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KR20220025946A - 항-ｅｇｆｒ 항체 및 항체 약물 접합체 - Google Patents

항-ｅｇｆｒ 항체 및 항체 약물 접합체 Download PDF

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KR20220025946A
KR20220025946A KR1020227005625A KR20227005625A KR20220025946A KR 20220025946 A KR20220025946 A KR 20220025946A KR 1020227005625 A KR1020227005625 A KR 1020227005625A KR 20227005625 A KR20227005625 A KR 20227005625A KR 20220025946 A KR20220025946 A KR 20220025946A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antibody
seq
amino acid
egfr
acid sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
KR1020227005625A
Other languages
English (en)
Inventor
에드워드 비. 레일리
앤드류 씨. 필립스
로렌조 베나툴
프리츠 지. 뷰캐넌
조나단 에이. 뮬브로크
충-밍 시에
제니퍼 페레즈
Original Assignee
애브비 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=52997522&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR20220025946(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 애브비 인코포레이티드 filed Critical 애브비 인코포레이티드
Priority to KR1020227029416A priority Critical patent/KR20220123560A/ko
Publication of KR20220025946A publication Critical patent/KR20220025946A/ko
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Abstract

본 발명은, 항-표피 성장 인자(EGFR: epidermal growth factor) 항체 및 항체 약물 접합체(ADC: antibody drug conjugate)에 관한 것이고, 상기 항체 및 ADC를 사용한 조성물 및 사용하는 방법을 포함한다.

Description

항-ＥＧＦＲ 항체 및 항체 약물 접합체{ANTI-EGFR ANTIBODIES AND ANTIBODY DRUG CONJUGATES}
관련 출원
본 출원은 2014년 3월 21일에 제출된 U.S. 가특허출원 제61/968,819호에 대한 우선권 이익을 주장한다. 상기 언급된 우선권 출원의 내용은 이의 전문이 본원에 참조로 인용된다.
서열목록
본 출원은, ASCII 포맷의 전자로 제출되었고 전문이 본원에 참조로 인용되는 서열목록을 포함한다. 2015년 3월 12일에 생성된 상기 ASCII 사본의 파일명은 117813-06202_SL.txt이고 크기는 110,863 바이트이다.
본 발명의 배경
사람 표피 성장 인자 수용체(HER-1 또는 Erb-B1로서도 공지되어 있고, 본원에는 "EGFR"로서 나타냄)는 c-erbB 원발종양 유전자(protooncogene)에 의해 암호화된 170kDa의 막관통 수용체이고, 고유한 티로신 키나제 활성을 나타낸다(Modjtahedi et al., Br. J. Cancer 73:228-235 (1996); Herbst and Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002)). SwissProt 데이터베이스 엔트리 P00533은 사람 EGFR의 서열을 제공한다. EGFR은, 세포 증식, 분화, 세포 생존, 아폽토시스(apoptosis), 혈관신생, 세포분열 유도(mitogenesis), 및 전이를 제어하는 신호 전달 경로의 활성화를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 티로신-키나제 매개된 신호 전달 경로를 통해 다수의 세포 프로세스를 조절한다(Atalay et al., Ann. Oncology 14:1346-1363 (2003); Tsao and Herbst, Signal 4:4-9 (2003); Herbst and Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002); Modjtahedi et al., Br. J. Cancer 73:228-235 (1996)).
EGFR의 공지의 리간드로는 EGF, TGFA/TGF-알파, 앰피레귤린(amphiregulin), 에피젠(epigen)/EPGN, BTC/베타셀룰린, 에피레귤린/EREG 및 HBEGF/헤파린-결합 EGF가 포함된다. EGFR에 의한 리간드 결합은 주요 세포질 잔기들의 수용체 동종- 및/또는 이종이량체화 및 자가 인산화(autophosphorylation)를 유발한다. 인산화된 EGFR은, 결과적으로 적어도 하기 주요 다운스트림 신호전달 캐스케이드: RAS-RAF-MEK-E가 PI3 키나제-AKT, PLC감마-PKC, 및 STAT 모듈(module)을 포함하는 신호전달 캐스케이드(cascade) 다운스트림의 복합체를 활성화하는 GRB2와 같은 어댑터 단백질을 유입한다. 또한, 이러한 자가 인산화는, 이들 자체의 포스포티로신-결합 SH2 도메인을 통해 인산화된 티로신과 회합하는 몇몇의 다른 단백질에 의해 다운스트림 활성화 및 신호전달을 유도한다. 이들 다운스트림 신호전달 단백질은 세포 증식을 초래하는 몇몇의 신호 전달 캐스케이드, 주로 MAPK, Akt 및 JNK 경로를 개시한다. 또한, EGFR에 의한 리간드 결합은 NF-카파-B 신호전달 캐스케이드를 활성화할 수 있다. 또한, 리간드 결합은 직접적으로, 단백질의 GTPase 활성을 활성화하여 G 단백질-커플링된 수용체 신호전달에 신호를 전달하는 EGF 수용체에 잠재적으로 커플링하는 RGS16과 같은 다른 단백질을 직접적으로 인산화한다. 리간드 결합은 또한 MUC1을 인산화하고 SRC 및 CTNNB1/베타-카테닌과의 이의 상호작용을 증가시킨다.
EGFR의 과발현은 방광, 뇌, 두경부, 췌장, 폐, 유방, 난소, 결장, 전립선, 및 신장의 암을 포함하는 다수의 사람 악성 조건으로 보고되었다(Atalay et al., Ann. Oncology 14:1346-1363 (2003); Herbst and Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002); 및 Modjtahedi et al., Br. J. Cancer 73:228-235 (1996)). 다수의 이들 조건에 있어서, EGFR의 과발현은 환자의 좋지 못한 예후와 상호관련되어 있거나 이와 관계가 있다. (Herbst and Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002); 및 Modjtahedi et al., Br. J. Cancer 73:228-235 (1996)). 또한, EGFR은 정상 조직의 세포, 구체적으로는 피부, 간 및 위장관의 상피 조직에서도 발현되지만, 악성 세포에서보다 일반적으로 더 낮은 수준으로 발현된다(Herbst and Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002)).
EGFR 유전자의 증폭을 포함하는 종양의 유의한 비율(즉, EGFR 유전자의 다중 카피) 또한 de2-7 EGFR, ΔEGFR, EGFRvIII, 또는 Δ2-7(본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어들)(Olapade-Olaopa et al. (2000) Br. J. Cancer. 82, 186-94)로서 공지되어 있는 절단된(truncated) 버전의 수용체를 공동-발현시킨다(Wikstrand et al. (1989) J. Neurovirol. 4, 148-158). de2-7 EGFR에서 보여지는 재배열은 엑손 2 내지 7에 걸쳐 801개 뉴클레오타이드가 결여되어 있는 프레임-내(in-frame) 성숙 mRNA를 초래한다(Wong et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 2965-9; Yamazaki et al. (1990) Jpn. J. Cancer Res. 81, 773-9; Yamazaki et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8, 1816-20; 및 Sugawa et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 8602-6). 상응하는 EGFR 단백질은 세포외 도메인 잔기 6 내지 273을 포함하는 267개 아미노산 결실, 및 융합 연결부(fusion junction)에 신규한 글리신을 갖는다(Sugawa et al., 1990). 이러한 결실은 글리신 잔기의 삽입과 함께 결실 인터페이스(interface)에 고유한 연결 펩타이드(junctional peptide)를 생성시킨다(Sugawa et al., 1990).
EGFRvIII는 신경교종, 유암, 폐, 난소 및 전립선을 포함하는 다수의 종양 유형에서 보고되어 왔다(Wikstrand et al. (1997) Cancer Res. 57, 4130-40; Olapade-Olaopa et al. (2000) Br. J. Cancer. 82, 186-94; Wikstrand, et al. (1995) Cancer Res. 55, 3140-8; Garcia de Palazzo et al. (1993) Cancer Res. 53, 3217-20). 이러한 절단된 수용체는 리간드에 결합하지 않지만, 낮은 구성성분 활성(constitutive activity)을 갖고 누드 마우스에서 종양 이종이식편으로서 성장된 신경교종 세포에 유의한 성장 이점을 부여하고(Nishikawa et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 7727-31), NIH3T3(Batra et al. (1995) Cell Growth Differ. 6, 1251-9) 세포 및 MCF-7 세포를 형질전환시킬 수 있다. 신경교종에서 de2-7 EGFR에 의해 이용되는 세포의 기작은 완전하게 정의되어 있는 것은 아니지만, 아폽토시스의 감소(Nagane et al., (1996) Cancer Res. 56, 5079-86) 및 증식의 소규모 향상(Nagane et al., 1996)을 포함하는 것으로 보고되어 있다. 이러한 절단된 수용체의 발현이 종양 세포에 제한되는 바와 같이, 이는 항체 치료요법에 대해 고도로 특이적인 표적을 나타낸다.
항체 약물 접합체(ADC)는, 화학적 링커를 통해 세포독성 약물에 접합된 항체를 포함하는 새로운 부류의 치료제를 나타낸다. ADC의 치료학적 개념은 약물과의 항체의 결합 능력들을 조합하는 것이고, 여기서, 항체는 표적 표면 항원에의 결합에 의해 종양 세포에 약물을 전달하는데 사용된다.
따라서, 당해 분야에는 암의 치료시 치료학적 목적을 위해 사용될 수 있는 항-EGFR 항체 및 ADC에 대한 요구가 남아있다.
본 발명의 요약
소정 양상에서, 본 발명은 EGFRvIII에 특이적으로 결합하는 항-EGFR 항체 및 항체 약물 접합체(ADC)를 제공한다.
한 실시형태에서, 본 발명은, 항-사람 표피 성장 수용체(항-hEGFR: anti-human epidermal growth factor receptor) 항체 또는 이의 항원 결합부로서, 아미노산 서열 CGADSYEMEEDGVRKC(서열번호 45) 내의 에피토프에 결합하거나, 경쟁적 결합 검정시 표피 성장 인자 수용체 변이체 III(EGFRvIII)(서열번호 33)에 결합하기 위해 제2 항-hEGFR 항체와 경쟁하고(여기서, 상기 제2 항-EGFR 항체는 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다); 표면 플라스몬 공명에 의한 측정시 약 1 x 10-6M 이하의 해리 상수(Kd)로 EGFR(1-525)(서열번호 47)에 결합하고; 생체내 사람 비-소세포 폐 암종(NSCLC) 이종이식편 검정시, EGFR에 대해 특이적이지 않은 사람 IgG 항체에 비하여 약 50% 이상의 종양 성장 억제율 %(TGI%)로 종양 성장을 억제하는(여기서, 상기 사람 IgG 항체는 NSCLC 이종이식편 검정시 항-hEGFR 항체 또는 이의 항원 결합부와 동일한 용량 및 빈도로 투여된다), 항-사람 표피 성장 수용체(항-hEGFR) 항체 또는 이의 항원 결합부를 특징으로 한다.
본 발명의 소정 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합부는 표면 플라스몬 공명에 의한 측정시 약 1 x 10-6M 내지 약 1 x 10-10M의 Kd로 EGFR(1-525)(서열번호 47)에 결합한다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합부는 표면 플라스몬 공명에 의한 측정시 약 1 x 10-6M 내지 약 1 x 10-7M의 Kd로 EGFR(1-525)(서열번호 47)에 결합한다.
소정 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부는 표면 플라스몬 공명에 의한 측정시 약 8.2 x 10-9M 이하의 Kd로 EGFRvIII(서열번호 33)에 결합한다. 추가의 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합부는 표면 플라스몬 공명에 의한 측정시 약 8.2 x 10-9M 내지 6.3 x 10-10M의 Kd로 EGFRvIII(서열번호 33)에 결합한다. 몇몇의 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합부는 표면 플라스몬 공명에 의한 측정시 약 8.2 x 10-9M 내지 2.0 x 10-9M의 Kd로 EGFRvIII(서열번호 33)에 결합한다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합부는 생체내 사람 비-소세포 폐 암종(NSCLC) 이종이식편 검정시, EGFR에 대해 특이적이지 않은 사람 IgG 항체에 비하여 약 60% 이상 종양 성장을 억제한다.
소정 실시형태에서, 본 발명은, 항체 또는 이의 항원 결합부로서, 생체내 사람 비-소세포 폐 암종(NSCLC) 이종이식편 검정시, EGFR에 대해 특이적이지 않은 사람 IgG 항체에 비하여 약 70% 이상 종양 성장을 억제하는, 항체 또는 이의 항원 결합부를 특징으로 한다. 소정 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합부는 생체내 사람 비-소세포 폐 암종(NSCLC) 이종이식편 검정시, EGFR에 대해 특이적이지 않은 사람 IgG 항체에 비하여 약 80% 이상 종양 성장을 억제한다.
몇몇의 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합부는, 서열번호 12에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 도메인, 서열번호 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 도메인, 및 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1 도메인; 및 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 도메인, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 도메인, 및 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1 도메인을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합부는, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합부는, 서열번호 41에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역, 및 서열번호 43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합부는 서열번호 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합부는 아우리스타틴에 접합된다.
소정 실시형태에서, 본 발명은 또한 본원에 기술된 것과 같은 항체 또는 이의 항원 결합부를 암호화하는 단리된 핵산을 제공한다.
소정 실시형태에서, 본 발명은 또한 항-hEGFR 항체 또는 이의 항원 결합부로서, 서열번호 40에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 도메인, 서열번호 39에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 도메인, 및 서열번호 38에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1 도메인; 및 서열번호 37에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 도메인, 서열번호 36에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 도메인, 및 서열번호 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1 도메인을 포함하는, 항-hEGFR 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함한다.
소정 실시형태에서, 본 발명은 항-hEGFR 항체 또는 이의 항원 결합부로서, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 및 78로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 및 79로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항-hEGFR 항체 또는 이의 항원 결합부를 특징으로 한다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 항-hEGFR 항체 또는 이의 항원 결합부로서, 서열번호 10, 11, 및 12; 서열번호 16, 17, 및 18; 서열번호 10, 11, 및 19; 서열번호 20, 11, 및 12; 서열번호 21, 3, 및 22; 서열번호 16, 17, 및 19; 서열번호 2, 3, 및 4; 서열번호 10, 3, 및 12; 서열번호 80, 11, 및 18; 서열번호 80, 3, 및 18; 서열번호 20, 3, 및 12; 서열번호 80, 11, 및 12; 및 서열번호 81, 11, 및 22로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중쇄 CDR 세트(CDR1, CDR2, 및 CDR3); 및 서열번호 6, 7, 및 8; 서열번호 23, 24, 및 25; 서열번호 26, 27, 및 28; 서열번호 29, 30, 및 31; 서열번호 6, 7, 및 84; 서열번호 82, 83, 및 31; 및 서열번호 82, 27, 및 85로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 경쇄 CDR 세트(CDR1, CDR2 및 CDR3)를 포함하고, 여기서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합부는 서열번호 2, 3, 및 4의 중쇄 CDR 세트, 및 서열번호 6, 7, 및 8의 경쇄 CDR 세트 둘 다를 포함하지 않는, 항-hEGFR 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함한다. 몇몇의 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합부는 서열번호 41에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 및/또는 서열번호 43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함한다.
본 발명의 몇몇의 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합부는 사람 IgG 불변 도메인, 사람 IgM 불변 도메인, 사람 IgE 불변 도메인, 및 사람 IgA 불변 도메인으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중쇄 면역글로불린 불변 도메인을 포함한다. 몇몇의 실시형태에서, 상기 IgG 불변 도메인은 IgG1 불변 도메인, IgG2 불변 도메인, IgG3 불변 도메인, 및 IgG4 불변 도메인으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, 상기 항체는 다특이적 항체이다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합부는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 디설파이드 링크된 Fv, scFv, 단일 도메인 항체, 및 디아바디를 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합부는 조영제에 접합된다. 본 발명의 소정 실시형태에서, 상기 조영제는 방사성 표지, 효소, 형광성 표지, 발광성 표지, 생물발광성 표지, 자기 표지, 및 비오틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 본 발명의 다른 실시형태에서, 상기 방사성 표지는 인듐이다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원 결합부, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다.
몇몇의 실시형태에서, 본 발명은 또한 하나 이상의 약물에 접합된, 본원에 기술된 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는, 항체 약물 접합체(ADC)를 포함한다. 소정 실시형태에서, 상기 항체는, 아미노산 서열 CGADSYEMEEDGVRKC(서열번호 45) 내의 에피토프에 결합하거나, 경쟁적 결합 검정시 표피 성장 인자 수용체 변이체 III(EGFRvIII)(서열번호 33)에 결합하기 위해 제2 항-hEGFR 항체와 경쟁하고(여기서, 상기 제2 항-EGFR 항체는 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다); 표면 플라스몬 공명에 의한 측정시 약 1 x 10-6M 이하의 해리 상수(Kd)로 EGFR(1-525)(서열번호 47)에 결합하고; 생체내 사람 비-소세포 폐 암종(NSCLC) 이종이식편 검정시, EGFR에 대해 특이적이지 않은 사람 IgG 항체에 비하여 약 50% 이상의 종양 성장 억제율 %(TGI%)로 종양 성장을 억제하는(여기서, 상기 사람 IgG 항체는 NSCLC 이종이식편 검정시 항-hEGFR 항체 또는 이의 항원 결합부와 동일한 용량 및 빈도로 투여된다), 항-사람 표피 성장 인자 수용체(항-hEGFR) 항체 또는 이의 항원 결합부이다. 본 발명의 한 실시형태에서, 상기 하나 이상의 약물은 항-아폽토시스성 제제, 유사분열 억제제, 항-종양 항생제, 면역조절제, 유전자 치료요법을 위한 핵산, 알킬화제, 항-혈관신생제, 항-대사물질, 붕소-함유제, 화합물 보호제, 호르몬제, 항-호르몬제, 코르티코스테로이드, 광활성(photoactive) 치료학적 제제, 올리고뉴클레오타이드, 방사성 핵종 제제, 방사선 증감제, 토포이소머라제(topoisomerase) 억제제, 및 티로신 키나제 억제제로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 소정 실시형태에서, 상기 유사분열 억제제는 돌라스타틴, 아우리스타틴, 메이탄시노이드, 및 식물성 알칼로이드이다. 소정 실시형태에서, 상기 약물은 돌라스타틴, 아우리스타틴, 아우리스타틴, 메이탄시노이드, 및 식물성 알칼로이드이다. 아우리스타틴의 예로는 모노메틸아우리스타틴 F(MMAF) 또는 모노메틸아우리스타틴 E(MMAE)가 있다. 메이탄시노이드의 예로는 DM1, DM2, DM3, 및 DM4가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 소정 실시형태에서, 상기 항-종양 항생제는 악티노마이신, 안트라사이클린, 칼리케아마이신, 및 듀오카르마이신으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 소정 실시형태에서, 상기 악티노마이신은 피롤로벤조디아제핀(PBD)이다.
몇몇의 실시형태에서, 본 발명은 또한 아우리스타틴에 접합된 항-EGFR 항체를 포함하는 ADC로서, 상기 항체는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인, 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 아우리스타틴에 접합된 항-EGFR 항체를 포함하는 ADC를 포함한다. 한 실시형태에서, 상기 항체는 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함한다.
몇몇의 실시형태에서, 본 발명은 또한 하나 이상의 약물(MMAE가 포함되지만 이에 한정되는 것은 아님)에 접합된 항-EGFR 항체를 포함하는 ADC로서, 상기 약물의 1 내지 8개의 분자들이 항체에 접합되는, 하나 이상의 약물에 접합된 항-EGFR 항체를 포함하는 ADC를 포함한다. 한 실시형태에서, 상기 약물의 1 내지 4개의 분자들이 상기 ADC의 항체에 접합된다. 한 실시형태에서, 상기 약물의 2 내지 4개의 분자들이 상기 ADC의 항체에 접합된다.
몇몇의 실시형태에서, 본 발명은 또한 하나 이상의 약물에 접합된 항-EGFR 항체를 포함하는 ADC로서, 상기 약물이 말레이미도카프로일, 발린-시트룰린 링커를 통해 접합되는, 하나 이상의 약물에 접합된 항-EGFR 항체를 포함하는 ADC를 포함한다. 추가의 실시형태에서, 상기 약물은 말레이미도카프로일, 발린-시트룰린, p-아미노벤질옥시카르바밀(PABA) 링커를 통해 상기 항체에 접합된다.
몇몇의 실시형태에서, 본 발명은 또한 링커(예를 들면, 말레이미도카프로일, 발린-시트룰린)를 통해 모노메틸아우리스타틴 E(MMAE)에 공유결합적으로 링크된 항-EGFR IgG1 항체를 포함하는 ADC를 포함한다. 소정 실시형태에서, 상기 항체는 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 소정 실시형태에서, MMAE의 1 내지 4개의 분자들이 상기 항체에 링크된다.
몇몇의 실시형태에서, 본 발명은 또한 말레이미도카프로일, 발린-시트룰린, p-아미노벤질옥시카르바밀-모노메틸아우리스타틴 E(mc-vc-PABA-MMAE)에 공유결합적으로 링크된 항-EGFR IgG1 항체를 포함하는 ADC로서, 상기 항체는 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 서열번호 5에 지시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서, MMAE의 1 내지 4개의 분자들이 상기 항체에 링크되는, ADC를 포함한다. 소정 실시형태에서, 상기 항체는 서열번호 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하고, 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 소정 실시형태에서, MMAE의 2 내지 4개의 분자들은 상기 항체에 링크된다. 소정 실시형태에서, 상기 EGFR 항체는 도 11에 도시된 바와 같이 mc-vc-PABA-MMAE에 링크된다.
몇몇의 실시형태에서, 본 발명은 또한 사람 EGFR에 특이적인 IgG1 항체, MMAE, 및 상기 항체에 MMAE를 공유결합적으로 부착시키는 링커를 포함하는, EGFR-지시된 ADC를 포함한다. 소정 실시형태에서, 상기 항체는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인, 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고; 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시형태에서, 상기 항체는 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은, 서열번호 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 복수의 본원에 기술된 ADC, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 ADC 혼합물을 포함하는, 약제학적 조성물을 포함한다. 소정 실시형태에서, 상기 ADC 혼합물은 2 내지 4의 평균 약물 대 항체 비(DAR)를 갖는다. 다른 실시형태에서, 상기 ADC 혼합물은 각각 2 내지 8의 DAR을 갖는 ADC를 포함한다. 소정 실시형태에서, 상기 ADC 혼합물은 약 2.4 내지 약 3.6의 평균 약물 대 항체 비(DAR)를 갖는다.
소정 실시형태에서, 본 발명은 암을 갖는 대상체의 치료 방법으로서, 상기 암을 갖는 대상체에게 본원에 기술된 약제학적 조성물을 투여함을 포함하여 상기 대상체가 치료되도록 하는, 암을 갖는 대상체의 치료 방법을 포함한다. 한 실시형태에서, 상기 암은 유방암, 폐암, 교모세포종, 전립선암, 췌장암, 결장암, 두경부암, 및 신장암으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 한 실시형태에서, 상기 암은 유방암, 폐암, 교모세포종, 전립선암, 췌장암, 결장암, 결장직장암, 두경부암, 중피종, 신장암, 편평 세포 암종, 삼중 음성 유방암, 및 비-소세포 폐암으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 한 실시형태에서, 상기 암은 유방암이다. 한 실시형태에서, 상기 암은 폐암이다. 한 실시형태에서, 상기 암은 전립선암이다. 한 실시형태에서, 상기 암은 췌장암이다. 한 실시형태에서, 상기 암은 결장암이다. 한 실시형태에서, 상기 암은 두경부암이다. 한 실시형태에서, 상기 암은 신장암이다. 한 실시형태에서, 상기 암은 결장직장암이다. 한 실시형태에서, 상기 암은 중피종이다. 한 실시형태에서, 상기 암은 편평 세포 암종이다. 한 실시형태에서, 상기 암은 삼중 음성 유방암이다. 한 실시형태에서, 상기 암은 비-소세포 폐암이다. 소정 실시형태에서, 상기 편평 세포 암종은 편평 폐암 또는 편평 두경부암이다.
또 다른 실시형태에서, 상기 암은 EGFR의 증폭을 포함하거나 EGFR을 과발현시킨다. 소정 실시형태에서, 상기 암은 EGFR 과발현을 갖는 것으로 특성확인된다. 소정 실시형태에서, 상기 암은 EGFR 증폭을 갖는 것으로 특성확인된다.
소정 실시형태에서, 본 발명은 고형 종양을 갖는 대상체에서의 고형 종양 성장을 억제하거나 감소시키기 위한 방법으로서, 상기 고형 종양을 갖는 대상체에게 본원에 기술된 약제학적 조성물을 투여함을 포함하여 상기 고형 종양 성장이 억제되거나 감소되는, 고형 종양을 갖는 대상체에서의 고형 종양 성장을 억제하거나 감소시키기 위한 방법을 추가로 포함한다. 소정 실시형태에서, 상기 고형 종양은 EGFR 과발현을 갖는 것으로 특성확인된다. 소정 실시형태에서, 상기 고형 종양은 EGFR 증폭을 갖는 것으로 특성확인된다.
본 발명의 한 실시형태에서, 본 발명은 고형 종양을 갖는 대상체에서의 고형 종양 성장을 억제하거나 감소시키기 위한 방법으로서, 상기 고형 종양을 갖는 대상체에게 본원에 기술된 항체 또는 ADC의 유효량을 투여함을 포함하여 상기 고형 종양 성장이 억제되거나 감소되는, 고형 종양을 갖는 대상체에서의 고형 종양 성장을 억제하거나 감소시키기 위한 방법을 제공한다.
소정 실시형태에서, 상기 고형 종양은 EGFR 발현 고형 종양 또는 EGFRvIII 양성 고형 종양이다. 다른 실시형태에서, 상기 고형 종양은 비-소세포 폐 암종 또는 교모세포종이다. 다른 실시형태에서, 상기 고형 종양은 편평 세포 암종이다.
본 발명의 한 실시형태에서, 본 발명은 암을 갖는 대상체의 치료 방법으로서, 하나 이상의 아우리스타틴에 접합된, 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 ADC의 유효량을 투여함을 포함하고, 여기서, 상기 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합부는 IgG 이소타입이고; 서열번호 12에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인, 서열번호 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고; 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는, 암을 갖는 대상체의 치료 방법을 제공한다. 소정 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합부는 mc-vc-PABA-MMAE에 링크된다.
소정 실시형태에서, 본 발명은 암을 갖는 대상체의 치료 방법으로서, 상기 대상체에게 본원에 기술된 약제학적 조성물을 추가의 제제 또는 추가의 치료요법과 병용하여 투여함을 포함하는, 암을 갖는 대상체의 치료 방법을 포함한다. 소정 실시형태에서, 상기 추가의 제제는 항-PD1 항체(예를 들면, 펨브롤리주맙(Keytruda®) 또는 니볼루맙), 항-CTLA-4 항체(예를 들면, 이필리무맙), 이브루티닙, 두벨리십, 이델랄리십, 베네토클락스, 및 테모졸로미드로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 소정 실시형태에서, 상기 추가의 치료요법은 방사선이다. 소정 실시형태에서, 상기 추가의 제제는 항-PD1 항체(예를 들면, 펨브롤리주맙(Keytruda®) 또는 니볼루맙)이다. 소정 실시형태에서, 상기 추가의 제제는 항-CTLA-4 항체(예를 들면, 이필리무맙)이다. 소정 실시형태에서, 상기 추가의 제제는 이브루티닙이다. 소정 실시형태에서, 상기 추가의 제제는 두벨리십이다. 소정 실시형태에서, 상기 추가의 제제는 이델랄리십이다. 소정 실시형태에서, 상기 추가의 제제는 베네토클락스이다. 소정 실시형태에서, 상기 추가의 제제는 테모졸로미드이다.
소정 실시형태에서, 본 발명은 또한 본원에 기술된 바와 같은 항체 또는 이의 항원 결합부를 암호화하는 단리된 핵산을 제공한다. 추가로, 본 발명은, 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포, 예를 들면, 원핵생물 또는 진핵생물 세포(예를 들면, 동물 세포, 원생생물 세포, 식물 세포, 및 진균 세포)를 포함한다. 본 발명의 실시형태에서, 상기 동물 세포는 포유동물 세포, 곤충 세포, 및 조류 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 한 실시형태에서, 상기 포유동물 세포는 CHO 세포, COS 세포, 및 Sp2/0 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
소정의 실시형태에서, 본 발명은 아우리스타틴에 접합된 항-hEGFR 항체를 포함하는 항-hEGFR 항체 약물 접합체(ADC)로서, 상기 항체는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 도메인, 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 도메인, 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1 도메인; 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 도메인, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 도메인, 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1 도메인을 포함하는, 아우리스타틴에 접합된 항-hEGFR 항체를 포함하는 항-hEGFR 항체 약물 접합체(ADC)를 특징으로 한다. 한 실시형태에서, 상기 항체는 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 항체는 IgG 중쇄 면역글로불린 불변 도메인을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 IgG는 IgG1 또는 IgG4 중쇄 면역글로불린 불변 도메인이다.
한 실시형태에서, 본 발명은 ADC로서, 상기 아우리스타틴이 모노메틸아우리스타틴 F(MMAF) 또는 모노메틸아우리스타틴 E(MMAE)인, ADC를 포함한다. 한 실시형태에서, 본 발명은 ADC로서, 상기 아우리스타틴이 모노메틸아우리스타틴 F(MMAF)인, ADC를 포함한다. 한 실시형태에서, 본 발명은 ADC로서, 상기 아우리스타틴이 모노메틸아우리스타틴 E(MMAE)인, ADC를 포함한다.
추가의 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하고, 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 상기 항-EGFR 항체는, 말레이미도카프로일, 발린-시트룰린, p-아미노벤질알콜(mc-vc-PABA)을 포함하는 링커에 의해 아우리스타틴에 공유결합적으로 링크된다.
한 실시형태에서, 본 발명은 항-EGFR 및 방사성 표지, 예를 들면, 인듐을 포함하는 ADC를 포함한다.
한 실시형태에서, 본원에 기술된 항-EGFR 항체는 하나 이상의 피롤로벤조디아제핀(PBD)에 공유결합적으로 링크된다. 소정 실시형태에서, 본원에 개시된 항-EGFR 항체는 도 21에 기술된 바와 같은 PBD(즉, SGD-1882)에 링크된다.
몇몇의 실시형태에서, 본 발명은 본원에 기술된 ADC, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 특징으로 한다. 소정 실시형태에서, 본 발명은 본원에 기술된 ADC를 포함하는 ADC 혼합물을 포함하는 약제학적 조성물로서, 상기 ADC 혼합물 중의 평균 약물 대 항체 비(DAR) 범위는 2 내지 4인, 약제학적 조성물을 특징으로 한다. 소정 실시형태에서, 상기 ADC 혼합물 중의 평균 약물 대 항체 비(DAR) 범위는 2.4 내지 3.6이다.
한 실시형태에서, 본 발명은 항-hEGFR 항체 약물 접합체(ADC)를 포함하는 ADC 혼합물, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물로서, 상기 ADC 혼합물은 2 내지 4의 평균 약물 대 항체 비(DAR)를 갖고, 여기서, 상기 ADC는, 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 도메인, 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 도메인, 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1 도메인; 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 도메인, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 도메인, 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1 도메인을 포함하는 항-hEGFR 항체에 접합된 모노메틸아우리스타틴 E(MMAE)를 포함하는, 약제학적 조성물을 특징으로 한다.
한 실시형태에서, 상기 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 항-EGFR 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 상기 항체는 IgG 중쇄 면역글로불린 불변 도메인을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 본 발명은 IgG1 또는 IgG4 중쇄 면역글로불린 불변 도메인을 갖는 항체를 포함한다. 한 실시형태에서, 본 발명은 IgG1 이소타입인 항체를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 포함한다. 한 실시형태에서, 본 발명은, 말레이미도카프로일, val-cit, PABA 링커에 의해 항체에 접합되는 MMAE를 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 한 실시형태에서, 본 발명은 암을 갖는 대상체의 치료 방법으로서, 상기 대상체에게 본원에 기술된 항체 또는 ADC를 포함하는 약제학적 조성물을 투여함을 포함하여 상기 암을 갖는 대상체가 치료되도록 하는, 암을 갖는 대상체의 치료 방법을 제공한다. 한 실시형태에서, 상기 암은 유방암, 폐암, 교모세포종, 전립선암, 췌장암, 결장암, 두경부암, 및 신장암으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 한 실시형태에서, 상기 암은 유방암, 폐암, 교모세포종, 전립선암, 췌장암, 결장암, 결장직장암, 두경부암, 중피종, 신장암, 편평 세포 암종, 삼중 음성 유방암, 및 비-소세포 폐암으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 또 다른 실시형태에서, 상기 암은 EGFR의 증폭을 포함하거나 EGFR을 과발현한다. 한 실시형태에서, 상기 편평 세포 암종은 편평 폐암 또는 편평 두경부암이다. 한 실시형태에서, 상기 암은 EGFR 과발현 암이다. 한 실시형태에서, 상기 암은 EGFR 증폭된 것으로 특성확인된다. 한 실시형태에서, 상기 암은 유방암이다. 한 실시형태에서, 상기 암은 폐암이다. 한 실시형태에서, 상기 암은 전립선암이다. 한 실시형태에서, 상기 암은 췌장암이다. 한 실시형태에서, 상기 암은 결장암이다. 한 실시형태에서, 상기 암은 두경부암이다. 한 실시형태에서, 상기 암은 신장암이다. 한 실시형태에서, 상기 암은 결장직장암이다. 한 실시형태에서, 상기 암은 중피종이다. 한 실시형태에서, 상기 암은 편평 세포 암종이다. 한 실시형태에서, 상기 암은 삼중 음성 유방암이다. 한 실시형태에서, 상기 암은 비-소세포 폐암이다. 소정 실시형태에서, 상기 편평 세포 암종은 편평 폐암 또는 편평 두경부암이다.
또한, 소정 실시형태에서, 본 발명은 고형 종양을 갖는 대상체에서의 고형 종양 성장을 억제하거나 감소시키기 위한 방법으로서, 상기 방법은 상기 고형 종양을 갖는 대상체에게 본원에 기술된 약제학적 조성물을 투여함을 포함하여 상기 고형 종양 성장이 억제되거나 감소되는, 고형 종양을 갖는 대상체에서의 고형 종양 성장을 억제하거나 감소시키기 위한 방법을 제공한다. 한 실시형태에서, 상기 고형 종양은 비-소세포 폐 암종 또는 교모세포종이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 고형 종양은 EGFRvIII 양성 종양 또는 EGFR-발현 고형 종양이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 고형 종양은 EGFR 과발현 고형 종양이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 고형 종양은 EGFR 증폭된 종양이다. 한 실시형태에서, 상기 고형 종양은 증폭된 EGFR을 갖는 비-소세포 폐 암종이다. 한 실시형태에서, 상기 고형 종양은 EGFR 과발현을 갖는 비-소세포 폐암종이다. 한 실시형태에서, 상기 고형 종양은 증폭된 EGFR을 갖는 교모세포종이다. 한 실시형태에서, 상기 고형 종양은 EGFR 과발현을 갖는 교모세포종이다.
소정 실시형태에서, 본 발명은, 병용 치료요법에 의해 본원에 기술된 약제학적 조성물이 이를 필요로 하는 대상체(예를 들면, 암 또는 고형 종양을 갖는 대상체)에게 투여되는 병용 치료요법을 제공한다. 본원에 기술된 약제학적 조성물은 추가의 제제의 투여 또는 추가의 치료요법과 동시에, 전에 또는 후에 투여될 수 있다. 소정 실시형태에서, 상기 추가의 제제는 항-PD1 항체, 항-CTLA-4 항체, 테모졸로미드, bcl-xl 억제제, 및 니코틴아미드 포스포리보실트랜스퍼라제(NAMPT) 억제제로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 또 다른 실시형태에서, 상기 추가의 제제는 화학치료학적 제제이다. 소정 실시형태에서, 상기 추가의 치료요법은 방사선이다. 다른 실시형태에서, 상기 추가의 제제는 이브루티닙(Imbruvica®, Pharmacyclics)이다. 다른 실시형태에서, 상기 추가의 제제는 두벨리십이다. 다른 실시형태에서, 상기 추가의 제제는 이델랄리십(Zydelig®, Gilead Sciences, Inc.)이다. 다른 실시형태에서, 상기 추가의 제제는 베네토클락스(ABT-199/GDC-0199, AbbVie, Inc.)이다. 소정 실시형태에서, 상기 추가의 제제는 항-PD1 항체(예를 들면, 펨브롤리주맙(Keytruda®) 또는 니볼루맙)이다. 소정 실시형태에서, 상기 추가의 제제는 항-CTLA-4 항체(예를 들면, 이필리무맙)이다. 소정 실시형태에서, 상기 추가의 제제는 테모졸로미드이다.
소정 실시형태에서, 본 발명은 본 원에 기술된 항체의 항원 결합 영역, 예를 들면, CDR 또는 본원에 기술된 scFv를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 특징으로 한다. 소정 실시형태에서, 본 발명은, 서열번호 40에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인, 서열번호 39에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 38에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는 가변 중경쇄; 및 서열번호 37에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인, 서열번호 36에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 CAR을 특징으로 한다.
소정 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 12에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인, 서열번호 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는 가변 중경쇄; 및 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 CAR을 특징으로 한다.
도 1은 Ab1(서열번호 1 및 5) 및 AbA(서열번호 9 및 5)의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 영역 아미노산 서열을 제공한다. VH 및 VL 영역 내의 CDR 서열은 박스표시되어 있고, Ab1 VH 서열과 AbA VH 서열 사이의 차이는 어둡게 표시되어 있다.
도 2는 Ab1(서열번호 13 및 14) 및 AbA(서열번호 13 및 15)에 대한 전장 경쇄 및 중쇄를 기술한다. 중쇄에 있어서 Ab1 서열과 AbA 서열 사이의 차이는 강조되어 있다.
도 3은 Ab1 및 Ab2와 비교한 다중 Ab1 변이체 항체에 대한 Biacore 결합 검정 친화도 측정을 요약하는 표를 제공한다. EGFR(1-525) 및 EGFRvIII를 결합 분석에 사용하였다. 도 3에 기술된 바와 같은 ka(M-1 s-1)는 항체/항원 복합체를 형성하기 위한 항원에의 항체의 회합을 위한 속도 상수를 나타내고, kd(s-1)는 항체/항원 복합체로부터의 항체의 해리를 위한 오프 속도 상수를 나타내고, Kd(M)는 평형 해리 속도 상수를 나타낸다.
도 4는 AbA가 Ab1에 비하여 A431 종양 세포(사람 편평 암종 세포)에 개선된 결합을 가졌지만, Ab2와 비교하여 더 낮은 결합 친화도를 가졌음을 보여주는 FACS 분석의 그래프 요약을 제공한다.
도 5는 Ab1 변이체 항체가 Ab1과 동일한 EGFR 에피토프를 인식함을 나타내는 FACS 경쟁 검정으로부터의 결과를 도시한다.
도 6은 EGFR(1-525)에 대한 Ab1 및 Ab1 변이체 항체의 결합의 요약을 제공한다. 닫힌 원은 Ab1 또는 Ab2(대조군)를 나타내고 열린 원은 Ab1 변이체 항체를 나타낸다. 원들은 도 7에 제공된 데이터를 요악하는 그룹 1 및 그룹 2를 나타낸다.
도 7은 시험관내에서 상이한 세포주에 대한 Ab1 및 Ab1 변이체 항체의 활성을 시험하는 웨스턴 블롯 분석으로부터의 결과를 제공한다. SCC-15(도 7a)로부터의 세포 및 H292 세포를 실시예 4에 기술된 조건에 노출시켰고, 항-포스포티로신 EGFR(pY EGFR), 항-EGFR(tot EGFR(총 EGFR)), 및 항-액틴(액틴) 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 분석하였다. 도 7a는 SCC-15 세포에서 EGFR의 EGF-매개된 티로신 인산화를 억제하는 Ab1, Ab2 및 Ab1 변이체 항체의 능력을 보여주는 결과를 제공한다. 도 7b는 H292 세포에서 EGFR의 EGF-매개된 티로신 인산화를 억제하는 Ab1, Ab2 및 Ab1 변이체 항체의 능력을 보여주는 결과를 제공한다.
도 8은 Ab1, Ab2 및 Ab1 변이체를 포함하는 pEGFR ELISA 검정의 결과(도 8a) 및 A431 억제 연구로부터의 Ab2 및 AbP와 비교한 Ab1의 억제 수준(도 8b)을 도시한다. 도 8a의 Y-축은 450nm에서의 광학 밀도(OD)이다.
도 9는 FACS 결합 검정을 이용하여 야생형 EGFR을 발현하는 정상 사람 표피 각질세포에의 Ab1, Ab2 및 Ab1 변이체 항체의 결합을 그래픽으로 도시한다.
도 10은 Ab1, Ab2, 및 사람 IgG(huIgG) 대조군에 비교하여 사람 NSCLC 암종 이종이식편에서의 종양 성장을 억제하는 AbA, AbG, AbK, AbM, 및 AbP의 능력을 비교하는 마우스 이종이식편 억제 검정의 결과를 그래픽으로 도시한다. 화살표는 각종 항체의 투여 시점을 나타낸다.
도 11은 AbA-말레이미도카프로일-vc-PABA-MMAE ADC(본원에 "AbA-vcMMAE"로서도 나타냄)의 구조를 제공한다.
도 12는 AbA-vcMMAE의 정제의 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 분석으로부터의 결과를 제공한다.
도 13은 AbA-vcMMAE의 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 분석으로부터의 결과를 제공한다.
도 14는 항-EGFR ADC를 이용한 2회의 마우스 이종이식편 억제 검정으로부터의 결과를 그래프로 도시한다. 도 14a는 사람 NSCLC 암종 이종이식편으로부터 NCI-H1703 세포에서의 종양 성장 억제를 비교하는 마우스 이종이식편 억제 검정으로부터의 결과를 도시하고, 이는 Ab1 및 Ab1-mcMMAF ADC에 비하여 AbA-vcMMAE의 향상된 억제를 입증한다. 도 14b는 사람 NSCLC 암종 이종이식편으로부터 EBC-1 세포에서의 종양 성장 억제를 비교하는 마우스 이종이식편 억제 검정으로부터의 결과를 도시하고, 이는 Ab1 및 Ab1-mcMMAF ADC에 비하여 AbA-vcMMAE의 향상된 억제를 입증한다. 화살표는 항체의 투여 시점을 나타낸다.
도 15는 항-EGFR ADC를 이용한 마우스 이종이식편 억제 검정의 결과를 그래픽으로 도시한다. 도 15a는 NCI-H292 세포에서의 종양 성장 억제를 비교하는 마우스 이종이식편 억제 검정의 결과를 보여주고, 이는 정제된 Ab1-vcMMAE(Ab1-vcMMAEp), Ab1-vcMMAE, 정제된 Ab1-mcMMAF ADC(Ab1-mcMMAFp), 및 Ab1-mcMMAF(대 3개의 대조군)에 비하여 정제된 AbA-vcMMAE(AbA-vcMMAEp) 및 AbA-vcMMAE에 의한 향상된 억제를 입증한다. 도 15b는 NCI-H292 세포에서의 종양 성장 억제를 비교하는 마우스 이종이식편 억제 검정의 결과를 보여주고, 이는 정제된 AbA-vcMMAE(AbA-vcMMAEp)에 비하여 AbA-vcMMAE, 그리고 정제된 Ab1-vcMMAE(Ab1-vcMMAEp), Ab1-vcMMAE, Ab1-mcMMAF, 및 Ab1-mcMMAFp에 비하여 Aba-vcMMAE의 향상된 억제 활성을 입증한다. 도 15a 및 도 15b에서 분자들의 용량은 괄호 안에 표시된다, 즉, 3mg/kg 또는 6mg/kg이다. 화살표는 항체 또는 ADC의 투여 시점을 나타낸다. 도 15에서 대조군 2는, EGFR에 결합하지 않는 항-파상풍 독소 항체인 음성 대조군을 나타낸다.
도 16은 Ab1 변이체 가변 중쇄(VH) 라이브리러리 고안(도 16a) 및 Ab1 변이체 가변 경쇄(VL) 라이브러리 고안(도 16b)의 아미노산 서열을 제공한다.
도 17은 EGFR, 및 Ab1 및 Ab2에 의해 결합된 영역의 도해를 보여준다.
도 18은 항-EGFR ADC를 이용한 마우스 이종이식편 억제 검정(NCI-H292(NSCLC) 세포를 이용함)으로부터의 결과를 그래픽으로 도시한다. 분자들의 용량은 괄호 안에 표시한다, 즉, 3mg/kg 또는 6mg/kg이다. 화살표는 항체 또는 ADC의 투여 시점을 나타낸다.
도 19는 항-EGFR MMAE 및 MMAF ADC를 이용한 마우스 교모세포종 이종이식편 억제 검정으로부터의 결과를 그래프로 도시한다. 도 19에서 분자들의 용량은 괄호 안에 표시한다, 즉, 1mg/kg이다. 화살표는 항체 또는 ADC의 투여 시점을 나타낸다. 도 19에서 대조군 2는, EGFR에 결합하지 않는 항-파상풍 독소 항체인 음성 대조군을 나타낸다.
도 20a 및 도 20b는 AbA, Ab1, 또는 111In으로 표지된 대조군 항체를 이용하여 2개의 종양 모델(각각 SW48(도 20a) 및 EBC1(도 20b) 종양 모델)에서의 EGFR 발현 종양에 의한 항체 활용(uptake) 효능을 비교하는 단일-광자 방출 단층촬영(SPECT) 영상화 검정으로부터의 결과를 그래프로 도시한다.
도 21은 말레이미도카프로일-발린-알라닌 링커(총체적으로 SGD-1910으로서 나타냄)를 통해 항체(Ab)에 접합된 PBD 이량체(SGD-1882)의 구조를 도시한다.
본 발명의 각종 양상은 항-EGFR 항체 및 항체 단편, 항-EGFR ADC, 및 이들의 약제학적 조성물, 및 이러한 항체 및 단편을 제조하기 위한 핵산, 재조합 발현 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 사람 EGFR을 검출하기 위해, 사람 EGFR 활성을 억제하기 위해, 그리고 상피암, 유방암, 결장직장암, 두경부암(예를 들면, 교모세포종), 폐암, 신장암, 췌장암, 중피종, 편평 세포 암종(예를 들면, 편평 폐암 또는 편평 두경부암), 삼중 음성 유방암, 비-소세포 폐암, 및 전립선암과 같은 암을 치료하기 위해 본원에 기술된 항체 및 ADC를 사용하는 방법도 본 발명에 포함된다.
I. 정의
본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위해서, 우선 소정 용어들을 정의한다. 또한, 파라미터의 값 또는 값들의 범위가 인용될 때마다 상기 값 및 상기 인용된 값들의 중간 정도인 범위도 본 발명의 일부인 것으로 의도됨에 주목해야만 한다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "항-표피 성장 인자(EGF) 수용체 항체" 또는 "항-EGFR 항체"는 EGFR에 특이적으로 결합하는 항체를 말한다. 목적하는 항원, 즉, EGFR에 "결합하는" 항체는, 상기 항체가 항원 발현 세포를 표적으로 하는데 유용하도록 당해 항원에 충분한 친화도로 결합할 수 있는 항체이다. 바람직한 실시형태에서, 상기 항체는 사람 EGFR(hEGFR)에 특이적으로 결합한다. 항-EGFR 항체의 예는 하기 실시예 1에 개시되어 있다. 달리 나타내지 않는 한, 용어 "항-EGFR 항체"는 야생형 EGFR 또는 EGFR의 임의의 변이체, 예를 들면, EGFRvIII에 결합하는 항체를 말한다.
야생형 사람 EGFR의 아미노산 서열은 하기에 서열번호 32로서 제공되고, 여기서, 신호 펩타이드(아미노산 잔기 1 내지 24)는 밑줄 그어져 있고, 세포외 도메인의 아미노산 잔기(ECD, 아미노산 잔기 25 내지 645)는 볼드체로 강조되어 있다. EGFR의 절단된 야생형 ECD(본원에서 EGFR(1-525)로서도 나타냄)는 서열번호 47에 상응하고, 서열번호 32의 아미노산 1 내지 525와 동등하다. 야생형 EGFR의 성숙한 형태는 신호 펩타이드를 제외한 단백질, 즉, 서열번호 32의 아미노산 잔기 25 내지 1210에 상응한다.
Figure pat00001
사람 EGFR의 ECD의 아미노산 서열은 하기 서열번호 34로서 제공되고, 신호 서열(밑줄 그어짐)을 포함한다.
Figure pat00002
EGFR의 전체 구조는 도 17에 기술된다. EGFR의 ECD는 4개의 도메인들을 갖는다(Cochran et al. (2004) J. Immunol. Methods, 287, 147-158). 도메인 I 및 III는 리간드에 대한 높은 친화성 결합 부위의 형성에 기여하는 것으로 시사되어 왔다. 도메인 II 및 IV는, 단백질 폴딩을 안정화시키고 가능한 EGFR 이량체화 계면을 포함하는 시스테인이 풍부한 라미닌-유사 영역이다.
EGFR 변이체는 EGFR 유전자 증폭에 의해 달성된 유전자 재배열로부터 초래될 수 있다.
EGFRvIII는 사람 암에서 가장 흔히 발생하는 EGFR의 변이체이다(Kuan et al. Endocr Relat Cancer. 8(2):83-96 (2001)). 유전자 증폭 프로세스 동안, 융합 연결부(fusion junction)에 삽입된 글리신 잔기를 갖는 EGFR의 세포외 도메인에서 267개 아미노산 결실이 발생한다. 따라서, EGFRvIII에는 야생형 EGFR의 세포외 도메인의 아미노산 6 내지 273이 결여되어 있고, EGFRvIII는 연결부에 글리신 잔기 삽입을 포함한다. EGFR의 EGFRvIII 변이체는 세포외 도메인의 267개 아미노산 잔기들의 결실을 포함하고, 여기서, 글리신은 결실 연결부에 삽입된다. EGFRvIII 아미노산 서열은 하기에 서열번호 33으로서 나타낸다(ECD는 볼드체로 강조되어 있고 서열번호 46에 상응하고, 신호 서열은 밑줄 그어져 있다).
Figure pat00003
EGFRvIII는 리간드 독립적 방식으로의 구성적(constitutive) 신호전달을 통해 종양 진행에 기여한다. EGFRvIII는 정상 조직에서 발현되지 않는 것으로 알려져 있지만(Wikstrand et al. Cancer Research 55(14): 3140-3148 (1995); Olapade-Olaopa et al. Br J Cancer. 82(1):186-94 (2000)), 유방암, 신경교종, NSCL 암, 난소암, 및 전립선암을 포함하는 종양 세포에서 유의한 발현을 나타낸다(Wikstrand et al. Cancer Research 55(14): 3140-3148 (1995); Ge et al. Int J Cancer. 98(3):357-61 (2002); Wikstrand et al. Cancer Research 55(14): 3140-3148 (1995); Moscatello et al. Cancer Res. 55(23):5536-9 (1995); Garcia de Palazzo et al. Cancer Res. 53(14):3217-20 (1993); Moscatello et al. Cancer Res. 55(23):5536-9 (1995); and Olapade-Olaopa et al. 2(1):186-94 (2000)).
본원에 사용되는 "EGFR의 생물학적 활성"은, 표피 성장 인자(EGF)에의 결합, 종양 성장 인자 α(TGFα)에의 결합, 동종이량체화, JAK2 키나제 활성의 활성화, MAPK 키나제 활성의 활성화, 및 막관통 수용체 단백질 티로신 키나제 활성의 활성화를 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아닌 EGFR의 모든 고유한 생물학적 특성을 말한다.
항체 또는 ADC의 제2 화학 종과의 상호작용과 관련하여 본원에 사용되는 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하는"은 상기 상호작용이 화학 종 상의 특정 구조(예를 들면, 항원성 결정인자 또는 에피토프)의 존재에 의존적임을 의미하고; 예를 들면, 항체는 일반적으로 단백질보다는 특정 단백질 구조를 인식하고 이에 결합한다. 항체 또는 ADC가 에피토프 "A"에 대해 특이적인 경우, 표지된 "A" 및 항체를 포함하는 반응에서 에피토프 A(또는 A를 포함하지 않거나, 비표지된 A)를 함유하는 분자의 존재는 항체 또는 ADC에 결합된 표지된 A의 양을 감소시킬 것이다.
본원에 사용되는 어구 "hEGFR에 특이적으로 결합한다" 또는 "hEGFR에 대한 특이적 결합"은 Ab1 또는 Ab1 ADC와 동일하거나 이보다 더 큰 친화도로 hEGFR과 상호작용하는 항-EGFR 항체 또는 ADC의 능력을 말한다.
본원에 사용되는 용어 "EGFR(1-525)에 대한 특이적 결합" 또는 "EGFR(1-525)에 특이적으로 결합한다"는, EGFR(1-525)에 결합하고 표면 플라스몬 공명에 의한 측정시 2.3 x 10-6M 이하의 해리 상수(KD)를 갖는 항체 또는 ADC를 말한다.
용어 "항체"는 광범위하게는 일반적으로 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)의 4개의 폴리펩타이드 쇄들로 이루어진, 면역글로불린(Ig) 분자 또는 Ig 분자의 필수적인 표적 결합 특성을 보유하는 이의 기능성 단편, 돌연변이체, 변이체, 또는 유도체를 말한다. 이러한 돌연변이체, 변이체 또는 유도체 항체 포맷은 당해 분야에 공지되어 있다. 이의 비-제한적 실시형태는 하기에 논의된다.
전장 항체에서, 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에 HCVR 또는 VH로서 약칭함) 및 중쇄 불변 영역으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2, 및 CH3의 3개의 도메인들로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에 LCVR 또는 VL로서 약칭함) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 CL의 1개의 도메인으로 이루어진다. VH 및 VL 영역은, 프레임워크 영역(FR)이라고 칭하는 보다 보존된 영역들 사이에 개재된 상보성 결정 영역(CDR)이라고 칭하는 초가변성 영역들로 더 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단으로부터 카복시-말단으로 하기 순서: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4로 배열된 3개의 CDR들 및 4개의 FR들로 이루어진다. 면역글로불린 분자는 임의의 유형(예를 들면, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY) 및 클래스(예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스(subclass)로 이루어질 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 항체의 "항원 결합부"(또는 간략하게 "항체부")는 항원(예를 들면, hIL-13)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 말한다. 항체의 항원 결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있음이 밝혀졌다. 이러한 항체 실시형태는 또한 2개 이상의 상이한 항원들에 특이적으로 결합하는 이특이적, 이중 특이적, 또는 다-특이적 포맷일 수 있다. 용어 항체의 "항원 결합부" 내에 포함된 결합 단편의 예로는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인들로 이루어진 1가의 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디설파이드 가교에 의해 링크된 2개의 Fab 단편들을 포함하는 2가의 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인들로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암(arm)의 VL 및 VH 도메인들로 이루어진 Fv 단편; (v) dAb 단편(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546, Winter et al., PCT 공보 WO 90/05144 A1, 본원에 인용에 의해 포함됨); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR)이 포함된다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인인 VL 및 VH는 별도의 유전자들에 의해 암호화되지만, 이들은, 재조합 방법을 이용하여, VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가의 분자(단일 쇄 Fv(scFv)로서 공지되어 있음; 예를 들면, 문헌[Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883]을 참조한다)를 형성하는, 이들이 단일 단백질 쇄로서 제조되는 것을 가능하게 하는 합성 링커에 의해 연결될 수 있다. 이러한 단일 쇄 항체는 또한 용어 항체의 "항원 결합부" 내에 포함되는 것으로 의도된다. 본 발명의 소정 실시형태에서, scFv 분자는 융합 단백질에 포함될 수 있다. 단일 쇄 항체의 다른 형태, 예를 들면, 디아바디도 포함된다. 디아바디는, VH 및 VL 도메인들이 단일 폴리펩타이드 쇄 상에서 발현되지만, 동일한 쇄 상의 2개의 도메인들 사이에 쌍을 이루도록 하기에 너무 짧은 링커를 이용하여, 이에 의해 상기 도메인들이 다른 쇄의 상보성 도메인과 쌍을 이루도록 하여 2개의 항원 결합 부위를 생성시키는, 2가의 이특이적 항체이다(예를 들면, 문헌[Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123]을 참조한다). 이러한 항체 결합부는 당해 분야에 공지되어 있다(Kontermann and Dubel eds., Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York. 790 pp. (ISBN 3-540-41354-5)).
본원에 사용되는 용어 "항체 작제물"은 링커 폴리펩타이드 또는 면역글로불린 불변 도메인에 링크된 하나 이상의 본 발명의 항원 결합부를 포함하는 폴리펩타이드를 말한다. 링커 폴리펩타이드는 펩타이드 결합에 의해 연결된 2개 이상의 아미노산 잔기들을 포함하고, 하나 이상의 항원 결합부를 링크하는데 사용된다. 이러한 링커 폴리펩타이드는 당해 분야에 익히 공지되어 있다(예를 들면, 문헌[Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123]을 참조한다). 면역글로불린 불변 도메인은 중쇄 또는 경쇄 불변 도메인을 말한다. 예시의 사람 IgG 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 아미노산 서열은 당해 분야에 공지되어 있고 하기에 나타낸다.
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또한, 항체 또는 이의 항원 결합부는, 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩타이드와의 항체 또는 항체 부분의 공유결합적 또는 비공유결합적 회합에 의해 형성된 보다 큰 면역부착 분자의 부분일 수 있다. 이러한 면역부착 분자의 예로는 사량체성 scFv 분자를 제조하기 위한 스트렙트아비딘 코어 영역의 사용(Kipriyanov, S.M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) 및 2가의 비오티닐화된 scFv 분자를 제조하기 위한 시스테인 잔기, 마커 펩타이드, 및 C-말단 폴리히스티딘 태그의 사용이 포함된다(Kipriyanov, S.M., et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058). 항체 부분, 예를 들면, Fab 및 F(ab')2 단편은 전체 항체로부터 종래 기술, 예를 들면, 각각 전체 항체의 파파인 또는 펩신 분해를 이용하여 제조될 수 있다. 그러나, 항체, 항체 부분 및 면역부착 분자는 본원에 기술된 바와 같은 표준 재조합 DNA 기술을 이용하여 수득할 수 있다.
본원에 사용되는 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체를 실질적으로 포함하지 않는 항체(예를 들면, EGFR에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 EGFR 이외의 다른 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 실질적으로 포함하지 않는다)를 나타내는 것으로 의도된다. 그러나, EGFR에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 항원, 예를 들면, 다른 종 유래의 EGFR 분자에 교차-반응성을 가질 수 있다. 또한, 단리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질을 실질적으로 포함하지 않을 수 있다.
용어 "사람화된 항체"는 비사람 종(예를 들면, 마우스) 유래의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하지만, 여기서, VH 및/또는 VL 서열의 적어도 일부는 보다 "사람-유사"하도록, 즉, 사람 생식선 가변 서열에 보다 유사하도록 변경된 항체를 말한다. 특히, 용어 "사람화된 항체"는, 목적하는 항원에 면역특이적으로 결합하고, 실질적으로 사람 항체의 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역(FR) 및 실질적으로 비-사람 항체의 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체 또는 이의 변이체, 유도체, 유사체 또는 단편이다. CDR과 관련하여 본원에 사용되는 용어 "실질적으로"는 비-사람 항체 CDR의 아미노산 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR을 말한다. 사람화된 항체는, 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역들이 비-사람 면역글로불린(즉, 공여자 항체)의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 프레임워크 영역들이 사람 면역글로불린 컨센서스 서열의 것인, 실질적으로 모든 적어도 1개 및 전형적으로 2개의 가변 도메인(Fab, Fab', F(ab')2, FabC, Fv)을 포함한다. 바람직하게, 사람화된 항체는 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc), 전형적으로 사람 면역글로불린의 불변 영역의 적어도 일부를 포함한다. 몇몇의 실시형태에서, 사람화된 항체는 경쇄, 및 적어도 중쇄의 가변 도메인 둘 다를 포함한다. 상기 항체는 또한 중쇄의 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 CH4 영역을 포함할 수 있다. 몇몇의 실시형태에서, 사람화된 항체는 사람화된 경쇄만을 포함한다. 다른 실시형태에서, 사람화된 항체는 사람화된 중쇄만을 포함한다. 특정 실시형태에서, 사람화된 항체는 경쇄의 사람화된 가변 도메인 및/또는 사람화된 중쇄만을 포함한다.
사람화된 항체는 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE를 포함하는 면역글로불린의 임의의 클래스, 및 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 제한없이 포함하는 임의의 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 사람화된 항체는 1개 초과의 클래스 또는 이소타입 유래의 서열을 포함할 수 있고, 당해 분야에 익히 공지되어 있는 기술을 이용하여 원하는 이펙터 기능을 최적화하도록 특정 불변 도메인을 선택할 수 있다.
용어 "카바트 번호매김", "카바트 정의" 및 "카바트 레이블링"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 당해 분야에 인식되어 있는 이들 용어는 항체 또는 이의 항원 결합부의 중쇄 및 경쇄 가변 영역에서 다른 아미노산들보다 더 가변성(즉, 초가변성)인 아미노산 잔기 번호매김 시스템을 말한다(Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad, Sci. 190:382-391 and, Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). 중쇄 가변 영역에 관해서, 초가변성 영역은 CDR1에 대해 아미노산 위치 31 내지 35, CDR2에 대해 아미노산 위치 50 내지 65, 그리고 CDR3에 대해 아미노산 위치 95 내지 102의 범위이다. 경쇄 가변 영역에 관해서, 초가변성 영역은 CDR1에 대해 아미노산 위치 24 내지 34, CDR2에 대해 아미노산 위치 50 내지 65, 그리고 CDR3에 대해 아미노산 위치 89 내지 97의 범위이다.
본원에 사용되는 용어 "CDR"은 항체 가변 서열 내의 상보성 결정 영역을 말한다. 중쇄(HC) 및 경쇄(LC)의 각각의 가변 영역에는 3개의 CDR들이 존재하고, 이들은 각각의 가변 영역에 대해 CDR1, CDR2 및 CDR3(또는 구체적으로 HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3)이라고 명명한다. 본원에 사용되는 용어 "CDR 세트"는 항원에 결합할 수 있는 단일 가변 영역에서 발생하는 3개의 CDR들의 그룹을 말한다. 이들 CDR들의 정확한 경계는 상이한 시스템에 따라 별도로 정의되어 왔다. 카바트(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) and (1991))에 의해 기술된 시스템은 항체의 임의의 가변 영역에 적용가능한 명확한 잔기 번호매김 시스템을 제공할 뿐만 아니라 3개의 CDR들을 정의하는 정확한 잔기 경계도 제공한다. 이들 CDR은 카바트 CDR로서 나타낼 수 있다. 초티아(Chothia) 및 동료들(Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) 및 Chothia et al., Nature 342:877-883 (1989))은 카바트 CDR 내의 소정의 서브-부분은 아미노산 서열 수준에서 큰 다양성을 가짐에도 불구하고 거의 동일한 펩타이드 백본 입체구조를 채택함을 발견하였다. 이들 서브-부분은 L1, L2 및 L3 또는 H1, H2 및 H3으로서 명명하였고, 여기서, "L" 및 "H"는 각각 경쇄 및 중쇄 영역을 지명한다. 이들 영역은 카바트 CDR과 중첩되는 경계를 갖는 초티아 CDR로서 나타낼 수 있다. 카바트 CDR과 중첩되는 CDR을 한정하는 다른 경계는 문헌[Padlan (FASEB J. 9:133-139 (1995)) 및 MacCallum (J Mol Biol 262(5):732-45 (1996)]에 기재되어 있다. 또 다른 CDR 경계 한정은 상기 시스템들 중 하나를 엄격히 따르지 않을 수 있지만, 그럼에도 불구하고 카바트 CDR과 중첩될 것이고, 이들은 특정 잔기 또는 잔기들의 그룹 또는 심지어 전체 CDR이 항원 결합에 유의하게 영향을 미치지 않는다는 예측 또는 실험적 발견의 관점에서 단축되거나 연장될 수 있다. 본원에서 사용되는 방법은 이들 시스템 중 임의의 것에 따라 정의된 CDR을 이용할 수 있지만, 바람직한 실시형태는 카바트 또는 초티아 정의된 CDR을 사용한다.
본원에 사용되는 용어 "프레임워크" 또는 "프레임워크 서열"은 CDR을 뺀 가변 영역의 나머지 서열을 말한다. CDR 서열의 정확한 정의는 상이한 시스템에 의해 결정될 수 있으므로, 프레임워크 서열의 의미는 상응하여 상이하게 해석된다. 6개의 CDR(경쇄의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3, 및 중쇄의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3)은 또한 경쇄 및 중쇄 상의 프레임워크 영역을 각각의 쇄 상의 4개의 서브-영역(FR1, FR2, FR3 및 FR4)로 나누고, 여기서, CDR1은 FR1과 FR2 사이에 위치되고, CDR2는 FR2와 FR3 사이에 위치되고, CDR3은 FR3과 FR4 사이에 위치된다. 특정 서브-영역을 FR1, FR2, FR3 또는 FR4로서 구체화하지 않고, 다른 사람들에 의해 지칭되는 프레임워크 영역은 단일 자연 발생 면역글로불린 쇄의 가변 영역 내의 연합된 FR을 나타낸다. 본원에서 사용되는 바와 같이, FR은 4개의 서브-영역들 중 하나를 나타내고, FR들은 프레임워크 영역을 구성하는 4개의 서브-영역들 중 2개 이상을 나타낸다.
사람화된 항체의 프레임워크 및 CDR 영역은 모(parental) 서열과 정확하게 상응할 필요는 없다, 예를 들면, 공여자 항체 CDR 또는 컨센서스 프레임워크는 1개 이상의 아미노산 잔기의 치환, 삽입 및/또는 결실에 의해 돌연변이되어 해당 부위에서의 CDR 또는 프레임워크 잔기가 공여자 항체 또는 컨센서스 프레임워크 중 어느 하나에 상응하지 않을 수 있다. 그러나, 바람직한 실시형태에서, 이러한 돌연변이는 광범위하지 않을 것이다. 보통, 사람화된 항체 잔기의 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 95%가 모 FR 및 CDR 서열의 것과 상응할 것이다. 본원에 사용되는 용어 "컨센서스 프레임워크"는 컨센서스 면역글로불린 서열의 프레임워크 영역을 말한다. 본원에서 사용되는 용어 "컨센서스 면역글로불린 서열"은 관련 면역글로불린 서열들의 패밀리에서 가장 빈번하게 발생하는 아미노산들(또는 뉴클레오타이드들)로 이루어진 서열을 말한다(예를 들면, 문헌[Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987)]을 참조한다). 면역글로불린의 패밀리에 있어서, 컨센서스 서열에서 각각의 위치는 상기 패밀리에서 당해 위치에 가장 빈번하게 발생하는 아미노산에 의해 점유된다. 2개의 아미노산이 동등하게 빈번히 발생하는 경우, 둘 중 어느 하나가 컨센서스 서열에 포함될 수 있다.
펩타이드 또는 폴리펩타이드 서열에 관한 "아미노산 서열 동일성 백분율(%)"은, 서열들을 정렬하고 필요에 따라 최대 서열 동일성 백분율을 달성하기 위한 갭을 도입한 후, 그리고 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 부분으로서 고려하지 않고, 특정 펩타이드 또는 폴리펩타이드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성을 측정할 목적을 위한 정렬은 당해 분야 숙련가의 기술 내인 각종 방식으로, 예를 들면, 공공의 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들면, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 달성될 수 있다. 당해 분야 숙련가들은, 비교되는 서열들의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘들을 포함하는, 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터들을 결정할 수 있다. 한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 1 내지 31, 서열번호 35 내지 40, 또는 서열번호 50 내지 85 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
용어 "다가 항체"는 본원에서 2개 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 항체를 나타내는 것으로 사용된다. 소정 실시형태에서, 다가 항체는 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖도록 조작될 수 있고, 일반적으로 자연 발생 항체는 아니다.
용어 "다특이적 항체"는 2개 이상의 비관련(unrelated) 항원에 결합할 수 있는 항체를 말한다. 한 실시형태에서, 다특이적 항체는 2개의 비관련 항원들에 결합할 수 있는 이특이적 항체, 예를 들면, EGFR(예를 들면, EGFRvIII) 및 CD3d에 결합하는 이특이적 항체 또는 이의 항원 결합부이다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "이원 가변 도메인" 또는 "DVD"는 2개 이상의 항원 결합 부위를 포함하고 4가 또는 다가 결합 단백질인 항원 결합 단백질이다. 이러한 DVD는 단일 특이적, 즉 1개의 항원에 결합할 수 있거나, 다특이적, 즉 2개 이상의 항원에 결합할 수 있다. 2개의 중쇄 DVD 폴리펩타이드 및 2개의 경쇄 DVD 폴리펩타이드를 포함하는 DVD 결합 단백질은 DVD Ig로 나타낸다. DVD Ig의 각각의 절반은 중쇄 DVD 폴리펩타이드 및 경쇄 DVD 폴리펩타이드, 및 2개의 항원 결합 부위를 포함한다. 각각의 결합 부위는, 항원 결합 부위당 항원 결합에 관여하는 총 6개의 CDR들을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, 본원에 기술된 CDR은 항-EGFR DVD에 사용된다.
용어 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"은 적어도 (1) 항원-결합 영역, 예를 들면, 항체의 가변 중쇄 또는 경쇄, (2) CAR을 T 세포에 앵커링(anchoring)시키기 위한 막관통 도메인, 및 (3) 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 재조합 단백질을 말한다.
용어 "활성"은, 항원에 대한 항체, 예를 들면, hEGFR 항원에 결합하는 항-hEGFR 항체 또는 ADC의 결합 특이성/친화성 및/또는 항체, 예를 들면, hEGFR에 대한 결합이 hEGFR의 생물학적 활성을 억제하는 항-hEGFR 항체의 중화 효력, 예를 들면, EGFR 발현 세포주, 예를 들면, 사람 폐 암종 세포주 H292에서의 EGFR 인산화의 억제 또는 EGFR 발현 세포주, 예를 들면, 사람 H292 폐 암종 세포, 사람 H1703 폐 암종 세포, 또는 사람 EBC1 폐 암종 세포의 증식의 억제와 같은 활성을 포함한다.
본원에 사용되는 용어 "비 소세포 폐 암종(NSCLC) 이종이식편 검정"은, 항-EGFR 항체 또는 ADC가 종양 성장(예를 들면, 추가의 성장)을 억제하고/하거나 면역결핍 마우스에의 NSCLC 세포의 이식으로부터 초래되는 종양 성장을 감소시킬 수 있는지를 측정하는데 사용되는 생체내 검정을 말한다. NSCLC 이종이식편 검정은, 종양이 원하는 크기, 예를 들면, 200 내지 250㎣로 성장하도록 하고, 그 때문에 항체 또는 ADC가 종양 성장을 억제하고/하거나 감소시킬 수 있는지를 측정하기 위해 마우스에게 항체 또는 ADC를 투여하는 면역결핍 마우스에의 NSCLC 세포의 이식을 포함한다. 소정 실시형태에서, 항체 또는 ADC의 활성은, 대조군 항체, 예를 들면, 종양 세포에 특이적으로 결합하지 않는, 예를 들면, 암과 관련되어 있지 않은 항원에 대해 지시되거나 비암성인 공급원으로부터 얻어지는 사람 IgG 항체(또는 이의 수집물)(예를 들면, 정상 사람 혈청)에 비한 종양 성장 억제 백분율(%TGI)에 따라 측정된다. 이러한 실시형태에서, 항체(또는 ADC) 및 대조군 항체는 마우스에게 동일한 용량으로, 동일한 빈도로, 그리고 동일한 경로를 통해 투여한다. 한 실시형태에서, NSCLC 이종이식편 검정에 사용된 마우스는 중증의 복합 면역결핍증(SCID) 마우스 및/또는 무흉선 CD-1 누드 마우스이다. NSCLC 이종이식편 검정에 사용될 수 있는 NSCLC 세포의 예로는 H292 세포(예를 들면, NCIH292 [H292](ATCC® CRL1848™))가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
용어 "에피토프"는 항체 또는 ADC에 의해 결합되는 항원의 영역을 말한다. 소정 실시형태에서, 에피토프 결정인자는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴, 또는 설포닐과 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹핑을 포함하고, 소정 실시형태에서 특이적 3차원 구조 특징 및/또는 특이적 전하 특징을 가질 수 있다. 소정 실시형태에서, 항체는 단백질 및/또는 거대분자의 복합 혼합물 중의 이의 표적 항원을 우선적으로 인식하는 경우에 항원에 특이적으로 결합한다고 한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체는 아미노산 서열 CGADSYEMEEDGVRKC(서열번호 45)(이는 hEGFR의 성숙한 형태의 아미노산 잔기 287 내지 302에 상응한다)에 의해 정의된 에피토프에 결합한다.
본원에 사용되는 용어 "표면 플라스몬 공명"은, 예를 들면, BIAcore 시스템(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ)을 이용하여 바이오센서 매트릭스 내의 단백질 농도 변경의 검출에 의해 실시간 생체특이적 상호작용의 분석을 가능하게 하는 광학 현상을 말한다. 추가의 상세설명을 위해, 문헌[Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; 및 Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277]을 참조한다. 한 실시형태에서, 표면 플라스몬 공명은 실시예 2에 기술된 방법에 따라 측정한다.
본원에 사용되는 용어 "kon" 또는 "ka"는 항체/항원 복합체를 형성하기 위한 항원에의 항체의 회합에 관한 온 속도 상수(on rate constant)를 나타내는 것으로 의도된다.
본원에 사용되는 용어 "koff" 또는 "kd"는 항체/항원 복합체로부터의 항체의 해리에 관한 오프 속도 상수(off rate constant)를 나타내는 것으로 의도된다.
본원에 사용되는 용어 "KD"는 특정 항체-항원 상호작용(예를 들면, AbA 항체 및 EGFR)의 평형 해리 상수를 나타내는 것으로 의도된다. KD는 ka/kd에 의해 계산된다.
본원에 사용되는 용어 "경쟁적 결합"은 제1 항체가 제3 분자, 예를 들면, 항원 상의 결합 부위에 대해 제2 항체와 경쟁하는 상황을 나타낸다. 한 실시형태에서, 2개의 항체 사이의 경쟁적 결합은 FACS 분석을 이용하여 측정한다.
용어 "경쟁적 결합 검정"은 2개 이상의 항체가 동일한 에피토프에 결합하는지를 측정하기 위해 사용되는 검정이다. 한 실시형태에서, 경쟁적 결합 검정은, 비-표지된 항체의 도입으로 인하여 표지된 항체의 형광성 신호가 감소되는지를 측정함으로써 2개 이상의 항체가 동일한 에피토프에 결합하는지를 측정하기 위해 사용되는 경쟁 형광 활성화 세포 분류(FACS) 검정이고, 여기서, 동일한 에피토프에 대한 경쟁이 형광성 수준을 저할 시킬 것이다. 경쟁 결합 FACS 검정의 예는 U87MG 세포(이는 EGFRvIII을 발현함)를 이용한 경쟁 FACS 검정이 기술된 실시예 3에 제공된다.
본원에 사용되는 용어 "표지된 항체"는 결합 단백질, 예를 들면, 항체의 동정을 제공하는 표지를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합부를 말한다. 바람직하게, 상기 표지는 검출가능한 마커, 예를 들면, 방사성 표지된 아미노산의 포함 또는 표시된 아비딘(예를 들면, 광학적 또는 비색적 방법에 의해 검출될 수 있는 형광성 마커 또는 효소적 활성을 포함하는 스트렙트아비딘)에 의해 검출될 수 있는 비오티닐 모이어티의 폴리펩타이드에의 부착이다. 폴리펩타이드에 대한 표지의 예로는 하기가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다: 방사성 동위원소 또는 방사성 핵종(예를 들면, 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho, 또는 153Sm); 형광성 표지(예를 들면, FITC, 로다민, 란타나이드 인광체), 효소적 표지(예를 들면, 서양고추냉이 퍼옥시다제, 루시페라제, 알칼리성 포스파타제); 화학발광성 마커; 비오티닐 그룹; 2차 리포터(예를 들면, 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그)에 의해 인식되는 소정의 폴리펩타이드 에피토프; 및 자성제(magnetic agent), 예를 들면, 가돌리늄 킬레이트.
용어 "항체-약물-접합체" 또는 "ADC"는, 임의로 치료학적 또는 세포독성 제제일 수 있는 하나 이상의 화학적 약물(들)(제제(들)로서도 나타냄)에 화학적으로 링크된 결합 단백질, 예를 들면, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 말한다. 바람직한 실시형태에서, ADC는 항체, 세포독성 또는 치료학적 약물, 및 상기 항체에의 상기 약물의 부착 또는 접합을 가능하게 하는 링커를 포함한다. ADC는 전형적으로, 2, 4, 6 또는 8개의 종이 부하된 약물을 포함하는, 항체에 접합된 대체로 1 내지 8개의 약물을 갖는다. ADC에 포함될 수 있는 약물의 비-제한적 예로는 유사분열 억제제, 항종양 항생제, 면역조절제, 유전자 치료요법을 위한 벡터, 알킬화제, 항혈관신생제, 항대사물질, 붕소-함유제, 화합물 보호제, 호르몬, 항호르몬제, 코르티코스테로이드, 광활성 치료학적 제제, 올리고뉴클레오타이드, 방사성 핵종 제제, 토포이소머라제 억제제, 티로신 키나제 억제제, 및 방사선 증감제가 있다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "항-표피 성장 인자 항체 약물 접합체", "항-EGFR 항체 약물 접합체", 또는 "항-EGFR ADC"는, EGFR에 특이적으로 결합함으로써 항체가 하나 이상의 화학적 제제(들)에 접합되는 항체를 포함하는 ADC를 나타낸다. 한 실시형태에서, 항-EGFR ADC는 아우리스타틴, 예를 들면, MMAE 또는 MMAF에 접합된 항체 AbA이다. 항체 AbA의 경쇄 및 중쇄에 상응하는 아미노산 서열은 각각 서열번호 13 및 서열번호 15에 제공된다.
본원에 사용되는 용어 "아우리스타틴"은 항유사분열제의 패밀리를 말한다. 아우리스타틴 유도체는 또한 용어 "아우리스타틴"의 정의 내에 포함된다. 아우리스타틴의 예로는 아우리스타틴 E(AE), 모노메틸아우리스타틴 E(MMAE), 모노메틸아우리스타틴 F(MMAF), 및 돌라스타틴의 합성 유사체가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 한 실시형태에서, 본원에 기술되는 항-EGFR 항체는 아우리스타틴에 접합되어 항-EGFR ADC가 형성된다.
본원에 사용되는 용어 "AbA-vcMMAE"는 모노메틸아우리스타틴 E(MMAE)에 말레이미도카프로일 발린 시트룰린 p-아미노벤질옥시카르바밀(PABA) 링커를 통해 커플링된 항체 AbA를 포함하는 ADC를 나타내는 것으로 사용된다. AbA-vcMMAE는 도 11에 기술된다.
본원에 사용되는 용어 "mcMMAF"는 말레이미도카프로일-모노메틸아우리스타틴 F(MMAF)의 링커/약물 조합을 나타내는 것으로 사용된다.
용어 "약물-대-항체 비" 또는 "DAR"은 ADC의 항체에 부착된 약물, 예를 들면, 아우리스타틴의 수를 나타낸다. ADC의 DAR은 1 내지 8의 범위일 수 있지만, 항체 상의 링크 부위의 수에 따라 보다 높은 부하, 예를 들면, 10도 가능하다. 용어 DAR은 개별 항체에 부하된 약물의 수와 관련하여 사용될 수 있거나, 대안으로는 ADC 그룹의 평균(average 또는 mean) DAR과 관련하여 사용될 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "원하지 않는 ADC 종"은, 상이한 약물 부하를 갖는 ADC 종으로부터 분리되어야 하는 임의의 약물 부하 종을 말한다. 한 실시형태에서, 용어 원하지 않는 ADC 종은 6개 이상의 약물 부하 종, 즉, DAR6, DAR7, DAR8 및 8 초과의 DAR을 포함하는 6 이상의 DAR을 갖는 ADC(즉, 6, 7, 8 또는 8개 초과의 약물 부하 종)를 나타낼 수 있다. 별도의 실시형태에서, 용어 원하지 않는 ADC 종은 8개 이상의 약물 부하 종, 즉, DAR8 및 8 초과의 DAR을 포함하는 8 이상의 DAR을 갖는 ADC(즉, 8 또는 8개 초과의 약물 부하 종)을 나타낼 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "ADC 혼합물"은 이질성 DAR 분포의 ADC를 함유하는 조성물을 말한다. 한 실시형태에서, ADC 혼합물은 1 내지 8, 예를 들면, 2, 4, 6 및 8의 DAR 분포를 갖는 ADC(즉, 2, 4, 6 및 8개의 약물 부하 종)를 함유한다. 특히, 분해 생성물은 1, 3, 5 및 7의 DAR도 상기 혼합물에 포함될 수 있도록 할 수 있다. 추가로, 혼합물 내의 ADC는 또한 8 초과의 DAR을 가질 수 있다. ADC 혼합물은 쇄간 디설파이드 환원, 이어서, 접합으로부터 초래된다. 한 실시형태에서, ADC 혼합물은 4 이하의 DAR을 갖는 ADC(즉, 4개 이하의 약물 부하 종) 및 6 이상의 DAR을 갖는 ADC(즉, 6개 이상의 약물 부하 종) 둘 다를 포함한다.
용어 "암"은 전형적으로 조절되지 않은 세포 성장에 의해 특성확인되는 포유동물에서의 생리학적 병태를 나타내거나 기술하는 것을 의미한다. 암의 예로는 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 및 백혈병 또는 림프구 악성 종양이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 이러한 암의 보다 구체적인 예로는 교모세포종, 비-소세포 폐암, 폐암, 결장암, 결장직장암, 두경부암, 유방암(예를 들면, 삼중 음성 유방암), 췌장암, 편평 세포 종양, 편평 세포 암종(예를 들면, 편평 세포 폐암 또는 편평 세포 두경부암), 항문암, 피부암, 및 외음부암이 포함된다. 한 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 ADC는 EGFR 유전자의 증폭을 포함하는 종양(들)을 갖는 환자에게 투여되고, 이에 의해 종양은 절단된 버젼의 EGFR인 EGFRvIII를 발현한다. 한 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 ADC는 EGFR을 과발현하는 경향이 있는 고형 종양을 갖는 환자에게 투여된다. 한 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 ADC는 편평 세포 비-소세포 폐암(NSCLC)을 갖는 환자에게 투여된다. 한 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 ADC는 진행성 고형 종양을 포함하는 고형 종양을 갖는 환자에게 투여된다.
본원에 사용되는 용어 "EGFR 발현 종양"은 EGFR 단백질을 발현하는 종양을 말한다. 한 실시형태에서, 종양에서의 EGFR 발현은 종양 세포 막의 면역조직화학 염색을 이용하여 측정되고, 여기서, 종양 샘플 중의 백그라운드(background) 수준을 초과하는 임의의 면역조직화학 염색은 종양이 EGFR 발현 종양임을 나타낸다. 종양에서의 EGFR의 발현을 검출하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들면, 예를 들면, EGFR pharmDx™ 키트(Dako)이다. 대조적으로, "EGFR 음성 종양"은 면역조직화학 기술에 의해 측정시 종양 샘플 중의 백그라운드 초과의 EGFR 막 염색이 부재하는 종양으로서 정의된다.
본원에 사용되는 용어 "EGFRvIII 양성 종양"은 EGFRvIII 단백질을 발현하는 종양을 말한다. 한 실시형태에서, 종양에서의 EGFRvIII 발현은 종양 세포 막의 면역조직화학 염색을 이용하여 측정되고, 여기서, 종양 샘플 중의 백그라운드 수준을 초과하는 임의의 면역조직화학 염색은 종양이 EGFRvIII 발현 종양임을 나타낸다. 종양에서의 EGFR의 발현을 검출하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 이로는 면역조직화학 검정이 포함된다. 대조적으로, "EGFRvIII 음성 종양"은 면역조직화학 기술에 의해 측정시 종양 샘플 중의 백그라운드 초과의 EGFRvIII 막 염색이 부재하는 종양으로서 정의된다.
상호교환적으로, 용어 "과발현한다", "과발현" 또는 "과발현된"은 정상 세포와 비교하여 보통 암 세포에서 검출가능하게 더 큰 수준으로 전사되거나 번역되는 유전자를 나타낸다. 따라서, 과발현은 (증가된 전사, 전사 후 프로세싱, 번역, 번역 후 프로세싱, 변경된 안정성, 및 변경된 단백질 분해로 인한) 단백질 및 RNA의 과발현, 및 변경된 단백질 수송 패턴(증가된 핵 국소화) 및 예를 들면, 기질의 증가된 효소 가수분해에서와 같은 증강된 기능적 활성으로 인한 국소적 과발현 둘 다를 말한다. 따라서, 과발현은 단백질 또는 RNA 수준 중 어느 하나를 말한다. 과발현은 또한 정상 세포 또는 비교 세포와 비교하여 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상만큼일 수 있다. 소정 실시형태에서, 본 발명의 항-EGFR 항체 또는 ADC는 EGFR을 과발현하는 경향이 있는 고형 종양을 치료하는데 사용된다.
본원에 사용되는 용어 "투여하는"은 치료학적 목적(예를 들면, EGFR-관련 장애의 치료)을 달성하기 위한 기질(예를 들면, 항-EGFR 항체 또는 ADC)의 전달을 나타내는 것을 의미한다. 투여 방식은 비경구, 장관 및 국부일 수 있다. 비경구 투여는 일반적으로 주사에 의한 것이고, 이는 제한 없이 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 낭내, 안와내, 심장내, 피부내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 낭하, 지주막하, 척추내 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다.
본원에 사용되는 용어 "병용 치료요법"은 2개 이상의 치료학적 물질, 예를 들면, 항-EGFR 항체 또는 ADC 및 추가의 치료학적 제제의 투여를 말한다. 추가의 치료학적 제제는 항-EGFR 항체 또는 ADC의 투여와 동시에, 이의 투여 이전에, 또는 이의 투여 후에 투여될 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "유효량" 또는 "치료학적 유효량"은, 장애, 예를 들면, 암, 또는 이의 하나 이상의 증상의 중증도 및/또는 지속시간을 감소시키거나 개선시키거나, 장애의 진전을 방지하거나, 장애의 퇴행(regression)을 야기하거나, 장애와 관련된 하나 이상의 증상의 재발, 발달, 개시 또는 진행을 예방하거나, 장애를 검출하거나, 다른 치료요법(예를 들면, 예방학적 또는 치료학적 제제)의 예방학적 또는 치료학적 효과(들)를 향상시키거나 개선하기에 충분한 약물, 예를 들면, 항체 또는 ADC의 양을 말한다. 항체 또는 ADC의 유효량은 예를 들면, 종양 성장을 억제(예를 들면, 종양 체적의 증가를 억제)하고/하거나, 종양 성장을 감소(예를 들면, 종양 체적을 감소)시키고/시키거나, 암 세포의 수를 감소시키고/시키거나, 암과 관련된 증상들 중 하나 이상을 어느 정도 경감시킬 수 있다. 유효량은 예를 들면, 무병 생존율(disease free survival)(DFS)을 향상시키거나, 전체 생존율(OS)을 향상시키거나, 재발 가능성을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 각종 양상들은 하기 서브섹션에서 추가로 상세하게 기술된다.
II. 항-EGFR 항체
본 발명의 한 양상은 개선된 특징, 예를 들면, Ab1 및 당해 분야에 공지되어 있는 다른 항체들에 비하여 EGFR에 대해 증가된 결합 친화도를 갖는 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공한다. 본 발명의 다른 양상은 본원에 기술된 항-EGFR 항체, 및 아우리스타틴을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 하나 이상의 약물(들)을 포함하는 항체 약물 접합체(ADC)를 특징으로 한다. 본 발명의 항체 또는 ADC는 EGFRvIII를 발현하는 종양 세포에의 결합, EGFR을 발현하는 종양 세포 상의 야생형 EGFR에의 결합, EGFR 상의 에피토프 CGADSYEMEEDGVRKC(서열번호 45)의 인식, 정상 사람 상피 각질세포 상의 EGFR에의 결합, 및 마우스 모델에서의 이종이식편 종양 성장의 감소 또는 억제를 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아닌 특징들을 갖는다.
Ab1(항체 1)은 사람화된 항-EGFR 항체이다. Ab1의 경쇄 및 중쇄 서열은 각각 서열번호 13 및 서열번호 14에 기술된다(또한 본원에 인용에 의해 포함된 문헌[US 특허 출원 공보 제20120183471호]을 참조한다). Ab1의 경쇄 가변 영역은 서열번호 5에 기술되고, 서열번호 6에 제시된 CDR1 아미노산 서열, 서열번호 7에 제시된 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 8에 제시된 CDR3 아미노산 서열을 포함한다. Ab1의 중쇄 가변 영역은 서열번호 1에 기술되고, 서열번호 2에 제시된 CDR1 아미노산 서열, 서열번호 3에 제시된 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 4에 제시된 CDR3 아미노산 서열을 포함한다.
일반적으로, 본 발명의 Ab1 변이체 항체는 모 항체 Ab1의 에피토프 특이성을 보유한다. 따라서, 한 실시형태에서, 본 발명의 항-EGFR 항체는 서열번호 45에 의해 정의되는 EGFR 내의 에피토프에 결합할 수 있고/있거나 EGFR에 결합하기 위해 Ab1과 경쟁할 수 있다. 각종 실시형태에서, 상기 결합은 하기 실시예 3에 제시되는 프로토콜에 따라 검정될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 항-EGFR 항체는 Ab1과 경쟁하고, EGFR의 1-525(서열번호 47)에의 개선된 결합 친화도, 예를 들면, 표면 플라스몬 공명에 의한 측정시, 약 1 x 10-6M 내지 약 1 x 10-10M의 해리 상수(Kd)를 갖는다.
한 실시형태에서, 본 발명은, 하기 실시예에 기술되는 바와 같은, Ab1의 변이체이고 개선된 특징, 예를 들면, 개선된 결합 친화도 및 생체내에서 NSCLC 종양 세포 증식을 억제하는 능력을 갖는 항-EGFR 항체를 특징으로 한다. 총체적으로, 이들 신규한 항체들은 본원에 "Ab1 변이체 항체"로서 나타낸다. 일반적으로, Ab1 변이체 항체는 Ab1과 동일한 에피토프 특이성을 보유한다. 따라서, 한 실시형태에서, 본 발명의 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합부는 서열번호 45에 제시된 아미노산 서열 내의 에피토프에 결합하고, 경쟁적 결합 검정에서 EGFRvIII에 결합하기 위해 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항-EGFR 항체와 경쟁한다. Ab1과는 대조적으로, 본 발명의 항-EGFR 항체는 누드 마우스에서의 H292 사람 비-소세포 폐 암종(NSCLC) 이종이식편 검정에서 생체내 종양 성장을 억제하거나 감소시키고/시키거나 정상 사람 상피 각질세포 상의 야생형 EGFR에 결합할 수 있다. 각종 실시형태에서, 본 발명의 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 EGFR의 생물학적 기능을 조정할 수 있다. 상기 양상들의 다른 실시형태에서, 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 EGFRvIII에 결합하고, EGFR을 과발현하는 세포 상의 EGFR에 결합하고, EGFR 상의 에피토프 CGADSYEMEEDGVRKC(서열번호 45)를 인식한다. 추가의 실시형태에서, 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 EGFRvIII 연결 펩타이드와 별개인 에피토프에서 EGFRvIII에 결합한다. 상기 양상들의 추가의 실시형태에서, 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 EGFR에 결합하기 위해 세툭시맙과 경쟁하지 않는다. 하기 실시예에 기술되는 AbA 항체 및 Ab1 변이체는 상기 특징들을 갖는다.
따라서, 본 발명은, 경쟁 결합 검정에서 Ab1과 경쟁할 수 있지만 종양 성장을 억제하거나 감소시키는데 보다 효과적인 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함한다. 한 실시형태에서, 본 발명의 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합부는 아미노산 서열 CGADSYEMEEDGVRKC(서열번호 45) 내의 에피토프에 결합하고 경쟁 결합 검정에서 표피 성장 인자 수용체 변이체 III(EGFRvIII)(서열번호 33)에 결합하기 위해 Ab1(또는 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항-EGFR 항체)과 경쟁할 수 있다.
한 실시형태에서, 본 발명의 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합부는 표면 플라스몬 공명에 의한 측정시 약 1 x 10-6M 이하의 해리 상수(Kd)로 EGFR(1-525)(서열번호 47)에 결합한다. 대안으로, 항체 또는 이의 항원 결합부는 표면 플라스몬 공명에 의한 측정시 약 1 x 10-6M 내지 약 1 x 10-10M의 Kd로 EGFR(1-525)(서열번호 47)에 결합한다. 추가의 대안에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는 표면 플라스몬 공명에 의한 측정시 약 1 x 10-6M 내지 약 1 x 10-7M의 Kd로 EGFR(1-525)(서열번호 47)에 결합한다. 대안으로, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부는 표면 플라스몬 공명에 의한 측정시 약 1 x 10-6M 내지 약 5 x 10-10M의 Kd; 약 1 x 10-6M 내지 약 1 x 10-9M의 Kd; 약 1 x 10-6M 내지 약 5 x 10-9M의 Kd; 약 1 x 10-6M 내지 약 1 x 10-8M의 Kd; 약 1 x 10-6M 내지 약 5 x 10-8M의 Kd; 약 5.9 x 10-7M 내지 약 1.7 x 10-9M의 Kd; 약 5.9 x 10-7M 내지 약 2.2 x 10-7M의 Kd로 EGFR(1-525)(서열번호 47)에 결합한다. 소정 실시형태에서, 본 발명의 항체 및 이의 항원-결합 단편의 해리 상수(Kd)는 한 실시형태에서는 Ab1에 관한 해리 상수보다 낮지만 항-EGFR 항체 세툭시맙의 속도보다 높다.
본 발명의 항-EGFR 항체 및 이의 항원-결합부의 하나의 이점은 당해 항체가 EGFRvIII를 발현하는 종양 세포에 결합할 수 있다는 점이다. EGFRvIII은 소정 유형의 암과 관련되어 있지만, 당해 분야에 공지되어 있는 다수의 항-EGFR 항체, 예를 들면, 세툭시맙은 EGFRvIII 발현 종양에서의 종양 성장을 억제하거나 감소시키는데 효과적이지 않다. 따라서, 한 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부는 표면 플라스몬 공명에 의한 측정시 약 8.2 x 10-9M 이하의 Kd로 EGFRvIII(서열번호 33)에 결합한다. 대안으로, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부는 표면 플라스몬 공명에 의한 측정시 약 8.2 x 10-9M 내지 약 6.3 x 10-10M의 Kd; 약 8.2 x 10-9M 내지 약 2.0 x 10-9M의 Kd; 약 2.3 x 10-9M 내지 약 1.5 x 10-10M의 Kd로 EGFRvIII(서열번호 33)에 결합한다.
한 실시형태에서, 본 발명의 항체는 생체내 이종이식편 마우스 모델에서의 종양 성장을 억제하거나 감소시킬 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부는, EGFR에 대해 특이적이지 않은 사람 IgG 항체에 비하여 생체내 사람 비-소세포 폐 암종(NSCLC) 이종이식편 검정에서 종양 성장을 적어도 약 50% 만큼 억제할 수 있다. 소정 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부는, 동일한 용량 및 투약 주기로 투여되는 경우, EGFR에 대해 특이적이지 않은 사람 IgG 항체에 비하여 생체내 사람 비-소세포 폐 암종(NSCLC) 이종이식편 검정에서 종양 성장을 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80% 만큼 억제하거나 감소시킬 수 있다. 소정 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합부는, 동일한 용량 및 투약 주기로 투여되는 경우, EGFR에 대해 특이적이지 않은 사람 IgG 항체에 비하여 생체내 사람 비-소세포 폐 암종(NSCLC) 이종이식편 검정에서 종양 성장을 약 80% 내지 약 90%, 또는 약 84% 내지 약 90%, 또는 약 88% 내지 약 90% 만큼 억제하거나 감소시킬 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "이종이식편 검정"은, 사람 종양 세포가 사람 세포를 거부하지 않는 면역적합 마우스에게 피부 아래에 또는 종양이 기원된 장기 유형에 이식되는 사람 종양 이종이식편 검정을 말한다.
상기 특징들의 조합을 갖는 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합부도 본 발명의 실시형태인 것으로 간주됨에 주의해야만 한다. 예를 들면, 본 발명의 항체는 표면 플라스몬 공명에 의한 측정시 약 1 x 10-6M 이하의 해리 상수(Kd)로 EGFR(1-525)(서열번호 47)에 결합할 수 있고, 아미노산 서열 CGADSYEMEEDGVRKC(서열번호 45) 내의 에피토프에 결합하여 경쟁 결합 검정에서 표피 성장 인자 수용체 변이체 III(EGFRvIII)(서열번호 33)에 결합하기 위해 Ab1(또는 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항-EGFR 항체)과 경쟁할 수 있다.
소정 실시형태에서, 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합부는 아미노산 서열 CGADSYEMEEDGVRKC(서열번호 45) 내의 에피토프에 결합하고, 경쟁 결합 검정에서 표피 성장 인자 수용체 변이체 III(EGFRvIII)(서열번호 33)에 결합하기 위해 Ab1(또는 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항-EGFR 항체)과 경쟁하고; 표면 플라스몬 공명에 의한 측정시 약 8.2 x 10-9M 이하의 Kd로 EGFRvIII(서열번호 33)에 결합한다.
소정 실시형태에서, 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합부는 아미노산 서열 CGADSYEMEEDGVRKC(서열번호 45) 내의 에피토프에 결합하고, 경쟁 결합 검정에서 표피 성장 인자 수용체 변이체 III(EGFRvIII)(서열번호 33)에 결합하기 위해 Ab1(또는 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항-EGFR 항체)과 경쟁하고; 생체내 이종이식편 마우스 모델에서의 종양 성장을 억제하거나 감소시킨다. 보다 구체적으로, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부는, 동일한 용량 및 투약 주기로 투여되는 경우, EGFR에 대해 특이적이지 않은 사람 IgG 항체에 비하여 생체내 사람 비-소세포 폐 암종(NSCLC) 이종이식편 검정에서 종양 성장을 적어도 약 50% 만큼 억제하거나 감소시킬 수 있다. 대안으로, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부는, 동일한 용량 및 투약 주기로 투여되는 경우, EGFR에 대해 특이적이지 않은 사람 IgG 항체에 비하여 생체내 사람 비-소세포 폐 암종(NSCLC) 이종이식편 검정에서 종양 성장을 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80% 만큼 억제하거나 감소시킬 수 있다. 소정 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합부는, 동일한 용량 및 투약 주기로 투여되는 경우, EGFR에 대해 특이적이지 않은 사람 IgG 항체에 비하여 생체내 사람 비-소세포 폐 암종(NSCLC) 이종이식편 검정에서 종양 성장을 약 80% 내지 약 90%, 또는 약 84% 내지 약 90%, 또는 약 88% 내지 약 90% 만큼 억제하거나 감소시킬 수 있다.
상기 언급된 특징들 중 임의의 것의 조합을 갖는 항체는 본 발명의 양상으로서 고려된다. 하기에 보다 상세하게 기술되는 본 발명의 ADC는 또한 상기 특징들 중 임의의 것을 가질 수 있다.
한 실시형태에서, 본 발명은, 서열번호 40에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC CDR3 도메인, 서열번호 39에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC CDR2, 및 서열번호 38에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC CDR1; 및 서열번호 37에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC CDR3, 서열번호 36에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC CDR2, 및 서열번호 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC CDR1 도메인을 포함하는, 항-hEGFR 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함한다.
한 실시형태에서, 본 발명은, 서열번호 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 및 78로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 및 79로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항-hEGFR 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함한다.
한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 10, 11, 및 12; 서열번호 16, 17, 및 18; 서열번호 10, 11, 및 19; 서열번호 20, 11, 및 12; 서열번호 21, 3, 및 22; 서열번호 16, 17, 및 19; 서열번호 2, 3, 및 4; 서열번호 10, 3, 및 12; 서열번호 80, 11, 및 18; 서열번호 80, 3, 및 18; 서열번호 20, 3, 및 12; 서열번호 80, 11, 및 12; 및 서열번호 81, 11, 및 22로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 HC CDR 세트(CDR1, CDR2 및 CDR3); 및 서열번호 6, 7, 및 8; 서열번호 23, 24, 및 25; 서열번호 26, 27, 및 28; 서열번호 29, 30, 및 31; 서열번호 6, 7, 및 84; 서열번호 82, 83, 및 31; 및 서열번호 82, 27, 및 85로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 LC 경쇄 CDR 세트(CDR1, CDR2 및 CDR3)를 포함하는, 항-hEGFR 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하고, 여기서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합부는 서열번호 2, 3, 및 4의 HC CDR 세트, 및 서열번호 6, 7, 및 8의 LC CDR 세트 둘 다를 포함하지 않는다.
바람직하게, 본 발명의 항-EGFR 항체는, 예를 들면, 당해 분야에 공지되어 있는 몇몇의 시험관내 및 생체내 검정 중 임의의 하나에 의해 평가시 EGFR 활성을 감소시키거나 중화시키는데 높은 능력을 나타낸다. 예를 들면, EGFR 발현 세포주, 예를 들면, h292 세포주에서의 EGFR 인산화의 억제가 측정될 수 있다. 소정 실시형태에서, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합부는 사람 EGFR에 결합하고, 여기서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합부는 표면 플라스몬 공명에 의한 측정시 약 5.9 x 10-7M 이하의 KD 속도 상수로 사람 EGFR(EGFR 1-525)로부터 해리된다. 대안으로, 상기 항체 또는 이의 항원 결합부는 표면 플라스몬 공명에 의한 측정시 약 4.2 x 10-7M의 KD 속도 상수로 사람 EGFR(1-525)로부터 해리될 수 있다. 대안으로, 상기 항체 또는 이의 항원 결합부는 표면 플라스몬 공명에 의한 측정시 약 2.5 x 10-7M의 KD 속도 상수의 koff 속도 상수로 사람 EGFR(1-525)로부터 해리될 수 있다. 소정 실시형태에서, 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 5.9 x 10-7M 내지 5 x 10-9M의 KD 속도 상수를 갖는다.
대안으로, 상기 항체 또는 이의 항원 결합부는 표면 플라스몬 공명에 의한 측정시 약 6.1 x 10-9M 이하의 KD 속도 상수로 사람 EGFRvIII로부터 해리될 수 있다. 대안으로, 상기 항체 또는 이의 항원 결합부는 표면 플라스몬 공명에 의한 측정시 약 3.9 x 10-9M 이하의 KD 속도 상수로 사람 EGFRvIII로부터 해리될 수 있다. 대안으로, 상기 항체 또는 이의 항원 결합부는 표면 플라스몬 공명에 의한 측정시 약 2.3 x 10-9M 이하의 KD 속도 상수로 사람 EGFRvIII로부터 해리될 수 있다.
한 실시형태에서, 본 발명은 항체 AbA인 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합부를 특징으로 한다. AbA는 EGFR에 대해 Ab1에 비하여 개선된 결합 친화도를 갖고, 또한 Ab1에 비하여 고유한 시험관내 및 생체내 특징들을 나타낸다. AbA는 시험관내 각질세포 결합 검정에서 Ab1의 친화도보다 훨씬 더 큰 친화도로 EGFR에 결합한다. 추가로, AbA는 이종이식편 H292 세포 검정에서 종양 성장을 억제하거나 감소시킬 수 있다. 특히, AbA는 AbA의 결합 친화도보다 더 높은 결합 친화도를 갖는 다른 Ab1 변이체 항체와 비슷한 시험관내 및 생체내 특징들을 갖는다. 다른 Ab1 변이체 항체(예를 들면, 도 3에서 AbP 및 AbQ 대 AbA를 참조한다)와 비교하여 더 낮은 결합 친화도를 가짐에도 불구하고, AbA는 생체내 검정에서 세포 성장을 억제하는 것에 있어서 비슷하였다.
용어 "AbA"는 AbA의 적어도 6개의 CDR을 갖는 IgG 항체를 포함하는 것을 의미한다. AbA 항체는 Ab1의 것과 동일한 경쇄를 갖지만, 모 항체 Ab1에 비하여 6개의 아미노산 서열 변화(중쇄의 가변 영역에서의 4개의 아미노산 변화 및 불변 영역에서의 2개의 변화)를 포함하는 중쇄를 갖는다. AbA 항체는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인, 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. AbA의 중쇄 가변 영역은 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열에 의해 정의되고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함한다. 항체 AbA의 전장 중쇄는 서열번호 15에 기술된 아미노산 서열에 제시되고, 한편, 항체 AbA의 전장 경쇄는 서열번호 13에 기술된 아미노산 서열에 제시된다(도 2 참조). AbA의 중쇄의 핵산 서열은 하기에 제공된다:
Figure pat00005
AbA의 경쇄의 핵산 서열은 하기에 제공된다:
Figure pat00006
한 실시형태에서, 본 발명은 항체 AbB인 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합부를 특징으로 한다. AbB 항체는 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인, 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체를 제공한다.
한 실시형태에서, 본 발명은 항체 AbC인 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합부를 특징으로 한다. AbC 항체는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 84의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 본 발명은, 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체를 제공한다.
한 실시형태에서, 본 발명은 항체 AbD인 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합부를 특징으로 한다. AbD 항체는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인, 서열번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 본 발명의 서열번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체를 제공한다.
한 실시형태에서, 본 발명은 항체 AbE인 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합부를 특징으로 한다. AbE 항체는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 85의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인, 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체를 제공한다.
한 실시형태에서, 본 발명은 항체 AbF인 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합부를 특징으로 한다. AbF 항체는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체를 제공한다.
한 실시형태에서, 본 발명은 항체 AbG인 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합부를 특징으로 한다. AbG 항체는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인, 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인, 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 본 발명의 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체를 제공한다.
한 실시형태에서, 본 발명은 항체 AbH인 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합부를 특징으로 한다. AbH 항체는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인, 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인, 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체를 제공한다.
한 실시형태에서, 본 발명은 항체 AbJ인 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합부를 특징으로 한다. AbJ 항체는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인, 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체를 제공한다.
한 실시형태에서, 본 발명은 항체 AbK인 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합부를 특징으로 한다. AbK 항체는 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인, 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인, 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체를 제공한다.
한 실시형태에서, 본 발명은 항체 AbL인 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합부를 특징으로 한다. AbL 항체는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인, 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인, 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체를 제공한다.
한 실시형태에서, 본 발명은 항체 AbM인 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합부를 특징으로 한다. AbM 항체는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인, 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인, 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체를 제공한다.
한 실시형태에서, 본 발명은 항체 AbN인 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합부를 특징으로 한다. AbN 항체는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인, 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 60의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체를 제공한다.
한 실시형태에서, 본 발명은 항체 AbO인 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합부를 특징으로 한다. AbO 항체는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인, 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인, 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체를 제공한다.
한 실시형태에서, 본 발명은 항체 AbP인 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합부를 특징으로 한다. AbP 항체는 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인, 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 78의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체를 제공한다.
한 실시형태에서, 본 발명의 항체 AbQ인 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합부를 특징으로 한다. AbQ 항체는 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인, 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인, 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체를 제공한다.
하기에 제시된 실시예의 표 1에 기술되는 바와 같이, Ab1 변이체 항체 서열은, Ab1 EGFR 에피토프에의 개선된 결합을 초래하는 CDR 도메인을 나타내는 아미노산 컨센서스 서열을 제공한다. 따라서, 한 실시형태에서, 본 발명은, 서열번호 40에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인, 서열번호 39에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 서열번호 38에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열번호 37에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인, 서열번호 36에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합부를 특징으로 한다.
한 실시형태에서, 항-표피 성장 인자 수용체(항-EGFR) 항체 또는 이의 항원 결합부는 서열번호 50, 52, 53, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 및 68로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 및 69로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
추가의 실시형태에서, 본 발명의 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합부는 서열번호 12, 18, 19 및 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인; 서열번호 11 또는 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인; 및 서열번호 10, 16, 20 및 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 8, 25, 28 및 31에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인; 서열번호 7, 24, 27, 및 30에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인; 및 서열번호 6, 23, 26, 및 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
인산화 및 증식 검정은 본원에 기술된 항체가 EGFR 매개된 인산화 및 종양 세포 성장을 억제하였음을 입증하였다. 예를 들면, 실시예 6에 제시된 바와 같이, (시험된) 본 발명의 EGFR 항체는 생체내에서 종양 세포 성장을 억제시키는 것으로 밝혀졌다.
상기 항-EGFR 항체 CDR 서열은, 본 발명에 따라 단리되고 하기 표 1 내지 표 3에 열거된 CDR 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 신규한 패밀리의 EGFR 결합 단백질을 확립한다.
hEGFR에 관한 바람직한 EGFR 결합 및/또는 중화 활성을 갖는 CDR들을 생성하고 선택하기 위해서, 본원에 구체적으로 기술되어 있는 것들을 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아닌, 항체 또는 이의 항원 결합부를 생성하고 이들 항체 또는 이의 항원 결합부의 EGFR 결합 및/또는 중화 특징을 평가하기 위한 당해 분야에 공지되어 있는 표준 방법을 사용할 수 있다.
소정 실시형태에서, 상기 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역과 같은 중쇄 불변 영역을 포함한다. 소정 실시형태에서, 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합부는 사람 IgG 불변 도메인, 사람 IgM 불변 도메인, 사람 IgE 불변 도메인, 및 사람 IgA 불변 도메인으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중쇄 면역글로불린 불변 도메인을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합부는 IgG1 중쇄 불변 영역, IgG2 중쇄 불변 영역, IgG3 불변 영역, 또는 IgG4 중쇄 불변 영역을 갖는다. 바람직하게, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 중쇄 불변 영역 또는 IgG4 중쇄 불변 영역이다. 또한, 상기 항체는 카파 경쇄 불변 영역 또는 람다 경쇄 불변 영역 중 어느 하나인 경쇄 불변 영역을 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 항체는 카파 경쇄 불변 영역을 포함한다. 대안으로, 상기 항체부는 예를 들면, Fab 단편 또는 단일쇄 Fv 단편일 수 있다.
소정 실시형태에서, 항-EGFR 항체 결합부는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 디설파이드 링크된 Fv, scFv, 단일 도메인 항체, 또는 디아바디이다.
소정 실시형태에서, 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합부는 다특이적 항체, 예를 들면, 이특이적 항체이다.
소정 실시형태에서, 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합부는 서열번호 41에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 및/또는 서열번호 43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함한다.
항체 이펙터 기능을 변경하기 위한 Fc 부분에서의 아미노산 잔기들의 대체가 기술되어 왔다(Winter, et al. US 특허 제5,648,260호 및 제5,624,821호, 본원에 인용에 의해 포함됨). 항체의 Fc 부분은 몇몇의 중요한 이펙터 기능, 예를 들면, 사이토카인 유도, ADCC, 식세포작용, 보체 의존적 세포독성(CDC) 및 항체 및 항원-항체 복합체의 반감기/청소율을 매개한다. 몇몇의 경우, 이들 이펙터 기능은 치료학적 항체에 바람직하지만, 다른 경우에는 치료학적 목적에 따라 불필요하거나 심지어 유해할 수도 있다. 소정의 사람 IgG 이소타입, 특히, IgG1 및 IgG3은 각각 FcγR 및 보체 C1q를 통해 ADCC 및 CDC를 매개한다. 신생아 Fc 수용체(FcRn)는 항체의 순환 반감기를 결정하는 결정적 구성성분이다. 또 다른 실시형태에서, 적어도 하나의 아미노산 잔기는 항체의 불변 영역, 예를 들면, 항체의 Fc 영역에서 대체되어 항체의 이펙터 기능이 변경된다.
본 발명의 한 실시형태는 본원에 기술되는 항체들의 결합 영역들, 예를 들면, AbA의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR들을 포함하는 재조합 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함한다. 본원에 기술되는 재조합 CAR은 사람 백혈구 항원(HLA)-비의존적 방식으로 항원에 T 세포 특이성을 재지시하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 CAR은 대상체의 종양을 인식하고 공격하기 위한 사람 대상체 자체의 면역 세포를 조작하는 것을 보조하기 위한 면역 치료요법에 사용될 수 있다(예를 들면, 문헌[U.S. Pat. 제6,410,319호; 제8,389,282호; 제8,822,647호; 제8,906,682호; 제8,911,993호; 제8,916,381호; 제8,975,071호; 및 U.S. 특허 출원 공보 제US20140322275호, 상기 문헌의 각각은 CAR 기술에 관하여 본원에 인용에 의해 포함됨]을 참조한다). 이러한 유형의 면역 치료요법은 입양 세포 전이(ACT: adoptive cell transfer)라고 칭하고, 이를 필요로 하는 대상체에서의 암을 치료하는데 사용할 수 있다.
본 발명의 항-EGFR CAR은 바람직하게는 T 세포에 CAR을 앵커링하는데 사용되는 막관통 도메인인 EGFR(예를 들면, EGFRvIII)에 대해 특이적인 세포외 항원-결합 도메인 및 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 본 발명의 한 실시형태에서, CAR은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단백질의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인을 포함한다. 본 발명의 한 실시형태에서, CAR은 공동자극 도메인, 예를 들면, OX40, CD2, CD27, CD28, CD5, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278), 및 4-1BB (CD137)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단백질의 기능성 신호전달 도메인을 포함하는 공동자극 도메인을 포함한다. 본 발명의 소정 실시형태에서, CAR은, CDR 또는 본원에 기술된 가변 영역, 예를 들면, AbA 항체 유래의 CDR들 또는 가변 영역들, 막관통 도메인, 공동자극 도메인(예를 들면, CD28 또는 4-1BB 유래의 기능성 신호전달 도메인), 및 CD3(예를 들면, CD3-제타) 유래의 기능성 신호전달 도메인을 포함하는 신호전달 도메인을 포함하는, scFv를 포함한다.
소정 실시형태에서, 본 발명은 본원에 기술된 항체들의 항원 결합 영역, 예를 들면, CDR, 또는 본원에 기술된 scFv를 포함하는, CAR을 포함하는 T 세포(CAR T 세포로서도 나타냄)를 포함한다.
본 발명의 소정 실시형태에서, CAR은, 서열번호 40에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인, 서열번호 39에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 38에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는 가변 중경쇄; 및 서열번호 37에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인, 서열번호 36에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명의 소정 실시형태에서, CAR은 서열번호 12에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인, 서열번호 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는 가변 중경쇄; 및 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명의 한 실시형태는 표지된 항-EGFR 항체 또는 이의 항체부를 포함하고, 여기서, 상기 항체는 하나 이상의 기능성 분자(들)(예를 들면, 다른 펩타이드 또는 단백질)로 유도체화되거나 이에 링크된다. 예를 들면, 표지된 항체는, 하나 이상의 다른 분자 실체, 예를 들면, 다른 항체(예를 들면, 이특이적 항체 또는 디아바디), 검출가능한 제제, 약제학적 제제, 다른 분자(예를 들면, 스트렙트아비딘 코어 영역 또는 폴리히스티딘 태그)와의 항체 또는 항체부의 회합을 매개할 수 있는 단백질 또는 펩타이드, 및/또는 유사분열 억제제, 항종양 항생제, 면역조절제, 유전자 치료요법을 위한 벡터, 알킬화제, 항혈관신생제, 항대사물질, 붕소-함유제, 화합물 보호제, 호르몬, 항호르몬제, 코르티코스테로이드, 광활성 치료학적 제제, 올리고뉴클레오타이드, 방사성 핵종 제제, 토포이소머라제 억제제, 티로신 키나제 억제제, 방사선 증감제, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 세포독성 제제 또는 치료학적 제제에 본 발명의 항체 또는 항체부를 (화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유결합적 회합 또는 기타에 의해) 기능적으로 링크시킴으로써 유도될 수 있다.
검출가능한 제제를 이용하여 항체 또는 이의 항체부가 유도체화될 수 있는 유용한 검출가능한 제제로는 형광성 화합물이 포함된다. 예시의 형광 검출가능한 제제로는 플루오레세인, 플루오레세인, 이소티오시아네이트, 로다민, 5-디메틸아민-1-나프탈렌설포닐 클로라이드, 및 피코에리트린 등이 포함된다. 항체는 또한 검출가능한 효소, 예를 들면, 알칼리성 포스파타제, 서양 고추냉이 퍼옥시다제, 및 글루코스 옥시다제 등을 이용하여 유도체화될 수 있다. 검출가능한 효소를 이용하여 항체가 유도체화되는 경우, 검출가능한 반응 생성물을 생산하기 위해 효소가 이용하는 추가의 시약을 부가함으로써 검출된다. 예를 들면, 검출가능한 제제 서양 고추냉이 퍼옥시다제가 존재하는 경우, 과산화수소 및 디아미노벤지딘의 부가는 검출가능한 착색된 반응 생성물을 유도한다. 항체는 또한 비오틴을 이용하여 유도체화될 수 있고, 아비딘 또는 스트렙트아비딘 결합의 간접적 측정을 통해 검출될 수 있다.
한 실시형태에서, 본 발명의 항체는 조영제에 접합된다. 본원에 기술된 조성물 및 방법에 사용될 수 있는 조영제의 예로는 방사성 표지(예를 들면, 인듐), 효소, 형광성 표지, 발광성 표지, 생물발광성 표지, 자기 표지, 및 비오틴이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
한 실시형태에서, 항체 또는 ADC는 방사성 표지, 이에 한정되는 것은 아니지만 예를 들면 인듐(111In)에 링크된다. 111인듐은 EGFR 양성 종양을 식별하는데 사용하기 위한 본원에 기술된 항체 및 ADC를 표지하기 위해 사용될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 본원에 기술된 항-EGFR 항체(또는 ADC)는 이기능성 사이클로헥실 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA) 킬레이트인 이기능성 킬레이터를 통해 111In으로 표지된다(문헌[US 특허 제5,124,471호; 제5,434,287호; 및 제5,286,850호]을 참조하고, 이들 문헌의 각각은 본원에 인용에 의해 포함된다).
본 발명의 다른 실시형태는, 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합부가 하나 이상의 탄수화물 잔기를 포함하는 글리코실화된 결합 단백질을 제공한다. 초기 생체내 단백질 생산은 번역-후 변형으로서 공지되어 있는 추가의 프로세싱을 경험할 수 있다. 특히, 당(글리코실) 잔기는 효소적으로 첨가될 수 있고, 글리코실화로서 공지되어 있는 프로세스이다. 공유결합적으로 링크된 올리고사카라이드 측쇄를 지닌 얻어진 단백질은 글리코실화된 단백질 또는 당단백질로서 공지되어 있다. 항체는 Fc 도메인에의 하나 이상의 탄수화물 잔기 및 가변 도메인을 갖는 당단백질이다. Fc 도메인의 탄수화물 잔기들은 항체의 항원 결합 또는 반감기에 대한 최소 효과와 Fc 도메인의 이펙터 기능에 대한 중요한 효과를 갖는다(R. Jefferis, Biotechnol. Prog. 21 (2005), pp. 11-16). 대조적으로, 가변 도메인의 글리코실화는 항체의 항원 결합 활성에 대한 효과를 가질 수 있다. 가변 도메인에서의 글리코실화는 입체적 장해에 기인한 것으로 보이는 항체 결합 친화도에 대한 부정적 효과를 가질 수 있거나(Co, M. S., et al., Mol. Immunol. (1993) 30:1361-1367), 항원에 대한 친화도를 증가시킬 수 있다(Wallick, S. C., et al., Exp. Med. (1988) 168:1099-1109; Wright, A., et al., EMBO J. (1991) 10:2717 2723).
본 발명의 한 양상은, 결합 단백질의 O- 또는 N-연결된 글리코실화 부위가 돌연변이된 글리코실화 부위 돌연변이체를 생성하는 것에 관한 것이다. 당해 분야 숙련가는 익히 공지되어 있는 표준 기술을 이용하여 이러한 돌연변이체를 생성할 수 있다. 생물학적 활성을 보유하지만 증가되거나 감소된 결합 활성을 갖는 글리코실화 부위 돌연변이체는 본 발명의 다른 목적이다.
또 다른 실시형태에서, 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합부의 글리코실화는 변형된다. 예를 들면, 아글리코실화된(aglycosylated) 항체가 제조될 수 있다(즉, 항체에는 글리코실화가 결여되어 있다). 글리코실화는 예를 들면, 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시키도록 변경될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들면, 항체 서열 내의 글리코실화의 하나 이상의 부위를 변경함으로써 달성될 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 가변 영역 글리코실화 부위의 제거를 초래하여 당해 부위에서 글리코실화를 제거하는 하나 이상의 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 이러한 아글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 이러한 접근법은 PCT 공보 WO2003016466A2 및 미국 특허 제5,714,350호 및 6,350,861호에 추가로 상세하게 기술되어 있고, 상기 문헌의 각각은 이들의 전문이 본원에 인용에 의해 포함된다.
추가로 또는 대안으로, 변경된 유형의 글리코실화를 갖는 본 발명의 변형된 항-EGFR 항체, 예를 들면, 감소된 양의 푸코실 잔기를 갖는 저푸코실화된 항체 또는 증가된 이분성(bisecting) GlcNAc 구조를 갖는 항체가 제조될 수 있다. 이러한 변경된 글리코실화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 입증되어 왔다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들면, 변경된 글리코실화 기구를 이용하여 숙주 세포에서 항체를 발현시킴으로써 달성될 수 있다. 변경된 글리코실화 기구를 갖는 세포가 당해 분야에 기술되어 왔고, 당해 세포는 숙주 세포로서 사용될 수 있으며, 여기서, 당해 세포는 본 발명의 재조합 항체를 발현시켜 변경된 글리코실화를 이용하여 항체를 생산하기 위한 것이다. 예를 들면, 문헌[Shields, R. L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-1, 및 유럽 특허 제EP 1,176,195호; PCT 공보 WO 03/035835; WO 99/54342 80, 상기 문헌은 각각 이들의 전문이 본원에 인용에 의해 포함된다]을 참조한다.
단백질 글리코실화는 목적하는 단백질의 아미노산 서열뿐만 아니라 당해 단백질이 발현되는 숙주 세포에도 의존한다. 상이한 유기체는 상이한 글리코실화 효소(예를 들면, 글리코실트랜스퍼라제 및 글리코시다제)를 생산할 수 있고, 이용가능한 상이한 기질(뉴클레오타이드 당)을 가질 수 있다. 이러한 인자들로 인하여, 단백질 글리코실화 패턴 및 글리코실 잔기의 조성은, 특정 단백질이 발현되는 숙주 시스템에 따라 상이할 수 있다. 본 발명에 유용한 글리코실 잔기로는 글루코스, 갈락토스, 만노스, 퓨코스, n-아세틸글루코사민, 및 시알릭산이 포함될 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게, 글리코실화된 결합 단백질이 글리코실 잔기를 포함하므로 글리코실화 패턴은 사람이다.
상이한 단백질 글리코실화가 상이한 단백질 특성을 초래할 수 있다. 예를 들면, 효모와 같은 미생물 숙주에서 생산되고 효모 내인성 경로를 이용하여 글리코실화된 치료학적 단백질의 효능은 포유동물 세포, 예를 들면, CHO 세포주에서 발현된 동일한 단백질의 효능에 비하여 감소될 수 있다. 또한, 이러한 당단백질은 사람에서 면역원성일 수 있고, 투여 후에 생체내에서 감소된 반감기를 나타낼 수 있다. 사람 및 다른 동물에서 특정 수용체는 특정 글리코실 잔기를 인식할 수 있고, 혈류로부터 단백질의 신속한 청소를 촉진시킬 수 있다. 다른 부작용으로는 단백질 폴딩, 가용성, 프로테아제에 대한 감수성, 트래픽킹(trafficking), 수송, 구획화, 분비, 다른 단백질 또는 인자에 의한 인식, 항원성 또는 알레르기원성의 변화가 포함될 수 있다. 따라서, 실행자는 글리코실화의 특정 조성 및 패턴, 예를 들면, 사람 세포에서 또는 의도된 대상체 동물의 종-특이적 세포에서 생산된 것과 동일하거나 적어도 유사한 글리코실화 조성 및 패턴을 갖는 치료학적 단백질을 선호할 수 있다.
숙주 세포의 것과 상이한 글리코실화된 단백질을 발현시키는 것은, 숙주 세포를 유전적으로 변형시켜 이형 글리코실화 효소를 발현시킴으로써 달성될 수 있다. 재조합 기술을 이용하여, 실행자는 사람 단백질 글리코실화를 나타내는 항체 또는 이의 항원 결합부를 생성할 수 있다. 예를 들면, 효모 스트레인은 유전적으로 변형되어 비-천연 발생 글리코실화 효소를 발현시켜 이들 효모 스트레인에서 생산된 글리코실화된 단백질(당단백질)이 동물 세포, 특히 사람 세포의 단백질 글리코실화와 동일한 단백질 글리코실화를 나타냈다(미국 특허 공개 제20040018590호 및 제20020137134호 및 PCT 공보 WO2005100584 A2).
항체는 다수의 기술들 중 임의의 것에 의해 생산될 수 있다. 예를 들면, 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 발현 벡터(들)가 표준 기술에 의해 숙주 세포로 형질감염되는, 숙주 세포로부터의 발현. 용어 "형질감염"의 다양한 형태는 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에의 외인성 DNA의 도입을 위해 흔히 사용되는 다양한 기술, 예를 들면, 전기천공, 칼슘-포스페이트 침전, 및 DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포함하는 것으로 의도된다. 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에서 항체를 발현시킬 수 있지만, 이러한 진핵생물 세포(및 특히 포유동물 세포)는 원핵생물 세포보다 적절하게 폴딩되고 면역학적으로 활성인 항체를 더욱 어셈블링하고 분비하는 경향이 있기 때문에, 진핵생물 세포에서의 항체의 발현이 바람직하고, 포유동물 숙주 세포에서의 발현이 가장 바람직하다.
본 발명의 재조합 항체를 발현시키기 위한 바람직한 포유동물 숙주 세포로는 차이니즈 햄스터 난소(CHO 세포)(문헌[Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220]에 기술되어 있는 dhfr- CHO 세포 포함, 예를 들면, 문헌[R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621]에 기술되어 있는 DHFR 선택가능한 마커와 함께 사용됨), NS0 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포가 포함된다. 항체 유전자를 암호화하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포에 도입되는 경우, 상기 항체는 숙주 세포에서 항체를 발현시키기에, 또는 보다 바람직하게는 숙주 세포가 성장되는 배양 배지에 항체를 분비하기에 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 생산된다. 항체는 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다.
또한, 숙주 세포는 기능성 항체 단편, 예를 들면, Fab 단편 또는 scFv 분자를 생산하는데 사용될 수 있다. 상기 절차에 대한 변형은 본 발명의 범위 내임이 이해될 것이다. 예를 들면, 숙주 세포를 본 발명의 항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 기능성 단편을 암호화하는 DNA로 형질감염시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 재조합 DNA 기술은, 목적하는 항원에 대한 결합에 필요하지 않은 경쇄 및 중쇄 중 어느 하나 또는 경쇄 및 중쇄 둘 다를 암호화하는 DNA의 일부 또는 전부를 제거하는데 사용될 수 있다. 이러한 절단된 DNA 분자로부터 발현된 분자도 본 발명의 항체에 포함된다. 또한, 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄가 본 발명의 항체이고 다른 중쇄 및 경쇄는 목적하는 항원 이외의 다른 항원에 대해 특이적인 이기능성 항체는, 표준 화학적 가교결합 방법에 의해 제2 항체에 본 발명의 항체를 가교결합시킴으로써 생산될 수 있다.
항체 또는 이의 항원 결합부의 재조합 발현을 위한 바람직한 시스템에서, 항체 중쇄 및 항체 경쇄 둘 다를 암호화하는 재조합 발현 벡터는 칼슘 포스페이트-매개된 형질감염에 의해 dhfr- CHO 세포에 도입된다. 재조합 발현 벡터 내에서, 항체 중쇄 및 경쇄 유전자는 각각 CMV 인핸서/AdMLP 프로모터 조절 요소에 작동적으로 링크되어 높은 수준의 유전자 전사를 유도한다. 또한, 재조합 발현 벡터는 DHFR 유전자를 갖고, 이는 메토트렉세이트 선택/증폭을 이용하여 벡터로 형질감염된 CHO 세포의 선택을 가능하게 한다. 선택된 형질전환 숙주 세포가 배양되어 항체 중쇄 및 경쇄의 발현을 가능하게 하고, 온전한 항체가 배양 배지로부터 회수된다. 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 재조합 발현 벡터를 제조하고, 숙주 세포를 형질감염시키고, 형질전환체를 선택하고, 숙주 세포를 배양하고, 배양 배지로부터 항체를 회수한다. 또한, 추가로, 본 발명은, 적합한 배양 배지에서 숙주 세포를 재조합 항체가 합성될 때까지 배양함으로써 본 발명의 재조합 항체를 합성하는 방법을 제공한다. 본 발명의 재조합 항체는 본원에 개시된 아미노산 서열에 상응하는 핵산 분자를 이용하여 생산될 수 있다. 한 실시형태에서, 서열번호 86 및/또는 서열번호 87에 제시된 핵산 분자는 재조합 항체의 생산에 사용된다. 상기 방법은 배양 배지로부터 재조합 항체를 단리하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
III. 항-EGFR 항체 약물 접합체(ADC)
본원에 기술된 항-EGFR 항체는 약물 모이어티에 접합되어 항-EGFR 항체 약물 접합체(ADC)를 형성할 수 있다. 항체-약물 접합체(ADC)는 표적 조직, 예를 들면, 종양-관련 항원, 예를 들면, EGFR 발현 종양에 하나 이상의 약물 모이어티(들)를 선택적으로 전달하는 ADC의 능력으로 인하여, 질환, 예를 들면, 암을 치료하는데 있어서 항체의 치료학적 효능을 증가시킬 수 있다. 따라서, 소정 실시형태에서, 본 발명은 치료학적 사용, 예를 들면, 암의 치료를 위한 항-EGFR ADC를 제공한다.
본 발명의 항-EGFR ADC는 항-EGFR 항체, 즉, 하나 이상의 약물 모이어티에 링크된, EGFR에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. ADC의 특이성은 항체, 즉, 항-EGFR의 특이성에 의해 정의된다. 한 실시형태에서, 항-EGFR 항체는 EGFR을 발현하는 형질전환된 암 세포에 내부로 전달되는 하나 이상의 세포독성 약물(들)에 링크된다.
본 발명의 항-EGFR ADC에 사용될 수 있는 약물의 예는 하기에 제공되고, 항체 및 하나 이상의 약물(들)을 접합시키는데 사용될 수 있는 링커들이다. 용어 "약물", "제제" 및 "약물 모이어티"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 용어 "링크된" 및 "접합된"도 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 항체와 모이어티가 공유결합적으로 링크되어 있음을 나타낸다.
몇몇의 실시형태에서, ADC는 하기 화학식(화학식 I)을 갖고:
Ab-(L-D) n (I)
여기서, Ab는 항체, 예를 들면, 항-EGFR 항체 AbA이고, (L-D)는 링커-약물 모이어티이다. 링커-약물 모이어티는 링커인 L-, 및 예를 들면, 표적 세포, 예를 들면, EGFR을 발현하는 세포에 대해 세포분열 정지, 세포독성, 또는 그렇지 않으면 치료학적 활성을 갖는 약물 모이어티인 -D로 이루어지고; n은 1 내지 20의 정수이다. 몇몇의 실시형태에서, n은 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2이거나, 1이다. ADC의 DAR은 화학식 I에서 나타낸 "n"과 등가이다. 한 실시형태에서, ADC는 Ab-(L-D) n 의 화학식을 갖고, 여기서, Ab는 항-EGFR 항체, 예를 들면, AbA이고, L은 링커, 예를 들면, 발린 시트룰린(vc)이고, D는 약물, 예를 들면, MMAF 또는 MMAE와 같은 아우리스타틴이고, n은 2 내지 4(2 내지 4의 DAR과 등가임)이다. 본 발명의 ADC에 사용될 수 있는 약물(화학식 I의 D) 및 링커(화학식 I의 L), 및 대안의 ADC 구조에 관한 추가의 상세설명은 하기에 기술된다.
A. 항-EGFR ADC: 접합을 위한 예시의 약물
항-EGFR 항체는 목적하는 세포, 예를 들면, EGFR을 발현하는 암 세포에 하나 이상의 약물(들)을 표적화하기 위해 ADC에서 사용될 수 있다. 본 발명의 항-EGFR ADC는 하나 이상의 약물(들)이 특정 세포에 전달되므로, 예를 들면, 항암 치료요법으로 종종 나타나는 부작용을 감소시킬 수 있는 표적화된 치료요법을 제공할 수 있다.
아우리스타틴
본 발명의 항-EGFR 항체, 예를 들면, AbA 항체는 적어도 하나의 아우리스타틴에 접합될 수 있다. 아우리스타틴은 일반적으로 미세소관 동역학 및 GTP 가수분해를 간섭하여 세포 분할을 억제함으로써 항암 활성을 갖는 것으로 밝혀진 한 그룹의 돌라스타틴 유사체를 나타낸다. 아우리스타틴 E(U.S. 특허 제5,635,483호)는 항암 약물 빈크리스틴과 튜불린 상의 동일한 부위에 결합함으로써 튜불린 중합을 억제하는 화합물인 해양 천연 생성물 돌라스타틴 10의 합성 유사체이다(G. R. Pettit, Prog. Chem. Org. Nat. Prod, 70: 1-79 (1997)). 돌라스타틴 10, 아우리스타틴 PE, 및 아우리스타틴 E는 4개의 아미노산을 갖고 이들 중 3개는 돌라스타틴 클래스의 화합물에 대해 고유한 선형 펩타이드이다. 아우리스타틴 서브클래스의 유사분열 억제제의 예시적 실시형태로는 모노메틸 아우리스타틴 D(MMAD 또는 아우리스타틴 D 유도체), 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE 또는 아우리스타틴 E 유도체), 모노메틸 아우리스타틴 F(MMAF 또는 아우리스타틴 F 유도체), 아우리스타틴 F 페닐렌디아민(AFP), 아우리스타틴 EB(AEB), 아우리스타틴 EFP(AEFP), 및 5-벤조일발레르산-AE 에스테르(AEVB)가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 아우리스타틴 유도체의 합성 및 구조는 문헌[U.S. 특허 출원 공개 제2003-0083263호, 제2005-0238649호 및 제2005-0009751호; 국제 특허 공보 제WO 04/010957호, 국제 특허 공보 제WO 02/088172호, 및 U.S. Pat. 제6,323,315호; 제6,239,104호; 제6,034,065호; 제5,780,588호; 제5,665,860호; 제5,663,149호; 제5,635,483호; 제5,599,902호; 제5,554,725호; 제5,530,097호; 제5,521,284호; 제5,504,191호; 제5,410,024호; 제5,138,036호; 제5,076,973호; 제4,986,988호; 제4,978,744호; 제4,879,278호; 제4,816,444호; 및 제4,486,414호, 이들 문헌의 각각은 본원에 인용에 의해 포함된다]에 기술되어 있다.
한 실시형태에서, 본 발명의 항-EGFR 항체, 예를 들면, AbA는 적어도 하나의 MMAE(모노-메틸 아우리스타틴 E)에 접합된다. 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE, 베도틴)는 튜불린의 중합을 차단함으로써 세포 분할을 억제한다. 또한, 이의 초독성 때문에, 약물 자체로서 사용할 수는 없다. 최근 암 치료요법 개발에 있어서, 이는 암 세포에서 특이적 마커 발현을 인식하고 MMAE를 암 세포에 지시하는 모노클로날 항체(mAb)에 링크된다. 한 실시형태에서, MMAE를 항-EGFR 항체에 링크하는 링커는 세포외 유체(즉, 세포에 대해 외부에 존재하는 배지 또는 환경)에서 안정하지만, 카텝신에 의해 절단되고, 일단 ADC가 특정 암 세포 항원에 결합되어 암 세포에 진입하면, 이로써 독성 MMAE를 방출시키고 잠재적 항-유사분열 메커니즘을 활성화시킨다.
한 실시형태에서, 본원에 기술된 항-EGFR 항체, 예를 들면, AbA는 적어도 하나의 MMAF(모노메틸아우리스타틴 F)에 접합된다. 모노메틸 아우리스타틴 F(MMAF)는 튜불린의 중합을 차단함으로써 세포 분할을 억제한다. 이는, 비하전된 대응부 MMAE에 비하여 이의 세포독성 활성을 약화시키는 하전된 C-말단 페닐알라닌 잔기를 갖는다. 이의 초독성 때문에, 약물 자체로서 사용할 수는 없지만, 이를 암 세포에 지시하는 모노클로날 항체(mAb)에 링크될 수 있다. 한 실시형태에서, 항-EGFR 항체에의 링커는 세포외 유체에서 안정하지만, 카텝신에 의해 절단되고, 일단 접합체가 종양 세포에 진입하면, 이로써 항-유사분열 메커니즘을 활성화시킨다.
MMAF 및 MMAE의 구조는 하기에 제공된다.
Figure pat00007
또한, AbA-vcMMAE의 예는 도 11에 제공된다. 특히, 도 11은 항체(예를 들면, AbA)가 단일 약물에 커플링되고, 따라서, 1의 DAR을 갖는 상황을 기술한다. 소정 실시형태에서, ADC는 2 내지 8, 또는 대안으로 2 내지 4의 DAR을 가질 것이다.
접합을 위한 다른 약물들
ADC에 사용될 수 있는 약물, 즉, 본 발명의 항-EGFR 항체에 접합될 수 있는 약물의 예는 하기에 제공되고, 이로는 유사분열 억제제, 항종양 항생제, 면역조절제, 유전자 치료요법 벡터, 알킬화제, 항혈관신생제, 항대사물질, 붕소-함유제, 화합물 보호제, 호르몬제, 글루코코르티코이드, 광활성 치료학적 제제, 올리고뉴클레오타이드, 방사성 동위원소, 방사선 증감제, 토포이소머라제 억제제, 티로신 키나제 억제제, 및 이들의 조합이 포함된다.
1. 유사분열 억제제
한 양상에서, 항-EGFR 항체는 하나 이상의 유사분열 억제제(들)에 접합되어 암의 치료를 위한 ADC를 형성할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "유사분열 억제제"는 암 세포에 특히 중요한 생물학적 프로세스인 유사분열 또는 세포 분할을 차단하는 세포독성 및/또는 치료학적 제제를 말한다. 유사분열 억제제는 미세소관을 방해하여 흔히 미세소관 중합 또는 미세소관 탈중합(depolymerization)에 영향을 미침으로써 세포 분할이 방지되도록 한다. 따라서, 한 실시형태에서, 본 발명의 항-EGFR 항체는, 튜불린 중합을 억제함으로써 미세소관 형성을 방해하는 하나 이상의 유사분열 억제제(들)에 접합된다. 한 실시형태에서, 본 발명의 ADC에 사용되는 유사분열 억제제는 Ixempra(익사베필론)이다. 본 발명의 항-EGFR ADC에 사용될 수 있는 유사분열 억제제의 예는 하기에 제공된다. 상기 기술된 아우리스타틴은 유사분열 억제제 속(genus)에 포함된다.
a. 돌라스타틴
본 발명의 항-EGFR 항체는 적어도 하나의 돌라스타틴에 접합되어 ADC를 형성할 수 있다. 돌라스타틴은 인도양 군소 돌라벨라 아우리큘라리아(Dollabella auricularia)로부터 단리된 짧은 펩타이드 화합물이다(문헌[Pettit et al., J. Am. Chem. Soc., 1976, 98, 4677]을 참조한다). 돌라스타틴의 예로는 돌라스타틴 10 및 돌라스타틴 15가 포함된다. 돌라벨라 아루리큘라리아로부터 유도된 7개-서브유닛 뎁시펩타이드인 돌라스타틴 15는 동일한 유기체로부터 얻어진 5개-서브유닛 펩타이드인 항튜불린제 돌라스타틴 10과 구조적으로 관련되어 있는 잠재적 항유사분열 제제이다. 따라서, 한 실시형태에서, 본 발명의 항-EGFR ADC는 본원에 기술된 항-EGFR 항체 및 적어도 하나의 돌라스타틴을 포함한다. 상기 기술된 아우리스타틴은 돌라스타틴 10의 합성 유도체이다.
b. 메이탄시노이드
본 발명의 항-EGFR 항체는 적어도 하나의 메이탄시노이드에 접합되어 ADC를 형성할 수 있다. 메이탄시노이드는 동일한 종의 이끼류 및 보다 고등 식물 패밀리 노박덩굴(Celastraceae), 갈매나무(Rhamnaceae) 및 대극(Euphorbiaceae)의 구성원으로부터 최초로 단리된 잠재적 항종양 제제이다(Kupchan et al, J. Am. Chem. Soc. 94:1354-1356 [1972]; Wani et al, J. Chem. Soc. Chem. Commun. 390: [1973]; Powell et al, J. Nat. Prod. 46:660-666 [1983]; Sakai et al, J. Nat. Prod. 51 :845-850 [1988]; 및 Suwanborirux et al, Experientia 46:117-120 [1990]). 증거는 메이탄시노이드가 미세소관 단백질 튜불린의 중합을 억제하여 미세소관의 형성을 방지함으로써 유사분열을 억제함을 시사한다(예를 들면, 문헌[U.S. Pat. 제6,441,163호 및 Remillard et al., Science, 189, 1002-1005 (1975)]을 참조한다). 메이탄시노이드는 세포 배양 모델을 이용한 시험관내에서 그리고 실험실 동물 시스템을 이용한 생체내에서 종양 세포 성장을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 메이탄시노이드의 세포독성은 종래의 화학치료학적 제제, 예를 들면, 메토트렉세이트, 다우노루비신, 및 빈크리스틴보다 1,000-배 더 크다(예를 들면, U.S. Pat. 제5,208,020호를 참조한다).
메이탄시노이드는 메이탄신, 메이탄시놀, 메이탄시놀의 C-3 에스테르, 및 다른 메이탄시놀 유사체 및 유도체를 포함한다(예를 들면, U.S. Pat. 제5,208,020호 및 제6,441,163호를 참조하고, 이들 문헌의 각각은 본원에 인용에 의해 포함된다). 메이탄시놀의 C-3 에스테르는 천연 발생이거나 합성적으로 유도될 수 있다. 또한, 천연 발생 및 합성 C-3 메이탄시놀 에스테르 둘 다는 단순 카르복실산을 갖는 C-3 에스테르 또는 N-메틸-L-알라닌의 유도체를 갖는 C-3 에스테르로서 분류될 수 있고, 후자는 전자보다 더 세포독성이다. 합성 메이탄시노이드 유사체는 예를 들면, 문헌[Kupchan et al., J. Med. Chem., 21, 31-37 (1978)]에 기술되어 있다.
본 발명의 ADC에 사용하기에 적합한 메이탄시노이드는 천연 공급원으로부터 단리될 수 있거나, 합성적으로 생산되거나, 반-합성적으로 생산될 수 있다. 또한, 메이탄시노이드는 최후 접합체 분자에서 충분한 세포독성이 보존되는 한 임의의 적합한 방식으로 변형될 수 있다. 이와 관련하여, 메이탄시노이드에는 항체가 링크될 수 있는 적합한 기능성 그룹이 결여되어 있다. 바람직하게는 링크 모이어티를 이용하여 메이탄시노이드를 항체에 링크하여 접합체를 형성하고, 이는 섹션 III.B에 보다 상세하게 기술된다. 예시의 메이탄시노이드의 구조, 메르탄신(DM1)은 하기에 제공된다.
Figure pat00008
메이탄시노이드의 대표예로는 DM1(N2'-데아세틸-N2'-(3-메르캅토-1-옥소프로필)-메이탄신; 메르탄신(약물 메이탄시노이드 1; ImmunoGen, Inc.)으로서도 나타냄; 또한 문헌[Chari et al. (1992) Cancer Res 52:127)]을 참조한다), DM2, DM3(N2'-데아세틸-N2'-(4-메르캅토-1-옥소펜틸)-메이탄신), DM4(4-메틸-4-메르캅토-1-옥소펜틸)-메이탄신) 및 메이탄시놀(합성 메이탄시노이드 유사체)이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 메이탄시노이드의 다른 예는 본원에 인용에 의해 포함된 US 특허 제8,142,784호에 기술되어 있다.
안사미토신(Ansamitocin)은 각종 박테리아 공급원으로부터 단리된 한 그룹의 메이탄시노이드 항생제이다. 이들 화합물은 잠재적 항종양 활성을 갖는다. 대표예로는 안사미토신 P1, 안사미토신 P2, 안사미토신 P3, 및 안사미토신 P4가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 한 실시형태에서, 항-EGFR 항체는 적어도 하나의 DM1에 접합된다. 한 실시형태에서, 항-EGFR 항체는 적어도 하나의 DM2에 접합된다. 한 실시형태에서, 항-EGFR 항체는 적어도 하나의 DM3에 접합된다. 한 실시형태에서, 항-EGFR 항체는 적어도 하나의 DM4에 접합된다.
d. 식물성 알칼로이드
본 발명의 항-EGFR 항체는 적어도 하나의 식물성 알칼로이드, 예를 들면, 탁산 또는 빈카 알칼로이드에 접합될 수 있다. 식물성 알칼로이드는 소정 유형의 식물로부터 제조 유도된 화학 치료요법 치료이다. 빈카 알칼로이드는 페리윙클(periwinkle) 식물(일일초(catharanthus rosea))로부터 제조되고, 반면, 탁산은 태평양 주목(Pacific Yew tree)의 나무껍질(주목(taxus))로부터 제조된다. 빈카 알칼로이드 및 탁산 둘 다는 항미세소관 제제로서도 공지되어 있고, 하기에 보다 상세하게 기술된다.
탁산
본원에 기술된 항-EGFR 항체는 적어도 하나의 탁산에 접합될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "탁산"은 미세소관 작용의 메커니즘을 갖고 탁산 환 구조 및 세포분열 정지 활성에 요구되는 입체특이적 측쇄를 포함하는 구조를 갖는 항신생물제의 한 클래스를 말한다. 또한, 친수성 유도체 및 소수성 유도체 둘 다를 포함하는 각종 공지의 유도체도 용어 "탁산" 내에 포함된다. 탁산 유도체로는 국제 특허 공보 제WO 99/18113호에 기술된 갈락토스 및 만노스 유도체; WO 99/14209에 기술된 피페라지노 및 기타 유도체; WO 99/09021, WO 98/22451, 및 U.S. Pat. 제5,869,680호에 기술된 탁산 유도체; WO 98/28288에 기술된 6-티오 유도체; U.S. Pat. 제5,821,263호에 기술된 설펜아미드 유도체; 및 U.S. Pat. 제5,415,869호에 기술된 탁솔 유도체가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니고, 상기 문헌들의 각각은 본원에 인용에 의해 포함된다. 탁산 화합물은 또한 U.S. Pat. 제5,641,803호, 제5,665,671호, 제5,380,751호, 제5,728,687호, 제5,415,869호, 제5,407,683호, 제5,399,363호, 제5,424,073호, 제5,157,049호, 제5,773,464호, 제5,821,263호, 제5,840,929호, 제4,814,470호, 제5,438,072호, 제5,403,858호, 제4,960,790호, 제5,433,364호, 제4,942,184호, 제5,362,831호, 제5,705,503호, 및 제5,278,324호에 이전에 기술되었고, 이들 문헌은 전부 인용에 의해 명백히 포함된다. 탁산의 추가의 예로는 도세탁셀(Taxotere; Sanofi Aventis), 파클리탁셀(Abraxane 또는 Taxol; Abraxis Oncology), 및 나노입자 파클리탁셀(ABI-007 / Abraxene; Abrzxis Bioscience)이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
한 실시형태에서, 본 발명의 항-EGFR 항체는 적어도 하나의 도세탁셀에 접합된다. 한 실시형태에서, 본 발명의 항-EGFR 항체는 적어도 하나의 파클리탁셀에 접합된다.
빈카 알칼로이드
한 실시형태에서, 항-EGFR 항체는 적어도 하나의 빈카 알칼로이드에 접합된다. 빈카 알칼로이드는 튜불린에 작용하여 미세소관의 형성을 방지함으로써 암 세포가 분할하는 능력을 억제함으로써 작용하는 세포-주기-특이적 약물의 한 클래스이다. 본 발명의 ADC에 사용될 수 있는 빈카 알칼로이드의 예로는 빈데신 설페이트, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 및 비노렐빈이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
2. 항종양 항생제
본 발명의 항-EGFR 항체는 암의 치료를 위한 하나 이상의 항종양 항생제(들)에 접합될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "항종양 항생제"는 DNA를 간섭함으로써 세포 성장을 차단하고 미생물로부터 제조되는 항신생물 약물을 의미한다. 보통, 항종양 항생제는 DNA 가닥을 브레이크업(break up)하거나 DNA 합성을 서행시키거나 정지시킨다. 본 발명의 항-EGFR ADC에 포함될 수 있는 항종양 항생제의 예로는 하기에 보다 상세하게 기술되는 악티노마이신(예를 들면, 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀), 안트라사이클린, 칼리케아마이신, 및 듀오카르마이신이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
a. 악티노마이신
본 발명의 항-EGFR 항체는 적어도 하나의 악티노마이신에 접합될 수 있다. 악티노마이신은 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속의 박테리아로부터 단리된 항종양 항생제의 한 서브클래스이다. 악티노마이신의 대표예로는 악티노마이신 D(Cosmegen[악티노마이신, 닥티노마이신, 악티노마이신 IV, 악티노마이신 C1로서도 공지되어 있음], Lundbeck, Inc.), 안트라마이신, 치카마이신 A, DC-81, 마제트라마이신, 네오트라마이신 A, 네오트라마이신 B, 포로트라마이신, 프로트라카르신 B, SG2285, 시바노마이신, 시비로마이신, 및 토메이마이신이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 한 실시형태에서, 본 발명의 항-EGFR 항체는 적어도 하나의 피롤로벤조디아제핀(PBD)에 접합된다. PBD의 예로는 안트라마이신, 치카마이신 A, DC-81, 마제트라마이신, 네오트라마이신 A, 네오트라마이신 B, 포로트라마이신, 프로트라카르신 B, SG2000(SJG-136), SG2202(ZC-207), SG2285(ZC-423), 시바노마이신, 시비로마이신 및 토메이마이신이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 따라서, 한 실시형태에서, 본 발명의 항-EGFR 항체는 적어도 하나의 악티노마이신, 예를 들면, 악티노마이신 D, 또는 적어도 하나의 PBD, 예를 들면, 피롤로벤조디아제핀(PBD) 이량체에 접합된다.
PBD의 구조는 예를 들면, U.S. 특허 출원 공개 제2013/0028917호 및 제2013/0028919호에서 그리고 WO 2011/130598 A1에서 찾을 수 있고, 이들 문헌의 각각은 이들의 전문이 본원에 인용에 의해 포함된다. PBD의 일반적 구조는 하기에 제공된다.
Figure pat00009
PBD들은 치환체의 수, 유형 및 위치에 있어서, 이들의 방향족 A 환 및 피롤로 C 환에 있어서, 그리고 C 환의 포화도에 있어서 상이하다. B-환에 있어서, DNA를 알킬화하는데 관여하는 친전자성 중심인 N10-C11 위치에는 일반적으로 이민(N=C), 카르비놀아민(NH-CH(OH)) 또는 카르비놀아민 메틸 에테르(NH-CH(OMe))가 존재한다. 모든 공지의 천연 생성물은, C 환으로부터 A 환을 향하여 보았을 때 이들에 오른손 방향 트위스트(right-handed twist)를 제공하는 키랄 C11α 위치에 (S)-입체배치를 갖는다. 본원에 제공된 PBD 예는 본 발명의 항-EGFR 항체에 접합될 수 있다. 본 발명의 항-EGFR 항체에 접합될 수 있는 PBD의 추가의 예는 예를 들면, U.S. 특허 출원 공개 제2013/0028917 A1호 및 제2013/0028919 A1에서, U.S. 특허 제7,741,319 B2호에서, 그리고 WO 2011/130598 A1 및 WO 2006/111759 A1에서 찾을 수 있고, 상기 문헌들의 각각은 이들의 전문이 본원에 인용에 의해 포함된다.
하기 화학식 II를 갖는 대표적 PBD 이량체는 본 발명의 항-EGFR 항체에 접합될 수 있다:
Figure pat00010
여기서:
R2는 화학식 III으로 이루어지고:
Figure pat00011
여기서, A는 C5-7 아릴 그룹이고, X는 -O-, -S-, -C(O)O-, -C(O)-, -NH(C-O)-, 및 -N(RN)-으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 링커 유닛에 접합된 그룹이고, 여기서, RN은 H, C1-4 알킬 및 (C2H4O)mCH3이고, 여기서, m은 1 내지 3이고:
(i) Q1은 단일 결합이고, Q2는 단일 결합 및 -Z-(CH2)n-로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 여기서, Z는 단일 결합, O, S 및 NH로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, n은 1 내지 3이거나;
(ii) Q1은 -CH-CH-이고, Q2는 단일 결합이고;
R12는 할로, 니트로, 시아노, C1-12 알콕시, C3-20 헤테로사이클로알콕시, C5-20 아릴옥시, 헤테로아릴옥시, 알킬알콕시, 아릴알콕시, 알킬아릴옥시, 헤테로아릴알콕시, 알킬헤테로아릴옥시, C1-7 알킬, C3-7 헤테로사이클릴 및 비스-옥시-C1-3 알킬렌으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 치환체에 의해 임의로 치환된 C5-10 아릴 그룹이고;
R6 및 R9는 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', 니트로, Me3Sn 및 할로로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
여기서, R 및 R'은 임의로 치환된 C1-12 알킬, C3-20 헤테로사이클릴 및 C5-20 아릴 그룹으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
R7은 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NHRR', 니트로, Me3Sn 및 할로로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
(a) R10은 H이고, R11은 OH, ORA, 여기서, RA는 C1-4 알킬이거나;
(b) R10 및 R11은, 이들이 결합되는, 질소와 탄소 원자 사이의 질소-탄소 이중 결합을 형성하거나;
(c) R10은 H이고, R11은 SOzM이고, 여기서, z는 2 또는 3이고;
R"은, O, S, NH 및 방향족 환으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로 원자에 의해 쇄가 간섭될 수 있는 C3-12 알킬렌 그룹이고;
Y 및 Y'은 O, S, 및 NH로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
R6', R7', R9'은 각각 R6, R7 및 R9와 동일한 그룹으로부터 선택되고, R10' 및 R11'은 R10 및 R11과 동일하고, 각각의 M은 1가의 약제학적으로 허용되는 양이온이거나 M 그룹 둘 다는 함께 2가의 약제학적으로 허용되는 양이온이다.
본원에 사용된 어구 "임의로 치환된"은 치환되지 않을 수 있거나 치환될 수 있는 모 그룹에 관한 것이다.
달리 명시되지 않는 한, 본원에 사용된 용어 "치환된"은 하나 이상의 치환체를 갖는 모 그룹에 관한 것이다. 용어 "치환체"는 본원에서 종래 의미로 사용되고, 모 그룹에 공유결합적으로 부착되거나, 적절하게는 모그룹에 융합된 화학적 모이어티를 말한다. 다양한 치환체들이 익히 공지되어 있고, 이들의 형성 및 각종 모 그룹에의 도입을 위한 방법들도 익히 공지되어 있다.
C1-12 알킬: 본원에서 사용된 용어 "C1-12 알킬"은, 지방족 또는 지환식일 수 있고 포화되거나 불포화(예를 들면, 부분적 불포화, 완전 불포화)될 수 있는 1 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 탄화수소 화합물의 탄소 원자로부터 수소 원자를 제거함으로써 얻어지는 1가의 모이어티에 관한 것이다. 따라서, 용어 "알킬"은 하기에 논의되는 서브-클래스 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬 등을 포함한다.
포화된 알킬 그룹의 예로는 메틸(C1), 에틸(C2), 프로필(C3), 부틸(C4), 펜틸(C5), 헥실(C6) 및 헵틸(C7)이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
포화된 선형 알킬 그룹의 예로는 메틸(C1), 에틸(C2), n-프로필(C3), n-부틸(C4), n-펜틸(아밀)(C5), n-헥실(C6) 및 n-헵틸(C7)이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
포화된 분지형 알킬 그룹의 예로는 이소-프로필(C3), 이소-부틸(C4), sec-부틸(C4), tert-부틸(C4), 이소-펜틸(C5), 및 네오-펜틸(C5)이 포함된다.
C3-20 헤테로사이클릴: 본원에 사용된 용어 "C3-20 헤테로사이클릴"은 모이어티가 3 내지 20개의 환 원자를 갖고 이들 중 1 내지 10개가 환 헤테로 원자인 헤테로환 화합물의 환 원자로부터 수소 원자를 제거함으로써 얻어지는 1가의 모이어티에 관한 것이다. 바람직하게, 각각의 환은 3 내지 7개의 환 원자를 갖고, 이들 중 1 내지 4개는 환 헤테로 원자이다.
이러한 문맥에서, 접두사(예를 들면, C3-20, C3-7, C5-6 등)는 탄소 원자 또는 헤테로 원자에 관계없이 환 원자의 수, 또는 환 원자의 수의 범위를 나타낸다. 예를 들면, 본원에 사용되는 용어 "C5-6 헤테로사이클릴"은 5 또는 6개의 환 원자를 갖는 헤테로사이클릴 그룹을 나타낸다.
모노사이클릭 헤테로사이클릴 그룹의 예로는 하기로부터 유도된 것들이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다:
N1: 아지리딘(C3), 아제티딘(C4), 피롤리딘(테트라하이드로피롤)(C5), 피롤린(예를 들면, 3-피롤린, 2,5-디하이드로피롤)(C5), 2H-피롤 또는 3H-피롤(이소피롤, 이소아졸)(C5), 피페리딘(C6), 디하이드로피리딘(C6), 테트라하이드로피리딘(C6), 아제핀(C7); O1: 옥시란(C3), 옥세탄(C4), 옥솔란(테트라하이드로푸란)(C5), 옥솔(디하이드로푸란)(C5), 옥산(테트라하이드로피란)(C6), 디하이드로피란(C6), 피란(C6), 옥세핀(C7); S1: 티이란(C3), 티에탄(C4), 티올란(테트라하이드로티오펜)(C5), 티안(테트라하이드로티오피란)(C6), 티에판(C7); O2: 디옥솔란(C5), 디옥산(C6), 및 디옥세판(C7); O3: 트리옥산(C6); N2: 이미다졸리딘(C5), 피라졸리딘(디아졸리딘)(C5), 이미다졸린(C5), 피라졸린(디하이드로피라졸)(C5), 피페라진(C6); N1O1: 테트라하이드로옥사졸(C5), 디하이드로옥사졸(C5), 테트라하이드로이소옥사졸(C5), 디하이드로이소옥사졸(C5), 모르폴린(C6), 테트라하이드로옥사진(C6), 디하이드로옥사진(C6), 옥사진(C6); N1S1: 티아졸린(C5), 티아졸리딘(C5), 티오모르폴린(C6); N2O1: 옥사디아진(C6); O1S1: 옥사티올(C5) 및 옥사티안(티옥산)(C6); 및 N1O1S1: 옥사티아진(C6).
치환된 모노사이클릭 헤테로사이클릴 그룹의 예로는 사이클릭 형태의 사카라이드, 예를 들면, 아라비노푸라노스, 릭소푸라노스, 리보푸라노스, 및 자일로푸라노스와 같은 푸라노스(C5), 및 예를 들면, 알로피라노스, 알트로피라노스, 글루코피라노스, 만노피라노스, 굴로피라노스, 이도피라노스, 갈락토피라노스, 및 탈로피라노스와 같은 피라노스(C6)로부터 유도된 것들이 포함된다.
C5-20 아릴: 본원에 사용되는 용어 "C5-20 아릴"은 모이어티가 3 내지 20개의 환 원자를 갖는 방향족 화합물의 방향족 환 원자로부터 수소 원자를 제거함으로써 얻어지는 1가의 모이어티에 관한 것이다. 바람직하게, 각각의 환은 5 내지 7개의 한 원자를 갖는다.
이러한 문맥에서, 접두사(예를 들면, C3-20, C5-7, C5-6 등)는 탄소 원자 또는 헤테로 원자에 관계없이 환 원자의 수, 또는 환 원자의 수의 범위를 나타낸다. 예를 들면, 본원에 사용되는 용어 "C5-6 아릴"은 5 또는 6개의 환 원자를 갖는 아릴 그룹을 나타낸다.
한 실시형태에서, 본 발명의 항-EGFR 항체는 하기 화학식을 갖는 PBD 이량체에 접합될 수 있다:
Figure pat00012
여기서, 상기 구조는 PBD 이량체 SG2202(ZC-207)를 기술하고, 링커 L을 통해 본 발명의 항-EGFR 항체에 접합된다. SG2202(ZC-207)는 예를 들면, 본원에 인용에 의해 그 전문이 포함되는 U.S. 특허 App. Pub. 제2007/0173497호에 개시되어 있다.
다른 실시형태에서, PBD 이량체, SGD-1882는 도 21에 도시된 바와 같이 약물 링커를 통해 본 발명의 항-EGFR 항체에 접합된다. SGD-1882는 문헌[Sutherland et al. (2013) Blood 122(8):1455]에 그리고 U.S 특허 App. Pub. 제2013/0028919호에 개시되어 있고, 상기 문헌은 본원에 그 전문이 인용에 의해 포함된다. 도 21에 기술되는 바와 같이, PBD 이량체 SGD-1882는 mc-val-ala-디펩타이드 링커를 통해 항체에 접합될 수 있다(도 21에서 총체적으로 SGD-1910으로서 칭함). 소정 실시형태에서, 본원에 개시된 항-EGFR 항체는 도 21에 기술된 PBD 이량체에 접합된다. 따라서, 추가의 실시형태에서, 본 발명은 도 21에 기술된 바와 같이 mc-val-ala-디펩타이드 링커를 통해 PBD 이량체에 접합된, 본원에 개시된 항-EGFR 항체를 포함한다. 소정 실시형태에서, 본 발명은, 도 21에 기술된 PBD 이량체를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 PBD에 접합된, 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인, 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항-EGFR 항체를 포함한다. 소정 실시형태에서, 본 발명은, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열에 의해 정의되는 AbA의 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-EGFR 항체를 포함하고, 여기서, 상기 항체는 PBD, 이에 한정되는 것은 아니지만 예를 들면 도 21의 예시의 PBD 이량체에 접합된다.
b. 안트라사이클린
본 발명의 항-EGFR 항체는 적어도 하나의 안트라사이클린에 접합될 수 있다. 안트라사이클린은 스트렙토마이세스 속의 박테리아로부터 단리된 항종양 항생제의 한 서브클래스이다. 대표예로는 다우노루비신(Cerubidine, Bedford Laboratories), 독소루비신(Adriamycin, Bedford Laboratories; 독소루비신 하이드로클로라이드, 하이드록시다우노루비신, 및 Rubex로서도 칭함), 에피루비신(Ellence, Pfizer), 및 이다루비신(Idamycin; Pfizer Inc.)이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 따라서, 한 실시형태에서, 본 발명의 항-EGFR 항체는 적어도 하나의 안트라사이클린, 예를 들면, 독소루비신에 접합된다.
c. 칼리케아마이신
본 발명의 항-EGFR 항체는 적어도 하나의 칼리케아마이신에 접합될 수 있다. 칼리케아마이신은 토양 생물 마이크로모노스포라 에치노스포라(Micromonospora echinospora)로부터 유도된 엔다이인 항생제의 한 패밀리이다. 칼리케아마이신은 DNA의 소홈(minor groove)에 결합하여 이중-가닥의 DNA 브레이크(break)를 유도하고, 이는 다른 화학치료제에 비하여 100배 증가된 세포 사멸을 초래한다(Damle et al. (2003) Curr Opin Pharmacol 3:386). 본 발명에서 약물 접합체로서 사용될 수 있는 칼리케아마이신의 조제가 기술되어 왔고, 예를 들면, 문헌[U.S. Pat. 제5,712,374호; 제5,714,586호; 제5,739,116호; 제5,767,285호; 제5,770,701호; 제5,770,710호; 제5,773,001호; 및 제5,877,296호]을 참조한다. 사용될 수 있는 칼리케아마이신의 구조적 유사체로는 γ1 I, α2 I, α3 I, N-아세틸-γ1 I, PSAG 및 θI 1이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다(Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928 (1998) 및 상기 언급된 U.S. 특허 제5,712,374호; 제5,714,586호; 제5,739,116호; 제5,767,285호; 제5,770,701호; 제5,770,710호; 제5,773,001호; 및 제5,877,296호). 따라서, 한 실시형태에서, 본 발명의 항-EGFR 항체는 적어도 하나의 칼리케아마이신에 접합된다.
d. 듀오카르마이신
본 발명의 항-EGFR 항체는 적어도 하나의 듀오카르마이신에 접합될 수 있다. 듀오카르마이신은 스트렙토마이세스 속의 박테리아로부터 단리된 항종양 항생제의 한 서브클래스이다. (문헌[Nagamura and Saito (1998) Chemistry of Heterocyclic Compounds, Vol. 34, No. 12]을 참조한다). 듀오카르마이신은 DNA의 소홈에 결합하여 N3 위치에서 핵염기 아데닌을 알킬화한다(Boger (1993) Pure and Appl Chem 65(6):1123; 및 Boger and Johnson (1995) PNAS USA 92:3642). 듀오카르마이신의 합성 유사체로는 아도젤레신, 비젤레신, 및 카르젤레신이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 따라서, 한 실시형태에서, 본 발명의 항-EGFR 항체는 적어도 하나의 듀오카르마이신에 접합된다.
e. 다른 항종양 항생제
상기에 추가하여, 본 발명의 항-EGFR ADC에 사용될 수 있는 추가의 항종양 항생제로는 블레오마이신(Blenoxane, Bristol-Myers Squibb), 미토마이신, 및 플리카마이신(미트라마이신으로서도 공지되어 있음)이 포함된다.
3. 면역조절제
한 양상에서, 본 발명의 항-EGFR 항체는 적어도 하나의 면역조절제에 접합될 수 있다. 본원에 사용되는 용어 "면역조절제"는 면역 반응을 자극하거나 변형시킬 수 있는 제제를 말한다. 한 실시형태에서, 면역조절제는 대상체의 면역 반응을 향상시키는 면역자극제이다. 다른 실시형태에서, 면역조절제는 대상체의 면역 반응을 방지하거나 감소시키는 면역억제제이다. 면역조절제는 골수 세포(단핵구, 대식세포, 수지상 세포, 거핵구 및 과립구) 또는 림프 세포(T 세포, B 세포 및 자연 살해(NK) 세포) 및 이들의 임의의 추가의 분화된 세포를 조절할 수 있다. 대표예로는 바실러스 칼메트-게린(BCG: bacillus calmette-guerin) 및 레바미솔(Ergamisol)이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 ADC에 사용될 수 있는 면역조절제의 다른 예로는 암 백신, 사이토카인, 및 면역조절 유전자 치료요법이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
a. 암 백신
본 발명의 항-EGFR 항체는 암 백신에 접합될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "암 백신"은 종양-특이적 면역 반응을 유발하는 조성물(예를 들면, 종양 항원 및 사이토카인)을 말한다. 상기 반응은 암 백신을 투여함으로써, 또는 본 발명의 경우에는 항-EGFR 항체 및 암 백신을 포함하는 ADC를 투여함으로써, 대상체 자체의 면역 시스템으로부터 유발된다. 바람직한 실시형태에서, 면역 반응은 신체 내의 종양 세포(예를 들면, 원발성 또는 전이성 종양 세포)의 근절(eradication)을 초래한다. 암 백신의 용도는 일반적으로 예를 들면, 특정 암 세포의 표면 상에 존재하거나 암 형성을 가능하게 하는 것으로 밝혀진 특정 감염성 제제의 표면 상에 존재하는 특정 항원 또는 항원들의 그룹의 투여를 포함한다. 몇몇의 실시형태에서, 암 백신의 용도는 예방학적 목적을 위한 것이고, 한편, 다른 실시형태에서 상기 용도는 치료학적 목적을 위한 것이다. 본 발명의 항-EGFR ADC에 사용될 수 있는 암 백신의 비-제한적 예로는 재조합 2가 사람 유두종 바이러스(HPV) 백신 유형 16 및 18 백신(Cervarix, GlaxoSmithKline). 재조합 4가 사람 유두종 바이러스(HPV) 유형 6, 11, 16, 및 18 백신(Gardasil, Merck & Company), 및 시푸류셀-T(Provenge, Dendreon)가 포함된다. 따라서, 한 실시형태에서, 본 발명의 항-EGFR 항체는 면역자극제이거나 면역억제제인 적어도 하나의 암 백신에 접합된다.
b. 사이토카인
본 발명의 항-EGFR 항체는 적어도 하나의 사이토카인에 접합될 수 있다. 용어 "사이토카인"은 일반적으로 다른 세포에 대해 세포간 매개자로서 작용하는 하나의 세포 집단에 의해 방출되는 단백질을 말한다. 사이토카인은 종양 부위에서 면역 이펙터 세포 및 기질 세포를 직접 자극하여, 세포독성 이펙터 세포에 의한 종양 세포 인식을 향상시킨다(Lee and Margolin (2011) Cancers 3:3856). 다수의 동물 종양 모델 연구는 사이토카인이 광범위한 항-종양 활성을 갖고 이는 다수의 암 치료요법에 관한 사이토카인-기반 접근법으로 번역되어 왔음을 입증하였다(Lee and Margoli, supra). 최근 수년간 GM-CSF, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18 및 IL-21을 포함하는 다수의 사이토카인이 밝혀졌고, 진행 암을 지닌 환자에 대한 임상 시험에 진입하였다(Lee and Margoli, supra).
본 발명의 ADC에 사용될 수 있는 사이토카인의 예로는 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 렐락신; 프로렐락신; 당단백질 호르몬, 예를 들면, 여포 자극 호르몬(FSH), 갑상선 자극 호르몬(TSH), 및 황체형성 호르몬(LH); 간 성장 인자; 섬유아세포 성장 인자; 프로락틴; 태반 락토겐, 종양 괴사 인자; 뮐러-억제(mullerian-inhibiting) 물질; 마우스 고나도트로핀-관련 펩타이드; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴(TPO); 신경 성장 인자, 예를 들면, NGF; 혈소판-성장 인자; 형질전환 성장 인자(TGF); 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II; 에리트로포이에틴(EPO); 골유도(osteoinductive) 인자; 인터페론, 예를 들면, 인터페론 α, β, 및 γ, 콜로니 자극 인자(CSF); 과립구-대식세포-C-SF(GM-CSF); 및 과립구-CSF(G-CSF); 인터류킨(IL), 예를 들면, IL-1, IL-1a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; 종양 괴사 인자; 및 LIF 및 키트 리간드(KL)를 포함하는 기타 폴리펩타이드 인자가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 본원에 사용되는 용어 사이토카인은 천연 공급원 유래의 또는 재조합 세포 배양물 및 본래 서열 사이토카인의 생물학적 활성 등가물 유래의 단백질을 포함한다. 따라서, 한 실시형태에서, 본 발명은 본원에 기술된 항-EGFR 항체 및 사이토카인을 포함하는 ADC를 제공한다.
c. 콜로니-자극 인자(CSF)
본 발명의 항-EGFR 항체는 적어도 하나의 콜로니 자극 인자(CSF)에 접합될 수 있다. 콜로니 자극 인자(CSF)는 적혈구 세포 제조시 골수를 보조하는 성장 인자이다. 몇몇의 암 치료(예를 들면, 화학 치료요법)는 백혈구 세포(이는 감염에 대항하는 것을 돕는다)에 영향을 미칠 수 있으므로, 백혈구 세포 수준을 지지하는 것을 돕고 면역 시스템을 강화하기 위해 콜로니-자극 인자를 도입할 수 있다. 콜로니-자극 인자는 또한 골수 이식 후 새로운 골수가 백혈구 세포를 생산하는 것을 돕기 위해 사용할 수 있다. 본 발명의 항-EGFR ADC에 사용될 수 있는 CSF의 대표예로는 에리트로포이에틴(Epoetin), 필그라스팀(Neopogen(과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF)로서도 공지되어 있음; Amgen, Inc.), 사르그라모스팀(류킨(과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 및 GM-CSF); Genzyme Corporation), 프로메가포이에틴, 및 오프렐베킨(재조합 IL-11; Pfizer, Inc.)이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 따라서, 한 실시형태에서, 본 발명은 본원에 기술된 항-EGFR 항체 및 CSF를 포함하는 ADC를 제공한다.
4. 유전자 치료요법
본 발명의 항-EGFR 항체는 유전자 치료요법을 위해 적어도 하나의 핵산에 (직접적으로 또는 담체를 통해 간접적으로) 접합될 수 있다. 유전자 치료요법은 일반적으로 유전자 치료요법에 의해 유전적 물질이 질환을 치료하도록 고안된 세포에의 유전적 물질의 도입을 말한다. 면역조절제에 관한 바와 같이, 유전자 치료요법은 암 세포 증식을 억제하거나 암 세포를 사멸시키는 대상체의 본래 능력을 자극하기 위해 사용된다. 한 실시형태에서, 본 발명의 항-EGFR ADC는, 암과 관련된 돌연변이되거나 그렇지 않으면 기능장애(dysfuntional)(예를 들면, 절단된) 유전자를 대체하기 위해 사용되는 기능성 치료학적 유전자를 암호화하는 핵산을 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 항-EGFR ADC는 암을 치료하기 위한 치료학적 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하거나 그렇지 않으면 이의 생산을 제공한다. 치료학적 유전자를 암호화하는 핵산은 항-EGFR 항체에 직접적으로 접합될 수 있거나, 대안으로 담체를 통해 항-EGFR 항체에 접합될 수 있다. 유전자 치료요법을 위한 핵산을 전달하기 위해 사용될 수 있는 담체의 예로는 바이러스성 벡터 또는 리포솜이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
5. 알킬화제
본 발명의 항-EGFR 항체는 하나 이상의 알킬화제(들)에 접합될 수 있다. 알킬화제는 DNA에 알킬 그룹을 부착시키는 항신생물 화합물의 한 클래스이다. 본 발명의 ADC에 사용될 수 있는 알킬화제의 예로는 알킬 설포네이트, 에틸렌이민, 메틸아민 유도체, 에폭시드, 질소 머스타드, 니트로소우레아, 트리아진, 및 하이드라진이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
a. 알킬 설포네이트
본 발명의 항-EGFR 항체는 적어도 하나의 알킬 설포네이트에 접합될 수 있다. 알킬 설포네이트는 화학식: R-SO2-O-R1(여기서, R 및 R1은 전형적으로 알킬 또는 아릴 그룹이다)을 갖는 알킬화제의 한 서브클래스이다. 알킬 설포네이트의 대표예로는 부설판(Myleran, GlaxoSmithKline; Busulfex IV, PDL BioPharma, Inc.)이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
b. 질소 머스타드
본 발명의 항-EGFR 항체는 적어도 하나의 질소 머스타드에 접합될 수 있다. 항암 화합물의 이러한 서브클래스의 대표예로는 클로람부실(Leukeran, GlaxoSmithKline), 사이클로포스파미드(Cytoxan, Bristol-Myers Squibb; Neosar, Pfizer, Inc.), 에스트라무스틴(에스트라무스틴 포스페이트 나트륨 또는 Estracyt), Pfizer, Inc.), 이포스파미드(Ifex, Bristol-Myers Squibb), 메클로르에타민(Mustargen, Lundbeck Inc.), 및 멜팔란(Alkeran 또는 L-Pam 또는 페닐알라닌 머스타드; GlaxoSmithKline)이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
c. 니트로소우레아
본 발명의 항-EGFR 항체는 적어도 하나의 니트로소우레아에 접합될 수 있다. 니트로소우레아는 지용성인 알킬화제의 한 서브클래스이다. 대표예로는 카르무스틴(BCNU[BiCNU, N,N-Bis(2-클로로에틸)-N-니트로소우레아, 또는 1,3-비스 (2-클로로에틸)-1-니트로소우레아로서도 공지되어 있음], Bristol-Myers Squibb), 포테무스틴(Muphoran으로서도 공지되어 있음), 로무스틴(CCNU 또는 1-(2-클로로-에틸)-3-사이클로헥실-1-니트로소우레아, Bristol-Myers Squibb), 니무스틴(ACNU로서도 공지되어 있음), 및 스트렙토조신(Zanosar, Teva Pharmaceuticals)이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
d. 트리아진 및 하이드라진
본 발명의 항-EGFR 항체는 적어도 하나의 트리아진 또는 하이드라진에 접합될 수 있다. 트리아진 및 하이드라진은 질소-함유 알킬화제의 한 서브클래스이다. 몇몇의 실시형태에서, 이들 화합물은 자발적으로 분해되거나, 대사되어 핵산, 펩타이드 및/또는 폴리펩타이드에의 알킬 그룹의 이동을 가능하게 하는 알킬 디아조늄 중간물을 생산하고, 이에 의해 돌연변이유발, 발암성, 또는 세포독성 효과를 야기할 수 있다. 대표예로는 다카르바진(DTIC-Dome, Bayer Healthcare Pharmaceuticals Inc.), 프로카르바진(Mutalane, Sigma-Tau Pharmaceuticals, Inc.) 및 테모졸로미드(Temodar, Schering Plough)가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
e. 기타 알킬화제
본 발명의 항-EGFR 항체는 적어도 하나의 에틸렌이민, 메틸아민 유도체, 또는 에폭시드에 접합될 수 있다. 에틸렌이민은 전형적으로 적어도 하나의 아지리딘 환을 함유하는 알킬화제의 한 서브클래스이다. 에폭시드는 3개의 환 원자만을 갖는 환형 에테르로서 특성확인되는 알킬화제의 한 서브클래스를 나타낸다.
에틸렌이민의 대표예로는 티오페타(Thioplex, Amgen), 디아지쿠온(아지리디닐 벤조퀴논(AZQ)으로서도 공지되어 있음), 및 미토마이신 C가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 미토마이신 C는 아지리딘 환을 함유하고 가교-결합 DNA를 통해 세포독성을 유도하는 것으로 밝혀진 천연 생성물이다(Dorr RT, et al. Cancer Res. 1985;45:3510; Kennedy KA, et al Cancer Res. 1985;45:3541). 메틸아민 유도체 및 이들의 유사체의 대표예로는 헥사메틸아민 및 헥사스태트로서도 공지되어 있는 알트레타민(Hexalen, MGI Pharma, Inc.)이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 항암 화합물의 이러한 클래스의 에폭시드의 대표예로는 디안하이드로갈락티톨이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 디안하이드로갈락티톨(1,2:5,6-디안하이드로둘시톨)은 화학적으로 아지리딘과 관련되어 있고, 일반적으로 상기 기술된 바와 유사한 메커니즘을 통해 알킬 그룹의 이동을 가능하게 한다. 디브로모둘시톨은 디안하이드로갈락티톨로 가수분해되므로, 에폭시드에 대한 프로드럭이다(Sellei C, et al. Cancer Chemother Rep. 1969;53:377).
6. 항혈관신생제
한 양상에서, 본원에 기술된 항-EGFR 항체는 적어도 하나의 항혈관신생제에 접합된다. 항혈관신생제는 새로운 혈관의 성장을 억제한다. 항혈관신생제는 이들의 효과를 각종 방식으로 발휘한다. 몇몇의 실시형태에서, 이들 제제는 성장 인자의 표적에 도달하는 성장 인자의 능력에 간섭한다. 예를 들면, 혈관 내피 성장 인자(VEGF)는 세포 표면 상의 특정 수용체에 결합함으로써 혈관신생을 억제하는데 관여하는 1차 단백질들 중 하나이다. 따라서, 이의 동족 수용체와의 VEGF의 상호작용을 방지하는 소정의 항혈관신생제는 VEGF가 혈관신생을 개시하는 것을 방지한다. 다른 실시형태에서, 이들 제제는 세포내 신호전달 캐스케이드에 간섭한다. 예를 들면, 일단 세포 표면 상의 특정 수용체가 촉발되면, 다른 화학적 신호의 캐스케이드가 개시되어 혈관의 성장을 촉진시킨다. 따라서, 예를 들면, 세포 증식에 기여하는 세포내 신호전달 캐스케이드를 가능하게 하는 것으로 공지되어 있는 소정 효소, 예를 들면, 몇몇의 티로신 키나제는 암 치료에 대한 표적이다. 다른 실시형태에서, 이들 제제는 세포간 신호전달 캐스케이드에 간섭한다. 또한, 다른 실시형태에서, 이들 제제는 세포 성장을 활성화시키고 촉진시키는 특정 표적을 손상시키거나, 또는 혈관 세포의 성장에 직접적으로 간섭함으로써 손상시킨다. 혈관신생 억제 특성은 다수의 직접 및 간접 억제 효과를 갖는 300개의 물질들보다 더 많이 발견되었다.
본 발명의 ADC에 사용될 수 있는 항혈관신생제의 대표예로는 안지오스타틴, ABX EGF, C1-1033, PKI-166, EGF 백신, EKB-569, GW2016, ICR-62, EMD 55900, CP358, PD153035, AG1478, IMC-C225(Erbitux, ZD1839(Iressa), OSI-774, 에를로티닙(tarceva), 안지오스타틴, 아레스틴, 엔도스타틴, BAY 12-9566 및 w/플루오로우라실 또는 독소루비신, 칸스타틴, 카르복시아미도트리오졸 및 파클리탁셀과 함께, EMD121974, S-24, 비탁신, 디메틸크산테논 아세트산, IM862, 인터류킨-12, 인터류킨-2, NM-3, HuMV833, PTK787, RhuMab, 안지오자임(리보자임), IMC-1C11, 네오바스태트t, 마림스태트, 프리노마스태트, BMS-275291,COL-3, MM1270, SU101, SU6668, SU11248, SU5416, 파클리탁셀과 함께, 겜시타빈 및 시스플라틴과 함께, 그리고 이리노테칸 및 시스플라틴과 함께, 그리고 방사선과 함께, 테코갈란, 테모졸로미드 및 PEG 인터페론 α2b, 테트라티오몰리브데이트, TNP-470, 탈리도미드, CC-5013 및 탁소테레와 함께, 툼스타틴, 2-메톡시스트라디올, VEGF 트랩, mTOR 억제제(데포롤리무스, 에베롤리무스(Afinitor, Novartis Pharmaceutical Corporation), 및 템시롤리무스(Torisel, Pfizer, Inc.)), 티로신 키나제 억제제(예를 들면, 에를로티닙(Tarceva, Genentech, Inc.), 이마티닙(Gleevec, Novartis Pharmaceutical Corporation), 게피티닙(Iressa, AstraZeneca Pharmaceuticals), 다사티닙(Sprycel, Brystol-Myers Squibb), 수니티닙(Sutent, Pfizer, Inc.), 닐로티닙(Tasigna, Novartis Pharmaceutical Corporation), 라파티닙(Tykerb, GlaxoSmithKline Pharmaceuticals), 소라페닙(Nexavar, Bayer and Onyx), 포스포이노시티드 3-키나제(PI3K)가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
7. 항대사물질
본 발명의 항-EGFR 항체는 적어도 하나의 항대사물질에 접합될 수 있다. 항대사물질은 세포 내의 정상 물질과 매우 유사한 화학치료요법 치료제 유형이다. 세포가 세포 대사에 항대사물질을 도입하는 경우, 그 결과는 세포에 대해 부정적이다, 예를 들면, 세포는 분할할 수 없다. 항대사물질은 이들이 함께 간섭하는 물질에 따라 분류된다. 본 발명의 ADC에 사용될 수 있는 항대사물질의 예로는 하기에 보다 상세하게 기술되는 엽산 길항제(예를 들면, 메토트렉세이트), 피리미딘 길항제(예를 들면, 5-플루오로우라실, 폭스우리딘, 시타라빈, 카페시타빈, 및 겜시타빈), 퓨린 길항제(예를 들면, 6-메르캅토퓨린 및 6-티오구아닌) 및 아데노신 데아미나제 억제제(예를 들면, 클라드리빈, 플루다라빈, 넬라라빈, 및 펜토스타틴)가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
a. 엽산 길항제(antifolate)
본 발명의 항-EGFR 항체는 적어도 하나의 엽산 길항제에 접합될 수 있다. 엽산 길항제는 엽산과 구조적으로 유사한 항대사물질의 한 서브클래스이다. 대표예로는 메토트렉세이트, 4-아미노-엽산(아미노프테린 및 4-아미노프테르산으로서도 공지되어 있음), 로메트렉솔(LMTX), 페메트렉세드(Alimpta, Eli Lilly and Company) 및 트리메트렉세이트(Neutrexin, Ben Venue Laboratories, Inc.)가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
b. 퓨린 길항제
본 발명의 항-EGFR 항체는 적어도 하나의 퓨린 길항제에 접합될 수 있다. 퓨린 유사체는 퓨린으로서 공지되어 있는 화합물의 그룹과 구조적으로 유사한 항대사물질의 한 서브클래스이다. 퓨린 길항제의 대표예로는 아자티오프린(Azasan, Salix; Imuran, GlaxoSmithKline), 클라드리빈(Leustatin[2-CdA로서도 공지되어 있음], Janssen Biotech, Inc.), 메르캅토퓨린(Purinethol[6-메르캅토에탄올로서도 공지되어 있음], GlaxoSmithKline), 플루다라빈(Fludara, Genzyme Corporation), 펜토스타틴(Nipent, 2'-데옥시코포르마이신(DCF)으로서도 공지되어 있음), 6-티오구아닌(Lanvis[티오구아닌으로서도 공지되어 있음], GlaxoSmithKline)이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
c. 피리미딘 길항제
본 발명의 항-EGFR 항체는 적어도 하나의 피리미딘 길항제에 접합될 수 있다. 피리미딘 길항제는 퓨린으로서 공지되어 있는 화합물의 그룹과 구조적으로 유사한 항대사물질의 한 서브클래스이다. 피리미딘 길항제의 대표예로는 아자시티빈(Vidaza, Celgene Corporation), 카페시타빈(Xeloda, Roche Laboratories), 시타라빈(시토신 아라비노사이드 및 아라비노실시토신으로서도 공지되어 있음, Bedford Laboratories), 데시타빈(Dacogen, Eisai Pharmaceuticals), 5-플루오로우라실(Adrucil, Teva Pharmaceuticals; Efudex, Valeant Pharmaceuticals, Inc), 5-플루오로-2'-데옥시우리딘 5'-포스페이트(FdUMP), 5-플루오로우리딘 트리포스페이트, 및 겜시타빈(Gemzar, Eli Lilly and Company)이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
8. 붕소-함유제
본 발명의 항-EGFR 항체는 적어도 하나의 붕소 함유제에 접합될 수 있다. 붕소 함유제는 세포 증식에 간섭하는 암 치료학적 화합물의 한 클래스를 포함한다. 붕소 함유제의 대표예로는 보로파이신 및 보르테조밉(Velcade, Millenium Pharmaceuticals)이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
9. 화합물 보호제
본 발명의 항-EGFR 항체는 적어도 하나의 화합물 보호제에 접합될 수 있다. 화합물 보호 약물은 화학 치료요법의 특정 독성 효과에 대해 신체를 보호하는 것을 보조하는 화합물의 한 클래스이다. 화학치료요법 약물의 독성 효과로부터 건강한 세포를 보호하는 한편, 동시에 투여된 화학치료제로 암 세포가 치료되도록 하기 위해서 화합물 보호제를 각종 화학치료요법과 함께 투여될 수 있다. 대표적 화합물 보호제로는 시스플라틴의 누적 용량(cumulative dose)과 관련된 신장 독성을 감소시키기 위해 사용되는 아미포스틴(Ethyol, Medimmune, Inc.), 안트라사이클린(Totect)의 투여에 의해 야기되는 혈액유출의 치료를 위한, 그리고 항종양 항생제 독소루비신(Zinecard)의 투여에 의해 야기되는 심장-관련 합병증의 치료를 위한 덱스라족산(Totect, Apricus Pharma; Zinecard), 및 이포스파미드를 이용한 화학치료요법 치료 동안 출혈성 방광염을 예방하기 위해 사용되는 메스나(Mesnex, Bristol-Myers Squibb)가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
10. 호르몬제
본 발명의 항-EGFR 항체는 적어도 하나의 호르몬제에 접합될 수 있다. 호르몬제(합성 호르몬 포함)는 내분비 시스템의 내인적으로 생성된 호르몬의 생산 또는 활성에 간섭하는 화합물이다. 몇몇의 실시형태에서, 이들 화합물은 세포 성장에 간섭하거나 세포독성 효과를 생성시킨다. 비-제한적 예로는 안드로겐, 에스트로겐, 메드록시프로게스테론 아세테이트(Provera, Pfizer, Inc.) 및 프로게스틴이 포함된다.
11. 항호르몬제
본 발명의 항-EGFR 항체는 적어도 하나의 항호르몬제에 접합될 수 있다. "항호르몬"제는 소정의 내인성 호르몬의 생산을 억제하고/하거나 소정 내인성 호르몬의 기능을 방지하는 제제이다. 한 실시형태에서, 항호르몬제는 안드로겐, 에스트로겐, 프로게스테론, 및 고나도트로핀-방출 호르몬으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 호르몬의 활성에 간섭하고, 이에 의해 각종 암 세포의 성장에 간섭한다. 항호르몬제의 대표예로는 아미노글루테티미드, 아나스트로졸(Arimidex, AstraZeneca Pharmaceuticals), 비칼루타미드(Casodex, AstraZeneca Pharmaceuticals), 시프로테론 아세테이트(Cyprostat, Bayer PLC), 데가렐릭스(Firmagon, Ferring Pharmaceuticals), 엑세메스탄(Aromasin, Pfizer Inc.), 플루타미드(Drogenil, Schering-Plough Ltd), 플루베스트란트(Faslodex, AstraZeneca Pharmaceuticals), 고세렐린(Zolodex, AstraZeneca Pharmaceuticals), 레트로졸(Femara, Novartis Pharmaceuticals Corporation), 류프롤리드(Prostap), 루프론, 메드록시프로게스테론 아세테이트(Provera, Pfizer Inc.), 메게스트롤 아세테이트(Megace, Bristol-Myers Squibb Company), 타목시펜(Nolvadex, AstraZeneca Pharmaceuticals), 및 트리프토렐린(Decapetyl, Ferring)이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
12. 코르티코스테로이드
본 발명의 항-EGFR 항체는 적어도 하나의 코르티코스테로이드에 접합될 수 있다. 코르티코스테로이드는 염증을 감소시키기 위해 본 발명의 ADC에 사용될 수 있다. 코르티코스테로이드의 예로는 글루코코르티코이드, 예를 들면, 프레드니손(Deltasone, Pharmacia & Upjohn Company, a division of Pfizer, Inc.)이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
13. 광활성 치료학적 제제
본 발명의 항-EGFR 항체는 적어도 하나의 광활성 치료학적 제제에 접합될 수 있다. 광활성 치료학적 제제는 특정 파장의 전자기 방사선에 노출시 치료된 세포를 사멸시키도록 효용될 수 있는 화합물을 포함한다. 치료학적으로 관련된 화합물은 조직에 침투하는 파장에서 전자기 방사선을 흡수한다. 바람직한 실시형태에서, 상기 화합물은, 충분한 활성화시에 세포 또는 조직에 독성인 광화학적 효과를 생산할 수 있는 비-독성 형태로 투여된다. 다른 바람직한 실시형태에서, 이들 화합물은 암성 조직에 의해 보유되고, 정상 조직으로부터 쉽게 제거된다. 비-제한적 예로는 각종 크로마겐 및 염료가 포함된다.
14. 올리고뉴클레오타이드
본 발명의 항-EGFR 항체는 적어도 하나의 올리고뉴클레오타이드에 접합될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 유전적 정보의 프로세싱에 간섭함으로써 작용하는 짧은 핵산 쇄로 이루어진다. 몇몇의 실시형태에서, ADC에 사용하기 위한 올리고뉴클레오타이드는 비변형 단일-가닥 및/또는 이중-가닥 DNA 또는 RNA 분자이고, 한편, 다른 실시형태에서, 이들 치료학적 올리고뉴클레오타이드는 화학적으로 변형된 단일-가닥 및/또는 이중-가닥 DNA 또는 RNA 분자이다. 한 실시형태에서, ADC에 사용된 올리고뉴클레오타이드는 상대적으로 짧고(19 내지 25개 뉴클레오타이드) 세포에 존재하는 핵산 표적의 전체 풀의 고유한 핵산 서열로 하이브리드화된다. 중요한 올리고뉴클레오타이드 기술들 중 몇몇으로는 안티센스 올리고뉴클레오타이드(RNA 간섭(RNAi) 포함), 압타머, CpG 올리고뉴클레오타이드, 및 리보자임이 포함된다.
a. 안티센스 올리고뉴클레오타이드
본 발명의 항-EGFR 항체는 적어도 하나의 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 접합될 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 왓슨-크릭(Watson-Crick) 하이브리드화를 통해 RNA에 결합하도록 고안된다. 몇몇의 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 EGFR의 영역, 도메인, 부분, 또는 절편을 암호화하는 뉴클레오타이드에 대해 상보성이다. 몇몇의 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 약 5 내지 약 100개의 뉴클레오타이드, 약 10 내지 약 50개의 뉴클레오타이드, 약 12 내지 약 35개, 및 약 18 내지 약 25개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 몇몇의 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 EGFR 유전자의 영역, 부분, 도메인, 또는 절편에 대해 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 100% 상동성이다. 몇몇의 실시형태에서, EGFR 유전자의 적어도 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 또는 100개의 연속적 뉴클레오타이드에 걸친 실질적 서열 상동성이 존재한다. 바람직한 실시형태에서, 이들 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 크기는 12 내지 25개 뉴클레오타이드 길이의 범위이고, 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 대부분은 18 내지 21개 뉴클레오타이드 길이이다. 일단 올리고뉴클레오타이드가 표적 RNA에 결합하면 RNA의 기능을 억제시키는데 활용될 수 있는 다수의 메커니즘이 존재한다(Crooke ST. (1999). Biochim. Biophys. Acta, 1489, 30-42). 최상-특성확인된 안티센스 메커니즘은 RNase H 또는 RNA 간섭 메커니즘과 관련된 뉴클레아제와 같은 내인성 세포 뉴클레아제에 의한 표적화된 RNA의 절단을 초래한다. 그러나, 스플라이싱의 조절 또는 번역 정지와 같은 비-촉매성 메커니즘에 의해 표적 유전자의 발현을 억제하는 올리고뉴클레오타이드는 또한 잠재적이고 선택적인 유전자 기능 조절제일 수 있다.
최근 더 주목받고 있는 다른 RNase-의존적 안티센스 메커니즘은 RNAi이다(Fire et al. (1998). Nature, 391, 806-811.; Zamore PD. (2002). Science, 296, 1265-1269.). RNA 간섭(RNAi)은 전사-후 프로세스이고, 여기서, 이중 가닥 RNA는 서열 특이적 방식으로 유전자 발현을 억제한다. 몇몇의 실시형태에서, RNAi 효과는 상대적으로 더 긴 이중-가닥 RNA(dsRNA)의 도입을 통해 달성되고, 한편, 바람직한 실시형태에서, 이러한 RNAi 효과는 보다 짧은 이중-가닥 RNA, 예를 들면, 소형 간섭 RNA(siRNA) 및/또는 microRNA(miRNA)의 도입에 의해 달성된다. 또 다른 실시형태에서, RNAi는 또한 표적 유전자에 대해 상보성인 dsRNA를 생성시키는 플라스미드를 도입함으로써 달성될 수 있다. 상기 실시형태들의 각각에서, 이중-가닥 RNA는 세포 내의 특정 표적 서열의 유전자 발현에 간섭하도록 고안된다. 일반적으로, 메커니즘은, 상동성 mRNA 표적에 리보뉴클레아제를 지시하고(문헌[Ruvkun, Science 2294:797 (2001)]에 요약됨), 이어서, 상응하는 내인성 mRNA를 분해하고, 이에 의해 유전자 발현의 조절을 초래하는 짧은 RNA로의 dsRNA의 전환을 포함한다. 특히, dsRNA는 치료학적 적용을 예상하는 것을 가능하게 하는 항-증식 특성을 갖는 것으로 보고되었다(Aubel et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 88:906 (1991)). 예를 들면, 합성 dsRNA는 마우스에서의 종양 성장을 억제하는 것으로 밝혀졌고(Levy et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 62:357-361 (1969)), 백혈병 마우스의 치료시 활성이고(Zeleznick et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 130:126-128 (1969)), 마우스 피부에서 화학적으로 유도되는 종양형성을 억제한다(Gelboin et al., Science 167:205-207 (1970)). 따라서, 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 유방암의 치료를 위한 ADC에서의 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 용도를 제공한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 안티센스 올리고뉴클레오타이드 치료를 개시하기 위한 조성물 및 방법을 제공하고, 여기서, dsRNA는 mRNA 수준에서 EGFR의 표적 세포 발현에 간섭한다. 상기 사용된 dsRNA는 천연-발생 RNA, 부분적으로 정제된 RNA, 재조합적으로 생산된 RNA, 합성 RNA, 및 비-가닥 뉴클레오타이드, 비-뉴클레오타이드 물질, 뉴클레오타이드 유사체(예를 들면, 잠금 핵산(LNA)), 데옥시리보뉴클레오타이드, 및 이들의 임의의 조합의 포함에 의해 천연 발생 RNA와 상이한 변경된 RNA를 말한다. 본 발명의 RNA는, 단지 본원에 기술된 안티센스 올리고뉴클레오타이드-기반 조절을 매개하는 능력을 갖는 천연 RNA와 충분히 유사할 필요가 있다.
b. 압타머
본 발명의 항-EGFR 항체는 적어도 하나의 압타머에 접합될 수 있다. 압타머는 다른 분자에 결합하는 능력에 기초하여 랜덤 풀로부터 선택된 핵산 분자이다. 항체와 마찬가지로, 압타머는 특별한 친화도 및 특이성을 갖는 표적 분자에 결합할 수 있다. 다수의 실시형태에서, 압타머는, 표적 단백질과의 상호작용을 가능하게 하여 항체-항원 상호작용과 유사한 단단히 결합된 복합체를 초래하고, 이에 의해 상기 단백질의 기능에 간섭하는, 복합체, 서열-의존적, 3차원 형태로 추정된다. 압타머의 표적 단백질에 단단히 그리고 특이적으로 결합하는 압타머의 특정 능력은 표적화도니 분자 치료요법으로서의 이들의 잠재력을 강조한다.
c. CpG 올리고뉴클레오타이드
본 발명의 항-EGFR 항체는 적어도 하나의 CpG 올리고뉴클레오타이드에 접합될 수 있다. 박테리아 및 바이러스 DNA는 사람에서의 선천적 면역성 및 특이적 면역성 둘 다의 강한 활성인자인 것으로 공지되어 있다. 이들 면역학적 특성은 박테리아 DNA에서 발견된 비메틸화된 CpG 디뉴클레오타이드 모티프와 관련되어 왔다. 이들 모티프가 사람에서 드물다는 사실 덕분에, 사람 면역 시스템은 이들 모티프를 감염의 조기 징후로서 인식하고 후속적으로 면역 반응을 개시하는 능력을 발달시켰다. 따라서, 이러한 CpG 모티프를 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 항종양 면역 반응을 개시하도록 활용될 수 있다.
d. 리보자임
본 발명의 항-EGFR 항체는 적어도 하나의 리보자임에 접합될 수 있다. 리보자임은 약 40 내지 155개 뉴클레오타이드 길이 범위의 촉매성 RNA 분자이다. 특정 RNA 분자를 인식하고 컷팅하는 리보자임의 능력은 이들을 치료제에 대한 잠재적 후보물이 되게 한다. 대표예로는 안지오자임이 포함된다.
15. 방사성 핵종 제제(방사성 동위원소)
본 발명의 항-EGFR 항체는 적어도 하나의 방사성 핵종 제제에 접합될 수 있다. 방사성 핵종 제제는 방사성 붕괴를 경험할 수 있는 불안정한 핵에 의해 특성확인되는 제제를 포함한다. 성공적인 방사성 핵종 치료를 위한 기초는 암 세포에 의한 방사성 핵종의 충분한 농도 및 연장된 보유에 의존한다. 고려되는 다른 인자들로는 방사성 핵종 반감기, 방출된 입자의 에너지, 및 방출된 입자가 이동할 수 있는 최대 범위가 포함된다. 바람직한 실시형태에서, 치료학적 제제는 111In, 177Lu, 212Bi, 213Bi, 211At, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 90Y, I25I, 131I, 32P, 33P, 47Sc, 111Ag, 67Ga, 142Pr, 153Sm, 161Tb, 166Dy, 166Ho, 186Re, 188Re, 189Re, 212Pb, 223Ra, 225Ac, 59Fe, 75Se, 77As, 89Sr, 99Mo, 105Rh, 109Pd, 143Pr, 149Pm, 169Er, 194Ir, 198Au, 199Au, 및 211Pb로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방사성 핵종이다. 또한, Auger-방출 입자로 실질적으로 붕괴하는 방사성 핵종도 바람직하다. 예를 들면, Co-58, Ga-67, Br-80m, Tc-99m, Rh-103m, Pt-109, In-111 1, Sb-119, I-125, Ho-161, Os-189m 및 Ir-192이다. 유용한 베타-입자-방출 핵종은 바람직하게는 Dy-152, At-211, Bi-212, Ra-223, Rn-219, Po-215, Bi-211, Ac-225, Fr-221, At-217, Bi-213 및 Fm-255이다. 유용한 알-입자-방출 핵종의 붕괴 에너지는 바람직하게는 2,000 내지 10,000keV, 보다 바람직하게는 3,000 내지 8,000keV, 가장 바람직하게는 4,000 내지 7,000keV이다. 사용되는 추가의 잠재적 방사성 동위원소로는 11C, 13N, 15O, 75Br, 198Au, 224Ac, 126I, 133I, 77Br, 113mIn, 95Ru, 97Ru, 103Ru, 105Ru, 107Hg, 203Hg, 121mTe, 122mTe, 125mTe, 165Tm, 167Tm, 168Tm, 197Pt, 109Pd, 105Rh, 142Pr, 143Pr, 161Tb, 166Ho, 199Au, 57Co, 58Co, 51Cr, 59Fe, 75Se, 201Tl, 225Ac, 76Br, 및 169Yb 등이 포함된다.
16. 방사선 증감제
본 발명의 항-EGFR 항체는 적어도 하나의 방사선 증감제에 접합될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "방사선 증감제"는, 전자기 방사선에 대해 방사선 증감되는 세포의 민감성을 증가시키고/시키거나 전자기 방사선으로 치료가능한 질환의 치료를 촉진시키기 위해 동물에게 치료학적 유효량으로 투여되는 분자, 바람직하게는 저 분자량 분자로서 정의된다. 방사선 증감제는 암 세포가 방사선 치료요법에 보다 민감성이 되도록 하고, 한편, 전형적으로 정상 세포에 대한 영향이 훨씬 적은 제제이다. 따라서, 방사선 증감제는 방사성 표지된 항체 또는 ADC와 병용하여 사용될 수 있다. 방사선 증감제의 부가는 방사성 표지된 항체 또는 항체 단편 단독으로의 치료와 비교하는 경우에 향상된 효능을 초래할 수 있다. 방사선 증감제는 문헌[D. M. Goldberg (ed.), Cancer Therapy with Radiolabeled Antibodies, CRC Press (1995)]에 기술되어 있다. 방사선 증감제의 예로는 겜시타빈, 5-플루오로우라실, 탁산, 및 시스플라틴이 포함된다.
방사선 증감제는 X-선의 전자기 방사선에 의해 활성화될 수 있다. X-선 활성화된 방사선 증감제의 대표예로는 하기가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다: 메트로니다졸, 미소니다졸, 데스메틸미소니다졸, 피모니다졸, 에타니다졸, 니모라졸, 미토마이신 C, RSU 1069, SR 4233, E09, RB6145, 니코틴아미드, 5-브로모데옥시우리딘(BUdR), 5-요오도데옥시우리딘(IUdR), 브로모데옥시시티딘, 플루오로데옥시우리딘(FUdR), 하이드록시우레아, 시스플라틴, 및 상기의 치료학적으로 유효한 유사체 및 유도체. 대안으로, 방사선 증감제는 광역학적 치료요법(PDT)을 이용하여 활성화될 수 있다. 광역학적 방사선 증감제의 대표예로는 헤마토포르피린 유도체, 포토프린(r), 벤조포르피린 유도체, NPe6, 주석 에티오프로피린(SnET2), 페오보르비드 a, 박테리오클로로필 a, 나프탈로시아닌, 프탈로시아닌, 아연 프탈로시아닌, 및 상기의 치료학적으로 유효한 유사체 및 유도체가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
16. 토포이소머라제 억제제
본 발명의 항-EGFR 항체는 적어도 하나의 토포이소머라제 억제제에 접합될 수 있다. 토포이소머라제 억제제는, 정상 세포 주기 동안 DNA 가닥의 포스포디에스테르 백본을 브레이킹하고 재연결함으로써 DNA 구조의 변화를 제어하는 효소인 토포이소머라제 효소(토포이소머라제 I 및 II)의 작용에 간섭하도록 고안된 화학 치료요법 제제이다. DNA 토포이소머라제 I 억제제의 대표예로는 캄프토테신 및 이의 유도체 이리노테칸(CPT-11, Camptosar, Pfizer, Inc.) 및 토포테칸(Hycamtin, GlaxoSmithKline Pharmaceuticals)이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. DNA 토포이소머라제 II 억제제의 대표예로는 암사크린, 다우노루비신, 독소루비신, 에피포도필로톡신, 엘리프티신, 에피루비신, 에토포시드, 라족산, 및 테니포시드가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
17. 티로신 키나제 억제제
본 발명의 항-EGFR 항체는 적어도 하나의 티로신 키나제 억제제에 접합될 수 있다. 티로신 키나제는 아미노산 티로신에 포스페이트 그룹을 부착하도록 기능하는 세포 내의 효소이다. 기능하는 단백질 티로신 키나제의 능력을 차단함으로써, 종양 성장이 억제될 수 있다. 본 발명의 ADC에 사용될 수 있는 티로신 키나제의 예로는 악시티닙, 보수티닙, 세디라닙, 다사티닙, 에를로티닙, 게피티닙, 이마티닙, 라파티닙, 레스타우르티닙, 닐로티닙, 세막사닙, 수니티닙, 및 반데타닙이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
18. 기타 제제
본 발명의 ADC에 사용될 수 있는 기타 제제의 예로는 아브린(예를 들면, 아브린 A 쇄), 알파 독소, 유동(Aleurites fordii) 단백질, 아마톡신, 크로틴, 쿠르신, 디안틴 단백질, 디프테리아 독소(예를 들면, 디프테리아 A 쇄 및 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편), 데옥시리보뉴클레아제(Dnase), 겔로닌, 미토겔린, 모데신 A 쇄, 여주(momordica charantia) 억제제, 네오마이신, 온코나제, 페노마이신, 미국 자리공(Phytolacca americana) 단백질(PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 미국자리공 항바이러스성 단백질, 슈도모나스(Pseudomonas) 내독소, 슈도모나스 외독소(예를 들면, 외독소 A 쇄(슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 유래), 레스트릭토신, 리신 A 쇄, 리보뉴클레아제(Rnase), 비누풀(saponaria officinalis) 억제제, 사포린, 알파-사르신, 스태필로코커스 장내독소-A, 파상풍 독소, 시스플라틴, 카르보플라틴, 및 옥살리플라틴(Eloxatin, Sanofi Aventis), 프로테아솜 억제제(예를 들면, PS-341[보르테조밉 또는 Velcade]), HDAC 억제제(보리노스태트(Zolinza, Merck & Company, Inc.)), 벨리노스태트, 엔티노스태트, 모세티노스태트, 및 파노비노스태트), COX-2 억제제, 치환된 요소, 열 충격 단백질 억제제(예를 들면, 겔다나마이신 및 이의 다수의 유사체), 부신피질 억제제, 및 트리코테센이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. (예를 들면, WO 93/21232를 참조한다). 기타 제제로는 또한 아스파라기나제(Espar, Lundbeck Inc.), 하이드록시우레아, 레바미솔, 미토탄(Lysodren, Bristol-Myers Squibb), 및 트레티노인(Renova, Valeant Pharmaceuticals Inc.)이 포함된다.
본 발명의 항-EGFR ADC에 사용될 수 있는 약물 모이어티의 상기 언급된 그룹들은, 약물의 소정 예가 하나 초과의 카테고리에서 발견될 수 있다, 예를 들면, 안사미토신은 유사분열 억제제 및 항종양 항생제 둘 다인 점에서, 제외되지 않음에 주의해야만 한다.
상기 약물 모이어티의 모든 입체 이성체들, 즉, D의 키랄 탄소에서의 R 및 S 입체배치의 임의의 조합은 본 발명의 화합물로서 고려된다.
상기 제제들(즉, 항체에 접합되지 않는 네이키드(naked) 제제)은 또한 본원에 기술된 항-EGFR 항체와 병용 치료요법으로 사용될 수 있다. 한 실시형태에서, 항-EGFR 항체 또는 ADC는 암을 치료하기 위한 병용 치료요법으로 상기 제제들 중 임의의 것과 함께 사용되고, 여기서, 상기 제제는 대상체에게 항-EGFR 항체 또는 ADC를 투여하기 전에, 이를 투여함과 동시에, 또는 이의 투여 후에 투여된다.
B. 항-EGFR ADC: 예시의 링커들
항-EGFR ADC는 항-EGFR 항체 및 적어도 하나의 약물(들)을 포함하고, 이에 의해 상기 항체 및 적어도 하나의 약물은 링커에 의해 접합된다. 본원에 사용되는 용어 "링커"는 이기능성 또는 다기능성일 수 있는 화학적 모이어티를 말하고, 이는 약물 모이어티에 항체를 부착시키는데 사용된다. 링커는 하나의 접합 구성성분을 포함할 수 있거나 다중 구성성분을 포함할 수 있다.
예를 들면, 링커는 예를 들면, 항체의 활성 부위를 차폐시키거나 ADC의 용해도를 개선시키는 것을 피하기 위해 약물 링크를 연장시키는 모이어티인 스페이서를 포함할 수 있다. 링커의 구성성분들의 다른 예로는 스트레쳐(stretcher) 유닛 및 아미노산 유닛이 포함된다.
약물을 항체에 접합시키기 위해 2개의 방법이 흔히 사용된다: 효소적으로 절단불가능한 말레이미도 또는 단순하고 절단가능한 디설파이드 링커를 통한 환원된 쇄간 시스테인 디설파이드의 알킬화, 및 절단가능한 선형 아미노산에 의한 라이신의 아실화.
한 양상에서, 링커는 항체를 약물 모이어티에 공유결합적으로 부착시킨다. ADC는 항체 및 약물에 결합하기 위한 반응 기능성을 갖는 링커를 이용하여 조제된다. 예를 들면, 항체의, 시스테인 티올, 또는 아민, 예를 들면, N-말단 또는 아미노산 측쇄, 예를 들면, 라이신은 링커의 기능성 그룹과의 결합을 형성할 수 있다.
한 양상에서, 링커는 항체 상에 존재하는 유리 시스테인과 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있는 기능성을 갖는다. 비제한적 예시의 이러한 반응 기능성으로는 말레이미드, 할로아세트아미드, α-할로아세틸, 활성화된 에스테르, 예를 들면, 석신이미드 에스테르, 4-니트로페닐 에스테르, 펜타플루오로페닐 에스테르, 테트라플루오로페닐 에스테르, 무수물, 산 염화물, 설포닐 클로라이드, 이소시아네이트, 및 이소티오시아네이트가 포함된다. 예를 들면, 문헌[Klussman, et al (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773]의 766 페이지의 접합 방법을 참조한다.
몇몇의 실시형태에서, 항체 상에 존재하는 링커는 친전자성 그룹과 반응할 수 있는 기능성을 갖는다. 예시의 이러한 친전자성 그룹으로는 알데하이드 및 케톤 카르보닐 그룹이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 몇몇의 실시형태에서, 링커의 반응 기능성의 헤테로 원자는 항체 상의 친전자성 그룹과 반응하여 항체 유닛에의 공유 결합을 형성할 수 있다. 비제한적 예시의 이러한 반응 기능성으로는 하이드라지드, 옥심, 아미노, 하이드라진, 티오세미카르바존, 하이드라진 카르복실레이트, 및 아릴하이드라지드가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
예시의 링커 구성성분으로는 6-말레이미도카프로일, 말레이미도프로파노일("MP"), 발린-시트룰린("val-cit" 또는 "vc"), 알라닌-페닐알라닌("ala-phe"), p-아미노벤질옥시카르보닐("PAB"), N-석신이미딜 4-(2-피리딜티오) 펜타노에이트("SPP"), 및 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1 카르복실레이트("MCC")가 포함된다.
한 양상에서, 항-EGFR 항체는 말레이미도카프로일("mc"), 발린 시트룰린(val-cit 또는 "vc"), 및 PABA("mc-vc-PABA 링커"로서 나타냄)을 포함하는 링커를 통해 아우리스타틴, 예를 들면, MMAE에 접합된다. 말레이미도카프로일은 항-EGFR 항체에의 링커로서 작용하고, 절단불가능하다. Val-cit은 링커의 아미노산 유닛인 디펩타이드이고, 프로테아제, 구체적으로는 프로테아제 카텝신 B에 의해 링커의 절단을 가능하게 한다. 따라서, 링커의 val-cit 구성성분은 세포내 환경에의 노출시 ADC로부터 아우리스타틴을 방출시키기 위한 수단을 제공한다. 링커 내에서, p-아미노벤질알콜(PABA)은 스페이서로서 작용하고, 자기 희생적이며, 이는 MMAE의 방출을 가능하게 한다. mc-vc-PABA-MMAE 링커의 구조는 도 11에 제공된다.
적합한 링커로는 예를 들면, 절단가능한 및 절단불가능한 링커들이 포함된다. 링커는 약물의 방출을 가능하게 하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 비제한적 예시의 절단가능한 링커로는 산-불안정(acid-labile) 링커(예를 들면, 하이드라존 포함), 프로테아제-민감성(예를 들면, 펩티다제-민감성) 링커, 광-불안정 링커, 또는 디설파이드-함유 링커(Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992); U.S. Pat. No. 5,208,020)가 포함된다. 절단가능한 링커는 전형적으로 세포내 조건 하에서 절단에 민감성이다. 적합한 절단가능한 링커로는 예를 들면, 세포내 프로테아제, 예를 들면, 리포솜성 프로테아제 또는 엔도솜성 프로테아제에 의해 절단가능한 펩타이드 링커가 포함된다. 예시의 실시형태에서, 링커는 디펩타이드 링커, 예를 들면, 발린-시트룰린(val-cit) 또는 페닐알라닌-라이신(phe-lys) 링커일 수 있다.
링커는 바람직하게는 치료학적으로 유효하기에 충분한 방식으로 세포외에서 안정하다. 세포에의 수송 또는 전달 전에, ADC는 바람직하게는 안정하고 온전하다, 즉, 항체는 약물 모이어티에 접합된 상태를 유지한다. 표적 세포 외부에서 안정한 링커는 세포 내부에서는 한동안 소정의 효과적인 속도로 절단될 수 있다. 따라서, 효과적인 링커는 (i) 항체의 특이적 결합 특성을 유지하고; (ii) 약물 모이어티의 전달, 예를 들면, 세포내 전달을 가능하게 하고; (iii) 약물 모이어티의 치료학적 효과, 예를 들면, 세포독성 효과를 유지할 것이다.
한 실시형태에서, 링커는, 링커의 절단이 치료학적으로 유효한 세포내 환경에서 항체로부터 약물을 충분하게 방출시키도록 세포내 조건 하에 절단가능하다. 몇몇의 실시형태에서, 절단가능한 링커는 pH-민감성, 즉, 소정의 pH 값에서 가수분해에 대해 민감성이다. 전형적으로, pH-민감성 링커는 산성 조건 하에 가수분해될 수 있다. 예를 들면, 리소좀에서 가수분해될 수 있는 산-불안정 링커(예를 들면, 하이드라존, 세미카르바존, 티오세미카르바존, 시스-아코니틱 아미드, 오르토에스테르, 아세탈, 또는 케탈 등)를 사용할 수 있다. (예를 들면, 문헌[U.S. Pat. 제5,122,368호; 제5,824,805호; 제5,622,929호; Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123; Neville et al., 1989, Biol. Chem. 264:14653-14661]을 참조한다). 이러한 링커들은 중성 pH 조건, 예를 들면, 혈액 내의 조건 하에 상대적으로 안정하지만, 리소좀의 대략적 pH, pH 5.5 또는 5.0 미만에서 불안정하다. 소정 실시형태에서, 가수분해가능한 링커는 티오에테르 링커(예를 들면, 아실하이드라존 결합을 통해 치료학적 제제에 부착된 티오에테르)이다(예를 들면, U.S. Pat 제5,622,929호를 참조한다).
다른 실시형태에서, 링커(예를 들면, 디설파이드 링커)는 환원 조건 하에 절단가능하다. 예를 들면, SATA(N-석신이미딜-5-아세틸티오아세테이트), SPDP(N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트), SPDB(N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오)부티레이트) 및 SMPT(N-석신이미딜옥시카르보닐-알파-메틸-알파-(2-피리딜-디티오)톨루엔)을 사용하여 형성될 수 있는 디설파이드 링커들, SPDB 및 SMPT를 포함하는, 다양한 디설파이드 링커가 당해 분야에 공지되어 있다. (예를 들면, 문헌[Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47:5924-5931; Wawrzynczak et al., In Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987)을 참조한다). 또한, U.S. Pat. 제4,880,935호를 참조한다.
몇몇의 실시형태에서, 링커는 세포내 환경(예를 들면, 리소좀 또는 엔도솜 또는 포낭(caveolae) 내)에 존재하는 절단 제제(cleaving agent)에 의해 절단가능하다. 상기 링커는, 예를 들면, 리소좀 또는 엔도솜 프로테아제를 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아닌 세포내 펩티다제 또는 프로테아제 효소에 의해 절단되는 펩티딜 링커일 수 있다. 몇몇의 실시형태에서, 펩티딜 링커는 적어도 2개의 아미노산 길이 또는 적어도 3개의 아미노산 길이이다. 절단 제제는 카텝신 B 및 D 및 플라스민을 포함할 수 있으며, 이들 전부는 디펩타이드 약물 유도체를 가수분해하여 표적 세포 내부에서 활성 약물의 방출을 초래하는 것으로 공지되어 있다(예를 들면, 문헌[Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123]을 참조한다). EGFR-발현 세포에 존재하는 효소에 의해 절단가능한 펩티딜 링커들이 가장 전형적이다. 이러한 링커의 예는 예를 들면, 본원에 그 전문이 인용에 의해 그리고 모든 목적을 위해 포함된 U.S. Pat. 제6,214,345에 기술되어 있다. 특정 실시형태에서, 세포내 프로테아제에 의해 절단가능한 펩티딜 링커는 Val-Cit 링커 또는 Phe-Lys 링커이다(예를 들면, val-cit 링커와의 독소루비신의 합성을 기술하는 U.S. Pat. 제6,214,345호를 참조한다). 치료학적 제제의 세포내 단백질분해적 방출을 사용하는 것의 하나의 이점은 상기 제제가 접합되는 경우에 통상적으로 약해지고 접합체의 혈청 안정성이 통상적으로 높아진다는 점이다.
다른 실시형태에서, 링커는 말로네이트 링커(Johnson et al., 1995, Anticancer Res. 15:1387-93), 말레이미도벤조일 링커(Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1299-1304), 또는 3'-N-아미드 유사체(Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1305-12)이다.
또 다른 실시형태에서, 링커 유닛은 절단불가능하고, 약물은 예를 들면, 항체 분해에 의해 방출된다. 본원에 그 전문이 인용에 의해 포함되는 U.S. 공개 제20050238649호를 참조한다. 절단불가능한 링커를 포함하는 ADC는, ADC가 실질적으로 세포 외부에 남아 있고 표적 세포 표면 상의 소정 수용체와 상호작용하여 ADC의 결합이 특정 세포 신호전달 경로를 개시하도록(또는 방지하도록) 고안될 수 있다.
몇몇의 실시형태에서, 링커는 실질적으로 친수성 링커(예를 들면, PEG4Mal 및 설포-SPDB)이다. 친수성 링커는 MDR(다중 약물 내성) 또는 기능적으로 유사한 수송체를 통해 내성 암 세포로부터 약물이 펌핑 아웃(pumped out)될 수 있는 정도를 감소시키는데 사용될 수 있다.
다른 실시형태에서, 절단시, 링커는 세포 성장 및/또는 세포 증식을 직접적으로 또는 간접적으로 억제하도록 기능한다. 예를 들면, 몇몇의 실시형태에서, 링커는 절단시 개재성 제제(intercalating agent)로서 기능하여 거대 분자 생합성(예를 들면, DNA 복제, RNA 전사 및/또는 단백질 합성)을 억제할 수 있다.
다른 실시형태에서, 링커는 주위 세포에의 링커-약물 및/또는 약물 단독의 확산을 통한 방관자 사멸(bystander killing)(주위 세포의 사멸)을 가능하게 하도록 고안된다. 다른 실시형태에서, 링커는 세포 내재화를 촉진시킨다.
입체적으로 장해된(sterically hindered) 디설파이드의 존재는 특정 디설파이드 결합의 안정성을 증가시킬 수 있고, 이는 ADC의 효력을 향상시킨다. 따라서, 한 실시형태에서, 링커는 입체적으로 장해된 디설파이드 링크를 포함한다. 입체적으로 장해된 디설파이드는 특정 분자 환경 내에 존재하는 디설파이드 결합을 말하고, 여기서, 상기 환경은, 디설파이드 결합의 환원을 방지하거나 적어도 부분적으로 억제하는, 동일한 분자 또는 화합물 내에서의 특정 공간적 배열 또는 원자들의 배향에 의해 특성확인된다. 따라서, 디설파이드 결합 부근의 부피가 큰(bulky)(또는 입체적으로 장해성인) 화학적 모이어티 및/또는 부피가 큰 아미노산 측쇄는, 디설파이드 결합의 환원을 초래할 수 있는 잠재적 상호작용하는 것으로부터 디설파이드 결합을 방지하거나 적어도 부분적으로 억제한다.
특히, 상기 언급된 링커 유형은 상호 배타적이지 않다. 예를 들면, 한 실시형태에서, 본원에 기술된 항-EGFR ADC에 사용되는 링커는 세포 내재화를 촉진시키는 절단불가능한 링커이다.
몇몇의 실시형태에서, ADC는 하기 화학식(화학식 I):
Ab-(L-D) n (I)
또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 갖고; 여기서, Ab는 항체, 예를 들면, 항-EGFR 항체 AbA이고, (L-D)는 링커-약물 모이어티이다. 링커-약물 모이어티는 링커인 L-, 및 예를 들면, 표적 세포, 예를 들면, EGFR을 발현하는 세포에 대해 세포분열 정지, 세포독성, 또는 그렇지 않으면 치료학적 활성을 갖는 약물 모이어티인 -D로 이루어지고; n은 1 내지 20의 정수이다.
몇몇의 실시형태에서, n은 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2이거나, 1이다.
몇몇의 실시형태에서, 상기 -D 모이어티들은 동일하다. 또 다른 실시형태에서, 상기 -D 모이어티들은 상이하다.
상기 기술된 바와 같은 링커는 단일 모이어티일 수 있거나, 2개 이상의 구성성분들을 포함할 수 있다. 이와 같이, 몇몇의 실시형태에서, 상기 ADC는 하기 화학식(II):
Ab-(Aa-Ww-Yy-D) n (II)
또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 갖고, 여기서, Ab는 항체, 예를 들면, 항-EGFR 항체 AbA이고, -Aa-Ww-Yy-는, 임의의 스트레쳐 유닛인 -A-(a는 0 또는 1이다), 독립적으로 아미노산 유닛(또는 몇몇의 실시형태에서는 글루쿠로니드 유닛(또한, US 공개 제2012/0107332 A1을 참조한다))인 각각의 -W-(w는 0 내지 12 범위의 정수이다), 자기-희생 스페이스 유닛인 -Y-(y는 0, 1 또는 2이다)를 포함하는 3개 이상의 구성성분을 포함하는 링커(L)이고; -D는 예를 들면, 표적 세포, 예를 들면, EGFR을 발현하는 세포에 대해 세포분열 정지, 세포독성, 또는 그렇지 않으면 치료학적 활성을 갖는 약물 모이어티이고; n은 1 내지 20의 정수이다.
몇몇의 실시형태에서, 링커 구성성분은 항체를 다른 링커 구성성분에 또는 약물 모이어티에 링크하는 "스트레쳐 유닛"(A)을 포함한다. 비제한적 예시의 스트레쳐 유닛은 하기에 나타낸다(여기서, 물결선은 항체, 약물, 또는 추가의 링커 구성성분에의 공유결합적 부착 부위를 나타낸다):
Figure pat00013
스트레쳐 유닛(A)은 존재하는 경우, 항체를 존재하는 경우 아미노산 유닛(-W-)에, 존재하는 경우 스페이서 유닛(-Y-)에; 또는 약물(-D)에 링크할 수 있다(화학식 II 참조). 자연적으로 또는 화학적 조작을 통해, 본원에 기술되는 항-EGFR 항체 상에 존재할 수 있는 유용한 기능성 그룹으로는 설프하이드릴, 아미노, 하이드록실, 탄수화물의 아노머 하이드록실 그룹, 및 카르복실이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 적합한 기능성 그룹은 설프하이드릴 및 아미노이다. 한 예에서, 설프하이드릴 그룹은 항-EGFR 항체의 분자내 디설파이드 결합의 환원에 의해 생성될 수 있다. 다른 실시형태에서, 설프하이드릴 그룹은 2-이미노티올란(Traut 시약) 또는 다른 설프하이드릴 생성 시약과의 항-EGFR 항체의 라이신 모이어티의 아미노 그룹의 반응에 의해 생성될 수 있다. 소정 실시형태에서, 항-EGFR 항체는 재조합 항체이고, 하나 이상의 라이신 모이어티를 갖도록 조작된다. 소정의 다른 실시형태에서, 재조합 항-EGFR 항체는 추가의 설프하이드릴 그룹, 예를 들면, 추가의 시스테인을 갖도록 조작된다.
한 실시형태에서, 스트레쳐 유닛은 항체의 황 원자와의 결합을 형성한다. 황 원자는 항체의 설프하이드릴 그룹으로부터 유도될 수 있다. 이러한 실시형태의 대표적 스트레쳐 유닛은 하기 나타낸 화학식 IIIa 및 IIIb의 대괄호 내에 도시된다:
Figure pat00014
여기서, L-, -W-, -Y-, -D, w 및 y는 상기 정의된 바와 같고, R17은 -C1-C10 알킬렌-, -C1-C10 알케닐렌-, -C1-C10 알키닐렌-, 카르보사이클로-, -O-(C1-C8 알킬렌)-, O-(C1-C8 알케닐렌)-, -O-(C1-C8 알키닐렌)-, -아릴렌-, -C1-C10 알킬렌-아릴렌-, -C2-C10 알케닐렌-아릴렌, -C2-C10 알키닐렌-아릴렌, 아릴렌-C1-C10 알킬렌-, -아릴렌-C2-C10 알케닐렌-, -아릴렌-C2-C10 알키닐렌-, -C1-C10 알킬렌-(카르보사이클로)-, -C2-C10 알케닐렌-(카르보사이클로)-, C2-C10 알키닐렌-(카르보사이클로)-, -(카르보사이클로)-C1-C10 알킬렌-, -(카르보사이클로)-C2-C10 알케닐렌-, -(카르보사이클로)-C2-C10 알키닐렌, -헤테로사이클로-, -C1-C10 알킬렌-(헤테로사이클로)-, -C2-C10 알케닐렌-(헤테로사이클로)-, -C2-C10 알키닐렌-(헤테로사이클로)-, -(헤테로사이클로)-C1-C10 알킬렌-, -(헤테로사이클로)-C2-C10 알케닐렌-, -(헤테로사이클로)-C1-C10 알키닐렌-, -(CH2CH2O)r-, 또는 -(CH2CH2O)r-CH2-로부터 선택되고, r은 1 내지 10의 범위의 정수이고, 여기서, 상기 알킬, 알케닐, 알키닐, 알킬렌, 알케닐렌, 알키닐렌, 아릴, 카르보사이클, 카르보사이클로, 헤테로사이클로, 및 아릴렌 라디칼은 단독으로 또는 다른 그룹의 부분으로서 임의로 치환된다. 몇몇의 실시형태에서, R17은 -C1-C10 알킬렌-, -카르보사이클로-, -O-(C1-C8 알킬렌)-, -아릴렌-, -C1-C10 알킬렌-아릴렌-, -아릴렌-C1-C10 알킬렌-, -C1-C10 알킬렌-(카르보사이클로)-, -(카르보사이클로)-C1-C10 알킬렌-, -C3-C8 헤테로사이클로-, -C1-C10 알킬렌-(헤테로사이클로)-, -(헤테로사이클로)-C1-C10 알킬렌-, -(CH2CH2O)r-, 및 -(CH2CH2O)r-CH2-로부터 선택되고; r은 1 내지 10의 범위의 정수이고, 여기서, 상기 알킬렌 그룹은 치환되지 않고, 나머지 그룹은 임의로 치환된다.
예시의 스트레쳐 유닛은 R17이 -(CH2)5-인 하기에 도시되는 바와 같은 화학식 IIIa의 유닛이다(또한 U.S. 8,309,093을 참조한다).
다른 예시의 스트레쳐 유닛은 R17이 -(CH2CH2O)r-CH2-이고; r이 2인 하기에 도시되는 바와 같은 화학식 IIIa의 유닛이다(또한, 본원에 인용에 의해 포함되는 U.S. 8,309,093을 참조한다).
Figure pat00015
다른 예시의 스트레쳐 유닛은 R17이 아릴렌- 또는 아릴렌-C1-C10 알킬렌-인 화학식 IIIa의 유닛이다. 몇몇의 실시형태에서, 아릴 그룹은 비치환 페닐 그룹이다. 또한 다른 예시의 스트레쳐 유닛은 R17이 -(CH2)5-인 하기에 도시되는 바와 같은 화학식 IIIb의 유닛이다(또한, 본원에 인용에 의해 포함되는 U.S. 8,309,093을 참조한다).
Figure pat00016
소정 실시형태에서, 스트레쳐 유닛은 항-EGFR 항체 유닛의 황 원자와 스트레쳐 유닛의 황 원자 사이의 디설파이드 결합을 통해 항-EGFR 항체에 링크된다. 이러한 실시형태의 대표적 스트레쳐 유닛은 화학식 IV의 대괄호 내에 도시되고(또한, 본원에 인용에 의해 포함되는 U.S. 8,309,093을 참조한다), 여기서, R17, L-, -W-, -Y-, -D, w 및 y는 상기에 정의된 바와 같다.
Figure pat00017
하기 나타낸 화학식의 S 모이어티(또한, 본원에 인용에 의해 포함되는 U.S. 8,309,093을 참조한다)는 문맥에서 달리 나타내지 않는 한 항체의 황 원자를 나타낸다는 것에 주의해야만 한다.
Figure pat00018
또 다른 실시형태에서, 스트레쳐는 항체의 1차 또는 2차 아미노 그룹과의 결합을 형성할 수 있는 반응성 부위를 포함한다. 이들 반응성 부위의 예로는 활성화된 에스테르, 예를 들면, 석신이미드 에스테르, 4 니트로페닐 에스테르, 펜타플루오로페닐 에스테르, 테트라플루오로페닐 에스테르, 무수물, 산 염화물, 설포닐 ㅋ클로라이드, 이소시아네이트 및 이소티오시아네이트가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 이러한 실시형태의 대표적 스트레쳐 유닛은 화학식 Va 및 Vb의 대괄호 내에 도시되고(하기를 참조한다(또한, 본원에 인용에 의해 포함되는 U.S. 8,309,093을 참조한다)), 여기서, R17, L-, -W-, -Y-, -D, w 및 y는 상기에 정의된 바와 같다.
Figure pat00019
몇몇의 실시형태에서, 스트레쳐는 항체 상에 존재할 수 있는 변형된 탄수화물의 (-CHO) 그룹에 대해 반응성인 반응성 부위를 포함한다. 예를 들면, 탄수화물은 과요오드산 나트륨과 같은 시약을 이용하여 약하게 산화될 수 있고, 얻어진 산화된 탄수화물의 (-CHO) 유닛은 하이드라지드, 옥심, 1급 또는 2급 아민, 하이드라진, 티오세미카르바존, 하이드라진 카르복실레이트, 및 아릴하이드라지드, 예를 들면, 문헌[Kaneko et al., 1991, Bioconjugate Chem. 2:133-41]에 기술된 것들과 같은 기능성을 포함하는 스트레쳐와 압축될 수 있다. 이러한 실시형태의 대표적 스트레쳐 유닛은 화학식 VIa, VIb, 및 VIc의 대괄호 내에 도시되고(하기를 참조한다(또한, 본원에 인용에 의해 포함되는 U.S. 8,309,093을 참조한다)), 여기서, -R17-, L-, -W-, -Y-, -D, w 및 y는 상기에 정의된 바와 같다.
Figure pat00020
몇몇의 실시형태에서, 링커 구성성분은 "아미노산 유닛"(W)을 포함한다. 몇몇의 이러한 실시형태에서, 아미노산 유닛은 프로테아제에 의한 링커의 절단을 가능하게 하고, 이에 의해 세포내 프로테아제, 예를 들면, 리소좀 효소에의 노출시 면역접합체로부터의 약물 방출이 가능해진다(Doronina et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21:778-784). 예시의 아미노산 유닛으로는 디펩타이드, 트리펩타이드, 테트라펩타이드, 및 펜타펩타이드가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 예시의 디펩타이드로는 발린-시트룰린(vc 또는 val-cit), 알라닌-페닐알리닌(af 또는 ala-phe); 페닐알라닌-라이신(fk 또는 phe-lys); 페닐알라닌-호모라이신(phe-homolys); 및 N-메틸-발린-시트룰린(Me-val-cit)이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 예시의 트리펩타이드의 예로는 글리신-발린-시트룰린(gly-val-cit) 및 글리신-글리신-글리신(gly-gly-gly)이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 아미노산 유닛은 천연 발생 아미노산 잔기 및/또는 소량의 아미노산을 포함할 수 있고/있거나, 비-천연 발생 아미노산 유사체, 예를 들면, 시트룰린 아미노산 유닛은 특정 효소, 예를 들면, 종양-관련 프로테아제, 카텝신 B, C 및 D, 또는 플라스민 프로테아제에 의한 효소적 절단에 대해 고안되어 최적화될 수 있다.
한 실시형태에서, W 아미노산 유닛은 발린-시트룰린(vc 또는 val-cit)이다. 다른 양상에서, 아미노산 유닛은 페닐알라닌-라이신(즉, fk)이다. 아미노산 유닛의 또 다른 양상에서, 아미노산 유닛은 N-메틸발린-시트룰린이다. 또 다른 양상에서, 아미노산 유닛은 5-아미노발레르산, 호모 페닐알라닌 라이신, 테트라이소퀴놀린카르복실레이트 라이신, 사이클로헥실알라닌 라이신, 이소네페코트산 라이신, 베타-알라닌 라이신, 글리신 세린 발린 글루타민 및 이소네페코트산이다.
대안으로, 몇몇의 실시형태에서, -W-는, 스트레쳐 및 스페이서 유닛이 존재하는 경우 스트레쳐 유닛을 스페이서 유닛에 링크하고, 스페이서 유닛이 부재하는 경우 스트레쳐 유닛을 약물 모이어티에 링크하고, 스트레쳐 및 스페이서 유닛이 부재하는 경우 링커 유닛을 약물에 링크하는, 글루쿠로니드 유닛이다. 글루쿠로니드 유닛은 β-글루쿠로니다제 효소에 의해 절단될 수 있는 부위를 포함한다(또한, 본원에 인용에 의해 포함되는 US 2012/0107332를 참조한다). 몇몇의 실시형태에서, 글루쿠로니드 유닛은 글리코시드 결합(-O'-)을 통해 하기 도시되는 바와 같은 화학식의 자기 희생 그룹(Z)에 링크된 당 모이어티(Su)를 포함한다(또한, 본원에 인용에 의해 포함되는 US 2012/0107332를 참조한다).
Figure pat00021
글리코시드 결합(-O'-)은 전형적으로 β-글루쿠로니다제-절단 부위, 예를 들면, 사람, 리포솜 β-글루쿠로니다제에 의해 절단가능한 결합이다. 글루쿠로니드 유닛과 관련하여, 용어 "자기-희생 그룹"은 2개 또는 3개의 스페이싱된(spaced) 화학적 모이어티들(즉, 당 모이어티(글리코시드 결합을 통해), 약물 모이어티(직접적으로 또는 스페이서 유닛을 통해 간접적으로), 및 몇몇의 실시형태에서는 링커(직접적으로 또는 스트레쳐 유닛을 통해 간접적으로))을 함께 안정한 분자로 공유결합적으로 링크할 수 있는 2- 또는 3-기능성 화학적 모이어티를 말한다. 자기-희생 그룹은 당 모이어티에의 이의 결합이 절단되는 경우 제1 화학적 모이어티(예를 들면, 스페이서 또는 약물 유닛)로부터 자발적으로 분리될 것이다.
몇몇의 실시형태에서, 당 모이어티(Su)는 환상 헥소스, 예를 들면, 피라노스, 또는 환상 펜토스, 예를 들면, 푸라노스이다. 몇몇의 실시형태에서, 피라노스는 글루쿠로니드 또는 헥소스이다. 당 모이어티는 일반적으로 β-D 입체배좌로 존재한다. 특정 실시형태에서, 피라노스는 β-D-글루쿠로니드 모이어티(즉, β-글루쿠로니다제에 의해 절단가능한 글리코시드 결합을 통해 자기-희생 그룹 -Z-에 링크된 β-D-글루쿠론산)이다. 몇몇의 실시형태에서, 당 모이어티는 비치환된다(예를 들면, 천연 발생 환상 헥소스 또는 환상 펜토스). 다른 실시형태에서, 당 모이어티는 치환된 β-D-글루쿠로니드(즉, 수소, 하이드록실, 할로겐, 황, 질소 또는 저급 알킬과 같은 하나 이상의 그룹으로 치환된 글루쿠론산)일 수 있다.
몇몇의 실시형태에서, 글루쿠로니드 유닛은 하기 도시된 화학식들 중 하나를 갖고(또한, 본원에 인용에 의해 포함되는 US 2012/0107332를 참조한다),
Figure pat00022
여기서, Su는 당 모이어티이고, 글리코시드 결합은 Su와 자기 희생 그룹 Z 사이의 산소 결합을 포함하고, 각각의 R은 독립적으로 수소, 할로(예를 들면, 클로로, 브로모, 플루오로 등), -CN, -NO2, 또는 다른 전자 인출 또는 공여 그룹이고, 단, 글루쿠로니드 유닛(및 특히 Z)은 글리코시드 결합의 절단시에 자기-희생을 경험한다. 몇몇의 실시형태에서, 각각의 R은 독립적으로 수소, 할로(예를 들면, 클로로, 브로모, 플루오로 등), -CN 또는 -NO2이다.
몇몇의 실시형태에서, 글루쿠로니드 유닛은 하기 도시된 화학식들 중 하나를 갖고(또한, 본원에 인용에 의해 포함되는 US 2012/0107332를 참조한다),
Figure pat00023
여기서, Su는 당 모이어티이고, 글리코시드 결합(-O'-)은 Su와 자기 희생 그룹 Z 사이의 산소 결합을 포함하고, 각각의 R은 독립적으로 수소이다.
몇몇의 실시형태에서, 자기-희생 그룹(Z)은 당 모이어티에, 약물에(직접적으로 또는 스페이서 유닛(들)을 통해 간접적으로), 그리고 링커에(직접적으로 또는 스트레쳐 유닛(들)을 통해 간접적으로) 공유결합적으로 링크된다. 몇몇의 실시형태에서, 약물 링커 접합체는 하기 도시된 화학식을 갖고(또한, 본원에 인용에 의해 포함되는 US 2012/0107332를 참조한다),
Figure pat00024
여기서, Su, O', Z, Y, y, D, A 및 a는 본원에 정의된다. 전형적으로, 이러한 약물-링커 접합체의 1 내지 20은 링커에 링크될 수 있다.
몇몇의 실시형태에서, 글루쿠로니드 유닛을 포함하는 ADC는 하기 도시된 화학식들 중 하나를 갖고(또한, 본원에 인용에 의해 포함되는 US 2012/0107332를 참조한다), 여기서, Su, Y, y, D, A, a, 및 L은 본원에 기술된 바와 같이 정의된다.
Figure pat00025
몇몇의 실시형태에서, 글루쿠로니드 유닛을 포함하는 ADC는 하기 도시된 화학식을 갖고(또한, 본원에 인용에 의해 포함되는 US 2012/0107332를 참조한다), 여기서, Y, y, D, A, a, 및 L은 본원에 정의된다.
Figure pat00026
몇몇의 실시형태에서, 글루쿠로니드 유닛을 포함하는 ADC는 하기 도시된 화학식을 갖고(또한, 본원에 인용에 의해 포함되는 US 2012/0107332를 참조한다), 여기서, Y, y, D, 및 L은 본원에 기술된 바와 같이 정의된다.
Figure pat00027
몇몇의 실시형태에서, 글루쿠로니드 유닛을 포함하는 ADC는 하기 도시된 화학식을 갖고(또한, 본원에 인용에 의해 포함되는 US 2012/0107332를 참조한다), 여기서, Y, y, D, 및 L은 본원에 기술된 바와 같이 정의된다.
Figure pat00028
몇몇의 실시형태에서, 글루쿠로니드 유닛을 포함하는 ADC는 하기 도시된 화학식을 갖고(또한, US 2012/0107332를 참조한다), 여기서, D는 본원에 기술된 바와 같고, mAb는 모노클로날 항체이다.
Figure pat00029
스페이서 유닛(-Y-)은, 존재하는 경우, 아미노산 유닛(또는 글루쿠로니드 유닛, 또한, 본원에 인용에 의해 포함되는 US 2012/0107332를 참조한다)이 존재하는 경우 아미노산 유닛을 약물 모이어티에 링크한다. 대안으로, 스페이서 유닛은 아미노산 유닛이 부재하는 경우 스트레쳐 유닛을 약물 모이어티에 링크한다. 스페이서 유닛은 또한 아미노산 유닛 및 스트레쳐 유닛이 부재하는 경우 약물 유닛을 항체 유닛에 링크한다.
스페이서 유닛은 2개의 일반적 유형: 비 자기-희생 또는 자기-희생으로 이루어진다. 비 자기-희생 스페이서 유닛은, 항체-약물 접합체로부터의 아미노산 유닛(또는 글루쿠로니드 유닛)의 특히 효소적 절단 후 스페이서 유닛의 일부 또는 전부가 약물 모이어티에 결합된 상태를 유지하는 것이다. 비 자기-희생 스페이서 유닛의 예로는 (글리신-글리신) 스페이서 유닛 및 글리신 스페이서 유닛이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다(둘 다 하기 반응식 1에 도시됨(또한, 본원에 인용에 의해 포함되는 U.S. 8,309,093을 참조한다)).
Figure pat00030
글리신-글리신 스페이서 유닛 또는 글리신 스페이서 유닛을 포함하는 접합체가 효소(예를 들면, 종양-세포 관련-프로테아제, 암-세포-관련 프로테아제 또는 림프구-관련 프로테아제)를 통한 효소적 절단을 경험하는 경우, 글리신-글리신-약물 모이어티 또는 글리신-약물 모이어티는 L-Aa-Ww-로부터 절단된다. 한 실시형태에서, 독립적 가수분해 반응은 표적 세포 내에서 발생하고, 이는 글리신-약물 모이어티 결합을 절단시키고 약물을 방출시킨다.
몇몇의 실시형태에서, 비 자기-희생 스페이서 유닛(-Y-)은 -Gly-이다. 몇몇의 실시형태에서, 비 자기-희생 스페이서 유닛(-Y-)은 -Gly-Gly-이다.
한 실시형태에서, 스페이서 유닛이 부재하는(y=0) 약물-링커 접합체, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물이 제공된다.
대안으로, 자기-희생 스페이서 유닛을 포함하는 접합체는 약물 모이어티의 방출을 가능하게 할 수 있다. 자기-희생 스페이서 유닛은 제1 모이어티에의 이의 결합이 절단되는 경우 제2 화학적 모이어티로부터 자발적으로 분리될 것이다.
몇몇의 실시형태에서, -Yy-는 페닐렌 부분이 Qm으로 치환된 p-아미노벤질 알콜(PAB) 유닛이고, 여기서, Q는 -C1-C8 알킬, -C1-C8 알케닐, -C1-C8 알키닐, -O-(C1-C8 알킬), -O-(C1-C8 알케닐), -O-(C1-C8 알키닐), -할로겐, -질소 또는 -시아노이고; m은 0 내지 4의 범위의 정수이다. 알킬, 알케닐 및 알키닐 그룹은 단독으로 또는 다른 그룹의 일부로서 임의로 치환될 수 있다.
몇몇의 실시형태에서, -Y-는 PAB 그룹의 아미노 질소 원자를 통해 -Ww-에 링크되고 카르보네이트, 카르바메이트 또는 에테르 그룹을 통해 -D에 직접적으로 연결되는 PAB 그룹이다. 임의의 특정 이론 또는 메커니즘에 얽매이지 않고, 하기 반응식 2(또한, U.S. 8,309,093을 참조한다)는 문헌[Toki et al., 2002, J. Org. Chem. 67:1866-1872]에 기술되는 바와 같이 카르바메이트 또는 카르보네이트 그룹을 통해 -D에 직접적으로 부착되는 PAB 그룹의 약물 방출의 가능한 메커니즘을 도시한다.
Figure pat00031
반응식 2에서, Q는 -C1-C8 알킬, -C1-C8 알케닐, -C1-C8 알키닐, -O-(C1-C8 알킬), -O-(C1-C8 알케닐), -O-(C1-C8 알키닐), -할로겐, -니트로 또는 -시아노이고; m은 0 내지 4의 범위의 정수이고; p는 1 내지 약 20의 범위이다. 알킬, 알케닐 및 알키닐 그룹은 단독으로 또는 다른 그룹의 일부로서 임의로 치환될 수 있다.
자기-희생 스페이서의 다른 예로는 2-아미노이미다졸-5-메탄올 유도체(Hay et al., 1999, Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237) 및 오르토 또는 파라-아미노벤질아세탈과 같은 PAB 그룹과 전기적으로 유사한 방향족 화합물이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 아미드 결합 가수분해시 환화(cyclization)를 경험하는 스페이서, 예를 들면, 치환된 및 비치환된 4-아미노부티르산 아미드(Rodrigues et al., 1995, Chemistry Biology 2:223), 적절하게 치환된 비시클로[2.2.1] 및 비시클로[2.2.2] 환 시스템(Storm et al., 1972, J. Amer. Chem. Soc. 94:5815) 및 2-아미노페닐프로피온산 아미드(Amsberry et al., 1990, J. Org. Chem. 55:5867)를 사용할 수 있다. 글리신의 α-위치에서 치환되는 아민-함유 약물(Kingsbury et al., 1984, J. Med. Chem. 27:1447)의 제거는 또한 자기-희생 스페이서의 예이다.
한 양상에서, 스페이서 유닛(-Yy-)은 화학식 (X) 내지 (XII)로 나타내고(하기를 참조한다(또한, U.S. 8,309,093을 참조한다)), 여기서, Q는 -C1-C8 알킬, -C1-C8 알케닐, -C1-C8 알키닐, -O-(C1-C8 알킬), -O-(C1-C8 알케닐), -O-(C1-C8 알키닐), -할로겐, -니트로 또는 -시아노이고; m은 0 내지 4의 범위의 정수이다.
Figure pat00032
자기-희생 스페이서의 다른 예로는 2-아미노이미다졸-5-메탄올 유도체(예를 들면, 문헌[Hay et al., 1999, Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237]을 참조한다) 및 오르토 또는 파라-아미노벤질아세탈과 같은 PAB 그룹과 전기적으로 유사한 방향족 화합물이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 아미드 결합 가수분해시 환화를 경험하는 스페이서, 예를 들면, 치환된 및 비치환된 4-아미노부티르산 아미드(예를 들면, 문헌[Rodrigues et al., 1995, Chemistry Biology 2:223]을 참조한다), 적절하게 치환된 비시클로[2.2.1] 및 비시클로[2.2.2] 환 시스템(예를 들면, 문헌[Storm et al., 1972, J. Amer. Chem. Soc. 94:5815]을 참조한다) 및 2-아미노페닐프로피온산 아미드(예를 들면, 문헌[Amsberry et al., 1990, J. Org. Chem. 55:5867]을 참조한다)를 사용할 수 있다. 글리신의 α-위치에서 치환되는 아민-함유 약물(예를 들면, 문헌[Kingsbury et al., 1984, J. Med. Chem. 27:1447]을 참조한다)의 제거는 또한 자기-희생 스페이서의 예이다.
다른 적합한 스페이서 유닛은 공개된 U.S. 특허 출원 제2005-0238649호에 개시되어 있고, 이의 개시는 본원에 인용에 의해 포함된다.
ADC의 생성을 위한 다른 접근법은 약물 모이어티에 항-EGFR 항체를 링크하는 헤테로이기능성 가교-결합제의 사용을 포함한다. 사용될 수 있는 가교-결합제의 예로는 N-석신이미딜 4-(5-니트로-2-피리딜디티오)-펜타노에이트 또는 고도의 수용성 유사체 N-설포석신이미딜 4-(5-니트로-2-피리딜디티오)-펜타노에이트, N-석신이미딜-4-(2-피리딜디티오) 부티레이트(SPDB), N-석신이미딜-4-(5-니트로-2-피리딜디티오) 부티레이트(SNPB), 및 N-설포석신이미딜-4-(5-니트로-2-피리딜디티오) 부티레이트(SSNPB), N-석신이미딜-4-메틸-4-(5-니트로-2-피리딜디티오)펜타노에이트(SMNP), N-석신이미딜-4-(5-N,N-디메틸카르복스아미도-2-피리딜디티오) 부티레이트(SCPB) 또는 N-설포석신이미딜 4-(5-N,N-디메틸카르복스아미도-2-피리딜디티오) 부티레이트(SSCPB))가 포함된다. 본 발명의 항체는 가교-결합제로 변형될 수 있고, 이어서, N-석신이미딜 4-(5-니트로-2-피리딜디티오)-펜타노에이트, N-설포석신이미딜 4-(5-니트로-2-피리딜디티오)-펜타노에이트, SPDB, SNPB, SSNPB, SMNP, SCPB, 또는 SSCPB는 티올 모이어티를 함유하는 특정 약물의 약간의 과량과 반응하여 우수한 수율의 ADC를 제공할 수 있다. 바람직하게, 가교-결합제는 하기에 도시되는 화학식의 화합물이고(또한, 본원에 인용에 의해 포함되는 U.S. 특허 제6,913,748호를 참조한다),
Figure pat00033
여기서, R, R1, R2 및 R3은 동일하거나 상이하고, H, 메틸, 에틸, 또는 3 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형, 분지형, 또는 환상 알킬이고, n은 0 또는 1 내지 4의 정수이고, X 및 Y는 동일하거나 상이하고, H, CONR4R5 또는 NO2이고, 단, X 및 Y는 둘 다 동시에 H는 아니고, R4 및 R5는 동일하거나 상이하고, 각각 H, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, 이소-부틸 또는 tert-부틸이고, Z는 SO3 -M+ 또는 H이고, 여기서, M+는 메탈 이온 또는 테트라 알킬 암모늄 이온을 나타내고, 단, X 및/또는 Y가 NO2인 경우, Z는 H가 아니다. 추가의 헤테로이기능성 가교결합제 및 이를 이용한 ADC의 제조 방법은 U.S. 특허 제6,913,748호에 기술되어 있고, 이는 본원에 인용에 의해 명백히 포함된다.
한 실시형태에서, 하전된 링커(또한 사전-하전된(pro-charged) 링커)를 사용하여 항-EGFR 항체를 약물에 접합시켜 ADC를 형성한다. 하전된 링커들로는 세포 프로세싱 후에 하전되는 링커가 포함된다. 특정 ADC의 링커 내의 또는 세포 프로세싱 후 약물 상의 하전된 그룹(들)의 존재는 몇몇의 이점, 예를 들면, (i) ADC의 보다 높은 수용성, (ii) 수용액 중의 보다 높은 농도에서 작동하는 능력, (iii) 항체당 보다 큰 수의 약물 분자를 링크하는 능력(잠재적으로 보다 높은 효력을 초래함), (iv) 표적 세포 내에 보유되는 하전된 접합체 종에 대한 잠재력(보다 높은 효력을 초래함), 및 (v) 다중 약물 내성 세포의 향상된 민감도(이는 세포로부터 하전된 약물 종을 이출할 수 없을 수 있음)를 제공한다. 몇몇의 적합한 하전된 또는 사전-하전된 가교-결합제의 예 및 이들의 합성은 U.S. 특허 제8,236,319호의 도 1 내지 도 10에 나타내어지고, 상기 문헌은 본원에 인용에 의해 포함된다. 바람직하게, 하전된 또는 사전-하전된 가교-결합제는 ADC, 특히, 2 내지 20개의 접합된 약물을 갖는 ADC의 용해도를 유의하게 증가시키는 설포네이트, 포스페이트, 카르복실 또는 4급 아민 치환체를 함유하는 것들이다. 사전-하전된 모이어티를 함유하는 링커들로부터 조제된 접합체는 접합체가 세포에서 대사된 후에 하나 이상의 하전된 모이어티를 생산할 것이다.
추가의 실시형태에서, 본 발명의 ADC는 하기 도시된 화학식을 갖는 링커를 포함하고(또한, 본원에 인용에 의해 포함되는 U.S. 특허 제8,236,319호를 참조한다),
Figure pat00034
여기서, Y'은 항체와의 반응을 가능하게 하는 기능성 그룹을 나타내고; Q는 디설파이드, 티오에테르, 티오에스테르, 펩타이드, 하이드라존, 에스테르, 에테르, 카르바메이트 또는 마이드 결합을 통한 약물의 링크를 가능하게 하는 기능성 그룹을 나타내고; R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, 및 R10은 동일하거나 상이하고, H, 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형 알킬, 3 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 분지형 또는 환형 알킬, 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형, 분지형 또는 환형 알케닐 또는 알키닐, 이들에 한정되는 것은 아니지만 예를 들면, SO3 -, X-SO3 -, OPO3 2-, X-OPO3 2-, PO3 2-, X-PO3 2-, CO2-를 포함하는 음이온, 이들에 한정되는 것은 아니지만 예를 들면, 질소 함유 헤테로사이클, N+R11R12R13, 또는 X-N+R11R12R13을 포함하는 양이온, 또는 페닐이고, 여기서: R11, R12, 및 R13은 동일하거나 상이하고, H, 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형 알킬, 또는 3 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 분지형 또는 환형 알킬이고, X는 페닐 또는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형 알킬, 또는 3 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 분지형 또는 환형 알킬을 나타내고; l, m, 및 n은 0 또는 1 내지 4의 정수이고; A는 페닐 또는 치환된 페닐이고, 여기서, 치환체는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형 알킬, 또는 3 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 분지형 또는 환형 알킬, 이들에 한정되는 것은 아니지만 SO3 -, X-SO3 -, OPO3 2-, X-OPO3 2-, PO3 2-, X-PO3 2-, CO2-와 같은 음이온들, 및 이들에 한정되는 것은 아니지만 질소 함유 헤테로사이클, N+R11R12R13, 또는 X-N+R11R12R13와 같은 양이온들로부터 선택되는 하전된 치환체이고, 여기서, X는 상기와 동일한 정의를 갖고, 여기서, g는 0 또는 1이고; Z는 화학식 (OCH2CH2)p의 임의의 폴리에틸렌옥시 유닛(여기서, p는 0 또는 2 내지 약 1000의 정수이다), 또는 F1-E1-P-E2-F2 유닛(여기서, E1 및 E2는 동일하거나 상이하고, C=O, O 또는 NR14이고, 여기서, R14는 H, 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형 알킬, 3 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 분지형 또는 환형 알킬, 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형, 분지형 또는 환형 알케닐 또는 알키닐이고; P는 2 내지 20개 아미노산 길이의 펩타이드 유닛이고, 여기서, E1 또는 E2는 말단 질소, 말단 탄소를 통해 또는 펩타이드의 아미노산들 중 하나의 측쇄를 통해 펩타이드에 링크될 수 있고; F1 및 F2는 동일하거나 상이하고, 화학식 (OCH2CH2)p의 임의의 폴리에틸렌옥시 유닛이고, 여기서, p는 0 또는 2 내지 약 1000의 정수이다)이고; 단, Z가 F1-E1-P-E2-F2가 아닌 경우, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, 및 R10 중 적어도 하나는 하전된 치환체이거나, g가 1인 경우, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, 및 R10 중 적어도 하나는 하전된 치환체이다.
조성물 및 방법에 사용될 수 있는 링커들의 추가의 예로는 발린-시트룰린; 말레이미도카프로일; 아미노 벤조산; p-아미노벤질카르바모일(PAB); 리소좀 효소-절단가능한 링커; 말레이미도카프로일-폴리에틸렌 글리콜(MC(PEG)6-OH); N-메틸-발린 시트룰린; N-석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC); N-석신이미딜 4-(2-피리딜디티오)부타노에이트(SPDB); 및 N-석신이미딜 4-(2-피리딜티오)펜타노에이트(SPP)가 포함된다(또한, US 2011/0076232를 참조한다). 본 발명에 사용하기 위한 다른 링커로는 아비딘-비오틴-함유 ADC를 제공하기 위한 아비딘-비오틴 링크가 포함되고(또한, U.S. 특허 제4,676,980호, PCT 공보 제WO1992/022332A2호, 제WO1994/016729A1호, 제WO1995/015770A1호, 제WO1997/031655A2호, 제WO1998/035704A1호, 제WO1999/019500A1호, 제WO2001/09785A2호, 제WO2001/090198A1호, 제WO2003/093793A2호, 제WO2004/050016A2호, 제WO2005/081898A2호, 제WO2006/083562A2호, 제WO2006/089668A1호, 제WO2007/150020A1호, 제WO2008/135237A1호, 제WO2010/111198A1호, 제WO2011/057216A1호, 제WO2011/058321A1호, 제WO2012/027494A1호, 및 제EP77671B1호를 참조한다), 여기서, 몇몇의 이러한 링커들은 비오티니다제 절단에 대해 내성이다. 본 발명에 사용될 수 있는 추가의 링커들로는 코헤신-독케린-함유 ADC를 제공하기 위한 코헤신/독케린 쌍이 포함된다(PCT 공보 제WO2008/097866A2호, 제WO2008/097870A2호, 제WO2008/103947A2호, 및 제WO2008/103953A2호를 참조한다).
본 발명에 사용하기 위한 추가의 링커들은 비-펩타이드 중합체(예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸화된 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 엑스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, PLA(폴리(락트산)), PLGA(폴리(락트산-글리콜산)), 및 이들의 조합이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니고, 여기서, 바람직한 중합체는 폴리에틸렌 글리콜이다)를 포함할 수 있다(또한, PCT 공보 제WO2011/000370호를 참조한다). 추가의 링커는 또한 WO 2004-010957, U.S. 공개 제20060074008호, U.S. 공개 제20050238649호, 및 U.S. 공개 제20060024317호에 기술되어 있고, 이들 문헌의 각각은 그 전문이 본원에 인용에 의해 포함된다.
메이탄시노이드를 포함하는 ADC에 관해서, 메이탄시노이드 상의 다수의 위치는 링크 모이어티를 화학적으로 링크하기 위한 위치로서 작용할 수 있다. 한 실시형태에서, 메이탄시노이드는 메이탄시놀의 C-3 에스테르 및 이의 유사체인 반응성 화학적 그룹을 함유하는 링크 모이어티를 포함하고, 여기서, 링크 모이어티는 디설파이드 결합을 포함하고, 화학적 반응성 그룹은 N-석신이미딜 또는 N-설포석신이미딜 에스테르를 포함한다. 예를 들면, 하이드록실 그룹을 갖는 C-3 위치, 하이드록시메틸로 변형된 C-14 위치, 하이드록시로 변형된 C-15 위치, 하이드록시 그룹을 갖는 C-20 위치는 모두 유용하다. 링크 모이어티는 메이탄시놀의 C-3 위치에 링크되는 것이 가장 바람직하다.
링커를 통한 항체에의 약물의 접합은 당해 분야에 공지되어 있는 임의의 기술에 의해 달성될 수 있다. 항체에의 약물 및 링커의 공유결합적 부착을 위해 다수의 다양한 반응을 이용할 수 있다. 이는 라이신의 아민 그룹, 글루탐산 및 아스파르트산의 유리 카르복실산 그룹, 시스테인의 설프하이드릴 그룹 및 방향족 아미노산의 각종 모이어티를 포함하는 항체의 아미노산 잔기의 반응에 의해 달성될 수 있다. 가장 흔히 사용되는 비-특이적 공유결합적 부착 방법들 중 하나는 화합물의 카르복시(또는 아미노) 그룹을 항체의 아미노(또는 카르복시) 그룹에 링크시키는 카르보디이미드 반응이다. 추가로, 이기능성 제제, 예를 들면, 디알데하이드 또는 이미도에스테르는 화합물의 아미노 그룹을 항체의 아미노그룹에 링크시키는데 사용되어 왔다. 또한, 항체에의 약물의 부착을 위해 Schiff 염기 반응을 이용할 수 있다. 이러한 방법은 글리콜 또는 하이드록시 그룹을 포함하는 약물의 과요오드산염 산화를 포함하고, 이로써 이어서 결합제와 반응하는 알데하이드가 형성된다. 부착은 항체의 아미노 그룹과의 Schiff 염기의 형성을 통해 발생한다. 이소티오시아네이트는 또한 항체에 약물을 공유결합적으로 부착시키기 위한 커플링제로서 사용될 수 있다. 다른 기술들은 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있고 본 발명의 범위 내이다.
소정 실시형태에서, 링커의 전구체인 중간물은 적절한 조건 하에 약물과 반응한다. 소정 실시형태에서, 반응성 그룹은 약물 또는 중간물에 대해 사용된다. 약물과 중간물 사이의 반응의 생성물, 또는 유도체화된 약물은 후속적으로 적절한 조건 하에 항-EGFR 항체와 반응한다. 예시의 링커, 스트레쳐 유닛, 아미노산 유닛, 자기-희생 스페이서 유닛의 합성 및 구조는 U.S. 특허 출원 공개 제20030083263호, 제20050238649호 및 제20050009751호에 기술되어 있고, 이들의 각각은 본원에 인용에 의해 포함된다.
ADC의 능력은 표준 분석적 기술, 질량 분광측정법, HPLC, 및 분리/분석 기술 LC/MS에 의해 측정될 수 있다.
IV. 항-EGFR ADC의 정제
ADC의 정제 방법은 소정의 DAR을 갖는 ADC가 수집되는 방식으로 달성될 수 있다. 예를 들면, HIC 수지를 이용하여 최적의 약물 대 항체 비(DAR), 예를 들면, 4 이하의 DAR을 갖는 ADC로부터 고도의 약물 부하된 ADC를 분리할 수 있다. 한 실시형태에서, 소수성 수지를 ADC 혼합물에 첨가하여 바람직하지 못한 ADC, 즉, 보다 높은 약물 부하된 ADC가 수지에 결합하여 상기 혼합물로부터 선택적으로 제거될 수 있도록 한다. 소정 실시형태에서, ADC의 분리는 ADC 혼합물(예를 들면, 4 이하의 ADC의 약물 부하 종 및 6 이하의 ADC의 약물 부하 종을 포함하는 혼합물)을 소수성 수지와 접촉시킴으로써 달성될 수 있고, 여기서, 수지의 양은 상기 ADC 혼합물로부터 제거될 약물 부하 종의 결합을 가능하게 하기에 충분하다. 수지 및 ADC 혼합물을 함께 혼합하여, 제거될 ADC 종들(예를 들면, 6 이상의 약물 부하 종들)이 수지에 결합하고 ADC 혼합물 중의 다른 ADC 종들로부터 분리될 수 있도록 한다. 당해 방법에서 사용되는 수지의 양은 제거될 종들과 수지 사이의 중량비에 기초하고, 사용되는 수지의 양은 원하는 약물 부하 종들의 유의한 결합을 허용하지 않는다. 따라서, 평균 DAR을 5.5 내지 4 미만으로 감소시키는 방법을 사용할 수 있다. 또한, 본원에 기술된 정제 방법을 사용하여 임의의 원하는 범위의 약물 부하 종들, 예를 들면, 4 이하의 약물 부하 종들, 3 이하의 약물 부하 종들, 2 이하의 약물 부하 종들, 1 이하의 약물 부하 종들을 갖는 ADC를 단리할 수 있다.
소정 종의 분자(들)는 당해 종들과 소수성 수지 사이의 소수성 상호작용에 기초하여 표면에 결합한다. 한 실시형태에서, 본 발명의 방법은 소수성 수지와 ADC 혼합물의 상호혼합에 의존하는 정제 프로세스를 나타내고, 여기서, 상기 혼합물에 첨가되는 수지의 양은 결합될 종들(예를 들면, 6 이상의 DAR을 갖는 ADC들)을 결정한다. 발현 시스템(예를 들면, 포유동물 발현 시스템)으로부터의 항체의 생산 및 정제 후, 항체를 환원시키고 접합 반응을 통해 약물에 커플링시킨다. 얻어진 ADC 혼합물은 종종 예를 들면, 1 내지 8의 DAR 범위를 갖는 ADC를 함유한다. 한 실시형태에서, ADC 혼합물은 4 이하의 약물 부하 종들 및 6 이상의 약물 부하 종들을 포함한다. 본 발명의 방법에 따르면, 이에 제한되는 것은 아니지만 배치(batch) 프로세스와 같은 프로세스를 사용하여 ADC 혼합물을 정제하여, 4 이하의 약물 부하 종들을 갖는 ADC를 선택하고 이를 보다 높은 약물 부하를 갖는 ADC(예를 들면, 6 이상의 약물 부하 종들을 갖는 ADC들)로부터 분리할 수 있다. 특히, 본원에 기술된 정제 방법을 사용하여 임의의 원하는 범위의 DAR, 예를 들면, 4 이하의 DAR, 3 이하의 DAR, 2 이하의 DAR을 갖는 ADC를 단리할 수 있다.
따라서, 한 실시형태에서, 4 이하의 약물 부하 종들 및 6 이상의 약물 부하 종들을 포함하는 ADC 혼합물을 소수성 수지와 접촉시켜 수지 혼합물을 형성할 수 있고(여기서, ADC 혼합물과 접촉되는 소수성 수지의 양은 상기 수지에의 6 이상의 약물 부하 종들의 결합을 허용하기에 충분하지만 4 이하의 약물 부하 종들의 유의한 결합은 허용하지 않는다); 상기 ADC 혼합물로부터 상기 소수성 수지를 제거하여, ADC를 포함하는 조성물을 수득할 수 있다(여기서, 상기 조성물은 6 이상의 약물 부하 종들을 15% 미만으로 포함하고, 상기 ADC는 아우리스타틴에 접합된 항체를 포함한다). 별도의 실시형태에서, 본 발명의 방법은, 4 이하의 약물 부하 종들 및 6 이상의 약물 부하 종들을 포함하는 ADC 혼합물을 소수성 수지와 접촉시켜 수지 혼합물을 형성하는 단계(여기서, ADC 혼합물과 접촉되는 소수성 수지의 양은 수지에의 6 이상의 약물 부하 종들의 결합을 허용하기에 충분하지만 4 이하의 약물 부하 종들의 유의한 결합은 허용하지 않는다); 및 상기 ADC 혼합물로부터 상기 소수성 수지를 제거하여, ADC를 포함하는 조성물을 수득하는 단계(여기서, 상기 조성물은 6 이상의 약물 부하 종들을 15% 미만으로 포함하고, 상기 ADC는 아우리스타틴에 접합된 항체를 포함하며, 상기 소수성 수지 중량은 ADC 혼합물 중의 6 이상의 약물 부하 종들의 중량의 3 내지 12배이다)를 포함한다.
본원에 기술된 ADC 분리 방법은 배치 정제 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 배치 정제 프로세스는 일반적으로 용기 내의 소수성 수지에 ADC 혼합물을 첨가하고, 혼합하고, 후속적으로 상청액으로부터 수지를 분리하는 단계를 포함한다. 예를 들면, 배치 정제의 맥락에서, 소수성 수지를 원하는 평형 완충액 중에서 제조하거나 상기 완충액에 대해 평형화될 수 있다. 이로써 소수성 수지의 슬러리를 수득할 수 있다. 이어서, ADC 혼합물을 상기 슬러리와 접촉시켜, 소수성 수지에 의해 분리될 ADC(들)의 특정 종들을 흡착시킬 수 있다. 이어서, 소수성 수지 물질에 결합하지 않는 원하는 ADC를 포함하는 용액을, 예를 들면, 여과에 의해 또는 슬러리의 침적 및 상청액 제거에 의해 슬러리로부터 분리할 수 있다. 얻어진 슬러리를 하나 이상의 세척 단계에 적용할 수 있다. 결합된 ADC를 용리하기 위해, 염 농도를 감소시킬 수 있다. 한 실시형태에서, 본 발명에 사용되는 프로세스는 50g 이하의 소수성 수지를 포함한다.
따라서, 배치 방법을 사용하여 4 이하의 약물 부하 종들 및 6 이상의 약물 부하 종들을 포함하는 ADC 혼합물을 소수성 수지와 접촉시켜 수지 혼합물을 형성할 수 있고(여기서, ADC 혼합물과 접촉되는 소수성 수지의 양은 수지에의 6 이상의 약물 부하 종들의 결합을 허용하기에 충분하지만 4 이하의 약물 부하 종들의 유의한 결합은 허용하지 않는다); 상기 ADC 혼합물로부터 상기 소수성 수지를 제거하여, ADC를 포함하는 조성물을 수득할 수 있다(여기서, 상기 조성물은 6 이상의 약물 부하 종들을 15% 미만으로 포함하고, 상기 ADC는 아우리스타틴에 접합된 항체를 포함한다). 별도의 실시형태에서, 배치 방법을 사용하여 4 이하의 약물 부하 종들 및 6 이상의 약물 부하 종들을 포함하는 ADC 혼합물을 소수성 수지와 접촉시켜 수지 혼합물을 형성하고(여기서, ADC 혼합물과 접촉되는 소수성 수지의 양은 수지에의 6 이상의 약물 부하 종들의 결합을 허용하기에 충분하지만 4 이하의 약물 부하 종들의 유의한 결합은 허용하지 않는다); 상기 ADC 혼합물로부터 상기 소수성 수지를 제거하여, ADC를 포함하는 조성물을 수득한다(여기서, 상기 조성물은 6 이상의 약물 부하 종들을 15% 미만으로 포함하고, 상기 ADC는 아우리스타틴에 접합된 항체를 포함하며, 상기 소수성 수지 중량은 ADC 혼합물 중의 6 이상의 약물 부하 종들의 중량의 3 내지 12배이다).
대안으로, 별도의 실시형태에서, 순환 프로세스를 사용하여 정제를 수행할 수 있고, 이에 의해 수지를 용기에 팩킹하고, 분리될 ADC(들)의 특정 종들이 제거될 때까지 ADC 혼합물을 소수성 수지 층(bed) 위에 통과시킨다. 이어서, (원하는 ADC 종들을 함유하는) 상청액을 용기로부터 펌핑하고, 수지 층을 세척 단계에 적용할 수 있다.
순환 프로세스를 사용하여 4 이하의 약물 부하 종들 및 6 이상의 약물 부하 종들을 포함하는 ADC 혼합물을 소수성 수지와 접촉시켜 수지 혼합물을 형성할 수 있고(여기서, ADC 혼합물과 접촉되는 소수성 수지의 양은 수지에의 6 이상의 약물 부하 종들의 결합을 허용하기에 충분하지만 4 이하의 약물 부하 종들의 유의한 결합은 허용하지 않는다); 상기 ADC 혼합물로부터 상기 소수성 수지를 제거하여, ADC를 포함하는 조성물을 수득할 수 있다(여기서, 상기 조성물은 6 이상의 약물 부하 종들을 15% 미만으로 포함하고, 상기 ADC는 아우리스타틴에 접합된 항체를 포함한다). 별도의 실시형태에서, 순환 프로세스를 사용하여 4 이하의 약물 부하 종들 및 6 이상의 약물 부하 종들을 포함하는 ADC 혼합물을 소수성 수지와 접촉시켜 수지 혼합물을 형성하고(여기서, ADC 혼합물과 접촉되는 소수성 수지의 양은 수지에의 6 이상의 약물 부하 종들의 결합을 허용하기에 충분하지만 4 이하의 약물 부하 종들의 유의한 결합은 허용하지 않는다); 상기 ADC 혼합물로부터 상기 소수성 수지를 제거하여, ADC를 포함하는 조성물을 수득한다(여기서, 상기 조성물은 6 이상의 약물 부하 종들을 15% 미만으로 포함하고, 상기 ADC는 아우리스타틴에 접합된 항체를 포함하며, 상기 소수성 수지 중량은 ADC 혼합물 중의 6 이상의 약물 부하 종들의 중량의 3 내지 12배이다).
대안으로, 유동 통과(flow through) 프로세스를 사용하여 ADC 혼합물을 정제하여 소정의 원하는 DAR을 갖는 다수의 ADC를 포함하는 조성물에 도달할 수 있다. 유동 통과 프로세스에서는, 컨테이너, 예를 들면, 컬럼에 수지를 팩킹하고, ADC 혼합물을 팩킹된 수지에 통과시켜 원하는 ADC 종들이 수지에 실질적으로 결합하지 않고 수지를 통과하여 유동하고, 원하지 않는 ADC 종들은 수지에 결합되도록 한다. 유동 통과 프로세스는 단일 통과 방식으로(목적하는 ADC 종들이 컨테이너 내의 수지를 통한 단일 통과의 결과로서 수득된다) 또는 다중-통과 방식(multi-pass mode)으로(목적하는 ADC 종들이 컨테이너 내의 수지를 통한 다중 통과의 결과로서 수득된다) 수행될 수 있다. 유동 통과 프로세스는, 선택된 수지의 중량은 원하지 않는 ADC 집단에 결합하고, 원하는 ADC(예를 들면, DAR 2 내지 4)는 수지 위에 유동하여 1회 또는 다중 통과 후 유동 통과액 내에서 수집되도록 수행된다.
유동 통과 프로세스를 사용하여 4 이하의 약물 부하 종들 및 6 이상의 약물 부하 종들을 포함하는 ADC 혼합물을 소수성 수지와 접촉시킬 수 있고(여기서, ADC 혼합물과 접촉되는 소수성 수지의 양은 수지에의 6 이상의 약물 부하 종들의 결합을 허용하기에 충분하지만 4 이하의 약물 부하 종들의 유의한 결합은 허용하지 않는다), 상기 4 이하의 약물 부하 종들은 수지를 통과하고 1회 또는 다중 통과 후 후속적으로 수집되어, 원하는 ADC들(예를 들어, DAR 2 내지 4)을 포함하는 조성물을 수득할 수 있다(여기서, 상기 조성물은 6 이상의 약물 부하 종들을 15% 미만으로 포함하고, 상기 ADC는 아우리스타틴에 접합된 항체를 포함한다). 별도의 실시형태에서, 유동 통과 공정을 사용하여 4 이하의 약물 부하 종들 및 6 이상의 약물 부하 종들을 포함하는 ADC 혼합물을 소수성 수지에 통과시킴으로써 ADC 혼합물을 수지와 접촉시키고(여기서, ADC 혼합물과 접촉되는 소수성 수지의 양은 수지에의 6 이상의 약물 부하 종들의 결합을 허용하기에 충분하지만 4 이하의 약물 부하 종들의 유의한 결합은 허용하지 않는다), 상기 4 이하의 약물 부하 종들은 수지를 통과하고 후속적으로 수집되어, ADC를 포함하는 조성물을 수득한다(여기서, 상기 조성물은 6 이상의 약물 부하 종들을 15% 미만으로 포함하고, 상기 ADC는 아우리스타틴에 접합된 항체를 포함하며, 상기 소수성 수지 중량은 ADC 혼합물 중의 6 이상의 약물 부하 종들의 중량의 3 내지 12배이다).
유동 통과 프로세스 후, 수지를 1회 이상의 세척으로 세척하여, (세척 여액 중에서 발견되는) 원하는 DAR 범위를 갖는 ADC를 추가로 회수한다. 예를 들면, 감소하는 전도도를 갖는 복수의 세척을 사용하여 목적하는 DAR을 갖는 ADC를 추가로 회수할 수 있다. 후속적으로, 목적하는 DAR을 갖는 ADC의 개선된 회수를 위해 수지의 세척으로부터 수득되는 용리 물질을 유동 통과 프로세스로부터 얻어진 여액과 합할 수 있다.
상기 언급된 배치, 순환 및 유동 통과 프로세스 정제 방법은 소수성 수지를 사용하여 ADC의 높은 약물 부하 종들 대 낮은 약물 부하 종들을 분리하는 것에 기초한다. 소수성 수지는 ADC의 소수성 성질과 상호작용하는 소수성 그룹들을 포함한다. ADC 상의 소수성 그룹들이 소수성 수지 내의 소수성 그룹들과 상호작용한다. 단백질의 소수성이 클수록 상기 단백질은 소수성 수지와 더 강하게 상호작용할 것이다.
소수성 수지는 보통 기저 매트릭스(예를 들면, 가교-결합된 아가로스 또는 합성 공중합체 물질)를 포함하고, 상기 매트릭스에 소수성 리간드(예를 들면, 알킬 또는 아릴 그룹)가 커플링된다. 다수의 소수성 수지가 상업적으로 입수가능하다. 이의 예로는 저치환 또는 고치환 Pheny Sepharose™ 6 Fast Flow(Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Sweden); Pheny Sepharose™ High Performance(Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Sweden); Octyl Sepharose™ High Performance(Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Sweden); Fractogel™ EMD Propyl 또는 Fractogel™ EMD Phenyl 컬럼(E. Merck, Germany); Macro-Prep™ Methyl 또는 Macro-Prep™. t-Butyl Supports(Bio-Rad, California); WP HI-Propyl (C3)™(J. T. Baker, New Jersey); 및 Toyopearl™ 에테르, 헥실, 페닐 또는 부틸(TosoHaas, PA)이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 한 실시형태에서, 소수성 수지는 부틸 소수성 수지이다. 다른 실시형태에서, 소수성 수지는 페닐 소수성 수지이다. 다른 실시형태에서, 소수성 수지는 헥실 소수성 수지, 옥틸 소수성 수지, 또는 데실 소수성 수지이다. 한 실시형태에서, 소수성 수지는 n-부틸 리간드를 갖는 메타크릴 중합체(예를 들면, TOYOPEARL® Butyl-600M)이다.
ADC 혼합물을 정제하여 원하는 DAR을 갖는 조성물을 수득하기 위한 추가의 방법은 본원에 그 전문이 인용에 의해 포함되는 U.S. 출원 제14/210,620호(U.S. 특허 Appln. 공개 제US 2014/0286968호)에 기술되어 있다.
V. 항-EGFR 항체 및 항-EGFR ADC의 용도
본 발명의 항체 및 항체부(및 ADC)는 바람직하게는 둘 다 생체내에서 사람 EGFR 활성을 중화시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 이러한 항체 및 항체부는 예를 들면, hEGFR을 함유하는 세포 배양물에서, 사람 대상체에서 또는 본 발명의 항체와 교차-반응하는 EGFR을 갖는 기타 포유동물 대상체에서 hEGFR 활성을 억제시키는데 사용될 수 있다. 한 실시형태에서, 본 발명은, hEGFR을 본 발명의 항체 또는 항체부와 접촉시켜 hEGFR 활성이 억제되도록 하는 것을 포함하는 hEGFR 활성을 억제하는 방법을 제공한다. 예를 들면, hEGFR을 함유하거나 hEGFR을 함유하는 것으로 의심되는 세포 배양물에 있어서, 본 발명의 항체 또는 항체부를 배양 배지에 첨가하여 상기 배양물 중의 hEGFR 활성을 억제시킬 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명은, EGFR 활성이 유해한 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체로부터 유리하게 대상체에서의 hEGFR 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 이러한 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체에서의 EGFR 활성을 감소시키는 방법을 제공하고, 이 방법은 상기 대상체에게 본 발명의 항체 또는 항체부를 투여하여 상기 대상체에서의 EGFR 활성이 감소되도록 하는 것을 포함한다. 바람직하게, 상기 EGFR은 사람 EGFR이고, 상기 대상체는 사람 대상체이다. 대안으로, 상기 대상체는 본 발명의 항체가 결합할 수 있는 EGFR을 발현하는 포유동물일 수 있다. 또한 추가로, 상기 대상체는 (예를 들면, EGFR의 투여에 의해 또는 EGFR 전이 유전자의 발현에 의해) EGFR이 도입된 포유동물일 수 있다. 본 발명의 항체는 치료학적 목적을 위해 사람 대상체에게 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 수의학적 목적을 위해 또는 사람 질환의 동물 모델로서, 항체가 결합할 수 있는 EGFR을 발현하는 비-사람 포유동물에게 투여될 수 있다. 후자에 관해서, 이러한 동물 모델은 본 발명의 항체의 치료학적 효능을 평가(예를 들면, 용량 및 투여의 경시 과정의 시험)하는데 유용할 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "EGFR 활성이 유해한 장애"는, 상기 장애를 앓고 있는 대상체에서의 EGFR의 존재가, 존재하는 것으로 밝혀졌거나 상기 장애의 병리생리학에 관여하거나 상기 장애의 악화에 기여하는 인자인 것으로 의심되는, 질환 및 기타 장애를 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, EGFR 활성이 유해한 장애는, EGFR 활성의 감소가 장애의 증상 및/또는 진행을 완화시키는 것으로 기대되는 장애이다. 이러한 장애는 예를 들면, 장애를 앓고 있는 대상체의 생물학적 체액 중의 EGFR 농도의 증가(예를 들면, 대상체의 종양, 혈청, 혈장, 활액 등 중의 EGFR 농도의 증가)에 의해 증명될 수 있고, 이는 예를 들면, 상기 기술된 바와 같이 항-EGFR 항체를 이용하여 검출될 수 있다. 본 발명의 항체, 예를 들면, AbA, 또는 이의 항원 결합 단편으로 치료될 수 있는 장애의 비-제한적 예로는 하기 논의되는 장애들이 포함된다. 예를 들면, 적합한 장애로는 이들에 한정되는 것은 아니지만 유방암, 폐암, 신경교종, 전립선암, 췌장암, 결장암, 두경부암, 및 신장암을 포함하는 각종 암이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 본원에 개시된 조성물 및 방법을 이용하여 치료될 수 있는 암의 다른 예로는 편평 세포 암종(예를 들면, 편평 폐암 또는 편평 두경부암), 삼중 음성 유방암, 비-소세포 폐암, 결장직장암, 및 중피종이 포함된다. 한 실시형태에서, 본원에 개시된 항체 및 ADC는 EGFR을 과발현하거나 EGFR 양성인 고형 종양을 치료하기 위해, 예를 들면, 고형 종양의 성장을 억제하거나 이의 크기를 감소시키기 위해 사용된다. 한 실시형태에서, 본 발명은 EGFR 증폭된 편평 폐암의 치료에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 본원에 개시된 항체 및 ADC는 EGFR 증폭된 편평 두경부암을 치료하기 위해 사용된다. 다른 실시형태에서, 본원에 개시된 항체 및 ADC는 삼중 음성 유방암(TNBC)을 치료하기 위해 사용된다. 본원에 기술된 질환 및 장애는 본 발명의 항-EGFR 항체 또는 ADC, 및 이러한 항-EGFR 항체 또는 ADC를 포함하는 약제학적 조성물에 의해 치료될 수 있다.
소정 실시형태에서, 상승된 수준의 표피 성장 인자 수용체(EGFR)를 나타내는 경향이 있는 진행 고형 종양 유형을 치료하기 위해 치료를 필요로 하는 대상체에게 본원에 개시된 항체 및 ADC를 투여한다. 이러한 종양의 예로는 두경부 편평 세포 암종, 비-소세포 폐암, 삼중 음성 유방암, 결장직장 암종, 및 다형 교모세포종이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
소정 실시형태에서, 본 발명은 고형 종양을 갖는 대상체에서의 고형 종양 성장을 억제하거나 감소시키는 방법을 포함하고, 상기 방법은 상기 고형 종양을 갖는 대상체에게 본원에 기술된 항-EGFR 항체 또는 ADC를 투여하여 고형 종양 성장이 억제되거나 감소되도록 하는 것을 포함한다. 소정 실시형태에서, 고형 종양은 비-소세포 폐 암종 또는 교모세포종이다. 추가의 실시형태에서, 고형 종양은 EGFRvIII 양성 종양 또는 EGFR-발현 고형 종양이다. 추가의 실시형태에서, 고형 종양은 EGFR 증폭된 고형 종양 또는 EGFR 과발현 고형 종양이다. 소정 실시형태에서, 본원에 기술된 항-EGFR 항체 또는 ADC를 다형 교모세포종을 갖는 대상체에게 단독으로 또는 추가의 제제, 예를 들면, 방사선 및/또는 테모졸로미드와 병용하여 투여한다.
소정 실시형태에서, 본 발명은 EGFR 발현 또는 EGFR 과발현 종양(또는 EGFRvIII 발현 종양)으로서 확인된 고형 종양을 갖는 대상체에서의 고형 종양 성장을 억제하거나 감소시키는 방법을 포함하고, 상기 방법은 상기 고형 종양을 갖는 대상체에게 본원에 기술된 항-EGFR 항체 또는 ADC를 투여하여 고형 종양 성장이 억제되거나 감소되도록 하는 것을 포함한다. EGFR 발현 종양(예를 들면, EGFR 과발현 종양)을 확인하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 이로는 FDA-승인된 시험 및 타당성 검정(validation assay)이 포함된다. 예를 들면, EGFR pharmDx™ 검정(Dako North America, Inc.)은 조직학적 평가를 위해 일상적으로-고정된 정상 및 신생물 조직에서의 EGFR 발현을 확인하기 위해 사용되는 질적 면역조직화학적(IHC) 키트 시스템이다. EGFR pharmaDx는 EGFR-발현 세포에서의 EGFR (HER1) 단백질을 특이적으로 검출한다. 또한, PCR-기반 검정도 EGFR 과발현 종양을 확인하기 위해 사용할 수 있다. 예를 들면, 이들 검정은 변이체 EGFR 유전자(예를 들면, 서열번호 33) 및/또는 cDNA에 대해 특이적이고 EGFR 유전자/cDNA 또는 이들의 부분의 증폭을 초래하는 프라이머를 사용할 수 있다. 증폭된 PCR 생성물은 후속적으로 예를 들면, 당해 분야에 공지되어 있는 표준 방법을 이용한 겔 전기영동에 의해 분석하여 PCR 생성물의 크기를 측정할 수 있다. 이러한 시험들을 사용하여 본원에 기술된 방법 및 조성물로 치료될 수 있는 종양을 확인할 수 있다.
당해 분야에서 이용가능한 유전자 치료요법을 위한 방법들 중 임의의 방법을 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 유전자 치료요법의 방법의 일반적 검토를 위해, 문헌[Goldspiel et al., 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, Science 260:926- 932 (1993); 및 Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; May, 1993, TIBTECH 11(5):155-215]을 참조한다. 사용될 수 있는 재조합 DNA 기술의 당해 분야에 익히 공지되어 있는 방법은 문헌[Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, NY (1993); 및 Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)]에 기술되어 있다. 유전자 치료요법의 각종 방법들의 상세한 설명은 본원에 인용에 의해 포함되는 US20050042664 A1에 제공된다.
다른 양상에서, 본 출원은 대상체에서의 EGFR-관련 장애를 치료하거나 예방하는(예를 들면, EGFR-관련 장애의 개시를 치유하거나, 억제하거나, 개선하거나, 지연시키거나, 예방하거나, 또는 EGFR-관련 장애의 재현 또는 재발을 예방하는) 방법을 특징으로 한다. 당해 방법은 대상체에게 EGFR 결합제(특히 길항제), 예를 들면, 본원에 기술되는 항-EGFR 항체 또는 이의 단편을 EGFR-관련 장애를 치료하거나 예방하는데 충분한 양으로 투여하는 것을 포함한다. EGFR 길항제, 예를 들면, 항-EGFR 항체 또는 이의 단편은 대상체에게 단독으로 또는 본원에 기술되는 다른 치료학적 양식과 병용하여 투여할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 ADC, 또는 이들의 항원 결합부는 이러한 질환을 치료하기 위해 단독으로 또는 병용하여 사용될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부는 단독으로 또는 이의 의도된 목적을 위해 당해 분야 숙련가에 의해 선택되는 추가의 제제, 예를 들면, 치료학적 제제와 병용하여 사용할 수 있음을 이해해야만 한다. 예를 들면, 추가의 제제는 본 발명의 항체에 의해 치료되는 질환 또는 병태를 치료하는데 유용한 것으로 당해 분야에 인식되어 있는 치료학적 제제일 수 있다. 추가의 제제는 또한 치료학적 조성물에 이로운 속성을 부여하는 제제, 예를 들면, 상기 조성물의 점도에 영향을 미치는 제제일 수 있다.
본 발명 내에 포함되는 병용물은 이들의 목적에 유용한 병용물임이 추가로 이해되어야만 한다. 하기에 제시되는 제제들은 본 발명의 목적을 위한 예시이고, 한정되는 것으로 의도되지 않는다. 본 발명의 일부인 병용물은 본 발명의 항체 및 하기 목록으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가의 제제일 수 있다. 또한, 병용물이, 제조된 조성물이 이의 의도된 기능을 수행할 수 있도록 이루어진 경우 상기 병용물은 1개 초과의 추가의 제제, 예를 들면, 2개 또는 3개의 추가의 제제를 포함할 수 있다.
병용 치료요법은, 본원에 더 기술되는 바와 같이, 하나 이상의 추가의 치료학적 제제, 예를 들면, 하나 이상의 사이토카인 및 성장 인자 억제제, 면역억제제, 소염제(예를 들면, 전신적 소염제), 항-섬유화제, 대사 억제제, 효소 억제제 및/또는 세포독성 또는 세포분열 정지제, 유사분열 억제제, 항종양 항생제, 면역조절제, 유전자 치료요법을 위한 벡터, 알킬화제, 항혈관신생제, 항대사물질, 붕소-함유제, 화학물질 보호제, 호르몬, 항호르몬제, 코르티코스테로이드, 광활성 치료학적 제제, 올리고뉴클레오타이드, 방사성 핵종 제제, 토포이소머라제 억제제, 티로신 키나제 억제제, 또는 방사선 증감제와 함께 제형화되고/되거나, 이들과 함께 동시-투여되는, 하나 이상의 EGFR 길항제, 예를 들면, 항-EGFR 항체 또는 이의 단편을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에 기술되는 항-EGFR 결합 단백질, 예를 들면, 항-EGFR 항체는 항암제 또는 항신생물제와 병용하여 사용된다. 용어 "항암제" 및 "항신생물제"는 암성 성장과 같은 악성 종양을 치료하는데 사용되는 약물을 말한다. 약물 치료요법은 단독으로 또는 수술 또는 방사선 치료요법과 같은 다른 치료와 병용하여 사용될 수 있다. 몇몇 클래스의 약물들은 관련된 장기의 성질에 따라 암 치료에 사용될 수 있다. 예를 들면, 유방암은 흔히 에스트로겐에 의해 자극되고, 성 호르몬을 불활성화시키는 약물로 치료할 수 있다. 유사하게, 전립선암은 남성 성 호르몬인 안드로겐을 불활성화시키는 약물로 치료할 수 있다. 본 발명의 항-EGFR 항체 또는 ADC과 함께 사용할 수 있는 항암제로는 특히 하기 제제들이 포함된다.
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상기 항암제에 추가하여, 본원에 기술된 항-EGFR 항체 및 ADC는 섹션 II에 기술된 제제들과 병용하여 투여할 수 있다. 추가로, 상기 언급된 항암제는 또한 본 발명의 ADC에 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 상기 항-EGFR 항체 또는 ADC는 단독으로, 또는 EGFR 활성과 관련된 질환을 치료하기 위한 항체와 함께 또는 이러한 항체와 함께 상승작용적으로 작용하는 다른 항암제와 함께 투여할 수 있다. 이러한 항암제로는 예를 들면, 당해 분야에 익히 공지되어 있는 제제들(예를 들면, 세포독소, 화학치료학적 제제, 소분자 및 방사선)이 포함된다. 항암제의 예로는 파노렉스(Glaxo-Welcome), 리툭산(IDEC/Genentech/Hoffman la Roche), 마일로타그(Wyeth), 캄파트(Millennium), 제발린(IDEC and Schering AG), 벡사르(Corixa/GSK), 에르비툭스(Imclone/BMS), 아바스틴(Genentech) 및 헤르셉틴(Genentech/Hoffman la Roche)이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 다른 항암제로는 U.S. 특허 제7,598,028호 및 국제 공보 제WO2008/100624호[상기 문헌의 내용은 본원에 인용에 의해 포함된다]에 개시된 것들이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 하나 이상의 항암제는 본 발명의 항체 또는 항원 결합부의 투여와 동시에 또는 이의 투여 전에 또는 이의 투여 후에 투여될 수 있다.
본 발명의 특정 실시형태에서, 본원에 기술된 항-EGFR 항체 또는 ADC는 대상체에서의 백혈병과 같은 암을 치료하기 위해 아폽토시스성 제제, 예를 들면, bcl-xl 억제제 또는 Bcl-2(B-세포 림프종 2) 억제제(예를 들면, ABT-199(베네토클락스))와의 병용 치료요법에 사용할 수 있다. 한 실시형태에서, 본원에 기술된 항-EGFR 항체 또는 ADC는 암을 치료하기 위해 bcl-xl 억제제와의 병용 치료요법에 사용할 수 있다. 한 실시형태에서, 본원에 기술된 항-EGFR 항체 또는 ADC는 암을 치료하기 위해 베네토클락스와의 병용 치료요법에 사용할 수 있다.
본 발명의 특정 실시형태에서, 본원에 기술된 항-EGFR 항체 또는 ADC는 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하기 위해 NAMPT의 억제제(본원에 인용에 의해 포함되는 US 2013/0303509; AbbVie, Inc.의 억제제의 예를 참조한다)와의 병용 치료요법에 사용할 수 있다. MAMPT(전(pre)-B-세포-콜로니-향상 인자(PBEF) 및 비스파틴으로서도 공지되어 있음)는 니코틴아미드의 포스포리보실화를 촉진시키는 효소이고, NAD를 회복하는 2개의 경로 중 하나에서 속도-제한 효소이다. 본 발명의 한 실시형태에서, 본원에 기술된 항-EGFR 항체 및 ADC는 대상체에서의 암의 치료를 위해 NAMPT 억제제와 병용하여 투여한다.
본 발명의 특정 실시형태에서, 본원에 기술된 항-EGFR 항체 또는 ADC는, 토포이소머라제 억제제 이리노테칸의 활성 대사물질인 SN-38과의 병용 치료요법에 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 본원에 기술된 항-EGFR 항체 또는 ADC는, 유방암, 난소암 및 비-소세포 폐암을 포함하는 암을 치료하기 위해 PARP(폴리 ADP 리보스 폴리머라제) 억제제, 예를 들면, 벨리파립과의 병용 치료요법에 사용할 수 있다.
본원에 기술된 항-EGFR 항체 또는 항-EGFR ADC와 동시-투여되고/되거나 제형화될 수 있는 추가의 치료학적 제제의 추가의 예로는 흡입형 스테로이드; 베타-효능제, 예를 들면, 단기-작용성 또는 장기-작용성 베타-효능제; 류코트리엔 또는 류코트리엔 수용체의 길항제; ADVAIR과 같은 병용 약물; IgE 억제제, 예를 들면, 항-IgE 항체(예를 들면, XOLAIR®, 오말리주맙); 포스포디에스테라제 억제제(예를 들면, PDE4 억제제); 크산틴; 항콜린성 약물; 거세포-안정화제, 예를 들면, 크로몰린; IL-4 억제제; IL-5 억제제; 에오탁신/CCR3 억제제; H1, H2, H3 및 H4를 포함하는 히스타민 또는 이의 수용체의 길항제, 및 프로스타글란딘 D 또는 이의 수용체의 길항제(DP1 및 CRTH2) 중 하나 이상이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 이러한 병용물은 예를 들면, 천신 및 기타 호흡기 장애를 치료하기 위해 사용할 수 있다. 본원에 기술된 항-EGFR 항체 또는 항 EGFR ADC와 동시-투여되고/되거나 이와 함께 제형화될 수 있는 추가의 치료학적 제제의 기타 예로는 테모졸로미드, 이브루티닙,두벨리십, 및 이델랄리십 중 하나 이상이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 하나 이상의 항-EGFR 항체 또는 이의 단편과 동시-투여되고/되거나 이와 함께 제형화될 수 있는 치료학적 제제의 추가의 예로는 특히 TNF 길항제(예를 들면, TNF 수용체의 가용성 단편, 예를 들면, p55 또는 p75 사람 TNF 수용체 또는 이의 유도체, 예를 들면, 75kD TNFR-IgG(75kD TNF 수용체-IgG 융합 단백질, ENBREL)); TNF 효소 길항제, 예를 들면, TNF 전환 효소(TACE) 억제제; 무스카린 수용체 길항제; TGF-베타 길항제; 인터페론 감마; 페르페니돈; 화학치료학적 제제, 예를 들면, 메토트렉세이트, 레플루노미드, 또는 시롤리무스(라파르나이신) 또는 이들의 유사체, 예를 들면, CCI-779; COX2 및 cPLA2 억제제; NSAID; 면역조절제; p38 억제제, TPL-2, MK-2 및 NFkB 억제제 중 하나 이상이 포함된다.
다른 바람직한 병용물은 사이토카인 억제성 소염성 약물(들)(CSAID); 다른 사람 사이토카인 또는 성장 인자, 예를 들면, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, IL-21, IL-31, 인터페론, EMAP-II, GM-CSF, FGF, EGF, PDGF, 및 엔도텔린-1에 대한 항체 또는 이들의 길항제, 및 이들 사이토카인 및 성장 인자들의 수용체이다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부는 CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80(B7.1), CD86(B7.2), CD90, CTLA, CTLA-4, PD-1, 또는 CD154를 포함하는 이들의 리간드들(gp39 또는 CD40L)과 같은 세포 표면 분자에 대한 항체와 병용할 수 있다.
치료학적 제제의 바람직한 병용물은 염증 캐스케이드의 상이한 시점에서 간섭할 수 있고; 이의 바람직한 예로는 키메라, 사람화된 또는 사람 TNF 항체와 같은 TNF 길항제, 아달리무맙, (HUMIRA; D2E7; 본원에 인용에 의해 포함되는 PCT 공보 제WO 97/29131호 및 U.S. 특허 제6,090,382호), CA2(Remicade™), CDP 571, 및 가용성 p55 또는 p75 TNF 수용체, 이의 유도체, (p75TNFR1gG(Enbrel™) 또는 p55TNFR1gG(Lenercept)이 포함되고, 또한 TNF 전환 효소(TACE) 억제제; 유사하게는 IL-1 억제제(인터류킨-1-전환 효소 억제제, IL-1RA 등)는 동일한 이유로 효과적일 수 있다. 다른 바람직한 병용물은 인터류킨 4를 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 "치료학적 유효량" 또는 "예방학적 유효량"의 본 발명의 항체 또는 항체부를 포함할 수 있다. "치료학적 유효량"은 원하는 치료학적 결과를 달성하기 위해 필요한 용량에서 그리고 시간 동안 유효한 양을 말한다. 항체 또는 항체부의 치료학적 유효량은 당해 분야 숙련가에 의해 결정될 수 있고, 개체의 질환 상태, 연령, 성별, 및 체중과 같은 인자들, 및 개체에서 원하는 반응을 유발하는 항체 또는 항체부의 능력에 따라 다를 수 있다. 치료학적 유효량은 또한 치료학적으로 이로운 효과가 항체 또는 항체부의 임의의 독성 또는 유해 효과보다 더 많은 것이다. "예방학적 유효량"은 원하는 예방학적 결과를 달성하기 위해 필요한 용량에서 그리고 시간 동안 유효한 양을 말한다. 전형적으로, 예방학적 용량은 질환의 초기 병기 전의 또는 초기 병기의 대상체에게 사용되므로, 예방학적 유효량은 치료학적 유효량보다 적을 것이다.
투약 용법은 최적의 원하는 반응(예를 들면, 치료학적 또는 예방학적 반응)을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들면, 단일 볼루스를 투여할 수 있거나, 몇몇의 분할 용량을 시간 경과에 따라 투여할 수 있거나, 용량은 치료학적 상황의 긴급함(exigency)에 의해 나타내어지는 바와 같이 비례하게 감소되거나 증가될 수 있다. 투여의 용이성 및 용량의 균일성을 위해 비경구 조성물을 단위 제형(dosage unit form)으로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용되는 단위 제형은 치료될 포유동물 대상체에 대해 단일 용량(unitary dosage)으로서 적합한 물리적으로 별개의 단위를 말하고; 각각의 단위는 요구되는 약제학적 담체와 함께 원하는 치료학적 효과를 생성시키는 것으로 계산된 소정 양의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 단위 제형에 관한 설명은 (a) 활성 화합물의 고유한 특성 및 달성될 특정 치료학적 또는 예방학적 효과, 및 (b) 개체에서의 민감성의 치료를 위한 이러한 활성 화합물을 합성하는 분야에 내재하는 제한에 의해 기술되고, 이들에 직접 의존한다.
본 발명의 ADC, 항체 또는 항체부의 치료학적 또는 예방학적 유효량에 관한 예시의 비-제한적 범위는 0.1 내지 20mg/kg, 보다 바람직하게는 1 내지 10mg/kg이다. 한 실시형태에서, 본원에 기술된 항체 및 ADC의 용량은 1 내지 6mg/kg이고, 그 안에 인용된 개별 용량들, 예를 들면, 1mg/kg, 2mg/kg, 3mg/kg, 4mg/kg, 5mg/kg 및 6mg/kg이 포함된다. 다른 실시형태에서, 본원에 기술된 항체 및 ADC의 용량은 1 내지 200㎍/kg이고, 그 안에 인용된 개별 용량들, 예를 들면, 1㎍/kg, 2㎍/kg, 3㎍/kg, 4㎍/kg, 5㎍/kg, 10㎍/kg, 20㎍/kg, 30㎍/kg, 40㎍/kg, 50㎍/kg, 60㎍/kg, 80㎍/kg, 100㎍/kg, 120㎍/kg, 140㎍/kg, 160㎍/kg, 180㎍/kg 및 200㎍/kg이 포함된다. 용량 값은 완화될 병태의 유형 및 중증도에 따라 다를 수 있음에 주의해야만 한다. 임의의 특정 대상체의 경우, 특정 투약 용법은 개체의 요구 및 조성물을 투여하거나 조성물의 투여를 감시하는 사람의 전문적 판단에 따라 시간 경과에 따라 조정되어야만 함, 그리고, 본원에 제시된 용량 범위는 단지 예시이고 청구되는 조성물의 범위 또는 실행을 한정하는 것으로 의도되지 않음이 추가로 이해되어야만 한다.
한 실시형태에서, 본원에 기술된 항-EGFR 항체, 예를 들면, AbA, 또는 이의 항원 결합부는 이를 필요로 하는 대상체, 예를 들면, 암을 갖는 대상체에게 0.1 내지 30mg/kg의 용량으로의 ADC로서 투여된다. 다른 실시형태에서, 항-EGFR 항체, 예를 들면, AbA, 또는 이의 항원 결합부는 이를 필요로 하는 대상체, 예를 들면, 암을 갖는 대상체에게 1 내지 15mg/kg의 용량으로의 ADC로서 투여된다. 다른 실시형태에서, 항-EGFR 항체, 예를 들면, AbA, 또는 이의 항원 결합부는 이를 필요로 하는 대상체, 예를 들면, 암을 갖는 대상체에게 1 내지 10mg/kg의 용량으로의 ADC로서 투여된다. 다른 실시형태에서, 항-EGFR 항체, 예를 들면, AbA, 또는 이의 항원 결합부는 이를 필요로 하는 대상체, 예를 들면, 암을 갖는 대상체에게 2 내지 3mg/kg의 용량으로의 ADC로서 투여된다. 다른 실시형태에서, 항-EGFR 항체, 예를 들면, AbA, 또는 이의 항원 결합부는 이를 필요로 하는 대상체, 예를 들면, 암을 갖는 대상체에게 1 내지 4mg/kg의 용량으로의 ADC로서 투여된다.
한 실시형태에서, 본원에 기술된 항-EGFR 항체, 예를 들면, AbA, 또는 이의 항원 결합부는 이를 필요로 하는 대상체, 예를 들면, 암을 갖는 대상체에게 1 내지 200㎍/kg의 용량으로의 ADC로서 투여된다. 다른 실시형태에서, 항-EGFR 항체, 예를 들면, AbA, 또는 이의 항원 결합부는 이를 필요로 하는 대상체, 예를 들면, 암을 갖는 대상체에게 5 내지 150㎍/kg의 용량으로의 ADC로서 투여된다. 다른 실시형태에서, 항-EGFR 항체, 예를 들면, AbA, 또는 이의 항원 결합부는 이를 필요로 하는 대상체, 예를 들면, 암을 갖는 대상체에게 5 내지 100㎍/kg의 용량으로의 ADC로서 투여된다. 다른 실시형태에서, 항-EGFR 항체, 예를 들면, AbA, 또는 이의 항원 결합부는 이를 필요로 하는 대상체, 예를 들면, 암을 갖는 대상체에게 5 내지 90㎍/kg의 용량으로의 ADC로서 투여된다. 다른 실시형태에서, 항-EGFR 항체, 예를 들면, AbA, 또는 이의 항원 결합부는 이를 필요로 하는 대상체, 예를 들면, 암을 갖는 대상체에게 5 내지 80㎍/kg의 용량으로의 ADC로서 투여된다. 다른 실시형태에서, 항-EGFR 항체, 예를 들면, AbA, 또는 이의 항원 결합부는 이를 필요로 하는 대상체, 예를 들면, 암을 갖는 대상체에게 5 내지 70㎍/kg의 용량으로의 ADC로서 투여된다. 다른 실시형태에서, 항-EGFR 항체, 예를 들면, AbA, 또는 이의 항원 결합부는 이를 필요로 하는 대상체, 예를 들면, 암을 갖는 대상체에게 5 내지 60㎍/kg의 용량으로의 ADC로서 투여된다. 다른 실시형태에서, 항-EGFR 항체, 예를 들면, AbA, 또는 이의 항원 결합부는 이를 필요로 하는 대상체, 예를 들면, 암을 갖는 대상체에게 10 내지 80㎍/kg의 용량으로의 ADC로서 투여된다.
한 실시형태에서, 본원에 기술된 항-EGFR ADC, 예를 들면, AbA-vc-MMAE는 이를 필요로 하는 대상체, 예를 들면, 암을 갖는 대상체에게 0.1 내지 6mg/kg의 용량으로 투여된다. 다른 실시형태에서, 본원에 기술된 항-EGFR ADC, 예를 들면, AbA-vc-MMAE는 이를 필요로 하는 대상체, 예를 들면, 암을 갖는 대상체에게 0.5 내지 4mg/kg의 용량으로 투여된다. 다른 실시형태에서, 본원에 기술된 항-EGFR ADC, 예를 들면, AbA-vc-MMAE는 이를 필요로 하는 대상체, 예를 들면, 암을 갖는 대상체에게 1.8 내지 2.4mg/kg의 용량으로 투여된다. 다른 실시형태에서, 본원에 기술된 항-EGFR ADC, 예를 들면, AbA-vc-MMAE는 이를 필요로 하는 대상체, 예를 들면, 암을 갖는 대상체에게 1 내지 4mg/kg의 용량으로 투여된다. 다른 실시형태에서, 본원에 기술된 항-EGFR ADC, 예를 들면, AbA-vc-MMAE는 이를 필요로 하는 대상체, 예를 들면, 암을 갖는 대상체에게 약 1mg/kg의 용량으로 투여된다. 다른 실시형태에서, 본원에 기술된 항-EGFR ADC, 예를 들면, AbA-vc-MMAE는 이를 필요로 하는 대상체, 예를 들면, 암을 갖는 대상체에게 3 내지 6mg/kg의 용량으로 투여된다. 다른 실시형태에서, 본원에 기술된 항-EGFR ADC, 예를 들면, AbA-vc-MMAE는 이를 필요로 하는 대상체, 예를 들면, 암을 갖는 대상체에게 3mg/kg의 용량으로 투여된다. 다른 실시형태에서, 본원에 기술된 항-EGFR ADC, 예를 들면, AbA-vc-MMAE는 이를 필요로 하는 대상체, 예를 들면, 암을 갖는 대상체에게 2 내지 3mg/kg의 용량으로 투여된다. 다른 실시형태에서, 본원에 기술된 항-EGFR ADC, 예를 들면, AbA-vc-MMAE는 이를 필요로 하는 대상체, 예를 들면, 암을 갖는 대상체에게 6mg/kg의 용량으로 투여된다.
다른 실시형태에서, 약물, 예를 들면, PBD에 접합된 본원에 기술된 항-EGFR 항체(ADC)는 이를 필요로 하는 대상체, 예를 들면, 암을 갖는 대상체에게 1 내지 200㎍/kg의 용량으로 투여된다. 다른 실시형태에서, 본원에 기술된 항-EGFR ADC는 이를 필요로 하는 대상체, 예를 들면, 암을 갖는 대상체에게 5 내지 100㎍/kg의 용량으로 투여된다. 다른 실시형태에서, 본원에 기술된 항-EGFR ADC는 이를 필요로 하는 대상체, 예를 들면, 암을 갖는 대상체에게 5 내지 90㎍/kg의 용량으로 투여된다. 다른 실시형태에서, 본원에 기술된 항-EGFR ADC는 이를 필요로 하는 대상체, 예를 들면, 암을 갖는 대상체에게 5 내지 80㎍/kg의 용량으로 투여된다. 다른 실시형태에서, 본원에 기술된 항-EGFR ADC는 이를 필요로 하는 대상체, 예를 들면, 암을 갖는 대상체에게 5 내지 70㎍/kg의 용량으로 투여된다. 다른 실시형태에서, 본원에 기술된 항-EGFR ADC는 이를 필요로 하는 대상체, 예를 들면, 암을 갖는 대상체에게 5 내지 60㎍/kg의 용량으로 투여된다.
상기 기술된 용량들은 본원에 개시된 항-EGFR ADC 또는 항체의 투여에 유용할 수 있다.
다른 양상에서, 본 출원은 시험관내 샘플(예를 들면, 혈청, 혈장, 조직, 생검과 같은 생물학적 샘플) 중의 EGFR의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 대상 방법은 장애, 예를 들면, 암을 진단하는데 사용할 수 있다. 당해 방법은 (i) 샘플 또는 대조군 샘플을 본원에 기술된 항-EGFR 항체 또는 이의 단편과 접촉시키는 것; 및 (ii) 상기 항-EGFR 항체 또는 이의 단편과 상기 샘플 또는 대조군 샘플 사이의 복합체 형성을 검출하는 것을 포함하고, 여기서, 대조군 샘플에 비하여 상기 샘플 중의 복합체의 형성시 통계학적으로 유의한 변화는 샘플 중의 EGFR의 존재의 지표이다.
사람 EGFR에 결합하는 이들의 능력을 고려하면, 본 발명의 항-사람 EGFR 항체 또는 이의 부분(및 이들의 ADC)은 종래 면역검정, 예를 들면, 효소 링크된 면역흡착 검정(ELISA), 방사선 면역검정(RIA) 또는 조직 면역조직화학을 이용하여 (예를 들면, 혈청 또는 혈장과 같은 생물학적 샘플 중의) 사람 EGFR을 검출하는데 사용할 수 있다. 한 양상에서, 본 발명은, 생물학적 샘플을 본 발명의 항체 또는 항체부와 접촉시키고, 사람 EGFR에 결합된 항체(또는 항체부) 또는 결합되지 않은 항체(또는 항체부)를 검출하여 생물학적 샘플 중의 사람 EGFR을 검출함을 포함하는, 생물학적 샘플 중의 사람 EGFR을 검출하는 방법을 제공한다. 항체는 검출가능한 물질로 직접적으로 또는 간접적으로 표지하여 결합되거나 결합되지 않은 항체의 검출을 가능하게 한다. 적합한 검출가능한 물질로는 각종 효소, 보결분자단, 형광성 물질, 발광성 물질 및 방사성 물질이 포함된다. 적합한 효소의 예로는 서양 고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스테라제가 포함되고; 적합한 보결분자단 복합체의 예로는 스트렙트아비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴이 포함되고; 적합한 형광성 물질의 예로는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린이 포함되고; 발광성 물질의 예로는 루미놀이 포함되고; 적합한 방사성 물질의 예로는 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho, 또는 153Sm가 포함된다.
항체를 표지하는 것의 대안으로, 검출가능한 물질로 표지된 rhEGFR 가닥 및 표지되지 않은 항-사람 EGFR 항체를 이용한 경쟁적 면역검정에 의해 생물학적 체액 중의 사람 EGFR을 검정할 수 있다. 이러한 검정에서, 생물학적 샘플, 표지된 rhEGFR 가닥 및 항-사람 EGFR 항체를 합하고, 표지되지 않은 항체에 결합된 표지된 rhEGFR 가닥의 양을 측정한다. 생물학적 샘플 중의 사람 EGFR의 양은 항-EGFR 항체에 결합된 표지된 rhEGFR 가닥의 양에 반비례한다. 유사하게, 검출가능한 물질로 표지된 rhEGFR 및 표지되지 않은 항-사람 EGFR 항체를 이용한 경쟁 면역검정에 의해 생물학적 유체 중의 사람 EGFR도 검정할 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 출원은 생체내 EGFR의 존재를 검출하는 방법(예를 들면, 대상체의 생체내 영상화)을 제공한다. 대상 방법은 장애, 예를 들면, EGFR-관련 장애를 진단하는데 사용할 수 있다. 당해 방법은 (i) EGFR에의 항-EGFR 항체 또는 이의 단편의 결합을 가능하게 하는 조건 하에 대상체 또는 대조군 대상체에게 본원에 기술된 항-EGFR 항체 또는 이의 단편을 투여하는 것; 및 (ii) 상기 항-EGFR 항체 또는 이의 단편과 EGFR 사이의 복합체 형성을 검출하는 것을 포함하고, 여기서, 대조군 대상체에 비하여 상기 대상체의 복합체의 형성시 통계학적으로 유의한 변화는 샘플 중의 EGFR의 존재의 지표이다.
VI. 약제학적 조성물
본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부, 또는 ADC, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 항체 또는 ADC를 포함하는 약제학적 조성물은 장애를 진단하거나, 검출하거나, 모니터링하는데, 장애 또는 이의 하나 이상의 증상을 예방하거나, 치료하거나, 관리하거나, 개선시키는데, 그리고/또는 연구에 사용하기 위한 것이지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 특정 실시형태에서, 조성물은 하나 이상의 본 발명의 항체를 포함한다. 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은, EGFR 활성이 유해한 장애를 치료하기 위해, 하나 이상의 본 발명의 항체 또는 ADC 및 본 발명의 항체 또는 ADC 이외의 다른 하나 이상의 예방학적 또는 치료학적 제제를 포함한다. 바람직하게, 유용한 것으로 공지되어 있거나 장애 또는 이의 하나 이상의 증상의 예방, 치료, 관리 또는 개선에 사용되어 왔거나 현재 본 발명에서 사용되고 있는 예방학적 또는 치료학적 제제. 이들 실시형태에 따르면, 상기 조성물은 담체, 희석제 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 및 항체-부 또는 ADC는 대상체에게의 투여에 적합한 약제학적 조성물에 포함될 수 있다. 전형적으로, 약제학적 조성물은 본 발명의 항체 또는 항체부 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본원에 사용되는 "약제학적으로 허용되는 담체"로는 생리학적으로 적합한 임의의 그리고 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장성 제제 및 흡수 지연제 등이 포함된다. 약제학적으로 허용되는 담체의 예로는 물, 염수, 포스페이트 완충 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 및 에탄올 등, 및 이들의 조합물 중 하나 이상이 포함된다. 다수의 경우, 상기 조성물에 등장성 제제, 예를 들면, 당류, 폴리알콜, 예를 들면, 만니톨, 소르비톨 또는 염화 나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 약제학적으로 허용되는 담체는 미량의 보조제 물질, 예를 들면, 습윤제 또는 유화제, 보존제 또는 완충제를 추가로 포함할 수 있고, 이는 항체 또는 항체부 또는 ADC의 유통 기한 또는 유효성을 향상시킨다.
한 실시형태에서, 본 발명은 항-EGFR 항체 약물 접합체, 슈크로스, 폴리소르베이트 80, 및 히스티딘을 포함하는 감압 동결건조된 제형을 특징으로 하고, 여기서, 상기 제형은 약 5 내지 7의 pH를 갖고, 여기서, 상기 항-EGFR 항체 약물 접합체는, 모노메틸아우리스타틴 E(MMAE)에 접합된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함한다. 한 실시형태에서, 본 발명은, 아우리스타틴, 예를 들면, MMAE에 접합된, 본원에 기술된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합부를 포함하는 항-EGFR ADC, 당, 예를 들면, 슈크로스, 계면활성제, 예를 들면, 폴리소르베이트, 예를 들면, 폴리소르베이트 80, 및 히스티딘을 포함하는 감압 동결건조된 제형을 추가로 제공한다. 한 실시형태에서, 감압 동결건조된 제형은 1 내지 20mg의 히스티딘, 약 320 내지 410mg의 당, 약 0.1mg 내지 0.9mg의 계면활성제, 및 약 1 내지 150mg의, 아우리스타틴, 예를 들면, MMAE에 접합된, 본원에 기술된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 항-EGFR ADC를 포함한다. 본 발명은 또한, 약 1 내지 100mg/ml의, 아우리스타틴, 예를 들면, MMAE에 접합된, 본원에 기술된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 항-EGFR ADC, 약 1 내지 10mg/mL의 히스티딘, 약 50 내지 90mg/ml의 당, 예를 들면, 슈크로스, 및 약 0.01 내지 0.2mg/ml의 계면활성제, 예를 들면, 폴리소르베이트 80을 포함하는, 수성 제형을 제공한다.
각종 전달 시스템이 공지되어 있고, 이는 본 발명의 하나 이상의 항체 또는 ADC 또는 본 발명의 하나 이상의 항체들의 조합물 및 장애 또는 이의 하나 이상의 증상을 예방하거나, 관리하거나, 치료하거나, 개선시키는데 유용한 예방학적 제제 또는 치료학적 제제를 투여하는데 사용될 수 있고, 예를 들면, 리포솜 내 캡슐화, 미립자, 미세캡슐, 항체 또는 항체 단편을 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체-매개된 세포내이입(endocytosis)(예를 들면, 문헌[Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)]을 참조한다), 레트로바이러스 또는 다른 벡터의 일부로서의 핵산의 작제 등이다. 본 발명의 예방학적 또는 치료학적 제제의 투여 방법으로는 비경구 투여(예를 들면, 피내, 근육내, 복강내, 정맥내 및 피하), 경막외 투여, 종양내 투여, 및 점막 투여(예를 들면, 비강내 및 경구 경로)가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 또한, 폐 투여는 흡입기 또는 네뷸라이저(nebulizer)의 사용, 및 에어로졸제로의 제형화에 의해 이용할 수 있다. 예를 들면, U.S. Pat. 제6,019,968호, 제5,985,320호, 제5,985,309호, 제5,934,272호, 제5,874,064호, 제5,855,913호, 제5,290,540호, 및 제4,880,078호; 및 PCT 공보 제WO 92/19244호, 제WO 97/32572호, 제WO 97/44013호, 제WO 98/31346호, 및 제WO 99/66903호를 참조하고, 상기 문헌의 각각은 그 전문이 본원에 인용에 의해 포함된다. 한 실시형태에서, 본 발명의 항체, 병용 치료요법 또는 본 발명의 조성물은 Alkermes AIR® 폐 약물 전달 기술(Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.)을 이용하여 투여한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 예방학적 또는 치료학적 제제는 근육내, 정맥내, 종양내, 경구, 비강내, 폐, 또는 피하 투여한다. 예방학적 또는 치료학적 제제는 임의의 편리한 경로에 의해, 예를 들면, 주입 또는 볼루스 주사에 의해, 상피 또는 점막(예를 들면, 경구 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여할 수 있고, 다른 생물학적 활성제와 함께 투여할 수 있다. 투여는 전신적이거나 국부적일 수 있다.
특정 실시형태에서, 치료를 필요로 하는 부위에 본 발명의 예방학적 또는 치료학적 제제를 국부 투여하는 것이 바람직할 수 있고; 이는 이에 한정되는 것은 아니지만 예를 들면, 국부 주입에 의해, 주사에 의해, 또는 이식물의 수단에 의해 달성될 수 있고, 상기 이식물은 시알라스틱(sialastic) 막, 중합체, 섬유성 매트릭스(예를 들면, Tissuel®) 또는 콜라겐 매트릭스를 포함하는 막 및 매트릭스를 포함하는 다공성 또는 비-다공성 재료이다. 한 실시형태에서, 장애 또는 이의 증상을 예방하고/하거나, 치료하고/하거나, 관리하고/하거나, 개선시키기 위해 본 발명의 하나 이상의 항체 길항제의 유효량을 환부에 국부적으로 투여한다. 다른 실시형태에서, 장애 또는 이의 하나 이상의 증상을 예방하고/하거나, 치료하고/하거나, 관리하고/하거나, 개선시키기 위해 대상체에게 본 발명의 하나 이상의 항체의 유효량을 본 발명의 항체 이외의 다른 하나 이상의 치료요법(예를 들면, 하나 이상의 예방학적 또는 치료학적 제제)의 유효량과 병용하여 환부에 국부 투여한다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 예방학적 또는 치료학적 제제는 제어 방출 또는 지연 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 한 실시형태에서, 펌프를 이용하여 제어 방출 또는 지연 방출을 달성할 수 있다(문헌[Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574]을 참조한다). 다른 실시형태에서, 중합체 재료를 이용하여 본 발명의 치료요법의 제어 또는 지연 방출을 달성할 수 있다(예를 들면, 문헌[Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61]을 참조하고; 또한 문헌[Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 7 1:105); U.S. Pat. 제5,679,377호; U.S. Pat. 제5,916,597호; U.S. Pat. 제5,912,015호; U.S. Pat. 제5,989,463호; U.S. Pat. 제5,128,326호; PCT 공보 제WO 99/15154호; 및 PCT 공보 제WO 99/20253호]을 참조한다). 지연된 방출 제형에 사용되는 중합체의 예로는 폴리(2-하이드록시 에틸 메타크릴레이트), 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(아크릴산), 폴리(에틸렌-코-비닐아세테이트), 폴리(메타크릴산), 폴리글리콜라이드(PLG), 다가 무수물, 폴리(N-비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알콜), 폴리아크릴아미드, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리락타이드(PLA), 폴리(락타이드-코-글리콜라이드)(PLGA), 및 폴리오르토에스테르가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 실시형태에서, 지연된 방출 제형에 사용되는 중합체는 비활성이고, 침출가능한 불순물을 포함하지 않고, 보관시 안정하고, 멸균성이고, 생체분해성이다. 또 다른 실시형태에서, 제어 또는 지연 방출 시스템은 예방학적 또는 치료학적 표적의 부근에 위치될 수 있고, 이로써 전신 용량의 분획만이 요구된다(예를 들면, 문헌[Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)]을 참조한다).
제어 방출 시스템은 문헌[Langer (1990, Science 249:1527-1533]에 의한 검토에서 논의된다. 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있는 임의의 기술을 이용하여 본 발명의 하나 이상의 치료학적 제제를 포함하는 지연 방출 제형을 생산할 수 있다. 예를 들면, 문헌[U. S. Pat. 제4,526,938호, PCT 공보 WO 91/05548, PCT 공보 제WO 96/20698호, Ning et al., 1996, "Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel," Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al., 1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397, Cleek et al., 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application," Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854, and Lam et al., 1997, "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759- 760]을 참조하고, 상기 문헌은 각각 그 전문이 본원에 인용에 의해 포함된다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물이 예방학적 또는 치료학적 제제를 암호화하는 핵산인 경우, 상기 핵산은, 이를 적절한 핵산 발현 벡터의 일부로서 작제하고, 예를 들면, 레트로바이러스 벡터의 사용에 의해 세포내가 되도록 투여함으로써(U.S. Pat. 제4,980,286호를 참조한다), 또는 직접적 주사에 의해, 또는 미립자 충격(microparticle bombardment)(예를 들면, 유전자 총; Biolistic, Dupont)의 사용에 의해, 또는 지질 또는 세포-표면 수용체 또는 형질감염제로의 코팅에 의해, 또는 핵에 진입하는 것으로 공지되어 있는 호메오박스(homeobox)-유사 펩타이드에의 링크에 이를 투여함으로써(예를 들면, 문헌[Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868]을 참조한다), 생체내 투여하여 암호화된 예방학적 또는 치료학적 제제의 발현을 촉진시킬 수 있다. 대안으로, 핵산은 세포내 도입되어, 상동성 재조합에 의한 발현을 위해 숙주 세포 DNA 내에 포함될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물을 이의 의도된 투여 경로에 적합하게 제형화한다. 투여 경로의 예로는 비경구, 예를 들면, 정맥내, 피내, 피하, 경구, 비강내(예를 들면, 흡입), 경피(예를 들면, 국소), 경점막, 및 직장 투여가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 특정 실시형태에서, 상기 조성물은 일상적 절차에 따라 사람에게의 정맥내, 피하, 근육내, 경구, 비강내 또는 국소 투여에 적합한 약제학적 조성물로서 제형화된다. 전형적으로, 정맥내 투여를 위한 조성물은 멸균 등장성 수성 완충제의 용액이다. 필요한 경우, 상기 조성물은 또한 가용화제 및 국부 마취제, 예를 들면, 리도카인을 포함하여 주사 부위에서의 통증을 경감시킬 수 있다.
본 발명의 방법이 조성물의 비강내 투여를 포함하는 경우, 상기 조성물은 에어로졸 형태, 스프레이, 미스트로 또는 점적 형태로 제형화될 수 있다. 특히, 본 발명에 따라 사용하기 위한 예방학적 또는 치료학적 제제는 적합한 추진제(예를 들면, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화 탄소 또는 기타 적합한 기체)의 사용으로, 가압 팩 또는 네뷸라이저로부터 에어로졸 스프레이 방식의 형태로 편리하게 전달될 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계측된 양을 전달하는 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 흡입기 또는 취입기에 사용하기 위한 캡슐 및 카트리지(예를 들면, 젤라틴으로 이루어짐)는 화합물 및 적합한 분말 기재, 예를 들면, 락토스 또는 전분의 분말 혼합물을 함유하여 제형화할 수 있다.
본 발명의 방법이 경구 투여를 포함하는 경우, 조성물은 정제, 캡슐제, 샤쉐트, 겔 캡, 용액, 및 현탁제 등으로 경구용으로 제형화될 수 있다. 정제 또는 캡슐제는 약제학적으로 허용되는 부형제, 예를 들면, 결합제(예를 들면, 전호화 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈, 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로스); 충전제(예를 들면, 락토스, 미세결정 셀룰로스, 또는 인산 수소 칼슘); 윤활제(예를 들면, 스테아르산 마그네슘, 탈크, 또는 실리카); 붕해제(예를 들면, 감자 전분 또는 글리콜산 나트륨 전분); 또는 습윤제(예를 들면, 황산 라우릴 나트륨)로 종래 수단에 의해 조제될 수 있다. 정제는 당해 분야에 익히 공지되어 있는 방법에 의해 코팅될 수 있다. 경구 투여를 위한 액체 조제는 용액, 시럽제 또는 현탁제의 형태를 취할 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니고, 또는 이들은 사용하기 전에 물 또는 다른 적합한 비히클과의 구성을 위한 건조 생성물로서 제시될 수 있다. 이러한 액체 조제는 약제학적으로 허용되는 첨가제, 예를 들면, 현탁제(예를 들면, 소르비톨 시럽, 셀룰로스 유도체, 또는 수소첨가된 식용 지방); 유화제(예를 들면, 레시틴 또는 아카시아); 비-수성 비히클(예를 들면, 아몬드 오일, 오일 에스테르, 에틸 알콜, 또는 분획화된 식물성 오일); 및 보존제(예를 들면, 메틸 또는 프로필-p-하이드록시벤조에이트 또는 소르브산)와 함께 종래 수단에 의해 조제될 수 있다. 상기 조제는 또한 완충염, 향미제, 착색제, 및 감미제를 적절하게 함유할 수 있다. 경구 투여를 위한 조제는 예방학적 제제 또는 치료학적 제제(들)의 서방출, 제어 방출, 또는 지연 방출에 적합하게 제형화될 수 있다.
본 발명의 방법은 예를 들면, 흡입기 또는 네뷸라이저의 사용에 의한 에어로졸제로 제형화된 조성물의 폐 투여를 포함할 수 있다. 예를 들면, 문헌[U.S. Pat. 제6,019,968호, 제5,985,320호, 제5,985,309호, 제5,934,272호, 제5,874,064호, 제5,855,913호, 제5,290,540호, 및 제4,880,078호; 및 PCT 공보 제WO 92/19244호, 제WO 97/32572호, 제WO 97/44013호, 제WO 98/31346호, 및 제WO 99/66903호]을 참조하고, 상기 문헌은 각각 이들의 전문이 본원에 인용에 의해 포함된다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체, 병용 치료요법 및/또는 본 발명의 조성물은 Alkermes AIR® 폐 약물 전달 기술(Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.)을 이용하여 투여한다.
본 발명의 방법은 주사에 의한(예를 들면, 볼루스 주사 또는 연속적 주입에 의한) 비경구 투여를 위해 제형화된 조성물의 투여를 포함할 수 있다. 주사용 제형은 첨가된 보존제와 함께 단위 제형으로(예를 들면, 앰플로 또는 다중-용량 컨테이너로) 제시될 수 있다. 상기 조성물은 현탁제, 용액 또는 유성 또는 수성 비히클 중의 유제와 같은 형태를 취할 수 있고, 제형화제, 예를 들면, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안으로, 활성 성분은 사용하기 전에 적합한 비히클(예를 들면, 멸균 발열원-불포함 물)과의 구성을 위한 분말 형태로 존재할 수 있다.
본 발명의 방법은 데포(depot) 조제로서 제형화된 조성물의 투여를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 장기 작용성 제형은 (예를 들면, 피하 또는 근육내) 이식에 의해 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 상기 조성물은 적합한 중합체성 또는 소수성 재료(예를 들면, 허용되는 오일 중의 유제로서) 또는 이온 교환 수지와 함께, 또는 난용성 유도체로서(예를 들면, 난용성 염으로서) 제형화될 수 있다.
본 발명의 방법은 중성 또는 염 형태로서 제형화된 조성물의 투여를 포함한다. 약제학적으로 허용되는 염으로는 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유도된 것과 같은 음이온으로 이루어진 것들, 및 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화 철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유도된 것과 같은 양이온으로 이루어진 것들이 포함된다.
일반적으로, 조성물의 성분은 별도로 공급되거나, 단위 제형에, 예를 들면, 활성제를 양을 표시하는 앰플 또는 샤쉐트와 같은 용봉된 컨테이너 내의 건조 감압동결건조된 분말 또는 무수 농축물로서 함께 혼합되어 공급된다. 투여 방식이 주입인 경우, 조성물은 멸균 약제학적 등급수 또는 염수를 함유하는 주입 보틀로 조제될 수 있다. 투여 방식이 주사에 의한 것인 경우, 주사용 멸균수 또는 염수의 앰플은 성분들이 투여하기 전에 혼합될 수 있도록 제공할 수 있다.
특히, 본 발명은 또한, 본 발명의 예방학적 또는 치료학적 제제 또는 약제학적 조성물 중 하나 이상이 제제의 양을 표시하는 앰플 또는 샤쉐트와 같은 용봉된 컨테이너 내에 패키징된 것을 제공한다. 한 실시형태에서, 본 발명의 예방학적 또는 치료학적 제제, 또는 약제학적 조성물 중 하나 이상은 용봉된 컨테이너 내의 건조 멸균된 감압 동결건조 분말 또는 무수 농축물로서 공급되고, 대상체에게의 투여를 위해 (예를 들면, 물 또는 염수를 이용하여) 적절한 농도로 재구성될 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 예방학적 또는 치료학적 제제 또는 약제학적 조성물 중 하나 이상은 용봉된 컨테이너 내의 건조 멸균 감압 동결조된 분말로서 적어도 5mg, 적어도 10mg, 적어도 15mg, 적어도 25mg, 적어도 35mg, 적어도 45mg, 적어도 50mg, 적어도 75mg, 또는 적어도 100mg의 단위 용량으로 공급된다. 본 발명의 감압 동결건조된 예방학적 또는 치료학적 제제 또는 약제학적 조성물은 이의 본래 컨테이너 내에서 2℃ 내지 8℃에서 보관되어야만 하고, 본 발명의 예방학적 또는 치료학적 제제 또는 약제학적 조성물은 재구성된 후 1주 이내, 5일 이내, 72시간 이내, 48시간 이내, 24시간 이내, 12시간 이내, 6시간 이내, 5시간 이내, 3시간 이내, 또는 1시간 이내에 투여되어야만 한다. 대안의 실시형태에서, 본 발명의 예방학적 또는 치료학적 제제 또는 약제학적 조성물 중 하나 이상은 제제의 양 및 농도를 표시하는 용봉된 컨테이너 내에 액체형으로 공급된다. 바람직하게, 투여된 조성물의 액체형은 용봉된 컨테이너 내에 적어도 0.25mg/ml, 적어도 0.5mg/ml, 적어도 1mg/ml, 적어도 2.5mg/ml, 적어도 5mg/ml, 적어도 8mg/ml, 적어도 10mg/ml, 적어도 15mg/kg, 적어도 25mg/ml, 적어도 50mg/ml, 적어도 75mg/ml 또는 적어도 100mg/ml로 공급된다. 액체형은 이의 본래 컨테이너 내에서 2℃ 내지 8℃에서 보관되어야만 한다.
본 발명의 항체 및 항체부는 비경구 투여에 적합한 약제학적 조성물에 포함될 수 있다. 바람직하게, 상기 항체 또는 항체부는 0.1 내지 250mg/ml의 항체를 함유하는 주사가능한 용액으로서 조제될 것이다. 주사가능한 용액은 플린트 또는 갈색 바이알, 앰플 또는 사전-충전된 시린지 내의 액체 또는 감압 동결건조된 제형으로 이루어질 수 있다. 완충제는 pH 5.0 내지 7.0(최적으로는 pH 6.0)에서 L-히스티딘(1 내지 50mM), 최적으로는 5 내지 10mM일 수 있다. 다른 적합한 완충제로는 석신산 나트륨, 시트르산 나트륨, 인산 나트륨 또는 인산 칼륨이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 염화 나트륨을 이용하여 용액의 독성을 0 내지 300mM(최적으로는 액체 제형의 경우 150mM)의 농도로 변형시킬 수 있다. 동결보호제(cryoprotectant)는 감압 동결건조된 제형에 원칙적으로는 0 내지 10%(최적으로는 0.5 내지 1.0%) 슈크로스로 포함될 수 있다. 다른 적합한 동결보호제로는 트레할로스 및 락토스가 포함된다. 증량제(bulking agent)는 감압 동결건조된 제형에 원칙적으로 1 내지 10%(최적으로는 2 내지 4%) 만니톨로 포함될 수 있다. 안정화제는 액체 및 감압 동결건조된 제형 둘 다에 원칙적으로 1 내지 50mM(최적으로는 5 내지 10mM) L-메티오닌으로 사용될 수 있다. 다른 적합한 증량제로는 글리신, 아르기닌이 포함되고, 0 내지 0.05%(최적으로는 0.005 내지 0.01%) 폴리소르베이트-80로서 포함될 수 있다. 추가의 계면활성제로는 폴리소르베이트 20 및 BRIJ 계면활성제가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 비경구 투여를 위한 주사가능한 용액으로서 조제된 본 발명의 항체 및 항체부를 포함하는 약제학적 조성물은 보조제로서 유용한 제제, 예를 들면, 치료학적 단백질(예를 들면, 항체)의 흡수 또는 분산을 증가시키는데 사용되는 제제를 추가로 포함할 수 있다. 특히 유용한 보조제는 하이알루로니다제, 예를 들면, Hylenex®(재조합 사람 하이알루로니다제)이다. 주사가능한 용액에의 하이알루로니다제의 첨가는 비경구 투여, 특히, 피하 투여 후 사람 생체이용률(bioavailability)을 향상시킨다. 이는 또한 더 적은 통증 및 불편감, 그리고 주사 부위 반응의 최소 발생률로 보다 큰 주사 부위 용적(즉, 1ml보다 더 크다)을 가능하게 한다. (본원에 인용에 의해 포함되는 WO2004078140, US2006104968을 참조한다).
본 발명의 조성물은 각종 형태로 존재할 수 있다. 이들로는 예를 들면, 액체, 반-고체 및 고체 제형, 예를 들면, 액체 용액(예를 들면, 주사가능한 용액 및 주입가능한 용액), 분산액 또는 현탁액, 정제, 환제, 분말, 리포솜 및 좌제가 포함된다. 바람직한 형태는 투여의 의도된 방식 및 치료학적 용도에 의존한다. 전형적인 바람직한 조성물, 예를 들면, 다른 항체를 이용한 사람의 수동적 면역화에 사용되는 것과 유사한 조성물은 주사가능한 용액 또는 주입가능한 용액의 형태로 존재한다. 투여의 바람직한 방식은 비경구(예를 들면, 정맥내, 피하, 복강내, 근육내)이다. 바람직한 실시형태에서, 항체는 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여된다. 다른 바람직한 실시형태에서, 항체는 근육내 또는 피하 주사에 의해 투여된다.
치료학적 조성물은 전형적으로 멸균성이고 제조 및 보관 조건 하에 안정해야만 한다. 조성물은 용액, 미세유제, 분산액, 리포솜, 또는 높은 약물 농도에 적합한 기타 주문된 구조로서 제형화될 수 있다. 멸균의 주사가능한 용액은, 필요에 따라 상기 열거된 성분들 중 하나 또는 조합을 갖는 적절한 용매에 활성 화합물(즉, 항체 또는 항체부)을 요구량 포함시키고, 이어서, 여과 멸균시킴으로써 조제할 수 있다. 일반적으로, 분산액은, 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터의 요구되는 다른 성분들을 함유하는 멸균 비히클에 활성 화합물을 포함시킴으로써 조제된다. 멸균의 주사가능한 용액의 조제를 위한 멸균의 감압 동결건조된 분말의 경우, 바람직한 조제 방법은 활성 성분의 분말 및 이의 사전 멸균-여과된 용액으로부터의 임의의 추가의 원하는 성분을 수득하는 진공 건조 및 분무-건조이다. 용액의 적절한 유동성은 예를 들면, 레시틴과 같은 코팅제의 사용에 의해, 분산액의 경우에는 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 조성물에 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들면, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 포함시킴으로써 야기될 수 있다.
본 발명의 항체 및 항체부 또는 ADC는 당해 분야에 공지되어 있는 각종 방법에 의해 투여될 수 있지만, 다수의 치료학적 적용의 경우 투여의 바람직한 경로/방식은 피하 주사, 정맥내 주사 또는 주입이다. 당해 분야 숙련가에 의해 이해될 것인 바와 같이, 투여의 경로 및/방식은 원하는 결과에 따라 다를 것이다. 소정 실시형태에서, 활성 화합물은 상기 화합물을 신속한 방출에 대해 보호할 것인 담체와 함께 예를 들면, 이식물, 경피 패치, 및 미세캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 제어 방출 제형으로 조제될 수 있다. 생체분해가능한 생체적합성 중합체, 예를 들면, 에틸렌 비닐 아세테이트, 다가 무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산을 사용할 수 있다. 이러한 제형을 조제하기 위한 다수의 방법은 특허출원되어 있거나, 당해 분야 숙련가들에게 일반적으로 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌[Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다.
소정 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 항체부 또는 ADC는 비활성 희석제 또는 동화가능한 식용 담체와 함께 경구 투여될 수 있다. 화합물(및 원하는 경우 다른 성분들)은 또한 경질 또는 연질 쉘 젤라틴 캡슐 내에 봉입되거나, 정제로 압출되거나, 대상체의 식이에 직접 포함될 수 있다. 경구 치료학적 투여를 위해, 상기 화합물은 부형제와 함께 포함될 수 있고, 섭취가능한 정제, 협측 정제, 트로키제, 캡슐제, 엘릭시르제, 현탁제, 시럽제, 및 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 비경구 투여 이외의 다른 투여에 의해 본 발명의 화합물을 투여하기 위해, 상기 화합물을 이의 불활성화를 방지하기 위한 재료로 코팅하거나, 상기 화합물을 이러한 재료와 함께 동시-투여하는 것이 필요할 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 항체부 또는 ADC를 중합체-기반 종에 접합시켜 상기 중합체-기반 종이 본 발명의 상기 항체 또는 항체부에 충분한 크기를 부여하여 본 발명의 상기 항체 또는 항체부가 향상된 투과성 및 재긴장(retension) 효과(EPR 효과)로부터 이로울 수 있도록 할 수 있다(또한 문헌[PCT 공보 제WO2006/042146A2호 및 U.S. 공개 제2004/0028687A1호, 제2009/0285757A1호, 및 제2011/0217363A1호, 및 U.S. 특허 제7,695,719호(이들 문헌의 각각은 이들의 전문이 그리고 모든 목적을 위해 본원에 인용에 의해 포함된다)).
보충 활성 화합물도 상기 조성물에 포함될 수 있다. 소정 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 항체부 또는 ADC는, EGFR 활성이 유해한 장애를 치료하는데 유용한 하나 이상의 추가의 치료학적 제제와 함께 제형화되고/되거나 이와 동시-투여된다. 예를 들면, 본 발명의 항-hEGFR 항체 또는 항체부 또는 ADC는 다른 표적을 결합시키는 하나 이상의 추가의 항체(예를 들면, 사이토카인을 결합시키거나 세포 표면 분자를 결합시키는 항체)와 함께 제형화되고/되거나 이와 동시-투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 하나 이상의 항체는 상기 치료학적 제제 중 2개 이상과 병용하여 사용할 수 있다. 이러한 병용 치료요법은 투여된 치료학적 제제의 보다 적은 용량을 유리하게 이용할 수 있고, 이로써 각종 단일 치료요법과 관련된 가능한 독성 또는 합병증을 회피할 수 있다.
소정 실시형태에서, EGFR에 대한 항체 또는 ADC 또는 이들의 단편은 당해 분야에 공지되어 있는 반감기 연장 비히클에 링크된다. 이러한 비히클로는 Fc 도메인, 폴리에틸렌 글리콜, 및 덱스트란이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 이러한 비히클은 U.S. 출원 일련번호 제09/428,082호 및 공개된 PCT 출원 제WO 99/25044호에 기술되어 있고, 상기 문헌은 본원에 임의의 목적을 위해 인용에 의해 포함된다.
본원에 기술된 본 발명의 방법의 다른 적합한 변형 및 각색은 명백하고, 본 발명의 범위 또는 본원에 개시된 실시형태들로부터 벗어나지 않고 적합한 등가물을 이용하여 이루어질 수 있음은 당해 분야 숙련가들에게 매우 명백할 것이다. 이하에 본 발명에 상세하게 기술하여, 상기는 하기 실시예를 참조하여 보다 명확하게 이해될 것이고 이는 단지 설명 목적을 위해 포함되고 한정되는 것으로 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1: 개선된 항-EGFR 항체의 동정
항체 1
항체 1(Ab1)은 사람화된 항-egfr 항체이다. Ab1의 중쇄 가변 영역(VH) 아미노산 서열은 하기 서열번호 1로서 제공된다. Ab1의 VH CDR 아미노산 서열은 하기 밑줄 그어져 있고, 이하와 같다: GYSISSDFAWN(VH CDR1; 서열번호 2); YISYSGNTRYQPSLKS(VH CDR2; 서열번호 3); 및 AGRGFPY(VH CDR3; 서열번호 4).
Ab1 VH 서열
Figure pat00039
Ab1의 경쇄 가변 영역(VL) 아미노산 서열은 하기 서열번호 5로서 제공된다. Ab1의 VL CDR 아미노산 서열은 하기 밑줄 그어져 있고, 이하와 같다: HSSQDINSNIG(VL CDR1; 서열번호 6); HGTNLDD(VL CDR2; 서열번호 7); 및 VQYAQFPWT(VL CDR3; 서열번호 8).
Ab1 VL 서열
Figure pat00040
스크리닝을 수행하여 Ab1에 비하여 개선된 특성을 갖는 항-EGFR 항체를 동정하였다. Ab1 변이체의 동정의 상세설명은 하기에 제공된다.
Ab1 변이체 VL 및 VH 라이브러리의 조제
Ab1 변이체 항체는 Ab1의 변이체 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 3개의 단일쇄(scFv) 라이브러리를 스크리닝함으로써 동정하였다. scFv 라이브러리 중 하나는 Ab1 변이체 가변 중쇄(즉, Ab1 변이체 가변 중쇄 및 Ab1 가변 경쇄를 포함하는 scFv)를 포함하였고, 한편, 제2 scFv 라이브러리는 Ab1 변이체 가변 경쇄(즉, Ab1 변이체 가변 경쇄 및 Ab1 가변 중쇄를 포함하는 scFv)를 포함하였다. Ab1 변이체 VH 및 VL 영역은 또한 제3 scFv 라이브러리에 결합되었고, 이는 후속적으로 다중 라운드(round)를 통해 스크리닝되어 Ab1보다 더 높은 결합 친화도를 갖는 VH 및 VL Ab1 변이체의 조합을 선택하였다. Ab1 변이체 VH 및 VL 라이브러리의 고안은 도 16에 나타낸다.
변이체 Ab1 VH 영역을 생성하기 위해서, VH4-4(서열번호 93) 및 VH4-b 생식선 서열(도 16a를 참조하고, 여기서, 돌연변이된 아미노산 잔기가 "X"로서 지칭된다)을 갖는 Ab1의 VH의 정렬에 적어도 일부 기초한 돌연변이를 위해 12개의 아미노산 잔기를 선택하였다. P101D 변경(도 16a에서 "Z"라고 지칭함)은 또한 사람 생식선 및 Ab1 서열에 기초하여 생성되었다. 상기 기술된 코돈 용도를 이용하여, 12개의 잔기(도 16a의 "X" 잔기)를 표적화함으로써 109개의 라이브러리는 클론당 4개 이하의 돌연변이된 잔기를 갖는 VH Ab1 변이체의 대부분을 제공할 수 있음이 계산하였다. 도 16a에 기술된 바와 같이, 1개의 프레임워크 잔기(Q1E)도 N-말단 피로글루타메이트 형성을 방지하도록 변경되었다.
변이체 Ab1 VL 영역을 생성하기 위해서, IGKV1-12(L5) 생식선 서열(도 16b에 "X"로 표시된 잔기를 참조한다)(IGKV1-12는 서열번호 94에 기술된다)을 갖는 Ab1의 VL 영역의 정렬에 적어도 일부 기초한 돌연변이를 위해 11개의 아미노산 잔기를 선택하였다. 위치 33 및 52의 잔기(도 16b에서 각각 "1" 및 "2"로 표시함)는 한정된 다양성을 갖는 것으로 고안되었다. 위치 33의 잔기는 L, V, I, 또는 F에 한정되었고, 위치 52의 잔기는 S, A, T, 및 P에 한정되었다.
상기에 기초한 효모 라이브러리는 문헌[Benatuil et al. (2010) Protein Eng, Design, and Selection, 23 (4): 155-159]에 기술된 형질전환 방법을 이용하여 생성되었다.
scFv Ab1 변이체 라이브러리의 스크리닝
Ab1 변이체 VH 또는 VL 영역을 포함하는 단일쇄 가변 단편(scFv)들이 각각의 라이브러리로부터 발현되었고, 절단된 야생형(wt) 사람 EGFR1-525, 및 돌연변이체 EGFR(CA)을 결합하는 scFv의 능력에 기초하여 스크리닝되었다. EGFR(CA)은 위치 295 및 307에 알라닌 돌연변이에 시스테인을 포함하는 EGFR 변이체이다(문헌[Garrett et al. (2009) PNAS USA 106(13): 5082-5087]을 참조한다). 약 1 x 109 클론을 포함하는 라이브러리가 스크리닝되었다.
Ab1이 EGFR(CA)에 결합하지만 wtEGFR에는 실질적으로 결합하지 않음을 고려하면, 스크리닝의 초기 라운드는 EGFR(CA)을 사용하여 Ab1에 비하여 EGFR(CA)에 대해 개선된 결합 친화도(kon, koff 또는 둘 다의 속도)를 갖는 Ab1 변이체 중쇄 및 경쇄를 동정하였다. 그러나, 스크리닝의 후기 라운드는 EGFR(1-525)을 사용하여 EGFR(1-52)에 대해 Ab1에 비하여 개선된 결합 친화도(kon, koff 또는 둘 다의 속도)를 갖는 Ab1 변이체를 동정하였다.
자기 비드 분류(MACS(자기 세포 분리 기술)) 및 FACS 기반 검정을 포함하는 2개의 방법을 이용하여 라이브러리 스크리닝을 수행하였다(MACS 및 FACS에 대해서는 예를 들면, 문헌[Chao et al (2006) Nature Protocols 1:755-765; Feldhaus et al. (2003) Nature Biotech 21:163-170; and VanAntwerp (2000) Biotechnol. Prog. 16:31-37]을 참조한다).
적어도 2 라운드의 자기 비드 농축에 기초한 스크리닝을 수행하였고, 이어서, 적어도 3 라운드의 유동 세포측정 분류에 기초한 스크리닝을 수행하였다(Feldhaus and Siegel, Ch. 17 of Flow Cytometry Protocols, 2nd ed., ed. Hawley and Hawley, vol. 263). 평형 및 koff 선택 둘 다를 이용하여 Ab1에 비하여 개선된 결합을 갖는 scFv를 동정하였다.
총, Ab1에 비하여 개선된 결합을 갖는 Ab1 변이체 VH 및 VL 영역에 대해 3개의 라이브러리가 스크리닝되었다. Ab1 변이체 VH 및 VL 라이브러리를 이용하여 4 내지 5 라운드의 스크리닝을 수행하였고, 조합된 Ab1 변이체 VH/VL 라이브러리에 대해 5 내지 6 라운드를 수행하였다. Ab1 변이체 VL 라이브러리, Ab1 변이체 VH 라이브러리, 및 조합된 Ab1 변이체 VH 및 VL 라이브러리의 스크리닝은, Ab1에 비하여 EGFR(EGFR(1-525) 및 EGFR(CA))에 대해 더 높은 결합 친화도를 갖는 Ab1 변이체 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv의 동정을 초래하였다.
개선된 항체의 동정
EGFR(1-525)에 대한 특이적 결합을 포함하는 개선된 결합 특성을 갖는 것으로 동정된 15개의 Ab1 변이체 scFv들을 IgG 단백질(구체적으로는 IgG1 항체)로의 전환을 위해 선택하였다. 15개의 Ab1 변이체 항체는 본원에 기술되어 있고, 이로는 항체 A(본원에 "AbA"로서 나타냄)(VH 서열번호 9; VL 서열번호 5를 참조한다), 항체 B(본원에 "AbB"로서 나타냄)(VH 서열번호 64; VL 서열번호 65를 참조한다), 항체 C(본원에 "AbC"로서 나타냄)(VH 서열번호 66; VL 서열번호 67을 참조한다), 및 항체 D(본원에 "AbD"로서 나타냄)(VH 서열번호 68; VL 서열번호 69를 참조한다), 항체 E(본원에 "AbE"로서 나타냄)(VH 서열번호 50; VL 서열번호 51을 참조한다), 항체 F(본원에 "AbF"로서 나타냄)(VH 서열번호 52; VL 서열번호 53을 참조한다), 항체 G(본원에 "AbG"로서 나타냄)(VH 서열번호 72; VL 서열번호 73을 참조한다), 항체 H(본원에 "AbH"로서 나타냄)(VH 서열번호 54; VL 서열번호 55를 참조한다), 항체 J(본원에 "AbJ"로서 나타냄)(VH 서열번호 56; VL 서열번호 57을 참조한다), 항체 K(본원에 "AbK"로서 나타냄), 항체 L(본원에 "AbL"로서 나타냄)(VH 서열번호 58; VL 서열번호 59를 참조한다), 항체 M(본원에 "AbM"로서 나타냄)(VH 서열번호 76; VL 서열번호 77을 참조한다), 항체 N(본원에 "AbN"로서 나타냄)(VH 서열번호 60; VL 서열번호 61을 참조한다), 항체 O(본원에 "AbO"로서 나타냄)(VH 서열번호 62; VL 서열번호 63을 참조한다), 및 항체 P(본원에 "AbP"로서 나타냄)(VH 서열번호 78; VL 서열번호 79를 참조한다)가 포함된다. VH 및 VL 라이브러리로부터 선택된 클론들은 각각 Ab1 VL 또는 VH 영역과 쌍을 이루었다(AbA, AbB, AbC, AbD, AbE, 및 AbF를 참조한다).
Ab1 변이체 항체의 VH 영역의 아미노산 서열은 하기에 제공된다. CDR은 밑줄 그어져 있고, Ab1에 대한 아미노산 변화는 볼드체로 강조되어 있다.
Figure pat00041
Figure pat00042
Ab1 변이체 항체의 VL 영역의 아미노산 서열은 하기에 제공된다. CDR들은 밑줄 그어져 있고, Ab1에 대한 아미노산 변화는 볼드체로 강조되어 있다.
Figure pat00043
Figure pat00044
Figure pat00045
15개의 Ab1 변이체 VH 및/또는 VL 도메인의 핵산 서열을 전장 IgG 항체의 발현을 위한 발현 벡터에 서브클로닝하였다(둘 다 본원에 인용에 의해 포함된 US 특허 제8,187,836호 및 US 특허 제8,455,219호에 개시된 벡터 및 방법을 참조한다). 항체 발현 벡터를 표준 방법에 따라 HEK293 세포에 일시적으로 형질감염시켰다(문헌[Durocher et al. (2002) Nucleic Acid Res. 30(2;e9)]을 참조한다). 각각의 Ab1 변이체의 중쇄의 발현에 사용되는 리더 서열의 아미노산 서열은 MEFGLSWLFLVAILKGVQC(서열번호 88)이었고, 한편, 각각의 Ab1 변이체의 경쇄의 발현의 리더 서열에 사용되는 아미노산 서열은 MRVPAQLLGLLLLWFPGSRC(서열번호 89)이었다. Ab1 항체 변이체는 후속적으로 친화도 및 기능성 평가를 위해 단백질 A 크로마토그래피에 의해 배지로부터 정제되었다.
항체 AbA
동정된 Ab1 변이체 항체들 중 하나는 AbA였다. AbA는 동일한 CDR1, CDR2, 및 CDR3 아미노산 서열(각각 서열번호 6, 서열번호 7, 및 서열번호 8로 기술됨)을 포함하는, Ab1과 동일한 가변 경쇄 서열(서열번호 5)을 갖는다.
AbA의 VH 아미노산 서열은 하기 서열번호 9에 제공된다. AbA의 VH CDR 아미노산 서열은 하기와 같고: GYSISRDFAWN(CDR1; 서열번호 10); YISYNGNTRYQPSLKS(CDR2; 서열번호 11); 및 ASRGFPY(CDR3; 서열번호 12), 하기에 밑줄 그어져 있다. AbA 대 Ab1의 중쇄 가변 영역에서 상이한 잔기들은 하기에 볼드체로 나타낸다.
AbA VH 아미노산 서열
Figure pat00046
도 1 및 도 2는 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열들의 정렬(도 1) 및 Ab1 및 AbA의 완전 중쇄 및 경쇄(도 2)를 제공한다. Ab1 및 AbA의 경쇄 아미노산 서열은 동일하다(서열번호 13). 그러나, Ab1 및 AbA의 중쇄 아미노산 서열은 2개의 서열 사이에 6개의 아미노산 차이를 갖고, 이들 중 3개는 CDR에 존재한다. Ab1 VH 아미노산 서열과 AbA VH 아미노산 서열 사이의 차이는 도 1에 어둡게 표시되고, 각각의 VH CDR에서 발견된다. AbA의 가변 중쇄의 CDR1 도메인은 세린(Ab1)으로부터 아르기닌으로의 아미노산 변화를 포함하였다. 가변 중쇄의 CDR2 도메인은 Ab1의 세린으로부터 AbA의 아스파라긴으로의 아미노산 변화를 포함하였다. 마지막으로, 가변 중쇄의 CDR3 도메인은 Ab1의 글리신으로부터 AbA의 세린으로의 아미노산 변화를 포함하였다. AbA 내의 아미노산 변화들 중 2개는 중쇄의 불변 영역에 존재하였다(D354E 및 L356M). AbA의 Fc 영역 아미노산 돌연변이는 a z, a 알로타입(allotype)으로부터 a z, 비-a 알로타입으로의 사람 IgG 알로타입 변화를 나타낸다. 다른 변화에 추가하여, 제1 아미노산은 예를 들면, 도 1에 기술된 바와 같이 글루타민(Q)으로부터 글루탐산(E)으로 변화되었다.
Ab1 서열에 대한 Ab1 변이체 항체 서열의 비교
표 1은 Ab1 변이체 항체 AbA, AbG, AbK, AbM, 및 AbP에 대한 중쇄 및 경쇄 CDR의 아미노산 서열의 정렬을 Ab1과 비교하여 제공한다. 표 2는 Ab1, AbA, AbG, AbK, AbM, 및 AbP에 대한 항-EGFR 항체 CDR 컨센서스 서열의 비교를 제공한다. 표 1 및 표 3의 빈칸은 잔기가 Ab1과 동일함을 나타낸다.
Figure pat00047
Figure pat00048
표 2에 기술된 바와 같이, Ab1 변이체 항체 AbA, AbG, AbK, AbM, AbP 각각 CDR3의 가변 중쇄에 글리신 대신에 세린 잔기를 갖는다(표 2에 볼드체/밑줄로 나타냄).
Ab1 대 항체 AbB, AbC, AbD, AbE, AbF, AbH, AbJ, AbL, AbN, AbO, 및 AbQ의 VH 및 VL CDR 서열의 비교는 표 3에 기술된다. 표 3에 기술된 CDR 변화에 추가하여, AbG는 VH의 프레임워크 2 영역 내에 아미노산 잔기 변화를 갖는다.
Figure pat00049
Figure pat00050
Ab1 변이체 항체의 특성확인은 하기 실시예 2 내지 실시예 8에 기술된다.
실시예 2: 항-EGFR 항체의 결합
Biacore 분석
Biacore 분석을 수행하여, 재조합 EGFR의 3개의 형태, 특히, 야생형 EGFR 세포외 도메인(ECD)(EGFR 1-645)(서열번호 34, EGFRvIII(EGFR (1-29)-G-(298-645)(서열번호 46)) 및 절단된 야생형 EGFR 1-525(EGFR1 (1-525)(서열번호 47))에 대해 Ab1, Ab2(세툭시맙의 동일한 6개의 CDR 아미노산 서열을 갖는 항체), 및 실시예 1에서 동정된 항-EGFR항체의 친화도를 비교하였다. Ab2는 각각 서열번호 48 및 48에 제공되는 Ab2의 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 포함하고, 이는 표준 방법에 따라 조제되었다.
Ab1 및 Ab2는 둘 다 항-EGFR 항체이지만, 이들은 별개의 특성을 갖고 고유한 에피토프에 결합한다. Ab2는 EGFR의 L2 도메인에 결합하고(Gan et al. (2012) Cancer Res 72(12)1-7; Li et al. (2005) Cancer Cell 7:301), 반면 Ab1은 EGFR의 CR1 도메인(도메인 II)의 아미노산 잔기 287 내지 302에 결합한다(Gan et al. (2012) 72(12)1-7; Johns et al.(2004) J BiolChem 279:30375-30384). EGFR의 도메인 II는 EGFR의 연장된 입체배좌에서 노출된다(Li et al. (2005) Cancer Cell 7:301). 도 17은 EGFR의 전체 구조적 도메인 조직의 다이아그램을 제공하고, 이는 일반적으로 Ab2 및 Ab1에 대한 에피토프가 위치되는 곳을 나타낸다. Ab2와는 달리, Ab1은 EGFR ECD(서열번호 34)에 결합하지 않는다(또는 매우 약한 결합을 갖는다). Ab1은 활성화된 야생형 EGFR에 결합할 수 있지만, 생체내 Ab2에 비하여 EGFRvIII에 대해 보다 높은 결합 친화도를 갖는다. 따라서, Ab2는 상이한 에피토프에 결합하고 Ab1과 상이한 결합 친화도 특성을 갖는 제2 항-EGFR 항체로서 본원에 기술된 실험에서 대조군으로서 사용되었다.
CM5 센서리 칩(sensory chip)과 Biacore T100를 이용하여 Biacore 분석을 수행하였고, 시험 항체들은, 제조업자의 지침에 따른 표준 아민 커플링 키트(GE healthcare)를 이용하여 칩에 아미노 커플링된 항-사람 Fc 항체를 통해 포획되었다. 간략하게, CM5 칩 표면은 EDC/NHS로 활성화되었다. 염소 항-사람 Fc 특이적 폴리클로날 항체(Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL)를 10mM 아세트산 나트륨(pH 4.5) 중에 25㎍/mL로 희석시켰고, 활성화된 표면에 주사하여 고정화를 달성하였다. 바이오센서 표면 상의 미반응 모이어티를 에탄올아민으로 차단하였다. Biacore T100은 항체와 이의 항원 사이의 상호작용을 포함하는 생체분자 상호작용을 검출하고, 특성확인하고, 정량하기 위한 표면 플라스몬 공명 기반 바이오센서이다. 항원을 3분 동안 80μL/분으로 주사하였고, 15분 동안 해리가 이어졌다. 시험된 EGFR ECD는 myc 및 히스티딘 태그에 융합된 EGFR의 아미노산 1 내지 645를 포함하였다(EGFR (1-645)-LESRGPF-Myc-NMHTG-6His ("LESRGPF" (서열번호 90); "6His" (서열번호 91)). EGFRvIII 변이체는 또한 myc 및 히스티딘 태그에 융합되었고(EGFR (1-29)-G-(298-645)-LESRGPF-Myc-NMHTG-6His), 따라서 ECD EGFR 1-525 (EGFR1 (1-525)-SRGPF-Myc-NMHTG-6His ("SRGPF"(서열번호 92))이었다. Biacore 분석에 사용된 러닝 완충액은 HBS-EP+: 10mM Hepes, pH 7.5, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.05% Tween 20이었다.
Biacore 결합 분석으로부터의 결과는 도 3에 나타낸다. 시험된 Ab1 변이체 항체들 중에서, AbK는 절단된 EGFR (1-525)에 대해 1.7 x 10-9M의 KD로 최고 결합 친화도를 가졌고, 이는 Ab1의 KD에 비하여 1300배 초과의 증가였다. 도 3에 기술되는 바와 같이, AbE는 절단된 EGFR (1-525)에 대해 5.9 x 10-7M의 KD로 최저 측정가능한 친화도를 나타냈고 이는 Ab1의 KD에 비하여 단지 약 4배의 친화도 증가였다. AbA는 절단된 EGFR (1-525)에 대해 10배의 KD 향상을 나타냈다(2.2 x 10-7M의 KD(AbA) 대 2.3 x 10-6M의 KD(Ab1). Ab1에 대한 AbB, AbC, AbD, AbF, AbG, AbH, AbJ, AbL, AbM, AbN, AbO, 및 AbP의 KD 비는 또한 절단된 EGFR 1-525에 관해 도 3에 기술된다.
또한, EGFRvIII에 대한 Ab1 변이체 항체, Ab1 및 Ab2의 결합 친화도를 시험하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, Ab1 변이체 전부는 EGFRvIII에 대해 Ab1보다 더 높은 결합 친화도를 나타냈다. 예를 들면, AbA는 EGFRvIII로부터 2.3 x 10-9M의 KD로 해리되었고, 반면, Ab1은 9.4 x 10-9M의 KD의 해리 상수를 가졌다. 따라서, AbA는 Ab1에 비하여 4배의 친화도 증가를 가졌다(해리 상수에 의해 측정됨).
Ab1에 비하여 절단된 EGFR(1-525)에 대해 보다 높은 해리 상수를 나타낸 Ab1 변이체 항체는 EGFRvIII에 대한 친화도에 있어서 반드시 동일한 증가를 나타낸 것은 아니었다. 예를 들면, 도3에 기술되는 바와 같이, AbO는 Ab1에 비하여 EGFRvIII에 대한 친화도에 있어서 최대 배수 증가(63배)를 나타냈지만, AbK는 Ab1에 비하여 절단된 EGFR(1-525)에 대해 최대 배수 증가(1300배 초과의 증가)를 나타냈다. 다른 예로, 도 3에 기술되는 바와 같이, AbG는 Ab1 변이체 항체들 중에서 EGFRvIII에 대한 결합에 있어 2번째 최대 배수 증가(47배 초과의 증가)를 나타냈지만, Ab1에 비하여 절단된 EGFR(1-525)에 대한 친화도 증가(263배 증가)에 있어서는 6번째로 랭킹되었다.
많은 Ab1 변이체들은 Biacore 시험에서 절단된 EGFR(1-525)에 대해 예를 들면, 4.0 x 10-9M의 KD를 가졌던 Ab2보다 EGFR 1-525 및 EGFRvIII 둘 다에 대해 더 낮은 친화도를 갖는 것으로 측정되었다.
Biacore 분석은 Ab1도 Ab1 변이체 항체도 EGFR 전장 ECD(EGFR 아미노산 1-645)에 결합하지 않았음을 밝혔다. 대조적으로, Ab2는 EGFR의 ECD에 결합하였다. 따라서, 야생형 EGFR ECD에의 Ab1 변이체의 결합이 Ab1에 대해서도 관찰된 바와 같이 부재하였거나 무시해도 좋은 정도였다는 관찰에도 불구하고, 절단된 수용체 EGFR(1-525)에 대한 증가된 결합 친화도는 Ab1 변이체와 함께 증가하였다.
FACS(형광 활성화 세포 분류) 분석
FACS 분석을 수행하여 Ab1 및 Ab2와 비교한 종양 세포(A431 세포)에의 AbA의 결합 특성을 측정하였다. FACS 분석을 이용하여, 형광 강도 및 세포 수를 측정하였고, 여기서, 세포에 결합된 항체의 양은 유동 세포측정 소프트웨어를 이용한 분석을 통해 얻어진 형광 강도(즉, 기하 평균 값)에 반영되었다. 구체적으로, 결합된 항체의 양에 의해 제시되는 항체의 결합 활성은 기하 평균 값을 측정함으로써 평가되었다.
세포 해리 완충액을 이용하여 대략 80% 컨플루언스(confluence)에서 플라스크로부터 A431 세포를 수거하였다. 수거된 A431 세포를 PBS/1% FBS(소 태아 혈청)(FACS 완충액)에서 1회 세척하였고, 이어서, FACS 완충액에 2.5 x 106세포/mL로 재현탁시켰다. 환저 96-웰 플레이트에 웰당 100μL의 세포를 부가하였다. 10μL의 항체의 10x 농축액을 사용하였다(최종 농도는 도 4에 나타낸다). 웰을 FACS 완충액으로 2회 세척하였고, FACS 완충액에 희석된 2차 항체(AlexFluor 488) 50μL에 재현탁시켰다. 상기 플레이트를 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였고, FACS 완충액으로 2회 세척하였다. 세포를 PBS/1% 포름알데하이드의 100μL에 재현탁시켰고, Becton Dickinson LSRII 유동 세포측정기에서 분석하였다. 데이터는 WinList 유동 세포측정 분석 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.
A431 종양 세포에의 Ab1, Ab2, 및 AbA 결합의 FACS 분석으로부터의 결과는 도 4에 제공되고, 이는 기하 평균 대 세포 내에서 인큐베이션된 항체의 농도를 나타낸다. 도 4에 기술되는 바와 같이, AbA는 Ab1보다 A431 종양 세포 상의 EGFR에 대한 보다 높은 결합을 가졌지만, AbA는 Ab2와 비교하여 보다 낮은 결합 친화도를 가졌다. 도 4의 데이터는 이들의 항원에 대한 각각의 항체의 직접적 결합을 나타낸다.
도 3 및 도 4에 기술되는 바와 같이, AbA는 EGFR에 대한 결합 친화도를 증가시켰고, Ab1에 비하여 높은 수준의 EGFR을 갖는 세포(A431 종양 세포)에 증가된 결합을 나타냈다. 또한, A431 세포에의 결합에 대해 보다 낮은 수준의 EGFR을 갖는 세포(데이터 도시하지 않음)에의 결합에 있어 더 적은 증가를 나타냈음이 측정되었다.
실시예 3: 항-EGFR 항체의 에피토프 분석
실시예 1에서 동정된 항-EGFR 항체가 항체 Ab1과 동일한 에피토프를 가졌는지 또는 Ab1 변이체 항체 AbA, AbG, AbK, AbM, 및 AbP 내의 아미노산 변화가 에피토프 결합에 영향을 미쳤는지를 측정하기 위한 실험을 수행하였다.
경쟁 검정 분석
경쟁 결합 FACS 검정을 이용하여 Ab1, Ab2, 및 대조군 1 항체(음성 대조군으로서 사용되는 항-CD20 항체(리툭시맙(Roche)))와 비교하여 개선된 항-EGFR 항체들 사이의 에피토프 특이성을 측정하였다. EGFRvIII을 발현하는 U87MG 세포(사람 교모세포종 세포주(A. Scott, Ludwig Institute for Cancer Research로부터 수득됨)(U87MG는ATCC HTB-14™으로서 ATCC로부터 입수가능하고; 또한, 예를 들면, U-87MG Cell Line human, Sigma-Aldrich를 참조한다)를 사용하였다. 세포 해리 완충액을 이용하여 대략 80% 컨플루언스에서 플라스크로부터 U87MG 세포를 수거하였다. 세포를 PBS/1% FBS(소 태아 혈청)(FACS 완충액)에서 1회 세척하였고, 이어서, FACS 완충액에 2.5 x 106세포/mL로 재현탁시켰다. 환저 96-웰 플레이트에 웰당 100μL의 세포를 부가하였다. 경쟁 FACS를 위해, Ab1을 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)의 부가에 의해 100nM의 최종 농도로 (경쟁 항체 존재 또는 부재 하에) 형광 접합시켰고, 이어서, 상기 웰을 FACS 완충액으로 2회 세척하였고, PBS/1% 포름알데하이드의 100μL에 재현탁시켰고, Becton Dickinson LSRII 유동 세포측정기에서 분석하였다. 488nM에서 형광도를 측정하였다.
경쟁 검정으로부터의 결과는 도 5에 기술되고, 이는, 형광도의 Geo 평균 계산이 표지되지 않은 Ab1 변이체 항체 농도의 증가와 함께 감소됨을 고려하면, 시험된 Ab1 변이체 항체(즉, AbA, AbG, AbK, AbM, 및 AbP)가 Ab1과 동일한 에피토프("연장된" EGFR 입체배좌에서 노출되는 EGFR의 도메인 II)를 인식하였음을 나타낸다. 상기 결과는 또한 Ab1/AbA/AbG/AbK/AbM/AbP 에피토프가 Ab2 에피토프와 별개이고, 따라서 Ab2와 Ab1 사이의 또는 Ab2와 Ab1 변이체 항체 사이의 경쟁이 관찰되지 않았음을 보여준다. 대조군 1 항체는 또한 경쟁 검정에서 Ab1 에피토프에의 검출가능한 결합이 존재하지 않았음을 보여주었고, 따라서 대조군 1 항체는 세포에 결합하기 위해 FITC 표지된 Ab1과 경쟁하는데 실패하였음을 보여주었다.
영상화 분석
EGFR 발현 종양에 의한 항체 활용의 효능을 평가하기 위해서, 111In으로 표지된 AbA를 이용하여 SPECT 영상화 검정을 수행하였다(예를 들면, 문헌[Khalil, et al. International Journal of Molecular Imaging, Vol. 2011, Article ID 796025, p. 1-15]을 참조한다). 2개의 종양 모델, SW48 세포(결장 종양 세포; ATCC No. CLL-231™) 및 EBC-1 세포(EBC-1 세포는 Japanese Research Resources Bank(Id No. RCB1965)(Tokyo, Japan)로부터의 사람 폐 편평 세포 암종 세포주 유래이다)를, 면역조직화학 분석에 기초하여 이들의 중간정도 EGFR 발현 수준으로 선택하였다. 마우스에 종양 세포를 주사하고, 후속적으로 표지된 AbA 항체, 표지된 Ab1, 또는 표지된 음성 대조군(비-EGFR 발현 IgG)을 투여한 후, nanoSPECT/CT를 이용하여 주사 후 4, 12, 24, 48, 72, 120 및 168시간째에 마우스의 SPECT/CT 화상을 획득하였다. 모든 표지된 항체들은 꼬리 정맥 주사를 통해 투약되었다. 항체에 대한 혈액 청소율 차이를 설명하기 위해, 데이터는 종양 대 혈액의 비로서 보고된다. 도 20a 및 도 20b 둘 다에 제공되는 결과는 Ab1 및 IgG 대조군에 비하여 마우스의 SW48(도 20a) 및 EBC-1(도 20b) 세포 둘 다에서의 보다 높은 AbA 활용을 입증한다. 보다 낮은 수준의 EGFR 발현을 갖는 모델인 EBC1 모델(도 20b)에서, Ab1 활욜은 IgG 대조군과 유사하였고, 한편, AbA 활용은 Ab1 또는 음성 대조군 둘 다보다 더 높았다. 도 20에 제공되는 결과는 AbA가 특정 EGFR-발현 종양을 표적화할 수 있음을 입증한다. 또한, (높은 수준의 EGFR 발현을 갖는 것으로 공지되어 있는 표피모양 암종 고형 종양(ATCC No. CRL-1555)로부터 유도된) A431 종양 세포를 이용하여 AbA에 대한 유사한 영상화 결과가 관찰되었다.
실시예 4: 종양 세포주에서의 항-EGFR 항체 활성의 시험관내 분석
SCC-15 및 H292 종양 세포주에서의 EGFR 신호전달의 시험간내 분석
시험관내에서 종양 세포주의 EGFR의 EGF-매개된 티로신 인산화를 억제하는 Ab1, Ab2, AbA, AbB, AbC, AbD, AbG, AbK, AbM, 및 AbP의 능력을, 편평 암종 세포 (SCC)-15(ATCC® CRL-1623™) 및 H292 세포(폐 암종 세포주; ATCC® CRL-1848™)를 이용한 웨스턴 블롯 분석에 의해 평가하였다. SCC-15 및 H292 세포 둘 다는 야생형 EGFR을 발현한다. 항체 치료에 의해 유도된 야생형 EGFR 발현 종양 세포에서의 pEGFR의 하향 조절은, 이들 항체가 수용체를 통한 신호전달의 억제에 의해 적어도 부분적으로 기능함을 나타낸다. SCC-15 세포(사람 혀 편평 세포 암종)는 각질세포로 형질전환되고, 생체내에서 Ab1에 대해 민감성이다. SCC-15 세포는 생체내에서 Ab1에 대해 민감성이지만, H292(사람 비-소세포 폐암(NSCLC)) 세포는 시험관내 및 생체내 둘 다에서 EGFR의 EGF-매개된 티로신 인산화의 Ab1 억제에 대해 내성이다. 따라서, 상기 세포주 둘 다는, 시험관내에서 종양 세포의 EGFR 신호전달을 억제하는 AbA, AbB, AbC, AbD, AbG, AbK, AbM, 및 AbP의 능력을 시험하기 위해 사용하였다.
세포는 24-웰 플레이트에 웰당 60,000 내지 80,000으로 플레이팅하거나 6-웰 조직 배양 플레이트에 웰당 100,000 내지 200,000으로 플레이팅하였다. 세포를 성장 배지에서 밤새 인큐베이션하였다. 37℃에서 24시간 동안의 혈청-절식(starvation) 후, 적절한 경우, 세포를 37℃에서 1시간 동안 항체와 함께 인큐베이션하였고, 이어서, 37℃에서 10분 동안 재조합 사람 EGF(R&D Systems)로 자극하였다. 이어서, 세포를 빙냉 PBS로 2회 세척하였고, Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail(Roche) 및 0.1% NP40(Tergitol-타입 NP-40; 노닐 페녹시폴리에톡시에탄올)이 보충된 세포 용해 완충액(Cell Signaling Technolgy)의 100 내지 200μL/웰로 용해시켰다. -80℃에서 적어도 20분 동안의 급속-냉동 후, 세포 용해물을 4℃에서 10분 동안 14,000rpm으로의 원심분리에 의해 제거하였다. BCA 단백질 검정(Pierce_Thermo Scientific)을 통해 제거된 샘플 용해물의 단백질 농도를 측정하였다. 4 내지 12% bis-Tris, Midi 겔, (Life Technologies)를 이용한 SDS-PAGE에 의해 세포 용해물(10㎍)을 해상시켰고, iBlot Dry Transfer system(Life Technologies)을 이용하여 니트로셀룰로스 막으로 이동시켰다. 블롯은 5% 우유/Tween-Tris 완충된 염수(TTBS)로 실온에서 1시간 동안 차단시켰고, TTBS로 3회 세척하였고, 이어서, 적절한 1차 항체(항-포스포티로신 (4G10) 비오틴 접합체, Millipore, 인산화된 EGFR을 검출하기 위한 1:1000 희석; 토끼 항-EGFR, Lifespan Biosciences, 총 EGFR을 검출하기 위한 1:2000 희석; 토끼 항-Pan 액틴, Cell Signaling Technology, 내부 대조군 액틴을 검출하기 위한 1:1000 희석)와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 1차 항체와 밤새 인큐베이션한 후, 블롯을 TTBS로 5분 동안 3회 세척하였고, 이어서, 총 EGFR을 검출하기 위해 당나귀 항-토끼 항체(Jackson Laboratories, 1:2000 희석)와 함께 또는 인산화된 EGFR을 검출하기 위해 스트렙트아비딘-HRP 접합체(KPL, 1:1000 희석)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 블롯을 TTBS로 3회 세척하였고, West Dura Chemiluminescent 기질(Thermo Scientific)로 처리하였다. LAS-4000 스캐너(Fuji)를 이용한 스캐닝에 의해 블롯을 가시화하였다.
Ab2를 양성 대조군(즉, EGFR 인산화의 억제제)으로서 사용하였고, 대조군 1 항체를 음성 대조군(즉, EGFR에 결합하지 않으므로 인산화된 EGFR에 영향을 미치지 않음)으로서 사용하였다.
SCC-15 세포를 이용한 시험관내 연구의 웨스턴 블롯 분석으로부터의 결과는 도 7a에 제공되고, 이는, 인산화된 EGFR의 유의한 하향 조절의 부재에 의해 나타내어지는 바와 같이, Ab1 및 항체 AbA, AbB, AbC 및 AbD가 SCC-15 세포에서 EGFR 신호전달을 유의하게 억제할 수 없었음을 나타낸다. 대조적으로, 도 7a에 나타낸 바와 같은 인산화된 EGFR의 감소는, 인산화된 EGFR의 수준이 음성 대조군 및 Ab1에 비하여 더 낮았고 양성 대조군(Ab2)과 비슷하였음을 고려하면, 항체 AbG, AbK, AbP, 및 AbM이 시험관내 SCC-15 세포에서 EGFR 활성을 감소시켰음을 나타냈다. 따라서, 다수의 Ab1 변이체는 Ab1에 비하여 시험관내 활성을 수득하였다.
H292 세포를 이용한 시험관내 연구의 웨스턴 블롯 분석으로부터의 결과는 도 7b에 제공된다. 도 7b의 결과는, Ab1 및 항체 AbA, AbB, AbC, 및 AbD가 Ab2 및 항체 AbG, AbK, AbM 및 AbP와 비교하여 인산화된 EGFR에 대한 유의한 감소가 없는 시험관내 H292 세포에서 EGFR 신호전달의 억제를 거의 보이지 않았음을 나타낸다. 항체 AbG, AbK, AbM 및 AbP는, Ab1보다 우수한 H292 세포에서의 EGFR의 티로신 인산화의 억제에 보다 효과적이었다(도 7b 참조). Ab2(양성 대조군)는 또한 도 7b에 기술되는 바와 같이 EGFR 인산화를 억제하였고, 반면 음성 대조군(대조군 1 항체)은 Ab2에 비교한 결과를 고려하면 검출가능한 인산화 억제를 나타내지 않았다.
하기 기술되는 바와 같이, AbA는 시험관내 야생형 EGFR 양성 세포(H292)에서 EGFR 인산화를 억제시키는데 상대적으로 불활성인 것으로 발견되었지만, AbA는 동일한 조건 하에 시험된 항체 Ab1과 비교하여 생체내에서 이들 세포의 인산화를 억제할 수 있었다.
따라서, 도 7a 및 도 7b에 기술된 시험관내 결과는, (Ab1에 비하여) EGFR에의 AbA, AbB, AbC, AbD, AbG, AbK, AbM, 및 AbP의 증가된 결합에도 불구하고, Ab1 변이체 항체들 중 몇몇(즉, AbG, AbK, AbM 및 AbP)만이 시험된 종양 세포주에서 시험관내 EGF-매개된 신호전달을 유의하게 억제하거나 감소시킬 수 있었음을 나타낸다. 일반적으로, 시험관내에서 SCC-15 및 H292 세포의 EGFR의 EGF-매개된 티로신 인산화를 억제하는 시험된 Ab1 변이체 항체의 능력은, 표면 플라스몬 공명에 의한 측정시 EGFRvIII 및 절단된 EGFR(1-525) 둘 다에 대해 증가된 친화도와 상호관련되어 있었다.
도 6은 EGFR(1-525)에의 Ab1, Ab2, 및 Ab1 변이체 항체들의 결합 친화도의 요약을 제공한다. 도 6의 2개의 원은, H292 세포 또는 SCC-15 세포에서 EGFR 인산화를 억제하는 항체의 능력(EGFR 활성의 억제를 나타냄)에 관한 상기 기술된 시험관내 결과(또는 유사한 시험으로부터의 결과)를 반영한다. 도 6에 기술되는 바와 같이, Ab1 변이체 항체는 2개의 그룹(그룹 1 및 그룹 2)으로 분류될 수 있다: 도 7에 제공되는 결과에 기초하여 시험된 종양 세포주에서 시험관내 EGFR 신호전달을 억제하지 않는 그룹(Ab1, AbA, AbB, AbD, AbE, 및 AbF 포함; 도 6에서 그룹 1로 지칭함), 및 도 7에 기술되는 바와 같이 시험된 종양 세포주에서 시험관내 EGFR 신호전달을 억제하는 그룹(AbG, AbH, AbL, AbK, AbJ, AbM, AbN, AbO, 및 AbP 포함; 도 6에서 그룹 2로 지칭함). 도 6에 제공되는 비교는 Ab1의 변이체 항체는 전부 Ab1에 비하여 EGFR(1-525)에 대해 더 높은 친화도를 가졌다는 것, 그리고, 1 x 10-4s-1 미만의 Kd를 갖는 항체들(그룹 2)은 도 7에 제시된 결과에 기술되는 바와 같이 시험관내에서 EGFR-신호전달을 유의하게 억제할 수 있었다는 것을 나타낸다. 도 6에 기술되는 바와 같이, Ab1의 성숙 프로세스는 주로 향상된 오프-속도를 갖는 Ab1 변이체를 초래하였다.
A431 종양 세포주의 시험관내 분석
또한, EGFR의 EGF-매개된 인산화를 억제하는 Ab1 및 Ab1 변이체 항체들의 능력은 포스포-EGFR ELISA 검정을 이용하여 A431 사람 상피 암종 세포를 이용하여 시험하였다. A431 세포는 야생형 EGFR을 발현한다.
성장 배지에서 콜라겐 코팅된 96-웰 디쉬에 웰당 20,000으로 세포를 플레이팅하였다. 24시간 후, 세포를 무혈청 배지로 세척하였고, 4시간 동안 혈청 절식시켰다. 적절한 경우, 세포를 모노클로날 항체로 1시간 동안 전처리하였고, 이어서, 37℃에서 10분 동안 재조합 EGF로 자극하였다. EGF 자극 후, 세포를 빙냉 PBS로 2회 세척하였고, 프로테아제 억제제가 보충된 세포 용해 완충액 100μL/웰로 용해시켰고, -80℃에서 적어도 20분 동안 급속-냉동시켰다. 포획 플레이트는 웰을 50μL의 항-EGFR 항체(R&D systems, 파트 넘버 841402, 0.8㎍/mL)로 사전-코팅함으로써, 이어서, PBS/1% BSA 처리로 1시간 동안 차단함으로써 생성되었고, Tween-Tris 완충된 염수(TTBS)로 3회 세척하였다. 세포 용해물을 포획 플레이트에 부가하였고 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 플레이트를 TTBS에서 5회 세척하였고, pTry-서양 고추냉이 퍼옥시다제(R&D Systems, DYC1095)로 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 TTBS에서 5회 세척하였고, 100μL의 3,3,5,5-테트라메틸벤지딘(TMB)을 각각의 웰에 부가하였고, 색이 발현될 때까지 실온에서 인큐베이션하였다. 1N HCl의 부가에 의해 반응을 정지시켰고, 450nm에서 OD를 판독하였다.
A431 억제 연구로부터의 결과는 도 8a 및 도 8b에 기술되어 있고, Ab1 변이체 항체가 A431 세포에서 EGFR 활성을 억제하는 이들의 능력의 범위를 보여주었음을 나타낸다. 도 8a에 나타낸 바와 같이, Ab1 및 변이체들 AbA, AbB, AbC, AbD, AbE, 및 AbF는 1333nM의 항체 농도에서도 A431 세포에서 EGFR 신호전달(EGFR의 EGF-매개된 인산화에 의해 측정됨)을 억제하는데 효과적이지 않았다. 대조적으로, Ab1 변이체 항체들 AbG, AbH, AbJ, AbK, AbL, AbM, AbN, AbO, AbP, 및 AbQ는 Ab2보다 더 높은 농도에서도 Ab1보다 EGFR 인산화를 차단하는데 더 효과적이었다. EGFR에 결합하지 않는 대조군 1 항체는 A431 세포의 EGFR 억제에 대한 영향을 갖지 않았다.
도 8b는 항체 Ab1, AbP 및 Ab2에 관해 도 8a에 제공된 데이터에 대한 연장 설명이다. 도 8b에 기술되는 바와 같이, Ab1은 Ab2 또는 AbP와 비교하여 낮은 수준, 즉, 평균 10% 이하의 억제를 나타냈다. Ab1은 A431 세포에서의 EGFR 신호전달의 억제시 1333nM 초과의 IC50 값을 갖는 것으로 측정되었지만, AbP는 40nM 초과의 IC50 값을 가졌고, 이는 Ab1에 비하여 향상된 것이었다. Ab2는 2.3nM 초과의 IC50 값을 가졌다.
실시예 5: 시험관내 각질세포 결합 검정에서의 항-EGFR 항체의 FAC 분석
각질세포 FAC 결합 검정을 수행하여 정상 사람 표피 각질세포(NHEK) 세포에 대한 Ab1 변이체 항체의 결합 친화도를 측정하였다. NHEK 세포는 야생형 EGFR을 발현한다.
트립신을 이용하여 대략 80% 컨플루언스일 때 세포를 수거하였고, 중화시켰고, PBS/1% FBS(FACS 완충액)에서 1회 세척하였고, 이어서, FACS 완충액에 2.5 x 106세포/mL로 재현탁시켰다. 환저 96-웰 플레이트에 웰당 100μL의 세포를 부가하였다. 10x 농도의 Ab의 10μL(최종 농도는 도면에 열거된다)를 부가하였고, 플레이트를 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 웰을 FACS 완충액으로 2회 세척하였고, 이어서, FACS 완충액에 희석된 2차 항체(AlexaFluor 488) 50μL에 재현탁시켰다. 상기 플레이트를 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였고, 이어서, FACS 완충액으로 2회 세척하였다. 이어서, 세포를 100μL의 PBS/1% 포름알데하이드에 재현탁시켰고, Becton Dickinson LSRII 유동 세포측정기에서 분석하였다. 데이터는 WinList 유동 세포측정 분석 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.
시험관내 각질세포 결합 검정으로부터의 결과는 도 9에 기술되고, 이는, 표지된 AbA, AbG, AbK, AbM, 및 AbP 항체의 농도가 증가함에 따라 각질세포 상의 EGFR의 결합으로 인하여 측정된 형광성이 증가하였음을 나타낸다. Ab2는 양성 대조군으로서 사용하였고, NHEK 세포에의 항체의 부가로 증가된 형광성을 초래하였다. Ab1은 항체의 높은 농도에서도 훨씬 더 낮은 수준의 결합을 보여주었다.
도 9에 제시된 결과는 시험된 Ab1 변이체 항체가 각질세포 상의 야생형 EGFR에 결합하고 Ab1(및 음성 대조군, 대조군 1 항체)보다 더 큰 정상 사람 표피 각질세포에 대한 친화도를 갖는다는 것을 나타낸다. 도 9의 결과는 또한 항체 AbA, AbG, AbK, AbM 및 AbP가 Ab와 비교하여 정상 사람 표피 각질세포에 더 낮은 결합을 가짐을 보여준다. 이들 결과는 Ab1 변이체 항체가 Ab1보다 더 우수하게 각질세포 상의 야생형 EGFR에 결합할 수 있음을 나타낸다.
실시예 6: 종양에 대한 항-EGFR 항체의 생체내 분석
생체내 종양 성장에 대한 Ab1 변이체 항체의 효과를 마우스 이종이식편 검정을 이용하여 평가하였다.
Charles River(Wilmington, MA)로부터 SCID 및 흉선제거 CD-1 누드 마우스를 수득하였다. 10마리 마우스를 케이지에 수용하였다. 도착시 마우스의 체중은 18 내지 20g이었다. 모든 실험은 the Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care에 의해 인가된 시설에서 the National Institutes of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals 가이드라인에 따라 수행하였다. 각각의 피하 연구를 위해, 0일째 마우스의 우측 옆구리에 살아있는 세포를 피하 접종하였다. S-MEM 및 Matrigel(BD, Franklin Lakes, NJ)의 1:1 혼합물로 이루어진 주사 용적은 0.2mL였다. 종양은 대략 200 내지 250㎣로 사이즈 정합(size matching)되었다. 치료요법은 종양의 사이즈 정합일에 또는 사이즈 정합 24시간 후에 시작하였다. 사람 IgG 혼합물 대조군을 음성 대조군(사람 혈청과 유사한 정제된 사람 IgG; Innovative Research)으로서 사용하였다. 치료요법 개시시 마우스는 대략 25g으로 칭량되었다. 종양 체적은 매주 2 내지 3회 평가하였다. 종양의 길이(L) 및 폭(W)의 측정값은 전자 캘리퍼(caliper)를 통해 취하였고, 체적은 하기 식: V = (L x W2)/2에 따라 계산하였다. 종양 체적이 3,000㎣에 도달하였을 때 또는 피부 궤양이 발생하였을 때 마우스를 안락사시켰다. 적절한 양의 항체 스톡을 투여하기 전에 포스페이트 완충된 염수에 희석시켰다. 약물을 도면에 표시된 바와 같이 복강내 투여하였다. H292(사람 비-소세포 폐 암종(NSCLC)) 세포를 이종이식편 연구에 사용하였다.
생체내 실험으로부터의 결과는 Ab1 변이체 항체 AbA, AbG, AbK, AbM, 및 AbP가 Ab1에 비하여 종양 성장을 유의하게 억제할 수 있었음을 보여준다(도 10 참조). Ab1 변이체 항체는 또한 Ab1에 비하여 반응의 지속시간의 지속성(durability)을 증가시킬 수 있었고, 예를 들면, 종양 세포 주사 후 약 18일 동안 500㎣ 미만의 종양 체적을 유지하였던 Ab1에 비하여 AbA는 (동일한 용량 및 투여 스케쥴에 따라) 500㎣ 미만의 종양 체적을 29일 동안 유지하였다. 도 10에 나타낸 바와 같이, 20일째에, AbA가 주사된 마우스는 대략 300㎣의 종양 체적을 나타냈고, 반면 20일째에 Ab1이 주사된 마우스는 대략 700㎣의 체적을 갖는 종양을 나타냈다. 29일째까지, AbA 주사된 마우스는 20일째의 크기와 비교하여 유사한 체적(즉, 대략 300㎣)을 갖는 종양을 나타냈고, 반면, Ab1 주사된 마우스는 약 1000㎣로 종양 체적이 증가하였다.
도 10에 기술된 결과를 정량하기 위해서 종양 성장 억제율(%TGI)을 계산하였다. 도 10에 기술된 항체들에 대한 %TGI는 하기와 같다:
AbA = 74
AbG = 88
AbK = 90
AbM = 84
AbP = 86
Ab1 = 31
Ab2 = 73
%TGI 값은 사람 IgG 대조군으로 치료된 마우스의 종양 체적에 비한다. 상기 기술되는 바와 같이, Ab1은 사람 IgG 대조군에 비해 31% TGI를 초래하였고, 반면, AbA는 계산된 75% TGI를 가졌다. 특히, Ab1 변이체 항체는 Ab2에 비하여 같거나 더 큰 %TGI를 나타냈다.
AbA는 H292 이종이식편 종양 모델에서 생체내에서 반응의 지속성을 증가시키고 종양 체적을 감소시킬 수 있었지만(도 10에 기술된 바와 같음), 실시예 4 및 도 7에 기술되는 바와 같이 동일한 세포주에서 시험관내에서 EGFR의 인산화를 억제하는데 실패하였다. 생체내 항체 AbA 활성은 또한 EGFR(1-252) 및 EGFRvIII에 대해 더 낮은 결합 친화도를 가짐에도 불구하고 항체 AbG, AbK, AbM 및 AbP와 비슷하였다(도 3 참조). 따라서, AbA가 시험관내 세포 신호전달 억제를 거의 나타내지 않았다는 사실에도 불구하고, AbA는 생체내 H292 종양 세포 성장을, 보다 큰 친화도 값을 갖는 다른 항-EGFR 변이체 항체들, 예를 들면, AbK, AbM 및 AbP와 유사한 방식으로 감소시키거나 억제하였다.
실시예 7: AbA ADC를 이용한 생체내 종양 성장 억제 검정
생체내 마우스 이종이식편 검정을 이용하여, 종양 성장을 억제하는 AbA-vcMMAE ADC의 능력을 측정하였다. 이러한 실시예에서 사용되는 AbA ADC는 실시예 8에 기술된 방법에 따라 접합시켰지만, 본원에 기술된 배치 정제 방법에 따라 정제되지 않았다. 본 실시예에서 사용된 AbA ADC 조성물에 대한 평균 DAR은 3.7이었다. 2개의 상이한 NSCLC 세포주, NCI-H1703 및 EBC1을 이용하여 마우스 이종이식편 검정(실시예 6에 기술된 것과 유사함)을 수행하였다. 2개의 상이한 세포주로부터의 결과는 도 14에 제공된다.
도 14a에 나타낸 바와 같이, (1mg/kg 체중의 용량으로의) AbA-vcMMAE는 (10mg/kg 체중의 용량으로의) Ab1보다 그리고 Ab1 및 MMAF를 mc 링커와 함께 포함하는 Ab1 ADC와 비교하여 NCI-H1703 세포에서 종양 체적을 감소시키고 반응의 지속성을 증가시키는데 더욱 우수하였다. (10m/kg의 용량으로의) Ab1 단독은, 음성 대조군, 10mg/kg의 용량으로 종양 성장을 억제하지 않았던 항체 대조군 2(항-파상풍 독소 항체)와 유사한 종양 체적 억제의 전체적 결여를 초래하였다.
또한, AbA-vcMMAE ADC의 효능은 EBC1 세포를 이용하여 이종이식편 마우스 모델에서 연구하였다. 연구로부터의 결과는 도 14b에 나타내고, 이는 (3mg/kg 체중의 용량으로의) AbA-mcMMAF ADC가 (3mg/kg 체중의 용량으로의) Ab1과 비교하여 그리고 (3mg/kg 체중의 용량으로의) Ab1 및 MMAF를 mc 링커와 함께 포함하는 Ab1 ADC와 비교하여 종양 체적을 감소시키고 반응의 지속성을 증가시키는데 보다 효과적이었음을 나타낸다.
요약하면, 도 14에서의 결과는 2개의 상이한 AbA 아우리스타틴 ADC(AbA-vcMMAE 및 AbA-mcMMAF)가 Ab1 단독 또는 Ab1-MMAF ADC에 비하여 종양 체적을 감소시키고 생체내 반응의 지속성을 증가시키는데 효과적이었음을 보여준다.
실시예 8: 정제된 항-EGFR 항체 약물 접합체(ADC)
발린-시트룰린(vc) 링커를 통해 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE)에 링크된 AbA 항체를 포함하는 항체 약물 접합체(ADC)를 제조하였다. AbA-vcMMAE로서 언급된 이러한 ADC의 다이아그램은 도 11에 기술된다.
vcMMAE와의 AbA 항체의 접합은 AbA의 부분적 환원으로 시작되었고, 이어서, Val-Cit-MMAE(vcMMAE)와 반응시켰다. AbA 항체(20mg/mL)는 TCEP(TCEP:mAb의 몰 당량은 2.1이다)의 부가에 의해 부분적으로 환원되었고, 이어서, 0℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이어서, 환원 반응물을 20℃로 가온하였다. 모든 티올을 접합시키기 위해서, vcMMAE를 1.15의 최종 vcMMAE:환원된 Cys 몰 비로 부가하였다. CMSO의 10% v/v의 존재 하에 접합 반응을 수행하였고, 20℃에서 60분 동안 진행하였다.
접합 반응 후, 과량의 유리 N(아세틸)-시스테인(2당량 대 vcMMAE 전하)을 부가하여, Cys-Val-Cit-MMAE 부가물을 생산하는 미반응 vcMMAE를 켄칭(quench)하였다. Cys 켄칭 반응 20℃에서 대략 30분 동안 진행시켰다. Cys-켄칭된 반응 혼합물을 하기에 따라 정제하였다.
상기 접합 방법은 또한 항체에 mcMMAF를 접합시키기 위해 사용될 수 있다.
배치 정제
배치 정제 방법을 이용하여 AbA ADC를 정제하였다. 반응 혼합물을 물 세척된 Bu-HIC 수지(ToyoPearl; Tosoh Biosciences)의 적정량으로 처리하였다, 즉, 상기 혼합물에 7중량의 수지를 부가하였다. 수지 / 반응 혼합물을 적절한 시간 동안 교반하였고, 약물 접합체 생성물의 제거를 위해 분석적 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 모니터링하였고, 거친(coarse) 폴리프로필렌 필터를 통해 여과하였고, 2층(two bed) 체적의 완충액(0.28M 염화 나트륨, 7mM 인산 칼륨, pH 7)에 의해 세척하였다. 합한 여과물 및 세정액을 합하였고, HIC HPLC에 의한 생성물 프로파일에 대해 분석하였다. 합한 여과물 및 세정액은 한외여과 / 정용여과(UF/DF)에 의해 10 diavolumes 15nM 히스티딘 완충액을 이용하여 15mM 히스티틴, pH 6으로 완충액 교환되었다.
접합 및 정제 후, 얻어진 ADC 혼합물의 분석적 분석을 수행하였다. 샘플을 채취하였고, 소수성 상호작용 크로마토그래피-고성능 액체 크로마토그래피(HIC-HPLC)를 이용하여 분석하였다. 사용된 컬럼은 TSK 겔 Butyl-NRP 컬럼(4.6mm ID x 3.5cm, 2.5㎛, 30℃; Tosoh Bioscience LLC, Japan)이었고, 0.8mL/분의 유속으로 사용하였다. 이동상은 A: 25mM Na2HPO4, pH7, 1.5M (NH4)2SO 및 B: 25mM Na2HPO4, pH7(75%) 대 IPA(25%)를 포함하였다. 사용된 농도구배는 2분 동안 0% 상 B, 12분 동안 0 내지 100% B였고 1분 동안 유지되었다.
단백질 함량은 UV 분석을 이용하여 분석하였다. HIC 미량 분석(trace analysis)은 표 4 및 도 12에 하기 기술되는 바와 같이 AbA-vcMMAE에 대해 얻어진 평균 약물 대 항체 비(DAR)는 3.1이었음을 보여주었다. 평균 DAR은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8 ADC 생성물을 합하고 PA%(PA%는 필수 약물 부하에 의해 A280에서의 피크 아래 측정된 면적에 의해 결정되는 피크 면적 백분율이다)를 곱하고 100으로 나눔으로써 결정되었다.
Figure pat00051
표 4 및 도 12로부터 밝혀질 수 있는 바와 같이, AbA-vcMMAE의 배치 정제는 2 내지 4의 DAR을 초래하였다. 초기 평균 DAR은 4.1이었고, 여기서, 정제 후 최종 평균 DAR은 3.1이었다.
AbA-vcMMAE ADC 혼합물은 또한 크기-배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 분석하였다. SEC HPLC는 Tosoh TSKgel GS3000SWXL 컬럼(7.58 x 30cm, 5㎛)을 이용하여 수행하였다. 0.3mL/분의 유속을 사용하였다. 이동상은 92.5%의 25mM Na2PO4, pH 6.8, 350mM NaCl 및 7.5%의 이소프로필 알콜(IPA)을 포함하였다. 희석제는 이동상이었고, 214nm의 UV로 분석을 수행하였다. 214nm에서의 SEC pa% 결과는 하기 표 5에 제공된다. SEC 결과는 도 13에 나타낸다.
Figure pat00052
따라서, AbA-vcMMAE의 배치 정제는 2 내지 4 사이의 DAR을 초래하였고, 평균 3.1이었다.
실시예 9: AbA-MMAE ADC를 이용한 생체내 종양 성장 억제 검정
실시예 8에 기술된 바와 같이, 조성물 내의 ADC의 평균 DAR이 3.1이 되도록 AbA-vcMMAE의 정제된 조성물을 조제하였다. 후속적으로 정제된 AbA ADC 조성물이 생체내 종양 성장을 억제하는데 효과적인지를 측정하기 위해서 폐암 이종이식편 모델을 이용하여 상기 정제된 ADC를 시험하였다. 보다 구체적으로, 이종이식편 종양 성장 억제 검정을 수행하여 NCI-H292 세포(사람 NSCLC 암종 세포주)에 대한 정제된 AbA-vcMMAE(Ab1-vcMMAEp)의 효과를 평가하였다.
도 15a에 제공되는 결과는 (3mg/kg 체중의 용량으로의) AbA-vcMMAEp가, 정제되지 않은 AbA-vcMMAE와 비교하는 경우 NCI-H292 세포에서 종양 체적을 감소시키고 반응의 지속시간을 연장시키는데(반응의 지속성을 증가시키는데) 보다 효과적이었음을 입증한다. 유사하게, 도 15b는 (6mg/kg 체중의 용량으로의) 정제된 AbA-vcMMAEp도 AbA-vcMMAE의 정제되지 않은 형태와 비교하여 종양 성장을 억제하는데 보다 효과적이었음을 입증한다. 도 15a 및 도 15b 둘 다에 기술되는 바와 같이, 정제된 AbA-vcMMAE는 또한 음성 대조군 2 항체(단독 또는 MMAE에 접합됨), 정제되지 않거나 정제된 형태로의 MMAE 또는 MMAF에 접합된 Ab1보다 종양 체적을 감소시키고 반응의 지속시간을 연장시키는데 더 효과적이었다. 대조군 2 항체는 EGFR에 결합하지 않는 항-파상풍 독소 항체이다.
NCI-H292 세포(폐 암종 세포주; ATCC® CRL-1848™)에 대한 정제된 AbA-vcMMAE(Ab1-vcMMAEp)의 효과를 평가하는 추가의 연구에서, 정제된 AbA-vcMMAE를 3mg/kg 및 6mg/kg의 용량 대 유사한 용량으로의 Ab1-mcMMAF으로 시험하였다. NSCLC 종양 모델에서의 이러한 제2 연구의 결과는 도 18에 제공되고, 이는 정제된 AbA-vcMMAEp가 AbA-vcMMAE와 비교하는 경우 종양 성장을 억제하는데 보다 효과적이었음을 입증한다.
실시예 10: AbA-vcMMAE의 유동 통과 프로세스 정제
유동 통과 프로세스를 이용하여 항체당 vc-MMAE 분자의 감소된 약물 부하를 갖는 AbA-vcMMAE ADC를 포함하는 조성물을 제조하였다. AbA-vcMMAE ADC의 조제는 실시예 7에 상기 기술되어 있다.
DAR의 소정 범위(1 내지 8)를 갖는 ADC를 갖는 AbA-vcMMAE의 조성물을 정제하기 위한 유동 통과 프로세스를 하기에 따라 수행하였다. Bu-HIC 수지의 5mL 컬럼을 우선 대략 28mM의 NaCl, 7mM 인산 칼륨, pH 7로 평형화시켰다. 상기 반응 혼합물을 후속적으로 1.95M NaCl, 50mM 인산 칼륨, pH 7을 이용하여 1/6 체적으로 희석시켰고, 대략 수지 mL당 100mg 단백질의 비로 1mL/분의 유속(대략 5분의 체류 시간 또는 36cm/hr 선형 유동)으로 수지에 부하하였다. 1부의 이소프로판올 및 10부(체적)의 28mM NaCl, 7mM 인산 칼륨, pH 7로 이루어진 세정액을 약 12 컬럼 체적에 대한 세정액으로서 적용시켰다. 대략 1 컬럼 체적 후 시작하여 UV 신호가 평형화될 때까지 생성물을 수집하였다(이는 또한 분획으로 수집될 수 있다). 분획은 HIC HPLC에 의해 분석하였고, 원하는 분취액을 함께 풀링하였고, TFF(접선 유동 여과)에 의해 농축시켰고, 10 diavolume의 히스티딘 완충액을 이용하여 15mM 히스티딘, pH 6으로 교환하였다. 하기 표 6은 정제 전 및 정제 후의 반응 혼합물의 순도 결과를 제공한다.
Figure pat00053
실시예 8에 기술된 배치 정제와 비교하여, 단백질 대 수지의 부하는 각각의 정제 방식(배치 정제 및 유동 통과 정제)에 대해 비슷하였다. 배치 정제 프로세스에서, 효력 조정된 기준에 근거하여 ADC에 대해 2.26중량의 수지를 사용하였다. 수지의 밀도는 대략 0.23g/ml였다. 따라서, 예를 들면, 10g의 ADC를 사용한 경우, 98.2ml의 수지를 사용하였다. 사용된 부하는 (10g x 1000ml/L)/98.2ml = 102g/L 부하였다. 유동 통과 정제 실험은 100g/L의 부하를 표적으로 한다. 각각의 경우, 유동 통과 정제 세정액이 10% IPA v/v이었던 것을 제외하고는 부하 용액 및 세정 용액은 동일하였다.
실시예 8에 기술된 배치 정제 방법을 이용하여 수득된 정제된 AbA-vc-MMAE 조성물과 상기 기술된 유동 통과 프로세스를 이용하여 수득된 정제된 AbA-vcMMAE 조성물 사이의 비교는 표 7에 제공된다.
Figure pat00054
요약하면, 유동 통과 및 배치 정제 프로세스 둘 다는 2 내지 4의 DAR을 갖는 ADC 약 80%를 포함하는 조성물을 수득하는데 있어서 성공적이었고, 여기서, 0 내지 1 또는 5 내지 8의 DAR을 갖는 ADC의 양은 예를 들면, 표 7에 나타낸 바와 같이 조성물 중의 전체 ADC 집단의 약 20% 미만으로 제한되었다.
실시예 11: AbA MMAE ADC를 이용한 생체내 종양 성장 억제 검정
생체내 마우스 이종이식편 검정을 이용하여 교모세포종 종양 성장을 억제하는 AbA-vcMMAE ADC의 능력을 측정하였다. U87MGde2-7 세포(이는 EGFRvIII을 발현한다)를 이용하여 마우스 이종이식폄 검정(실시예 6에서 수행된 것과 유사함)을 수행하였다. U87 세포는 사람 악성 신경교종(ATCC No. HTB-14™)으로부터 유도된다. 연구를 위해, 종양 세포를 50% Matrigel(BD BioSciences, Franklin Lakes, NJ)과 혼합하였고, 0일째에 6 내지 8주령 Nu/Nu 암컷 마우스의 옆구리에 3 x 106 세포를 피하 접종하였다(Nu/Nu 암컷 마우스는 Charles River(Wilmington, MA)로부터 수득되었다). 종양의 길이(L) 및 폭(W)의 측정값은 전자 캘리퍼를 통해 취하였고, 체적은 하기 식: V = (L x W2)/2에 따라 계산하였다. 종양 체적이 3,000㎣에 도달하였을 때 또는 피부 궤양이 발생하였을 때 마우스를 안락사시켰다. 도 19에 제공된 결과는 AbA-vcMMAEp가 교모세포종 세포 성장을 억제하는데 음성 대조군(대조군 2 항체; 항-파상풍 항체)보다 더 효과적이었음을 입증한다.
서열 요약
Figure pat00055
Figure pat00056
인용에 의한 포함
본 출원에 걸쳐 인용된 모든 참조문헌, 특허, 미등록(pending) 특허 출원 및 공개된 특허는 본원에 인용에 의해 명확히 포함된다.
등가범위
당해 분야 숙련가는 단지 일상적 실험만을 이용하여 본원에 기술된 본 발명의 특정 실시형태들에 대한 다수의 등가범위를 인식하거나 확인할 것이다. 이러한 등가범위는 하기 청구범위에 의해 포함되도록 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> ABBVIE, INC. <120> ANTI-EGFR ANTIBODIES AND ANTIBODY DRUG CONJUGATES <130> 117813-06220 <150> 61/968,819 <151> 2014-03-21 <160> 94 <170> KopatentIn 3.0 <210> 1 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Asp 20 25 30 Phe Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Asn Thr Arg Tyr Gln Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Thr Ala Gly Arg Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic 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Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Gln Tyr Asp Asp Phe Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 76 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 76 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Gly Arg Asp 20 25 30 Phe Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Asn Thr Arg Tyr Gln Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Thr Ala Ser Arg Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 77 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 77 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 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Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Thr Ala Ser Trp Gly Leu Pro Trp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 79 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 79 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ser Ser Gln Asp Ile Asn Met Asn 20 25 30 Val Gly Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Phe Lys Gly Leu Ile 35 40 45 Tyr His Gly Ala Ile Leu Asp Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Gln Tyr Ala Glu Phe Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 80 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 80 Gly Tyr Ser Ile Gly Lys Asp Phe Ala Trp Asn 1 5 10 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Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 86 gaggtgcaac tccaagagag cgggcccggc ctcgtgaagc cctctcagac tctgtccctg 60 acttgcactg tgagcgggta ttccatcagc agagacttcg catggaactg gatccgccag 120 cctcccggta agggactgga gtggatgggg tacatcagct acaacggtaa tacacgctat 180 cagccctccc tgaagtctcg cattaccatt agtcgcgata cctccaagaa ccagttcttt 240 ctgaaactca acagcgtgac agccgctgac accgccacct actactgcgt gaccgccagc 300 agggggttcc cttactgggg ccagggcact ctggtcaccg tttcttctgc gtcgaccaag 360 ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 420 ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 480 gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 540 ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 600 gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaaag ttgagcccaa atcttgtgac 660 aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 720 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 780 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 840 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 900 gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 960 aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1020 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gcgaggagat gaccaagaac 1080 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1140 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1200 ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1260 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1320 tccctgtctc cgggtaaa 1338 <210> 87 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 87 gacatccaga tgacccagtc cccctccagt atgtctgtgt ctgtgggcga ccgtgtgacc 60 attacctgcc actcctccca ggacatcaat agcaatatcg gttggttgca acagaagcca 120 ggcaagtcct tcaaagggct gatttaccat ggtaccaacc tggacgacgg ggttcctagt 180 cgtttcagcg gctccgggtc cggaaccgat tacactctga ccatcagcag tttgcagcct 240 gaggactttg ctacctatta ttgtgtgcag tacgctcagt tcccatggac tttcggcggg 300 ggcaccaaac tggagatcaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642 <210> 88 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 88 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys <210> 89 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 89 Met 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Claims (1)

  1. 항-사람 표피 성장 수용체(항-hEGFR: anti-human epidermal growth factor receptor) 항체 또는 이의 항원 결합부로서,
    a) 아미노산 서열 CGADSYEMEEDGVRKC(서열번호 45) 내의 에피토프에 결합하거나, 경쟁적 결합 검정시 표피 성장 인자 수용체 변이체 III(EGFRvIII)(서열번호 33)에 결합하기 위해 제2 항-hEGFR 항체와 경쟁하고(여기서, 상기 제2 항-EGFR 항체는 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다);
    b) 표면 플라스몬 공명에 의한 측정시 약 1 x 10-6M 이하의 해리 상수(Kd)로 EGFR(1-525)(서열번호 47)에 결합하고;
    c) 생체내 사람 비-소세포 폐 암종(NSCLC) 이종이식편 검정시, EGFR에 대해 특이적이지 않은 사람 IgG 항체에 비하여 약 50% 이상의 종양 성장 억제 %(TGI%)로 종양 성장을 억제하는(여기서, 상기 사람 IgG 항체는 NSCLC 이종이식편 검정시 항-hEGFR 항체 또는 이의 항원 결합부와 동일한 용량 및 빈도로 투여된다),
    항-사람 표피 성장 수용체(항-hEGFR) 항체 또는 이의 항원 결합부.
KR1020227005625A 2014-03-21 2015-03-20 항-ｅｇｆｒ 항체 및 항체 약물 접합체 Withdrawn KR20220025946A (ko)

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