B: 1 l의 아세토니트릴 + 0.5 ml의 50% 농도 포름산; 구배: 0.0분 97% A → 0.5분 97% A → 3.2분 5% A → 4.0분 5% A 오븐: 50℃; 유량: 0.3 ml/분; UV 검출: 210 nm.
방법 7 (LC-MS):
기기: 애질런트 MS 쿼드 6150; HPLC: 애질런트 1290; 칼럼: 워터스 액퀴티 UPLC HSS T3 1.8 μ 50 x 2.1 mm; 이동상 A: 1 l의 물 + 0.25 ml의 99% 농도 포름산; 이동상 B: 1 l의 아세토니트릴 + 0.25 ml의 99% 농도 포름산; 구배: 0.0분 90% A → 0.3분 90% A → 1.7분 5% A → 3.0분 5% A 오븐: 50℃; 유량: 1.20 ml/분; UV 검출: 205 - 305 nm.
방법 8 (LC-MS):
MS 기기 유형: 워터스 시냅트 G2S; UPLC 기기 유형: 워터스 액퀴티 I-CLASS; 칼럼: 워터스, HSST3, 2.1 x 50 mm, C18 1.8 μm; 이동상 A: 1 l의 물 + 0.01% 포름산; 이동상 B: 1 l의 아세토니트릴 + 0.01% 포름산; 구배: 0.0분 2% B → 2.0분 2% B → 13.0분 90% B → 15.0분 90% B; 오븐: 50℃; 유량: 1.20 ml/분; UV 검출: 210 nm.
방법 9: (LC-MS 정제용 정제 방법)
MS 기기: 워터스, HPLC 기기: 워터스 (칼럼 워터스 엑스-브리지 C18, 19 mm x 50 mm, 5 μm, 용리액 A: 물 + 0.05% 암모니아, 이동상 B: 구배를 사용한 아세토니트릴 (ULC); 유량: 40 ml/분; UV 검출: DAD; 210-400 nm).
또는
MS 기기: 워터스, HPLC 기기: 워터스 (칼럼 페노메넥스 루나 5μ C18(2) 100A, 악시아 테크. 50 x 21.2 mm, 용리액 A: 물 + 0.05% 포름산, 용리액 B: 구배를 사용한 아세토니트릴 (ULC); 유량: 40 ml/분; UV 검출: DAD; 210-400 nm).
방법 10: (LC-MS 분석 방법)
MS 기기: 워터스 SQD; HPLC 기기: 워터스 UPLC; 칼럼: 조르박스 SB-Aq (애질런트), 50 mm x 2.1 mm, 1.8 μm; 이동상 A: 물 + 0,025% 포름산, 용리액 B: 아세토니트릴 (ULC) + 0,025% 포름산; 구배: 0.0분 98%A - 0.9분 25%A - 1.0분 5%A - 1.4분 5%A - 1.41분 98%A - 1.5분 98%A; 오븐: 40℃; 유량: 0,600 ml/분; UV 검출: DAD; 210 nm.
방법 11 (HPLC):
기기: HP1100 시리즈
칼럼: 머크 크로모리스 스피드로드 RP-18e, 50-4.6 mm, 카탈로그 번호 1.51450.0001, 전치칼럼 크로모리스 가드 카트리지 키트, RP-18e, 5-4.6mm, 카탈로그 번호 1.51470.0001
구배: 유량 5 ml/분
주입 부피 5 μl
용매 A: 물 중 HClO4 (70%) (4 ml/l)
용매 B: 아세토니트릴
출발 20% B
0.50분 20% B
3.00분 90% B
3.50분 90% B
3.51분 20% B
4.00분 20% B
칼럼 온도: 40℃
파장: 210 nm
방법 12 (LC-MS):
MS 기기 유형: 써모 사이언티픽 FT-MS; 기기 유형 UHPLC+: 써모 사이언티픽 얼티메이트 3000; 칼럼: 워터스, HSST3, 2.1 x 75 mm, C18 1.8 μm; 이동상 A: 1 l의 물 + 0.01% 포름산; 이동상 B: 1 l의 아세토니트릴 + 0.01% 포름산; 구배: 0.0분 10% B → 2.5분 95% B → 3.5분 95% B; 오븐: 50℃; 유량: 0.90 ml/분; UV 검출: 210 nm/ 최적 통합 경로 210-300 nm.
방법 13: (LC-MS):
MS 기기: 워터스 (마이크로매스) 쿼트로 마이크로; 기기 워터스 UPLC 액퀴티; 칼럼: 워터스 BEH C18 1.7 μ 50 x 2.1 mm; 이동상 A: 1 l의 물 + 0.01 mol의 포름산암모늄, 이동상 B: 1 l의 아세토니트릴; 구배: 0.0분 95% A → 0.1분 95% A → 2.0분 15% A → 2.5분 15% A→ 2.51분 10% A → 3.0분 10% A; 오븐: 40℃; 유량: 0.5 ml/분; UV 검출: 210 nm.
방법 14: (LC-MS) (MCW-LTQ-포로쉘-TFA98-10분)
MS 기기 유형: 써모피셔사이언티픽 LTQ-오비트랩-XL; HPLC 기기 유형: 애질런트 1200SL; 칼럼: 애질런트, 포로쉘 120, 3 x 150 mm, SB - C18 2.7 μm; 이동상 A: 1 l의 물 + 0.1% 트리플루오로아세트산; 이동상 B: 1 l의 아세토니트릴 + 0.1% 트리플루오로아세트산; 구배: 0.0분 2% B → 0.3분 2% B → 5.0분 95% B → 10.0분 95% B; 오븐: 40℃; 유량: 0.75 ml/분; UV 검출: 210 nm
이하에서 제조법이 명확하게 기재되어 있지 않은 모든 반응물 또는 시약은 일반적으로 접근가능한 공급원으로부터 상업적으로 구입하였다. 마찬가지로 이하에서 제조법이 기재되어 있지 않고, 상업적으로 입수가능하지 않거나, 일반적으로 접근가능하지 않은 공급원으로부터 수득되는 모든 다른 반응물 또는 시약의 경우에는, 그의 제조법이 기재되어 있는 공개된 문헌을 참조한다.
출발 화합물 및 중간체:
중간체 C52
(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로판-1-아민
Figure 112023060817933-pat00021
메틸 4-브로모-1H-피롤-2-카르복실레이트 10.00 g (49.01 mmol)을 처음에 DMF 100.0 ml에 충전하고, 탄산세슘 20.76 g (63.72 mmol) 및 벤질 브로마이드 9.22 g (53.91 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 물과 에틸 아세테이트 사이에 분배하고, 수성 상을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 상을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 용매를 감압 하에 증발시켰다. 메틸 4-브로모-1H-피롤-2-카르복실레이트 90.0 g을 사용하여 반응을 반복하였다.
2가지 합한 반응물을 정제용 RP-HPLC (칼럼: 다이소 300x100; 10μ, 유량: 250 ml/분, MeCN/물)에 의해 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고, 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 화합물 메틸 1-벤질-4-브로모-1H-피롤-2-카르복실레이트 125.15 g (이론치의 87%)을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.18분; MS (ESIpos): m/z = 295 [M+H]+.
아르곤 하에, 메틸 1-벤질-4-브로모-1H-피롤-2-카르복실레이트 4.80 g (16.32 mmol)을 처음에 DMF에 충전하고, (2,5-디플루오로페닐)보론산 3.61 g (22.85 mmol), 포화 탄산나트륨 용액 19.20 ml 및 [1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센]-디클로로팔라듐(II):디클로로메탄 1.33 g (1.63 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 85℃에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, 필터 케이크를 에틸 아세테이트로 세척하였다. 유기 상을 물로 추출한 다음, 포화 NaCl 용액으로 세척하였다. 유기 상을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 용매를 감압 하에 증발시켰다. 잔류물을 실리카 겔 (이동상: 시클로헥산/에틸 아세테이트 100:3)에 의해 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고, 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 화합물 메틸 1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-카르복실레이트 3.60 g (이론치의 67%)을 수득하였다.
LC-MS (방법 7): Rt = 1.59분; MS (ESIpos): m/z = 328 [M+H]+.
메틸 1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-카르복실레이트 3.60 g (11.00 mmol)을 처음에 THF 90.0 ml에 충전하고, 수소화알루미늄리튬 1.04 g (27.50 mmol) (THF 중 2.4 M)을 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반하였다. 포화 타르타르산나트륨칼륨 용액을 0℃에서 첨가하고, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트와 혼합하였다. 유기 상을 포화 타르타르산나트륨칼륨 용액으로 3회 추출하였다. 유기 상을 포화 NaCl 용액으로 1회 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 용매를 감압 하에 증발시키고, 잔류물을 디클로로메탄 30.0 ml 중에 용해시켰다. 산화망가니즈 (IV) 3.38 g (32.99 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 48시간 동안 교반하였다. 또 다른 산화망가니즈 (IV) 2.20 g (21.47 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, 필터 케이크를 디클로로메탄으로 세척하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고, 잔류물 (1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-카르브알데히드) 2.80 g을 합성의 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다.
LC-MS (방법 7): Rt = 1.48분; MS (ESIpos): m/z = 298 [M+H]+.
(R)-2-메틸프로판-2-술핀아미드 23.00 g (189.77 mmol)과 함께 1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-카르브알데히드 28.21 g (94.88 mmol)을 처음에 무수 THF 403.0 ml에 충전하고, 티타늄(IV) 이소프로폭시드 67.42 g (237.21 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 포화 NaCl 용액 500 ml 및 에틸 아세테이트 1000.0 ml를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 규조토를 통해 여과하고, 여과물을 포화 NaCl 용액으로 2회 세척하였다. 유기 상을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 용매를 감압 하에 증발시키고, 잔류물을 바이오타지 이솔레라 (실리카 겔, 칼럼 1500+340 g SNAP, 유량 200 ml/분, 에틸 아세테이트/시클로헥산 1:10)를 사용하여 정제하였다.
LC-MS (방법 7): Rt = 1.63분; MS (ESIpos): m/z = 401 [M+H]+.
(R)-N-{(E/Z)-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]메틸렌}-2-메틸프로판-2-술핀아미드 25.00 g (62.42 mmol)을 처음에 아르곤 하에 무수 THF에 충전하고, -78℃로 냉각시켰다. 이어서, tert-부틸리튬 12.00 g (187.27 mmol) (펜탄 중 1.7 M 용액)을 -78℃에서 첨가하고, 혼합물을 이 온도에서 3시간 동안 교반하였다. -78℃에서, 이어서 메탄올 71.4 ml 및 포화 염화암모늄 용액 214.3 ml를 연속적으로 첨가하고, 반응 혼합물을 실온으로 가온되도록 하고, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 물로 세척하였다. 유기 상을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 용매를 감압 하에 증발시켰다. 잔류물 (R)-N-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2-메틸프로판-2-술핀아미드를 합성의 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다.
LC-MS (방법 6): Rt = 2.97분; MS (ESIpos): m/z = 459 [M+H]+.
(R)-N-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2-메틸프로판-2-술핀아미드 28.00 g (61.05 mmol)을 처음에 1,4-디옥산 186.7 ml에 충전하고, 이어서 1,4-디옥산 용액 중 HCl 45.8 ml (4.0 M)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하고, 용매를 감압 하에 증발시켰다. 잔류물을 정제용 HPLC (칼럼: 키네텍스 100x30; 유량: 60 ml/분, MeCN/물)에 의해 정제하였다. 아세토니트릴을 감압 하에 증발시키고, 디클로로메탄을 수성 잔류물에 첨가하였다. 유기 상을 중탄산나트륨 용액으로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 용매를 감압 하에 증발시키고, 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 표제 화합물 16.2 g (이론치의 75%)을 수득하였다.
LC-MS (방법 6): Rt = 2.10분; MS (ESIpos): m/z = 338 [M-NH2]+, 709 [2M+H]+.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 0.87 (s, 9H), 1.53 (s, 2H), 3.59 (s, 1H), 5.24 (d, 2H), 6.56 (s, 1H), 6.94 (m, 1H), 7.10 (d, 2H), 7.20 (m, 1H), 7.26 (m, 2H), 7.34 (m, 2H), 7.46 (m, 1H).
중간체 C58
(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-2-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)부탄산
Figure 112023060817933-pat00022
중간체 C52 4.3 g (12.2 mmol)을 DCM 525 ml 중에 용해시키고, 소듐 트리아세톡시보로히드라이드 3.63 g (17.12 mmol) 및 아세트산 8.4 ml를 첨가하였다. 실온에서 5분 동안 교반한 후, DCM 175 ml 중에 용해된 중간체 L57 8.99 g (24.5 mmol)을 첨가하고, 반응물을 실온에서 추가로 45분 동안 교반하였다. 이어서, 반응물을 DCM 300 ml로 희석하고, 중탄산나트륨 용액 100 ml로 2회 및 포화 NaCl 용액으로 1회 세척하였다. 유기 상을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 용매를 감압 하에 증발시키고, 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이어서, 잔류물을 정제용 RP-HPLC (칼럼: 크로마토렉스 C18)에 의해 정제하였다. 적절한 분획의 조합 후, 용매를 감압 하에 증발시키고, 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 메틸 (2S)-4-({(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}아미노)-2-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)부타노에이트 4.6 g (이론치의 61%)을 수득하였다.
LC-MS (방법 12): Rt = 1.97분; MS (ESIpos): m/z = 614 (M+H)+.
이 중간체 2.06 g (3.36 mmol)을 처음에 DCM 76 ml에 충전하고, 트리에틸아민 2.1 ml의 존재 하에 2-클로로-2-옥소에틸 아세테이트 0.81 ml (7.17 mmol)로 아실화하였다. 실온에서 20시간 교반한 후, 2-클로르-2-옥소에틸 아세테이트 0.36 ml 및 트리에틸아민 0.94 ml를 첨가하고, 반응물을 실온에서 추가로 15분 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 에틸 아세테이트 500 ml로 희석하고, 5% 시트르산 300 ml로 2회, 포화 탄산수소나트륨 용액 300 ml로 2회 및 포화 염화나트륨 용액 100 ml로 1회 연속적으로 추출한 다음, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 고진공 하에 건조시켜 보호된 중간체 2.17 g (이론치의 79%)을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.48분; MS (ESIpos): m/z = 714 (M+H)+.
이 중간체 2.17 mg (2.64 mmol)을 THF 54 ml 및 물 27 ml 중에 용해시키고, 2-몰 수산화리튬 용액 26 ml를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, TFA 1.4 ml를 사용하여 pH 3 내지 4로 조정하였다. 혼합물을 감압 하에 농축시켰다. 대부분의 THF가 증류 제거되었을 때, 수용액을 DCM으로 2회 추출한 다음, 감압 하에 농축 건조시켰다. 잔류물을 정제용 HPLC (칼럼: 크로마토렉스 C18)에 의해 정제하였다. 적절한 분획의 조합 후, 용매를 감압 하에 증발시키고, 잔류물을 아세토니트릴/물로부터 동결건조시켰다. 이와 같이 하여 표제 화합물 1.1 g (이론치의 63%)을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.34분; MS (ESIpos): m/z = 656 (M-H)-.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 0.03 (s, 9H), 0.58 (m, 1H), 0.74-0.92 (m, 11H), 1.40 (m, 1H), 3.3 (m, 2H), 3.7 (m, 1H), 3.8-4.0 (m, 2H), 4.15 (q, 2H), 4.9 및 5.2 (2d, 2H), 5.61 (s, 1H), 6.94 (m, 2H), 7.13-7.38 (m, 7H), 7.48 (s, 1H), 7.60 (m, 1H), 12.35 (s, 1H).
중간체 C61
N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-2-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)부타노일]-베타-알라닌
Figure 112023060817933-pat00023
표제 화합물을, 중간체 C58 60 mg (0.091 mmol)을 메틸 β-알라니네이트와 커플링시킨 다음, 이어서 2M 수산화리튬 용액으로 에스테르 절단하여 제조하였다. 이와 같이 하여 2 단계에 걸쳐 표제 화합물 67 mg (이론치의 61%)을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.29분; MS (ESIpos): m/z = 729 (M+H)+.
중간체 C102
(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-2-{[(벤질옥시)카르보닐]아미노}부탄산
Figure 112023060817933-pat00024
먼저, 중간체 C52를 중간체 C2와 유사하게 벤질 (2S)-2-{[(벤질옥시)카르보닐]아미노}-4-옥소부타노에이트로 환원적으로 알킬화시켰다. 이어서, 2급 아미노 기를 2-클로로-2-옥소에틸 아세테이트로 아실화한 다음, 2개의 에스테르기를 메탄올 중 2M 수산화리튬 용액으로 가수분해하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.31분; MS (ESIpos): m/z = 646 (M-H)-.
중간체 C110(D)
디벤질 N-{(2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]부타노일}-베타-알라닐-D-글루타메이트
Figure 112023060817933-pat00025
표제 화합물을, 에틸 아세테이트와 5% 탄산수소나트륨 용액 사이에 분배함으로써 p-톨루엔술폰산 염으로부터 미리 방출된 디벤질 D-글루타메이트를 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 중간체 C61과 커플링시키고, 이후 트리플루오로에탄올 중 염화아연에 의해 Teoc 보호기를 분리시켜 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.08분; MS (ESIpos): m/z = 894 [M+H]+.
중간체 C111
디-tert-부틸 N-{(2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]부타노일}-베타-알라닐-D-글루타메이트
Figure 112023060817933-pat00026
우선, 디펩티드 유도체 디-tert-부틸 베타-알라닐-D-글루타메이트를, HATU의 존재 하에 상업적으로 입수가능한 N-[(벤질옥시)카르보닐]-베타-알라닌 및 디-tert-부틸 D-글루타메이트 히드로클로라이드 (1:1)를 커플링시키고, 이후 Z 보호기를 가수소분해적으로 분리시키는 통상적인 펩티드 화학 방법에 의해 제조하였다. 이어서, 표제 화합물을, 이 중간체를 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 중간체 C102와 커플링시키고, 이후 1시간 동안 표준 수소 압력 하에 실온에서 DCM/메탄올 1:1 중 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서의 수소화에 의해 Z 보호기를 분리시켜 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.06분; MS (ESIpos): m/z = 826 [M+H]+.
중간체 C117
트리플루오로아세트산 디벤질 N-{(2S)-2-(L-아스파라기닐아미노)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]부타노일}-베타-알라닐-D-글루타메이트 염
Figure 112023060817933-pat00027
중간체 C110D 및 2,5-디옥소피롤리딘-1-일-N2-(tert-부톡시카르보닐)-L-아스파라기네이트 (251 mg, 764 μmol)를 DMF 21 ml 중에 용해시키고, N,N-디이소프로필에틸아민 (363 μl, 2.01 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 교반한 다음, 정제용 RP-HPLC (칼럼: 크로마토렉스 C18-10)에 의해 직접 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고, 잔류물을 동결건조시켰다.
수득한 중간체 (578 mg, 52 μmol)를 트리플루오로에탄올 20.0 ml 중에 용해시켰다. 반응 혼합물을 염화아연 (426 mg, 3.13 mmol)과 혼합하고, 40분 동안 50℃에서 교반하였다. 혼합물을 에틸렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산 (914 mg, 3.13 mmol)과 혼합하고, 물 20 ml로 희석하고, TFA (200 μl)를 첨가하고, 혼합물을 간단히 교반하였다. 혼합물을 여과하고, 정제용 RP-HPLC (칼럼: 크로마토렉스 C18-5; 125x40, 유량: 100 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA 구배)에 의해 정제하였다. 동결건조시켜 표제 화합물을 수득하였다.
중간체 L57
메틸 (2S)-4-옥소-2-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)부타노에이트
Figure 112023060817933-pat00028
메틸 L-아스파라기네이트 히드로클로라이드 500.0 mg (2.72 mmol) 및 2-(트리메틸실릴)에틸 2,5-디옥소피롤리딘-1-카르복실레이트 706.3 mg (2.72 mmol)을 처음에 1,4-디옥산 5.0 ml에 충전하고, 트리에틸아민 826.8 mg (8.17 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 직접 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 250x40; 10μ, 유량 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 정제하였다. 이어서, 용매를 감압 하에 증발시키고, 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 화합물 (3S)-4-메톡시-4-옥소-3-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)부탄산 583.9 mg (이론치의 74%)을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.89분; MS (ESIneg): m/z = 290 (M-H)-.
(3S)-4-메톡시-4-옥소-3-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)부탄산 592.9 mg을 처음에 1,2-디메톡시에탄 10.0 ml에 충전하고, 혼합물을 -15℃로 냉각시키고, 4-메틸모르폴린 205.8 mg (2.04 mmol) 및 이소부틸 클로로포르메이트 277.9 mg (2.04 mmol)을 첨가하였다. 침전물을 15분 후에 흡인 여과하고, 각각의 경우에 1,2-디메톡시에탄 10.0 ml로 2회 여과하였다. 여과물을 -10℃로 냉각시키고, 물 10 ml 중에 용해된 수소화붕소나트륨 115.5 mg (3.05 mmol)을 격렬히 교반하면서 첨가하였다. 상을 분리하고, 유기 상을 포화 탄산수소나트륨 용액 및 포화 NaCl 용액으로 각각 1회 세척하였다. 유기 상을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 용매를 감압 하에 증발시키고, 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 화합물 메틸 N-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}-L-호모세리네이트 515.9 mg (이론치의 91%)을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.87분; MS (ESIpos): m/z = 278 (M+H)+.
메틸 N-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}-L-호모세리네이트 554.9 mg (2.00 mmol)을 처음에 디클로로메탄 30.0 ml에 충전하고, 데스-마르틴 퍼아이오디난 1.27 g (3.0 mmol) 및 피리딘 474.7 mg (6.00 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 4시간 후, 반응물을 디클로로메탄으로 희석하고, 유기 상을 10% 농도 Na2S2O3 용액, 10% 농도 시트르산 용액 및 포화 탄산수소나트륨 용액으로 각각의 경우에 3회 세척하였다. 유기 상을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 용매를 감압 하에 증발시켰다. 이와 같이 하여 표제 화합물 565.7 mg (이론치의 97%)을 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 0.03 (s, 9H), 0.91 (m, 2H), 2.70-2.79 (m, 1H), 2.88 (dd, 1H), 3.63 (s, 3H), 4.04 (m, 2H), 4.55 (m, 1H), 7.54 (d, 1H), 9.60 (t, 1H).
중간체 L95
N-[(벤질옥시)카르보닐]-L-발릴-L-알라닌
Figure 112023060817933-pat00029
이 중간체를 N-[(벤질옥시)카르보닐]-L-발린 및 tert-부틸 L-알라니네이트 히드로클로라이드로부터 시작하여 통상적인 펩티드 화학 방법에 의해 제조하였다.
LC-MS (방법 12): Rt = 1.34분; MS (ESIpos): m/z = 323.16 (M+H)+.
중간체 L103
N-(피리딘-4-일아세틸)-L-알라닐-L-알라닐-L-아스파라긴 트리플루오로아세테이트
Figure 112023060817933-pat00030
표제 화합물을, 4-피리딘아세트산을 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 상업적으로 입수가능한 tert-부틸 L-알라닐-L-알라니네이트와 커플링시키는 것으로 시작한 다음, 이어서 트리플루오로아세트산으로 탈보호시키고, tert-부틸 L-아스파라기네이트에 커플링시키고, 이후 카르복실 기를 트리플루오로아세트산으로 탈보호시키는 통상적인 펩티드 화학 방법에 의해 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.15분; MS (ESIpos): m/z = 394 (M+H)+.
중간체 L116
N-[(벤질옥시)카르보닐]-L-알라닐-N-메틸-L-알라닌
Figure 112023060817933-pat00031
표제 화합물을 상업적으로 입수가능한 N-[(벤질옥시)카르보닐]-L-알라닌으로부터 HATU의 존재 하에 tert-부틸 N-메틸-L-알라니네이트 히드로클로라이드 염과 커플링시키고, 최종적으로 tert-부틸 에스테르 보호기를 TFA로 제거하는 것에 의한 전형적인 펩티드 화학 방법에 의해 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.68분; MS (ESIpos): m/z = 309 [M+H]+
중간체 L117
N-[(벤질옥시)카르보닐]-L-알라닐-N-메틸-L-알라닐-L-아스파라긴 트리플루오로아세트산 염
Figure 112023060817933-pat00032
표제 화합물을 상업적으로 입수가능한 4-tert-부틸 L-아스파라기네이트로부터 HATU의 존재 하에 N-[(벤질옥시)카르보닐]-L-알라닐-N-메틸-L-알라닌 (중간체 L116)과 커플링시키고, 최종적으로 tert-부틸 에스테르 보호기를 TFA로 제거하는 것에 의한 전형적인 펩티드 화학 방법에 의해 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.57분; MS (ESIneg): m/z = 421 [M-H]-
중간체 L118
N-[(벤질옥시)카르보닐]-L-알라닐-N-메틸-L-알라닐-L-알라닌
Figure 112023060817933-pat00033
표제 화합물을 상업적으로 입수가능한 tert-부틸 L-알라니네이트 히드로클로라이드 염으로부터 HATU의 존재 하에 N-[(벤질옥시)카르보닐]-L-알라닐-N-메틸-L-알라닌 (중간체 L116)과 커플링시키고, 최종적으로 tert-부틸 에스테르 보호기를 TFA로 제거하는 것에 의한 전형적인 펩티드 화학 방법에 의해 제조하였다.
LC-MS (방법 12): Rt = 1.25분; MS (ESIneg): m/z = 378 [M-H]-
중간체 L121
N-[(벤질옥시)카르보닐]-L-알라닐-N-메틸-L-알라닐-L-류신
Figure 112023060817933-pat00034
표제 화합물을 상업적으로 입수가능한 tert-부틸 L-류시네이트 히드로클로라이드 염으로부터 HATU의 존재 하에 N-[(벤질옥시)카르보닐]-L-알라닐-N-메틸-L-알라닌 (중간체 L116)과 커플링시키고, 최종적으로 tert-부틸 에스테르 보호기를 TFA로 제거하는 것에 의한 전형적인 펩티드 화학 방법에 의해 제조하였다.
LC-MS (방법 12): Rt = 0.83분; MS (ESIneg): m/z = 420 [M-H]-
중간체 L122
(5S,8S,11S)-11-(2-아미노-2-옥소에틸)-8-[2-(벤질옥시)-2-옥소에틸]-5-메틸-3,6,9-트리옥소-1-페닐-2-옥사-4,7,10-트리아자도데칸-12-산
Figure 112023060817933-pat00035
표제 화합물을 상업적으로 입수가능한 4-벤질-1-tert-부틸-L-아스파르테이트 히드로클로라이드 (1:1)로부터 처음에 2,5-디옥소피롤리딘-1-일-N-[(벤질옥시)카르보닐]-L-알라니네이트와 커플링시킨 다음, tert-부틸 에스테르 보호기를 TFA로 제거한 다음, 이후 HATU의 존재 하에 4-tert-부틸 L-아스파라기네이트와 커플링시키고, 최종적으로 tert-부틸 에스테르 보호기를 TFA로 한번 더 제거하는 것에 의한 전형적인 펩티드 화학 방법에 의해 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.76분; MS (ESIpos): m/z = 543 [M+H]+
중간체 L138
1-브로모-2-옥소-6,9,12,15-테트라옥사-3-아자옥타데칸-18-산
Figure 112023060817933-pat00036
표제 화합물을, 1-아미노-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-산을 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 브로모아세트산 무수물과 커플링시켜 제조하였다.
LC-MS (방법 5): Rt = 1.05분; MS (ESIpos): m/z = 386 및 388 (M+H)+.
중간체 Q1
N-[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]-L-알라닐-N-메틸-L-알라닐-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-[(3-{[(1R)-1,3-디카르복시프로필]아미노}-3-옥소프로필)아미노]-1-옥소부탄-2-일}-L-아스파르트아미드
Figure 112023060817933-pat00037
표제 화합물을 화합물 C110D로부터 시작하여 먼저 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 중간체 L117과 커플링시킴으로써 제조하였다. 후속 단계에서, 모든 보호기를 1시간 동안 실온에서 표준 수소 압력 하에 DCM-메탄올 (1:1) 중 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서의 수소화에 의해 제거한 다음, 탈보호된 중간체를 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 1-{2-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-2-옥소에틸}-1H-피롤-2,5-디온과 반응시켜 표제 화합물로 전환시켰다.
LC-MS (방법 12): Rt = 1.66분; MS (ESIneg): m/z = 1119 [M-H]-.
중간체 Q2
N-{5-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-5-옥소펜타노일}-L-알라닐-N-메틸-L-알라닐-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-[(3-{[(1R)-1,3-디카르복시프로필]아미노}-3-옥소프로필)아미노]-1-옥소부탄-2-일}-L-아스파르트아미드
Figure 112023060817933-pat00038
표제 화합물을 화합물 C110D로부터 시작하여 먼저 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 중간체 L117과 커플링시킴으로써 제조하였다. 후속 단계에서, 모든 보호기를 1시간 동안 실온에서 표준 수소 압력 하에 DCM-메탄올 (1:1) 중 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서의 수소화에 의해 제거한 다음, 탈보호된 중간체를 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 1,1'-[(1,5-디옥소펜탄-1,5-디일)비스(옥시)]디피롤리딘-2,5-디온과 반응시켜 표제 화합물로 전환시켰다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.93분; MS (ESIpos): m/z = 1195 [M+H]+.
중간체 Q3
N-{5-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-5-옥소펜타노일}-L-알라닐-L-알라닐-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-[(3-{[(1R)-1,3-디카르복시프로필]아미노}-3-옥소프로필)아미노]-1-옥소부탄-2-일}-L-아스파르트아미드
Figure 112023060817933-pat00039
표제 화합물을 화합물 C117로부터 시작하여 먼저 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 N-(tert-부톡시카르보닐)-L-알라닐-L-알라닌과 커플링시킴으로써 제조하였다. 이어서, 중간체를 트리플루오로에탄올에 녹이고, tert-부톡시카르보닐-보호된 아민을 염화아연의 존재 하에 50℃에서 교반함으로써 방출시켰다. 후속 단계에서, 모든 벤질 보호기를 1시간 동안 실온에서 표준 수소 압력 하에 DCM-메탄올 (1:1) 중 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서의 수소화에 의해 제거한 다음, 탈보호된 중간체를 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 1,1'-[(1,5-디옥소펜탄-1,5-디일)비스(옥시)]디피롤리딘-2,5-디온과 반응시켜 표제 화합물로 전환시켰다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.90분; MS (ESIneg): m/z = 1181 [M-H]-.
중간체 Q4
N-[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]-L-알라닐-N-메틸-L-알라닐-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-[(3-{[(1R)-1,3-디카르복시프로필]아미노}-3-옥소프로필)아미노]-1-옥소부탄-2-일}-L-아스파르트아미드
Figure 112023060817933-pat00040
표제 화합물을 화합물 C110D로부터 시작하여 먼저 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 중간체 L117과 커플링시킴으로써 제조하였다. 후속 단계에서, 모든 보호기를 1시간 동안 실온에서 표준 수소 압력 하에 DCM-메탄올 (1:1) 중 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서의 수소화에 의해 제거한 다음, 탈보호된 중간체를 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 1-{6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}-1H-피롤-2,5-디온과 반응시켜 표제 화합물로 전환시켰다.
LC-MS (방법 1): Rt = 3.2분; MS (ESIpos): m/z = 1177 [M+H]+.
중간체 Q5
N-{5-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-5-옥소펜타노일}-L-알라닐-N-메틸-L-알라닐-N-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-[(3-{[(1R)-1,3-디카르복시프로필]아미노}-3-옥소프로필)아미노]-1-옥소부탄-2-일}-L-알라닌아미드
Figure 112023060817933-pat00041
표제 화합물을 화합물 C110D로부터 시작하여 먼저 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 중간체 L118과 커플링시킴으로써 제조하였다. 후속 단계에서, 모든 보호기를 1시간 동안 실온에서 표준 수소 압력 하에 DCM-메탄올 (1:1) 중 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서의 수소화에 의해 제거한 다음, 탈보호된 중간체를 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 1,1'-[(1,5-디옥소펜탄-1,5-디일)비스(옥시)]디피롤리딘-2,5-디온과 반응시켜 표제 화합물로 전환시켰다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.96분; MS (ESIpos): m/z = 1152 [M+H]+.
중간체 Q6
N-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-2-[(N-{5-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-5-옥소펜타노일}-L-발릴-L-알라닐)아미노]부타노일}-베타-알라닐-D-글루탐산
Figure 112023060817933-pat00042
표제 화합물을 화합물 C110D로부터 시작하여 먼저 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 중간체 L95와 커플링시킴으로써 제조하였다. 후속 단계에서, 모든 보호기를 1시간 동안 실온에서 표준 수소 압력 하에 DCM-메탄올 (1:1) 중 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서의 수소화에 의해 제거한 다음, 탈보호된 중간체를 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 1,1'-[(1,5-디옥소펜탄-1,5-디일)비스(옥시)]디피롤리딘-2,5-디온과 반응시켜 표제 화합물로 전환시켰다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.98분; MS (ESIpos): m/z = 1095 [M+H]+.
중간체 Q7
N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-2-({N-[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]-L-발릴-L-알라닐}아미노)부타노일]-베타-알라닐-D-글루탐산
Figure 112023060817933-pat00043
표제 화합물을 화합물 C110D로부터 시작하여 먼저 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 중간체 L95와 커플링시킴으로써 제조하였다. 후속 단계에서, 모든 보호기를 1시간 동안 실온에서 표준 수소 압력 하에 DCM-메탄올 (1:1) 중 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서의 수소화에 의해 제거한 다음, 탈보호된 중간체를 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 1-{2-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-2-옥소에틸}-1H-피롤-2,5-디온과 반응시켜 표제 화합물로 전환시켰다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.98분; MS (ESIpos): m/z = 1021 [M+H]+.
중간체 Q8
N-{5-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-5-옥소펜타노일}-L-알라닐-N-메틸-L-알라닐-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-[(3-{[(1R)-1,3-디카르복시프로필]아미노}-3-옥소프로필)아미노]-1-옥소부탄-2-일}-L-류신아미드
Figure 112023060817933-pat00044
표제 화합물을 화합물 C110D로부터 시작하여 먼저 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 중간체 L121과 커플링시킴으로써 제조하였다. 후속 단계에서, 모든 보호기를 1시간 동안 실온에서 표준 수소 압력 하에 에탄올 중 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서의 수소화에 의해 제거한 다음, 탈보호된 중간체를 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 1,1'-[(1,5-디옥소펜탄-1,5-디일)비스(옥시)]디피롤리딘-2,5-디온과 반응시켜 표제 화합물로 전환시켰다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.02분; MS (ESIpos): m/z = 1194 [M+H]+.
중간체 Q9
N-{5-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-5-옥소펜타노일}-L-알라닐-N-메틸-L-알파-아스파르틸-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-[(3-{[(1R)-1,3-디카르복시프로필]아미노}-3-옥소프로필)아미노]-1-옥소부탄-2-일}-L-아스파르트아미드
Figure 112023060817933-pat00045
표제 화합물을 화합물 C110D로부터 시작하여 먼저 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 중간체 L122와 커플링시킴으로써 제조하였다. 후속 단계에서, 모든 보호기를 1시간 동안 실온에서 표준 수소 압력 하에 메탄올 중 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서의 수소화에 의해 제거한 다음, 탈보호된 중간체를 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 3 당량의 1,1'-[(1,5-디옥소펜탄-1,5-디일)비스(옥시)]디피롤리딘-2,5-디온과 반응시켜 표제 화합물로 전환시켰다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.89분; MS (ESIpos): m/z = 1225 [M+H]+.
중간체 Q10
N-(브로모아세틸)-L-알라닐-N-메틸-L-알라닐-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-[(3-{[(1R)-1,3-디카르복시프로필]아미노}-3-옥소프로필)아미노]-1-옥소부탄-2-일}-L-아스파르트아미드
Figure 112023060817933-pat00046
표제 화합물을 화합물 C110D로부터 시작하여 먼저 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 중간체 L117과 커플링시킴으로써 제조하였다. 후속 단계에서, 모든 보호기를 1시간 동안 실온에서 표준 수소 압력 하에 DCM-메탄올 (1:1) 중 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서의 수소화에 의해 제거한 다음, 탈보호된 중간체를 3 당량의 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 브로모아세트산 무수물과 반응시켜 표제 화합물로 전환시켰다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.95분; MS (ESIpos): m/z = 1104 및 1106 [M+H]+.
중간체 Q11
N-(18-브로모-17-옥소-4,7,10,13-테트라옥사-16-아자옥타데칸-1-오일)-L-알라닐-N-메틸-L-알라닐-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-[(3-{[(1R)-1,3-디카르복시프로필]아미노}-3-옥소프로필)아미노]-1-옥소부탄-2-일}-L-아스파르트아미드
Figure 112023060817933-pat00047
표제 화합물의 합성을 처음에 1.5 당량의 HATU 및 3 당량의 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서 중간체 C111을 중간체 L117과 커플링시킴으로써 수행하였다. 후속적으로, Z 보호기를 실온에서 표준 수소 압력 하에 에탄올 중 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서의 2시간 수소화에 의해 제거하였다. 이어서, 탈보호된 중간체를 1.5 당량의 HATU 및 3 당량의 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서 중간체 L138과 반응시켰다. 마지막 단계에서, 트리플루오로에탄올 중 8 당량의 염화아연을 사용하여 50℃에서 2시간 교반함으로써 tert-부틸 에스테르 기를 절단하여 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 8): Rt = 4.06분; MS (ESI-pos): m/z = 1353 [M+H]+.
B: 항체-약물 접합체 (ADC)의 제조
B-1. 일반적인 항체 생성 방법
사용된 항체, 예를 들어 TPP-981, TPP-1015, TPP-6013, TPP-7006, TPP-7007, TPP-8382, TPP-8987, TPP-8988, TPP-9476, TPP-9574 및 TPP-9580의 단백질 서열 (아미노산 서열)을 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의해 상응하는 단백질을 코딩하는 DNA 서열로 변환시키고, 일시적 포유동물 세포 배양에 적합한 발현 벡터 내로 삽입하였다 (문헌 [Tom et al., Chapter 12 in Methods Express: Expression Systems, edited by Michael R. Dyson and Yves Durocher, Scion Publishing Ltd, 2007]에 기재됨).
B-2. 포유동물 세포에서의 항체의 발현을 위한 일반적 방법
항체, 예를 들어 TPP-981, TPP-1015, TPP-6013, TPP-7006, TPP-7007, TPP-8382, TPP-8987, TPP-8988, TPP-9476, TPP-9574 및 TPP-9580을 문헌 [Tom et al., Chapter 12 in Methods Express: Expression Systems, edited by Michael R. Dyson and Yves Durocher, Scion Publishing Ltd, 2007]에 기재된 바와 같이 일시적 포유동물 세포 배양에서 생산하였다.
B-3. 세포 상청액으로부터의 항체의 정제를 위한 일반적 방법
항체, 예를 들어 TPP-981, TPP-1015, TPP-6013, TPP-7006, TPP-7007, TPP-8382, TPP-8987, TPP-8988, TPP-9476, TPP-9574 및 TPP-9580을 세포 배양 상청액으로부터 수득하였다. 세포 상청액을 세포의 원심분리에 의해 정화하였다. 이어서, 세포 상청액을 맙셀렉트 슈어(MabSelect Sure) (지이 헬스케어) 크로마토그래피 칼럼 상에서 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 이를 위해, 칼럼을 DPBS pH 7.4 (시그마(Sigma)/알드리치(Aldrich)) 중에서 평형화시키고, 세포 상청액을 적용하고, 칼럼을 약 10 칼럼 부피의 DPBS pH 7.4 + 500 mM 염화나트륨으로 세척하였다. 항체를 50 mM 아세트산나트륨 pH 3.5 + 500 mM 염화나트륨 중에서 용리시킨 다음, DPBS pH 7.4 중에서 슈퍼덱스 200 칼럼 (지이 헬스케어) 상에서 겔 여과 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다.
상업적으로 입수가능한 항체는 상업용 제품으로부터 표준 크로마토그래피 방법 (단백질 A 크로마토그래피, 정제용 겔 여과 크로마토그래피 (SEC - 크기 배제 크로마토그래피))에 의해 정제하였다.
B-4. 시스테인 측쇄에 대한 커플링을 위한 일반적 방법
하기 항체를 커플링 반응에 사용하였다:
실시예 a: TPP-981 세툭시맙 (항-EGFR AK)
실시예 c: TPP-6013 (항-CD123 AK)
TPP-8987 (항-CD123 AK)
TPP-8988 (항-CD123 AK)
TPP-9476 (항-CD123 AK)
실시예 h: TPP-8382 (항-B7H3 AK)
실시예 e: TPP-1015 (항-Her2 AK)
실시예 k: TPP-7006 (항-TWEAKR AK)
TPP-7007 (항-TWEAKR AK)
실시예 x: TPP-9574 (항-CXCR5 AK)
TPP-9580 (항-CXCR5 AK)
커플링 반응을 통상적으로 아르곤 하에 수행하였다.
PBS 완충제 중에 용해시킨 2 내지 5 당량의 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 히드로클로라이드 (TCEP)를 1 mg/ml 내지 20 mg/ml 범위, 바람직하게는 약 10 mg/ml 내지 15 mg/ml 범위의 농도의 PBS 완충제 중 적절한 항체의 용액에 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 실온에서 교반하였다. 이러한 목적을 위해, 사용된 각각의 항체의 용액은 작업 실시예에 언급된 농도로 사용될 수 있거나, 또는 이는 또한 바람직한 농도 범위 내로 들어가기 위해 언급된 출발 농도의 약 절반으로 PBS 완충제에 의해 임의로 희석될 수 있다. 후속적으로, 의도된 로딩에 따라, 커플링될 2 내지 12 당량, 바람직하게는 약 5-10 당량의 말레이미드 전구체 화합물 또는 할라이드 전구체 화합물을 DMSO 중 용액으로서 첨가하였다. 여기서, DMSO의 양은 총 부피의 10%를 초과해서는 안된다. 혼합물을 말레이미드 전구체의 경우에 실온에서 60-240분 동안 교반하고 할라이드 전구체의 경우에 실온에서 8 내지 24시간 교반한 다음, PBS-평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 적용하고, PBS 완충제로 용리시켰다. 일반적으로, 달리 나타내지 않는 한, PBS 완충제 중 5 mg의 해당 항체를 환원 및 후속 커플링에 사용하였다. 따라서 각각의 경우에 PD10 칼럼 상에서 정제하여 3.5 ml PBS 완충제 중 각각의 ADC의 용액을 수득하였다. 이어서, 샘플을 초원심분리에 의해 농축시키고, PBS 완충제로 임의로 재희석하였다. 필요한 경우에, 저분자량 성분의 보다 우수한 제거를 위해, PBS 완충제로 재희석한 후에 한외여과에 의한 농축을 반복하였다. 생물학적 시험을 위해, 필요한 경우에, 최종 ADC 샘플의 농도를 재희석에 의해 0.5-15 mg/ml의 범위로 임의로 조정하였다. 작업 실시예에 언급된, ADC 용액의 각각의 단백질 농도를 결정하였다. 또한, 항체 로딩 (약물/mAb 비)을 B-6 하에 기재된 방법을 사용하여 결정하였다.
링커에 따라, 실시예에 제시된 ADC는 또한 보다 적은 또는 보다 높은 정도로 항체에 연결된 가수분해된 개방쇄 숙신아미드의 형태로 존재할 수 있다.
특히 링커 하위구조
Figure 112023060817933-pat00048
를 통해 항체의 티올 기에 연결된 KSP-I-ADC는 또한 임의로 개방쇄 숙신아미드를 통해 연결된 ADC에서 반응식 28에 따라 pH 8에서 약 20-24시간 동안 커플링시키고 교반한 후 재완충시킴으로써 선택적으로 제조될 수 있다.
#1은 항체에 대한 황 가교를 나타내고, #2는 변형된 KSP 억제제에 대한 부착 지점을 나타낸다.
링커가 가수분해된 개방쇄 숙신아미드를 통해 항체에 부착된 이러한 ADC는 임의로 또한 여기서 예로서 제시된 소규모 및 대규모 커플링에 의해 선택적으로 제조될 수 있다:
PBS 완충제 중에 용해된 2 내지 7 당량의 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 히드로클로라이드 (TCEP)를 1 mg/ml 내지 20 mg/ml의 범위, 바람직하게는 약 5 mg/ml 내지 15 mg/ml의 범위의 농도의 PBS 완충제 중 2-5 mg의 적절한 항체의 용액에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 30분 내지 1시간 동안 교반하였다. 후속적으로, 의도된 로딩에 따라, 커플링될 2 내지 20 당량, 바람직하게는 약 5-10 당량의 말레이미드 전구체 화합물을 DMSO 중 용액으로서 첨가하였다. 더 높은 DAR을 달성하기 위해, 15-20 당량을 사용하는 것이 또한 가능하다. 여기서, DMSO의 양은 총 부피의 10%를 초과해서는 안된다. 혼합물을 실온에서 60-240분 동안 교반하였다. 용리액을 PBS 완충제 (pH 8)에 의해 1-5 mg/ml의 농도로 희석한 다음, PBS 완충제 (pH 8)로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 통과시키고, PBS 완충제 (pH 8)로 용리시켰다. 용리액을 아르곤 하에 실온에서 밤새 교반하였다. 후속적으로, 용액을 초원심분리에 의해 농축시키고, PBS 완충제 (pH 7.2)로 재희석하였다.
중규모 커플링:
아르곤 하에, PBS 완충제 중 2-7 당량, 바람직하게는 3 당량의 TCEP의 용액 (c ~ 0.2-0.8 mg/ml, 바람직하게는 0.5 mg/ml)을 PBS 완충제 중 20-200 mg의 해당 항체 (c ~ 5-15 mg/ml)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, DMSO 중에 용해된 2-20, 바람직하게는 5-10 당량의 말레이미드 전구체 화합물을 첨가하였다. 더 높은 DAR을 달성하기 위해, 15-20 당량을 사용하는 것이 또한 가능하다. 실온에서 추가로 1.5시간-2시간 동안 교반한 후, 혼합물을 미리 pH 8로 조정된 PBS 완충제로 희석하였다. 이어서, 이 용액을 PBS 완충제 (pH 8)로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 적용하고, PBS 완충제 (pH 8)로 용리시켰다. 용리액을 PBS 완충제 (pH 8)로 2-7 mg/ml의 농도로 희석하였다. 이 용액을 아르곤 하에 실온에서 밤새 교반하였다. 필요한 경우에, 이어서, 용액을 pH 7.2로 재완충시켰다. ADC 용액을 초원심분리에 의해 농축시키고, PBS 완충제 (pH 7.2)로 재희석한 다음, 임의로 약 10 mg/ml의 농도로 다시 농축시켰다.
제시된 구조식에서, AK1은 하기 의미를 가질 수 있다:
실시예 a: TPP-981 세툭시맙 (부분적으로 환원됨)- S§1
실시예 c: TPP-6013 (항-CD123 AK) (부분적으로 환원됨)- S§1
TPP-8987 (항-CD123 AK) (부분적으로 환원됨)- S§1
TPP-8988 (항-CD123 AK) (부분적으로 환원됨)- S§1
TPP-9476 (항-CD123 AK) (부분적으로 환원됨)- S§1
실시예 e: TPP-1015 (항-Her2 AK) (부분적으로 환원됨)- S§1
실시예 h: TPP-8382 (항-B7H3 AK) (부분적으로 환원됨)- S§1
실시예 k: TPP-7006 (항-TWEAKR) (부분적으로 환원됨)- S§1
TPP-7007 (항-TWEAKR) (부분적으로 환원됨)- S§1
실시예 x: TPP-9574 (항-CXCR5 AK) (부분적으로 환원됨)- S§1
TPP-9580 (항-CXCR5 AK) (부분적으로 환원됨)- S§1
여기서
§1은 숙신이미드 기 또는 임의의 이성질체 가수분해된 개방쇄 숙신아미드 또는 그로부터 생성된 알킬렌 라디칼에 대한 연결을 나타내고,
S는 부분적으로 환원된 항체의 시스테인 잔기의 황 원자를 나타낸다.
B-5. 리신 측쇄에 대한 커플링을 위한 일반적 방법
하기 항체를 커플링 반응에 사용하였다:
실시예 a: TPP-981 세툭시맙 (항-EGFR AK)
실시예 c: TPP-6013 (항-CD123 AK)
TPP-8987 (항-CD123 AK)
TPP-8988 (항-CD123 AK)
TPP-9476 (항-CD123 AK)
실시예 e: TPP-1015 (항-Her2 AK)
실시예 k: TPP-7006 (항-TWEAKR AK)
TPP-7007 (항-TWEAKR AK)
실시예 x: TPP-9574 (항-CXCR5 AK)
TPP-9580 (항-CXCR5 AK)
커플링 반응을 통상적으로 아르곤 하에 수행하였다.
커플링될 2 내지 8 당량의 전구체 화합물을 DMSO 중 용액으로서 의도된 로딩에 따라 1 mg/ml 내지 20 mg/ml의 범위, 바람직하게는 약 10 mg/ml의 농도의 PBS 완충제 중 해당 항체의 용액에 첨가하였다. 실온에서 30분 내지 6시간 동안 교반한 후, DMSO 중 동일한 양의 전구체 화합물을 다시 첨가하였다. 여기서, DMSO의 양은 총 부피의 10%를 초과해서는 안된다. 실온에서 추가로 30분 내지 6시간 동안 교반한 후, 혼합물을 PBS로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 적용하고, PBS 완충제로 용리시켰다. 따라서 각각의 경우에 PD10 칼럼 상에서 정제하여 PBS 완충제 중 각각의 ADC의 용액을 수득하였다. 이어서, 샘플을 초원심분리에 의해 농축시키고, PBS 완충제로 임의로 재희석하였다. 필요한 경우에, 저분자량 성분의 보다 우수한 제거를 위해, PBS 완충제로 재희석한 후에 한외여과에 의한 농축을 반복하였다. 생물학적 시험을 위해, 필요한 경우에, 최종 ADC 샘플의 농도를 재희석에 의해 0.5-15 mg/ml의 범위로 임의로 조정하였다.
작업 실시예에 언급된, ADC 용액의 각각의 단백질 농도를 결정하였다. 또한, 항체 로딩 (약물/mAb 비)을 B-6 하에 기재된 방법을 사용하여 결정하였다.
제시된 구조식에서, AK2는 하기 의미를 갖는다.
실시예 a: TPP-981 세툭시맙 (항-EGFR AK) - NH§2
실시예 c: TPP-6013 (항-CD123 AK) - NH§2
TPP-8987 (항-CD123 AK) - NH§2
TPP-8988 (항-CD123 AK) - NH§2
TPP-9476 (항-CD123 AK) - NH§2
실시예 e: TPP-1015 (항-Her2 AK) - NH§2
실시예 k: TPP-7006 (항-TWEAKR AK) - NH§2
TPP-7007 (항-TWEAKR AK) - NH§2
실시예 x: TPP-9574 (항-CXCR5 AK) - NH§2
TPP-9580 (항-CXCR5 AK) - NH§2
여기서
§2는 카르보닐 기에 대한 연결을 나타내고,
NH는 항체의 리신 잔기의 측쇄 아미노 기를 나타낸다.
본 발명에 따른 접합체의 추가 정제 및 특징화
반응 후, 일부 경우에 반응 혼합물을, 예를 들어 한외여과에 의해 농축시킨 다음, 탈염시키고, 크로마토그래피에 의해, 예를 들어 세파덱스® G-25 칼럼을 사용하여 정제하였다. 예를 들어 포스페이트-완충 염수 (PBS)를 사용하여 용리를 수행하였다. 이어서, 용액을 멸균 여과하고 동결시켰다. 대안적으로, 접합체를 동결건조시킬 수 있다.
B-6. 항체, 독성단 로딩 및 개방 시스테인 부가물의 비율의 결정
탈글리코실화 및/또는 변성 후 분자량 결정에 더하여 단백질 확인을 위해, 변성, 환원 및 유도체화 후에 발견된 트립신 펩티드를 통해 단백질의 정체를 확인하는 트립신 소화를 수행하였다.
작업 실시예에 기재된 접합체로부터 수득된 PBS 완충제 용액의 독성단 로딩 (표에서 DAR, 약물-대-항체 비로 지칭됨)을 하기와 같이 결정하였다:
리신-연결된 ADC의 독성단 로딩의 결정을 개별 접합체 종의 분자량의 질량 분광측정 결정에 의해 수행하였다. 여기서, 항체 접합체를 먼저 PNGaseF로 탈글리코실화시키고, 샘플을 산성화시키고, HPLC 분리/탈염 후, ESI-MicroTofQ (브루커 달토닉(Bruker Daltonik))를 사용하여 질량 분광측정법에 의해 분석하였다. TIC (총 이온 크로마토그램)에서의 신호 상에 모든 스펙트럼을 부가하고, 상이한 접합체 종의 분자량을 MaxEnt 디컨볼루션에 기초하여 계산하였다. 이어서, 상이한 종의 신호 적분 후에 DAR (= 약물/항체 비)을 계산하였다. 이러한 목적을 위해, 독성단 수에 의해 가중된 모든 종에 대한 적분 결과의 총 합계를 모든 종에 대한 단순 가중된 적분 결과의 총 합계로 나누었다.
시스테인-연결된 접합체의 독성단 로딩을 환원 및 변성된 ADC의 역상 크로마토그래피에 의해 결정하였다. 구아니디늄 히드로클로라이드 (GuHCl) (28.6 mg) 및 DL-디티오트레이톨 (DTT)의 용액 (500 mM, 3 μl)을 ADC 용액 (1 mg/ml, 50 μl)에 첨가하였다. 혼합물을 55℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, HPLC에 의해 분석하였다.
HPLC 분석을 220 nm에서 검출하는 애질런트 1260 HPLC 시스템 상에서 수행하였다. 폴리머 래보러토리즈(Polymer Laboratories) PLRP-S 중합체 역상 칼럼 (카탈로그 번호 PL1912-3802) (2.1 x150 mm, 8 μm 입자 크기, 1000 Å)을 1 ml/분의 유량으로 하기 구배: 0분, 25%B; 3분, 25%B; 28분, 50%B로 사용하였다. 용리액 A는 물 중 0.05% 트리플루오로아세트산 (TFA)으로 이루어지고, 용리액 B는 아세토니트릴 중 0.05% 트리플루오로아세트산으로 이루어졌다.
검출된 피크는 비-접합 항체의 경쇄 (L0) 및 중쇄 (H0)와의 체류 시간 비교에 의해 할당되었다. 접합된 샘플에서 독점적으로 검출된 피크를 1개의 독성단을 갖는 경쇄 (L1) 및 1, 2 및 3개의 독성단을 갖는 중쇄 (H1, H2, H3)로 할당하였다.
항체에의 독성단의 평균 로딩 (DAR, 약물-대-항체 비로 지침됨)을 적분에 의해 결정된 피크 면적으로부터 HC 로드 및 LC 로드의 합계의 배수로서 계산하였으며, 여기서 LC 로드는 모든 LC 피크의 독성단 수-평균 가중 적분 결과의 합계를 모든 LC 피크의 단순 가중 적분 결과의 합계로 나눔으로써 계산되고, HC 로드는 모든 HC 피크의 독성단 수-평균 가중 적분 결과의 합계를 모든 HC 피크의 단순 가중 적분 결과의 합계로 나눔으로써 계산된다. 개별적 경우에, 일부 피크의 공동-용리로 인해, 독성단 로딩을 정확하게 결정할 수 없을 수 있었다.
경쇄 및 중쇄가 HPLC에 의해 충분히 분리될 수 없는 경우에, 시스테인-연결된 접합체의 독성단 로딩의 결정을 경쇄 및 중쇄에서의 개별 접합체 종의 분자량의 질량 분광측정 결정에 의해 수행하였다.
이러한 목적을 위해, 구아니디늄 히드로클로라이드 (GuHCl) (28.6 mg) 및 DL-디티오트레이톨 (DTT)의 용액 (500 mM, 3 μl)을 ADC 용액 (1 mg/ml, 50 μl)에 첨가하였다. 혼합물을 55℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, ESI-MicroTofQ (브루커 달토닉)를 사용하여 온라인 탈염시킨 후 질량 분광측정법에 의해 분석하였다.
DAR (약물-대-항체 비) 결정을 위해, TIC (총 이온 크로마토그램)에서의 신호 상에 모든 스펙트럼을 부가하고, 경쇄 및 중쇄에서의 상이한 접합체 종의 분자량을 MaxEnt 디컨볼루션에 기초하여 계산하였다. 항체에의 독성단의 평균 로딩을 적분에 의해 결정된 피크 면적으로부터 HC 로딩 및 LC 로딩의 총 합계의 배수로서 결정하였다. 이와 관련하여, LC 로딩은 독성단 수에 의해 가중된 모든 LC 피크에 대한 적분 결과의 총 합계를 모든 LC 피크에 대한 단순 가중 적분 결과의 총 합계로 나눔으로써 계산되고, HC 로딩은 독성단 수에 의해 가중된 모든 HC 피크에 대한 적분 결과의 총 합계를 모든 HC 피크에 대한 단순 가중 적분 결과의 총 합계로 나눔으로써 계산된다.
개방 구축물의 경우에, 개방 시스테인 부가물의 비율을 결정하기 위해, 모든 단순 접합된 경쇄 및 중쇄 변이체의 폐쇄 대 개방 시스테인 부가물의 분자량 면적 비 (분자량 델타 18 달톤)를 결정하였다. 모든 변이체의 평균은 개방 시스테인 부가물의 비율을 산출하였다.
B-7. ADC의 항원 결합의 확인
표적 분자에 결합하는 결합제의 능력을 커플링 수행 후에 조사하였다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이러한 목적을 위해 사용될 수 있는 다양한 방법에 친숙하고; 예를 들어, 접합체의 친화도는 ELISA 기술 또는 표면 플라즈몬 공명 분석 (비아코어(BIAcore)™ 측정)을 사용하여 조사될 수 있다. 접합체 농도는, 예를 들어 항체 접합체에 대한 단백질 결정에 의해 통상의 방법을 사용하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 측정될 수 있다. (또한 문헌 [Doronina et al.; Nature Biotechnol. 2003; 21:778-784 및 Polson et al., Blood 2007; 1102:616-623] 참조).
대사물의 작업 실시예
실시예 M1
N-{(2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]부타노일}-베타-알라닐-D-글루탐산
Figure 112023060817933-pat00049
중간체 C110D를 실온에서 수소 표준 압력 하에 에탄올 중 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서의 1시간 수소화에 의해 표제 화합물로 전환시켰다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.78분; MS (ESIpos): m/z = 714 [M+H]+.
예시적인 방식으로 하기에 나타낸 ADC는 바람직한 약리학적 특성을 갖는 바람직한 대사물 M1을 방출할 수 있다.
작업 실시예 ADC
말레이미드 라디칼을 통해 항체의 시스테인 측쇄에 커플링된 작업 실시예의 구조식에 제시된 ADC는, 링커 및 커플링 절차에 따라, 주로 각각의 경우에 제시된 개환 또는 폐환 형태로 존재한다. 그러나, 제제는 적은 비율의 각각의 다른 형태를 포함할 수 있다.
커플링 반응을 아르곤 하에 수행하였다. 생체내 시험을 위한 모든 보다 큰 배치를 제조의 종료 시에 멸균-여과하였다.
실시예 1
Figure 112023060817933-pat00050
예시적인 절차 A:
아르곤 하에, PBS 완충제 0.05 ml 중 TCEP 0.029 mg의 용액을 PBS 0.5 ml 중 해당 항체 5 mg (c=10 mg/ml)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, DMSO 50 μl 중에 용해된 중간체 Q1 0.26 mg (0.00023 mmol)을 첨가하였다. 실온에서 추가로 90분 동안 교반한 후, 혼합물을 미리 pH 8로 조정된 PBS 완충제에 의해 2.5 ml의 부피로 희석한 다음, PBS 완충제 (pH 8)로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 통과시키고, PBS 완충제 (pH 8)로 용리시켰다. 용리액을 아르곤 하에 실온에서 밤새 교반하였다. 이어서 초원심분리에 의해 농축시키고, PBS 완충제 (pH 7.2)로 재희석하였다.
예시적인 절차 B:
아르곤 하에, PBS 완충제 0.3 ml 중 TCEP 0.172 mg의 용액을 PBS 3 ml 중 해당 항체 30 mg (c=10 mg/ml)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, DMSO 300 μl 중에 용해된 중간체 Q1 1.57 mg (0.0014 mmol)을 첨가하였다. 실온에서 추가로 90분 동안 교반한 후, 혼합물을 미리 pH 8로 조정된 PBS 완충제에 의해 5 ml의 부피로 희석한 다음, PBS 완충제 (pH 8)로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 통과시키고, PBS 완충제 (pH 8)로 용리시켰다. 용리액을 PBS 완충제 (pH 8)에 의해 7.5 ml의 부피로 희석하고, 아르곤 하에 실온에서 밤새 교반하였다. 이어서 이러한 용액을 PBS 완충제 (pH 7.2)로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 적용하고, PBS 완충제 (pH 7.2)로 용리시켰다. 이어서 용리액을 초원심분리에 의해 농축시키고, PBS 완충제 (pH 7.2)로 재희석하고, 재농축시키고, 다시 멸균-여과하였다.
하기 ADC를 상기 절차와 유사하게 제조하였으며, 표에 나타난 바와 같이 특징화할 수 있다:
Figure 112023060817933-pat00051
실시예 2
Figure 112023060817933-pat00052
예시적인 절차 A:
아르곤 하에, DMSO 50 μl 중에 용해된 중간체 Q2 5 당량 (0.2 mg)을 PBS 0.5 ml 중 해당 항체 5 mg (c=10 mg/ml)에 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 동일한 양을 다시 첨가하고, 혼합물을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 후속적으로 PBS 완충제 (pH 7.2)에 의해 2.5 ml로 희석하고, 세파덱스 칼럼 상에서 정제한 다음, 초원심분리에 의해 농축시키고, PBS (pH 7.2)로 재희석하였다.
예시적인 절차 B:
아르곤 하에, DMSO 50 μl 중에 용해된 중간체 Q2 4 당량 (1 mg)을 PBS 완충제 (pH 7.2) 3 ml 중 해당 항체 30 mg (c=10 mg/ml)에 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 동일한 양을 다시 첨가하고, 혼합물을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 PBS 완충제 (pH 7.2)에 의해 5 ml로 희석하고, 세파덱스 칼럼 상에서 정제한 다음, 초원심분리에 의해 농축시키고, PBS (pH 7.2)로 재희석하고, 재농축시키고, 다시 멸균-여과하였다.
예시적인 절차 C:
아르곤 하에, DMSO 250 μl 중에 용해된 중간체 Q2 2.5 당량 (1 mg)을 PBS 완충제 (pH 7.2) 5 ml 중 해당 항체 50 mg (c=10 mg/ml)에 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 동일한 양을 다시 첨가하고, 혼합물을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 PBS 완충제 (pH 7.2)에 의해 7.5 ml로 희석하고, 세파덱스 칼럼 상에서 정제한 다음, 초원심분리에 의해 농축시키고, PBS (pH 7.2)로 재희석하고, 재농축시키고, 다시 멸균-여과하였다.
예시적인 절차 D:
아르곤 하에, DMSO 7.5 ml 중에 용해된 중간체 Q2 4.5 당량 (36 mg)을 PBS 완충제 (pH 7.2) 150 ml 중 해당 항체 1000 mg (c = 6.7 mg/ml)에 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 동일한 양을 다시 첨가하고, 혼합물을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 배치를 교차-유동 여과에 의해 정제하고, 농축시키고, 멸균-여과하였다.
Figure 112023060817933-pat00053
실시예 3
Figure 112023060817933-pat00054
예시적인 절차 A:
아르곤 하에, DMSO 50 μl 중에 용해된 중간체 Q3 5 당량 (0.2 mg)을 PBS 0.5 ml 중 해당 항체 5 mg (c=10 mg/ml)에 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 동일한 양을 다시 첨가하고, 혼합물을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 후속적으로 PBS 완충제 (pH 7.2)에 의해 2.5 ml로 희석하고, 세파덱스 칼럼 상에서 정제한 다음, 초원심분리에 의해 농축시키고, PBS (pH 7.2)로 재희석하였다.
예시적인 절차 B:
아르곤 하에, DMSO 50 μl 중에 용해된 중간체 Q3 4 당량 (1 mg)을 PBS 완충제 (pH 7.2) 3 ml 중 해당 항체 30 mg (c=10 mg/ml)에 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 동일한 양을 다시 첨가하고, 혼합물을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 PBS 완충제 (pH 7.2)에 의해 2.5 ml로 희석하고, 세파덱스 칼럼 상에서 정제한 다음, 초원심분리에 의해 농축시키고, PBS (pH 7.2)로 재희석하고, 재농축시키고, 다시 멸균-여과하였다.
Figure 112023060817933-pat00055
실시예 4
Figure 112023060817933-pat00056
예시적인 절차 A:
아르곤 하에, PBS 완충제 0.05 ml 중 TCEP 0.029 mg의 용액을 PBS 완충제 (pH 7.2) 0.4 ml 중 해당 항체 5 mg (c=12.5 mg/ml)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, DMSO 50 μl 중에 용해된 중간체 Q4 0.275 mg (0.00023 mmol)을 첨가하였다. 실온에서 추가로 90분 교반한 후, 반응물을 PBS 완충제에 의해 2.5 ml의 총 부피로 희석하였다. 이어서 이 용액을 PBS 완충제 (pH 7.2)로 평형화시킨 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 적용하고, PBS 완충제 (pH 7.2)로 용리시켰다. 이어서 초원심분리에 의해 농축시키고, PBS 완충제 (pH 7.2)로 재희석하였다.
Figure 112023060817933-pat00057
실시예 5
Figure 112023060817933-pat00058
예시적인 절차 A:
아르곤 하에, DMSO 50 μl 중에 용해된 중간체 Q5 5 당량 (0.2 mg)을 PBS 0.5 ml 중 해당 항체 5 mg (c=10 mg/ml)에 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 동일한 양을 다시 첨가하고, 혼합물을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 후속적으로 PBS 완충제 (pH 7.2)에 의해 2.5 ml로 희석하고, 세파덱스 칼럼 상에서 정제한 다음, 초원심분리에 의해 농축시키고, PBS (pH 7.2)로 재희석하였다.
Figure 112023060817933-pat00059
실시예 6
Figure 112023060817933-pat00060
예시적인 절차 A:
아르곤 하에, DMSO 50 μl 중에 용해된 중간체 Q6 5 당량 (0.18 mg)을 PBS 0.4 ml 중 해당 항체 5 mg (c=12.5 mg/ml)에 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 동일한 양을 다시 첨가하고, 혼합물을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 후속적으로 PBS 완충제 (pH 7.2)에 의해 2.5 ml로 희석하고, 세파덱스 칼럼 상에서 정제한 다음, 초원심분리에 의해 농축시키고, PBS (pH 7.2)로 재희석하였다.
Figure 112023060817933-pat00061
실시예 7
Figure 112023060817933-pat00062
예시적인 절차 A:
아르곤 하에, PBS 완충제 0.05 ml 중 TCEP 0.029 mg의 용액을 PBS 0.4 ml 중 해당 항체 5 mg (c=12.5 mg/ml)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, DMSO 50 μl 중에 용해된 중간체 Q7 0.24 mg (0.00023 mmol)을 첨가하였다. 실온에서 추가로 90분 동안 교반한 후, 혼합물을 미리 pH 8로 조정된 PBS 완충제에 의해 2.5 ml의 부피로 희석한 다음, PBS 완충제 (pH 8)로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 통과시키고, PBS 완충제 (pH 8)로 용리시켰다. 용리액을 아르곤 하에 실온에서 밤새 교반하였다. 이어서 초원심분리에 의해 농축시키고, PBS 완충제 (pH 7.2)로 재희석하였다.
Figure 112023060817933-pat00063
실시예 8
Figure 112023060817933-pat00064
예시적인 절차 A:
아르곤 하에, DMSO 50 μl 중에 용해된 중간체 Q8 5 당량 (0.2 mg)을 PBS 0.5 ml 중 해당 항체 5 mg (c=10 mg/ml)에 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 동일한 양을 다시 첨가하고, 혼합물을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 후속적으로 PBS 완충제 (pH 7.2)에 의해 2.5 ml로 희석하고, 세파덱스 칼럼 상에서 정제한 다음, 초원심분리에 의해 농축시키고, PBS (pH 7.2)로 재희석하였다.
Figure 112023060817933-pat00065
실시예 9
Figure 112023060817933-pat00066
예시적인 절차 A:
아르곤 하에, DMSO 50 μl 중에 용해된 중간체 Q9 5 당량 (0.2 mg)을 PBS 0.5 ml 중 해당 항체 5 mg (c=10 mg/ml)에 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 동일한 양을 다시 첨가하고, 혼합물을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 후속적으로 PBS 완충제 (pH 7.2)에 의해 2.5 ml로 희석하고, 세파덱스 칼럼 상에서 정제한 다음, 초원심분리에 의해 농축시키고, PBS (pH 7.2)로 재희석하였다.
Figure 112023060817933-pat00067
실시예 10
Figure 112023060817933-pat00068
예시적인 절차 A:
아르곤 하에, PBS 완충제 0.05 ml 중 TCEP 0.029 mg의 용액을 PBS 완충제 (pH 7.2) 0.5 ml 중 해당 항체 5 mg (c=10 mg/ml)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, DMSO 50 μl 중에 용해된 중간체 Q10 0.295 mg (0.00023 mmol)을 첨가하였다. 실온에서 추가로 20시간 교반한 후, 반응물을 PBS 완충제에 의해 2.5 ml의 총 부피로 희석하였다. 이어서 이 용액을 PBS 완충제 (pH 7.2)로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 적용하고, PBS 완충제 (pH 7.2)로 용리시켰다. 이어서 초원심분리에 의해 농축시키고, PBS 완충제 (pH 7.2)로 재희석하였다.
보다 높은 DAR을 수득하기 위한 예시적인 절차 C:
아르곤 하에, PBS 완충제 0.05 ml 중 TCEP 0.057 mg의 용액을 PBS 완충제 (pH 7.2) 0.5 ml 중 해당 항체 5 mg (c=10 mg/ml)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, DMSO 50 μl 중에 용해된 중간체 Q10 0.59 mg (0.00053 mmol)을 첨가하였다. 실온에서 추가로 20시간 교반한 후, 반응물을 PBS 완충제에 의해 2.5 ml의 총 부피로 희석하였다. 이어서 이 용액을 PBS 완충제 (pH 7.2)로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 적용하고, PBS 완충제 (pH 7.2)로 용리시켰다. 이어서 초원심분리에 의해 농축시키고, PBS 완충제 (pH 7.2)로 재희석하였다.
Figure 112023060817933-pat00069
실시예 11
Figure 112023060817933-pat00070
예시적인 절차 A:
아르곤 하에, PBS 완충제 0.05 ml 중 TCEP 0.029 mg의 용액을 PBS 완충제 (pH 7.2) 0.4 ml 중 해당 항체의 5 mg (c=12.5 mg/ml)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, DMSO 50 μl 중에 용해된 중간체 Q11 0.32 mg (0.00023 mmol)을 첨가하였다. 실온에서 추가로 20시간 교반한 후, 반응물을 PBS 완충제에 의해 2.5 ml의 총 부피로 희석하였다. 이어서 이 용액을 PBS 완충제 (pH 7.2)로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 적용하고, PBS 완충제 (pH 7.2)로 용리시켰다. 이어서 초원심분리에 의해 농축시키고, PBS 완충제 (pH 7.2)로 재희석하였다.
비교 목적을 위해, 하기 ADC를 제조하였다:
참조 실시예 R1:
Figure 112023060817933-pat00072
예를 들어 세툭시맙 및 트라스투주맙을 포함한 다양한 항체를 갖는 이러한 ADC는 WO2015/096982 및 WO2016/096610에 개시되었다. 비교 목적을 위해, 그 안에 개시된 전구체 중간체 F194를 추가로 또한 TPP-6013 (항-CD123 AK)과 반응시켰다. 하기 ADC를 비교 목적을 위해 사용하였다:
Figure 112023060817933-pat00073
참조 실시예 R2:
Figure 112023060817933-pat00074
비-글리코실화 항-TWEAKR 항체를 갖는 이러한 ADC는 WO2016/096610에 개시되었다. 비교 목적을 위해, 그 안에 개시된 전구체 중간체 F291을 추가로 또한 TPP-9574 (항-CXCR5 AK), TPP-981 (항-EGFR) 및 TPP-1015 (항-HER2 AK)와 반응시켰다. 하기 ADC를 비교 목적에 사용하였다:
Figure 112023060817933-pat00075
참조 실시예 R1의 경우, WO2015/096982는 그로부터 유래된 대사물 실시예 98을 기재한다. 참조 실시예 R2의 경우, WO2016/096610은 동일한 대사물 실시예 M9를 기재하며, 이는 참조 실시예 R3M으로서 본원에 열거된다.
참조 실시예 R3M:
N-(3-아미노프로필)-N-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2-히드록시아세트아미드
Figure 112023060817933-pat00076
제제는 WO2015/096982에 실시예 98로서 기재되었다.
상기 출원에 개시된 이들 참조 화합물에 대한 또는 신규 참조 화합물에 대해 수득된 생물학적 데이터는 챕터 C에 기재된다.
C: 생물학적 효능의 평가
본 발명에 따른 화합물의 생물학적 활성은 하기 기재된 검정에서 제시될 수 있다:
a. C-1a ADC의 세포독성 효과의 결정
ADC의 세포독성 효과의 분석을 다양한 세포주에서 수행하였다:
NCI-H292: 인간 점액표피양 폐 암종 세포, ATCC-CRL-1848, 표준 배지: RPMI 1640 (바이오크롬; #FG1215, stab. 글루타민) + 10% FCS (시그마; #F2442), TWEAKR-양성; EGFR-양성.
BxPC3: 인간 췌장 암종 세포, ATCC-CRL-1687, 표준 배지: RPMI 1640 (바이오크롬; #FG1215, stab. 글루타민) + 10% FCS (시그마; #F2442), TWEAKR-양성.
LoVo: 인간 결장직장암 세포, ATCC 번호 CCL-229, MTT 검정을 위한 배양: 표준 배지: 카인 + L-글루타민 (인비트로젠 21127) + 10% 열 불활성화 FCS (깁코(Gibco)로부터의 것, 번호 10500-064). CTG 검정을 위한 배양: RPMI 1640 (바이오크롬; #FG1215, stab. 글루타민) + 10% FCS (시그마 #F2442). TWEAKR-양성.
KPL4: 인간 유방 암 세포주, 바이엘 파마 아게(Bayer Pharma AG) (DSMZ에서 2012년 7월 19일에 정체가 조사 및 확인됨), 표준 배지: RPMI 1640 (깁코로부터의 것; #21875-059, stab. L-글루타민) + 10% 열 불활성화 FCS (깁코, 번호 10500-064); HER2-양성.
SK-HEP-1: 인간 간 세포 암 세포주, ATCC 번호 HTB-52, 표준 배지: 얼 염 + 글루타맥스 I (인비트로젠 41090) + 10% 열 불활성화 FCS (깁코로부터의 것, 번호 10500-064)를 갖는 MEM; EGFR-양성, TWEAKR-양성.
MOLM-13: 인간 급성 단핵구성 백혈병 세포 (AML-M5a), DSMZ, 번호 ACC 554, 표준 배지: RPMI 1640 (깁코로부터의 것; #21875- 059, stab. L-글루타민) + 20% 열 불활성화 FCS (깁코, 번호 10500-064); CD123-양성.
MV-4-11: 말초 혈액으로부터 수득된 인간 이중표현형 B 골수단핵구성 백혈병 세포, ATCC-CRL-9591, 표준 배지: IMDM (ATCC: 30-2005) + 10% 열 불활성화 FCS (깁코, 번호 10500-064); CD123-양성.
NB4: 골수로부터 수득된 인간 급성 전골수구성 백혈병 세포, DSMZ, 번호 ACC 207, 표준 배지: RPMI 1640 + 글루타맥스 I (인비트로젠 61870) + 10% 열 불활성화 FCS (깁코, 번호 10500-064) + 2.5 g의 글루코스 (20% 글루코스 용액, 깁코, 번호 19002) + 10 mM Hepes (인비트로젠 15630) + 1 mM 피루브산나트륨 (인비트로젠 11360); CD123-음성.
Rec-1: 인간 외투 세포 림프종 세포 (B 세포 비-호지킨 림프종) ATCC CRL-3004, 표준 배지: RPMI 1640 + 글루타맥스 I (인비트로젠 61870) + 10% 열 불활성화 FCS (깁코, 번호 10500-064) + 10 mM), CXCR5-양성.
U251: 인간 교모세포종 세포, 표준 배지: RPMI 1640 (바이오크롬; #FG1215, stab. 글루타민) + 10% FCS (바이오크롬; #S0415), B7H3-양성.
HBL-1: 인간 B 세포 림프종 세포 (미만성 대 B-세포 림프종) ATT CRL-RRID (자원 식별 계획(Resource Identification Initiative)): 뮌스터 대학교 렌츠 교수로부터 얻은, 문헌 [Abe et al. Cancer 61:483-490(1988)]에 최초 기재된 CVCL_4213: 표준 배지: RPMI 1640 (바이오크롬; #FG1215, stab. 글루타민) + 10% FCS (바이오크롬; #S0415), Rec-1 세포와 유사한 배양; CXCR5 양성.
해당 세포주에 대해 아메리칸 티슈 컬쳐 콜렉션(American Tissue Culture Collection) (ATCC) 또는 라이프니츠-인스티튜트 DSMZ-도이체 잠룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하(Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) (DSMZ)에 의해 언급된 바와 같은 표준 방법에 의해 세포를 배양하였다.
CTG 검정
세포를 표준 방법에 의해 C-1 하에 명시된 성장 배지를 사용하여 배양하였다. PBS 중 트립신 (0.05%) 및 EDTA (0.02%)의 용액 (바이오크롬 아게 #L2143)으로 세포를 분리시키고, 펠릿화하고, 배양 배지 중에 재현탁시키고, 계수하고, 백색 바닥을 갖는 96-웰 배양 플레이트 (코스타(Costar) #3610)에 뿌리고 (75 μl/웰, 웰당 하기 세포 수로 수행함: NCI-H292: 2500개 세포/웰, BxPC3 2500개 세포/웰, LoVo 3000개 세포/웰), 인큐베이터 내에서 37℃ 및 5% 이산화탄소에서 인큐베이션함으로써 시험을 수행하였다. 현탁 세포를 계수하고, 백색 바닥을 갖는 96-웰 배양 플레이트 (코스타 #3610)에 뿌렸다 (75 μl/웰, 웰당 하기 세포 수로 수행함: Rec-1: 3000개 세포/웰, HBL-1: 6000개 세포/웰). 24시간 후, 항체 약물 접합체를 25 μl의 배양 배지 (4-배 농축됨) 내 세포에 첨가하여 세포에 대해 3 x 10-7 M 내지 3 x 10-11 M의 최종 항체 약물 접합체 농도를 수득하였다 (삼중). 이어서, 세포를 인큐베이터 내에서 37℃ 및 5% 이산화탄소에서 인큐베이션하였다. 병행 플레이트 상에서, 약물 처리의 시작 시 (제0일) 세포 활성을 셀 타이터 글로(Cell Titer Glow) (CTG) 발광 세포 생존율 검정 (프로메가(Promega) #G7573 및 #G7571)을 사용하여 결정하였다. 이를 위해, 세포 배치당 100 μl의 기질을 첨가한 다음, 플레이트를 알루미늄 호일로 덮고, 플레이트 진탕기 상에서 180 rpm으로 2분 동안 진탕시키고, 실험실 벤치에 8분 동안 정치되도록 한 다음, 발광측정기 (빅터(Victor) X2, 퍼킨 엘머(Perkin Elmer))를 사용하여 측정하였다. 기질은 살아있는 세포에서 ATP 함량을 검출하여 발광 신호를 생성하며 이의 강도는 세포의 생존율에 정비례한다. 항체 약물 접합체와 72시간 동안 인큐베이션한 후에, 이어서 이들 세포의 생존율을 상기 기재된 바와 같은 셀 타이터 글로우 발광 세포 생존율 검정을 사용하여 또한 결정하였다. 측정된 데이터로부터, DRC (용량 반응 곡선) 분석 스프레드시트 및 4-파라미터 피트를 사용하여 제0일과 비교하여 성장 억제의 IC50을 계산하였다. DRC 분석 스프레드시트는 IDBS E-워크북 스위트 플랫폼(IDBS E-WorkBook Suite platform) (IDBS: ID 비지니스 솔루션즈 리미티드(ID Business Solutions Ltd.), 영국 길포드) 상의 바이엘 파마 아게 및 바이엘 비즈니스 서비시즈(Bayer Business Services)에 의해 개발된 바이오북 스프레드시트이다.
MTT 검정
세포를 표준 방법에 의해 C-1 하에 명시된 성장 배지를 사용하여 배양하였다. PBS 중 아큐타제의 용액 (바이오크롬 아게 #L2143)으로 세포를 분리시키고, 펠릿화하고, 배양 배지 중에 재현탁시키고, 계수하고, 백색 바닥을 갖는 96-웰 배양 플레이트 (코스타 #3610)에 뿌림으로써 (총 부피 100 μl 중, NCI H292: 2500개 세포/웰; SK-HEP-1: 1000개 세포/웰; KPL-4: 1200개 세포/웰) 시험을 수행하였다. 이어서, 세포를 인큐베이터 내에서 37℃ 및 5% 이산화탄소에서 인큐베이션하였다. 48시간 후, 배지를 대체하였다. 이어서, 항체 약물 접합체를 10 μl의 배양 배지 중 10-5M 내지 10-13M의 농도로 세포에 피펫팅한 다음 (삼중으로), 검정물을 인큐베이터 내에서 37℃ 및 5% 이산화탄소에서 인큐베이션하였다. 현탁 세포를 계수하고, 백색 바닥을 갖는 96-웰 배양 플레이트 (코스타 #3610) (#3610)에 뿌렸다 (총 부피 100 μl 중 MOLM-13: 2000개 세포/웰; NB4: 7000개 세포/웰; MV-4-11: 5000개 세포/웰). 37℃ 및 5% 이산화탄소에서의 6시간 인큐베이션 후에, 배지를 교체하고, 항체-약물 접합체 또는 대사물을 10 μl의 배양 배지 중 10-5M 내지 10-13M의 농도로 90 μl의 세포에 피펫팅하여 (삼중으로) 첨가하였다. 이어서, 배치를 인큐베이터 내에서 37℃ 및 5% 이산화탄소에서 인큐베이션하였다. 96시간 후, 세포 증식을 MTT 검정 (ATCC, 미국 버지니아주 마나사스, 카탈로그 번호 30-1010K)을 사용하여 검출하였다. 이를 위해, MTT 시약을 세포와 함께 4시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 세제를 첨가하여 세포를 밤새 용해시켰다. 형성된 염료를 570 nm에서 검출하였다 (인피니트 M1000 프로(Infinite M1000 pro), 테칸(Tecan)). 측정된 데이터를 사용하여 DRC (용량 반응 곡선)를 사용하여 성장 억제의 IC50을 계산하였다. 시험 물질로 처리되지 않았지만 그 외에는 동일하게 처리된 세포의 증식을 100% 수치로서 정의하였다.
하기 표 1a 및 1b는 이들 검정으로부터의 대표적인 작업 실시예에 대한 IC50 값을 기재한다:
표 1a
Figure 112023060817933-pat00077
Figure 112023060817933-pat00078
Figure 112023060817933-pat00079
표 1b
Figure 112023060817933-pat00080
하기 표 1c는 이들 검정으로부터의 참조 실시예의 IC50 값을 열거한다.
표 1c
Figure 112023060817933-pat00081
보고된 활성 데이터는 나타낸 약물/mAB 비를 갖는, 본 실험 섹션에 기재된 작업 실시예에 관한 것이다. 값은 상이한 약물/mAB 비에서 벗어날 수도 있다. IC50 값은 여러 독립적 실험의 평균 또는 개별 값이다. 항체 약물 접합체의 작용은 각각의 링커 및 독성단을 포함하는 각각의 이소형 대조군에 대해 선택적이었다. CD123에 대하여 지시된 ADC의 경우, CD123-음성 세포를 사용하여 시험함으로써 표적 특이성을 추가적으로 입증하였다.
일반적으로, 본 발명에 따른 ADC는 상응하는 참조 실시예와 비교하여 유의하게 개선된 세포독성 효력을 나타낸다.
C-1b 선택된 실시예에 의한 키네신 스핀들 단백질 KSP/Eg5의 억제의 결정
인간 키네신 스핀들 단백질 KSP/Eg5 (테부-바이오(tebu-bio)/시토스켈레톤 인크(Cytoskeleton Inc), 번호 027EG01-XL)의 모터 도메인을 10 nM의 농도로, 50 μg/ml 탁솔 (시그마 번호 T7191-5MG)로 안정화된 미세관 (소 또는 돼지, 테부-바이오/시토스켈레톤 인크)과 함께 15 mM PIPES, pH 6.8 (5 mM MgCl2 및 10 mM DTT, 시그마) 중에서 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 새로 제조된 혼합물을 384 MTP (코닝(Corning)으로부터의 것) 내로 분취하였다. 이어서, 1.0 x 10-6 M 내지 1.0 x 10-13 M의 농도의 검사될 억제제 및 ATP (최종 농도 500 μM, 시그마)를 첨가하였다. 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 말라카이트 그린 (바이오몰(Biomol))을 사용하여 형성된 무기 포스페이트를 검출함으로써 ATPase 활성을 검출하였다. 시약을 첨가한 후, 검정물을 실온에서 50분 동안 인큐베이션한 다음, 620 nm의 파장에서의 흡수를 검출하였다. 사용된 양성 대조군은 모나스트롤 (시그마, M8515-1mg) 및 이스피네시브 (아두큐 바이오사이언스(AdooQ Bioscience) A10486)였다. 용량-활성 곡선의 개별 데이터는 8-배 결정치이다. IC50 값은 2회의 독립적 실험의 평균이다. 100% 대조군은 억제제로 처리되지 않은 샘플이었다.
하기 표 2는 기재된 검정으로부터의 대표적인 작업 실시예의 IC50 값을 열거하고, 상응하는 세포독성 데이터 (MTT 검정)를 요약한다:
표 2
Figure 112023060817933-pat00082
보고된 활성 데이터는 본 실험 섹션에 기재된 작업 실시예에 관한 것이다.
C-1c 효소적 검정
a: 카텝신 B 검정
검사될 모든 카텝신 B-절단가능한 전구약물에 대해, 혼합물을 마이크로 반응 용기 (0.5 ml, 에펜도르프(Eppendorf)로부터의 것)에서 구성하였다. 여기서 사용된 효소는 인간 간 조직으로부터 수득하였다. 2 μg의 카텝신 B (시그마 C8571 25 μg)를 처음에 충전하고 50mM Na 포스페이트 완충제, pH6.0, 2 mM DTT에 의해 200 μl의 총 부피를 구성하였다. 이어서 검사될 50 μl의 기질 용액을 피펫팅하였다. 혼합물을 300 rpm으로의 일정한 교반 하에 40℃에서 써모블록 (써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific))에서 인큐베이션하였다. 효소적 반응을 동역학적으로 제어하였다. 이러한 목적을 위해, 10 μl 샘플을 상이한 시점에 취하였다. 효소적 반응을 정지시키기 위해 취한 샘플을 즉시 20 μl의 빙냉 메탄올과 혼합한 다음, -20℃에서 동결시켰다. 샘플링을 위해 선택된 시점은 10분, 2시간, 4시간 및 24시간 후였다. 이어서, 샘플을 RP-HPLC 분석 (역상 HPLC, 애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies) 1200 시리즈)에 의해 분석하였다. 방출된 독성단의 결정으로 효소적 반응의 반감기 t1/2의 결정이 가능해졌다.
b: 레구마인 검정
레구마인 검정을 재조합 인간 효소로 수행하였다. rh레구마인 효소 용액 (카탈로그 # 2199-CY, 알앤디 시스템즈(R&D Systems))을 50mM Na 아세테이트 완충제/100mM NaCl, pH4.0 중에서 목적하는 농도로 희석하고, 37℃에서 2시간 동안 사전인큐베이션하였다. 이어서, rh레구마인을 50 mM MES 완충제, 250 mM NaCl, pH 5.0 중 1 ng/μl의 최종 농도로 조정하였다. 검사될 모든 레구마인-절단가능한 전구약물에 대해, 혼합물을 마이크로 반응 용기 (0.5 ml, 에펜도르프로부터의 것)에서 구성하였다. 이러한 목적을 위해, 기질 용액을 50 mM MES 완충제, 250 mM NaCl, pH 5.0을 사용하여 목적하는 농도 (배수 농도)로 조정하였다. 효소적 반응의 동역학적 측정을 위해, 250 μl의 레구마인 용액을 먼저 처음에 충전하고, 250 μl의 기질 용액을 첨가함으로써 효소 반응을 시작하였다 (최종 농도: 단일 농도; 3 μM). 다양한 시점에서, 50 μl 샘플을 취하였다. 효소적 반응을 정지시키기 위해 이 샘플에 즉시 100 μl의 빙냉 메탄올을 첨가한 다음, 샘플을 -20℃에서 동결시켰다. 샘플링을 위해 선택된 시점은 0.5시간, 1시간, 3시간 및 24시간 후였다. 이어서, 샘플을 RP-HPLC 분석 및 LC-MS 분석에 의해 분석하였다. 방출된 독성단의 결정으로 효소적 반응의 반감기 t1/2의 결정이 가능해졌다.
레구마인-매개 절단을 제시하기 위한 대표적인 실시예로서, 레구마인 검정에서 생산된 기질은 모델 화합물 A 및 B였다.
참조 실시예 모델 화합물 A
N-(피리딘-4-일아세틸)-L-알라닐-L-알라닐-N1-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-(메틸아미노)-1-옥소부탄-2-일]-L-아스파르트아미드
Figure 112023060817933-pat00083
우선, 트리플루오로아세트산 (2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-N-메틸부탄아미드를 WO 2015096982 A1에 기재된 바와 같이 제조하였다. 후속적으로, 이 중간체를 사용하여 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서 중간체 L103에 커플링시킴으로써 표제 화합물을 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.86분; MS (ESIpos): m/z = 902 [M+H]+.
참조 실시예 모델 화합물 B
N-(피리딘-4-일아세틸)-L-알라닐-N-메틸-L-알라닐-N1-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-(메틸아미노)-1-옥소부탄-2-일]-L-아스파르트아미드
Figure 112023060817933-pat00084
우선, 트리플루오로아세트산 (2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-N-메틸부탄아미드를 WO 2015096982 A1에 기재된 바와 같이 제조하였다. 후속적으로, 이 중간체를 사용하여 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서 중간체 L118에 커플링시킴으로써 표제 화합물을 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.83분; MS (ESIpos): m/z = 916 [M+H]+.
모델 화합물 A는 레구마인에 대해 상기 기재된 조건 하에 0.4시간의 반감기로 표적 화합물로 절단되었다.
Figure 112023060817933-pat00085
모델 화합물 B는 레구마인에 대해 상기 기재된 조건 하에 0.5시간의 반감기로 표적 화합물로 절단되었다.
Figure 112023060817933-pat00086
C-2 내재화 검정
내재화는 항체 약물 접합체 (ADC)를 통한 항원-발현 암 세포에서의 세포독성 페이로드의 특이적이고 효율적인 제공을 가능하게 하는 주요 과정이다. 이러한 과정은 특이적 항체 및 이소형 대조군 항체의 형광 표지를 통해 모니터링된다. 먼저, 형광 염료를 항체의 리신에 접합시켰다. pH 8.3에서의 2배 내지 10배 몰 과량의 CypHer 5E 모노 NHS 에스테르 (배치 357392, 지이 헬스케어)를 사용하여 접합을 수행하였다. 커플링 후에, 반응 혼합물을 겔 크로마토그래피 (제바 스핀 탈염 칼럼, 40K, 써모 사이언티픽, 번호 87768; 용리 완충제: 둘베코 PBS, 시그마-알드리치, 번호 D8537)에 의해 정제하여, 과량의 염료를 제거하고 pH를 조정하였다. 비바스핀 500 칼럼 (사르토리우스 스테딤 바이오테크(Sartorius stedim biotec))를 사용하여 단백질 용액을 농축시켰다. 항체의 염료 로드를 분광광도측정법 분석 (나노드롭으로부터의 것) 및 후속 계산 (D/P = A염료 ε단백질:(A280-0.16A염료)ε염료)에 의해 결정하였다.
여기서 검사된 항체 및 이소형 대조군의 염료 로드는 대등한 자릿수였다. 세포 결합 검정에서, 커플링이 항체의 친화도에 어떠한 변화도 유도하지 않았다는 것을 확인하였다.
표지된 항체를 내재화 검정에 사용하였다. 처리의 시작 전에, 세포 (2 x 104개/웰)를 96-웰 MTP (편평, 흑색, 투명 바닥 번호 4308776, 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)로부터의 것) 내 100 μl 배지에 뿌렸다. 37℃/5%CO2에서 18시간 인큐베이션 후, 배지를 대체하고, 표지된 항체를 상이한 농도 (10, 5, 2.5, 1, 0.1 μg/ml)로 첨가하였다. 동일한 처리 프로토콜을 표지된 이소형 대조군 (음성 대조군)에 적용하였다. 선택된 인큐베이션 시간은 0시간, 0.25시간, 0.5시간, 1시간, 1.5시간, 2시간, 3시간, 6시간 및 24시간이었다. 형광 측정을 인셀애널라이저(InCellAnalyzer) 1000 (지이 헬스케어로부터의 것)을 사용하여 수행하였다. 이어서 파라미터 과립 수/세포 및 총 과립 강도/세포의 측정을 통해 동역학적으로 평가하였다.
수용체에 결합한 후, 항체를 그의 내재화 능력에 대해 검사하였다. 이러한 목적을 위해, 상이한 수용체 발현 수준을 갖는 세포를 선택하였다. 항체에 의해 표적-매개 특이적 내재화가 관찰된 반면에, 이소형 대조군은 어떠한 내재화도 나타내지 않았다.
C-2b 현탁된 세포를 사용한 내재화 검정
C2 하에 기재된 바와 같이 형광 염료의 커플링을 수행하였다. 검사될 항원은 조혈 현탁 세포에 의해 발현되고; 따라서, FACS-기반 내재화 검정에서 내재화를 검사하였다.
상이한 표적 발현 수준을 갖는 세포를 검사하였다. 세포 (5x104개/웰)를 100 μl의 총 부피로 96-MTP (그라이너 바이오-원(Greiner bio-one), 셀스타(CELLSTAR), 650 180, U-바닥)에 뿌렸다. 10 μg/ml의 최종 농도로 표적-특이적 항체의 첨가 후에, 배치를 37℃에서 상이한 기간 동안 (1시간, 2시간, 6시간, 삼중으로) 인큐베이션하였다. 이소형 대조군을 동일한 조건 하에 처리하였다. 병행 배치를 4℃에서 일정하게 처리 및 인큐베이션하였다 (음성 대조군). 구아바(Guava) 유동 세포측정기 (밀리포어(Millipore))를 사용하여 FACS 분석을 수행하였다. 형광 강도를 측정함으로써 동역학적 평가를 수행하고, 구아바소프트 2.6 소프트웨어 (밀리포어)를 사용하여 평가를 실시하였다. 본원에 기재된 표적 및 표적-특이적 항체의 경우, 다양한 세포에서 유의하고 특이적인 내재화가 검출되었고; 이소형 대조군은 어떠한 내재화도 나타내지 않았다.
C-2c 항-CD123 항체의 공동-국재화 검정
링커로 인해, 항체-약물 접합체의 활성 대사물은 리소솜 분해에 의해 생성된다. 따라서, 내재화가 일어난 후 세포내 트래픽킹이 필수적으로 중요하다. 리소솜 소기관에 특이적인 표지 (예를 들어 표면 분자 또는 소형 GTPase)를 사용하는 항체의 공동-국재화에 대한 연구는 목적하는 프로파일을 갖는 항체의 선택을 가능하게 한다. 이를 위해, 100 μl의 총 부피로 표적-양성 세포 (5x104개/웰)를 96-MTP (그라이너 바이오-원, 셀스타, 650 180, U-바닥)에 뿌렸다. CypHer5E-표지된 항-표적 항체 (최종 농도 20 μg/ml)의 첨가 후, 배치 (시점당 이중)를 인큐베이터 (5% CO2) 내에서 37℃에서 30분, 2시간 및 6시간 동안 인큐베이션하였다. 선택된 인큐베이션 시간의 종료 30분 전에, 리소솜-특이적 표지를 검사될 배치에 첨가하였다. 리소솜을 시토페인터 리소그린(CytoPainter LysoGreen) 지시 시약 (최종 농도 1:2000; 압캠(abcam), ab176826)으로 염색하였다. 인큐베이션 후, 200 μl의 빙냉 FACS 완충제 (둘베코 PBS, 시그마-알드리치, 번호 D8537 + 3% FBS 열 불활성화 FBS, 깁코, 번호 10500-064)를 첨가하고, 세포 현탁액을 400 x g 및 4℃에서 5분 동안 원심분리하였다. 세포 펠릿을 300 μl 빙냉 FACS 완충제 중에 재현탁시키고, 다시 원심분리하였다 (4분, 4℃에서 400 x g). 원심분리 후, 상청액을 폐기하고, 세포 펠릿을 30 μl의 빙냉 FACS 완충제 중에 취하였다. 이어서, 샘플을 즉시 FACS/이미지 분석 (플로우사이트 암니스(FlowSight amnis), 밀리포어)에 적용하였다. 특별한 소프트웨어 (공동-국재화 소프트웨어 IDEAS 어플리케이션 v6.1)를 사용하여 공동-국재화를 평가하였다. 표 3은 항-CD123 항체에 대한 예시적인 방식으로 본 검정으로부터의 결과를 요약한다.
표 3
Figure 112023060817933-pat00087
인간화 항체 TPP-9476 및 TPP-8987은 모 뮤린 항체와 비교하여 현저하게 개선된 프로파일을 나타낸다.
C-3 세포 투과성을 결정하기 위한 시험관내 시험
물질의 세포 투과성은 Caco-2 세포를 사용하여 유동 검정에서 시험관내 시험에 의해 조사될 수 있다 [M.D. Troutman and D.R. Thakker, Pharm. Res. 20 (8), 1210-1224 (2003)]. 이러한 목적을 위해, 세포를 24-웰 필터 플레이트 상에서 15-16일 동안 배양하였다. 투과의 결정을 위해, 각각의 시험 물질을 HEPES 완충제 중에서 세포에 정단으로 (A) 또는 기저로 (B) 적용하고, 2시간 동안 인큐베이션하였다. 0시간 후 및 2시간 후, 샘플을 시스 및 트랜스 구획으로부터 취하였다. 샘플을 역상 칼럼을 사용하여 HPLC (애질런트 1200, 독일 뵈블링엔)에 의해 분리하였다. HPLC 시스템을 터보 이온 스프레이 인터페이스를 통해 삼중 사중극자 질량 분광계 API 4000 (에이비 사이엑스 도이칠란트 게엠베하(AB SCIEX Deutschland GmbH), 독일 다름슈타트)에 커플링시켰다. 투과성을 Papp 값에 기초하여 평가하였으며, 이는 문헌 [Schwab et al. [D. Schwab et al., J. Med. Chem. 46, 1716-1725 (2003)]]에 공개된 식을 사용하여 계산되었다. Papp (A-B)에 대한 Papp (B-A)의 비 (유출 비)가 > 2 또는 < 0.5인 경우에 물질이 능동 수송되는 것으로 분류하였다.
세포내 방출된 독성단에 대해 B에서 A로의 투과성 [Papp (B-A)] 및 Papp (A-B)에 대한 Papp (B-A)의 비 (유출 비)가 매우 중요하다: 이 투과성이 더 낮을수록, Caco-2 세포의 단층을 통한 물질의 능동 및 수동 수송 과정이 더 느려, 세포내 방출 후 물질이 더 오랫동안 세포에 남아있게 된다. 더 오랫동안 세포에 남아있는 대사물로 인해, 생화학적 표적 (여기서: 키네신 스핀들 단백질 KSP / Eg5)과의 상호작용의 확률이 증가되어, 개선된 세포독성 작용을 가져온다.
하기 표 4는 본 검정으로부터의 대표적인 작업 실시예에 대한 투과성 데이터를 기재한다:
표 4
Figure 112023060817933-pat00088
본 발명에 따른 결합제-약물 접합체로부터 형성될 수 있는 대사물 M1은 참조 실시예 2의 결합제-약물 접합체로부터 형성될 수 있는 참조 대사물 R3M과 비교하여 감소된 세포로부터의 수송 및 감소된 유출 비 둘 다를 나타낸다.
C-4 P-당단백질 (P-gp)에 대한 기질 특성을 결정하기 위한 시험관내 시험
많은 종양 세포는 약물을 위한 수송체 단백질을 발현하고, 이는 빈번하게 세포증식억제제에 대한 저항성의 발생을 동반한다. 따라서 이러한 수송체 단백질, 예컨대 P-당단백질 (P-gp) 또는 BCRP의 기질이 아닌 물질은, 예를 들어 개선된 활성 프로파일을 나타낼 수 있다.
P-gp (ABCB1)에 대한 물질의 기질 특성을 P-gp를 과다발현하는 LLC-PK1 세포 (L-MDR1 세포)를 사용하여 유동 검정에 의해 결정하였다 [A.H. Schinkel et al., J. Clin. Invest. 96, 1698-1705 (1995)]. 이러한 목적을 위해, LLC-PK1 세포 또는 L-MDR1 세포를 96-웰 필터 플레이트 상에서 3-4일 동안 배양하였다. 투과의 결정을 위해, 각각의 시험 물질을, 단독으로 또는 억제제 (예컨대, 예를 들어 이베르멕틴 또는 베라파밀)의 존재 하에, HEPES 완충제 중에서 세포에 정단으로 (A) 또는 기저로 (B) 적용하고, 2시간 동안 인큐베이션하였다. 0시간 후 및 2시간 후, 샘플을 시스 및 트랜스 구획으로부터 취하였다. 샘플을 역상 칼럼을 사용하여 HPLC에 의해 분리하였다. HPLC 시스템을 터보 이온 스프레이 인터페이스를 통해 API 3000 삼중 사중극자 질량 분광계 (어플라이드 바이오시스템즈 어플레라(Applied Biosystems Applera), 독일 다름슈타트)에 커플링시켰다. 투과성을 Papp 값에 기초하여 평가하였으며, 이는 문헌 [Schwab et al. [D. Schwab et al., J. Med. Chem. 46, 1716-1725 (2003)]]에 공개된 식을 사용하여 계산되었다. Papp (A-B)에 대한 Papp (B-A)의 유출 비가 > 2인 경우에 물질을 P-gp 기질로서 분류하였다.
P-gp 기질 특성의 평가에 대한 추가의 기준으로서, L-MDR1 및 LLC-PK1 세포에서의 유출 비 또는 억제제의 존재 또는 부재 하의 유출 비를 비교할 수 있다. 이들 값이 2배 초과로 상이한 경우에, 해당 물질은 P-gp 기질이다.
C-5 약동학
수컷 위스타 래트에 실시예 2c-9476 (DAR 6.3) 및 실시예 2c-9476 (DAR 3.4)의 5 mg/kg의 i.v. 투여 후에, ADC의 혈장 농도를 ELISA에 의해 측정하고, 약동학적 파라미터, 예컨대 클리어런스 (CL), 곡선하 면적 (AUC) 및 반감기 (t1/2)를 계산하였다.
표 5는 DAR 6.3 및 DAR 3.4를 갖는 실시예 2c-9476의 약동학적 파라미터를 요약한다.
표 5
래트에 대한 이러한 탐색적 PK 연구에서, 둘 다의 실시예의 경우 i.v. 투여 후에 전형적인 IgG 프로파일이 관찰되었다. DAR 6.3을 갖는 실시예 2c-9476과 DAR 3.4를 갖는 실시예 2c-9476 사이에 어떠한 유의차도 관찰되지 않았다.
사용된 ADC의 정량화를 위한 분석
ADC의 항체 부분을 리간드 결합 검정 (ELISA)을 사용하여 혈장 샘플 및 종양 용해물 중 총 IgG 농도로서 결정하였다. 여기서, 샌드위치 ELISA 포맷을 사용하였다. 이 ELISA를 혈장 및 종양 샘플 중에서의 결정에 대해 정량화 및 검증하였다. ELISA 플레이트를 항-인간 염소 IgG Fc 항체로 코팅하였다. 샘플과 함께 인큐베이션한 후에, 플레이트를 세척하고, 원숭이 항-인간 IgG(H+L) 항체 및 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)의 검출 접합체와 함께 인큐베이션하였다. 추가의 세척 단계 후에, HRP 기질을 OPD에 첨가하고, 발색을 490 nm에서의 흡광도를 통해 모니터링하였다. 기지의 IgG 농도를 갖는 표준 샘플을 4-파라미터 방정식을 사용하여 피팅하였다. 정량화 하한 (LLOQ) 및 상한 (ULOQ) 내에서, 미지의 농도를 내삽에 의해 결정하였다.
C5a: 시험관내 내재화 후 ADC 대사물의 확인
방법 설명:
면역접합체를 사용한 내재화 연구를 수행하여 세포내에서 형성된 대사물을 분석한다. 이를 위해, 인간 폐 종양 세포 NCI H292 (3x105개/웰)를 6-웰 플레이트에 뿌리고, 밤새 인큐베이션한다 (37℃, 5% CO2). 세포를 10 μg/ml (66 nM)의 검사될 ADC로 처리한다. 내재화를 37℃ 및 5% CO2에서 수행하였다. 추가의 분석을 위해 세포 샘플을 다양한 시점 (0, 4, 24, 48, 72시간)에 취한다. 우선, 상청액 (약 5 ml)을 수거하고, 원심분리 (2분, 실온, 1000 rpm 헤라우스 바리오퓨즈(Heraeus Variofuge) 3.0R) 후, -80℃에서 보관한다. 세포를 PBS로 세척하고, 아큐타제로 분리시키고, 세포 수를 결정한다. 추가의 세척 후에, 한정된 수의 세포 (2 x 105개)를 100 ml의 용해 완충제 (포유동물 세포 용해 키트 (시그마 MCL1))로 처리하고, 계속 진탕시키면서 (써모믹서, 15분, 4℃, 650 rpm) 프로테인 로바인드 튜브 (에펜도르프 카탈로그 번호 0030 108.116)에서 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 용해물을 원심분리하고 (10분, 4℃, 12000 g, 에펜도르프 5415R), 상청액을 수거한다. 수득된 상청액을 -80℃에서 보관한다. 이어서, 모든 샘플을 하기와 같이 분석한다.
50 μl의 배양물 상청액/세포 용해물의 후처리를 위해, 150 μl의 침전 시약 (메탄올)을 첨가하고, 혼합물을 10초 동안 진탕시킨다. 침전 시약은 적합한 농도 (일반적으로 20-100 μg/l의 범위)로 내부 표준 (ISTD)을 함유한다. 1881 g에서 10분 동안 원심분리 후, 상청액을 오토샘플러 바이알로 옮기고, 용리액에 맞는 300 μl의 완충제로 구성하고, 다시 진탕시키고, 1881 g에서 10분 동안 원심분리한다.
세포 용해물 및 상청액 샘플을 최종적으로 에이비 사이엑스 도이칠란트 게엠베하로부터의 HPLC-커플링된 API6500 삼중-사중극자 질량 분광계를 사용하여 분석한다.
보정을 위해, 블랭크 용해물 또는 블랭크 상청액을 적절한 농도 (0.1-1000 μg/l)로 혼합한다. 검출 한계 (LLOQ)는 약 0.2 μg/l이다.
유효성을 시험하기 위한 품질 대조군은 4 및 40 μg/l을 함유한다.
C5b: 생체내 ADC 대사물의 확인
3-30 mg/kg의 상이한 ADC의 i.v. 투여 후에, ADC 및 발생하는 임의의 대사물의 혈장 및 종양 농도를 측정할 수 있고, 약동학적 파라미터, 예컨대 클리어런스 (CL), 곡선하 면적 (AUC) 및 반감기 (t1/2)를 계산할 수 있다.
잠재적 대사물의 정량화를 위한 분석
혈장, 종양, 간 및 신장에서의 화합물의 분석은 일반적으로 메탄올에 의한 단백질의 침전 후 삼중-사중극자 질량 분광계 (MS)에 커플링된 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 수행된다.
50 μl의 혈장의 후처리를 위해, 150 μl의 침전 시약 (일반적으로 메탄올)을 첨가하고, 혼합물을 10초 동안 진탕시킨다. 침전 시약은 적합한 농도 (일반적으로 20-100 μg/l의 범위)로 내부 표준 (ISTD)을 함유한다. 1881 g에서 10분 동안 원심분리 후, 상청액을 오토샘플러 바이알로 옮기고, 용리액에 맞는 300 μl의 완충제로 구성하고, 다시 진탕시킨다.
종양 또는 기관 물질의 후처리에서, 특정한 물질을 3-20배의 양의 추출 완충제와 혼합한다. 추출 완충제는 50 ml의 조직 단백질 추출 시약 (피어스(Pierce), 일리노이주 록포드), 2개의 펠릿의 완전-프로테아제-억제제-칵테일 (로슈 다이아그노스틱스 게엠베하(Roche Diagnostics GmbH), 독일 만하임) 및 페닐메틸술포닐 플루오라이드 (시그마, 미주리주 세인트루이스)를 1 mM의 최종 농도로 함유한다. 조직 유형 (경질: 종양; 연질: 간, 신장)에 따라, 프리셀리스(Prescellys) 24 용해 및 균질화 시스템 (베르탱 테크놀로지스(Bertin Technologies))의 용해 및 균질화 프로그램을 선택한다 (www.prescellys.com). 균질화된 샘플을 4℃에서 밤새 정치시킨다. 50 μl의 균질물을 오토샘플러 바이알로 옮기고, ISTD를 포함하는 150 μl의 메탄올로 구성하고, 10초 동안 교반한 다음, 5분 동안 정치시킨다. 300 μl의 아세트산암모늄 완충제 (pH 6.8)를 첨가하고 간단하게 교반한 후, 샘플을 1881 g에서 10분 동안 원심분리한다.
보정을 위해, 혈장 샘플을 위한 혈장 및 조직 샘플을 위한 상응하는 블랭크 매트릭스를 0.6-1000 μg/l의 농도로 혼합한다. 샘플 유형 또는 조직 유형에 따라, 검출 한계 (LOQ)는 1 내지 20 μg/l이다.
혈장 및 매트릭스 샘플을 최종적으로 에이비 사이엑스 도이칠란트 게엠베하로부터의 HPLC-커플링된 API4500 삼중-사중극자 질량 분광계를 사용하여 분석한다.
유효성을 시험하기 위한 품질 대조군은 4, 40 및 400 μg/l을 함유한다.
표 6은 MOLM-13 이종이식편 마우스 모델에서 실시예 2c-9476으로부터의 ADC의 5 mg/kg의 투여 24시간 후에 종양, 간, 신장 및 혈장에서 측정된 대사물 농도를 제시한다 (n=3). 측정된 대사물은 다음과 같다: 대사물 M1. n.c. = 계산되지 않음; LOQ: 정량 한계.
표 6
Figure 112023060817933-pat00090
레구마인-절단가능 링커를 갖는 본 발명에 따른 ADC 실시예 2c-9476의 투여는 다른 건강한 기관/조직과 비교하여 표적 조직 (종양)에서 활성 화합물의 현저하게 선택적인 풍부화를 유도한다.
C-6 생체내 활성 시험
본 발명에 따른 접합체의 활성을, 예를 들어 이종이식편 모델을 사용하여 생체내에서 시험하였다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명에 따른 화합물의 활성을 시험할 수 있는 선행 기술의 방법에 친숙하다 (예를 들어, WO 2005/081711; 문헌 [Polson et al., Cancer Res. 2009 Mar 15;69(6):2358-64] 참조). 이를 위해, 결합제의 표적 분자를 발현하는 종양 세포주를 설치류 (예를 들어 마우스)에 접종하였다. 이어서, 본 발명에 따른 접합체, 이소형 항체 대조군 접합체, 대조군 항체 또는 등장성 염수를 접종된 동물에게 투여하였다. 투여는 1회 또는 1회 초과로 이루어졌다. 수일의 인큐베이션 시간 후, 접합체-처리된 동물과 대조군을 비교함으로써 종양의 크기를 결정하였다. 접합체-처리된 동물은 보다 작은 종양 크기를 나타냈다.
C-6a. 마우스에서의 실험적 종양의 성장 억제 / 퇴행
항체-약물 접합체에 대한 항원을 발현하는 인간 종양 세포를 면역억제된 마우스, 예를 들어 NMRi 누드 또는 SCID 마우스의 측복부 내로 피하로 접종한다. 1-10백만 개의 세포를 세포 배양물로부터 분리시키고, 원심분리하고, 배지 또는 배지 / 매트리겔 중에 재현탁시킨다. 세포 현탁액을 마우스의 피부 아래에 주사한다.
수일 내에, 종양이 성장한다. 처리는 종양이 대략 40 mm2의 종양 크기에서 확립된 후 개시된다. 보다 큰 종양에 대한 효과를 조사하기 위해, 처리는 단지 50-100 mm2의 종양 크기에서 개시될 수 있다.
APDC 및 ADC를 사용한 처리는 마우스의 꼬리 정맥 내로 정맥내 (i.v.) 경로를 통해 수행된다. ADC는 5 ml/kg의 부피로 투여된다.
처리 프로토콜은 항체의 약동학에 좌우된다. 표준으로서 본 발명에 따른 접합체를 사용한 처리를 2 또는 3주 동안 1주에 1회 수행한다. 신속한 평가를 위해, 단일 처리를 사용한 프로토콜이 적합할 수 있다. 그러나, 처리는 또한 계속될 수 있거나, 또는 3일 처리의 제2 사이클이 나중에 이어질 수 있다.
표준으로서 처리군당 8마리의 동물을 사용한다. 활성 물질이 투여되는 군에 더하여, 1개의 군은 단지 완충제만을 갖는 대조군으로서 동일한 프로토콜에 따라 처리된다.
실험 동안, 종양 면적을 캘리퍼를 사용하여 2종의 치수 (길이 / 폭)로 규칙적으로 측정한다. 종양 면적을 길이 x 폭으로서 결정한다. 대조군의 평균 종양 면적에 대한 처리군의 평균 종양 면적의 비는 T/C 면적으로서 언급된다.
처리의 종료 후, 실험의 모든 군이 동시에 종결되는 경우에, 종양은 제거되고 칭량될 수 있다. 대조군의 평균 종양 중량에 대한 처리군의 평균 종양 중량의 비는 T/C 중량으로서 언급된다.
C-6b. 다양한 종양 모델에서의 본 발명에 따른 ADC의 효능
종양 세포 (예를 들어 NCI-H292, REC-1, MOLM-13 및 MV-4-11)를 암컷 NMRI-누드 마우스 (장비에(Janvier))의 측복부 내로 피하로 접종한다. ~ 40 mm2의 종양 크기에서, 항체-약물 접합체를 사용하여 정맥내 처리를 실시한다. 처리 후, 적절한 경우 종양 성장의 모니터링을 계속한다.
본 발명에 따른 ADC를 사용한 처리는 대조군 및 접합된 이소형 대조군 항체와 비교하여 종양 성장의 뚜렷한 억제 및 일부 경우에는 장기-지속되는 억제를 유도한다. 표 7은 처리 시작으로부터 계산된, 각각의 실험 종료 일에서의 종양 면적에 대해 결정된 T/C 값을 제시한다.
표 7
Figure 112023060817933-pat00091
SEQUENCE LISTING <110> Bayer Pharma Aktiengesellschaft <120> Binder-drug conjugates (ADCs) having enzymatically cleavable groups <130> BHC 16 1 067 <160> 116 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody Sequence <400> 1 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody Sequence <400> 2 Asn Tyr Gly Val His 1 5 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody Sequence <400> 3 Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser 1 5 10 15 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody Sequence <400> 4 Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 5 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody Sequence <400> 5 Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn 20 25 30 Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody Sequence <400> 6 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His 1 5 10 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody Sequence <400> 7 Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody Sequence <400> 8 Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr 1 5 <210> 9 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody Sequence <400> 9 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 10 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody Sequence <400> 10 Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn 20 25 30 Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 11 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody Sequence <400> 11 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 12 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody Sequence <400> 12 Asp Thr Tyr Ile His 1 5 <210> 13 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody Sequence <400> 13 Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody Sequence <400> 14 Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 15 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody Sequence <400> 15 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro 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Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 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Gly 225 230 235 240 Val Val His Arg Leu Arg Gln Ala Gln Arg Arg Pro Gln Arg Gln Lys 245 250 255 Ala Val Arg Val Ala Ile Leu Val Thr Ser Ile Phe Phe Leu Cys Trp 260 265 270 Ser Pro Tyr His Ile Val Ile Phe Leu Asp Thr Leu Ala Arg Leu Lys 275 280 285 Ala Val Asp Asn Thr Cys Lys Leu Asn Gly Ser Leu Pro Val Ala Ile 290 295 300 Thr Met Cys Glu Phe Leu Gly Leu Ala His Cys Cys Leu Asn Pro Met 305 310 315 320 Leu Tyr Thr Phe Ala Gly Val Lys Phe Arg Ser Asp Leu Ser Arg Leu 325 330 335 Leu Thr Lys Leu Gly Cys Thr Gly Pro Ala Ser Leu Cys Gln Leu Phe 340 345 350 Pro Ser Trp Arg Arg Ser Ser Leu Ser Glu Ser Glu Asn Ala Thr Ser 355 360 365 Leu Thr Thr Phe 370 <210> 113 <211> 534 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 113 Met Leu Arg Arg Arg Gly Ser Pro Gly Met Gly Val His Val Gly Ala 1 5 10 15 Ala Leu Gly Ala Leu Trp Phe Cys Leu Thr Gly Ala Leu Glu Val Gln 20 25 30 Val Pro Glu Asp Pro Val Val Ala Leu Val Gly Thr Asp Ala Thr Leu 35 40 45 Cys Cys Ser Phe Ser Pro Glu Pro Gly Phe Ser Leu Ala Gln Leu Asn 50 55 60 Leu Ile Trp Gln Leu Thr Asp Thr Lys Gln Leu Val His Ser Phe Ala 65 70 75 80 Glu Gly Gln Asp Gln Gly Ser Ala Tyr Ala Asn Arg Thr Ala Leu Phe 85 90 95 Pro Asp Leu Leu Ala Gln Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Gln Arg Val 100 105 110 Arg Val Ala Asp Glu Gly Ser Phe Thr Cys Phe Val Ser Ile Arg Asp 115 120 125 Phe Gly Ser Ala Ala Val Ser Leu Gln Val Ala Ala Pro Tyr Ser Lys 130 135 140 Pro Ser Met Thr Leu Glu Pro Asn Lys Asp Leu Arg Pro Gly Asp Thr 145 150 155 160 Val Thr Ile Thr Cys Ser Ser Tyr Gln Gly Tyr Pro Glu Ala Glu Val 165 170 175 Phe Trp Gln Asp Gly Gln Gly Val Pro Leu Thr Gly Asn Val Thr Thr 180 185 190 Ser Gln Met Ala Asn Glu Gln Gly Leu Phe Asp Val His Ser Ile Leu 195 200 205 Arg Val Val Leu Gly Ala Asn Gly Thr Tyr Ser Cys Leu Val Arg Asn 210 215 220 Pro Val Leu Gln Gln Asp Ala His Ser Ser Val Thr Ile Thr Pro Gln 225 230 235 240 Arg Ser Pro Thr Gly Ala Val Glu Val Gln Val Pro Glu Asp Pro Val 245 250 255 Val Ala Leu Val Gly Thr Asp Ala Thr Leu Arg Cys Ser Phe Ser Pro 260 265 270 Glu Pro Gly Phe Ser Leu Ala Gln Leu Asn Leu Ile Trp Gln Leu Thr 275 280 285 Asp Thr Lys Gln Leu Val His Ser Phe Thr Glu Gly Arg Asp Gln Gly 290 295 300 Ser Ala Tyr Ala Asn Arg Thr Ala Leu Phe Pro Asp Leu Leu Ala Gln 305 310 315 320 Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Gln Arg Val Arg Val Ala Asp Glu Gly 325 330 335 Ser Phe Thr Cys Phe Val Ser Ile Arg Asp Phe Gly Ser Ala Ala Val 340 345 350 Ser Leu Gln Val Ala Ala Pro Tyr Ser Lys Pro Ser Met Thr Leu Glu 355 360 365 Pro Asn Lys Asp Leu Arg Pro Gly Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys Ser 370 375 380 Ser Tyr Arg Gly Tyr Pro Glu Ala Glu Val Phe Trp Gln Asp Gly Gln 385 390 395 400 Gly Val Pro Leu Thr Gly Asn Val Thr Thr Ser Gln Met Ala Asn Glu 405 410 415 Gln Gly Leu Phe Asp Val His Ser Val Leu Arg Val Val Leu Gly Ala 420 425 430 Asn Gly Thr Tyr Ser Cys Leu Val Arg Asn Pro Val Leu Gln Gln Asp 435 440 445 Ala His Gly Ser Val Thr Ile Thr Gly Gln Pro Met Thr Phe Pro Pro 450 455 460 Glu Ala Leu Trp Val Thr Val Gly Leu Ser Val Cys Leu Ile Ala Leu 465 470 475 480 Leu Val Ala Leu Ala Phe Val Cys Trp Arg Lys Ile Lys Gln Ser Cys 485 490 495 Glu Glu Glu Asn Ala Gly Ala Glu Asp Gln Asp Gly Glu Gly Glu Gly 500 505 510 Ser Lys Thr Ala Leu Gln Pro Leu Lys His Ser Asp Ser Lys Glu Asp 515 520 525 Asp Gly Gln Glu Ile Ala 530 <210> 114 <211> 129 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 114 Met Ala Arg Gly Ser Leu Arg Arg Leu Leu Arg Leu Leu Val Leu Gly 1 5 10 15 Leu Trp Leu Ala Leu Leu Arg Ser Val Ala Gly Glu Gln Ala Pro Gly 20 25 30 Thr Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser Ala Asp Leu Asp Lys 35 40 45 Cys Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro His Ser Asp Phe Cys 50 55 60 Leu Gly Cys Ala Ala Ala Pro Pro Ala Pro Phe Arg Leu Leu Trp Pro 65 70 75 80 Ile Leu Gly Gly Ala Leu Ser Leu Thr Phe Val Leu Gly Leu Leu Ser 85 90 95 Gly Phe Leu Val Trp Arg Arg Cys Arg Arg Arg Glu Lys Phe Thr Thr 100 105 110 Pro Ile Glu Glu Thr Gly Gly Glu Gly Cys Pro Ala Val Ala Leu Ile 115 120 125 Gln <210> 115 <211> 1255 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 115 Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu 1 5 10 15 Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys 20 25 30 Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His 35 40 45 Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr 50 55 60 Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val 65 70 75 80 Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu 85 90 95 Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr 100 105 110 Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro 115 120 125 Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser 130 135 140 Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln 145 150 155 160 Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn 165 170 175 Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys 180 185 190 His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser 195 200 205 Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys 210 215 220 Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys 225 230 235 240 Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu 245 250 255 His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val 260 265 270 Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg 275 280 285 Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu 290 295 300 Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln 305 310 315 320 Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys 325 330 335 Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu 340 345 350 Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys 355 360 365 Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp 370 375 380 Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe 385 390 395 400 Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro 405 410 415 Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg 420 425 430 Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu 435 440 445 Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly 450 455 460 Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val 465 470 475 480 Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr 485 490 495 Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His 500 505 510 Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys 515 520 525 Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys 530 535 540 Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys 545 550 555 560 Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys 565 570 575 Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp 580 585 590 Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu 595 600 605 Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln 610 615 620 Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys 625 630 635 640 Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Ile Ser 645 650 655 Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly 660 665 670 Ile Leu Ile Lys Arg Arg Gln Gln Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg 675 680 685 Arg Leu Leu Gln Glu Thr Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly 690 695 700 Ala Met Pro Asn Gln Ala Gln Met Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Leu 705 710 715 720 Arg Lys Val Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys 725 730 735 Gly Ile Trp Ile Pro Asp Gly Glu Asn Val Lys Ile Pro Val Ala Ile 740 745 750 Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu 755 760 765 Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg 770 775 780 Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Val Thr Gln Leu 785 790 795 800 Met Pro Tyr Gly Cys Leu Leu Asp His Val Arg Glu Asn Arg Gly Arg 805 810 815 Leu Gly Ser Gln Asp Leu Leu Asn Trp Cys Met Gln Ile Ala Lys Gly 820 825 830 Met Ser Tyr Leu Glu Asp Val Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala 835 840 845 Arg Asn Val Leu Val Lys Ser Pro Asn His Val Lys Ile Thr Asp Phe 850 855 860 Gly Leu Ala Arg Leu Leu Asp Ile Asp Glu Thr Glu Tyr His Ala Asp 865 870 875 880 Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu Arg 885 890 895 Arg Arg Phe Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val 900 905 910 Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala 915 920 925 Arg Glu Ile Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro 930 935 940 Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met 945 950 955 960 Ile Asp Ser Glu Cys Arg Pro Arg Phe Arg Glu Leu Val Ser Glu Phe 965 970 975 Ser Arg Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Phe Val Val Ile Gln Asn Glu 980 985 990 Asp Leu Gly Pro Ala Ser Pro Leu Asp Ser Thr Phe Tyr Arg Ser Leu 995 1000 1005 Leu Glu Asp Asp Asp Met Gly Asp Leu Val Asp Ala Glu Glu Tyr 1010 1015 1020 Leu Val Pro Gln Gln Gly Phe Phe Cys Pro Asp Pro Ala Pro Gly 1025 1030 1035 Ala Gly Gly Met Val His His Arg His Arg Ser Ser Ser Thr Arg 1040 1045 1050 Ser Gly Gly Gly Asp Leu Thr Leu Gly Leu Glu Pro Ser Glu Glu 1055 1060 1065 Glu Ala Pro Arg Ser Pro Leu Ala Pro Ser Glu Gly Ala Gly Ser 1070 1075 1080 Asp Val Phe Asp Gly Asp Leu Gly Met Gly Ala Ala Lys Gly Leu 1085 1090 1095 Gln Ser Leu Pro Thr His Asp Pro Ser Pro Leu Gln Arg Tyr Ser 1100 1105 1110 Glu Asp Pro Thr Val Pro Leu Pro Ser Glu Thr Asp Gly Tyr Val 1115 1120 1125 Ala Pro Leu Thr Cys Ser Pro Gln Pro Glu Tyr Val Asn Gln Pro 1130 1135 1140 Asp Val Arg Pro Gln Pro Pro Ser Pro Arg Glu Gly Pro Leu Pro 1145 1150 1155 Ala Ala Arg Pro Ala Gly Ala Thr Leu Glu Arg Pro Lys Thr Leu 1160 1165 1170 Ser Pro Gly Lys Asn Gly Val Val Lys Asp Val Phe Ala Phe Gly 1175 1180 1185 Gly Ala Val Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Thr Pro Gln Gly Gly Ala 1190 1195 1200 Ala Pro Gln Pro His Pro Pro Pro Ala Phe Ser Pro Ala Phe Asp 1205 1210 1215 Asn Leu Tyr Tyr Trp Asp Gln Asp Pro Pro Glu Arg Gly Ala Pro 1220 1225 1230 Pro Ser Thr Phe Lys Gly Thr Pro Thr Ala Glu Asn Pro Glu Tyr 1235 1240 1245 Leu Gly Leu Asp Val Pro Val 1250 1255 <210> 116 <211> 1210 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 116 Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln 20 25 30 Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe 35 40 45 Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn 50 55 60 Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys 65 70 75 80 Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val 85 90 95 Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr 100 105 110 Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn 115 120 125 Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu 130 135 140 His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu 145 150 155 160 Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met 165 170 175 Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro 180 185 190 Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln 195 200 205 Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg 210 215 220 Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys 225 230 235 240 Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp 245 250 255 Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro 260 265 270 Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly 275 280 285 Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His 290 295 300 Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu 305 310 315 320 Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val 325 330 335 Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn 340 345 350 Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp 355 360 365 Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr 370 375 380 Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu 385 390 395 400 Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp 405 410 415 Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln 420 425 430 His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu 435 440 445 Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser 450 455 460 Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu 465 470 475 480 Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu 485 490 495 Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro 500 505 510 Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn 515 520 525 Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly 530 535 540 Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro 545 550 555 560 Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro 565 570 575 Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val 580 585 590 Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp 595 600 605 Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys 610 615 620 Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly 625 630 635 640 Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu 645 650 655 Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met Arg Arg Arg His 660 665 670 Ile Val Arg Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu Gln Glu Arg Glu Leu 675 680 685 Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Glu Ala Pro Asn Gln Ala Leu Leu 690 695 700 Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Phe Lys Lys Ile Lys Val Leu Gly Ser 705 710 715 720 Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Leu Trp Ile Pro Glu Gly Glu 725 730 735 Lys Val Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr Ser 740 745 750 Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Ser 755 760 765 Val Asp Asn Pro His Val Cys Arg Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser 770 775 780 Thr Val Gln Leu Ile Thr Gln Leu Met Pro Phe Gly Cys Leu Leu Asp 785 790 795 800 Tyr Val Arg Glu His Lys Asp Asn Ile Gly Ser Gln Tyr Leu Leu Asn 805 810 815 Trp Cys Val Gln Ile Ala Lys Gly Met Asn Tyr Leu Glu Asp Arg Arg 820 825 830 Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Lys Thr Pro 835 840 845 Gln His Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Leu Gly Ala 850 855 860 Glu Glu Lys Glu Tyr His Ala Glu Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp 865 870 875 880 Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu His Arg Ile Tyr Thr His Gln Ser Asp 885 890 895 Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ser 900 905 910 Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala Ser Glu Ile Ser Ser Ile Leu Glu 915 920 925 Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr 930 935 940 Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met Ile Asp Ala Asp Ser Arg Pro Lys 945 950 955 960 Phe Arg Glu Leu Ile Ile Glu Phe Ser Lys Met Ala Arg Asp Pro Gln 965 970 975 Arg Tyr Leu Val Ile Gln Gly Asp Glu Arg Met His Leu Pro Ser Pro 980 985 990 Thr Asp Ser Asn Phe Tyr Arg Ala Leu Met Asp Glu Glu Asp Met Asp 995 1000 1005 Asp Val Val Asp Ala Asp Glu Tyr Leu Ile Pro Gln Gln Gly Phe 1010 1015 1020 Phe Ser Ser Pro Ser Thr Ser Arg Thr Pro Leu Leu Ser Ser Leu 1025 1030 1035 Ser Ala Thr Ser Asn Asn Ser Thr Val Ala Cys Ile Asp Arg Asn 1040 1045 1050 Gly Leu Gln Ser Cys Pro Ile Lys Glu Asp Ser Phe Leu Gln Arg 1055 1060 1065 Tyr Ser Ser Asp Pro Thr Gly Ala Leu Thr Glu Asp Ser Ile Asp 1070 1075 1080 Asp Thr Phe Leu Pro Val Pro Glu Tyr Ile Asn Gln Ser Val Pro 1085 1090 1095 Lys Arg Pro Ala Gly Ser Val Gln Asn Pro Val Tyr His Asn Gln 1100 1105 1110 Pro Leu Asn Pro Ala Pro Ser Arg Asp Pro His Tyr Gln Asp Pro 1115 1120 1125 His Ser Thr Ala Val Gly Asn Pro Glu Tyr Leu Asn Thr Val Gln 1130 1135 1140 Pro Thr Cys Val Asn Ser Thr Phe Asp Ser Pro Ala His Trp Ala 1145 1150 1155 Gln Lys Gly Ser His Gln Ile Ser Leu Asp Asn Pro Asp Tyr Gln 1160 1165 1170 Gln Asp Phe Phe Pro Lys Glu Ala Lys Pro Asn Gly Ile Phe Lys 1175 1180 1185 Gly Ser Thr Ala Glu Asn Ala Glu Tyr Leu Arg Val Ala Pro Gln 1190 1195 1200 Ser Ser Glu Phe Ile Gly Ala 1205 1210

Claims (15)

  1. 화학식 (I)의 항체-약물 접합체 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 이들 용매화물의 염:

    여기서
    X1은 N을 나타내고,
    X2는 N을 나타내고,
    X3은 C를 나타내거나;
    또는
    X1은 N을 나타내고,
    X2는 C를 나타내고,
    X3은 N을 나타내거나;
    또는
    X1은 CH 또는 CF를 나타내고,
    X2는 C를 나타내고,
    X3은 N을 나타내거나;
    또는
    X1은 NH를 나타내고,
    X2는 C를 나타내고,
    X3은 C를 나타내거나;
    또는
    X1은 CH를 나타내고,
    X2는 N을 나타내고,
    X3은 C를 나타내고,
    R1은 수소 또는 메틸을 나타내고,
    R2는 메틸, 에틸, -CH2-CH(CH3)2, -CH2-C(=O)OH 또는 이소프로필을 나타내고,
    R3은 메틸, 에틸, -CH2-CH(CH3)2 또는 -CH2-C(=O)-NH2를 나타내고,
    M은 다음 기:
    #-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH2-NH-C(=O)-CH2-CH(##)-COOH,
    #-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH2-NH-C(=O)-CH(##)-CH2-COOH,
    #-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH2-W,
    #-C(=O)-CH2-NH-C(=O)-CH2-CH(##)-COOH,
    #-C(=O)-CH2-NH-C(=O)-CH(##)-CH2-COOH,
    #-C(=O)-CH2-W,
    #-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-(CH2)2-8-C(=O)-###,
    #-C(=O)-(CH2)3-C(=O)-###,
    #-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-(CH2)5-W,
    #-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-(CH2)-## 또는
    #-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-(CH2-CH2-O)1-8-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-##를 나타내고,
    W는 기 를 나타내고,
    n은 1 내지 50의 수를 나타내고,
    #는 화합물에 대한 결합을 나타내고,
    ##는 항체의 시스테인 측쇄의 황 원자에 대한 결합을 나타내고,
    ###는 항체의 리신 측쇄의 질소 원자에 대한 결합을 나타내고,
    AK는
    (i) 서열식별번호: 2에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR1 서열 (H-CDR1), 서열식별번호: 3에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR2 서열 (H-CDR2) 및 서열식별번호: 4에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR3 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄의 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 6에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR1 서열 (L-CDR1), 서열식별번호: 7에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR2 서열 (L-CDR2) 및 서열식별번호: 8에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR3 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-EGFR 항체;
    (ii) 서열식별번호: 12에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR1 서열 (H-CDR1), 서열식별번호: 13에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR2 서열 (H-CDR2) 및 서열식별번호: 14에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR3 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄의 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 16에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR1 서열 (L-CDR1), 서열식별번호: 17에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR2 서열 (L-CDR2) 및 서열식별번호: 18에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR3 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-Her2 항체;
    (iii) 서열식별번호: 32에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR1 서열 (H-CDR1), 서열식별번호: 33에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR2 서열 (H-CDR2) 및 서열식별번호: 34에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR3 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄의 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 36에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR1 서열 (L-CDR1), 서열식별번호: 37에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR2 서열 (L-CDR2) 및 서열식별번호: 38에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR3 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-TWEAKR 항체;
    (iv) 서열식별번호: 42에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR1 서열 (H-CDR1), 서열식별번호: 43에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR2 서열 (H-CDR2) 및 서열식별번호: 44에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR3 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄의 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 46에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR1 서열 (L-CDR1), 서열식별번호: 47에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR2 서열 (L-CDR2) 및 서열식별번호: 48에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR3 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-TWEAKR 항체; 또는
    (v) 서열식별번호: 52에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR1 서열 (H-CDR1), 서열식별번호: 53에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR2 서열 (H-CDR2) 및 서열식별번호: 54에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR3 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄의 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 56에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR1 서열 (L-CDR1), 서열식별번호: 57에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR2 서열 (L-CDR2) 및 서열식별번호: 58에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR3 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-B7H3 항체
    를 나타낸다.
  2. 제1항에 있어서,
    X1은 CH를 나타내고,
    X2는 C를 나타내고,
    X3은 N을 나타내고;
    R1은 수소 또는 메틸을 나타내고,
    R2는 메틸, -CH2-CH(CH3)2, -CH2-C(=O)OH 또는 이소프로필을 나타내고,
    R3은 메틸, -CH2-CH(CH3)2 또는 -CH2-C(=O)-NH2를 나타내고,
    M은 다음 기:
    #-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH2-NH-C(=O)-CH2-CH(##)-COOH,
    #-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH2-NH-C(=O)-CH(##)-CH2-COOH,
    #-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH2-W,
    #-C(=O)-CH2-NH-C(=O)-CH2-CH(##)-COOH,
    #-C(=O)-CH2-NH-C(=O)-CH(##)-CH2-COOH,
    #-C(=O)-CH2-W,
    #-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-(CH2)3-C(=O)-###,
    #-C(=O)-(CH2)3-C(=O)-###,
    #-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-(CH2)5-W,
    #-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-(CH2)-## 또는
    #-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-(CH2-CH2-O)4-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-##를 나타내고,
    W는 기 를 나타내고,
    n은 1 내지 50의 수를 나타내고,
    AK는 제1항에서 정의된 바와 같은 항-EGFR 항체, 항-Her2 항체, 항-TWEAKR 항체 또는 항-B7H3 항체를 나타내고,
    #는 화합물에 대한 결합을 나타내고,
    ##는 항체의 시스테인 측쇄의 황 원자에 대한 결합을 나타내고,
    ###는 항체의 리신 측쇄의 질소 원자에 대한 결합을 나타내는 것인,
    항체-약물 접합체 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 이들 용매화물의 염.
  3. 제1항에 있어서,
    R1은 수소 또는 메틸을 나타내고,
    R2는 메틸 또는 이소프로필을 나타내고,
    R3은 메틸 또는 -CH2-C(=O)-NH2를 나타내고,
    M은 기 #-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-(CH2)3-C(=O)-###를 나타내고,
    n은 1 내지 50의 수를 나타내고,
    AK는 제1항에서 정의된 바와 같은 항-EGFR 항체, 항-Her2 항체, 항-TWEAKR 항체 또는 항-B7H3 항체를 나타내고,
    #는 화합물에 대한 결합을 나타내고,
    ###는 항체의 리신 측쇄의 질소 원자에 대한 결합을 나타내는 것인,
    항체-약물 접합체 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 이들 용매화물의 염.
  4. 제1항에 있어서,
    R1은 메틸을 나타내고,
    R2는 메틸을 나타내고,
    R3은 -CH2-C(=O)-NH2를 나타내고,
    M은 기 #-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-(CH2)3-C(=O)-###를 나타내고,
    n은 1 내지 50의 수를 나타내고,
    AK는 제1항에서 정의된 바와 같은 항-EGFR 항체, 항-Her2 항체, 항-TWEAKR 항체 또는 항-B7H3 항체를 나타내고,
    #는 화합물에 대한 결합을 나타내고,
    ###는 항체의 리신 측쇄의 질소 원자에 대한 결합을 나타내는 것인,
    항체-약물 접합체 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 이들 용매화물의 염.
  5. 제1항에 있어서,
    R1은 메틸을 나타내고,
    R2는 메틸을 나타내고,
    R3은 -CH2-C(=O)-NH2를 나타내고,
    M은 기 #-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-(CH2)3-C(=O)-###를 나타내고,
    n은 1 내지 20의 수를 나타내고,
    AK는 항-EGFR 항체 TPP-981, 항-Her2 항체 TPP-1015, 항-TWEAKR 항체 TPP-7006 또는 TPP-7007, 또는 항-B7H3 항체 TPP-8382를 나타내고,
    #는 화합물에 대한 결합을 나타내고,
    ###는 항체의 리신 측쇄의 질소 원자에 대한 결합을 나타내는 것인,
    항체-약물 접합체 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 이들 용매화물의 염.
  6. 제1항에 있어서, 하기 중 어느 하나의 구조를 가지며,






    여기서
    AK1은 시스테인 측쇄의 황 원자를 통해 부착된, 제1항에서 정의된 바와 같은 항-EGFR 항체, 항-Her2 항체, 항-TWEAKR 항체 또는 항-B7H3 항체를 나타내고,
    AK2는 리신 측쇄의 질소 원자를 통해 부착된, 제1항에서 정의된 바와 같은 항-EGFR 항체, 항-Her2 항체, 항-TWEAKR 항체 또는 항-B7H3 항체를 나타내고,
    n은 1 내지 50의 수를 나타내는 것인,
    항체-약물 접합체 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 이들 용매화물의 염.
  7. 제6항에 있어서, n이 1 내지 20의 수를 나타내는 것인 항체-약물 접합체 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 이들 용매화물의 염.
  8. 제6항에 있어서, n이 1 내지 8의 수를 나타내는 것인 항체-약물 접합체 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 이들 용매화물의 염.
  9. 제6항에 있어서, n이 4 내지 8의 수를 나타내는 것인 항체-약물 접합체 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 이들 용매화물의 염.
  10. 제1항에 있어서, 항체가 세포외 표적 분자에 결합하는 것인 항체-약물 접합체 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 이들 용매화물의 염.
  11. 제1항에 있어서, 항체가 세포외 암 표적 분자에 결합하는 것인 항체-약물 접합체 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 이들 용매화물의 염.
  12. 제1항에 있어서, 항체가 표적 세포 상의 그의 세포외 표적 분자에 결합한 후, 결합을 통해 표적 세포에 의해 내재화되는 것인 항체-약물 접합체 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 이들 용매화물의 염.
  13. 과다증식성 및/또는 혈관신생 장애의 치료 방법에 사용하기 위한, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항체-약물 접합체 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 이들 용매화물의 염을 포함하는 제약 조성물.
  14. 암 및 종양의 치료 방법에 사용하기 위한, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항체-약물 접합체 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 이들 용매화물의 염을 포함하는 제약 조성물.
  15. 암 면역요법에 대한 1종 이상의 치료 접근법 또는 암 면역요법의 분자 표적에 대하여 지시된 1종 이상의 활성 화합물과 조합하여 암 및 종양의 치료 방법에 사용하기 위한, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항체-약물 접합체 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 이들 용매화물의 염을 포함하는 제약 조성물.
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Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016207089A1 (de) 2015-06-22 2016-12-29 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Binder-wirkstoff-konjugate (adcs) und binder-prodrug-konjugate (apdcs) mit enzymatisch spaltbaren gruppen
US10973923B2 (en) 2015-06-23 2021-04-13 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Site specific homogeneous with KSP inhibitors
CA2990398A1 (en) 2015-06-23 2016-12-29 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Antibody drug conjugates of kinesin spindel protein (ksp) inhibitors with anti-cd123-antibodies
KR20180123047A (ko) 2016-03-24 2018-11-14 바이엘 파마 악티엔게젤샤프트 효소적으로 절단가능한 기를 갖는 세포독성 활성제의 전구약물
WO2017216028A1 (en) 2016-06-15 2017-12-21 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Specific antibody-drug-conjugates (adcs) with ksp inhibitors and anti-cd123-antibodies
US12059472B2 (en) 2016-12-21 2024-08-13 Bayer Aktiengesellschaft Prodrugs of cytotoxic active agents having enzymatically cleavable groups
WO2018114578A1 (de) 2016-12-21 2018-06-28 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Binder-wirkstoff-konjugate (adcs) mit enzymatisch spaltbaren gruppen
CA3047522A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Specific antibody drug conjugates (adcs) having ksp inhibitors
EP3658172A4 (en) 2017-07-25 2021-05-05 TrueBinding, Inc. TREATING CANCER BY BLOCKING THE INTERACTION OF TIM-3 AND HIS LIGAND
KR102804751B1 (ko) * 2017-08-23 2025-05-13 막스-델부뤽-센트럼 퓌어 몰레쿨라레 메디친 인 데어 헬름홀츠-게마인샤프트 Cxcr5에 결합하는 키메라 항원 수용체 및 car-t 세포
WO2019243159A1 (de) * 2018-06-18 2019-12-26 Bayer Aktiengesellschaft Gegen cxcr5 gerichtete binder-wirkstoff-konjugate mit enzymatisch spaltbaren linkern und verbessertem wirkungsprofil
CN120058944A (zh) 2019-01-30 2025-05-30 真和制药有限公司 抗gal3抗体及其用途
MX2022014786A (es) 2020-05-26 2023-01-16 Truebinding Inc Metodos para tratar enfermedades inflamatorias mediante el bloqueo de galectina-3.
WO2022175595A1 (en) * 2021-02-16 2022-08-25 Glykos Finland Oy Linker-payloads and conjugates thereof
TW202320857A (zh) 2021-07-06 2023-06-01 美商普方生物製藥美國公司 連接子、藥物連接子及其結合物及其使用方法
WO2024105205A1 (en) 2022-11-17 2024-05-23 Bayer Aktiengesellschaft Antibody-drug conjugates (a2dcs) with enzymatically cleavable groups
WO2025027529A1 (en) 2023-07-31 2025-02-06 Advesya Anti-il-1rap antibody drug conjugates and methods of use thereof
TW202530255A (zh) 2023-12-15 2025-08-01 法商亞維西亞有限公司 抗ｉｌ－１ｒａｐ結合結構域及其抗體－藥物偶聯物
WO2025149667A1 (en) 2024-01-12 2025-07-17 Pheon Therapeutics Ltd Antibody drug conjugates and uses thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007064759A2 (en) 2005-11-29 2007-06-07 The Scripps Research Institute Inhibiting tumour cell invasion, metastasis and angiogenesis through targetting legumain
WO2016096610A1 (de) 2014-12-15 2016-06-23 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Antikörper-wirkstoff-konjugate (adcs) von ksp-inhibitoren mit aglycosylierten anti-tweakrantikörpern

Family Cites Families (150)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CU22545A1 (es) 1994-11-18 1999-03-31 Centro Inmunologia Molecular Obtención de un anticuerpo quimérico y humanizado contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico para uso diagnóstico y terapéutico
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4714681A (en) 1981-07-01 1987-12-22 The Board Of Reagents, The University Of Texas System Cancer Center Quadroma cells and trioma cells and methods for the production of same
US4474893A (en) 1981-07-01 1984-10-02 The University of Texas System Cancer Center Recombinant monoclonal antibodies
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
DE8808645U1 (de) 1988-07-06 1988-08-25 Hofer, Daniel, 7730 Villingen-Schwenningen Anzeigeeinrichtung für Feuerlöscher
US4925648A (en) 1988-07-29 1990-05-15 Immunomedics, Inc. Detection and treatment of infectious and inflammatory lesions
US5601819A (en) 1988-08-11 1997-02-11 The General Hospital Corporation Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding
ES2096590T3 (es) 1989-06-29 1997-03-16 Medarex Inc Reactivos biespecificos para la terapia del sida.
DK0595798T3 (da) 1989-10-20 1999-09-27 Medarex Inc Bispecifikke heteroantistoffer med dobbelte effektorfunktioner
US5270163A (en) 1990-06-11 1993-12-14 University Research Corporation Methods for identifying nucleic acid ligands
CA2093022C (en) 1990-10-05 2005-02-22 Michael W. Fanger Targeted immunostimulation with bispecific reagents
EP0557300B1 (en) 1990-10-29 1997-11-19 Chiron Corporation Bispecific antibodies, method of production, and uses thereof
DE69233153T2 (de) 1991-03-06 2004-05-27 Merck Patent Gmbh Humanisierte monoklonale antikörper
WO1992019973A1 (en) 1991-04-26 1992-11-12 Surface Active Limited Novel antibodies, and methods for their use
ES2193143T3 (es) 1992-03-05 2003-11-01 Univ Texas Uso de inmunoconjugados para la diagnosis y/o terapia de tumores vascularizaos.
ATE188874T1 (de) 1992-08-18 2000-02-15 Centro Inmunologia Molecular Monoklonale antikörper gegen den epidermalen wachstumsfaktorrezeptor, zellen und verfahren zur ihrer herstellung und sie erhaltende zusammensetzungen
DE69531187T2 (de) 1994-12-20 2004-04-22 Merck Patent Gmbh Monoklonaler Antikörper gegen das Alpha-V-Integrin
DK1143006T3 (da) 1995-08-18 2008-07-14 Morphosys Ip Gmbh Vektorer/DNA-sekvenser fra humane kombinatoriske antistofbiblioteker
WO1997024373A1 (en) 1995-12-29 1997-07-10 Medvet Science Pty. Limited Monoclonal antibody antagonists to haemopoietic growth factors
AU725583B2 (en) 1996-03-25 2000-10-12 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Monoclonal antibodies specific for the extracellular domain of prostate specific membrane antigen
US6150508A (en) 1996-03-25 2000-11-21 Northwest Biotherapeutics, Inc. Monoclonal antibodies specific for the extracellular domain of prostate-specific membrane antigen
NZ517331A (en) 1999-07-29 2004-02-27 Medarex Inc Human monoclonal antibodies to prostate specific membrane antigen and a transgenic mouse to produce the antibody
SK12232002A3 (sk) 2000-02-25 2003-03-04 The Government Of The United States, As Represented By The Anti-ERGFRvIII scFv so zlepšenou cytotoxicitou a výťažkom, imunotoxíny a spôsoby ich použitia
JP2003533987A (ja) 2000-05-19 2003-11-18 イス ケミカル カンパニー リミテッド 表皮成長因子収容体に対するヒト化抗体
US6884446B1 (en) 2000-07-27 2005-04-26 Red Arrow Products Co., Llc Article for browning and flavoring foodstuffs
US7288390B2 (en) 2000-08-07 2007-10-30 Centocor, Inc. Anti-dual integrin antibodies, compositions, methods and uses
AUPR395801A0 (en) 2001-03-26 2001-04-26 Austin Research Institute, The Antibodies against cancer
HUP0501113A3 (en) 2001-04-26 2007-12-28 Biogen Idec Inc Cripto blocking antibodies and uses thereof
PT1392359E (pt) 2001-05-11 2010-01-27 Ludwig Inst For Cancer Res Ltd Proteínas de ligação específica e suas utilizações
US7595378B2 (en) 2001-06-13 2009-09-29 Genmab A/S Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor (EGFR)
CN100497389C (zh) 2001-06-13 2009-06-10 根马布股份公司 表皮生长因子受体(egfr)的人单克隆抗体
WO2003060064A2 (en) 2001-07-12 2003-07-24 Incyte Genomics, Inc. Intracellular signaling molecules
SG114505A1 (en) 2001-10-17 2005-09-28 First Cube Pte Ltd System and method for facilitating delivery and return service
EP2360169B1 (en) 2001-10-23 2015-10-14 Psma Development Company, L.L.C. PSMA antibodies
DE60232994D1 (de) 2001-12-06 2009-08-27 Merck & Co Inc Inhibitoren von mitotischem kinesin
US20080193445A1 (en) 2002-01-18 2008-08-14 Liliane Goetsch Novel anti-IGF-IR antibodies and uses thereof
US7282567B2 (en) 2002-06-14 2007-10-16 Immunomedics, Inc. Monoclonal antibody hPAM4
CA2478833C (en) 2002-03-13 2015-11-10 Biogen, Inc. Anti-.alpha.v.beta.6 antibodies
EP1494693B1 (en) 2002-03-22 2010-12-08 Biogen Idec MA Inc. Cripto-specific antibodies
MXPA05003830A (es) 2002-10-11 2005-06-23 Cytokinetics Inc Compuestos, composiciones y metodos.
US8658377B2 (en) * 2002-11-15 2014-02-25 Morehouse School Of Medicine Detecting cancer with anti-CCL25 and anti-CCR9 antibodies
US8512701B2 (en) * 2002-11-15 2013-08-20 Morehouse School Of Medicine Anti-CXCL13 and anti-CXCR5 antibodies for the prevention and treatment of cancer and cancer cell migration
JP2006524693A (ja) 2003-04-11 2006-11-02 メディミューン，インコーポレーテッド ＥｐｈＡ２および非腫瘍性過増殖性細胞障害
WO2004100873A2 (en) 2003-05-07 2004-11-25 Cytokinetics, Inc. Compounds, compositions, and methods
BRPI0411803A (pt) 2003-06-27 2006-05-23 Abgenix Inc anticorpos dirigidos aos mutantes de deleção de receptor de fator de crescimento epidérmico e seus usos
FR2857811A1 (fr) 2003-07-16 2005-01-21 St Microelectronics Sa Methode de chiffrage d'un flux audio ou video compresse a tolerance d'erreurs
WO2005009369A2 (en) 2003-07-21 2005-02-03 Immunogen, Inc. A ca6 antigen-specific cytotoxic conjugate and methods of using the same
PT2489364E (pt) 2003-11-06 2015-04-16 Seattle Genetics Inc Compostos de monometilvalina conjugados com anticorpos
KR20060127413A (ko) 2003-11-25 2006-12-12 카이론 코포레이션 항암제로서의 퀴나졸리논 화합물
EP1701979A2 (en) 2003-12-03 2006-09-20 Xencor, Inc. Optimized antibodies that target the epidermal growth factor receptor
US7662581B1 (en) 2003-12-18 2010-02-16 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Eg5 co-crystals
US7767792B2 (en) 2004-02-20 2010-08-03 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. Antibodies to EGF receptor epitope peptides
US7598350B2 (en) 2004-03-19 2009-10-06 Imclone Llc Human anti-epidermal growth factor receptor antibody
KR101170925B1 (ko) 2004-06-18 2012-08-07 노바티스 백신즈 앤드 다이아그노스틱스 인코포레이티드 암 치료용 키네신 방추 단백질 (ｋｓｐ) 억제제로서의ｎ-(1-(1-벤질-4-페닐-1ｈ-이미다졸-2-일)-2,2-디메틸프로필)벤자미드 유도체 및 관련 화합물
EP1773884B1 (en) 2004-08-03 2012-03-07 Innate Pharma Therapeutic and diagnostic methods and compositions targeting 4ig-b7-h3 and its counterpart nk cell receptor
US7449486B2 (en) 2004-10-19 2008-11-11 Array Biopharma Inc. Mitotic kinesin inhibitors and methods of use thereof
US20100093767A1 (en) 2004-12-03 2010-04-15 Takeda San Diego, Inc. Mitotic Kinase Inhibitors
EA013323B1 (ru) 2004-12-09 2010-04-30 Сентокор, Инк. Иммуноконъюгаты против интегрина, способы и варианты применения
GB0428250D0 (en) 2004-12-23 2005-01-26 Novartis Ag Organic compounds
EP2230517A1 (en) 2005-01-07 2010-09-22 Diadexus, Inc. OVR110 antibody compositions and methods of use
US8207303B2 (en) 2005-02-18 2012-06-26 Medarex, Inc. Monoclonal antibodies against CD30 lacking in fucosyl residues
GB0505969D0 (en) 2005-03-23 2005-04-27 Novartis Ag Organic compounds
CN103127523A (zh) 2005-06-20 2013-06-05 Psma开发有限公司 Psma抗体-药物缀合物
TW200800951A (en) 2005-08-09 2008-01-01 Novartis Ag Substituted imidazole compounds as KSP inhibitors
CA2893252C (en) 2005-08-24 2018-05-29 Immunogen, Inc. Process for preparing antibody maytansinoid conjugates
EA016186B1 (ru) 2005-09-26 2012-03-30 Медарекс, Инк. Человеческие моноклональные антитела к cd70 и их применение
EP1790664A1 (en) 2005-11-24 2007-05-30 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies against claudin-18 for treatment of cancer
DOP2006000277A (es) 2005-12-12 2007-08-31 Bayer Pharmaceuticals Corp Anticuerpos anti mn y métodos para su utilización
WO2008004834A1 (en) 2006-07-06 2008-01-10 Isu Abxis Co., Ltd Humanized monoclonal antibody highly binding to epidermal growth factor receptor, egf receptor
EP2066349B1 (en) 2006-09-08 2012-03-28 MedImmune, LLC Humanized anti-cd19 antibodies and their use in treatment of tumors, transplantation and autoimmune diseases
AU2007294122B2 (en) 2006-09-10 2013-03-07 Glycotope Gmbh Use of human cells of myeloid leukaemia origin for expression of antibodies
EP1900750A1 (en) 2006-09-18 2008-03-19 Glycotope Gmbh Fully human high yield production system for improved antibodies
EP1911766A1 (en) 2006-10-13 2008-04-16 Glycotope Gmbh Use of human cells of myeloid leukaemia origin for expression of antibodies
WO2008036688A2 (en) 2006-09-18 2008-03-27 Xencor, Inc. Optimized antibodies that target hm1.24
EP1914242A1 (en) 2006-10-19 2008-04-23 Sanofi-Aventis Novel anti-CD38 antibodies for the treatment of cancer
PT2099823E (pt) 2006-12-01 2014-12-22 Seattle Genetics Inc Agentes de ligação ao alvo variantes e suas utilizações
WO2008140603A2 (en) 2006-12-08 2008-11-20 Macrogenics, Inc. METHODS FOR THE TREATMENT OF DISEASE USING IMMUNOGLOBULINS HAVING FC REGIONS WITH ALTERED AFFINITIES FOR FCγR ACTIVATING AND FCγR INHIBITING
GEP20125415B (en) 2007-01-05 2012-03-12 Novartis Ag Imidazole derivatives as kinesin spindle protein inhibitors (eg-5)
WO2008092117A2 (en) 2007-01-25 2008-07-31 Xencor, Inc. Immunoglobulins with modifications in the fcr binding region
US20100143245A1 (en) 2007-03-22 2010-06-10 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Uses of monoclonal antibody 8h9
KR20090122403A (ko) 2007-03-29 2009-11-27 노파르티스 아게 증식성 질환의 치료를 위한 3-이미다졸릴-인돌
US8163279B2 (en) 2007-04-13 2012-04-24 Stemline Therapeutics, Inc. IL3Rα antibody conjugates and uses thereof
NZ556142A (en) 2007-06-25 2009-11-27 Novartis Ag Animal remedy dispensing means
KR20100029099A (ko) 2007-06-28 2010-03-15 톰슨 라이센싱 비디오 믹서 교차점 매트릭스의 2중 사용
JP5409628B2 (ja) 2007-08-03 2014-02-05 アッヴィ・バイオセラピューティクス・インコーポレイテッド 抗ｔｗｅａｋ受容体抗体の治療上の使用
JP5532486B2 (ja) 2007-08-14 2014-06-25 ルードヴィッヒ インスティテュート フォー キャンサー リサーチ Ｅｇｆ受容体を標的とするモノクローナル抗体１７５ならびにその誘導体および用途
US8865875B2 (en) 2007-08-22 2014-10-21 Medarex, L.L.C. Site-specific attachment of drugs or other agents to engineered antibodies with C-terminal extensions
MX2010001975A (es) 2007-08-29 2010-03-10 Sanofi Aventis Anticuerpos anti-cxcr5 humanizados, derivados de los mismos y su uso.
HRP20130649T1 (hr) 2007-09-07 2013-08-31 Agensys, Inc. Protutijela i povezane molekule koje se vežu za 24p4c12 proteine
US8039597B2 (en) 2007-09-07 2011-10-18 Agensys, Inc. Antibodies and related molecules that bind to 24P4C12 proteins
US9023351B2 (en) 2007-11-26 2015-05-05 Bayer Intellectual Property Gmbh Anti-mesothelin antibodies and uses thereof
EA201070687A1 (ru) 2007-12-06 2010-12-30 Си Эс Эл ЛИМИТЕД Способ ингибирования лейкозных стволовых клеток
US8252832B2 (en) 2007-12-14 2012-08-28 Novartis Ag Kinesin inhibitors as cancer therapeutics
ES2526433T3 (es) 2007-12-26 2015-01-12 Biotest Ag Inmunoconjugados dirigidos a CD138 y usos de los mismos
EP2238168B8 (en) 2007-12-26 2014-07-23 Biotest AG Agents targeting cd138 and uses thereof
AU2009231991B2 (en) 2008-04-02 2014-09-25 Macrogenics, Inc. HER2/neu-specific antibodies and methods of using same
CA2723973A1 (en) 2008-05-15 2009-11-19 Biogen Idec Ma Inc. Anti-fn14 antibodies and uses thereof
EP2331577B1 (en) 2008-08-29 2017-06-07 Symphogen A/S Recombinant anti-epidermal growth factor receptor antibody compositions
WO2010084186A1 (en) 2009-01-26 2010-07-29 Novartis Ag Salts and polymorphs of a kinesin inhibitor compound
SG174963A1 (en) 2009-03-31 2011-11-28 Roche Glycart Ag Treatment of cancer with a humanized anti-egfr igg1 antibody and irinotecan
AR075982A1 (es) 2009-03-31 2011-05-11 Roche Glycart Ag Terapia de combinacion de un anticuerpo afucosilado y una o mas de las citoquinas seleccionadas de gm- csf humano, m -csf humano y/o il-3 humano y composicion
EP2426148B1 (en) 2009-04-27 2015-08-05 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Anti-il-3ra antibody for use in treatment of blood tumor
CN101959216B (zh) 2009-07-20 2014-06-18 电信科学技术研究院 一种分载波配置增强cell_fach的方法、系统和设备
PL2486141T3 (pl) 2009-10-07 2018-07-31 Macrogenics, Inc. Polipeptydy zawierające regiony fc i mające w wyniku zmian w zakresie fukozylacji ulepszoną funkcję efektorową, i sposoby zastosowania tych polipeptydów
WO2012010582A1 (en) * 2010-07-21 2012-01-26 Roche Glycart Ag Anti-cxcr5 antibodies and methods of use
NZ604510A (en) 2010-08-17 2013-10-25 Csl Ltd Dilutable biocidal compositions and methods of use
AR086363A1 (es) 2011-04-21 2013-12-11 Bayer Ip Gmbh Conjugados de principio activo-ligante (adc) y el uso de los mismos
KR102087854B1 (ko) 2011-06-10 2020-03-12 메르사나 테라퓨틱스, 인코포레이티드 단백질-중합체-약물 접합체
US9726666B2 (en) * 2011-06-13 2017-08-08 Tla Targeted Immunotherapies Ab Diagnosing and treating inflammatory diseases
AR088941A1 (es) 2011-11-23 2014-07-16 Bayer Ip Gmbh Anticuerpos anti-fgfr2 y sus usos
UA112096C2 (uk) 2011-12-12 2016-07-25 Байєр Інтеллектуал Проперті Гмбх Заміщені триазолопіридини та їх застосування як інгібіторів ttk
AU2013222935B2 (en) * 2012-02-24 2016-03-10 Alteogen Inc. Modified antibody in which motif comprising cysteine residue is bound, modified antibody-drug conjugate comprising the modified antibody, and production method for same
PT2850106T (pt) 2012-05-18 2022-07-18 Aptevo Res & Development Llc Imunofusão biespecífica (bif) de scfv de ligação a cd123 e cd3
WO2014061277A1 (ja) 2012-10-19 2014-04-24 第一三共株式会社 親水性構造を含むリンカーで結合させた抗体－薬物コンジュゲート
WO2014093640A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 Mersana Therapeutics,Inc. Hydroxy-polmer-drug-protein conjugates
TW201437211A (zh) 2013-03-01 2014-10-01 Bayer Pharma AG 經取代咪唑并嗒□
US9498532B2 (en) 2013-03-13 2016-11-22 Novartis Ag Antibody drug conjugates
US9498540B2 (en) 2013-03-15 2016-11-22 Novartis Ag Cell proliferation inhibitors and conjugates thereof
CN105451773A (zh) * 2013-03-15 2016-03-30 诺华股份有限公司 细胞增殖抑制剂及其缀合物
WO2014177652A1 (en) 2013-05-02 2014-11-06 Ares Trading S.A Monoclonal antibody directed against cxcr5
CN105308070A (zh) 2013-06-14 2016-02-03 拜耳制药股份公司 抗tweakr抗体及其用途
KR102087850B1 (ko) 2013-10-11 2020-03-12 메르사나 테라퓨틱스, 인코포레이티드 단백질-고분자-약물 접합체
CA2932476A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 Stemcentrx, Inc. Novel anti-dpep3 antibodies and methods of use
KR102329024B1 (ko) 2013-12-23 2021-11-19 바이엘 파마 악티엔게젤샤프트 키네신 스핀들 단백질(ksp)과의 항체 약물 접합체 (adcs)
AU2015229463A1 (en) 2014-03-12 2016-09-15 Novartis Ag Specific sites for modifying antibodies to make immunoconjugates
WO2015189143A1 (en) 2014-06-12 2015-12-17 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Aglycosyl anti-tweakr antibodies and uses thereof
US10786578B2 (en) 2014-08-05 2020-09-29 Novartis Ag CKIT antibody drug conjugates
JP2017525710A (ja) 2014-08-22 2017-09-07 ソレント・セラピューティクス・インコーポレイテッドＳｏｒｒｅｎｔｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ． Ｃｘｃｒ５に結合する抗原結合タンパク質
MX2017003123A (es) * 2014-09-12 2017-05-12 Genentech Inc Anticuerpos y conjugados modificados geneticamente con cisteina.
TW201709932A (zh) 2015-06-12 2017-03-16 西雅圖遺傳學公司 Ｃｄ１２３抗體及其共軛物
WO2016207089A1 (de) 2015-06-22 2016-12-29 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Binder-wirkstoff-konjugate (adcs) und binder-prodrug-konjugate (apdcs) mit enzymatisch spaltbaren gruppen
US10973923B2 (en) * 2015-06-23 2021-04-13 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Site specific homogeneous with KSP inhibitors
CN108025085A (zh) 2015-06-23 2018-05-11 拜耳制药股份公司 Ksp抑制剂与抗b7h3抗体的抗体药物缀合物(adc)
JP2018525334A (ja) 2015-06-23 2018-09-06 バイエル ファーマ アクチエンゲゼルシャフト キネシンスピンドルタンパク質（ｋｓｐ）阻害剤の抗ｔｗｅａｋｒ抗体との抗体薬物複合体
CA2990411A1 (en) 2015-06-23 2016-12-29 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Antibody drug conjugates of kinesin spindel protein (ksp) inhibitors with anti-b7h3-antibodies
CA2990398A1 (en) 2015-06-23 2016-12-29 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Antibody drug conjugates of kinesin spindel protein (ksp) inhibitors with anti-cd123-antibodies
KR20180123047A (ko) 2016-03-24 2018-11-14 바이엘 파마 악티엔게젤샤프트 효소적으로 절단가능한 기를 갖는 세포독성 활성제의 전구약물
WO2017216028A1 (en) 2016-06-15 2017-12-21 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Specific antibody-drug-conjugates (adcs) with ksp inhibitors and anti-cd123-antibodies
CA3047522A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Specific antibody drug conjugates (adcs) having ksp inhibitors
WO2018114578A1 (de) 2016-12-21 2018-06-28 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Binder-wirkstoff-konjugate (adcs) mit enzymatisch spaltbaren gruppen
US12059472B2 (en) 2016-12-21 2024-08-13 Bayer Aktiengesellschaft Prodrugs of cytotoxic active agents having enzymatically cleavable groups
WO2019243159A1 (de) 2018-06-18 2019-12-26 Bayer Aktiengesellschaft Gegen cxcr5 gerichtete binder-wirkstoff-konjugate mit enzymatisch spaltbaren linkern und verbessertem wirkungsprofil
IL282748B2 (en) 2018-11-05 2025-07-01 Bayer Pharma AG Cytostatic conjugates with integrin ligands

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007064759A2 (en) 2005-11-29 2007-06-07 The Scripps Research Institute Inhibiting tumour cell invasion, metastasis and angiogenesis through targetting legumain
WO2016096610A1 (de) 2014-12-15 2016-06-23 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Antikörper-wirkstoff-konjugate (adcs) von ksp-inhibitoren mit aglycosylierten anti-tweakrantikörpern

Also Published As

Publication number Publication date
CA3047489A1 (en) 2018-06-28
PE20191235A1 (es) 2019-09-11
JP7066714B2 (ja) 2022-05-13
US20230338559A1 (en) 2023-10-26
IL267473B (en) 2022-04-01
IL267473A (en) 2019-08-29
EP3558388A1 (de) 2019-10-30
TWI781125B (zh) 2022-10-21
JP7307231B2 (ja) 2023-07-11
MX2024008464A (es) 2024-07-19
US11660351B2 (en) 2023-05-30
CN116327974A (zh) 2023-06-27
RU2761390C2 (ru) 2021-12-07
KR102556826B1 (ko) 2023-07-18
CN110312534A (zh) 2019-10-08
TWI823564B (zh) 2023-11-21
TW202300525A (zh) 2023-01-01
IL310558A (en) 2024-03-01
KR102628678B1 (ko) 2024-01-25
IL291308A (en) 2022-05-01
AR110418A1 (es) 2019-03-27
JP2020506883A (ja) 2020-03-05
AU2024220178A1 (en) 2024-10-17
MX2019007641A (es) 2019-09-09
US20190328897A1 (en) 2019-10-31
KR20190099246A (ko) 2019-08-26
WO2018114578A1 (de) 2018-06-28
US20220016258A1 (en) 2022-01-20
MX2023009205A (es) 2023-08-21
JP2022093432A (ja) 2022-06-23
RU2019122802A3 (ko) 2021-03-24
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