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KR102182479B1 - 신규한 ｒｉｇ-ｉ 리간드 및 이를 제조하는 방법 - Google Patents

신규한 ｒｉｇ-ｉ 리간드 및 이를 제조하는 방법 Download PDF

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KR102182479B1
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라이니쉐 프리드리히-빌헬름스-유니베르지탯트 본
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Abstract

본 발명은 RIG-I 리간드로 작용할 수 있는 신규한 트리포스페이트-변형 올리고뉴클레오티드(triphosphate-modified oligonucleotides)뿐만 아니라, 이를 약학적 용도에 적합한 고수율 및 고순도로 합성 및 정제하는 신규한 방법에 관한 것이다.

Description

신규한 ＲＩＧ-Ｉ 리간드 및 이를 제조하는 방법{Novel RIG-I ligands and methods for producing them}
본 발명은 RIG-I 리간드로 작용할 수 있는 신규한 트리포스페이트-변형 올리고뉴클레오티드(triphosphate-modified oligonucleotides)뿐만 아니라, 이를 약학적 용도에 적합한 고수율 및 고순도로 합성 및 정제하는 신규한 방법에 관한 것이다.
Schlee 외, Immunity, 2009, 31, 25-34는 RIG-I 헬리카제(helicase)에 결합하여 면역 시스템의 강력한 자극제 역할을 하는, 가닥들 중 하나에 5'-O-트리포스페이트 모이어티(5'-O-triphosphate moiety)를 갖는 블런트-말단(blunt-ended) 이중 가닥 RNA를 기술한다. 따라서, 약학적 용도에 적합한 고순도의 트리포스페이트-변형 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위한 단순하고 효율적인 방법을 제공할 필요가 있다.
트리포스페이트 기(triphosphate groups) 또는 이들의 유사체(analogues)와 뉴클레오시드 화합물(nucleosidic compounds)의 5'-OH 기(group)의 결합(coupling)은 당업계에 잘 알려져 있다. Ludwig J. 외, J. Org. Chem., 1989, 54, 631-635에서는 포스피틸화제(phosphitylating agent)로서 2-클로로-4H-1,3,2-벤조디옥사포스포린-4-원(2-chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one)을 이용하여 뉴클레오시드(nucleosides)의 5'-O-트리포스페이트 및 유사체를 제조하는 용액 트리포스포릴화(triphosphorylation) 방법을 개시한다. Gaur R.K. 외, 1992, Tetrahedron Letters, 33, 3301-3304에서는 2'-O-메틸리보뉴클레오시드 5'-O-트리포스페이트(2'-O-methylribonucleoside 5'-O-triphosphates) 및 이들의 Pα-티오(thio) 유사체 합성을 위한 고상(solid-phase)에서의 상기 방법의 용도를 기술한다. 미국특허 제6,900,308 B2호에서는 잠재적 항바이러스 화합물로서 변형된 뉴클레오시드 5'-O-트리포스페이트의 고상 합성을 개시하고, 미국 특허 제7,285,658호, 제7,598,230호 및 제7,807,653호에서는 당(sugar), 핵염기(nucleobase) 및 트리포스페이트 엔티티(triphosphate entity)에 변형이 있는 뉴클레오시드의 트리포스페이트 유사체를 개시한다.
WO96/40159에서는 캡핑된(capped) RNA 또는 RNA 유사체 분자를 제조하는 방법을 기술하고, 상기 RNA 또는 RNA 유사체 올리고뉴클레이티드는 2-클로로-4H-1,3,2-벤조디옥사포스포린-4-원 또는 이들의 고리-치환 유도체와 같은 포스피틸화제와 반응시킨다. 상기 결과물인 중간체는 산화 또는 가수 분해된 포스페이트 또는 피로포스페이트(pyrophosphate) 또는 이들의 염과 반응된다. 디(di)- 또는 트리포스포릴화된 RNA(triphosphorylated RNA) 또는 RNA 유사체는 활성화된 m7G 트리-, 디- 또는 모노포스페이트(monophosphate) 또는 유사체와 반응하여 캡핑된다.
WO 2009/060281에서는 변형된 올리고포스페이트 모이어티를 함유하는 면역 자극(immune stimulatory) 올리고리보뉴클레오티드 유사체 및 이러한 화합물의 제조 방법을 기술한다. 이 방법은, 적절한 용매 및 염기의 존재하에 올리고뉴클레오티드의 5'-말단에 있는 뉴클레오티드를 2-클로로-4H-1,3,2-벤조디옥사포스포린-4-원과 같은 포스피틸화제와 반응시키는 단계, 상기 포스피틸화된 올리고뉴클레오티드를 피로포스페이트 또는 피로포스페이트 유사체와 반응시키는 단계, 상기 올리고뉴클레오티드를 산화제로 산화시키는 단계 및 상기 올리고뉴클레오티드를 탈보호(deprotecting)시켜 트리포스페이트- 또는 트리포스페이트 유사체-변형 올리고뉴클레오티드를 제공하는 단계의 고체 지지체 상에서의 올리고뉴클레오티드의 합성을 포함한다.
WO 96/40159에 이용된 폴리아크릴아미드 겔-전기영동은 소규모의 분리에만 적용할 수 있다. 보다 긴 올리고리보뉴클레오티드의 5'-모노-, 디-, 트리포스포릴화 산물에 대한 이온 교환 크로마토그래피의 해상력은 제한된다. 필수 변성 조건은 분리를 지루한 작업으로 만들고(Sproat, 1999; Zlatev, 2010; WO 2009/060281), 또한, 산물은 일반적으로 n-1, n-2 서열 및 이의 모노- 및 디포스페이트로 오염되어 불충분 순도를 야기한다. RIG-I 리간드의 정확한 말단(terminal) 구조에 대한 민감성을 감안할 때, 이러한 정제 방법은 약학적 적용에 차선이다.
따라서, 특히 RIG-I 선택성을 갖는 신규한 트리포스포릴화된 올리고뉴클레오티드(triphosphorylated oligonucleotides) 및 이의 유사체뿐만 아니라 이러한 화합물을 제조하는 방법에 대한 높은 요구가 있다.
그러므로, 본 발명은 잠재적 임상 사용을 위한 대규모로 생산될 수 있는 신규한 5'-트리포스포릴화된 올리고뉴클레오티드 및 이의 유사체뿐만 아니라 이러한 올리고뉴클레오티드를 용이하게 제조할 수 있는 방법에 관한 것이다. 또한, 올리고뉴클레오티드의 변형은, 상기 올리고뉴클레오티드의 RIG-I 선택성을 확립, 유지 및/또는 개선시키거나 이들의 화학적 안정성을 향상시키는 것으로 기술된다.
따라서, 본 발명의 일 양태는 화학식 (I)의 변형 올리고뉴클레오티드에 관한 것으로서
Figure 112015041082667-pct00001
상기 V1, V3 및 V5는 독립적으로 O, S 및 Se로부터 각각 선택되고;
V2, V4 및 V6은 독립적으로 OH, OR1, SH, SR1, F, NH2, NHR1, N(R1)2 및 BH3-M+로부터 각각 선택되며,
W1은 O 또는 S이고,
W2는 O, S, NH 또는 NR2이며,
W3은 O, S, NH, NR2, CH2, CHHal 또는 C(Hal)2이고,
R1, R2 및 R3는 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C2-6 아실 또는 사이클릭 기로부터 선택되며, 각각 선택적으로 치환되고,
또는 상기 2 개의 R1은 이들에 결합된 N-원자와 함께 고리를 형성할 수 있으며,
M+는 양이온이고,
X는 NH, NR3, O 또는 S이며,
Z는 캡처 태그(capture tag) 또는 H를 나타내고,
Y는 X에 캡처 태그(capture tag)를 연결하는 결합(bond) 또는 링커(linker)를 나타내며, 그리고
ON은 최소 4 개의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체 빌딩 블록을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.
본 명세서의 문맥 내 용어 "올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)"는 복수의, 예컨대, 최소 4 개의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체 빌딩 블록을 포함하는화합물을 포함한다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드는 6-100 개, 예컨대, 20-40 개의 빌딩 블록을 포함한다. 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체 빌딩 블록은 인터-서브유닛 연결(inter-subunit linkages)에 의해 연결된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드 유사체 서브유닛을 포함할 수 있다. 뉴클레오시드 서브유닛은 데옥시리보뉴클레오시드 서브유닛, 리보뉴클레오시드 서브유닛 및/또는 이들의 유사체, 특히 당- 및/또는 핵염기(nucleobase)-변형 뉴클레오시드 유사체를 포함한다. 또한, 올리고뉴클레오티드는 비-뉴클레오티드 빌딩 블록 및/또는 추가적인 말단 및/또는 측쇄 변형을 포함할 수 있다.
바람직한 당-변형 서브유닛(sugar-modified subunits)에서, 리보뉴클레오시드 서브유닛의 2'-OH는 OR, R, 할로(halo), SH, SR, NH2, NHR, NR2 또는 CN으로부터 선택된 기(group)로 대체되며, 상기 R은 C1-6 알킬, C2-6 알케닐 또는 C2-6 알키닐이고 할로는 F, Cl, Br 또는 I이다. 보다 바람직한 당-변형 서브유닛에서, 리보오스는 다른 당, 예컨대, 아라비노스와 같은 펜토오스로 치환될 수 있다. 이러한 당 변형은 2'-플루오로아라비노뉴클레오시드 서브유닛과 같은, 상술한 바와 같이, 2'-OH 변형과 결합할 수 있다. 보다 더욱 바람직한 당-변형 서브유닛은 LNA(locked nucleosides) 또는 UNA(2',3'-seco- nucleosides)를 포함한다. 바람직한 핵염기-변형 뉴클레오시드 빌딩 블록에서, 비-표준, 예컨대 비-천연 핵염기(non-naturally occurring nucleobase)가 표준 핵염기 대신 이용된다. 비-표준 핵염기의 예로는 5-위치에서 변형된 우라실 또는 시토신, 예컨대, 5-(2-아미노)프로필 우라실 또는 5-브로모우라실; 하이포잔틴; 2,6-디아미노퓨린; 8-위치에서 변형된 아데닌 또는 구아닌, 예컨대, 8-브로모구아닌; 데아자뉴클레오시드, 예컨대, 7-데아자구아닌 또는 7-데아자아데닌; 또는 O- 및 N-알킬레이티드 핵염기, 예컨대, N6-메틸아데닌, 또는 N6,N6-디메틸아데닌이 있다. 추가적인 적합한 핵염기 유사체는 5-니트로인돌과 같은 유니버셜 핵염기 유사체로부터 선택될 수 있다.
서브유닛 간의 인터-서브유닛 연결은 포스포디에스테르 연결 또는 변형된 연결, 예컨대, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포라미데이트, 보라노포스페이트 또는 기술 분야의 당업자에게 공지된 다른 변형 연결일 수 있다.
올리고뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 유사체로부터 선택될 수 있다. 데옥시리보뉴클레오티드(desoxyribonucleoside), 리보뉴클레오티드 및/또는 올리고뉴클레오티드 유사체는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 및/또는 올리고뉴클레오티드 유사체의 뉴클레오시드 및/또는 리보오스 서브유닛이 화학적으로 변형될 수 있다. 데옥시리보뉴클레오티드(desoxyribonucleoside) 또는 리보뉴클레오티드의 유사체는 최소 1 종의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오시드 서브유닛 및 최소 1 종의 변형 뉴클레오시드 서브유닛 및/또는 상술한 바와 같은 최소 1 종의 변형 인터-서브유닛 연결을 포함할 수 있다. 또한, 올리고뉴클레오티드 유사체는 변형된 뉴클레오시드 서브유닛으로 전부 구성될 수 있다.
올리고뉴클레오티드는 단일-가닥 분자 또는 이중-가닥 분자일 수 있다. 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 완전히 또는 부분적으로 상보적인 가닥을 포함할 수 있다. 이중-가닥 분자는 블런트-말단일 수 있거나 또는 최소 하나의 오버행(overhang), 예를 들어, 5'- 또는 3'-오버행을 포함할 수 있다. 오버행이 존재하는 경우, 바람직하게는 상기 분자(트리포스페이트/트리포스페이트 유사체 기(triphosphate/triphosphate analogue group) 관련)의 원위 말단(distal end)에 위치한다. 또한, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 헤어핀-구조를 포함할 수 있고, 상기 이합체는 이들(트리포스페이트/트리포스페이트 유사체 기 관련)의 원위 말단에 있는 루프에 의해 근접한다. 루프는 뉴클레오티드 및/또는 비-뉴클레오티드 빌딩 블록, 예를 들어 에틸렌 글리콜 모이어티, 예컨대, 트리(에틸렌)글리콜 또는 헥사(에틸렌)글리콜; 프로판-1,3-디올; 도데칸-1,12-디올; 또는 3,12-디옥사-7,8-디티아테트라데칸-1,14-디올과 같은 디올-기반 빌딩 블록을 포함할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 이중-가닥 분자는 블런트-말단, 특히 이들(트리포스페이트/트리포스페이트 유사체 기 관련)의 근위 말단(proximal end)이다.
특히 바람직한 구현예에 따르면, 올리고뉴클레오티드는 이중-가닥이고, 상기 이중 가닥의 각 가닥은 최소 19 개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 상기 길이의 블런트-말단 이중-가닥 올리고뉴클레오티드가 특히 바람직하다. 보다 바람직한 구현예에 따르면, 올리고뉴클레오티드의 각 가닥은 최소 19 내지 50 개의 뉴클레오티드, 19 내지 30 개의 뉴클레오티드, 20 내지 30 개의 뉴클레오티드, 22 내지 28 개의 뉴클레오티드, 특히 바람직하게 22 내지 26 개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는다.
올리고뉴클레오티드는 추가적으로 말단 및/또는 측쇄 변형을 포함할 수 있고, 예를 들어, 이들에 공유결합으로 부착하는 세포 특이적 타겟팅 엔티티이다. 이들의 엔티티는 세포 또는 세포-특이 유입을 촉진할 수 있고, 예를 들어, 지질, 비타민, 호르몬, 펩티드, 올리고사카라이드 및 이들의 유사체를 포함 할 수 있다. 타겟팅 엔티티는 예를 들어, 당업자에게 공지된 방법에 의해 변형된 핵염기 또는 비-뉴클레오티드 빌딩 블록에 부착될 수 있다.
바람직한 구현예에 따르면, 변형은, 소정의 타겟에 대한 올리고뉴클레오티드의 선택성을 확립 및/또는 향상시킨다. 특히 바람직한 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 RIG-I 선택성은 확립 또는 향상된다. 소정의 올리고뉴클레오티드의 RIG-I 선택성을 결정하는 방법은 본 명세서에 상세히 설명되고(참조, 실시예들) 및/또는 당업자에게 공지되어 있다.
또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 화학적 변형은 올리고뉴클레오티드의 화학적 안정성을 유지 또는 향상시킨다. 소정의 올리고뉴클레오티드의 화학적 안정성을 결정하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 또한, 이러한 방법은 예컨대, 실시예들에서 설명한다.
바람직한 구현예에 따르면, 올리고뉴클레오티드의 화학적 변형은 할로겐화, 특히 F-할로겐화, 2'-O-알킬화, 특히 2'-O-메틸화, 및/또는 인터뉴클레오티드 연결의 포스포로티오에이트 변형을 포함하는 군으로부터 독립적으로 선택된다. 2'-O-메틸화가 올리고뉴클레오티드의 RIG-I 선택성을 확립하거나 증가시키는 반면, 특히 F-할로겐화 및 포스포로티오에이트 변형은 올리고뉴클레오티드의 안정성을 증가시킨다. 또한 2'-O-메틸화는 RNA의 면역원성을 변형시킬 수 있다. 바람직한 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 가닥 당 1 또는 2 개의 2'-O-메틸화만을 포함하고, 보다 바람직하게는 가닥 당 1 개의 2'-O-메틸화를 포함한다.
2'-F 치환이 특히 바람직하다. 리보오스의 2' 위치에 있는 하이드록실 기는 플루오로로 치환된다. RNA의 2'-F 치환은 특히 뉴클레아제 절단에 대해 향상된 안정성을 야기한다. 추가적인 구현예에서, 2'-플루오로-치환은 특히 RIG-I-의존적 면역 자극을 보강할 수 있다.
본 명세서에서, 일반적으로 포스포로티오에이트 화합물은 인터뉴클레오티드 연결의 포스포로티오에이트 변형과 관련이 있다.
올리고뉴클레오티드의 말단에 변형을 갖는 포스포로티오에이트-변형 화합물이 특히 바람직하다. 포스포로티오에이트 변형 동안, 연결하는 포스페이트(bridging phosphate)의 비-결합 산소 원자는 핵산의 백본 내 황 원자로 치환된다. 이러한 치환은 이 위치에서의 뉴클레아제에 의한 절단가능성(cleavability)를 크게 감소시켜서 핵산 가닥의 높은 안정성을 야기한다.
특히 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 F-할로겐화, 메틸화, 특히 2'-O-메틸화뿐만 아니라 포스포로티오에이트 변형, 특히 올리고뉴클레오티드의 말단에서의 변형을 나타낸다.
소정의 올리고뉴클레오티드의 식별 패턴은 올리고뉴클레오티드 서열 및 길이에 의존적이고 각각 소정의 올리고뉴클레오티드에 대하여 결정될 수 있다. 당업자에게 이러한 결정을 실시하는 방법은 잘 공지되어 있다.
상술한 바와 같이, 소정의 올리고뉴클레오티드의 RIG-I 선택성 및/또는 안정성을 결정하기 위한 이러한 방법들은 본 명세서에서 상세히 설명된다.
화학식 (I) 또는 (IV)의 올리고뉴클레오티드는 트리포스페이트/트리포스페이트 유사체 기(group)을 포함한다. 이 기에서 V1, V3 및 V5는 O, S 및 Se로부터 독립적으로 선택된다. 바람직하게는 V1, V3 및 V5는 O이다. V2, V4 및 V6는 각각 OH, OR1, SH, SR1, F, NH2, NHR1, N(R1)2 및 BH3 -M+으로부터 독립적으로 선택된다. V2, V4 및 V6 는 OH이다. R1은 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C2-6 아실 또는 사이클릭 기, 예를 들어, C3-8 사이클로(헤테로)알킬기, C3-8 사이클로(헤테로)알케닐기, 페닐 또는 C5-6 헤테로아릴기이고, 상기 헤테로원자는 N, O 및 S으로부터 선택된다. 또한, 2 개의 R1은 이들에 결합된 N-원자와 함께 고리, 예컨대, 5- 또는 6-원 고리(membered ring)를 형성할 수 있다. 또한, R1은 할로(halo), 예컨대, F, Cl, Br 또는 I, O(할로)C1-2 알킬 및 -사이클릭 기인 경우- (할로)C1-2 알킬과 같은 치환기(substituents)를 포함할 수 있다. M+은 무기(inorganic) 또는 유기 양이온(organic cation), 예컨대, 알칼리 금속 양이온 또는 암모늄 또는 아민 양이온일 수 있다.
W1은 O 또는 S일 수 있다. 바람직하게는, W1는 O이다. W2는 O, S, NH 또는 NR2일 수 있다. 바람직하게는, W2는 O이다. W3는 O, S, NH, NR2, CH2, CHHal 또는 C(Hal)2일 수 있다. 바람직하게는, W3는 O, CH2 또는 CF2이다. R2은 R1에서 상술한 군으로부터 선택될 수 있다. 할(Hal)은 F, Cl, Br 또는 I일 수 있다.
특히 바람직한 구현예에 따르면, V1, V2, V3, V4, V5, V6, W1, W2 및 W3은 O이다.
트리포스페이트/트리포스페이트 유사체 기는 바람직하게는 올리고뉴클레오티드의 말단에 부착된다. 바람직하게는, 상기 기는 올리고뉴클레오티드의 5'-말단, 특히 이의 5'-말단 당의 5'-OH-기에 부착된다.
본 명세서에서 정의된 바와 같이, Z는 캡처 태그 또는 H를 나타낸다. 캡처 태그 Z는 하기의 실시가능한 일련의 실시예에 의해 기능적으로 정의될 수 있다. 일반적인 규칙은 다음과 같을 수 있다: Z는 편리한 정제가 가능해야 하고, pppRNA 안정성 요구사항과 양립가능한 조건하에서 제거가능해야 한다. 소정의 태그가 기능적 정의를 충족하는지 여부는 당업자가 과도한 부담없이 결정할 수 있다. 따라서, 당업자는 이러한 캡처 태그, 특히 본 명세서에 제시된 상세한 실시예와 관련하여 주지하고 있다.
바람직한 구현예에 따르면, 캡처 태그 Z는 장쇄 지방족 잔기(long-chain aliphatic residue), 비-공유 고-친화성 결합 쌍의 파트너, 반응성 화학적 엔티티(reactive chemical entity), Q 또는 NHC2-C24 알킬로부터 선택되고, 바람직하게는 Q는 H, 아미노산, 아미노산 유사체, C1-C24 알킬로부터 선택되며, 바람직하게는 C12-C24 알킬, 펩티드 및 지질로부터 선택된다. 그러나, 특히 바람직한 구현예에서 Z는 데실, 즉, C10 알킬이다.
본 발명에 따른 캡처 태그 Z는 캡처 태그를 함유하지 않는 다른 종으로부터의 올리고뉴클레오티드 (I)와 같은 캡처 태그를 포함하는 화합물이 분리되도록 하는 조건 하에서 캡처 제제와 비-공유결합 또는 공유결합으로 상호작용이 가능한 모이어티이다. 바람직하게는, 캡처 제제는 고정화(immobilized) 제제 또는 고정화시킬 수 있는 제제이다.
적합한 캡처 태그는, 예를 들면 장쇄, 예컨대, C8-24, 바람직하게는 C13-24, 보다 바람직하게는 C13-C14 지방족 알킬 잔기, 예를 들어 옥타데실 또는 기타 지질/친유성 잔기, 예를 들어 콜레스테릴, 토코페릴 또는 트리틸 및 이들의 유도체이다. 그러나, 특히 바람직한 구현예에 따르면 Z는 데실 잔기이다. 이 경우, 태그된 트리포스페이트 엔티티가 캡처될 수 있고, 표준 역상 크로마토그래피, 예를 들어 RP-HPLC, 또는 HIC(hydrophobic interaction chromatography)에 의하여 고상에서 정제될 수 있다. 또한, 캡처 태그는 예를 들어 플루오러스사(Fluorous Technologies, Inc.)에서 상업적으로 구입가능한 플루오러스 친화성 지지체(Fluorous Affinity support) 상의 변형 올리고-트리포스페이트의 특이 캡처를 위하여 4-(1H,1H,2H,2H-퍼플루오로데실)벤질 또는 3-(퍼플루오로옥틸)프로필 잔기와 같은 퍼플루오로알킬(perfluoroalkyl) 엔티티일 수 있다.
다른 구현예에서, 캡처 태그는 비-공유 고-친화성 결합 쌍의 제1 파트너일 수 있고, 예를 들어, 비오틴, 또는 데스티오비오틴, 비오틴 유사체, 합텐 또는 항원이고, 이는 캡처 제제와 고 친화성(예, 1-06 I/mol 이하의 결합 상수)를 갖고, 이는 고-친화성 결합 쌍의 제2 상보적 파트너, 예를 들어, 스트렙타비딘, 아비딘 또는 항체이다.
또 다른 구현예에서, 캡처 태그는 공유 결합 쌍의 제1 파트너일 수 있고, 이는 캡처 제제와 공유 결합을 형성할 수 있으며, 이는 공유 결합 쌍의 제2 상보적 파트너이고, 상기 공유 결합은 가역적 또는 비가역적 결합일 수 있다. 이 구현예에서, 캡처 태그 컴포넌트 Z는, Husigen 3+2 고리화 첨가반응(cycloaddition reaction)(예를 들어 사이클로옥틴 유도체 내 심한 고리응력(ring strain)의 방출을 통해 Cu(I) 이온없이 진행되는 촉매화된 Cu(I) 또는 이의 이형(variant)인 소위 "클릭-반응(click-reaction)")의 경우 상보적인 반응성 기, 예를 들어, 알키닐 또는 아지드 모이어티를 각각 포함하는 캡처 제제와 공유 반응할 수 있는 아지드 또는 알키닐기와 같은 반응성 화학적 엔티티일 수 있다. 이러한 경우 Z-Y-X에 대한 구체적인 예는 프로파질아미노(propargylamino)가 될 수 있다.
다른 구현예에서, 캡처 태그 컴포넌트는 추가적인 친핵성 기(nucleophilic group), 예컨대 NH2-Y-XH 형 제제 내 제2 아미노기를 함유하는 화학적 엔티티일 수있다. 콜레스테롤, 클로로포르미에이트 또는 비오틴 N-히드록시 숙시니미드 활성 에스테르와 같은 광범위의 적합한 친전자성(electrophilic) Z 제제는 올리고뉴클레오티드가 고상에 부착된 경우 태깅 기(tagging group)를 도입시키는 데 이용될 수 있고, 따라서 태깅 반응의 범위가 상당히 확장될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 캡처 태그는 장쇄 알킬 잔기, 퍼플루오로알킬 엔티티, 아지드 또는 알키닐 기이다.
본 발명의 다른 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 상이한 위치, 예를 들어 3'-말단(terminus)에서 제2 캡처 태그를 포함할 수 있다. 제1 및 제2 캡처 태그는 바람직하게는 초고순도 물질의 회수를 가능하게 하는 2 직교(orthogonal) 방법에 의해 정제되도록 선택된다. 예를 들어, 제1 캡처 태그는 적합한 크로마토그래피 지지체와 상호작용하는 친유성 기일 수 있고, 제2 캡처 태그는 스트렙타비딘과 상호작용하는 비오틴일 수 있다.
올리고리보뉴클레오티드 합성을 위하여 변형된 CPG(조절된 유리 지지체)를 이용하여 합성을 실시함으로써 제2 캡처 태그를 편리하게 도입시킬 수 있다.
Y는 화학적 결합 또는 링커, 예를 들어, 알킬렌을 나타내며, 바람직하게는 C1-6-알킬렌 링커, 보다 바람직하게는 C2-5-알킬렌 링커, 또는 아랄킬렌 링커이고, 선택적으로 헤테로원자 또는 헤테로원자-함유 기, 예를 들어 O, S, NH, C=O 또는 C =S를 포함하고/또는 선택적으로 C=C 또는 C≡C 결합을 포함한다. 특히 바람직한 구현예에 따르면, Y는 결합이다.
또 다른 바람직한 구현예에서 링커는 폴리알킬렌 옥사이드, 바람직하게는 폴리-C2-C6-알킬렌 옥사이드, 보다 바람직하게는 폴리-C2-C3-알킬렌 옥사이드이다. 링커의 수 평균 분자량은 30-800 g/mol의 범위일 수 있고, 바람직하게는 40-450 g/mol, 보다 바람직하게는 40-250 g/mol이다. 링커는 n = 1-10, 바람직하게는 N = 1-7, 보다 바람직하게는 N = 2-5, 보다 더욱 바람직하게는 n = 3인 [-CH2CHR4-O-]n일 수 있다. R4는 H 또는 C1-6-알킬일 수 있다. Y의 보다 바람직한 구현예는 도 4에 나타낸다. 바람직한 구현예에서 R4는 H이다.
본 발명의 특히 바람직한 구현예에 따르면,
X는 NH 또는 O이고,
Y는 -K-((CHR1)m-CH2-O)n-R-, 또는
(O-(CHR3)m3-CH2)n1-(O-(CHR2)m2-CH2)n2-(O-(CHR1)m1-CH2)n3- 이며, 그리고
K는 O 또는 NH이고
m, m1, m2 및 m3은 독립적으로 1 내지 12이며, 바람직하게는 1 내지 8, 보다 바람직하게는 1 내지 5, 보다 더욱 바람직하게는 1 내지 3이며,
n, n1, n2 및 n3은 독립적으로 0 내지 20이고, 바람직하게는 0 내지 10, 보다 바람직하게는 0 내지 5, 보다 더욱 바람직하게는 0 내지 3이며, 그리고
R1, R2 및 R3는 독립적으로 H, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C2-C6-아실 또는 사이클릭 기(group)로부터 선택되며, 각각 선택적으로 치환되고, 그리고
R은 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C2-C6-아실 또는 사이클릭 기(group)이며, 각각 선택적으로 치환된다. 바람직하게는 R은 CH2CH2이다.
특히 바람직한 구현예에 따르면 Y는 앞서 정의한 바와 같고, R1 및 R2는 H이고, n1은 O이며 n2 및 n3는 1이다. 보다 바람직한 구현예는 도 4에서 취할 수 있다.
다른 바람직한 구현예에 따르면 Y는 앞서 정의한 바와 같고, R1, R2 및 R3 는 H이며 n1, n2 및 n3은 1이다.
바람직한 구현예에 따르면 X는 NH이고, K는 NH이며 Y는 앞서 정의한 n의 (CH2CH2O)n이고, 상기 K는 콜레스테롤-C(O)-, 트리틸 또는 이들의 유도체로 추가적으로 치환된다.
화학식 (I)의 올리고뉴클레오티드의 특히 바람직한 구현예에 따르면 X는 NH 또는 O이고, Y는 결합이며, Z는 C1-C12알킬 또는 H이고, 바람직하게는 C10, Q 또는 NHC2-C24알킬이고, 상기 Q는 H, 아미노산, 아미노산 유사체, C1-C24알킬, 바람직하게는 C12-C24알킬, 펩티드 및 지질이며, V1, V2, V3, V4, V5, V6, W1, W2 및 W3는 O이다.
화학식 (I)의 올리고뉴클레오티드의 보다 바람직한 구현예에 따르면 X는 NH 또는 O이고, Y는 결합이며, Z는 데실 또는 H이고, V1, V2, V3, V4, V5, V6, W1, W2 및 W3는 바람직하게는 O이다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 명세서에 정의된 바와 같은 변형 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 보조제를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어 "담체(carrier)"는 사용되는 투여량 및 농도에 노출되는 세포 또는 포유 동물에게 무독성인 담체, 부형제 및/또는 안정화제를 포함한다. 종종 생리학적으로 허용가능한 담체는 수성 pH 완충된 용액 또는 리포좀을 포함한다. 생리학적으로 허용가능한 담체의 예로는 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산과 같은 완충액(그러나, 본 발명의 제형과 관련하여 포스페이트 완충액이 바람직하다); 아스코르브산을 비롯한 산화방지제, 저분자량 (약10 잔기 미만) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; EDTA, 당, 알콜, 예를 들어 만니톨 또는 소르비톨과 같은 킬레이트화제; 소디윰과 같은 염-형성 카운터 이온; 및/또는 TWEEN, 폴리에틸렌 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 비-이온계 계면활성제를 포함한다. 특히 바람직한 구현예에 따르면 본 발명의 화합물은 멸균 증류수에 용해시킨다.
본 발명에 따른 이러한 조성물 및/또는 제형은 적절한 수단에 의하여 특정 증상의 치료를 위한 충분한 용량으로, 이를 필요로 하는 대상, 특히 인간 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 조성물 및/또는 제형은 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 보조제와 함께 약학적 조성물로 제형화될 수 있다. 치료 효율 및 독성은 표준 프로토콜에 따라 결정될 수 있다. 약학적 조성물은 전신, 예를 들어 복강내, 근육내 또는 정맥내 또는 국소적, 예컨대 비강내, 피하, 피내 또는 막내로 투여될 수 있다. 물론 본 조성물 및/또는 제형의 투여량은 치료 대상 및 대상의 체중, 대상의 연령, 치료해야 할 질병 또는 상해의 유형 및 정도와 같은 대상의 상태, 투여 방식 및 의사의 판단에 따라 달라진다.
바람직한 구현예에서 본 약학적 조성물은 피내 투여된다. 본 조성물은 문신, 미세침 및/또는 미세침 패치를 통해 피내 투여되는 것이 특히 바람직하다.
본 발명에 따른 화합물은 바람직하게는 멸균 증류수(정제수)에 원하는 농도로 용해 및 희석된 다음, 면도 및 에탄올-소독한 피부에 피펫팅(pipetting) 기기를 사용하여 도포되고, 이어서 피부에 문신된다.
문신용, 예를 들면, 본 발명에 따른 수성 약학적 조성물은 다중-바늘(단일 용량) 바늘-팁(예컨대, 9-바늘, 단일-용량 팁)이 장착된 (의료용) 문신 장치를 사용하여, 피부에 피내 주사된다.
전형적인 문신 절차는 다음과 같다: 수성 약학적 조성물을 면도 및 에탄올-소독한 피부에 피펫팅한 후, 수성 약학적 조성물의 비말(droplet)의 상부에서 부드럽게 실행 바늘 팁을 배치하여 문신 기계의 다중-바늘 팁으로 도입시킨다(실행 속도는 예를 들어, 100-120 ㎐, 특히 100 Hz). 일단 수성 약학적 조성물의 비말이 완전히 실행 바늘 팁에 흡착되어, 실행 바늘 사이에 존재하면, 채워진 바늘 팁을 피부에 대하여 정확하게 90 도 각도로 고정하여 실행 팁을 피부 위에 앞뒤로 부드럽게 움직인다. 이 방법을 이용하여, 수성 약학적 조성물은 피부에 완전히 문신된다. 수성 약학적 조성물의 50-100 ㎕은 일반적으로 2~4 제곱 센티미터의 피부 면적에서 10-15초 걸린다. 이러한 기준 단일 피내 볼루스(bolus) 주사를 통한 치료의 장점은 수성 약학적 조성물이 피부의 보다 큰 영역 전체에 균일하게 주입되고, 타겟 조직 전체를 보다 균일하고 보다 정확하게 분할한다는 것이다: 9-바늘 팁을 10초 동안 100 Hz 속도로 사용함으로써, 이러한 방법은 처리된 피부에서 9000 균일하게 분산시키는 피내 주사를 보장한다.
물론, 당업자는 환자 또는 치료해야 할 신체의 일부에 따라 절차를 벗어나거나 조정할 수 있다. 미세침 절차는 문신 절차와 거의 유사하게 실시될 수 있다. 그러나, 미세침은 문신 바늘 팁을 미세침 팁으로 대체되며, 이는 보다 피상적 피내 투여가 가능하게 한다. 수성 약학적 조성물은 원칙적으로 면도 및 에탄올 세정된 피부에 피펫팅한 후, 문신 절차와 유사하게, 미세침 팁을 사용하여 피내 투여한다. 미세침은 미세침 바늘 사이에 미리 약학적 조성물의 흡착시킬 필요가 없다.
추가적으로, 약학적 조성물로 코팅 또는 포함하는 미세침 패치는 경피/피내 전달을 위해 사용될 수 있는 것으로 구상된다. 이것은 병원 방문 및/또는 의료 전문가 문신/미세침 개입할 필요없이 대상자 그-/그녀 자신에 의해 약학적 조성물의 피내 전달이 안전하게 실시될 수 있다는 특이 장점을 갖는다. 이는 치료 계획에 크게 유연성을 부여할 수 있고, 높게 개인화된 치료 요법, 낮은 치료-관련 통증, 및 낮은 처리 비용이 가능하게 한다. 이러한 패치는 약학적 조성물의 시간-제어-, 지속- 또는 볼루스 경피 전달을 위한 용해- 또는 비용해- 미세침 패치를 포함하여 구성될 수 있으며 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드를 제조하는 방법에 관한 것이며
(a) 화학식 (IIa)의 화합물을 산화제와 반응시켜 화학식 (IIb)의 화합물을 수득하는 단계로서,
Figure 112015041082667-pct00002
상기 V1, V3, V5, V4, V6, W1, W2, W3, 및 ON은 앞에서 정의된 바와 같고, 상기 ON은 최소 1 개의 보호기(protection group)에 의하여 보호되며
Figure 112015041082667-pct00003
상기 V1, V3, V5, V2, V4, V6, W1, W2, W3 및 ON은 앞에서 정의된 바와 같고, 상기 ON은 최소 1 개의 보호기(protection group)에 의하여 보호되고,
(b) 화학식 (IIb)의 화합물을 화학식 (III)의 캡처 태그 제제와 반응시켜 화학식 (I)의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 반응 산물을 수득하는 단계로서,
Z - Y - XH (III),
상기 X, Z, 및 Y는 앞에서 정의된 바와 같고, 상기 X는 바람직하게는 O이며, 그리고
(c) 상기 최소 1 개의 ON 보호기를 탈보호(deprotection)하는 단계, 및
(d) 단계 (b)의 상기 반응 산물을 캡처 태그와 상호작용이 가능한 캡처 제제와 접촉시키는 단계로서, 상기 접촉은 상기 반응 산물에 함유된 다른 종으로부터 상기 올리고뉴클레오티드 (I)이 분리되도록 하는 조건 하에서 발생한다.
구현예에서, 상기 X는 O인 것이 특히 바람직하다.
본 방법 동안 ON 올리고뉴클레오티드는 최소 1 개의 보호기를 포함한다. 본 발명에 따른 보호기의 이용은 적용된 올리고뉴클레오티드의 2'-OH기 리보오스 서브유닛 보호를 특히 목표로 하고 있다. 당업자 특히 뉴클레오티드 합성 분야에 종사하는 사람에게 보호기가 합성에 적합하다는 것은 알려져 있다. 올리고뉴클레오티드의 리보오스 서브유닛의 2'-OH 위치에 있는 보호기가 바람직하다. 본 발명의 바람직한 구현예에서 리보오스 유닛의 2'-OH 위치에 플루오라이드-불안정(fluoride-labile) 보호기가 사용된다.
특히 2'-O-TBDMS 또는 2'-O-TOM 보호기가 바람직하다. 특히 바람직한 구현예에서, TBDMS 보호기가 적용된다.
특히 향상된 Z-Y-X-PPP 결합 안정성을 갖는 X = O인 화합물의 합성 동안, 탈보호 조건의 광범위한 스펙트럼은 절단되는 2'-OH 보호기를 유도할 수 있다.
공지된 모든 탈보호 시약은 TBDMS 보호기를 절단하기에 적합하다. 특히, 다음과 같은 시약이 적용될 수 있다:
(a) 극성 용매와 선택적으로 조합할 있는 트리에틸아민-트리하이드로플루오라이드,
(b) 트리알클일아민(trialklylamine), 트리에틸아민-트리하이드로플루오라이드 및 극성 용매,
(C) 피리딘-HF 및 유기성 질소 염기의 하이드로플루오라이드의 기타 부가물,
(d) 암모늄 플루오라이드,
(E) 테트라-n-부틸-암모늄 플루오라이드,
(F) 테트라메틸-암모늄 플루오라이드, 및 기타 테트라알킬-암모늄 플루오라이드 및 이들의 조합.
(c) 단계는 바람직하게는 트리포스페이트 모이어티(예를 들어 하기에 상세히 기재)의 분해가 발생하지 않은 조건 하에서 실시한다.
본 발명의 방법의 단계 (a)는 화학식 (IIa)의 사이클릭 P(V)-P(V)-P(III) 종과 산화제의 반응을 포함한다. 화학식 (IIa)의 화합물은 Ludwig 등, 1989, supra 및 Gaur 등, 1992, supra에 기재된 표준 방법에 따라 수득할 수 있으며, 즉, 적합한 조건, 예를 들어 디옥산 또는 디클로로메탄과 같은 적합한 용매에서 염기(피리딘 또는 디이소프로필에틸아민)의 존재하에서 올리고뉴클레오티드의 5'-말단 OH-기를 2-클로로-4H-1,3,2-벤조디옥사포스포린-4-원과 같은 3작용성의 포스피틸화제와 반응시키고, 피로포스페이트 (W3=O) 또는 변형 피로포스페이트 (W3은 O과 상이한, 예를 들어 CH2, CCl2, NH 또는 CF2)와 후속 반응시키는 것이다.
바람직하게는, DMF 중 피로포스페이트 또는 변형 피로포스페이트의 트리-n-부틸암모늄 염이 이용된다. 상기 결과물인 사이클릭 P(III)-P(V) 중간체(IIa)는 무수 조건, 예를 들어 t-부틸 하이드로퍼옥사이드, 큐멘 하이드로퍼옥사이드, (10 캄포설포닐)옥사지리딘과 같은 퍼옥사이드로 산화된다. 대안적으로, 페닐아세틸디술피드 (V2=S), 또는 보란-디이소프로필에틸아민 복합체 (V2=BH3) 또한 각각 이용하여 화학식 (IIb)의 해당 사이클릭 5'-트리포스페이트/트리포스페이트 유사체를 수득할 수 있다. 또한, 이 문맥의 참조는 본 명세서에서 참조로 인용되는, 국제출원 WO 96/40159 또는 WO 2009/060281에 의해 달성된다.
반응 단계 (a)는 용액 내 올리고 뉴클레오티드 또는 고상, 예를 들어 유기 수지 또는 CPG와 같은 유리에 결합된 올리고뉴클레오티드로 대체할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 추가적으로 보호기, 예를 들어 당업자에게 잘 알려진 당- 또는 핵염기 보호기를 포함할 수 있다. 보호기의 바람직한 예는 인터뉴클레오시드 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트에 대한 2-시아노에틸, tert- 부틸디메틸실릴, 리보오스 2'-히드록실기에 대한 트리이소프로필실릴옥시메틸 또는 비스(아세톡시에톡시)메틸, 4-t-부틸페녹시아세틸 또는 페녹시아세틸, 아세틸, 이소부티릴, 핵염기의 엑소사이클릭 아미노기에 대한 벤조일이다. 보다 바람직하게는, 단계 (a)는 올리고뉴클레오티드가 결합된 고상으로 실시한다.
본 발명의 방법의 단계 (b)에 따르면, 화합물 (IIb)은 화학식 (III)의 캡처 태그 제제와 반응한다.
Z-Y-XH (III)
상기 X는 NH, NR3, O로부터 선택되는 기이고 X 및 Y는 상기에서 정의 된 바와 같다. R3는 상기에서 R1에 대하여 상술한 바와 같이 정의된다.
특히, O인 X의 경우 데칸올과 같이 제한된 친핵성의 제제를 고리 오프닝(도 1의 단계 4 참조)에 이용할 수 있다. 이러한 단계는 실온에서, 예를 들어 48 시간 동안 실시될 수 있고, 사이클로트리포스페이트가 목표인 트리포스페이트 γ-에스테르로 전환된다.
단계 (c)에 따라 ON 보호기가 절단된다.
단계 (c) 동안, 예를 들면, 상기 특정 탈보호 제제 (a) 및 (b)는 20 분 내지 180 분 기간, 보다 바람직하게는 60 분 내지 약 150 분, 특히 약 120 분에 걸쳐, 60-70℃에서 X = O인 탈보호 조건이 이어질 수 있다. X = NH인 경우, 이러한 반응은 상이한 결합 안정성으로 인해 제외되거나, 또는 단지 현저히 악화시킨 반응 변수 하에서, 예를 들어 40 시간의 기간에 걸쳐 상온에서 실시될 수 있다.
본 발명의 방법의 단계 (d)는, 반응 산물 내 함유된 다른 종으로부터 캡처 태그 함유 올리고뉴클레오티드 (I)이 분리되도록 하는 조건 하에서 캡처 태그 Z와 상호작용할 수 있는 캡처 제제와 단계 (b)의 반응 산물을 접촉시키는 단계를 포함한다. 단계 (d) 전에, 고상-결합 올리고뉴클레오티드 (I)은 고상으로부터 절단되어 탈보호, 즉 보호기가 부분적으로 또는 완전히 제거된다. 캡쳐 제제는 바람직하게는 적합한 지지체, 예를 들어 크로마토그래피 지지체 상에 고정화된다. 비-캡처 태그 -함유 종으로부터의 캡처 태그 함유 올리고뉴클레오티드 (I)의 분리를 제공하기 위해, 단계 (b)로부터의 반응 산물이 고상으로부터 절단 및 탈보호되고, 필요한 경우, 분리 과정을 실시하며, 바람직하게는 캡처 제제와 캡처 태그 Z의 상호작용에 기반한 크로마토그래피 분리 과정이다. 분리 단계 동안, 서열의 길이 및 복잡성에 따라 조물질(crude material)에 대하여 일반적으로 25-70% 범위인 올리고뉴클레오티드 (I)의 순도는 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 이상으로 증가될 수 있다. 독성 연구에서 > 85%의 순도가 바람직한 반면, 최종 단계 임상 시험에서 순도는 최소 90-95%의 범위 내에 있어야 한다. 따라서, 본 발명은 인간의 임상 실험에 요구되는 바와 같이 고순도 pppRNA을 수득하는 방법을 제공한다.
단계 (d)에서, 캡처 태그 및 이와 상호작용할 수 있는 캡처 제제는 바람직하게는 다음으로부터 선택되며 (i) 소수성(hydrophobic) 또는 플루오르화 기(fluorinated group) 및 소수성 또는 플루오르화 기에 대하여 친화성을 갖는 크로마토그래피 물질, 예를 들어, 역상 물질(reversed phase material) 또는 불소 친화성 지지체(fluorous affinity support); (ⅱ) 비-공유 고-친화성 결합 쌍의 제1 파트너 및 비-공유 결합 쌍의 제2 파트너, (ⅲ) 공유 결합 쌍의 제1 파트너 및 공유 결합 쌍의 제2 파트너 결합 쌍이며, 상기 제1 및 제2 파트너는 공유 결합을 형성한다.
캡처 태그는 하기의 실시가능한 일련의 실시예에 의해 기능적으로 정의될 수 있다. 일반적인 규칙은 다음과 같을 수 있다:
Z는 편리한 정제가 가능해야 하고, pppRNA 안정성 요구사항과 양립가능한 조건하에서 제거가능해야 한다.
추가적으로, 본 방법은 캡처 태그를 제거하여 화학식 (IV)의 올리고뉴클레오티드를 수득하는 단계 (e)를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, X=O에 대하여 화학식 (IV)a 또는 (IV)b의 화합물
Figure 112015041082667-pct00004
및 X=NH에 대하여 화학식 (IV)a의 화합물
Figure 112015041082667-pct00005
이 수득된다.
단계 (e)는 트리포스페이트 최종 산물의 안정성 필요조건 및 인터리보뉴클레오티드 결합의 안정성 필요조건과 양립가능해야 한다. X가 NH인 경우에는 약 산성 조건에 의한 절단을, X가 S인 경우에는 은 이온으로 절단을, Y-X-P가 -SS-CH2-CH2-O-P를 함유한 경우에는 티이란의 제거를 야기하는 디티오트레이톨과 같은 티올에 의한 절단을 포함할 수 있다.
추가적인 구현예에서 캡처 태그 Z는 제거되지 않거나 또는 완전히 제거되지 않는다. 이들 구현예에서 태깅된 올리고뉴클레오티드는 유용성, 예를 들어 약학적제제로서 유용성을 가질 수 있다.
이러한 구현예에서, 제제 Z-Y-XH는 Z-잔기의 서브 그룹으로부터 선택되어야 하고, 이는 RIG-I 센서의 구조적 필요조건과 기능적으로 양립가능하다. 예를 들어, Z=데실-옥타데실, Y=링크 X=NH 또는 O 조합은 이러한 필요조건을 충족하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에 따라 생산된 트리포스페이트/트리포스페이트 유사체 변형 올리고뉴클레오티드는 이들의 높은 순도 때문에 약학적 적용에 특히 적합하다. 특히 바람직한 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 (I) 또는 (IV)는 RIG-I 헬리카제(helicase)의 활성제(activator)이다. 적합한 RIG-I 활성제의 특정예는 Schlee 등, 2009, supra에 개시 되어 있고, 상기 문헌의 내용은 본 명세서에 참고로 인용된다.
도 1은 올리고뉴클레오티드 트리포스페이트 에스테르 유도체에 대한 합성 방법의 개략도를 나타낸다.
도 2는 데실-O-pppRNA 24mer 합성의 RP-HPLC 및 ESI-LC/MS 분석을 나타낸다 (RNA 서열: 5'-GACGCUGACCCUGAAGUUCAUCUU)
(A) 다음의 RP-HPLC 프로파일
a) 48% 데실-O-pppRNA를 함유하는 조물질 반응 혼합물(RT=14분)
b) 순수 데실-O-pppRNA
컬럼: 해밀턴 PRP-1 4.1x250, 10㎛
구배(Gradient): 18분 내 0-100% B, A=100mM TEAB; B=80% 메탄올, 100mM TEAB
(B) RP-LC/MS를 이용하여 기록된 순수 데실-O-pppRNA의 ESI-MS 프로파일
(MW calc.: 7987, found: 7968)
도 3은 데실-O-pppRNA의 1μmol 규모 반응의 반제조(semipreparative) 규모의 RP-HPLC 정제를 나타낸다: 데실-태깅은 합성 실패 서열, 전장 비-포스포릴화된 OH-RNA 및 비-유도체화된 pppRNA을 포함하는 비-태그 측면 산물로부터 원하는 산물(분획물3)이 효율적으로 분리되도록 한다
컬럼: 해밀턴 PRP-1 7x250mm, 10㎛
구배(Gradient): 50분 내 0-80% B, A=100mM TEAB; B=80% 메탄올, 100mM TEAB.
도 4: Y의 특히 바람직한 구현예.
도 5: 2'-O-메틸화의 스크린이 RIG-I의 선택성을 도입하는 위치를 해결한다.
도 6: 메틸화가 이합체를 RIG-I 특이적이고 활성을 높일 수 있다.
도 7: 말단 포스포로티오에이트는 선택적 이합체의 면역원성을 증가시킨다.
도 8: 선택된 2'-플루오로-치환은 이합체의 RIG-I 활성화 가능성을 증가시킨다.
도 9: OH ds-RNA OH-GFP2의 다중 변형 패턴은 RIG-I 활성화 잠재력의 강한 향상을 유도한다.
도 10: 백본 변형에 의한 면역원성의 향상은 트리포스포릴화된 이합체에 전달할 수 있다.
도 11은 친핵성 고리 오프닝 제제인 알킬폴리에틸렌글리콜에 대한 실시예로써 디에틸렌글리콜모노부틸에테르를 이용하는 본 발명의 방법의 개략도를 나타낸다.
도 12: 45% C4-DEG-pppRNA(88.4 ㎖ 구배 부피에서 피크) 및 50% pppRNA(77.5 ㎖에서 피크)를 함유하는 C4-DEG-pppRNA 조반응(crude reaction) 혼합물의 RP-HPLC 정제
컬럼: 해밀턴 PRP-1 7 × 250 mm, 10μm 유속 3 ㎖/분.
구배(Gradient): 50분 내 1-80% B, A=0.1M TEAB; B=80% 메탄올 0.1 M TEAB.
도 13: HPLC 정제 후 C4-DEG-pppRNA 해당하는 MALDI-TOF 스펙트럼. 정확한 질량 피크는 m/z 7972.6 (A)에서 관찰된다.
도 14는 친유성 폴리에테르 복합 태그를 이용하는 pppRNA의 합성 개요를 나타낸다.
도 15는 도 14에 관련된 HPLC 정제 및 MALDI 데이터를 나타낸다
(RNA 서열: 5'-GACGCUGACCCUGAAGUUCAUCUU)
(A) 다음의 RP-HPLC 정제
C11-CONH-CH2CH2CH2-(O-CH2CH2)2-O-CH2CH2CH2-NHpppRNA
컬럼: 해밀턴 PRP-1 4.1x250mm, 10㎛
구배(Gradient): 50분 내 0-80% B,; A=100mM TEAB, B=80% 메탄올, 100mM TEAB.
(B) C11-CONH-CH2CH2CH2-(O-CH2CH2)2-O-CH2CH2CH2NHpppRNA의 존재를 나타내는 탈염 후 조반응 혼합물로부터 기록된 MALDI 스펙트럼 (Mw 8214,8)
(C) 정제된 C11-CONH-CH2CH2CH2-(O-CH2CH2)2-O-CH2CH2CH2NHpppRNA의 pH=3.8 가수 분해 산물의 MALDI 스펙트럼 (Mw 7832.6)
도 16은 해당 pppRNA에 대한 선택적 절단과 콜레스테릴-태그 pppRNA의 합성 개요를 나타낸다.
도 17는 콜레스테릴-태그 pppRNA(RNA 서열: 5'-GACGCUGACCCUGAAGUUCAUCUU)의 정제 및 분석을 나타낸다:
(A) 콜레스테릴-CONH-CH2CH2-(O-CH2CH2)2-NH-ppp-RNA의 RP-HPLC 정제
컬럼: 해밀턴 PRP-1 4.1x250mm, 10㎛
구배(Gradient): 5분 내 0-10%B, 9분 동안 10%B, 33분 내 10-100%B;
A=50mM TEAB, B=95% 메탄올, 50mM TEAB
(B) 순수 콜레스테릴-CONH-CH2CH2-(O-CH2CH2)2-NH-ppp-RNA의 RP-HPLC 분석.
컬럼: 해밀턴 PRP-1 4.1x250mm, 10㎛
구배(Gradient): 18분 내 0-100%B, 4분 동안 100%B; A=50mM TEAB, B=95% 메탄올, 50mM TEAB
(C) 순수 콜레스테릴-CONH-CH2CH2-(O-CH2CH2)2-NH-ppp-RNA의 MALDI 스펙트럼.
pppRNA 피크 (7827.3Da)는 이온화 과정 동안의 PN-절단으로 인한 것이다.
실시예
실시예 1: 5'-데실-O-트리포스페이트 RNA(5'-Decyl-O-triphosphate RNA)의 제조
개요(도 1)에 명시된 데실-O-트리포스페이트 RNA 합성 과정은 다음과 같은 합성 단계를 포함한다:
1-4) 5'-데실-O-트리포스페이트 RNA
지지체-결합, 완전 보호된 5'OH-RNA (1μmol)는 합성 컬럼 내 진공 상태에서 3 시간 동안 건조하고, 이어서 무수 피리딘/디옥산(1:3, V/V, 4 ㎖)으로 세척하였다. 아르곤 하에서, 건조 디옥산(100㎕, 100μmol)에 새롭게 제조된 2-클로로-4H-1,3,2-벤조디옥사포스포린-4-원(2-chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one)의 1M 용액을 무수 피리딘/디옥산(1:3, V/V) 2 ㎖을 함유하는 플라스크에 주입하였다. 상기 결과물인 50mM 포스피틸화 용액을 합성 컬럼 내로 따르고 30분의 반응 시간 동안 천천히 앞뒤로 밀어주었다. 이어서, DMF (1 ㎖, 0,5mmol) 중 비스(tri-n-butylammonium) 피로포스페이트의 0,5M 용액과 트리-n-부틸아민 (238㎕, 1mmol)을 혼합하여 테트라(tri-n-butylammonium) 피로포스페이트 용액을 제조하였다. 상기 피로포스페이트 용액을 컬럼에 통과시키고, 컬럼으로부터 과량의 포스피틸화제를 방출 및 폐기한 후, 남아있는 피로포스페이트 용액은 두 주사기를 이용하여 앞뒤로 밀었다. 10 분 후 컬럼을 무수 아세토니트릴 (3 ㎖)로 세척하였다. 데칸 (300㎕) 중 5,5M 테르트-부틸 하이드로퍼옥사이드 용액을 무수 아세토니트릴 (2 ㎖)에 용해하고, 합성 지지체와 접촉시켰다. 15 분 후 컬럼을 무수 아세토니트릴 (6 ㎖)로 세척하였다. 이어서, N-메틸이미다졸 (240㎕, 3mmol), 트리-n-부틸아민 (250㎕, 1,1mmol) 및 n-데실 알코올 (2 ㎖, 10,5mmol)의 균질액이 컬럼을 통과하도록 반복적으로 앞뒤로 밀어주고, 데실-O-트리포스페이트로의 사이클로트리포스페이트 변환을 위하여 48 시간 동안 반응하도록 두었다. 컬럼을 무수 아세토니트릴 (6 ㎖)로 세척하고, 비-반응 사이클로트리포스페이트의 가수분해를 위하여 20 분 동안 0,1M 트리에틸암모늄 바이카보네이트(TEAB, 2 ㎖)으로 처리하여, 이후의 탈보호 과정 동안의 비특이적 유도체화를 방지하였다. 무수 아세토니트릴 (9㎖)로 추가적인 세척 단계 이후 합성 지지체를 아르곤 대기 중에서 건조시켰다.
5-6) 탈보호 및 정제
두 개의 주사기를 이용하여 5'-데실-O-트리포스페이트 올리고뉴클레오티드를 40% 수성 메틸아민의 새로 제조된 용액과 농축 수성 암모니아(AMA, 1:1, v/v, 2 ㎖)에 접촉시켰다. 30 분 절단 시간 후 상기 용액을 깨끗한 스크류 캡 바이알에 옮기고 상기 지지체를 AMA(1 ㎖)로 세정하였다. 조합된 용액 및 세척을 65℃에서 10 분 동안 가열하였다. 얼음에서 냉각시킨 후 상기 용액을 증발건조시키고 잔류물은 무수 에탄올로 공-증발시켜 건조시켰다. 2'-O-TBDMS 보호기 제거를 위하여 트리에틸아민 트리하이드로플루오라이드 (TEA.3HF)로의 처리는 변형 트리포스페이트 모이어티의 상당한 손실없이 사용할 수 있다. 상기 데실-O-트리포스페이트 올리고뉴클레오티드를 N-메틸피롤리돈/트리에틸아민/TEA.3HF(NMP/TEA/TEA.3HF, 6:4:3, v/v, 325㎕)의 새로 제조된 용액에 재용해시키고 상기 용액을 2 시간 동안 65℃에서 가열하였다. 대안적으로, DMSO(1:1, V/V, 600㎕) 중 TEA.3HF의 탈보호 용액을 이용할 수 있다. n-부탄올을 이용하여 완전히 탈보호된 데실-O-트리포스페이트 올리고뉴클레오티드를 탈보호 용액에서 침전시키고 HPLC로 정제하였다. 친유성 데실-태그는 역상 크로마토그래피를 사용하여 태그를 함유하지 않는 불순물로부터 데실-O-트리포스페이트를 분리시킨다. 상기 반응 산물을 7x250mm PRP-1 컬럼에 적용하고 3 ㎖/분의 유속으로 50 분간 0 내지 100% 완충액 B의 선형 구배로 분리하였다. 완충액 A는 100mM TEAB이고, 완충액 B는 80% 메탄올 중 100mM TEAB이었다. 메탄올로 공-증발을 반복하여 상기 산물 분획을 수집, 증발 및 탈염시켰다. 잔류물을 물에 용해시키고 0.3 M 염화나트륨의 존재하에 에탄올 침전에 의해 나트륨 형태로 전환시켰다.
실시예 2
5'-pppRNA 감마 2-(2-부톡시에톡시)에틸-에스테르(C4-DEG-pppRNA)의 제조
실시예 2에 기재된 반응식의 개요는 도 11에 나타내었다.
단계 1: 아르곤 대기 하의 10 ㎖ 셉텀 바이알 내에서 2-클로로-4H-1,3,2-벤조디옥사포스포린-4-원(2-chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one) 203 mg(1 mmol)을 건조 디옥산 1 ㎖에 용해시킨다.
단계 2: 12 시간 동안 진공 상태에서 데티트릴화(detitrylated)하고 아세토니트릴로 철저히 세척한 완전 보호된 RNA를 함유하는 합성 컬럼을 건조시킨다. 아르곤 대기 중에서 무수 디옥산/피리딘 용액 3:1(V/V) 2 ㎖을 넣고 제거하기를 반복하여 철저히 컬럼 내용물을 세척한다.
단계 3: 바이알에 피리딘/디옥산 3:1 v/v 2 ㎖을 먼저 첨가하고 이어서 건조 디옥산 중 2-클로로-4H-1,3,2-벤조디옥사포스포린-4-원 용액 100 ㎕을 첨가하여 포스피틸화제 50mM 용액, 예를 들어 디옥산/피리딘 3:1(V/V) 중 2-클로로-4H-1,3,2-벤조디옥사포스포린-2-원을 수득한다. 가볍게 흔들어 용액을 균질화시킨다. 바이알로부터 합성 컬럼을 관통하도록 2-클로로-4H-1,3,2-벤조디옥사포스포린-4-원 용액을 따름으로써 반응을 개시한다.
반응 동안, RNA가 지지된 고상과의 접촉 및 혼합이 잘 되도록 합성 컬럼에 2-클로로-4H-1,3,2-벤조디옥사포스포린-4-원 용액 함유 용액을 넣고 방출하기를 반복한다. 30 분의 반응 시간으로 통상적으로 20 내지 40 nt 범위의 상기 올리고머가 결합된 지지체의 유리 5'-OH 기(free 5'-OH group)의 정량 반응이 거의 일어난다.
4 단계: 30 분 반응 시간 후 폐액 용기로 과량의 포스피틸화제를 함유한 디옥산/피리딘 용액을 방출하고, 새로운 주사기에 건조 DMF 중 0.5 M (Bu3NH)2 피로포스페이트 1 ㎖과 건조 Bu3N 238 ㎕(1 mmol)을 볼텍싱한 혼합물로 채워서 0.5 M (Bu3N)4로 피로포스페이트 용액을 얻는다. 상기 용액이 컬럼을 통과하도록 밀어서 디옥산/피리딘 용액으로 교체한다. 과량의 피로포스페이트는 P(III)-P(V) 사이클릭 무수물 IIa에 대한 중간체의 양적 전환을 확실하게 한다.
5 단계: DMF 및 과량의 PPI를 제거하고, 건조 CH3CN로 컬럼 반응기를 채우기 위해 CH3CN 3 ㎖으로 컬럼을 세척한다.
단계 6: 무수물 CH3CN 2 ㎖에 t-BuOOH(데칸 중 5.5 M 용액, Sigma-Aldrich) 300 ㎕을 용해하여 약 0.7 M 균질액을 수득한다. 산화된 P (V) 사이클린 무수물 IIb를 얻기 위해 15 분 동안 상기 용액으로 합성 지지체를 접촉시킨다.
7 단계: 건조 CH3CN 3 ㎖으로 컬럼을 세척하여 과량의 퍼옥사이드를 제거하고 건조 CH3CN로 채운다
8 단계: 접촉 0.1 M N-메틸이미다졸 및 0.1 M 트리-n-부틸아민을 함유하는 건조 2-(2-부톡시에톡시)에탄올 (디에틸렌 글리콜 모노부틸 에테르) 2 ㎖을 컬럼 내 지지체에 접촉시킨다, 알코올과 CPG의 접촉 시간은 실온에서 최소 48 시간이어야한다.
9 단계: 9 ㎖의 아세토니트릴로 충분히 컬럼을 세척하고, 비반응 사이클로트리포스페이트를 가수분해하기 위하여 물 중 0.1 M TEAB(triethylammonium bicarbonate) 용액으로 컬럼을 1 시간 동안 접촉시킨다.
10 단계 - 탈보호의 첫 번째 단계: 탈보호 용액(40 % 수성 메틸아민/농축 수성 암모니아 1 v/v. AMA 시약) 1 ㎖이 지지체를 통과하도록 하여 2-3 회 반복한다. 30 분의 접촉 후 새로운 바이알에 용액을 옮긴다. 동량의 AMA 탈보호 용액으로 지지체를 세척하고 세척물을 결합한다. 결합된 용액과 세척물을 65℃에서 10 분 동안 가열한다. 얼음 위에서 냉각시킨 후, 300-500 ㎕의 부피로 용액을 농축하고, 건조증발시킨다.
11 단계 - 2'-O-TBDMS 보호기의 제거: 건조 EtOH 300 ㎕의 첨가 및 공동 증발에 의해 잔류물을 건조시키고, THF 중 건조 1 M TBAF (tetra-n-butylammonium fluoride) 1 ㎖을 첨가하여 밀봉하고, 16 시간 동안 진탕기에 넣어둔다. 멸균 수성 1 M TEAB (triethylammonium bicarbonate) 1 ㎖로 반응을 퀀칭(Quench)시키고, 용출액으로서 멸균수를 이용하여 NAPTM-25 (핵산 정제) 컬럼 상에서 탈염시킨다. 멸균 2 μm의 필터를 통한 여과는 이 단계에서 필수적일 수 있다. 150 ㎕의 부피로 UV-흡수 분획을 결합 및 증발시키고, 1 M TEAB pH8 100 ㎖를 첨가하여, HPLC 정제를 실시하기 전까지 -20℃에서 냉동 보관 용액에서 보관한다.
12 단계 - HPLC 정제: 11 단계의 1 μmol 스케일 반응 혼합물로부터 반응 산물을 7x25 mm PRP-1 컬럼 (Hamilton)에 로딩하였다. 정제는 3 ㎖/분의 유속으로 50 분에서 0 내지 80% 직선 구배 완충액 B를 사용하여 실시하였다. 완충액 A는 100 mM TEAB이고 완충액 B는 메탄올/물 8:2 v/v 중 100 mM TEAB이다. 24-머(mer) 정제의 전형적인 예는 도 3에 나타내었다. 4 원자 알킬 태그와 디에틸렌글리콜 잔기의 조합은 pppRNA로부터의 기준선 분리에 충분하다. 88.4 ㎖에서의 피크에 해당하는 분획을 결합하여, 건조 메탄올로 여러번의 공동 증발에 의하여 회전 증발기상에서 증발 및 탈염시켰다.
실시예 3
친유성 폴리에테르 복합 태그(lipophilic polyether composite tags)와 전처리된 친유성 폴리에테르 아민을 이용한 pppRNA의 유도체화(Derivatisation)
실시예 3은 구조 ZY-H의 친유성 폴리에테르 아민을 이용하여 ZYNHpppRNA를 생성한다.
파트 A : 친유성 폴리 에테르아민의 경제적인 대규모 제조
이 과정은 플래시 컬럼크로마토그래피없이 실시할 수 있고, 일반적으로 수용성 디아민으로부터의 모노아민(monoamides)과 친유성 카르복실 산의 메틸 에스테르의 합성에 적용할 수 있다.
N-라우릴-4,7,10-트리옥사-1,13-트리데칸디아민(N-Lauryl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine)(화합물 3, 도 14)의 합성: 4,7,10-트리옥사-1,13-트리데칸디아민(43,8 ㎖, 200 mmol)을 32.5 ㎖ 메탄올에 용해시켰다. 라우르 산 메틸 에스테르(4.92 ㎖, 20 mmol)를 교반하면서 서서히 첨가하고, 상기 밀폐 플라스크를 실온에서 5 일 동안 유지하였다. 회전 증발기 상에서 메탄올을 반응 혼합물로부터 제거하고, 잔류물을 100 ㎖ 에틸아세테이트에 용해시켰다.
과량의 디아민을 물(2*120 ㎖)로 추출한 뒤 소디윰 클로라이드(2*100 ㎖)로 농축하여 제거하였다. 상기 에틸아세테이트 상(phase)을 증발시키고 잔류 오일을 -20 ℃에서 정치시켜 결정화하여 순수한 N-라우릴 4,7,10-트리옥사-1,13-트리데칸디아민 6.8 g (17 mmol)을 수득하였다.
파트 B : N-라우릴-4,7,10-트리옥사-1,13-트리데칸디아민과 CPG 결합 RNA 사이클로트리포스페이드(CPG bound RNA cyclotriphosphate)의 개환 반응(Ring opening reactions)
상술한 실시예 2의 1-7 단계에 따라 CPG 결합 RNA 사이클로트리포스페이트 (화합물 4, 도 14)를 합성하였다. RNA 사이클로트리포스페이트가 고정된 고상의 개환 반응을 아세토니트릴 중 N-라우릴-4,7,10-트리옥사-1,13-트리데칸디아민 0.08 M 용액으로 실시하였다. 아세토니트릴 용액을 실온에서 3 시간 동안 CPG와 접촉시킨 후, 지지체는 10 ㎖ 건조 아세토니트릴로 세척하고 아르곤으로 플러싱 건조하였다. 지지체로부터의 절단, 탈보호 및 추가적인 HPLC 처리를 실시예 2의 10-12 단계와 똑같이 실시하였다. 산물 5을 75% 메탄올 농축액으로 용출하였다(도 15A). 반응 혼합물의 MALDI 스펙트럼 분석으로 화합물 5의 구조(Mw 8214.8Da, 도 15B)를 확인하였다.
선택적으로, 해당 트리포스페이트 올리고 뉴클레오티드를 얻기 위해 정제 태그를 제거할 수 있다: 100 nmol N-라우릴 치환 감마 아미드(N-lauryl subtituted gamma amid)(화합물 5, 도 14)을 2 ㎖ 에펜도르프 튜브에 넣은 pH 3.8 탈보호 완충액 400 ㎕에 용해하고, 튜브를 밀봉하여 70 분 동안 60℃로 가열하였다. 이러한 조건은 트리포스페이트 모이어티의 분해없이 화합물 5의 포스포라미데이트 결합(phosphoramidate bond)의 양적 절단을 야기한다. 반응 혼합물을 얼음에서 냉각시키고, 멸균 5M NaCl 용액 14 ㎕ 및 무수 에탄올 1.2 ㎖를 첨가하였다. 원심분리로 침전물을 수집하고, 냉에탄올로 세척하여 Speed Vac으로 건조시키고, 멸균수에 용해하여, -20℃에서 냉동저장하였다.
pppRNA 산물의 예상된 MW을 MALDI 스펙트럼 분석으로 확인하였다(Mw 7832 Da, 도 15C).
실시예 4:
친유성 폴리 에테르 복합 태그와 pppRNA의 유도체화를 위한 온-컬럼(On-column) 접근법
실시예 4는 ZYNHpppRNA를 생성하기 위하여 고정화된 HYNHpppRNA 올리고뉴클레오티드의 온-컬럼 유도체화를 이용하는 2-단계 과정이다.
콜레스테릴-태그 트리포스페이트 RNA(Cholesteryl-tagged triphosphate RNA)의 준비(Chl-CONH-CH2CH2-(O-CH2CH2)2-NH-ppp-RNA, 화합물 4, 도 16)
트리포스페이트 RNA에 대한 친유성 콜레스테릴-태그의 콘쥬게이션(Conjugation)은 RP-HPLC에 의한 비-태그 불순물로부터 태그-pppRNA 산물의 분리를 효율적으로 할 수 있다. 콜레스테릴-태그 트리포스페이트 RNA의 제조에 대한 반응식의 개요는 도 16에 나타내었다. 제 1 단계에서 지지체-결합, 완전 보호된 5'OH-RNA는 실시예 2의 1-7 단계에 기술한 바와 같이 사이클릭 트리포스페이트 중간체(화합물 2, 도 16)로 전환시켰다.
이어서, 컬럼을 무수 아세토니트릴 (3 ㎖)로 세척하였다. 2,2'-(에틸렌디옥시)디에틸아민 (화합물 1, 도 16; 1,2 mmol) 176 ㎕을 무수 아세토니트릴 (1 ㎖)에 용해시키고, 상기 용액을 컬럼 내 지지체와 접촉시켰다. 3 분 후, 컬럼을 무수 아세토니트릴 (3 ㎖) 및 무수 디클로로메탄 (6 ㎖)로 세척하였다.
이어서, 무수 디클로로메탄 (5 ㎖) 중 콜레스테릴 클로로포르메이트(36 ㎎, 80 μmol), N,N-디이소프로필에틸아민 (13,9 ㎕, 40 μmol) 및 4-디메틸아미노피리딘(4,9 ㎎, 40 μmol)의 전-혼합 용액으로 아미노-변형 트리포스페이트 (즉, 화합물 3, 도 16)를 15 분 동안 처리하였다. 컬럼을 무수 디클로로메탄 (3 ㎖) 및 무수 아세토니트릴 (6 ㎖)로 세척하고, 아르곤 대기 하에서 건조시켰다. 지지체로부터의 절단 및 탈보호를 위하여, 두개의 주사기를 이용하여 유도체화된 올리고뉴클레오티드를 40% 수성 메틸아민과 농축 수성 암모니아(AMA, 1:1, v/v, 2 ㎖)의 새로 제조된 용액과 접촉시켰다. 30 분 절단 시간 후, 용액을 스크류 캡 바이알에 옮기고, 65℃에서 10 분 동안 가열하여 건조 증발시켰다. 잔류물을 무수 에탄올로 공동-증발시켜 건조시키고, 16 시간 동안 진탕하면서 THF 중 1M 테트라-n-부틸암모늄 플루오라이드 (1 ㎖, 1 mmol)로 처리 하였다. NAP-25 컬럼에서 탈염한 후 완전 탈보호된 콜레스테릴-태그 트리포스페이트 올리고뉴클레오티드를 역상 컬럼을 사용하여 HPLC로 정제하였다(Hamilton PRP-1, 4.1x250 mm, 도 17A). 화합물 4를 95% 메탄올 농도에서 용출하고 예상 구조를 MALDI 분석으로 확인하였다(Mw 8370,6 Da, 도 17C).
선택적으로, 실시예 3에서 상술한 동일 절차에 따라 60℃에서 pH 3.8에서 산 가수 분해로 콜레스테릴-태그를 제거하여 해당하는 트리포스페이트 올리고뉴클레오티드(화합물 5, 도 16)를 수득한다.
실시예 5: 2'-O-메틸화(methylation)의 시스템 도입은 RIG-I 선택적 RNA 이합체(RIG-I selective RNA duplex)를 야기한다
약어와 그 의미의 리스트는 본 명세서의 말미에서 확인할 수 있다.
자가 RNA(body's own RNA)는 RNA 기능(tRNAs 및 rRNAs)에 영향을 미칠 수 있는 복수의 변형에 의한 것을 특징으로 한다. 따라서, 2'-O-메틸화는 RNA의 면역원성(immunogenicity)을 변형시킬 수 있다. 따라서, 선택적 RIG-I 리간드는 가닥 당 하나 이상의 2'-O-메틸화를 포함해서는 안된다. 이러한 특성은 적절하게 메틸화된 센스 및 안티센스 가닥의 조합에 의해 RNA 이합체에 포함된다.
2'-O-메틸화의 스크린(screen)은 RIG-I의 선택성이 도입되는 위치(position)를 해결하였다(도 5). OH-GFP2의 센스 (A) 및 안티센스 (B) 가닥에 대하여, 전체 2'-O-메틸화 스크린을 실시하였다. 각 위치를 2'-O-메틸화에 의해 개별적으로 변형하여 RIG-I, TLR7 또는 TLR8의 자극에 이용하였다. RIG-I의 자극을 위하여, PBMC(blood mononuclear cells)를 클로로퀸(Chloroquine)으로 블록킹하고, 이합체의 리포펙션으로 자극하였다. IFNα를 ELISA로 20h 시간 자극 후를 측정하였다. TLR7과 TLR8만을 위하여, 적절한 단일-가닥을 자극 능력에 대하여 스크리닝하여 비블록킹된 PBMC를 확인하였다. 폴리-L-아르기닌으로의 복합체형성(complexation)으로 단일-가닥을 형질전환시키고, 형질전환 20 시간 후 TLR7 활성화 IFNα, TLR8 활성화 IL12p70를 ELISA에 의해 측정하였다. 센스 가닥에 대한 GFP2와의 100% 유도는 RIG-I에 대하여 3085 pg/㎖ IFNα, TLR7에 대하여 2758 pg/㎖ IFNα및 TLR8에 대하여 1206 pg/㎖ IL12p70에 해당한다. 안티센스 가닥에 대한 GFP2의 100%는 RIG-I에 대하여 2342 pg/㎖ IFNα, TLR7에 대하여 1831 pg/㎖ IFNα및 TLR8에 대하여 3018 pg/㎖ IL12p70에 해당한다. 2'-O-메틸화의 위치 의존적 도입의 영향의 개요는 표 에 나타내었다(도 5). 레퍼런스로서 비변형 가닥으로 효과들을 정규화하였다. 흰색=변화없음, 노란색=면역 자극의 감소, 적색=면역 자극 없음, 녹색=증가된 면역 자극.
또한, 특정 메틸화가 이합체를 RIG-I 특이적이고 활성을 높이는 것으로 나타 날 수 있다.
도 6: (A) RIG-I 활성화를 위한 메틸화 불활성(inert)은 안티센스 가닥에 결합하고, 생성된 이합체는 0,8 ㎍/㎖의 농도로 클로로퀸-블록킹 PBMC의 자극에 이용하였다. IFNα는 20 시간 자극 후 ELISA에 의해 측정하였다. OH-GFP2의 100%는 2729 pg/㎖ IFNα와 유사하다. (B) 센스 및 안티센스 가닥에서의 2'-O-메틸화의 상이한 조합으로 혼성화하여 PBMC의 자극에 이용하였다. RIG-I의 자극을 위하여 이것들을 클로로퀸으로 블록킹하여 리포펙타민으로 형질전환시키고, TLR7과 TLR8을 위하여 비블록킹된 PBMC를 이용하고 폴리-L-아르기닌으로 복합된 이합체로 형질전환시켰다. IVT-2에 대한 100%는 RIG-I에 대한 4861 pg/㎖ IFNα에 해당하고, 9.2S에서의 100%는 TLR7에 대하여 1975 pg/㎖ IFNα, TLR8에 대하여 771 pg/㎖ IL12p70에 해당한다. (A) 및 (B)는 3 공여체(donor)의 평균±SEM으로 나타낸다.
실시예 6: RNA-안정화 변형(RNA-stabilising modifications)의 삽입에 의한 RIG-I 활성화의 증가
siRNA 치료 동안 짧은 dsRNA 단편이 체내에 삽입되어, 이것들이 타겟 세포 내 특정 단백질의 형성을 억제한다. 이러한 형태의 치료의 문제점은 siRNA 이합체의 거대한 불안정성이다. RNA는 타겟 세포로 이동하는 동안 혈청에 있는 엑소뉴클레아제(exonucleases) 및 엔도뉴클레아제(endonucleases)에 의해 분해될 수 있다.
이 치료 목적으로 사용되는 외인성(exogenous) RNA의 상당 부분은 투여되는 대상의 혈청 및 세포질에서 분해될 가능성이 있을 것으로 보인다.
각각의 5'-PTO 변형은 이합체 면역 활성에 긍정적인 효과가 있고, 센스 및 안티센스 가닥에서의 5'PTO의 조합은 활성에 있어 최대 증가를 야기한다는 것을 보여줄 수 있다(s15 PTO/as3에 대한 PTOs15/as3; 도 7B). 따라서, RIG-I 선택적 리간드에서 RNA 백본의 변형과 같은 이용은 유리한 것으로 간주될 수 있다.
특히, 5'-포스포로티오에이트가 선택적 이합체의 면역원성을 증가시킨다는 것을 보여준다.
도 7: (A) PBMC를 클로로퀸으로 블로킹하고 0,8 ㎍/㎖ 농도의 이합체로 자극 하였다. 20 시간 자극 후 IFNα를 ELISA에 의해 측정하였다. IVT2의 100%는 6138 pg/㎖ IFNα에 해당한다. (B) 표시된 이합체를 적정하여 RIG-I의 자극에 이용하였다. PBMC를 클로로퀸으로 블록킹하고 이합체는 리포펙타민을 이용하여 형질전환시켰다. 20 시간 자극 후 IFNα를 ELISA에 의해 상층액에서 산출하였다. 50 nM 3P-GFP2의 100%sms 16044 pg/㎖ IFNα에 해당한다. 결과들은 4 공여체의 평균±SEM으로 나타낸다.
치료용 siRNA의 개발에 있어 혈청 안정성의 문제는 또 다른 종류의 변형에 의해 해결되었다: 2'-플루오로 치환이 RNA에 도입되면, 그 결과물인 RNA는 뉴클레아제 절단에 대하여 보다 안정적이었다. 그러나 RIG-I 의존적 면역 자극의 경우 2'-플루오로 치환은 면역 자극을 활성화할 수 있음이 관찰되었다.
특히, 5'-포스포로티오에이트가 선택적 이합체의 면역원성을 증가시킨다는 것을 보여준다.
그러나, 본 발명에 따르면, 선택된 2'-플루오로 치환이 이합체의 RIG-I 활성화 전위를 증가시킨다는 것을 확인하였다.
이합체의 센스 (A) 및 안티센스 (B) 가닥을 위하여, 각각 위치는 개별적으로 2'-플루오로-치환하여 변형시켰다(도 8). 얻어진 이합체는 0,8 ㎍/㎖의 농도로 PBMC의 자극에 이용하였다. RIG-I 활성화의 평가를 위하여 PBMC를 블록킹하여 리포펙타민으로 형질전환시키고, TLR7 및 TLR8의 자극을 위하여 PBMC를 이용하여 비블록킹하고 폴리-L-아르기닌으로 복합된 이합체로 형질전환시켰다. 20 시간 자극 후 사이토카인을 ELISA로 측정하였다. 센스 가닥의 GFP2에 대한 100%는 RIG-I에 대하여 2407 pg/㎖ IFNα, TLR7에 대하여 3281 pg/㎖, TLR8에 대하여 1990 pg/㎖과 유사하다. 안티센스 가닥의 경우 100% GFP2는 RIG-I에 대하여 4512 pg/㎖ IFNα, TLR7에 대하여 4691 pg/㎖ IFNα, TLR8에 대하여 1997 pg/㎖ IL12p70에 해당한다. 표시는 4 공여체의 평균±SEM이다.
따라서, 강한 활성에 의한 RNA의 손실을 보상할 수 있을 만큼 활성화되는 이합체를 확립하는 것이 매우 중요하다. 이전 단락에서 RNA 변형이 선택적 PTO 결합 및 2'-플루오로 치환에 의해 식별될 수 있는 방법을 설명하였고, 이는 이합체의 활성화에 있어 증가를 야기한다.
실시예 7: 모든 변형의 조합은 강한 면역원성 RIG-I 리간드를 야기한다
PTO 결합 또는 2'-플루오로 치환이 2'-O-메틸화와 결합되어 선택성을 증가시킬 수 있는지 테스트하기 위해서, 이합체 단계별로 결합하였다.
PBMC를 클로로퀸으로 블록킹하여 RIG-I의 자극에 이용하였다. OH-GFP2에 기반한 차별적 변형 이합체를 이용하고 RIG-I의 활성화는 20 시간 자극 후 ELISA에 의해 IFNα에 대하여 측정하였다(도 9). 다중 변형 이합체(Multiply modified duplexes)는 OH-GFP2 (A)에 또는 트리포스포릴화된 3P-GFP2 (B)와 비교하였다. IVT 4의 100%는 INFa의 21305 pg/㎖에 해당한다. 표시는 2 공여체의 평균±SEM이다.
RNA OH-GFP2를 개시하기 위하여, 먼저 2'-O 메틸화 s15/as3를 첨가한 다음 센스 및 안티센스(OH-GFP2 PTO 5', 도 9A)의 PTO 변형과 비교하였다(OH-GFP2 oMet15s/oMet3as, 도 9). 이어서, 변형의 두 종류 모두를 이합체와 결합시켰다(OH-GFP2oMet15/oMet3 PTO, 도 9A). 최종적으로, 센스 내 7과 23 위치 및 안티센스 내 13 위치에 있는 3 개의 2'-플루오로 치환을 추가적으로 포함하는 이합체가 생성되었다(OH-GFP2oMet15 /3-F23/13-PTO, 도 9). 이러한 RNA 이중-가닥의 비교 적정은 다중-변형 올리고 OH-GFP2oMet15/3-F23/13-PTO가 활성에 있어 지금까지 다른 이합체들을 능가하는 것으로 나타났다. 활성의 더 나은 평가를 위해, 이합체를 적정하고 그의 비변형된 트리포스페이트 이합체와 비교하였다(도 9B). 변형의 삽입은 올리고뉴클레오티드를 변화시켜 그의 트리포스페이트 등가물(equivalent)과 비교하여 그의 면역 활성을 변화시킬 수 있다는 것을 발견하였다(3P-GFP2, 도 9B).
실시예 8: 요소들은 3P-dsRNA 시스템에 전달가능하다.
RIG-I 선택적 리간드의 전체 개발을 서열 GFP2의 OH 수준에 대하여 실시하였다. 활성은 적합한 변형에 의해 상당히 증가될 수 있으나, 리간드의 트리포스포릴화은 추가적으로 그 활성을 증가시킬 수 있다.
지금까지 상기 변형 및 이들의 각 위치가 3P-GFP2 시스템에 전달될 수 있는지의 여부는 명확하지 않았다.
이러한 질문에 대한 답을 찾기 위하여 이합체를 제조하였고, 이는 활성을 증가시키는 모든 변형을 가졌다: 센스 가닥 내 15 염기의 2'-O 메틸화, 7과 23 염기의 2'-플루오로 치환 및 5'과 3' 말단의 2 개의 PTO 결합(2S2F, 도 10). 안티센스가닥에서 3 염기의 2'-O 메틸화, 13 염기의 2'-플루오로 치환 및 2 개의 5'-PTO 결합을 조합하였다. 센스 가닥에 있는 2 개의 5'-PTO 결합이 그들의 트리포스페이트에 대한 근접성(proximity)에 의해 중단되는 것을 방지하기 위하여, 5'-PTO가 없는 다중-변형 센스 가닥을 추가적으로 제조하였다(1S2F, 도 10).
트리포스포릴화에 의한 활성에 있어 이득을 산정할 수 있도록 하기 위해, 이합체는 각각 5'-하이드록실 및 5'-트리포스페이트로 제조하고(OH vs 3P, 도 10) PBMC에 대한 자극 적정에 의해 서로 비교하였다.
도 10: (A) 다중변형된 이합체를 트리포스페이트와 함께 또는 없이 합성하였다. 클로로퀸 블록킹된 PBMC에 대하여 용량 적정을 실시하였다. 20 시간 면역 자극 활성 후 IFNα를 ELISA에 의해 측정하였다. 표시는 4 공여체의 평균±SEM이다. (B) 적정 곡선을 기반으로 하여 생물학적 EC50 값을 계산하였다.
다중-변형 OH 이합체는, 1 개 또는 2 개의 PTO 말단의 존재와 상관없이, OH-GFP2 비변형된 형태의 활성 한계에 도달할 수 있다는 것을 발견하였다(OH Multi 1S2F, OH Multi 2S2F, OH-GFP2, 도 10). 센스 가닥의 5'-트리포스페이트 추가는 하이드록시 복합체에 비해 5 배 활성의 추가적인 증가를 야기하였다(3P-Multi 1S2F, 3P-Multi 2S2F, 도 10).
그 결과, 다양한 변형의 활성-증가 효과를 올리고뉴클레오티드의 트리포스포릴화과 조합할 수 있고, 또한, 이들이 긍정적인 영향을 보여준다는 것을 관찰 하였다.
선택성(2'-O 메틸화)의 수준에 있어서 본래 이합체 OH-GFP2의 점진적 증가, 안정화시키는 변형(PTO 결합 및 2'-플루오로 치환)에 의한 활성의 증가 및 결합 포켓(트리포스페이트)에 대한 친화성에 의하여, 강력한 선택적 RIG-I 리간드 (3P-Multi 1S2F)를 정의하는 것이 가능하게 되었다.
최종적으로, 3P-dsRNA를 개발할 수 있었고, 면역-자극 활성은 변형의 특정 삽입에 의하여 최대로 증가하였다. 면역원성의 이러한 증가는 낮은 수준에서 약제의 투여량을 유지하고, 세포내 진입할 때까지 약제의 적용으로부터의 기간에 발생하는 RNA의 손실을 보상 할 수 있도록 한다.
RNA 올리고뉴클레오티드
Figure 112015041082667-pct00006
Figure 112015041082667-pct00007
Figure 112015041082667-pct00008
Figure 112015041082667-pct00009

Claims (20)

  1. 5' GACGCUGfACCCUGAAmGUUCAUCPTOUfPTOU 3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 센스가닥(sense strand); 및 3' CUGmCGACUGGGACfUUCAAGUAGPTOAPTOA 5'의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 가닥(antisense strand)을 포함하는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)로서,
    상기 m으로 색인된 뉴클레오티드는 2'-O-메틸화된 것이며;
    상기 f로 색인된 뉴클레오티드는 2'-플루오로(fluoro)이고;
    두 뉴클레오티드 사이의 상기 색인 PTO는 상기 두 뉴클레오티드가 포스포티오에이트 결합에 의하여 연결되는 것을 나타내고; 및
    상기 센스 가닥은 5' 말단에 트리포스페이트를 포함하는 것인, 올리고뉴클레오티드.
  2. 5' GPTOAPTOCGCUGfACCCUGAAmGUUCAUCPTOUfPTOU 3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 센스가닥(sense strand); 및 3' CUGmCGACUGGGACfUUCAAGUAGPTOAPTOA 5'의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 가닥(antisense strand)을 포함하는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)로서,
    상기 m으로 색인된 뉴클레오티드는 2'-O-메틸화된 것이며;
    상기 f로 색인된 뉴클레오티드는 2'-플루오로(fluoro)이고;
    두 뉴클레오티드 사이의 상기 색인 PTO는 상기 두 뉴클레오티드가 포스포티오에이트 결합에 의하여 연결되는 것을 나타내고; 및
    상기 센스 가닥은 5' 말단에 트리포스페이트를 포함하는 것인, 올리고뉴클레오티드.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오티드는 RIG-I 리간드인 것인, 올리고뉴클레오티드.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오티드는 RIG-I 리간드인 것인, 올리고뉴클레오티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드를 포함하는 면역증강용 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 복강내(intraperitoneally), 근육내(intramuscularly), 정맥내(intravenously), 비강내(intranasally), 피하(subcutaneously), 피내(intradermally) 또는 막내(intrathecally)로 투여되는 것인, 약학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 피내(intradermally) 투여되는 것인, 약학적 조성물.
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