CN119285688A - 修饰的核苷酸单体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一类核苷酸单体化合物及其在核酸干扰(RNAi)药物分子中的应用。在siRNA反义链种子区引入本发明核苷酸单体后，能够显著降低反义链种子区潜在的脱靶效应，并能保持或提升siRNA的活性，从而对靶基因mRNA进行更高选择地沉默，扩大siRNA药物的安全窗口，能提升siRNA的成药性，从而可以更加有效地治疗因靶基因mRNA引起的相关疾病。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学领域，具体涉及一种修饰的核苷酸单体及其在siRNA分子中的用途。
背景技术
近年来，在siRNA成药方面取得了相当程度的进展。siRNA作为药物活性成分已为公众所知，RNA干扰其对应的siRNA作用机制是以一种核酸内切酶复合物为特征介导的RNA干扰方式。从基因水平上，通过siRNA几乎可以治疗所有的疾病，包括肿瘤、传染病、遗传性疾病等，因而siRNA已成为最热门的生物医药研究领域。理论上，siRNA疗法可以靶向任何致病基因组中的靶基因，有着强力和持久的作用疗效，可以显著降低给药频率，提高患者用药的依从性，从而达到更好的治疗效果。
研究表明，RNAi脱靶效应的一个主要因素是与靶点mRNA结合的siRNA序列中的部分片段可能起到像微RNA(miRNA)一样的功能，它们可以与其它mRNA的3’-端非转录区(3’-UTR)相结合，抑制mRNA的翻译和稳定性。而miRNA主要通过种子区域(5'-末端的位置2-8位)与靶mRNA之间的碱基配对识别靶基因的。研究也表明由siRNA引起的脱靶效应主要源自siRNA的反义链种子区域与一个或多个mRNA的碱基互补性。因此，反义链种子区域的序列可能影响多种基因的表达，成为RNAi药物副作用的主要因素。
为了有效解决反义链种子区的脱靶效应，Alnylam通过对位于种子区的核苷酸单体进行修饰，找到了一类新型核苷单体(甘油核酸，Glycerol Nucleic Acid，简称GNA)，引入到siRNA反义链种子区后，能够减低RNAi的脱靶效应，提高药物的安全性。因此，反义链种子区的脱靶效应是可以通过对其区域内的核苷单体修饰得到合理解决的。
本发明通过药物化学手段，合成经修饰后的核苷酸单体，并通过磷酸二酯键链接方式引入到siRNA反义链种子区的特定位置，这种对siRNA序列的修饰，能够对siRNA靶基因的沉默效应不受影响的同时，显著减低了siRNA的脱靶效应，扩大了siRNA药物分子的安全窗口。因此，本发明对siRNA药物的开发和临床应用具有十分重要的价值。
发明内容
为解决上述问题，本发明旨在提供一种新型修饰核苷酸，能够提高RNAi药物分子对靶基因沉默的选择性，降低脱靶效应。
一方面，本发明提供了一种具有式I所示结构的核苷酸单体化合物，或其氘代化合物、或其氟代化合物、或其可用的盐：
其中：
Bx为非常规碱基；
R为羟基保护基团；优选地，R选自4,4’-双甲氧基三苯甲基，4-甲氧基三苯甲基；
Sug为核糖环或核糖替代环；
n为0～3；m为0～3；
Z为磷酸酯部分、硫代磷酸酯部分或亚磷酰胺部分。
进一步地，
Sug选自如下结构：
其中，aa端与Bx端相连，bb端与OR端相连，cc端与Z端相连；
X选自O或S；
Y选自氢、卤素、叠氮基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、-O-(C1-C6亚烷基)-O-(C1-C6烷基)、-O-(C1-C6亚烷基)-C(O)NRY1RY2；
RY1、RY2分别独立选自氢、C1-C6烷基、环烷基。
在本发明的一些实施方案中，式I所示的化合物如式II或式III所示：
其中，
Bx为非常规碱基；
X选自O或S；
n为0～3；m为0～3；
R为羟基保护基团；优选地，R选自4,4’-双甲氧基三苯甲基，4-甲氧基三苯甲基；
Y选自氢、卤素、叠氮基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、-O-(C1-C6亚烷基)-O-(C1-C6烷基)、-O-(C1-C6亚烷基)-C(O)NRY1RY2；
RY1、RY2分别独立选自氢、C1-C6烷基、环烷基。
Z为磷酸酯部分、硫代磷酸酯部分或亚磷酰胺部分。
在本发明的一些实施方案中，式I所示的化合物如式IV所示：
Bx为非常规碱基；
R为羟基保护基团；优选地，R选自4,4’-双甲氧基三苯甲基，4-甲氧基三苯甲基；
n为0～3；m为0～3；
Z为磷酸酯部分、硫代磷酸酯部分或亚磷酰胺部分。
在本发明的一些实施方案中，所述的非常规碱基为除常规核苷碱基之外的非常规嘌呤、嘧啶或含氮杂环碱基；
优选地，
非常规碱基选自A环、B环或A环B环相互稠合、桥合而成的环；
A环、B环分别独立选自五元、六元或七元杂环；
A环B环相互稠合、桥合而成的环如式V所示：
其中,
A环、B环分别独立为五元、六元或七元环杂环；
所述杂环含有0～3个O、S或N原子；
A环、B环或A环B环相互稠合、桥合而成的环任选被C1-C6烷基或环烷基、苯基、C1-C3烷基取代的苯基或者卤代苯基取代。
在本发明的一些实施方案中，所述非常规碱基的具体结构如下：
ssdd；其中，R、R0选自氢、C1-C6烷基、C3-C6环烷基。
在本发明的一些实施方案中，所述非常规碱基的具体结构如下：
在本发明的一些实施方案中，所述非常规碱基的具体结构如下：
在本发明的一些实施方案中，
R选自氢或DMT；
m为0；n为0或1；
Y为甲氧基；
Z为在本发明的一些具体实施方案中，所述化合物具体为：
本发明还提供了任一上述的核苷酸单体化合物在制备寡核苷酸中作为中间体的用途；优选地，所述寡核苷酸为siRNA。
在本发明的一些实施方案中，提供所述的核苷酸单体化合物作为中间体在制备siRNA反义链种子区中作为中间体的用途。
另一方面，本发明还提供了一种siRNA，其包含正义链和反义链；所述正义链和反义链各自包含15至45个修饰或未修饰的核苷酸，正义链和反义链部分互补形成双链区；其中，所述反义链的种子区中至少含有一个具有式VIa或式VIb所示的结构的核苷酸，并在位点与siRNA其余部分共价连接：
其中：
X分别独立选自O或S；
Y选自氢、卤素、叠氮基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、-O-(C1-C6亚烷基)-O-(C1-C6烷基)、-O-(C1-C6亚烷基)-C(O)NRY1RY2；
RY1、RY2分别独立选自氢、C1-C6烷基、环烷基；
Bx为非常规碱基；
n为0～3。
优选地，式VIa或式VIb所示的结构的核苷酸位于反义链的第2、3、4、5、6、7、8位。
再一方面，本发明还提供了一种siRNA，其包含正义链和反义链；所述正义链和反义链各自包含15至45个修饰或未修饰的核苷酸，正义链和反义链部分互补形成双链区；其中，所述反义链的种子区中至少含有一个具有式VIc所示的结构的核苷酸，并在位点与siRNA其余部分共价连接：
其中，
X分别独立选自O或S；
Bx为非常规碱基；
n为0～3。
优选地，式VIc所示的结构的核苷酸位于反义链的第2、3、4、5、6、7、8位。
在本发明的一些实施方案中，所述的非常规碱基为除常规核苷碱基之外的非常规嘌呤、嘧啶或含氮杂环碱基；
优选地，
非常规碱基选自A环、B环或A环B环相互稠合、桥合而成的环；
A环、B环分别独立选自五元、六元或七元杂环；
A环B环相互稠合、桥合而成的环如式V所示：
其中,
A环、B环分别独立为五元、六元或七元环杂环；
所述杂环含有0～3个O、S或N原子；
A环、B环或A环B环相互稠合、桥合而成的环任选被C1-C6烷基或环烷基、苯基、C1-C3烷基取代的苯基或者卤代苯基取代。
在本发明的一些实施方案中，所述非常规碱基的具体结构如下：
其中，R、R0代表自氢、C1-C6烷基、C3-C6环烷基。
在本发明的一些实施方案中，所述非常规碱基的具体结构如下：
在本发明的一些实施方案中，
X为O或S；
n为0或1；
Y选自甲氧基或-OCH2CH2OCH3。
在本发明的一些实施方案中，所述碱基修饰的核苷酸的碱基选自如下结构：
在本发明的一些具体实施方案中，所述siRNA中式VIa或式VIb或式VIc所示的结构具体为：
本发明还提供了一种药物组合物，包含任一上述的siRNA以及药学上可接受的载体。
本发明还提供了一种siRNA缀合物，由任一上述的siRNA和缀合分子缀合而成。
本发明还提供了一种试剂盒，包含任一上述的siRNA、和/或上述的药物组合物和/或上述的siRNA缀合物。
本发明还提供了任一上述的siRNA,、和/或上述的药物组合物、和/或上述的siRNA缀合物、和/或上述的试剂盒在制备药物中的用途。
另一方面，本发明还提供了一种抑制细胞中目标基因表达水平的方法，所述方法包括将有效量的本发明的siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物与所述细胞接触。
本发明的修饰核苷酸能够提高RNAi药物分子对靶基因沉默的选择性，降低脱靶效应。
在siRNA反义链种子区引入本发明核苷酸单体后，能够显著降低反义链种子区潜在的脱靶效应，并能保持或提升siRNA的活性，从而对靶基因mRNA进行更高选择地沉默，扩大siRNA药物的安全窗口，能提升siRNA的成药性，从而可以更加有效地治疗因靶基因mRNA引起的相关疾病。
本发明所述，“核糖基替代基”是指能够替代天然存在的核糖核苷酸的五元呋喃糖环的结构，例如吗啉基、环己烯基、环己六醇、或开环的结构等。
本发明所述的修饰核苷酸能改善siRNA药物分子的成药性。在一些实施方案中，本发明所述的修饰核苷酸可增强siRNA降解靶基因的效果。因此，本发明所述的修饰核苷酸对于siRNA沉默，可增强其药效作用。
本发明提供的siRNA缀合物由siRNA和缀合分子缀合而成，包含有本发明的siRNA以及缀合连接至该siRNA的缀合基团，所述缀合基团包含接头和药学上可接受的靶向基团和/或递送辅助基团，并且，所述siRNA、所述接头和所述靶向基团或者所述递送辅助基团依次共价或非共价连接，每个所述靶向基团选自能够和细胞表面受体结合的配体，每个递送辅助基团选自能够增加所述siRNA缀合物在递送目标器官或组织中的生物相容性的基团。
在一些实施方案中，包含本发明所述的修饰核苷酸的siRNA药物是双链的。就双链siRNA药物而言，所述siRNA药物的正义和反义链的长度独立地为15-45个核苷酸。在一些实施方案中，双链siRNA药物包含彼此至少部分互补(至少70％互补)的正义链和反义链。反义链包含具有与靶mRNA中的序列完美互补(100％互补)或至少部分互补(至少85％互补)的序列的区域。正义和反义链可以是相同长度也可以是不同长度。
在一些实施方案中，正义链的长度为约19个核苷酸，而反义链的长度为约21个核苷酸。在一些实施方案中，正义链的长度为约21个核苷酸，而反义链的长度为约23个核苷酸。正义链和反义链之间的完美或部分互补区域通常为15-25个核苷酸的长度，且位于反义链的5’-末端或附近(例如该区域距离反义链的5’-末端1、2、3或4个核苷酸，其不完美或部分互补)。
就双链siRNA药物而言，如果存在其它的正义链核苷酸，则其可以与靶mRNA中的相应序列相同或不相同。如果存在其它的反义链核苷酸，则其可以与相应的正义链的其它核苷酸(如果存在的话)互补或不互补。
在一些实施方案中，本发明所述的包含所述修饰核苷酸的双链siRNA药物的正义链和反义链含有相同数量的核苷酸。在一些实施方案中，本发明所述的siRNA药物的正义和反义链含有不同数量的核苷酸。
在一些实施方案中，正义链和反义链均含有1至4个硫代磷酸酯连接。
在一些实施方案中，本发明的siRNA中，每个核苷酸均是修饰或未修饰的核苷酸。在本公开的上下文中，所使用的术语“修饰的核苷酸”是指核苷酸的核糖基2'位羟基被其他基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物，或者核苷酸上的碱基是经修饰的碱基的核苷酸。所述修饰的核苷酸不会导致siRNA调节基因表达的功能明显削弱或丧失。例如，可以选择J.K.Watts，G.F.Deleavey，and M.J.Damha，Chemically modified siRNA:tools andapplications.Drug Discov.Today，2008，13(19-20):842-55中公开的修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，包含所述修饰核苷酸的siRNA药物抑制细胞、组织或体内中的靶mRNA的表达。在一些实施方案中，将治疗有效量的包含本发明所述的修饰核苷酸的siRNA药物给予体内，从而抑制体内中的靶mRNA的表达。
在一些实施方案中，所述siRNA药物用于治疗、预防或控制与靶mRNA的表达有关的临床表现。在一些实施方案中，将治疗或预防有效量的一种或多种siRNA药物给予需要这种治疗、预防或控制的对象。
本发明所述的包含所述修饰核苷酸的siRNA药物以及包含本发明所述的siRNA药物的组合物，可以使用本领域已知的寡核苷酸递送技术递送至细胞、肿瘤、组织或对象。一般来说，可以将本领域适合于(在体外或体内)递送核酸分子的任意方法，应用于本发明所述的包含一个或多个修饰核苷酸的siRNA药物。
在一些siRNA药物为双链的实施方案中，靶向性配体或靶向性基团、连接基团或递送载体与正义链共价连接形成缀合物。在一些实施方案中，靶向性配体、连接基团和/或递送载体直接地或通过接头间接地与正义链的3’或5’末端连接。
在一些实施方案中，靶向性配体或靶向性基团含有二到四个末端N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)，其与包含一个或多个所述修饰核苷酸的siRNA药物连接。已知三触角型(GalNAc)结合ASGPR的亲和性大于二触角型或单触角型结构(Connolly等，J.Biol.Chem.,1982,257,939-945)。
关于本发明的使用术语的定义：除非另有说明，本文中基团或者术语提供的初始定义适用于整篇说明书的该基团或者术语；对于本文没有具体定义的术语，应该根据公开内容和上下文，给出本领域技术人员能够给予它们的含义。
本发明中，如无特别说明，大写字母C、G、U、A、T表示核苷酸的碱基组成，包括修饰和未修饰的核苷酸；m表示与该标识m右侧相邻的一个核苷酸为2’-甲氧基核苷酸；f表示与该标识f右侧相邻的一个核苷酸为2’-氟核苷酸；d表示与该标识d右侧相邻的一个核苷酸为2’-脱氧核苷酸；gn表示表示与该标识gn右侧相邻的一个核苷酸为甘油核苷酸(GNA)；标识*表示与该标识*左右相邻的两个核苷酸之间(或核苷酸与接头-靶向配体部分之间)为硫代磷酸酯基连接；eVP表示与其右侧相邻的一个核苷酸是(E)-乙烯基磷酸酯修饰的核苷酸；iab表示反向脱碱基残基。
本发明中“寡核苷酸”指连接的核苷的聚合物，其中每一个核苷可独立地被修饰或不被修饰，包含有约10-50个单链核苷酸或双链核苷酸碱基对的寡聚核苷酸序列。在一些实施方案中，寡核苷酸具有与细胞内表达的靶基因核心序列至少部分互补的核碱基序列。在一些实施方案中，寡核苷酸在递送至表达基因的细胞后，能调控相应靶基因的表达。靶基因表达可以在体外或体内被调控。“寡核苷酸”包括但不限于：单链反义寡核苷酸、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、核酶、干扰性RNA分子和dicer酶底物。
本发明中“siRNA”是指含有能够以序列特异性方式降低或抑制信使RNA(mRNA)翻译的RNA或RNA类(例如化学修饰的RNA)寡核苷酸分子。
本发明中“种子区”是指寡核苷酸序列中从5’-端开始的第2个碱基到第8个碱基的特定区域。
siRNA可以通过RNA干扰机制(例如通过与哺乳动物细胞的mRNA干扰通路机制(RNA诱导沉默复合物RISC)的相互作用来诱导mRNA降解)、或其它任意机制或通路发挥作用。虽然认为本发明所用的术语siRNA药物主要通过RNA干扰机制发挥作用，但所述siRNA药物并不受限于或局限于任何特定的作用通路或机制。siRNA药物包括但不限于：单链反义寡核苷酸、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)和dicer酶底物。本发明所述的siRNA药物由具有与作为靶标的mRNA至少部分互补的寡核苷酸链构成。在一些实施方案中，本发明所述的siRNA药物是双链的，且由反义链和与该反义链至少部分互补的正义链构成。
术语“沉默”、“减少”、“抑制”、“下调”、或“敲减”指给定的基因表达时，用本发明所述的siRNA药物分子处理细胞、组织、器官或动物体内直接给药时，与未经如此处理的细胞、组织、器官或动物体内给药相比，基因的表达水平有所减少或降低。
术语“序列”或“核苷酸序列”是指核碱基或核苷酸的顺序或次序，使用标准核苷酸命名法以字母顺序表示。
术语“杂环碱基”是本发明所定义的核碱基或修饰核碱基。在一些实施方案中，杂环碱基部分是嘧啶、取代的嘧啶、嘌呤或取代的嘌呤以及含氮杂环。在一些实施方案中，杂环碱基部分是非常规的嘌呤或取代的嘌呤。在一些实施方案中，杂环碱基部分是非常规的嘧啶或取代的嘧啶。在一些实施方案中，杂环碱基部分含有非天然五元含氮杂环。在一些实施方案中，杂环碱基部分可以包含一个或多个保护基团。
本发明中“核苷酸碱基”或“核碱基”是杂环嘧啶或嘌呤化合物，其中“常规核苷碱基”包括腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)常规核苷酸的碱基。核碱基可以被修饰或被新型非常规核碱基替代。核苷酸碱基包括天然存在的核苷酸碱基以及非天然存在的核苷酸碱基。这对本领域技术人员来说应该是很明显的，即以前认为是“非天然存在的”各种核苷酸碱基后来在自然界均已发现。因而，“核苷酸碱基”不仅包括已知的嘌呤和嘧啶杂环，而且还包括其杂环类似物和互变异构体。核苷酸碱基的示范性例子有腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、嘌呤、黄嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-N6-甲基腺嘌呤、7-二氮杂黄嘌呤、7-二氮杂鸟嘌呤、N4，N4-桥亚乙基胞嘧啶、N6，N6-桥亚乙基-2,6-二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-(C3-C6)-炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假异胞嘧啶、2-羟基-5-甲基-4-三唑吡啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、肌苷和描述于Benner等的美国专利号5432272中的“非天然存在的”核苷酸碱基。术语“核苷酸碱基”包括这些例子中的每一种和全部及其类似物和互变异构体。特别重要的核苷酸碱基有腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶，它们被认为是与人类治疗学和诊断学应用有关的天然存在的核苷酸碱基。
术语“互补”在用于描述第一核苷酸序列(例如siRNA药物正义链或靶标mRNA)和第二核苷酸序列(例如单链反义寡核苷酸或双链siRNA药物反义链)之间的关系，是指包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多寡核苷酸与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多寡核苷酸在某些条件下杂交(在哺乳动物生理条件下或类似的体外条件下)形成碱基配对并形成双链体或双螺旋结构的能力。互补序列包含沃森-克里克碱基配对或非沃森-克里克碱基配对，且包含天然或修饰的核苷酸或核苷酸类似物，其程度至少能满足上述杂交的要求。例如，就确定相同性或互补性的目的而言，单体a和Af与U(或T)互补，并且等同于A。
术语“正义链”是指RNA分子上携带有编码蛋白质氨基酸信息的核苷酸序列的链称为正义链，又称编码链、有义链或正链，而与其互补的另外一条核苷酸序列即为反义链。
术语“反义链”与目标基因表达的mRNA中的一段长度与所述反义链相同的核苷酸序列基本上反向互补或实质上反向互补。
术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生的场合。例如，“任选被烷基取代的杂环基团”意味着烷基可以但不必须存在，该说明包括杂环基团被烷基取代的情形和杂环基团不被烷基取代的情形。
术语“取代”指基团中的一个或多个氢原子，优选为最多5个，更优选为1～3个氢原子彼此独立地被相应数目的取代基取代。不言而喻，取代基仅处在它们的可能的化学位置，本领域技术人员能够通过现有技术手段和实验条件下(通过实验或理论)可能或不可能的取代。例如，具有游离氢的氨基或羟基与具有不饱和(如烯属)键的碳原子结合时可能是不稳定的。
碳氢基团中碳原子含量的最小值和最大值通过前缀表示，例如，前缀Ca～Cb烷基表明任何含“a”至“b”个碳原子的烷基。因此，例如，C1～6烷基是指包含1～6个碳原子的直链或支链的烷基。
烷基是指烷烃分子中直链或支链的烃基，例如甲基-CH3、乙基-CH2CH3、亚甲基-CH2-；烷基基团也可以是其他基团的一部分，所述其他基团例如为C1～C6烷氧基，C1～C6烷基氨基。非限制性实施例则包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、正己基等。烷基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代，所述取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、氧基、羧基或羧酸酯基。
“烯基”是指具有至少2个碳原子且具有至少1个乙烯基不饱和位点(>C＝C<)的直链或支链烃基基团。例如，Ca-b烯基是指具有a至b个碳原子的烯基基团并且意在包括例如乙烯基、丙烯基、异丙烯基、1,3-丁二烯基等。
“炔基”是指含有至少一个三键的直链一价烃基或支链一价烃基。术语“炔基”还意在包括具有一个三键和一个双键的那些烃基基团。例如，C2-6炔基意在包括乙炔基、丙炔基等。
“烷氧基”指-O-(烷基)或者-O-(环烷基)，其中烷基的定义如上所述。烷氧基的非限制性实例包括：甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基。烷氧基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、羧基或羧酸酯基。
“卤素”为氟、氯、溴或碘。
“卤代取代的烷基”指被一个或多个卤素取代的烷基，其中烷基如上所定义。
“酯基”指-C(O)O(烷基)或-C(O)O(环烷基)，其中烷基和环烷基如上所定义。
“酰基”指含有-C(O)R基团的化合物，其中R为烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基。
“杂原子”杂原子是指有机化合物中，除了碳和氢以外的其他原子。一般指在分子骨架(特别是环系)中替换碳的原子。氮、氧、硫、磷、硼、氯、溴、碘等都是常见的杂原子。若有机化合物中有包括杂原子的环，称为杂环化合物。
本发明中“保护基”是指本领域已知的用于防止反应性基团(例如羟基、氨基、羧基和巯基)在合成过程中发生不希望反应的不稳定的化学部分。保护基团通常选择性和/或正交地用于在反应中的其它反应性位点保护位点，并且随后被除去而释放出未保护的基团，使其能够用于进一步反应。在一些实施方案中，“取代的”基团或取代基包含保护基团。
本发明中代表性的羟基保护基团公开于Beaucage等人，Tetrahedron 1992,48,2223-2311，以及Greeneand Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，Chapter2,2d ed，John Wiley&Sons，New York，1991中，以引用的方式将上述文献各自整体并入本文。在一些实施方案中，保护基团在碱性条件下稳定，但可以在酸性条件下脱除。在一些实施方案中，本发明可使用的羟基保护基的非排他性实例包括二甲氧基三苯甲基(DMT)、单甲氧基三苯甲基、9-苯基氧杂蒽-9-基(Pixyl)和9-(对甲氧基苯基)氧杂蒽-9-基(Mox)。在一些实施方案中，本发明可使用的羟基保护基的非排他性实例包括Tr(三苯甲基)、MMTr(4-甲氧基三苯甲基)、DMTr(4,4'-二甲氧基三苯甲基)和TMTr(4,4',4”-三甲氧基三苯甲基)。
本发明所述的化合物和组合物可以具有处于质子化或脱质子化状态的某些原子(例如N、O或S原子)，这取决于该化合物或组合物所处的环境。因此，如本发明所用，本发明所述的结构考虑到某些官能团、例如OH、SH或NH可以质子化或脱质子化。本发明的公开内容旨在涵盖上述的化合物和组合物，而无论它们的基于环境pH的质子化状态如何，这是本领域普通技术人员容易理解的。
术语“盐”和“可用的盐”是指上述化合物或其立体异构体，与无机和/或有机酸和碱形成的酸式和/或碱式盐，也包括两性离子盐(内盐)，还包括季铵盐，例如烷基铵盐。这些盐可以是在化合物的最后分离和纯化中直接得到。也可以是通过将上述化合物，或其立体异构体，与一定数量的酸或碱适当(例如等当量)进行混合而得到。这些盐可能在溶液中形成沉淀而以过滤方法收集，或在溶剂蒸发后回收而得到，或在水介质中反应后冷冻干燥制得。
附图说明
图1为单体XY-007-2MS谱图；
图2为单体XY-007-2H-NMR谱图；
图3为单体XY-007-2P-NMR谱图；
图4为单体XY-007-3MS谱图；
图5为单体XY-007-3H-NMR谱图；
图6为单体XY-007-3P-NMR谱图；
图7为单体XY-007-5MS谱图；
图8为单体XY-007-5H-NMR谱图；
图9为单体XY-007-5P-NMR谱图；
图10为单体XY-007-6MS谱图；
图11为单体XY-007-6H-NMR谱图；
图12为单体XY-007-6P-NMR谱图；
图13为利用固相载体合成siRNA序列的固相合成路线示意图；
图14为GalNAc(L96)修饰的固相载体(L96-PS)结构图；
图15为利用固相载体合成siRNA序列的合成工艺流程图。
具体实施方案
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
本发明公开的化合物可以运用如下合成方法制备。
实施例
在下文中，为了帮助理解本公开，将提供示例性实施例。然而，提供以下实施例只是为了更容易理解本公开，并不用于限制本公开。
除非特别说明，实施例中所用到的材料、试剂均为市售商品。所用到的核酸电泳、实时PCR等操作均按常规方案进行。例如，可按Molecular Cloning(Cold Spring HarborLaboratory Press(1989))所记载的进行。
实施例1：单体XY-007-2的化学合成
化合物XY-007-2-2的合成：
在干燥的1000mL单口瓶中加入底物XY-007-2-1(134g,0.27mol)溶于无水乙腈(150mL)，随后在氮气保护下加入1a(44.7g,0.29mol)，BSA(8.0g,53.2mmol),TMSOTf(62g,0.28mol),加完后反应体系保持在80度下搅拌2小时。LCMS检测原料完全消失，反应结束。然后向反应液中加入2000mL乙酸乙酯，用水进行洗涤(1000mL*3)，并用饱和食盐水进行洗涤(1000mL)，有机相经无水Na2SO4干燥、过滤、浓缩，得到粗品用经柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝5:1)，浓缩得到白色固体产物XY-007-2-2(44.0g,73.7mmol,30％收率)。
ESI-LCMS m/z 598.1[M+H].1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.60(s,1H),8.06(s,1H),7.66-7.53(m,4H),7.40-7.38(m,2H),7.31-7.22(m,8H),6.88-6.86(m,4H),6.68-6.67(m,1H),5.56-5.55(m,1H),4.68-4.66(m,1H),4.12-4.10(m,1H),3.96-3.94(m,1H),3.73(s,6H).
化合物XY-007-2-3的合成：
在干燥的1000mL单口瓶中加入底物XY-007-2-2(44.0g,73.7mmol)溶于甲醇(500mL)，随后在氮气保护下加入K2CO3(2.1g,14.7mmol)，加完后反应体系保持在室温下搅拌2小时。LCMS检测原料完全消失，反应结束。然后向反应液中加入1000mL乙酸乙酯，用水进行洗涤(500mL*3)，并用饱和食盐水进行洗涤(500mL)，有机相经无水Na2SO4干燥、过滤、浓缩，得到粗品用经柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝1:5)，浓缩得到白色固体产物XY-007-2-3(15.5g,54.4mmol,74％收率)。
ESI-LCMS:m/z 284.2[M-H]-；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)8.67(s,1H),8.02-8.01(s,1H),6.76-6.75(m,1H),6.22-6.20(m,1H),5.42-5.41(m,1H),5.21-5.20(m,1H),5.08-5.06(m,1H),4.44-4.40(m,1H),4.14-4.05(m,1H),3.96-3.93(m,1H),3.68-3.54(m,2H).
化合物XY-007-2-4的合成：
在干燥的500mL单口瓶中加入底物XY-007-2-3(15.5g,54.4mmol)溶于吡啶(200mL)的混合中，随后在氮气保护下加入DMTrCl(22.1g,65.3mmol)，反应体系保持在室温下搅拌2小时。LCMS检测原料完全消失，反应结束。然后向反应液中加入500mL乙酸乙酯，用水进行洗涤(200mL*3)，并用饱和食盐水进行洗涤(200mL)，有机相经无水Na2SO4干燥、过滤、浓缩，得到粗品用经柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝1:1)，浓缩得到白色固体产物XY-007-2-4(18.0g,30.6mmol,60％收率)。
ESI-LCMS:m/z 586.2[M-H]-；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)8.65(s,1H),7.84-7.83(m,1H),7.38-7.36(m,2H),7.29-7.21(m,7H),6.86-6.83(m,2H),6.72-6.71(m,1H),6.21-6.20(m,1H),5.54-5.53(m,1H),5.25-5.24(m,1H),4.53-4.51(m,1H),4.23-4.22(m,1H),3.73(s,6H).
化合物XY-007-2-5的合成：
在干燥的500mL单口瓶中加入底物XY-007-2-4(18.0g,30.6mmol)溶于DMF(200mL)，随后在氮气保护下加入咪唑(3.7g,61.2mmol)和TBSCl(4.6g,30.6mmol)，加完后反应体系保持在室温下搅拌2小时。LCMS检测原料完全消失，反应结束。然后向反应液中加入500mL乙酸乙酯，用水进行洗涤(100mL*3)，并用饱和食盐水进行洗涤(100mL)，有机相经无水Na2SO4干燥、过滤、浓缩，得到粗品用经柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝3:1)，浓缩得到白色固体产物XY-007-2-5和XY-007-2-5’两种的混合物(19.8g,28.2mmol,90％收率)。
ESI-LCMS:m/z 700.3[M-H]-；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)8.83(s,1H),8.04-8.03(m,1H),7.61-7.43(m,9H),,7.08-7.06(m,4H),6.94-6.93(m,1H),6.45-6.43(m,1H),5.38-5.37(m,1H),4.83-4.80(m,1H),4.37-4.31(m,2H),3.94(s,6H),0.91(s,9H),0.20--0.10(m,6H).
化合物XY-007-2-6的合成：
在干燥的500mL单口瓶中加入底物XY-007-2-5(19.8g,28.2mmol)溶于CH3I(200mL)，随后在氮气保护下加入Ag2O(36g,155mmol)加毕，反应体系保持在80度下搅拌2小时。LCMS检测原料完全消失，反应结束。然后向反应液过滤、浓缩，得到粗品用经柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝3:1)，浓缩得到白色固体产物XY-007-2-6和XY-007-2-6’两种的混合物(10.3g,14.4mmol,50％收率)。ESI-LCMS:m/z 716.3[M+H]+；
化合物XY-007-2-7的合成：
在干燥的500mL单口瓶中加入底物XY-007-2-6(10.3g,14.4mmol)溶于NH3的甲醇溶液(200mL)，反应体系保持在140度下封管搅拌5小时。LCMS检测原料消失70％，反应结束。然后反应液中浓缩，得到粗品用经柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝2:1)，浓缩得到白色固体产物XY-007-2-7和XY-007-2-7’两种的混合物，并SFC拆分得白色固体产物XY-007-2-7(700mg,1.0mmol)、XY-007-2-7’(710mg,1.0mmol)、未拆分的混合物(2.3g，3.2mmol)总收率40％。
XY-007-2-7：ESI-LCMS:m/z 697.2[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)8.26(s,1H),7.66-7.64(m,2H),7.56-7.64(m,9H),7.42-7.38(m,2H),7.25(s,2H),7.13-7.11(m,4H),6.82-6.81(m,1H),6.31-6.30(m,1H),4.98-4.96(m,1H),4.34-4.33(m,1H),4.05-4.03(m,1H),3.98-3.96(m,7H),3.60(s,3H),2.53(s,1H),0.96(s,8H),0.22--0.05(m,6H).
XY-007-2-7’：ESI-LCMS:m/z 697.2[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)8.00(s,1H),7.32-7.30(m,2H),7.26-7.14(m,9H),6.99(s,2H),6.81-6.79(m,5H),6.56-6.53(m,1H),6.08-6.07(m,1H),4.47-4.45(m,1H),4.17-4.14(m,1H),3.90-3.86(m,1H),3.68-3.67(m,7H),3.23(s,3H),3.07-3.03(m,7H),0.76(s,10H),0.00--0.05(m,6H).
化合物XY-007-2-8的合成：
在干燥的100mL单口瓶中加入底物XY-007-2-7(700mg,1.1mmol)溶于吡啶(10mL)，随后在氮气保护下加入BzCl(310mg,2.2mmol)，加完后反应体系保持在室温搅拌2小时。LCMS检测原料消失，然后向反应液中加入100mL乙酸乙酯，用水进行洗涤(100mL*3)，并用饱和食盐水进行洗涤(100mL)，有机相经无水Na2SO4干燥、过滤、浓缩，得到粗品用经柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝1:1)，浓缩得到白色固体产物XY-007-2-8(630mg,0.8mmol,72％收率)。ESI-LCMS:m/z 801.3[M+H]+；
化合物XY-007-2-9的合成：
在干燥的100mL单口瓶中加入底物XY-007-2-8(630mg,0.8mmol)溶于THF(10mL)，随后在氮气保护下加入3HF.TEA(644mg,4.0mmol)和TEA(565mg,5.6mmol)，加完后反应体系保持在50℃搅拌过夜。LCMS检测原料消失,然后向反应液中加入100mL乙酸乙酯，用水进行洗涤(100mL*3)，并用饱和食盐水进行洗涤(100mL)，有机相经无水Na2SO4干燥、过滤、浓缩，得到粗品用经柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝1:2)，浓缩得到白色固体产物XY-007-2-9(490mg,0.7mmol,85％收率)。
ESI-LCMS:m/z 687.7[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)8.61(s,1H),8.08-8.05(m,2H),8.02-7.99(m,2H),7.76-7.53(m,7H),7.42-7.21(m,10H),6.88-6.84(m,4H),6.72-6.71(m,1H),6.60-6.59(m,1H),4.57-4.55(m,1H),4.29-4.26(m,1H),3.73(s,6H),3.40-3.35(m,4H).
化合物XY-007-2的合成：
在干燥的50mL单口瓶中加入底物XY-007-2-9(490mg,0.7mmol)溶于无水DCM(10mL)，随后在氮气保护下加入DCI(74mg,0.6mmol)和CEP[N(iPr)2]2(253mg,0.8mmol)加完后反应体系保持在室温下搅拌2小时。LCMS检测原料完全消失，反应结束。然后向反应液中加入100mL二氯甲烷，用水进行洗涤(100mL*3)，并用饱和食盐水进行洗涤(100mL)，有机相经无水Na2SO4干燥、过滤、浓缩，得到粗品用反相C18(CH3CN/H2O(0.05％ NH4HCO3)＝1/0)，浓缩得到白色固体产物XY-007-2(460mg,0.5mmol,75％收率)。
ESI-LCMS(图1):m/z 887.1[M+H]+；1H NMR(图2)(400MHz,DMSO-d6)δ8.71(s,1H),8.53(s,1H),7.99-7.98(m,2H),7.63-7.59(m,1H),7.55-7.42(m,6H),7.36-7.20(m,9H),7.03-7.01(m,1H),6.84-6.80(m,4H),6.52-6.49(m,1H),4.68-4.55(m,1H),4.37-4.35(m,1H),4.31-4.23(m,1H),3.99-3.85(m,1H),3.79-3.78(m,7H),3.67-3.50(m,4H),3.49-3.41(m,4H),3.35-3.31(m,1H),2.69-2.65(m,1H),2.39-2.35(m,1H),1.20-1.17(m,10H),1.05-1.03(m,4H).31P NMR(图3)(162MHz,DMSO-d6)δ150.90,150.20.
实施例2：单体XY-007-3的化学合成
化合物XY-007-3-1的合成：
在干燥的100mL单口瓶中加入底物XY-007-2-7’(700mg,0.9mmol)溶于THF(10mL)，随后在氮气保护下加入3HF.TEA(704mg,4.3mmol)，TEA(618mg,6.1mmol)，加完后反应体系保持在50℃搅拌过夜。LCMS检测原料消失,然后向反应液中加入100mL乙酸乙酯，用水进行洗涤(100mL*3)，并用饱和食盐水进行洗涤(100mL)，有机相经无水Na2SO4干燥、过滤、浓缩，得到粗品用经柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝1:2)，浓缩得到白色固体产物XY-007-3-1(480mg,0.7mmol,80％收率)。
ESI-LC MS:m/z 687.7[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.61(s,1H),8.08-8.05(m,2H),8.02-7.99(m,2H),7.76-7.53(m,7H),7.42-7.21(m,10H),6.88-6.84(m,4H),6.72-6.71(m,1H),6.60-6.59(m,1H),4.57-4.55(m,1H),4.29-4.26(m,1H),3.73(s,6H),3.40-3.35(m,4H)
化合物XY-007-3的合成：
在干燥的50mL单口瓶中加入底物XY-007-3-1(480mg,0.7mmol)溶于无水DCM(10mL)，随后在氮气保护下加入DCI(74mg,0.6mmol)和CEP[N(iPr)2]2(253mg,0.8mmol)加完后反应体系保持在室温下搅拌2小时。LCMS检测原料完全消失，反应结束。然后向反应液中加入100mL二氯甲烷，用水进行洗涤(100mL*3)，并用饱和食盐水进行洗涤(100mL)，有机相经无水Na2SO4干燥、过滤、浓缩，得到粗品用反相C18(CH3CN/H2O(0.05％ NH4HCO3)＝1/0)，浓缩得到白色固体产物XY-007-3(410mg,0.5mmol,70％收率)。
ESI-LCMS(图4):m/z 887.4[M+H]+；1H NMR(图5)(400MHz,DMSO-d6)δ8.71(s,1H),8.53(s,1H),7.99-7.98(m,2H),7.63-7.59(m,1H),7.55-7.42(m,6H),7.36-7.20(m,9H),7.03-7.01(m,1H),6.84-6.80(m,4H),6.52-6.49(m,1H),4.68-4.55(m,1H),4.37-4.35(m,1H),4.31-4.23(m,1H),3.99-3.85(m,1H),3.79-3.78(m,7H),3.67-3.50(m,4H),3.49-3.41(m,4H),3.35-3.31(m,1H),2.69-2.65(m,1H),2.39-2.35(m,1H),1.20-1.17(m,10H),1.05-1.03(m,4H),31P NMR(图6)(600MHz,DMSO-d6)δ151.54,150.86.
实施例3：单体XY-007-5的化学合成
化合物XY-007-5-2的合成：
在干燥的3000mL单口瓶中加入底物XY-007-5-1(170.0g,340.0mmol)溶于无水乙腈(1.5L)，随后在氮气保护下加入1a(56.7g,370.0mmol)，BSA(75.4g,0.37mmol)，加完后反应体系保持在50℃下搅拌0.5小时至体系澄清,反应体系降温至0℃，在氮气保护下缓慢加入TMSOTf(78.6g,350.0mmol)加完后反应体系保持在80℃下搅拌2小时。LCMS检测原料完全消失，反应结束。然后向反应液中加入2000mL乙酸乙酯，用水进行洗涤(1000mL*3)，并用饱和食盐水进行洗涤(1000mL)，有机相经无水Na2SO4干燥、过滤、浓缩，得到粗品用经柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝5:1)，浓缩得到白色固体产物XY-007-5-2(53.5g,89.6mmol,30％收率)。
ESI-LCMS m/z 598.1[M+H].1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.60(s,1H),8.06(s,1H),7.66-7.53(m,4H),7.40-7.38(m,2H),7.31-7.22(m,8H),6.88-6.86(m,4H),6.68-6.67(m,1H),5.56-5.55(m,1H),4.68-4.66(m,1H),4.12-4.10(m,1H),3.96-3.94(m,1H),3.73(s,6H).
化合物XY-007-5-3的合成：
在干燥的1000mL单口瓶中加入底物XY-007-5-2(53.5g,89.6mmol)溶于1M的MeONa的甲醇溶液(500mL)，加完后反应体系保持在60℃下搅拌2小时。LCMS检测原料完全消失，反应结束。然后反应液直接浓缩得到粗品用经柱层析纯化(甲醇：二氯甲烷＝1:1)，得到白色固体产物XY-007-5-3(19.0g,67.6mmol,75％收率)。ESI-LCMS:m/z 282.1[M+H]+；
化合物XY-007-5-4的合成：
在干燥的500mL单口瓶中加入底物XY-007-5-3(19.0g,67.6mmol)溶于吡啶(200mL)的混合中，随后在氮气保护下加入DMTrCl(25.2g,74.4mmol)，反应体系保持在室温下搅拌2小时。LCMS检测原料完全消失，反应结束。然后向反应液中加入500mL乙酸乙酯，用水进行洗涤(200mL*3)，并用饱和食盐水进行洗涤(200mL)，有机相经无水Na2SO4干燥、过滤、浓缩，得到粗品用经柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝1:1)，浓缩得到白色固体产物XY-007-5-4(31.0g,53.2mmol,78％收率)。
ESI-LCMS:m/z 582.3[M-H]-；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.65(s,1H),7.84-7.83(m,1H),7.38-7.36(m,2H),7.29-7.21(m,7H),6.86-6.83(m,2H),6.72-6.71(m,1H),6.21-6.20(m,1H),5.54-5.53(m,1H),5.25-5.24(m,1H),4.53-4.51(m,1H),4.23-4.22(m,1H),3.73(s,6H).
化合物XY-007-5-5的合成：
在干燥的500mL单口瓶中加入底物XY-007-5-4(31.0g,53.2mmol)溶于DMF(300mL)，随后在氮气保护下加入咪唑(4.7g,79.8mmol)和TBSCl(7.2g,47.9mmol)，加完后反应体系保持在室温下搅拌2小时。LCMS检测原料完全消失，反应结束。然后向反应液中加入500mL乙酸乙酯，用水进行洗涤(100mL*3)，并用饱和食盐水进行洗涤(100mL)，有机相经无水Na2SO4干燥、过滤、浓缩，得到粗品用经柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝3:1)，浓缩得到白色固体产物XY-007-5-5和XY-007-5-5’两种的混合物(29.0g,41.6mmol,78％收率)。
ESI-LCMS:m/z 696.4[M-H]-；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.48-8.47(m,1H),7.64-7.59(m,1H),7.49-7.42(m,2H),7.38-7.26(m,7H),6.95-6.90(m,4H),6.66-6.65(m,1H),6.29-6.18(m,1H),5.42-5.15(m,1H),4.69-4.15(m,1H),4.43-4.12(m,1H),4.16-4.04(m,4H),3.81-3.80(m,6H),3.35-3.32(m,1H),3.19-3.15(m,1H),0.91-0.78(m,9H),0.20--0.20(m,6H).
化合物XY-007-5-6的合成：
在干燥的500mL单口瓶中加入底物XY-007-5-5和XY-007-5-5’的混合物(29.0g,41.6mmol)溶于CH3I(200mL)，随后在氮气保护下加入Ag2O(52.9g,229mmol)加毕，反应体系保持在80度下搅拌2小时。LCMS检测原料完全消失，反应结束。然后向反应液过滤、浓缩，得到粗品用经柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝3:1)，浓缩得到白色固体产物XY-007-5-6和XY-007-5-6’的混合物(16.5g,23.2mmol,55％收率)。ESI-LCMS:m/z 712.3[M+H]+；
化合物XY-007-5-7的合成：
在干燥的500mL单口瓶中加入底物XY-007-5-6和XY-007-5-6’的混合物(8.0g,11.2mmol)溶于DCM(100mL)，随后在氮气保护下加入1M的BBr3的DCM溶液(56.2mL,56.2mmol)加毕反应体系保持在室温下搅拌2小时。LCMS检测原料消失，反应结束。然后向反应液中加入100mL乙酸乙酯，用碳酸氢钠水进行洗涤(100mL*3)，并用饱和食盐水进行洗涤(100mL)，有机相经无水Na2SO4干燥、过滤、浓缩，得到粗品用经柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝2:1)，浓缩得到白色固体产物XY-007-5-7(680mg,1.7mmol,15％收率)和XY-007-5-7’(480mg,1.2mmol,30％收率)。
XY-007-5-7：ESI-LCMS:m/z 396.1[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.87(s,1H),7.81(s,1H),7.31-7.30(m,1H),6.44-6.43(m,1H),6.05-5.99(m,1H),5.01-4.98(m,1H),4.34-4.32(m,1H),4.06-4.03(m,1H),3.78-3.76(m,1H),3.51-3.39(m,2H),3.10(s,3H),0.78(s,9H),0.10--0.10(m,6H).
XY-007-5-7’：ESI-LCMS:m/z 396.1[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.05(s,1H),7.99(s,1H),7.49-7.48(m,1H),6.63-6.62(m,1H),5.28-5.26(m,1H),4.71-4.68(m,1H),4.12-4.08(m,1H),3.88-3.86(m,1H),3.76-3.63(m,2H),3.51(s,3H),1.00-0.72(m,9H),0.21--0.23(m,6H).
化合物XY-007-5-8的合成：
在干燥的100mL单口瓶中加入底物XY-007-5-7(460mg,1.1mmol)溶于吡啶(10mL)，随后在氮气保护下加入DMTrCl(472mg,1.4mmol)，加完后反应体系保持在室温搅拌2小时。LCMS检测原料消失，然后向反应液中加入100mL乙酸乙酯，用水进行洗涤(100mL*3)，并用饱和食盐水进行洗涤(100mL)，有机相经无水Na2SO4干燥、过滤、浓缩，得到粗品用经柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝1:1)，浓缩得到白色固体产物XY-007-5-8(620mg,0.9mmol,81％收率)。
ESI-LCMS:m/z 698.3[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.01(s,1H),7.92-7.91(m,1H),7.46-7.27(m,12H),6.96-6.92(m,5H),6.55-6.57(m,1H),6.09-6.07(m,1H),4.71-4.68(m,1H),4.17-4.14(m,1H),3.82-3.76(m,8H),3.41(s,3H),0.77(s,9H),0.00--0.10(m,6H).
化合物XY-007-5-9的合成：
在干燥的100mL单口瓶中加入底物XY-007-5-8(620mg,0.9mmol)溶于THF(10mL)，随后在氮气保护下加入3HF.TEA(716mg,4.4mmol)和TEA(628mg,6.2mmol)，加完后反应体系保持在50℃搅拌过夜。LCMS检测原料消失,然后向反应液中加入100mL乙酸乙酯，用水进行洗涤(100mL*3)，并用饱和食盐水进行洗涤(100mL)，有机相经无水Na2SO4干燥、过滤、浓缩，得到粗品用经柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝1:2)，浓缩得到白色固体产物XY-007-5-9(460mg,0.8mmol,85％收率)。
ESI-LCMS:m/z 582.3[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.01(s,1H),7.91(s,1H),7.40-7.39(m,2H),7.31-7.21(m,8H),6.88-6.86(m,2H),6.53-6.52(m,1H),6.16-6.15(m,1H),5.27-5.26(m,1H),4.29-4.26(m,1H),4.13-4.10(m,1H),4.04-4.00(m,1H),3.74(s,6H).
化合物XY-007-5的合成：
在干燥的50mL单口瓶中加入底物XY-007-5-9(460mg,0.8mmol)溶于无水DCM(10mL)，随后在氮气保护下加入DCI(84mg,0.7mmol)和CEP[N(iPr)2]2(286mg,1.0mmol)加完后反应体系保持在室温下搅拌2小时。LCMS检测原料完全消失，反应结束。然后向反应液中加入100mL二氯甲烷，用水进行洗涤(100mL*3)，并用饱和食盐水进行洗涤(100mL)，有机相经无水Na2SO4干燥、过滤、浓缩，得到粗品用反相C18(CH3CN/H2O(0.05％ NH4HCO3)＝1/0)，浓缩得到白色固体产物XY-007-5(420mg,0.5mmol,70％收率)。
ESI-LC MS(图7):m/z 782.1[M-H]-；1H NMR(图8)(400MHz,DMSO-d6)δ12.03(s,1H),7.90-7.89(m,1H),7.41-7.37(m,2H),7.32-7.20(m,8H),6.89-6.85(m,4H),6.55-6.54(m,1H),6.16-6.13(m,1H),4.51-4.46(m,1H),4.37-4.30(m,1H),4.20-4.12(m,1H),3.84-3.73(m,7H),3.69-3.51(m,3H),3.34-3.20(m,10H),2.80-2.88(m,1H),2.61-2.58(m,1H),1.15-1.12(m,10H),1.02-0.90(m,3H),31P NMR(图9)(162MHz,DMSO-d6)δ149.55,149.27.
实施例4：单体XY-007-6的化学合成
化合物XY-007-6-2的合成：
在干燥的100mL单口瓶中加入底物XY-007-6-1(470mg,1.1mmol)溶于吡啶(10mL)，随后在氮气保护下加入DMTrCl(483mg,1.4mmol)，加完后反应体系保持在室温搅拌2小时。LCMS检测原料消失，然后向反应液中加入100mL乙酸乙酯，用水进行洗涤(100mL*3)，并用饱和食盐水进行洗涤(100mL)，有机相经无水Na2SO4干燥、过滤、浓缩，得到粗品用经柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝1:1)，浓缩得到白色固体产物XY-007-6-2(630mg,0.9mmol,80％收率)。
ESI-LCMS:m/z 698.3[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.01(s,1H),7.92-7.91(m,1H),7.46-7.27(m,12H),6.96-6.92(m,5H),6.55-6.57(m,1H),6.09-6.07(m,1H),4.71-4.68(m,1H),4.17-4.14(m,1H),3.82-3.76(m,8H),3.41(s,3H),0.77(s,9H),0.10--0.25(m,6H).
化合物XY-007-6-3的合成：
在干燥的100mL单口瓶中加入底物XY-007-6-2(630mg,0.9mmol)溶于THF(10mL)，随后在氮气保护下加入3HF.TEA(716mg,4.4mmol)和TEA(628mg,6.2mmol)，加完后反应体系保持在50℃搅拌过夜。LCMS检测原料消失,然后向反应液中加入100mL乙酸乙酯，用水进行洗涤(100mL*3)，并用饱和食盐水进行洗涤(100mL)，有机相经无水Na2SO4干燥、过滤、浓缩，得到粗品用经柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝1:2)，浓缩得到白色固体产物XY-007-6-3(450mg,0.8mmol,80％收率)。
ESI-LCMS:m/z 582.3[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.01(s,1H),7.91(s,1H),7.40-7.39(m,2H),7.31-7.21(m,8H),6.88-6.86(m,2H),6.53-6.52(m,1H),6.16-6.15(m,1H),5.27-5.26(m,1H),4.29-4.26(m,1H),4.13-4.10(m,1H),4.04-4.00(m,1H),3.74(s,6H).
化合物XY-007-6的合成：
在干燥的50mL单口瓶中加入底物XY-007-6-3(450mg,0.8mmol)溶于无水DCM(10mL)，随后在氮气保护下加入DCI(82mg,0.7mmol)和CEP[N(iPr)2]2(279mg,1.0mmol)加完后反应体系保持在室温下搅拌2小时。LCMS检测原料完全消失，反应结束。然后向反应液中加入100mL二氯甲烷，用水进行洗涤(100mL*3)，并用饱和食盐水进行洗涤(100mL)，有机相经无水Na2SO4干燥、过滤、浓缩，得到粗品用反相C18(CH3CN/H2O(0.05％ NH4HCO3)＝1/0)，浓缩得到白色固体产物XY-007-6(350mg,0.4mmol,60％收率)。
ESI-LCMS(图10):m/z 782.1[M-H]-；1H NMR(图11)(400MHz,DMSO-d6)δ12.03(s,1H),7.90-7.89(m,1H),7.41-7.37(m,2H),7.32-7.20(m,8H),6.89-6.85(m,4H),6.55-6.54(m,1H),6.16-6.13(m,1H),4.51-4.46(m,1H),4.37-4.30(m,1H),4.20-4.12(m,1H),3.84-3.73(m,7H),3.69-3.51(m,3H),3.34-3.20(m,10H),2.80-2.88(m,1H),2.61-2.58(m,1H),1.15-1.12(m,10H),1.02-2.00(m,3H).31P NMR(图12)(600MHz,DMSO-d6)δ150.53,150.48.
实施例5：siRNA合成
对于本发明的siRNA序列的正义链和反义链以及修饰双链体的正义链和反义链，使用固相载体开始链合成；使用GalNAc(L96)修饰的固相载体作为正义链合成的起始循环，使用通用固相载体(Primer support 5G unylinker 350)作为反义链的起始循环(图13)。GalNAc(L96)修饰的固相载体(L96-PS)结构如图14：Primer support 5G unylinker 350载体结构如图下：
●代表PS聚苯乙烯(polystyrene)固相载体
对于本发明的siRNA序列的正义链和反义链以及修饰双链体的正义链和反义链，使用PS作为固相载体；使用GalNAc修饰的PS固相作为正义链合成的起始循环，使用通用PS作为反义链的起始循环(图13)。
使用YB-192S合成仪，采用亚磷酰胺三酯固相合成法，以固相载体为起始，按照3’-5’方向依次连接核苷单体，进行合成规模为0.2umol的序列合成。
工艺流程见图15。
工艺描述：
Oligo合成是以Universal-PS为起始，使用3'-0-(2-氰乙基)亚磷酰胺/4,4'二甲氧基三苯甲基(二甲氧基三苯甲基，DMT)基团保护的方法，在固相载体PS上组装寡核苷酸链。每个合成循环都包括5'-羟基脱保护、偶联、盖帽封端和氧化(硫代)。每个偶联反应都是通过活化适当的亚磷酰胺单体并与载体固定的受保护的核苷酸或寡核苷酸的游离5'-羟基反应来进行的。按照序列信息循环合成得到相应的粗寡核苷酸单链PS-Oligo，粗寡核苷酸单链从固相载体上裂解下来，并脱除相关保护基团。然后经过制备色谱纯化，超滤脱盐，退火，冷冻干燥步骤得到终产物。
(1)合成程序
包括如下单元：
1)脱保护(De-blocking)：5’-OH端带有DMT基团(二对甲氧三苯甲基)保护的核糖核苷酸，在合成的第一步使用三氯乙酸(TCA)将DMT保护基团从固相载体和核糖核苷酸上脱除，以便裸露核糖核苷酸的5’-OH偶联新的碱基。
2)偶联(Coupling)：核苷酸单体与活化试剂混合，与合成柱中PS-Oligo进行反应，活化试剂提供一个质子给3’-磷酸上二异丙酰胺的N原子，形成亚磷酰胺四唑活性中间体。亚磷酰胺四唑与PS-Oligo接触时，与其5’-羟基发生亲核反应，发生偶联并脱掉四唑，延伸一个核苷酸。
3)盖帽封端(Capping)：由于偶联效率无法达到100％，为了防止未偶联成功的PS-Oligo继续进入下一步的偶联，使用Cap试剂将PS-Oligo的5’-羟基盖帽封端。
4)氧化(Oxidation)或者硫代：偶联反应后核苷酸通过亚磷酯键(三价磷)与PS上的寡核苷酸相连，此亚磷酯键不稳定，易被酸、碱水解，通过氧化试剂将此处三价磷氧化为五价磷。硫代是指通过硫代试剂在弱碱性条件下，将亚磷酯键的三价磷反应形成磷硫键。
5)VP保护基脱除以及氨解
将合成结束的PS-oligo从合成柱中转移至离心管中，按照体积比3:2:100＝TMS-I:吡啶:DCM比例配制脱除试剂，将脱除试剂加入至离心管中反应30min。配制TEA/乙腈＝1:1溶液，加入2-巯基乙醇(终浓度2M)，混合均匀后，加入至反应中终止反应。除去上清，5min×2次进行洗涤PS-oligo。洗涤结束后加入氨解液(2-巯基乙醇(2M)/28％氨水)进行氨解10h。氨解结束后真空离心除去氨水并进行纯化。
缀合物合成后LC-MS检测
(3)纯化
氨解稀释后的样品采用阴离子柱交换色谱进行纯化，液相系统采用高效液相色谱，色谱条件如下。
色谱柱：PS-15Q10*250mm
流速：4ml/min
检测波长：260nm
离子柱制备纯化梯度程序：
流动相：A相：10mM NaOH溶液(PH＝10)B相：10mM NaOH溶液(PH＝10)+2MNaCl
制备后样品进行质谱确认以及纯度确认。
(4)超滤
纯化后得到的样品，加入4ml PBS溶解，转移至1K超滤管中，以5000r/min转速离心45min，然后使用Nanodrop检测离心管内液体是否存在样品，若于260nm波长条件下检测含有样品则说明超滤膜破损，需更换超滤管，重新超滤；若260nm波长条件下检测不含有样品，补加4ml RNase水再次超滤。超滤3次，每次45min。
(5)退火
正义链和反义链超滤结束后，分别以3mg/ml的浓度稀释样品，按照1：1的摩尔比混合正义链和反义链。水浴锅加热至90℃，将按比例混合后的正义链和反义链放置水浴锅内，退火30min。关闭水浴锅，自然降至室温16h。取样10μL进行HPLC检测。
使用已知具有TTR，HAO，HBV等基因抑制效果的PC序列作为工具序列，进行修饰前后效果的对照。
测试siRNA缀合物列表
其中，C、G、U、A、T表示核苷酸的碱基组成，包括修饰和未修饰的核苷酸；m表示与该标识m右侧相邻的一个核苷酸为2’-甲氧基核苷酸；f表示与该标识f右侧相邻的一个核苷酸为2’-氟核苷酸；标识*表示与该标识*左右相邻的两个核苷酸之间(或核苷酸与接头-靶向配体部分之间)为硫代磷酸酯基连接；GalNAc(L96)是指该处缀合有接头-靶向配体部分GalNAc(L96)；直接相邻的核苷酸之间没有符号。
在本发明所述siRNA中非常规碱基核苷酸单体结构具体如下：
实施例6：siRNA种子区脱靶能力评估
针对siRNA序列分别构建用于检测在靶活性和种子区脱靶活性序列。在靶检测序列为与待检siRNA完全匹配的序列，种子区脱靶检测为与待检siRNA反义链种子区(5’末端2-8)完全匹配，其他位置序列完全不匹配。每个psiCHECK质粒中分别插入5个在靶或者种子区脱靶检测序列。
293T细胞以20000细胞/孔接种到96孔板中；利用lipofectamine 2000，待测siRNA分别和25ng构建的在靶或者种子区脱靶psiCHECK质粒进行共转染。37℃，5％ CO2的环境中培养24h后，使用Dual-Glo luciferase assay system(Promega，E2920)进行双荧光素酶报告测定荧光值。以单独转染psiCHECK质粒无siRNA分子做为对照组，每种双链体进行3-4次独立的转染测试，每条siRNA转染浓度为50nM，10nM，2.0nM，0.4nM，0.08nM，0.016nM，0.0032nM。通过测量Renilla荧光素酶归一化到组成型表达的萤火虫荧光素酶水平来确定靶标抑制效果，并计算siRNA的在靶或者种子区脱靶活性IC50。通过种子区脱靶活性IC50/在靶活性IC50之间的比值评估该siRNA种子区脱靶风险。测试结果见下表。
缀合物种子区脱靶风险评估
| 编号 | On target IC50(nM) | Off target IC50(nM) | Ratio |
| 缀合物1 | 0.001217 | >50 | >41084.6 |
| 缀合物2 | 0.0009985 | 0.3299 | 330.4 |
| 缀合物3 | 0.001448 | >50 | >34530.3 |
| 缀合物4 | 0.001384 | >50 | >36127.1 |
| 缀合物5 | 0.00503 | >50 | >9940.3 |
| 缀合物6 | 0.001359 | 0.4832 | 355.6 |
| 缀合物11 | 0.007037 | 0.7272 | 103.3 |
| 缀合物12 | 0.0882 | 0.2096 | 2.4 |
| 缀合物13 | 0.5061 | >50 | >98.8 |
| 缀合物14 | 0.009281 | >50 | >5387.4 |
| 缀合物15 | 0.08061 | 1.068 | 13.2 |
| 缀合物16 | 0.0622 | 0.231 | 3.7 |
| 缀合物21 | 0.06914 | >50 | >723.2 |
| 缀合物22 | 0.07488 | 0.5347 | 7.1 |
| 缀合物23 | 0.2879 | >50 | >173.7 |
| 缀合物24 | 0.2107 | >50 | >237.3 |
| 缀合物25 | 0.1517 | >50 | >329.6 |
| 缀合物26 | 0.1117 | >50 | >447.6 |
| 缀合物31 | 0.006334 | 2.729 | 433 |
| 缀合物32 | 0.02944 | 0.1539 | 5.17 |
| 缀合物33 | 0.007973 | >50 | >6250 |
| 缀合物34 | 0.01244 | >50 | >4019 |
| 缀合物35 | 0.01063 | >50 | >4703 |
| 缀合物36 | 0.02727 | >50 | >1834 |
实验结果表明，在siRNA反义链种子区引入本发明核苷酸单体后，能够显著降低反义链种子区潜在的脱靶效应，并能保持或提升siRNA的活性，从而对靶基因mRNA进行更高选择地沉默，扩大siRNA药物的安全窗口，能提升siRNA的成药性，从而可以更加有效地治疗因靶基因mRNA引起的相关疾病。
Claims (22)
1.一种具有式I所示结构的核苷酸单体化合物，或其氘代化合物、或其氟代化合物、或其可用的盐：
其中：
Bx为非常规碱基；
R为羟基保护基团；优选地，R选自4,4’-双甲氧基三苯甲基，4-甲氧基三苯甲基；
Sug为核糖环或核糖替代环；
n为0～3；m为0～3；
Z为磷酸酯部分、硫代磷酸酯部分或亚磷酰胺部分。
2.根据如权利要求1所述的化合物，其特征在于：
Sug选自如下结构：
其中，aa端与Bx端相连，bb端与OR端相连，cc端与Z端相连；
X选自O或S；
Y选自氢、卤素、叠氮基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、-O-(C1-C6亚烷基)-O-(C1-C6烷基)、-O-(C1-C6亚烷基)-C(O)NRY1RY2；
RY1、RY2分别独立选自氢、C1-C6烷基、环烷基。
3.根据权利要求1或2所述的化合物，其特征在于：式I所示的化合物如式II或式III所示：
其中，
Bx为非常规碱基；
X选自O或S；
n为0～3；m为0～3；
R为羟基保护基团；优选地，R选自4,4’-双甲氧基三苯甲基，4-甲氧基三苯甲基；
Y选自氢、卤素、叠氮基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、-O-(C1-C6亚烷基)-O-(C1-C6烷基)、-O-(C1-C6亚烷基)-C(O)NRY1RY2；
RY1、RY2分别独立选自氢、C1-C6烷基、环烷基。
Z为磷酸酯部分、硫代磷酸酯部分或亚磷酰胺部分。
4.根据权利要求1或2所述的化合物，其特征在于：式I所示的化合物如式IV所示：
Bx为非常规碱基；
R为羟基保护基团；优选地，R选自4,4’-双甲氧基三苯甲基，4-甲氧基三苯甲基；
n为0～3；m为0～3；
Z为磷酸酯部分、硫代磷酸酯部分或亚磷酰胺部分。
5.根据权利要求1-4任一所述的化合物，其特征在于，
所述的非常规碱基为除常规核苷碱基之外的非常规嘌呤、嘧啶或含氮杂环碱基；
优选地，
非常规碱基选自A环、B环或A环B环相互稠合、桥合而成的环；
A环、B环分别独立选自五元、六元或七元杂环；
A环B环相互稠合、桥合而成的环如式V所示：
其中,
A环、B环分别独立为五元、六元或七元环杂环；
所述杂环含有0～3个O、S或N原子；
A环、B环或A环B环相互稠合、桥合而成的环任选被C1-C6烷基或环烷基、苯基、C1-C3烷基取代的苯基或者卤代苯基取代。
6.根据权利要求5所述的化合物，其特征在于：
所述非常规碱基的具体结构如下：
其中，R、R0选自氢、C1-C6烷基、C3-C6环烷基。
7.根据权利要求5所述的化合物，其特征在于,所述非常规碱基的具体结构如下：
8.根据权利要求1-7任一所述的化合物，其特征在于：
R选自氢或DMT；
m为0；n为0或1；
Y为甲氧基；
Z为
9.根据权利要求1-8任一所述的化合物，其特征在于，所述化合物具体为：
10.权利要求1～9任一所述的核苷酸单体化合物在制备寡核苷酸中作为中间体的用途；优选地，所述寡核苷酸为siRNA。
11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于：权利要求1～8任一所述的核苷酸单体化合物作为中间体在制备siRNA反义链种子区中作为中间体的用途。
12.一种siRNA，其包含正义链和反义链；所述正义链和反义链各自包含15至45个修饰或未修饰的核苷酸，正义链和反义链部分互补形成双链区；其中，所述反义链的种子区中至少含有一个具有式VIa或式VIb所示的结构的核苷酸，并在位点与siRNA其余部分共价连接：
其中：
X分别独立选自O或S；
Y选自氢、卤素、叠氮基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、-O-(C1-C6亚烷基)-O-(C1-C6烷基)、-O-(C1-C6亚烷基)-C(O)NRY1RY2；
RY1、RY2分别独立选自氢、C1-C6烷基、环烷基；
Bx为非常规碱基；
n为0～3。
13.一种siRNA，其包含正义链和反义链；所述正义链和反义链各自包含15至45个修饰或未修饰的核苷酸，正义链和反义链部分互补形成双链区；其中，所述反义链的种子区中至少含有一个具有式VIc所示的结构的核苷酸，并在位点与siRNA其余部分共价连接：
其中，
X分别独立选自O或S；
Bx为非常规碱基；
n为0～3。
14.根据权利要求12或13所述的siRNA，其特征在于：
所述的非常规碱基为除常规核苷碱基之外的非常规嘌呤、嘧啶或含氮杂环碱基；
优选地，
非常规碱基选自A环、B环或A环B环相互稠合、桥合而成的环；
A环、B环分别独立选自五元、六元或七元杂环；
A环B环相互稠合、桥合而成的环如式V所示：
其中,
A环、B环分别独立为五元、六元或七元环杂环；
所述杂环含有0～3个O、S或N原子；
A环、B环或A环B环相互稠合、桥合而成的环任选被C1-C6烷基或环烷基、苯基、C1-C3烷基取代的苯基或者卤代苯基取代。
15.根据权利要求14所述的siRNA，其特征在于：所述非常规碱基的具体结构如下：
其中，R、R0代表自氢、C1-C6烷基、C3-C6环烷基。
16.根据权利要求14所述的siRNA，其特征在于：所述非常规碱基的具体结构如下：
17.根据权利要求11～16任一所述的siRNA，其特征在于：
X为O或S；
n为0或1；
Y选自甲氧基或-OCH2CH2OCH3。
18.根据权利要求11～17任一所述的siRNA，其特征在于：所述siRNA中式VIa或式VIb或式VIc所示的结构具体为：
19.一种药物组合物，包含权利要求11-18任一所述的siRNA以及药学上可接受的载体。
20.一种siRNA缀合物，由权利要求11-18任一所述的siRNA和缀合分子缀合而成。
21.一种试剂盒，包含权利要求11-18任一所述的siRNA、和/或权利要求18所述的药物组合物和/或权利要求19所述的siRNA缀合物。
22.权利要求11-18任一所述的siRNA,、和/或权利要求19所述的药物组合物、和/或权利要求20所述的siRNA缀合物、和/或权利要求21所述的试剂盒在制备药物中的用途。
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