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CN105647946B - 一种基于FcγRⅢa的嵌合基因及其用途 - Google Patents

一种基于FcγRⅢa的嵌合基因及其用途 Download PDF

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CN105647946B CN201610156775.7A CN201610156775A CN105647946B CN 105647946 B CN105647946 B CN 105647946B CN 201610156775 A CN201610156775 A CN 201610156775A CN 105647946 B CN105647946 B CN 105647946B
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Abstract

本发明涉及一种基于FcγRⅢa的嵌合基因及其用途，所述嵌合基因包括依次串联的FcγRⅢa信号肽、FcγRⅢa细胞外区域、CD8α跨膜区域和胞内信号传导结构域，所述FcγRⅢa细胞外区域直接与CD8α跨膜区域连接；本发明通过将FcγRⅢa细胞外结构域直接与CD8α跨膜区连接，删除了常规嵌合抗原受体(CAR)分子设计中的CD8α铰合区，使得该种FcγRⅢa‑CAR分子更有利于激活效应细胞，显著提高了FcγRⅢa‑CAR分子对肿瘤细胞的杀伤能力；该种设计的FcγRⅢa‑CAR分子与单克隆抗体药物联合可通用于多种肿瘤的细胞治疗。

Description

一种基于FcγRⅢa的嵌合基因及其用途
技术领域
本发明涉及肿瘤生物治疗技术领域，尤其涉及一种基于FcγRⅢa的嵌合基因及其用途，还涉及基于FcγRⅢa的基因工程化免疫细胞及其用途。
背景技术
单克隆抗体已经逐渐成为癌症治疗中的支柱。单克隆抗体发挥治疗作用的机制主要是通过抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependent cellularcytotoxicity,ADCC)杀死靶细胞。在单克隆抗体临床应用中，经常观察到不理想的治疗效果。原因是患者经过放化疗之后单抗药物ADCC作用的效应细胞耗竭，使得单抗药物不能充分发挥作用。
嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)CD19的T细胞(CART-19细胞)已经在CD19表达的B细胞恶性肿瘤的治疗中取得了显著成功(Kochenderfer et al.,2010；Porter et al.,2011)。常规的CAR分子的设计采用鼠源单抗的scFv结合CD3ζ与共刺激分子(CD28、4-1BB等)组成。针对不同组织的肿瘤相关抗原(TAA)需要设计相应特异性的scFv，所构建的CAR分子只局限于针对于该种肿瘤，不具备通用性，限制了CAR技术的临床应用。
常规嵌合抗原受体(CAR)分子的设计主要包括CD8α前导区、由Linker序列连接VH和VL形成的单链可变区(scFv)、CD8α铰合区、CD8α跨膜区和胞内信号转导区。其中CD8α铰合区为scFv与抗原的结合提供灵活的空间，解决scFv与抗原结合空间位阻的问题。
FcγRⅢa(CD16a)是唯一表达于NK细胞上可与IgG结合介导ADCC作用的Fc受体。FcγRⅢa是一种跨膜糖蛋白，含有信号肽序列、细胞外结构域、跨膜区和细胞内结构域。其中细胞外结构域与IgG的Fc段结合介导ADCC作用。阳性表达FcγRⅢa的效应细胞是发挥单克隆抗体ADCC作用的关键因素。临床上迫切需要补充阳性表达FcγRⅢa的效应细胞以提高单克隆抗体药物的临床疗效。
因此，如何研发一种基于FcγRⅢa的嵌合基因以及基因工程化免疫细胞以解决现有单克隆抗体和嵌合抗原受体两种技术所存在的问题已成为目前研究的重点。
发明内容
本发明基于FcγRⅢa与抗体Fc段结合产生ADCC作用的原理，在优化CAR分子结构的基础上，设计了作用位点为FcγRⅢa的CAR分子，其不仅可与多种不同的单克隆抗体药物联合使用，用于多种肿瘤的治疗，同时又能够发挥CAR分子对肿瘤细胞的高效杀伤功能。
本发明人为实现上述目的进行了反复深入的研究，结果发现，通过将嵌合基因中的FcγRⅢa细胞外结构域直接与CD8α跨膜区连接，不需要CD8α铰合区，该种FcγRⅢa-CAR分子设计更有利于激活效应细胞，能显著提高FcγRⅢa-CAR分子对多种肿瘤细胞的杀伤能力，可实现上述目的。
即，本发明采用了如下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种基于FcγRⅢa的嵌合基因，所述嵌合基因包括依次串联的FcγRⅢa信号肽、FcγRⅢa细胞外区域、CD8α跨膜区域和胞内信号传导结构域，所述FcγRⅢa细胞外区域直接与CD8α跨膜区域连接。
本发明不同于常规CAR分子的设计。本发明所述嵌合基因中，FcγRⅢa细胞外区域直接与CD8α跨膜区域连接，其删除了常规CAR分子中的CD8α铰合区。该种设计不仅未出现由Linker序列连接VH和VL形成的单链可变区(scFv)与抗原结合的空间位阻问题，而且，发明人惊喜地发现，与未删除CD8α铰合区的结构相比，该种FcγRⅢa-CAR分子设计更有利于激活效应细胞，更能显著提高FcγRⅢa-CAR分子对肿瘤细胞的杀伤能力。
本发明提供的基于FcγRⅢa的CAR分子既可以通过单克隆抗体药物靶向性介导效应细胞对肿瘤细胞进行识别，提高单克隆抗体药物的临床疗效，又可以发挥CAR分子的肿瘤细胞杀伤功能；采用该设计的CAR分子与单克隆抗体药物联合可通用于多种肿瘤的细胞治疗。
根据本发明，所述FcγRⅢa信号肽具有如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，其编码基因序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明中采用FcγRⅢa信号肽作为信号肽，相比采用常规的CD8α前导序列，其具有的优势主要体现在：FcγRⅢa信号肽为FcγRⅢa基因原有结构的一部分，相对于CD8α前导序列，更有利于指引FcγRⅢa细胞外区域蛋白穿膜，并在后期剪切。本发明通过构建含有CD8α前导序列的FcγRⅢa-CAR(定义为CD8αleader-FcγRⅢa-CAR)，与本发明设计的FcγRⅢa信号肽FcγRⅢa-CAR(定义为FcγRⅢa signal peptide-FcγRⅢa-CAR)针对肿瘤细胞杀伤能力试验相比较，本发明FcγRⅢa信号肽的选择明显优于常规CAR分子设计的CD8α前导序列。
根据本发明，所述FcγRⅢa细胞外区域具有如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，其编码基因序列如SEQ ID NO:4所示。
根据本发明，所述CD8α跨膜区域具有如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，其编码基因序列如SEQ ID NO:5所示。
根据本发明，所述嵌合基因还含有Kozak序列；所述Kozak序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明中在信号肽区域之前采用加入Kozak序列，其具有的优势主要体现在：加入Kozak序列可用于增强本发明设计的CAR分子在真核细胞(如人T细胞和NK细胞)中的翻译效率。
本发明中所述Kozak序列与FcγRⅢa信号肽和细胞外区域依次拼接，组成与单克隆抗体Fc段结合的功能区域序列。
根据本发明，所述胞内信号传导结构域由共刺激分子和细胞活化信号拼接而成。
根据本发明，所述共刺激分子为CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3或CD83中的任意一种或至少两种的组合，优选为CD28或4-1BB中的任意一种或两种的组合，进一步优选为4-1BB。
本发明中采用4-1BB作为优选的共刺激分子，其具有的优势主要体现在：4-1BB作为共刺激分子相对于CD28更有利于T细胞在体内的存活。
根据本发明，所述4-1BB具有如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，其编码基因序列如SEQ ID NO:6所示。
根据本发明，所述细胞活化信号为CD3ζ信号传导结构域。
根据本发明，所述CD3ζ信号传导结构域具有如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，其编码基因序列如SEQ ID NO:7所示。
作为优选，本发明所述嵌合基因由Kozak序列、FcγRⅢa信号肽、FcγRⅢa细胞外区域、CD8α跨膜区域、共刺激分子和CD3ζ信号传导结构域依次串联拼接而成，所述FcγRⅢa细胞外区域直接与CD8α跨膜区域连接，不含有CD8α铰合区。
本发明中的无CD8α铰合区的FcγRⅢa-CAR分子结构具体为：
Kozak-FcγRⅢa信号肽(signal peptide)-FcγRⅢa细胞外区域(extracellularportion)-CD8α跨膜区域(transmembrane region)-4-1BB-CD3ζ。
本发明优选采用上述串联拼接结构，作为一个整体，其具有的优势主要体现在：Kozak序列可以增强在真核细胞中的翻译效率；FcγRⅢa信号肽更有利于指引FcγRⅢa细胞外区域蛋白穿膜，并在后期剪切；FcγRⅢa的细胞外区域直接与CD8α跨膜区相连，更有利于激活该CAR分子修饰的T细胞；4-1BB作为共刺激分子更有利于T细胞在体内的存活。本发明所设计的上述串联拼接结构构成的CAR分子，可以靶向性高效的杀伤肿瘤细胞。
根据本发明，所述嵌合基因优选具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
以上各分子的核苷酸序列和氨基酸序列可利用分子生物学领域已知的基因重组方法获得，例如以表达基因的细胞的cDNA为文库，通过PCR扩增的方式得到该基因，优选核酸序列被合成生产，而不是克隆。
本发明提供了一种通用型的基因工程修饰的免疫细胞制备方法，其既可以通过单克隆抗体药物介导效应细胞对肿瘤细胞的识别，又可以发挥CAR的肿瘤细胞杀伤功能，解决了现有单克隆抗体和嵌合抗原受体两种技术所存在的问题。
本发明提供了基于FcγRⅢa的基因工程化免疫细胞的制备方法，嵌合基因包括Kozak序列，人FcγRⅢa的信号肽和细胞外区域，CD8α跨膜结构域和细胞内共刺激信号传导区(4-1BB)以及CD3ζ信号传导结构域。其中FcγRⅢa的细胞外区域可以与多种单克隆抗体的Fc段结合，靶向性识别相关肿瘤，启动ADCC作用和CAR分子的细胞毒性作用。
为了比较本发明与现有技术的设计优势，本发明无CD8α铰合区的嵌合基因命名为FcγRⅢa-BB-ζ，现有技术含有CD8α铰合区的嵌合基因结构命名为FcγRⅢa-CD8α-BB-ζ。发明人经研究发现，无CD8α铰合区结构设计的CAR分子，CD8α跨膜区直接与FcγRⅢa的细胞外区域相连，更有利于激活该CAR分子修饰的T细胞。
第二方面，本发明还提供了一种重组表达载体，其包含如第一方面所述的嵌合基因。
第三方面，本发明还提供了一种细胞，其表达如第一方面所述的嵌合基因或含有如第二方面所述的重组表达载体。
根据本发明，所述细胞为T细胞、NK细胞或DC细胞中的任意一种。
优选地，所述T细胞为中心记忆T细胞、效应记忆T细胞或效应T细胞中的任意一种。
优选地，所述NK细胞为原代培养的NK细胞或NK92细胞系。
将本发明所述嵌合基因导入效应细胞，使其持续表达。基因导入方法在本领域内是已知的，具体的包括物理学方法、化学方法和生物学方法。物理学方法包括磷酸钙转染法、显微注射、电穿孔等，化学方法包括脂质体转染系统等，生物学方法主要通过构建病毒载体完成，优选采用生物学方法，其中病毒载体包括腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、慢病毒和单纯疱疹病毒等，优选采用慢病毒。
采用本领域已知的方法构建本发明嵌合基因的慢病毒载体，与辅助质粒共转染293T细胞，得到具有感染能力含有本发明嵌合基因的慢病毒。
本发明中效应细胞定义为能够整合转染本发明嵌合基因，可以介导ADCC作用，能够杀伤靶细胞的细胞。该效应细胞可以是原代培养的效应细胞，也可以是来源于细胞系的效应细胞。
T细胞的来源包括但不限于外周血、骨髓、淋巴结组织、脐带血、腹水、胸腔积液，优选为外周血来源。采用本领域已知的Ficoll分离的方式进行PBMC的富集，然后采用流式分选的方法或MACS磁珠分选的方法从中分离出CD3+T细胞，进行后续的基因修饰。
NK细胞的来源包括但不限于外周血、骨髓、淋巴结组织、脐带血、腹水、胸腔积液，还可来源于NK92细胞系。采用本领域已知的Ficoll分离的方式进行PBMC的富集，然后采用流式分选的方法或MACS磁珠分选的方法从中分离出CD3-CD16/56+NK细胞，进行后续的基因修饰。
与效应细胞协同使用的单克隆抗体包括但不限于CD20、CD52、Her-1/2、EGFR、VEGF、CD117或PD-1等。
第四方面，本发明还提供了根据第三方面所述的细胞在制备预防和/或治疗和/或辅助治疗恶性肿瘤或者病毒感染性疾病的药物中的用途。
根据本发明，所述恶性肿瘤包含但不限于肺癌、肝细胞癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌或前列腺癌中的任意一种。
本发明中，所述细胞与单克隆抗体联合使用。
优选地，所述单克隆抗体为CD20、CD52、Her-1/2、EGFR、VEGF、CD117或PD-1中的任意一种或至少两种的混合物。
本发明设计的嵌合FcγRⅢa基因的免疫细胞，体外扩增后回输患者体内，补充有功能的ADCC效应细胞，在单克隆抗体药物的介导下特异性识别肿瘤细胞，同时通过CAR分子起到对肿瘤细胞的杀伤作用。
单克隆抗体的临床应用需要大量的抗体，而本发明可以使治疗性单克隆抗体与效应细胞预先结合，即，在冻存T或NK细胞前预先用相应的治疗性抗体孵育细胞之后冻存，解冻后直接回输使用，提高了抗体的使用效价，ADCC效应最大值在0.1μg/ml治疗性抗体，大大减少了临床抗体的用量。
含有该发明嵌合基因的工程化免疫细胞可与治疗性抗体结合，提升单抗的临床治疗效果。同时本发明嵌合基因修饰的免疫细胞在有抗体存在的情况下可以在体内扩增，所以可以通过控制注射的抗体的剂量，从而可控性地杀伤肿瘤细胞，避免常规CAR分子治疗带来的细胞因子风暴。
CART细胞虽然在临床治疗中表现出安全性和有效性，但是目前应用范围不广，只在血液肿瘤中表现出较好的治疗效果，然而本发明的CAR分子可用于多种肿瘤的治疗，同时又能够发挥CAR分子对多种肿瘤细胞的高效杀伤功能，克服了CART在治疗多种肿瘤时肿瘤特异性抗原的局限性问题。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
(1)本发明在优化CAR分子结构的基础上，设计了作用位点为FcγRⅢa的CAR分子，其采用将FcγRⅢa细胞外区域直接与CD8α跨膜区域连接，删除了常规CAR分子CD8α铰合区的独特设计，不仅可与多种不同的单克隆抗体药物联合使用，用于多种肿瘤的治疗，同时与含有CD8α铰合区的结构相比，其更有利于激活效应细胞，能更进一步发挥CAR分子对肿瘤细胞的高效杀伤功能，在效靶比5:1时其细胞杀伤率可高达90％以上。
(2)本发明设计的嵌合FcγRⅢa基因的免疫细胞，体外扩增后回输患者体内，补充有功能的ADCC效应细胞，在单克隆抗体药物的介导下特异性识别肿瘤细胞，同时通过CAR分子起到对肿瘤细胞的杀伤作用。
(3)本发明可以使治疗性单克隆抗体与效应细胞预先结合，即，在冻存T或NK细胞前预先用相应的治疗性抗体孵育细胞之后冻存，解冻后直接回输使用，提高了抗体的使用效价，大大减少了临床抗体的用量；另外，其冻存复苏后仍能达到90％以上的细胞活率。
(4)本发明设计的嵌合FcγRⅢa基因的免疫细胞在有抗体存在的情况下可以在体内扩增，通过控制注射的抗体的量，从而能够可控性地杀伤肿瘤细胞，避免常规CAR分子治疗带来的细胞因子风暴。
附图说明
图1是本发明嵌合基因的结构示意图。
图2是本发明的嵌合基因FcγRⅢa-BB-ζ在慢病毒表达载体pLVX-EF1α载体上用BamH1和Sal1双酶切后释放的目的基因部分，目的基因片段1269bp，泳道1为核酸分子量标准，泳道2为BamH1和Sal1双酶切产物。
图3是采用Western Blotting检测嵌合FcγRⅢa-BB-ζ基因的T细胞中内源性CD3和融合基因FcγRⅢa-BB-ζ的表达结果图，泳道1为未转染的T细胞作为阴性对照，泳道2为5MOI慢病毒转染的T细胞，泳道3为10MOI慢病毒转染的T细胞。
图4是采用流式细胞仪检测病毒转导效率结果图；其中，图4-A为CD3PE和CD16FITC双标散点图，表示所培养的细胞为CD3阳性，CD3阳性细胞中有83.57％为CD16阳性，说明病毒转导效率为83.57％；图4-B为CD16FITC直峰图，表示在总细胞中的转导效率。
图5是采用流式细胞术检测CD3ζ的磷酸化水平结果图，其中图5-A是FcγRⅢa-CD8α-BB-ζ的磷酸化水平，图5-B是FcγRⅢa-BB-ζ的磷酸化水平。
图6是本发明的嵌合基因FcγRⅢa-BB-ζ对靶细胞的杀伤能力测试图，其中，图6-A中是嵌合基因FcγRⅢa-BB-ζ对靶细胞Raji的杀伤能力测试图；图6-B是嵌合基因FcγRⅢa-BB-ζ对靶细胞SKOV3的杀伤能力测试图；图6-C是嵌合基因FcγRⅢa-BB-ζ对靶细胞ANT1的杀伤能力测试图；图6-D是嵌合基因FcγRⅢa-BB-ζ与CD8αleader-FcγRⅢa-CAR分别对靶细胞的杀伤能力测试图。
图7是本发明的嵌合基因FcγRⅢa-BB-ζ对Raji、SKOV3和ANT1三种细胞的IFN-γ分泌水平的检测图。
图8是本发明嵌合FcγRⅢa-BB-ζ基因的NK92细胞的杀伤能力图。
图9是本发明制备的FcγRⅢa-BB-ζ-NK细胞冻存前和冻存后的细胞活率比较图。
图10是本发明制备的FcγRⅢa-BB-ζ-NK细胞冻存前和冻存复苏后的细胞杀伤能力比较图。
下面对本发明进一步详细说明。但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
为更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，本发明的典型但非限制性的实施例如下：
图1示出了本发明嵌合基因的结构，该FcγRⅢa-CAR分子结构具体为：
Kozak-FcγRⅢa信号肽-FcγRⅢa细胞外区域-CD8α跨膜区域-4-1BB-CD3ζ
本发明中的嵌合基因不含有CD8α铰合区，其是采用FcγRⅢa细胞外区域直接与CD8α跨膜区域连接而成。
实施例1FcγRⅢa-BB-ζ慢病毒表达载体的限制性内切酶BamH/Sal1双酶切鉴定
图2是嵌合基因FcγRⅢa-BB-ζ在慢病毒表达载体pLVX-EF1α载体上用BamH1和Sal1双酶切后释放的目的基因部分，目的基因片段1269bp。泳道1为核酸分子量标准，泳道2为BamH1和Sal1双酶切产物。
将双酶切鉴定正确的质粒送上海生工生物工程有限公司对插入的嵌合基因片段进行测序。将测序测序正确的质粒命名为pLVX-FcγRⅢa-BB-ζ。
实施例2FcγRⅢa-BB-ζ慢病毒的制备
FcγRⅢa-BB-ζ嵌合基因如本发明所述进行设计和构造。嵌合基因FcγRⅢa-BB-ζ的慢病毒制备和纯化采用如下所述方法：
1.采用Qiagen EndoFree Plasmid Maxi Kit抽提质粒；
2.预先准备100mm培养皿的293T细胞；
3.将细胞用胰酶消化后，用电动移液器吸取10ml完全培养基，将所有细胞吹打成单细胞悬液，按比例转到其他100mm培养皿中；37℃，5％CO2培养箱过夜；
4.细胞融合度在70％-80％时转染；
5.细胞换液，全量替换为新鲜无血清DMEM培养基；
6.配制质粒混合液：取一个新的1.5ml离心管，加入0.5mL DMEM和质粒；
7.配制PEI混合液：取一个新的1.5ml离心管，加入0.5mL DMEM和30μl PEI，混匀；
8.将PEI混合液加到质粒混合液中，混匀，室温静置15min；
9.取一皿细胞，将离心管中的1ml混合液滴加进去，尽可能使转试剂分布到整个培养皿中；
10.将培养皿放还到5％CO2培养箱中，放置6h；
11.转染6h后换液，换成10ml完全培养基；
12.转染48h后，将同一个病毒包装上清液收集到一起，丢弃培养皿；
13.分装到50ml离心管中，500g室温离心10min，除去细胞和大的碎片；
14.用0.22μM针式滤头过滤上清液，置于4℃，待纯化；
15.使用AKTA flux 6机器，5L病毒0.65μm中空纤维微滤柱过柱；
16.使用AKTA flux 6机器，病毒300kD中空纤维超滤柱过柱；
17.病毒浓缩至200ml；
18.使用AKTA pure 150Protein Purification System进行病毒纯化；
19.病毒用50ml PBS洗脱；
20.病毒用0.22μM的滤头过滤，病毒管分装。
慢病毒包被体系包括但不限于三质粒表达系统和四质粒表达系统，本实施例中优选四质粒表达系统(目的质粒、pRRE、pREV、VSVG)。
慢病毒纯化体系包括但不限于超速离心法、透析法、超滤法等，本发明优选中空纤维超滤法。
实施例3嵌合FcγRⅢa-BB-ζ基因的细胞产物的制备
细胞来源于患者或者健康供者，采用静脉采血方式或者血液成分单采术获得外周血单个核细胞(PBMC)。T细胞培养方法采用CD3、CD28单克隆抗体包被培养瓶活化T细胞方法，或者采用包被有CD3和CD28单克隆抗体的顺磁聚丙乙烯珠T细胞活化方法，NK细胞培养方法如所述进行(Hiroyuki等，Cancer Res 2009；69:4010-4017)。慢病毒转导如文所述操作(Levine等，2006，Proc Natl Acad Sci USA103:17372-17377)。
实施例4流式细胞术检测嵌合基因FcγRⅢa-BB-ζ修饰的T细胞表型鉴定
采用实施例3的方法培养T细胞至第14天，Western Blotting检测嵌合FcγRⅢa-BB-ζ基因的T细胞中内源性CD3和融合基因FcγRⅢa-BB-ζ的表达。如图3所示。
图3示出了转染融合基因FcγRⅢa-BB-ζ慢病毒的T细胞，用Western Blotting检测内源性CD3和融合蛋白的表达。泳道1为未转染的T细胞作为阴性对照，泳道2为5MOI慢病毒转染的T细胞，泳道3为10MOI慢病毒转染的T细胞，内参为β-actin。结果显示成功表达融合蛋白。
实施例5病毒转导效率检测
10MOI融合基因FcγRⅢa-BB-ζ慢病毒感染T细胞5天，取样做流式细胞仪检测CD3PE、CD16FITC表达，CD16表达量表示慢病毒的转导效率。
如图4-A和4-B所述，CD16的表达量为83.57％，即融合基因FcγRⅢa-BB-ζ慢病毒的转导效率为83.57％。
实施例6流式细胞术检测CD3ζ的磷酸化水平
采用同一供者来源的PBMC，10MOI融合基因FcγRⅢa-BB-ζ慢病毒感染T细胞，培养至第5天。对照组采用10MOI融合基因FcγRⅢa-CD8α-BB-ζ慢病毒感染T细胞，培养至第5天。取CD20阳性的Raji细胞1×105，加入1μg/ml的Rituximab抗体，与转染后培养到第5天的T细胞1×106共孵育2小时。流式细胞术检测CD3ζ的磷酸化水平。结果如图5所示。
如图5-A所示，FcγRⅢa-CD8α-BB-ζ磷酸化水平为50.45％，如图5-B所述，FcγRⅢa-BB-ζ磷酸化水平为79.77％，两者有明显差异。说明本发明所设计的CAR分子结构FcγRⅢa-BB-ζ较已有技术FcγRⅢa-CD8α-BB-ζ更有利于CD3ζ的磷酸化，有利于转染的T细胞的活化，预示着对肿瘤细胞更高的杀伤能力。
实施例7细胞杀伤试验
抗体孵育的浓度为0.1μg/ml，E:T＝5:1、2.5:1、1.25:1、0.6:1、0.3:1，5种靶效比情况下对Raji细胞(CD20+，rituximab)、SKOV3细胞(Her2+，trastuzumab)、ANT1细胞(CCR4+，mogamulizumab)的杀伤能力分析。
结果如图6-A、图6-B和图6-C所示，在不同的效靶比的情况下，针对Raji、SKOV3和ANT1三种细胞，在相应的抗体0.1μg/ml共同孵育的情况下，本发明FcγRⅢa-BB-ζ对靶细胞的杀伤能力都明显优于FcγRⅢa-CD8α-BB-ζ。
图6-D示出了在不同的效靶比的情况下，针对Raji细胞，在rituximab抗体0.1μg/ml共同孵育的情况下，FcγRⅢa signal peptide-FcγRⅢa-CAR对靶细胞的杀伤能力明显优于CD8αleader-FcγRⅢa-CAR。所以本发明优选FcγRⅢa信号肽作为信号肽，而不用常规的CD8α前导序列。
实施例8检测IFN-γ分泌量
抗体孵育的浓度为0.1μg/ml，E:T＝1:1情况下对Raji细胞(CD20+，rituximab)、SKOV3细胞(Her2+，trastuzumab)、ANT1细胞(CCR4+，mogamulizumab)共同孵育4个小时之后，IFN-γ分泌水平的检测，采用BD CBA assay kit。以K562和相应抗体孵育作为对照组，其结果如图7所示。
结果显示，FcγRⅢa-BB-ζ对Raji、SKOV3和ANT1三种细胞，在相应的抗体0.1μg/ml共同孵育的情况下，其细胞因子IFN-γ的分泌水平都明显高于FcγRⅢa-CD8α-BB-ζ组。
实施例9FcγRⅢa-BB-ζ慢病毒感染NK92试验
NK92本身无CD16a的表达，采用FcγRⅢa-BB-ζ转导NK92细胞系，以未转染NK92作为对照，从而验证FcγRⅢa-BB-ζ的特异性杀伤能力。其中NK92无ADCC作用能力，该实验用于直接证明该CAR分子设计的优势。
NK92细胞参考ATCC说明进行培养，10MOI FcγRⅢa-BB-ζ慢病毒感染培养的NK92细胞，以未转染的NK92细胞作为对照，和抗体共同孵育研究对Raji细胞(CD20+，rituximab)、SKOV3细胞(Her2+，trastuzumab)、ANT1细胞(CCR4+，mogamulizumab)的杀伤能力。NK92细胞本身缺失FcγRⅢa的表达，其结果如图8所示。
经过对照试验确切说明嵌合FcγRⅢa-BB-ζ基因的NK92细胞具有ADCC的杀伤能力；结果还显示，相对于未转染的NK92细胞，表达嵌合基因FcγRⅢa-BB-ζ的NK92细胞的杀伤能力明显提高，说明NK92细胞通过嵌合基因FcγRⅢa-BB-ζ的ADCC作用起到针对性的杀伤作用。
实施例10FcγRⅢa-BB-ζ-NK的制备方法(用于异基因治疗的产品化细胞制剂)。
1、采用IL-15、IL-21细胞因子培养法从PBMC培养NK细胞，经过14到21天的培养，NK细胞纯度达90％以上；
2、收获培养的NK细胞，DPBS洗涤三遍；
3、加入生理盐水重悬，调整细胞浓度为5×107/ml，加入0.1μg/ml治疗性单克隆抗体，4℃孵育45分钟；
4、1500rpm，10min离心收集抗体孵育后的细胞，加入含有10％DMSO的细胞冻存液，调整细胞浓度为5×107/ml，置于细胞冻存袋中，超低温冰箱过夜后转移到液氮中保存；
5、需要回输该细胞时，液氮或者干冰运输到回输地，在37℃水浴锅中快速解冻，之后回输回患者体内；
6、冻存复苏后细胞功能验证：细胞活率和杀伤能力试验，其结果如图9-10所示。
图9显示，冻存复苏后细胞活率略有下降，仍能达到90％以上的细胞活率，能够满足临床治疗的需要。
图10显示，冻存复苏后的NK细胞依旧保留了单克隆抗体的ADCC作用能力，细胞杀伤能力略有下降，细胞杀伤能力水平能够满足临床治疗的需求。复苏后可以直接回输患者，能够起到结合治疗性单克隆抗体的ADCC作用。
通过上述实施例可以看出，本发明在优化CAR分子结构的基础上，设计的作用位点为FcγRⅢa的CAR分子，其采用将FcγRⅢa细胞外区域直接与CD8α跨膜区域连接，删除了CD8α铰合区的独特设计，不仅可与多种不同的单克隆抗体药物联合使用，用于多种肿瘤的治疗，同时与含有CD8α铰合区的结构相比，其更有利于激活效应细胞，能更进一步发挥CAR分子对肿瘤细胞的高效杀伤功能；同时，该设计的嵌合FcγRⅢa基因的免疫细胞，体外扩增后回输患者体内，补充有功能的ADCC效应细胞，在单克隆抗体药物的介导下特异性识别肿瘤细胞，同时通过CAR分子起到对肿瘤细胞的杀伤作用。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细结构特征，但本发明并不局限于上述详细结构特征，即不意味着本发明必须依赖上述详细结构特征才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用部件的等效替换以及辅助部件的增加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (19)

1.一种基于FcγRⅢa的嵌合基因，其特征在于，所述嵌合基因包括依次串联的FcγRⅢa信号肽、FcγRⅢa细胞外区域、CD8α跨膜区域和胞内信号传导结构域，所述FcγRⅢa细胞外区域直接与CD8α跨膜区域连接。
2.根据权利要求1所述的嵌合基因，其特征在于，所述FcγRⅢa信号肽具有如SEQ IDNO:8所示的氨基酸序列，其编码基因序列如SEQ ID NO:3所示。
3.根据权利要求1所述的嵌合基因，其特征在于，所述FcγRⅢa细胞外区域具有如SEQID NO:9所示的氨基酸序列，其编码基因序列如SEQ ID NO:4所示。
4.根据权利要求1所述的嵌合基因，其特征在于，所述CD8α跨膜区域具有如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，其编码基因序列如SEQ ID NO:5所示。
5.根据权利要求1所述的嵌合基因，其特征在于，所述嵌合基因还含有Kozak序列；所述Kozak序列如SEQ ID NO:2所示。
6.根据权利要求1所述的嵌合基因，其特征在于，所述胞内信号传导结构域由共刺激分子和细胞活化信号拼接而成。
7.根据权利要求6所述的嵌合基因，其特征在于，所述共刺激分子为CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3或CD83中的任意一种或至少两种的组合。
8.根据权利要求7所述的嵌合基因，其特征在于，所述共刺激分子为CD28或4-1BB中的任意一种或两种的组合。
9.根据权利要求8所述的嵌合基因，其特征在于，所述共刺激分子为4-1BB。
10.根据权利要求9所述的嵌合基因，其特征在于，所述4-1BB具有如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，其编码基因序列如SEQ ID NO:6所示。
11.根据权利要求6所述的嵌合基因，其特征在于，所述细胞活化信号为CD3ζ信号传导结构域。
12.根据权利要求11所述的嵌合基因，其特征在于，所述CD3ζ信号传导结构域具有如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，其编码基因序列如SEQ ID NO:7所示。
13.根据权利要求1所述的嵌合基因，其特征在于，所述嵌合基因是由Kozak序列、FcγRⅢa信号肽、FcγRⅢa细胞外区域、CD8α跨膜区域、共刺激分子和CD3ζ信号传导结构域依次串联拼接而成，所述FcγRⅢa细胞外区域直接与CD8α跨膜区域连接，不含有CD8α铰合区。
14.根据权利要求13所述的嵌合基因，其特征在于，所述嵌合基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
15.一种重组表达载体，其包含如权利要求1-14之一所述的嵌合基因。
16.一种细胞，其表达如权利要求1-14之一所述的嵌合基因或含有如权利要求15所述的重组表达载体；所述细胞为NK细胞。
17.根据权利要求16所述的细胞，其特征在于，所述NK细胞为原代培养的NK细胞或NK92细胞系。
18.根据权利要求16所述的细胞在制备预防和/或治疗和/或辅助治疗恶性肿瘤的药物中的用途。
19.根据权利要求18所述的用途，其特征在于，所述细胞与单克隆抗体联合使用；
所述单克隆抗体为CD20、Her2或CCR4中的任意一种或至少两种的混合物。
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