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CN117659203B - 一种抗met/egfr双特异性抗体及其药物偶联物 - Google Patents

一种抗met/egfr双特异性抗体及其药物偶联物 Download PDF

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CN117659203B CN202311671052.7A CN202311671052A CN117659203B CN 117659203 B CN117659203 B CN 117659203B CN 202311671052 A CN202311671052 A CN 202311671052A CN 117659203 B CN117659203 B CN 117659203B
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Abstract

本发明一种抗MET/EGFR双特异性抗体及其药物偶联物。具体地，本发明提供了抗MET的纳米抗体和抗EGFR的纳米抗体，及包含本发明两种纳米抗体的双特异性抗体。本发明还提供了基于纳米抗体和双特异性纳米抗体构建的药物偶联物。

Description

一种抗MET/EGFR双特异性抗体及其药物偶联物
技术领域
本发明涉及生物医药领域。具体地说，本发明涉及抗MET/EGFR双特异性抗体及其药物偶联物。
背景技术
ADC(抗体药物偶联)技术是当前癌症治疗领域的研究热点，其通过单克隆抗体特异性结合靶标、携带小分子药物至病灶组织、释放小分子药物发挥药效，达到杀伤肿瘤细胞、治疗癌症的目的。由于肿瘤的发生与多因素有关，单一靶向疗法易造成耐药及正常组织细胞损伤，因此，单靶点ADC不能完全满足癌症治疗需求，亟需开发双靶点ADC药物以减少正常组织细胞毒性、缓解耐药。
MET(Mesenchymal-Epithelial Transition Factor)与EGFR(Epidermal GrowthFactor Receptor)是肿瘤治疗的经典靶点，均属于受体酪氨酸激酶蛋白，与肿瘤的发生发展、转移、耐药等病理活动密切相关。MET的扩增是肿瘤细胞对EGFR抑制剂耐药的因素之一，例如Cetuximab或Panitumumab耐药的转移性结直肠癌中，MET出现基因扩增，抑制MET可有效抑制Cetuximab耐药的PDX小鼠模型中肿瘤的生长。鉴于EGFR与MET在肿瘤发展过程中存在的关联，同时抑制MET及EGFR成为抗肿瘤药物研发的策略之一。
现有技术中几乎所有的ADC均使用传统抗体IgG1、IgG4等偶联毒素。目前已有的MET-EGFR双靶抗体为Amivantamab，用于EGFR 20号外显子插入突变非小细胞肺癌的治疗。阿斯利康公布AZD9592的MET-EGFR双靶ADC专利号(US20230183358A1)，目前处于临床1期研究阶段。此外，Sorrento WO2018069851A2专利中MET-EGFR ADC处于临床前研究阶段。尽管传统抗体应用广泛，具有良好的靶向性，但其分子量大，肿瘤渗透能力有限，分布缓慢。与传统抗体相比，纳米抗体仅由重链二聚体组成，包含VHH区、CH2区、CH3区，分子量较小，理论上在肿瘤组织中的扩散能力较强，更有利于ADC药物进入细胞、释放毒素。
此外，现有技术还存在如下的缺陷：
1)产物纯度低：目前市售ADC药物的药物抗体比(DAR)主要分布在3-5，如Tisotumab Vedotin-tftv、Brentuximab Vedotin、Disitamab Vedotin、EnfortumabVedotin-ejfv等。上述ADC均使用半胱氨酸法对抗体和毒素进行偶联。由于使用的抗体均为IgG1传统抗体，该类型抗体铰链区含有四对二硫键，通过半胱氨酸偶联法最多可偶联8个毒素，因此偶联混合物中包含DAR2、DAR4、DAR6、DAR8的偶联产物，工艺不易控制，产物复杂。例如，艾伯维US20150337042专利中，EGFR靶点的ADC产物存在8个HIC峰，主要分布在DAR2及DAR4峰处，DAR4的产物纯度为35.28％，纯化后达45.88％；AU2017268342B2的ABBV-399的DAR4产物仅占26％。
2)毒副作用：EGFR广泛表达于正常组织，在皮肤、甲状腺中表达极高，故抑制EGFR易引起正常组织损伤。目前EGFR抗体及ADC的开发以降低亲和力为方向，使用亲和力降低的EGFR抗体进行毒素偶联，以减低对正常组织的毒性。但亲和力过低则会影响杀伤性能，如何取得平衡需要大量探索。
因此，本领域有必要开发分子量更小的基于纳米抗体的MET-EGFR双靶点ADC药物。
发明内容
本发明的目的就是提供抗MET/EGFR双特异性抗体及其药物偶联物。
在本发明的第一方面，提供了一种靶向MET的纳米抗体，所述纳米抗体的VHH链具有以下互补决定区CDR1、CDR2和CDR3：
SEQ ID NO:13所示的CDR1，
SEQ ID NO:14所示的CDR2，和
SEQ ID NO:15所示的CDR3。
在另一优选例中，所述的纳米抗体VHH链的CDR区包含与上述序列中任一具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％的序列相似性的氨基酸序列。
在另一优选例中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留MET结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量为1-3个，较佳地为1-2个，更佳地为1个。
在另一优选例中，所述纳米抗体的VHH链还包括框架区(FR)。
在另一优选例中，所述的CDR1、CDR2和CDR3由VHH链的框架区FR1、FR2、FR3和FR4所隔开。
在另一优选例中，所述的框架区FR为人源、鼠源、兔源或骆驼源的。
在另一优选例中，所述的纳米抗体结合人源、鼠源或猴源的MET。
在另一优选例中，所述的纳米抗体能够被表达MET抗原的细胞内吞。
在另一优选例中，所述的纳米抗体阻断MET和HGF的结合。
在另一优选例中，所述靶向MET的纳米抗体的VHH链具有与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列同源性≥85％、≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、或≥99％的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述靶向MET的纳米抗体的VHH链具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
在本发明的第二方面，提供了一种靶向MET的抗体，所述抗体包括一个或多个如本发明第一方面所述的靶向MET的纳米抗体的VHH链。
在另一优选例中，所述靶向MET的纳米抗体的VHH链具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗体为单体、二价抗体、和/或多价抗体。
在另一优选例中，所述抗体为动物源抗体、人源化抗体、嵌合抗体或嵌合抗原受体抗体(CAR)。
在另一优选例中，所述人源化抗体的CDR区包含1、2、或3个氨基酸的变化。
在另一优选例中，所述的动物为非人哺乳动物，较佳地为鼠、羊、兔、骆驼。
在另一优选例中，所述的抗体为双链抗体、或单链抗体。
在另一优选例中，所述的抗体为单克隆抗体。
在另一优选例中，所述的抗体是部分或全人源化的抗体。
在另一优选例中，所述的抗体为重链抗体，所述重链抗体包含重链恒定区CH2和CH3(Fc段)。
在另一优选例中，所述的重链恒定区来源于IgG的Fc段，优选地为人IgG的Fc段。
在另一优选例中，所述重链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在另一优选例中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留MET结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的40％，较佳地为20％，更佳地为10％。
在另一优选例中，所述的抗体结合人源、鼠源或猴源的MET。
在另一优选例中，所述的抗体能够被表达MET抗原的细胞内吞。
在另一优选例中，所述的抗体阻断MET和HGF的结合。
在本发明的第三方面，提供了一种靶向EGFR的纳米抗体，所述纳米抗体的VHH链具有以下互补决定区CDR1、CDR2和CDR3：
SEQ ID NO:16所示的CDR1，
SEQ ID NO:17所示的CDR2，和
SEQ ID NO:18所示的CDR3。
在另一优选例中，所述的纳米抗体VHH链的CDR区包含与上述序列中任一具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％的序列相似性的氨基酸序列。
在另一优选例中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留EGFR结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量为1-3个，较佳地为1-2个，更佳地为1个。
在另一优选例中，所述纳米抗体的VHH链还包括框架区(FR)。
在另一优选例中，所述的CDR1、CDR2和CDR3由VHH链的框架区FR1、FR2、FR3和FR4所隔开。
在另一优选例中，所述的框架区FR为人源、鼠源、兔源或骆驼源的。
在另一优选例中，所述的纳米抗体结合人源、鼠源或猴源的EGFR。
在另一优选例中，所述的纳米抗体能够被表达EGFR抗原的细胞内吞。
在另一优选例中，所述的纳米抗体不阻断EGFR和EGF的结合。
在另一优选例中，所述靶向EGFR的纳米抗体的VHH链具有与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列同源性≥85％、≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、或≥99％的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述靶向EGFR的纳米抗体的VHH链具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
在本发明的第四方面，提供了一种靶向EGFR的抗体，所述抗体包括一个或多个如本发明第三方面所述的靶向EGFR的纳米抗体的VHH链。
在另一优选例中，所述靶向EGFR的纳米抗体的VHH链具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗体为单体、二价抗体、和/或多价抗体。
在另一优选例中，所述抗体为动物源抗体、人源化抗体、嵌合抗体或嵌合抗原受体抗体(CAR)。
在另一优选例中，所述人源化抗体的CDR区包含1、2、或3个氨基酸的变化。
在另一优选例中，所述的动物为非人哺乳动物，较佳地为鼠、羊、兔、骆驼。
在另一优选例中，所述的抗体为双链抗体、或单链抗体。
在另一优选例中，所述的抗体为单克隆抗体。
在另一优选例中，所述的抗体是部分或全人源化的抗体。
在另一优选例中，所述的抗体为重链抗体，所述重链抗体包含重链恒定区CH2和CH3(Fc段)。
在另一优选例中，所述的重链恒定区来源于IgG的Fc段，优选地为人IgG的Fc段。
在另一优选例中，所述重链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
在另一优选例中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留EGFR结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的40％，较佳地为20％，更佳地为10％。
在另一优选例中，所述的抗体结合人源、鼠源或猴源的EGFR。
在另一优选例中，所述的抗体能够被表达EGFR抗原的细胞内吞。
在另一优选例中，所述的抗体不阻断EGFR和EGF的结合。
在本发明的第五方面，提供了一种多特异性抗体，所述的多特异性抗体包含：如本发明第一方面所述的靶向MET的纳米抗体的VHH链、如本发明第二方面所述的靶向MET的抗体、如本发明第三方面所述的靶向EGFR的纳米抗体的VHH链、如本发明第四方面所述的靶向EGFR的抗体、或其组合。
在另一优选例中，所述的多特异性抗体为靶向MET和EGFR的双特异性抗体。
在另一优选例中，所述的多特异性抗体包含一条或多条抗原结合链，所述一条或多条抗原结合链各自独立地从N端到C端具有式(I)所示结构：
V1-L1-V2-H1-Fc1-L2-V3(I)
其中，
V1、V2、V3各自独立地为无、所述靶向MET的纳米抗体的VHH链、或所述靶向EGFR的纳米抗体的VHH链，且V1、V2、V3中至少一个为靶向MET或EGFR的纳米抗体的VHH链；
L1、L2各自独立地为无或连接肽；
H1为无或免疫球蛋白铰链区；
Fc1为免疫球蛋白Fc段；
“-”代表肽键。
在另一优选例中，所述的双特异性抗体为第一抗原结合链和第二抗原结合链组成的二聚体。
在另一优选例中，所述的双特异性抗体为同源二聚体或异源二聚体。
在另一优选例中，所述的双特异性抗体从N端到C端具有式II所示的结构：
V1-L1-V2-H1-Fc1-L2-V3
||
V4-L3-V5-H2-Fc2-L4-V6
(II)；
其中，
V1、V2、V3、V4、V5、V6各自独立地为无、所述靶向MET的纳米抗体的VHH链、或所述靶向EGFR的纳米抗体的VHH链，
V1、V2、V3中至少一个为靶向MET的纳米抗体的VHH链，V4、V5、V6中至少一个为靶向EGFR的纳米抗体的VHH链；
L1、L2、L3、L4、L5、L6各自独立地为无或连接肽；
H1和H2各自独立地为无或免疫球蛋白铰链区；
Fc1和Fc2各自独立地为免疫球蛋白Fc段；
“||”代表二硫键或杵臼(knob-into-hole)连接；
“-”代表肽键。
在另一优选例中，所述的连接肽为柔性连接肽。
在另一优选例中，所述的连接肽由(G4S)n表示，其中n为选自1-6的整数，优选为2、3、4或5。
在另一优选例中，所述的Fc1和/或Fc2来源于IgG的Fc段，优选地为人IgG的Fc段。
在另一优选例中，所述的H1和/或H2来源于IgG的铰链区，优选地来源于人IgG的铰链区。
在另一优选例中，所述的H1和/或H2相较于野生型免疫球蛋白(如人IgG)铰链区，在N端截短1-7个氨基酸，例如3、4或5个氨基酸。
在另一优选例中，所述的H1和H2的序列各自独立地如SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示。
在另一优选例中，所述的双特异性抗体从N端到C端具有下式(IIa)所示的结构：
V1-L1-V2-H1-Fc1
||
V4-L3-V5-H2-Fc2
(IIa)
其中，
V1和V2中的一个为靶向MET的纳米抗体的VHH链，另一个为无或靶向EGFR的纳米抗体的VHH链；
V4和V5中的一个为靶向EGFR的纳米抗体的VHH链，另一个为无或靶向MET的纳米抗体的VHH链；
其余各元件如式(II)中所定义。
在另一优选例中，所述V1为靶向MET的纳米抗体的VHH链，V2为无。
在另一优选例中，所述V1为靶向MET的纳米抗体的VHH链，V2为靶向EGFR的纳米抗体的VHH链。
在另一优选例中，所述V4为靶向EGFR的纳米抗体的VHH链，V5为靶向MET的纳米抗体的VHH链。
在另一优选例中，所述的V4为靶向MET的纳米抗体的VHH链，V5为靶向EGFR的纳米抗体的VHH链。
在另一优选例中，所述的双特异性抗体从N端到C端具有下式(IIb)所示的结构：
V1-H1-Fc1
||
V4-H2-Fc2
(IIb)
其中，
V1为靶向MET的纳米抗体的VHH链；
V4为靶向EGFR的纳米抗体的VHH链；
其余各元件如式(II)中所定义。
在另一优选例中，所述的双特异性抗体从N端到C端具有下式(IIc)所示的结构：
V1-H1-Fc1-L2-V3
||
V4-H2-Fc2-L4-V6
(IIc)
其中，
V1和V4各自独立地为靶向MET的纳米抗体的VHH链；
V3和V6各自独立地为无或靶向EGFR的纳米抗体的VHH链，并且V3和V6中至少一个为靶向EGFR的纳米抗体的VHH链；
其余各元件如式(II)中所定义。
在另一优选例中，所述的抗原结合链的氨基酸序列选自下组：
(a)SEQ ID NO:2、5-12中任一项所示的氨基酸序列；
(b)对(a)中的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸添加、一个或多个氨基酸的取代或1-30个氨基酸缺失所形成的衍生序列，所述衍生序列保留其来源序列的抗原特异性结合能力。
在另一优选例中，所述的第一抗原结合链的氨基酸序列选自下组：
(a)SEQ ID NO:2、6、11、12中任一项所示的氨基酸序列；
(b)对(a)中的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸添加、一个或多个氨基酸的取代或1-30个氨基酸缺失所形成的衍生序列，所述衍生序列保留其来源序列的抗原特异性结合能力。
在另一优选例中，所述的第二抗原结合链的氨基酸序列选自下组：
(a)SEQ ID NO:5、7-12中任一项所示的氨基酸序列；
(b)对(a)中的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸添加、一个或多个氨基酸的取代或1-30个氨基酸缺失所形成的衍生序列，所述衍生序列保留其来源序列的抗原特异性结合能力。
在另一优选例中，所述的双特异性抗体包括SEQ ID NO:2所示的第一抗原结合链和SEQ ID NO:5或7所示的第二抗原结合链。
在另一优选例中，所述的多特异性抗体进一步包括靶向其他抗原的抗原结合区，优选地，所述抗原结合区为纳米抗体。
在本发明的第六方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：
(i)如本发明第一方面所述的靶向MET的纳米抗体、如本发明第二方面所述的靶向MET的抗体、如本发明第三方面所述的靶向EGFR的纳米抗体、如本发明第四方面所述的靶向EGFR的抗体、或如本发明第五方面所述的多特异性抗体；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在另一优选例中，所述的标签序列选自下组：6His标签、GGGS序列、FLAG标签。
在本发明的第七方面，提供了一种嵌合抗原受体(CAR)构建物，所述的CAR构建物的抗原结合区域包括如本发明第一方面所述的靶向MET的纳米抗体、如本发明第三方面所述的靶向EGFR的纳米抗体、或其组合。
在本发明的第八方面，提供了一种重组的免疫细胞，所述的免疫细胞表达外源的如本发明第七方面所述的CAR构建物。
在另一优选例中，所述的免疫细胞选自NK细胞或T细胞。
在另一优选例中，所述的免疫细胞来自人或非人哺乳动物(如鼠)。
在本发明的第九方面，提供了一种免疫偶联物，所述的免疫偶联物含有：
(a)抗体部分，所述抗体部分为如本发明第一方面所述的靶向MET的纳米抗体、如本发明第二方面所述的靶向MET的抗体、如本发明第三方面所述的靶向EGFR的纳米抗体、如本发明第四方面所述的靶向EGFR的抗体、或如本发明第五方面所述的多特异性抗体；和
(b)与所述纳米抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、或其组合。
在另一优选例中，所述免疫偶联物为抗体药物偶联物。
在另一优选例中，所述的抗体部分与所述的偶联部分通过化学键或接头进行偶联。
在另一优选例中，所述的可检测标记物为化学标记、生物标记、或其组合。
在另一优选例中，所述化学标记为同位素、免疫毒素和/或化学药物。
在另一优选例中，所述生物标记为生物素、亲和素或酶标记。
在另一优选例中，所述的药物为小分子药物、生物因子、或其组合。
在另一优选例中，所述的药物为细胞毒性药物(毒素)。
在另一优选例中，所述的毒素选自下组：
耳他汀类(例如，耳他汀E、耳他汀F、MMAE和MMAF)、SN-38、依西替康、Dxd、金霉素、类美坦西醇、篦麻毒素、篦麻毒素A-链、考布他汀、多卡米星、多拉司他汀、阿霉素、柔红霉素、紫杉醇、顺铂、cc1065、溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊甙、替诺泊甙(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙素、二羟基炭疽菌素二酮、放线菌素、白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒素、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌、白树毒素、迈托毒素(mitogellin)、局限曲菌素(retstrictocin)、酚霉素、依诺霉素、麻疯树毒蛋白(curicin)、巴豆毒素、卡奇霉素、肥皂草(Sapaonaria officinalis)抑制剂、糖皮质激素、或其组合。
在另一优选例中，所述的偶联部分为MMAE。
在另一优选例中，所述偶联部分为可检测标记物。
在另一优选例中，所述可检测标记物包括放射性核素，所述的放射性核素包括：
(i)诊断用同位素，所述的诊断用同位素选自下组：Tc-99m、Ga-68、F-18、I-123、I-125、I-131、In-111、Ga-67、Cu-64、Zr-89、C-11、Lu-177、Re-188、或其组合；和/或
(ii)治疗用同位素，所述的治疗用同位素选自下组：Lu-177、Y-90、Ac-225、As-211、Bi-212、Bi-213、Cs-137、Cr-51、Co-60、Dy-165、Er-169、Fm-255、Au-198、Ho-166、I-125、I-131、Ir-192、Fe-59、Pb-212、Mo-99、Pd-103、P-32、K-42、Re-186、Re-188、Sm-153、Ra223、Ru-106、Na24、Sr89、Tb-149、Th-227、Xe-133 Yb-169、Yb-177、或其组合。
在另一优选例中，所述偶联物选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金单域颗粒/单域棒、病毒颗粒、脂质体、单域磁粒、前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))、化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的单域颗粒等。
在另一优选例中，所述的检测为体内检测或体外检测。
在另一优选例中，所述免疫偶联物用于诊断和/或治疗表达MET蛋白的肿瘤。
在另一优选例中，所述免疫偶联物具有如下分子式所示：
其中：
nAb是如本发明第一方面所述的靶向MET的纳米抗体、如本发明第二方面所述的靶向MET的抗体、如本发明第三方面所述的靶向EGFR的纳米抗体、如本发明第四方面所述的靶向EGFR的抗体、或如本发明第五方面所述的多特异性抗体；
LU为化学键或连接子；
D是药物；
p为所述抗体-药物偶联物中的药物平均偶联数量，并且p是选自1～10的值。
在另一优选例中，p为2～6，优选为3～4，更优选为3.6～4.0。
在另一优选例中，所述的LU为马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸(MC-Val-Cit)接头。
在本发明的第十方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包含：
(i)如本发明第一方面所述的靶向MET的纳米抗体、如本发明第二方面所述的靶向MET的抗体、如本发明第三方面所述的靶向EGFR的纳米抗体、如本发明第四方面所述的靶向EGFR的抗体、如本发明第五方面所述的多特异性抗体、如本发明第六方面所述的重组蛋白、如本发明第八方面所述的重组的免疫细胞或如本发明第九方面所述的免疫偶联物；
(ii)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物包括单方药物、复方药物、或协同药物。
在另一优选例中，所述的药物组合物还包含其他生物活性物质，如治疗肿瘤的药物。
在另一优选例中，所述的药物组合物的施用方式选自下组：皮下注射、皮内注射、肌肉注射、静脉注射、腹腔注射、微针注射、口服、或口鼻腔喷入和雾化吸入。
在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型选自下组：液态、固体、或凝胶态。
在另一优选例中，所述的药物组合物为液态制剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂。
在本发明的第十一方面，提供了一种活性成分的用途，所述的活性成分选自下组：如本发明第一方面所述的靶向MET的纳米抗体、如本发明第二方面所述的靶向MET的抗体、如本发明第三方面所述的靶向EGFR的纳米抗体、如本发明第四方面所述的靶向EGFR的抗体、如本发明第五方面所述的多特异性抗体、如本发明第六方面所述的重组蛋白、如本发明第八方面所述的重组的免疫细胞或如本发明第九方面所述的免疫偶联物、或其组合，所述活性成分用于(a)制备检测试剂、检测板或试剂盒；和/或(b)制备预防和/或治疗疾病的药物。
在另一优选例中，所述检测试剂、检测板或试剂盒用于：
(1)检测样品中的MET和/或EGFR蛋白；和/或
(2)检测表达MET蛋白和/或EGFR蛋白的肿瘤细胞。
在另一优选例中，所述的检测试剂、检测板或试剂盒用于诊断MET和/或EGFR相关疾病。
在另一优选例中，所述疾病为MET和/或EGFR相关疾病。
在另一优选例中，所述疾病包括癌症。
在另一优选例中，所述的癌症包括实体瘤、血液癌。
在另一优选例中，所述癌症选自下组：结肠癌、肾嫌色细胞癌、肾乳头状细胞癌、间皮瘤、胰腺癌、前列腺癌、卵巢生殖细胞癌、甲状腺癌、胃癌、食管癌、肺癌(如肺腺癌和非小细胞肺癌)、乳腺癌(如三阴性乳腺癌)、恶性脑胶质瘤、肝癌、膀胱癌、子宫内膜癌、宫颈癌、白血病、骨髓癌、骨肉瘤、血管肉瘤、或其组合。
在另一优选例中，所述的癌症选自下组：肺癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、肾癌、胃癌。
在本发明的第十二方面，提供了一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码选自下组的多肽：
(1)如本发明第一方面所述的靶向MET的纳米抗体、如本发明第二方面所述的靶向MET的抗体、如本发明第三方面所述的靶向EGFR的纳米抗体、如本发明第四方面所述的靶向EGFR的抗体、或如本发明第五方面所述的多特异性抗体；
(2)如本发明第六方面所述的重组蛋白；或
(3)如本发明第七方面所述的CAR构建物。
在另一优选例中，所述多核苷酸包括RNA、DNA或cDNA。
在另一优选例中，所述的多核苷酸包括选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO:19、20、21、22、或其组合。
在本发明的第十三方面，提供了一种载体，所述的载体含有如本发明第十二方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。
在本发明的第十四方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有如本发明第十三方面所述的载体或基因组中整合有如本发明第十二方面所述的多核苷酸。
在本发明的第十五方面，提供了一种重组多肽的制备方法，所述方法包括：
(a)在适合表达的条件下，培养如本发明第十四方面所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是如本发明第一方面所述的靶向MET的纳米抗体、如本发明第二方面所述的靶向MET的抗体、如本发明第三方面所述的靶向EGFR的纳米抗体、如本发明第四方面所述的靶向EGFR的抗体、或如本发明第五方面所述的多特异性抗体、或如本发明第六方面所述的重组蛋白。
在本发明的第十六方面，提供了一种治疗疾病的方法，所述方法包括：给需要的对象施用如本发明第一方面所述的靶向MET的纳米抗体、如本发明第二方面所述的靶向MET的抗体、如本发明第三方面所述的靶向EGFR的纳米抗体、如本发明第四方面所述的靶向EGFR的抗体、或如本发明第五方面所述的多特异性抗体、如本发明第六方面所述的重组蛋白、如本发明第八方面所述的重组的免疫细胞、如本发明第九方面所述的免疫偶联物、或如本发明第十方面所述的药物组合物、或其组合。
在另一优选例中，所述的方法还包括：给需要的对象施用其他药物或治疗方法进行联合治疗。
在另一优选例中，所述的其他药物或治疗方法包括：抗肿瘤免疫治疗药物、肿瘤靶向药物、肿瘤化疗药物、肿瘤放射治疗。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1显示了纳米抗体筛选流程。
图2显示了MET抗体KY301-01与重组人MET抗原结合(ELISA法)。
图3显示了MET抗体KY301-01与重组人MET抗原(A)、鼠MET抗原(B)及猴MET抗原(C)结合(ELISA法)。
图4显示了MET抗体KY301-01可与CHO-K1-MET细胞(表达人源MET蛋白的CHO-K1细胞)结合。
图5显示了MET抗体KY301-01可在ASPC-1(A)、HCT116(B)、NCI-H1993(C)、EBC-1(D)细胞中发生内吞。
图6显示了MET抗体KY301-01可阻断HGF与MET抗原结合。
图7显示了MET抗体-MMAE偶联产物可有效杀伤NCI-H1975(A)、HCT116(B)、BxpC-3(C)、MDA-MB-468(D)、NCI-H1993(E)、HT29(F)、MDA-MB-231(G)、786O细胞(H)。
图8显示了MET抗体-MMAE产物可有效抑制HCT116移植瘤的生长。
图9显示了MET抗体-MMAE产物可有效抑制NCG荷瘤小鼠模型中的NCI-H1975肿瘤细胞的生长。
图10显示了EGFR抗体KY303-58可结合重组人EGFR抗原(ELISA法)。
图11显示了EGFR抗体KY303-58与重组人EGFR抗原(A)、鼠EGFR抗原(B)及猴EGFR抗原(C)结合(ELISA法)。
图12显示了EGFR抗体KY303-58不与CHO-K1细胞结合。
图13显示了EGFR抗体KY303-58可在NCI-H1975(A)及HCT116(B)细胞中发生内吞。
图14显示了EGFR抗体KY303-58不可阻断EGF与EGFR的结合。
图15显示了EGFR抗体-MMAE偶联产物可有效杀伤HCT116(A)、NCI-H1975(B)、NCI-H1993(C)、MDA-MB-468(D)、MDA-MB-231(E)、HT29(F)、BxpC-3(G)。
图16显示了EGFR抗体-MMAE产物可有效抑制NCG荷瘤小鼠模型中的NCI-H1975肿瘤细胞的生长。
图17显示了EGFR抗体-MMAE产物可有效抑制NCG荷瘤小鼠模型中的肿瘤生长。
图18显示了MET-EGFR双抗的8种形式。
图19显示了MET-EGFR抗体可与重组人MET抗原结合(ELISA法)。
图20显示了MET-EGFR抗体可与重组人EGFR抗原结合(ELISA法)。
图21显示了MET-EGFR抗体可与重组人、鼠、猴的MET及EGFR抗原结合。
图22显示了MET-EGFR抗体在细胞上的结合具有特异性。
图23显示了8种MET-EGFR抗体-MMAE产物可有效杀伤HCT116细胞。
图24显示了1.25μg/mL下，BH01-BK58、DH01-DK58、BH01-DK58对HCT116细胞具有显著的杀伤作用。
图25显示了8种MET-EGFR抗体-MMAE产物可有效杀伤NCI-H1975细胞。
图26显示了1.25μg/mL下，BH01-BK58、DH01-DK58、BH01-DK58对NCI-H1975细胞具有显著的杀伤作用。
图27显示了BH01-BK58、BH01-DK58以及对标抗体AZ-RAA22/B09与MET、EGFR抗原的结合解离动力学曲线。
图28显示了BH01-BK58-MMAE、BH01-DK58-MMAE主要为DAR4产物。
图29显示了BH01-BK58-MMAE、BH01-DK58-MMAE可有效杀伤HT29(A)、BxPC-3(B)、HS746T(C)、SNU-5(D)细胞。
图30显示了BH01-BK58-MMAE、BH01-DK58-MMAE可有效抑制接种HCT116细胞的B-NDG小鼠的肿瘤生长，BH01-DK58-MMAE的抑瘤效果优于BH01-BK58-MMAE。
图31显示了BH01-BK58-MMAE、BH01-DK58-MMAE可有效抑制接种NCI-H1975细胞的B-NDG小鼠的肿瘤生长，BH01-DK58-MMAE的抑瘤效果优于BH01-BK58-MMAE。
图32显示了BH01-BK58-MMAE、BH01-DK58-MMAE在10mg/kg及以下剂量耐受良好。
图33显示了BH01-BK58-MMAE在16mg/kg与20mg/kg给药剂量下对雄性C57BL/6小鼠具有一定毒性，BH01-DK58-MMAE高剂量下依然耐受良好。
图34显示了BH01-DK58的内化能力强于单靶抗体及对标抗体。
图35显示了9种肿瘤细胞中MET及EGFR蛋白水平。
图36显示了BH01-DK58-MMAE对肿瘤的杀伤作用优于单靶ADC(KY 301-01-MMAE、KY303-58-MMAE)。
图37显示了BH01-DK58-MMAE对正常细胞的毒性弱于对标抗体的MMAE偶联物。
图38显示了BH01-DK58-MMAE可诱导HCT116发生G2/M期阻滞。
图39显示了KY-0301(即BH01-DK58-MMAE)结构示意图。
图40显示了KY-0301能显著抑制人肺癌肿瘤细胞EBC-1移植瘤的生长。
图41显示了KY-0301能显著抑制人结直肠癌肿瘤细胞HT29移植瘤的生长。
图42显示了KY-0301对NCI-H1975异种移植瘤的高肿瘤负荷模型和复发模型抗肿瘤药效明显。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了一种抗MET/EGFR双特异性抗体及其药物偶联物。具体地，本发明提供了抗MET的纳米抗体和抗EGFR的纳米抗体，及包含本发明两种纳米抗体的双特异性抗体。本发明的双特异性纳米抗体同时靶向MET、EGFR双靶点，本发明具有分子量小、肿瘤组织渗透较快的特点，与传统抗体相比具有更好的毒素递送能力。在此基础上，完成了本发明。
MET
MET又称HGF(hepatocyte growth factor)受体，由胞外区、跨膜区、胞内区三个部分。胞外区包含Sema(Semaphorin)结构域、PSI(Plexin Semaphorin Integrin)结构域及IPT(Immunoglobulin Plexin Transcription)结构域，HGF的SPH结构域与与MET的SEMA结构域相互作用，诱导MET激活。MET的胞内区包含近膜区(Juxtamembrane)、酪氨酸激酶催化结构域及C末端尾链。当HGF与MET结合，MET二聚化，酪氨酸激酶催化结构域中酪氨酸Y1234、Y1235发生自磷酸化，并诱导C末端尾链中Y1349、Y1356发生磷酸化，招募GRB2、SRC、PI3K、GV1等效应分子，激活下游信号通路。近膜区丝氨酸975、酪氨酸Y1003是负向调节MET活性的重要位点。酪氨酸Y1003磷酸化后，招募泛素连接酶c-CBL，泛素化MET，促进MET降解，减少MET信号通路的传导。MET下游信号通路RAS/MAPK增殖生存信号通路、PI3K/AKT/mTOR细胞运动及侵袭信号通路、SRC/FAK机械传感信号通路，当MET发生基因扩增、突变、过表达时，MET过度激活，诱发癌变或促进肿瘤耐药、侵袭。例如，MET扩增是非小细胞肺癌、肝癌、胃癌、三阴性乳腺癌不良预后的指标。在EGFR抑制剂耐药的NSCLC细胞中，MET基因发生扩增，影响治疗效果；MET 14位外显子跳跃突变存在于约4％的非小细胞肺癌中，与其免疫治疗的不良预后相关。
EGFR
EGFR是HER(Human Epidermal Growth Factor Receptor)蛋白家族成员，又称HER1，与MET结构相似，分为胞外区、跨膜区、胞内区3个部分。EGFR的胞外区有4个结构域(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)，结构域Ⅰ、Ⅲ利用leucine-rich结构与GF、TGF-α、HB-EGF等配体结合，Ⅱ、Ⅳ结构域中富集半胱氨酸。EGFR胞内区分为近膜区、酪氨酸激酶区、C末端尾链，含有Y992、Y1045、Y1068、Y1148、Y117 5个自磷酸化位点。配体与EGFR结合后，EGFR形成二聚体，发生自磷酸化，激活下游RAS/RAF/MAPK、AKT、JAK/STAT信号通路，调控细胞的生长、增殖、分化等生理功能。有研究表明，EGFR过表达及突变与许多肿瘤的发生发展、耐药有关。例如，EGFR表达水平的升高是头颈癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌、食道癌等的预测指标。被称为EGFR“经典”突变的19号外显子的缺失和21号外显子的单氨基酸L858R替代在EGFR突变的NSCLC中约占85％。
MET与EGFR作为两个重要的原癌基因，两者之间存在相互关联。MET、EGFR两者在肿瘤组织中的表达常高于正常组织，且在多种肿瘤细胞中呈共表达趋势。如GEPIA数据库中显示，结肠癌、肾嫌色细胞癌、肾乳头状细胞癌、间皮瘤、胰腺癌、前列腺癌、卵巢生殖细胞癌及甲状腺癌中，MET与EGFR表达的线性相关系数在0.5以上，具有较好的相关性。
表1MET与EGFR在部分肿瘤细胞中的共表达相关性
癌种 COAD KICH KIRP MESO PAAD PRAD TGCT THCA
R 0.54 0.54 0.52 0.53 0.59 0.61 0.62 0.6
p-value 0 2.4e-06 0 1.2e-07 0 0 6.7e-16 0
纳米抗体
如本文所用，术语“本发明的抗MET纳米抗体”、“抗MET纳米抗体”可互换使用，均指本发明第一方面的特异性识别和结合于MET(包括人MET)的纳米抗体，特别优选的是VHH链的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的纳米抗体。
如本文所用，术语“本发明的抗EGFR纳米抗体”、“抗EGFR纳米抗体”可互换使用，均指本发明第一方面的特异性识别和结合于EGFR(包括人EGFR)的纳米抗体，特别优选的是VHH链的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的纳米抗体。
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
如本文所用，术语“纳米抗体nanobody”、“VHH”具有相同的含义，指单克隆抗体重链的可变区。纳米抗体(VHH)是具有完整功能的最小的抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的纳米抗体(VHH)。
如本文所用，术语“重链抗体”指仅含有重链的抗体。在骆驼科动物血液中发现有一部分抗体是缺失轻链的“重链抗体”。本发明的重链抗体包含重链可变区(VHH)和重链恒定区CH2和CH3。本发明的重链抗体可以是分离自动物的(如骆驼源的)天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的抗体；或者可以是使用本发明的纳米抗体(VHH)与重链恒定区重组获得的重组抗体。本发明重链抗体可以包含来源于例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定区，较佳地来源于IgG1的恒定区。
如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链可变区包括三个互补决定区CDR1、CDR2、和CDR3。CDR的分区方法目前有多种，包括IMGT法、Kabat法、Chothia法、VBASE2法等。在一种实施方式中，本发明所提及的CDR分区方法均使用IMGT法。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区。
本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含可变区的重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该可变区与本发明抗体的重链可变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。
在本发明中，术语“本发明重组蛋白”、“本发明融合蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用，都指特异性结合MET和/或EGFR蛋白的多肽，例如具有本发明纳米抗体VHH链的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。
本发明抗体的重链的可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的抗体重链可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。
抗MET纳米抗体和抗EGFR纳米抗体
本发明提供了靶向MET的纳米抗体，所述纳米抗体的VHH链具有以下互补决定区CDR1、CDR2和CDR3：
SEQ ID NO:13所示的CDR1，
SEQ ID NO:14所示的CDR2，和
SEQ ID NO:15所示的CDR3。
在一种实施方式中，所述靶向MET的纳米抗体的VHH链具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
本发明还提供了靶向EGFR的纳米抗体，所述纳米抗体的VHH链具有以下互补决定区CDR1、CDR2和CDR3：
SEQ ID NO:16所示的CDR1，
SEQ ID NO:17所示的CDR2，和
SEQ ID NO:18所示的CDR3。
在一种实施方式中，所述靶向EGFR的纳米抗体的VHH链具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
较佳地，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留对MET和/或EGFR的结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸序列所形成的序列优选为同源性为至少80％，较佳地至少85％，更佳地至少为90％，最佳地至少95％的氨基酸序列。
其中，所述动物优选为哺乳动物，如鼠、骆驼。
在优选实施例中，本发明公开了多种靶向MET和/或EGFR的高特异性和高亲和力的骆驼源和人源化纳米抗体，其仅包括重链，所述重链含有重链可变区(VHH)氨基酸序列和可选的恒定区CH2、CH3。
双特异性抗体
在本发明中，还包括含有本发明的MET和/或EGFR纳米抗体的重组蛋白(或融合蛋白)。一种优选的融合蛋白为多特异性抗体，例如双特异性抗体。
本发明的双特异性抗体特异性结合MET和EGFR抗原。在优选的实施方式中，本发明的双特异抗体对MET(例如人MET)的亲和力显著高于对EGFR(例如人EGFR)的亲和力。例如，当以对抗原的平衡解离常数(KD值)表示亲和力时，本发明的双特异性抗体对EGFR的KD值与对MET的KD值的比值(KDEGFR/KDMET)≥50，较佳地≥100，更佳地≥150。
本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
本发明的抗体可以是双链或单链抗体，并且可以是选自动物源抗体、嵌合抗体、人-动物嵌合抗体、优选为人源化抗体。
本发明所述抗体衍生物可以是单链抗体、和/或抗体片段，如：Fab、Fab'、(Fab')2或该领域内其他已知的抗体衍生物等，以及IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM抗体或其他亚型的抗体中的任意一种或几种。
本发明的抗体可以是同源二聚体或异源二聚体。如本文所用，“同源二聚体”是指具有两条具有相同氨基酸序列的抗原结合链的抗体。如本文所用，“异二聚体”是指具有两条具有不同氨基酸序列的抗原结合链的抗体。当本发明的抗体是异源二聚体时，其可以在每一条链上包含一个或多个特异性结合位点。例如，可以在一条链上包含靶向Met和EGFR的结合域(如VHH)，在另一条链上仅包含靶向Met的结合域(如VHH)。
本发明的双特异性抗体可以通过“knob-into-hole”策略产生。简而言之，在IgG中形成恒定区接合点的选定氨基酸可以在影响恒定区相互作用的位置发生突变，以促进异二聚体的形成。将具有小侧链(hole)的氨基酸引入一个链的恒定区，将具有大侧链(knob)的氨基酸引入另一链的恒定区。由于带有“hole”的重链与带有“knob”的抗原结合链的优先相互作用，在两条链间形成异二聚体。
本发明双特异性抗体的每一条抗原结合链中，VHH部分可以通过铰链区与IgG的Fc段连接。在一种实施方式中，靶向EGFR-VHH结构域采用短臂铰链连接到Fc段。该短臂铰链与野生型的IgG1铰链(EPKSSDKTHTCPPCP,SEQ ID NO:23)相比可以在N端截短1-7个氨基酸。在一种实施方式中，断臂铰链截短4个氨基酸，并将截短后的铰链突变为ADKTHTCPPCP(SEQ IDNO:24)。短臂铰链设计有助于降低EGFR端的抗体摆动范围，从而降低EGFR抗体与抗原的结合优先级。
如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明抗体指具有MET和/或EGFR蛋白结合活性的、包括上述CDR区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
在本发明中，“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表A
最初的残基 代表性的取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％ Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。
抗体的制备
本发明抗体或其片段的DNA分子的序列可以用常规技术，比如利用PCR扩增或基因组文库筛选等方法获得。此外，还可将将纳米抗体和恒定区的编码序列融合在一起，形成重链抗体。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码所述的本发明的抗体(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。优选的动物细胞包括(但并不限于)：CHO-S、HEK-293细胞。
通常，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。然后用常规的免疫球蛋白纯化步骤，如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的抗体。
所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。比如，单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结合试验(如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来测定。单克隆抗体的结合亲和力例如可用Munson等,Anal.Biochem.,107:220(1980)的Scatchard分析来测定。
本发明的抗体可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
免疫偶联物
本发明还提供了基于本发明抗体的免疫偶联物(ADC)，例如纳米抗体偶联药物(nanobody-drug conjugate，NDC)。
典型地，所述抗体偶联药物包括所述抗体、以及效应分子，所述抗体与所述效应分子偶联，并优选为化学偶联。其中，所述效应分子优选为具有治疗活性的药物。此外，所述效应分子可以是毒蛋白、化疗药物、小分子药物或放射性核素中的一种或多种。
本发明抗体与所述效应分子之间可以是通过偶联剂进行偶联。所述偶联剂的例子可以是非选择性偶联剂、利用羧基的偶联剂、肽链、利用二硫键的偶联剂中的任意一种或几种。所述非选择性偶联剂是指使效应分子和抗体形成共价键连接的化合物，如戊二醛等。所述利用羧基的偶联剂可以是顺乌头酸酐类偶联剂(如顺乌头酸酐)、酰基腙类偶联剂(偶联位点为酰基腙)中的任意一种或几种。
抗体上某些残基(如Cys或Lys等)用于与多种功能基团相连，其中包括成像试剂(例如发色基团和荧光基团)，诊断试剂(例如MRI对比剂和放射性同位素)，稳定剂(例如乙二醇聚合物)和治疗剂。抗体可以被偶联到功能剂以形成抗体-功能剂的偶联物。功能剂(例如药物，检测试剂，稳定剂)被偶联(共价连接)至抗体上。功能剂可以直接地、或者是通过接头间接地连接于抗体。
纳米抗体可以偶联药物从而形成抗体药物偶联物(ADCs)。典型地，ADC包含位于药物和抗体之间的接头。接头可以是可降解的或者是不可降解的接头。可降解的接头典型地在细胞内环境下容易降解，例如在目标位点处接头发生降解，从而使药物从抗体上释放出来。合适的可降解的接头包括，例如酶降解的接头，其中包括可以被细胞内蛋白酶(例如溶酶体蛋白酶或者内体蛋白酶)降解的含有肽基的接头，或者糖接头例如，可以被葡糖苷酸酶降解的含葡糖苷酸的接头。肽基接头可以包括，例如二肽，例如缬氨酸-瓜氨酸，苯丙氨酸-赖氨酸或者缬氨酸-丙氨酸。其它合适的可降解的接头包括，例如，pH敏感接头(例如pH小于5.5时水解的接头，例如腙接头)和在还原条件下会降解的接头(例如二硫键接头)。不可降解的接头典型地在抗体被蛋白酶水解的条件下释放药物。
连接到抗体之前，接头具有能够和某些氨基酸残基反应的活性反应基团，连接通过活性反应基团实现。巯基特异性的活性反应基团是优选的，并包括：例如马来酰亚胺类化合物，卤代酰胺(例如碘、溴或氯代的)；卤代酯(例如碘、溴或氯代的)；卤代甲基酮(例如碘、溴或氯代)，苄基卤代物(例如碘、溴或氯代的)；乙烯基砜，吡啶基二硫化物；汞衍生物例如3,6-二-(汞甲基)二氧六环，而对离子是醋酸根、氯离子或者硝酸根；和聚亚甲基二甲基硫醚硫代磺酸盐。接头可以包括，例如，通过硫代丁二酰亚胺连接到抗体上的马来酰亚胺。
在一种实施方式中，本发明的ADC使用马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸(MC-Val-Cit)接头。
药物可以是任何细胞毒性，抑制细胞生长或者免疫抑制的药物。在实施方式中，接头连接抗体和药物，而药物具有可以和接头成键的功能性基团。例如，药物可以具有可以和连接物成键的氨基，羧基，巯基，羟基，或者酮基。在药物直接连接到接头的情况下，药物在连接到抗体之前，具有反应的活性基团。
有用的药物类别包括，例如，抗微管蛋白药物、DNA小沟结合试剂、DNA复制抑制剂、烷化试剂、抗生素、叶酸拮抗物、抗代谢药物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱等。特别有用的细胞毒性药物类的例子包括，例如，DNA小沟结合试剂、DNA烷基化试剂、和微管蛋白抑制剂、典型的细胞毒性药物包括、例如奥瑞他汀(auristatins)、喜树碱(camptothecins)、多卡霉素/倍癌霉素(duocarmycins)、依托泊甙(etoposides)、美登木素(maytansines)和美登素类化合物(maytansinoids)(例如DM1和DM4)、紫杉烷(taxanes)、苯二氮卓类(benzodiazepines)或者含有苯二氮卓的药物(benzodiazepine containingdrugs)(例如吡咯并[1,4]苯二氮卓类(PBDs)，吲哚啉苯并二氮卓类(indolinobenzodiazepines)和噁唑烷并苯并二氮卓类(oxazolidinobenzodiazepines))和长春花生物碱(vinca alkaloids)。
在本发明中，药物-接头可以用于在一个简单步骤中形成ADC。在其它实施方式中，双功能连接物化合物可以用于在两步或多步方法中形成ADC。例如，半胱氨酸残基在第一步骤中与接头的反应活性部分反应，并且在随后的步骤中，接头上的功能性基团与药物反应，从而形成ADC。
通常，选择接头上功能性基团，以利于特异性地与药物部分上的合适的反应活性基团进行反应。作为非限制性的例子，基于叠氮化合物的部分可以用于特异性地与药物部分上的反应性炔基基团反应。药物通过叠氮和炔基之间的1,3-偶极环加成，从而共价结合于接头。其它的有用的功能性基团包括，例如酮类和醛类(适合与酰肼类和烷氧基胺反应)，膦(适合与叠氮反应)；异氰酸酯和异硫氰酸酯(适合与胺类和醇类反应)；和活化的酯类，例如N-羟基琥珀酰亚胺酯(适合与胺类和醇类反应)。这些和其它的连接策略，例如在《生物偶联技术》，第二版(Elsevier)中所描述的，是本领域技术人员所熟知的。本领域技术人员能够理解，对于药物部分和接头的选择性反应，当选择了一个互补对的反应活性功能基团时，该互补对的每一个成员既可以用于接头，也可以用于药物。
本发明还提供了制备ADC的方法，可进一步地包括：将抗体与药物-接头化合物，在足以形成抗体偶联物(ADC)的条件下进行结合。
在某些实施方式中，本发明方法包括：在足以形成抗体-接头偶联物的条件下，将抗体与接头化合物进行结合。在这些实施方式中，本发明方法还进一步地包括：在足以将药物部分通过接头共价连接到抗体的条件下，将抗体接头偶联物与药物部分进行结合。
本发明提供的双特异性抗体制备的ADC具有均一的药物抗体比(DAR)。在一些实施方式中，其药物抗体比在2～4范围内，例如2～2.5、2.5～3、3～3.2、3.2～3.4、3.4～3.6、3.6～3.8、3.8～4。
应用
本发明还提供了本发明抗体的用途，例如用于制备诊断制剂、或制备用于预防和/或治疗MET和/或EGFR相关的疾病的药物。所述MET和/或EGFR相关的疾病包括肿瘤发生、生长和/或转移、肿瘤耐药相关疾病、炎症、代谢相关疾病等。
本发明抗体、ADC或CAR-T等的用途，包括(但并不限于)：诊断、预防和/或治疗肿瘤发生、生长和/或转移，尤其是MET和/或EGFR高表达的肿瘤。所述肿瘤包括(但并不限于)：结肠癌、肾嫌色细胞癌、肾乳头状细胞癌、间皮瘤、胰腺癌、前列腺癌、卵巢生殖细胞癌、甲状腺癌、胃癌、食管癌、肺癌(如肺腺癌和非小细胞肺癌)、乳腺癌(如三阴性乳腺癌)、恶性脑胶质瘤、肝癌、膀胱癌、子宫内膜癌、宫颈癌、白血病、骨髓癌、血管肉瘤、或其组合。
药物组合物
本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白或其ADC或相应的CAR-T细胞，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明所述抗体也可以是由核苷酸序列在细胞内表达用于的细胞治疗，比如，所述抗体用于嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)等。
本发明的药物组合物可直接用于结合MET和/或EGFR蛋白分子，因而可用于预防和治疗肿瘤等疾病。此外，还可同时使用其他治疗剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的单克隆抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约20毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
对于ADC而言，由于本发明提供的纳米抗体-药物偶联物可以靶向瞄准特殊的细胞群体，与细胞表面特异蛋白(抗原)结合，从而通过结合物内吞或药物渗入使得药物以活性形式释放到细胞内，因此，本发明的纳米抗体-药物偶联物可以用于治疗目标疾病，上面提到的抗体-药物偶联物可以以治疗有效量，通过合适的途径给予受试者(例如人)。需要治疗的受试者可以是有风险，或怀疑患有与特定抗原的活性或表达量有关病症的患者。这样的患者可以通过常规体检来鉴定。
当用本发明的纳米抗体-药物偶联物治疗时，可以通过本领域常规的方法进行递送。例如，它可以通过使用脂质体，水凝胶，环糊精，生物可降解的纳米胶囊，或生物粘附性微球被引入到细胞中。或者，所述核酸或载体可在本地通过直接注射或通过使用输注泵递送。
本发明的主要优点包括：
1)本发明纳米抗体的具有分子量小、肿瘤组织渗透较快的特点，与传统抗体相比，其构建的纳米抗体ADC具有更好的毒素递送能力
2)本发明MET-EGFR双靶点ADC使用纳米抗体，其铰链区仅两对二硫键，通过随机半胱氨酸偶联法最多可偶联4个毒素，DAR值均一，偶联后未纯化DAR4的ADC纯度可达90％以上，利于大规模生产。
3)本发明中EGFR抗体经过优化具有适中的亲和力。本发明双特异性抗体对MET的亲和力显著高于对EGFR的亲和力。同时，MET-EGFR双靶ADC的EGFR端进行短臂hinge设计，一定程度上降低EGFR抗体与抗原的结合优先级，提高MET-EGFR双靶ADC的安全性，在小鼠急性毒性实验研究中，EGFR端短臂hinge设计可以有效降低小鼠毒副作用。
4)肿瘤细胞对EGFR抑制剂耐药多与MET基因的扩增有关，同时抑制MET、EGFR能够增强肿瘤杀伤效果，减少肿瘤耐药。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例中使用的细胞系包括：
肿瘤细胞
肺癌：NCI-H1975、NCI-H1993、EBC-1、HCC827
结直肠癌：HCT116、HT29
胰腺癌：BxPC-3、ASPC-1
乳腺癌：MDA-MB-231、MDA-MB-468
肾癌：786-O
胃癌：HS746T、SNU-5
非肿瘤细胞
仓鼠卵巢细胞：CHO-K1、CHO-K1-MET(表达人MET蛋白的CHO-K1细胞)、CHO-K1-EGFR(表达人EGFR蛋白的CHO-K1细胞)
人正常组织细胞：HFL-1(人肺成纤维细胞)、MIHA细胞(人正常肝细胞)、MRC-5(人胚肺成纤维细胞)、BEAS-2B(人正常支气管上皮细胞)
实施例1.羊驼免疫和MET纳米抗体筛选
用重组人MET抗原免疫羊驼，经过4次抗原免疫，羊驼血清效价达到建库标注后，提取羊驼PBMC中的mRNA，反转录获得cDNA，通过噬菌体展示技术进行抗体筛选。纳米抗体筛选流程见图1。
实施例2.MET纳米抗体表达纯化
经过噬菌体筛选技术，获得MET纳米抗体序列KY301-VHH01，其氨基酸序列和核苷酸序列见表2。其后将KY301-VHH01与IgG1 Fc序列融合表达，融合表达的MET纳米抗体命名为KY301-01。
KY301-01 CDR序列(IMGT)如下所示：
CDR1:GRTDSTYA(SEQ ID NO:13)；
CDR2:ISWSGGST(SEQ ID NO:14)；
CDR3:AADHRTGSTRFRTAQYDYDY(SEQ ID NO:15)。
表2MET抗体的可变区氨基酸序列及核酸序列
实施例3.MET抗体与人MET抗原的结合活性评价
方法：
1.包被重组人MET抗原4℃过夜，200μL PBST(0.01％ Tween-20)清洗2遍；
2.3％BSA溶液300μL/孔封闭2h，200μL PBST(0.01％ Tween-20)清洗2遍；
3.加入MET抗体，室温孵育1h，200μL PBST(0.01％ Tween-20)清洗2遍；
4.加入抗Fc-HRP抗体稀释液100μL，37℃孵育0.5h，200μL PBST(0.01％Tween-20)清洗4遍；
5.加入100μL TMB显色液，显色5min；
6.加入50μL终止液终止反应，于酶标仪450nm处读取吸光度值。
实验结果如表3和图2所示。结果显示，MET抗体KY301-01可与MET抗原结合，其抗原水平结合活性与MET-BMK2和MET-BMK4相当。MET-BMK2来自于专利US11142578B2中的SEQ IDNO:82，MET-BMK4来自于Amivantamab中的MET单抗部分。
表3MET抗体与重组人MET抗原结合的EC50值
KY301-01 MET-BMK2 MET-BMK4
EC50(μg/mL) 0.002333 0.007301 0.01818
实施例4.MET抗体的种属交叉结合活性评价
方法：
1.分别包被重组人、鼠、猴源MET抗原4℃过夜，200μL PBST(0.01％Tween-20)清洗2遍；
2. 3％BSA溶液300μL/孔封闭2h，200μL PBST(0.01％ Tween-20)清洗2遍；
3.加入MET抗体，室温孵育1h，200μL PBST(0.01％ Tween-20)清洗2遍；
4.加入抗Fc-HRP抗体稀释液100μL，37℃孵育0.5h，200μL PBST(0.01％Tween-20)清洗4遍；
5.加入100μL TMB显色液，显色5min；
6.加入50μL终止液终止反应，于酶标仪450nm处读取吸光度值。
如图3和表4所示，实验结果显示，MET抗体KY301-01可与人、鼠、猴的MET抗原结合，具有种属交叉性质。MET-BMK2和MET-BMK4与小鼠MET抗原无结合活性。
表4MET抗体与鼠、猴源MET抗原结合的EC50值
EC50(μg/mL) KY301-01 MET-BMK2 MET-BMK4
mMET 0.01692 / /
cynoMET 0.004290 0.008757 0.005713
实施例5.MET抗体在细胞水平的结合活性评价
方法：
1.CHO-K1-MET细胞(表达人源MET蛋白的CHO-K1细胞)铺至96孔透明V底板中，1E5个细胞/孔，每孔100μL细胞悬液；
2.每孔加入100μL稀释的待测抗体液，4℃孵育1h，1％ FBS的PBS200μL清洗细胞2次；
3.每孔加入100μL 1:100稀释的抗Fc-PE抗体，4℃孵育0.5h；
4.1％ FBS的PBS100μL清洗细胞2次，100μL重悬细胞，PE荧光通道检测荧光信号，观察中位荧光强度。
如图4所示，实验结果显示，MET抗体与CHO-K1-MET细胞具有结合活性，且结合活性强于MET-BMK2。
实施例6.MET抗体在肿瘤细胞中的内吞活性评价
方法：
1.ASPC-1、HCT116、NCI-H1993、EBC-1细胞分别铺至96孔透明V底板中，3E5个细胞/孔，每孔100μL细胞悬液；
2.每孔加入100μL稀释的待测抗体液，4℃孵育1h，培养基200μL清洗细胞2次；
3.200μL培养基重悬细胞，每孔转移100μL细胞悬液至新的96孔V底板中，置于37℃2h，孔板中的剩余细胞置于4℃2h；
4.离心去除上清，每孔加入100μL 1:100稀释的抗Fc-PE抗体，4℃孵育0.5h；
5.1％ FBS的PBS100μL清洗细胞2次，100μL重悬细胞，PE荧光通道检测荧光信号，观察中位荧光强度，计算内吞率。
如图5所示，实验结果显示，MET抗体在ASPC-1、HCT116、NCI-H1993、EBC-1细胞中均发生内吞，内吞率与细胞种类有关。
实施例7.MET抗体的配体阻断活性评价
方法：
1.包被重组人MET抗原，4℃过夜，200μL PBST(0.01％ Tween-20)清洗2遍；
2.3％BSA溶液300μL/孔封闭2h，200μL PBST(0.01％ Tween-20)清洗2遍；
3.加入100μL MET抗体与不同梯度稀释的HA标签HGF配体的混合液，室温孵育1h，200μL PBST(0.01％ Tween-20)清洗2遍；
4.加入抗HA-HRP抗体稀释液100μL，37℃孵育0.5h，200μL PBST(0.01％Tween-20)清洗4遍；
5.加入100μL TMB显色液，显色5min；
6.加入50μL终止液终止反应，于酶标仪450nm处读取吸光度值。
如图6所示，实验结果显示，KY301-01具有阻断HGF的作用。
实施例8.MET抗体偶联MMAE
方法：
1.依次加入组氨酸-醋酸缓冲液(pH值为5.5)、EDTA-2Na溶液、TCEP溶液、MET抗体，使MET抗体终浓度为2～3mg/mL，EDTA-2Na终浓度5mM，TCEP物质的量为MET抗体物质的量的8倍，混匀，37℃振荡反应4h；
2.加入9倍于抗体物质的量的MMAE及DMSO溶液，使DMSO总量占总反应体积的10％，4℃振荡反应2h；
3.加入7倍于抗体物质的量的L-半胱氨酸，混匀；
4.将上述反应产物离心，取上清转移至10KDa的超滤管中，离心，加入组氨酸-醋酸缓冲液，离心，重复18次，去除未偶联在抗体上的游离毒素；
5.将超滤管中的液体取出，用组氨酸-醋酸缓冲液润洗超滤管，与之前取出的液体混匀，280nm处检测吸光度，计算抗体浓度。
实施例9.MET抗体-MMAE产物的细胞毒性评价
方法：
1.NCI-H1975/HCT116/BxPC-3/MDA-MB-468/NCI-H1993/HT29/MDA-MB-231/786O细胞铺至黑壁透明底96孔板中，100μL细胞悬液/孔；
2.每孔加入10μL梯度稀释的待测ADC，培养6天；
3.每孔加入100μL CellTiter-Glo 2.0Cell Viability Assay，振荡混匀10min，检测荧光强度。
如图7所示，实验结果显示，MET抗体-MMAE偶联物对不同肿瘤细胞的敏感性不同，在高浓度下可有效抑制多种肿瘤细胞的生长。
表5MET抗体-MMAE偶联产物在不同肿瘤细胞中的IC50值(μg/mL)
Cell Line KY301-01 Cell Line KY301-01
HCT116 6.320 786-O >20
HT29 >20 BxPC-3 >20
NCI-H1975 9.961 NCI-H1993 >20
MDA-MB-468 1.512 MDA-MB-231 3.096
实施例10.MET抗体-MMAE产物抑制HCT116异种移植瘤的生长
方法：
1.将HCT116接种于雌性NCG小鼠右侧前胁肋部皮下(5-6周龄，18-21)；
2.待肿瘤生长至100-150mm3左右时分组，每组5只，分3组；
3.尾静脉注射给予MET单靶ADC或PBS，给药剂量为6mg/kg、2mg/kg，每周1次，持续2周；
4.每周2次测量肿瘤体积及体重，记录荷瘤鼠体重和肿瘤体积的变化与给药时间的关系；
5.计算肿瘤体积及肿瘤生长抑制率：
肿瘤体积：(V)计算为(长×宽2)/2
肿瘤生长抑制率(TGI％)用以下公式计算：
肿瘤生长抑制率＝(1-药物处理组肿瘤体积变化/对照组肿瘤体积变化)×100％
如图8所示，实验结果显示，接种HCT116肿瘤细胞的NCG小鼠模型中，2mg/kg给药剂量下，肿瘤生长得到明显抑制，Day16抑瘤率为79.1％；加大剂量情况下(6mg/kg)，MET单靶ADC对肿瘤体积的抑制作用进一步显著提高，抑瘤率达到98.6％。上述结果表明，MET单靶ADC可有效抑制HCT116移植瘤的生长，且呈剂量依赖性。同时，低剂量和高剂量组均未表现出对小鼠体重的显著影响。
实施例11.MET抗体-MMAE产物抑制NCI-H1975异种移植瘤的生长方法：
1.将NCI-H1975细胞接种于雌性NCG小鼠右侧前胁肋部皮下(5-6周龄，18-21)；
2.待肿瘤生长至100-150mm3左右时分组，每组5只，分3组；
3.尾静脉注射给予MET单靶ADC或PBS，给药剂量为6mg/kg、2mg/kg，每周1次，持续2周；
4.每周2次测量肿瘤体积及体重，记录荷瘤鼠体重和肿瘤体积的变化与给药时间的关系；
5.计算肿瘤体积及肿瘤生长抑制率：
肿瘤体积：(V)计算为(长×宽2)/2
肿瘤生长抑制率(TGI％)用以下公式计算：
肿瘤生长抑制率＝(1-药物处理组肿瘤体积变化/对照组肿瘤体积变化)×100％
如图9所示，实验结果显示，接种NCI-H1975肿瘤细胞的NCG小鼠模型中，2mg/kg与6mg/kg剂量下，肿瘤生长均得到显著抑制，Day20的抑瘤率分别为97.6％、98.01％2mg/kg。上述结果表明，MET单靶ADC可有效抑制HNCI-H1975异种移植瘤的生长，且呈剂量依赖性。同时，低剂量和高剂量组均未表现出对小鼠体重的显著影响。
实施例12.羊驼免疫和EGFR纳米抗体筛选及表达纯化
用重组人EGFR抗原免疫羊驼，经过4次抗原免疫，羊驼血清效价达到建库标注后，提取羊驼PBMC中的mRNA，反转录获得cDNA，通过噬菌体展示技术进行抗体筛选。纳米抗体筛选流程见图1。
经过噬菌体筛选，获得EGFR纳米抗体序列KY303-VHH58，其氨基酸序列和核苷酸序列见表6。其后将KY303-VHH58与IgG1 Fc序列融合表达，融合表达的EGFR纳米抗体命名为KY303-58。
KY303-58的CDR序列(IMGT)如下所示：
CDR1:GSTFSSYA(SEQ ID NO:16)；
CDR2:ISSGGST(SEQ ID NO:17)；
CDR3:NLHPRVN(SEQ ID NO:18)。
表6EGFR抗体的可变区氨基酸序列及核酸序列
实施例13.EGFR抗体与人EGFR抗原的结合活性评价
方法：
1.包被重组人EGFR抗原4℃过夜，200μL PBST(0.01％ Tween-20)清洗2遍；
2. 3％BSA溶液300μL/孔封闭2h，200μL PBST(0.01％ Tween-20)清洗2遍；
3.加入EGFR抗体，室温孵育1h，200μL PBST(0.01％ Tween-20)清洗2遍；
4.加入抗Fc-HRP抗体稀释液100μL，37℃孵育0.5h，200μL PBST(0.01％Tween-20)清洗4遍；
5.加入100μL TMB显色液，显色5min；
6.加入50μL终止液终止反应，于酶标仪450nm处读取吸光度值。
如图10所示，实验结果显示，EGFR抗体KY303-58可与EGFR抗原结合，且亲和力低于对标抗体EGFR-BMK2，与EGFR的亲和力弱，提示具有更好的安全性。EGFR-BMK2来自于专利US10047160B2中的SEQ ID NO 34和SEQ ID NO 42。
表7EGFR抗体与重组人EGFR抗原结合的EC50值
KY303-58 EGFR-BMK2
EC50(μg/mL) 0.01271 0.007996
实施例14.EGFR抗体的种属交叉结合活性评价
方法：
1.分别包被重组人、鼠、猴源EGFR抗原4℃过夜，200μL PBST(0.01％Tween-20)清洗2遍；
2.3％BSA溶液300μL/孔封闭2h，200μL PBST(0.01％ Tween-20)清洗2遍；
3.加入EGFR抗体，室温孵育1h，200μL PBST(0.01％ Tween-20)清洗2遍；
4.加入抗Fc-HRP抗体稀释液100μL，37℃孵育0.5h，200μL PBST(0.01％Tween-20)清洗4遍；
5.加入100μL TMB显色液，显色5min；
6.加入50μL终止液终止反应，于酶标仪450nm处读取吸光度值。
如图11所示，实验结果显示，EGFR抗体KY303-58可与人、鼠、猴的EGFR抗原结合，具有种属交叉性质，EGFR-BMK1与小鼠EGFR抗原没有结合活性。EGFR-BMK1来自于Cetuximab。
表8EGFR抗体与鼠、猴源EGFR抗原结合的EC50值
EC50(μg/mL) KY303-58 EGFR-BMK1
mEGFR 0.01692 /
cynoEGFR 0.002586 2.439
实施例15.EGFR抗体在细胞水平的结合特异性
方法：
1.CHO-K1、CHO-K1-EGFR细胞(表达人源EGFR蛋白的CHO-K1细胞)铺至96孔透明V底板中，1E5个细胞/孔，每孔100μL细胞悬液；
2.每孔加入100μL稀释的待测抗体液，4℃孵育1h，1％ FBS的PBS200μL清洗细胞2次；
3.每孔加入100μL 1:100稀释的抗Fc-PE抗体，4℃孵育0.5h；
4. 1％ FBS的PBS100μL清洗细胞2次，100μL重悬细胞，PE荧光通道检测荧光信号，观察中位荧光强度。
如图12所示，实验结果显示，EGFR抗体与CHO-K1细胞不结合，表明EGFR抗体在细胞水平上的结合具有特异性。
实施例16.EGFR抗体在肿瘤细胞中的内吞活性评价
方法：
1.HCT116、NCI-H1975细胞铺至96孔透明V底板中，3E5个细胞/孔，每孔100μL细胞悬液；
2.每孔加入100μL稀释的待测抗体液，4℃孵育1h，培养基200μL清洗细胞2次；
3. 200μL培养基重悬细胞，每孔转移100μL细胞悬液至新的96孔V底板中，置于37℃2h，孔板中的剩余细胞置于4℃2h；
4.离心去除上清，每孔加入100μL 1:100稀释的抗Fc-PE抗体，4℃孵育0.5h；
5.1％ FBS的PBS100μL清洗细胞2次，100μL重悬细胞，PE荧光通道检测荧光信号，观察中位荧光强度，计算内吞率。
如图13所示，实验结果显示，EGFR抗体在HCT116、NCI-H1975细胞中均发生内吞，内吞率与细胞种类有关。
实施例17.EGFR抗体的配体阻断活性评价
方法：
1.包被重组人EGFR抗原，4℃过夜，200μL PBST(0.01％ Tween-20)清洗2遍；
2.3％BSA溶液300μL/孔封闭2h，200μL PBST(0.01％ Tween-20)清洗2遍；
3.加入100μL EGFR抗体与不同梯度稀释的HA标签EGF配体的混合液，室温孵育1h，200μL PBST(0.01％ Tween-20)清洗2遍；
4.加入抗HA-HRP抗体稀释液100μL，37℃孵育0.5h，200μL PBST(0.01％Tween-20)清洗4遍；
5.加入100μL TMB显色液，显色5min；
6.加入50μL终止液终止反应，于酶标仪450nm处读取吸光度值。
如图14所示，实验结果显示，KY303-58没有阻断EGF与EGFR结合的作用。
实施例18.EGFR抗体偶联MMAE
方法：
1.依次加入组氨酸-醋酸缓冲液(pH值为5.5)、EDTA-2Na溶液、TCEP溶液、EGFR抗体，使EGFR抗体终浓度为2～3mg/mL，EDTA-2Na终浓度5mM，TCEP物质的量为EGFR抗体物质的量的8倍，混匀，37℃振荡反应4h；
2.加入9倍于抗体物质的量的MMAE及DMSO溶液，使DMSO总量占总反应体积的10％，4℃振荡反应2h；
3.加入7倍于抗体物质的量的L-半胱氨酸，混匀；
4.将上述反应产物离心，取上清转移至10KDa的超滤管中，离心，加入组氨酸-醋酸缓冲液，离心，重复18次，去除未偶联在抗体上的游离毒素；
5.将超滤管中的液体取出，用组氨酸-醋酸缓冲液润洗超滤管，与之前取出的液体混匀，280nm处检测吸光度，计算抗体浓度。
实施例19.EGFR抗体-MMAE产物的细胞毒性评价
方法：
1.NCI-H1975/HCT116/BxPC-3/MDA-MB-468/NCI-H1993/HT29/MDA-MB-231细胞铺至黑壁透明底96孔板中，100μL细胞悬液/孔；
2.每孔加入10μL梯度稀释的待测ADC，培养6天；
3.每孔加入100μL CellTiter-Glo 2.0Cell Viability Assay，振荡混匀10min，检测荧光强度。
如图15和表9所示，EGFR抗体-MMAE可有效抑制多种肿瘤细胞的生长。
表9EGFR抗体-MMAE偶联产物在不同肿瘤细胞中的IC50值(μg/mL)
Cell Line KY303-58 Cell Line KY303-58
HCT116 5.689 BxPC-3 0.2344
HT29 15.11 NCI-H1993 0.3978
NCI-H1975 0.4907 MDA-MB-231 3.483
MDA-MB-468 0.01033
实施例20.EGFR抗体-MMAE产物有效抑制NCI-H1975异种移植瘤的生长
方法：
1.在15只雌性NCG小鼠右侧前胁肋部皮下接种NCI-H1975细胞；
2.待肿瘤生长至100-150mm3左右时，将小鼠随机分成3组，每组5只；
3.尾静脉注射PBS、EGFR单靶ADC，EGFR单靶ADC的给药剂量为1.5mg/kg、3mg/kg，每周1次，持续2周；
4.每周2次测量肿瘤体积及体重，记录荷瘤鼠体重和肿瘤体积的变化与给药时间的关系。
如图16所示，实验结果显示，1.5mg/kg、3mg/kg给药剂量下，Day14肿瘤生长抑制率分别为89.5％、93.5％。上述结果表明，EGFR单靶ADC可显著抑制NCI-H1975异种移植瘤的生长。同时，低剂量和高剂量组均未表现出对小鼠体重的显著影响。
实施例21.EGFR抗体-MMAE产物有效抑制HCT116异种移植瘤的生长
方法：
1.在15只雌性NCG小鼠右侧前胁肋部皮下接种HCT116细胞；
2.待肿瘤生长至100-150mm3左右时，将小鼠随机分成3组，每组5只；
3.尾静脉注射PBS、EGFR单靶ADC，EGFR单靶ADC的给药剂量为0.5mg/kg、1.5mg/kg、4.5mg/kg，每周1次，持续2周；
4.每周2次测量肿瘤体积及体重，记录荷瘤鼠体重和肿瘤体积的变化与给药时间的关系。
如图17所示，实验结果显示，4.5mg/kg给药剂量下，Day18的肿瘤生长抑制率为60.2％。上述结果表明，EGFR单靶ADC可抑制HCT116异种移植瘤的生长。同时，低剂量、中剂量和高剂量组均未表现出对小鼠体重的显著影响。
实施例22.MET-EGFR双抗的设计
设计8种形式的MET、EGFR组合双抗，分别为BH01-BK58、DH01-DK58、BH01-DK58、BH01-BK0158、BH01-BK5801、BH01-BK01-C58、01-58-IgG1、01-IgG1-58。其中，01-58-IgG1和01-IgG1-58使用野生型IgG1 FC；BH、BK、DH、DK的Fc区进行突变形成hole链或者knob链以形成两条Fc链间的“knob-into-hole”连接。BH01-BK58、DH01-DK58和BH01-DK58为“1+1”的“Y”型近似对称的结构，“DH”“DK”是“BH”“BK”的hinge截短形式；BH01-BK0158、BH01-BK5801为“1+2”的“Y”型结构，BK0158臂、BK5801臂均具有结合MET和EGFR的CDR区，仅前后位置不同；BH01-BK01-C58中，EGFR结合臂位于BH01-BK58的Fc的另一端；01-58-IgG1为“2+2”的“Y”型近似对称的结构，即每个Fab均具有结合MET、EGFR的CDR区；01-IgG1-58具有4个Fab，分别位于Fc的两侧，同侧Fab的CDR区序列相同。MET-EGFR双抗的8种形式如图18所示，各臂的氨基酸序列如表10所示。
表10MET-EGFR双抗氨基酸序列表
实施例23.MET-EGFR双抗瞬转表达
方法：
1.在293T细胞中瞬时转染BH01-BK58质粒(BH01、BK58双质粒共转染)、DH01-DK58(DH01、DK58双质粒共转染)、BH01-DK58(BH01、DK58双质粒共转染)、BH01-BK0158(BH01、BK0158双质粒共转染)、BH01-BK5801(BH01、BK5801双质粒共转染)、BH01-BK01-C58(BH01、BK01C58双质粒共转染)、01-58-IgG1(01-58-IgG1单质粒转染)、01-IgG1-58(01-IgG1-58单质粒转染)；
2.裂解细胞，进行protein A亲和纯化，收集洗脱液并浓缩。
3.
表11 8种MET-EGFR双抗的表达量及纯度
实施例24.MET-EGFR双抗与重组人MET抗原的结合活性
方法：
1.包被重组人MET抗原4℃过夜，200μL PBST(0.01％ Tween-20)清洗2遍；
2. 3％BSA溶液300μL/孔封闭2h，200μL PBST(0.01％ Tween-20)清洗2遍；
3.加入MET-EGFR双抗，室温孵育1h，200μL PBST(0.01％ Tween-20)清洗2遍；
4.加入抗Fc-HRP抗体稀释液100μL，37℃孵育0.5h，200μL PBST(0.01％Tween-20)清洗4遍；
5.加入100μL TMB显色液，显色5min；
6.加入50μL终止液终止反应，于酶标仪450nm处读取吸光度值。
如图19和表12所示，实验结果显示，MET-EGFR双抗可与MET抗原结合。
表12MET-EGFR抗体与重组人MET抗原结合的EC50值
抗体名称 EC50(μg/mL) 抗体名称 EC50(μg/mL)
BH01-BK58 0.005770 BH01-BK5801 0.005053
DH01-DK58 0.003316 BH01-BK01-C58 0.007529
BH01-DK58 0.005423 01-58-IgG1 0.007075
BH01-BK0158 <0.00061 01-IgG1-58 0.009844
实施例25.MET-EGFR双抗与重组人EGFR抗原的结合活性
方法：
1.包被重组人EGFR抗原4℃过夜，200μL PBST(0.01％ Tween-20)清洗2遍；
2. 3％BSA溶液300μL/孔封闭2h，200μL PBST(0.01％ Tween-20)清洗2遍；
3.加入MET-EGFR双抗，室温孵育1h，200μL PBST(0.01％ Tween-20)清洗2遍；
4.加入抗Fc-HRP抗体稀释液100μL，37℃孵育0.5h，200μL PBST(0.01％Tween-20)清洗4遍；
5.加入100μL TMB显色液，显色5min；
6.加入50μL终止液终止反应，于酶标仪450nm处读取吸光度值。
如图20和表13所示，实验结果显示，MET-EGFR双抗可与EGFR抗原结合，其中BH01-BK58、DH01-DK58、BH01-DK58、01-58-IgG1对hEGFR的结合能力较强。
表13MET-EGFR抗体与重组人EGFR抗原结合的EC50值
抗体名称 EC50(μg/mL) 抗体名称 EC50(μg/mL)
BH01-BK58 0.02742 BH01-BK5801 0.03424
DH01-DK58 0.02320 BH01-BK01-C58 0.3065
BH01-DK58 0.02991 01-58-IgG1 0.007556
BH01-BK0158 0.02656 01-IgG1-58 0.02139
实施例26.候选MET-EGFR双抗对MET、EGFR抗原的种属交叉活性方法：
1.分别包被重组人、鼠、猴源MET或EGFR抗原4℃过夜，200μL PBST(0.01％ Tween-20)清洗2遍；
2. 3％BSA溶液300μL/孔封闭2h，200μL PBST(0.01％ Tween-20)清洗2遍；
3.加入MET-EGFR双抗，室温孵育1h，200μL PBST(0.01％ Tween-20)清洗2遍；
4.加入抗Fc-HRP抗体稀释液100μL，37℃孵育0.5h，200μL PBST(0.01％Tween-20)清洗4遍；
5.加入100μL TMB显色液，显色5min；
6.加入50μL终止液终止反应，于酶标仪450nm处读取吸光度值。
如图21、表14-15所示，实验结果显示，MET-EGFR双抗可与鼠、猴的MET抗原结合，具有种属交叉性质。
表14MET-EGFR抗体与重组鼠、猴MET抗原结合的EC50值(μg/mL)
抗体名称 mMET cynoMET
BH01-BK58 0.4434 0.008300
DH01-DK58 0.3839 0.008959
BH01-DK58 0.2269 0.009824
BH01-BK5801 0.05034 0.008582
01-IgG1-58 0.07469 0.01104
表15MET-EGFR抗体与重组鼠、猴EGFR抗原结合的EC50值(μg/mL)
抗体名称 mEGFR cynoEGFR
BH01-BK58 0.08091 0.6687
DH01-DK58 0.09397 0.8715
BH01-DK58 0.06836 0.3915
BH01-BK5801 0.05819 0.4461
01-IgG1-58 0.02834 0.3301
实施例27.候选MET-EGFR双抗的细胞结合特异性
方法：
1.CHO-K1、CHO-K1-EGFR细胞(表达人源EGFR蛋白的CHO-K1细胞)、CHO-K1-MET细胞(表达人源MET蛋白的CHO-K1细胞)铺至96孔透明V底板中，1E5个细胞/孔，每孔100μL细胞悬液；
2.每孔加入100μL稀释的待测抗体液，4℃孵育1h，1％ FBS的PBS200μL清洗细胞2次；
3.每孔加入100μL 1:100稀释的抗Fc-PE抗体，4℃孵育0.5h；
4. 1％ FBS的PBS100μL清洗细胞2次，100μL重悬细胞，PE荧光通道检测荧光信号，观察中位荧光强度。
如图22所示，实验结果显示，MET-EGFR双抗与CHO-K1抗原阴性细胞不结合，与CHO-K1抗原阳性细胞(CHO-K1-EGFR、CHO-K1-MET)结合，表明其在细胞水平上的结合具有特异性。
实施例28.MET-EGFR双抗偶联MMAE
方法：
1.依次加入组氨酸-醋酸缓冲液(pH值为5.5)、EDTA-2Na溶液、TCEP溶液、EGFR抗体，使MET-EGFR抗体终浓度为2～3mg/mL，EDTA-2Na终浓度5mM，TCEP物质的量为MET-EGFR抗体物质的量的8倍，混匀，37℃振荡反应4h；
2.加入9倍于抗体物质的量的MMAE及DMSO溶液，使DMSO总量占总反应体积的10％，4℃振荡反应2h；
3.加入7倍于抗体物质的量的L-半胱氨酸，混匀；
4.将上述反应产物离心，取上清转移至10KDa的超滤管中，离心，加入组氨酸-醋酸缓冲液，离心，重复18次，去除未偶联在抗体上的游离毒素；
5.将超滤管中的液体取出，用组氨酸-醋酸缓冲液润洗超滤管，与之前取出的液体混匀，280nm处检测吸光度，计算抗体浓度。
实施例29.MET-EGFR抗体-MMAE产物比单靶抗体-MMAE更有效抑制HCT116肿瘤细胞的生长
方法：
1.HCT116细胞铺至黑壁透明底96孔板中，100μL细胞悬液/孔；
2.每孔加入10μL梯度稀释的待测ADC，培养6天；
3.每孔加入100μL CellTiter-Glo 2.0Cell Viability Assay，振荡混匀10min，检测荧光强度。
如图23所示，实验结果显示，MET-EGFR抗体-MMAE均可有效抑制HCT116肿瘤细胞的生长。其中，BH01-BK58-MMAE、DH01-DK58-MMAE、BH01-DK58-MMAE的肿瘤杀伤效果较优，低浓度下可有效抑制肿瘤生长。如图24所示，在同等剂量下，本发明双特异性MET-EGFR抗体偶联物对HCT116靶细胞的细胞杀伤性能显著优于MET单靶ADC(KY301-01-MMAE)和EGFR单靶ADC(KY303-58-MMAE)，具有协同效应。
实施例30.MET-EGFR抗体-MMAE产物比单靶抗体-MMAE更有效抑制NCI-H1975肿瘤细胞的生长
方法：
1.NCI-H1975细胞铺至黑壁透明底96孔板中，100μL细胞悬液/孔；
2.每孔加入10μL梯度稀释的待测ADC，培养6天；
3.每孔加入100μL CellTiter-Glo 2.0Cell Viability Assay，振荡混匀10min，检测荧光强度。
如图25所示，实验结果显示，MET-EGFR抗体-MMAE均可有效抑制HCT116肿瘤细胞的生长。其中，BH01-BK58-MMAE、DH01-DK58-MMAE、BH01-DK58-MMAE、BK01-BH0158-MMAE、BK01-BH5801-MMAE的肿瘤杀伤效果较优。如图26所示，在同等剂量下，本发明双特异性MET-EGFR抗体偶联物对HCT116靶细胞的细胞杀伤性能显著优于MET单靶ADC(KY301-01-MMAE)和EGFR单靶ADC(KY303-58-MMAE)，具有协同效应。
实施例31.BH01-BK58、BH01-DK58的结合亲和力及动力学常数
在Biacore 2000仪器上使用实时表面等离子体共振生物传感器测定法测定MET及EGFR结合MET-EGFR抗体的平衡解离常数(KD值)。
方法：
1.抗体捕获：使用1×PBST(含0.05％ Tween 20的1×PBS溶液，pH 7.4)缓冲液作为运行缓冲液，将各抗体用PBS缓冲液稀释至1μg/mL，流速设置为10μL/min，用Protein A芯片持续捕获抗体60s；
2.结合监测：将人重组MET抗原用1×PBST稀释成不同浓度(0nM、31.25nM、62.5nM、125nM、250nM、500nM、1000nM、2000nM)，以30μL/min的流速注射到抗体捕获表面上，检测抗原与抗体的结合120s；
3.解离监测：在1×PBST运行缓冲液中监测MET抗原解离360s；
4.再生：使用Gly-HCl缓冲液(pH 1.5)再生，流速设置为30μL/min，再生30s，1×PBST稳定芯片60s；
5.抗体捕获：使用1×PBST(含0.05％ Tween 20的1×PBS溶液，pH 7.4)缓冲液作为运行缓冲液，将各抗体用PBS缓冲液稀释至1μg/mL，流速设置为10μL/min，用Protein A芯片持续捕获抗体60s；
6.结合监测：将人重组EGFR抗原用1×PBST稀释成不同浓度(0nM、31.25nM、62.5nM、125nM、250nM、500nM、1000nM、2000nM)，以30μL/min的流速注射到抗体捕获表面上，检测抗原与抗体的结合120s；
7.解离监测：在1×PBST运行缓冲液中监测MET抗原解离360s；
8.再生：使用Gly-HCl缓冲液(pH 1.5)再生，流速设置为30μL/min，再生30s。
BH01-BK58、BH01-DK58及对标抗体AZ-RAA22/B09与靶抗原的结合解离动力学曲线如图27所示。亲和力常数总结于表16中。BH01-DK58、BH01-BK58与hMET的KD值相近，为MET抗体KY301-01亲和力的两倍，表明BH01-DK58、BH01-BK58与hMET的亲和力弱于KY301-01。对比与hEGFR的亲和力，从强到弱依次排序为：KY303-58、BH01-BK58、BH01-DK58。BH01-DK58与BH01-BK58的VHH序列相同，两者与hEGFR的亲和力差异源于DK58的“短臂”hinge设计，降低靶向EGFR造成的正常组织细胞毒性。
表16MET-EGFR双抗与重组人MET或EGFR抗原的结合亲和力及动力学常数
抗原 抗体 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
hMET KY301-1 6.63E+04 2.16E-05 3.26E-10
hMET BH01-DK58 1.47E+04 1.15E-05 7.81E-10
hMET BH01-BK58 3.24E+04 2.41E-05 7.44E-10
hEGFR KY303-58 1.60E+04 9.13E-04 5.69E-08
hEGFR BH01-DK58 7.13E+03 9.02E-04 1.26E-07
hEGFR BH01-BK58 1.22E+04 2.58E-03 2.11E-07
如表17、18所示，BH01-DK58对hMET和hEGFR的亲和力相差161倍，远大于对标抗体AZ-RAA22/B09与hMET、hEGFR的亲和力差异(对hMET和hEGFR的亲和力相差24.7倍)。对hMET和hEGFR亲和力的差异设计旨在降低MET-EGFR抗体与EGFR的结合优先级，进一步降低靶向EGFR引起的毒副作用，提高安全性。
表17BH01-DK58与重组人、鼠、猴MET或EGFR的结合亲和力及动力学常数
表18对标MET-EGFR双抗(AZ-RAA22/B09)与重组人、鼠、猴MET或EGFR的结合亲和力及动力学常数
实施例32.BH01-BK58、BH01-DK58双抗偶联MMAE
方法：
1.依次加入组氨酸-醋酸缓冲液(pH值为5.5)、EDTA-2Na溶液、TCEP溶液、EGFR抗体，使MET-EGFR抗体终浓度为2～3mg/mL，EDTA-2Na终浓度5mM，TCEP物质的量为MET-EGFR抗体物质的量的8倍，混匀，37℃振荡反应4h；
2.加入9倍于抗体物质的量的MMAE及DMSO溶液，使DMSO总量占总反应体积的10％，4℃振荡反应2h；
3.加入7倍于抗体物质的量的L-半胱氨酸，混匀；
4.将上述反应产物离心，取上清转移至10KDa的超滤管中，离心，加入组氨酸-醋酸缓冲液，离心，重复18次，去除未偶联在抗体上的游离毒素；
5.将超滤管中的液体取出，用组氨酸-醋酸缓冲液润洗超滤管，与之前取出的液体混匀，280nm处检测吸光度，计算抗体浓度。
实施例33.BH01-BK58、BH01-DK58双抗偶联MMAE产物DAR值及游离毒素检测
方法：
DAR值检测：
取BH01-BK58、BH01-DK58双抗偶联MMAE产物50μg注入高效液相色谱柱中，经不同流动相洗脱，同时记录色谱图(图28)，根据DAR＝Σ(relative peak area×number ofloaded drugs)/100计算DAR值；
游离毒素检测：
取偶联后的样品80μg与3μL DMSO样品混合，与60μL含氯化钠无水甲醇-乙腈混合液混匀，取20μL注入高效液相色谱，进行洗脱并记录色谱图。根据毒素标准品不同浓度下对应的图谱峰面积数值，拟合回归方程，计算出待测物中游离毒素的含量：Free Drug(mol/mol％)＝残留小分子摩尔浓度/抗体摩尔浓度×100.
表19MET-EGFR抗体-MMAE产物的DAR值及游离毒素含量
表20MET-EGFR抗体-MMAE产物的DAR值产物含量
实施例34.BH01-BK58-MMAE、BH01-DK58-MMAE对肿瘤细胞的杀伤能力
方法：
1.BxPC-3/HT29/HS746T/SNU-5细胞铺至黑壁透明底96孔板中，100μL细胞悬液/孔；
2.每孔加入10μL梯度稀释的待测抗体，培养6天；
3.每孔加入100μL CellTiter-Glo 2.0Cell Viability Assay，振荡混匀10min，检测荧光强度。
如图29所示，BH01-BK58-MMAE、BH01-DK58-MMAE均可有效杀伤BxPC-3/HT29/HS746T/SNU-5 4种肿瘤细胞，且杀伤效果相近。
实施例35.BH01-DK58-MMAE和BH01-BK58-MMAE对HCT116异种移植瘤的抗肿瘤药效优于。
实验小鼠：雌性B-NDG小鼠，实验时36只，7周龄；
实验细胞：收集对数生长期的人结肠癌肿瘤细胞HCT116，去除培养基并用PBS洗两次后接种；
接种量：5×106/100μL/只；
接种位置：右侧背部区域位置；
分组给药：待肿瘤平均体积生长至100-150mm3左右，对荷瘤小鼠进行随机分组，并于分组当天给药，定义分组给药当天为Day0。静脉注射给药，每周给药1次，共给药2次。试验过程中，每周2次测量肿瘤体积及体重，记录荷瘤鼠体重和肿瘤体积的变化与给药时间的关系，肿瘤体积(mm3)计算方式为(长×宽2)/2，肿瘤生长抑制率(TGI％)＝(1-药物处理组肿瘤体积变化/对照组肿瘤体积变化)×100％；
给药剂量：0.5mg/kg，1mg/kg，3mg/kg；
如图30、表21所示，BH01-BK58-MMAE、BH01-DK58-MMAE可显著抑制人结肠癌肿瘤细胞HCT116生长，呈剂量依赖性。在3mg/kg给药剂量下，BH01-BK58-MMAE、BH01-DK58-MMAE在Day14的抑瘤率分别为91.34％与95.52％。此外，BH01-DK58-MMAE的起效剂量较低，在0.5mg/kg剂量下即表现出抑瘤效果(TGI％为24.11％)，表明BH01-DK58-MMAE具有较大的治疗窗口。
表21BH01-BK58-MMAE、BH01-DK58-MMAE在Day14对HCT116异种移植瘤的肿瘤抑制率
实施例36.BH01-DK58-MMAE和BH01-BK58-MMAE对NCI-H1975异种移植瘤的抗肿瘤药效。
实验小鼠：雌性B-NDG小鼠，实验时35只，7周龄
实验细胞：收集对数生长期的人肺癌肿瘤细胞NCI-H1975，去除培养基并用PBS洗两次后接种；
接种量：5×106/100μL/只；
接种位置：右侧背部区域位置；
分组给药：当肿瘤平均体积生长至100-150mm3左右，对荷瘤小鼠进行随机分组，并于分组当天给药，定义分组给药当天为Day0。静脉注射给药，每周给药1次，共给药2次。试验过程中，每周2次测量肿瘤体积及体重，记录荷瘤鼠体重和肿瘤体积的变化与给药时间的关系，肿瘤体积(mm3)计算方式为(长×宽2)/2，肿瘤生长抑制率(TGI％)＝(1-药物处理组肿瘤体积变化/对照组肿瘤体积变化)×100％；
给药剂量：0.25mg/kg，0.5mg/kg，1mg/kg。
如图31和表22所示，BH01-BK58-MMAE、BH01-DK58-MMAE能显著抑制人肺癌肿瘤细胞NCI-H1975生长，呈现剂量依赖关系。Day17时BH01-DK58-MMAE与BH01-BK58-MMAE在1mg/kg剂量下均表现出显著的抑瘤效果(TGI％分别为72.98％和61.47％)。此外，BH01-DK58-MMAE的起效剂量较低，在0.25mg/kg剂量即表现出抑瘤效果(TGI％为15.24％)，在0.5mg/kg剂量下，第17天时相较对照组已表现出显著的肿瘤抑制。
表22BH01-BK58-MMAE、BH01-DK58-MMAE在Day20对NCI-H1975异种移植瘤的肿瘤抑制率
实施例37.C57BL/6小鼠模型对BH01-BK58-MMAE、BH01-DK58-MMAE具有良好的耐受性
实验小鼠：C57BL/6小鼠，6周龄，雌性48只，雄性48只。
分组给药：对小鼠按照体重进行随机分组，并于分组当天给药，定义分组给药当天为Day0。静脉注射给药，每2周给药1次，共给药2次。试验过程中，每周3次测量体重，记录小鼠体重的变化与给药时间的关系。
如图32和表23、24所示，试验结果显示，不同剂量组、不同性别动物平均体重均增加，未出现因药物的毒性导致体重明显下降的现象，表明C57BL/6小鼠对BH01-BK58-MMAE与BH01-DK58-MMAE在10mg/kg及以下剂量耐受良好。
表23Day27静脉注射BH01-BK58-MMAE的C57BL/6小鼠体重变化
表24Day28静脉注射BH01-DK58-MMAE的C57BL/6小鼠体重变化
实施例38.高剂量BH01-DK58-MMAE对雌、雄性C57BL/6小鼠的毒性小于同剂量下BH01-BK58-MMAE的毒性
实验小鼠：C57BL/6小鼠，6周龄，雌雄各半(雌性48只，雄性48只)
分组给药：对小鼠按照体重进行随机分组，并于分组当天给药，定义分组给药当天为Day0。静脉注射给药，单次给药。试验过程中，每周3次测量体重，记录小鼠体重的变化与给药时间的关系。
如图33和表25、26所示，静脉注射12-20mg/kg BH01-BK58-MMAE，在Day8时的雌性体重变化范围为2.86％-6.64％，未见显著差异；而雄性体重变化范围为-2.30％-11.86％，其中16mg/kg与20mg/kg体重增加量显著低于12mg/kg和PBS组，表明BH01-BK58-MMAE对雄性小鼠具有一定毒性。静脉注射2-20mg/kg BH01-DK58-MMAE，Day7时雌性体重变化范围1.97％-5.37％；雄性体重变化范围7.84％-9.22％，均未见显著差异，表明小鼠对BH01-DK58-MMAE的耐受性更好。
上述结果提示，控制EGFR结合域的亲和力并对铰链区进行截短以降低EFGR靶向性的策略对安全性是有好处的，显著降低了对正常组织细胞的毒性，使制备的双抗和ADC具有更低的副作用。
表25Day15静脉注射BH01-BK58-MMAE的C57BL/6小鼠体重变化
表26Day14静脉注射BH01-DK58-MMAE的C57BL/6小鼠体重变化
实施例39.BH01-DK58抗体的内化作用强于单靶抗体及对标抗体
方法：
1.Accutase消化、收集靶细胞并用实验缓冲液(相应的完全培养基)重悬靶细胞。
2.用实验缓冲液调整靶细胞密度至1E5个细胞/毫升，并将细胞悬液转移到96孔实验板(Corning，Cat.#：3595)相应孔中(50μL/孔，5000细胞/孔)。
3.将实验板置于细胞培养箱(37℃/5％ CO2)中培养过夜，使靶细胞贴壁。
4.用实验缓冲液配制供试品/对照品工作液(4×)及标记试剂(HumanFabfluor-pH Red Antibody Labeling Reagent，Sartorius，Cat.#：4722)工作液(4×)。
5.将供试品/对照品工作液及标记试剂工作液以1:3摩尔比、1:1体积比进行混合，置于细胞培养箱(37℃/5％ CO2)中孵育15分钟使二者充分偶联。
6.根据实验方案，转移偶联混合物工作液至96孔实验板相应孔中(50μL/孔)。
7.将实验板于S3活细胞分析仪成像系统(37℃/5％ CO2)中孵育培养，使用Incucyte软件设置成像程序(成像通道：Phase和Red；物镜：10×；成像时间间隔：2小时；成像截止：48小时)，数据处理系统Controller在合适的检测波段及指定时间点进行拍照成像。
8.抗体内化实验数据分析(Incucyte法)：实验原始数据和结果经由活细胞分析仪数据处理系统Live-Cell Analysis System分析并导出。分析结果参数表示为：Total Red Object Area(μm2/Image)。所导出的原始数据可经Microsoft Office Excel2016和GraphPad Prism 6软件进行进一步分析。
如图34所示，BH01-DK58的内化作用在HCT116及NCI-H1975细胞中均强于单靶抗体KY301-01、KY303-58和对标抗体Amivantamab及AZ-RAA/B09、AZ-QD6/B09。
实施例40.肿瘤细胞中MET及EGFR的蛋白水平
方法：
1.制备蛋白样品：取出细胞，置于冰上，4℃，300×g离心5min，预冷PBS洗涤2遍并离心去除上清，在细胞沉淀中加入RIPA裂解液，充分震荡混匀裂解。采用BCA法进行蛋白质定量。
2.电泳：采用4-12％的预制胶，按顺序加入5μL蛋白marker和18μL蛋白样品，插上电源插头，调整电压至80-90V，15-30min后，溴酚蓝进入下层胶时将电压调至120-130V，溴酚蓝刚好跑出胶时停止电泳。
3.转膜：取出PVDF膜用剪刀剪出与凝胶大小形状一致的一块，将裁剪好的PVDF膜使用前在甲醇中浸泡15秒进行激活，激活后的PVDF膜完全覆盖住胶块。取下玻璃板，对凝胶进行适当切割，凝胶扣在膜上，膜与胶块之间不能有气泡，然后在膜上再覆盖上浸泡过转膜液的滤纸和海绵，整体放入转膜装置中，再放在转膜槽中，膜侧置于正极，胶侧置于负极，槽中放入冰盒并加满转膜缓冲液，调节电压，根据目的蛋白分子量大小设定适当转膜时间进行转膜。
4.封闭：用0.1％ TBST清洗PVDF膜2-3次，每次5min，加入配置的5％脱脂牛奶，室温摇床上封闭60min；
5.清洗：0.1％ TBST润洗封闭后的PVDF膜3次，每次5min；
6.孵育一抗：4℃下摇床，过夜封闭；
7.清洗：0.1％ TBST润洗封闭后的PVDF膜3次，每次5min；
8.孵育二抗：0.1％ TBST稀释HRP标记的对应种属的二抗，室温下摇床孵育60min；
9.清洗：0.1％ TBST润洗NC膜3次，每次10min；
10.显色：按1：1的比例将ECL发光剂中A液和B液混匀后滴加到PVDF膜上，暗室内曝光、显影、定影及胶片扫描。
如图35所示，NCI-H1975、HCT116、HCC827、ASPC-1、EBC-1、BxPC-3、786-O、A498、HT29 9种细胞中均表达MET及EGFR蛋白。
实施例41.BH01-DK58-MMAE对肿瘤细胞的杀伤效果优于单靶-MMAE方法：
1.将786-O/ASPC-1/A498/BxPC-3/EBC-1/HCC827/NCI-H1975/HCT116/HT29细胞铺至黑壁透明底96孔板中，100μL细胞悬液/孔；
2.每孔加入10μL梯度稀释的待测ADC，培养6天；
3.每孔加入100μL CellTiter-Glo 2.0Cell Viability Assay，振荡混匀10min，检测荧光强度
如图36所示，BH01-DK58-MMAE、对标抗体AZD9592-MMAE、KY301-01-MMAE、KY303-58-MMAE均可有效杀伤中、高、低表达MET及EGFR的肿瘤细胞(786-O/ASPC-1/A498/BxPC-3/EBC-1/HCC827/NCI-H1975/HCT116/HT29)肿瘤细胞，其中BH01-DK58-MMAE的杀伤作用强于单靶ADC(KY301-01-MMAE、KY303-58-MMAE)，与AZD9592-MMAE的杀伤效果相近(IC50值如表27所示)。
表27BH01-DK58-MMAE、AZD9592-MMAE在不同肿瘤细胞中的IC50值
IC50(μg/mL) BH01-DK58-MMAE AZD9592-MMAE
786-O 0.0579 0.0271
A498 30.9200 7.9070
ASPC-1 ～0.03064 0.0065
BXPC-3 0.0082 0.0051
EBC-1 0.0021 ～0.001583
HCC827 0.0050 0.0026
NCI-H1975 0.1119 0.0196
HCT116 0.0992 0.4183
HT29 0.0133 0.0068
实施例42.BH01-DK58-MMAE对正常细胞的毒性弱于对标抗体AZD9592-MMAE
方法：
1.HFL-1/MIHA/MRC-5/BEAS-2B细胞铺至黑壁透明底96孔板中，100μL细胞悬液/孔；
2.每孔加入10μL梯度稀释的待测ADC，培养6天；
3.每孔加入100μL CellTiter-Glo 2.0Cell Viability Assay，振荡混匀10min，检测荧光强度
如图37所示，BH01-DK58-MMAE在高浓度(20μg/mL)下对HFL-1/MRC-5/BEAS-2B正常细胞有毒性，对MIHA几乎无毒性；而对标抗体AZD9592-MMAE在较低剂量0.8μg/mL下即杀伤HFL-1/MRC-5/BEAS-2B正常细胞，在极高剂量100μg/mL对MIHA细胞有杀伤作用。结果表明BH01-DK58-MMAE对正常细胞的毒性明显弱于对标抗体AZD9592-MMAE，提示BH01-DK58-MMAE的安全性优于AZD9592-MMAE。
实施例43.BH01-DK58-MMAE可引起肿瘤细胞发生细胞周期阻滞
方法：
1.消化经BH01-DK58-MMAE处理48h的HCT116细胞，制备细胞悬液；
2.取50μL细胞悬液，加入1mL预冷PBS重悬细胞，重悬、离心，去除上清，保留50μL上清液，轻弹管底使细胞分散；
3.加入1mL预冷的70％乙醇，轻轻混匀，4℃固定30min以上，离心，保留沉淀；
4.加入1mL预冷PBS溶液重悬，离心；
5.加入碘化丙啶染色液0.5mL，缓慢充分重悬细胞，37℃孵育30min，冰浴保存；
6.流式细胞仪检测。
如图38所示，HCT116经BH01-DK58-MMAE处理48h后，G2/M期细胞占比为43.76％，远高于空白对照组18.8％，表明BH01-DK58-MMAE可诱发HCT116细胞发生G2/M期阻滞。
实施例44.KY-0301对EBC-1异种移植瘤的抗肿瘤药效明显
实验小鼠：雌性Balb/C Nude小鼠
实验细胞：收集对数生长期的人肺癌肿瘤细胞EBC-1，去除培养基并用PBS洗两次后接种；
接种量：5×106/100μL/只；
接种位置：右侧背部区域位置；
分组给药：当肿瘤平均体积生长至100-150mm3左右，对荷瘤小鼠进行随机分组，并于分组当天给药，定义分组给药当天为Day0。静脉注射给药，每周给药1次，给药2次。试验过程中，每周2次测量肿瘤体积及体重，记录荷瘤鼠体重和肿瘤体积的变化与给药时间的关系，肿瘤体积(mm3)计算方式为(长×宽2)/2，肿瘤生长抑制率(TGI％)＝(1-药物处理组肿瘤体积变化/对照组肿瘤体积变化)×100％；
给药剂量：1mg/kg，2mg/kg，4mg/kg。
KY-0301即上文所述的BH01-DK58-MMAE，结构示意图见图39。如图40所示，KY-0301能显著抑制人肺癌肿瘤细胞EBC-1生长，呈现剂量依赖关系。Day17时4mg/kg的KY-0301抑瘤率为100％)。
实施例45.KY-0301对HT29异种移植瘤的抗肿瘤药效明显
实验小鼠：雌性Balb/C Nude小鼠
实验细胞：收集对数生长期的人结直肠癌肿瘤细胞HT29，去除培养基并用PBS洗两次后接种；
接种量：5×106/100μL/只；
接种位置：右侧背部区域位置；
分组给药：当肿瘤平均体积生长至100-150mm3左右，对荷瘤小鼠进行随机分组，并于分组当天给药，定义分组给药当天为Day0。静脉注射给药，每周给药1次，给药2次。试验过程中，每周2次测量肿瘤体积及体重，记录荷瘤鼠体重和肿瘤体积的变化与给药时间的关系，肿瘤体积(mm3)计算方式为(长×宽2)/2，肿瘤生长抑制率(TGI％)＝(1-药物处理组肿瘤体积变化/对照组肿瘤体积变化)×100％；
给药剂量：1mg/kg，2mg/kg，4mg/kg。
如图41所示，KY-0301能显著抑制人结直肠癌肿瘤细胞HT29生长，呈现剂量依赖关系。Day22时4mg/kg的KY-0301抑瘤率为98％。
实施例46.KY-0301对NCI-H1975异种移植瘤的高肿瘤负荷模型和复发模型抗肿瘤药效明显
实验小鼠：雌性Balb/C Nude小鼠
实验细胞：收集对数生长期的人肺癌肿瘤细胞NCI-H1975，去除培养基并用PBS洗两次后接种；
接种量：5×106/100μL/只；
接种位置：右侧背部区域位置；
高肿瘤负荷模型组给药：当PBS组肿瘤平均体积生长至3000mm3左右，对荷瘤小鼠进行随机分组，并于D26和D33分别给药2次，给药剂量5mg/kg。试验过程中，每周2次测量肿瘤体积及体重，记录荷瘤鼠体重和肿瘤体积的变化与给药时间的关系，肿瘤体积(mm3)计算方式为(长×宽2)/2，肿瘤生长抑制率(TGI％)＝(1-药物处理组肿瘤体积变化/对照组肿瘤体积变化)×100％；
复发模型组给药：当肿瘤平均体积生长至100-150mm3左右，对荷瘤小鼠进行随机分组，并于分组当天给药，定义分组给药当天为Day0。静脉注射给药，每周给药1次，给药2次，给药剂量1.5mg/kg。至D30，肿瘤恢复生长，至D47,肿瘤体积生长至1600mm3左右。再次于D47、D54给药1.5mg/kg，挑战KY-0301对再次生长的肿瘤的杀伤。试验过程中，每周2次测量肿瘤体积及体重，记录荷瘤鼠体重和肿瘤体积的变化与给药时间的关系，肿瘤体积(mm3)计算方式为(长×宽2)/2，肿瘤生长抑制率(TGI％)＝(1-药物处理组肿瘤体积变化/对照组肿瘤体积变化)×100％；
如图42A所示，KY-0301能显著抑制人肺癌NCI-H1975高肿瘤负荷模型的生长，肿瘤体积由3500mm3左右至完全清除。
如图42B所示，KY-0301能显著抑制人肺癌NCI-H1975复发模型的生长，肿瘤体积由2000mm3左右至完全清除。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (15)

1.一种靶向MET的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的VHH链具有以下互补决定区CDR1、CDR2和CDR3：
SEQ ID NO: 13所示的CDR1，
SEQ ID NO: 14所示的CDR2，和
SEQ ID NO: 15所示的CDR3。
2. 如权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述靶向MET的纳米抗体的VHH链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
3.一种靶向MET的抗体，其特征在于，所述抗体包括一个或多个如权利要求1所述的靶向MET的纳米抗体的VHH链。
4.一种靶向EGFR的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的VHH链具有以下互补决定区CDR1、CDR2和CDR3：
SEQ ID NO: 16所示的CDR1，
SEQ ID NO: 17所示的CDR2，和
SEQ ID NO: 18所示的CDR3。
5. 如权利要求4所述的纳米抗体，其特征在于，所述靶向EGFR的纳米抗体的VHH链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示。
6.一种靶向EGFR的抗体，其特征在于，所述抗体包括一个或多个如权利要求4所述的靶向EGFR的纳米抗体的VHH链。
7. 一种靶向MET和EGFR的双特异性抗体，所述的多特异性抗体包含：
（1）如权利要求1所述的靶向MET的纳米抗体的VHH链、或如权利要求3所述的靶向MET的抗体；和
（2）如权利要求4所述的靶向EGFR的纳米抗体的VHH链、或如权利要求6所述的靶向EGFR的抗体。
8. 如权利要求7所述的双特异性抗体，其特征在于，所述的多特异性抗体包含一条或多条抗原结合链，所述一条或多条抗原结合链各自独立地从N端到C端具有式(I)所示结构：
V1-L1-V2-H1-Fc1-L2-V3 (I)
其中，
V1、V2、V3各自独立地为无、所述靶向MET的纳米抗体的VHH链、或所述靶向EGFR的纳米抗体的VHH链，且V1、V2、V3中至少一个为靶向MET或EGFR的纳米抗体的VHH链；
L1、L2各自独立地为无或连接肽；
H1为无或免疫球蛋白铰链区；
Fc1为免疫球蛋白Fc段；
“-”代表肽键。
9. 一种免疫偶联物，其特征在于，所述的免疫偶联物由以下组成：
(a) 抗体部分，所述抗体部分为如权利要求1所述的靶向MET的纳米抗体、如权利要求3所述的靶向MET的抗体、如权利要求4所述的靶向EGFR的纳米抗体、如权利要求6所述的靶向EGFR的抗体、或如权利要求7所述的多特异性抗体；和
(b) 与所述纳米抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、或其组合；所述药物为MMAE或Dxd。
10.如权利要求9所述的免疫偶联物，其特征在于，所述的偶联部分为MMAE。
11.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包含：
(i) 如权利要求1所述的靶向MET的纳米抗体、如权利要求3所述的靶向MET的抗体、如权利要求4所述的靶向EGFR的纳米抗体、如权利要求6所述的靶向EGFR的抗体、或如权利要求7所述的多特异性抗体、或如权利要求9所述的免疫偶联物；
(ii)药学上可接受的载体。
12.如权利要求1所述的靶向MET的纳米抗体、如权利要求3所述的靶向MET的抗体、如权利要求4所述的靶向EGFR的纳米抗体、如权利要求6所述的靶向EGFR的抗体、或如权利要求7所述的多特异性抗体、或如权利要求9所述的免疫偶联物在用于制备治疗MET和/或EGFR相关癌症的药物中的用途，所述的癌症选自下组：肺癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、肾癌、胃癌。
13.一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码选自下组的多肽：
如权利要求1所述的靶向MET的纳米抗体、如权利要求3所述的靶向MET的抗体、如权利要求4所述的靶向EGFR的纳米抗体、如权利要求6所述的靶向EGFR的抗体、或如权利要求7所述的多特异性抗体。
14.一种载体，所述的载体含有如权利要求13所述的多核苷酸。
15.一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有如权利要求14所述的载体或基因组中整合有如权利要求13所述的多核苷酸。
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