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CN109200291B - 一种靶向于egfr的抗体偶联药物及其制备方法和其用途 - Google Patents

一种靶向于egfr的抗体偶联药物及其制备方法和其用途 Download PDF

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CN109200291B CN201811245835.8A CN201811245835A CN109200291B CN 109200291 B CN109200291 B CN 109200291B CN 201811245835 A CN201811245835 A CN 201811245835A CN 109200291 B CN109200291 B CN 109200291B
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Abstract

本发明公开了一种靶向于EGFR的抗体偶联药物及其制备方法和其用途。所述的靶向于EGFR的抗体偶联药物，命名为LR004‑VC‑MMAE，其由抗体、细胞毒性药物和连接子组成，所述抗体药物偶联物具有式I所示的结构，其中，mAb为LR004单克隆抗体，n＝2～8。该新型抗体偶联药物LR004‑VC‑MMAE既能够靶向EGFR抗原，又有强烈的杀伤肿瘤细胞的活性。且相较于LR004本身，并未影响抗体的亲和力，内吞活性和靶向性，较好的保留其生物学功能。相较于LR004，LR004‑VC‑MMAE抗体偶联药物的抑瘤效果有显著性的提高，且出现肿瘤消失的情况。相较于LR004，LR004‑VC‑MMAE抗体偶联药物总抗体呈现较长的半衰期，较慢的清除速率，血浆中游离的MMAE浓度较低，且半衰期短，清除速度快，有利于降低毒性。

Description

一种靶向于EGFR的抗体偶联药物及其制备方法和其用途
技术领域
本发明属于生物技术药物领域。具体而言，本发明提供了一类可以产生靶向肿瘤杀伤作用的抗体偶联药物、其制备方法及其用途。
技术背景
根据《全球癌症报告》显示，2018年全球预计新增1810万例癌症病例，死亡人数达960万，平均每分钟18人因癌症死亡，全球癌症负担进一步加重。中国是癌症大国，新发病人数呈显著上升趋势。其中，肺癌、乳腺癌、结肠直肠癌等实体瘤是发病率极高的癌症，且通常确诊时，病情已经发展到中晚期。目前主要的治疗手段为手术治疗、放射治疗和药物化疗，该治疗策略不仅疾病预后差，5年生存率低，而且其毒副作用大，给病人带来了极大的痛苦。近年来，随着分子生物学的不断发展，分子靶向治疗成为肿瘤治疗的新方向，给癌症病人带来了福音。
表皮生长因子受体(EGFR,HER-1,ErbB-1)是一种酪氨酸激酶受体，是 EGFR酪氨酸激酶家族四个成员之一，EGFR活化通过起特异性配体例如表皮生长因子(EGF)和转化生长因子-α(TGF-α)的结合触发。当EGFR与配体结合时，其发生二聚化并导致胞内酪氨酸激酶区活化，进一步激活下游信号通路。EGFR及其配体是细胞信号传导系统的一部分，其信号传导网络在肿瘤的形成和发展过程中起重要作用，EGFR在多种上皮来源的肿瘤中都呈过表达，如头颈癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、食管癌等。因此 EGFR是肿瘤治疗中的一个很重要的靶点。EGFR的靶向治疗目前主要有酪氨激酶抑制剂(替尼类)小分子药物和抗EGFR抗体药物。其中，抗体药物的作用机制一般为阻断EGFR配体结合，导致抑制下游作用，如抑制胞内信号传导、抑制细胞周期进程、诱导细胞凋亡以及抑制DNA修复、血管生成、肿瘤细胞运动、侵袭以及转移。但是抗体的治疗具有一定的局限性，通常要与化疗药物合用才能达到疗效。
抗体-药物偶联物(Antibody-drug conjugate,ADC)是提高抗体疗效的策略之一，它是以抗体作为载体，通过连接子连接细胞毒性药物送至靶部位，既提高了细胞毒药物的靶向性，又增加抗体的抗肿瘤活性，从整体上提高了治疗窗，为疾病的“精准医疗”提供了有效的武器。ADC一般由抗体(antibody)、弹头分子(warhead)和连接前两者的连接子(linker)3个构件组成。ADC 对细胞毒素的细胞毒性有着极高的要求，通常IC50＜10-9mol/L，这样才能利用抗体所携带的有限数量的细胞毒素有效杀灭肿瘤细胞。MMAE(monomethylauristatin E)是一种线性多肽类细胞毒分子，它通过作用于微管蛋白抑制肿瘤生长，在多种人癌症细胞系中，IC50为10-9～10-11mol/L，为传统抗癌小分子药物长春碱的200倍，现已被广泛应用于ADC的研发中。2011年，MMAE已被成功用于FDA批准上市的霍奇金淋巴瘤(HL)和间变性大细胞淋巴瘤 (ALCL)的治疗药物布妥昔单抗凡酯(brentuximab vedotin，Adcetris)中，据Ⅱ期临床试验报道，102例患者以1.8mg/kg给药三周，HL病人总缓解率为75％(34％全响应，40％部分响应)，ALCL病人总缓解率为87％(53％全响应)，治疗效果显著。在MMAE类ADC的偶联中Val-Cit二肽的连接子应用最为广泛，其由组织蛋白酶B高效裂解而释放毒素，由于这种酶在血液中几乎没有分布，使得此类ADC在血液中具有很高的稳定性而在肿瘤组织中可选择性地释放毒素。
目前有靶向CD30,CD33,CD22和Her-2等靶点的抗体偶联药物(ADC)被 FDA批准上市，由于EGFR能够在多种肿瘤中高表达，以EGFR为靶点的ADC 可以用于多种实体瘤的治疗，扩展ADC的肿瘤治疗类型，临床及市场前景广阔，可以为众多肿瘤的治疗尤其是实体瘤的治疗带来希望。
LR004抗体是一种靶向于EGFR的抗体，该抗体单独或与一种或多种额外治疗剂组合用于治疗表现EGFR的相关癌症(专利公布号：CN 106470697 A； WO 2016/044234 EN)。LR004抗体的优点主要有以下几点：针对于抗体本身， LR004的唾液酸是N-乙酰神经氨酸(NANA被视更类似人类)，LR004抗体不含可检测量的有效寡糖免疫原半乳糖-α-1,3-半乳糖结构，这两点特征使得其产生较低的免疫反应；在活性方面，LR004抗体在多种肿瘤细胞(A431,CEO, MDA-MB-468)中呈现良好的疗效。
本发明的创新性和先进性在于充分采用LR004抗体的上述优势，利用其良好的靶向性、亲和性以及内吞能力，制得了一种新型抗体偶联药物 LR004-VC-MMAE，其在体内外均显示出较已知ADC更强的抗实体瘤的效果，相比LR004，活性得到了明显的提高。在药代动力学研究中，LR004-VC-MMAE 抗体偶联药物总抗体呈现较长的半衰期，更慢的清除速率，血浆中游离的 MMAE浓度较低，有利于降低毒性。综上所述，靶向于EGFR的抗体偶联药物LR004-VC-MMAE显示出了很好的应用前景。
发明内容
本发明的目的之一是在于提供了一种靶向于EGFR的抗体偶联药物 LR004-VC-MMAE及其制备方法，其对EGFR阳性的肿瘤组织具有高效靶向性、内吞活性以及亲和活性。
本发明的目的之二是提供以上述ADC为活性成分的抗肿瘤药物及其用途。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明的一种靶向于EGFR的抗体偶联药物，命名为LR004-VC-MMAE，所述的药物由抗体、细胞毒性药物和连接子组成，所述抗体药物偶联物具有如下式I所示的结构：
Figure BDA0001840499860000031
其中，mAb为LR004单克隆抗，n＝2～8，优选的n＝4。
在本发明中，所述LR004单可隆抗体为人鼠嵌合抗体，特异性结合于人EGFR的N端部分，所述抗体的分子量约为153kDa。所述单克隆抗体可使用本领域中已知的方法在中国仓鼠卵巢细胞CHO中制得。所述细胞毒药物为 MMAE。所述连接子为Val-Cit(VC)接头，全称MC-VC-PAB～接头。MMAE 首先与VC接头相连接，经纯化制备后，其马来酰亚胺基团再与LR004抗体的链间二硫键发生加成反应制得抗体偶联药物。
进一步的，本发明还提出了一种制备所述的抗体偶联药物的方法，包括以下步骤：
1)将MC-VC-PAB-MMAE(即连接子-细胞毒药物)溶于二甲基亚砜，得到连接子-细胞毒药物储备液；
2)将还原剂溶于缓冲液中，配置还原剂储备液；
3)将LR004抗体与所述步骤2)中的还原剂溶液混合进行还原反应1-2 h，得到抗体还原后的溶液；
4)将所述步骤1)中的连接子-细胞毒药物储备液滴加到抗体还原后的溶液中，进行加成反应1-2h，得到抗体偶联药物。
在所述的方法中，优选的，步骤3)中还原剂优选TCEP，混合时以LR004 抗体的摩尔量为基准，还原剂的摩尔量为抗体摩尔量的2-4倍。
在所述的方法中，优选的，所述步骤4)混合时以LR004抗体的摩尔量为基准，所加连接子-细胞毒药物的摩尔量为抗体摩尔量的4-8倍。
在所述的方法中，优选的，步骤3)和步骤4)中的反应在搅拌转速为 100～300rpm，氮气保护下进行，步骤3)中的反应温度为35～40℃，优选为 37℃。
在所述的方法中，优选的，还包括将得到的抗体偶联药物 LR004-VC-MMAE进一步纯化的步骤，优选AKTA purifier蛋白质纯化系统，收集所需抗体偶联药物组分峰；收集完毕后，使用30kDa超滤管进行超滤离心，浓缩，经无菌滤膜过滤。
再进一步的，本发明还提出了所述的抗体偶联药物在制备用于肿瘤靶向治疗的药物中的用途，其中，所述的肿瘤为EGFR阳性实体肿瘤，包括食管癌，鳞状上皮细胞癌，肺癌，乳腺癌，胰腺癌，头颈癌，结肠癌，前列腺癌，骨肉瘤癌。
更进一步的，本发明还提出了一种用于肿瘤靶向治疗的药物组合物，其含有药学上有效量的本发明所述的抗体偶联药物及药学上允许的佐剂。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
1、本发明通过利用LR004单克隆抗体，采用MMAE为弹头分子，Val-Cit 为连接子，通过还原抗体链间二硫键的化学方法与VC-MMAE偶联，构建了一种靶向于EGFR以实体瘤治疗为主的抗体偶联药物LR004-VC-MMAE。优选TCEP作为还原剂，在对其反应条件进行一定优化之后，制备出平均药物抗体偶联比率(DAR)在4左右的抗体偶联药物，裸抗及偶联率为8的组分均低于5％，单体含量大于95％，且质量稳定可控，重复性好，收率可观，且并未影响抗体的稳定性。
2、该新型抗体偶联药物LR004-VC-MMAE，既能够靶向EGFR抗原，又有强烈的杀伤肿瘤细胞的活性。且相较于LR004本身，并未影响抗体的亲和力，内吞活性和靶向性，较好的保留了其生物学功能。在体外活性评价中，相较于LR004，抑瘤活性得到了明显的提高，IC50均在nM级别。在体内活性评价中，相较于LR004，LR004-VC-MMAE抗体偶联药物的抑瘤效果有显著性的提高，且出现肿瘤消失的情况。在药代动力学研究中，LR004-VC-MMAE 抗体偶联药物总抗体呈现较长的半衰期，较慢的清除速率，血浆中游离的 MMAE浓度较低，且半衰期短，清除速度快，有利于降低毒性。
附图说明
图1为MMAE，VC连接子和VC-MMAE的合成路线图
其中，图1a为MMAE的合成路线
图1b为VC连接子(MC-VC-PAB-PNP)的合成路线
图1c为VC-MMAE(MC-VC-PAB-MMAE)的合成路线
图2为测定不同肿瘤细胞中的EGFR表达水平。
其中，图2a为WesternBlot检测不同肿瘤细胞中EGFR的表达水平。
图2b为流式细胞法检测不同肿瘤细胞中EGFR的表达水平。
图3为LR004和LR004-VC-MMAE的结合活性分析。
其中，图3a为ELISA法测定LR004-VC-MMAE和对照LR004与抗原 EGFR的亲和力曲线。
图3b为流式细胞法测定LR004和LR004-VC-MMAE针对于EGFR阳性表达细胞的亲和力曲线。
图4为免疫共聚焦方法检测LR004和LR004-VC-MMAE在KYSE520细胞中的内吞情况。
图5为LR004-VC-MMAE在荷瘤裸鼠体内的活体成像。
图6为LR004-VC-MMAE及MMAE在不同EGFR表达水平的肿瘤细胞中的IC50值。
图7为LR004-VC-MMAE在A431裸鼠移植瘤模型中的药效研究。
图7a为不同剂量组的LR004-VC-MMAE在A431裸鼠移植瘤模型中的药效研究。
图7b为LR004-VC-MMAE 15mg/kg剂量组在A431(肿瘤体积为400-500 mm3)的裸鼠移植瘤模型中的药效研究。
图8为LR004-VC-MMAE在KYSE520裸鼠移植瘤模型中的药效研究。
图8a不同剂量的LR004-VC-MMAE在KYSE520裸鼠移植瘤模型中的药效研究。
图8b为实验中对照组和给药组体重变化曲线图。
15mg/kg)对裸鼠各脏器的毒性。
图9为裸鼠体内LR004-VC-MMAE各组分的药时曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1VC-MMAE(MC-VC-PAB-MMAE)的合成：
1.1MMAE的合成
合成路线如图1a所示：
步骤a：Boc-Dap-N-去甲基麻黄碱的合成
化合物Boc-Dap-OH(500mg,1.7mmol)与(1S,2R)-(±)-去甲基麻黄碱 (289.3mg,1.9mmol)溶于10mL DMF中，依次加入DEPC(368.9mg,2.2 mmol)和Et3N(228.8mg.2.2mmol)，室温下搅拌反应过夜。反应完毕后，加水停止反应，用乙酸乙酯萃取三次，用饱和NaCl溶液萃取一次后，无水 Na2SO4干燥过夜。柱层析分离纯化，分离条件为石油醚：乙酸乙酯＝5：1，得白色固体485mg。C23H36N2O5.MS(ESI)m/z:321.1H NMR(400MHz, DMSO-d6)δ7.66(d,J＝8.6Hz,1H),7.36–7.25(m,4H),7.22–7.16(m,1H), 5.37(d,J＝4.6Hz,1H),4.46(t,J＝5.1Hz,1H),3.97(dp,J＝8.5,6.6Hz,1H), 3.52(d,J＝9.7Hz,1H),3.40–3.31(m,2H),3.18(s,1H),3.09–2.95(m,1H), 2.15–2.04(m,1H),1.71(s,2H),1.61–1.48(m,2H),1.41(s,10H),1.01(dd,J＝ 8.8,6.6Hz,7H).
步骤b:Dap-N-去甲基麻黄碱的合成。将上述反应产物溶于6mL DCM中，冰浴下加入TFA 1mL,室温下搅拌过夜。反应完毕后，加入DCM萃取三遍，合并有机相，分别用饱和NaHCO3溶液和饱和NaCl溶液萃取一遍，加入无水 Na2SO4干燥过夜。抽滤并旋干DCM，用乙醚洗涤两次，得到产物，无需进一步纯化。
步骤c：Fmoc-L-Val-Dil-OBut的合成。反应物Dil-OBut.HCl(500mg,1.7 mmol)和Fmoc-L-Val-OH(780mg,2.3mmol)溶于10mL 2-Me-THF中，依次加入CDMT(403.5mg,2.3mmol)和NMM(256.6mg,2.55mmol),室温下搅拌反应过夜。待反应完毕后，加入乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，用饱和NaCl 洗涤一次，加入无水Na2SO4干燥过夜。柱层析分离，分离条件为石油醚：乙酸乙酯＝6：1，得到反应产物486mg。C34H48N2O6.MS(ESI)m/z:581.1H NMR (400MHz,DMSO-d6)δ7.89(d,J＝7.5Hz,2H),7.77–7.69(m,2H),7.62(d,J＝ 8.8Hz,1H),7.42(t,J＝7.4Hz,2H),7.31(tdd,J＝7.5,3.2,1.2Hz,2H),4.33–4.13(m,4H),3.77(s,1H),3.25(s,3H),2.93(s,3H),2.57(d,J＝2.7Hz,1H), 2.17(dd,J＝15.6,9.3Hz,1H),2.11–1.95(m,1H),1.77(s,1H),1.40(s,9H), 1.32–1.24(m,3H),0.93–0.86(m,9H),0.70(t,J＝7.3Hz,3H).
步骤d:L-Val-Dil-OBut的合成。将上步反应产物溶于15mL无水THF中，加入200μL的Et2NH，室温搅拌过夜。反应完毕后旋干反应液，用乙醚洗涤 3次后，得到357mg产物，无需进一步纯化。
步骤e:Fmoc-(N-Me)-L-Val-L-Val-Dil-OBut的合成。将上步反应产物溶于 10mLEtOAc中，加入Fmoc-(N-Me)-L-Val-OH(455mg，1.2mmol)，依次加入DEPC(214mg,1.3mmol)和1.6mL DIEA后，室温搅拌反应过夜。反应完毕后，加水停止反应。加入乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，用饱和NaCl溶液萃取一次，加入无水Na2SO4干燥过夜。柱层析分离，分离条件为石油醚：乙酸乙酯＝4：1，得白色固体536mg。C40H59N3O7.MS(ESI)m/z:694.1H NMR (400MHz,DMSO-d6)δ＝7.90(d,J＝7.5,2H),7.70–7.60(m,2H),7.46–7.38 (m,2H),7.32(td,J＝7.5,1.2,2H),4.61(s,1H),4.39(td,J＝13.1,11.8,5.9,2H), 4.30(q,J＝7.3,6.5,1H),4.23(t,J＝6.6,1H),3.76(s,1H),3.39(q,J＝7.0,1H),3.24 (d,J＝7.9,3H),2.96(d,J＝9.4,3H),2.80(d,J＝8.9,3H),2.64–2.53(m,1H),2.16 (dd,J＝15.6,9.6,1H),2.10–1.92(m,2H),1.83–1.61(m,1H),1.41(s,9H),1.33 –1.21(m,2H),1.10(t,J＝7.0,1H),0.90–0.71(m,18H).
步骤f:Fmoc-(N-Me)-L-Val-L-Val-Dil-OH.将上部反应产物溶于10mL的 DCM中，加入1.5mL的TFA，室温搅拌反应过夜。反应完毕后，加入DCM 萃取三遍，合并有机相，分别用饱和NaHCO3溶液和饱和NaCl溶液萃取一遍，加入无水Na2SO4干燥过夜。抽滤并旋干DCM，用乙醚洗涤两次，得到产物 523mg。C36H51N3O7.MS(ESI)m/z:638.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝12.25(s,1H),7.90(d,J＝7.5,3H),7.63(d,J＝7.4,2H),7.42(t,J＝7.4,2H),7.33(q, J＝7.4,2H),4.62(s,1H),4.37(ddt,J＝36.6,21.5,8.2,5H),3.34(s,1H),3.26(d, J＝7.9,1H),2.96(d,J＝9.2,3H),2.80(d,J＝9.5,3H),2.56(dd,J＝16.2,8.1,1H), 2.20(dt,J＝15.8,7.9,1H),2.11–1.91(m,2H),1.77(s,1H),1.30(s,1H),1.01– 0.67(m,21H).
步骤g：Fmoc-MMAE的合成。将反应步骤b产物(300mg,0.93mmol) 和反应步骤f产物(464mg,0.73mmol)溶于15mL的DCM中，依次加入 HATU(461mg,1.2mmol)和DIEA 600μL，室温下搅拌反应过夜。反应完毕后，加入DCM萃取三遍，合并有机相，分别用2％的柠檬酸溶液和饱和NaCl 溶液各萃取一遍，加入无水Na2SO4干燥过夜。抽滤并旋干DCM，加入乙醚洗涤3次，无需进一步纯化，得微黄色固体495mg。
步骤h：将步骤g的反应产物溶于10mL DCM中，加入300μL Et2NH，室温下搅拌反应过夜。反应结束后旋干反应溶剂，使用制备液相进行分离纯化。色谱条件如下：A相H2O+0.08％TFA，B相乙腈+0.08％TFA。0-35min B 相45％等梯度洗脱，收集纯品，冻干反应产物。MMAE.C39H67N5O7.1H NMR (500MHz,DMSO-d6)δ(ppm):7.45–7.21(m,5H),4.67(m,2H),4.34–4.06(m, 2H),3.89(dd,J＝9.1,2.0Hz,1H),3.76–3.66(m,1H),3.61–3.53(m,1H),3.49 –3.39(m,1H),3.36(m,J＝13.8,4.9Hz,5H),3.25–3.12(m,2H),2.88–2.82 (m,1H),2.59–2.44(m,2H),2.37–2.29(m,3H),2.24(m,J＝9.0,6.9Hz,1H), 2.20–2.02(m,2H),2.01–1.77(m,4H),1.76–1.54(m,2H),1.50–1.25(m,2H), 1.24–1.08(m,6H),1.07–0.81(m,19H).
1.2VC连接子(MC-VC-PAB-PNP)的合成
合成路线如图1b所示：
步骤a:Fmoc-Val-OSu的合成。将反应产物Fmoc-L-Val-OH(10g,29.3 mmol)和HoSu(3.7g,32.3mmol)溶于100mL THF中，冰浴下加入DCC(6.6 g,32.3mmol)，加入完毕后，撤去冰浴，室温下搅拌反应过夜。反应完毕后，将反应液移至冰浴，待固体完全析出后抽滤，将滤液旋干，旋至泡沫状即可。反应产物较纯，无需进一步纯化。
步骤b：将上步反应产物(16g,36.6mmol)溶于90mL DME中，L-Cit(6.7 g,38.5mmol)溶于NaHCO3(3.2g,38.5mmol)的90mL水中成盐，再加入到反应体系中，50mL THF助溶，反应室温搅拌过夜至澄清。反应完毕后，冰浴下加入与THF等体积的15％的柠檬酸水溶液，待反应产物白色固体完全析出，布氏漏斗抽滤至滤液澄清，滤饼抽干，真空干燥箱干燥。干燥完毕后,将白色固体研磨，用乙醚洗涤，抽滤，得白色固体。C26H32N4O6.1H NMR(400MHz, DMSO-d6)δ12.48(s,1H),8.17(d,J＝7.4Hz,1H),7.90(d,J＝7.5Hz,2H),7.76(t,J＝7.1Hz,2H),7.41(q,J＝7.7Hz,3H),7.33(td,J＝7.5,2.3Hz,2H),6.00(s, 1H),5.63(s,2H),4.30–4.21(m,3H),4.16(td,J＝8.1,5.1Hz,1H),3.93(dd,J＝ 9.2,7.0Hz,1H),2.98–2.89(m,2H),1.99(h,J＝6.8Hz,1H),1.77–1.66(m, 1H),1.57(dtd,J＝13.9,9.2,5.7Hz,1H),1.41(dq,J＝10.5,6.1,5.0Hz,2H), 0.88(dd,J＝13.0,6.7Hz,6H).
步骤c：将反应步骤b的反应产物(7.6g,15.3mmol)和PABOH(3.76g, 30.6mmol)溶于140mL CH2Cl2和70mL的CH3OH混合溶剂中，避光加入 EEDQ(7.5g,30.6mmol)。室温下搅拌反应,反应完毕后旋干反应液，乙醚洗涤，抽滤。C33H39N5O6.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝9.99(s,1H),8.11(d, J＝7.5,1H),7.90(d,J＝7.6,2H),7.75(t,J＝8.0,2H),7.55(d,J＝8.2,2H),7.43(q, J＝8.0,7.5,3H),7.33(t,J＝7.4,2H),7.24(d,J＝8.1,2H),5.99(t,J＝6.0,1H),5.41 (s,2H),5.10(t,J＝5.8,1H),4.43(d,J＝5.5,3H),4.31(s,1H),4.25(d,J＝6.3,2H), 3.94(t,J＝7.9,1H),3.03–2.88(m,2H),2.00(d,J＝9.0,1H),1.76–1.65(m,1H),1.60(d,J＝9.8,1H),1.48–1.36(m,2H),0.92–0.85(m,6H).
步骤d:上步反应产物(8.4g,19mmol)溶于150mL DMF中，加入Et2NH 25mL,室温下搅拌反应过夜。反应完毕后，旋干溶剂，乙醚洗三遍后，得微黄色固体2.3g。C28H40N6O7.1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.91(s,1H),8.07 (d,J＝7.6Hz,1H),7.82(d,J＝8.6Hz,1H),7.55(d,J＝8.1Hz,2H),7.23(d,J＝ 8.1Hz,2H),7.01(s,2H),5.99(t,J＝5.9Hz,1H),5.42(s,2H),5.10(t,J＝5.7Hz, 1H),4.43(d,J＝4.9Hz,2H),4.20(t,J＝7.7Hz,1H),3.00(dq,J＝26.1,6.7Hz, 2H),2.17(dq,J＝14.6,7.0Hz,2H),1.97(q,J＝6.7Hz,1H),1.71(q,J＝7.7Hz, 1H),1.64–1.57(m,1H),1.54–1.43(m,6H),1.20(q,J＝7.8Hz,2H),1.10(t,J ＝7.0Hz,1H),0.84(dd,J＝12.7,6.7Hz,6H).
步骤e：反应步骤d产物(0.5g,1.3mmol)溶于18mL DMF中，加入 MC-OSu(0.45g,1.4mmol)，室温搅拌反应过夜。反应完毕后，旋干反应溶剂，乙醚洗三遍后，抽滤得黄色固体0.69g，无需进一步纯化。
步骤f:将反应步骤e的反应产物溶于12mL DMF中，溶解后加入(PNP)2CO(1.1g,3.6mmol)和DIEA 0.5mL,室温搅拌下过夜。反应完毕后，旋干溶剂，硅胶柱分离纯化，分离条件为二氯甲烷：甲醇＝20：1。得产物为微黄色固体0.42g。C35H43N7O11.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm):10.09(s, 1H),8.32(d,J＝9.1Hz,2H),8.14(d,J＝7.1Hz,1H),7.83(d,J＝8.6Hz,1H), 7.66(d,J＝8.4Hz,2H),7.57(d,J＝9.1Hz,2H),7.41(d,J＝8.6Hz,2H),7.01(s, 2H),6.00(t,1H),5.44(s,2H),5.24(s,2H),4.39(m,J＝12.6Hz,7.1,1H),4.20(t, J＝7.2Hz,1H),3.37(m,J＝7.1Hz,2H),2.99(m,2H),2.22–2.09(m,2H),1.96 (m,J＝13.5Hz,6.7,1H),1.72(m,1H),1.65–1.56(m,1H),1.52–1.43(m,6H), 1.22–1.15(m,2H),0.87–0.82(m,6H).
1.3VC-MMAE(MC-VC-PAB-MMAE)的合成
合成路线如图1c所示：
MC-VC-PAB-PNP(93mg,0.125mmol)和MMAE(60mg,0.083mmol)溶于4mL DMF中，依次加入HoBt(10mg,0.074mmol)和0.5mL吡啶，室温下搅拌反应过夜。反应产物使用制备液相进行分离纯化。色谱条件如下：A相 H2O+0.08％TFA，B相乙腈+0.08％TFA。0-35min B相65％等梯度洗脱，收集纯品，冻干反应产物。C68H105N11O15.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ＝10.05(s,1H),7.88(d,J＝7.6,2H),7.73(dd,J＝10.7,7.8,2H),7.56(q,J＝13.9,10.7,2H), 7.41(dd,J＝7.6,4.1,2H),7.37–7.21(m,7H),7.16(m,2H),5.16–4.95(m,4H), 4.77-4.69(m,1H),4.69-4.59(m,1H),4.55-4.49(m,2H),4.46–4.38(m,2H), 4.37-4.17(m,5H),4.09-3.94(m,3H),3.93-3.89(m,1H),3.80-3.75(m,1H), 3.34-3.29(m,1H),3.28-3.21(m,4H),3.19(d,J＝13.3,3H),3.11(s,2H),3.03(dq, J＝13.5,6.6,2H),2.98-2.95(m,1H),2.96–2.91(m,1H),2.86(dd,J＝17.7,3.2, 3H),2.40(d,J＝15.9,2H),2.32-2.24(m,2H),2.16-2.04(m,3H),2.04-1.91(m, 3H),1.86-1.65(m,5H),1.63–1.43(m,5H),1.41-1.27(m,3H),1.09–0.94(m, 6H),0.94–0.69(m,21H).
实施例2抗体药物偶联物LR004-VC-MMAE的制备
包括以下步骤：
1)将实施例1制备得到的MC-VC-PAB-MMAE(即连接子-细胞毒药物) 溶于二甲基亚砜，得到连接子-细胞毒药物储备液。
2)将TCEP还原剂溶于缓冲液PBS(含1mM DTPA)中，配置一定摩尔量的还原剂储备液。
3)还原前更换LR004抗体的缓冲液，缓冲液体系为PBS(含1mM DTPA)。更换方法为脱盐柱更换。所述更换方法如下：脱盐柱上样2.5mL,用置换缓冲液洗脱3.5mL，超滤浓缩浓度，超滤转速4000rpm，4℃离心10min。配置得到5mg/mL LR004抗体溶液。
4)将步骤3)中的5mg/mL LR004抗体溶液与所述步骤2)中的还原剂 TCEP溶液混合，37℃，搅拌转速为200rpm条件下进行还原反应1～2h，反应时氮气保护，得到抗体还原后的溶液。所加TCEP还原剂的摩尔量为LR004 抗体摩尔量的3倍；
5)将所述步骤1)中的连接子-细胞毒药物溶液滴加到抗体还原后的溶液中，搅拌转速为200rpm条件下进行加成反应1～2h，反应时氮气保护，得到抗体偶联药物。混合时以LR004抗体的摩尔量为基准，所加连接子-细胞毒药物溶液为LR004抗体摩尔量的6倍。
6)反应结束后，得到的抗体偶联药物LR004-VC-MMAE需要进一步纯化，采用AKTApurifier蛋白质纯化系统，收集所需抗体偶联药物组分峰。收集完毕后，使用30kDa超滤管进行超滤离心，浓缩缓冲液浓度，离心温度优选4℃，转速优选4000rpm，离心时间优选12min。纯化后，经无菌滤膜过滤并储存于-80℃，活性评价前经鲎试剂检测内毒素是否达标。
制备得到的LR004-VC-MMAE抗体药物偶联物具有如下式I所示的结构：
Figure BDA0001840499860000121
其中，mAb为LR004单克隆抗体；n＝4。
实施例3不同肿瘤细胞中EGFR的表达检测
3.1WesternBlot检测不同肿瘤细胞的EGFR表达水平
收集对数期的食管癌细胞(KYSE450),乳腺癌细胞(MDA-MB-468)，头颈癌细胞(SCC-25)，结肠癌细胞(HCT-116)，胰腺癌细胞(AsPC-1)，骨肉瘤细胞(143B)和前列腺癌细胞(PC-3)。细胞消化收集细胞并计数，收集1×107的上述细胞，离心弃上清备用。预冷RIPA蛋白抽提试剂，加入蛋白酶抑制剂(磷酸化蛋白需要同时加入磷酸酶抑制剂)。在蛋白抽提开始前加入0.1M PMSF母液，PMSF终浓度1mM。细胞计数，以细胞数量1×107加入1ml裂解液，4℃离心分装，保存，BCA法测定蛋白浓度。根据蛋白浓度进行WesternBlot实验，上样量为20μg/孔，转膜时间1h。转膜完成后使用丽春红染色试剂对膜进行染色。染色之后用3％BSA-TBST进行封闭，用 3％BSA-TBST稀释一抗，4℃过夜，TBST洗膜5次。用5％脱脂奶粉-TBST 稀释二抗，山羊抗小鼠IgG(H+L)HRP，室温轻摇40min。TBST洗膜6次。 ECL加到膜上后胶片曝光：10s-5min(曝光时间随不同光强度而调整)，显影2min，定影，结果如图2a所示。
3.2流式细胞法检测不同细胞的表达水平
选取LR004-VC-MMAE，浓度为10μg/mL，分别与5×105的食管癌细胞 (KYSE520,KYSE150)，鳞状上皮细胞癌A431，非小细胞肺癌细胞(HCC827, NCI-H1975,A549)，乳腺癌细胞(MDA-MB-468,MCF-7)，胰腺癌细胞 (AsPC-1)和间变性大细胞淋巴瘤细胞Karpas299在4℃下共同孵育1h，2％ FBS/PBS洗涤2次，加入FITC标记的羊抗人IgG(中杉金桥，1:200稀释)4℃孵育1h，PBS洗涤两次后用500μL PBS重悬细胞液，用流式细胞仪检测不同细胞的荧光强度，结果如图2b所示。
实施例4LR004-VC-MMAE的亲和力测定
4.1ELISA法检测LR004-VC-MMAE与抗原EGFR的结合活性
将抗原EGFR(购于ACRO Biosystems)用PBS稀释至2μg/mL,铺于96 孔板，每孔100μl，4℃过夜孵育后PBST洗涤3次，用2％BSA封闭过夜，吸除封闭液，用PBST洗3次，将蛋白LR004-VC-MMAE以及对照LR004稀释成一系列不同浓度，加入已经包被好EGFR抗原的96孔板，每孔50μL， 37℃孵育1h，PBST洗3次，每次5min。随后加入碱性磷酸酶标记的山羊抗人(Fab特异性)二抗(1:1000稀释)，37℃孵育1h，PBST洗涤三次，每次5min。加入TMB底物显色约10min，于405nm波长测吸光度值，作图表示两者与EGFR的结合曲线。结果表明，LR004-VC-MMAE与抗原EGFR结合呈浓度依赖，并且偶联MMAE后对抗体本身的亲和活性影响不大(图3a)。
4.2Biocare法测定LR004-VC-MMAE的亲和力常数
分别将1μg/mL的LR004-VC-MMAE绑定于CM5芯片上，将不同浓度的EGFR抗原(ACROBiosystems)注射至系统中，并流过芯片与偶联物相结合。芯片表面采用3M的MgCl2进行解离。由Biacore T200系统计算亲和力常数值。亲和力数值如下：
表1LR004-VC-MMAE亲和力常数
Figure BDA0001840499860000141
4.3流式细胞法检测LR004-VC-MMAE结合活性
选取LR004-VC-MMAE和LR004不同的浓度，分别与5×105细胞4℃共同孵育1h，2％FBS/PBS洗涤2次，加入FITC标记的羊抗人IgG(中杉金桥， 1:200稀释)4℃孵育1h，PBS洗涤两次后用500μL的PBS重悬细胞液，用流式细胞仪检测其荧光强度。结果表明，在不同EGFR阳性肿瘤细胞中， LR004-VC-MMAE与LR004的结合活性相当(如图3b)。
实施例5激光共聚焦显微镜观察LR004-VC-MMAE在细胞中的内吞活性
将处于对数生长期的KYSE520细胞制成单细胞悬液，细胞计数并调整其浓度，按每孔1×104个细胞接种于96孔板中，待37℃培养2h后加入 LR004-VC-MMAE，终其浓度为5μg/mL。对于偶联物与细胞表面抗原结合情况的观察，加入偶联物后4℃孵育30min，收集细胞样品，PBS洗2次，用细胞甩片机将细胞离心至载玻片上，4％多聚甲醛固定10min，PBST洗3次，0.2％TritonX-100/PBS透化10min，PBST洗3次，用5％的羊血清封闭过夜。 37℃孵育AlexaFluor488标记的抗人荧光二抗30min，PBST洗3次， Hoechst3342染核15min，PBST洗3次，滴加抗荧光淬灭剂，盖上盖玻片于共聚焦显微镜观察。观察细胞对偶联物的内吞情况时，加入蛋白后需37℃孵育24h。用LAMP-1抗体(购自Cell Signaling Thechnology)和Alexa Fluro555 标记的驴抗兔二抗(购自碧云天)标记溶酶体。其余操作与上述过程相同。
结果表明，LR004-VC-MMAE在4℃孵育时，可与细胞膜上EGFR受体结合，但并未进入细胞内部。而37℃孵育时，LR004-VC-MMAE通过内吞进入细胞内部，可在溶酶体中共定位(如图4所示)。
实施例6LR004-VC-MMAE在裸鼠体内的靶向肿瘤能力
用DyLight680抗体标记试剂盒(购自Thermo Scientific)分别标记 LR004-VC-MMAE，阳性对照LR004和阴性对照rituximab-VC-MMAE，具体方法参阅操作说明书。将KYSE520细胞接种于BALB/c裸鼠腋下，当瘤体积至200-300mm3时，将标记的上述三者以20mg/kg的给药剂量尾静脉注射荷瘤鼠(n＝2)。利用XENGOEN(美国Caliper公司)的小动物活体成像仪进行观察。分别于不同时间点，采用医用麻醉剂异氟烷进行处理，置于37℃预热的观测板上(同时麻醉)，利用冷却到-90℃的CCD镜头监测药物荧光在荷瘤裸鼠体内的分布及靶向肿瘤的情况。结果发现，LR004-VC-MMAE能较好地靶向裸鼠移植瘤部位，48h时可见较强的肿瘤富集程度，荧光强度可以维持6天(图5)。
实施例7LR004-VC-MMAE针对于不同EGFR表达的肿瘤细胞的细胞杀伤活性
结合实施例3中获得的肿瘤细胞EGFR表达量结果，对这些细胞进行抗体偶联药物LR004-VC-MMAE的体外细胞杀伤活性评价。具体为食管癌细胞 (KYSE520,KYSE150)，鳞状上皮细胞癌A431，非小细胞肺癌细胞(HCC827, NCI-H1975,A549)，乳腺癌细胞(MDA-MB-468,MCF-7)，胰腺癌细胞(AsPC-1)和间变性大细胞淋巴瘤细胞Karpas299。具体步骤如下：
取对数生长期的细胞离心重悬计数，并以1×104-3×104/孔接种于96孔板中，于37℃培养2h。然后，加入不同浓度的LR004-VC-MMAE(MMAE作为阳性对照)，每个药物浓度设置3个平行孔。于37℃孵育48h，每孔加入20μL CCK8试剂继续培养1-2h。观察颜色反应，并用酶标仪测定450nm处的吸光值。实验过程中分别设置空白组(不含细胞)及阴性对照组(无药物处理)，按下列公式计算细胞的存活率：细胞存活率＝(加药组A450值-空白组A450 值)/(对照组A450值-空白组A450值)×100％。IC50值计算使用SPSS软件。根据结果(图6)所示，LR004-VC-MMAE与MMAE具有接近的IC50值，且在 EGFR阴性细胞系Karpas299不显示出抗肿瘤活性，因此该发明获得的 LR004-VC-MMAE不仅能够有效地发挥LR004抗体部分的生物学功能，还兼有MMAE对肿瘤细胞的高效杀伤活性，另外显示出了良好的靶向性和选择性。
实施例8LR004-VC-MMAE对A431移植瘤模型的抗肿瘤药效研究
8.1LR004-VC-MMAE对A431移植瘤模型(起始肿瘤体积约100mm3) 的抗肿瘤药效研究
取体重为18-22g的雌性BALB/c裸鼠，将EGFR阳性细胞A431接种于裸鼠右侧腋窝皮下，每只接种5×106个细胞。待瘤块长至约100mm3时，按照体重和瘤体积进行随机分组，每组6只，设空白对照组。按照下述给药方案处理：LR004-VC-MMAE(1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg和15mg/kg)、MMAE (0.3mg/kg)、LR004(15mg/kg)。给药方式为尾静脉给药，每只200μL，对照组不作处理，每4天给药一次，共给药6次。实验期间，每隔3～4天对裸鼠体重和肿瘤的体积进行测量。根据公式V＝a*b*b/2计算肿瘤体积(a:肿瘤长径，b:肿瘤短径)，绘制肿瘤生长曲线(图7a)。
抑瘤率＝(对照组平均瘤体积-实验组平均瘤体积)/对照组平均瘤体积×100％
结果显示，在实验60天结束后，LR004-VC-MMAE(5mg/kg、10mg/kg 和15mg/kg)组肿瘤抑制率分别为97.7％，98.2％和98.9％。与LR004(肿瘤抑制率为 82.6%) 相比，具有统计学上的显著性差异。
8.2LR004-VC-MMAE对A431移植瘤模型(起始肿瘤体积约400-500 mm3)的抗肿瘤药效研究
取体重为18-22g的雌性BALB/c裸鼠，将EGFR阳性细胞A431接种于裸鼠右侧腋窝皮下，每只接种5×106个细胞。待瘤块长至约400-500mm3时，按照体重和瘤体积进行随机分组，每组6只，设空白对照组和 LR004-VC-MMAE 15mg/kg剂量组。其余操作与上述8.1过程相同。结果显示，在实验40天结束后，对照组肿瘤体积达到约2500mm3，而 LR004-VC-MMAE 15mg/kg剂量组平均肿瘤体积约为370mm3，肿瘤抑制率为87.2％。说明LR004-VC-MMAE ADC对大肿瘤也有很好的响应，并且能压制肿瘤不再生长甚至减小肿瘤体积，肿瘤抑制曲线如图7b。
实施例9LR004-VC-MMAE对KYSE520移植瘤模型的抗肿瘤药效研究
取体重为18-22g的雌性BALB/c裸鼠，将EGFR阳性细胞A431接种于裸鼠右侧腋窝皮下，每只接种5×106个细胞。待瘤块长至约100mm3时，按照体重和瘤体积进行随机分组，每组8只，设空白对照组。按照下述给药方案处理： LR004-VC-MMAE(5mg/kg、10mg/kg和15mg/kg)、LR004(15mg/kg)和 Rituximab-VC-MMAE(15mg/kg)。给药方式为尾静脉给药，每只200μL，对照组不作处理，每4天给药一次，共给药4次。实验期间，每隔3～4天对裸鼠体重和肿瘤的体积进行测量。根据公式V＝a*b*b/2计算肿瘤体积(a:肿瘤长径，b:肿瘤短径)，绘制肿瘤生长曲线。对照组、LR004(15mg/kg)和Rituximab-VC-MMAE(15mg/kg) 于44天给与裸鼠安乐死，LR004-VC-MMAE(5mg/kg、10mg/kg和15mg/kg)继续观察至60天实验结束。结果显示，阴性对照组rituximab-VC-MMAE(15mg/kg)无抗肿瘤活性。LR004(15mg/kg)在该肿瘤中并未呈现明显抗肿瘤活性，肿瘤抑制率仅为13.8％。LR004-VC-MMAE(5mg/kg、10mg/kg和15mg/kg)组出现肿瘤消失情况，其中，LR004-VC-MMAE(5mg/kg)组6只裸鼠肿瘤消失，LR004-VC-MMAE(10mg/kg)组7只裸鼠肿瘤消失，LR004-VC-MMAE(15mg/kg)组全部裸鼠肿瘤消失(图8)。
实施例10LR004-VC-MMAE在裸鼠体内药代动力学情况
10.1ELISA法检测裸鼠体内中总抗体的浓度
将40只BALB/c裸鼠(体重20-22g)接受尾静脉注射LR004-VC-MMAE 15mg/kg，在时间点0、0.5、1、2、8、24、48、72、120、216小时，处死，取全血。每个时间点设置4只小鼠。收集裸鼠全血，离心-80℃保存。配制 LR004-VC-MMAE标准品：制备含有0.5mL标准稀释剂的6个稀释标准点： 20ng/mL，10ng/mL，5ng/mL，2.5ng/mL，1.25ng/mL，0.625ng/mL。ELISA 具体检测方法同应用实施例4.1所述.
10.2LC-MS/MS方法检测裸鼠体内游离型MMAE和结合型MMAE的浓度
游离型MMAE检测：将上述血清样品20μL加入60μL含有200ng/mL Tolbutamide的乙腈溶液，涡旋离心。将10μL注入LC-MS/MS系统。
总MMAE检测：将1μL组织蛋白酶B加入12μL上述血清样本中，在37℃下孵育3小时。加入38μL含有200ng/mL Tolbutamide的乙腈溶液终止反应，涡旋离心。将10μL注入LC-MS/MS系统。
LC-MS/MS系统：Waters HSS T3 1.8μm 2.1×50mm；A相为0.1％的甲酸 +H2O；B相为0.1％的甲酸+乙腈。B:10％-90％,0-2min；流速为0.5mL/min；柱温为50℃。MMAE检测分子量718.7/152.2。
结合型MMAE浓度计算公式＝(总MMAE浓度-游离MMAE浓度)/组织蛋白酶B水解速率×100％，其中药时曲线如图9所示，药代动力学参数如表2-4所示。
结果表明，LR004-VC-MMAE的总抗体(偶联的抗体和未偶联的抗体) 半衰期约为5天，清除率较低，可持续发挥抗肿瘤活性。游离型MMAE浓度较低，24h后可降低至2ng/mL左右，半衰期短，清除率高，可降低毒性发生。
表2LR004-VC-MMAE中总抗体的药代动力学参数
Figure BDA0001840499860000191
表3LR004-VC-MMAE中结合型MMAE的药代动力学参数
Figure BDA0001840499860000192
表4LR004-VC-MMAE中游离MMAE的药代动力学参数
Figure BDA0001840499860000193

Claims (11)

1.一种靶向于EGFR的抗体偶联药物，命名为LR004-VC-MMAE，其特征在于，所述的药物由抗体、细胞毒性药物和连接子组成，所述抗体药物偶联物具有如下式I所示的结构：
Figure FDA0003018811500000011
其中，mAb为LR004单克隆抗体，n＝2～8。
2.根据权利要求1所述的抗体偶联药物，其特征在于，n＝4。
3.一种制备权利要求1或2所述的抗体偶联药物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将MC-VC-PAB-MMAE溶于二甲基亚砜，得到连接子-细胞毒药物储备液；
2)将还原剂溶于缓冲液中，配置还原剂储备液；
3)将LR004抗体与所述步骤2)中的还原剂溶液混合进行还原反应1-2h，得到抗体还原后的溶液；
4)将所述步骤1)中的连接子-细胞毒药物储备液滴加到抗体还原后的溶液中，进行加成反应1-2h，得到所述的抗体偶联药物。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤3)中还原剂为TCEP，混合时以LR004抗体的摩尔量为基准，还原剂的摩尔量为抗体摩尔量的2-4倍。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤4)混合时以LR004抗体的摩尔量为基准，所加连接子-细胞毒药物的摩尔量为抗体摩尔量的4-8倍。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤3)和步骤4)中的反应在搅拌转速为100～300rpm，氮气保护下进行，步骤3)中的反应温度为35～40℃。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤3)中的反应温度为37℃。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，还包括将得到的抗体偶联药物LR004-VC-MMAE进一步纯化的步骤，收集所需抗体偶联药物组分峰；收集完毕后，使用30kDa超滤管进行超滤离心，浓缩，经无菌滤膜过滤。
9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，采用AKTA purifier蛋白质纯化系统进行纯化。
10.根据权利要求1或2所述的抗体偶联药物在制备用于肿瘤靶向治疗的药物中的用途，其中，所述的肿瘤为EGFR阳性实体肿瘤，包括食管癌，鳞状上皮细胞癌，肺癌，乳腺癌，胰腺癌，头颈癌，结肠癌，前列腺癌，骨肉瘤癌。
11.一种用于肿瘤靶向治疗的药物组合物，其特征在于，含有药学上有效量的权利要求1或2所述的抗体偶联药物及药学上允许的佐剂。
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