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CN105308070A - 抗tweakr抗体及其用途 - Google Patents

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CN105308070A
CN105308070A CN201480033756.4A CN201480033756A CN105308070A CN 105308070 A CN105308070 A CN 105308070A CN 201480033756 A CN201480033756 A CN 201480033756A CN 105308070 A CN105308070 A CN 105308070A
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S.哈默
U.格里灿
S.贝恩特
D.朱博夫
L.林登
S.克里斯琴
A.哈伦加
J.伯肯费尔德
C.弗里贝格
S.戈尔菲尔
A.艾克
S.格雷文
B.施特尔特-路德维希
M.拉施克
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Bayer Pharma AG
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Abstract

本发明提供对于TWEAKR(TNFRSF12A,FN14)特异性的重组抗原结合区和含有此类抗原结合区的抗体和功能片段。因此，所述抗体可用于治疗与TWEAKR的表达相关的肿瘤和其它病症和病况。本发明还提供编码前述抗体的核酸序列、含有其的载体、药物组合物和具有使用说明书的药剂盒。

Description

抗TWEAKR抗体及其用途
本发明提供对TWEAKR (TNFRSF12A, FN14)特异性的重组抗原结合区和含有此类抗原结合区的抗体和功能片段。
因此，所述抗体可用于治疗与TWEAKR的表达相关的肿瘤和其它病症和病况。本发明还提供编码前述抗体的核酸序列、含有其的载体、药物组合物和具有使用说明书的药剂盒。
发明背景
基于抗体的疗法被证明在各种癌症(包括实体瘤)的治疗中非常有效。例如，HERCEPTIN®已成功地用于治疗乳癌，且RITUXAN®在B细胞相关的癌症类型中是有效的。对于开发新颖的成功的基于抗体的疗法核心的是分离针对发现在肿瘤细胞上优先表达的细胞-表面蛋白的抗体，其能够在功能上改变相应受体的活性。
肿瘤坏死因子(TNF)，如凋亡的微弱诱导剂(TWEAK)和TWEAK受体(TWEAKR，别名TNFRSF12A、FN14、CD266；Swiss Prot Acc. Q9NP84, NP_057723)是参与炎症、增殖、侵袭、迁移、分化、凋亡和血管生成的TNF超家族配体-受体对(Winkles JA, Nat Rev Drug Discov. 2008 May;7(5):411-25; Michaelson JS和Burkly LC, Results Probl Cell Differ. 2009;49:145-60)。TWEAK以0.8-2.4 nM的亲和力结合至TWEAKR，并且是TNF家族结合该受体的唯一成员(Wiley SR等人, Immunity. 2001 Nov;15(5):837-46)。TWEAKR在正常组织中以相对低水平表达，但在损伤组织(其中其在组织重塑中具有作用)中显著地局部增加(Winkles JA, Nat Rev Drug Discov. 2008 May;7(5):411-25; Zhou等人, Mol Cancer Ther. 2011 Jul;10(7):1276-88; Burkly LC等人, Immunol Rev. 2011 Nov;244(1):99-114)。TWEAKR信号传导参与诸如创伤愈合、慢性自身免疫性疾病和急性缺血性中风(Burkly LC等人, Immunol Rev. 2011 Nov;244(1):99-114)的过程。此外，TWEAKR在各种实体瘤类型中高度表达，所述实体瘤类型如，例如胰腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、结肠直肠癌(CRC)、乳腺癌、肾癌、头颈癌、食管癌、膀胱癌、肝细胞癌、卵巢癌、黑色素瘤以及肝和骨转移(Culp P等人, Clin Cancer Res. 2010 Jan 15;16(2):497-508; Zhou H等人, J Invest Dermatol. 2013 Apr;133(4):1052-62)。增加的TWEAKR表达和更高肿瘤分级和/或不良预后的关联已经描述于脑癌(Tran NL等人, Cancer Res.2006 Oct 1;66(19):9535-42)、乳腺癌(Willis AL等人, Mol Cancer Res.2008 May;6(5):725-34; Wang J等人, Histol Histopathol.2013 Jan 9 [Epub ahead of print])、食管癌(Watts GS等人, Int J Cancer.2007 Nov 15;121(10):2132-9 2007)、前列腺癌(Huang M等人, Carcinogenesis.2011 Nov;32(11):1589-96)、胃癌(Kwon OH等人, Cancer Lett.2012 Jan 1;314(1):73-81)、神经母细胞瘤(Pettersen I等人, Int J Oncol.2013 Apr;42(4):1239-48)和膀胱癌(Shimada K等人, Clin Cancer Res.2012 Oct 1;18(19):5247-55)中。
TWEAKR的表达由生长因子如FGF、PDGF和VEGF诱导(Winkles JA, Nat Rev Drug Discov. 2008 May;7(5):411-25)。与该观察一致，已经显示，TWEAKR表达与NSCLC中的EGFR过表达或活化(Whitsett TG等人, Am J Pathol.2012 Jul;181(1):111-20)和乳腺癌中的HER2表达(Wang J等人, Histol Histopathol.2013 Jan 9 [Epub ahead of print]; Chao DT等人, J Cancer Res Clin Oncol.2013 Feb;139(2):315-25)相关。
TWEAK对TWEAKR的活化导致TNF受体相关因子(TRAF)招募至胞内结合域，导致经由规范和非规范的NF-kB途径的延长的NF-kB活化和细胞因子(如IL-8和MCP-1)分泌的诱导(综述于Michaelson JS和Burkly LC, Results Probl Cell Differ.2009;49:145-60)。这与描述的TWEAK/TWEAKR途径的促炎性作用完全一致。然而，负责经由TWEAKR的细胞杀伤的信号传导途径不太清楚，因为TWEAKR缺乏特征性的“死亡结构域”。在一些肿瘤细胞系(Kym-1、SKOV-3、OVCAR)中，其通过TNF和招募TRAF2、随后溶酶体降解所得的TRAF2-cIAP复合物而诱导凋亡(Nakayama M.等人, J Immunol. 2002 Jan 15;168(2):734-43; Schneider P等人, Eur J Immunol. 1999 Jun;29(6):1785-92; Vince JE等人, J Cell Biol. 2008 Jul 14;182(1):171-84)。在其它细胞系(HSC3、HT-29、KATO-III)中，TWEAK诱导的凋亡被报道为TNF非依赖的(Nakayama M等人, J Immunol. 2003 Jan 1;170(1):341-8; Wilson CA等人, Cell Death Differ. 2002 Dec;9(12):1321-33)。在一份新近报道中，显示TWEAK对凋亡的诱导依赖于Stat-1磷酸化的刺激，因为用JAK抑制剂治疗废除了TWEAK增加WiDr细胞中的胱天蛋白酶3/7活化的能力(Chapman MS等人, Cytokine. 2013 Jan;61(1):210-7)。
几项研究验证TWEAKR为肿瘤学目标。Michaelson等人已经显示，TWEAK的施用降低了鼠异种移植模型中的肿瘤生长(Michaelson JS等人, MAbs. 2011 Jul-Aug;3(4):362-75)。几个小组已经用激动性抗TWEAKR抗体模拟了该抗肿瘤作用。已经通过免疫小鼠和随后克隆选择和人源化生成了潜在的药物候选物，即BIIB0036/P4A8 (Michaelson JS等人, MAbs. 2011 Jul-Aug; 3(4):362-75)和PDL-192, (Culp PA等人, Clin Cancer Res.2010 Jan 15;16(2):497-508)。
PDL-192以5.5 nM的结合亲和力结合至TWEAKR (Culp PA等人, Clin Cancer Res.2010 Jan 15;16(2):497-508)，且抑制几种表达TWEAKR的癌细胞系的生长。然而，与TWEAK配体相比，PDL-192被显示在增殖和凋亡测定中关于EC/IC50的效力更低，且仅达到胱天蛋白酶3/7活化的降低功效(Vmax)(Culp PA等人, Clin Cancer Res. 2010 Jan 15;16(2): 497-508)。乳腺癌细胞系的较大实验对象组中的概况分析证实单体PDL-192的仅适度的抗增殖活性(Culp PA等人, Clin Cancer Res.2010 Jan 15;16(2):497-508; Chao DT等人, J Cancer Res Clin Oncol.2013 Feb;139(2):315-25)，其中27种细胞系中的仅5种响应，增殖抑制为>20％。所述抗体的交联或固定稍微增强抗体的抗增殖活性。此外，PDL-192表现出ADCC，且异种移植模型中描述的抗肿瘤活性被认为是ADCC和肿瘤细胞生长抑制效应的混合(Culp PA等人, Clin Cancer Res. 2010 Jan 15;16(2):497-508)。PDL-192的进一步局限性是缺乏物种交叉反应性，特别是小鼠和大鼠，其不允许例如评估常见的临床前研究作为毒理学研究。
描述为药物候选物的第二激动性抗TWEAKR抗体，BIIB036/P4A8以1.7 nM的亲和力结合至TWEAKR，这在与内源配体TWEAK类似的范围内(Michaelson JS等人, MAbs. 2011 Jul-Aug;3(4):362-75)。显示该抗体诱导癌细胞中NF-kB的活化和细胞因子释放，虽然与Fc-TWEAK (具有与重组可溶性TWEAK类似的活性的可溶性TWEAK (aa 106-249)的hIgG1 Fc-融合体)相比功效显著更低(Michaelson JS等人, Oncogene. 2005 Apr 14;24(16):2613-24)。这同样适用于细胞增殖测定以及用于凋亡的诱导，如用抗体处理细胞之后的TUNEL染色所示，其中BIIB036/P4A8的效力与Fc-TWEAK相比也显著降低。抗增殖活性在该抗体的多聚化之后增加，而且多聚化形式与重组Fc-TWEAK相比仍然功效较低。相反，BIIB036/P4A8是ADCC的有效诱导剂，且显示异种移植模型中的抗肿瘤活性在很大程度是依赖于Fc效应功能。
除了两种药物候选物外，已经描述了几个鼠抗体，其需要抗体工程改造用于人源化而可用于人治疗。对癌细胞具有抗增殖活性的第一抗TWEAKR抗体是由Nakayama等人描述的抗体Item 1-4 (Nakayama M等人, Biochem Biophys Res Commun.2003 Jul 11;306(4):819-25)。然而，这些抗体仅具有相对弱的激动活性，且显示充当关于TWEAK介导的TWEAKR活化的部分激动剂/拮抗剂。抗体136.1和18.3.3 (WO2009/020933)显示与TWEAK配体相比较高的亲和力结合，其没有转化为更有效的胱天蛋白酶活化。抗体P3G5和P2D3 (WO2009/140177)以与Fc-TWEAK相比显著更低功效在癌细胞中诱导细胞因子释放。总之，关于本领域中描述的抗TWEAKR抗体的凋亡诱导和增殖抑制的TWEAKR激动活性有限，且没有达到或超过内源配体TWEAK的功效。这种激动活性的缺乏不是由于降低的亲和力，因为这些抗体以与内源配体TWEAK相比类似范围内的亲和力结合至TWEAKR (Michaelson JS等人, MAbs.2011 Jul-Aug;3(4):362-75; Culp PA等人, Clin Cancer Res.2010 Jan 15;16(2):497-508)，且具有更高结合亲和力的抗体也不一定表现出更有效的信号传导活性(Culp PA等人, Clin Cancer Res.2010 Jan 15;16(2):497-508)。显示先前描述的抗体的抗肿瘤活性依赖于Fc效应功能，且显示ADCC在小鼠模型中发挥对于体内功效的显著作用。然而，鉴于抗体和免疫效应细胞穿透入实体瘤的挑战，ADCC和经由Fc-Fc受体(FcR)相互作用的体内交联对临床上实体瘤中的抗肿瘤活性的贡献仍不清楚(Culp PA等人, Clin Cancer Res. 2010 Jan 15;16(2): 497-508)。此外，携带FcgRIIIA的低亲和力等位基因的患者由于较低的Fc-FcR相互作用能力将表现出降低的来自治疗的益处(Varchetta S等人, Cancer Res. 2007 Dec 15;67(24):11991-9)。
因此，高度需要与内源配体TWEAK相比在相同或甚至更高程度上具有通过TWEAKR的超活化诱导癌细胞凋亡和生长抑制的强固有能力的可开发的人抗体。由于多年来凋亡的诱导和增殖的抑制是诱导患者中的抗肿瘤应答中的有效概念(Hanahan D and Weinberg RA, Cell.2000 Jan 7;100(1):57-70; Kim R等人, Cancer Chemother Pharmacol.2002 Nov;50(5):343-52; Fesik SW, Nat Rev Cancer.2005 Nov;5(11):876-855)，所以预期这些抗体在人中的实体瘤中显示增加的抗肿瘤活性，且因此是对于癌症的治疗有希望的药物候选物。
发明概述
本发明涉及抗体、或其抗原结合抗体片段、或其变体，其导致TWEAKR的强烈活化，因此导致在显示TWEAKR的过表达的各种癌细胞中的凋亡的强烈诱导。本文描述的抗体对癌细胞凋亡的诱导与本领域中描述的所有抗体(例如，PDL-192或BIIB0036/P4A8；例如需要添加交联剂)是更有效的。本发明的抗体的独特特性基于新颖结合表位，其特征在于所述抗体与TWEAKR (SEQ ID NO:169；且参见图1)的位置47的氨基酸(D47)的选择性结合。
本发明的抗体因此适合于治疗癌症以及其转移，特别是表达TWEAKR的肿瘤，诸如结肠直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、头颈癌、食管癌、黑色素瘤、肝细胞癌、膀胱癌、胃癌、乳腺癌、胰腺癌、肾细胞癌、前列腺癌、卵巢癌和子宫颈癌。
本发明描述了抗体，其与现有抗TWEAKR抗体的差异在于它们在大多数细胞系中以与内源配体TWEAK抗体相比优异的水平诱导癌细胞凋亡的强烈活化。本发明的抗体或其抗原结合片段a) 强烈活化TWEAKR，b) 诱导癌细胞中的凋亡，c) 诱导从癌细胞的细胞因子分泌，d) 所有一起导致所述抗体在体内肿瘤实验中的抗肿瘤活性，e) 此外，当在单独的抗体没有作用的实验条件下与肥皂草毒蛋白-缀合的二抗孵育时，所述抗体导致TWEAKR的内化和癌细胞增殖的抑制，f) 与几个物种交叉反应。本文更充分描述本发明的这些和其它目标。
本发明的抗体可以与已知的药物共同施用，并且在一些情况下，所述抗体自身可被修饰。例如，抗体可以与细胞毒性剂、免疫毒素、毒簇或放射性同位素缀合以潜在地进一步增加功效。
本发明进一步提供这样的抗体，其构成用于诊断TWEAKR表达与正常组织相比提高的恶性病况或发育异常病况的工具。本发明提供缀合至可检测标记的抗TWEAKR抗体。优选的标记是放射性标记、酶、发色团或荧光剂。
本发明还涉及编码本发明的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸、表达本发明的抗体或其抗原结合片段的细胞、用于产生本发明的抗体或其抗原结合片段的方法、用于使用本发明的抗体或其抗原结合片段抑制发育异常细胞的生长的方法和用于使用本发明的抗体或其抗原结合片段治疗和检测癌症的方法。
本发明还涉及分离的核酸序列，其各自可以编码对TWEAKR的表位特异性的前述抗体或其抗原结合片段。本发明的核酸适合于抗体或抗原结合抗体片段的重组产生。因此，本发明还涉及含有本发明的核酸序列的载体和宿主细胞。
本发明的组合物可以用于治疗性或预防性应用。因此，本发明包括药物组合物，其因此包含本发明的抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体或赋形剂。在相关方面，本发明提供用于治疗与表达TWEAKR的细胞的不期望存在相关的病症或病况的方法。在一个优选实施方案中，所述病症是癌症。此方法包括向有需要的对象施用有效量的含有本文描述或考虑的本发明抗体的药物组合物的步骤。
本发明还提供用于使用抗体文库以分离特异性结合至TWEAKR的此文库的一个或多个成员的说明书。
附图描述
图 1：不同物种的TWEAKR富含半胱氨酸的结构域(aa 34-68)的比对。(数字表明包括信号序列的全长构建体中的氨基酸位置；SEQ ID NO:169)。
图 2：A - TWEAKR (SEQ ID NO:169)的结构的示意图。该图显示包括富含半胱氨酸的结构域(36-67)的细胞外结构域(aa 28-80) (SEQ ID NO:168)、跨膜结构域 – TM (81-101)和细胞内结构域(102-129)。TPP-2202 – 融合至hIgG1的Fc结构域的完整胞外域(28-80)。TPP-2203 – 融合至hIgG1的Fc结构域的N-和C-末端截短的细胞外结构域(34-68)。二硫键Cys36-Cys49、Cys52-Cys67和Cys55-Cys64由黑条表明。与纯富含半胱氨酸的结构域相比，TPP-2203 N-末端含有多两个氨基酸且C-末端含有多一个氨基酸，以确保正确的折叠。TPP-1984 – 融合至HIS6标签的C-末端截短的细胞外结构域(28-68)。所有三种构建体都显示相当的与本发明的抗体和PDL-192(TPP-1104)的结合。P4A8(TPP-1324)的确仅结合至完整细胞外结构域(TPP-2202)。
B – 细胞外结构域的氨基酸序列：已公开aa46对于TWEAK配体结合是必要的，aa47已表征为对于本发明的抗体的结合是必要的。
图 3：TWEAKR胞外域与本发明的抗体和参考抗体的相互作用。显示了用TWEAKR-Fc融合蛋白(TPP-2202)包被(1µg/ml)和0.08 µg/ml(空心柱)和0.3 µg/ml(实心柱)的生物素化的IgG作为可溶性结合伴侣的ELISA的结果。用链霉亲和素-HRP和Amplex-Red底物进行检测。Y是“ELISA信号强度[Rfu]”；X是“测试的抗体构建体”：a是“TPP-2090”；b是“TPP-2084”；c是“PDL-192(TPP-1104)”；d是“P4A8(TPP-1324)”；e是“P3G5(TPP-2195)”；f是“136.1(TPP-2194)”；h是“ITEM1”；i是“ITEM4”；j是鼠同种型对照；k是人同种型对照。所有测试的抗体都显示以80 ng/ml的浓度的饱和结合。
图 4：TWEAKR富含半胱氨酸的结构域与本发明的抗体和参考抗体的相互作用。显示了用TWEAKR(34-68)-Fc融合蛋白(TPP-2203)包被(1µg/ml)和0.08 µg/ml(空心柱)和0.3 µg/ml(实心柱)的生物素化的IgG作为可溶性结合伴侣的ELISA的结果。用链霉亲和素-HRP和Amplex-Red底物进行检测。Y是“ELISA信号强度[Rfu]”；X是“测试的抗体构建体”：a是“TPP-2090”；b是“TPP-2084”；c是“PDL-192(TPP-1104)”；d是“P4A8(TPP-1324)”；e是“P3G5(TPP-2195)”；f是“136.1(TPP-2194)”；h是“ITEM1”；i是“ITEM4”；j是鼠同种型对照；k是人同种型对照。本发明的抗体结合至所述富含半胱氨酸的结构域。
图 5：TWEAKR(28-68)与本发明的抗体和参考抗体的相互作用。显示了用TWEAKR (28-68)-HIS (TPP-1984)包被(1µg/ml)和0.08 µg/ml(空心柱)和0.3 µg/ml(实心柱)的生物素化的IgG作为可溶性结合伴侣的ELISA的结果。用链霉亲和素-HRP和Amplex-Red底物进行检测。Y是“ELISA信号强度[Rfu]”；X是“测试的抗体构建体”：a是“TPP-2090”；b是“TPP-2084”；c是“PDL-192(TPP-1104)”；d是“P4A8(TPP-1324)”；e是“P3G5(TPP-2195)”；f是“136.1(TPP-2194)”；h是“ITEM1”；i是“ITEM4”；j是鼠同种型对照；k是人同种型对照。本发明的抗体结合至所述富含半胱氨酸的结构域。抗体P4A8(TPP-1324)、P3G5 (TPP-2195)、ITEM-1和ITEM-4显示受损的结合。
图 6：A - 富含半胱氨酸的结构域的丙氨酸扫描。分析TWEAKR(34-68)-Fc的突变蛋白的PDL-192(TPP-1104) (X)和TPP-2090 (Y)结合。S37A、R38A、S40A、W42A、S43A、D45A、D47A、K48A、D51A、S54A、R56A、R58A、P59A、H60A、S61A、D62A、F63A和L65A突变蛋白在HEK293细胞中表达(黑色菱形)。包被PDL-192(TPP-1104)和TPP-2090 (1 µg/ml)，且对于TWEAKR突变蛋白结合，添加HEK293发酵液的八倍稀释的上清液。X是“PDL-192(TPP-1104)相互作用的ELISA强度[Rfu]”，Y是“TPP-2090相互作用的ELISA强度[Rfu]”。TPP-2090 (Y)显示受损的对于D47A TWEAKR突变蛋白的结合(封闭框)且PDL-192(TPP-1104) (X)显示受损的与R56A的结合(虚线框)。
B - Y是“通过野生型结合信号均一化的％结合[％]”，1是“TPP-2090”；2是“PDL-192(TPP-1104)”；3是“P4A8(TPP-1324)”。包被抗体(1 µg/ml)，添加250 ng/ml的TWEAKR变体，经由抗HIS HRP检测。TTP-2090显示与野生型构建体相比小于5％结合。
C - Y是“通过野生型结合信号均一化的％结合[％]”，1是“TPP-2090”；2是“TPP-2149”, 3是“TPP-2093”；4是“TPP-2148”；5是“TPP-2084”；6是“TPP-2077”；7是“TPP-1538”；8是“TPP-883”；9是“TPP-1854”；10是“TPP-1853”；11是“TPP-1857”；12是“TPP-1858”；13是“PDL-192(TPP-1104)”。包被抗体(1 µg/ml)，添加250 ng/ml的TWEAKR变体，经由抗HIS HRP检测。除了PDL-192以外的所有变体都显示与野生型构建体相比小于5％结合。
图 7：由Pellegrini等人公开的TWEAKR胞外域的NMR结构(FEBS 280:1818-1829)。TWEAK结合依赖于L46(Pellegrini等人)，TPP-2090结合依赖于D47且PDL-192 结合依赖于R56。PDL-192结合TWEAK配体结合位点的对面，TPP-2090直接结合至TWEAK配体位点。
图 8：为了区分本发明的抗体和参考抗体的结合表位，进行竞争实验。注射二抗之后缺乏第二结合事件表明各抗体对内的明显竞争。非竞争抗体对显示二抗注射之后高于背景的明显结合信号。此外，自我竞争(一抗和二抗相同)的研究被监测为内部系统对照。(-) 未检测到第二结合；(+)第二结合。本发明的抗体与所有测试的抗体竞争。
图 9：为了区分本发明的抗体和参考抗体的结合表位，进行竞争实验。通常，所有分析的抗TWEAKR抗体可以成簇为三个不同的“竞争组”。一组专门含有TPP-2084和TPP-2090，两者均显示与所有其它测试的成员的竞争。这些其它成员可以分成两个独立的抗体集合，其不显示任何彼此之间的竞争。两种本发明的抗体均结合至新的且独特的表位。
图 10：所有29种已知的TNF受体超家族成员的同源树。最接近的同源物TNFRSF13C和TNFRSF17只有约30％序列同一性。
图 11：用所有29种TNF受体超家族成员的结合ELISA用于TPP-2090的选择性评估。显示了ELISA的结果：Y是“ELISA信号强度[Rfu]”；X是“测试的TNF受体超家族蛋白(Fc-融合蛋白)”：1是“TWEAKR”；2是“TWEAKR”；3是“Apo-3”；4是“Trail-R1”；5是“Trail-R2”；6是“CD385”；7是“CD95”；8是“Rank”；9是“TNF-R1”；10是“TNF-R2”；11是“BAFF-R”；12是“DcR3”；13是“BCMA”；14是“TACI”；15是“OX40”；16是“CD30”；17是“CD27”；18是“CD40”；19是“护骨蛋白”；20是“EDAR”；21是“GITR”；22是“HVEM”；23是“NGF R”；24是“Trail R3”；25是“淋巴毒素(Lymphotioxin) ß R”；26是“Trail R4”；27是“EDA2R”；28是“TROY”；29是“RELT”；30是“4-1BB”。在(1)中，采用300 pM TPP-2090，在(2)中，采用75 nM TPP-2090。TPP-2090在300pM的非常低的浓度(1)和75 nM的高浓度(2)饱和结合至TWEAKR。对于与所有其它TNF受体超家族成员(3 - 30)的结合分析，使用75 nM TPP-2090。TPP-2090选择性结合至TWEAKR。
图 12：抗TWEAKR抗体与HT-29细胞的结合的FACS分析。Y是“FACS信号的背景校正的几何-平均值[au]”。显示了与如所示10µg/ml的抗体孵育的HT-29细胞的FACS分析后的荧光减去与单独的二抗孵育的HT-29细胞的荧光的几何-平均值。在该浓度，本发明的抗体(TPP-1538、TPP-2084、TPP-2090)显示与已知抗体[PDL-192(TPP-1104)和P4A8(TPP-1324)]相比较低的细胞结合。
图 13：HT-29细胞中抗TWEAKR抗体的胱天蛋白酶3/7活化。X是“测试的抗TWEAKR抗体[µg/ml]”；Y是“相对光单位[RLU]”。将HT-29细胞与如所示(0.03-300µg/ml)不同浓度的抗TWEAKR抗体在IFNγ存在的情况下孵育24小时。针对抗体浓度绘制如通过胱天蛋白酶3/7 Glo试剂(Promega)的发光测量的胱天蛋白酶3/7活性。显示以一式三份进行的1-3次代表性实验的平均结果，包括标准偏差。实心符号显示本发明的抗体，空心符号显示已知的抗体[PDL-192(TPP-1104)；P4A8(TPP-1324)，136.1(TPP-2194)]。本发明的抗体(TPP-1538、TPP-1854、TPP-2084、TPP-2090)与已知抗体[PDL-192(TPP-1104)；P4A8(TPP-1324)和136.1(TPP-2194)]相比表现出诱导胱天蛋白酶3/7活化的更强的功效。
图 14：抗TWEAKR抗体在WiDr(A)和786-O(B)细胞中的抗增殖活性。X是“测试的抗TWEAKR抗体[µg/ml]”；Y是“相对于未处理的对照细胞的增殖的细胞增殖[％]”。将细胞与如所示(0.03-300µg/ml)不同浓度的抗TWEAKR抗体孵育96小时(WiDr细胞不存在；786-O细胞，在IFNγ存在的情况下)。显示以一式三份进行的代表性实验的平均结果，且通过误差条指示标准偏差。实心符号：本发明的抗体，空心符号：已知的抗体[PDL-192(TPP-1104)和P4A8 (TPP-1324)]。本发明的抗体(TPP-1538、TPP-1854、TPP-2084、TPP-2090)与已知抗体[PDL-192(TPP-1104)和P4A8(TPP-1324)]相比表现出抑制细胞增殖的更强的功效。
图 15：A375细胞中抗TWEAKR抗体诱导的IL-8分泌。X是“测试的抗TWEAKR抗体[µg/ml]”；Y是“IL-8水平[pg/ml]”。将A375细胞与如所示(0.03-300µg/ml)不同浓度的抗TWEAKR抗体孵育。24小时处理之后在细胞的上清液中测定IL-8的水平(且针对使用的抗体浓度进行绘制。显示以一式三份进行的1-3次代表性实验的平均结果，包括标准偏差。实心符号显示本发明的抗体，空心符号显示已知的抗体[PDL-192(TPP-1104)；P4A8(TPP-1324)，136.1(TPP-2194)]，且指示用同种型对照抗体的处理(C)。本发明的抗体(TPP-1538、TPP-1854、TPP-2084、TPP-2090)与已知抗体[PDL-192(TPP-1104)、P4A8(TPP-1324)、136.1(TPP-2194)]相比表现出从A375细胞诱导IL-8分泌的更强的功效。
图 16：小鼠中的异种移植物中抗TWEAKR抗体诱导的人IL-8分泌。
A：携带WiDr异种移植肿瘤的小鼠用3 mg/kg TPP-2090(空心符号)或媒介物(C – 实心符号)的单一剂量处理，和携带肿瘤的小鼠的血浆中在处理之后不同的时间点测定的人IL-8的水平(IL-8 pg/ml)。X是“处理后的小时数[h]”；Y是“Il-8水平[pg/ml]”。指示来自每组3个动物的结果，误差条代表标准偏差。在携带WiDr肿瘤的小鼠中，用TPP-2090处理之后，以时间依赖的方式特异性诱导人IL-8分泌。
B: 携带A375肿瘤(实心符号)或未携带肿瘤(空心符号)小鼠用10 mg/kg TPP-1538、媒介物或同种型对照抗体的单一剂量处理。C1是“媒介物对照”；C2是“同种型对照抗体”；Y是“人Il-8的水平[pg/ml]”。显示了处理之后7h每组4只小鼠的血清中测定的人IL-8的水平。TPP-1538在携带A375肿瘤的小鼠中特异性诱导IL-8分泌，但在同等处理的无肿瘤动物中没有诱导。
图 17：TWEAKR在抗体结合至表达内源TWEAKR的细胞后的特异性内化的时间进程的显微镜评估。对肾癌细胞系786-O研究TPP-1538和TPP-2090的内化。针对如所示不同的孵育时间绘制用本发明的抗体(以1/µg/ml)或同种型对照(以5µg/ml)处理之后的颗粒计数/细胞(X是“时间[min]”；Y是“颗粒计数/细胞[量]”)。本发明的抗体(TPP-1538、TPP-2090)显示表达TWEAKR的细胞中的快速和特异性的内化。
图 18：抗TWEAKR抗体在与肥皂草毒蛋白-缀合的二抗孵育之后对786-O细胞增殖的抑制(Hum-Zap测定)。将786-O细胞与TWEAKR或同种型对照抗体在10nM抗体浓度的肥皂草毒蛋白-缀合的二抗存在或不存在的情况下孵育48小时(在干扰素γ不存在的情况下)。X是“测试的抗体变体”，a是“媒介物对照”，b是“同种型对照抗体”，c是“TPP-2084”，d是“TPP-2090”；Y是“与未处理的对照细胞相比的细胞增殖[％]”。对于在肥皂草毒蛋白-缀合的二抗存在(空心柱)或不存在(实心柱)的情况下用不同的抗体处理的786-O细胞，绘制与未处理的对照细胞相比的细胞增殖。显示来自一式三份的一个代表性实验的结果，且通过误差条指示标准偏差。在使用的实验条件，仅本发明的抗体(TPP-2084、TPP-2090)在肥皂草毒蛋白-缀合的二抗存在的情况下几乎完全抑制786-O细胞的增殖。因此，从抗TWEAKR抗体在肥皂草毒蛋白-缀合的二抗存在的情况下观察到的抗增殖效应是抗体-复合物结合至表达TWEAKR的细胞之后肥皂草毒蛋白的特异性内化的结果。
图 19：在肿瘤细胞接种后第7天开始的用0.3、1.0和3.0 mg/kg (i.v., q4dx3)处理之后抗TWEAKR抗体在人肾细胞癌异种移植物786-O中的功效。显示了在第40天时的最终肿瘤重量。A是“用PBS (i.v. q4dx3)处理的媒介物组”。B是“同种型, 3 mg/kg”，C是“TPP-2084, 0.3 mg/kg”，D是“TPP-2084, 1 mg/kg”，E是“TPP-2084, 3 mg/kg”，F是“TPP-2090, 0.3 mg/kg”，G是“TPP-2090, 1 mg/kg”，H是“TPP-2090, 3 mg/kg”。(Y是“n=8的肿瘤重量平均值；SD [g]”)。
图 20：在单一治疗和与伊立替康(5mg/kg，i.v.，4天应用，3天不应用)和瑞格非尼(10mg/kg，p.o.，每天)的组合治疗中，3mg/kg TPP-2090 (i.v., q4dx7)在人结肠癌异种移植物WiDr中的功效。用确立的约40mm2的肿瘤接种后7天开始治疗。A是“用PBS (i.v. q4dx7)处理的媒介物组”。B是“TPP-2090, 3 mg/kg”，C是“TPP-2090, 10 mg/kg”，D是 “伊立替康, 5 mg/kg”，E是“Combo TPP-2090 3 mg/kg + 伊立替康, 5 mg/kg”，F是“瑞格非尼, 10 mg/kg”，G是“Combo TPP-2090, 3mg/kg + 瑞格非尼 10 mg/kg”。(X是“接种之后的时间(天数)”，Y是“肿瘤面积，n=10的平均值；SD [mm2])”。
图 21：在单一治疗和与紫杉醇(16mg/kg, i.v., q7dx4)的组合治疗中，10mg/kg TPP-2090 (i.v., q4dx8)在人肺癌异种移植物NCI-H322中的功效。用确立的约45mm2的肿瘤接种后14天开始治疗。A是“用PBS (i.v. q4dx8)处理的媒介物组”。B是“TPP-2090, 5mg/kg”，C是“TPP-2090, 10mg/kg”，D是“紫杉醇, 16 mg/kg”，E是“Combo TPP-2090 10 mg/kg + 紫杉醇 16 mg/kg”。(X是“接种之后的时间(天数)”；Y是“肿瘤面积，n=10的平均值；SD [mm2]”)。
图 22：用本发明的抗体处理之后异种移植物中的增殖性细胞的减少。通过免疫组织化学针对增殖标记Ki67染色用PBS (i.v., q4dx7:A)或TPP-2090 (10 mg/kg , i.v. q4dx7:B)处理之后来自WiDr异种移植肿瘤的冷冻切片。肿瘤细胞接种之后第7天开始处理，且从在研究结束时(第29天)取的肿瘤制备冷冻切片。分析每组N=3个肿瘤，且显示代表性图像。用TPP-2090处理导致小鼠中的WiDr异种移植肿瘤中的Ki67阳性细胞(图像中深色染色的细胞)的强烈降低。
图 23：抗TWEAKR抗体在体内对Stat-1和NF-κB2信号传导途径的诱导。用PBS (i.v., q4dx7:泳道1&2)或TPP-2090 (3mg/kg, i.v., q4dx7:泳道3&4)处理之后的快速冷冻的WiDr异种移植肿瘤的裂解物进行用针对P-Stat1 (a)、Stat-1 (b)、NF-κ2 – p52 (c)和GAPDH (d)的特异性抗体检测的Western印迹分析。肿瘤细胞接种之后第7天开始小鼠的处理，且从在研究结束时(第29天)取的快速冷冻的肿瘤制备裂解物。显示了来自每组2个代表性动物的印迹。用TPP-2090处理导致WiDr异种移植肿瘤中的P-Stat1和总Stat1水平以及NF-κB2活化(通过p52条带的出现显示)的强烈活化。
图 24：抗TWEAKR抗体的共有序列。CDR-H1 – 位置5的X：M或I；CDR-H2 – 位置8的X：S或K；CDR-L1 – 位置8的X：G或S；CDR-L2 – 位置1的X：N、A或Q；CDR-L3 – 位置5的X：T或S；位置6的X：S或T；位置8的X：F或G。
图 25：连续CDR序列命名。(A) 将方框中的位置多样化用于收集突变(成熟过程)。(B) 在一个重组文库中重组方框中的单一取代。
图 26：本发明的序列。
发明详述
本发明基于对TWEAKR具有特异性亲和力且可向对象递送治疗益处的新颖抗体的发现。本发明的抗体(其可以是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)可用于本文将更全面描述的许多情况中。
定义
除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。然而，以下参考文献可以为本发明涉及领域的技术人员提供本发明中使用的许多术语的一般定义，并且可以参考和使用，只要此类定义与本领域中通常理解的含义一致。此类参考文献包括，但不限于：Singleton等人, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2d ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991);和Lackie等人, The Dictionary of Cell & Molecular Biology (3d ed. 1999);和Cellular and Molecular Immunology, 编 Abbas, Lichtman and Pober, 2nd Edition, W.B. Saunders Company。可以查询本领域普通技术人员可用于提供具有本领域中通常理解的含义的本文使用的术语的定义的任何额外的技术资源。对于本发明的目的，进一步定义以下术语。本说明书中别处定义了额外术语。如本文和所附权利要求中所使用，单数形式“一个/种(a)”和“该(the)”包括复数对象，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提及“一种基因”是指一种或多种基因，并且包括本领域技术人员已知的其等效物，等等。
术语“多肽”和“蛋白”在本文中可互换使用来指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。除非另外指出，特定的多肽序列也隐含地涵盖其保守修饰的变体。
“人”抗体或其抗原结合片段在本文定义为不是嵌合的(例如非“人源化的”)且并非来自(完全或部分)非人物种的抗体或其抗原结合片段。人抗体或其抗原结合片段可源自人或可以是合成的人抗体。“合成的人抗体”在本文定义为具有完全或部分在计算机芯片上源自合成序列的序列的抗体，所述合成序列基于已知人抗体序列的分析。可以例如通过分析人抗体或抗体片段序列的数据库且利用从中获得的数据设计多肽序列，来实现人抗体序列或其片段的在计算机芯片上的设计。人抗体或其抗原结合片段的另一个实例是由从人来源的抗体序列的文库分离的核酸编码的人抗体或其抗原结合片段(例如此文库基于取自人天然来源的抗体)。人抗体的实例包括如Söderlind等人, Nature Biotech. 2000, 18:853-856中描述的抗体。
“人源化抗体”或其人源化抗原结合片段在本文定义为这样的人源化抗体或其人源化抗原结合片段：(i)源自非人来源(例如携带异种免疫系统的转基因小鼠)，所述抗体基于人种系序列；(ii)其中非人抗体的构架区的氨基酸通过遗传工程改造部分转换为人氨基酸序列，或(iii)CDR移植的，其中可变结构域的CDR来自非人来源，而可变结构域的一个或多个构架是人来源的，且恒定结构域(如果有的话)是人来源的。
“嵌合抗体”或其抗原结合片段在本文中定义为这样的嵌合抗体或其抗原结合片段，其中可变结构域源自非人来源，且一些或所有恒定结构域源自人来源。
如本文所使用的术语“单克隆抗体”是指获得自基本均质抗体群体的抗体，即除了可以少量存在的可能突变(例如天然存在的突变)以外，构成该群体的各个抗体是相同的。因此，术语“单克隆”表明抗体特征为不是离散抗体的混合物。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，单克隆抗体制备物的各单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了其特异性以外，单克隆抗体制备物是有利的，因为它们通常未被其它免疫球蛋白污染。术语“单克隆”不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。术语单克隆抗体特别地包括嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。如本文所使用的“激动剂/激动性抗体”是模拟目标多肽的功能活性中的至少一种的抗体(此处为TWEAKR配体TWEAK)。
如本文所使用，抗体“特异性结合至”目的抗原(例如肿瘤相关的多肽抗原目标(在这里为TWEAKR))、对目的抗原“特异性”或“特异性识别”目的抗原，是以足够的亲和力结合抗原的抗体，使得所述抗体可在靶向表达抗原的细胞或组织中用作治疗剂且不与其它蛋白显著交叉反应或不与前述抗原目标的直向同源物(ortholog)和变体(例如突变形式、剪接变体或蛋白水解截短形式)以外的蛋白显著交叉反应。例如对抗原具有以下单价KD的抗体或其抗原结合片段可表现出如本文所使用的术语“特异性识别”或“特异性结合至”特定多肽或特定多肽目标上的表位或者对特定多肽或特定多肽目标上的表位“特异性”：小于约10-4 M、或者小于约10-5 M、或者小于约10-6 M、或者小于约10-7 M、或者小于约10-8 M、或者小于约10-9 M、或者小于约10-10 M、或者小于约10-11 M、或者小于约10-12 M或更小。如果抗体能够将抗原与一种或多种参考抗原区别开，则此抗体“特异性结合至”此抗原、对此抗原“特异性”或“特异性识别”此抗原。在其最普遍的形式中，“特异性结合”、“特异性结合至”、“对…特异性”或“特异性识别”是指根据例如以下方法之一测定的抗体区别目的抗原和无关抗原的能力。此类方法包括但不限于Western印迹、ELISA测试、RIA测试、ECL测试、IRMA测试和肽扫描。例如，可实施标准ELISA测定。可通过标准显色(例如二抗与辣根过氧化物酶和四甲基联苯胺与过氧化氢)实施评分。在某些孔中的反应通过例如在450 nm的光密度来评分。典型背景(=阴性反应)可以是0.1 OD；典型阳性反应可以是1 OD。这意味着阳性/阴性的差异是大于5倍、10倍、50倍且优选大于100倍。通常不使用单一参考抗原，而是约三至五种无关抗原的集合，例如奶粉、BSA、转铁蛋白等，来进行结合特异性的测定。
“结合亲和力”是指分子的单一结合位点与其结合伴侣之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所使用的“结合亲和力”是指反映结合对成员(例如抗体和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。解离常数“KD”通常用来描述分子(诸如抗体)和其结合伴侣(诸如抗原)之间的亲和力，即配体如何紧密地结合至特定蛋白。配体-蛋白亲和力受两个分子之间的非共价分子间相互作用的影响。亲和力可通过本领域已知的常用方法(包括本文描述的方法)进行测量。在一个实施方案中，使用根据实施例2的Biacore T100仪器(GE Healthcare Biacore, Inc.)，通过使用表面等离振子共振测定法测量本发明的“KD”或“KD值”。其它合适的装置是BIACORE T200、BIACORE(R)-2000、BIACORe 4000、BIACORE (R)-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)或ProteOn XPR36仪器(Bio-Rad Laboratories, Inc.)。
如本文所使用，术语“抗体”意指免疫球蛋白分子，其优选由四条多肽链(两条重(H)链和两条轻(L)链(其通常通过二硫键相互连接))构成。每条重链由重链可变区(本文简称为VH)和重链恒定区构成。重链恒定区可包含例如三个结构域CH1、CH2和CH3。各轻链由轻链可变区(本文简称为VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域(CL)构成。可将VH和VL区进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其穿插于更保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL通常由三个CDR和至多四个FR构成，其例如以下列顺序从氨基末端至羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
如本文所使用，术语“互补决定区(CDR；例如CDR1、CDR2和CDR3)是指抗体可变结构域的氨基酸残基，其存在是抗原结合所必需的。各可变结构域通常具有三个CDR区，被称为CDR1、CDR2和CDR3。各互补决定区可包含来自由Kabat定义的“互补决定区”的氨基酸残基(例如轻链可变结构域中的约残基24-34 (L1)、50-56 (L2)和89-97 (L3)和重链可变结构域中的约残基31-35 (H1)、50-65 (H2)和95-102 (H3)；(Kabat等人, Sequences of Proteins of Immulological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))和/或来自“高变环”的那些残基(例如轻链可变结构域中的约残基26-32 (L1)、50-52 (L2)和91-96 (L3)和重链可变结构域中的约残基26-32 (H1)、53-55 (H2)和96-101 (H3)(Chothia和Lesk; J Mol Biol 196: 901-917 (1987))。在一些情况下，互补决定区可包括来自由Kabat定义的CDR区和高变环两者的氨基酸。
根据其重链恒定结构域的氨基酸序列，可将完整抗体分为不同的“类型”。存在五种主要的完整抗体类型：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，且这些中的几种可进一步分成“亚类”(同种型)，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同抗体类型的重链恒定结构域分别称为[α]、[δ]、[ε]、[γ]和[μ]。不同免疫球蛋白类型的亚基结构和三维构型是众所周知的。如本文所使用的抗体常规称为抗体及其功能片段。
本文抗体/免疫球蛋白的“功能片段”或“抗原结合抗体片段”被定义为保留抗原结合区的抗体/免疫球蛋白的片段(例如IgG的可变区)。抗体的“抗原结合区”通常见于抗体的一个或多个高变区中，例如CDR1、CDR2和/或CDR3区域；然而，可变“构架”区也可诸如通过提供用于CDR的支架，而在抗原结合中发挥重要作用。优选地，“抗原结合区”包含可变轻(VL)链的至少氨基酸残基4-103和可变重(VH)链的至少氨基酸残基5-109，更优选VL的氨基酸残基3-107和VH的氨基酸残基4-111，且特别优选的是完整的VL和VH链(VL的氨基酸位置1-109和VH的氨基酸位置1-113；根据WO 97/08320编号)。用于本发明的优选的免疫球蛋白类型是IgG。
本发明的“功能片段”或“抗原结合抗体片段”包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；单结构域抗体(DAb)、线性抗体；单链抗体分子(scFv)和由抗体片段形成的多特异性(诸如二特异性和三特异性)抗体(C. A. K Borrebaeck, 编辑(1995) Antibody Engineering (Breakthroughs in Molecular Biology), Oxford University Press; R. Kontermann & S. Duebel, 编辑(2001) Antibody Engineering (Springer Laboratory Manual), Springer Verlag)。“多特异性”或“多功能性”抗体之外的抗体被理解为其各个结合位点相同。可将F(ab')2或Fab工程改造以尽可能降低或完全除去在CH1和CL结构域之间存在的分子间二硫化物相互作用。
本文中的术语“Fc区”用于定义含有恒定区的至少一部分的免疫球蛋白重链的C-末端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基-末端。然而，Fc区的C-末端赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。除非在本文中另有规定，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号根据EU编号系统，也称为EU索引，如描述于Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991。
本发明中考虑的抗体或抗原结合抗体片段的变体是其中针对TWEAKR的抗体或抗原结合抗体片段的结合活性得到维持的分子。
本发明中考虑的结合蛋白是例如抗体模拟物，诸如亲和体(Affibodies)、Adnectins、Anticalins、DARPins、亲合体(Avimer)、纳米抗体(综述于Gebauer M.等人, Curr. Opinion in Chem. Biol. 2009; 13:245-255; Nuttall S.D.等人, Curr. Opinion in Pharmacology 2008; 8:608-617)。
如本文所使用，术语“表位”包括能够特异性结合至免疫球蛋白或T细胞受体的任何蛋白决定簇。表位决定簇通常由分子的化学活性表面组群(诸如氨基酸或糖侧链或其组合)组成，且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特性。
“分离的”抗体是已经鉴定且与表达所述抗体的细胞组分分离的抗体。细胞的污染物组分是可干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，且可包括酶、激素和其它蛋白性或非蛋白性溶质。在优选实施方案中：抗体被纯化(1)至大于95重量%的抗体，且在一个进一步优选实施方案中，大于99%重量，如例如通过Lowry方法、UV-Vis光谱法或通过SDS-毛细管凝胶电泳(例如在Caliper LabChip GXII、GX 90或Biorad Bioanalyzer装置上)测定，被纯化(2)至足以获得N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)在还原或非还原条件下使用考马斯蓝或优选银染色，通过SDS-PAGE，被纯化至同质性。分离的天然存在的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为抗体的天然环境的至少一种组分将不存在。然而，通常，分离的抗体可通过至少一个纯化步骤来制备。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指细胞毒性的一种形式，其中结合至某些细胞毒性细胞(例如NK细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc γ受体(FcγR)的分泌Ig使得这些细胞毒性效应子细胞特异性结合至携带抗原的目标细胞，且随后例如用细胞毒素杀死目标细胞。为了评价目的抗体的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定法，诸如美国专利号5,500,362或5,821,337或美国专利号6,737,056 (Presta)中描述的体外ADCC测定法。用于此类测定法的有用效应子细胞包括PBMC和NK细胞。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体存在的情况下目标细胞的裂解。通过补体系统的第一组分(C1q)结合至抗体(适当亚类的抗体)起始经典补体途径的活化，所述抗体结合至其同源抗原(cognate antigen)。为了评价补体活化，可例如如Gazzano-Santoro等人, J. Immunol. Methods 202: 163 (1996)中所述，进行CDC测定。在例如美国专利号6,194,551 Bl和WO 1999/51642中，描述了Fc区氨基酸序列改变(具有变体Fc区的多肽)且C1q结合增加或降低的多肽变体。
术语免疫缀合物(可互换地称为“抗体-药物缀合物”或“ADC”)是指与一种或多种细胞毒性剂或细胞生长抑制剂缀合的抗体，所述细胞毒性剂或细胞生长抑制剂诸如化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如蛋白毒素，细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射性缀合物)。免疫缀合物已经在癌症治疗中用于局部递送细胞毒性剂，即杀死或抑制细胞的生长或增殖的药物(例如Liu等人, Proc Natl. Acad. Sci. (1996), 93, 8618-8623))。免疫缀合物允许将药物部分靶向递送至肿瘤且在其中细胞内蓄积，其中全身施用未缀合的药物可导致对正常细胞和/或组织的不可接受的毒性水平。用于抗体-毒素缀合物的毒素包括细菌毒素诸如白喉毒素、植物毒素诸如蓖麻毒蛋白、小分子毒素诸如格尔德霉素。所述毒素可以通过机制(包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制)发挥其细胞毒性作用。
关于参考多核苷酸或多肽序列的“百分比(%)序列同一性”分别定义为在比对序列和引入缺口(必要时)以达到最大百分比序列同一性之后，分别与参考多核苷酸或多肽序列中的核酸或氨基酸残基分别相同的候选序列中的核酸或氨基酸残基分别的百分比。保守取代不被视为序列同一性的部分。优选的是无缺口的比对。出于确定百分比氨基酸序列同一性目的的比对可以本领域技术内的各种方式实现，例如，使用公开可得的计算机软件诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较序列全长内达到最大比对所需要的任何算法。
术语“成熟的抗体”或“成熟的抗原结合片段”，诸如成熟的Fab变体，包括表现出与给定抗原诸如TWEAKR的细胞外结构域的更强的结合(即以增加的亲和力结合)的抗体或抗体片段的衍生物。成熟是鉴定抗体或抗体片段的六个CDR内导致该亲和力增加的少量突变的过程。成熟过程是用于将突变引入抗体和筛选用于鉴定改善的结合剂的分子生物学方法的组合。
本文中可以通过其众所周知的三字母符号或通过IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号提及氨基酸。同样地，可以通过其普遍接受的单字母代码提及核苷酸。
“激动性”抗体或具有“激动活性”的抗体是结合至其目标且诱导各自目标的活化、例如导致由各自目标介导的信号传导途径或生物效应的活化的抗体。
本发明的抗体
本发明涉及抗体、或其抗原结合抗体片段、或其变体，其导致TWEAKR (SEQ ID NO:169(蛋白)；SEQ ID NO:170 (DNA))的强烈活化，因此导致在显示TWEAKR的过表达的各种癌细胞中的细胞凋亡的强烈诱导。
关于先前描述的抗TWEAKR抗体(例如，PDL-192)的细胞凋亡的诱导和增殖的抑制的TWEAKR激动活性受限，且没有达到内源配体TWEAK的功效。这种激动活性的缺乏不是由于降低的亲和力，因为这些抗体以与内源配体TWEAK相比类似范围内的亲和力结合至TWEAKR(Michaelson JS等人, MAbs.2011 Jul-Aug;3(4):362-75; Culp PA等人, Clin Cancer Res.2010 Jan 15;16(2):497-508)，且具有更高结合亲和力的抗体也不一定表现出更有效的信号传导活性(Culp PA等人, Clin Cancer Res.2010 Jan 15;16(2):497-508)。此外，显示先前描述的抗体的抗肿瘤活性依赖于Fc效应功能，且显示ADCC在小鼠模型中发挥对于体内功效的显著作用。
本发明提供了抗体、其抗原结合片段或其变体，其具有此类关于细胞凋亡的诱导和增殖的抑制的强烈激动活性，其可以实现体内抗肿瘤功效，而没有发挥显著作用的ADCC。技术人员知道提供缺乏Fcγ受体活化以防止ADCC、同时维持抗原结合和激动活性的抗体变体的方法。此类方法包括但不限于使用人IgG2和人IgG4抗体同种型，使用无糖基化抗体，或使用具有防止Fcγ受体活化的突变的抗体。
本发明的一个实施方案是提供在一种或多种表达TWEAKR的细胞系中具有胱天蛋白酶3/7的强烈诱导的抗体或其抗原结合抗体片段或其变体。在一个优选实施方案中，一种或多种表达TWEAKR的细胞系选自WiDr、A253、NCI-H322、HT-29和786-O细胞。“胱天蛋白酶3/7的诱导”可以通过本领域中已知的常用方法、包括本文描述的那些来测量。在一个实施方案中，根据本发明的“胱天蛋白酶3/7的诱导”通过使用以胱天蛋白酶3/7溶液(Promega, #G8093)的活性测定和在VICTOR V (Perkin Elmer)上读取发光而测量。在孵育时间结束时，测定胱天蛋白酶3/7活性，且计算与未处理的细胞相比的胱天蛋白酶3/7的诱导倍数。如果诱导倍数大于1.2，优选大于1.5，更优选大于1.8，更优选大于2.1，更优选大于2.5，则抗体被成为具有胱天蛋白酶3/7的“强烈诱导”。提供了抗TWEAKR抗体，与先前描述的激动性抗体[例如PDL-192(TPP-1104)、P4A8(TPP-1324)、136.1(TPP-2194)]相比且还与300ng/ml重组人TWEAK相比，其导致导致HT-29细胞中的胱天蛋白酶3/7的更强的诱导。该诱导癌细胞中的细胞凋亡的强功效也见于WiDr、A253、NCI-H322和786-O细胞中，其中测试的本发明的抗体在大多数实验中诱导与参考抗体[PDL-192(TPP-1104)、P4A8(TPP-1324)]和300ng/ml TWEAK相比更高的倍数变化。本发明的一些抗体以与内源配体TWEAK的亲和力相比明显更低且与其它已知的激动性抗体相比更低的仅中等亲和力(>10nM)结合至TWEAKR。该特性提供了进一步可能优势，如例如可能改善的肿瘤穿透。
针对这些目的，本发明的一个实施方案是在新颖表位选择性结合至TWEAKR的抗体或其抗原结合抗体片段，其特征在于在TWEAKR (SEQ ID NO:169；且参见图1)的位置47(D47)特异性结合至天冬氨酸(D)。鉴定的抗体相互作用对于某些TWEAKR氨基酸的相关性与已经对于这些抗体确定的激动活性相关。天然配体TWEAK显示TWEAKR的有效活化，且依赖于TWEAKR的富含半胱氨酸的结构域中的亮氨酸46结合(Pellegrini等人, FEBS 280:1818-1829)。P4A8显示非常低的激动活性，且至少部分与TWEAKR的富含半胱氨酸的结构域外侧的结构域相互作用。PDL-192显示中等的激动活性，且依赖于R56至富含半胱氨酸的结构域，但与TWEAK配体位点相对。本发明的抗体(示例性TPP-2090)依赖于D47结合，且TWEAK依赖于L46结合，且结合至类似、但可区分的结合位点(图7)。因此，显示强烈的激动活性的本发明的抗体结合至与非常强的激动活性相关的抗体的新颖表位(D47依赖的)。
TWEAKR (SEQ ID NO:169)的位置47的氨基酸(D47)被认为对于本发明的抗体的结合是关键的，这意味着当通过如实施例2和图6中所述将该残基变为丙氨酸而抗体失去其ELISA信号的超过20%、或者超过30%、或者超过40%、或者超过50%、或者超过60%、或者超过70%、或者超过80%、或者超过90%、或者100%时，所述抗体特异性结合至TWEAKR (SEQ ID NO:169)的位置47的D (D47)。或者，当抗体与TPP-2203相比失去其在TPP-2614上的ELISA信号的超过20%、或者超过30%、或者超过40%、或者超过50%、或者超过60%、或者超过70%、或者超过80%、或者超过90%、或者100%时，所述抗体特异性结合至TWEAKR (SEQ ID NO:169)的位置47的D (D47)。优选地，当抗体与TPP-2203相比失去其在TPP-2614上的ELISA信号的超过80%时，所述抗体特异性结合至TWEAKR (SEQ ID NO:169)的位置47的D (D47)。
本发明的一个优选实施方案是特异性结合至TWEAKR (SEQ ID NO:169)的天冬氨酸47 (D47)的抗TWEAKR抗体或其抗原结合片段。
本发明的一个进一步优选实施方案是特异性结合至TWEAKR (SEQ ID NO:169)的天冬氨酸47 (D47)的激动性抗TWEAKR抗体或其抗原结合片段。
本发明的一个进一步优选实施方案是具有降低的ADCC活性或缺乏ADCC活性且特异性结合至TWEAKR (SEQ ID NO:169)的天冬氨酸47 (D47)的激动性抗TWEAKR抗体或其抗原结合片段。本发明的一个进一步优选实施方案是特异性结合至TWEAKR (SEQ ID NO:169)的天冬氨酸47 (D47)的激动性抗TWEAKR抗体或其抗原结合片段，其中所述抗TWEAKR抗体的激动活性选自胱天蛋白酶3/7的诱导、表达TWEAKR的细胞系的增殖的抑制和细胞因子分泌的诱导。
本发明的一个进一步优选实施方案是特异性结合至TWEAKR (SEQ ID NO:169)的天冬氨酸47 (D47)的激动性抗TWEAKR抗体或其抗原结合片段，其中所述抗TWEAKR抗体的激动活性是胱天蛋白酶3/7的诱导。
本发明的一个进一步优选实施方案是特异性结合至TWEAKR (SEQ ID NO:169)的天冬氨酸47 (D47)的激动性抗TWEAKR抗体或其抗原结合片段，其中所述抗TWEAKR抗体的激动活性是在表达TWEAKR的癌细胞系中的胱天蛋白酶3/7的诱导。
本发明的一个进一步优选实施方案是特异性结合至TWEAKR (SEQ ID NO:169)的天冬氨酸47 (D47)的激动性抗TWEAKR抗体或其抗原结合片段，其中所述抗TWEAKR抗体的激动活性是选自WiDr、A253、NCI-H322、HT-29和786-O细胞的表达TWEAKR的癌细胞系中的胱天蛋白酶3/7的诱导。
本发明的一个进一步更优选实施方案是特异性结合至TWEAKR (SEQ ID NO:169)的天冬氨酸47 (D47)的激动性抗TWEAKR抗体或其抗原结合片段，其中所述抗TWEAKR抗体的激动活性是与重组人TWEAK的诱导相比HT-29和/或786-O细胞系中的胱天蛋白酶3/7的更高的诱导。在一个进一步优选实施方案中，使用的抗TWEAKR抗体的浓度为100µg/ml，且重组人TWEAK的浓度为300 ng/ml。
本发明的另一个实施方案是提供特异性结合至不同物种的TWEAKR的富含半胱氨酸的结构域(SEQ ID:169的aa 34-68)的抗体或其抗原结合抗体片段或其变体。
本发明的另一个优选实施方案是提供特异性结合至TWEAKR的富含半胱氨酸的结构域(SEQ ID:169的aa 34-68)且特异性结合至TWEAKR的位置47的D (D47)的抗体或其抗原结合抗体片段或其变体。
本发明的另一个优选实施方案是提供特异性结合至选自人、小鼠、狗、猪、大鼠和食蟹猴的TWEAKR物种的至少两种物种的TWEAKR的富含半胱氨酸的结构域(SEQ ID:169的aa 34-68)且特异性结合至TWEAKR的位置47的D (D47)的抗体或其抗原结合抗体片段或其变体。在一个优选实施方案中，所述两种物种是人和小鼠。
本发明的另一个实施方案是提供抑制不同的表达TWEAKR的细胞系的增殖的抗体或其抗原结合抗体片段或其变体。与胱天蛋白酶3/7的强烈诱导一致，观察到不同的癌细胞系的增殖的有效抑制。在抑制各种癌细胞系的增殖中，本发明的抗体与其它已知的抗体(PDL-192，P4A8)相比更有效。在大多数实验中，本发明的抗体显示与TWEAK配体相比更高的功效或相同的功效。因此，所述抗体在它们诱导癌细胞系的广泛实验对象组(包括但不限于786-O、LOVO、NCI-H1975、SW480、WiDr、HT-29、A253、SK-OV3)中的细胞凋亡和增殖抑制的功效中是独特的。
本发明的一个进一步优选实施方案是特异性结合至TWEAKR (SEQ ID NO:169)的天冬氨酸47 (D47)的激动性抗TWEAKR抗体或其抗原结合片段，其中所述抗TWEAKR抗体的激动活性是抑制表达TWEAKR的细胞系的增殖。在本发明的一个优选实施方案中，所述表达TWEAKR的细胞系包含于786-O、LOVO、NCI-H1975、SW480、WiDr、HT-29、A253和SK-OV3组成的组中。
本发明的一个进一步更优选实施方案是特异性结合至TWEAKR (SEQ ID NO:169)的天冬氨酸47 (D47)的激动性抗TWEAKR抗体或其抗原结合片段，其中所述抗TWEAKR抗体的激动活性是与重组人TWEAK的抑制相比786-O和/或WiDr细胞系的增殖的更强抑制。在一个进一步优选实施方案中，使用的抗TWEAKR抗体的浓度为100µg/ml，且重组人TWEAK的浓度为300 ng/ml。
本发明的另一个实施方案是提供强烈诱导从各种癌细胞(包括但不限于A375、WiDr细胞和异种移植物)的细胞因子分泌的抗体或其抗原结合抗体片段或其变体。诱导的细胞因子包括但不限于IL-8、IL-15、IP-10、IL-1RA和MCP-1。诱导的优选细胞因子是IL-8。本发明的抗体显示与其它已知抗体(PDL-192(TPP-1104)、P4A8(TPP-1324)、136.1(TPP-2194))相比诱导A375细胞中的IL-8的更高功效。
本发明的一个优选实施方案是特异性结合至TWEAKR (SEQ ID NO:169)的天冬氨酸47 (D47)的激动性抗TWEAKR抗体或其抗原结合片段，其中所述抗TWEAKR抗体的激动活性是细胞因子分泌的诱导。
本发明的一个优选实施方案是特异性结合至TWEAKR (SEQ ID NO:169)的天冬氨酸47 (D47)的激动性抗TWEAKR抗体或其抗原结合片段，其中所述抗TWEAKR抗体的激动活性是表达TWEAKR的癌细胞系中的细胞因子分泌的诱导。在一个更优选实施方案中，表达TWEAKR的癌细胞系是A375或WiDr细胞系。
本发明的一个进一步优选实施方案是特异性结合至TWEAKR (SEQ ID NO:169)的天冬氨酸47 (D47)的激动性抗TWEAKR抗体或其抗原结合片段，其中所述抗TWEAKR抗体的激动活性是细胞因子分泌的诱导，其中所述细胞因子包含于由IL-8、IL-15、IP-10、IL-1RA和MCP-1组成的细胞因子组中。
本发明的一个进一步优选实施方案是特异性结合至TWEAKR (SEQ ID NO:169)的天冬氨酸47 (D47)的激动性抗TWEAKR抗体或其抗原结合片段，其中所述抗TWEAKR抗体的激动活性是表达TWEAKR的癌细胞系分泌中的细胞因子分泌的诱导，其中所述细胞因子包含于由IL-8、IL-15、IP-10、IL-1RA和MCP-1组成的细胞因子组中。
本发明的一个进一步优选实施方案是特异性结合至TWEAKR (SEQ ID NO:169)的天冬氨酸47 (D47)的激动性抗TWEAKR抗体或其抗原结合片段，其中所述抗TWEAKR抗体的激动活性是表达TWEAKR的癌细胞系分泌中的细胞因子分泌的诱导，其中所述细胞因子包含于由IL-8、IL-15、IP-10、IL-1RA和MCP-1组成的细胞因子组中，且其中表达TWEAKR的癌细胞系是A375或WiDr细胞系。
在一个进一步优选实施方案中，所述细胞因子是IL-8，在一个甚至更优选实施方案中，所述IL-8是人IL-8。
本发明的一个优选实施方案是特异性结合至TWEAKR (SEQ ID NO:169)的天冬氨酸47 (D47)的激动性抗TWEAKR抗体或其抗原结合片段，其中所述抗TWEAKR抗体的激动活性是小鼠肿瘤异种移植模型中的细胞因子分泌的诱导。在一个进一步优选实施方案中，分泌的细胞因子是源自肿瘤异种移植物的人细胞因子。
本发明的一个进一步优选实施方案是特异性结合至TWEAKR (SEQ ID NO:169)的天冬氨酸47 (D47)的激动性抗TWEAKR抗体或其抗原结合片段，其中所述抗TWEAKR抗体的激动活性是小鼠肿瘤异种移植模型中的人IL-8分泌的诱导。
在一个进一步优选实施方案中，所述小鼠肿瘤异种移植物模型是A375或WiDr小鼠异种移植模型。
在一个进一步优选实施方案中，在注射3mg/kg或更高或10 mg/kg或更高本发明的抗TWEAKR抗体之后，观察到细胞因子分泌的诱导。
本发明的一个进一步优选实施方案是特异性结合至TWEAKR (SEQ ID NO:169)的天冬氨酸47 (D47)的激动性抗TWEAKR抗体或其抗原结合片段，其中所述抗TWEAKR抗体的激动活性是注射3mg/kg所述抗体之后小鼠WiDr肿瘤异种移植模型中的人IL-8分泌的诱导，其中没有检测到小鼠IL-8类似物KC的诱导。
在一个进一步优选实施方案中，在携带肿瘤的小鼠的血浆中观察到细胞因子分泌的诱导。
本发明的另一个实施方案是提供结合至广泛范围的不同的表达TWEAKR的细胞系(包括、但不限于表21中显示的细胞系)的抗体或其抗原结合抗体片段或其变体。表21中的实例包括来自许多肿瘤起源的人和鼠细胞系(例如NSCLC、CRC、HNSCC、RCC、PancCA、OvCa、乳腺CA、黑色素瘤、胃CA、食管癌CA、膀胱CA、HCC、前列腺CA，神经母细胞瘤)。
本发明的另一个实施方案是提供对于人施用是安全的抗体或其抗原结合抗体片段或其变体。
本发明的另一个实施方案是提供结合至人TWEAKR且与另一物种(包括但不限于小鼠、大鼠、猪、狗、食蟹猴)的TWEAKR以具有类似亲和力交叉反应的抗体或其抗原结合抗体片段或其变体。优选地，所述其它物种是啮齿类动物，诸如小鼠或大鼠。最优选地，所述抗体或其抗原结合抗体片段或其变体结合至人TWEAKR且与鼠TWEAKR交叉反应。
本发明的另一个实施方案是提供构成用于诊断恶性或发育异常病况的工具的抗体，在所述病况中，TWEAKR表达与正常组织相比升高或TWEAKR从细胞表面脱落且变得在血清中可检测。提供与可检测标记缀合的抗TWEAKR抗体。优选的标记是放射性标记、酶、发色团或荧光剂。
在本文通篇，如表31中所述参考本发明的以下优选抗体：“TPP-2090”、“TPP-2149”、“TPP-2093”、“TPP-2148”、“TPP-2084”、“TPP-2077”、“TPP-1538”、“TPP-883”、“TPP-1854”、“TPP-1853”、“TPP-1857”、“TPP-1858”和“TPP-2658”。
TPP-2090代表包含对应于SEQ ID NO:2的重链区和对应于SEQ ID NO:1的轻链区的抗体。
TPP-2149代表包含对应于SEQ ID NO:12的重链区和对应于SEQ ID NO:11的轻链区的抗体。
TPP-2093代表包含对应于SEQ ID NO:22的重链区和对应于SEQ ID NO:21的轻链区的抗体。
TPP-2148代表包含对应于SEQ ID NO:32的重链区和对应于SEQ ID NO:31的轻链区的抗体。
TPP-2084代表包含对应于SEQ ID NO:42的重链区和对应于SEQ ID NO:41的轻链区的抗体。
TPP-2077代表包含对应于SEQ ID NO:52的重链区和对应于SEQ ID NO:51的轻链区的抗体。
TPP-1538代表包含对应于SEQ ID NO:62的重链区和对应于SEQ ID NO:61的轻链区的抗体。
TPP-883代表包含对应于SEQ ID NO:72的重链区和对应于SEQ ID NO:71的轻链区的抗体。
TPP-1854代表包含对应于SEQ ID NO:82的重链区和对应于SEQ ID NO:81的轻链区的抗体。
TPP-1853代表包含对应于SEQ ID NO:92的重链区和对应于SEQ ID NO:91的轻链区的抗体。
TPP-1857代表包含对应于SEQ ID NO:102的重链区和对应于SEQ ID NO:101的轻链区的抗体。
TPP-1858代表包含对应于SEQ ID NO:112的重链区和对应于SEQ ID NO:111的轻链区的抗体。
TPP-2658代表包含对应于SEQ ID NO:213的重链区和对应于SEQ ID NO:1的轻链区的抗体。
TPP-2090代表包含对应于SEQ ID NO:10的可变重链区和对应于SEQ ID NO:9的可变轻链区的抗体。
TPP-2149代表包含对应于SEQ ID NO:20的可变重链区和对应于SEQ ID NO:19的可变轻链区的抗体。
TPP-2093代表包含对应于SEQ ID NO:30的可变重链区和对应于SEQ ID NO:29的可变轻链区的抗体。
TPP-2148代表包含对应于SEQ ID NO:40的可变重链区和对应于SEQ ID NO:39的可变轻链区的抗体。
TPP-2084代表包含对应于SEQ ID NO:50的可变重链区和对应于SEQ ID NO:49的可变轻链区的抗体。
TPP-2077代表包含对应于SEQ ID NO:60的可变重链区和对应于SEQ ID NO:59的可变轻链区的抗体。
TPP-1538代表包含对应于SEQ ID NO:70的可变重链区和对应于SEQ ID NO:69的可变轻链区的抗体。
TPP-883代表包含对应于SEQ ID NO:80的可变重链区和对应于SEQ ID NO:79的可变轻链区的抗体。
TPP-1854代表包含对应于SEQ ID NO:90的可变重链区和对应于SEQ ID NO:89的可变轻链区的抗体。
TPP-1853代表包含对应于SEQ ID NO:100的可变重链区和对应于SEQ ID NO:99的可变轻链区的抗体。
TPP-1857代表包含对应于SEQ ID NO:110的可变重链区和对应于SEQ ID NO:109的可变轻链区的抗体。
TPP-1858代表包含对应于SEQ ID NO:120的可变重链区和对应于SEQ ID NO:119的可变轻链区的抗体。
在一个进一步优选实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含重链或轻链CDR序列，所述重链或轻链CDR序列分别与抗体“TPP-2090”、“TPP-2149”、“TPP-2093”、“TPP-2148”、“TPP-2084”、“TPP-2077”、“TPP-1538”、“TPP-883”、“TPP-1854”、“TPP-1853”、“TPP-1857”或“TPP-1858”的至少一个CDR序列、优选对应CDR序列至少50％、55％、60％、70％、80％、90％或95％相同，或与“TPP-2090”、“TPP-2149”、“TPP-2093”、“TPP-2148”、“TPP-2084”、“TPP-2077”、“TPP-1538”、“TPP-883”、“TPP-1854”、“TPP-1853”、“TPP-1857” 或“TPP-1858”的VH或VL序列至少50%、60%、70%、80%、90%、92%或95%相同。
在一个进一步优选实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段包含如表31中所示的至少一个CDR序列或至少一个可变重链或可变轻链序列。
在一个更优选实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有包含SEQ ID NO:6 (H-CDR1)、SEQ ID NO:7 (H-CDR2)和SEQ ID NO:8 (H-CDR3)的重链抗原结合区和包含SEQ ID NO:3 (L-CDR1)、SEQ ID NO:4 (L-CDR2)和SEQ ID NO:5 (L-CDR3)的轻链抗原结合区。
在一个更优选实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有包含SEQ ID NO:16 (H-CDR1)、SEQ ID NO:17 (H-CDR2)和SEQ ID NO:18 (H-CDR3)的重链抗原结合区和包含SEQ ID NO:13 (L-CDR1)、SEQ ID NO:14 (L-CDR2)和SEQ ID NO:15 (L-CDR3)的轻链抗原结合区。
在一个更优选实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有包含SEQ ID NO:26 (H-CDR1)、SEQ ID NO:27 (H-CDR2)和SEQ ID NO:28 (H-CDR3)的重链抗原结合区和包含SEQ ID NO:23 (L-CDR1)、SEQ ID NO:24 (L-CDR2)和SEQ ID NO:25 (L-CDR3)的轻链抗原结合区。
在一个更优选实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有包含SEQ ID NO:36 (H-CDR1)、SEQ ID NO:37 (H-CDR2)和SEQ ID NO:38 (H-CDR3)的重链抗原结合区和包含SEQ ID NO:33 (L-CDR1)、SEQ ID NO:34 (L-CDR2)和SEQ ID NO:35 (L-CDR3)的轻链抗原结合区。
在一个更优选实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有包含SEQ ID NO:46 (H-CDR1)、SEQ ID NO:47 (H-CDR2)和SEQ ID NO:48 (H-CDR3)的重链抗原结合区和包含SEQ ID NO:43 (L-CDR1)、SEQ ID NO:44 (L-CDR2)和SEQ ID NO:45 (L-CDR3)的轻链抗原结合区。
在一个更优选实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有包含SEQ ID NO:56 (H-CDR1)、SEQ ID NO:57 (H-CDR2)和SEQ ID NO:58 (H-CDR3)的重链抗原结合区和包含SEQ ID NO:53 (L-CDR1)、SEQ ID NO:54 (L-CDR2)和SEQ ID NO:55 (L-CDR3)的轻链抗原结合区。
在一个更优选实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有包含SEQ ID NO:66 (H-CDR1)、SEQ ID NO:67 (H-CDR2)和SEQ ID NO:68 (H-CDR3)的重链抗原结合区和包含SEQ ID NO:63 (L-CDR1)、SEQ ID NO:64 (L-CDR2)和SEQ ID NO:65 (L-CDR3)的轻链抗原结合区。
在一个更优选实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有包含SEQ ID NO:76 (H-CDR1)、SEQ ID NO:77 (H-CDR2)和SEQ ID NO:78 (H-CDR3)的重链抗原结合区和包含SEQ ID NO:73 (L-CDR1)、SEQ ID NO:74 (L-CDR2)和SEQ ID NO:75 (L-CDR3)的轻链抗原结合区。
在一个更优选实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有包含SEQ ID NO:86 (H-CDR1)、SEQ ID NO:87 (H-CDR2)和SEQ ID NO:88 (H-CDR3)的重链抗原结合区和包含SEQ ID NO:83 (L-CDR1)、SEQ ID NO:84 (L-CDR2)和SEQ ID NO:85 (L-CDR3)的轻链抗原结合区。
在一个更优选实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有包含SEQ ID NO:96 (H-CDR1)、SEQ ID NO:97 (H-CDR2)和SEQ ID NO:98 (H-CDR3)的重链抗原结合区和包含SEQ ID NO:93 (L-CDR1)、SEQ ID NO:94 (L-CDR2)和SEQ ID NO:95 (L-CDR3)的轻链抗原结合区。
在一个更优选实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有包含SEQ ID NO:106 (H-CDR1)、SEQ ID NO:107 (H-CDR2)和SEQ ID NO:108 (H-CDR3)的重链抗原结合区和包含SEQ ID NO:103 (L-CDR1)、SEQ ID NO:104 (L-CDR2)和SEQ ID NO:105 (L-CDR3)的轻链抗原结合区。
在一个更优选实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有包含SEQ ID NO:116 (H-CDR1)、SEQ ID NO:117 (H-CDR2)和SEQ ID NO:118 (H-CDR3)的重链抗原结合区和包含SEQ ID NO:113 (L-CDR1)、SEQ ID NO:114 (L-CDR2)和SEQ ID NO:115 (L-CDR3)的轻链抗原结合区。
本发明的抗体的CDR的序列比对揭示共有序列(参见图24)。在一个更优选实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含：
可变重链，其包含
● 由包含式PYPMX (SEQ ID NO:171)的氨基酸序列编码的重链CDR1，其中X是I或M；
● 由包含式YISPSGGXTHYADSVKG (SEQ ID NO:172)的氨基酸序列编码的重链CDR2，其中X是S或K；和
● 由包含式GGDTYFDYFDY (SEQ ID NO:173)的氨基酸序列编码的重链CDR3；
和可变轻链，其包含
● 由包含式RASQSISXYLN (SEQ ID NO:174)的氨基酸序列编码的轻链CDR1，其中X是G或S；
● 由包含式XASSLQS (SEQ ID NO:175)的氨基酸序列编码的轻链CDR2，其中X是Q、A或N；和
● 由包含式QQSYXXPXIT (SEQ ID NO:176)的氨基酸序列编码的轻链CDR3，其中位置5的X是T或S，且位置6的X是T或S，且位置8的X是G 或F。
抗体不仅在其互补决定区(CDR)内、而且在构架(FR)中序列不同。这些序列差异被编码在不同的V-基因中。已经完全测序了人抗体种系所有组成成分。存在约50种功能性VH种系基因，其可以根据序列同源性分成六个亚家族VH1、VH2、VH3、VH4、VH5和VH6(Tomlinson等人, 1992, J. Mol. Biol. 227, 776-798; Matsuda & Honjo, 1996, Advan. Immunol. 62, 1-29)。已知包含七个亚家族的约40种功能性VLκ基因(Cox等人, 1994, Eur. J. Immunol. 24, 827-836; Barbie & Lefranc, 1998, Exp. Clin. Immunogenet. 15, 171-183)，Vκ1、Vκ2、Vκ3、Vκ4、Vκ5、Vκ6和Vκ7。本文分别公开属于人VH3亚家族的本发明的抗体的重链和属于人Vκ1亚家族的本发明的抗体的轻链。已知属于相同亚家族的抗体的构架序列是紧密相关的，例如包含人Vh3亚家族成员的抗体都共享相当的稳定性(Honegger等人, 2009, Protein Eng Des Sel. 22(3):121-134)。本领域中众所周知的是，来自抗体的CDR可以被接枝在不同的构架上，同时维持相应初始抗体的特殊特征。CDR已经成功地接枝在属于不同物种的构架上以及属于不同亚家族的相同物种的构架上。在一个进一步实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段包含如表31中所示的本发明的抗体的至少一个CDR序列和人可变链构架序列。
在一个优选实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段含有如表31中所示的本发明的抗体的包含可变轻链的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3序列的可变轻链或轻链抗原结合区或包含可变重链的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3序列的可变重链或重链抗原结合区以及人可变轻和人可变重链构架序列。
在一个更优选实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段含有如表31中所示的本发明的抗体的包含可变轻链的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3序列的可变轻链或轻链抗原结合区或包含可变重链的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3序列的可变重链或重链抗原结合区以及用于可变重链的人VH3亚家族构架序列和用于可变轻链的人Vκ1亚家族构架序列。在一个更优选实施方案中，用于可变重链的人VH3亚家族构架序列包含于由以下组成的VH3亚家族构架序列组中：VH3-07、VH3-09、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-30.3、VH3-30.5、VH3-33、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74和VH3-d。在一个甚至更优选实施方案中，人VH3构架序列与人VH3-23构架序列具有小于16或小于15个氨基酸交换。在一个更优选实施方案中，用于可变轻链的人Vκ1亚家族构架序列包含于由以下组成的Vκ1亚家族构架序列组中：Vκ1-5、Vκ 1-6、Vκ 1-8、Vκ 1D-8、Vκ 1-9、Vκ 1-12、Vκ 1D-12、Vκ 1-13、Vκ 1D-13、Vκ 1-16、Vκ 1D-16、Vκ 1-17、Vκ 1D-17、Vκ 1-27、Vκ 1-33、Vκ 1D-33、Vκ 1-37、Vκ 1D-37、Vκ 1-39、Vκ 1D-39、Vκ 1D-42、Vκ 1D-43。在一个甚至更优选实施方案中，人Vκ 1构架序列与人Vκ 1-39构架序列具有小于15或小于13个氨基酸交换。
在一个更优选实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段含有如表31中所示的本发明的抗体的包含可变轻链的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3序列的可变轻链或轻链抗原结合区或包含可变重链的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3序列的可变重链或重链抗原结合区以及用于可变重链的人VH3亚家族构架序列和用于可变轻链的人Vκ1-39构架序列。
在一个最优选实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段含有如表31中所示的本发明的抗体的包含可变轻链的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3序列的可变轻链或轻链抗原结合区或包含可变重链的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3序列的可变重链或重链抗原结合区以及用于可变重链的人VH3-3构架序列和用于可变轻链的人Vκ1-39构架序列。
在一个优选实施方案中，所述可变轻链构架序列属于人Vκ1亚家族，且所述可变重链构架序列属于人VH3亚家族。VH3亚家族或Vκ1亚家族可变链构架序列与分别野生型构架序列相比可以包含序列变异以采用构架用于插入分别CDR序列。在一个进一步实施方案中，与野生型构架序列相比包含序列变异的VH3亚家族或Vκ1亚家族可变链构架序列分别是VH3亚家族成员或Vκ1亚家族成员。优选地，此变体构架序列具有多达15个序列变异，更优选多达10个序列变异，更优选多达5个序列变异，最优选多达3个序列变异。
本发明的抗体可以是IgG (例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)，而抗体片段可以是例如Fab、Fab'、F(ab')2或scFv。因此，本发明的抗体片段可以是或可以含有以如本文所述的一种或多种方式起作用的抗原结合区。
在一个优选实施方案中，本发明的抗体或抗原结合抗体片段是单克隆的。在一个进一步优选实施方案中，本发明的抗体或抗原结合抗体片段是人的、人源化的或嵌合的。
在另一个方面，本发明提供具有特异性结合至TWEAKR和/或对于TWEAKR具有高亲和力的抗原结合区的抗体或其抗原结合片段。如果亲和力测量值小于250 nM (抗体或抗原结合片段的单价亲和力)，则抗体或抗原结合片段被称为对于抗原具有“高亲和力”。本发明的抗体或抗原结合区优选可以以下亲和力结合至人TWEAKR：小于250 nM、优选小于150 nM、更优选小于100 nM，更优选小于50 nM，更优选小于30 nM、更优选小于20 nM，其测定为与人TWEAKR的单价亲和力((参见实施例2)，如表6中所示)。
在另一个方面，本发明提供具有抗原结合区的抗体或其抗原结合片段，所述抗原结合区特异性结合至TWEAKR且不结合至TNF受体超家族的其它成员(参见表20)，如图11中对于TPP-2090所示。
IgG1形式用于通过荧光激活细胞分选(FACS)的基于细胞的亲和力测定。表21对于TPP-2090和TPP-1538示例性提供代表性抗TWEAKR抗体在人和鼠起源的肿瘤细胞系上的结合的概述。如通过本发明的FACS分析检测的抗体的最大细胞结合与其它描述的抗体相比是中等的，但尽管如此，这些抗体具有非常强的激动活性，强调了本发明的抗体发现的新颖表位的重要性。
本发明的另一个实施方案是提供在结合至表达TWEAKR的细胞之后被有效内化的抗体或其抗原结合抗体片段或其变体。本发明的抗体可与已知药物共同施用，并且在一些情况下，所述抗体本身可以进行修饰。例如，抗体可以与细胞毒性剂、免疫毒素、毒簇或放射性同位素缀合以可能进一步增加功效。
如颗粒计数/细胞所测量，当本发明的抗体或抗原结合片段进入表达TWEAKR的肿瘤细胞的半最大内化时间(t½)短于400分钟或更优选短于300分钟且还更优选短于200分钟时，其“有效”内化。进一步优选的是具有通过实施例7和图17中描述的方案测定的100分钟或更短的半最大内化时间(t½)的抗体或抗原结合片段。
本发明的可内化抗体或其抗原结合片段适合作为抗体-药物缀合物(ADC)的靶向部分。抗体或抗原结合片段适合于体外或体内方法中将化合物、优选细胞毒性剂递送至表达TWEAKR的细胞。用荧光标记的抗体显示有效内化(实施例7)。用肥皂草毒蛋白-缀合的抗体例举作为抗体药物缀合物的有效用途(实施例7)。
在一些实施方案中，分离本发明的抗体或其抗原结合片段或者编码其的核酸。分离的生物组分(诸如核酸分子或蛋白诸如抗体)是这样的生物组分，其已经与其中天然存在所述组分的生物体的细胞中的其它生物组分(例如其它染色体和染色体外DNA和RNA、蛋白和细胞器)基本分离或纯化。已经“分离的”核酸和蛋白包括通过如例如Sambrook等人(1989)中所述的标准纯化方法纯化的核酸和蛋白(Sambrook, J., Fritsch, E. F.和Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA)和Robert K. Scopes等人 1994 (Protein Purification, - Principles and Practice, Springer Science and Business Media LLC)。该术语还包括在宿主细胞中通过重组表达制备的核酸和蛋白以及化学合成的核酸。
本发明的抗体可以源自重组抗体文库，其基于已经大量健康志愿者的抗体中分离的氨基酸序列，例如，使用n-CoDeR®技术，将完全人CDR重组为新的抗体分子。或者可替代地，Hoet RM等人, Nat Biotechnol 2005;23(3):344-8)中描述的作为完全人抗体噬菌体展示文库的抗体文库可用于分离TWEAKR特异性抗体。
抗体产生
通过以人和鼠TWEAKR的二聚Fc-融合的细胞外结构域作为固定目标的蛋白淘选(Hoogenboom H.R., Nat Biotechnol 2005;23(3):1105-16)使用完全人抗体噬菌体展示文库(Hoet RM等人, Nat Biotechnol 2005;23(3):344-8)分离本发明的TWEAKR-特异性的人单克隆抗体。
鉴定11种不同的Fab-噬菌体，且将相应的抗体再克隆入哺乳动物IgG表达载体，其提供可溶性Fab中不存在的丢失CH2-CH3结构域。鉴定优选抗体之后，这些被表达为全长IgG。将这些构建体例如在哺乳动物细胞中瞬时表达，如描述于Micheal R. Dyson和Yves Durocher, Scion Publishing Ltd, 2007编辑的Methods Express:Expression Systems中的Tom等人，第12章(参见实施例1)。抗体通过蛋白A层析纯化，且通过ELISA和BIAcore分析中其与可溶性单体TWEAKR的结合亲和力进一步表征，如实施例2中所述。为了测定抗-TWEAKR抗体的细胞结合特征，通过流式细胞术测试与细胞系的实验对象组(HT29、HS68、HS578)的结合。
进行NF-κB报告基因测定以评估所有11种鉴定的抗体(人IgG1)的激动活性。选择具有最强的体外功效(TPP-883)的抗体用于进一步效力和亲和力成熟(对于细节，参见实施例1)。以改善的激动活性检测1种单取代变体：CDR-H3的G102T。最后，基于与最好的单取代变体G102T相比增强的亲和力选择7种变体。将这些的相应DNA再克隆于哺乳动物IgG表达载体中，且在上述提到的NFκB报道细胞测定中测试功能活性。最后，将获得的序列与人种系序列进行比较，且调整没有对亲和力和效力的显著影响的偏差。通过抗体文库筛选和亲和力和/或效力成熟获得以下抗体：“TPP-2090”、“TPP-2149”、“TPP-2093”、“TPP-2148”、“TPP-2084”、“TPP-2077”、“TPP-1538”、“TPP-883”、“TPP-1854”、“TPP-1853”、“TPP-1857”和“TPP-1858”。
本发明的抗体可以通过本领域中已知的方法进一步生成，所述方法如抗体噬菌体展示筛选(例如参见Hoet RM等人, Nat Biotechnol 2005;23(3):344-8)、良好确立的杂交瘤技术(例如参见Köhler和Milstein Nature.1975 Aug 7;256(5517):495-7)或免疫小鼠、尤其免疫hMAb小鼠(例如，VelocImmune小鼠®)。
肽变体
本发明的抗体或抗原结合片段不限于本文提供的特定肽序列。反而，本发明还包括这些多肽的变体。关于本公开内容和常规可得的技术和参考文献，技术人员能够制备、测试和利用本文公开的抗体的功能性变体，同时理解这些具有结合至TWEAKR的能力的变体落入本发明的范围。
变体可以包括例如相对于本文公开的肽序列具有至少一个改变的互补决定区(CDR)(高变)和/或构架(FR)(可变)结构域/位置的抗体。为了更好地说明该构思，抗体结构的简述如下。
抗体由两条肽链构成，各含有一个(轻链)或三个(重链)恒定结构域和一个可变区(VL、VH)，后者在各情况下由四个FR区和三个间插的CDR构成。所述抗原结合位点由一个或多个CDR组成，而FR区提供CDR的结构构架，因此，在抗原结合中发挥重要作用。通过改变CDR或FR区的一个或多个氨基酸残基，技术人员常规可以生成突变或多样化的抗体序列，例如可针对抗原筛选新的或改进的特性。
本发明的一个进一步优选实施方案是这样的抗体或抗原结合片段，其中如表31所示选择VH和VL序列。技术人员可以使用表31中的数据以设计本发明范围内的肽变体。优选通过改变一个或多个CDR区内的氨基酸来构建变体；变体还可具有一个或多个改变的构架区。还可以在构架区内进行改变。例如，可改变肽FR结构域，其中与种系序列相比残基存在偏差。
或者，技术人员可以使用例如Knappik A.,等人, JMB 2000, 296:57-86中描述的程序，通过将本文公开的氨基酸序列与此类抗体的相同类型的已知序列进行比较，来进行相同分析。
此外，可以通过以下获得变体：使用一种抗体作为用于进一步优化的起点，所述进一步优化通过使抗体中的一个或多个氨基酸残基、优选使一个或多个CDR中的氨基酸残基多样化，且针对具有改进特性的变体筛选所得的抗体变体集合。特别优选的是VL和/或VH的CDR3中的一个或多个氨基酸残基的多样化。多样化可以例如通过使用三核苷酸诱变(TRIM)技术，合成DNA分子的集合来进行(Virnekäs B.等人, Nucl. Acids Res. 1994, 22: 5600.)。抗体或其抗原结合片段包括具有修饰/变异的分子，包括但不限于例如导致半衰期改变(例如Fc部分的修饰或其它分子诸如PEG的连接)、结合亲和力改变或ADCC或CDC活性改变的修饰。
抗体的一个实施方案是TPP-2658，其包括导致改变的ADCC的修饰。TPP-2658具有在Fc部分中在N297的突变(与TPP-2090相比)，其导致产生缺乏ADCC的无糖基化抗体变体。
保守氨基酸变体
可以制备多肽变体，其保留本文所述的抗体肽序列的总体分子结构。鉴于各个氨基酸的特性，技术人员将认识到一些合理的取代。例如基于涉及残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性，进行氨基酸取代，即“保守取代”。
例如，(a)非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；(b)极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；(c)带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；和(d)带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。取代通常在(a)-(d)组内进行。此外，甘氨酸和脯氨酸可以基于其破坏α-螺旋的能力彼此取代。类似地，某些氨基酸，诸如丙氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸和赖氨酸更普遍存在于α-螺旋中，而缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和苏氨酸更普遍存在于β-折叠片中。甘氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺和脯氨酸普遍存在于转角中。一些优选的取代可在以下组中进行：(i) S和T；(ii) P和G；和(iii) A、V、L和I。鉴于已知遗传密码以及重组和合成DNA技术，具有技术的科研人员可容易地构建编码保守氨基酸变体的DNA。
如本文所使用，两个多肽序列之间的“序列同一性”表明该序列之间相同的氨基酸的百分比。“序列同源性”表明相同氨基酸或代表保守氨基酸取代的氨基酸的百分比。
本发明的 DNA 分子
本发明还涉及编码本发明的抗体或其抗原结合片段的DNA分子。用于表达的抗体的DNA序列在表32中给出。这些序列针对哺乳动物表达进行优化。本发明的DNA分子不限于本文公开的序列，而是还包括其变体。可通过参考其在杂交中的物理特性来描述本发明内的DNA变体。技术人员应认识到，可以使用核酸杂交技术，使用DNA以鉴定其互补序列及其等同物或同源物(因为DNA是双链的)。还应认识到，可以以小于100%互补性进行杂交。然而，鉴于适当的条件选择，可以基于DNA序列与特定探针的结构相关性，使用杂交技术以区分DNA序列。对于此类条件的指导，参见Sambrook等人, 1989同上和Ausubel等人, 1995 (Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Sedman, J. G., Smith, J. A., & Struhl, K. 编 (1995). Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley and Sons)。
两个多核苷酸序列之间的结构相似性可以表示为两个序列将彼此杂交的条件的“严格性”的函数。如本文所使用，术语“严格性”是指条件不利于杂交的程度。严格条件强烈不利于杂交，并且在此类条件下只有结构上最相关的分子将彼此杂交。相反，非严格条件有利于表现出较低程度的结构相关性的分子的杂交。因此，杂交严格性与两个核酸序列的结构关系直接相关。以下关系可用于将杂交和相关性相关联(其中Tm是核酸双链体的解链温度)：
a. Tm = 69.3 + 0.41(%G+C)℃
b. 双链体DNA的Tm随着错配碱基对数目每增加1%而下降1℃
c. (Tm)μ 2 - (Tm)μ 1 = 18.5 log10μ2/μ1
其中μ1和μ2是两种溶液的离子强度。
杂交严格性随着许多因素而变化，所述因素包括总DNA浓度、离子强度、温度、探针大小和破坏氢键键合的试剂的存在。促进杂交的因素包括高DNA浓度、高离子强度、低温、较长的探针大小和不存在破坏氢键键合的试剂。杂交通常在以下两个阶段中进行：“结合”阶段和“洗涤”阶段。
功能等同性变体
可以通过参考其编码的产物来描述本发明的范围内的又另一类DNA变体。这些功能等同的多核苷酸的特征在于以下事实，由于遗传密码的简并性，它们编码相同的肽序列。
应认识到，可以以几种不同方式构建本文提供的DNA分子的变体。例如，它们可以作为完全合成的DNA来构建。有效合成20个至约150个核苷酸范围内的寡核苷酸的方法是广泛可得的。参见Ausubel等人，第2.11节，补充材料21 (1993)。可以由Khorana等人, J. Mol. Biol. 72:209-217 (1971)首次报道的方式，合成和装配重叠的寡核苷酸；还参见Ausubel等人，同上，第8.2节。优选用所述基因5'和3'端处工程改造的方便限制性位点设计合成的DNA以促进克隆至适当载体中。
如所示，生成变体的方法用本文公开的DNA之一开始，然后构建位点定向诱变。参见Ausubel等人，同上，第8章，补充材料37 (1997)。在典型方法中，将目标DNA克隆至单链DNA噬菌体载体中。分离单链DNA，且与含有期望的一个或多个核苷酸变异的寡核苷酸杂交。合成互补链，且将双链噬菌体导入宿主中。所得子代中的一些将含有期望的突变体，其可使用DNA测序来证实。此外，增加子代噬菌体成为期望突变体的概率的各种方法是可得的。这些方法是本领域技术人员众所周知的，且用于生成此类突变体的试剂盒是商业可得的。
重组 DNA 构建体和表达
本发明进一步提供包含本发明的核苷酸序列中的一种或多种的重组DNA构建体(参见表32)。本发明的重组构建体与载体(诸如质粒、噬菌粒、噬菌体或病毒载体)结合使用，向所述载体中插入编码本发明的抗体或其抗原结合片段或其变体的DNA分子。
如本文所使用，术语“载体”，是指能够繁殖与之连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括载体作为自我复制的核酸结构以及并入其已被引入的宿主细胞的基因组的载体。某些载体能够指导与它们可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，是指细胞已经向其中引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括初始转化的细胞和由其衍生的后代，而不考虑世代数目。后代在核酸含量中可以与亲本细胞不完全相同，但可以含有突变。本文包括与在初始转化的细胞中筛选或选择具有相同的功能或生物学活性的突变后代。
可通过在宿主细胞中重组表达编码轻链和重链或其部分的核酸序列来制备本文提供的抗体、其抗原结合部分或变体。为了重组表达抗体、其抗原结合部分或变体，宿主细胞可以用一种或多种重组表达载体(其携带编码轻链和/或重链或其部分的DNA片段)转染，使得轻链和重链在宿主细胞中表达。使用标准重组DNA方法制备和/或获得编码重链和轻链的核酸，将这些核酸并入重组表达载体中，且将所述载体引入宿主细胞中，诸如描述于以下的那些：Sambrook, Fritsch和Maniatis (编), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel, F. M.等人 (编) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989)和Boss等人的美国专利号4,816,397。
此外，可将编码重链和/或轻链的可变区的核酸序列转化为例如编码全长抗体链、Fab片段或scFv的核酸序列。可将编码VL或VH的DNA片段与编码例如抗体恒定区或柔性接头的另一DNA片段可操作连接(使得由两个DNA片段编码的氨基酸序列是符合读框的)。人重链和轻链恒定区的序列是本领域已知的(参见例如Kabat, E. A.,等人 (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第五版, U.S. Department of Health and Human Services, NIH公布号91-3242)，且涵盖这些区域的DNA片段可通过标准PCR扩增获得。
在某些测定中，本发明抗体表达为鼠IgG是优选的，例如，可以通过使用鼠抗体更容易地分析用人样品分析免疫组织化学。
为了生成编码scFv的多核苷酸序列，可将编码VH和VL的核酸与编码柔性接头的另一片段可操作连接，使得VH和VL序列可表达为连续的单链蛋白，其中VL和VH区域由柔性接头连接(参见例如Bird等人 (1988) Science 242:423-426; Huston等人 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty等人, Nature (1990) 348:552-554)。
为了表达抗体、其抗原结合片段或其变体，可以使用标准重组DNA表达方法(参见例如Goeddel; Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990))。例如，可将编码期望多肽的DNA插入表达载体，然后将其转染至合适的宿主细胞中。合适的宿主细胞是原核细胞和真核细胞。原核宿主细胞的实例是例如细菌，真核宿主细胞的实例是酵母、昆虫或哺乳动物细胞。在一些实施方案中，将编码重链和轻链的DNA插入不同载体中。在其它实施方案中，将编码重链和轻链的DNA插入相同的载体。应理解，表达载体的设计，包括调节序列的选择受因素诸如例如宿主细胞的选择、期望蛋白的表达水平和表达是组成型还是诱导型的影响。
细菌表达
通过以与功能性启动子的可操作阅读相(operable reading phase)，插入编码期望蛋白的结构DNA序列连同合适的翻译起始和终止信号，来构建用于细菌应用的有用的表达载体。所述载体可包含一种或多种表型选择标记和复制起点，以确保载体的维持，且如果需要，提供宿主内的扩增。用于转化的合适的原核宿主包括但不限于大肠杆菌(E. coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)以及假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)和葡萄球菌属(Staphylococcus)内的各个菌种。
细菌载体可以是例如基于噬菌体、质粒或噬菌粒的。这些载体可含有选择标记和源自商业可得的质粒的细菌复制起点，所述质粒通常含有众所周知的克隆载体pBR322 (ATCC 37017)的元件。在转化合适的宿主菌株和宿主菌株生长至适当细胞密度之后，通过适当方式(例如温度变化或化学诱导)去阻抑/诱导所选择的启动子，且将细胞再培养一段时间。细胞通常通过离心收获、通过物理或化学方式破坏，且保留所得粗提物用于进一步纯化。
在细菌系统中，可根据意欲用于所表达的蛋白的用途，有利地选择许多表达载体。例如，当待产生大量此类蛋白以用于例如生成抗体或筛选肽文库时，指导易于纯化的高水平融合蛋白产物的表达的载体可能是期望的。
因此，本发明的一个实施方案是包含编码本发明的新颖抗体的核酸序列的表达载体。对于示例性描述，参见实施例1。
本发明的抗体或其抗原结合片段或其变体包括天然纯化的产物、化学合成程序的产物和通过重组技术从以下原核宿主产生的产物，包括例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌以及假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属内的各个菌种，优选从大肠杆菌细胞产生的产物。
哺乳动物表达和纯化
用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调节序列包括指导蛋白在哺乳动物细胞中的高水平表达的病毒元件，诸如源自以下的启动子和/或增强子：巨细胞病毒(CMV)(诸如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40 (SV40)(诸如SV40启动子/增强子)、腺病毒、(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒。对于病毒调节元件及其序列的进一步描述，参见例如Stinski的U.S. 5,168,062、Bell等人的U.S. 4,510,245和Schaffner等人的U.S. 4,968,615。重组表达载体还可以包括复制起点和选择标记(参见例如Axel等人的U.S. 4,399,216、4,634,665和U.S. 5,179,017)。合适的选择标记包括在已经引入载体的宿主细胞中赋予对药物(诸如G418、潮霉素或甲氨蝶呤)的抗性的基因。例如，二氢叶酸还原酶(DHFR)基因赋予对甲氨蝶呤的抗性，neo基因赋予对G418的抗性。
表达载体至宿主细胞中的转染可以使用标准技术(诸如电穿孔、磷酸钙沉淀和DEAE-葡聚糖转染)实施。
用于表达本文提供的抗体、其抗原结合片段或其变体的合适的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞) [包括Urlaub和Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220中描述的dhfr-CHO细胞，与例如R. J. Kaufman和P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621中描述的DHFR选择标记一起使用]、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。在一些实施方案中，设计表达载体，使得表达的蛋白分泌到宿主细胞生长的培养基中。抗体、其抗原结合片段或其变体可以使用标准蛋白纯化方法从培养基回收。
本发明的抗体或其抗原结合片段或其变体可以通过众所周知的方法从重组细胞培养物回收且纯化，所述方法包括但不限于硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、蛋白A色谱法、蛋白G色谱法、阴离子或阳离子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水作用色谱法、亲和色谱法、羟磷灰石色谱法和凝集素色谱法。高效液相色谱法(“HPLC”)也可用于纯化。参见例如Colligan, Current Protocols in Immunology, 或Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001)，例如第1、4、6、8、9、10章，各自通过引用整体并入本文。
本发明的抗体或其抗原结合片段或其变体包括天然纯化的产物、化学合成程序的产物和通过重组技术从真核宿主(包括例如酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)产生的产物。根据重组产生程序中利用的宿主，本发明的抗体可以是糖基化的或可以是非糖基化的。此类方法描述于许多标准实验室手册，诸如Sambrook，同上，第17.37-17.42节；Ausubel，同上，第10、12、13、16、18和20章。
因此，本发明的一个实施方案也是包含载体或核酸分子的宿主细胞，从而所述宿主细胞可以是高等真核宿主细胞，诸如哺乳动物细胞，低等真核宿主细胞，诸如酵母细胞，并且可以是原核细胞，诸如细菌细胞。
本发明的另一个实施方案是使用宿主细胞以产生抗体和抗原结合片段的方法，其包括在合适条件下培养宿主细胞且回收所述抗体。
因此，本发明的另一个实施方案是用本发明的宿主细胞产生根据本发明的抗体和将这些抗体纯化至至少95重量％均匀性。
治疗方法
治疗方法涉及向需要治疗的对象施用治疗有效量的本发明考虑的抗体或其抗原结合片段或其变体。“治疗有效”量在本文定义为抗体或抗原结合片段作为单一剂量或根据多剂量方案，单独或与其它药剂组合，在对象的受治疗部位中足以降低TWEAKR阳性细胞的增殖或减小表达TWEAKR的肿瘤的尺寸的量，其导致不利病况的减轻，但该量是毒理学上可耐受的。所述对象可以是人或非人动物(例如兔、大鼠、小鼠、狗、猴或其它低级灵长类动物)。
本发明的一个实施方案是提供在源自细胞系和源自患者的人肿瘤模型的广泛实验对象组中具有强抗肿瘤功效的抗体或其抗原结合抗体片段或其变体。肿瘤模型包括但不限于786-O、A375、A253、SK-OV-3、WiDr、SW480、Co5682、NCI-H1975、NCI-H322、Lu7343和Lu7433(对于进一步细节，参见实施例8)、Co5676和Co 5841 (对于进一步细节，参见实施例10)、SCaBER (对于进一步细节，参见实施例11)和SCC4(对于进一步细节，参见实施例12)。例如，对于人肾细胞癌症模型786-O，TPP-2084和TPP-2090的剂量依赖性功效显示于图19。TPP-2090在人结肠癌异种移植物WiDr中的体内抗肿瘤功效示例性显示于图20中，且人肺癌异种移植物NCI-H322中的体内抗肿瘤功效示例性显示于图21中。还在其它结肠直肠肿瘤模型诸如SW480和源自患者的肿瘤模型Co5682中在单一疗法和/或联合治疗中研究抗TWEAKR抗体TPP-2090的功效，具有类似的良好结果(参见表29)。进一步肿瘤模型786-O、A375、A253、SK-OV-3、BX-PC3显示于表28且NCI-H322、NCI-H1975、Lu7343和Lu7433显示于表30。
本发明的一个实施方案是提供用作药物的本发明的抗体或其抗原结合片段。
本发明的一个实施方案是提供用作用于治疗癌症的药物的本发明的抗体或其抗原结合片段。在一个优选实施方案中，所述癌症是实体瘤。本发明的一个实施方案是提供用于治疗癌症的本发明的抗体或其抗原结合片段。在一个优选实施方案中，所述癌症是实体瘤。
本发明的一个实施方案是本发明的抗体或其抗原结合片段用于制备用于治疗癌症的药物的用途。在一个优选实施方案中，所述癌症是实体瘤。
本发明的另一个实施方案是提供用于治疗癌症的方法，其包括向有需要的对象施用治疗有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段。在一个优选实施方案中，所述癌症是实体瘤。
本发明的抗体或其抗原结合片段或其变体可以与已知的药物共同施用，在一些情况下，该抗体自身可被修饰。例如，抗体或其抗原结合片段或其变体可以与细胞毒性剂或放射性同位素缀合以潜在地进一步增加功效。
本发明的抗体或其抗原结合片段或其变体可以作为单独的药剂施用或与一种或多种额外治疗剂组合施用，其中所述组合不引起不可接受的不良反应。该组合治疗包括施用含有本发明的抗体或其抗原结合片段或其变体和一种或多种额外治疗剂的单一药物剂型，以及施用本发明的抗体和呈其自身分开药物剂型的各额外治疗剂。例如，可将本发明的抗体或其抗原结合片段或其变体和治疗剂在单一液体组合物中一起施用于患者，或各药剂可以以分开的剂型施用。
当使用分开的剂型时，本发明的抗体或其抗原结合片段或其变体和一种或多种额外治疗剂基本上可在相同时间(例如同时)或在单独错开的时间(例如相继)施用。
本发明的另一个实施方案是提供抗体或其抗原结合抗体片段或其变体，如果抗体治疗与伊立替康、瑞格非尼、紫杉醇、PI3K抑制剂1、奥沙利铂、顺铂、5-氟尿嘧啶(5-FU)、吉西他滨或西妥昔单抗组合，则所述抗体或其抗原结合抗体片段或其变体在源自细胞系和源自患者的人肿瘤模型中具有协同或累加功效。
本发明的一个优选实施方案是本发明的抗体或其抗原结合抗体片段或其变体与选自伊立替康、顺铂、奥沙利铂、5-氟尿嘧啶(5-FU)、瑞格非尼和西妥昔单抗的进一步活性成分的组合。甚至更优选的是抗体TPP-2090与选自伊立替康、顺铂、5-氟尿嘧啶(5-FU)和瑞格非尼的进一步活性成分的组合。
本发明的一个优选实施方案是本发明的抗体或其抗原结合抗体片段或其变体与选自伊立替康、奥沙利铂、5-氟尿嘧啶(5-FU)、瑞格非尼和西妥昔单抗的进一步活性成分的组合，其用于治疗结肠直肠癌。甚至更优选的是抗体TPP-2090与选自伊立替康、5-氟尿嘧啶(5-FU)和瑞格非尼的进一步活性成分的组合，其用于治疗结肠直肠癌。
在一个优选实施方案中，用本发明的抗体或其抗原结合抗体片段或其变体与伊立替康、奥沙利铂、5-氟尿嘧啶(5-FU)、瑞格非尼或西妥昔单抗的组合治疗结肠直肠癌。甚至更优选的是用TPP-2090与伊立替康、5-氟尿嘧啶(5-FU)或瑞格非尼的组合治疗结肠直肠癌。
一个进一步优选实施方案是本发明的抗体或其抗原结合抗体片段或其变体与顺铂的组合，其用于治疗膀胱癌。甚至更优选的是抗体TPP-2090与顺铂的组合，其用于治疗膀胱癌。
一个进一步优选实施方案是用本发明的抗体或其抗原结合抗体片段或其变体与顺铂的组合治疗膀胱癌。甚至更优选的是用TPP-2090与顺铂的组合治疗膀胱癌。
在人结肠癌异种移植物WiDr中，如果例如TPP-2090与伊立替康或瑞格非尼组合，则可以表明明显的积极效果。在人肺癌异种移植物NCI-H322和NCI-H1975中，如果例如TPP-2090与紫杉醇组合，则可以表明积极效果。
具体而言，本发明的抗体或其抗原结合片段或其变体可以与其它抗肿瘤药剂以固定组合或分开组合使用，所述其它抗肿瘤药剂诸如烷化剂、抗代谢药、植物来源的抗肿瘤药剂、激素治疗药剂、拓扑异构酶抑制剂、喜树碱衍生物、激酶抑制剂、靶向药物、抗体、干扰素和/或生物反应调节剂、抗血管生成化合物和其它抗肿瘤药物。在这方面，以下是可以与本发明的抗体组合使用的第二药剂的实例的非限制性列表：
烷化剂包括但不限于氮芥N-氧化物、环磷酰胺、异环磷酰胺、塞替派(thiotepa)、雷莫司汀(ranimustine)、尼莫司汀(nimustine)、替莫唑胺(temozolomide)、六甲蜜胺(altretamine)、阿帕齐醌(apaziquone)、brostallicin、苯达莫司汀(bendamustine)、卡莫司汀(carmustine)、雌莫司汀(estramustine)、福莫司汀(fotemustine),、葡磷酰胺(glufosfamide)、马磷酰胺(mafosfamide)、苯达莫司汀(bendamustin)和二溴卫矛醇(mitolactol)；铂配位的烷化化合物包括但不限于顺铂、卡铂、依铂、洛铂、奈达铂、奥沙利铂和沙铂；
抗代谢药包括但不限于甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤核苷、巯基嘌呤、5-氟尿嘧啶(单独或与亚叶酸组合)、替加氟(tegafur)、去氧氟尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、阿糖胞苷十八烷基磷酸盐(cytarabine ocfosfate)、依诺他滨(enocitabine)、吉西他滨(gemcitabine)、氟达拉滨(fludarabine)、5-阿扎胞苷(5-azacitidine)、卡培他滨(capecitabine)、克拉屈滨(cladribine)、氯法拉滨(clofarabine)、地西他滨(decitabine)、依氟鸟氨酸(eflornithine)、乙炔基胞苷(ethynylcytidine)、阿糖胞苷(cytosine arabinoside),、羟基脲、美法仑(melphalan)、奈拉滨(nelarabine)、诺拉曲塞(nolatrexed)、ocfosfite、培美曲塞二钠、喷司他丁(pentostatin)、吡利曲索(pelitrexol)、雷替曲塞(raltitrexed)、triapine、三甲曲沙(trimetrexate)、阿糖腺苷(vidarabine)、长春新碱和长春瑞滨(vinorelbine)；
激素治疗药剂包括但不限于依西美坦(exemestane)、醋酸亮丙瑞林(Lupron)、阿那曲唑(anastrozole)、度骨化醇(doxercalciferol)、法倔唑(fadrozole)、福美坦(formestane)、11-β羟基类固醇脱氢酶1抑制剂、17-α羟化酶/17,20裂解酶抑制剂诸如醋酸阿比特龙(abiraterone acetate)、5-α还原酶抑制剂诸如非那雄胺(finasteride)和依立雄胺(epristeride)、抗雌激素类诸如枸橼酸他莫昔芬(tamoxifen citrate)和氟维司群(fulvestrant)、Trelstar、托瑞米芬(toremifene)、雷洛昔芬(raloxifene)、拉索昔芬(lasofoxifene)、来曲唑(letrozole)、抗雄激素类诸如比卡鲁胺(bicalutamide)、氟他胺(flutamide)、米非司酮(mifepristone)、尼鲁米特(nilutamide)、康士德(Casodex)和抗黄体酮和其组合；
植物来源的抗肿瘤物质包括例如选自有丝分裂抑制剂的那些，例如埃坡霉素(epothilone)诸如沙戈匹隆(sagopilone)、伊沙匹隆(ixabepilone)和埃坡霉素B(epothilone B)、长春碱、长春氟宁(vinflunine)、多西他赛(docetaxel)和紫杉醇；
细胞毒性拓扑异构酶抑制剂包括但不限于阿柔比星(aclarubicin)、多柔比星(doxorubicin)、氨萘非特(amonafide)、贝洛替康(belotecan)、喜树碱、10-羟基喜树碱、9-氨基喜树碱、二氟替康(diflomotecan)、伊立替康(irinotecan)、托泊替康(topotecan)、艾特咔林(edotecarin)、epimbicin、依托泊苷(etoposide)、依沙替康(exatecan)、吉马替康(gimatecan)、勒托替康(lurtotecan)、米托蒽醌(mitoxantrone)、pirambicin、匹蒽醌(pixantrone)、卢比替康(rubitecan)、索布佐生(sobuzoxane)、他氟泊苷(tafluposide)和其组合；
免疫药(Immunologicals)包括干扰素(诸如干扰素α、干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素β、干扰素γ-1a和干扰素γ-n1)和其它免疫增强剂诸如L19-IL2和其它IL2衍生物、非格司亭(filgrastim)、香菇多糖、西佐喃(sizofilan)、TheraCys、乌苯美司(ubenimex)、阿地白介素(aldesleukin)、阿仑单抗(alemtuzumab)、BAM-002、达卡巴嗪(dacarbazine)、达克珠单抗(daclizumab)、地尼白介素(denileukin)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、奥佐米星(ozogamicin)、替伊莫单抗(ibritumomab)、咪喹莫特(imiquimod)、来格司亭(lenograstim)、香菇多糖、黑色素瘤疫苗(Corixa)、莫拉司亭(molgramostim)、沙格司亭(sargramostim)、他索纳明(tasonermin)、替西白介素(tecleukin)、胸腺法新(thymalasin)、托西莫单抗(tositumomab)、Vimlizin、依帕珠单抗(epratuzumab)、米妥莫单抗(mitumomab)、奥戈伏单抗(oregovomab)、帕尼单抗(pemtumomab)和普罗文奇(Provenge)；
生物反应调节剂是改进活生物体的防御机制或生物反应(诸如组织细胞的存活、生长或分化)以引导它们具有抗肿瘤活性的药剂；此类药剂包括例如云芝多糖(krestin)、香菇多糖、西佐喃、溶血性链球菌制剂(picibanil)、ProMune和乌苯美司(ubenimex)；
抗血管生成化合物包括但不限于阿维A(acitretin)、阿普西柏(aflibercept)、血管生长抑素、aplidine、asentar、阿昔替尼(axitinib)、贝伐单抗(bevacizumab)、brivanib alaninat、西仑吉肽(cilengtide)、考布他汀(combretastatin)、内皮生长抑素、芬维A胺(fenretinide)、卤夫酮(halofuginone)、帕唑帕尼(pazopanib)、雷珠单抗(ranibizumab)、瑞马司他(rebimastat)、recentin、瑞格非尼、removab、revlimid、索拉非尼(sorafenib)、角鲨胺(squalamine)、舒尼替尼(sunitinib)、telatinib、沙利度胺(thalidomide)、ukrain、伐他拉尼(vatalanib)和vitaxin；
抗体包括但不限于曲妥单抗(trastuzumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、贝伐单抗、利妥昔单抗(rituximab)、替西木单抗(ticilimumab)、伊匹木单抗(ipilimumab)、鲁昔单抗(lumiliximab)、卡妥索单抗(catumaxomab)、atacicept、奥戈伏单抗、帕尼单抗和阿仑单抗；
VEGF抑制剂诸如例如索拉非尼、瑞格非尼、贝伐单抗、舒尼替尼、recentin、阿昔替尼、阿普西柏、telatinib、丙氨酸布立尼布(brivanib alaninate)、伐他拉尼、帕唑帕尼和雷珠单抗；
EGFR (HER1)抑制剂诸如例如西妥昔单抗、帕尼单抗(panitumumab)、vectibix、吉非替尼(gefitinib)、埃罗替尼(erlotinib)和Zactima；
HER2抑制剂诸如例如拉帕替尼(lapatinib)、曲妥单抗(tratuzumab)和培妥珠单抗(pertuzumab)；
mTOR抑制剂诸如例如坦罗莫司(temsirolimus)、西罗莫司/雷帕霉素(sirolimus/Rapamycin)和依维莫司(everolimus)；
c-Met抑制剂；
PI3K抑制剂诸如PI3K抑制剂1 (2-氨基-N-[7-甲氧基-8-(3-吗啉-4-基丙氧基)-2,3-di氢咪唑并[1,2-c]喹唑啉-5-基]嘧啶-5-甲酰胺二盐酸盐(参见WO 2012/136553的实施例1和2的化合物，(其以其整体通过引用并入本文)
和AKT抑制剂；
CDK抑制剂诸如roscovitine和黄酮吡多(flavopiridol)；
纺锤体装配检查点抑制剂和靶向的抗有丝分裂剂诸如PLK抑制剂、Aurora抑制剂(例如Hesperadin)、检查点激酶抑制剂和KSP抑制剂；
HDAC抑制剂诸如例如帕比司他(panobinostat)、伏林司他(vorinostat)、MS275、belinostat和LBH589；
HSP90和HSP70抑制剂；
蛋白酶体抑制剂诸如硼替佐米(bortezomib)和carfilzomib；
丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂包括MEK抑制剂和Raf抑制剂诸如索拉非尼；
法呢基转移酶抑制剂诸如例如替匹法尼(tipifarnib)；
酪氨酸激酶抑制剂包括例如达沙替尼(dasatinib)、尼洛替尼(nilotibib)、瑞格非尼、波舒替尼(bosutinib)、索拉非尼、贝伐单抗、舒尼替尼、cediranib、阿昔替尼、阿普西柏、telatinib、甲磺酸伊马替尼、丙氨酸布立尼布、帕唑帕尼、雷珠单抗、伐他拉尼、西妥昔单抗、帕尼单抗、vectibix、吉非替尼、埃罗替尼、拉帕替尼、曲妥单抗、培妥珠单抗和c-Kit抑制剂；
维生素D受体激动剂；
Bcl-2蛋白抑制剂诸如奥巴克拉(obatoclax)、奥利美生钠(oblimersen sodium)和棉酚(gossypol)；
分化20受体簇拮抗剂(Cluster of differentiation 20 receptor antagonist)诸如例如利妥昔单抗；
核糖核苷酸还原酶抑制剂诸如例如吉西他滨；
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体1激动剂诸如例如马帕木单抗(mapatumumab)；
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体2激动剂诸如例如，来沙木单抗(lexatumumab)、conatumumab、CS-1008、PRO95780；
5-羟色胺受体拮抗剂诸如例如rEV598、扎利罗登(xaliprode)、盐酸帕洛诺司琼(palonosetron hydrochloride)、格拉司琼(granisetron)、Zindol和AB-1001；
整联蛋白抑制剂包括α5-β1整联蛋白抑制剂诸如，例如E7820、JSM 6425、伏洛昔单抗(volociximab)和内皮生长抑素；
雄激素受体拮抗剂包括例如癸酸诺龙、氟甲睾酮、甲睾酮(Android)、Prost-aid、andromustine、比卡鲁胺、氟他胺、apo-cyproterone(apo-环丙孕酮)、apo-flutamide(apo-氟他胺)、醋酸氯地孕酮(chlormadinone acetate)、色普龙(Androcur)、Tabi、醋酸环丙孕酮(cyproterone acetate)和尼鲁米特；
芳香酶抑制剂诸如例如阿那曲唑、来曲唑、睾内酯、依西美坦、氨鲁米特(aminoglutethimide)和福美坦；
基质金属蛋白酶抑制剂；
其它抗癌药剂包括例如阿利维A酸(alitretinoin)、聚肌胞(ampligen)、阿曲生坦(atrasentan)、贝沙罗汀(bexarotene)、硼替佐米(bortezomib)、波生坦(bosentan)、骨化三醇、依昔舒林(exisulind)、福莫司汀、伊班膦酸(ibandronic acid)、米替福新(miltefosine)、米托蒽醌、I-天冬酰胺酶、丙卡巴肼(procarbazine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、羟基脲、培门冬酶(pegaspargase)、喷司他丁(pentostatin)、他扎罗汀(tazaroten)、万珂(velcade)、硝酸镓、坎磷酰胺(canfosfamide)、darinaparsin和维A酸(tretinoin)。
在一个优选实施方案中，本发明的抗体可以与化学疗法(即细胞毒性剂)、抗激素和/或靶向疗法诸如其它激酶抑制剂(例如EGFR抑制剂)、mTOR抑制剂和血管生成抑制剂组合使用。
本发明的化合物也可以与放射疗法和/或手术介入结合用于癌症治疗。
在一些情况下，本发明的抗体或其抗原结合片段自身可被修饰。例如，可将抗体与任何(但不限于)上述化合物或任何放射性同位素缀合以潜在地进一步增加功效。此外，本发明的抗体可以原样利用或可用于组合物、研究和诊断，或可作为分析参考标准品等，其为本领域众所周知的。
本发明的抗体或其抗原结合片段可在具有异常TWEAKR-信号传导的各种情况(例如细胞增殖性病症诸如癌症或纤维化疾病)中用作治疗或诊断工具。特别适合于用本发明的抗体治疗的病症和病况是实体瘤，诸如乳腺癌、呼吸道癌、脑癌、生殖器官癌、消化道癌、泌尿道癌、眼癌、肝癌、皮肤癌、头颈癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌及其远处转移。那些病症还包括淋巴瘤、肉瘤和白血病。
消化道肿瘤包括但不限于肛门癌、结肠癌、结肠直肠癌、食管癌、胆囊癌、胃癌、胰腺癌、直肠癌、小肠癌和唾液腺癌。
食管癌的实例包括，但不限于：食管细胞癌和腺癌，以及鳞状细胞癌、平滑肌肉瘤、恶性黑色素瘤、横纹肌肉瘤和淋巴瘤。
胃癌的实例包括，但不限于肠型和弥漫型胃腺癌。
胰腺癌的实例包括，但不限于导管腺癌、腺鳞癌和胰腺内分泌肿瘤。
乳腺癌的实例包括但不限于三阴性乳腺癌、侵袭性导管癌、侵袭性小叶癌、原位导管癌和原位小叶癌。
呼吸道癌的实例包括但不限于小细胞肺癌和非小细胞肺癌以及支气管腺瘤和胸膜肺胚细胞瘤。
脑癌的实例包括但不限于脑干和下丘脑神经胶质瘤、小脑和大脑星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、成神经管细胞瘤、室管膜瘤以及神经外胚层瘤和松果体瘤。
男性生殖器官肿瘤包括但不限于前列腺癌和睾丸癌。女性生殖器官肿瘤包括但不限于子宫内膜癌、宫颈癌、卵巢癌、阴道癌和外阴癌以及子宫肉瘤。
卵巢癌的实例包括，但不限于：浆液性肿瘤、子宫内膜肿瘤、粘液性囊腺癌、粒层细胞瘤、Sertoli-Leydig细胞肿瘤和男性细胞瘤。
子宫颈癌的实例包括，但不限于鳞状细胞癌、腺癌、腺鳞癌、小细胞癌、神经内分泌肿瘤、玻璃状细胞癌和绒毛管状腺癌。
泌尿道肿瘤包括但不限于膀胱癌、阴茎癌、肾癌、肾盂癌、输尿管癌、尿道癌及遗传性和偶发性乳头状肾癌。
肾癌的实例包括，但不限于肾细胞癌、泌尿道上皮细胞癌、近肾小球细胞肿瘤(肾素瘤)、血管肌脂肪瘤、肾嗜酸细胞瘤、Bellini管癌、肾的透明细胞肉瘤、中胚层肾瘤和Wilms氏肿瘤。
膀胱癌的实例包括但不限于移行细胞癌、鳞状细胞癌、腺癌、肉瘤和小细胞癌。
眼癌包括但不限于眼内黑色素瘤和成视网膜细胞瘤。
肝癌的实例包括但不限于肝细胞癌(有或没有纤维板层变型的肝细胞癌)、胆管癌(肝内胆管癌)和混合型肝细胞胆管癌。
皮肤癌包括但不限于鳞状细胞癌、卡波西肉瘤(Kaposi's sarcoma)、恶性黑色素瘤、梅克尔细胞(Merkel cell)皮肤癌和非黑色素瘤皮肤癌。
头颈癌包括但不限于头颈鳞状细胞癌、喉癌、下咽癌、鼻咽癌、口咽癌、唾液腺癌、唇癌和口腔癌和鳞状细胞癌。
淋巴瘤包括但不限于AIDS相关淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)、皮肤T细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、霍奇金病和中枢神经系统淋巴瘤。
肉瘤包括但不限于软组织肉瘤、骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、淋巴肉瘤和横纹肌肉瘤。
白血病包括但不限于急性髓细胞样白血病、急性成淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病和毛细胞白血病。
在一个优选实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段适合于用于治疗或诊断癌症疾病的治疗或诊断方法。在一个优选实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段适合于用于治疗或诊断癌症疾病的治疗或诊断方法，其中所述癌症是实体瘤。
在一个优选实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段适合于用于治疗或诊断癌症疾病的治疗或诊断方法，所述癌症疾病选自胃癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、肺癌、子宫内膜癌、食管癌、头颈癌、肝细胞癌、黑色素瘤和膀胱癌。
在一个更优选实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段适合于用于治疗或诊断癌症疾病的治疗或诊断方法，所述癌症疾病选自膀胱癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、肾癌、黑色素瘤、卵巢癌、头颈癌和胰腺癌。
在一个更优选实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段用于用于治疗癌症疾病的治疗方法中，所述癌症疾病选自膀胱癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、肾癌、黑色素瘤、卵巢癌、头颈癌和胰腺癌。
一个更优选实施方案是本发明的抗体或其抗原结合片段用于制备用于治疗癌症疾病的药物的用途，所述癌症疾病选自膀胱癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、肾癌、黑色素瘤、卵巢癌、头颈癌和胰腺癌。
一个更优选实施方案是用于治疗癌症疾病的方法，所述癌症疾病选自膀胱癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、肾癌、黑色素瘤、卵巢癌、头颈癌和胰腺癌，所述方法包括施用治疗有效量的本发明的抗体或抗原结合片段。
此外，本发明的抗体或抗原结合片段也可以用作其中涉及TWEAKR的各种其它病症中的治疗或诊断工具，所述其它病症诸如但不限于纤维变性疾病诸如肺泡内纤维化、二氧化硅-诱导的肺纤维化、实验性肺纤维化、特发性肺纤维化、肾纤维化以及淋巴管肌瘤病、多囊卵巢综合征、痤疮、牛皮癣、胆脂瘤、胆脂瘤慢性中耳炎、牙周炎、日光性斑痣、肠病、动脉粥样硬化或子宫内膜异位症。
上述病症在人中已得到良好表征，但也以类似病原学存在于其它动物(包括哺乳动物)中，并且可通过施用本发明的药物组合物来治疗。
为了治疗任何前述病症，可使用一种或多种生理上可接受的载体或赋形剂，以常规方式配制根据本发明使用的药物组合物。根据所治疗的病症类型，本发明的抗体或其抗原结合片段可通过任何合适的方式施用。可能的施用途径包括胃肠外(例如肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下)、肺内和鼻内，且如果需要，用于局部免疫抑制治疗、病灶内施用(intralesional administration)。此外，本发明的抗体或其抗原结合片段或其变体可用例如减量的抗体通过脉冲输注施用。优选地，通过注射(最优选静脉内或皮下注射)给予剂量，这部分取决于是短暂施用还是长期施用。待施用的量将取决于多种因素，诸如临床症状、个体体重、是否施用其它药物。技术人员应认识到，施用途径可根据待治疗的病症或病况而改变。
确定本发明的新颖抗体或其抗原结合片段或其变体的治疗有效量，大大取决于具体患者特征、施用途径和待治疗的病症的性质。一般指导可参见例如国际协调会议(International Conference on Harmonization)出版物和Remington's Pharmaceutical Sciences，第27和28章，第484-528页(第18版, Alfonso R. Gennaro, Ed., Easton, Pa.: Mack Pub. Co., 1990)。更具体地，治疗有效量的确定取决于因素诸如药物的毒性和功效。毒性可使用本领域中众所周知的方法测定，且可见于前述参考文献。可利用相同指导结合下文实施例中描述的方法测定功效。
诊断方法
抗TWEAKR抗体或其抗原结合片段可用于检测表达TWEAKR的肿瘤的存在。各种生物样品(包括血清和组织活检样本)内的含有TWEAKR的细胞或脱落TWEAKR的存在可以用抗TWEAKR抗体检测。此外，抗TWEAKR抗体可用于各种成像方法，诸如用99Tc(或其它同位素)缀合的抗体的免疫闪烁法。例如，成像方案(其类似于描述的使用111In缀合的抗PSMA抗体的成像方案)可用于检测胰腺癌或卵巢癌(Sodee等人, Clin. Nuc. Med. 21: 759-766, 1997)。可以使用的另一种检测方法是通过将本发明的抗体与合适的同位素缀合的正电子发射断层扫描术(参见Herzog等人, J. Nucl. Med. 34:2222-2226, 1993)。
药物组合物和施用
本发明的一个实施方案是药物组合物，其包含单独或与至少一种其它药剂(诸如稳定化合物)组合的抗TWEAKR抗体或其抗原结合片段或其变体，所述药物组合物可以在任何无菌的生物相容性药物载体中施用，所述载体包括但不限于盐水、缓冲盐水、右旋糖和水。一个进一步实施方案是这样的药物组合物，其包含TWEAKR结合抗体或其抗原结合片段和适合于治疗TWEAKR相关疾病(诸如癌症)的其它药物活性化合物。任何这些分子可单独施用于患者，或与其它药剂、药物或激素组合施用于患者、在其与一种或多种赋形剂或药学上可接受的载体混合的药物组合物施用于患者。在本发明的一个实施方案中，药学上可接受的载体是药学上惰性的。
本发明还涉及药物组合物的施用。此类施用经口或胃肠外实现。胃肠外递送的方法包括局部、动脉内(直接至肿瘤)、肌内、皮下、髓内、鞘内、心室内、静脉内、腹膜内或鼻内施用。除了活性成分以外，这些药物组合物还可含有合适的药学上可接受的载体(包括赋形剂和助剂)，其有利于将活性化合物加工成药学上可使用的制剂。关于用于配制和施用的技术的进一步细节可参见Remington's Pharmaceutical Sciences的最新版本(主编Maack Publishing Co, Easton, Pa.)。
术语“药物制剂”是指这样的制备物，其形式使得允许其中含有的活性成分的生物活性是有效的，且不含对将施用所述制剂的对象而言具有不可接受的毒性的额外组分。
用于口服施用的药物组合物可使用本领域众所周知的药学上可接受的载体以适合于口服施用的剂量配制。此类载体使得药物组合物能够配制为被患者摄入的片剂、丸剂、锭剂、胶囊剂、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、浆液(slurry)、悬浮剂等。
用于经口使用的药物制备物可以通过以下获得：将活性化合物与固体赋形剂混合，任选研磨所得混合物，和加工颗粒的混合物，在添加合适的助剂(如果需要)之后，以获得片剂或锭剂核心。合适的赋形剂是碳水化合物或蛋白填充剂诸如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；来自玉米、小麦、稻米、马铃薯或其它植物的淀粉；纤维素，诸如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素钠；和树胶包括阿拉伯树胶和西黄蓍胶；和蛋白诸如明胶和胶原。如果需要，可以添加崩解剂或增溶剂，诸如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、藻酸或其盐，诸如藻酸钠。
锭剂核心可以用合适的包衣(诸如浓缩糖溶液)提供，其还可以含有阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波普胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆用溶液(lacquer solution)和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可将染料或颜料添加至片剂或锭剂包衣中用于产品鉴定或表征活性化合物的量，即剂量。
可以经口使用的药物制备物包括由明胶制成的推入适配胶囊剂(push-fit capsule)，以及由明胶和包衣(诸如甘油或山梨醇)制成的密封软胶囊剂。推入适配胶囊剂可含有与填充剂或粘合剂(诸如乳糖或淀粉)、润滑剂(诸如滑石或硬脂酸镁)和任选稳定剂混合的活性成分。在软胶囊剂中，可将活性化合物溶解于或悬浮于含有或不含稳定剂的合适的液体中，所述液体诸如脂肪油、液状石蜡或液态聚乙二醇。
用于胃肠外施用的药物制剂包括活性化合物的水溶液。对于注射剂，本发明的药物组合物可在水溶液中、优选在生理相容的缓冲液诸如Hank氏溶液、林格氏液或生理缓冲盐水中配制。水性注射悬浮剂可含有增加悬浮液的粘度的物质，诸如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。此外，可将活性化合物的悬浮液制备为适当的油性注射悬浮剂。合适的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油(诸如芝麻油)或合成脂肪酸酯(诸如油酸乙酯或甘油三酯)或脂质体。任选地，悬浮剂还可含有合适的稳定剂或增加化合物的溶解度以允许制备高度浓缩的溶液的试剂。
对于局部或经鼻施用，在制剂中使用适于待渗透的特定屏障的渗透剂。此类渗透剂通常是本领域已知的。
药剂盒
本发明进一步涉及药包(pharmaceutical pack)和药剂盒，其包含装有前述本发明组合物的一种或多种成分的一个或多个容器。此一个或多个容器可附有监管药物或生物制品的制造、使用或销售的政府机构所规定格式的通知，其反映用于人施用的产品得到监管机构的制造、使用或销售的批准。
在另一个实施方案中，所述药剂盒可以含有编码本发明的抗体或其抗原结合片段或其片段的DNA序列。优选地，编码这些抗体的DNA序列可以提供于适合于转染至宿主细胞中且由宿主细胞表达的质粒。所述质粒可以含有启动子(通常为诱导型启动子)以调节DNA在宿主细胞中的表达。所述质粒还可以含有适当的限制位点以利于其它DNA序列插入质粒以产生各种抗体。所述质粒还可以含有多种其它元件以利于所编码蛋白的克隆和表达。此类元件是本领域技术人员众所周知的，且包括例如选择标记、起始密码子、终止密码子等。
制备和储存
本发明的药物组合物可以以本领域已知方式制备，例如借助常规混合、溶解、制粒、制锭(dragee-making)、研碎、乳化、胶囊化、包封(entrapping)或冻干过程。
药物组合物可作为盐提供，且可以与酸一起形成，所述酸包括但不限于盐酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸等。盐趋于更溶于水性溶剂或其它质子溶剂(其为相应的游离碱形式)中。在其它情况下，优选的制剂可以是在4.5-5.5的pH范围内的1 mM-50 mM组氨酸、0.1%-2%蔗糖、2%-7%甘露醇中的冻干粉，其使用前与缓冲液混合。
在已经制备包含在可接受的载体中配制的本发明化合物的药物组合物之后，可将其置于适当的容器中，且标记用于治疗适应症。对于抗TWEAKR抗体或其抗原结合片段的施用，此标记可包括施用的量、频率和方法。
治疗有效剂量
适用于本发明的药物组合物包括这样的组合物，其中包含有效量的活性成分以实现预期目的，即治疗特征在于TWEAKR表达的特定疾病状态。有效剂量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内。
对于任何化合物，最初可在细胞培养测定(例如赘生性细胞)中，或在动物模型(通常为小鼠、兔、狗、猪或猴)中，估算治疗有效剂量。动物模型还用于实现期望的浓度范围和施用途径。然后，可以使用此信息确定用于在人中施用的可用剂量和途径。
治疗有效剂量是指改善症状或病况的抗体或其抗原结合片段的量。可在细胞培养物或实验动物中，通过标准药学程序，例如ED50(50%群体中治疗有效的剂量)和LD50(50%群体的致死剂量)，来确定此类化合物的治疗功效和毒性。治疗和毒性作用之间的剂量比是治疗指数，且其可表示为ED50/LD50比率。表现出大的治疗指数的药物组合物是优选的。将从细胞培养测定和动物研究中获得的数据用于确定用于人使用的剂量范围。此类化合物的剂量优选位于包括ED50的几乎无毒或无毒的循环浓度范围内。根据所采用的剂型、患者的敏感性和施用途径，该剂量在该范围变化。
确切的剂量由每个医生考虑到待治疗的患者来选择。调整剂量和施用以提供足够水平的活性部分或保持期望效果。可考虑的额外因素包括疾病状态的严重度，例如肿瘤大小和部位；患者的年龄、体重和性别；饮食、施用时间和频率、药物组合、反应敏感性和对治疗的耐受性/反应。可根据特定制剂的半衰期和清除率，例如每3至4天、每周、每两周一次、或每三周一次施用长效药物组合物。
根据施用途径，正常剂量可从0.1微克至100,000微克、直至约2 g的总剂量变化。文献中提供了关于特定剂量和递送方法的指导。参见美国专利号4,657,760；5,206,344；或5,225,212。本领域技术人员可采用不同于蛋白或其抑制剂的制剂的多核苷酸制剂。类似地，多核苷酸或多肽的递送对于特定细胞、病况、部位等是特异性的。放射性标记的抗体的优选比活性范围可为0.1-10 mCi/mg蛋白(Riva等人, Clin. Cancer Res. 5:3275-3280, 1999; Ulaner等人, 2008 Radiology 246(3):895-902)。
本发明的一个进一步优选实施方案是：
1. 分离的抗TWEAKR抗体或其抗原结合片段，其特异性结合至TWEAKR (SEQ ID NO:169)的位置47的D (D47)。
2. 根据实施方案1的抗体或其抗原结合片段，其中当所述抗体与TPP-2203相比失去其在TPP-2614上的ELISA信号的超过80%时，所述抗体特异性结合至TWEAKR (SEQ ID NO:169)的位置47的D (D47)。
3. 根据实施方案1或2的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是激动性抗体。
4. 根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含：
可变重链，其包含
(a) 由包含式PYPMX (SEQ ID NO:171)的氨基酸序列编码的重链CDR1，其中X是I或M；
(b) 由包含式YISPSGGXTHYADSVKG (SEQ ID NO:172)的氨基酸序列编码的重链CDR2，其中X是S或K；和
(c) 由包含式GGDTYFDYFDY (SEQ ID NO:173)的氨基酸序列编码的重链CDR3；
和可变轻链，其包含：
(a) 由包含式RASQSISXYLN (SEQ ID NO:174)的氨基酸序列编码的轻链CDR1，其中X是G或S；
(b) 由包含式XASSLQS (SEQ ID NO:175)的氨基酸序列编码的轻链CDR2，其中X是Q、A或N；和
(c) 由包含式QQSYXXPXIT (SEQ ID NO:176)的氨基酸序列编码的轻链CDR3，其中位置5的X是T或S，且位置6的X是T或S，且位置8的X是G 或F。
5. 根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含：
a. 可变重链，其包含如由SEQ ID NO:6代表的可变重链CDR1序列、如由SEQ ID NO:7代表的可变重链CDR2序列和如由SEQ ID NO:8代表的可变重链CDR3序列，和
可变轻链，其包含如由SEQ ID NO:3代表的可变轻链CDR1序列、如由SEQ ID NO:4代表的可变轻链CDR2序列和如由SEQ ID NO:5代表的可变轻链CDR3序列，或
b. 可变重链，其包含如由SEQ ID NO:16代表的可变重链CDR1序列、如由SEQ ID NO:17代表的可变重链CDR2序列和如由SEQ ID NO:18代表的可变重链CDR3序列，和
可变轻链，其包含如由SEQ ID NO:13代表的可变轻链CDR1序列、如由SEQ ID NO:14代表的可变轻链CDR2序列和如由SEQ ID NO:15代表的可变轻链CDR3序列，或
c. 可变重链，其包含如由SEQ ID NO:26代表的可变重链CDR1序列、如由SEQ ID NO:27代表的可变重链CDR2序列和如由SEQ ID NO:28代表的可变重链CDR3序列，和
可变轻链，其包含如由SEQ ID NO:23代表的可变轻链CDR1序列、如由SEQ ID NO:24代表的可变轻链CDR2序列和如由SEQ ID NO:25代表的可变轻链CDR3序列，或
d. 可变重链，其包含如由SEQ ID NO:36代表的可变重链CDR1序列、如由SEQ ID NO:37代表的可变重链CDR2序列和如由SEQ ID NO:38代表的可变重链CDR3序列，和
可变轻链，其包含如由SEQ ID NO:33代表的可变轻链CDR1序列、如由SEQ ID NO:34代表的可变轻链CDR2序列和如由SEQ ID NO:35代表的可变轻链CDR3序列，或
e. 可变重链，其包含如由SEQ ID NO:46代表的可变重链CDR1序列、如由SEQ ID NO:47代表的可变重链CDR2序列和如由SEQ ID NO:48代表的可变重链CDR3序列，和
可变轻链，其包含如由SEQ ID NO:43代表的可变轻链CDR1序列、如由SEQ ID NO:44代表的可变轻链CDR2序列和如由SEQ ID NO:45代表的可变轻链CDR3序列，或
f. 可变重链，其包含如由SEQ ID NO:56代表的可变重链CDR1序列、如由SEQ ID NO:57代表的可变重链CDR2序列和如由SEQ ID NO:58代表的可变重链CDR3序列，和
可变轻链，其包含如由SEQ ID NO:53代表的可变轻链CDR1序列、如由SEQ ID NO:54代表的可变轻链CDR2序列和如由SEQ ID NO:55代表的可变轻链CDR3序列，或
g. 可变重链，其包含如由SEQ ID NO:66代表的可变重链CDR1序列、如由SEQ ID NO:67代表的可变重链CDR2序列和如由SEQ ID NO:68代表的可变重链CDR3序列，和
可变轻链，其包含如由SEQ ID NO:63代表的可变轻链CDR1序列、如由SEQ ID NO:64代表的可变轻链CDR2序列和如由SEQ ID NO:65代表的可变轻链CDR3序列，或
h. 可变重链，其包含如由SEQ ID NO:76代表的可变重链CDR1序列、如由SEQ ID NO:77代表的可变重链CDR2序列和如由SEQ ID NO:78代表的可变重链CDR3序列，和
可变轻链，其包含如由SEQ ID NO:73代表的可变轻链CDR1序列、如由SEQ ID NO:74代表的可变轻链CDR2序列和如由SEQ ID NO:75代表的可变轻链CDR3序列，或
i. 可变重链，其包含如由SEQ ID NO:86代表的可变重链CDR1序列、如由SEQ ID NO:87代表的可变重链CDR2序列和如由SEQ ID NO:88代表的可变重链CDR3序列，和
可变轻链，其包含如由SEQ ID NO:83代表的可变轻链CDR1序列、如由SEQ ID NO:84代表的可变轻链CDR2序列和如由SEQ ID NO:85代表的可变轻链CDR3序列，或
j. 可变重链，其包含如由SEQ ID NO:96代表的可变重链CDR1序列、如由SEQ ID NO:97代表的可变重链CDR2序列和如由SEQ ID NO:98代表的可变重链CDR3序列，和
可变轻链，其包含如由SEQ ID NO:93代表的可变轻链CDR1序列、如由SEQ ID NO:94代表的可变轻链CDR2序列和如由SEQ ID NO:95代表的可变轻链CDR3序列，或
k. 可变重链，其包含如由SEQ ID NO:106代表的可变重链CDR1序列、如由SEQ ID NO:107代表的可变重链CDR2序列和如由SEQ ID NO:108代表的可变重链CDR3序列，和
可变轻链，其包含如由SEQ ID NO:103代表的可变轻链CDR1序列、如由SEQ ID NO:104代表的可变轻链CDR2序列和如由SEQ ID NO:105代表的可变轻链CDR3序列，或
l. 可变重链，其包含如由SEQ ID NO:116代表的可变重链CDR1序列、如由SEQ ID NO:117代表的可变重链CDR2序列和如由SEQ ID NO:118代表的可变重链CDR3序列，和
可变轻链，其包含如由SEQ ID NO:113代表的可变轻链CDR1序列、如由SEQ ID NO:114代表的可变轻链CDR2序列和如由SEQ ID NO:115代表的可变轻链CDR3序列。
6. 根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含：
a. 如由SEQ ID NO:10代表的可变重链序列和如由SEQ ID NO:9代表的可变轻链序列，或
b. 如由SEQ ID NO:20代表的可变重链序列和如由SEQ ID NO:19代表的可变轻链序列，或
c. 如由SEQ ID NO:30代表的可变重链序列和如由SEQ ID NO:29代表的可变轻链序列，或
d. 如由SEQ ID NO:40代表的可变重链序列和如由SEQ ID NO:39代表的可变轻链序列，或
e. 如由SEQ ID NO:50代表的可变重链序列和如由SEQ ID NO:49代表的可变轻链序列，或
f. 如由SEQ ID NO:60代表的可变重链序列和如由SEQ ID NO:59代表的可变轻链序列，或
g. 如由SEQ ID NO:70代表的可变重链序列和如由SEQ ID NO:69代表的可变轻链序列，或
h. 如由SEQ ID NO:80代表的可变重链序列和如由SEQ ID NO:79代表的可变轻链序列，或
i. 如由SEQ ID NO:90代表的可变重链序列和如由SEQ ID NO:89代表的可变轻链序列，或
j. 如由SEQ ID NO:100代表的可变重链序列和如由SEQ ID NO:99代表的可变轻链序列，或
k. 如由SEQ ID NO:110代表的可变重链序列和如由SEQ ID NO:109代表的可变轻链序列，或
l. 如由SEQ ID NO:120代表的可变重链序列和如由SEQ ID NO:119代表的可变轻链序列。
7. 根据前述实施方案中任一项的抗体，其为IgG抗体。
8. 根据前述实施方案中任一项的抗体，其包含：
a. 如由SEQ ID NO:2代表的重链序列和如由SEQ ID NO:1代表的轻链序列，或
b. 如由SEQ ID NO:12代表的重链序列和如由SEQ ID NO:11代表的轻链序列，或
c. 如由SEQ ID NO:22代表的重链序列和如由SEQ ID NO:21代表的轻链序列，或
d. 如由SEQ ID NO:32代表的重链序列和如由SEQ ID NO:31代表的轻链序列，或
e. 如由SEQ ID NO:42代表的重链序列和如由SEQ ID NO:41代表的轻链序列，或
f. 如由SEQ ID NO:52代表的重链序列和如由SEQ ID NO:51代表的轻链序列，或
g. 如由SEQ ID NO:62代表的重链序列和如由SEQ ID NO:61代表的轻链序列，或
h. 如由SEQ ID NO:72代表的重链序列和如由SEQ ID NO:71代表的轻链序列，或
i. 如由SEQ ID NO:82代表的重链序列和如由SEQ ID NO:81代表的轻链序列，或
j. 如由SEQ ID NO:92代表的重链序列和如由SEQ ID NO:91代表的轻链序列，或
k. 如由SEQ ID NO:102代表的重链序列和如由SEQ ID NO:101代表的轻链序列，或
l. 如由SEQ ID NO:112代表的重链序列和如由SEQ ID NO:111代表的轻链序列，或
m. 如由SEQ ID NO:213代表的重链序列和如由SEQ ID NO:1代表的轻链序列。
9. 根据前述实施方案中任一项的抗原结合片段，其为scFv、Fab、Fab'片段或F(ab')2片段。
10. 根据前述实施方案中任一项的抗体或抗原结合片段，其为单克隆抗体或其抗原结合片段。
11. 根据前述实施方案中任一项的抗体或抗原结合片段，其为人、人源化或嵌合抗体或其抗原结合片段。
12. 抗体-药物缀合物，其包含根据实施方案1至11的抗体或其抗原结合片段。
13. 分离的核酸序列，其编码根据实施方案1至11的抗体或抗原结合片段。
14. 载体，其包含根据实施方案13的核酸序列。
15. 分离的细胞，其表达根据实施方案1至11中任一项的抗体或抗原结合片段和/或包含根据实施方案13的核酸或实施方案14的载体。
16. 根据实施方案15的分离的细胞，其中所述细胞是原核或真核细胞。
17. 产生根据实施方案1至11中任一项的抗体或抗原结合片段的方法，其包括培养根据实施方案16的细胞和纯化所述抗体或抗原结合片段。
18. 根据实施方案1-11的抗体或抗原结合片段或根据实施方案12的抗体-药物缀合物，其作为药物使用。
19. 根据实施方案1-11中任一项的抗体或抗原结合片段，其作为诊断剂使用。
20. 根据实施方案1-11的抗体或抗原结合片段或根据实施方案12的抗体-药物缀合物，其用于癌症的治疗中。
21. 药物组合物，其包含根据实施方案1-11的抗体或抗原结合片段或根据实施方案12的抗体-药物缀合物。
22. 根据实施方案21的药物组合物和一种或多种治疗活性化合物的组合。
23. 用于治疗与TWEAKR的不期望存在相关的病症或病况的方法，其包括向有需要的对象施用有效量的根据实施方案21的药物组合物或根据实施方案22的组合。
通过以下实施例进一步描述本发明。通过参考具体实施方案，提供实施例仅用于说明本发明。这些例举，尽管说明本发明的某些具体方面，但并非描述所公开发明的限制方面或限定所公开发明的范围。
所有实施例使用本领域技术人员众所周知且常规的标准技术实施，除非另有详细描述。实施以下实施例的常规分子生物学技术，如描述于标准实验室手册，诸如Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989。
实施例 1 ：从 Dyax 抗体文库生成抗体
通过以人和鼠TWEAKR的二聚Fc-融合的细胞外结构域作为固定目标的蛋白淘选(Hoogenboom H.R., Nat Biotechnol 2005;23(3):1105-16)使用完全人抗体噬菌体展示文库(Hoet RM等人, Nat Biotechnol 2005;23(3):344-8)分离本发明的TWEAKR-特异性的人单克隆抗体。
表1：用于抗体选择的重组抗原的列表
。
所述抗原根据制造商的说明书使用近似2倍摩尔过量的生物素-LC-NHS (Pierce; 目录号21347)进行生物素化，且使用Zeba脱盐柱(Pierce;目录号89889)脱盐。将洗涤的磁珠(Dynabeads)与200 nM生物素化的人抗原在4℃孵育o/n，且在4℃用封闭缓冲液(含有3% BSA, 0.05%Tween-20的PBS)封闭1小时。将封闭的Fab-噬菌体文库添加至封闭的TWEAKR-珠 (Dynabeads streptavidin M280 - Invitrogen 112-06D)且在室温孵育30分钟。在严格洗涤(封闭缓冲液中3次且PBS中9次(150 mM NaCl; 8 mM Na2HPO4; 1.5 mM KH2PO4; 调节至pH = 7.4-7.6)，含有0.05% Tween-20)之后，将特异性结合至生物素化的TWEAKR珠(Dynabeads streptavidin M280 - Invitrogen 112-06D)的Fab噬菌体重悬浮于PBS中，且用于扩增，直接用于感染大肠杆菌菌株TG1。在第二轮选择中，鼠TWEAKR (200nM)用于选择交叉反应性结合剂，且在第三轮选择中，人TWEAKR的浓度下降(100nM)以增加对于高亲和力结合剂的选择压力。
鉴定11种不同的Fab-噬菌体，且将相应的抗体再克隆入哺乳动物IgG表达载体，其提供可溶性Fab中不存在的丢失CH2-CH3结构域。将所得IgG在哺乳动物细胞中瞬时表达，如描述于Micheal R. Dyson和Yves Durocher, Scion Publishing Ltd, 2007编辑的Methods Express:Expression Systems中的Tom等人，第12章。简而言之，将基于CMV-启动子的表达质粒转染入HEK293-6E，且在Fernbach –烧瓶或Wave-袋中孵育。表达在37℃在F17培养基(Invitrogen)中持续5至6天。转染后24小时补充1% Ultra-Low IgG FCS (Invitrogen)和0.5 mM丙戊酸(Sigma)。抗体通过蛋白A层析纯化，且通过ELISA和BIAcore分析中其与可溶性单体TWEAKR的结合亲和力进一步表征，如实施例2中所述。
表2：用于亲和力测量的重组抗原的列表
。
为了测定抗TWEAKR抗体的细胞结合特征，通过流式细胞术测试与细胞系的实验对象组(HT29、HS68、HS578)的结合。将细胞悬浮于抗体(5µg/ml)于FACS缓冲液中的稀释液中，且在冰上孵育1小时。随后，添加二抗(PE山羊抗人IgG，Dianova #109-115-098)。在冰上孵育1小时之后，使用FACS-阵列(BD Biosciences)通过流式细胞术分析细胞。
进行NF-κB报道基因测定以评估所有11种鉴定的抗体(人IgG1)的激动活性。根据制造商的说明书使用293fectin用NF-κB报道构建体(BioCat, 目录号LR-0051-PA)瞬时转染HEK293细胞。在37℃、5％CO2，用F17培养基(无血清; Invitrogen)中的转染的细胞接种白色聚赖氨酸包被的384孔板(BD)。第二天，细胞用不同浓度的纯化抗体刺激6小时，且随后遵循以下标准程序实施萤光素酶测定。
内化之后是抗TWEAKR抗体的荧光标记(CypHer 5E单NHS酯; GE Healthcare)。处理前，将HT29细胞(2 x 104/孔)接种于96-MTP板(大、黑色、透明底No 4308776, Applied Biosystems)中的100μl培养基中。在37℃/5% CO2孵育18小时之后，更换培养基(表No 21)，且以不同浓度(10、5、2.5、1、0.1 µg/ml)添加标记的抗TWEAKR抗体。所选的孵育时间是0、0.25、0.5、1、1.5、2、3、6和24小时。用InCell分析仪1000 (GE Healthcare)进行荧光测量。
选择具有最强的体外功效(TPP-883)的抗体用于进一步效力和亲和力成熟。
TPP-883的轻(SEQ ID NO.71)和重(SEQ ID NO.72)链的氨基酸序列；重链和轻链两者的CDR加下划线。
通过第一突变收集轮和随后的最大亲和力和效力增加的氨基酸改变的重组进行成熟。对于突变收集，通过使用合成的寡核苷酸的定点诱变(包括NNK密码子-多样化)生成在以下各个氨基酸位置的NNK (N = AGCT，K = G或T)随机化(连续氨基酸命名，比较图25)：CDR-L1中的S35、S36、Y37和N39；CDR-L2中的A51、S53、S54、Q56和S57；CDR-L3中的S92、Y93、S94、S95、G97和I98；CDR-H1中的P31、Y32、P33、M34和M35；CDR-H2中的Y50、S52、P53、S54、G56、K57和H59；CDR-H3中的G99、G100、D101、G102、Y103、F104、D105和Y106。将所有单一NNK饱和诱变文库的DNA分别再克隆于用于效力成熟的哺乳动物IgG表达载体和用于亲和力成熟的噬菌粒载体。通过噬菌体淘选进行亲和力成熟。将洗涤的磁珠(Dynabeads)与10 nM、1 nM、100 pM和10 pM生物素化的人抗原在4℃孵育o/n，且在4℃用封闭缓冲液(含有3% BSA, 0.05% Tween-20的PBS)封闭1小时。将封闭的Fab-噬菌体文库以与理论文库复杂度相比10000倍、1000倍和100倍过量添加至封闭的TWEAKR-Dynabeads且在室温孵育30分钟。因此，总共遵循12种策略(4种抗原浓度 x 3种Fab-噬菌体滴度)。在严格洗涤(封闭缓冲液中3次且PBS中9次，含有0.05% Tween-20)之后，将特异性结合至生物素化的TWEAKR-Dynabeads (Dynabeads streptavidin M280 - Invitrogen 112-06D)的Fab-噬菌体重悬浮于PBS中，且用于扩增，直接用于感染大肠杆菌菌株TG1。在第二轮选择中，人TWEAKR-Fc的浓度下降(1 nM、100 pM、10 pM和1 pM)，且相同的Fab-噬菌体滴度用于所有12种策略(4.4 x 1011)。对于可溶性Fab表达，噬菌粒载体用限制性核酸内切酶MluI消化以去除对于噬菌体上的Fab展示所需的geneIII膜锚定序列且再连接。12种选择合并物各自的96种变体表达为可溶性Fab，且在ELISA形式中测试。因此，包被2.5 nM生物素化的TWEAKR-Fc抗原，且通过抗c-Myc抗体(Abcam ab62928)检测可溶性Fab的结合。以与TWEAKR-Fc (Seq ID No 138)的改善结合检测7种单取代变体(连续氨基酸命名，比较图25)：CDR-L1的S36G，CDR-L2的A51Q和S57K，CDR-L3的S94T和G97F，CDR-H1的M35I和CDR-H3的G102T。对于效力成熟，用NF-κB报道分子(BioCat, 目录号LR-0051-PA)转染HEK293细胞。用F17培养基(无血清; Invitrogen)中的转染的细胞接种白色聚赖氨酸包被的384孔板(BD)，且在哺乳动物细胞中瞬时表达NNK多样化的位置抗体(人IgG1)文库的各变体。第二天，NF-κB报道细胞用表达的单NNK诱变抗体变体刺激6小时，且随后遵循以下标准程序实施萤光素酶测定。以改善的激动活性检测1种单取代变体：CDR-H3的G102T。该变体也获得自亲和力成熟，且其中还显示最大的亲和力增强。通过亲和力和效力筛选突变收集之后，在一个重组文库中重组(文库复杂度：128种变体)所有7种有利的单取代。为此，合成寡核苷酸以便在各所选位置引入所选的突变或相应野生型氨基酸。使用相继轮的重叠延伸PCR进行文库构建。将最终PCR产物连接入细菌可溶性Fab表达载体，且随机选择528种变体(~ 4倍过采样)，用于用如前所述的可溶性Fab的平衡ELISA筛选。最后，基于与最好的单取代变体G102T相比增强的亲和力选择7种变体。将这些的相应DNA再克隆于哺乳动物IgG表达载体中，且在上述提到的NF-κB报道细胞测定中测试功能活性。最后，将获得的序列与人种系序列进行比较，且调整没有对亲和力和效力的显著影响的偏差。通过抗体文库筛选和亲和力和/或效力成熟获得具有以下序列的抗体：
。
TPP-2090的轻(SEQ ID NO.1)和重(SEQ ID NO.2)链的氨基酸序列；重链和轻链两者的CDR加下划线。
TPP-2149的轻(SEQ ID NO.11)和重(SEQ ID NO.12)链的氨基酸序列；重链和轻链两者的CDR加下划线。
TPP-2093的轻(SEQ ID NO.21)和重(SEQ ID NO.22)链的氨基酸序列；重链和轻链两者的CDR加下划线。
TPP-2148的轻(SEQ ID NO.31)和重(SEQ ID NO.32)链的氨基酸序列；重链和轻链两者的CDR加下划线。
TPP-2084的轻(SEQ ID NO.41)和重(SEQ ID NO.42)链的氨基酸序列；重链和轻链两者的CDR加下划线。
TPP-2077的轻(SEQ ID NO.51)和重(SEQ ID NO.52)链的氨基酸序列；重链和轻链两者的CDR加下划线。
TPP-1538的轻(SEQ ID NO.61)和重(SEQ ID NO.62)链的氨基酸序列；重链和轻链两者的CDR加下划线。
TPP-1854的轻(SEQ ID NO.81)和重(SEQ ID NO.82)链的氨基酸序列；重链和轻链两者的CDR加下划线。
TPP-1853的轻(SEQ ID NO.91)和重(SEQ ID NO.92)链的氨基酸序列；重链和轻链两者的CDR加下划线。
TPP-1857的轻(SEQ ID NO.101)和重(SEQ ID NO.102)链的氨基酸序列；重链和轻链两者的CDR加下划线。
TPP-1858的轻(SEQ ID NO.111)和重(SEQ ID NO.112)链的氨基酸序列；重链和轻链两者的CDR加下划线。
实施例 2 ：抗体的生物化学特征
通过 Biacore 分析测定结合亲和力：
在Biacore T100仪器(GE Healthcare Biacore, Inc.)上通过表面等离振子共振分析，测定抗TWEAKR抗体的结合亲和力。通过间接俘获试剂抗人IgG(Fc)将抗体固定在CM5传感器芯片上。如制造商所述，使用来自“人抗体俘获试剂盒”(BR-1008-39, GE Healthcare Biacore, Inc.)的试剂。将抗TWEAKR抗体以10µg/ml的浓度以10µl/分钟注射10秒。
表3：用于亲和力测量的重组抗原(TWEAKR)的列表
。
表4：用于亲和力测量的抗体的列表
。
表5：用于亲和力测量的市售抗体的列表
。
将各种浓度(200 nM、100 nM、50 nM、25 nM、12.5 nM、6.25 nM、3.12 nM、1.56nM)的纯化的抗TWEAKR抗体以60 µl/min的流速持续3分钟针对固定的TWEAKR抗体注入HEPES-EP缓冲液(GE Healthcare Biacore, Inc.)中，且允许解离5分钟。在线内参考细胞校正、随后减去缓冲液样品之后，生成传感图。基于结合(kon)和解离速率(koff)常数(其通过将传感图与一级1:1结合模型拟合而获得)的比率，计算解离平衡常数(KD)。
表6：通过用TWEAKR蛋白(TPP-2305 (SEQ ID NO:168))的Biacore测量的抗TWEAKR抗体的单价KD值。
测定本发明的抗体以中等亲和力(KD 10-200 nM)结合TWEAKR，而用于比较的一些抗体(例如，PDL-192 (TPP-1104)、136.1 (TPP-2194)、18.3.3 (TPP-2193)、P4A8 (TPP-1324)、P3G5 (TPP-2195)、P2D3 (TPP-2196)、ITEM-1、ITEM-4)显示高亲和力结合(0.7-3.7 nM)。抗体PDL-192、136.1、18.3.3、P4A8、P3G5和P2D3的可变结构域的序列获得自专利WO2009/020933和WO2009/140177，且添加编码人IgG1和鼠IgG2的恒定区的序列，导致全长IgGs PDL-192 (TPP-1104)、136.1 (TPP-2194)、18.3.3 (TPP-2193)、P4A8 (TPP-1324)、P3G5 (TPP-2195)、P2D3 (TPP-2196)。该研究中对于其它先前描述的抗体测量的亲和力的范围与公开的数据完全符合：对于PDL-192，18.3.3和136.1，公开了5.5、0.2和0.7 nM的KD值(WO2009/020933)；对于P4A8，2.6 nM (WO2009/140177)。对于比较，天然配体TWEAK以0.8-2.4 nM的KD值结合TWEAKR (Immunity. 2001 Nov;15(5):837-46; Biochem J. 2006 Jul 15;397(2):297-304; Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2003 Apr 1;23(4):594-600)。
作为结果，本发明的抗体(TPP-883、TPP-1538、TPP-2077、TPP-2084、TPP-2148、TPP-2093、TPP-2149和TPP-2090)以中等亲和力(KD 10-200 nM)结合TWEAKR。
通过 Biacore 分析分析物种交叉反应性：
对于物种交叉反应性的分析，表达人、大鼠、小鼠、狗、猪和食蟹猴TWEAKR，且表达为人Fc片段融合蛋白，且使用胺偶联经由标准的EDC/NHS-介导的化学法(BR-1006-33, GE Healthcare Biacore, Inc.)固定至CM5传感器芯片上。
表7：用于分析物种间结合剂概况的ELISA中使用的重组蛋白的列表
。
将各种浓度(200 nM、100 nM、50 nM、25 nM、12.5 nM、6.25 nM、3.12 nM、1.56 nM)的抗TWEAKR抗体以60 µl/min的流速持续3分钟针对固定的TWEAKR物种注入HEPES-EP缓冲液(GE Healthcare Biacore, Inc.)中，且允许解离5分钟。在线内参考细胞校正、随后减去缓冲液样品之后，生成传感图。使用Biavaluation软件(4.0版)，基于结合(kon1)和解离速率(koff1)常数(其通过将传感图与二价分析物模型拟合而获得)的比率，计算解离平衡常数(KD)。抗TWEAKR抗体的物种交叉反应性已经以“抗体亲抗原性模式(avidity mode)”用固定的二价抗原进行测定，其不提供“绝对”KD值，但给出良好的比较数据。
表8：通过Biacore测量的抗TWEAKR抗体与不同物种的KD值(nM)
。
作为结果，本发明的抗体(TPP-1538、TPP-2077、TPP-2084和TPP-2090)显示与所有测试的物种(人、大鼠、小鼠、狗、猪和食蟹猴TWEAKR)的亲和力。
通过 TWEAKR 胞外域的 N- 和 C- 末端截短变体表征 TPP-2090 的结合表位：
不同物种的TWEAKR富含半胱氨酸的结构域(aa 34-68)的比对(图1)显示，其在所有6种分析的物种中是非常保守的。PDL-192依赖于R56结合(WO2009/020933：图2B)，且因此不结合至大鼠、猪和小鼠TWEAKR。TPP-2090依赖于保守的氨基酸D47结合，且因此结合至所有所述的物种。
在表征上述抗体的结合表位的第一种方法中，生成TWEAKR胞外域的N-和C-末端截短突变体，且测试其结合至不同的抗TWEAKR抗体的能力。N-末端的氨基酸28至33和C-末端的氨基酸69至80缺失，因此在Cys36-Cys49、Cys52-Cys67和Cys55-Cys64之间具有二硫键的富含半胱氨酸的结构域保持完好(比较图2)。分别地，表达两种构建体，包括N-和C-末端的完整胞外域28-80和截短的胞外域34-68，且纯化为Fc融合蛋白TPP-2202和TPP-2203。
为了分析结合，包被1 µg/ml的分别的二聚TWEAKR-Fc构建体，且0.3 µg/ml和0.08 µg/ml的生物素化的IgG用作可溶性结合伴侣。用链霉亲和素-HRP和Amplex-Red底物进行检测。IgG根据制造商的说明书使用近似2倍摩尔过量的生物素-LC-NHS(Pierce; 目录号21347)进行生物素化，且使用Zeba脱盐柱(Pierce;目录号89889)脱盐。在可溶性配体的所有应用的浓度，本发明的抗体显示与两种构建体的饱和结合，而抗体P4A8(TPP-1324)、P3G5(TPP-2195)和ITEM-4显示仅与全长胞外域的饱和结合和与N-和C-末端截短构建体的受损结合(图3和图4)。这表明，本发明的抗体的结合表位位于氨基酸34-68之间的富含半胱氨酸的结构域之内。为了分析TWEAKR胞外域的N-末端或C-末端对于P4A8(TPP-1324)和P3G5(TPP-2195)结合是否是需要的，生成具有氨基酸69至80的C-末端缺失的单体胞外域。P4A8(TPP-1324)和P3G5(TPP-2195)与C-末端截短的TWEAKR胞外域的结合也受损，而本发明的抗体显示饱和的结合(图5)。
表9：用于表位概况分析的ELISA分析中使用的重组抗原的列表
。
表10：用于表位概况分析的ELISA分析中使用的抗体的列表
。
因此，TPP-2090、TPP-2084、PDL-192(TPP-1104)和136.1(TPP-2194)的结合表位位于富含半胱氨酸的结构域之内，且P4A8(TPP-1324)和P3G5(TPP-2195)的结合表位位于富含半胱氨酸的结构域的至少部分外侧。
TWEAKR-Fc 突变蛋白对抗体亲和力的影响：
为了更详细定义本发明的抗体的结合特征，测试已提出对于结合已知激动性抗体相关的TWEAKR的某些突变蛋白(WO2009/140177)。因此，表达具有以下单一氨基酸取代的完整胞外域(氨基酸28-80)，且纯化为Fc融合蛋白：T33Q；S40R；W42A；M50A；R56P；H60K；L65Q。
表11：用于突变蛋白结合的ELISA分析中使用的重组蛋白的列表
。
为了收集剂量-应答数据，将不同的TWEAKR-Fc突变蛋白以低浓度(62 ng/ml)包被于384-孔Maxisorb ELISA板中，且生物素化的IgG的以100 nM的浓度开始的连续2倍稀释液用作可溶性结合伴侣。用链霉亲和素-HRP和Amplex Red进行检测。测试的IgG是本发明的TPP-2090和TPP-2084，来自WO2009/020933的PDL-192、136.1和18.3.3，来自WO2009/140177的P4A8和P3G5，和来自Nakayama等人[Biochem Biophys Res Com 306:819-825]的ITEM-1和ITEM-4。
表12：用于突变蛋白分析的ELISA分析中使用的抗体的列表
。
表13：用于突变蛋白分析的ELISA中使用的市售抗体的列表
。
IgG根据制造商的说明书使用近似2倍摩尔过量的生物素-LC-NHS(Pierce; 目录号21347)进行生物素化，且使用Zeba脱盐柱(Pierce;目录号89889)脱盐。拟合剂量-应答数据且测定IC50。为了显现结果，生成表格，“-”表明高于50 nM的IC50，“+”表明1至150 pM范围内的IC50。
表14：突变蛋白对抗体结合的影响
。
如先前公开，ITEM-4显示与H60K突变蛋白的受损结合[WO2009/140177：图23F]和PDL-192与R56P突变蛋白的受损结合[WO2009/020933：图22B]。与公开的数据相反，ITEM-1显示与R56P和针对W42A的所有抗体的受损结合[WO2009/140177：图23E，图23F]。该差异可以通过所选方法进行解释；极低包被浓度有利于辨别解离速率损害，因为其尽可能减少亲和力影响。由于分析的抗体无一显示与W42A突变蛋白的未受损的结合，所以该取代似乎引起结构变化，而不是结合表位的直接变化。
与ITEM-1、ITEM-4、PDL-192、136.1和18.3.3相反，本发明的抗体独立于除了W42A取代以外的所有取代结合。
富含半胱氨酸的结构域的丙氨酸扫描：
为了描绘本发明的抗体的结合位点，进行富含半胱氨酸的结构域(氨基酸34-68)的丙氨酸扫描。在图6中，可以显示TWEAKR的全长胞外域的N-和C-末端截短变体不损害本发明的抗体的结合。因此，结合表位位于富含半胱氨酸的结构域之内。在TWEAKR(34-68)-Fc构建体中构建以下取代：S37A、R38A、S40A、S41A、W42A、S43A、D45A、D47A、K48A、D51A、S54A、R56A、R58A、P59A、H60A、S61A、D62A、F63A和L65A。
表15：用于富含半胱氨酸的结构域的丙氨酸扫描的TWEAKR突变蛋白构建体的列表
。
在HEK293细胞中表达这些TWEAKR(34-68)-Fc突变蛋白。为了收集剂量-应答数据，将IgG以1 µg/ml的浓度包被于384-孔Maxisorp ELISA板中，且含有TWEAKR突变蛋白的上清液的连续2倍稀释液用作可溶性结合伴侣。用抗HIS-HRP和Amplex Red进行检测。测试的IgG是本发明的TPP-2090，来自WO2009/020933的PDL-192和来自WO2009/140177的P4A8。
表16：用于富含半胱氨酸的结构域的丙氨酸扫描的抗体的列表
。
为了评估各TWEAKR突变蛋白对于结合至不同的IgG的相关性，制备在特定突变蛋白浓度的关联印迹。示例性地，在图6中，用X轴上的PDL-192(TPP-1104)和Y轴上的TPP-2090显示TWEAKR表达培养液的8倍稀释的上清液的关联印迹。印迹显示，取代D47A损害TPP-2090的结合，且取代R56A损害PDL-192(TPP-1104)的结合。对于所有构建体，无法检测到与P4A8(TPP-1324)的结合，这与先前获得的结果一致(图6)。因此，P4A8表位至少部分位于富含半胱氨酸的结构域的外侧。鉴定的抗体相互作用对于某些TWEAKR氨基酸的相关性与已经对于这些抗体确定的激动活性相关。天然配体TWEAK显示TWEAKR的有效活化，且依赖于TWEAKR的富含半胱氨酸的结构域中的亮氨酸46结合(Pellegrini等人, FEBS 280:1818-1829)。P4A8显示非常低的激动活性，且至少部分与TWEAKR的富含半胱氨酸的结构域外侧的结构域相互作用。PDL-192显示中等的激动活性，且依赖于R56至富含半胱氨酸的结构域，但与TWEAK配体位点相对。TPP-2090和TWEAK分别依赖于D47和L46结合，因此结合至类似的结合位点(图7)。
为了支持本发明的所有抗体的共同表位的证据，测试进一步的抗体(即TPP-2090、TPP-2149、TPP-2093、TPP-2148、TPP-2084、TPP-2077、TPP-1538、TPP-883、TPP-1854、TPP-1853、TPP-1857、TPP-1858)。已经测试的所有抗体都特异性结合至TWEAKR的位置47的D (D47)(参见图6C)。再次，PDL-192(TPP-1104)仍然能够结合至TWEAKR的D47A突变蛋白。
总之，本发明的抗体(例如TPP-2090)依赖于D47结合至TWEAKR。
鉴定的抗体相互作用对于某些TWEAKR氨基酸的相关性与已经对于这些抗体确定的激动活性相关。天然配体TWEAK显示TWEAKR的有效活化，且依赖于TWEAKR的富含半胱氨酸的结构域中的亮氨酸46结合(Pellegrini等人, FEBS 280:1818-1829)。P4A8显示非常低的激动活性，且至少部分与TWEAKR的富含半胱氨酸的结构域外侧的结构域相互作用。PDL-192显示中等的激动活性，且依赖于R56至富含半胱氨酸的结构域，但与TWEAK配体位点相对。本发明的抗体(参见图6C)依赖于D47结合，且TWEAK依赖于L46结合，且结合至类似、但可区分的结合位点(图7)。因此，显示强烈的激动活性的本发明的抗体结合至与非常强的激动活性相关的抗体的新颖表位(D47依赖的)。有趣地，Michaelson等人(参见Michaelson JS等人, MAbs.2011 Jul-Aug;3(4):362-75中的第369页，左栏)给出了为什么他们检查的所有激动性抗体与天然配体TWEAK相比具有较弱的激动活性的解释。在他们的结论中，降低的功效可能与抗体与TWEAKR的二聚结合相互作用相关，其中TWEAK据推测参与三聚相互作用。因此，令人惊讶的发现是，本发明的抗体，但在与TWEAKR的二聚相互作用中具有甚至更高的激动活性。该令人惊讶的效果与本发明的抗体的特异性结合特性相关，因此与特异性结合至TWEAKR的D47相关。
通过表位竞争实验表征本发明的抗体：
为了理解本发明的抗体和其它已知的抗TWAEKR抗体的差异，进行竞争实验。已经通过Biacore T100仪器(GE Healthcare Biacore, Inc.)上的表面等离振子共振分析进行该几种抗TWEAKR抗体的重叠结合基序的研究。
表17：用于竞争实验的抗体的列表
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表18：用于竞争实验的市售抗体的列表
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表19：用于竞争实验的重组抗原的列表
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使用“胺偶联试剂盒”(BR-1006-33, GE Healthcare Biacore, Inc.)将所有抗体直接固定至CM5传感器芯片上。已经如制造商所述使用试剂。为了用抗原饱和一抗(固定的抗体)，以30 µl/min注射200 nM TWEAKR (TPP-2305)/HEPES-EP缓冲液(GE Healthcare Biacore, Inc.)持续120秒。随后，以30µl/min将200 nM二抗(“竞争抗体”)/HEPES-EP缓冲液注入流动室持续120秒。通常，在内嵌参考室校正且随后减去样品缓冲液之后生成传感图。已经通过使用Biavaluation软件(版本4.0)彻底人工检查传感图而生成定性竞争数据(图8)。注射二抗之后缺乏第二结合事件表明各抗体对内的明显竞争。非竞争抗体对显示二抗注射之后高于背景的明显结合信号。此外，自我竞争(一抗和二抗相同)被监测为内部系统对照。总体而言，九种对九种抗体的矩阵包括于该分析中。
通常，抗TWEAKR抗体可以成簇为三个不同的“竞争组”(图9)。一组专门含有TPP-2084和TPP-2090，两者均显示与所有其它测试的成员的竞争。这些其它成员可以分成两个独立的抗体集合，其不显示任何彼此之间的竞争。因此，与所有测试的抗TWEAKR抗体的“完全”竞争对于TPP-2084和TPP-2090是独特的。
这支持上述发现：两种测试的本发明的抗体都结合至新的和独特的表位。
本发明的抗体的选择性评估：
还测试本发明的抗体TPP-2090与TNF受体超家族的其它成员的结合，以评估其选择性。TNF受体超家族显示非常高的序列差异，如图10中所描绘。与TWEAKR最类似的是只有约30％序列同一性的TNFRSF13C和TNFRSF17。表位区域本身(富含半胱氨酸的结构域)在任何其它TNFRSF成员中不匹配(对于最佳命中，BLAST E-值= 0.7)。所有29种已知的TNF受体超家族成员的胞外域作为Fc融合蛋白购买(表20)，且在Maxisorp ELISA板中包被1 µg/ml。
为了收集剂量-应答数据，以2 µM的浓度开始的生物素化的IgG的连续3倍稀释液用作可溶性结合伴侣。用抗hIgG1-HRP和Amplex Red进行检测。测试的IgG是本发明的TPP-2090。如图11中所描绘，TPP-2090已经以300 pM的非常低的浓度饱和结合至TWEAKR，而也以75 nM的非常高的浓度，其不结合至所有其它28种TNF受体超家族成员。
因此，TPP-2090选择性结合至TWEAKR。
表20：用于选择性概况分析的ELISA中使用的重组蛋白的列表
。
实施例 3 ：抗 TWEAKR 抗体与癌细胞系的细胞表面的结合
为了测定抗TWEAKR抗体对小鼠和人癌细胞系的结合特征，通过流式细胞术测试与细胞系的实验对象组的结合。将贴壁细胞用不含Ca和Mg的PBS(Biochrom #L1825：含有8000mg/l NaCl、200mg/l KCl、1150mg/l Na2HPO4和200mg/l KH2PO4的水溶液)洗涤两次，且通过基于无酶的PBS的细胞脱离缓冲液(Invitrogen)脱壁。将细胞以近似105个细胞/孔悬浮于FACS缓冲液(无Ca/Mg、含有3％FCS的PBS，Biochrom)。将细胞离心(250g，5分钟，4℃)且弃去上清液。将细胞重悬浮于目的抗体(如果没有另外说明，于80µl中10µg/ml)于FACS缓冲液中的稀释液中，且在冰上孵育1小时。在下面，将细胞用100μl冷FACS缓冲液洗涤一次，且添加80µl以1:150稀释的二抗(PE山羊抗人IgG，Dianova #109-115-098，或PE山羊抗小鼠IgG，Jackson Immuno Research #115-115-164)。在冰上孵育1小时之后，将细胞用冷FACS缓冲液再次洗涤，重悬浮于100μl FACS缓冲液中，且使用FACS-测定(BD Biosciences)通过流式细胞术分析。将结果计算为目的抗体检测检测的荧光的几何平均值减去通过用单独的二抗检测测量的背景荧光。根据以下系统将值评分：
几何平均值 - 单独的二抗的几何平均值 >10：+，>100：++，>1000：+++，10000：++++，接近于()中的类别边界。表21中给出细胞系的来源。
如表21中所示，以10µg/ml的浓度使用的本发明的所有抗TWEAKR抗体结合代表多种肿瘤实体的范围广泛的表达鼠(4T1, Lewis Lung)和人(表中包括的所有其它细胞系)来源的TWEAKR的肿瘤细胞。
表21：通过FACS分析的评分的抗TWEAKR抗体(10µg/ml)与不同细胞系的结合：TPP-1538和TPP-2090结合至代表各种肿瘤适应症的鼠和人肿瘤细胞系的广泛实验对象组。
(几何平均值-单独的二抗的几何平均值>10：+，>100：++；>1000：+++，>10000：++++，接近于()中的类别边界)
*来自表21的癌细胞系的生长培养基的列表：
1. DMEM / Ham's F12；(Biochrom；# FG 4815，具有稳定的谷氨酰胺)，10% FCS
2. RPMI 1640；(Biochrom；# FG 1215，具有稳定的谷氨酰胺)，10% FCS
3. DMEM；(Biochrom；# FG 0435，具有稳定的谷氨酰胺)，10% FCS
4. MEM Earle's；(Biochrom；# FG 0325，具有稳定的谷氨酰胺)，10% FCS
5. DMEM；(Biochrom；# FG 0435，具有稳定的谷氨酰胺) L-丙氨酰-L-谷氨酰胺；(对于最终4mM额外2mM，Biochrom，# K 0302) 非必需氨基酸；(最终：1x，Biochrom；# K 0293)，10% FCS
6. DMEM；(Biochrom；# FG 0445，高葡萄糖，具有稳定的谷氨酰胺)，10% FCS
7. RPMI 1640；(Biochrom；# FG 1215，具有稳定的谷氨酰胺)，20% FCS
8. MEM Earle's；(Biochrom；# F 0315)，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺；(最终：2mM，Biochrom；# K 0302) 非必需氨基酸；(最终：1x，Biochrom； # K 0293)，10% FCS
9. DMEM / Ham's F12；(Biochrom；# FG 4815，具有稳定的谷氨酰胺)，马血清(最终：2.5%)；(Biochrom；# S 9135) 10% FCS
10. DMEM / Ham's F12；(Biochrom；# FG 4815，具有稳定的谷氨酰胺)，氢化可的松；(最终：40ng/mL，Biochrom；# K 3520)，10% FCS
11. McCoy's 5A；(Biochrom；# F 1015) L-丙氨酰-L-谷氨酰胺；(额外1.5mM，Biochrom；# K 0302)，10% FCS。
总体而言，必须指出的是，如通过FACS分析检测的本发明的抗体的最大细胞结合与其它已知的抗体相比是中等的。如表23和图12中所示，与10µg/ml(其中如通过FACS分析检测的抗体的细胞结合已经达到其平台的浓度)的其它已知的抗体(PDL-192(TPP-1104)、P4A8(TPP-1324))相比，如通过FACS分析检测的结合至不同细胞的抗体的量更低(数据未显示)。
表22：用于FACS分析的抗体的列表
。
表23：通过FACS分析的评分的不同的抗TWEAKR抗体10µg/ml与细胞系的实验对象组的结合。仅显示通过用特异性抗体检测测量的荧光的几何平均值减去用二抗测量的几何平均值。
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实施例 4 ：表达不同 TWEAKR 的细胞系中的胱天蛋白酶 3/7 活化的诱导
为了测定细胞凋亡诱导的水平，在用TWEAK或激动性抗TWEAKR抗体处理癌细胞之后测量胱天蛋白酶3/7活化。因此，将HT-29细胞以4000个细胞/75µl/孔的密度铺板于96孔板中的测定培养基(DMEM/Ham´sF12, Biochrom #FG4815 + 10% FCS + 100ng/ml IFNγ (R&D Systems #285-IF))中。24小时后，将细胞与如所示的各种浓度的针对TWEAKR的抗体(参见表24)、重组人TWEAK(R&D，#1090-TW-025/CF，大肠杆菌来源的重组可溶性人TWEAK，登录号Q4ACW9的Arg93-His249，Entrez基因编号8742，具有N-末端Met和6-His标签)或相应的同种型对照IgG孵育。与所述抗体孵育24小时之后，通过将100µl/孔胱天蛋白酶3/7溶液(Promega, #G8093)添加至细胞、孵育一小时且在VICTOR V (Perkin Elmer)上阅读发光来测定胱天蛋白酶3/7活性。
如表13和图25中所示，与本领域中描述的抗体(PDL-192(TPP-1104)、P4A8(TPP-1324)、136.1(TPP-2194))相比且还与300ng/ml重组人TWEAK(表25)相比，与本发明的抗体孵育导致胱天蛋白酶3/7的更强的最大诱导。因此，在诱导HT-29细胞中的胱天蛋白酶3/7方面，本文所述的抗体优于先前描述的抗体。
为了测定本发明的抗体的强功效是否在除了HT-29以外的其它细胞系中还有效，在细胞系的实验对象组中评估抗TWEAKR抗体与重组人TWEAK相比诱导胱天蛋白酶3/7的能力。对于该分析，使用以下条件：将WiDr细胞以3000个细胞/孔铺板且在TWEAK或所述抗体存在的情况下孵育48小时，将A253细胞以2500个细胞/孔铺板且孵育24小时，将NCI-H322细胞以5000个细胞/孔铺板且孵育48小时，且将786-O细胞以2500个细胞/孔铺板且孵育48小时。如表21中所述，将细胞铺板于培养基中，对于A253、NCI-H322和786-O细胞，添加100ng/ml IFNγ(R&D Systems #285-IF)。铺板之后24小时，添加100µg/ml的抗体或300ng/ml的TWEAK(对于NCI-H322细胞，100ng/ml TWEAK)，且将细胞进一步孵育上示时间段。在孵育时间结束时，如对于HT-29细胞所述测定胱天蛋白酶3/7活性。计算与未处理的细胞相比的胱天蛋白酶3/7的诱导倍数。
如表25中所示，所有测试的本发明的抗体显示与其它已知的抗体相比HT-29细胞中的增加的胱天蛋白酶3/7诱导，且与300ng/ml TWEAK配体相比达到更强的活性。该诱导癌细胞的细胞凋亡的强功效(如通过胱天蛋白酶3/7活化所测量)也见于WiDr、A253、NCI-H322和786-O细胞中，其中测试的本发明的抗体在大多数实验中诱导与其它抗体和300ng/ml TWEAK相比更高的倍数变化。
表24：用于胱天蛋白酶诱导测定的抗体的列表
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表25：与100µg/ml抗TWEAKR抗体或重组人TWEAK (300ng/ml或*100ng/ml)孵育之后在不同癌细胞中的胱天蛋白酶3/7的诱导倍数。显示来自以一式三份进行的1-3次代表性实验的结果，包括标准偏差。测试的本发明的抗体显示与已知抗体或重组TWEAK相比在不同的细胞类型中的胱天蛋白酶3/7的增强的诱导。
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实施例 5 ：癌细胞系中激动性抗 TWEAKR 抗体对增殖的抑制
为了研究本发明的抗体诱导胱天蛋白酶3/7的功效是否也受不同癌细胞系的增殖的有效抑制影响，在与本发明的抗体孵育之后，测量与参考抗体或TWEAK配体相比的抗增殖活性。
因此，将细胞以以下细胞数铺板于96孔板中的75μl测定培养基中(来自表21的培养基，对于786-O细胞，加上100ng/ml IFNγ)：WiDr细胞，3000个细胞/孔；786-O细胞；2500个细胞/孔。24小时后，将细胞与所示浓度(0.03-300µg/ml的抗体，TWEAK 100或300ng/ml)的抗TWEAKR抗体(参见表26)、重组人TWEAK或同种型对照IgG(未显示)孵育。在添加抗体时，在姐妹板中测定细胞活力(时间点零)：因此，将75μl/孔CTG溶液(Promega Cell Titer Glo溶液(目录号G755B和G756B)添加至细胞，孵育10分钟，且在Victor V (Perkin Elmer)上阅读发光。与药剂孵育之后96小时，通过添加100µl/孔CTG溶液、孵育10分钟和读取发光而在测定板中测定细胞活力。通过从未处理的对照孔中的发光值减去时间零值而计算对照孔中的增殖。计算化合物处理的孔中与未处理的对照孔相比的％细胞增殖。
代表处理的细胞中与对照细胞相比的细胞增殖的所得剂量应答曲线显示于图14A (WiDr细胞)和图14B (786-O细胞)。所有测试的本发明的抗体使WiDr细胞的增殖抑制50-60％且使786-O细胞的增殖抑制70-80％，这显著多于其它已知的抗体(例如，PDL-192(TPP-1104)和P4A8(TPP-1324))达到的增殖抑制。因此，本发明的抗体是迄今描述的最有效的抗增殖抗TWEAKR抗体。
为了评估在更广泛的细胞实验对象组中是否也可以观察到这种强抗增殖活性，此外，将LOVO、NCI-H1975、SW-480 (均3000个细胞/孔)、HT-29 (4000个细胞/孔)、A253和SK-OV3 (两者均2500个细胞/孔)细胞与100µg/ml抗TWEAKR抗体或TWEAK配体孵育如表27中所示的时间段。将所有细胞接种于表21中所示的生长培养基，且对于除了WiDr细胞以外的所有细胞，当接种细胞时，将100ng/ml IFNγ添加至测定培养基。如上所述测量和计算处理的细胞的生长抑制与未处理的对照细胞中的增殖相比的百分比。
如表27中所示，在以100µg/ml抑制各种癌细胞系的增殖中，本发明的抗体与其它已知的抗体相比更有效。在大多数实验中，本发明的抗体也显示与100-300ng/ml TWEAK配体相比相等或更强的功效。因此，本发明中描述的抗体在它们诱导癌细胞系的广泛实验对象组中的细胞凋亡和增殖抑制的活性中是独特的。
表26：用于增殖测定的抗体的列表
。
表27：与100µg/ml抗TWEAKR抗体或TWEAK配体(*100ng/ml, **300ng/ml)孵育之后诱导的增殖的%抑制。在药剂存在的情况下的孵育时间表明为以[h]计的测定​​时间。显示来自以一式三份进行的1-3次代表性实验的结果。本发明的抗体显示与已知抗体(PDL-192(TPP-1104)，P4A8(TPP-1324))相比癌细胞增殖的更强抑制以及与重组TWEAK相比相当或更强的活性。
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实施例 6 ：来自癌细胞和异种移植肿瘤的由抗 TWEAKR 抗体诱导的细胞因子分泌
接下来，感兴趣的是研究在从癌细胞诱导细胞因子分泌中是否也看到本发明的抗体的强激动活性。
因此，将A375细胞以2500个细胞/孔铺板于96孔板中的生长培养基DMEM(Biochrom；# FG 0435，具有稳定的谷氨酰胺)，10％FCS中。24小时后，将细胞与所示各种浓度的抗TWEAKR抗体、重组人TWEAK或相应的同种型对照IgG孵育。开始与所述抗体孵育后24小时，将细胞上清液或其稀释物添加至人CXCL8/IL-8 ELISA试剂盒(R&D Systems DY208)的捕获ELISA板，且在4℃通过振摇300rpm孵育过夜。第二天，根据制造商的说明书使用人CXCL8/IL-8-ELISA试剂盒(R&D Systems DY208)分析样品。在450 nm (Tecan Spectra, Rainbow)连同背景校正测量光密度。为了计算IL-8的绝对水平，根据制造商的推荐(R&D Systems)应用使用重组人IL-8蛋白的标准曲线。
如图15中所示，本发明的抗体显示与先前已知的其它抗体相比增加的IL-8释放的诱导。在100µg/ml，本发明的抗体TPP-1538/-1854/-2084/-2090与300ng/ml TWEAK配体相比分别达到134/129/113/103%的活化。相反，用于比较的抗体PDL-192(TPP-1104)/P4A8(TPP-1324)/136.1(TPP-2194)分别仅达到66/29/93%。因此，本发明的抗体显示与先前已知的抗体和300ng/ml TWEAK配体相比关于IL-8分泌的诱导的最强活性。
为了研究观察到的细胞因子分泌是否也在小鼠中的异种移植肿瘤中是相关的，研究来自携带肿瘤(A375, WiDr)以及无肿瘤的小鼠的血清/血浆中的人和鼠细胞因子。将5x106个A375细胞/基质胶/PBS (1:1)或5x106个WiDr细胞/基质胶/培养基(1:1)皮下接种于免疫缺陷的雌性NMRI裸鼠中。平行于携带A375的小鼠，研究非肿瘤小鼠。用确立的约40mm2的肿瘤接种后7天开始治疗。通过将TPP-1538 (10 mg/kg)或TPP-2090 (3 mg/kg)(两者均稀释于PBS中)单次静脉内注入尾静脉而治疗小鼠。然后在给定时间点(对于携带A375的小鼠，0小时、6小时、24小时，且对于携带WiDr的小鼠，0小时、7小时、24小时、72小时、168小时、240小时)将小鼠处死以收获血清/血浆样品。断头之后收集血液，且通过30分钟凝血和随后以1000xg离心制备血清。
使用Luminex®珠免疫测定定量细胞因子。用包含IL-1â、IL-1RA、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12 (p40)、IL-13、IL-15、IL-17、TNF-á、IFN-á、IFN-ã、GM-CSF、MIP-1á、MIP-1â、IP-10、MIG、嗜酸细胞活化趋化因子、RANTES和MCP-1)的人细胞因子磁性25-重实验对象组(Invitrogen®，目录号LHC0009M)测定人细胞因子。用包含FGF碱性、GM-CSF、IFN-ã、IL-1á、IL-1â、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、IL-12 (p40/p70)、IL-17、IP-10、KC、MCP-1、MIG、MIP-1á、TNF-á和VEGF)的小鼠细胞因子磁性20-重实验对象组(Invitrogen®，目录号LHC0006M)测定鼠细胞因子。根据制造商的说明书进行测定，且通过Luminex阅读器Bio-Plex 200 (Bio-Rad GmbH)测量。通过操作软件Bio-Plex Manger (Bio-Rad GmbH)，从标准曲线内插细胞因子浓度，作为测定程序的部分。
如图16A中所示，通过以时间依赖的方式用TPP-2090 3mg/kg单次治疗，从WiDr异种移植物释放人IL-8。此外，用TPP-2090治疗之后观察到人MCP-1、IP-10和IL-15的分泌的诱导(未显示)。
为了进一步研究用本发明的激动性抗TWEAKR抗体治疗之后携带肿瘤的小鼠的血浆中观察到的细胞因子诱导是否确实是肿瘤特异性的，在携带A375肿瘤和无肿瘤小鼠中实施类似的研究，且测量人以及鼠细胞因子。
如图16B中所示，在用10 mg/kg的TPP-1538治疗之后6小时，从携带肿瘤的小鼠中的A375异种移植物释放人IL-8。此外，观察到增加的人MCP-1、IP-10和IL-1RA的水平(未显示)。相反，在处理的无肿瘤小鼠的血浆中，没有检测到增加的人细胞因子分泌(图16B且未显示)。此外，用TPP-1538治疗之后，在携带肿瘤和无肿瘤小鼠的血浆中，都检测到包括鼠IL-8类似物KC的鼠细胞因子的增加(数据未显示)。总之，本发明的抗体以肿瘤特异性方式有力地诱导从癌细胞和体内异种移植物的细胞因子的分泌。
实施例 7 ：抗 TWEAKR 抗体的内化和药物缀合物方法的可用性
为了研究本发明的抗TWEAKR抗体是否可能可用于生成抗体药物缀合物(ADC)，研究所述抗体的内化能力。
为了显现该过程，选择TWEAKR特异性抗体TPP-1538和TPP-2090和同型对照抗体。在两倍摩尔过量的CypHer 5E单NHS酯(批次357392, GE Healthcare)(pH 8.3)存在的情况下缀合抗体。缀合之后，将反应混合物在4℃透析(slide-A-Lyser Dialysis Cassettes MWCD 10kD, Fa.Pierce)过夜，以消除过量染料且调节pH值。其后，浓缩蛋白溶液(VIVASPIN 500, Fa Sartorius Stedim Biotec)。除了pH依赖的荧光染料CypHer5E以外，使用ph-非依赖性的染料Alexa 488。用分光光度计(Fa. NanoDrop)测定抗体的染料负载。TPP-1538、TPP-2090和同种型对照抗体的染料负载在类似的范围内。在细胞结合测定中测试标记的抗体的亲和力以确保标记不改变结合至TWEAKR。以下内化测定中使用这些标记的抗体。处理前，将细胞(2x104/孔)接种于96-MTP(脂肪、黑色、透明底No 4308776, Fa.Applied Biosystems)中的100μl培养基中。在37℃/5%CO2孵育18小时之后，更换培养基，且以各种浓度(10、5、2.5、1、0.3、0.1µg/ml)添加标记的抗-TWEAKR抗体TPP-1538和TPP-2090。用同种型对照抗体(阴性对照)实施相同的处理。孵育时间选择为0、0.5小时、1小时、2小时、3小时、6小时和24小时。用InCellAnalyzer 1000 (Fa.GE Healthcare)进行荧光测量。以动态方式测量每个细胞的颗粒计数和总荧光强度。
在表达内源TWEAKR的癌细胞系786-O(肾癌)和HT-29(结肠癌)中观察到TPP-1538和TPP-2090的高度特异性和显著的内化。
该内化是目标特异性的，因为仅可使用抗TWEAKR抗体表明摄取，而用同种型对照抗体没有观察到内化。在前6小时，抗TWEAKR抗体显示与同种型对照相比抗体内化的20-40倍增加。同种型对照抗体显示在长暴露(>24小时)之后的轻微内化。
结合后用Alexa 488标记的抗TWEAKR抗体的内化揭示，多于50%的内化的抗体看起来遵循胞吞途径。
在图17中，显示TPP-1538和TPP-2090结合至表达内源TWEAKR的细胞后的特异性内化的时间进程的评估。对肾癌细胞系786-O研究抗体(1 µg/ml)的内化。以动态方式测量每个细胞的颗粒计数。对于TPP-1538和TPP-2090可以观察到快速内化，而同种型对照hIgG1没有内化。此外，用TPP-2090看到显著改善的内化功效。可以在使用具有不同的受体水平的各种癌细胞进行的内化测定中验证TPP-2090的更高功效(未显示)。
此外，在Hum-Zap测定中评估抗TWEAKR抗体当在肥皂草毒蛋白-缀合的二抗存在的情况下孵育时抑制细胞的增殖的活性。因此，将786-O细胞以2500个细胞/75µl/孔铺板于96孔板中的生长培养基(DMEM/Ham´sF12, Biochrom #FG4815 + 10% FCS)中。24小时后，将40nM抗体(TPP-1538、TPP-2090或同种型对照抗体)在40nM肥皂草毒蛋白-缀合的二抗(Hum Zap, Advanced Targeting Systems 目录号IT-22, 批次59-83)存在或不存在的情况下在室温孵育15分钟。孵育时间之后，将25µl反应混合物添加至细胞，导致样品孔中的10nM抗体的最终浓度。在添加抗体时，在姐妹板中测定细胞活力(时间点零)。因此，将75μl/孔CTG溶液(Promega Cell Titer Glo溶液(目录号G755B和G756B)添加至细胞，孵育10分钟，且在Victor V (Perkin Elmer)上阅读发光。
开始与抗体/Zap复合物孵育之后48小时，将100 µL/孔CTG溶液添加至所有测试的孔，孵育10分钟且在VICTOR V上读取发光。
如图18中所示，在肥皂草毒蛋白-缀合的二抗存在的情况下将786-O细胞与10nM的抗TWEAKR抗体孵育几乎完全抑制细胞增殖，而在相同的实验条件下(不存在IFNγ，仅48小时孵育时间)，在肥皂草毒蛋白-缀合的二抗不存在的情况下或用同种型对照抗体没有观察到抗增殖活性。
总之，本发明的抗TWEAKR抗体显示缀合的有效载荷的快速内化和靶向递送，且因此非常适合于生成和用作ADC。
实施例 8 ：抗 TWEAKR 抗体在异种移植物模型中的体内抗肿瘤功效
为了研究抗TWEAKR抗体是否显示体内抗肿瘤活性，测试源自不同的癌细胞系的异种移植肿瘤或患者来源的肿瘤模型针对单一或组合疗法中激动性抗TWEAKR抗体的肿瘤生长抑制的敏感性。
开始体内实验之前，通过免疫组织化学评估所选异种移植模型中TWEAKR的表达。因此，相应异种移植物的冷冻切片(5 µM)在4℃用丙酮固定5分钟，且针对非特异性蛋白结合和过氧化物酶活性进行封闭。将组织切片与兔抗TWEAKR抗体(Fn14, Epitomics, 3488-1)在室温孵育60分钟，随后与过氧化物酶标记的抗兔聚合物(DAKO, K4011)孵育30分钟。切片用二氨基联苯胺显色，且最后用苏木精复染。仅对于TWEAKR的表达阳性的模型用于体内实验。
为了研究抗TWEAKR抗体的体内抗肿瘤活性，通过重复静脉内注射治疗携带来自不同人肿瘤细胞系的异种移植物或患者来源的肿瘤的裸鼠。
如上述部分中所述培养肿瘤细胞系，且将含有特定数目的肿瘤细胞的细胞系的100 µl皮下(s.c.)接种于雌性无胸腺裸鼠(NMRI nu/nu，6-8周，20-25g，Taconic)。小鼠在标准化无病原体条件下圈养，且根据动物福利指南治疗。
肿瘤生长至近似40mm2的大小之后，将小鼠随机化为对照组和治疗组，其中分别组大小为n=8-10。通过以每周两次时间表静脉内注射(i.v.)入尾静脉而用稀释于PBS中的各种剂量的抗TWEAKR抗体治疗小鼠(q4dx3：每周应用两次，总共应用三次；q4dx8：每周应用两次，总共应用八次)。将组合治疗伴侣诸如瑞格非尼 (每天10mg/kg，每os)和PI3K抑制剂1(10mg/kg，BID，2天应用，5天不应用(连续两天每天应用两次，随后不治疗五天)，i.v.)稀释于其各自的制剂中，而将护理治疗标准品伊立替康(5mg/kg，4天应用，3天不应用(连续四天每天应用一次，随后不治疗三天)，i.v.)和紫杉醇(16mg/kg，q7dx4(每周应用一次，总共四次应用)，i.v.)稀释于0.9% NaCl中。用PBS注射的动物充当对照(媒介物)组。化合物的应用体积为每只小鼠5ml/kg体重。
通过卡尺测量(以mm计的长度 x宽度)以及体重(以g计)每周2-3次监测肿瘤生长。在研究结束时，切出肿瘤，称重且用于计算肿瘤与对照(T/C)比率(治疗动物的平均肿瘤重量除以对照/媒介物动物的平均肿瘤重量)。
在人肾细胞癌模型786-O (阳性TWEAKR表达)中，在三种不同的低剂量测试抗TWEAKR抗体TPP-2084和TPP-2090针对同种型对照抗体的功效。将2x106个肿瘤细胞/100％基质胶s.c.接种于雌性裸鼠中。7天后，建立的大小为约40 mm2的肿瘤用0.3 mg/kg、1 mg/kg和3 mg/kg抗体进行治疗(i.v.，q4dx3：每周应用两次，总共三次应用)。在第40天，切出之后肿瘤重量的比较显示TPP-2084和TPP-2090的剂量依赖性功效，这在3 mg/kg最高(图19)。可以表明针对同种型和媒介物(用PBS治疗)的明显差异。在任何组中都没有观察到体重损失。表28中列出的肿瘤与对照比率表明在786-O模型和在进一步肿瘤模型(A375、A253、SK-OV-3、Bx-PC3，用3-10 mg/kg抗TWEAKR抗体TPP-1538、TPP-2094或TPP-2090以q7dx3 (每周应用一次，总共三次应用)或q4dx3 (每周应用两次，总共三次应用)时间表进行治疗)中的良好功效，除了MDA-MB-231，其中达到单一治疗功效可能需要抗TWEAKR抗体的更强烈的给药方案。
表28：用TPP-1538、TPP-2084或TPP-2090处理之后的786-O和进一步肿瘤模型中的最终肿瘤与对照(T/C)比率。抗TWEAKR抗体显示在来自不同实体瘤适应症的多种异种移植模型中的强抗肿瘤活性。
T/C: 基于切出后的最终肿瘤重量或基于肿瘤面积的测量的肿瘤与对照比率(*)。
图20显示抗TWEAKR抗体TPP-2090在单一治疗和与伊立替康和瑞格非尼的组合治疗中的人结肠癌异种移植WiDr (其代表HT-29肿瘤细胞系的亚克隆)中的功效。将5x106个WiDr细胞/基质胶/培养基(1:1)s.c.接种于免疫缺陷的NMRI裸鼠中。用确立的约40mm2的肿瘤接种后7天开始治疗。甚至单一治疗中的3mg/kg TPP-2090(i.v.，q4dx7：每周应用两次，总共七次应用)强烈有效地控制肿瘤生长。3mg/kg TPP-2090与伊立替康(5mg/kg，i.v.，4天应用，3天不应用)或瑞格非尼(10mg/kg，p.o.，每天)的组合导致累加功效，同时肿瘤消退。所有治疗方案都被小鼠良好耐受(最大4％初始和可逆的体重减轻)。最终T/C值列于表29中。
还在其它结肠直肠肿瘤模型诸如SW480和源自患者的肿瘤模型Co5682中研究TPP-2090，具有类似的良好结果(表29)。10mg/kg剂量的TPP-2090在SW480中的单一治疗中有效控制肿瘤生长(T/C 0.49)，且在与5mg/kg伊立替康(T/C 0.22)或10mg/kg瑞格非尼(T/C 0.37)的组合中导致肿瘤消退。在Co5682异种移植物中，3mg/kg TPP-2090与伊立替康组合显示对于肿瘤消退的协同功效(T/C 0.23)，且与瑞格非尼组合显示对于肿瘤停滞的协同功效(T/C 0.27)。
表29：基于研究结束时的肿瘤重量，用TPP-2090和组合伴侣治疗之后两种结肠癌细胞系WiDr和SW480和一种源自患者的结肠癌异种移植物Co5682的最终肿瘤与对照(T/C)比率。
T/C：基于切出后的最终肿瘤重量的肿瘤与对照比率，Tx：治疗，combo：组合治疗。
图21显示抗TWEAKR抗体TPP-2090在单一治疗和与紫杉醇的组合治疗中的人非小细胞肺癌异种移植物NCI-H322中的功效。将5x106个NCI-H322细胞/基质胶s.c.接种于免疫缺陷的NMRI裸鼠中。用确立的约45mm2的肿瘤接种后14天开始治疗。在5mg/kg的剂量，TPP-2090 (i.v.，q4dx8)在单一治疗中是强烈有效的，表明肿瘤消退。10mg/kg TPP-2090与紫杉醇(16mg/kg，i.v.，q7dx4)的组合导致轻微的累加功效。所有治疗方案都被小鼠良好耐受(最大3%可逆的体重减轻)。最终T/C值列于表30中。
再次，还在其它肺癌模型诸如NCI-H1975和源自患者的肿瘤模型Lu7343和Lu7433中研究TPP-2090，具有相当结果(表30)。3mg/kg剂量的TPP-2090显示与16mg/kg紫杉醇组合在NCI-H1975中的累加效应，导致肿瘤消退(T/C 0.08)。类似地，在源自患者的NSCLC模型Lu7343和Lu7433中，3mg/kg TPP-2090与10mg/kg PI3K-抑制剂1的组合导致累加有效方式的肿瘤控制或消退(T/C 0.18-0.36)。
PI3K-抑制剂1是(2-氨基-N-[7-甲氧基-8-(3-吗啉-4-基丙氧基)-2,3-二氢咪唑并[1,2-c]喹唑啉-5-基]嘧啶-5-甲酰胺二盐酸盐。
表30：基于研究结束时的肿瘤重量，用TPP-2090和组合伴侣治疗之后两种NSCLC细胞系NCI-H322和–H1975和两种源自患者的肺癌异种移植物Lu7343和Lu7433的最终肿瘤与对照(T/C)比率。
T/C：基于切出后的最终肿瘤重量的肿瘤与对照比率，Tx：治疗，combo：组合治疗。
所有描述的体内实施例表明抗TWEAKR抗体TPP-2090在单一治疗中以及组合治疗中的源自细胞系和源自患者的人肿瘤模型(所有都具有TWEAKR阳性表达)的广泛实验对象组中的强烈功效。TPP-2090在所有使用的剂量都被小鼠良好耐受。
实施例 9 ：抗 TWEAKR 抗体在异种移植物模型中的作用模式
为了研究抗TWEAKR抗体的体内作用模式，如实施例8中所述在研究结束时从WiDr异种移植物取肿瘤，且通过免疫组织化学和Western印迹分析研究。
将WiDr异种移植物(来自每组3个个体动物的肿瘤)的冰冻切片(5 µm)针对增殖标志物蛋白Ki67进行免疫组织化学染色(对于体内实验的细节，参见实施例8)。将切片在4℃用新鲜制备的4％多聚甲醛固定20分钟，且针对非特异性蛋白结合和过氧化物酶活性进行封闭。鼠抗Ki67抗体(DAKO, M7240)根据制造商的说明书(DAKO, K3954)用生物素标记，且在室温与组织切片孵育60分钟，随后ExtraVidin-过氧化物酶(DAKO, K3468)孵育30分钟。切片用二氨基联苯胺显色，且最后用苏木精复染。为了定量，使用ARIOL自动化显微镜版本3.2 (Applied Imaging, San Jose CA, USA)扫描和分析整个肿瘤切片。针对Ki67染色的PBS (i.v., q4dx7)和TPP-2090 (10mg/kg, i.v., q4dx7)治疗的异种移植物的代表性图像分别显示于图22A和B中。使用ARIOL图像系统定量，揭示用10 mg/kg TPP-2090 (i.v. q4dx7)治疗的组中的355+/-59个Ki67阳性细胞/mm2，和媒介物治疗组中的863 +/-90个Ki67阳性细胞/ mm2。因此，与观察到的肿瘤体积减少一致，用激动性抗TWEAKR抗体治疗导致异种移植肿瘤中增殖标志物Ki67的减少。
此外，在研究结束时快速冷冻的WiDr异种移植肿瘤(对于体内实验的细节，参见实施例8)，通过Western印迹分析，以评估所述抗体对Stat-1和NF-κB信号传导途径的影响。将每组4个个体动物的肿瘤切于约5mm直径的载片中，且每个载片连同预冷的5mm钢头(steel bull)和500µl裂解缓冲液(50mM Hepes pH 7.2, 150mM NaCl, 1mM MgCl2, 10mM Na4P2O7, 100mM NaF, 10%甘油, 1.5% Triton X-100, 新鲜添加的完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche No. 1873580001), 4mM Na3VO4, pH用NaOH调节至7.4))沉积于2ml Eppendorf管中。将样品在Tissuelyzer (Qiagen)中以300Hz裂解3分钟，随后在冰上孵育30分钟。在下面，将样品在4℃在Micro-离心机(Eppendorf)中以13000 rpm离心10分钟，且将来自一个原始肿瘤的上清液合并回一起。通过使用BCA蛋白测定试剂盒(Novagen，裂解物1:50稀释于H2O中)测定肿瘤裂解物中的蛋白水平。将样品稀释至4mg/ml的最终浓度，且将10µl样品与3.08 µl (10*)样品还原剂、10µl H2O和7,68µl (4*) NuPAGE样品缓冲液(Invitrogen)混合。将对应于40μg蛋白的样品应用于来自Invitrogen的NuPage 4-12% SDS page凝胶且在120V运行2小时45分钟。根据制造商的推荐通过iBlot洗脱(Invitrogen)实施印迹。将膜在室温在PBST中的5% BLOT QuickBlocker (Invitrogen)中封闭2小时，随后在4℃与一抗孵育过夜。一抗为如下：Phospho-Stat1 #9167S，Stat-1 #9172，两者均来自Cell Signaling Technology，1:1000稀释于3% BLOT QuickBlocker/PBST；TWEAKR/Fn14 #3488-1 Epitomics，1:10000稀释于3% BLOT QuickBlocker/PBST；NF-κB2 p100/p52 #4882S，Cell Signaling Technology，1:1000稀释于3% BLOT QuickBlocker/PBST。第二天，将膜在PBST中洗涤三次，随后在室温与二抗(过氧化物酶-缀合的驴抗兔IgG # NA934，GE Healthcare，1:10000稀释于3% BLOT QuickBlocker/PBST)孵育2小时。随后，将膜用PBST洗涤四次，持续10分钟，且在与ECL试剂孵育之后通过化学发光检测信号。为了检测上样对照，将膜在室温在振摇的情况下用剥离溶液Re-Blot Plus强溶液#2504, Milipore (1:10稀释于Milipore-H2O中)剥离15分钟，随后封闭且用抗GAPDH抗体(克隆6C5, # MAB374, Millipore，1:10000稀释于3% QuickBlocker/PBST中)和二抗(过氧化物酶-缀合的山羊抗小鼠IgG，Jackson Immunoresearch #115-035-003，1:10000稀释于3% BLOT Quickblocker/PBST中)进行检测。
用TPP-2090 3mg/kg治疗的每组2个动物的肿瘤与并排的来自媒介物治疗的动物的肿瘤的代表性印迹显示于图23。用TPP-2090治疗导致总和磷酸化的Stat-1水平的强烈增加以及NF-κB2的强烈活化，如p52片段的出现所示。因此，NF-κB2以及Stat-1途径在异种移植肿瘤中由激动性抗TWEAKR抗体活化，且该活化可能参与相应抗体的抗肿瘤活性。
表31：抗体的蛋白序列：
。
表32：本发明的抗体的DNA序列：
。
实施例 10 ：抗 TWEAKR 抗体 TPP-2090 在进一步人结肠直肠癌模型中的体内抗肿瘤功效
对于进一步人结肠直肠癌肿瘤细胞系Colo205和LoVo和对于进一步人结肠直肠癌患者来源的模型Co7553、Co5896、Co5676、Co5841、CXF 1103和CXF 533，如实施例8中所述进行动物研究。标准给药时间表是10 mg/kg TPP-2090，每周两次，持续4周，在单一治疗中或与瑞格非尼或护理标准品(SoCs)伊立替康(5-15 mg/kg i.p.，4天应用，3天不应用)、奥沙利铂(3-8 mg/kg i.p.，每周两次)、5-氟尿嘧啶(50-100 mg/kg i.p.，每周一次)和西妥昔单抗(15 mg/kg i.p.，每周两次)组合。将TPP-2090和西妥昔单抗配制于PBS中，PBS也被用作对照组中的媒介物，且将SoC配制于0.9% NaCl中。瑞格非尼的制剂描述于实施例8中。
TPP-2090在这些人结肠直肠癌患者来源和基于细胞系的模型中的单一疗效是中度的，其中最终肿瘤与对照(T/C)比率在0.48-1.07的范围内。TPP-2090与SoC(特别是5-FU和伊立替康)的组合导致显著的累加和协同效应(参见表33-35)。在TPP-2090在这些模型中的单一疗效受限的情况下，达到更高的单一疗效可能需要抗TWEAKR抗体的更强烈的给药时间表，如实施例8中对于结肠直肠癌已显示。
表33：在单一治疗或与伊立替康和奥沙利铂的组合中用TPP-2090治疗的结肠直肠癌模型的最终肿瘤与对照(T/C)比率。
T/C:基于解剖后的最终肿瘤重量或基于肿瘤面积的测量的肿瘤与对照比率(*)
n.d.：未测定。
表34：在与5-FU和瑞格非尼的组合中用TPP-2090治疗的结肠直肠癌模型的最终肿瘤与对照(T/C)比率。
T/C:基于解剖后的最终肿瘤重量或基于肿瘤面积的测量的肿瘤与对照比率(*)。
n.d.：未测定。
表35：在与西妥昔单抗的组合中用TPP-2090治疗的结肠直肠癌模型的肿瘤与对照(T/C)比率。
T/C:基于解剖后的最终肿瘤重量或基于肿瘤面积的测量的肿瘤与对照比率(*)。
n.d.：未测定。
实施例 11 ：抗 TWEAKR 抗体 TPP-2090 在人膀胱癌模型中的体内抗肿瘤功效
对于人膀胱癌细胞系SCaBER和KU-19-19和对于人膀胱癌患者来源的模型BXF1352和BXF1228，如实施例8中所述进行动物研究。标准给药时间表是10 mg/kg TPP-2090，每周两次，持续4周，在单一治疗中或与护理标准品(SoCs)吉西他滨(200 mg/kg i.p.，每周一次)和顺铂(3 mg/kg i.p.，每周一次)组合。将TPP-2090配制于PBS中，PBS也被用作对照组中的媒介物，且将护理标准品(SoCs)配制于0.9% NaCl中。
在SCaBER异种移植模型中发现TPP-2090的强单一疗效。在人膀胱癌患者来源的膀胱癌模型BXF1352和BXF1228中的TPP-2090与SoCs(顺铂和吉西他滨)的组合导致显著的协同效应(参见表36)。)。在TPP-2090在这些膀胱癌模型中的单一疗效受限的情况下，达到更高的单一疗效可能需要抗TWEAKR抗体的更强烈的给药时间表。
表36：在单一治疗或与顺铂或吉西他滨的组合中用TPP-2090治疗的人膀胱癌模型的肿瘤与对照(T/C)比率。
T/C：基于最终肿瘤重量的肿瘤与对照比率
n.d.：未测定。
实施例 12 ：抗 TWEAKR 抗体 TPP-2090 在进一步人癌症模型中的体内抗肿瘤功效
对于不同适应症的进一步人癌细胞系，如实施例8中所述进行动物研究。标准给药时间表为单一治疗中的10 mg/kg TPP-2090，每周两次，持续2-3周。将TPP-2090配制于PBS中，PBS也被用作对照组中的媒介物。
在SCC4 (头颈癌)和A375(黑色素瘤)异种移植物中发现TPP-2090的强单一疗效，且在BxPC3(胰腺癌)异种移植物中发现中等功效(参见表37)。在TPP-2090在某些异种移植模型中的单一疗效受限的情况下(ACHN (肾细胞癌)、PA-1 (卵巢癌)、NCI-292 (非小细胞肺癌)和U87MG (胶质母细胞瘤))，可能需要抗TWEAKR抗体的更密集的给药时间表以达到更高的单一疗效。
表37：在单一治疗中的用TPP-2090治疗的进一步人癌模型的肿瘤与对照(T/C)比率
T/C：基于解剖后的最终肿瘤重量或基于肿瘤面积的测量的肿瘤与对照比率(*)。
实施例 13 ：抗 TWEAKR 抗体在异种移植物模型中的进一步作用模式
为了评估TPP-2090的抗肿瘤功效是否依赖于抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或单独的激动活性是否已经足够，进行SCID米黄色小鼠(Janvier)中的异种移植物研究，且在NMRI裸鼠中研究TPP-2090的无糖基化变体，即TPP-2658。
在SCID米黄色小鼠中的WiDr(人结肠直肠癌)和SCaBER(人膀胱癌)异种移植物中，如实施例8中所述进行动物研究，其中对照组的肿瘤生长与先前研究的NMRI裸鼠中的肿瘤生长相当。标准给药时间表为单一治疗中的10 mg/kg TPP-2090，i.v. (配制于PBS中)，每周两次，持续2周。
发现TPP-2090在缺乏NK细胞的SCID小鼠米黄色异种移植模型(WiDr和SCaBER)中的类似的强单一疗效，如NMRI裸鼠中所见。这表明不依赖于ADCC的体内作用模式(参见表38)。
表38：在单一治疗中用TPP-2090治疗的SCID米黄色小鼠中的WiDr和SCaBER肿瘤的肿瘤与对照(T/C)比率(NMRI小鼠用于比较)
T/C：基于解剖后的最终肿瘤重量或基于肿瘤面积的测量的肿瘤与对照比率(*)。
体外分析显示，TPP-2090的HT29细胞结合导致NK92V效应细胞对目标细胞的剂量依赖的ADCC，而无糖基化的TPP-2658不能诱导ADCC(表40)。分配1x104个HT-29目标细胞，且以25 µg/ml；5 µg/ml；1 µg/ml；0,2 µg/ml和0,04 µg/ml的最终浓度添加测试的抗体。30分钟的预孵育时间之后，添加效应细胞(5x104个NK92V效应细胞)。在37℃孵育4小时之后，用“细胞毒性检测试剂盒 - LDH (Roche)”测定HT29细胞裂解，从溶解于1% Triton X-100中的细胞获得最大释放，阴性对照不与抗体预孵育。下式用于计算% HT29裂解：[Ext (样品) – Ext (阴性) x 100] / [Ext (最大释放) - Ext (阴性)]。TPP-2090导致NK92V效应细胞对目标细胞的剂量依赖性的ADCC，且依赖于N297糖基化。
而当在WiDr-或A375-异种移植模型中使用TPP-2090的无糖基化变体(即TPP-2658)时，在体内发现类似的效应(参见表39)。变体TPP-2658在两种模型中显示与TPP-2090同样强的单一疗效，表明ADCC-依赖的作用模式。
表39：用TPP-2658治疗的WiDr和A375-异种移植物的肿瘤与对照(T/C)比率(TPP-2090用于比较)
T/C：基于切出后的最终肿瘤重量的肿瘤与对照比率。
表40：用HT-29目标细胞和NK92V效应细胞的体外ADCC测定用于测试抗体TPP-2090 (hIgG1)和TPP-2658 (TPP-2090 – hIgG1 N297A的无糖基化对应物)：
。

Claims (22)

1.分离的抗TWEAKR抗体或其抗原结合片段，其特异性结合至如SEQ ID NO:169所示的TWEAKR的位置47的D (D47)。
2.根据权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是激动性抗体。
3.根据权利要求1或2的抗体或其抗原结合片段，其包含：
可变重链，其包含
(a) 由包含式PYPMX (SEQ ID NO:171)的氨基酸序列编码的重链CDR1，其中X是I或M；
(b) 由包含式YISPSGGXTHYADSVKG (SEQ ID NO:172)的氨基酸序列编码的重链CDR2，其中X是S或K；和
(c) 由包含式GGDTYFDYFDY (SEQ ID NO:173)的氨基酸序列编码的重链CDR3；
和可变轻链，其包含：
(a) 由包含式RASQSISXYLN (SEQ ID NO:174)的氨基酸序列编码的轻链CDR1，其中X是G或S；
(b) 由包含式XASSLQS (SEQ ID NO:175)的氨基酸序列编码的轻链CDR2，其中X是Q、A或N；和
(c) 由包含式QQSYXXPXIT (SEQ ID NO:176)的氨基酸序列编码的轻链CDR3，其中位置5的X是T或S，且位置6的X是T或S，且位置8的X是G 或F。
4.根据前述权利要求中任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含：
a. 可变重链，其包含如由SEQ ID NO:6代表的可变重链CDR1序列、如由SEQ ID NO:7代表的可变重链CDR2序列和如由SEQ ID NO:8代表的可变重链CDR3序列，和
可变轻链，其包含如由SEQ ID NO:3代表的可变轻链CDR1序列、如由SEQ ID NO:4代表的可变轻链CDR2序列和如由SEQ ID NO:5代表的可变轻链CDR3序列，或
b. 可变重链，其包含如由SEQ ID NO:16代表的可变重链CDR1序列、如由SEQ ID NO:17代表的可变重链CDR2序列和如由SEQ ID NO:18代表的可变重链CDR3序列，和
可变轻链，其包含如由SEQ ID NO:13代表的可变轻链CDR1序列、如由SEQ ID NO:14代表的可变轻链CDR2序列和如由SEQ ID NO:15代表的可变轻链CDR3序列，或
c. 可变重链，其包含如由SEQ ID NO:26代表的可变重链CDR1序列、如由SEQ ID NO:27代表的可变重链CDR2序列和如由SEQ ID NO:28代表的可变重链CDR3序列，和
可变轻链，其包含如由SEQ ID NO:23代表的可变轻链CDR1序列、如由SEQ ID NO:24代表的可变轻链CDR2序列和如由SEQ ID NO:25代表的可变轻链CDR3序列，或
d. 可变重链，其包含如由SEQ ID NO:36代表的可变重链CDR1序列、如由SEQ ID NO:37代表的可变重链CDR2序列和如由SEQ ID NO:38代表的可变重链CDR3序列，和
可变轻链，其包含如由SEQ ID NO:33代表的可变轻链CDR1序列、如由SEQ ID NO:34代表的可变轻链CDR2序列和如由SEQ ID NO:35代表的可变轻链CDR3序列，或
e. 可变重链，其包含如由SEQ ID NO:46代表的可变重链CDR1序列、如由SEQ ID NO:47代表的可变重链CDR2序列和如由SEQ ID NO:48代表的可变重链CDR3序列，和
可变轻链，其包含如由SEQ ID NO:43代表的可变轻链CDR1序列、如由SEQ ID NO:44代表的可变轻链CDR2序列和如由SEQ ID NO:45代表的可变轻链CDR3序列，或
f. 可变重链，其包含如由SEQ ID NO:56代表的可变重链CDR1序列、如由SEQ ID NO:57代表的可变重链CDR2序列和如由SEQ ID NO:58代表的可变重链CDR3序列，和
可变轻链，其包含如由SEQ ID NO:53代表的可变轻链CDR1序列、如由SEQ ID NO:54代表的可变轻链CDR2序列和如由SEQ ID NO:55代表的可变轻链CDR3序列，或
g. 可变重链，其包含如由SEQ ID NO:66代表的可变重链CDR1序列、如由SEQ ID NO:67代表的可变重链CDR2序列和如由SEQ ID NO:68代表的可变重链CDR3序列，和
可变轻链，其包含如由SEQ ID NO:63代表的可变轻链CDR1序列、如由SEQ ID NO:64代表的可变轻链CDR2序列和如由SEQ ID NO:65代表的可变轻链CDR3序列，或
h. 可变重链，其包含如由SEQ ID NO:76代表的可变重链CDR1序列、如由SEQ ID NO:77代表的可变重链CDR2序列和如由SEQ ID NO:78代表的可变重链CDR3序列，和
可变轻链，其包含如由SEQ ID NO:73代表的可变轻链CDR1序列、如由SEQ ID NO:74代表的可变轻链CDR2序列和如由SEQ ID NO:75代表的可变轻链CDR3序列，或
i. 可变重链，其包含如由SEQ ID NO:86代表的可变重链CDR1序列、如由SEQ ID NO:87代表的可变重链CDR2序列和如由SEQ ID NO:88代表的可变重链CDR3序列，和
可变轻链，其包含如由SEQ ID NO:83代表的可变轻链CDR1序列、如由SEQ ID NO:84代表的可变轻链CDR2序列和如由SEQ ID NO:85代表的可变轻链CDR3序列，或
j. 可变重链，其包含如由SEQ ID NO:96代表的可变重链CDR1序列、如由SEQ ID NO:97代表的可变重链CDR2序列和如由SEQ ID NO:98代表的可变重链CDR3序列，和
可变轻链，其包含如由SEQ ID NO:93代表的可变轻链CDR1序列、如由SEQ ID NO:94代表的可变轻链CDR2序列和如由SEQ ID NO:95代表的可变轻链CDR3序列，或
k. 可变重链，其包含如由SEQ ID NO:106代表的可变重链CDR1序列、如由SEQ ID NO:107代表的可变重链CDR2序列和如由SEQ ID NO:108代表的可变重链CDR3序列，和
可变轻链，其包含如由SEQ ID NO:103代表的可变轻链CDR1序列、如由SEQ ID NO:104代表的可变轻链CDR2序列和如由SEQ ID NO:105代表的可变轻链CDR3序列，或
l. 可变重链，其包含如由SEQ ID NO:116代表的可变重链CDR1序列、如由SEQ ID NO:117代表的可变重链CDR2序列和如由SEQ ID NO:118代表的可变重链CDR3序列，和
可变轻链，其包含如由SEQ ID NO:113代表的可变轻链CDR1序列、如由SEQ ID NO:114代表的可变轻链CDR2序列和如由SEQ ID NO:115代表的可变轻链CDR3序列。
5.根据前述权利要求中任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含：
a. 如由SEQ ID NO:10代表的可变重链序列和如由SEQ ID NO:9代表的可变轻链序列，或
b. 如由SEQ ID NO:20代表的可变重链序列和如由SEQ ID NO:19代表的可变轻链序列，或
c. 如由SEQ ID NO:30代表的可变重链序列和如由SEQ ID NO:29代表的可变轻链序列，或
d. 如由SEQ ID NO:40代表的可变重链序列和如由SEQ ID NO:39代表的可变轻链序列，或
e. 如由SEQ ID NO:50代表的可变重链序列和如由SEQ ID NO:49代表的可变轻链序列，或
f. 如由SEQ ID NO:60代表的可变重链序列和如由SEQ ID NO:59代表的可变轻链序列，或
g. 如由SEQ ID NO:70代表的可变重链序列和如由SEQ ID NO:69代表的可变轻链序列，或
h. 如由SEQ ID NO:80代表的可变重链序列和如由SEQ ID NO:79代表的可变轻链序列，或
i. 如由SEQ ID NO:90代表的可变重链序列和如由SEQ ID NO:89代表的可变轻链序列，或
j. 如由SEQ ID NO:100代表的可变重链序列和如由SEQ ID NO:99代表的可变轻链序列，或
k. 如由SEQ ID NO:110代表的可变重链序列和如由SEQ ID NO:109代表的可变轻链序列，或
l. 如由SEQ ID NO:120代表的可变重链序列和如由SEQ ID NO:119代表的可变轻链序列。
6.根据前述权利要求中任一项的抗体，其为IgG抗体。
7.根据前述权利要求中任一项的抗体，其包含：
a. 如由SEQ ID NO:2代表的重链序列和如由SEQ ID NO:1代表的轻链序列，或
b. 如由SEQ ID NO:12代表的重链序列和如由SEQ ID NO:11代表的轻链序列，或
c. 如由SEQ ID NO:22代表的重链序列和如由SEQ ID NO:21代表的轻链序列，或
d. 如由SEQ ID NO:32代表的重链序列和如由SEQ ID NO:31代表的轻链序列，或
e. 如由SEQ ID NO:42代表的重链序列和如由SEQ ID NO:41代表的轻链序列，或
f. 如由SEQ ID NO:52代表的重链序列和如由SEQ ID NO:51代表的轻链序列，或
g. 如由SEQ ID NO:62代表的重链序列和如由SEQ ID NO:61代表的轻链序列，或
h. 如由SEQ ID NO:72代表的重链序列和如由SEQ ID NO:71代表的轻链序列，或
i. 如由SEQ ID NO:82代表的重链序列和如由SEQ ID NO:81代表的轻链序列，或
j. 如由SEQ ID NO:92代表的重链序列和如由SEQ ID NO:91代表的轻链序列，或
k. 如由SEQ ID NO:102代表的重链序列和如由SEQ ID NO:101代表的轻链序列，或
l. 如由SEQ ID NO:112代表的重链序列和如由SEQ ID NO:111代表的轻链序列。
8.根据前述权利要求中任一项的抗原结合片段，其为scFv、Fab、Fab'片段或F(ab')2片段。
9.根据前述权利要求中任一项的抗体或抗原结合片段，其为单克隆抗体或其抗原结合片段。
10.根据前述权利要求中任一项的抗体或抗原结合片段，其为人、人源化或嵌合抗体或抗原结合片段。
11.抗体-药物缀合物，其包含根据权利要求1至10的抗体或其抗原结合片段。
12.分离的核酸序列，其编码根据权利要求1至10的抗体或抗原结合片段。
13.载体，其包含根据权利要求12的核酸序列。
14.分离的细胞，其表达根据权利要求1至10中任一项的抗体或抗原结合片段和/或包含根据权利要求12的核酸或根据权利要求13的载体。
15.根据权利要求14的分离的细胞，其中所述细胞是原核或真核细胞。
16.产生根据权利要求1至10中任一项的抗体或抗原结合片段的方法，其包括培养根据权利要求15的细胞和纯化所述抗体或抗原结合片段。
17.根据权利要求1-10的抗体或抗原结合片段或根据权利要求11的抗体-药物缀合物，其作为药物使用。
18.根据权利要求1-10中任一项的抗体或抗原结合片段，其作为诊断剂使用。
19.根据权利要求1-10的抗体或抗原结合片段或根据权利要求11的抗体-药物缀合物，其作为药物用于癌症的治疗中。
20.药物组合物，其包含根据权利要求1-10的抗体或抗原结合片段或根据权利要求11的抗体-药物缀合物。
21.根据权利要求20的药物组合物和一种或多种治疗活性化合物的组合。
22.用于治疗与TWEAKR的不期望存在相关的病症或病况的方法，其包括向有需要的对象施用有效量的根据权利要求20的药物组合物或根据权利要求21的组合。
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