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CN110845623B - 一种egfr特异性嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

一种egfr特异性嵌合抗原受体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种EGFR特异性嵌合抗原受体及其应用，其包括依次相连的跨膜信号区、胞外识别区、铰链区、跨膜区和胞内信号传导区。表面修饰有本发明的EGFR特异性嵌合抗原受体的CAR‑T对三阴性乳腺癌具有很强的肿瘤特异性抗原激活作用、细胞因子分泌功能以及肿瘤杀伤能力，在较低的效靶比下体外杀伤效率达90％以上，动物实验也验证了其显著的有效抑制作用，体内实验中也有显著的肿瘤抑制效果，表明本发明的EGFR特异性嵌合抗原受体的CAR‑T对三阴性乳腺癌具有良好的适用性。

Description

一种EGFR特异性嵌合抗原受体及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学和免疫学技术领域，具体涉及一种EGFR特异性嵌合抗原受体及其应用。
背景技术
2014年国家癌症中心的报告中指出乳腺癌在中国女性中的发病率为每10万人中41.82人(Cancer incidence and mortality in China，2014.Chinese Journal ofCancer Research，2018，30(1)：1-12.)，位居女性恶性肿瘤首位。目前，中国每年乳腺癌发病数量超过16万例，同时还在以3％到4％的速度递增。统计数据显示，中国主要城市的乳腺癌发病率在10年间增长了37％，死亡率增长了38.9％。因此，乳腺癌的防治在我国存在着巨大的医疗健康需求。其中，三阴乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)占所有类型乳腺癌的12-17％，与其他类型乳腺癌相比缺乏α-雌激素受体(estrogen receptor，ER)，孕激素受体(progesterone receptor，PR)和人类表皮生长因子受体2(human epidermalgrowth factor receptor-2，HER-2)的表达，因此三阴性乳腺癌侵袭性及转移性最强，激素治疗无效，也难以进行靶向治疗，临床预后极差。目前临床上主要治疗方法以蒽环和铂类化疗为主，但疗效不佳，通常由于药物耐受而复发，常面临着无药可治的局面。因此，对TNBC治疗新策略的研究具有极大的需求和意义。
在过去的几十年中，免疫疗法被证实是癌症治疗的有效方法(The future ofimmune checkpoint therapy.Science 2015，348(6230)：56-61.)，其中包括对供体T细胞进行被动免疫，利用具有免疫调节特性的免疫佐剂或细胞因子、癌症疫苗、嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell，CAR-T)以及免疫检查点阻断抗体等。这些疗法也陆续用于三阴性乳腺癌的治疗。目前研究者们已在多个临床实验中将以免疫检查点为靶点的抗体或小分子抑制剂用于三阴性乳腺癌的治疗，比如抗PD-1单抗Pembrolizumab、JS001、PDR001和Nivolumab以及抗PD-L1单抗Atezolizumab和Durvalumab等(Neoadjuvantinterferons：critical for effective PD-1-based immunotherapy in TNBC.CancerImmunol Res.2017；5：871-84.)。虽然单一用药并未取得特别好的疗效，但是来自英国伦敦玛丽皇后大学的研究人员证明了，通过将PD-L1抑制剂与传统化疗药物相结合的方法，可将三阴性乳腺癌患者的生存期延长10个月之久，其最新的研究成果发表于2018年的《新英格兰杂志》(Atezolizumab and Nab-Paclitaxel in advanced triple-negative breastcancer.The New England Journal of Medicine 2018，379(22)：2108-2121.)。这预示了免疫疗法将为三阴性乳腺癌患者带来新的希望。与此同时，在嵌合抗原受体T细胞的研究中，科学家们也已针对三阴性乳腺癌制备不同特异性靶点的嵌合抗原受体T细胞并展开临床前或临床试验，比如宾夕法尼亚大学的研究人员利用c-Met，这种在乳腺癌中异常激活且与不良预后相关的蛋白为靶标，制备二代CAR-T治疗难治型转移性乳腺癌患者，以及新诊断可手术的三阴性乳腺癌患者，进行I/II期临床试验(NCT01837602)，其I期临床结果表明此CAR-T不仅具有安全性而且在肿瘤注射位点产生显著的坏死区域，成功激活抗肿瘤效应(Safetv and efficacy of intratumoral injections of chimeric antigen receptor(CAR)T Cells in metastatic breast cancer.Cancer Immunology Research 2017，5(12)：1152)。另外，针对乳腺癌酪氨酸激酶受体ROR1的二代CAR-T治疗三阴性或转移性乳腺癌的I期临床试验也正在开展中(NCT02706362)，其良好的安全性已于2018年发表在《临床肿瘤学杂志》。
嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cells，CAR-T)是利用基因工程技术将能够特异性识别肿瘤表面抗原的CAR结构表达在T细胞表面形成的一种具有抗肿瘤活性的细胞。CAR-T输入病人体内后，可以不受MHC限制直接识别并结合肿瘤抗原，随后特异性激活T细胞，发挥抗肿瘤作用。目前全球共有两个CAR-T产品被FDA批准上市，分别是诺华的Kymriah和Kite制药的Yescarta，用于治疗B淋巴细胞白血病和淋巴瘤。CAR-T在血液瘤上的成功也预示了其在实体瘤上应用的可能性。
CAR的结构主要包括胞外抗原识别区、跨膜区和胞内信号传导区，此外还需要一个引导跨膜的信号肽。表达有特定CAR结构的T细胞可以通过胞外抗原识别区与肿瘤表面抗原特异性结合，产生T细胞活化的第一信号，并由胞内的共刺激结构域产生T细胞活化的第二信号，从而激活T细胞的免疫反应；活化产生的信号被报道通过ZAP70、TRAF1、PI3K、GRB2等分子进行放大，导致信号中间体及随后相关基因的上调，从而促进了T细胞的生存和功能(Chimeric antigen receptor T cell(CAR-T)immunotherapy for solid tumors：Lessons learned and strategies for moving forward[J].Journal of Hematology&Oncology，2018，11(1)：22.)；T细胞激活后，能分泌细胞因子(包括白介素、干扰素和肿瘤坏死因子)、穿孔素及颗粒酶等，并激活死亡受体，通过直接溶解、诱导肿瘤细胞凋亡坏死，及激活其他免疫细胞等，直接或间接导致肿瘤细胞死亡(Human CD4+T cells lyse targetcells via granzyme/pefforin upon circumvention of MHC class II restriction byan antibody-likeimmunoreceptor.J Immunol.2006；177(8)：5668-75.)。
由现有的研究和产品可知，CAR-T目前在血液瘤中得到了很好的应用，而在实体瘤上仍具有许多挑战。由于实体瘤中靶点的缺乏和部分抗原表达的异质性，因此针对特定肿瘤找到一个理想的肿瘤抗原作为靶点，一直是CAR-T成功运用于实体瘤治疗时需要面对的重要问题。
虽然TNBC缺乏乳腺癌中常用靶点ER、PR和HER-2的表达，但是研究发现表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor，EGFR)在78％的TNBC上高表达，其高表达显著高于其他类型的乳腺癌；EGFR的高表达也与预后差相关，说明EGFR是TNBC的一个潜在靶点(High EGFR gene copy number predicts poor outcome in triple-negative breastcancer.Modern Pathology，2014，27(9)：1212-1222.)。EGFR是ERBB家族的一个跨膜受体酪氨酸激酶。EGFR与配体结合后，胞内结构发生自磷酸化，随后激活下游RAS/MAPK和PI3K/AKT通路，从而导致细胞增殖、生存和药物耐受相关基因转录的上调(Cell signaling byreceptor tyrosine kinases，Cell，2000)。通过EGFR的抗体或小分子抑制剂阻断EGFR通路治疗TNBC的方法已开始在临床前和临床试验中进行研究。基于EGFR抗体设计的嵌合抗原受体T细胞，由于同时具有EGFR通路阻断作用和T细胞杀伤作用，相较之下更具优势。本发明首次阐明靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞对TNBC具有高效的抗肿瘤活性作用。
但在目前的研究中发现，EGFR-CAR-T并非对所有EGFR过表达的肿瘤都能有效运用。EGFR在许多恶性肿瘤细胞表面均高表达(The EGFR family and its ligands inhuman cancer.signalling mechanisms and therapeutic opportunities.EuropeanJournal ofCancer.37Suppl4，S3-8.)，其中包括表皮鳞癌、乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、肾癌及头颈部恶性肿瘤等，以EGFR为靶点的靶向治疗也被广泛应用于多种肿瘤。而靶向EGFR的CAR-T目前也已在临床上用于部分EGFR过表达肿瘤的治疗，其中一项临床实验的结果显示，11例非小细胞肺癌患者在靶向EGFR的CAR-T治疗后，2例患者出现部分响应，5例患者达到病情稳定，持续时间2-8个月；而17例胆管癌或胆囊癌患者接受靶向EGFR的CAR-T治疗后，出现1例完全响应，10例病情稳定，持续时间4个月(NCT01869166)。可见靶向EGFR的CAR-T在临床上的应用中，针对不同EGFR过表达肿瘤所产生的效果并不一致。CN104087607A中公开了一种特异性识别人EGFR的CAR-T，在相同效靶比下，对过表达EGFR的脑胶质瘤细胞U87的体外杀伤率高达98％，然而对过表达EGFR的胰腺癌细胞CFPAC-1的体外杀伤率仅为40％；CN103113470A也公开了一种靶向人EGFR的CAR-T，当效靶比提高到超过40∶1后，其对过表达EGFR的人表皮鳞癌细胞A431的体外杀伤率仍仅为50％左右。从目前结果上看靶向EGFR的CAR-T并非在所有EGFR过表达的肿瘤中都能有效应用，主要的研究还是集中在效果比较好的非小细胞肺癌及脑胶质瘤上，应用较为局限。EGFR作为一个在肿瘤上过表达同时影响肿瘤发生发展的重要靶点，有进一步扩大其在肿瘤治疗上的应用范围以及进一步提高治疗效果的需求。
此外，现研究表明过继性T细胞发挥抗肿瘤作用需要在体内有效扩增和持续。CD8阳性T细胞的分化过程经历从初始T细胞(
Figure BDA0002229606000000041
T cell，TN)到干细胞记忆T细胞(T stemcell memory cell，TSCM)，再到中心记忆T细胞(T central memory cell，TCM)，再到效应记忆T细胞(T effector memory cell，TEM)，最后分化为效应T细胞(T effector cell，TEFF)，这些细胞类型具有不同的基因表达水平，同时也表现出不同的活性。随着分化程度的增加，T细胞的效应功能逐渐增强，与之相反记忆功能逐渐下降，表现为增殖能力逐渐减弱，T细胞开始趋于耗竭状态。当分化成为耗竭性T细胞后，其增殖和细胞因子分泌的能力都大大下降，而抑制性受体表达水平升高，最终限制其抗肿瘤作用。CAR结构的改造通常赋予T细胞介导强大肿瘤细胞杀伤的效应功能，但T细胞的过度激活会驱使T细胞的耗竭，因此同时也可能反过来限制T细胞的持续性，因而现有的CAR-T虽然大多具有效应性却常面临着耗竭性强从而治疗效果不佳的困境。EGFR特异性CAR-T在临床上运用于治疗非小细胞肺癌的结果表明，11例非小细胞肺癌患者中2例产生部分响应，5例病情稳定，但持续时间仅为2-8个月，随后出现病情进展(NCT01869166)，由此看到目前EGFR特异性CAR-T的应用亟需进一步提高持续性并降低耗竭性。如果能在增强持续性的同时又保持一定的功能性，使CAR-T处于初始性T细胞及效应性T细胞平衡状态，将增强CAR-T的治疗效果(Calibration of CARactivation potential directs alternative T cell fates and therapeuticpotency，Nature Medicine 25，82-88(2019))。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种EGFR特异性嵌合抗原受体及其应用。
本发明的技术方案之一：
一种EGFR特异性嵌合抗原受体，包括依次相连的跨膜信号区、胞外识别区、铰链区、跨膜区和胞内信号传导区，其中
跨膜信号区来源于IL-2R，其氨基酸序列如SEQ ID NO.01所示；
胞外识别区来源于抗EGFR的西妥昔单抗，其氨基酸序列如SEQ ID NO.02所示；
铰链区来源于IgG1 Fc铰链区或IgG1 Hinge铰链区，其氨基酸序列分别如SEQ IDNO.03和04所示。
在本发明的一个优选实施方案中，所述跨膜区来源于CD28跨膜区，其氨基酸序列如SEQ ID NO.05所示。
在本发明的一个优选实施方案中，所述胞内信号传导区来源于CD28、4-1BB和CD3ζ中的至少一种，其氨基酸序列依次如SEQ ID NO.06、07和08所示。
在本发明的一个优选实施方案中，其氨基酸序列如SEQ ID NO.09、10、11或12所示。
进一步优选的，其核苷酸序列如SEQ ID NO.13、14、15或16所示。
本发明的技术方案之二：
一种重组慢病毒载体，包括包装载体和转移载体，该转移载体上装载有上述EGFR特异性嵌合抗原受体的核苷酸序列。
本发明的技术方案之三：
一种多核苷酸分子，其编码上述EGFR特异性嵌合抗原受体的氨基酸序列。
本发明的技术方案之四：
一种重组T细胞，其细胞膜表面修饰有上述EGFR特异性嵌合抗原受体，或被上述重组慢病毒载体所感染，或含有上述多核苷酸分子。
本发明的技术方案之五：
一种用于治疗三阴性乳腺癌的组合物，其包含上述EGFR特异性嵌合抗原受体、上述重组慢病毒载体、上述多核苷酸分子和上述重组T细胞中的至少一种。
在本发明的一个优选实施方案中，还包含药学上可接受的载体或辅料。
本发明的技术方案之六：
一种用于治疗胶质瘤的组合物，其包含上述EGFR特异性嵌合抗原受体、上述重组慢病毒载体、上述多核苷酸分子和上述重组T细胞中的至少一种。
在本发明的一个优选实施方案中，还包含药学上可接受的载体或辅料。
本发明的有益效果是：
1、表面修饰有本发明的EGFR特异性嵌合抗原受体的CAR-T对三阴性乳腺癌具有很强的肿瘤特异性抗原激活作用、细胞因子分泌功能以及肿瘤杀伤能力，在较低的效靶比(3∶1)下体外杀伤效率达90％以上，动物实验也验证了其显著的有效抑制作用，表明本发明的EGFR特异性嵌合抗原受体的CAR-T对三阴性乳腺癌具有良好的适用性。
2、表面修饰有本发明的EGFR特异性嵌合抗原受体的CAR-T在肿瘤的刺激活化作用下，具有延缓CAR-T耗竭、并增强CAR-T持续性的特点，成为对TNBC持续发挥肿瘤杀伤作用的关键。
3、通过高通量测序RNA-seq可知表面修饰有本发明的EGFR特异性嵌合抗原受体的CAR-T在肿瘤刺激下，能够上调肿瘤中细胞因子介导的信号通路、T细胞活化、细胞因子产生和干扰素反应等相关基因并下调肿瘤的细胞周期和DNA复制等相关基因，通过激活多种细胞信号通路对三阴性乳腺癌产生细胞毒性，这些信号通路包括但不限于granzymes-perforin-PARP，FAS-FADD-Caspase和IFNγ信号通路。
4、对于已证明的EGFR特异性CAR-T治疗有效的脑胶质瘤，表面修饰有本发明的EGFR特异性嵌合抗原受体的CAR-T同样具有较强的肿瘤特异性抗原激活作用、细胞因子分泌功能以及肿瘤杀伤能力，在较低的效靶比(3∶1)下体外杀伤效率可以达到90％以上。
附图说明
图1为本发明的EGFR特异性嵌合抗原受体Fc-EGFR CAR或Hinge-EGFR CAR的结构示意图。其中，Sp(signal peptide)1表示IL-2R来源的跨膜信号肽，EGFR scFv表示人源化EGFR特异性单链抗体，IgG1 Fc和IgG1 Hinge表示两种IgG1来源的铰链区，CD28 TM(transmembrane domain)表示CD28来源的跨膜结构区，CD28表示CD28来源的胞内共刺激信号域，4-1BB表示4-1BB来源的胞内共刺激信号域，CD3ζ表示CD3ζ来源的胞内信号域。
图2为本发明实施例2中使用抗人IgG1 Fc或抗人IgG(Fab′)2流式抗体，利用流式检测实施例1中转染60h后的293T上所述嵌合抗原受体的表达效率图。
图3为本发明实施例2中使用CD3ζ特异性抗体，利用Western blot检测实施例1中转染60h后的293T上所述嵌合抗原受体的表达效率图。
图4为本发明实施例3中所培养的人原代T淋巴细胞经过T细胞培养基富集培养后，T细胞表面标志物CD3和CD8的表达效率图。
图5为本发明实施例4中所制备的EGFR CAR-T表面CAR的表达效率图，其中A为含三代结构(胞内传导域为CD28+4-1BB+CD3ζ)的EGFR CAR-T(三代EGFR CAR-T)的CAR表达效率，B为含二代结构(胞内传导域为CD28+CD3ζ)的EGFR CAR-T(二代EGFR CAR-T)。
图6为本发明实施例4中所制备的EGFR CAR-T的扩增曲线图。
图7为本发明实施例5中的Western blot鉴定的不同乳腺癌细胞和正常乳腺上皮细胞(MCF10A)中EGFR的表达情况图，其中乳腺癌细胞包括雌激素受体阳性(ER+)(T47D，MCF7)、孕激素受体阳性(PR+)(BT474)、人类表皮生长因子受体阳性(HER2+)(SK-BR-3)和三阴性乳腺癌(TNBC)(MDA-MB-231，MDA-MB-468，HS578T，Hcc1806)细胞。
图8为本发明实施例5中的流式鉴定的三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231和MDA-MB-468)的EGFR表达情况图。
图9为本发明实施例6中的EGFR CAR-T与三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231和MDA-MB-468)共培养48h后的CFSE增殖情况图。
图10为本发明实施例6中的EGFR CAR-T与三阴性乳腺癌细胞系(MDA-MB-231和MDA-MB-468)共培养48h后表面激活标志物CD69(A)、CD25(B)的表达效率图。
图11为本发明实施例6中的EGFR CAR-T与三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231，MDA-MB-468)共培养48h后细胞因子(TNFa，IL2，IFNγ)的分泌量图。
图12为本发明实施例6中的EGFR CAR-T在不同效靶比(1∶1，3∶1，6∶1，10∶1)和时间(24h，48h，72h，96h)下对三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231，MDA-MB-468)的体外杀伤作用。
图13为本发明实施例7中的EGFR CAR-T与三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231)以效靶比1∶2共培养72h后，RNA-seq检测的CAR-T中表达上调和下调的基因数量图(RPKM＞0.5，FC＞4)。
图14为本发明实施例7中的EGFR CAR-T与三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231)以效靶比1∶2共培养72h后，通过热图(A)和箱图(B)显示的CAR-T细胞中的基因调控情况图。
图15为本发明实施例7中的EGFR CAR-T与三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231)以效靶比1∶2共培养72h后，CAR-T中表达上调基因(A)和表达下调基因(B)的GO富集分析图。
图16为本发明实施例7中的EGFR CAR-T与三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231)以效靶比1∶2共培养72h后，CAR-T细胞中效应/耗竭T细胞相关的代表基因(如TBX21、PLEK、GZMA等)下调且初始T细胞相关的代表基因(如CCR7、TCF7、TAF4B等)上调的情况图。
图17为本发明实施例7中的EGFR CAR-T与三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231)以效靶比1∶2共培养72h后，RT-qPCR检测的CAR-T细胞中效应/耗竭T细胞相关的代表基因(如TBX21、PLEK、GZMA等)(A)和初始T细胞相关的代表基因(如CCR7、TCF7、TAF4B等)(B)的表达情况图。
图18为本发明实施例8中的EGFR CAR-T与三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231)以效靶比1∶2共培养72h后，RNA-seq检测的MDA-MB-231中表达上调和下调的基因数量图(RPKM＞0.5，FC＞4)。
图19为本发明实施例8中的EGFR CAR-T与三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231)以效靶比1∶2共培养72h后，通过热图(A)和箱图(B)显示的CAR-T细胞中的基因调控情况图。
图20为本发明实施例8中的EGFR CAR-T与三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231以效靶比1∶2共培养72h后，MDA-MB-231中表达上调基因(A)和表达下调基因(B)的GO富集分析图。
图21为本发明实施例8中的EGFR CAR-T与三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231以效靶比1∶2共培养72h后，MDA-MB-231中与MHC通路、IFN-γ响应、细胞杀伤和细胞凋亡相关的代表基因(如TAP2、STAT1、GZMB、BAK1等)表达上调(A)，同时与细胞周期、DNA复制和细胞分裂相关的代表基因(如E2F1、MCM2、BUB1等)表达下调(B)的情况图。
图22为本发明实施例8中的EGFR CAR-T与三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231)以效靶比1∶2共培养72h后，RT-qPCR检测的MDA-MB-231中上调的代表基因(如TAP2、STAT1、GZMB、BAK1等)(A)和下调的代表基因(如E2F1、MCM2、BUB1等)(B)的表达情况图。
图23为本发明实施例8中的Western blot检测的EGFR CAR-T杀伤三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231)相关的granzymes-perforin-PARP，FAS-FADD-Caspase和IFNγ信号通路上蛋白的表达情况图。
图24为本发明实施例9中在剂量a(1.25×108个细胞/kg)、b(2.5×108个细胞/kg)、c(5×108个细胞/kg)的EGFR CAR-T治疗下，免疫缺陷小鼠中人三阴性乳腺癌MDA-MB-231皮下移植瘤在20天内的肿瘤活体成像(A)和肿瘤生长曲线(B)。
图25为本发明实施例9中在剂量a(1.25×108个细胞/kg)、b(2.5×108个细胞/kg)、c(5×108个细胞/kg)的EGFR CAR-T治疗后第20天，免疫缺陷小鼠中人三阴性乳腺癌MDA-MB-231皮下移植瘤的肿瘤荧光值(A)和肿瘤体积大小(B)。
图26为本发明实施例9中的EGFR CAR-T治疗三阴性乳腺癌MDA-MB-231后，治疗组和对照组小鼠解剖后的肿瘤、肝、肺上Ki67(A)、EGFR(B)、CD8(C)的免疫组化染色结果图。
图27为本发明实施例9中EGFR CAR-T治疗三阴性乳腺癌MDA-MB-231后，RT-qPCR检测的治疗组和对照组小鼠肿瘤组织中，EGFR CAR-T杀伤肿瘤相关的granzymes-perforin-PARP，FAS-FADD-Caspase和IFNγ信号通路上基因的表达情况图。
图28为本发明实施例5中流式鉴定的脑胶质瘤细胞(U87、U251和GBM-PDX)的EGFR表达情况图。
图29为本发明实施例6中EGFR CAR-T与脑胶质瘤细胞(U87、U251和GBM-PDX)共培养48h后的CFSE增殖情况图。
图30为本发明实施例6中的三代EGFR CAR-T与脑胶质瘤细胞(U87和GBM-PDX)共培养48h后表面激活标志物CD69(A)、CD25(B)的表达效率图。
图31为本发明实施例6中含IgG1 Fc铰链区或IgG1 Hinge铰链区的二代EGFR CAR-T与脑胶质瘤细胞U87共培养48h后表面激活标志物CD69的表达效率图。
图32为本发明实施例6中的三代EGFR CAR-T与脑胶质瘤细胞(U87和GBM-PDX)共培养48h后细胞因子(TNFa，IL2，IFNγ)的分泌量图。
图33为本发明实施例6中含IgG1 Fc铰链区或IgG1 Hinge铰链区的二代EGFR CAR-T与脑胶质瘤细胞U87共培养48h后IFNγ的分泌量图。
图34为本发明实施例6中的三代EGFRCAR-T在不同效靶比(1∶1，3∶1，6∶1，10∶1)和时间(24h，48h，72h，96h)下对脑胶质瘤细胞(U87和GBM-PDX)的体外杀伤作用图。
图35为本发明实施例6中含IgG1 Fc铰链区或IgG1 Hinge铰链区的二代EGFR CAR-T在不同效靶比(1∶1，3∶1，6∶1，10∶1)下对脑胶质瘤细胞U87在72h内的体外杀伤作用图。
图36为本发明实施例10中在剂量a(1.25×108个细胞/kg)、b(2.5×108个细胞/kg)、c(5×108个细胞/kg)的EGFR CAR-T治疗下，免疫缺陷小鼠中人脑胶质瘤U87原位移植瘤16天内的肿瘤活体成像(A)和肿瘤生长曲线(B)。
图37为剂量a(1.25×108个细胞/kg)、b(2.5×108个细胞/kg)、c(5×108个细胞/kg)的EGFR CAR-T治疗下，免疫缺陷小鼠中人脑胶质瘤U87原位移植瘤在治疗16天后的肿瘤终点荧光柱状图。
图38为本发明实施例10中在剂量a(1.25×108个细胞/kg)、b(2.5×108个细胞/kg)、c(5×108个细胞/kg)的EGFR CAR-T治疗下，免疫缺陷小鼠中病人原代IV级脑胶质瘤GBM-PDX(patient-derived xenograft)原位移植瘤在12天内的肿瘤活体成像(A)和肿瘤生长曲线(B)。
图39为剂量a(1.25×108个细胞/kg)、b(2.5×108个细胞/kg)、c(5×108个细胞/kg)的EGFR CAR-T治疗下，免疫缺陷小鼠中病人原代IV级脑胶质瘤GBM-PDX原位移植瘤在治疗12天后的肿瘤终点荧光柱状图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
下述实施例中，二代是指胞内信号传导区为CD28+CD3ζ，而三代是指胞内信号传导区为CD28+4-1BB+CD3ζ。
实施例1
本实施例为EGFR-CAR重组慢病毒载体的包装和制备方法，该EGFR-CRA包括如SEQID NO.09所示的EGFR-Fc-CAR(二代)、如SEQ ID NO.10所示的EGFR-Fc-CAR(三代)、如SEQID NO.11所示的EGFR-Hinge-CAR(二代)和如SEQ ID NO.12所示的EGFR-Hinge-CAR(三代)，核苷酸序列依次如SEQ ID NO.13-16所示。
在转染前两天，将293T以2.5×106铺于10cm板中，使用8mL完全培养基DMEM+10％FBS进行培养。转染前2-4h，将293T培养基更换为7mL完全培养基RMPI 1640+10％FBS。转染时将84μL PEI溶解于600μL基础培养基RMPI 1640中，静置2min；接着将42μg质粒溶解于600μL基础培养基RPMI 1640中，其中基于pCDH载体的EGFR-CAR重组转移载体、psPAX和pMD2G的比例为4∶3∶1，随后将PEI溶液加入质粒溶液中，立即震荡8s，静置8min后加入293T细胞中。转染12h后，将293T培养基更换为12mL完全培养基DMEM+10％FBS。转染60h后收取细胞上清，3500rpm离心5min，获得上清用0.22μm滤膜过滤，随后用Millipore超滤离心管浓缩20-40倍得到慢病毒。使用abm公司生产的qPCR Lentivirus Titration(Titer)Kit测定慢病毒滴度，滴度可以达到1×109IU/mL-1×1010 IU/mL。随后分装放置于-80℃保存。同时，收集转染60h后的293T细胞，通过实施例2中的检测方法验证慢病毒载体包装的有效性。
实施例2
本实施例为嵌合抗原受体在293T上表达的检测方法。
(1)流式细胞仪检测嵌合抗原受体在293T细胞表面的表达
收取实施例1中转染60h后的293T细胞，1000rpm离心5min去上清，PBS清洗2次，随后以1×106个/mL加入PBS悬浮细胞，加入相应的抗体4℃避光40min后PBS洗涤，重悬，最后流式细胞仪检测。其中Fc-EGFR-CAR由抗人IgG1 Fc抗体检测；Hinge-EGFR-CAR由抗人IgG(Fab′)2抗体检测。
(2)Western blot验证嵌合抗原受体在293T细胞中的表达
收取实施例1中转染60h后的293T细胞，通过RIPA裂解液裂解、超声、离心取上清、测浓度定量、煮样，进行Western blot检测。嵌合抗原受体由抗人CD3ζ抗体进行检测。
流式检测的结果如图2所示，可见慢病毒载体转染60h后，Fc-EGFR-CAR在293T细胞表面的表达效率为95.2％，Hinge-EGFR-CAR的表达效率为94.6％；同时图3所示的抗人CD3ζ抗体检测的Western blot结果也验证了慢病毒载体转染60h后，Fc-EGFR-CAR(75kDa)和Hinge-EGFR-CAR(50kDa)分别都在293T细胞中表达。
本实施例证明了实施例1制得的慢病毒载体在293T细胞上的成功转染，同时说明了本发明所设计的嵌合抗原受体可以高效表达在293T细胞表面。
实施例3
本实施例为人原代T淋巴细胞的分离和培养。
用人外周血淋巴细胞分离液Ficoll(天津灏洋公司生产)分离获得淋巴细胞，用含10％FBS及CD3、CD28抗体及细胞因子的X-VIVO(LONZA公司生产)培养基作为T细胞培养基，调整细胞密度为1×106个/mL进行培养，刺激培养72h后通过流式检测T细胞表面标志物CD3和CD8的表达，并使用实施例1制备得到的慢病毒进行感染。
结果如图4所示，分离培养的淋巴细胞99％为CD3阳性细胞，同时95％为CD8阳性的效应细胞，说明已分离得到可用于慢病毒感染制备CAR-T的效应性T细胞。
实施例4
本实施例为慢病毒感染人原代T细胞以制备EGFR CAR-T细胞。
使用实施例1中制备的慢病毒对实施例3中培养的人原代T淋巴细胞进行感染，可选择感染一次或感染两次
(1)感染一次：
将培养的人原代T淋巴细胞以每孔2×105个细胞接种到24孔板中，以MOI为100-400，加入实施例1中制备的慢病毒混合均匀，在板式离心机中800×g、32℃离心50-60min，进行感染，随后在37℃、5％CO2培养箱中培养12h后，取出细胞后1000rpm离心弃去上清，每孔用500μL新鲜T细胞培养基悬浮后加入24孔板中继续培养。
(2)感染两次：
按步骤(1)感染一次的操作至取出细胞后1000rpm离心弃去上清后，再次加入实施例1中制备的慢病毒混合均匀，在板式离心机中800×g、32℃离心50-60min，进行感染，随后在37℃、5％CO2培养箱中培养12h后，取出细胞后1000rpm离心弃去上清，每孔用500μL新鲜T细胞培养基悬浮后加入24孔板中继续培养。
将按步骤(1)或步骤(2)感染后的细胞以隔天换液的方式培养4-7天后获得本发明所述的EGFR CAR-T，随后通过血球计数板进行计数，检测细胞生长情况；同时通过流式检测所制备EGFR CAR-T表面的CAR表达效率：1000rpm离心5min去上清，PBS清洗2次，随后以1×106个/mL加入PBS悬浮细胞，加入相应的抗体4℃避光40min后PBS洗涤，重悬，最后流式细胞仪检测。其中Fc-EGFR-CAR修饰的CAR-T细胞由抗人IgG1 Fc抗体检测；Hinge-EGFR-CAR修饰的CAR-T细胞由抗人IgG(Fab′)2抗体检测。
结果如图5和图6所示。流式检测结果如图5所示，其中三代Fc-EGFR-CAR修饰的CAR-T细胞的表达效率为32.8％，三代Hinge-EGFR-CARA修饰的CAR-T细胞的表达效率为30.4％，同时二代Fc-EGFR-CAR修饰的CAR-T细胞的表达效率为33.3％。图6显示，所制备的三代Fc-EGFR-CAR修饰的CAR-T细胞在21天内由2.5×105个细胞有效扩增至原来的40倍。
本实施例说明所制备的EGFRCAR-T可有效扩增，且表面CAR表达效率达30％以上；三代中Fc-EGFR-CAR修饰的CAR-T细胞较Hinge-EGFR-CAR修饰的CAR-T细胞具有更好的扩增能力，因此三代中Fc-EGFR-CAR作为更优选的结构进行体内外活性验证。
实施例5
本实施例鉴定了三阴性乳腺癌细胞和脑胶质瘤细胞的EGFR表达情况。
选取多株乳腺癌细胞和正常乳腺上皮细胞(MCF10A)，其中乳腺癌细胞包括雌激素受体阳性(ER+)(T47D，MCF7)、孕激素受体阳性(PR+)(BT474)、人类表皮生长因子受体阳性(HER2+)(SK-BR-3)和三阴性乳腺癌(TNBC)(MDA-MB-231，MDA-MB-468，HS578T，Hcc1806)细胞。这些细胞通过RIPA裂解液裂解、超声、离心取上清、测浓度定量、煮样后，进行Westernblot检测。另外将三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231和MDA-MB-468)以及脑胶质瘤细胞(U87、U251和GBM-PDX)用EGFR特异性流式抗体孵育，使用流式细胞仪检测细胞表面的EGFR表达。
图7的Western blot结果显示，三阴性乳腺癌相较于正常乳腺上皮细胞和其他类型的乳腺癌细胞有更高的EGFR表达。图8和图28的流式结果显示，三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231和MDA-MB-468)及脑胶质瘤细胞(U87、U251和GBM-PDX)表面的EGFR表达效率均达到80％以上。其中MDA-MB-231和MDA-MB-468分别达到80.1％和99.3％，U87、U251和GBM-PDX分别达到98.1％、91.2％和99.8％。
本实施例确定了EGFR在三阴性乳腺癌相较于其他乳腺癌和正常乳腺上皮细胞有更高的表达，可作为三阴性乳腺癌的一个良好的靶点；另外确定了三阴性乳腺癌(MDA-MB-231和MDA-MB-468)和脑胶质瘤细胞(U87、U251和GBM-PDX)表面都高表达EGFR，可以用于EGFR CAR-T治疗EGFR过表达肿瘤的研究。
实施例6
本实施例为本发明所述EGFR CAR-T对EGFR过表达肿瘤细胞的体外功能验证。
(1)CFSE增殖能力：
使用CellTraceTMCFSE Cell Proliferation Kit(Thermo Fisher公司生产)对CAR-T细胞进行染色，将染色后的CAR-T细胞分别与以上鉴定的EGFR过表达肿瘤细胞(包括三阴性乳腺癌和脑胶质瘤)以1∶1的效靶比共培养48h，随后收集CAR-T细胞使用流式进行检测。
图9流式结果显示，与EGFR过表达的三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231和MDA-MB-468共培养后，EGFR CAR-T细胞可产生多个不容强度的荧光峰，说明产生了多代的增殖。
同样地，图29流式结果显示，与EGFR过表达的脑胶质瘤细胞GBM-PDX、U87和U251共培养后，EGFR CAR-T细胞也产生了多代的增殖。
(2)抗原刺激活化作用：分别取实施例4中获得的EGFR CAR-T细胞分别与以上鉴定的EGFR过表达肿瘤细胞(包括三阴性乳腺癌和脑胶质瘤细胞)以1∶1的效靶比共培养48h。使用流式检测共培养后的EGFR CAR-T表面的激活标志物CD69和CD25的表达。
图10的流式结果显示，与EGFR过表达的三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231和MDA-MB-468共培养后，CD8阳性的T细胞表面C69和CD25的表达率仅为1％左右，而CD8阳性的三代EGFR CAR-T细胞表面CD69和CD25的表达率可以达到30％以上。
同样地，图30的流式结果显示，与EGFR过表达的脑胶质瘤细胞U87和GBM-PDX共培养后，CD8阳性的T细胞表面CD69和CD25的表达率仅为1％左右，而CD8阳性的三代EGFR CAR-T细胞表面CD69和CD25的表达率可以达到20-30％。图31中二代EGFR CAR-T在脑胶质瘤细胞U87的刺激下，含IgG1 Fc铰链区或IgG1 Hinge铰链区的二代EGFR CAR-T都能产生激活作用，CD69表达率略低于三代EGFR CAR-T。
综上所述，EGFR CAR-T在与EGFR阳性肿瘤细胞共培养后，能够较T细胞产生更高的CD69和CD25表达，表明EGFR特异性嵌合抗原受体在抗原刺激下能够有效活化。
(3)细胞因子分泌能力的验证：分别取实施例4中得到的EGFR CAR-T与以上鉴定的EGFR过表达肿瘤细胞(包括三阴性乳腺癌和脑胶质瘤细胞)分别按如下效靶比共培养：1∶1、3∶1、6∶1、10∶1，共培养72h后，使用ELISA检测细胞上清中细胞因子TNFα、IL2和IFNγ的表达。
三代EGFR CAR-T的培养上清的ELISA结果如图11(三阴性乳腺癌上的实验结果)和图32(脑胶质瘤上的实验结果)所示，所述三代EGFR CAR-T在与EGFR过表达肿瘤细胞共培养后，可产生很高的细胞因子分泌量，且均呈现出效靶比梯度的依赖性，即效靶比越高，细胞因子分泌量越高；这些细胞因子包括TNFα、IL2和IFNγ，它们在介导肿瘤杀伤中发挥重要作用。以三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231为例，EGFR CAR-T以10∶1的效靶比与其共培养后，TNFα的分泌量达到200pg/mL以上，IL2的分泌量达到100pg/mL以上，IFNγ的分泌量则达到20000pg/mL以上。另外，二代EGFR CAR-T的培养上清的ELISA结果如图33所示，在脑胶质瘤细胞U87的刺激下，含IgG1 Fc铰链区或IgG1 Hinge铰链区的二代EGFR CAR-T的IFNγ分泌量也可达到20000pg/mL以上。(4)EGFR CAR-T对EGFR过表达肿瘤细胞的杀伤能力：分别取实施例4中得到的EGFR CAR-T与以上鉴定的EGFR过表达肿瘤细胞(包括三阴性乳腺癌和脑胶质瘤细胞)以如下效靶比共培养：1∶1、3∶1、6∶1、10∶1。使用xCELLigence多功能实时无标记细胞分析仪实时动态监测肿瘤细胞的细胞指数至96h，从而监测EGFR CAR-T对肿瘤细胞的杀伤。细胞杀伤率按以下公式进行计算：
Figure BDA0002229606000000141
其中三代EGFR CAR-T的体外杀伤效果结果如图12(三阴性乳腺癌上的实验结果)和图34(脑胶质瘤上的实验结果)所示，所述EGFR CAR-T对EGFR过表达肿瘤细胞的杀伤率呈现出效靶比和时间梯度的依赖性，即效靶比越高，杀伤率越高，且均能达90％以上的杀伤率。另外，二代EGFR CAR-T的体外杀伤结果如图35所示，在72h内含IgG1 Fc铰链区或IgG1Hinge铰链区的EGFR CAR-T对U87也能产生90％以上的杀伤率。
本实施例说明本发明所述EGFR CAR-T在体外与EGFR过表达肿瘤细胞共培养后能够有效增殖、激活和分泌大量细胞因子，并高效杀伤肿瘤细胞。
实施例7
本实施例鉴定了本发明所述的三代EGFR CAR-T细胞在三阴性乳腺癌细胞刺激下的基因特征变化。
用6孔板以4×105每孔接种肿瘤细胞，37℃、5％CO2培养箱中培养过夜，待肿瘤细胞贴壁后，以2×105每孔加入实施例4中所制备的EGFR CAR-T(所用CAR结构为三代Fc-EGFR-CAR)，共孵育72h；分离悬浮的EGFR CAR-T，用Eastep Super Total RNA Extraction Kit(Promega公司生产)提取总RNA，一部分送样测序进行RNA-seq检测，另一部分进行RT-qPCR检测。
结果图13-17显示，所述EGFR CAR-T与EGFR过表达肿瘤细胞共培养后，大量基因在转录水平上受到调控。其中图13显示EGFR CAR-T细胞与肿瘤细胞共孵育后，大量基因发生至少4倍的变化，其中3107个基因上调，852个基因下调，图14显示了这些基因的表达谱。图15的GO分析表明，CAR-T中表达上调的基因与初始T细胞特性相关(如，组织形态发生和发展的造血干细胞特性)；而CAR-T中表达下调的基因主要与效应T细胞特性相关(如，白细胞活化、DNA复制和细胞周期转变)。图16显示在三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231和脑胶质瘤细胞U87刺激后，耗竭T细胞相关的代表性基因(如TBX21、PLEK、GZMA等)表达下调，初始T细胞相关的代表性基因(如CCR7、TCF7、TAF4B等)表达上调。另外图17中显示了，通过RT-qPCR验证这些代表性基因的表达情况。
本实施例表明，在抗原刺激下，EGFR CAR-T细胞进入一种趋向初始T细胞的状态，这可能会增强持久性，延缓分化和T细胞衰竭。
实施例8
本实施例阐明了本发明所述的三代EGFR CAR-T细胞杀伤三阴性乳腺癌细胞的分子机制。
用6孔板以4×105每孔接种肿瘤细胞，37℃、5％CO2培养箱中培养过夜，待肿瘤细胞贴壁后，以2×105每孔加入实施例4中所制备的EGFR CAR-T(所用CAR结构为三代Fc-EGFR-CAR)，共孵育72h；弃去上清，保留贴壁的肿瘤细胞，用Eastep Super Total RNAExtraction Kit(Promega公司生产)提取总RNA，一部分送样测序进行RNA-seq检测，另一部分进行RT-qPCR和Western blot检测。
结果如图18-23所示。图18显示，EGFR CAR-T共培养MDA-MB-231细胞中，2369个基因表达上调，2053个基因表达下调，图19显示了这些基因的表达谱。图20的GO富集分析显示，MDA-MB-231细胞中表达上调基因最多的富集项与细胞因子介导的信号通路、T细胞活化、细胞因子产生和干扰素反应等相关(A)；而在MDA-MB-231细胞中，表达下调基因最多的富集项与细胞周期检查点和DNA复制等相关，这些对肿瘤的生长和增殖至关重要(B)。图21显示，MDA-MB-231中上调的代表性基因(如TAP2、STAT1、GZMB、BAK1等)和下调的代表性基因(如E2F1、MCM2、BUB1等)的表达热图。另外图22的结果通过RT-qPCR验证这些代表性基因的表达情况。MDA-MB-231中受到影响的这些基因表明，至少有三条主要信号通路参与了EGFRCAR-T介导的细胞杀伤，包括granzymes-perforin-PARP，FAS-FADD-Caspase和IFNγ信号通路，图23的Western blot结果验证了这些信号通路的激活。
本实施例说明EGFR CAR-T通过激活多种细胞信号通路对三阴性乳腺癌产生细胞毒性，这些信号通路包括但不限于granzymes-perforin-PARP，FAS-FADD-Caspase和FNγ信号通路。
实施例9
本实施例验证了本发明所述的三代EGFR CAR-T在免疫缺陷小鼠三阴性乳腺癌移植瘤模型中的抗肿瘤作用。
使用4-6周龄SCID免疫缺陷小鼠，皮下注射5×105个经转染和筛选过表达荧光素酶基因的MDA-MB-231细胞。肿瘤生长3-4天后，腹腔注射荧光素底物后通过活体成像检测肿瘤细胞产生的荧光强度。当荧光强度达到1×107-5×107p/sec/cm2/sr时，小鼠以每组三只分为三个治疗组和一个对照组，三个治疗组(即CAR-T a组、CAR-T b组和CAR-T c组)分别通过尾静脉注射a剂量(1.25×108个细胞/kg)、b剂量(2.5×108个细胞/kg)和c剂量(5×108个细胞/kg)的实施例4中所得到的EGFRCAR-T(所用CAR结构为三代Fc-EGFR-CAR)，并采用注射两天间隔一天的治疗策略，同时对照组(即Control组)尾静脉注射等体积PBS，之后持续通过活体成像检测各组肿瘤细胞的荧光强度，并测量各组肿瘤细胞的体积。治疗持续20天后，颈椎脱臼法处死小鼠，解剖出肝、肺和肿瘤组织，脱水、石蜡、切片后进行免疫组化染色。
治疗结果如图24-27所示。其中图24和图25显示，不同剂量下的EGFR CAR-T治疗均能抑制肿瘤的生长，其中b剂量(2.5×108个细胞/kg)下的抑制效果最佳，并且b剂量组的肿瘤终点荧光值与对照组有显著差异，表明b剂量为治疗最佳剂量。图26显示，治疗组(EGFRCAR-T组)肿瘤组织上增殖标志物Ki67和EGFR的表达相较于对照组(Control组)减少，且在肝、肺组织上没有明显的表达，说明EGFR CAR-T治疗后抑制了TNBC的增殖并且阻滞了其转移，同时，治疗组的肿瘤组织上CD8表达较高，提示了所述EGFR CAR-T在尾静脉治疗后能够特异性靶向肿瘤细胞，并通过有效浸润产生肿瘤杀伤作用。图27中对肿瘤细胞的RT-qPCR结果，验证了实施例8所述的EGFR CAR-T杀伤三阴性乳腺癌的分子通路。
本实施例证明了本发明所述EGFR CAR-T对三阴性乳腺癌具有体内抗肿瘤作用。
实施例10
本实施例验证了本发明所述的三代EGFR CAR-T在免疫缺陷小鼠脑胶质瘤原位移植瘤模型中的抗肿瘤作用。
使用6-8周龄SCID免疫缺陷小鼠，颅内注射3×105个经转染和筛选过表达荧光素酶基因的U87细胞或5×105个经转染和筛选过表达荧光素酶基因的GBM-PDX细胞。肿瘤生长3-4天后，腹腔注射荧光素底物后通过活体成像检测肿瘤细胞产生的荧光强度。当荧光强度达到1×107-5×107p/sec/cm2/sr时，小鼠以每组三只分为三个治疗组和一个对照组，三个治疗组(即CAR-T a组、CAR-T b组和CAR-T c组)分别通过尾静脉注射a剂量(1.25×108个细胞/kg)、b剂量(2.5×108个细胞/kg)和c剂量(5×108个细胞/kg)的实施例4中所得到的EGFRCAR-T(所用CAR结构为三代Fc-EGFR-CAR)，并采用注射两天间隔一天的治疗策略，同时对照组(即Control组)尾静脉注射等体积PBS，之后持续通过活体成像检测各组肿瘤细胞的荧光强度。
对U87原位移植瘤的治疗结果如图36和图37所示，在U87原位移植瘤模型中，本发明所述的EGFR CAR-T在不同剂量下治疗均能抑制肿瘤的生长，其中b剂量(2.5×108个细胞/kg)下的抑制效果最佳，并且b剂量组的肿瘤终点荧光值与对照组有显著差异，表明b剂量为治疗最佳剂量图38和图39的结果进一步在病人原代的GBM-PDX原位异种移植瘤模型中验证了本发明所述的EGFR CAR-T的体内抗肿瘤作用，同样地，最佳治疗剂量为b剂量(2.5×108个细胞/kg)。
本实施例证明了本发明所述EGFR CAR-T对脑胶质瘤也具有一定的体内抑制作用。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
序列表
<110> 厦门大学
<120> 一种EGFR特异性嵌合抗原受体及其应用
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> PRT
<213> Artifical Sequence
<400> 1
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1 5 10 15
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20
<210> 2
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<212> PRT
<213> Artifical Sequence
<400> 2
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50 55 60
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Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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145 150 155 160
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165 170 175
Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile
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Lys
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<212> PRT
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50 55 60
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65 70 75 80
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165 170 175
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<213> Artifical Sequence
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Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
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<400> 7
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1 5 10 15
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Arg
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<212> PRT
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Val Ile Met Ser Arg Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr Phe Gly Ala Gly
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Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
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Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
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Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
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Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
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Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
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Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
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Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
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Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe
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Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
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<400> 11
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ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag 1140
aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca 1200
tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat 1260
cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 1320
acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac 1380
aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 1440
aaccactaca cacagaagag cctctccctg tctccgggta aattttgggt gctggtggtg 1500
gttggtggag tcctggcttg ctatagcttg ctagtaacag tggcctttat tattttctgg 1560
gtgaggagta agaggagcag gctcctgcac agtgactaca tgaacatgac tccccgccgc 1620
cccgggccca cccgcaagca ttaccagccc tatgccccac cacgcgactt cgcagcctat 1680
cgctccacta gtctgagagt gaagttcagc aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag 1740
ggccagaacc agctctataa cgagctcaat ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg 1800
gacaagagac gtggccggga ccctgagatg gggggaaagc cgcagagaag gaagaaccct 1860
caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa gataagatgg cggaggccta cagtgagatt 1920
gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt 1980
acagccacca aggacaccta cgacgccctt cacatgcagg ccctgccccc tcgctaa 2037
<210> 14
<211> 2163
<212> DNA
<213> Artifical Sequence
<400> 14
atggattttc aggtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt cataatgtct 60
agacaggtgc agctgaagca gtccggcccc ggcctggtgc agccctccca gtccctgtcc 120
atcacctgca ccgtgtccgg cttctccctg accaactacg gcgtgcactg ggtgcggcag 180
tcccccggca agggcctgga gtggctgggc gtgatctggt ccggcggcaa caccgactac 240
aacaccccct tcacctcccg gctgtccatc aacaaggaca actccaagtc ccaggtgttc 300
ttcaagatga actccctgca gtccaacgac accgccatct actactgcgc ccgggccctg 360
acctactacg actacgagtt cgcctactgg ggccagggca ccctggtgac cgtgtccgcc 420
ggaggtggcg gatctggagg gggtggtagc ggtggaggcg ggagtgacat cctgctgacc 480
cagtcccccg tgatcctgtc cgtgtccccc ggcgagcggg tgtccttctc ctgccgggcc 540
tcccagtcca tcggcaccaa catccactgg taccagcagc ggaccaacgg ctccccccgg 600
ctgctgatca agtacgcctc cgagtccatc tccggcatcc cctcccggtt ctccggctcc 660
ggctccggca ccgacttcac cctgtccatc aactccgtgg agtccgagga catcgccgac 720
tactactgcc agcagaacaa caactggccc accaccttcg gcgccggcac caagctggag 780
ctgaaggagc ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa 840
ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc 900
tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc 960
aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 1020
gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 1080
ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag 1140
aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca 1200
tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat 1260
cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 1320
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aaccactaca cacagaagag cctctccctg tctccgggta aattttgggt gctggtggtg 1500
gttggtggag tcctggcttg ctatagcttg ctagtaacag tggcctttat tattttctgg 1560
gtgaggagta agaggagcag gctcctgcac agtgactaca tgaacatgac tccccgccgc 1620
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cgctccacta gtctgaaacg gggcagaaag aaactcctgt atatattcaa acaaccattt 1740
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gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct gagatggggg gaaagccgca gagaaggaag 1980
aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg cagaaagata agatggcgga ggcctacagt 2040
gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt 2100
ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc 2160
taa 2163
<210> 15
<211> 1386
<212> DNA
<213> Artifical Sequence
<400> 15
atggattttc aggtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt cataatgtct 60
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cagtcccccg tgatcctgtc cgtgtccccc ggcgagcggg tgtccttctc ctgccgggcc 540
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ctgctgatca agtacgcctc cgagtccatc tccggcatcc cctcccggtt ctccggctcc 660
ggctccggca ccgacttcac cctgtccatc aactccgtgg agtccgagga catcgccgac 720
tactactgcc agcagaacaa caactggccc accaccttcg gcgccggcac caagctggag 780
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ctggtggtgg ttggtggagt cctggcttgc tatagcttgc tagtaacagt ggcctttatt 900
attttctggg tgaggagtaa gaggagcagg ctcctgcaca gtgactacat gaacatgact 960
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<212> DNA
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<400> 16
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agacaggtgc agctgaagca gtccggcccc ggcctggtgc agccctccca gtccctgtcc 120
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tcccccggca agggcctgga gtggctgggc gtgatctggt ccggcggcaa caccgactac 240
aacaccccct tcacctcccg gctgtccatc aacaaggaca actccaagtc ccaggtgttc 300
ttcaagatga actccctgca gtccaacgac accgccatct actactgcgc ccgggccctg 360
acctactacg actacgagtt cgcctactgg ggccagggca ccctggtgac cgtgtccgcc 420
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taccagggtc tcagtacagc caccaaggac acctacgacg cccttcacat gcaggccctg 1500
ccccctcgct aa 1512

Claims (6)

1.一种EGFR特异性嵌合抗原受体，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
2.如权利要求1所述的一种EGFR特异性嵌合抗原受体，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO. 14所示。
3.一种重组慢病毒载体，包括包装载体和转移载体，其特征在于：该转移载体上装载有权利要求1或2所述的EGFR特异性嵌合抗原受体的核苷酸序列。
4.一种多核苷酸分子，其特征在于：其编码如权利要求1或2所述的EGFR特异性嵌合抗原受体的氨基酸序列。
5.一种重组T细胞，其特征在于：其细胞膜表面修饰有权利要求1或2所述的EGFR特异性嵌合抗原受体，或被权利要求3所述的重组慢病毒载体所感染，或含有权利要求4所述的多核苷酸分子。
6.一种用于治疗三阴性乳腺癌的组合物，其特征在于：其包含权利要求1或2所述的EGFR特异性嵌合抗原受体、权利要求3所述的重组慢病毒载体、权利要求4所述的多核苷酸分子和权利要求5所述的T细胞中的至少一种。
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