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JP5532486B2 - Ｅｇｆ受容体を標的とするモノクローナル抗体１７５ならびにその誘導体および用途 - Google Patents

Ｅｇｆ受容体を標的とするモノクローナル抗体１７５ならびにその誘導体および用途 Download PDF

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Description

本発明は、ＥＧＦ受容体、特に、増幅された又は過剰発現された上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）およびＥＧＦＲのｄｅ２−７ ＥＧＦＲトランケート化体に結合する抗体、特に抗体１７５およびそのフラグメントに関する。これらの抗体は癌の診断および治療において有用である。本発明の抗体は、化学療法剤もしくは抗癌剤および／または他の抗体もしくはそのフラグメントと組合せて、療法において使用されうる。
増殖性疾患、特に癌の、化学療法手段による治療は、しばしば、ヒトまたは動物の身体における標的増殖性細胞と他の正常細胞との間の相違を利用することに基づいている。例えば、多数の化学物質は、ＤＮＡ複製および細胞分裂の過程が妨げられるよう、迅速に複製しているＤＮＡにより取り込まれるよう設計される。もう１つのアプローチは、発生したヒト組織において通常は発現されない腫瘍細胞または他の異常細胞の表面上の抗原、例えば腫瘍抗原または胚性抗原を特定することである。そのような抗原は、該抗原を遮断または中和しうる抗体のような結合性タンパク質を使用して標的化されうる。また、抗体およびそのフラグメントを含む該結合性タンパク質は、腫瘍部位において毒性物質を直接的または間接的に活性化しうる毒性物質または他の物質を運搬しうる。
ＥＧＦＲは多数の型の上皮腫瘍において過剰発現されるので腫瘍標的化抗体療法に対する魅力的な標的である。（Ｖｏｌｄｂｏｒｇ，Ｂ．Ｒ．ら（１９９７）Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ ８：１１９７−２０６；ｄｅｎ Ｅｙｎｄｅ，Ｂ．およびＳｃｏｔｔ，Ａ．Ｍ．（１９９８）Ｔｕｍｏｒ Ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｉｎ：Ｐ．Ｊ．ＤｅｌｖｅｓおよびＩ．Ｍ．Ｒｏｉｔｔ（編），Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｐ．２４２４−３１．Ｌｏｎｄｏｎ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）。さらに、ＥＧＦＲの発現は、胃、結腸、膀胱、乳房、前立腺、子宮内膜、腎臓および脳（例えば、神経膠腫）を含む多数の腫瘍型における予後不良に関連している。したがって、いくつかの実施中の臨床評価で、多数のＥＧＦＲ抗体が文献報告されている（Ｂａｓｅｌｇａ，Ｊ．ら，（２０００）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．１８：９０４；Ｆａｉｌｌｏｔ，Ｔ．ら，（１９９６）Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ ３９：４７８−８３；Ｓｅｙｍｏｕｒ，Ｌ．（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｖ ２５：３０１−１２）。頭部および頸部癌、扁平上皮肺癌、脳神経膠腫ならびに悪性星状細胞腫を有する患者においてＥＧＦＲ ｍＡｂを使用した研究からの結果は励みになるものであった。ほとんどのＥＧＦＲ抗体の抗腫瘍活性は、リガンド結合をそれらが遮断しうることにより増強される（Ｓｔｕｒｇｉｓ，Ｅ．Ｍ．ら，（１９９４）Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ Ｓｕｒｇ １１１：６３３−４３；Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｎ．Ｉ．ら，（１９９５）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １：１３１１−８）。そのような抗体は、細胞増殖のモジュレーションおよび抗体依存性免疫機能（例えば、補体活性化）の両方によりそれらの効力をもたらしうる。しかし、これらの抗体の使用は、ＥＧＦＲの高い内因性レベルを有する器官、例えば肝臓および皮膚における取り込みにより制限されうる（Ｂａｓｅｌｇａ，Ｊ．ら，（２０００）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．１８：９０４；Ｆａｉｌｌｏｔ，Ｔ．ら，（１９９６）Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ ３９：４７８−８３）。
ＥＧＦＲ遺伝子のアンプリコン（すなわち、ＥＧＦＲ遺伝子の複数のコピー）を含有する腫瘍のかなりの割合は、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲ、ΔＥＧＦＲまたはΔ２−７（これらの用語は本明細書においては互換的に用いられる）（Ｏｌａｐａｄｅ−Ｏｌａｏｐａ，Ｅ．Ｏ．ら，（２０００）Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８２：１８６−９４）として公知の該受容体のトランケート化体（Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ，Ｃ．Ｊ．ら，（１９９８）Ｊ Ｎｅｕｒｏｖｉｒｏｌ ４：１４８−５８）をも共発現する。ｄｅ２−７ ＥＧＦＲにおいて見られる再構成は、エキソン２−７伸長する８０１ヌクレオチドを欠くインフレーム成熟ｍＲＮＡを与える（Ｗｏｎｇ，Ａ．Ｊ．ら，（１９９２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：２９６５−９；Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｈ．ら，（１９９０）Ｊｐｎ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ８１：７７３−９；Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｈ．ら，（１９９８） Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ８：１８１６−２０；Ｓｕｇａｗａ，Ｎ．，ら（１９９０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７：８６０２−６）。対応ＥＧＦＲタンパク質は細胞外ドメインの残基６−２７３を含む２６７アミノ酸の欠失および融合連結部における新たなグリシン残基を有する（Ｓｕｇａｗａ，Ｎ．ら，（１９９０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７：８６０２−６）。この欠失は、グリシン残基の挿入と一緒になって、欠失境界に、特有の連結ペプチドを与える。ｄｅ２−７ ＥＧＦＲは、神経膠腫、乳房、肺、卵巣および前立腺を含む多数の腫瘍型において報告されている（Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ，Ｃ．Ｊ．ら，（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：４１３０−４０；Ｏｌａｐａｄｅ−Ｏｌａｏｐａ，Ｅ．Ｏ．ら，（２０００）Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８２：１８６−９４；Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ，Ｃ．Ｊ．ら，（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５：３１４０−８；Ｇａｒｃｉａ ｄｅ Ｐａｌａｚｚｏ，Ｉ．Ｅ．ら，（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５３：３２１７−２０）。このトランケート化受容体はリガンドに結合しないが、それは低い構成的活性を有し、ヌードマウスにおいて腫瘍異種移植片として増殖する神経膠腫細胞に対して有意な増殖上の利点をもたらし（Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｒ．ら，（１９９４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１：７７２７−３１，１９９４）、ＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＭＣＦ−７細胞を形質転換しうる（Ｂａｔｒａ，Ｓ．Ｋ．ら，（１９９５）Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ ６：１２５１−９）。神経膠腫細胞においてｄｅ２−７ ＥＧＦＲにより利用される細胞メカニズムは完全には明らかにされていないが、アポトーシスの軽減および増殖の若干の増強を含むことが報告されている（Ｎａｇａｎｅ，Ｍ．ら，（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５６：５０７９−８６）。
このトランケート化受容体の発現は腫瘍細胞に限定されるため、それは抗体療法のための高度に特異的な標的に相当する。したがって、多数の研究所は、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲの特有のペプチドに特異的なポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方の作製を報告している（Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ，Ｃ．Ｊ．ら，（１９９８）Ｊ Ｎｅｕｒｏｖｉｒｏｌ ４：１４８−５８；Ｈｕｍｐｈｒｅｙ，Ｐ．Ａ．ら，（１９９０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７：４２０７−１１；Ｏｋａｍｏｔｏ， Ｓ．ら，（１９９６）Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ７３：１３６６−７２；Ｈｉｌｌｓ，Ｄ．ら，（１９９５）Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ６３：５３７−４３）。特有のｄｅ２−７ペプチドでの免疫化の後に単離された一連のマウスｍＡｂは全て、該トランケート化受容体に対する選択性および特異性を示し、ヌードマウスにおいて成長したｄｅ２−７ ＥＧＦＲ陽性異種移植片を標的化した（Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ，Ｃ．Ｊ．ら，（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５：３１４０−８；Ｒｅｉｓｔ，Ｃ．Ｊ．ら，（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５７：１５１０−５；Ｒｅｉｓｔ，Ｃ．Ｊ．ら，（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５：４３７５−８２）。
しかし、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲ抗体の、１つの潜在的欠点は、ＥＧＦＲ遺伝子の増幅を示す腫瘍の一部だけがｄｅ２−７ ＥＧＦＲをも発現することである。そのために、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲ特異的抗体はＥＧＦＲ陽性腫瘍の一部のみにおいて有用であると予想されるであろう。それ故に、ＥＧＦＲ抗体の活性の現存する証拠は励みになるものではあるが、前記で示した適用可能性および効力の範囲に対する認められる制限は相変わらずである。したがって、広範な腫瘍で効力を示す抗体および同様の物質を得ることが望ましく、本発明が向けられているのは、その目的の達成である。また、正常組織を、および増幅、過剰発現または突然変異の非存在下のＥＧＦＲを標的化しない抗体が特に有用であろう。１つのそのような抗体であるモノクローナル抗体ｍＡｂ８０６がＷＯ０２０９２７７１およびＷＯ０５０８１８５４に既に記載されている。追加的なそのような抗体が必要とされており、望ましいであろう。
本明細書における参考文献の引用は、それが本発明の先行技術であると自認するものと解釈されるものではない。
国際公開第０２／０９２７７１号 国際公開第０５／０８１８５４号
Ｖｏｌｄｂｏｒｇ，Ｂ．Ｒ．ら（１９９７）Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ ８：１１９７−２０６ ｄｅｎ Ｅｙｎｄｅ，Ｂ．およびＳｃｏｔｔ，Ａ．Ｍ．（１９９８）Ｔｕｍｏｒ Ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｉｎ：Ｐ．Ｊ．ＤｅｌｖｅｓおよびＩ．Ｍ．Ｒｏｉｔｔ（編），Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｐ．２４２４−３１．Ｌｏｎｄｏｎ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｂａｓｅｌｇａ，Ｊ．ら，（２０００）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．１８：９０４ Ｆａｉｌｌｏｔ，Ｔ．ら，（１９９６）Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ ３９：４７８−８３ Ｓｅｙｍｏｕｒ，Ｌ．（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｖ ２５：３０１−１２ Ｓｔｕｒｇｉｓ，Ｅ．Ｍ．ら，（１９９４）Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ Ｓｕｒｇ １１１：６３３−４３ Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｎ．Ｉ．ら，（１９９５）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １：１３１１−８ Ｏｌａｐａｄｅ−Ｏｌａｏｐａ，Ｅ．Ｏ．ら，（２０００）Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８２：１８６−９４ Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ，Ｃ．Ｊ．ら，（１９９８）Ｊ Ｎｅｕｒｏｖｉｒｏｌ ４：１４８−５８ Ｗｏｎｇ，Ａ．Ｊ．ら，（１９９２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：２９６５−９ Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｈ．ら，（１９９０）Ｊｐｎ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ８１：７７３−９ Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｈ．ら，（１９９８） Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ８：１８１６−２０ Ｓｕｇａｗａ，Ｎ．ら，（１９９０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７：８６０２−６ Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ，Ｃ．Ｊ．ら，（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：４１３０−４０ Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ，Ｃ．Ｊ．ら，（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５：３１４０−８ Ｇａｒｃｉａ ｄｅ Ｐａｌａｚｚｏ，Ｉ．Ｅ．ら，（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５３：３２１７−２０ Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｒ．ら，（１９９４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１：７７２７−３１，１９９４ Ｂａｔｒａ，Ｓ．Ｋ．ら，（１９９５）Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ ６：１２５１−９ Ｎａｇａｎｅ，Ｍ．ら，（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５６：５０７９−８６ Ｈｕｍｐｈｒｅｙ，Ｐ．Ａ．ら，（１９９０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７：４２０７−１１ Ｏｋａｍｏｔｏ， Ｓ．ら，（１９９６）Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ７３：１３６６−７２ Ｈｉｌｌｓ，Ｄ．ら，（１９９５）Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ６３：５３７−４３ Ｒｅｉｓｔ，Ｃ．Ｊ．ら，（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５７：１５１０−５ Ｒｅｉｓｔ，Ｃ．Ｊ．ら，（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５：４３７５−８２
発明の概括
本発明の抗体である抗体１７５およびそのフラグメントまたはそれに由来する単量体、組換え体もしくはハイブリッド抗体は、腫瘍形成性、過剰増殖性または異常細胞において見出され正常または野生型細胞においては検出不可能なＥＧＦＲエピトープを認識する。本発明の抗体は、本明細書に記載されている抗体ｍＡｂ １７５により更に例示される。
本発明は、既に記載されているモノクローナル抗体（ｍＡｂ）８０６（ＷＯ０２０９２７７１およびＷＯ０５０８１８５４に記載されている）と同じＥＧＦ受容体エピトープを標的とする抗体を記載する。ｍＡｂ １７５の抗原結合のための最も重要なアミノ酸である相補性決定領域（ＣＤＲ）は該８０６抗体と高度に相同性であり、少数のアミノ酸相違を伴うに過ぎない。
抗体のその標的抗原への結合は、その重鎖および軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）によりもたらされ、３つのＣＤＲ領域、すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が存在する。したがって、ｍＡｂ １７５の重鎖または軽鎖（好ましくはその両方）のＣＤＲ領域に基づく抗体は、インビボ療法を含む診断および治療用途のための有用な抗体となるであろう。特定されたｍＡｂ １７５抗体のＣＤＲに基づく抗体は、増幅されたＥＧＦＲを有する腫瘍を、そのｄｅ２−７ ＥＧＦＲの状態には無関係に標的化するのに有用であろう。ｍＡｂ １７５は正常野生型受容体には有意には結合しないため、現在検討中であるＥＧＦＲ抗体の制限である、正常組織における有意な取り込みは生じないであろう。
ＥＧＦ受容体を標的とするモノクローナル抗体１７５の配列は決定されており、該抗体のＣＤＲ領域は、図１に記載されているアミノ酸配列を有する。軽鎖および重鎖のそれぞれのＣＤＲは本明細書中に記載されている。Ａｂ１７５軽鎖ＣＤＲはＣＤＲ１（配列番号１）、ＣＤＲ２（配列番号２）およびＣＤＲ３（配列番号３）に対応する。Ａｂ１７５重鎖ＣＤＲはＣＤＲ１（配列番号４）、ＣＤＲ２（配列番号５）およびＣＤＲ３（配列番号６）に対応する。
抗体 ８０６と同様に、本発明の１７５抗体も、増幅された野生型ＥＧＦＲおよびｄｅ２−７ ＥＧＦＲを認識するが、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲ突然変異の特有の連結ペプチド（連結ペプチドＬＥＥＫＫＧＮＹＶＶＴＤＨ（配列番号１３））とは異なるエピトープに結合する。ＭＡｂ １７５はＡ４３１細胞の表面に結合し、これはＥＧＦＲ遺伝子の増幅体を有するが、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲを発現しない。重要なことに、ｍＡｂ １７５は、ｍＡｂ ８０６と同様に、あるレベルの内因性野生型（ｗｔ）ＥＧＦＲを発現するがＥＧＦＲが異常には発現されず増幅もされない肝臓および皮膚のような正常組織には有意には結合しない。
ｍＡｂ １７５は、エピトープ結合、免疫組織化学的染色などに関してｍＡｂ ８０６に非常に類似した特性を有するが、ｄｅ２−７ ＥＧＦ受容体を発現するヒト神経膠腫異種移植片の処理においてｍＡｂ ８０６より高い効力を示す。
１つの態様においては、本発明は、抗原に結合しうる抗体であって、配列番号１〜３に記載されているものを含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３を含むＡｂ１７５の軽鎖のＣＤＲにおいて記載されているのと実質的に同じアミノ酸配列を含むポリペプチド結合性ドメインを含む抗体を提供する。もう１つの態様においては、本発明は、抗原に結合しうる抗体であって、配列番号４〜６に記載されているものを含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３を含むＡｂ１７５の重鎖のＣＤＲにおいて記載されているのと実質的に同じアミノ酸配列を含むポリペプチド結合性ドメインを含む抗体を提供する。したがって、本発明は、組換え、ヒト化、キメラ、表面修飾（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）または他のそのような抗体、あるいは抗体ペプチド、例えば、Ａｂ１７５の重鎖および／または軽鎖のＣＤＲを含むドメインペプチドを含む。そのような抗体は、軽鎖に関しては配列番号１〜３、および重鎖に関しては配列番号４〜６に記載されている配列を含みうる。好ましい実施形態においては、該結合性ドメインはヒト抗体フレームワークにより含有される。
他の態様においては、本発明は、前記のとおりの抗体をコードする配列を含む単離された核酸、および該結合メンバーの発現を引き起こす条件下で該核酸を発現させ、該結合メンバーを回収することを含む、本発明の抗体の製造方法を提供する。
さらに、本発明のもう１つの態様は、ＥＧＦＲに結合する、好ましくはそれへのリガンド結合を抑制する抗体のような追加的な抗体を伴う、そのような抗体の組成物である。そのような組成物は、好ましくは投与がし易くなるよう製剤化された、「ワンポット（ｏｎｅ ｐｏｔ）」カクテル、キットなどでありうる。
本発明の抗体またはそのフラグメントは、ヒトまたは動物の身体の治療または診断方法、例えば、本発明の抗体の有効量を患者に投与することを含む、ヒト患者における腫瘍の治療方法において使用されうる。
本発明はまた、本発明の抗体をコードする組換えＤＮＡ分子もしくはクローン化遺伝子またはそれらの縮重変異体、好ましくは、図１（配列番号４〜６）に示す抗体ＶＨ ＣＤＲ １、２および／または３ドメインをコードする核酸分子、特に組換えＤＮＡ分子またはクローン化遺伝子に関する。もう１つの実施形態においては、本発明はまた、本発明の抗体をコードする組換えＤＮＡ分子もしくはクローン化遺伝子またはそれらの縮重変異体、好ましくは、図１（配列番号１〜３）に示す抗体ＶＬ ＣＤＲ １、２および／または３ドメインをコードする核酸分子、特に組換えＤＮＡ分子またはクローン化遺伝子に関する。
本発明のもう１つの実施形態においては、本明細書に記載されている配列をコードする組換えＤＮＡ分子またはクローン化遺伝子の完全ＤＮＡ配列は、適当な宿主内に導入されうる発現制御配列に機能的に連結されうる。したがって、本発明は、該抗体の本ＶＨおよび／またはＶＬ ＣＤＲまたはその一部をコードするＤＮＡ配列、より詳しくは、前記および図１および配列番号１、２、３、４、５および／または６に記載されているＶＨおよび／またはＶＬ ＣＤＲをコードするＤＮＡ配列を含むクローン化遺伝子または組換えＤＮＡ分子で形質転換された単細胞宿主にまで拡張される。
本発明は、本質的には、本明細書に例示されているとおり公知組換え技術を含む、抗体およびその活性フラグメントの製造のための幾つかの手段を含み、したがって、本発明は、その範囲内に、そのような合成またはキメラ抗体調製物を含むと意図される。本明細書に開示されている核酸およびアミノ酸配列の単離は、そのような組換え技術により本発明の抗体の再生を促進し、したがって、本発明は、組換えＤＮＡ技術により宿主系内での発現のために製造された発現ベクター、および得られた形質転換宿主にまで拡張される。
本発明は、薬物または他の実体、例えば、抗体に結合することにより抗体活性をモジュレーション、抑制または増強しうる抗イディオタイプ抗体のような抗体を提供する。そのような抗イディオタイプ抗体は、ｍＡｂ１７５のような抗体もしくはそのエピトープに特異的に結合する又はその活性を増強する薬物の開発において有用であろう。
本発明の診断用途は、腫瘍もしくは細胞サンプルを特徴づけするための又は腫瘍もしくは癌に関してスクリーニングするためのアッセイ（インビトロおよびインビボ診断アッセイを含む）における本発明の抗体の用途にまで拡張される。イムノアッセイにおいては、対照量の該抗体などを調製し、酵素、特異的結合パートナーおよび／または放射性元素で標識し、ついで細胞サンプル内に導入することが可能である。該標識物質またはその結合パートナーが該サンプル内の部位と反応する機会を得た後、生じた物質を、付着している標識の性質によって様々となりうる公知技術により検査することが可能である。
本発明の抗体は、検出可能または機能的な標識を含有しうる。該特異的結合メンバーは、放射能標識、例えば同位体３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２１Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、２１１Ａｔ、１９８Ａｕ、６７Ｃｕ、２２５Ａｃ、２１３Ｂｉ、９９Ｔｃおよび１８６Ｒｅを含有しうる。放射能標識を使用する場合、該抗体を特定し定量するために、公知の現在利用可能な計数方法が用いられうる。標識が酵素である場合には、検出は、当技術分野で公知の現在利用されている比色、分光光度、蛍光分光光度、電流測定または気体定量技術のいずれかにより達成されうる。
放射能標識抗体およびそのフラグメントは、インビトロ診断技術およびインビボラジオイメージング技術において有用である。本発明のもう１つの態様においては、放射能標識抗体およびそのフラグメント、特にラジオイムノコンジュゲートは、放射線免疫療法において、特に、癌治療のための放射能標識抗体として有用である。さらにもう１つの態様においては、放射能標識抗体およびそのフラグメントは、それが癌細胞、前癌細胞、腫瘍細胞および過剰増殖細胞の存在および／または位置をそのような細胞の除去のための手術の前、途中または後で特定し示しうる放射免疫支援外科技術において有用である。
本発明の抗体およびフラグメントが他の分子または物質にコンジュゲート化または結合されている本発明のイムノコンジュゲートまたは抗体融合タンパク質は更に、化学的切除用物質、毒素、イムノモジュレーター（免疫調節物質）、サイトカイン、細胞毒性物質、化学療法剤または薬物にコンジュゲート化された結合メンバー（これらに限定されるものではない）を含む。
本発明は、例えば増幅されたＥＧＦＲまたはｄｅ２−７ ＥＧＦＲの存在の度合の定量分析のための試験キットの形態で調製されうるアッセイ系を含む。該系または試験キットは、本明細書に記載されている放射能および／または酵素技術、該抗体への標識のカップリングの１つにより調製された標識成分、ならびに１以上の追加的免疫化学的試薬（それらの少なくとも１つは、決定すべき遊離もしくは固定化成分またはそれらの結合パートナーである）を含みうる。
もう１つの実施形態においては、本発明は、該抗体またはその活性フラグメントの活性に基づく、あるいは同じ活性を有すると決定された物質または他の薬物に基づく或る治療方法に関する。第１の治療方法は、頭部および頸部、乳房、前立腺ならびに神経膠腫（これらに限定されるものではない）を含む癌の予防または治療に関連している。
特に、本発明の抗体、および特定の実施形態においては、本明細書中の図１および配列番号１〜６に示されているＣＤＲドメイン領域配列を有する１７５抗体、またはそれらの活性フラグメント、ならびにそれらに由来するキメラ（二重特異性）または合成抗体は、例えば癌を治療するための療法に適した投与のための適当なビヒクル、担体または希釈剤を含む医薬組成物として製造されうる。そのような医薬組成物は、当技術分野で公知の方法（例えば、ペジル化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ））により該抗体またはフラグメントの半減期をモジュレーションする方法をも含みうる。そのような医薬組成物は更に、追加的な抗体または治療用物質を含みうる。
したがって、本発明の組成物は、治療すべき状態に応じて、単独で、または他の治療、治療用物質もしくは因子と組合せて同時または連続的に投与されうる。また、本発明は、本明細書に記載されている抗体またはそのフラグメントおよび他の物質または治療用物質（例えば、抗癌物質もしくは治療用物質、抗ＥＧＦＲ物質もしくは抗体、または免疫モジュレーター）を含む組成物を想定しており、該組成物を含む。より一般的には、これらの抗癌物質はチロシンキナーゼインヒビターまたはリン酸化カスケードインヒビター、翻訳後モジュレーター、細胞増殖または分裂インヒビター（例えば、抗有糸分裂物質）、ＰＤＧＦＲインヒビターまたはシグナル伝達インヒビターでありうる。他の治療または療法は、適当な用量の鎮痛薬、例えば非ステロイド性抗炎症薬（例えばアスピリン、パラセタモール、イブプロフェンまたはケトプロフェン）またはオピエート、例えばモルヒネ、または制吐薬の投与を含みうる。したがって、これらの物質は抗ＥＧＦＲ特異的物質、例えばＡＧ１４７８であることが可能であり、あるいはより一般的な抗癌および抗腫瘍物質（その非限定的な具体例には、ドキソルビシン、カルボプラチンおよびシスプラチンが含まれる）であることが可能である。また、該組成物は、免疫応答を及び癌細胞または腫瘍の減少または除去を刺激する免疫モジュレーター、例えばインターロイキン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）または他の増殖因子、サイトカインもしくはホルモン、例えばデキサメタゾンと共に投与されうる。該組成物は、抗ＥＧＦＲ抗体ｍＡｂ８０６、抗体５２８、２２５、ＳＣ−０３、１０８（ＡＴＣＣ ＨＢ９７６４）（米国特許第６，２１７，８６６号）、１４Ｅ１（米国特許第５，９４２，６０２号）、ＤＨ８．３、Ｌ８Ａ４，Ｙ１０、ＨｕＭＡＸ−ＥＧＦＲｒ（Ｇｅｎｍａｂ／Ｍｅｄａｒｅｘ）、ＩＣＲ６２およびＡＢＸ−ＥＧＦ（Ａｂｇｅｎｉｘ）（これらに限定されるものではない）を含む他の抗ＥＧＦＲ抗体と共に投与されることも可能であり、該抗ＥＧＦＲ抗体との組合せを含むことも可能である。
本発明はまた、他の分子または物質と共有結合または会合した抗体およびそのフラグメントを含む。これらの他の分子または物質には、異なる認識特性を有する分子（抗体または抗体フラグメントを含む）、毒素、リガンドおよび化学療法剤（これらに限定されるものではない）が含まれる。
他の目的および利点は、後記の例示的図面および添付の特許請求の範囲に関して説明されている以下の詳細な説明の精査から当業者に明らかとなろう。
詳細な説明
本発明においては、当技術分野における技量の範囲内の通常の分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ技術が用いられうる。そのような技術は文献中に十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”（１９８９）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ［Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編，（１９９４）］；“Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ”Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ［Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｉｓ編（１９９４））］；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ［Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編，（１９９４）］；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（ＭＪ．Ｇａｉｔ編 １９８４）；“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ ＳＪ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８５）］；“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ ＳＪ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，（１９８４）］；“Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ”［Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編，（１９８６）］；“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ”［ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）］；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”（１９８４）を参照されたい。
したがって、本明細書中で用いられる以下の用語は、以下に記載する定義を有するものとする。
Ａ．用語
「異常発現」なる語は、その種々の文法形態において、増強された発現または翻訳、タンパク質のプロモーターまたは調節体のモジュレーション、タンパク質に関する遺伝子の増幅、あるいは増加した半減期または安定性を含むいずれかの手段により引き起こされる、組織におけるタンパク質の、いずれかの増強もしくは改変された発現または過剰発現（例えば、タンパク質の量における増加）により、非過剰発現状態と比較して大量のタンパク質が存在し又は同時に検出されうることを意味し、それを含みうる。異常発現は、タンパク質の発現の増強またはタンパク質のレベルもしくは量の増加（配列の改変、欠失もしくは挿入またはフォールディングの改変による突然変異タンパク質または変異体と同様に改変タンパク質が発現される場合を含む）により細胞内のタンパク質発現または翻訳後修飾装置に負荷がかかっている又は損なわれている、いずれかの場合または改変を含み、それらを想定している。
「異常発現」なる語は、本明細書においては、異常な（通常は増加した）量／レベルのタンパク質が、その異常な量またはレベルの発生原因には無関係に存在する状態を含むよう、特に選ばれていることを理解することが重要である。したがって、タンパク質の異常な量は遺伝子増幅の非存在下の該タンパク質の過剰発現から生じることがあり、これは、例えば、癌を有する被験者の頭部および頸部から採取された多数の細胞／組織サンプルにおいて見出され、一方、遺伝子増幅に起因する異常タンパク質レベルを示すサンプルもある。
この後者に関連して、本発明を例示するために本明細書中に示されている本発明者らの或る研究は、ＥＦＧＲの増幅から生じる異常タンパク質レベルを或るサンプルが示す、サンプルの分析を含む。したがって、これは、増幅に関連した実験的知見の本明細書における提示に相当し、ＥＧＦＲの異常レベルの説明における「増幅／増幅された」などの語の使用に相当する。しかし、本発明の結合性メンバーによる臨床的介入が想定される環境または状況を明確に定めるのは、該タンパク質の異常な量またはレベルの観察であり、この理由により、「異常発現」なる語は、ＥＦＧＲレベルにおける対応する異常を引き起こす原因となる環境をより広く包含するものである、と本明細書はみなしている。
したがって、「過剰発現」および「増幅」なる語は、それらの種々の文法形態において、異なる技術的意味を有すると理解されるが、本発明において、異常なＥＦＧＲタンパク質レベルが存在する状態をそれらが表す場合には、それらは互いに同等であるとみなされるべきである。したがって、「異常発現」なる語は、その範囲内に「過剰発現」および「増幅」を包含すると考えられるため、本明細書で用いられる場合には全ての用語が互いに同等であるとみなされうるよう、「異常発現」なる語が採用されている。
「抗体」なる語は、天然の又は部分的もしくは完全に合成的に製造された免疫グロブリンを示す。この用語は、抗体結合ドメインである又はそれに相同な結合ドメインを有する任意のポリペプチドまたはタンパク質をも含む。ＣＤＲグラフティング抗体もこの用語に含まれる。
抗体は多数の方法で修飾されうるため、「抗体」なる語は、要求される特異性を有する結合ドメインを有する任意の結合メンバーまたは物質を含むと解釈されるべきである。したがって、この用語は、天然物または全体的もしくは部分的に合成物である免疫グロブリン結合ドメインを含む任意のポリペプチドを含む、抗体フラグメント、抗体の誘導体、機能的等価体およびホモログを含む。したがって、別のポリペプチドに融合された免疫グロブリン結合ドメインまたは等価体を含むキメラ分子が含まれる。キメラ抗体のクローニングおよび発現はＥＰ−Ａ−０１２０６９４およびＥＰ−Ａ−０１２５０２３ならびに米国特許第４，８１６，３９７号および第４，８１６，５６７号に記載されている。
全抗体のフラグメントは結合性抗原の機能を果たしうることが示されている。結合性フラグメントの具体例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインよりなるＦａｂフラグメント、（ｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインよりなるＦｄフラグメント、（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインよりなるＦｖフラグメント、（ｉｖ）ＶＨドメインよりなるｄＡｄフラグメント（Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ら，Ｎａｔｕｒｅ ３４１，５４４−５４６（１９８９））、（ｖ）単離されたＣＤＲ領域、（ｖｉ）２つの連結Ｆａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント、（ｖｉｉ）ＶＨドメインおよびＶＬドメインがペプチドリンカー（これは、抗原結合部位を形成するようそれらの２つのドメインが会合することを可能にする）により連結された一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（Ｂｉｒｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３−４２６，１９８８；Ｈｕｓｔｏｎら，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，８５，５８７９−５８８３，１９８８）、（ｖｉｉｉ）多価抗体フラグメント（ｓｃＦｖ二量体、三量体および／または四量体（ＰｏｗｅｒおよびＨｕｄｓｏｎ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４２：１９３−２０４ ９（２０００）））、（ｉｘ）二重特異性一本鎖Ｆｖ二量体（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５）、ならびに（ｘ）遺伝子融合により構築された多価または多重特異性フラグメントである「ジアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）」（ＷＯ９４／１３８０４；Ｐ．Ｈｏｌｌｉｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０ ６４４４−６４４８，（１９９３））が挙げられる。
「抗体結合部位」は、抗原に特異的に結合する、軽鎖または重および軽鎖可変および超可変領域から構成される抗体分子の構造的部分である。
「抗体分子」なる語は、本明細書中で用いられるその種々の文法形態において、無傷免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の両方を含む。
典型的な抗体分子としては、無傷免疫グロブリン分子、実質的に無傷な免疫グロブリン分子、およびパラトープを含有する免疫グロブリン分子の部分（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ｖ）として当技術分野で公知の部分が含まれ、それらの部分は、本明細書に記載されている治療方法における使用に好ましい）が挙げられる。
また、抗体は二重特異性でありうる。この場合、該抗体の一方の結合ドメインは本発明の特異的結合メンバーであり、他方の結合ドメインは、例えばエフェクター機能をリクルートするためなどの、異なる特異性を有する。本発明の二重特異性抗体は、該抗体の一方の結合ドメインが本発明の特異的結合メンバー（そのフラグメントを含む）であり、他方の結合ドメインが、異なる抗体またはそのフラグメント、例えば異なる抗ＥＧＦＲ抗体、例えば以下のものである場合を含む：抗体５２８（米国特許第４，９４３，５３３号）、キメラおよびヒト化２２５抗体（米国特許第４，９４３，５３３号およびＷＯ／９６４０２１０）、抗ｄｅ２−７抗体、例えばＤＨ８．３（Ｈｉｌｌｓ，Ｄ．ら（１９９５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６３（４）：５３７−５４３）、抗体Ｌ８Ａ４およびＹ１０（Ｒｅｉｓｔ，ＣＪら（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５（１９）：４３７５−４３８２；Ｆｏｕｌｏｎ ＣＦら（２０００）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６０（１６）：４４５３−４４６０）、ＩＣＲ６２（Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ Ｈら（１９９３）Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊａｎ−Ｊｕｎ；２２（ｌ−３）：１２９−４６；Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉら（２００２）Ｐ．Ａ．Ａ．Ｃ．Ｒ．５５（１４）：３１４０−３１４８）、またはＷｉｋｓｔｒａｎｄら（Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ Ｃ．ら（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５（１４）：３１４０−３１４８）の抗体。他方の結合ドメインは、神経または神経膠腫細胞特異的抗体の場合のような特定の細胞型を認識または標的化する抗体でありうる。本発明の二重特異性抗体においては、本発明の抗体の一方の結合ドメインは、例えば以下のものとして、特定の細胞受容体を認識し及び／又は特定の様態で細胞をモジュレーションする他の結合ドメインまたは分子と組合されうる：免疫モジュレーター（例えば、インターロイキン）、増殖モジュレーターまたはサイトカイン［例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、特に、２００２年２月１３日付け出願のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／３５５，８３８（その全体を本明細書に組み入れることとする）に示されているＴＮＦ二重特異性形態］または毒素（例えば、リシン）または抗有糸分裂もしくはアポトーシス分子もしくは因子。
抗体分子のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２部分は、よく知られた方法により、実質的に無傷の抗体分子上のそれぞれパパインおよびペプシンのタンパク質分解反応により製造されうる。例えば、Ｔｈｅｏｆｉｌｏｐｏｌｏｕｓらの米国特許第４，３４２，５６６号を参照されたい。Ｆａｂ’抗体分子部分もよく知られており、Ｆ（ａｂ’）２部分から製造され、ついで、メルカプトエタノールの場合と同様の２つの重鎖部分を連結するジスルフィド結合で還元され、ついで、生じたタンパク質メルカプタンの、例えばヨードアセトアミドのような試薬でのアルキル化に付される。無傷抗体分子を含有する抗体が本発明において好ましい。
「モノクローナル抗体」なる語は、その種々の文法形態において、特定の抗原と免疫反応しうる、唯一の種の抗体結合部位を有する抗体を意味する。したがって、モノクローナル抗体は、典型的には、それが免疫反応するいずれかの抗原に対する単一の結合アフィニティを示す。モノクローナル抗体は、異なる抗原にそれぞれが免疫特異的である複数の抗体結合部位を有する抗体分子、例えば、二重特異性（キメラ）モノクローナル抗体をも含みうる。
「抗原結合ドメイン」なる語は、抗原の一部または全部に特異的に結合しそれに相補的である領域を含む、抗体の部分を示す。抗原が大きい場合、抗体は抗原のみの特定の部分（この部分はエピトープと称される）に結合しうる。抗原結合ドメインは１以上の抗体可変ドメインにより提供されうる。好ましくは、抗原結合ドメインは抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）および抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
「翻訳後修飾」は、翻訳が完了した後およびリボソームから遊離された後または新生ポリペプチド上で翻訳と同時にタンパク質が受ける、共有結合修飾などの修飾のいずれか１つ又は組合せを含みうる。翻訳後修飾は、リン酸化、ミリスチル化、ユビキチン化、グリコシル化、補酵素結合、メチル化およびアセチル化（これらに限定されるものではない）を含む。翻訳後修飾は、タンパク質の活性、その細胞内もしくは細胞外目的地、その安定性または半減期および／またはリガンド、受容体もしくは他のタンパク質によるその認識をモジュレーションし又はそれらに影響を及ぼしうる。翻訳後修飾は、オルガネラにおいて、核もしくは細胞質において、または細胞外で生じうる。
「特異的」なる語は、特異的結合ペアのメンバーの１つがその特異的結合パートナー以外の分子へのいずれの有意な結合をも示さない状況を表すために用いられうる。該用語は、例えば、多数の抗原により担持される特定のエピトープに抗原結合ドメインが特異的である場合にも適用可能であり、この場合、該抗原結合ドメインを担持する特異的結合メンバーは、該エピトープを担持する種々の抗原に結合しうるであろう。
「含む」なる語は、一般に、包含するという意味、すなわち、１以上の特徴または成分の存在を許容するという意味で用いられる。
「実質的になる」なる語は、より大きな産物に共有結合していない一定数の残基の産物、特にペプチド配列に関して用いられる。しかし、前記の本発明のペプチドの場合、該ペプチドのＮまたはＣ末端への若干の修飾、例えば、保護基などを付加するための該末端の化学修飾、例えば、Ｃ末端のアミド化が想定されうる、と当業者は理解するであろう。
「単離（された）」なる語は、本発明の抗体、またはそのような抗体もしくはそのＣＤＲをコードする核酸が本発明に合致したものとなる状態を意味する。抗体および核酸は、それらに天然で付随している物質、例えば、それらの天然環境でそれらに付随して見出される、あるいはインビトロまたはインビボで行われる組換えＤＮＡ技術によりそれらが製造される環境（例えば、細胞培養）でそれらに付随して見出される他のポリペプチドまたは核酸を含有しない又は実質的に含有しないであろう。抗体および核酸は希釈剤または補助剤と共に製剤化されうるが、その場合でも尚、それらは実際の目的においては単離されており、例えば、該メンバーは、イムノアッセイにおける使用のためにマイクロタイタープレートをコートするために使用される場合には、通常、ゼラチンまたは他の担体と混合され、あるいは診断または療法において使用される場合には、医薬上許容される担体または希釈剤と混合されるであろう。抗体は天然で又は異種真核細胞の系によりグリコシル化されることが可能であり、あるいはそれは（例えば、原核細胞内での発現により産生される場合には）非グリコシル化形態でありうる。
また、本明細書中で用いる「グリコシル化」および「グリコシル化された」なる語は、オリゴ糖の付加による、糖タンパク質と称される、タンパク質の翻訳後修飾を含み、それを包含する。オリゴ糖は糖タンパク質のグリコシル化部位において付加される（特に、Ｎ結合オリゴ糖およびＯ結合オリゴ糖を含む）。Ｎ結合オリゴ糖はＡｓｎ残基に付加され、特に、該Ａｓｎ残基は配列Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ内に存在し、ここで、ＸはＰｒｏでもＡｓｐでもなく、それは、糖タンパク質において見出される最も一般的なものである。Ｎ結合糖タンパク質の生合成においては、まず、高マンノース型オリゴ糖（一般には、ドリコール、Ｎ−アセチルグルコサミン、マンノースおよびグルコースから構成される）が小胞体（ＥＲ）において形成される。ついで該高マンノース型糖タンパク質はＥＲからゴルジへ輸送され、ここで、該オリゴ糖の更なる加工および修飾が生じる。Ｏ結合オリゴ糖はＳｅｒまたはＴｈｒ残基のヒドロキシル基に付加される。Ｏ結合オリゴ糖においては、まず、ＥＲにおいてＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼによりＮ−アセチルグルコサミンがＳｅｒまたはＴｈｒ残基に移される。ついで該タンパク質はゴルジに移動し、ここで、更なる修飾および鎖伸長が生じる。Ｏ結合修飾は、それらのＳｅｒまたはＴｈｒ部位におけるＯＧ１ｃＮＡｃ単糖のみの単純な付加により生じることが可能であり、それらは、異なる条件下、グリコシル化ではなくリン酸化されることも可能である。
本明細書中で用いる「ｐｇ」はピコグラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ｕｇ」または「μｇ」またはマイクログラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「ｕｌ」または「μｌ」はマイクロリットルを意味し、「ｍｌ」はミリリットルを意味し、「ｌ」はリットルを意味する。
「抗体１７５」、「１７５抗体」、「ｍＡｂ１７５」なる語および具体的には挙げられていないいずれかの異形語は本明細書においては互換的に用いられることが可能であり、本出願および特許請求の範囲の全体において用いられる場合、単一または複数のタンパク質を含むタンパク質性物質を意味し、本明細書に記載されており図１に示されているアミノ酸配列データを有し配列番号１、２、３、４、５および／または６に記載のアミノ酸配列ならびに本明細書および特許請求の範囲に記載の活性のプロファイル有する又は含むタンパク質に拡張される。したがって、実質的に同等な又は改変された活性を示すタンパク質が同様に想定される。これらの修飾は、例えば、部位特異的突然変異誘発により得られる修飾のように意図的なものであることが可能であり、あるいは例えば該複合体またはその明示サブユニットの生産体である宿主における突然変異により得られる修飾のように偶発的なものであることが可能である。また、「抗体１７５」、「１７５抗体」および「ｍＡｂ１７５」は、本明細書中に具体的に挙げられているタンパク質ならびに全ての実質的に相同な類似体および対立遺伝子変異体をそれらの範囲内に含むと意図される。
本明細書に記載されているアミノ酸残基は「Ｌ」異性体であることが好ましい。しかし、免疫グロブリン結合の所望の機能特性が該ポリペプチドにより保有される限り、いずれかのＬ−アミノ酸残基の代わりに「Ｄ」異性体が用いられうる。ＮＨ２は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を意味する。ＣＯＯＨは、ポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離カルボキシ基を意味する。標準的なポリペプチド命名法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３：３５５２−５９（１９６９））に従ったアミノ酸残基の略語を以下の対応表に示す。
Figure 0005532486
全てのアミノ酸残基配列は、本明細書においては、左右の配向がアミノ末端からカルボキシ末端への通常の方向である式により表されていることに注目すべきである。さらに、アミノ酸残基配列の始め及び終わりにおけるダッシュは１以上のアミノ酸残基の別配列へのペプチド結合を示すことに注目すべきである。前記の表は、本明細書中で代わる代わる現れうる３文字の記号および１文字の記号を相関させるために記載されている。
「レプリコン」は、インビボでＤＮＡ複製の自律的単位として機能する（すなわち、それ自身の制御下で複製されうる）任意の遺伝的要素（例えば、プラスミド、染色体、ウイルス）である。
「ベクター」は、別のＤＮＡセグメントが結合して該結合セグメントの複製を引き起こしうる例えばプラスミド、ファージまたはコスミドのようなレプリコンである。
「ＤＮＡ分子」は、一本鎖形態または二重らせん形態のデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミンまたはシトシン）の重合形態を意味する。この用語は該分子の一次および二次構造を意味し、それをいずれかの特定の三次形態に限定するものではない。したがって、この用語は、とりわけ、直鎖状ＤＮＡ分子（例えば、制限断片）、ウイルス、プラスミドおよび染色体において見出される二本鎖ＤＮＡを含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造の考察においては、配列は、本明細書中では、ＤＮＡの非転写鎖（すなわち、ｍＲＮＡと相同な配列を有する鎖）に沿って５’から３’への方向の配列のみを与える通常の慣例に従い記載されうる。
「複製起点」は、ＤＮＡ合成に関与するＤＮＡ配列を意味する。
ＤＮＡ「コード配列」は、適当な調節配列の制御下に配置された場合にインビボで転写されポリペプチドに翻訳される二本鎖ＤＮＡ配列である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンにより定められる。コード配列には、原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳類）ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列および更には合成ＤＮＡ配列（これらに限定されるものではない）が含まれうる。ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列は、通常、コード配列の３’側に位置するであろう。
転写および翻訳制御配列は、宿主細胞内でのコード配列の発現をもたらす例えばプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなどのようなＤＮＡ調節配列である。
「プロモーター配列」は、細胞内でＲＮＡポリメラーゼに結合し下流（３’方向）コード配列の転写を開始させうるＤＮＡ調節領域である。本発明を定義する目的においては、プロモーター配列は、その３’末端において、転写開始部位との境界をなし、バックグラウンドを超える検出可能なレベルで転写を開始させるのに必要な最小数の塩基または要素を含むよう上流（５’方向）へと伸長する。プロモーター配列内には、転写開始部位（簡便には、ヌクレアーゼＳ１でのマッピングにより定められる）、およびＲＮＡポリメラーゼの結合をもたらすタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出されるであろう。真核生物プロモーターは、常にというわけではないがしばしば、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含有するであろう。原核生物プロモーターは、−１０および−３５コンセンサス配列に加えてシャイン・ダルガルノ配列を含有する。
「発現制御配列」は、別のＤＮＡ配列の転写および翻訳を制御し調節するＤＮＡ配列である。コード配列が細胞内で転写および翻訳制御配列の「制御下」にあるのは、ＲＮＡポリメラーゼが該コード配列をｍＲＮＡに転写し、ついでそれが、該コード配列によりコードされるタンパク質へと翻訳される場合である。
コード配列の前には「シグナル配列」が含まれうる。この配列はポリペプチドのＮ末端側のシグナルペプチドをコードしており、該シグナルペプチドは、該ポリペプチドを細胞表面へと導き該ポリペプチドを培地内に分泌させるよう宿主細胞に連絡し、このシグナルペプチドは、タンパク質が細胞を離れる前に宿主細胞により切断される。シグナル配列は、原核生物および真核生物に固有の種々のタンパク質と結びついていることが認められうる。
本発明のプローブに関して本明細書中で用いる「オリゴヌクレオチド」なる語は、２以上、好ましくは３以上のリボヌクレチドから構成される分子と定義される。その厳密なサイズは多数の要因に左右され、そしてこれらは該オリゴヌクレオチドの最終的な機能および用途に左右される。本明細書中で用いる「プライマー」なる語は、核酸鎖に相補的であるプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下、すなわち、ヌクレオチドおよび誘導物質、例えばＤＮＡポリメラーゼの存在下で適当な温度およびｐＨで配置された場合に合成の開始点として作用しうる、精製された制限消化物の場合のように天然に存在する又は合成的に製造されたオリゴヌクレオチドを意味する。該プライマーは一本鎖または二本鎖であることが可能であり、該誘導物質の存在下で所望の伸長産物の合成を始動させるのに十分な程度に長くなければならない。プライマーの厳密な長さは、温度、プライマー源および該方法の用途を含む多数の要因に左右されるであろう。例えば、診断用途では、標的配列の複雑性に応じて、オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には、１５〜２５またはそれ以上のヌクレオチドを含有するが、それより少数のヌクレオチドを含有することも可能である。プライマーは、特定の標的ＤＮＡ配列の、異なる鎖と「実質的に相補的」となるよう選択される。これは、プライマーが、そのそれぞれの鎖にハイブリダイズするのに十分な程度に相補的でなければならないことを意味する。したがって、プライマー配列は鋳型の厳密な配列を表す必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチド断片がプライマーの５’末端に結合していることが可能であり、この場合、該プライマー配列の残部が該鎖に相補的である。あるいは、プライマー配列が、該鎖の配列にハイブリダイズして伸長産物の合成のための鋳型を形成するのに十分な、該鎖の配列に対する相補性を有する限り、非相補的塩基またはより長い配列が該プライマー内に介在していることが可能である。
本明細書中で用いる「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」なる語は、特異的ヌクレオチド配列において又はその近傍で二本鎖ＤＮＡをそれぞれが切断する細菌酵素を意味する。
細胞が外因性または異種ＤＮＡにより「形質転換」されているのは、そのようなＤＮＡが細胞の内部に導入されている場合である。形質転換ＤＮＡは、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡ内に組み込まれる（共有結合される）ことが可能であり、あるいは組み込まれなくてもよい。例えば原核生物、酵母および哺乳類細胞においては、形質転換ＤＮＡはエピソーム要素（例えば、プラスミド）上に維持されうる。真核細胞の場合、安定に形質転換された細胞は、形質転換ＤＮＡが染色体内に組み込まれていて、それが染色体複製により娘細胞により受け継がれるようなっているものである。
この安定性は、該形質転換ＤＮＡを含有する娘細胞の集団から構成される細胞系またはクローンを該真核細胞が樹立しうることにより示される。「クローン」は、有糸分裂により単一の細胞または共通の祖先から誘導された細胞の集団である。「細胞系」は、インビトロで多数の世代にわたって安定に増殖しうる初代細胞のクローンである。
２つのＤＮＡ配列が「実質的に相同」であるのは、そのヌクレオチドの少なくとも約７５％（好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０または９５％）が該ＤＮＡ配列の一定の長さにわたって一致する場合である。実質的に相同な配列は、配列データバンクにおいて利用可能な標準的なソフトウェアを使用して該配列を比較することにより、あるいは例えばその特定の系に関して定められるストリンジェントな条件下のサザンブロットハイブリダイゼーション実験において特定されうる。適当なハイブリダイゼーション条件を定めることは当技術分野の技量の範囲内のものである。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら，前掲；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＶｏＩｓ．Ｉ＆ＩＩ，前掲；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，前掲を参照されたい。
本発明の抗体をコードしている、例えば、配列番号１、２、３、４、５または６と同じアミノ酸配列を有する又は含む可変領域ドメインを有する抗体をコードしているが配列番号１、２、３、４、５または６に対して縮重関係にあるＤＮＡ配列も本発明の範囲内であると理解されるべきである。「縮重」は、特定のアミノ酸を特定するために異なる３文字記号が用いられることを意味する。以下のコドンは、それぞれの特定のアミノ酸をコードするために互換的に用いられうることが、当技術分野でよく知られている。
フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ） ＵＵＵ又はＵＵＣ
ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ） ＵＵＡ又はＵＵＧ又はＣＵＵ又はＣＵＣ又はＣＵＡ又はＣＵＧ
イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ） ＡＵＵ又はＡＵＣ又はＡＵＡ
メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ） ＡＵＧ
バリン（Ｖａｌ又はＶ） ＧＵＵ又はＧＵＣ又はＧＵＡ又はＧＵＧ
セリン（Ｓｅｒ又はＳ） ＵＣＵ又はＵＣＣ又はＵＣＡ又はＵＣＧ又はＡＧＵ又はＡＧＣ
プロリン（Ｐｒｏ又はＰ） ＣＣＵ又はＣＣＣ又はＣＣＡ又はＣＣＧ
トレオニン（Ｔｈｒ又はＴ） ＡＣＵ又はＡＣＣ又はＡＣＡ又はＡＣＧ
アラニン（Ａｌａ又はＡ） ＧＣＵ又はＧＣＧ又はＧＣＡ又はＧＣＧ
チロシン（Ｔｙｒ又はＹ） ＵＡＵ又はＵＡＣ
ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ） ＣＡＵ又はＣＡＣ
グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ） ＣＡＡ又はＣＡＧ
アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ） ＡＡＵ又はＡＡＣ
リシン（Ｌｙｓ又はＫ） ＡＡＡ又はＡＡＧ
アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ） ＧＡＵ又はＧＡＣ
グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ） ＧＡＡ又はＧＡＧ
システイン（Ｃｙｓ又はＣ） ＵＧＵ又はＵＧＣ
アルギニン（Ａｒｇ又はＲ） ＣＧＵ又はＣＧＣ又はＣＧＡ又はＣＧＧ又はＡＧＡ又はＡＧＧ
グリシン（Ｇｌｙ又はＧ） ＧＧＵ又はＧＧＣ又はＧＧＡ又はＧＧＧ
トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ） ＵＧＧ
終止コドン ＵＡＡ（オーカー）又はＵＡＧ（アンバー）又はＵＧＡ（オパール）。
前記のコドンはＲＮＡ配列に関するものであると理解されるべきである。ＤＮＡに関する対応コドンはＵの代わりにＴを有する。
特定のコドンが、異なるアミノ酸をコードするコドンに変化するよう、本明細書に記載されている抗体ドメインをコードする核酸配列において突然変異が施されうる。そのような突然変異は、一般に、可能な最少のヌクレオチド変化を引き起こすことにより施される。この種の置換突然変異は、非保存的に（すなわち、特定のサイズまたは特性を有するアミノ酸のグループに属するアミノ酸から、別のグループに属するアミノ酸へと、コドンを変化させることにより）、または保存的に（すなわち、特定のサイズまたは特性を有するアミノ酸のグループに属するアミノ酸から、同じグループに属するアミノ酸へと、コドンを変化させることにより）、生じるタンパク質におけるアミノ酸を変化させるために施されうる。そのような保存的変化は、一般に、生じるタンパク質の構造および機能における、より少ない変化を招く。非保存的変化は、生じるタンパク質の構造、活性または機能を変化させる可能性がより高い。本発明は、生じるタンパク質の活性も結合特性も有意には変化させない保存的変化を含有する配列を含むとみなされるべきである。
以下はアミノ酸の種々のグループの一例である。
無極性Ｒ基を有するアミノ酸
アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン。
非荷電極性Ｒ基を有するアミノ酸
グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン。
荷電極性Ｒ基を有するアミノ酸（ｐＨ６．０において負に荷電）
アスパラギン酸、グルタミン酸。
塩基性アミノ酸（ｐＨ６．０において正に荷電）
リシン、アルギニン、ヒスチジン（ｐＨ６．０において）。
もう１つのグループは、フェニル基を有するアミノ酸でありうる：フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン。
もう１つのグループ分けは分子量（すなわち、Ｒ基のサイズ）によるものでありうる。
グリシン ７５
アラニン ８９
セリン １０５
プロリン １１５
バリン １１７
トレオニン １１９
システイン １２１
ロイシン １３１
イソロイシン １３１
アスパラギン １３２
アスパラギン酸 １３３
グルタミン １４６
リシン １４６
グルタミン酸 １４７
メチオニン １４９
ヒスチジン（ｐＨ６．０におけるおの） １５５
フェニルアラニン １６５
アルギニン １７４
チロシン １８１
トリプトファン ２０４。
特に好ましい置換は以下のとおりである。
・正電荷が維持されうるよう、ＡｒｇからＬｙｓへ、およびその逆。
・負電荷が維持されうるよう、ＡｓｐからＧｌｕへ、およびその逆。
・遊離−ＯＨが維持されうるよう、ＴｈｒからＳｅｒへ。
・遊離ＮＨ２が維持されうるよう、ＡｓｎからＧｌｎへ。
また、特に好ましい特性を有するアミノ酸で置換するために、アミノ酸置換が導入されうる。例えば、Ｃｙｓは別のＣｙｓとのジスルフィド架橋の潜在的部位に導入されうる。Ｈｉｓは、特に「触媒的」な部位として導入されうる（すなわち、Ｈｉｓは酸または塩基として作用することが可能であり、生化学的触媒における最も一般的なアミノ酸である）。Ｐｒｏは、タンパク質の構造においてβターンを誘導するその特に平面的な構造ゆえに、導入されうる。
２つのアミノ酸配列が「実質的に相同」であるのは、該アミノ酸残基の少なくとも約７０％（好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０または９５％）が同一であるか、または保存的置換を表す場合である。
ＤＮＡ構築物の「異種」領域は、より大きなＤＮＡ分子内の特定可能なＤＮＡセグメントであって、そのより大きな分子と共には天然で見出されないものである。したがって、該異種領域が哺乳類遺伝子をコードしている場合、該遺伝子は、通常、起源生物のゲノム内で哺乳類ゲノムＤＮＡに隣接していないＤＮＡに隣接しているであろう。異種コード配列のもう１つの例は、コード配列自体が天然では見いだされない構築物である（例えば、ゲノムコード配列がイントロンを含有するｃＤＮＡ、または天然遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）。対立遺伝子変異または天然に存在する突然変異事象は、本明細書中に定義されているＤＮＡの異種領域を与えない。
「医薬上許容される」なる語は、ヒトに投与された際に典型的にはアレルギーまたは同様の望ましくない反応（例えば、胃の不調、めまいなど）を引き起こさない生理的に許容される分子的実体および組成物を意味する。
「治療的有効量」なる語は、本明細書においては、標的細胞塊、癌細胞もしくは腫瘍の群または他の病的特徴の成長または進行または有糸分裂活性における臨床的に有意な変化を少なくとも約３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％妨げる、好ましくは軽減するのに十分な量を意味するものとして用いられる。
ＤＮＡ配列が発現制御配列に「機能的に連結」しているのは、該発現制御配列がそのＤＮＡ配列の転写および翻訳を制御し調節する場合である。「機能的連結」なる語は、発現されるべきＤＮＡ配列の前に適当な開始シグナル（例えば、ＡＴＧ）を有し、発現制御配列の制御下の該ＤＮＡ配列の発現、および該ＤＮＡ配列によりコードされる所望の産物の産生を可能にする適切なリーディングフレームを維持することを含む。組換えＤＮＡ分子内に挿入したい遺伝子が適当な開始シグナルを含有しない場合には、そのような開始シグナルが該遺伝子の前に挿入されうる。
「標準的なハイブリダイゼーション条件」なる語は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の両方に関して５×ＳＳＣおよび６５℃と実質的に同等な塩および温度条件を意味する。しかし、そのような「標準的なハイブリダイゼーション条件」は、バッファー中のナトリウムおよびマグネシウムの濃度、ヌクレオチド配列の長さ及び濃度、ミスマッチの割合、ホルムアミドの割合などを含む個々の条件に左右される、と当業者は認識するであろう。また、「標準的なハイブリダイゼーション条件」の決定において重要なのは、ハイブリダイズする２つの配列がＲＮＡ−ＲＮＡなのか、またはＤＮＡ−ＤＮＡなのか、またはＲＮＡ−ＤＮＡなのかである。そのような標準的なハイブリダイゼーション条件は、よく知られた手法に従い当業者により容易に決定され、ここで、ハイブリダイゼーションは、典型的には、推定される又は決定されたＴｍより１０〜２０℃低い温度で行われ、所望により、より高いストリンジェンシーの洗浄を伴う。
Ｂ．詳細な開示
本発明は、腫瘍形成性、過剰増殖性または異常細胞において露出されるＥＧＦＲエピトープ（ここで、該エピトープは増強され、現され又は明白であり、正常または野生型細胞においては検出可能でない）、特にＥＧＦＲペプチド（２８７ＣＧＡＤＳＹＥＭＥＥＤＧＶＲＫＣ３０２（配列番号１４））を認識する新規抗体１７５またはそのフラグメント（免疫原性フラグメントを含む）を提供する。特定の非限定的な実施形態においては、該抗体は、単純糖質修飾または初期グリコシル化に際して増強される又は明白であり複合糖質またはグリコシル化の存在下では軽減される又は明白ではないＥＧＦＲエピトープを認識する。該抗体またはそのフラグメントは、過剰発現、増幅または腫瘍形成事象の非存在下では、正常または野生型ＥＧＦＲエピトープを含有する正常または野生型細胞に結合せず、また、該細胞を認識しない。
本発明の特定の態様においては、前記のとおり、本発明者らは、増幅された野生型ＥＧＦＲおよびｄｅ２−７ ＥＧＦＲを特異的に認識するがｄｅ２−７ ＥＧＦＲ突然変異の特有の連結ペプチドとは異なるエピトープに結合する新規モノクローナル抗体１７５を見出した。また、ｍＡｂ １７５は、神経膠腫細胞の細胞表面上で発現される正常野生型ＥＧＦＲを認識しないが、それは、ポリペプチド態様を有するコンホメーションエピトープを示す、ＥＬＩＳＡプレートの表面上に固定化されたＥＧＦＲの細胞外ドメインに結合する。重要なことに、ｍＡｂ １７５は、ＥＧＦＲが過剰発現されず増幅もされない、ほとんどの他の正常組織の場合より高いレベルの内因性ｗｔＥＧＦＲを発現する肝臓および皮膚のような正常組織には有意には結合しない。したがって、ｍＡｂ１７５は、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲおよび増幅されたＥＧＦＲを認識するが正常野生型ＥＧＦＲもｄｅ２−７ ＥＧＦＲに特徴的な特有の連結ペプチドも認識しない新規かつ有用な特異性を示す。好ましい態様においては、本発明の抗体１７５は、図１ならびに配列番号１、２、３、４、５および６に示すＶＨおよびＶＬ ＣＤＲドメインアミノ酸配列を含む。
もう１つの態様においては、本発明は、１７５抗体と競合しうる抗体を提供し、この場合の競合は、１７５抗体のＶＨおよびＶＬ配列を有する抗体の少なくとも１０％がＥＬＩＳＡアッセイにおいてそのような抗体との競合によりｄｅ２−７ＥＧＦＲへの結合から遮断される条件下におけるものである。前記のとおり、本発明においては抗イディオタイプ抗体が想定される。
診断および治療用途
本発明の１７５抗体またはそのフラグメントの特有の特異性は、従前公知のＥＧＦＲ抗体で見られうる正常組織の取り込みに関連した問題を伴うことなく、多数の腫瘍形成性細胞型および腫瘍型（例えば、頭部および頸部、乳房、肺、暴行または前立腺腫瘍および神経膠腫）を特定、特徴づけ、標的化および治療、軽減または排除するための診断および治療用途を提供する。したがって、本発明の１７５抗体またはそのフラグメントを使用して、（例えば、突然変異体または変異体ＥＧＦＲの増幅または発現により）ＥＧＦＲ、特に、異常な翻訳後修飾を示すものを過剰発現する細胞が認識され、単離され、特徴づけられ、標的化され、治療され、または排除されうる。
したがって、本発明の抗体は、ＥＧＦＲの過剰発現、特に増幅および／またはＥＧＦＲ突然変異、特にｄｅ２−７ＥＧＦＲが存在する腫瘍または細胞を染色または認識することにより、ＥＧＦＲ腫瘍または腫瘍形成性細胞の性質を特異的に特徴づけしうる。さらに、本発明の１７５抗体は、増幅されたＥＧＦＲを含有する腫瘍に対する、およびｄｅ２−７ ＥＧＦＲ陽性異種移植片に対する有意なインビボ抗腫瘍活性を示す。本発明のもう１つの態様においては、本発明の抗体１７５の投与を含む、腫瘍、癌状態、前癌状態および過剰増殖性細胞増殖に関連した又はそれから生じる任意の状態の治療方法を提供する。
本発明の抗体は、ヒトまたは動物対象における腫瘍、特に上皮腫瘍の診断および治療の方法において使用されるよう設計される。これらの腫瘍は、神経膠腫、乳房、肺、前立腺、頭部または頸部腫瘍（これらに限定されるものではない）を含む任意の型の一次または二次充実性腫瘍でありうる。
抗体の製造
ハイブリドーマによりモノクローナル抗体を製造するための一般的方法はよく知られている。不死抗体産生細胞系は、融合以外の技術、例えば、発癌性ＤＮＡでのＢリンパ球の直接的な形質転換またはエプスタインバーウイルスでのトランスフェクションによっても作製されうる。例えば、Ｍ．Ｓｃｈｒｅｉｅｒら，“Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”（１９８０）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｔ−ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ”（１９８１）；Ｋｅｎｎｅｔｔら，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”（１９８０）；また、米国特許第４，３４１，７６１号、第４，３９９，１２１号、第４，４２７，７８３号、第４，４４４，８８７号、第４，４５１，５７０号、第４，４６６，９１７号、第４，４７２，５００号、第４，４９１，６３２号、第４，４９３，８９０号を参照されたい。ＥＦＧＲに対して産生されたモノクローナル抗体のパネルは、種々の特性、例えばイソタイプ、エピトープ、アフィニティなどに関してスクリーニングされうる。特に興味深いのは、ＥＦＧＲまたはそのサブユニットの活性を模擬するモノクローナル抗体である。そのようなモノクローナル抗体は特異的結合メンバー活性アッセイにおいて容易に特定されうる。高アフィニティ抗体は、天然または組換え特異的結合メンバーの免疫アフィニティ精製が可能である場合に有用である。本発明の実施において有用なモノクローナル抗体は、適当な抗原特異性の抗体分子を分泌するハイブリドーマを含有する栄養培地を含むモノクローナルハイブリドーマ培養を開始させることにより製造されうる。該培養は、該ハイブリドーマが該抗体分子を培地内に分泌するのに十分な条件下および時間にわたって維持される。ついで該抗体含有培地を集める。ついで、よく知られた技術により、該抗体分子を更に単離することが可能である。
モノクローナル抗ＥＧＦＲ抗体の製造方法は当技術分野でよく知られている。Ｎｉｍａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：４９４９−４９５３（１９８３）を参照されたい。典型的には、ＥＧＦＲまたはペプチド類似体は、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体を製造するための既に記載されている方法における免疫原として、単独で、または免疫原性担体にコンジュゲート化させて使用される。該ハイブリドーマは、腫瘍形成性、異常または過剰増殖性細胞に存在するＥＧＦＲと免疫反応する抗体を産生する能力に関してスクリーニングされる。他の抗ＥＧＦＲ抗体には、Ｇｅｎｍａｂ／ＭｅｄａｒｅｘのＨｕＭＡＸ−ＥＧＦｒ抗体、１０８抗体（ＡＴＣＣ ＨＢ９７６４）（米国特許第６，２１７，８６６号）およびＳｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧ（米国特許第５，９４２，６０２号）の抗体１４Ｅ１が含まれるが、これらに限定されるものではない。
組換え抗体、キメラ、二重特異性抗体およびフラグメント
一般に、配列番号１、２、３、４、５および／または６のＣＤＲ領域として記載されているのと実質的に同じアミノ酸配列を含むＣＤＲ領域は、腫瘍抗原へのＣＤＲ領域の結合を可能にする構造体内に含有されるであろう。「記載されているのと実質的に同じ」は、本発明のそのＣＤＲ領域が、配列番号１、２、３、４、５および／または６の特定されている領域と同一または高度に相同であることを意味する。「高度に相同」は、少数、好ましくは１〜８、好ましくは１〜５、好ましくは１〜４、または１〜３、または１〜２個のみの置換が該ＣＤＲ内に施されうることを意味する。
本発明のＣＤＲを含有するための構造は、一般に、再構成免疫グロブリン遺伝子によりコードされる天然に存在するＶＨおよびＶＬ抗体可変ドメインのＣＤＲ領域に対応する位置にＣＤＲ領域が位置する抗体重鎖もしくは軽鎖配列またはその実質的部分のものである。免疫グロブリン可変ドメインの構造および位置は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ．ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ．１９８７およびその改訂版（現在、インターネット（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ）上で入手可能）を参照して決定されうる。
好ましくは、配列番号４、５および６に記載されているのと実質的に同じアミノ酸配列はヒト重鎖可変ドメインまたはその実質的部分におけるＣＤＲ１、２および３として含有され、配列番号１、２および３に記載されているのと実質的に同じアミノ酸配列はヒト軽鎖可変ドメインまたはその実質的部分におけるそれぞれＣＤＲ１〜３として含有される。
可変ドメインは任意の生殖系列または再構成ヒト可変ドメインに由来することが可能であり、あるいは公知ヒト可変ドメインのコンセンサス配列に基づく合成可変ドメインであることが可能である。前段落で定義された、本発明のＣＤＲ由来配列は、組換えＤＮＡ技術を用いて、ＣＤＲ領域を欠く可変ドメインのレパートリー内に導入されうる。例えば、Ｍａｒｋｓら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９２，１０：７７９−７８３）は、可変ドメイン領域の５’末端またはその近傍に対するコンセンサスプライマーをヒトＶＨ遺伝子の第３フレームワーク領域に対するコンセンサスプライマーと共に使用して、１以上のＣＤＲを欠くＶＨ可変ドメインのレパートリーを得る、抗体可変ドメインのレパートリーの製造方法を記載している。Ｍａｒｋｓらは更に、このレパートリーがどのようにして特定の抗体のＣＤＲと組合されうるかを記載している。類似した技術を用いて、本発明のＣＤＲ由来配列は、１以上のＣＤＲを欠くＶＨまたはＶＬドメインのレパートリーとシャッフルされることが可能であり、シャッフルされた完全ＶＨまたはＶＬドメインはコグネイトＶＬまたはＶＨドメインと組合されて本発明の抗体を与えうる。ついで、適当な特異的結合メンバーが選択されうるよう、該レパートリーは適当な宿主系、例えばＷＯ９２／０１０４７のファージディスプレイ系において提示されうる。レパートリーは、１０４個以上のメンバー、例えば１０６〜１０８〜１０１０個のメンバーからのものよりなりうる。また、類似したシャッフリングまたは組合せ技術がＳｔｅｍｍｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ，１９９４，３７０：３８９−３９１）により開示されており、彼はβ−ラクタマーゼ遺伝子に関する技術を記載しているが、該アプローチが抗体の作製のために用いられうることを観察している。
もう１つの代替手段は、例えば、ｍＡｂ１７５ ＶＨまたはＶＬ ＣＤＲをコードする核酸のランダム突然変異誘発を用いて該ドメイン内に突然変異を作製して、本発明のＣＤＲ由来配列を含有する新規ＶＨまたはＶＬ領域を作製することである。そのような技術はＧｒａｍら（１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ，８９：３５７６−３５８０）により記載されており、彼はエラー頻発型ＰＣＲを用いた。用いられうるもう１つの方法は、突然変異誘発をＶＨまたはＶＬ遺伝子のＣＤＲ領域に導くことである。そのような技術はＢａｒｂａｓら（１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９１：３８０９−３８１３）およびＳｃｈｉｅｒら（１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：５５１−５６７）により開示されている。前記の全ての技術は当技術分野において自体公知であり、それ自体は本発明の部分を構成しない。当業者は、当技術分野における通常の方法を用いて本発明の特異的結合メンバーを得るために、そのような技術を用いうるであろう。
免疫グロブリン可変ドメインの実質的部分は少なくともそれらの３つのＣＤＲ領域を含むであろう。該可変ドメインの実質的部分のＮ末端またはＣ末端における追加的残基は、天然に存在する可変ドメイン領域に通常は付随していないものでありうる。例えば、組換えＤＮＡ技術により製造される本発明の抗体の構築は、クローニングまたは他の操作工程を促進するために導入されるリンカーによりコードされるＮ末端またはＣ末端残基の導入をもたらしうる。他の操作工程は、後記でより詳しく説明するとおり、免疫グロブリン重鎖、他の可変ドメイン（例えば、ジアボディの製造におけるもの）または他のタンパク質標識を含む他のタンパク質配列に本発明の可変ドメインを連結するためのリンカーの導入を含む。
本発明の好ましい態様においては、配列番号１、２、３、４、５および／または６に記載されているのと実質的に同じ配列に基づく１以上の結合ドメインを含む抗体が好ましいが、これらの配列のいずれかに基づく単一の結合ドメインは本発明の他の態様を構成する。配列番号６に記載されているのと実質的に同じ配列に基づく結合ドメインまたは配列番号４〜６のドメインの場合、そのような結合ドメインは腫瘍抗原に対する標的化物質として使用されうる。なぜなら、免疫グロブリンＶＨドメインは標的抗原に特異的に結合しうることが公知だからである。単一鎖特異的結合ドメインのいずれかの場合、これらのドメインは、本明細書に開示されているｍＡｂ１７５抗体と同様に良好な又は同等のインビボ特性を有する２−ドメイン特異的結合メンバーを形成しうる相補性ドメインに関してスクリーニングするために用いられうる。
これは、米国特許第５，９６９，１０８号に開示されているとおり、いわゆる階層的二重組合せアプローチを用いるファージディスプレイスクリーニング方法により達成可能であり、この場合、ＨまたはＬ鎖クローンを含有する個々のコロニーを使用して、他方の鎖（ＬまたはＨ）をコードするクローンの完全ライブラリーを感染させ、生じた２鎖特異的結合メンバーをファージディスプレイ技術（例えば、その参考文献に記載されているもの）に従い選択する。この技術もＭａｒｋｓら（同誌）に開示されている。
本発明の抗体は更に、抗体定常領域またはその一部を含みうる。例えば、配列番号１〜３に基づく抗体は、それらのＣ末端において、ヒトＣκまたはＣλ鎖を含む抗体軽鎖定常ドメインに結合されうる。同様に、配列番号４〜６に基づく抗体は、それらのＣ末端において、任意の抗体イソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤおよびＩｇＭ）およびイソタイプサブクラスのいずれか、特にＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ４に由来する免疫グロブリン重鎖の全部または一部に結合されうる。
マウスｍＡｂをキメラｍＡｂ（マウスＶ領域、ヒトＣ領域）に変換するための分子操作およびヒト化試薬（この場合、ｍＡｂ相補性決定領域（ＣＤＲ）のみがマウス由来である）の適用はｍＡｂ療法の臨床的成功のために決定的に重要である。操作されたｍＡｂは、著しく減少した免疫原性を有するか又は免疫原性を有さず、延長した血清半減期を有し、該ｍＡｂのヒトＦｃ部分は、補体および細胞毒性細胞の免疫エフェクターをリクルートする可能性を増加させる。体内分布、薬物動態、および臨床的に投与されたｍＡｂに対する免疫応答のいずれかの誘導に関する研究は、医薬タンパク質と内因性タンパク質とを識別するための分析の開発を要する。
該抗体またはその任意のフラグメントは、任意の細胞毒素、細菌または他の毒素（例えば、シュードモナス外毒素）、リシンまたはジフテリア毒素にコンジュゲート化または組換え的に融合されうる。使用される毒素の部分は、全毒素、または該毒素のいずれかの特定のドメインでありうる。そのような抗体−毒素分子は種々の種類の癌の標的化および療法のために成功裏に使用されている。例えば、Ｐａｓｔａｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９９７ Ｏｃｔ ２４；１３３３（２）：Ｃ１−６；Ｋｒｅｉｔｍａｎら，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２００１ Ｊｕｌ ２６；３４５（４）：２４１−７；Ｓｃｈｎｅｌｌら，Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２０００ Ｊａｎ；１４（１）：１２９−３５；Ｇｈｅｔｉｅら，Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００１ Ｊｕｌ；１８（３）：２５１−６８を参照されたい。
二重および三重特異的多量体は、異なるｓｃＦｖの結合により形成可能であり、腫瘍内へのＴ細胞リクルートメント（免疫療法）、ウイルス再標的化（遺伝子治療）のための架橋試薬として、および赤血球凝集試薬（免疫診断薬）として設計されている。例えば、Ｔｏｄｏｒｏｖｓｋａら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００１ Ｆｅｂ １；２４８（ｌ−２）：４７−６６；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０００；３２６：４６１−７９；ＭｃＣａｌｌら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１ Ｍａｙ １５；１６６（１０）：６１１２−７を参照されたい。完全ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖の大部分を含有するトランスジェニックマウスを免疫化することにより製造されうる。これらのマウスは当技術分野でよく知られており、それらのマウスの具体例としては、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（商標）（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．）（米国特許第６，０７５，１８１号および第６，１５０，５８４号）、ＨｕＭＡｂ−Ｍｏｕｓｅ（商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．／ＧｅｎＰｈａｒｍ）（米国特許第５５４５８０６号および第５５６９８２５号）、ＴｒａｎｓＣｈｒｏｍｏ Ｍｏｕｓｅ（商標）（Ｋｉｒｉｎ）およびＫＭ Ｍｏｕｓｅ（商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ／Ｋｉｒｉｎ）が挙げられる。また、抗体は、例えば、標準的なハイブリドーマ技術またはファージディスプレイにより製造されうる。したがって、これらの抗体は完全ヒトアミノ酸配列のみを含有するであろう。また、完全ヒト抗体は、ヒトライブラリーからファージディスプレイを用いて作製されうる。ファージディスプレイは、ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍらおよびＭａｒｋｓら（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ＨＲおよびＷｉｎｔｅｒ Ｇ．（１９９２）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２２７（２）：３８１−８；Ｍａｒｋｓ ＪＤら（１９９１）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２２２（３）：５８１−９７；そしてまた、米国特許第５８８５７９３号および第５９６９１０８号）に記載されているような当業者によく知られた方法を用いて行われうる。
治療用抗体および用途
本発明の抗体のインビボ特性、特に、腫瘍：血液比およびクリアランスの速度は、ｍＡｂ１７５に少なくとも比肩するものであろう。ヒトまたは動物対象への投与の後、そのような特異的結合メンバーは、＞１：１のピーク腫瘍：血液比を示すであろう。好ましくは、そのような比において、該特異的結合メンバーは、１：１より大きな、好ましくは２：１より大きな、より好ましくは５：１より大きな腫瘍：器官比をも有するであろう。好ましくは、そのような比において、該特異的結合メンバーは、腫瘍の部位から離れた器官において＜１：１の器官：血液比をも有するであろう。これらの比は、投与された特異的結合メンバーの異化および分泌の器官を除外している。
本発明の抗体は、検出可能な又は機能的な標識で標識されうる。検出可能な標識には、抗体イメージングの分野において公知の通常の化学法を用いて本発明の抗体に結合されうる同位体３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２１Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、２１１Ａｔ、１９８Ａｕ、６７Ｃｕ、２２５Ａｃ、２１３Ｂｉ、９９Ｔｃおよび１８６Ｒｅのような放射能標識が含まれるが、これらに限定されるものではない。標識には、蛍光標識、およびＭＲＩ−ＣＴイメージングのための当該分野で通常使用される標識も含まれる。それらには、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼのような酵素標識も含まれる。標識には更に、特異的コグネイト検出可能部分、例えば標識されたアビジンへの結合により検出されうる例えばビオチンのような化学的部分が含まれる。機能的標識には、腫瘍組織の破壊を引き起こすよう腫瘍の部位に標的化されるよう設計された物質が含まれる。そのような機能的標識には、細胞毒性薬、例えば５−フルオロウラシルまたはリシン、および酵素、例えば細菌カルボキシペプチダーゼまたはニトロレダクターゼ（これらは腫瘍の部位においてプロドラッグを活性薬に変換しうる）が含まれる。
１７５抗体およびそのサブユニットは或る診断用途を有しうる。それはらは、例えば、癌、前癌病変のような状態、過剰増殖性細胞増殖に関連した又はそれから生じる状態などを検出および／または測定する目的に利用されうる。放射能標識された１７５抗体およびそのフラグメントは、インビトロ診断技術およびインビボ放射能イメージング技術および放射免疫療法において有用である。インビボイメージングの場合、本発明の抗体は、例えば抗体分子がキレート化グループを介して多数の常磁性イオンでローディングされた磁気共鳴イメージ増強剤（これらに限定されるものではない）を含む、放射性同位体以外のイメージング剤（造影剤）にコンジュゲート化されうる。キレート化グループの具体例には、ＥＤＴＡ、ポルフィリン、ポリアミンクラウンエーテルおよびポリオキシムが含まれる。常磁性イオンの具体例には、ガドリニウム、鉄、マンガン、レニウム、ユロピウム、ランタニウム、ホルミウムおよびフェルビウムが含まれる。本発明のもう１つの態様においては、放射能標識された１７５抗体およびそのフラグメント、特に放射免疫コンジュゲートは、放射免疫療法において、特に癌治療のための放射能標識抗体として有用である。さらにもう１つの態様においては、放射能標識された１７５抗体およびそのフラグメントは放射免疫支援外科技術において有用であり、ここで、それらは、癌細胞、前癌細胞、腫瘍細胞および過剰増殖性細胞の存在および／または位置を、そのような細胞を除去するための手術の前、途中または後で特定し示しうる。本発明の１７５抗体およびそのフラグメントが他の分子または物質にコンジュゲート化または結合された、本発明の免疫コンジュゲートまたは抗体融合タンパク質には、化学的切除剤、毒素、免疫調節物質、サイトカイン、細胞毒性物質、化学療法剤または薬にコンジュゲート化された１７５抗体が含まれるが、これらに限定されるものではない。
放射免疫療法（ＲＡＩＴ）は既に診療所に導入されており、種々の抗体免疫コンジュゲートを使用して効力を示している。１３１Ｉ標識ヒト化抗癌胎児性抗原（抗ＣＥＡ）抗体ｈＭＮ−１４が結腸直腸癌において評価されており（Ｂｅｈｒ ＴＭら（２００２）Ｃａｎｃｅｒ ９４（４Ｓｕｐｐｌ）：１３７３−８１）、９０Ｙ標識を有する同じ抗体が髄様甲状腺癌において評価されている（Ｓｔｅｉｎ Ｒら（２００２）Ｃａｎｃｅｒ ９４（１）：５１−６１）。モノクローナル抗体を使用する放射免疫療法が非ホジキンリンパ腫および膵癌に関して評価されており報告されている（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ ＤＭ（２００１）Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｏｎｃｏｌ Ｈｅｍａｔｏｌ ３９（１−２）：１９５−２０１；Ｇｏｌｄ ＤＶら（２００１）Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｏｎｃｏｌ Ｈｅｍａｔｏｌ ３９（１−２）１４７−５４）。特定の抗体を使用する放射免疫療法は米国特許第６，３０６，３９３号および第６，３３１，１７５号にも記載されている。放射免疫支援手術（ＩＧＳ）も診療所に導入されており、抗ＣＥＡ抗体および腫瘍関連抗原に対する抗体を使用した場合などにおいて効力および有用性を示している（Ｋｉｍ ＪＣら（２００２）Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ９７（４）：５４２−７；Ｓｃｈｎｅｅｂａｕｍ Ｓら（２００１）Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｓｕｒｇ ２５（１２）：１４９５−８；Ａｖｉｔａｌ Ｓら（２０００）Ｃａｎｃｅｒ ８９（８）：１６９２−８；ＭｃＩｎｔｏｓｈ ＤＧら（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ １２（４）：２８７−９４）。
本発明の抗体は、任意の適当な経路、通常は血流もしくはＣＳＦ内への又は直接的に腫瘍の部位内への注射により、治療を要する患者に投与されうる。厳密な用量は、該抗体が診断用なのか治療量なのか、腫瘍のサイズおよび位置、該抗体の厳密な性質（全抗体、フラグメント、ジアボディなどであるかどうか）ならびに該抗体に結合した検出可能な又は機能的な標識の性質を含む多数の要因に左右される。放射性核種が治療に使用する場合、適当な最大１回量は約４５ｍＣｉ／ｍ２から最大で約２５０ｍＣｉ／ｍ２である。好ましい投与量は１５〜４０ｍＣｉの範囲であり、さらに好ましい投与量範囲は２０〜３０ｍＣｉ、または１０〜３０ｍＣｉである。そのような療法は骨髄または幹細胞置換を要するかもしれない。腫瘍イメージングまたは腫瘍治療のための典型的な抗体用量はＦ（ａｂ’）２形態の抗体０．５〜４０ｍｇ、好ましくは１〜４ｍｇの範囲となろう。裸抗体は、好ましくは、２０〜１０００ｍｇタンパク質／用量、または２０〜５００ｍｇタンパク質／用量、または２０〜１００ｍｇタンパク質／用量の用量で投与される。これは成人患者の単一治療のための用量であり、小児および乳児では、比例的に調節されることが可能であり、また、他の抗体形態では、分子量に比例して調節されうる。治療は、医師の判断により、毎日、週２回、毎週または毎月の間隔で反復されうる。これらの製剤は第２の結合性タンパク質、例えば前記のＥＧＦＲ結合性タンパク質を含みうる。特に好ましい形態においては、この第２の結合性タンパク質は、例えば前記の５２８または２２５のようなモノクローナル抗体である。
医薬組成物および治療用組成物
本発明の抗体は、通常、医薬組成物の形態で投与され、これは、該特異的結合メンバーに加えて、少なくとも１つの成分を含みうる。したがって、本発明の、および本発明に従い使用される医薬組成物は、有効成分に加えて、医薬上許容される賦形剤、担体、バッファー、安定剤または当業者によく知られている他の物質を含みうる。そのような物質は無毒性であるべきであり、有効成分の効力を妨げるべきではない。該担体または他の物質の厳密な性質は、経口経路または注射（例えば、静脈内）によるものでありうる投与経路に左右されるであろう。
経口投与用の医薬組成物は錠剤、カプセル剤、散剤または液体形態でありうる。錠剤は、固体担体、例えばゼラチン、または補助物質を含みうる。液体医薬組成物は、一般に、液体担体、例えば水、石油、動物もしくは植物油、鉱油または合成油を含む。生理食塩水、デキストロースもしくは他の糖溶液、またはグリコール、例えばエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールが含有されうる。
静脈内注射、または罹患部位における注射の場合、有効成分は、発熱物質を含有せず適当なｐＨ、等張性および安定性を有する非経口的に許容される水溶液の形態であろう。当業者は、例えば等張性ビヒクル、例えば食塩注射剤、リンゲル注射剤、乳酸添加リンゲル注射剤を使用して、適当な溶液を製造することが十分に可能である。必要に応じて、保存剤、安定剤、バッファー、抗酸化剤および／または他の添加剤も加えられうる。
組成物は、治療すべき状態に応じて、単独で、または他の治療、治療剤もしくは物質と組合せて同時もしくは連続的に投与されうる。また、本発明は、本明細書に記載されている結合メンバー、特に抗体またはそのフラグメント、および他の物質または治療剤、例えば抗癌物質または治療剤、ホルモン、抗ＥＧＦＲ物質または抗体、あるいは免疫モジュレーター（免疫調節物質）を含む組成物を想定しており、それを含む。より一般には、これらの抗癌物質は、チロシンキナーゼインヒビターまたはリン酸化カスケードインヒビター、翻訳後モジュレーター、細胞増殖または分裂インヒビター（例えば、抗有糸分裂物質）、あるいはシグナル伝達インヒビターでありうる。他の治療または療法は、適当な用量の鎮痛薬、例えば非ステロイド性抗炎症薬（例えばアスピリン、パラセタモール、イブプロフェンまたはケトプロフェン）またはオピエート、例えばモルヒネ、または制吐薬の投与を含みうる。該組成物は、チロシンキナーゼインヒビター（限定的なものではないが、ＡＧ１４７８およびＺＤ１８３９、ＳＴＩ５７１、ＯＳＩ−７７４、ＳＵ−６６６８が含まれる）、ドキソルビシン、テモゾロミド、シスプラチン、カルボプラチン、ニトロソウレア、プロカルバジン、ビンクリスチン、ヒドロキシ尿素、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド、シクロホスファミド、エピポドフィロトキシン、カルムスチン、ロムスチンおよび／または他の化学療法剤と組合せて（連続的（すなわち、前または後で）または同時に）投与されうる。例えば、これらの物質は抗ＥＧＦＲ特異的物質またはチロシンキナーゼインヒビター、例えばＡＧ１４７８、ＺＤ１８３９、ＳＴＩ５７１、ＯＳＩ−７７４、ＳＵ−６６６８であることが可能であり、あるいはより一般的な抗癌および抗腫瘍物質、例えばドキソルビシン、シスプラチン、テモゾロミド、ニトロソウレア、プロカルバジン、ビンクリスチン、ヒドロキシ尿素、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド、シクロホスファミド、エピポドフィロトキシン、カルムスチンまたはロムスチンでありうる。また、該組成物は、ホルモン、例えばデキサメタゾン、免疫モジュレーター（免疫調節物質）、例えばインターロイキン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、または免疫応答および癌細胞もしくは腫瘍の減少もしくは排除を刺激する他の増殖因子もしくはサイトカインと共に投与されうる。免疫モジュレーター、例えばＴＮＦは、８０６ ＥＧＦＲエピトープを認識しＴＮＦ受容体に結合する二重特異性抗体の形態の本発明のメンバーと組合されうる。該組成物は、抗ＥＧＦＲ抗体５２８、２２５、ＳＣ−０３、ＤＲ８．３、Ｌ８Ａ４、Ｙ１０、ＩＣＲ６２およびＡＢＸ−ＥＧＦ（これらに限定されるものではない）を含む他の抗ＥＧＦＲ抗体と共に投与されることが可能であり、あるいはそのような他の抗ＥＧＦＲ抗体との組合せを含みうる。
これまでに、抗ＥＧＦＲ抗体と組合されたドキソルビシンおよびシスプラチンのような物質の使用は抗腫瘍活性の増強を示している（Ｆａｎら，１９９３；Ｂａｓｅｌｇａら，１９９３）。ドキソルビシンとｍＡｂ５２８との組合せは、樹立されたＡ４３１異種移植片の完全な根絶をもたらしたが、いずれかの物質の単独での治療は一時的なインビボ増殖抑制をもたらしたに過ぎなかった（Ｂａｓｅｌｇａら，１９９３）。同様に、シスプラチンとｍＡｂ５２８または２２５のいずれかとの組合せも、十分に樹立されたＡ４３１異種移植片の根絶をもたらしたが、これは、いずれかの物質を使用した治療では観察されなかった（Ｆａｎら，１９９３）。
通常の放射線療法
また、本発明は、通常の放射線療法と組合された該抗体の使用のための治療用組成物を想定しており、それを含む。ＥＧＦ受容体を標的化する抗体での治療は通常の放射線療法の効果を増強しうることが示されている（Ｍｉｌａｓら，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０００ Ｆｅｂ：６（２）：７０１ ８，Ｈｕａｎｇら，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０００ Ｊｕｎ：６（６）：２１６６ ７４）。
該１７５抗体またはそのフラグメントと抗癌治療物質、特に抗ＥＧＦＲ治療物質（他の抗ＥＧＦＲ抗体を含む）との組合せが想定され、異種移植された腫瘍に対する有効な治療、特に相乗作用を示している。ＡＧ１４７８とｍＡｂ１７５との組合せはそのような典型的な組合せである。ＡＧ１４７８（４−（３−クロロアニリノ）−６，７−ジメトキシキナゾリン）はＥＧＦ受容体キナーゼの強力かつ選択的なインヒビターであり、米国特許第５，４５７，１０５号（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に詳細に記載されている（Ｌｉｕ，Ｗ．ら（１９９９）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１２：２４０９；Ｅｇｕｃｈｉ，Ｓ．ら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：８８９０；Ｌｅｖｉｔｓｋｙ，Ａ．およびＧａｚｉｔ，Ａ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：１７８２も参照されたい）。他の抗ＥＧＦＲ抗体、特に５２８抗ＥＧＦＲ抗体との１７５抗体の治療相乗作用が予想され想定される。
本発明は更に、本発明の治療方法の実施において有用な治療用組成物を含む。本発明の治療用組成物は、混合物中に、医薬上許容される賦形剤（担体）と、有効成分としての本明細書に記載されている１以上の抗体１７５またはそのフラグメントとを含む。好ましい実施形態においては、該組成物は、標的細胞との本結合メンバー／抗体の特異的結合をモジュレーションしうる抗原を含む。
有効成分としてポリペプチド、類似体または活性断片を含有する治療用組成物の製造は当技術分野において十分に理解されている。典型的には、そのような組成物は液体溶液または懸濁液としての注射剤として製造される。しかし、注射前に液体に溶解または懸濁するのに適した固体形態も製造されうる。また、該製剤は乳化されうる。該有効治療用成分は、しばしば、医薬上許容され該有効成分に適合した賦形剤と混合される。適当な賦形剤としては、例えば、水、食塩水（塩類液）、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組合せが挙げられる。また、所望により、該組成物は、該有効成分の有効性を増強する少量の補助物質、例えば湿潤または乳化剤、ｐＨ緩衝化剤を含有しうる。ポリペプチド、類似体または活性フラグメントは、中和された医薬上許容される塩形態として該治療用組成物中に配合されうる。医薬上許容される塩には、酸付加塩（該ポリペプチドまたは抗体分子の遊離アミノ基と共に形成されるもの）、および例えば塩酸もしくはリン酸のような無機酸または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と共に形成される塩が含まれる。遊離カルボキシル基から形成される塩は、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化第二鉄のような無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基からも誘導されうる。
治療用ポリペプチド、類似体または活性フラグメント含有組成物は通常、例えば単位用量の注射により、静脈内に投与される。本発明の治療用組成物に関して用いられる場合の「単位用量」なる語は、ヒトへの単位投与として適した物理的に分離している単位を意味し、各単位は、必要な希釈剤、すなわち、担体またはビヒクルと一緒になった、所望の治療効果を与えるよう計算された予め決められた量の活性物質を含有する。
該組成物は、投与製剤に適した様態で、治療的に有効な量で投与される。投与すべき量は、治療すべき対象、対象の免疫系が該有効成分を利用する能力、および望まれるＥＦＧＲ結合能の度合に左右される。投与するのに必要な有効成分の厳密な量は実施者の判断に左右され、各個体に特有のものである。しかし、適当な投与量は、１日当たり、個体の体重１キログラム当たり約０．１〜２０、好ましくは約０．５〜約１０、より好ましくは１〜数ミリグラムの有効成分の範囲でありうる。初期投与および追加投与のための適当な投与計画も様々となるが、初期投与、およびそれに続く、後続の注射または他の投与による１時間以上の間隔での反復投与が典型的である。あるいは、１０ナノモル濃度〜１０マイクロモル濃度の血中濃度を維持するのに十分な連続的静脈内注入が想定される。
経口投与用の医薬組成物は錠剤、カプセル剤、散剤または液体形態でありうる。錠剤は、固体担体、例えばゼラチン、または補助物質を含みうる。液体医薬組成物は、一般に、液体担体、例えば水、石油、動物もしくは植物油、鉱油または合成油を含む。生理食塩水、デキストロースもしくは他の糖溶液、またはグリコール、例えばエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールが含有されうる。静脈内注射、または罹患部位における注射の場合、有効成分は、発熱物質を含有せず適当なｐＨ、等張性および安定性を有する非経口的に許容される水溶液の形態であろう。当業者は、例えば等張性ビヒクル、例えば食塩注射剤、リンゲル注射剤、乳酸添加リンゲル注射剤を使用して、適当な溶液を製造することが十分に可能である。必要に応じて、保存剤、安定剤、バッファー、抗酸化剤および／または他の添加剤も加えられうる。
診断アッセイ
本発明はまた、異常に発現されたＥＧＦＲのような刺激の存在を、本発明の１７５抗体により認識されるその能力を参照することにより検出する方法を含む種々の診断用途に関する。本発明の抗体の診断用途には、当業者によく知られた及び標準的な及び本記載に基づくインビトロおよびインビボ用途が含まれる。ＥＧＦＲ状態（特にＥＧＦＲの異常発現に関するもの）のインビトロ査定および評価のための診断アッセイおよびキットは、患者のサンプル、例えば、癌、前癌状態、過剰増殖細胞増殖に関連した状態を有する又は有する疑いのあるもの、または腫瘍サンプルを診断、評価およびモニターするために利用されうる。ＥＧＦＲ状態の査定および評価は、薬物の臨床治験のための患者の適合性、または特定の化学療法剤もしくは本発明の特異的結合メンバー、特に抗体（その組合せを含む）の投与のための、異なる物質または抗体と比較した場合の患者の適合性の判定においても有用である。このタイプの診断モニターおよび評価は、乳癌におけるＨＥＲ２タンパク質に対する抗体（Ｈｅｒｃｅｐ Ｔｅｓｔ，Ｄａｋｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を利用して既に実施されており、この場合、該アッセイは、ヘルセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）を使用する抗体療法に関して患者を評価するためにも用いられる。インビボ用途には、腫瘍のイメージングまたは個体の癌状態の評価（ラジオイメージングを含む）が含まれる。
既に示唆されているとおり、本発明の診断方法は、ＥＦＧＲ／タンパク質に対するアンタゴニスト（例えば、抗ＥＦＧＲ抗体、好ましくは、本明細書に記載されているｍＡｂ１７５）の有効量を含むアッセイにより細胞サンプルまたは培地を検査することを含む。また、本発明において使用される抗ＥＦＧＲ抗体分子はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２もしくはＦ（ｖ）部分または全抗体分子の形態であることが好ましい。既に記載されているとおり、この方法から利益が得られうる患者には、癌、前癌病変、ウイルス感染、過剰増殖性細胞増殖または他の同様の病的障害に関連した又はそれらから生じる病状に罹患している患者が含まれる。
細胞内のＥＧＦＲの存在は、そのような決定に適用可能な通常のインビトロまたはインビボ免疫学的方法により確認されうる。多数の有用な方法が公知である。該方法およびその適用は当業者によく知られており、したがって、本発明の範囲内で利用されうる。そのような方法においては、ＥＧＦＲは１以上の抗体または結合パートナーとの複合体を形成し、該複合体のメンバーの１つは、検出可能な標識で標識される。複合体が形成されたこと、および所望により、その量は、標識の検出に適用可能な公知方法により決定されうる。これらの研究に最も一般的に使用される標識は、放射性元素、酵素、紫外線にさらされると蛍光を発する化学物質などである。多数の蛍光物質が公知であり、標識として使用されうる。これらには、例えば、フルオレセイン、ローダミン、オーラミン、テキサスレッド、ＡＭＣＡブルーおよびルシファー・イエロウ（Ｌｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ）が含まれる。ＥＧＦＲまたはＥＧＦＲ抗体１７５は放射性元素または酵素で標識されることも可能である。放射能標識は、現在利用可能な計数方法のいずれかにより検出されうる。好ましい同位体は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２１Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、２１１Ａｔ、１９８Ａｕ、６７Ｃｕ、２２５Ａｃ、２１３Ｂｉ、９９Ｔｃおよび１８６Ｒｅから選ばれうる。酵素標識も同様に有用であり、現在利用されている比色、分光光度、蛍光分光光度、電流測定または気体定量技術のいずれかにより検出されうる。該酵素は、例えばカルボジイミド、ジイソシアナート、グルタルアルデヒドなどのような架橋分子との反応により、選択された粒子にコンジュゲート化される。これらの方法において使用されうる多数の酵素が公知であり、使用可能である。好ましいのは、ペルオキシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ＋ペルオキシダーゼ、およびアルカリホスファターゼである。米国特許第３，６５４，０９０号、第３，８５０，７５２号、第４，０１６，０４３号が、例示として、代替的標識物質および方法のそれらの開示に関して参照される。
本発明のもう１つの実施形態においては、医学的専門家による使用に適した市販の試験キットは、疑われる標的細胞における、増幅ＥＧＦＲおよび／またはＥＧＦＲ突然変異（これらに限定されるものではない）を含むＥＧＦＲの異常発現の存在または非存在を決定するよう製造されうる。前記の試験技術に応じて、そのようなキットの１つのクラスは、少なくとも、標識されたＥＧＦＲまたはその結合パートナー、例えば、それに特異的な抗体（抗体１７５）、および、勿論、選択される方法に応じた説明、例えば「競合」、「サンドイッチ」、「ＤＡＳＰ」などを含有するであろう。該キットは、周辺試薬、例えばバッファー、安定剤などをも含有しうる。
したがって、試験キットは、ＥＧＦＲの異常発現または異常形態に関する細胞の存在または能力の実証のために製造されることが可能であり、
（ａ）検出可能な標識への１７５抗体またはそれに対する特異的結合パートナーの直接的または間接的結合により得られる少なくとも１つの標識された免疫化学的に反応性の成分の予め決められた量、
（ｂ）他の試薬、および
（ｃ）該キットの使用のための説明
を含みうる。
前記に従い、ＥＦＧＲの活性またはＥＧＦＲの異常発現および／または該抗体（特に１７５抗体）の活性もしくは結合をモジュレーションするのに有効な潜在的薬物をスクリーニングするためのアッセイ系が製造されうる。該受容体または該抗体を試験系内に導入することが可能であり、生じた細胞培養内に有望な薬物を導入することも可能であり、ついで該培養を検査して、その有望な薬物のみの添加による又は該既知物質の添加量の効果による該細胞のＳ期活性における変化を観察することが可能である。
核酸
本発明は更に、本発明の抗体１７５をコードする単離された核酸を提供する。核酸には、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。好ましい態様においては、本発明は、配列番号１、２、３、４、５および／または６に記載されているポリペプチドを含む前記の本発明のポリペプチドをコードする核酸を提供する。本発明はまた、前記の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むプラスミド、ベクター、転写または発現カセットの形態の構築物を提供する。本発明はまた、前記の１以上の構築物を含む組換え宿主細胞を提供する。提供されるそのもののいずれかの抗体１７５をコードする核酸は、該抗体のコード化核酸からの発現を含む該抗体の製造方法と同様に、本発明の１つの態様を構成する。発現は、該核酸を含有する組換え宿主細胞を適当な条件下で培養することにより簡便に達成されうる。発現による産生の後、特異的結合メンバーを、任意の適当な技術を用いて単離および／または精製し、ついで適宜、使用することが可能である。
本発明の抗体およびコード化核酸分子およびベクターは、例えばそれらの天然環境から単離および／または精製された形態、実質的に純粋または均一な形態、あるいは核酸の場合には、必要な機能を有するポリペプチドをコードする配列以外の核酸または遺伝子源を含有しない又は実質的に含有しない形態で提供されうる。本発明の核酸はＤＮＡまたはＲＮＡを含むことが可能であり、全体的または部分的に合成物でありうる。多種多様な宿主細胞におけるポリペプチドのクローニングおよび発現のための系がよく知られている。適当な宿主細胞には、細菌、哺乳類細胞、酵母およびバキュロウイルス系が含まれる。異種ポリペプチドの発現のための当技術分野で利用可能な哺乳類細胞系には、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、乳児ハムスター腎細胞、ＮＳＯマウスメラノーマ細胞およびその他多数が含まれる。一般的な好ましい細菌宿主は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような原核細胞における抗体および抗体フラグメントの発現は当技術分野において十分に確立されている。概説としては、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：５４５−５５１（１９９１）を参照されたい。特異的結合メンバーの製造のための選択肢として、培養内の真核細胞における発現も当業者に利用可能である。最近の概説としては、例えば、Ｒａｆｆ，Ｍ．Ｅ．（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．４：５７３−５７６；Ｔｒｉｌｌ ＪＪ．ら（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ６：５５３−５６０を参照されたい。プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および他の配列を適宜含む適当な調節配列を含有する適当なベクターが選択または構築されうる。ベクターは、適宜、プラスミド、ウイルス、例えばファージまたはファジミドでありうる。更なる詳細は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい。例えば核酸構築物の製造、突然変異誘発、配列決定、細胞内へのＤＮＡの導入および遺伝子発現における核酸の操作ならびにタンパク質の分析のための多数の公知技術およびプロトコールがＳｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９２に詳細に記載されている。Ｓａｍｂｒｏｏｋら及びＡｕｓｕｂｅｌらの開示を参照により本明細書に組み入れることとする。
したがって、本発明のもう１つの態様は、本明細書に開示されている抗体をコードする核酸を含有する宿主細胞を提供する。さらにもう１つの態様は、そのような核酸を宿主細胞内に導入することを含む方法を提供する。該導入には、任意の利用可能な技術が用いられうる。該導入の後、例えば該遺伝子の発現のための条件下で宿主細胞を培養することにより、該核酸からの発現が生じ、または該発現が可能となりうる。１つの実施形態においては、本発明の核酸は宿主細胞のゲノム（例えば、染色体）内に組み込まれる。組み込みは、標準的な技術に従い、該ゲノムとの組換えを促進する配列を含めることにより促進されうる。本発明はまた、前記のとおりに抗体またはポリペプチドを発現させるために発現系において前記の構築物を使用することを含む方法を提供する。
前記のとおり、本発明はまた、配列番号１、２、３、４、５および／または６に記載されているアミノ酸配列を有する抗体１７５またはそのフラグメントをコードする組換えＤＮＡ分子もしくはクローン化遺伝子またはそれらの縮重変異体、好ましくは核酸分子に関する。当技術分野でよく知られているとおり、ＤＮＡ配列は、適当な発現ベクター内の発現制御配列にそれを機能的に連結しその発現ベクターを使用して適当な単細胞宿主を形質転換することにより発現されうる。
発現制御配列の選択においては、通常、種々の要因が考慮される。これらには、例えば、該系の相対的強度、その制御可能性、および発現すべき特定のＤＮＡ配列または遺伝子とのその適合性（特に、潜在的二次構造に関するもの）が含まれる。適当な単細胞宿主は、例えば選択されたベクターとのその適合性、その分泌特性、タンパク質を正しくフォールディングするその能力およびその発酵要件、ならびに発現すべきＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質の宿主に対する毒性および発現産物の精製の容易さを考慮することにより選択される。これらの及び他の要因を考慮して、当業者は、発酵に際して又は大規模動物培養において本発明のＤＮＡ配列を発現する種々のベクター／発現制御配列／宿主組合せを構築しうるであろう。
類似体、例えばフラグメントは、例えば、抗体ペプチドまたは物質のペプシン消化により製造されうる。他の類似体、例えば突然変異タンパク質は、特異的結合メンバーをコードする配列の標準的な部位特異的突然変異誘発により製造されうる。抗体１７５様活性を示す類似体（例えば、小分子）は、プロモーターとして機能するのかインヒビターとして機能するのかには無関係に、公知のインビボおよび／またはインビトロアッセイにより特定されうる。１７５抗体をコードするＤＮＡ配列は、クローニングではなく合成的に製造されうる。完全配列は、標準的な方法により調製された重複オリゴヌクレオチドから構築され、完全なコード配列へと構築される。例えば、Ｅｄｇｅ，Ｎａｔｕｒｅ，２９２：７５６（１９８１）；Ｎａｍｂａｉｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２３：１２９９（１９８４）；Ｊａｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：６３１１（１９８４）を参照されたい。合成ＤＮＡ配列は、特異的結合メンバーの類似体または「突然変異タンパク質」を発現する遺伝子の簡便な構築を可能にする。あるいは、突然変異タンパク質をコードするＤＮＡは天然特異的結合メンバー遺伝子またはｃＤＮＡの部位特異的突然変異誘発により製造されることが可能であり、突然変異タンパク質は、通常のポリペプチド合成を用いて直接的に製造されることが可能である。タンパク質内への非天然アミノ酸の部位特異的組込みのための一般的方法はＣｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｊ．Ｎｏｒｅｎ，Ｓｐｅｎｃｅｒ Ｊ． Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ，Ｍｉｃｈａｅｌ Ｃ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｐｅｔｅｒ Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１８２−１８８（Ａｐｒｉｌ １９８９）に記載されている。この方法は、非天然アミノ酸を含有する類似体を作製するために使用されうる。
本発明は、本発明の例示として記載されている以下の非限定的な実施例を参照することにより、より良く理解されうる。以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態をより完全に例示するために記載されており、いかなる点においても、本発明の広範な範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
ｍＡｂ８０６およびｍＡｂ１７５からのＣＤＲに関するアミノ酸配列のアライメント。それらの２つの抗体の間の配列相違が太字で示されている。 ｍＡｂ１７５での細胞系および正常ヒト肝臓の免疫組織化学的染色。Ａ：ビオチン化ｍＡｂ１７５を使用して、Ａ４３１細胞（ｗｔＥＧＦＲを過剰発現する）、Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７細胞（Δ２−７ ＥＧＦＲを発現する）およびＵ８７ＭＧ（適度なレベルでｗｔＥＧＦＲを発現する）を含有する塊から調製された切片を染色した。Ｂ；ｍＡｂ１７５（左パネル）、イソタイプ対照（中央パネル）および二次抗体対照（右パネル）での正常ヒト肝臓（４００倍）の染色。特異的な洞様毛細血管または肝細胞染色は観察されなかった。 酵母上で提示されたＥＧＦＲの断片とのｍＡｂ８０６およびｍＡｂ１７５の反応性。Ａ：酵母提示ＥＧＦＲ断片のｍＡｂ１７５およびｍＡｂ８０６標識の平均蛍光シグナルを示す代表的フローサイトメトリーヒストグラム。酵母提示では、一部の細胞はその表面上にタンパク質を発現せず、２つのヒストグラムピークを与える。全ての断片は直鎖状Ｃ末端ｃ−ｍｙｃタグを含有するため、陽性対照として９Ｅ１０抗体が使用される。Ｂ：種々のＥＧＦＲ断片への抗体結合の要約。Ｃ：酵母ペレットを８０℃まで３０分間加熱することにより、ＥＧＦＲ断片を変性させた。全ての場合において、該ｃ−ｍｙｃタグは９Ｅ１０抗ｍｙｃ抗体により尚も認識されたが、このことは、熱処理が酵母表面提示タンパク質を損なわないことを示している。変性を確認するために、コンホメーション感受性ＥＧＦＲ抗体ｍＡｂ２２５を使用した。 脳および前立腺癌異種移植片に対するｍＡｂ１７５の抗腫瘍効果。Ａ：Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７異種移植片を担持するマウス（ｎ＝５）に、ＰＢＳ、１ｍｇのｍＡｂ１７５またはｍＡｂ８０６（陽性対照）を、２週間にわたって週３回、第６、８、１０、１３、１５および１７日に注射（ｉ．ｐ．）した。この場合、出発腫瘍体積は１００ｍｍ３であった。データは平均腫瘍体積±ＳＥとして表されている。Ｂ：細胞を２つの無関係な抗体（青色べた塗りおよび緑色中空）、全ＥＧＦＲに対するｍＡｂ５２８（桃色べた塗り）、ｍＡｂ８０６（薄青色中空）およびｍＡｂ１７５（オレンジ色中空）で染色し、ついでＦＡＣＳにより分析した。Ｃ：ＤＵ１４５細胞を細胞溶解し、ｍＡｂ５２８、ｍＡｂ８０６、ｍＡｂ１７５または２つの独立した無関係な抗体でのＩＰに付し、ついでＥＧＦＲに関する免疫ブロット法に付した。Ｄ：ＤＵ１４５異種移植片を担持するマウス（ｎ＝５）に、ＰＢＳ、１ｍｇのｍＡｂ１７５またはｍＡｂ８０６を、第１８〜２２日、２５〜２９日および３９〜４３日に毎日注射（ｉ．ｐ．）した。この場合、出発腫瘍体積は８５ｍｍ３であった。データは平均腫瘍体積±ＳＥとして表されている。 Ｆａｂフラグメントに結合したＥＧＦＲペプチド２８７−３０２の結晶構造。（Ａ）軽鎖（赤色）、重鎖（青色）、結合ペプチド（黄色）およびＥＧＦＲ由来の重ね合わされたＥＧＦＲ２８７−３０２（紫色）を含有するＦａｂ８０６のカートゥーン（ｃａｒｔｏｏｎ）。（Ｂ）軽鎖（黄色）、重鎖（緑色）、結合ペプチド（ライラック色）およびＥＧＦＲ（Ｄ１−３）由来の重ね合わされたＥＧＦＲ２８７−３０２（紫色）を含有するＦａｂ１７５のカートゥーン。（Ｃ）ＦＡｂ１７５に結合したペプチドに対する、ＥＧＦＲにおけるＥＧＦＲ２８７−３０２の類似性を示す（Ｂ）からの詳細。ペプチドバックボーンがＣαトレースとして示されており、相互作用性側鎖が小枝として示されている。Ｏ原子は赤色に、Ｎは青色に、Ｓはオレンジ色に着色されており、Ｃは主鎖として示されている。（Ｄ）空間的重複を示すＦａｂ１７５：ペプチド複合体とのＥＧＦＲの重ね合わせ。（Ｃ）と同様に着色されており、ＥＧＦＲ１８７−２８６の表面は青緑色に着色されている。（Ｅ）（Ｄ）に対する直交図であり、ＥＧＦＲ１８７−２８６は不透明な青色で示されており、軽鎖（オレンジ色）および重鎖（緑色）の表面は透明で示されている。（Ｆ）抗原結合部位を示す１７５Ｆａｂ複合体の詳細な立体図。（Ｃ）と同様に着色されており、側鎖水素結合が黒色の点線で示されている。複合体形成に際して埋もれた水分子が赤色の球体として示されている。 ＥＧＦＲへのｍＡｂ８０６結合に対する２７１−２８３シスチン結合の影響。Ａ：ｗｔＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ−Ｃ２７１Ａ、ＥＧＦＲ−Ｃ２８３ＡまたはＣ２７１Ａ／Ｃ２８３Ａ突然変異体でトランスフェクトされた細胞をｍＡｂ５２８（べた塗り桃色ヒストグラム）、ｍＡｂ８０６（青色線）または二次抗体のみ（紫色）で染色し、ついでＦＡＣＳにより分析した。クラスが釣り合わされた無関係な抗体を使用して、利得を設定した。Ｂ：ＥＧＦＲ−Ｃ２７１ＡまたはＣ２７１／２８３Ａ ＥＧＦＲを発現するＢａＦ３細胞を、「方法」に記載されているとおりのＭＴＴアッセイにおいて、ＥＧＦに対するそれらの応答に関して検査した。データ点のボルツマンフィットを用いて、ＥＣ５０を導出した。データは３回重複の測定の平均およびｓｄを表す。Ｃ：ｗｔまたはＥＧＦＲ−Ｃ２７１Ａ／Ｃ２８３Ａを発現するＢａＦ３をＩＬ−３および血清飢餓させ、ついでＥＧＦまたはビヒクル対照にさらした。全細胞ライセートをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、抗ホスホチロシン抗体（上パネル）または抗ＥＧＦＲ抗体（下パネル）での免疫ブロット法に付した。Ｄ：ｗｔ（左パネル）またはＣ２７１Ａ／Ｃ２８３Ａ（右パネル）ＥＧＦＲを発現するＢａＦ３細胞を、抗体の非存在下（中空の記号）またはｍＡｂ５２８（灰色の丸印）もしくはｍＡｂ８０６（黒色の三角）（共に１０μｇ／ｍｌ）の存在下、漸増濃度のＥＧＦで刺激した。データは３回重複の測定の平均およびｓｄとして表されている。 ＥＧＦＲへのｍＡｂ８０６結合に対する２７１−２８３シスチン結合の影響。Ａ：ｗｔＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ−Ｃ２７１Ａ、ＥＧＦＲ−Ｃ２８３ＡまたはＣ２７１Ａ／Ｃ２８３Ａ突然変異体でトランスフェクトされた細胞をｍＡｂ５２８（べた塗り桃色ヒストグラム）、ｍＡｂ８０６（青色線）または二次抗体のみ（紫色）で染色し、ついでＦＡＣＳにより分析した。クラスが釣り合わされた無関係な抗体を使用して、利得を設定した。Ｂ：ＥＧＦＲ−Ｃ２７１ＡまたはＣ２７１／２８３Ａ ＥＧＦＲを発現するＢａＦ３細胞を、「方法」に記載されているとおりのＭＴＴアッセイにおいて、ＥＧＦに対するそれらの応答に関して検査した。データ点のボルツマンフィットを用いて、ＥＣ５０を導出した。データは３回重複の測定の平均およびｓｄを表す。Ｃ：ｗｔまたはＥＧＦＲ−Ｃ２７１Ａ／Ｃ２８３Ａを発現するＢａＦ３をＩＬ−３および血清飢餓させ、ついでＥＧＦまたはビヒクル対照にさらした。全細胞ライセートをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、抗ホスホチロシン抗体（上パネル）または抗ＥＧＦＲ抗体（下パネル）での免疫ブロット法に付した。Ｄ：ｗｔ（左パネル）またはＣ２７１Ａ／Ｃ２８３Ａ（右パネル）ＥＧＦＲを発現するＢａＦ３細胞を、抗体の非存在下（中空の記号）またはｍＡｂ５２８（灰色の丸印）もしくはｍＡｂ８０６（黒色の三角）（共に１０μｇ／ｍｌ）の存在下、漸増濃度のＥＧＦで刺激した。データは３回重複の測定の平均およびｓｄとして表されている。 Ａ）声帯の転移性扁平上皮癌を有する患者における１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６の生体分布の全身ガンマカメライメージであり、右頸部（矢印）の腫瘍における定量的な高い取り込みを示している。血液プール活性および肝臓における遊離１１１Ｉｎの若干の異化も認められる。Ｂ）この患者の頸部のシングルフォトンエミッションコンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）イメージであり、生存可能な腫瘍（矢印）における１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６の取り込みを示しており、ここで、中央の取り込みの減少は壊死を示している。Ｃ）頸部の対応ＣＴスキャンであり、中央の壊死を伴う大きな右頸部腫瘍塊（矢印）を示している。 非係留型ＥＧＦＲ１−６２１の構造の立体モデル。受容体バックボーンは青色で、リガンドＴＧＦ−αは赤色でトレースされている。ｍＡｂ８０６／１７５エピトープは青緑色で、ジスルフィド結合は黄色で描かれている。該エピトープを該受容体内に固定するジスルフィド結合の原子は空間充填形態で示されている。該モデルは、係留型コンホメーションからのＥＧＦＲ−ＥＣＤ ＣＲ２ドメイン（１３）を、対応リガンドの存在下の繋ぎとめられていないＥＧＦＲ単量体の構造（１４）上に繋ぎとめることにより構築した。 ＥＧＦＲの断片とのｍＡｂ８０６の反応性。可溶性１−５０１ ＥＧＦＲ断片またはＧＨ／ＥＧＦＲ断片融合タンパク質（ＧＨ−２７４−５０１、ＧＨ−２８２−５０１、ＧＨ−２９０−５０１およびＧＨ−２９８−５０１）を発現するベクターでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞からのライセートをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、膜にトランスファーし、ｍＡｂ８０６（左パネル）または抗ｍｙｃ抗体９Ｂ１１（右パネル）での免疫ブロット法に付した。 実施例 本発明は、本発明の例示として記載されている以下の非限定的な実施例を参照することにより、より良く理解されうる。以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態をより完全に例示するために記載されており、いかなる点においても、本発明の広範な範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
概要
ＥＧＦＲは、２つの十分に特徴づけられたコンホーマー（係留型（ｔｅｔｈｅｒｅｄ）および非係留型（ｕｎｔｅｔｈｅｒｅｄ））として存在する。係留型コンホーマーは、リガンド非含有（そして部分的に連結された）形態の該受容体でのみ観察されており、非係留型の後部−後部二量体を形成するようリガンドにより誘導されうる。ｍＡｂ８０６は、細胞表面上の幾つかのトランケート化された、過剰発現された又は活性化された形態のＥＧＦＲ上のエピトープを認識するが、それは、正常な未刺激細胞上のＥＧＦＲを認識しない。もう１つの関連抗体であるｍＡｂ１７５もこの異常エピトープを認識する。本発明者らは、抗体ｍＡｂ８０６およびｍＡｂ１７５のＦａｂに結合したＥＧＦＲ２８７−３０２ペプチドエピトープの３Ｄ構造を決定した。該抗体の存在下、該ペプチドエピトープは、両方の形態の該受容体において見出されるものに非常に類似したコンホメーションをとる。しかし、ｗｔＥＧＦＲ構造へのｍＡｂ８０６またはｍＡｂ１７５抗体の結合は、係留型および非係留型コンホメーションの両方において、ＣＲ１ドメインとのＦａｂの有意な立体的衝突により抑制されるであろう。ＣＲ１ドメインの３Ｄコンホメーションの精査は、該エピトープの直前のジスルフィド結合の破壊が、いずれかの抗体の結合を可能にするのに十分な程度にＣＲ１ドメインを開くことを可能にすることを示唆した。システイン突然変異体ＥＧＦＲＣ２７１Ａ／Ｃ２８３ＡはｍＡｂ８０６およびｍＡｂ１７５に結合するだけでなく、その化学量論は１：１である（すなわち、ＥＧＦＲ Ｌ２リガンド結合ドメインを認識するｍＡｂ５２８と同等である）。ｍＡｂ８０６は、野生型ＥＧＦＲを発現する細胞のインビトロ増殖を抑制しないが、ｍＡｂ８０６は、ＥＧＦＲＣ２７１Ａ／Ｃ２８３Ａを発現するＢａＦ／３細胞のリガンド関連刺激を完全に抑制する。本発明者らの結果は、抗体ｍＡｂ８０６およびｍＡｂ１７５の結合のメカニズムが、該エピトープが受容体活性化中またはトランケート化もしくは過剰発現により優先的に露出されるＥＧＦＲの形態を要することを示している。したがって、他のＥＧＦＲ抗体とは対照的に、ｍＡｂ８０６は、該ＥＧＦＲを過剰発現する癌患者における腫瘍に優先的に局在する。作用メカニズムは、過剰発現された、トランケート化した又は活性化された形態のＥＧＦＲファミリー受容体を有する癌細胞の抗体／インヒビター殺傷を改善するための及び腫瘍を検出するための抗体の作製のための新規アプローチを示唆している。
重要性
ＥＧＦＲは多数のヒト腫瘍の増殖の刺激に関与している。治療用物質としてインヒビターおよびアンタゴニストが使用されているが、１つには、正常組織上のＥＧＦＲの阻害のため、そしてもう１つには、それらの物質の幾つかの限定された一時的作用のため（すなわち、Ａｂは、より長い作用を示す）、成功は限定されたものである。抗体Ｍａｂ８０６およびＭａｂ１７５は該受容体の異常コンホメーションを認識し、これは、しばしば、腫瘍細胞上では見出されるが、正常細胞上では見出されない。ＥＧＦＲ上のこれらの抗体の三次元結合部位は、それらの腫瘍特異性を説明する異常コンホメーションを識別する。これらの抗体は、他の抗ＥＧＦＲ物質と相乗的に作用して、マウスにおける顕著な腫瘍殺傷を誘発する。該抗体の放射能標識形態を使用した癌患者における初期結果は腫瘍選択性を証明している。
序論
ＥＧＦＲの、そのリガンドファミリーによる活性化の理解は困難なことであるが、遺伝的（１−３）、生物物理的（４−８）、そしてより最近では、結晶学的（９−１７）な素晴らしい研究が、ＥＧＦＲ細胞内チロシンキナーゼドメインを活性化するために必要な複雑な一連のコンホメーション変化および凝集事象の多くを明らかにしている（１８）。これらの複雑性のうち、溶液中では、ＥＧＦＲ細胞外ドメインは少なくとも２つの基本的コンホメーション、すなわち、不活性な係留型（ｔｅｔｈｅｒｅｄ）コンホメーションおよび活性な非係留型または伸長型（ｅｘｔｅｄｎｅｄ）リガンド結合「後部−後部」二量体をとることが明らかである。ＥＧＦＲは、癌に関連した最初の増殖因子受容体であった（１９；２０）。ＥＧＦＲは自己分泌リガンドにより活性化され（１９；２１；２２）、高い割合の進行神経膠腫においては、ＥＧＦＲ受容体細胞外ドメインがトランケート化され（２３；２４）、したがって活性化される。しばしば、ＥＧＦＲの活性化が悪性状態の維持に要求される。逆に、毛包およびブルンネル腺における少数の細胞を除き、成体生物においては、ＥＧＦＲは低レベルで発現され、成体期においては不活性である。
ＥＧＦＲを標的化するための２つの主要クラスの物質、すなわち、チロシンキナーゼインヒビター（ＴＫＩ）およびモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が開発されている。ゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）（ＺＤ１８３９）およびエーロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）（ＯＳＩ−７７４）のようなＴＫＩはＥＧＦＲのＡＴＰポケットに競合的に結合して、その活性化を抑制する。これに対して、ＥＧＦＲに対する抗体、例えばセツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）（Ｃ２２５）およびパニツムマブ（ＡＢＸ−ＥＧＦＲ）はリガンド結合を競合的に抑制し、それにより受容体活性化を妨げる。該インヒビターおよび抗体のクラスは共に、ある範囲のＥＧＦＲ依存性マウス異種移植モデルにおいて有意な抗腫瘍活性を示し（２５−２９）、どちらも、ＮＳＣＬ、膵臓、頭部および頸部ならびに結腸を含む選択された癌において承認されている（３０−３２）。これらのＥＧＦＲ治療剤に対する応答率は適度であるが、ＥＧＦＲ遮断に応答する可能性のある患者小集団の特定に成功すれば、該患者に関する結果が改善されうると期待されている。例えば神経膠腫においては、タルセバ（Ｔａｒｃｅｖａ）に対する応答は、神経膠腫において一般的に発現されるＥＧＦＲの細胞外トランケート化体であるΔ２−７ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｖＩＩＩとも称される）およびＰＴＥＮに関して二重陽性である患者の小集団にほぼ限定されるらしい（３３）。これらの治療用物質は有望さを示しているが、ＥＧＦＲ発現が有意である正常皮膚におけるこれらの物質の有意な取り込みから生じる、用量を限定する毒性、例えば皮疹のため、それらの使用は制限される。
多数の神経膠腫は、主としてＥＧＦＲ遺伝子の増幅により、ＥＧＦＲを過剰発現する（２３；２４）。神経膠腫におけるＥＧＦＲ遺伝子増幅は、エキソン２−７の切除（３４）、およびそれに続く、前記のＥＧＦＲのトランケート化され部分的に活性化されたΔ２−７ ＥＧＦＲ形態の発現（３５；３６）を招く突然変異事象にも関連している。Δ２−７ ＥＧＦＲは、エキソン１および８のスプライシングおよび唯一のグリシンの挿入から生じた、Ｎ末端における特有の融合ペプチドを含有する。この連結ペプチドに対する幾つかのモノクローナル抗体は既に記載されており（３４）、したがって、Δ２−７ ＥＧＦＲに特異的な潜在的治療用物質に相当する。本発明者らは、このトランケート化ＥＧＦＲを過剰発現する（内因性ＥＧＦＲファミリーメンバーを欠く３Ｔ３の変異体としての）ＮＲ６細胞を使用して、Δ２−７ ＥＧＦＲ特異的抗体のパネルを作製した。これらの抗体の幾つかは、Δ２−７ ＥＧＦＲへの確固たる結合を示す一方で、生理的レベルでは発現されず過剰発現されたｗｔＥＧＦＲにも結合する。これらの抗体のうちの最もよく記載されているもの、すなわち、ＭＡｂ８０６（３５；３７；３８）は、細胞表面上で１×１０５未満のＥＧＦＲを発現する細胞には結合しないようであるが、より高い発現レベルがｍＡｂ８０６反応性ＥＧＦＲの顕著な集団（全受容体集団の５〜１０％）を与える場合にのみ、そのような結合が生じるらしい（３５，３７，３８）。
後続のエピトープマッピング研究は、ＥＧＦＲが係留型から伸長型コンホメーションへと移行するにつれて、一時的に露出されるに過ぎない細胞外ドメイン上のアミノ酸２８７−３０２間の短いシステインループにｍＡｂ８０６が結合することを示した（２３；２８）。したがって、ｍＡｂ８０６の反応性は、該受容体の突然変異（例えば、Δ２−７ ＥＧＦＲ）、過剰発現または活性化の存在のような受容体非係留化のための有利な条件を有する細胞においてのみ見出される。ＥＧＦＲの過剰発現の場合、リガンド非依存的ＥＧＦＲ活性化およびグリコシル化の変化の両方の結果として増強された非係留が存在するらしい（３９）。これらの状態は腫瘍細胞においては一般的であるが、正常組織においては稀であり、したがって、ｍＡｂ８０６が正常組織より優先的に腫瘍細胞（例えば、肝臓）を標的化することが可能となる。実際、ｍＡｂ８０６のキメラ形態を使用した、本発明者らの最近完了した第Ｉ相臨床治験からの結果は、この抗体により標的化されるエピトープが正常組織上では露出されないが、ある範囲のＥＧＦＲ陽性腫瘍上では接近可能であることを示している（２８；４０）。異種移植片においては、ｍＡｂ８０６は、Δ２−７ ＥＧＦＲを発現するＵ８７ＭＧ神経膠腫細胞、およびこの突然変異を伴わないｗｔＥＧＦＲを過剰発現する或る範囲の他のモデルに対して確固たる抗腫瘍活性を示している（２８；４０）。さらに、ｍＡｂ８０６は、ＥＧＦＲキナーゼインヒビター（２７）および無関係なエピトープを有する抗体（４１）を含む他のＥＧＦＲ治療用物質と組合せて使用された場合に、動物モデルにおいて相乗的抗腫瘍活性を示す。
システイン残基２８７と３０２との間のＥＧＦＲアミノ酸配列は、ｍＡｂ８０６に結合するのに十分なものである。しかし、Δ２−７ ＥＧＦＲにおいて見出されるトランケート化はｍＡｂ８０６による結合のためのこのシステインループを明らかに露出させるが、ｍＡｂ８０６−ｗｔＥＧＦＲ結合のメカニズムは部分的に解明されているに過ぎない。ＥＧＦＲの結晶構造は完全長細胞外ドメインおよびＥＧＦＲ−ＥＣＤ１−５０１断片（リガンドに結合したもの）の両方に関して解明されている。これらの構造の分析は、ｍＡｂ８０６が、完全長ＥＣＤ構造において観察される係留型ＥＧＦＲ（１３）にも、ＥＧＦＲ−ＥＣＤ１−５０１（１４）またはＥＧＦＲ−ＥＣＤ１−６２１（４２）構築物で見られるリガンド結合非係留型後部−後部二量体にも結合し得ないことを明らかにする。したがって、本発明者らは、ｍＡｂ８０６が、不活性状態と活性状態との間に存在する部分的に非係留型である形態のｗｔＥＧＦＲに結合すると提示している。連結された非係留型ＥＧＦＲにｍＡｂ８０６が結合し得ないことは、受容体インターナリゼーションを妨げる条件下でｗｔＥＧＦＲ発現ＢａＦ／３細胞をＥＧＦと共にプレインキュベートすることにより、更に証明された。これらの条件下、より大きな割合のＥＧＦＲが、連結された後部−後部二量体を形成して、ｍＡｂ８０６結合を妨げるはずであり、これは、明らかに証明された観察である（４３）。しかし、確固たるＥＧＦＲ／リガンド自己分泌ループを有する細胞において生じうるような、定常状態におけるｍＡｂ８０６結合に対するリガンドの効果は不明である。興味深いことに、細胞表面ｗｔＥＧＦＲへのｍＡｂ８０６の結合は、免疫学的な意味において、該受容体のコンホメーションに依存的であるが、該エピトープはコンホメーション的（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）ではない。なぜなら、ｍＡｂ８０６はウエスタンブロットにおけるＥＧＦＲに対する優れたプローブであり、すなわち、それは該変性受容体を認識しうるからである。明らかに、エピトープ自体のコンホメーションではなく、ＥＧＦＲのコンホメーションにより決定される該エピトープへの接近可能性がｍＡｂ８０６結合に関する最も決定的な要因である。ＭＡｂ８０６は、プラスチックおよび表面プラズモン共鳴チップ上に固定化されたＥＧＦＲにも結合する（３７）。
この報告においては、本発明者らは、ｍＡｂ８０６と同様にして産生された他の抗体の生物活性、特異性およびエピトープをも記載する。これらの抗体の特有の特異性を理解するために、本発明者らは、ｍＡｂ８０６およびｍＡｂ１７５のＦａｂフラグメントに結合したｍＡｂ８０６ペプチドエピトープ（ＥＧＦＲ２８７−３０２）ならびに該遊離Ｆａｂフラグメントの３Ｄ構造を決定した。該受容体上のＥＧＦＲ２８７−３０２の配向および抗体に結合したこのペプチドのコンホメーションは、ｍＡｂ８０６が該ＥＧＦＲの特異的形態に結合しなければならないこと、およびこの形態が、係留型または伸長型コンホメーションのいずれかにおいて観察されるｗｔＥＧＦＲとは異なってフォールディングされなければならないことを証明した。点突然変異を用いて、本発明者らは、ＥＧＦＲ構造およびｍＡｂ８０６／１７５反応性に対する隣接システインループ（アミノ酸２７１−２８３）の影響を調べた。なぜなら、このループはこれらの抗体の結合を著しく制限するらしいからである。本発明者らは、確固たるＴＧＦ−α／ＥＧＦＲ自己分泌刺激ループを有する前立腺細胞系であるＤＵ１４５異種移植片に対するｍＡｂ８０６および１７５の効力、ならびに第Ｉ相環境における頭部および頸部癌患者への放射能標識ｍＡｂ８０６の結合を報告する（４４）。
結果
ｍＡｂ１７５の特異性
予備的結合研究は、ｍＡｂ１７５が、ｍＡｂ８０６に類似した、ＥＧＦＲに対する特異性を示すことを示唆した。ｍＡｂ８０６（ＩｇＧ２ｂ）およびｍＡｂ１７５（ＩｇＧ１）のＣＤＲ領域においては、それぞれにおいて僅か１つのアミノ酸相違が存在するだけで、アミノ酸配列はほぼ同一である（図１）。これらの相違の全ては側鎖の電荷およびサイズを維持するものである。明らかに、これらの抗体は、独立して生じている。
本発明者らは、ｍＡｂ１７５結合の特異性を分析するために１組の免疫組織化学的実験を行った。ｍＡｂ１７５は、ＥＧＦＲを過剰発現するＡ４３１異種移植片の切片（図２Ａ）およびΔ２−７ＥＧＦＲを発現するＵ８７ＭＧ．Δ２−７神経膠腫異種移植片の切片（図２Ａ）を染色する。これとは対照的に、ｍＡｂ１７５はＵ８７ＭＧ異種移植片切片を染色しない。Ｕ８７ＭＧ細胞系は、あまり高くないレベルの野生型ＥＧＦＲを発現するに過ぎず（図２Ａ）、検出可能なＥＧＦＲ自己分泌ループを有さない。最も重要なことに、ｍＡｂ１７５は正常ヒト肝臓切片には結合しない（図２Ｂ）。したがって、ｍＡｂ１７５はｍＡｂ８０６と同じ特異性を示すらしい。すなわち、それは、過剰発現された及びトランケート化されたヒトＥＧＦＲを検出するが、あまり高くないレベルで発現されたｗｔＥＧＦＲを検出しない。
ｍＡｂ１７５エピトープの特定
ｍＡｂ１７５は、アミノ酸６−２７３が欠失しているΔ２−７ＥＧＦＲおよびＥＧＦＲ１−５０１にも結合するため、ｍＡｂ１７５エピトープは残基２７４−５０１内に含有されているに違いない。ｍＡｂ８０６のエピトープの決定においては、本発明者らは、全てアミノ酸５０１で終結するヒトＧＨのカルボキシ末端に融合された一連のｃ−ｍｙｃタグ付きＥＧＦＲフラグメントを発現させた（４５；４６）。ｍＡｂ１７５はまた、ウエスタンブロットにおいて、２７４−５０１および２８２−５０１ ＥＧＦＲフラグメントの両方と反応したが、アミノ酸２９０または２９８から始まるフラグメントを検出しなかった（補足的な図９）。全てのＧＨ−ＥＧＦＲ融合タンパク質の存在は、ｃ−ｍｙｃ抗体９Ｅ１０を使用して確認された（補足的な図９）。したがって、ｍＡｂ１７５エピトープの重要な決定基はアミノ酸２９０の近くに位置する。最後に、ｍＡｂ８０６エピトープが欠失した２７４−５０１ ＥＧＦＲフラグメント（Δ２８７−３０２）は、ｍＡｂ１７５結合に関して陰性であったが（図９）、このことは、この領域がｍＡｂ１７５結合のほとんどを同様に決定したことを示唆している。
本発明者らは、ｍＡｂ１７５エピトープを更に特徴づけるためにもう１つのアプローチを用いた。ＥＧＦＲの細胞外ドメインを含むフラグメントを酵母の表面上で発現させ、フローサイトメトリーを用いて間接免疫蛍光によりｍＡｂ１７５結合に関して試験した。ｍＡｂ１７５は、Δ２−７ ＥＧＦＲの細胞外ドメインに対応する酵母フラグメント２７３−６２１を認識したが、フラグメント１−１７６、１−２９４、２９４−５４３、または４７５−６２１のいずれをも認識しなかった（図３Ａおよび３Ｂ）。したがって、ｍＡｂ１７５エピトープの少なくとも一部はアミノ酸２７４−２９４の領域内に含有されていなければならず、これは、ＥＧＦＲフラグメントを使用した本発明者らの免疫ブロット法のデータに符合する。ｍＡｂ１７５は該２７３−６２１の変性フラグメントに結合するため（図３Ｃ）、該エピトープは本質的に直鎖状でなければならない（補足的な図９）。ｍＡｂ８０６およびｍＡｂ１７５はＥＧＦＲの類似した領域およびコンホメーションを認識することは明らかである。
表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）を用いて、本発明者らは、ＥＧＦＲペプチド（２８７ＣＧＡＤＳＹＥＭＥＥＤＧＶＲＫＣ３０２（配列番号１４））へのｍＡｂ１７５の結合を調べた。アミン、チオール−ジスルフィド交換またはＰｍｓ−Ｓｅｒカップリング化学を用いて、ＥＧＦＲ２８７−３０２をバイオセンサー表面上に固定化した。後者の方法は該ペプチドを専らＮ末端システインを介して固定化する（４７）。ｍＡｂ１７５は全ての配向のＥＧＦＲ２８７−３０２に結合した（表１）。ＥＧＦＲ２８７−３０２に対するｍＡｂ１７５のアフィニティは、Ｐｍｓ−セリンカップリンに関する３５ｎＭから、アミンカップリングに関する１５４ｎＭまでの範囲であった。すべての場合において、ＥＧＦＲ２８７−３０２に対するｍＡｂ１７５の結合アフィニティは、ｍＡｂ８０６に関して得られたものより低かった（表１）。本発明者らはＥＧＦＲの２つの異なる細胞外フラグメントに対するｍＡｂ１７５のアフィニティも決定した。ｍＡｂ１７５は、該１−５０１フラグメントに、該ペプチドを使用して得られたものに類似したアフィニティで結合した（１６ｎＭ対３５ｎＭ）（表１）。予想どおり、係留型コンホメーションを形成しうる該１−６２１完全長細胞外ドメインに対するｍＡｂ１７５のアフィニティは遥かに低かった（１８８ｎＭ）。ｍＡｂ８０６およびｍＡｂ１７５はＥＧＦＲ２８７−３０２に対する類似したアフィニティを有するが、ｍＡｂ１７５は、ＥＧＦＲの細胞外ドメインに対する、より高いアフィニティを示すようである（表１）。明らかに、ｍＡｂ１７５エピトープはＥＧＦＲ２８７−３０２に含有され、ＥＧＦＲの細胞外ドメインに対する結合アフィニティはコンホメーションに依存的である。
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酵母の表面上で発現される２７３−６２１ ＥＧＦＲフラグメントの突然変異体のパネル（４５；４６）を使用して、ｍＡｂ１７５エピトープの構造を特徴づけした。ｍＡｂ１７５およびｍＡｂ８０６は該突然変異体に対するほぼ同一の反応性パターンを示した（表２）。２８７−３０２ジスルフィド結合の破壊はエピトープ反応性に対するそれほど大きくない影響を及ぼしたに過ぎなかった。なぜなら、該抗体はＣ２８７における全ての突然変異体に結合し、Ｃ３０２における全てではないが幾つかの突然変異体に結合したからである（表２）。ｍＡｂ１７５結合に重要なアミノ酸には、Ｅ２９３、Ｇ２９８、Ｖ２９９、Ｒ３００およびＣ３０２が含まれる（表２）。ｍＡｂ１７５は、突然変異体Ｖ２９９およびＤ２９７に対して、若干、より感受性であるらしいが、ｍＡｂ８０６も、これらの部位における幾つかの突然変異への結合の低下を示した（表２）。この場合もまた、ｍＡｂ１７５エピトープは、ｍＡｂ８０６により認識されるエピトープと実質的に同じであるらしい。
Figure 0005532486
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Δ２−７ＥＧＦＲまたはＥＧＦＲ自己分泌ループにより刺激された腫瘍異種移植片に対するｍＡｂ１７５の効力
本発明者らはＵ８７ＭＧ．Δ２−７神経膠腫異種移植片に対するｍＡｂ８０６およびｍＡｂ１７５のインビボ抗腫瘍活性を調べた。異種移植片を、抗体療法（２週間にわたり、示されている日の週３回）を開始する前に６日間樹立させた。この時点で、平均腫瘍体積は１００ｍｍ３であった（図４Ａ）。ｍＡｂ１７５処理は、ビヒクルまたはｍＡｂ８０６での処理と比較して、全体的な腫瘍増殖速度の減少を引き起こし、それは接種後第１９日に非常に有意であり（Ｐ＜０．０００１対対照およびＰ＜０．００２対ｍａ８０６）、この時点で、倫理的理由により該対照群を犠死させた。この時点の平均腫瘍体積は、ビヒクル、ｍＡｂ８０６およびｍＡｂ１７５に関して、それぞれ１５３０、３００および１００ｍｍ３であり（図４Ａ）、このことは、ｍＡｂ１７５が、Δ２−７ＥＧＦＲを発現する異種移植片に対する抗腫瘍活性を有することを証明している。
Ｕ８７ＭＧ細胞が約１×１０５ ＥＧＦＲ／細胞を発現するとしても、ｍＡｂ８０６は該表面ＥＧＦＲのいずれをも認識できず、驚くまでもなく、Ｕ８７ＭＧのインビボ増殖を抑制しない。さらに、これらの細胞はいずれのＥＧＦＲリガンドをも共発現しない。ＥＧＦＲエピトープが一過性に露出され、したがって、ＥＧＦＲ自己分泌ループを含有する細胞においてｍＡｂ８０６およびｍＡｂ１７５により認識されうるかどうかを試験するため。前立腺細胞系ＤＵ１４５は、Ｕ８７ＭＧ細胞において観察されるものに類似したレベルでｗｔＥＧＦＲを発現するが、Ｕ８７ＭＧ細胞とは異なり、ＤＵ１４５細胞はＴＧＦ−α遺伝子の増幅を含有し、したがってＥＧＦＲ／ＴＧＦ−アルファ自己分泌ループを示す。ｍＡｂ１７５および８０６は共に、ＦＡＣＳ分析により測定された場合にＤＵ１４５細胞に結合し（図４Ｂ）、共に、これらの細胞から抽出されたＥＧＦＲの小さな割合を免疫沈降させうる（図４Ｃ）。どちらの技術も、ｍＡｂ１７５の、より大きな結合を示したが、Ｌ２ドメインに結合するｍＡｂ５２８と比較した場合、ｍＡｂ１７５およびｍＡｂ８０６はこれらの細胞の表面上のＥＧＦＲの一部に結合するに過ぎない（図４Ｂおよび４Ｃ）。もう１つの前立腺細胞系（ＬｎＣａｐ）および結腸系（ＬＩＭ１２１５）（これらは共に、ＥＧＦＲ自己分泌ループをも含有する（２２；４８））で、同様の観察が認められた（データ非表示）。明らかに、ｍＡｂ８０６およびｍＡｂ１７５は、自己分泌刺激ループの存在下、細胞上のＥＧＦＲの小さな割合のみを認識しうる。
ｍＡｂ１７５およびｍＡｂ８０６は、ＤＵ１４５細胞において発現されるＥＧＦＲに対しては、Ｕ８７ＭＧ細胞において発現されるＥＧＦＲに対する場合より効果的に結合するため、本発明者らは、ヌードマウスにおいて増殖させたＤＵ１４５異種移植片におけるこれらの抗体の抗腫瘍活性を分析するための研究を行った。異種移植片を、療法（３週間にわたり、示されている日の週３回）を開始する前に１８日間樹立させた。この時点で、平均腫瘍体積は９０ｍｍ３であった（図４Ｄ）。ｍＡｂ１７５およびｍＡｂ８０６は共に、ＤＵ１４５異種移植片の増殖を抑制した。該対照群を第６７日に犠死させ、それは１１４５ｍｍ３の平均腫瘍体積を有し、これに対して、ｍＡｂ８０６およびｍＡｂ１７５群は、それぞれ６０５および８１５ｍｍ３の平均腫瘍体積を有していた（それぞれ、Ｐ＜０．００７および０．０２）（図４Ｄ）。
ｍＡｂ８０６およびｍＡｂ１７５のＦａｂフラグメントと接触しているＥＧＦＲ２８７−３０２の３Ｄ構造
ｍＡｂ８０６およびｍＡｂ１７５が、全てではないが幾つかのコンホメーションにおけるＥＧＦＲをどのように認識しうるかの分子的詳細を理解するために、酸化型ＥＧＦＲ２８７−３０２エピトープと複合体化した（それぞれ、２．０および１．５９オングストロームの分解能、図５Ａおよび５Ｂ）、および単独の（それぞれ、２．３および２．８オングストロームの分解能）、両方の抗体のＦａｂフラグメントの結晶構造を決定した。どちらの場合も、遊離および複合体化Ｆａｂ構造は実質的に同一であり、該ペプチドおよび該抗体のＣＤＲループのコンホメーションは十分に特徴づけられた（図５）。該エピトープはβ−リボン構造をとり、ここで、該リボンの一方の末端はＦａｂを向き、Ｖ２９９は抗原結合部位の中央部に埋もれている（図５Ｃ〜Ｅ）。これらの抗体が、遥かに長いポリペプチドに結合することに合致して、該エピトープの両末端は溶媒に露出される。
該エピトープに接触している２０個の抗体残基のうち、ｍＡｂ８０６とｍＡｂ１７５との間には僅か２つの置換のみが存在する（図１）。ｍＡｂ１７５接触残基は以下のとおりである：軽鎖Ｓ３０、Ｓ３１、Ｎ３２、Ｙ４９、Ｈ５０、Ｙ９１、Ｆ９４、Ｗ９６および重鎖Ｄ３２、Ｙ３３、Ａ３４、Ｙ５１、Ｓ５３、Ｙ５４、Ｓ５５、Ｎ５７、Ｒ５９、Ａ９９、Ｇ１００、Ｒ１０１。ｍＡｂ８０６接触残基は、軽鎖Ｎ３０および重鎖Ｆ３３に関する配列相違を伴うこと以外は同じである。ＥＧＦＲ２８７−３０２はペプチド残基２９３−３０２間の密接な接触によりＦａｂに結合し、該接触のほとんどは残基２９７と３０２との間で生じる。ＦａｂおよびＥＧＦＲ２８７−３０２の主鎖原子間の唯一の水素結合は残基３００および３０２におけるものである（図５Ｆ）。該エピトープ配列の認識は、残基Ｅ２９３（ＦａｂのＨ５０およびＲ１０１へ）、Ｄ２９３（Ｙ５１およびＮ５７へ）、Ｒ３００（Ｄ３２へ）およびＫ３０１（水素分子を介してＹ５１およびＷ９６へ）への側鎖水素結合により生じる。疎水性接触はＧ２９８、Ｖ２９９およびＣ３０２において生じる。
２９３と３０２との間のエピトープバックボーンのコンホメーションは、Ｆａｂ８０６およびＦａｂ１７５結晶において同一であった（これらの残基におけるＣα原子に関して、ｒｍｓ偏差＝０．４オングストローム）。該ペプチドのＮ末端（２８７−２９２）は、ジスルフィド結合により束縛されるものの、この領域における抗体構造およびコンホメーションにおいて有意な接触をなさない。しかし、Ｆａｂ８０６複合体におけるこのセグメントはやや無秩序であるらしい。より興味深いことに、該抗体と接触しているＥＧＦＲ２８７−３０２ペプチドのコンホメーションは、係留型または非係留型ＥＧＦＲ構造のバックボーンにおいて観察されるＥＧＦＲ２８７−３０２のコンホメーションに非常に密接に関連している（Ｌｉら，２００５；Ｇａｒｒｅｔｔら，２００２）。Ｆａｂ１７５複合体からのＥＧＦＲ２８７−３０２の場合、Ｃα位におけるｒｍｓ偏差は、それぞれ、０．６６および０．７５オングストロームである（図５）。
ｍＡｂ８０６およびｍＡｂ１７５によるＥＧＦＲの認識に関する更なる洞察を得るために、１５Ｎ標識酸化型ペプチドＥＧＦＲ２８７−３０２のコンホメーションを、溶液中、遊離状態および８０６ Ｆａｂの存在下のＮＭＲ分光法により研究した（詳細は補足データを参照されたい）。該遊離ペプチドの場合、共鳴を帰属し、ランダムコイルのものと比較した。本質的に、該遊離ペプチドは、天然ＥＧＦＲで見られるようなベータリボン（１４）ではなくランダムコイル構造をとった。該Ｆａｂを添加すると、共鳴シフトが観察された。しかし、Ｆａｂの添加の際に広がる有意な線から生じる弱いシグナルのため、および該複合体の結晶化の成功により、該Ｆａｂ８０６−エピトープ複合体の溶液構造をそれ以上は追及しなかった。しかし、明らかに、該ペプチドがｍＡｂ８０６（またはｍＡｂ１７５）のＦａｂフラグメントに結合する際、該Ｆａｂは、該天然受容体におけるそのペプチドと合致する該ペプチドのコンホメーションを選択または誘発するようである。
なぜ、ｍＡｂ８０６およびｍＡｂ１７５はＥＧＦＲの幾つかのコンホメーションのみを認識するのか。本発明者らは、ＥＧＦＲ２８７−３０２を重ね合わせることにより、ｍＡｂ１７５のＦａｂフラグメントをＥＧＦＲ（係留型および非係留型単量体）の細胞外ドメイン上に合体させた。Δ２−７様フラグメントの場合、該受容体との有意な立体的破壊は存在しなかった。非係留形態においては、埋もれたＦａｂの接近可能表面積は、実質的に、より大きかった（９２０オングストローム２；これに対して、係留型では５５０オングストローム２）。したがって、酵母発現突然変異体により示されているとおり（４５）、この抗原は該抗体の非ＣＤＲ領域と追加的な接触をなしうる。逆に、該Ｆａｂ上への全ＥＧＦＲエクトドメインの合体の場合には、該Ｆａｂの中央部を通って走る、および該エピトープに先行するＣＲ１ドメインの部分（残基１８７−２８６）との相当な空間的重複が存在する（図５Ｄ、Ｅ）。したがって、ＣＲ１ドメインは、係留型または非係留型コンホメーションにおいて、実質的に同じ構造を有するため、ｍＡｂ８０６またはｍＡｂ１７５はＥＧＦＲのいずれの形態にも結合し得ないであろう。明らかに、ｗｔＥＧＦＲの公知コンホメーションにおけるＣＲ１ドメインに対する該エピトープの配向と、エピトープ結合を許容する配向との間に相違が存在しなければならない。ＣＲ１ドメインの精査は、ＥＧＦＲ２８７−３０２に先行するジスルフィド結合（２７１−２８３）が、該エピトープへの接近を遮断するポリペプチドを拘束することを示した。このジスルフィドの破壊は、それが該抗体への直接的結合に関与しないとしても、ｍＡｂ１７５またはｍＡｂ８０６が該エピトープへの接近を達成しうるよう、ＣＲ１ドメインの部分的アンフォールディングを可能にすると予想されるであろう。
ＥＧＦＲ２７１−２８３ジスルフィド結合の破壊はｍＡｂ８０６結合を増強する
タンパク質におけるジスルフィド結合は構造的剛性の増強をもたらすが、いくつかの細胞表面受容体、特に、サイトカインおよび増殖因子においては、ジスルフィド結合の一時的破壊およびジスルフィド交換が該受容体の機能を制御しうる（４９）。これは、ｍＡｂ８０６およびｍＡｂ１７５がそれらの結合部位への接近を達成しうる１つのメカニズムであったため、本発明者らは、２７１位および２８３位のシステイン残基の一方または両方をアラニン残基へと突然変異させることにより（Ｃ２７１Ａ／Ｃ２８３Ａ）、該エピトープの接近可能性を増強することを試みた。完全長Ｃ２７１Ａ−、Ｃ２８３Ａ−またはＣ２７１Ａ／Ｃ２８３Ａ−ＥＧＦＲを発現しうるベクターをＩＬ−３依存性Ｂａ／Ｆ３細胞系内にトランスフェクトした。Ｃ２７１Ａ−およびＣ２７１Ａ／Ｃ２８３Ａ−ＥＧＦＲ突然変異体をｗｔＥＧＦＲと同等のレベルで発現した安定なＢａ／Ｆ３クローンを選択した（図６Ａ）。高レベルの突然変異体Ｃ２８３Ａ−ＥＧＦＲを発現するＢａ／Ｆ３細胞は観察されなかった。既に記載されているとおり、ｗｔＥＧＦＲはｍＡｂ８０６と良くは反応しないが、該突然変異体受容体はｍＡｂ５２８、ｍＡｂ８０６および抗ＦＬＡＧ抗体と同じくらい強く反応し、このことは、該受容体が細胞表面で発現され、正しくフォールディングされ、ｍＡｂ８０６に対するエピトープがそのような場合に完全に接近可能であることを示唆している。ｍＡｂ８０６がＣ２７１Ａ／Ｃ２８３Ａ突然変異体を、ｗｔＥＧＦＲより効率的に認識することを証明するために、本発明者らはｍＡｂ５２８の結合に対するｍＡｂ８０６の結合の比を決定した。ｗｔおよびＣ２７１Ａ／Ｃ２８３Ａ ＥＧＦＲは共に、Ｎ末端においてＦＬＡＧタグ化されているため、本発明者らはＭ２抗体へのｍＡｂ８０６およびｍＡｂ５２８の結合の比をも決定した。既に報告されているとおり、ｍＡｂ８０６は、Ｂａ／Ｆ３細胞の表面上で発現される全ｗｔＥＧＦＲの小さな割合を認識したに過ぎなかった（ｍＡｂ８０６／５２８結合比は０．０８である）（表３）。これとは対照的に、ｍＡｂ８０６は、細胞表面上で発現されるＣ２７１Ａ／Ｃ２８３Ａ突然変異ＥＧＦＲの実質的に全てを認識した（１．０１のｍＡｂ８０６／５２８結合比）（図６Ａおよび表３）。
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それらの２つのシステインの突然変異はＥＧＦ結合または受容体機能を損なわなかった。Ｃ２７１Ａ／Ｃ２８３Ａ ＥＧＦＲ突然変異体を発現するＢａＦ３細胞はＥＧＦの存在下で増殖する（図６Ｂ）。本発明者らは、Ｃ２７１Ａ／Ｃ２８３Ａ突然変異を発現する細胞におけるＥＧＦに関する用量反応曲線における左シフトを再現性よく観察したが、これは、該リガンドに対する、より高いアフィニティ、または該突然変異受容体に関するシグナリング能力の増強のいずれかを示唆している。ウエスタンブロット分析は、Ｃ２７１Ａ／Ｃ２８３Ａ突然変異体がｗｔＥＧＦＲに類似したレベルで発現され、ＥＧＦ刺激に応答してチロシンリン酸化されることを証明した（図６Ｃ）。他の細胞系におけるこれまでの研究に一致して、ｍＡｂ８０６は、ｗｔＥＧＦＲを発現するＢａ／Ｆ３細胞のインビトロＥＧＦ誘導性増殖には全く影響を及ぼさないが、ｍＡｂ５２８を遮断するリガンドはこれらの細胞のＥＧＦ誘導性増殖を完全に抑制する（図６Ｄ、左パネル）。これとは対照的に、ｍＡｂ８０６は、Ｃ２７１／２８３Ａ突然変異体を発現するＢａＦ３細胞におけるＥＧＦ誘導性増殖を完全に排除した（図６Ｄ、右パネル）。２７１−２８３システインループが破壊されると、ｍＡｂ８０６がより効果的に結合するだけでなく、一旦結合すると、ｍＡｂ８０６はリガンド誘導性増殖を妨げる。
頭部および頸部癌における第Ｉ相イメージング研究
報告されているとおり（４４）、８名の患者［１名の女性および７名の男性；平均年齢６１歳（範囲４４〜７５歳）］がこの第１相治験を完了した。患者８（この患者は原発性脳腫瘍を有していた）を除く全ての患者が参加基準を満たし、研究開始時点で全員が転移性疾患を有していた。腫瘍によるＡｂ取り込みが全患者で見られ、１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６（ｍＡｂ８０６のキメラ化形態）は腫瘍における迅速かつ高レベルの取り込みを示した（図７）。正常器官（肝臓、肺、腎臓および脾臓）からの１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６のクリアランスは用量レベル間の相違を示さなかった（４４）。特に、肝臓クリアランスは用量レベル間の相違を全く示さず、これは、ｃｈ８０６に関する、肝臓における飽和可能抗原区画を全く示していない。全肝臓取り込みは、最大で、注入直後の１４．４５±２．４３％ＩＤであり、注入後７２時間までに８．４５±１．６３％ＩＤに、そして注入後１週間までに３．１８±０．８７％ＩＤに減少した。これは、注入後の３日間以上にわたって肝臓において３０％ＩＤ以上（用量４０ｍｇの場合）に達することが示されているｗｔＥＧＦＲに対する抗体（ｅｇ２２５）の取り込み（５０）と好対照である。
１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６の測定ピーク腫瘍取り込みは注入の５〜７日後に生じた。患者１および３における定量的腫瘍取り込みの計算は、心血液プールに標的病変が接近していたため、および患者が動いたため、正確に行えなかった。腫瘍におけるピークｃｈ８０６取り込みは５．２１〜１３．７３×１０−３％ＩＤ／ｇｍ腫瘍組織の範囲であった。腫瘍における実際のｃｈ８０６濃度の計算は、（平均±ＳＤ）０．８５±０μｇ／ｇｍ（５ｍｇ／ｍ２）、０．９２±０μｇ／ｇｍ（１０ｍｇ／ｍ２）、３．８０±１．１０μｇ／ｇｍ（２０ｍｇ／ｍ２）および７．０５±１．４０μｇ／ｇｍ（４０ｍｇ／ｍ２）のピーク値を示した。
考察
ＥＧＦＲまたは関連ｅｒｂＢ２のレベルまたは活性が一定しない場合、ＥＧＦＲファミリーメンバーを標的化するセツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）およびヘルセプチン（ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）のような抗体は癌治療のための重要な選択肢である。これらの抗体の結合部位、標的受容体およびより最近では抗体：受容体複合体の両方の３Ｄ構造の決定が、これらの抗体がどのようにして受容体活性化に干渉するのかに関する我々の理解を深めている。これらの研究は、この受容体ファミリー上の他のエピトープの標的化が、癌治療を改善するために抗体の組合せを使用する新たな機会をつくりうることを示唆している。
残念ながら、現在利用可能な治療用抗ＥＧＦＲ抗体の全ては、実質的に全ての正常組織において発現されるｗｔＥＧＦＲを認識する。正常組織において発現されるＥＧＦＲは該抗体の大きな溜り場となるだけでなく、それは、観察される用量限定性毒性（例えば、皮疹）において決定的に重要であり、抗体／細胞毒性コンジュゲートの使用を不可能にする可能性がある。これらの問題にもかかわらず、ほとんどの正常組織は活性化ＥＧＦＲを欠き、したがって、中和性抗ＥＧＦＲ抗体は必須の恒常性シグナリングに対して顕著な効果を与えないらしいことに注目すべきである。これとは対照的に、多数の腫瘍は、自己分泌／傍分泌メカニズム、トランケート化、突然変異、遺伝子増幅および／または過剰発現により活性化ＥＧＦＲを含有する。重要なことに、活性化ＥＧＦＲは、腫瘍細胞の細胞運動、増殖、浸潤、血管新生および生存を促進することにより、腫瘍形成に関与するようである。したがって、抗ＥＧＦＲ抗体またはＥＧＦＲキナーゼインヒビターの投与は腫瘍細胞の増殖および生存を低下させうる。Δ２−７ ＥＧＦＲにおける特有の連結ペプチドに対する抗体は、正常組織取り込みに関連した問題を伴うことなく、いくつかの腫瘍を標的化する能力を有する（５１）。神経膠腫においては、Δ２−７ ＥＧＦＲの発現は、ｍＡｂ８０６またはｍＡｂ１７５により抑制されるはずであるが他のΔ２−７ ＥＧＦＲ抗体によっては抑制されないｗｔＥＧＦＲの過剰発現を伴う。
これまでに、本発明者らは、Δ２−７ ＥＧＦＲを発現する細胞に対して産生させた抗体ｍＡｂ８０６を記載している。ｍＡｂ８０６はこのトランケート化受容体に結合するだけでなく、過剰発現したｗｔＥＧＦＲにも結合する。ｍＡｂ８０６は、Δ２−７ ＥＧＦＲにおいては接近可能であるが細胞上で及びリガンドの非存在下で低ないし中等度レベルで発現されるｗｔＥＧＦＲにおいては接近可能ではないシステインループ（アミノ酸２８７−３０２）内に含有されるエピトープを認識する。同様に、ＥＧＦＲの精製された完全長細胞外ドメイン（ＥＧＦＲ１−６２１）。この抗体に対するエピトープは、活性状態の形成中にコンホメーション変化を受けるＥＧＦＲ細胞外ドメインのヒンジ領域付近に存在することが判明した。さらに、不活性コンホメーションにおいて埋もれているエピトープだけではなく、それも、リガンドが結合した後部−後部非係留型ＥＧＦＲ二量体において接近不可能であるらしい。ｍＡｂ８０６の魅力的な特性に促されて、本発明者らは、初期融合体から単離されたモノクローナル抗体を発現する他のハイブリドーマを再分析した（３８）。予備スクリーニングにおいては、これらのｍＡｂ１７５の１つが、ｍＡｂ８０６に類似したＥＧＦＲ結合特性を有するようであった。それらのＣＤＲループ内のアミノ酸配列は著しく類似しており（９０％の配列同一性）、これらの相違は関連側鎖のサイズおよび電荷を維持するものである。ｍＡｂ８０６と同様に、ｍＡｂ１７５は、ＥＧＦＲを過剰発現する又はΔ２−７ ＥＧＦＲを発現する腫瘍細胞を染色するが、あまり高くないレベルのｗｔＥＧＦＲを含有する細胞（例えば、ヒト肝臓）を染色しない。詳細なエピトープマッピングは、ｍＡｂ１７５が、ｍＡｂ８０６と同じシステインループに結合することだけでなく、それが、このループ内に点突然変異を含有する一連の突然変異体に対するほぼ同じ結合プロファイルを有することをも示した。さらに、いずれの抗体も、エピトープジスルフィド結合が結合のために無傷であることを要しなかった。
ｍＡｂ８０６およびｍＡｂ１７５は共に、Δ２−７ ＥＧＦＲを発現するヒト神経膠腫異種移植片に対する抗腫瘍活性を有し、共に、腫瘍増殖における有意な遅延を誘発し、このモデルにおいて、ｍＡｂ１７５は、若干、より強力であるようであった。興味深いことに、ｍＡｂ８０６およびｍＡｂ１７５は、ＤＵ１４５前立腺細胞（これは、あまり高くないレベルのＥＧＦＲを発現するが、有意な量のＴＧＦ−αを自己分泌様態で分泌する細胞系である（５２））上で発現されるＥＧＦＲに結合する。ＥＧＦＲを過剰発現する細胞系の場合と同様に、どちらの抗体もＤＵ１４５細胞上の表面ＥＧＦＲの小さな割合に結合するに過ぎない。しかし、どちらの抗体もヌードマウスにおけるＤＵ１４５異種移植片の増殖を抑制する。したがって、生理的条件下でのリガンドの存在は、これらの抗体により認識されるＥＧＦＲの移行形態の利用可能性を増加させ、この形態の標的化は、ＥＧＦＲにより駆動される細胞増殖をダウンレギュレーションするのに十分である。
このクラスの抗ＥＧＦＲ抗体は、最初に予想されたものより一層広範な抗腫瘍作用を有する可能性がある。さらに、他のＥＧＦＲ治療剤（４１）と組合せて使用された場合のｍＡｂ８０６の相乗活性は、このクラスの抗体に関する直接的な治療的役割を示唆している。また、ｍＡｂ８０６は、ＥＧＦＲキナーゼを活性化する癌関連突然変異を含有する腫瘍細胞に結合する。ｍＡｂ８０６およびｍＡｂ１７５は、活性化ＥＧＦＲを有する細胞に選択的に結合し、現在承認されているＥＧＦＲ治療剤に応答する可能性のある患者を特定および／またはモニターするための有用な試薬でありうる。
ＥＧＦＲ２８７−３０２エピトープでの本発明者らの構造研究は、ｍＡｂ８０６およびｍＡｂ１７５が共に、同じ３Ｄ構造モチーフを認識したことを示している。ｍＡｂ８０６およびｍＡｂ１７５と接触しているペプチド残基は、どちらの場合でも、ほとんど同一の構造を示したが、このことは、これが、生成抗原であるΔ２−７ ＥＧＦＲにおいて見出されるこれらのアミノ酸のコンホメーションであることを示唆している。実際、該抗体／ペプチド構造において見られるＥＧＦＲ２８７−３０２のペプチドバックボーンは、ＥＧＦＲ構造の両方の公知コンホメーションにおいて見出されるものと厳密に一致する。しかし、抗体８０６がｗｔＥＧＦＲに結合しないという実験的観察に合致して、これらの構造におけるエピトープの配向は関連アミノ酸への抗体の接近を妨げるであろう。ＥＧＦＲ構造の詳細な精査はもう１つの興味深い可能性を提起した。ＥＧＦＲ２８７−３０２エピトープは第２のジスルフィドループ（アミノ酸２７１−２８３）から垂れ下がっており、このジスルフィド結合の破壊は、該エピトープのバックボーンコンホメーションを変化させることなく、ＥＧＦＲ２８７−３０２ループへの接近を可能にするはずである（図８を参照されたい）。Ｃ２７１Ａ／Ｃ２８３Ａ ＥＧＦＲ突然変異体での本発明者らの結果は、該突然変異受容体にｍＡｂ８０６および１７５が化学量論的に結合するのを可能にするようＣＲ１ドメインが開かなければならないことを示している。この突然変異受容体は尚も天然コンホメーションをとりうる。なぜなら、それはＥＧＦ刺激に完全に応答性であるが、ｗｔＥＧＦＲとは異なり、ｍＡｂ８０６により完全に抑制されるからである。
ｗｔＥＧＦＲを過剰発現する細胞の表面上に、ｍＡｂ８０６またはｍＡｂ１７５結合のためにＥＧＦＲ２８７−３０２エピトープが接近可能である受容体小集団が明らかに存在する。接近は受容体活性化中に最も容易に生じるが、この受容体小集団が非係留形態へのコンホメーション転移中のものであるのか、あるいは非係留形態からリガンド活性化状態への転移中のものであるのか、あるいは２７１と２８３との間のジスルフィド結合が損なわれた（還元された）ＥＧＦＲ小集団における不完全な酸化が存在するのかどうかは、未だ明らかでない。ＥＧＦＲの還元形態が癌細胞の表面上に存在する場合、それは活性であり、細胞シグナリングを始動しうる可能性があることを、本発明者らのデータは明らかに示している。受容体小集団に結合するのみであり、ＥＧＦＲの下流のシグナリングを抑制しないにもかかわらず、ｗｔＥＧＦＲを過剰発現する異種移植片の増殖をｍＡｂ８０６が抑制しうることは、依然として謎である。この理由により、異常なシグナリング特性を有する特有のＥＧＦＲ小集団にｍＡｂ８０６が結合するという概念は、特に、他のＥＧＦＲ治療剤とのその非常に大きな相乗作用を考えると、常に魅力的なものである。それが癌細胞の細胞表面上に存在する場合、２７１−２８３ジスルフィドにおいて還元されたＥＧＦＲはＥＧＦＲのこの特有の形態に相当しうるであろう。最後に、Δ２−７ＥＧＦＲにおける欠失は非常に大きいが、それはアミノ酸２７３で終わることが想起されるべきである。Δ２−７ ＥＧＦＲはこのジスルフィド結合を欠き、ｗｔＥＧＦＲとは異なるシグナリング特性を有することが公知である。一方、ＥＧＦＲの活性化キナーゼ突然変異、自己分泌ループおよび過少グリコシル化も、おそらくは２７１−２８３ジスルフィドの破壊を要することなく、該受容体の活性化を増強することにより、ｍＡｂ８０６反応性を増強する。ＥＧＦＲ活性化中の幾つかの点においてＥＧＦＲ２８７−３０２への接近を可能にするようＣＲ１ドメインがねじれうるが、ＣＲ１ドメインは係留およびリガンド結合形態におけるねじれから保護されるという概念を、これらの観察は支持している。本発明者らは現在、ｍＡｂ８０６により認識されるＥＧＦＲが還元型２７１−２８３ジスルフィド結合を含有するのかどうかを決定するための継続中の研究を行っているところである。
キメラ化８０６（ｃｈ８０６）の本発明者らの第Ｉ相治験の結果の分析は、ｍＡｂ８０６により標的化されるエピトープが腫瘍特異的であることを証明した。定量的体内分布分析は腫瘍におけるｃｈ８０６の迅速かつ特異的な取り込み明らかに示している。これらのデータは、癌細胞上で発現される抗原への抗体の最高の定量的標的化に合致しており、同等の用量におけるｗｔＥＧＦＲ抗体の値より著しく優れている（４４；５０）。全ての正常組織（肝臓を含む）におけるｃｈ８０６の取り込みは低かったが、これは、正常組織におけるｗｔＥＧＦＲへの結合の証拠を示すものではなく、また、肝臓においては、それは遊離１１１Ｉｎ−キレートの僅かな異化および血液プール活性に相当したに過ぎなかった。これは、大きなタンパク質用量が投与されたにもかかわらず（３００ｍｇまで）（５０）、注入後７２時間以上維持される肝臓における非常に高い取り込み（２０〜３０％ＩＤ）を有することが示されているｗｔＥＧＦＲを標的化する抗体（ｅｇ２２５；Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）とは著しく異なる。また、ｗｔＥＧＦＲに対する抗体は、腫瘍取り込みが明白になる前に正常組織を飽和させるためには大きな負荷用量を要し（５０）、皮膚および腸におけるｗｔＥＧＦＲへの抗体結合からの用量限定性毒性をも有する（５３）。これらの結果は、ｍＡｂ８０６がヒトにおける正常組織を標的化しないことを示しており、体内分布の定量的分析は、インビボでｍＡｂ８０６により標的化されるＥＧＦＲエピトープの腫瘍特異性を証明している。
ｍＡｂ８０６またはｍＡｂ１７５から誘導された抗体でのＥＧＦＲ２８７−３０２エピトープの標的化は、正常組織における最低限度の取り込みを伴って癌細胞における活性化ＥＧＦＲを攻撃するための１つの方法である。該受容体の活性化は、癌に関連したメカニズムの多くから生じうる。また、おそらくは最も重要なことに、これらの抗体は、細胞毒、治療用ナノ粒子、ｓｉＲＮＡおよび放射性同位体を腫瘍部位へ直接的に標的化するために使用されうる。最後に、これらの研究は、ｍＡｂ８０６およびｍＡｂ１７５が、細胞表面上のＥＧＦＲ活性化に関連した事象をマッピングするのを助けるための重要な手段であることを証明している。
抗体が異常および活性化形態の増殖因子受容体を認識しうるが不活性野生型受容体を認識し得ないのはどのようにして生じるのかを分子レベルで理解する場合、この研究は、癌治療のための他の標的、例えば、ＥＧＦＲファミリーの他のメンバーに対する抗体を作製するために用いられうる。１つの方法は、抗体ｍＡｂ８０６およびｍＡｂ１７５に化学量論的に結合するジスルフィド突然変異体ＥＧＦＲ−Ｃ２２７Ａ／Ｃ２８３Ａを使用しうるであろう。ＥＧＦＲに関して見られるコンホメーションの乱れが、ｅｒｂＢ２、ｅｒｂＢ３またはｅｒｂＢ４が連続的に過剰発現または活性化された場合にも生じれば、これらの受容体の相同ジスルフィド突然変異体は、腫瘍に対する選択性を有する他のＥＧＦＲファミリーメンバー標的化抗体を作製するための免疫原として作用しうる。さらに、腫瘍細胞が他の受容体、特に、ジスルフィドに富むドメインを含有するもの（例えば、Ｔｒｋ）を過剰発現する場合、これらの受容体の一部は、過少グリコシル化または一時的に破壊されたジスルフィド結合のため、部分的にミスフォールディングしうる。ジスルフィド突然変異体またはトランケート化受容体は、他の異常発現受容体を認識する抗体を潜在的に作製するために免疫原と同様に使用されうると考えられる。
実験方法
細胞系
Δ２−７ ＥＧＦＲでトランスフェクトされたＵ８７ＭＧ，Δ２−７（５４）およびＡ４３１細胞系（２）は既に記載されている。ホルモン非依存性前立腺細胞系ＤＵ１４５（５５）はＡＴＣＣ（ａｔｃｃ．ｏｒｇ）から入手した。該細胞系の増殖条件に関しては、補足的データを参照されたい。
抗体、Ｆａｂおよびペプチド
ｍＡｂ８０６およびｍＡｂ１７５はＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ｌｕｄｗｉｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ）において製造され精製された。該抗体、抗体フラグメントおよびペプチドエピトープの製造および特徴づけに関しては、補足的データを参照されたい。
哺乳類細胞および酵母において発現されたＥＧＦＲフラグメントを使用するＡｂ１７５のマッピング
補足的データに記載されているとおりにマッピングを行った。
表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）
ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００を全ての実験に使用した。５μｌ／分の流速でアミン、チオールまたはＰｍｓカップリングを用いて、推定ｍＡｂ８０６エピトープを含有するペプチドをＣＭ５センサーチップ上に固定化した（４７）。ｍＡｂ８０６およびｍＡｂ１７５を２５℃で５μｌ／分の流速で該センサー表面上を通過させた。各実施の間に、１０ｍＭ ＨＣｌを１０μｌ／分の流速で注入することにより、該表面を再生させた。
免疫沈降およびウエスタンブロット
細胞を細胞溶解バッファー（１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，５００ｍＭ ４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド，１５０ｎＭ アプロチニン，１ｍＭ Ｅ−６４プロテアーゼインヒビター，０．５ｍＭ ＥＤＴＡ，および１ｍＭ ロイペプチン，ｐＨ７．４）で２０分間細胞溶解し、１４，０００×ｇで３０分間の遠心分離により清澄化し、５μｇ／ｍｌの最終濃度の関連抗体で６０分間免疫沈降させ、セファロースＡビーズにより一晩捕捉した。ついでサンプルを２×ＮｕＰＡＧＥ ＳＤＳサンプルバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で溶出し、ＮｕＰＡＧＥゲル（３〜８％または４〜１２％）上で分離し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐトランスファーメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上にエレクトロトランスファーし、関連抗体でプローブした後、化学発光ラジオグラフィーにより検出した。
免疫組織化学
凍結切片を５μｇ／ｍｌ ｍＡｂ１７５または無関係なイソタイプ対照で室温で６０分間染色した。Ｄａｋｏ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ＋ＨＲＰ検出系を製造業者の説明に従い使用して、結合抗体を検出した。最後に、切片を水で洗浄し、ヘマトキシリンで対比染色し、マウントした。
異種移植モデル
１００μＬのＰＢＳ中のＵ８７ＭＧ．Δ２−７細胞（３×１０６）を４〜６週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｒｅ，Ｐｅｒｔｈ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）の両脇腹に皮下接種した。全ての研究は、既に報告されている確立された腫瘍モデル（４１）を使用して行った。適当な図面説明に示されている平均体積に腫瘍が達したら、治療を開始した。式（長さ×幅２）／２（ここで、長さは最長軸であり、幅は垂直測定値であった）を用いて、ｍｍ３単位の腫瘍体積を決定した。データは各治療群ごとに平均腫瘍体積±ＳＥとして表されている。片側スチューデントｔ検定により有意性に関して全てのデータを分析し、ここで、ｐ＜０．０５を、統計的に有意であるとみなした。この研究計画はＡｎｉｍａｌ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａｕｓｔｉｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌにより承認されたものであった。
ＥＧＦＲ突然変異構築物を発現する安定細胞系の作製および特徴づけ
（ｗｔ）ＥＧＦＲの突然変異を、部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して作製した。各突然変異誘発のための鋳型はヒトＥＧＦＲ ｃＤＮＡ（アクセッション番号ｘ００５８８）（２）であった。該ＥＧＦＲ突然変異の完全性を確認するために、各構築物の自動ヌクレオチド配列決定を行った。野生型および突然変異（Ｃ１７３Ａ／Ｃ２８１Ａ）ＥＧＦＲをＢａＦ／３細胞内にエレクトロポレーションによりトランスフェクトした。該細胞系の特徴づけに関する更なる詳細は補足的データに示されている。
Ｆａｂ１７５およびＦａｂ８０６、Ｆａｂ−ペプチド複合体の結晶構造決定ならびに溶液中の８０６ペプチドエピトープのＮＭＲ構造
Ｆａｂ８０６、Ｆａｂ１７５および個々のＦａｂ−ペプチド複合体を製造および分析するための結晶学的方法ならびに溶液中の１５Ｎ標識８０６エピトープペプチドのＮＭＲ研究に関する詳細は補足的データに記載されている。分子置換および精密化（以下のとおりに収束するもの）により構造を決定した：Ｆａｂ８０６に関してはＲ＝０．２２５／Ｒｆｒｅｅ＝０．２８９およびＦａｂ８０６：ペプチドに関してはＲ＝０．２２６／Ｒｆｒｅｅ＝０．２７９；Ｆａｂ８０６に関してはＲ＝０．２１０／Ｒｆｒｅｅ＝０．３０５およびＦａｂ８０６：ペプチドに関してはＲ＝０．２０３／Ｒｆｒｅｅ＝０．２５７。
患者におけるｃｈＡｂ８０６腫瘍の体内分布
インビボでのｍＡｂ８０６の腫瘍特異性を示すために、キメラ形態（ｃｈ８０６）を操作し、ｃＧＭＰ条件下（５６）で製造した。８０６陽性腫瘍を有する患者におけるｃｈ８０６の安全性、体内分布および免疫応答を評価するために、第Ｉ相初回人体治験を行った。安全性、体内分布および薬物動態学の結果は既に報告されている（４４）。患者における正常組織（すなわち、肝臓）と比較した腫瘍におけるｃｈ８０６の特異性を定めるために、腫瘍および肝臓におけるｃｈ８０６の定量的取り込みを、５〜７ｍＣｉ（２００〜２８０ＭＢｑ）の１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６の注射後１週間にわたって得た全身ガンマカメライメージからの１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６の％注射用量（ＩＤ）の計算により行った。肝臓および腫瘍線量測定の計算を、累積活性の計算を可能にするバックグラウンドおよび減衰に関して補正された各患者の１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６注入イメージデータセットにおける関心領域に基づいて行った。注射後１週間にわたる腫瘍および肝臓における１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６の濃度を導き出すために、線量測定計算を行った。
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補足的データ
実験方法
細胞系
全ての細胞系を、１０％ ＦＣＳ（ＣＳＬ，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ）、２ｍＭ グルタミン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）およびペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ）を含有するＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）内で維持した。また、４００ｍｇ／ｍｌのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ）内でＵ８７ＭＧ．Δ２−７細胞系を維持した。種々のＥＧＦ受容体を発現するＢａＦ／３（ｌ）およびＢａＦ／３細胞系（２）を、１０％ ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）および１０％ ＷＥＨＩ−３Ｂ馴らし培地（３）（ＩＬ−３源としてのもの）で補足されたＲＰＭＩ １６４０（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）内に常法により維持した。全ての細胞系を、空気／ＣＯ２（９５％〜５％）雰囲気中、３７℃で増殖させた。
抗体およびペプチド
抗体の作製。マウス線維芽細胞系ＮＲ６ΔＥＧＦＲを免疫原として使用した。アジュバント中の５×１０５〜２×１０６ 細胞でＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下に２〜３週間間隔で５回免疫化することにより、マウスハイブリドーマを作製した。初回注射には、完全フロイントアジュバントを使用した。ついで不完全フロイントアジュバント（Ｄｉｆｃｏ）を使用した。免疫化マウスからの脾細胞をマウス骨髄腫細胞系ＳＰ２／０と融合させた。新たに作製されたクローンの上清を赤血球吸着アッセイにおいて細胞系ＮＲ６、ＮＲ６ｗｔＥＧＦＲおよびＮＲ６ΔＥＧＦＲとの反応性に関してスクリーニングし、ついでヒト神経膠芽細胞腫細胞系Ｕ８７ＭＧ、Ｕ８７ＭＧｗｔＥＧＦＲおよびＵ８７ＭＧΔＥＧＦＲでの赤血球吸着アッセイにより分析した。
無傷ｍＡｂ（５０ｍｇ）を、ＰＢＳ中、活性化パパイン（１：２０の比）で３７℃で２〜３時間消化し、該パパインをヨードアセトアミドで不活性化した。ついで該消化を２０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８．０）中のプロテインＡセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ）のカラムに通過させ、Ｍｏｎｏ−Ｓカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用するカチオン交換によりフロースルーを更に精製した。ついで、１０，０００ＭＷＣＯ遠心濃縮装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、タンパク質を濃縮した。Ｆａｂ−ペプチド複合体の場合、モル過剰の凍結乾燥ペプチドを該Ｆａｂに直接的に加え、４℃で２時間インキュベートした後、結晶化実験を準備した。
哺乳類細胞において発現されたＥＧＦＲフラグメントを使用するｍＡｂ１７５のマッピング
これらのフラグメントでのトランスフェクションの前日に、ヒト２９３Ｔ胎児腎線維芽細胞を、２ｍｌの培地を含有する６ウェル組織培養プレート内に、８×１０５／ウェルで播いた。製造業者の説明に従いＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と複合体化された３〜４μｇのプラスミドＤＮＡで細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの２４〜４８時間後、細胞培養を吸引し、細胞単層を２５０μｌの細胞溶解バッファー（１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，１０％ グリセロール，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４），１ｍＭ ＥＧＴＡおよびＣｏｍｐｌｅｔｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ））中で細胞溶解した。細胞ライセートのアリコート（１０〜１５μｌ）を、１．５％ β−メルカプトエタノールを含有するＳＤＳサンプルバッファーと混合し、１００℃で５分間の加熱により変性させ、１０％ ＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で電気泳動させた。ついでサンプルをニトロセルロースメンブレンにエレクトロトランスファーし、それをＴＢＳＴバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１００ｍＭ ＮａＣｌおよび０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０）中で洗浄し、２．５％脱脂乳を含有するＴＢＳＴ中で室温で３０分間ブロッキングした。メンブレンを、ブロッキングバッファー中、０．５μｇ／ｍｌのｍＡｂ１７５と共に４℃で一晩インキュベートした。ｃ−ｍｙｃエピトープを検出するために、並行メンブレンをｍＡｂ９Ｂ１１（１：５０００，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｓｅｔｓ）でプローブした。メンブレンをＴＢＳＴ中で洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｂｉｏｒａｄ）を１：５０００の希釈度で含有するブロッキングバッファー中で室温で２時間インキュベートした。ついでブロットをＴＢＳＴ中で洗浄し、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）とのインキュベーションの後、オートラジオグラフィーフィルムを使用して現像した。
哺乳類細胞および酵母において発現されたＥＧＦＲ断片を使用するｍＡｂ１７５のマッピング
増殖ホルモンに融合された、残基２７４、２８２、２９０および２９８から始まり全てアミノ酸５０１で終わる一連の重複ｃ−ｍｙｃタグ化ＥＧＦＲエクトドメイン断片をは、既に記載されている（６）。
酵母細胞表面上でのＥＧＦＲタンパク質の発現を、既に記載されているとおり（７）に行った。簡潔に説明すると、形質転換されたコロニーを、酵母窒素塩基、カゼイン加水分解物、デキストロースおよびリン酸バッファー（ｐＨ７．４）を含有する最少培地内で、５〜６のＯＤ６００に達するまで約１日間、振とうプラットフォーム上、３０℃で増殖させた。ついで酵母細胞を、ガラクトースを含有する最少培地に移すことにより、タンパク質提示のために誘導し、３０℃で２４時間、振とうしながらインキュベートした。ついで培養を、分析するまで４℃で保存した。ｃ−ｍｙｃモノクローナル抗体９Ｅ１０を含有する腹水原液をＣｏｖａｎｃｅ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）から入手した。１×１０６個の酵母細胞を氷冷ＦＡＣＳバッファー（１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含有するＰＢＳ）で洗浄し、抗ｃ−ｍｙｃ腹水（１：５０希釈）またはヒトＥＧＦＲモノクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌ）と共に５０μｌの最終容量中、４℃で１時間インキュベートした。ついで該細胞を氷冷ＦＡＣＳバッファーで洗浄し、フィコエリトリン標識抗マウスＩｇＧ（１：２５希釈）と共に５０μｌの最終容量中、遮光条件下、４℃で１時間インキュベートした。該酵母細胞を氷冷ＦＡＣＳバッファーで洗浄した後、蛍光データをＣｏｕｌｔｅｒ Ｅｐｉｃｓ ＸＬフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）で得、ＷｉｎＭＤＩサイトメトリーソフトウェア（Ｊ．Ｔｒｏｔｔｅｒ，Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）で分析した。直線エピトープかコンホメーションエピトープかの決定のために、酵母細胞を８０℃で３０分間加熱し、ついで氷上で２０分間冷却した後、抗体で標識した。表２に挙げられている一連のＥＧＦＲ突然変異体は既に記載されている（８）。
ＥＧＦＲ突然変異構築物を発現する安定細胞系の作製および特徴づけ
ＥＧＦＲ突然変異体を発現する細胞系の作製
突然変異ＥＧＦＲを発現する安定細胞系をネオマイシン含有培地内での選択により得た。最終選択後、ｍＲＮＡを各細胞系から単離し、逆転写し、ＥＧＦＲ配列をＰＣＲにより増幅した。発現されたＥＧＦＲ内の全ての突然変異を、該ＰＣＲ産物を配列決定することにより確認した。５％ ＦＣＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ＰＢＳ中で１０μｇ／ｍｌの抗ＥＧＦＲ抗体ｍＡｂ５２８（９；１０）を使用し、ついでＡｌｅｘａ ４８８標識抗マウスＩｇ（１：４０００の最終希釈度）を使用して、ＦＡＣＳｔａｒ（Ｂｅｃｔｏｎ ａｎｄ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）でのＦＡＣＳ分析により、ＥＧＦＲ発現のレベルを決定した。クラスが釣り合った無関係な一次抗体と共に該細胞をインキュベートすることにより、バックグラウンド蛍光を決定した。ＲＰＭＩ，１０％ ＦＣＳ、１０％ ＷＥＨＩ３Ｂ馴らし培地および１．５ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８中、全ての細胞を常法により継代した。
突然変異ＥＧＦＲのＥＧＦ依存的活性化
ｗｔＥＧＦＲまたはＣ２７１Ａ／Ｃ２８３Ａ−ＥＧＦＲを発現する細胞を洗浄し、血清もＩＬ−３も含有しない培地内で３時間インキュベートした。細胞を遠心分離により集め、ＥＧＦ（１００ｎｇ）または同等容量のＰＢＳを含有する培地に再懸濁させた。１５分後、細胞を集め、ペレット化し、β−メルカプトエタノールを含有するＳＤＳ／ＰＡＧＥサンプルバッファー中で直接的に細胞溶解した。サンプルをＮｕＰＡＧＥ ４〜１２％ 勾配ゲル上で分離し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ ＰＶＤＦメンブレン上にトランスファーし、抗ホスホチロシン（４Ｇ１０，Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）または抗ＥＧＦＲ抗体（ｍＡｂ８０６，ＬＩＣＲにて製造）でプローブした。化学発光を用いて、反応性バンドを検出した。
細胞増殖に対するＥＧＦおよび抗体の効果
対数期で増殖している細胞を集め、ＰＢＳで２回洗浄して残存ＩＬ−３を除去した。細胞をＲＰＭＩ １６４０＋１０％ ＦＣＳに再懸濁させ、担体のみ又は漸増濃度のＥＧＦを伴う１０５ 細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播いた。適当な場合には、一定濃度のｍＡｂ５２８またはｍＡｂ８０６（２μｇ／ウェル）をも該培地に加えた。ＭＴＴアッセイ（１１）を用いて、増殖を決定した。
コンホメーション特異的抗体との反応性
細胞を遠心分離により集め、対照または試験抗体（全て、ＦＡＣＳバッファー中、１０μｇ／ｍｌ、氷上で４０分間、ＦＡＣＳバッファー中で洗浄）、ついでＡｌｅｘａ４８８標識抗マウスＩｇＧ（１：４００の最終希釈度、氷上で２０分間）で染色した。該細胞を氷冷ＦＡＣＳバッファーで洗浄し、遠心分離により集め、ＦＡＣＳｃａｎで分析し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（Ｂｅｃｔｏｎ ａｎｄ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）における統計ツールを使用してピーク蛍光チャネルおよび蛍光中央値を各サンプルに関して決定した。バックグラウンド（陰性対照）蛍光を全測定値から導き出した。蛍光中央値を、ピーク形状および蛍光強度を最もよく代表するものとして選択し、ｍＡｂ８０６対ｍＡｂ５２８結合の比を導き出すために用いた。
１７５および８０６Ｆａｂ、Ｆａｂ−ペプチド複合体の結晶構造決定ならびに溶液中の８０６ペプチドエピトープのＮＭＲ構造の
１０ｍｇ／ｍｌ Ｆａｂ、ならびに０．１Ｍ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．６）、６〜８％ ＰＥＧ６０００および１５〜２０％ イソプロパノールを含有するレザバーを使用して、懸滴蒸気拡散（ｈａｎｇｉｎｇ ｄｒｏｐ ｖａｐｏｕｒ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）により、天然８０６Ｆａｂの結晶を成長させた。データ収集のために、０．１Ｍ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．６）、１０％ ＰＥＧ６０００、１５〜２０％ イソプロパノールおよび１０％ グリセロールを含有する凍結防止剤溶液に結晶を移した。ついで結晶をナイロンループにおいてマウントし、直接的に液体窒素中で瞬間冷凍した。
１０ｍｇ／ｍｌ Ｆａｂ−ペプチド複合体、ならびに０．２Ｍ 酢酸ナトリウム、１６〜１８％ ＰＥＧ５，０００モノメチルエーテルを含有する貯蔵器を使用して、懸滴蒸気拡散（ｈａｎｇｉｎｇ ｄｒｏｐ ｖａｐｏｕｒ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）により、８０６ Ｆａｂ−ペプチド複合体の結晶を成長させ、ついで種入れ（ｓｅｅｄｉｎｇ）技術により結晶の質を改善した。データ収集のために、２５％ グリセロールで補足されたレザバーよりなる凍結防止剤溶液に結晶を移した。ついで結晶をナイロンループにおいてマウントし、直接的に液体窒素中で瞬間冷凍した。
１７５ Ｆａｂ−ペプチド複合体の結晶を、まず、Ｔｏｐａｚ結晶化系（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）を使用する自由境界拡散（ｆｒｅｅ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）により成長させた。同様の条件で７ｍｇ／ｍｌ Ｆａｂ、０．１Ｍ ビス−トリスプロパンバッファー、０．２Ｍ 酢酸アンモニウムおよび１８％ ＰＥＧ １０，０００を使用する懸滴蒸気拡散（ｈａｎｇｉｎｇ ｄｒｏｐ ｖａｐｏｕｒ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）により、微結晶を成長させた。ついで微結晶を０．１５ｍ ギ酸ナトリウムおよび１５％ ＰＥＧ １５００中へのストリークシーディングにより改良して、小さな板状結晶を得た。データ収集のために、２５％ グリセロールで補足されたレザバーよりなる凍結防止剤溶液に結晶を移した。ついで結晶をナイロンループにおいてマウントし、直接的に液体窒素中で瞬間冷凍した。
ＡＸＣＯ光学装置を備えたＲｉｇａｋｕ ｍｉｃｒｏｍａｘ−００７ジェネレーター上のＲ−ＡＸＩＳ ＩＶ検出器を使用して、８０６ Ｆａｂおよび１７５ Ｆａｂ複合体結晶に関する回折データを社内で集め、ついでこれらのデータを、ＣｒｙｓｔａｌＣｌｅａｒを使用して処理した。８０６ Ｆａｂ−ペプチド複合体データを、ビームラインＸ２９，Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙにおけるＡＤＳＣ量子３１５ ＣＣＤ検出器で集め、これらのデータをＨＫＬ２０００で処理した（１２）（データ収集統計を表１に示す）。Ｆａｂ構造２Ｅ８の座標を使用するプログラムＭＯＬＲＥＰ（１３）を使用する分子置換により、天然８０６ Ｆａｂを解析し、該構造の精密化をＲＥＦＭＡＣ５（１４）において行い、モデル構築をＣｏｏｔ（１５）において行った。８０６−ペプチドおよび１７５ Ｆａｂ−ペプチド構造を、８０６ Ｆａｂ構造の座標を使用するプログラムＭＯＬＲＥＰを使用する分子置換により解析し、精密化および再構築を、再び、ＲＥＦＭＡＣ５およびＣＯＯＴにおいて行い、最終構造の妥当性証明（Ｏ．Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）をＰＲＯＣＨＥＣＫ（１６）およびＷＨＡＴＣＨＥＣＫ（１７）で行った。
ＮＭＲ研究
ＮＭＲ研究のために、１５ＮＨ４Ｃｌで補足されたＮｅｉｄｈａｒｄｔの最少培地（１９）内で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を増殖させること以外はＦａｉｒｌｉｅら（１８）により既に記載されている方法を用いて、ＳＨＰ２のＳＨ２ドメインへの融合体として、１５Ｎ標識ペプチドを組換え製造した。該ペプチドを、ＣＮＢｒを使用して該融合相手から切断し、逆相ＨＰＬＣにより精製し、その同一性をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析およびＮ末端配列決定により確認した。該ペプチド自体の内部での切断ではなく該融合相手からの切断を可能にするために、８０６抗体−結合配列内のメチオニン残基をロイシンへと突然変異させた。
ＮＭＲ研究に使用したサンプルは、５％ Ｈ２Ｏ、７０ｍＭ ＮａＣｌおよび５０ｍＭ ＮａＰＯ４を含有するＨ２Ｏ溶液（ｐＨ６．８）中で調製した。全てのスペクトルは、クリオプローブ（ｃｒｙｏｐｒｏｂｅ）を使用して、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ５００分光計で、２９８Ｋで得た。標準的な２Ｄ ＴＯＣＳＹおよびＮＯＥＳＹならびに１５Ｎ−編集（ｅｄｉｔｅｄ）ＴＯＣＳＹおよびＮＯＥＳＹスペクトルを使用して、ｍ８０６Ｆａｂの非存在下、該ペプチドの連続的帰属を確立した。ｆＡｂ８０６の非存在下および存在下の該ペプチドの１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルをモニターすることにより、該ペプチドとｆＡｂ８０６との間の相互作用を調べた。ｆＡｂ８０６の存在下の該ペプチドの１５Ｎ ＨＳＱＣのスペクトルのスペクトル変動は、該ペプチドが、該存在溶液条件下でｆＡｂ８０６に結合可能であったことを明らかに示している。しかし、該複合体形態における該ペプチドの詳細なコンホメーションは決定しなかった。
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Claims (42)

  1. 腫瘍形成性、過剰増殖性または異常細胞においては見出されるが正常細胞においては検出不可能であるＥＧＦＲエピトープを認識する単離された抗体であって、該抗体が連結ペプチドＬＥＥＫＫＧＮＹＶＶＴＤＨ（配列番号１３）を認識せず、該抗体が、（ｉ）それぞれ配列番号１、２及び３のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、（ｉｉ）それぞれ配列番号４、５及び６のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域とを有する、抗体。
  2. ＥＧＦＲアミノ酸ペプチドエピトープ２８７ＣＧＡＤＳＹＥＭＥＥＤＧＶＲＫＣ３０２（配列番号１４）を認識する、請求項１記載の抗体。
  3. 完全なヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ化抗体である、請求項１又は２記載の単離された抗体。
  4. ＥＧＦＲエピトープペプチド２８７ＣＧＡＤＳＹＥＭＥＥＤＧＶＲＫＣ３０２（配列番号１４）を認識し、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲ連結ペプチドＬＥＥＫＫＧＮＹＶＶＴＤＨ（配列番号１３）を認識しない単離された抗体であって、（ｉ）それぞれ配列番号１、２及び３のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、（ｉｉ）それぞれ配列番号４、５及び６のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域とを有する、抗体。
  5. 該ＣＤＲがヒト抗体フレームワークにより含有されている、請求項１、２または４のいずれか１項記載の単離された抗体。
  6. ヒトＩｇＧ１定常領域を含む請求項１〜４のいずれか１項記載の抗体。
  7. ヒトカッパ定常領域を含む請求項１〜４のいずれか１項記載の抗体。
  8. 抗体Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖフラグメント、ジアボディ、トリアボディまたはテトラボディの形態の、請求項１〜７のいずれか１項記載の抗体。
  9. 検出可能または機能的な標識を含有する、請求項１〜８のいずれか１項記載の抗体。
  10. 該標識が、共有結合している薬物である、請求項９記載の抗体。
  11. 該標識が放射能標識である、請求項９記載の抗体。
  12. 該抗体がペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）されている、請求項１〜１１のいずれか１項記載の抗体。
  13. 請求項１〜７のいずれか１項記載の抗体をコードする配列を含んでなる単離された核酸。
  14. 請求項１〜１２のいずれか１項記載の抗体の製造方法であって、該抗体の発現を引き起こす条件下、請求項１３記載の核酸を発現させ、該抗体を回収することを含む、製造方法。
  15. ヒトまたは動物の身体の治療または診断の方法において使用するための、請求項１〜１２のいずれか１項記載の抗体。
  16. ＥＧＦＲ腫瘍抗原に結合しうる抗体の製造方法であって、
    ａ）ＣＤＲコード領域を欠くＶＨ及びＶＬドメインをコードする核酸の出発レパートリーを準備するステップと、
    ｂ）ＶＨドメインをコードするレパートリーを、配列番号４、５及び６に記載されるアミノ酸配列をコードするドナー核酸と合体させ、ＶＬドメインをコードするレパートリーを、配列番号１、２及び３に記載されるアミノ酸配列をコードするドナー核酸と合体させて、該ドナー核酸を該欠落ＣＤＲ領域内に挿入して、ＶＨ及びＶＬドメインをコードする核酸の産物レパートリーを得るステップと、
    ｃ）該産物レパートリーの核酸を発現させるステップと、
    ｄ）試験動物における＞１：１の最大腫瘍：血液局在化比を有し、場合によっては、該比において、＜１：１の腫瘍非含有器官：血液比を有する特異的結合メンバーを選択するステップと、
    ｅ）該結合メンバーまたはそれをコードする核酸を回収するステップと
    を含む製造方法。
  17. 請求項１〜１２および１５のいずれか１項記載抗体の有効量を含む、腫瘍を治療するための医薬組成物。
  18. 請求項１〜１２のいずれか１項記載の抗体、ならびに場合によっては、試薬および／または使用説明を含んでなる、ＥＧＦＲが異常発現される又はＥＧＦＲが増幅される若しくは突然変異体である腫瘍の診断のためのキット。
  19. 請求項１〜１０および１５のいずれか１項記載の抗体、ならびに場合によっては、医薬上許容されるビヒクル、担体または希釈剤を含んでなる医薬組成物。
  20. 請求項１９記載の医薬組成物の医薬剤形と、化学療法剤、抗ＥＧＦＲ抗体、放射線免疫療法剤およびそれらの組合せよりなる群から選ばれる追加的な抗癌剤を含む別個の医薬剤形とを含んでなる、ヒト患者における腫瘍の治療のためのキット。
  21. 化学療法剤が、チロシンキナーゼインヒビター、リン酸化カスケードインヒビター、翻訳後モジュレーター、細胞成長または分裂インヒビター（例えば、抗有糸分裂物質）、シグナル伝達インヒビターおよびそれらの組合せよりなる群から選ばれる、請求項２０記載のキット。
  22. 該チロシンキナーゼインヒビターが、ＡＧ１４７８、ＺＤ１８３９、ＳＴＩ５７１、ＯＳＩ−７７４、ＳＵ−６６６８およびそれらの組合せよりなる群から選ばれる、請求項２１記載のキット。
  23. 該抗ＥＧＦＲ抗体が、抗ＥＧＦＲ抗体５２８、２２５、ＳＣ−０３、ＤＲ８．３、Ｌ８Ａ４、Ｙ１０、ＩＣＲ６２、ＡＢＸ−ＥＧＦおよびそれらの組合せよりなる群から選ばれる、請求項２０記載のキット。
  24. 請求項１〜７のいずれか１項記載の抗体またはそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列またはその縮重変異体を含む組換えＤＮＡ分子で形質転換された単細胞宿主。
  25. 該単細胞宿主が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、酵母、ＣＨＯ、ＹＢ／２０、ＮＳＯ、ＳＰ２／０、Ｒ１．１、Ｂ−Ｗ、Ｌ−Ｍ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０およびＢＭＴ１０細胞、植物細胞、昆虫細胞ならびにヒト細胞（組織培養内のもの）よりなる群から選ばれる、請求項２４記載の単細胞宿主。
  26. 増幅されたＥＧＦＲまたはｄｅ２−７ＥＧＦＲの存在を検出するための方法であって、
    Ａ．増幅されたＥＧＦＲまたはｄｅ２−７ＥＧＦＲの存在が疑われる哺乳動物からの生物学的サンプルを、請求項１〜１２のいずれか１項記載の抗体と、該抗体への該ＥＧＦＲの結合が生じることを可能にする条件下で接触させ、
    Ｂ．該サンプルからのＥＧＦＲと該抗体との間の結合が生じたかどうかを検出することにより、該ＥＧＦＲを測定し、
    ここで、結合の検出が該サンプル中の該ＥＧＦＲの存在または活性を示す、方法。
  27. 該ＥＧＦＲの存在の検出が該哺乳動物における腫瘍または癌の存在を示す、請求項２６記載の方法。
  28. 哺乳動物における癌を予防および／または治療するために投与される請求項１９記載の医薬組成物。
  29. 哺乳動物における癌を予防および／または治療するために投与される請求項２２記載のキット。
  30. 哺乳動物における異常発現ＥＧＦＲを産生する脳固有癌を治療するために投与される請求項１９記載の医薬組成物。
  31. 哺乳動物における異常発現ＥＧＦＲを産生する脳固有癌を治療するために投与される請求項２０記載のキット。
  32. 該脳固有癌が、膠芽腫、髄芽腫、髄膜腫、腫瘍性星状細胞腫および増殖性動静脈奇形から選ばれる、請求項３０記載の医薬組成物。
  33. 該脳固有癌が、膠芽腫、髄芽腫、髄膜腫、腫瘍性星状細胞腫および増殖性動静脈奇形から選ばれる、請求項３１記載のキット。
  34. 全身投与される、請求項２８または３０記載の医薬組成物。
  35. 全身投与される、請求項２９または３１記載のキット。
  36. 哺乳動物における悪性神経性腫瘍の治療のために投与される請求項１９記載の医薬組成物。
  37. 哺乳動物における悪性神経性腫瘍の治療のために投与される請求項２０記載のキット。
  38. 哺乳動物における癌の治療または予防のための医薬の製造のための、請求項１〜１２のいずれか１項記載の抗体の使用。
  39. 該癌が脳または脳付近に位置する、請求項３８記載の使用。
  40. 哺乳動物における神経性腫瘍の治療または予防のための医薬の製造のための、請求項１〜１２のいずれか１項記載の抗体の使用。
  41. 治療のための方法が放射線免疫療法を含む、請求項３８〜４０のいずれか１項記載の使用。
  42. まず、請求項１９記載の医薬組成物を投与し、ついで、化学療法剤を含む組成物を投与する、請求項３８〜４０のいずれか１項記載の使用。
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Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110313230A1 (en) 2001-05-11 2011-12-22 Terrance Grant Johns Specific binding proteins and uses thereof
PT1392359E (pt) 2001-05-11 2010-01-27 Ludwig Inst For Cancer Res Ltd Proteínas de ligação específica e suas utilizações
US20100056762A1 (en) * 2001-05-11 2010-03-04 Old Lloyd J Specific binding proteins and uses thereof
US7767792B2 (en) * 2004-02-20 2010-08-03 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. Antibodies to EGF receptor epitope peptides
MX338185B (es) 2007-01-25 2016-04-05 Dana Farber Cancer Inst Inc Uso de anticuerpos anti-egfr en el tratamiento de enfermedad mediada por egfr mutante.
AU2008227123B2 (en) 2007-03-15 2014-03-27 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. Treatment method using EGFR antibodies and src inhibitors and related formulations
JP5532486B2 (ja) 2007-08-14 2014-06-25 ルードヴィッヒ インスティテュート フォー キャンサー リサーチ Ｅｇｆ受容体を標的とするモノクローナル抗体１７５ならびにその誘導体および用途
US8506963B2 (en) * 2009-09-22 2013-08-13 Shanghai Cancer Institute Anti-EFGRv3 monoclonal antibody
US20110076232A1 (en) 2009-09-29 2011-03-31 Ludwig Institute For Cancer Research Specific binding proteins and uses thereof
JP2013534515A (ja) 2010-06-01 2013-09-05 モナシュ ユニバーシティ プロセシングされていない受容体型チロシンキナーゼｃ−ＭＥＴに対する抗体
CN102175649B (zh) * 2011-01-04 2012-11-28 长沙理工大学 用于检测致癌基因C-myc重组蛋白的LSPR传感芯片
AR086363A1 (es) 2011-04-21 2013-12-11 Bayer Ip Gmbh Conjugados de principio activo-ligante (adc) y el uso de los mismos
CN103382223B (zh) * 2012-04-01 2015-06-10 上海益杰生物技术有限公司 针对表皮生长因子受体隐蔽表位和t细胞抗原的多功能抗体多肽
EP2970491A4 (en) * 2013-03-15 2016-11-23 Alper Biotech Llc MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST EGFR AND USES THEREOF
CN103626871A (zh) * 2013-04-19 2014-03-12 武汉纽斯特生物技术有限公司 特异性识别egfr突变蛋白的单克隆抗体、制备方法及其应用
KR102329024B1 (ko) 2013-12-23 2021-11-19 바이엘 파마 악티엔게젤샤프트 키네신 스핀들 단백질(ksp)과의 항체 약물 접합체 (adcs)
KR20220025946A (ko) 2014-03-21 2022-03-03 애브비 인코포레이티드 항-ｅｇｆｒ 항체 및 항체 약물 접합체
DE112014006656B4 (de) * 2014-05-14 2018-05-17 Carsgen Therapeutics Limited Nukleinsäure zur Kodierung eines chimären Antigen-Rezeptor-Proteins und T-Lymphozyt zur Expression eines chimären Antigen-Rezeptor-Proteins
WO2016207089A1 (de) 2015-06-22 2016-12-29 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Binder-wirkstoff-konjugate (adcs) und binder-prodrug-konjugate (apdcs) mit enzymatisch spaltbaren gruppen
US10973923B2 (en) * 2015-06-23 2021-04-13 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Site specific homogeneous with KSP inhibitors
WO2017060322A2 (en) 2015-10-10 2017-04-13 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Ptefb-inhibitor-adc
KR20180123047A (ko) 2016-03-24 2018-11-14 바이엘 파마 악티엔게젤샤프트 효소적으로 절단가능한 기를 갖는 세포독성 활성제의 전구약물
WO2017216028A1 (en) 2016-06-15 2017-12-21 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Specific antibody-drug-conjugates (adcs) with ksp inhibitors and anti-cd123-antibodies
WO2018114578A1 (de) 2016-12-21 2018-06-28 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Binder-wirkstoff-konjugate (adcs) mit enzymatisch spaltbaren gruppen
US12059472B2 (en) 2016-12-21 2024-08-13 Bayer Aktiengesellschaft Prodrugs of cytotoxic active agents having enzymatically cleavable groups
CA3047522A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Specific antibody drug conjugates (adcs) having ksp inhibitors
AU2020247828A1 (en) * 2019-03-22 2021-11-18 Certis Therapeutics Pty Ltd Anti-HER2 binding molecules
JP7088902B2 (ja) * 2019-12-27 2022-06-21 クレージュ メディカル カンパニー，リミテッド キメラ抗原受容体タンパク質をコードする核酸およびキメラ抗原受容体タンパク質を発現するｔリンパ球
CN112500490B (zh) * 2020-10-14 2022-05-03 华南农业大学 一种抗左旋氧氟沙星抗体的F(ab)2片段及其制备方法和应用
AR124681A1 (es) 2021-01-20 2023-04-26 Abbvie Inc Conjugados anticuerpo-fármaco anti-egfr

Family Cites Families (249)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CU22545A1 (es) 1994-11-18 1999-03-31 Centro Inmunologia Molecular Obtención de un anticuerpo quimérico y humanizado contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico para uso diagnóstico y terapéutico
US4162940A (en) 1977-03-31 1979-07-31 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for producing Antibiotic C-15003 by culturing nocardia
US4151042A (en) 1977-03-31 1979-04-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for producing maytansinol and its derivatives
US4169888A (en) 1977-10-17 1979-10-02 The Upjohn Company Composition of matter and process
US4137230A (en) 1977-11-14 1979-01-30 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for the production of maytansinoids
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4265814A (en) 1978-03-24 1981-05-05 Takeda Chemical Industries Matansinol 3-n-hexadecanoate
JPS5562090A (en) 1978-10-27 1980-05-10 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS5566585A (en) 1978-11-14 1980-05-20 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55164687A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4263294A (en) 1978-11-20 1981-04-21 Takeda Chemical Industries, Ltd. Maytansinoids, pharmaceutical compositions thereof and method of use thereof
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS55164685A (en) 1979-06-08 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55164686A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4309428A (en) 1979-07-30 1982-01-05 Takeda Chemical Industries, Ltd. Maytansinoids
JPS5622790A (en) 1979-07-31 1981-03-03 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
US4342566A (en) 1980-02-22 1982-08-03 Scripps Clinic & Research Foundation Solid phase anti-C3 assay for detection of immune complexes
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4413132A (en) 1980-11-18 1983-11-01 The Upjohn Company Antibiotic CC-1065 indoline intermediates
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
US4671958A (en) 1982-03-09 1987-06-09 Cytogen Corporation Antibody conjugates for the delivery of compounds to target sites
US4867973A (en) 1984-08-31 1989-09-19 Cytogen Corporation Antibody-therapeutic agent conjugates
FR2523445A1 (fr) 1982-03-17 1983-09-23 Sanofi Sa Nouveaux conjugues associant, par liaison covalente, une enzyme et un anticorps, et associations medicamenteuses utilisant lesdits conjugues
US4418064A (en) 1982-09-29 1983-11-29 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids: treflorine, trenudine, and N-methyltrenudone
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4933294A (en) 1984-01-30 1990-06-12 Icrf Patents Limited Method of detecting truncated epidermal growth factor receptors
US4943533A (en) 1984-03-01 1990-07-24 The Regents Of The University Of California Hybrid cell lines that produce monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US5851526A (en) 1985-04-19 1998-12-22 Ludwig Institute For Cancer Research Methods of treating colon cancer utilizing tumor-specific antibodies
US5776093A (en) 1985-07-05 1998-07-07 Immunomedics, Inc. Method for imaging and treating organs and tissues
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4997913A (en) 1986-06-30 1991-03-05 Oncogen pH-sensitive immunoconjugates and methods for their use in tumor therapy
IN165717B (ja) 1986-08-07 1989-12-23 Battelle Memorial Institute
US5034223A (en) 1986-10-09 1991-07-23 Neorx Corporation Methods for improved targeting of antibody, antibody fragments, hormones and other targeting agents, and conjugates thereof
USRE38008E1 (en) 1986-10-09 2003-02-25 Neorx Corporation Methods for improved targeting of antibody, antibody fragments, hormones and other targeting agents, and conjugates thereof
US5047324A (en) 1986-12-09 1991-09-10 Miles Inc. Substantially pure enzyme-antibody conjugate preparations
US5332837A (en) 1986-12-19 1994-07-26 The Upjohn Company CC-1065 analogs
US4952394A (en) 1987-11-23 1990-08-28 Bristol-Myers Company Drug-monoclonal antibody conjugates
US5563250A (en) 1987-12-02 1996-10-08 Neorx Corporation Cleavable conjugates for the delivery and release of agents in native form
WO1989006692A1 (en) 1988-01-12 1989-07-27 Genentech, Inc. Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function
US4937183A (en) 1988-02-03 1990-06-26 Cytogen Corporation Method for the preparation of antibody-fragment conjugates
IL106992A (en) 1988-02-11 1994-06-24 Bristol Myers Squibb Co Acylhydrazone derivatives of anthracycline and methods for their preparation
EP0329184A3 (en) 1988-02-19 1990-05-23 Neorx Corporation Antimers and antimeric conjugation
US6010902A (en) 1988-04-04 2000-01-04 Bristol-Meyers Squibb Company Antibody heteroconjugates and bispecific antibodies for use in regulation of lymphocyte activity
US5028697A (en) 1988-08-08 1991-07-02 Eli Lilly And Company Cytotoxic antibody conjugates of hydrazide derivatized methotrexate analogs via simple organic linkers
JP3380237B2 (ja) 1988-09-12 2003-02-24 ファルマシア・アンド・アップジョン・カンパニー ２のｃｐｉサブユニットを有する新規ｃｃ―１０６５アナログ類
AU4128089A (en) 1988-09-15 1990-03-22 Rorer International (Overseas) Inc. Monoclonal antibodies specific to human epidermal growth factor receptor and therapeutic methods employing same
US5171563A (en) 1988-09-30 1992-12-15 Neorx Corporation Cleavable linkers for the reduction of non-target organ retention of immunoconjugates
WO1990003799A1 (en) 1988-10-12 1990-04-19 Centocor, Inc. Radiotherapeutic immunoconjugates labeled with iodine-125
CA2006408A1 (en) 1988-12-27 1990-06-27 Susumu Iwasa Bispecific monoclonal antibody, its production and use
US5217713A (en) 1988-12-27 1993-06-08 Takeda Chemical Industries, Ltd. Cytotoxic bispecific monoclonal antibody, its production and use
US5013547A (en) 1989-02-07 1991-05-07 Erbamont, Inc. Anticancer drug - antibody conjugates and method for preparing same
US6020145A (en) 1989-06-30 2000-02-01 Bristol-Myers Squibb Company Methods for determining the presence of carcinoma using the antigen binding region of monoclonal antibody BR96
US5980896A (en) 1989-06-30 1999-11-09 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies reactive with human carcinomas
US5332567A (en) 1989-08-24 1994-07-26 Immunomedics Detection and treatment of infections with immunoconjugates
WO1991003489A1 (en) 1989-09-08 1991-03-21 The Johns Hopkins University Structural alterations of the egf receptor gene in human gliomas
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5459061A (en) 1990-01-26 1995-10-17 W. Alton Jones Cell Science Center, Inc. Hybridomas producing monoclonal antibodies which specifically bind to continuous epitope on the human EGF receptor and compete with EGF for binding to the EGF receptor
EP0515527A4 (en) 1990-02-20 1993-08-25 Coulter Corporation Improved antibody-enzyme direct conjugates and method of making same
AU7774391A (en) 1990-04-20 1991-11-11 Ludwig Institute For Cancer Research Aberrant, epidermal growth factor receptor dna, rna and protein forms and method
JPH05508394A (ja) 1990-04-25 1993-11-25 ファルマシア・アンド・アップジョン・カンパニー 新規なｃｃ―１０６５アナログ
US6248332B1 (en) 1990-10-05 2001-06-19 Medarex, Inc. Targeted immunostimulation with bispecific reagents
JPH04334377A (ja) 1990-12-31 1992-11-20 Akzo Nv 酸−不安定性リンカー分子
DE69233153T2 (de) 1991-03-06 2004-05-27 Merck Patent Gmbh Humanisierte monoklonale antikörper
JP3370324B2 (ja) 1991-04-25 2003-01-27 中外製薬株式会社 ヒトインターロイキン−６受容体に対する再構成ヒト抗体
US6797492B2 (en) 1991-05-17 2004-09-28 Merck & Co., Inc. Method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
EP0519596B1 (en) 1991-05-17 2005-02-23 Merck & Co. Inc. A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
WO1993011161A1 (en) 1991-11-25 1993-06-10 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
US5869619A (en) 1991-12-13 1999-02-09 Xoma Corporation Modified antibody variable domains
AU661533B2 (en) 1992-01-20 1995-07-27 Astrazeneca Ab Quinazoline derivatives
US5622929A (en) 1992-01-23 1997-04-22 Bristol-Myers Squibb Company Thioether conjugates
ES2149768T3 (es) 1992-03-25 2000-11-16 Immunogen Inc Conjugados de agentes enlazantes de celulas derivados de cc-1065.
ATE188874T1 (de) 1992-08-18 2000-02-15 Centro Inmunologia Molecular Monoklonale antikörper gegen den epidermalen wachstumsfaktorrezeptor, zellen und verfahren zur ihrer herstellung und sie erhaltende zusammensetzungen
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
DK0672142T3 (da) 1992-12-04 2001-06-18 Medical Res Council Multivalente og multispecifikke bindingsproteiner samt fremstilling og anvendelse af disse
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
US5674977A (en) 1993-02-05 1997-10-07 The Ontario Cancer Institute Branched synthetic peptide conjugate
US5556623A (en) 1993-03-30 1996-09-17 Eli Lilly And Company Antibody-drug conjugates
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
US5443953A (en) 1993-12-08 1995-08-22 Immunomedics, Inc. Preparation and use of immunoconjugates
PT749325E (pt) 1994-03-07 2002-11-29 Medarex Inc Mpleculas biespecificas possuindo utilidades clinicas
HU221001B1 (hu) 1994-03-17 2002-07-29 Merck Patent Gmbh. Egyláncú anti-EGFR Fv-k és anti-EGFR ellenanyagok
US5612474A (en) 1994-06-30 1997-03-18 Eli Lilly And Company Acid labile immunoconjugate intermediates
CU22615A1 (es) 1994-06-30 2000-02-10 Centro Inmunologia Molecular Procedimiento de obtención de anticuerpos monoclonales murinos menos inmunogénicos. anticuerpos monoclonales obtenidos
US5911995A (en) 1994-08-19 1999-06-15 Regents Of The University Of Minnesota EGF-genistein conjugates for the treatment of cancer
EP0796277B1 (en) 1994-11-28 2004-03-24 Thomas Jefferson University Fusion junction type iii mutant egf receptor peptide tumour vaccine
WO1996040662A2 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Cellpro, Incorporated Aminooxy-containing linker compounds and their application in conjugates
JPH11507535A (ja) 1995-06-07 1999-07-06 イムクローン システムズ インコーポレイテッド 腫瘍の成長を抑制する抗体および抗体フラグメント類
US7060808B1 (en) 1995-06-07 2006-06-13 Imclone Systems Incorporated Humanized anti-EGF receptor monoclonal antibody
US6410690B1 (en) 1995-06-07 2002-06-25 Medarex, Inc. Therapeutic compounds comprised of anti-Fc receptor antibodies
NZ321172A (en) 1995-10-03 2000-02-28 Scripps Research Inst CBI analogs of CC-1065 and the duocarmycins
US6699715B1 (en) 1995-11-30 2004-03-02 Bristol-Myers Squibb Co. Modified sFv molecules which mediate adhesion between cells and uses thereof
WO1997023243A1 (en) 1995-12-22 1997-07-03 Bristol-Myers Squibb Company Branched hydrazone linkers
US5760041A (en) 1996-02-05 1998-06-02 American Cyanamid Company 4-aminoquinazoline EGFR Inhibitors
US5708156A (en) 1996-05-31 1998-01-13 Ilekis; John V. Epidermal growth factor receptor-like gene product and its uses
AU3217897A (en) 1996-05-31 1998-01-05 Scripps Research Institute, The Analogs of cc-1065 and the duocarmycins
US6759509B1 (en) 1996-11-05 2004-07-06 Bristol-Myers Squibb Company Branched peptide linkers
US5942602A (en) 1997-02-13 1999-08-24 Schering Aktiengessellschaft Growth factor receptor antibodies
US6306393B1 (en) 1997-03-24 2001-10-23 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
US20020173629A1 (en) 1997-05-05 2002-11-21 Aya Jakobovits Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
EP0983248B1 (en) 1997-05-22 2004-07-14 The Scripps Research Institute Analogs of duocarmycin and cc-1065
EP1042285A4 (en) 1997-10-14 2002-11-20 Scripps Research Inst Iso-CBI OR iso-CI ANALOGS OF CC-1065 AND DUOCARMYCINS
JP2001525382A (ja) 1997-12-08 2001-12-11 ザ スクリップス リサーチ インスティテュート Ｃｃ−１０６５／デュオカルマイシン類似体の合成
US6417168B1 (en) 1998-03-04 2002-07-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods of treating tumors
US20030224001A1 (en) 1998-03-19 2003-12-04 Goldstein Neil I. Antibody and antibody fragments for inhibiting the growth of tumors
ES2230848T3 (es) 1998-04-28 2005-05-01 Smithkline Beecham Corporation Anticuerpos monoclonales con inmunogenicidad reducida.
US6962702B2 (en) 1998-06-22 2005-11-08 Immunomedics Inc. Production and use of novel peptide-based agents for use with bi-specific antibodies
US20030215387A1 (en) 1998-09-04 2003-11-20 Peter Harrison Bifunctional antibodies and their use in targeting anti-tumour agents
MXPA01011632A (es) 1999-05-14 2002-11-07 Imclone Systems Inc Tratamiento de tumores refractarios humanos, con antagonistas de receptor del factor de crecimiento epidermico.
US6946129B1 (en) 1999-06-08 2005-09-20 Seattle Genetics, Inc. Recombinant anti-CD40 antibody and uses thereof
US6949245B1 (en) 1999-06-25 2005-09-27 Genentech, Inc. Humanized anti-ErbB2 antibodies and treatment with anti-ErbB2 antibodies
EP1229934B1 (en) 1999-10-01 2014-03-05 Immunogen, Inc. Compositions and methods for treating cancer using immunoconjugates and chemotherapeutic agents
US7303749B1 (en) 1999-10-01 2007-12-04 Immunogen Inc. Compositions and methods for treating cancer using immunoconjugates and chemotherapeutic agents
HK1049997B (en) 1999-11-24 2007-02-23 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents comprising taxanes and their therapeutic use
DK1242438T3 (da) 1999-12-29 2007-02-12 Immunogen Inc Cytotoksiske midler omfattende modificerede doxorubiciner og daunorubiciner og deres terapeutiske anvendelse
SK12232002A3 (sk) 2000-02-25 2003-03-04 The Government Of The United States, As Represented By The Anti-ERGFRvIII scFv so zlepšenou cytotoxicitou a výťažkom, imunotoxíny a spôsoby ich použitia
US20010046686A1 (en) 2000-03-10 2001-11-29 Wong Albert J. Sensitive detection of wild-type and mutant EGFR by specific ELISA assays in any biological sample
US7097840B2 (en) 2000-03-16 2006-08-29 Genentech, Inc. Methods of treatment using anti-ErbB antibody-maytansinoid conjugates
DK2857516T3 (en) 2000-04-11 2017-08-07 Genentech Inc Multivalent antibodies and uses thereof
ATE279390T1 (de) 2000-05-02 2004-10-15 Tietze Lutz F Prof Dr Neue prodrugs von 6-hydroxy-2,3-dihydro-1h- indolen, 5-hydroxy-1,2-dihydro-3h-pyrrolo 3,2- e)indolen und 5-hydroxy-1,2-dihydro-3h-benzo e)indolen sowie von 6-hydroxy-1,2,3,4-tetrahydro- benzo f)chinolin-derivaten für eine selektive krebstherapie
EP1282443B1 (en) 2000-05-19 2009-09-02 Genentech, Inc. Gene detection assay for improving the likelihood of an effective response to an erbb antagonist cancer therapy
AUPQ841800A0 (en) 2000-06-28 2000-07-20 Biomolecular Research Institute Limited Truncated egf receptor
EP1311291A4 (en) 2000-08-09 2007-07-25 Imclone Systems Inc TREATMENT OF HYPERPROLIFERATIVE DISEASES USING EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR ANTAGONISTS
US6333410B1 (en) 2000-08-18 2001-12-25 Immunogen, Inc. Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids
AR030612A1 (es) 2000-09-12 2003-08-27 Smithkline Beecham Corp Procedimiento e intermedios
JP5010089B2 (ja) 2000-09-19 2012-08-29 スピロジェン リミテッド Ｃｃ−１０６５およびデュオカルマイシンのアキラルアナログの組成物およびその使用方法
DE10048417A1 (de) 2000-09-29 2002-04-11 Roche Diagnostics Gmbh Verbindungen mit verzweigtem Linker
JP2004519233A (ja) 2001-02-19 2004-07-02 メルク　パテント　ゲゼルシャフト　ミット　ベシュレンクテル　ハフトング 免疫原性の低減された修飾された抗ｅｇｆｒ抗体
US20080008704A1 (en) 2001-03-16 2008-01-10 Mark Rubin Methods of treating colorectal cancer with anti-epidermal growth factor antibodies
US20020156274A1 (en) 2001-03-16 2002-10-24 Terfloth Gerald J. Process for preparing maytansinol
EP1243276A1 (en) 2001-03-23 2002-09-25 Franciscus Marinus Hendrikus De Groot Elongated and multiple spacers containing activatible prodrugs
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
US7256257B2 (en) 2001-04-30 2007-08-14 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
US20030083263A1 (en) 2001-04-30 2003-05-01 Svetlana Doronina Pentapeptide compounds and uses related thereto
CZ20033226A3 (en) 2001-05-08 2004-07-14 Merck Patent Gmbh Combination therapy using anti-egfr antibodies and anti-hormonal agents
PT1392359E (pt) 2001-05-11 2010-01-27 Ludwig Inst For Cancer Res Ltd Proteínas de ligação específica e suas utilizações
US20100056762A1 (en) 2001-05-11 2010-03-04 Old Lloyd J Specific binding proteins and uses thereof
US6441163B1 (en) 2001-05-31 2002-08-27 Immunogen, Inc. Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents
US7129261B2 (en) 2001-05-31 2006-10-31 Medarex, Inc. Cytotoxic agents
CN100497389C (zh) 2001-06-13 2009-06-10 根马布股份公司 表皮生长因子受体(egfr)的人单克隆抗体
US7595378B2 (en) 2001-06-13 2009-09-29 Genmab A/S Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor (EGFR)
US20050107595A1 (en) 2001-06-20 2005-05-19 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
US7803915B2 (en) 2001-06-20 2010-09-28 Genentech, Inc. Antibody compositions for the diagnosis and treatment of tumor
EP1421113A4 (en) 2001-08-03 2005-04-13 Commw Scient Ind Res Org SCREENING BASED ON THE CRYSTAL STRUCTURE OF THE EGF RECEPTOR
JP2005502703A (ja) 2001-09-07 2005-01-27 ザ スクリプス リサーチ インスティテュート Ｃｃ−１０６５およびデュオカルマイシンのｃｂｉ類似体
US20030109682A1 (en) 2001-09-07 2003-06-12 Daniel Santi Maytansines and maytansine conjugates
US7091186B2 (en) 2001-09-24 2006-08-15 Seattle Genetics, Inc. p-Amidobenzylethers in drug delivery agents
US20040241703A1 (en) 2002-08-19 2004-12-02 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
AU2002360413A1 (en) 2001-11-21 2003-06-10 University Of Washington Biosynthetic gene cluster for the maytansinoid antitumor agent ansamitocin
US6716821B2 (en) 2001-12-21 2004-04-06 Immunogen Inc. Cytotoxic agents bearing a reactive polyethylene glycol moiety, cytotoxic conjugates comprising polyethylene glycol linking groups, and methods of making and using the same
AU2003201824A1 (en) 2002-01-03 2003-07-24 Smithkline Beecham Corporation Methods for preparing immunoconjugates
US6790954B2 (en) 2002-01-29 2004-09-14 Immunogen, Inc. Mutant Actinosynnema pretiosum strain with increased maytansinoid production
JP2006500905A (ja) 2002-02-13 2006-01-12 ルードヴィッヒ インスティテュート フォー キャンサー リサーチ ヒト化ｇｍ−ｃｓｆ抗体
CA2479306A1 (en) 2002-03-19 2003-10-02 The Penn State Research Foundation Egfr ligands and methods of use
US6756397B2 (en) 2002-04-05 2004-06-29 Immunogen, Inc. Prodrugs of CC-1065 analogs
US6534660B1 (en) 2002-04-05 2003-03-18 Immunogen, Inc. CC-1065 analog synthesis
US20050276812A1 (en) 2004-06-01 2005-12-15 Genentech, Inc. Antibody-drug conjugates and methods
AU2003228998A1 (en) 2002-05-13 2003-12-02 Smithkline Beecham Corporation Process for preparing maytansinol
US6596757B1 (en) 2002-05-14 2003-07-22 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising polyethylene glycol-containing taxanes and their therapeutic use
CA2485691A1 (en) 2002-05-20 2003-12-04 Abgenix, Inc. Treatment of renal carcinoma using antibodies against the egfr
EP1600459A3 (en) 2002-06-28 2005-12-07 Domantis Limited Ligand
EP2353611B1 (en) 2002-07-31 2015-05-13 Seattle Genetics, Inc. Drug conjugates and their use for treating cancer, an autoimmune disease or an infectious disease
US7390898B2 (en) 2002-08-02 2008-06-24 Immunogen Inc. Cytotoxic agents containing novel potent taxanes and their therapeutic use
BR0313197A (pt) 2002-08-02 2005-08-09 Immunogen Inc Agentes citotóxicos contendo potentes taxanos e seu uso terapêutico
ATE499116T1 (de) 2002-08-16 2011-03-15 Immunogen Inc Vernetzer mit hoher reaktivität und löslichkeit und ihre verwendung bei der herstellung von konjugaten für die gezielte abgabe von kleinmolekularen arzneimitteln
WO2004032960A1 (en) 2002-10-10 2004-04-22 Merck Patent Gmbh Pharmaceutical compositions directed to erb-b1 receptors
AU2003282624A1 (en) 2002-11-14 2004-06-03 Syntarga B.V. Prodrugs built as multiple self-elimination-release spacers
US20040147428A1 (en) 2002-11-15 2004-07-29 Pluenneke John D. Methods of treatment using an inhibitor of epidermal growth factor receptor
US20040202666A1 (en) 2003-01-24 2004-10-14 Immunomedics, Inc. Anti-cancer anthracycline drug-antibody conjugates
EP1622941A2 (en) 2003-03-20 2006-02-08 ImClone Systems Incorporated Method of producing an antibody to epidermal growth factor receptor
CA2450289A1 (en) 2003-03-20 2005-05-19 Imclone Systems Incorporated Method of producing an antibody to epidermal growth factor receptor
US7432088B2 (en) 2003-05-08 2008-10-07 Immunogen Inc. Methods for the production of ansamitocins
WO2004101767A2 (en) 2003-05-13 2004-11-25 The Scripps Research Institute Cbi analogues of the duocarmycins and cc-1065
EP2281577B1 (en) 2003-05-14 2016-11-16 ImmunoGen, Inc. Drug conjugate composition
US8088387B2 (en) 2003-10-10 2012-01-03 Immunogen Inc. Method of targeting specific cell populations using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, said conjugates, and methods of making said conjugates
US7276497B2 (en) 2003-05-20 2007-10-02 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising new maytansinoids
BRPI0411803A (pt) 2003-06-27 2006-05-23 Abgenix Inc anticorpos dirigidos aos mutantes de deleção de receptor de fator de crescimento epidérmico e seus usos
US8101720B2 (en) 2004-10-21 2012-01-24 Xencor, Inc. Immunoglobulin insertions, deletions and substitutions
PT2489364E (pt) 2003-11-06 2015-04-16 Seattle Genetics Inc Compostos de monometilvalina conjugados com anticorpos
EP1701979A2 (en) 2003-12-03 2006-09-20 Xencor, Inc. Optimized antibodies that target the epidermal growth factor receptor
EP1718677B1 (en) 2003-12-19 2012-04-18 Genentech, Inc. Monovalent antibody fragments useful as therapeutics
US20050214310A1 (en) 2004-01-23 2005-09-29 Seattle Genetics, Inc. Melphalan prodrugs
US7767792B2 (en) 2004-02-20 2010-08-03 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. Antibodies to EGF receptor epitope peptides
CA2556752C (en) 2004-02-23 2016-02-02 Genentech, Inc. Heterocyclic self-immolative linkers and conjugates
ES2533695T3 (es) 2004-03-02 2015-04-14 Seattle Genetics, Inc. Anticuerpos cargados parcialmente y métodos para su conjugación
TW200533339A (en) 2004-03-16 2005-10-16 Bristol Myers Squibb Co Therapeutic synergy of anti-cancer compounds
EP1737890A2 (en) 2004-03-24 2007-01-03 Xencor, Inc. Immunoglobulin variants outside the fc region
EP2439285B1 (en) 2004-03-31 2019-05-08 The General Hospital Corporation Method to determine responsiveness of cancer to epidermal growth factor receptor targeting treatments
US7838519B2 (en) 2004-04-14 2010-11-23 The Ohio State University Research Foundation Maytansinoid analogs as antitumor agents
CA2564076C (en) 2004-05-19 2014-02-18 Medarex, Inc. Chemical linkers and conjugates thereof
US7691962B2 (en) 2004-05-19 2010-04-06 Medarex, Inc. Chemical linkers and conjugates thereof
CA2569520C (en) 2004-06-04 2023-03-14 Genentech, Inc. Kras mutations for identifying colorectal tumors responsive to cetuximab or panitumumab
NZ553500A (en) 2004-09-23 2009-11-27 Genentech Inc Genentech Inc Cysteine engineered antibodies and conjugates withCysteine engineered antibodies and conjugates with a free cysteine amino acid in the heavy chain a free cysteine amino acid in the heavy chain
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
CA2586909A1 (en) 2004-11-12 2006-12-14 Seattle Genetics, Inc. Auristatins having an aminobenzoic acid unit at the n terminus
AU2005316844A1 (en) 2004-11-29 2006-06-22 Seattle Genetics, Inc. Engineered antibodies and immunoconjugates
US20070134243A1 (en) 2004-12-01 2007-06-14 Gazzard Lewis J Antibody drug conjugates and methods
BRPI0518086A (pt) 2004-12-07 2008-10-28 Genentech Inc métodos para tratamento de cáncer, métodos de avaliação de fosforilação ou ativação de her e método de identificação
EP1688415A1 (en) 2004-12-07 2006-08-09 Aventis Pharma S.A. Cytotoxic agents comprising new C-2 modified taxanes
EP1669358A1 (en) 2004-12-07 2006-06-14 Aventis Pharma S.A. Cytotoxic agents comprising new taxanes
US7301019B2 (en) 2005-01-21 2007-11-27 Immunogen, Inc. Method for the preparation of maytansinoid esters
EP2468304A3 (en) 2005-02-11 2012-09-26 ImmunoGen, Inc. Process for preparing stable drug conjugates
BRPI0609615A2 (pt) 2005-04-01 2010-04-27 Amgen Inc. métodos de predição da eficácia de tratamento de agente de ligação especìfica a egfr em tratamento de cáncer relacionado com egfr num sujeito, de tratamento do mesmo e de determinação da eficácia de tratamento em paciente
US7714016B2 (en) 2005-04-08 2010-05-11 Medarex, Inc. Cytotoxic compounds and conjugates with cleavable substrates
EP3498289A1 (en) 2005-07-07 2019-06-19 Seattle Genetics, Inc. Monomethylvaline compounds having phenylalanine side-chain modifications at the c-terminus
WO2007008848A2 (en) 2005-07-07 2007-01-18 Seattle Genetics, Inc. Monomethylvaline compounds having phenylalanine carboxy modifications at the c-terminus
WO2007011968A2 (en) 2005-07-18 2007-01-25 Seattle Genetics, Inc. Beta-glucuronide-linker drug conjugates
JP2009503105A (ja) 2005-08-03 2009-01-29 イミュノジェン・インコーポレーテッド 免疫複合体製剤
US8158590B2 (en) 2005-08-05 2012-04-17 Syntarga B.V. Triazole-containing releasable linkers, conjugates thereof, and methods of preparation
EP1913002B9 (en) 2005-08-09 2012-04-25 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Method of acylating maytansinol with chiral amino acids
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
CA2893252C (en) 2005-08-24 2018-05-29 Immunogen, Inc. Process for preparing antibody maytansinoid conjugates
EA016577B1 (ru) 2005-09-26 2012-06-29 Медарекс, Инк. Конъюгаты антитело-лекарство и их применение
SI1940789T1 (sl) 2005-10-26 2012-03-30 Medarex Inc Postopki in spojine za pripravo cc analogov
PL1945647T3 (pl) 2005-11-08 2012-04-30 Immunogen Inc Procesy wytwarzania maytansinolu
WO2007059404A2 (en) 2005-11-10 2007-05-24 Medarex, Inc. Duocarmycin derivatives as novel cytotoxic compounds and conjugates
DK1948180T3 (da) 2005-11-11 2013-05-27 Boehringer Ingelheim Int Kombinationsbehandling af cancer omfattende EGFR/HER2 inhibitorer
ES2340205T3 (es) 2005-11-12 2010-05-31 Eli Lilly And Company Anticuerpos anti-egfr.
KR20080110987A (ko) 2006-01-04 2008-12-22 메르크 파텐트 게엠베하 항-ｅｇｆｒ 및 항-ｈｅｒ２ 항체를 이용하는 조합 요법
MX2008009956A (es) 2006-02-02 2008-12-12 Syntarga Bv Analogos de cc-1065 solubles en agua y sus conjugados.
US7750116B1 (en) 2006-02-18 2010-07-06 Seattle Genetics, Inc. Antibody drug conjugate metabolites
WO2007103288A2 (en) 2006-03-02 2007-09-13 Seattle Genetics, Inc. Engineered antibody drug conjugates
EP1832577A1 (en) 2006-03-07 2007-09-12 Sanofi-Aventis Improved prodrugs of CC-1065 analogs
EP1996193A2 (en) 2006-03-13 2008-12-03 OSI Pharmaceuticals, Inc. Combined treatment with an egfr kinase inhibitor and an agent that sensitizes tumor cells to the effects of egfr kinase inhibitors
WO2008033495A2 (en) 2006-09-15 2008-03-20 Life Science Pharmaceuticals Method for detecting and treating skin disorders
JP2010509234A (ja) 2006-11-02 2010-03-25 シアトル ジェネティックス， インコーポレイテッド 新生物疾患、自己免疫疾患および炎症性疾患を処置する方法
US7790164B2 (en) 2006-11-14 2010-09-07 Van Andel Research Institute Fragments of antibodies to epidermal growth factor receptor and methods of their use
AU2007353412A1 (en) 2006-11-21 2008-11-20 Fox Chase Cancer Center Anti-EGFR family antibodies, bispecific anti-EGFR family antibodies and methods of use thereof
MX338185B (es) 2007-01-25 2016-04-05 Dana Farber Cancer Inst Inc Uso de anticuerpos anti-egfr en el tratamiento de enfermedad mediada por egfr mutante.
AU2008227123B2 (en) 2007-03-15 2014-03-27 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. Treatment method using EGFR antibodies and src inhibitors and related formulations
US20100322939A1 (en) 2007-06-21 2010-12-23 Genmab A/S Novel methods for treating egfr-associated tumors
ES2433379T3 (es) 2007-08-01 2013-12-10 Syntarga B.V. Análogos de CC-1065 sustituidos y sus conjugados
JP5532486B2 (ja) 2007-08-14 2014-06-25 ルードヴィッヒ インスティテュート フォー キャンサー リサーチ Ｅｇｆ受容体を標的とするモノクローナル抗体１７５ならびにその誘導体および用途
US20090269343A1 (en) 2008-04-11 2009-10-29 Duke University Dual Specific Immunotoxin for Brain Tumor Therapy
CN104524590B (zh) 2008-04-30 2019-06-21 伊缪诺金公司 交联剂和它们的用途
US9109026B2 (en) 2008-06-03 2015-08-18 Abbvie, Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
AU2010210646B2 (en) 2009-02-05 2015-10-29 Immunogen, Inc. Novel benzodiazepine derivatives
TW201116624A (en) 2009-05-01 2011-05-16 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
US8506963B2 (en) 2009-09-22 2013-08-13 Shanghai Cancer Institute Anti-EFGRv3 monoclonal antibody
US20110076232A1 (en) 2009-09-29 2011-03-31 Ludwig Institute For Cancer Research Specific binding proteins and uses thereof
US10886995B2 (en) * 2018-11-02 2021-01-05 Qualcomm Incorporated Beam management signaling

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