EA028707B1 - Новые лиганды rig-i и способы их получения - Google Patents

Abstract

Изобретение предлагает новые трифосфат-модифицированные олигонуклеотиды, которые можно использовать в качестве лигандов RIG-I, а также новый способ синтеза и очистки, позволяющий получить продукт с высоким выходом и чистотой, подходящей для фармацевтических применений.

Description

Настоящее изобретение предлагает новые трифосфат-модифицированные олигонуклеотиды, которые можно использовать в качестве лигандов К1С-1, а также новый способ синтеза и очистки, позволяющий получать продукт с высоким выходом и чистотой, подходящей для фармацевтических применений.

Уровень техники изобретения

8сЬ1ее е! а1., 1ттиийу, 2009, 31, 25-34 описывают двухцепочечные РНК с тупыми концами, несущие 5'-О-трифосфатный фрагмент на одной из цепей, которые действуют как мощные стимуляторы иммунной системы путем связывания геликазы КЮ-1. Таким образом, существует потребность в простом и эффективном способе получения трифосфат-модифицированных олигонуклеотидов с высокой степенью чистоты, подходящей для фармацевтического применения.

Способы присоединения трифосфатных групп или их аналогов к группе 5'-ОН нуклеозидных соединений хорошо известны в данной области. ЬибЮд 1. е! а1., 1. Огд. Сйет., 1989, 54, 631-635 раскрывают способ трифосфорилирования в растворе с получением 5'-О-трифосфатов нуклеозидов и их аналогов с использованием 2-хлор-4Н-1,3,2-бензодиоксафосфорин-4-она в качестве фосфитилирующего реагента. Сайг К.К. е! а1., 1992, Те1гайебгоп Ье11ег8, 33, 3301-3304 описывают применение указанного способа на твердой фазе для синтеза 2'-О-метилрибонуклеозид-5'-О-трифосфатов и их Р_а-тиоаналогов. В патенте США 6900308 В2 описан твердофазный синтез модифицированных нуклеозид-5'-О-трифосфатов как потенциальных противовирусных соединений, а в патентах США 7285658, 7598230 и 7807653 раскрываются трифосфатные аналоги нуклеозидов с модификациями в сахаре, нуклеотидном основании и в трифосфатном фрагменте.

В \УО 96/40159 описан способ получения кэпированных молекул РНК или аналогов РНК, где олигонуклеотид, представляющий собой РНК или аналог РНК, подвергают взаимодействию с фосфитилирующим реагентом, таким как 2-хлор-4Н-1,3,2-бензодиоксафосфорин-4-он или его производное, с замещением в цикле. Полученное промежуточное соединение подвергают взаимодействию с фосфатом или пирофосфатом или его солью, окисленным или гидролизованным. Ди- или трифосфорилированные РНК или аналоги РНК кэпируют путем взаимодействия с активированным т⁷С три-, ди- или монофосфатом или его аналогом.

В XV О 2009/060281 описаны иммуностимулирующие аналоги олигорибонуклеотидов, содержащие модифицированные олигофосфатные фрагменты, а также способы получения таких соединений. Указанные способы включают в себя синтез олигонуклеотида на твердом носителе, взаимодействие нуклеотида, присутствующего на 5'-конце олигонуклеотида, с фосфитилирующим реагентом, таким как 2-хлор-4Н1,3,2-бензодиоксафосфорин-4-он, в подходящем растворителе и в присутствии основания, взаимодействие фосфитилированного олигонуклеотида с пирофосфатом или аналогом пирофосфата, окисление олигонуклеотида окисляющим реагентом и удаление защитной группы с олигонуклеотида с получением модифицированного олигонуклеотида, содержащего трифосфат или аналог трифосфата.

Электрофорез в полиакриламидном геле, описанный в XVО 96/40159, можно использовать только для мелкомасштабного разделения. Разрешающая способность ионообменной хроматографии для 5'-моно-, ди- и трифосфорилированных продуктов более длинных олигорибонуклеотидов является ограниченной. Необходимость денатурирующих условий делает разделение трудоемкой задачей (§ргоа1, 1999; 21а1еу, 2010; VО 2009/060281), кроме того, продукты обычно загрязнены п-1, п-2 последовательностями и их моно- и дифосфатами, т.е. являются недостаточно чистыми. С учетом чувствительности лигандов К1С-1 к точным терминальным структурам указанные методы очистки не являются оптимальными для фармакологических приложений.

Таким образом, существует настоятельная потребность в новых трифосфорилированных олигонуклеотидах и их аналогах, в частности, обладающих селективностью в отношении К1С-1, а также в способах получения таких соединений.

Следовательно, настоящее изобретение предлагает новые 5'-трифосфорилированные олигонуклеотиды и их аналоги, которые можно получить в условиях крупномасштабного производства для потенциального клинического применения, а также удобный способ получения таких олигонуклеотидов. Кроме того, изобретение описывает модификации олигонуклеотидов, которые позволяют достичь, сохранить и/или улучшить селективность олигонуклеотидов в отношении К1С-1 или повысить их химическую стабильность.

- 1 028707

Таким образом, первый аспект настоящего изобретения относится к модифицированному олигонуклеотиду формулы (I) ν₅ ν₃ V, ιι ιι II

Ζ Υ—X—Ρ—'/<—Ρ—νγ₂—Ρ—νν,—ΟΝ ν„ ν₄ ν₂ I где VI, ν₃ и ν₅, в каждом случае независимо, выбраны из О, 8 и 8е;

ν₂, ν₄ и ν₆, в каждом случае независимо, выбраны из ОН, ОК¹, 8Н, 8К¹, Ρ, ΝΗ2, ΝΗΚ¹, Ν(Κ?)2 и ВН₃ ^-М+;

\₁ обозначает О или 8;

обозначает О, 8, ΝΗ или ΝΚ²;

\₃ обозначает О, 8, ΝΗ, ΝΚ², СН₂, СННа1 или С(На1)₂;

К¹, К² и К³ выбраны из С_1-6алкила, С_2-6алкенила, С_2-6алкинила, С_2-6ацила или циклической группы, каждый из которых может быть необязательно замещен или два К¹ вместе с атомом Ν, связанным с ними, могут образовывать цикл;

М+ обозначает катион,

X обозначает ΝΙ I, ΝΙΡ', О или 8;

Ζ обозначает улавливаемый маркер или Н;

Υ обозначает связь или линкер, соединяющий улавливаемый маркер с X; и

ОN обозначает олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере четыре структурных элемента, представляющих собой нуклеотиды или аналоги нуклеотидов.

Термин олигонуклеотид в контексте настоящего описания охватывает соединения, содержащие несколько, например по меньшей мере четыре, структурных элементов, представляющих собой нуклеотиды или аналоги нуклеотидов. Предпочтительно олигонуклеотид содержит 6-100, например 20-40, структурных элементов. Структурные элементы, представляющие собой нуклеотиды или аналоги нуклеотидов, могут содержать субъединицы из нуклеозидов или аналогов нуклеозидов, соединенных межсубъединичными связями. Нуклеозидные субъединицы включают в себя дезоксирибонуклеозидные субъединицы, рибонуклеозидные субъединицы и/или их аналоги, в частности аналоги нуклеозидов, модифицированные по сахарному остатку и/или нуклеотидному основанию. Кроме того, олигонуклеотиды могут содержать структурные элементы, отличные от нуклеотидов, и/или другие концевые модификации и/или модификации боковых цепей.

В предпочтительных субъединицах, модифицированных по остатку сахара, 2'-ОН рибонуклеозидной субъединицы замещают группой, выбранной из ОК, К, галогена, 8Н, 8К, ΝΙ1₂, NΗΚ, ΝΕ² или С^ где К обозначает С_1-6алкил, С_2-6алкенил или С_2-6алкинил, а галоген представляет собой Ρ, С1, Вг или I. В других предпочтительных субъединицах, модифицированных по остатку сахара, рибоза может быть замещена, например, другим сахаром, например пентозой, такой как арабиноза. Указанную модификацию сахара можно сочетать с описанными выше модификациями 2'-ОН, например, с получением 2'-фторарабинонуклеозидных субъединиц. Другие предпочтительные субъединицы, модифицированные по остатку сахара, включают в себя замкнутые нуклеозиды (ΡΝΆ) или 2',3'-секонуклеозиды (ϋΝΆ). В предпочтительных модифицированных по нуклеотидному основанию нуклеозидных структурных элементах вместо стандартного нуклеотидного основания используют нестандартное, например, не встречающееся в природе, нуклеотидное основание. Примеры нестандартных нуклеотидных оснований включают в себя производные урацила или цитозина, модифицированные по 5 положению, такие как 5-(2-амино)пропилурацил или 5-бромурацил; гипоксантин; 2,6-диаминопурин; производные аденина или гуанина, модифицированные по 8 положению, такие как 8-бромгуанин; деазануклеозиды, такие как 7-деазагуанин или 7-деазааденин; О- и Ν-алкилированные нуклеотидные основания, такие как ^-метиладенин или ^^⁶-диметиладенин. Другие подходящие аналоги нуклеотидов могут быть выбраны из универсальных нуклеотидных аналогов, таких как 5-нитроиндол.

Межсубъединичная связь может представлять собой фосфодиэфирную связь или модифицированную связь, такую как фосфоротиоатная, фосфородитиоатная, метилфосфонатная, фосфорамидатная, боранофосфатная или другая модифицированная связь, известная специалистам в данной области техники.

Олигонуклеотид может быть выбран из дезоксирибонуклеотидов, рибонуклеотидов и аналогов олигонуклеотидов. Дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды и/или аналоги олигонуклеотидов могут быть химически модифицированы по нуклеозидной и/или рибозной субъединице, дезоксирибонуклеотида, рибонуклеотида и/или аналога олигонуклеотида. Аналоги дезоксирибонуклеотидов или рибонуклеотидов могут содержать по меньшей мере одну дезоксирибонуклеозидную или рибонуклеозидную субъединицу и по меньшей мере одну модифицированную нуклеозидную субъединицу и/или по меньшей мере одну модифицированную межсубъединичную связь, например, такую, как описано выше. Аналоги олигонуклеотидов также могут содержать в своей структуре модифицированные нуклеозидные

- 2 028707 субъединицы.

Олигонуклеотид может представлять собой одноцепочечную молекулу или двухцепочечную молекулу. Двухцепочечные олигонуклеотиды могут содержать полностью или частично комплементарные цепи. Двухцепочечные молекулы могут содержать тупые концы или по меньшей мере один липкий конец, например 5'- или З'-липкий конец. Если липкие концы присутствуют, они предпочтительно располагаются на дистальном конце молекулы (по отношению к трифосфату/аналогу трифосфата). Двухцепочечные олигонуклеотиды также могут содержать шпилечную структуру, в которой дуплекс закрыт петлей на дистальном конце (по отношению к трифосфату/аналогу трифосфата). Петля может содержать нуклеотидные и/или ненуклеотидные структурные элементы, например диольные структурные элементы, включающие в себя этиленгликольные фрагменты, такие как три(этилен)гликоль или гекса(этиленгликоль)гликоль; пропан-1,3-диол; додекан-1,12-диол или 3,12-диокса-7,8-дитиатетрадекан1,14-диол.

В предпочтительном варианте осуществления двухцепочечные молекулы содержат тупые концы, в особенности, на ближнем конце (по отношению к трифосфату/аналогу трифосфата).

В соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществления олигонуклеотид является двухцепочечным, причем длина каждой отдельной цепи составляет по меньшей мере 19 нуклеотидов. Двухцепочечный олигонуклеотид указанной длины с тупыми концами является особенно предпочтительным. В соответствии со следующим предпочтительным вариантом осуществления каждая цепь олигонуклеотида содержит в длину по меньшей мере от 19 до 50 нуклеотидов, от 19 до 30 нуклеотидов, от 20 до 30 нуклеотидов, от 22 до 28 нуклеотидов, особенно предпочтительно от 22 до 26 нуклеотидов.

Олигонуклеотид может содержать другие концевые модификации и/или модификации боковых цепей, которые могут включать в себя, например, ковалентное присоединение фрагментов, специфичных к определенным клеткам. Указанные фрагменты могут стимулировать клеточное или клеточноспецифическое поглощение и включают в себя, например, липиды, витамины, гормоны, пептиды, олигосахариды и их аналоги. Специфичные фрагменты, например, можно присоединить к модифицированным нуклеотидным основаниям или ненуклеотидным структурным элементам с помощью способов, известных специалистам в данной области.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления модификации обеспечивают и/или повышают селективность олигонуклеотида к определенной мишени. В особенно предпочтительном варианте осуществления обеспечивается и/или повышается селективность олигонуклеотида в отношении ΚΙΟ-Ι. Методы определения селективности конкретного олигонуклеотида в отношении ΚΙΟ-Ι описаны подробно в данном документе (см. раздел Примеры) и/или известны специалистам в данной области.

В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления химические модификации поддерживают или повышают химическую стабильность олигонуклеотида. Специалистам в данной области техники известны методы определения химической стабильности конкретного олигонуклеотида. Такие способы также описаны, ы частности, в разделе Примеры.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления химические модификации олигонуклеотидов независимо выбраны из группы, включающей в себя галогенирование, например Р-галогенирование, 2'-О-алкилирование, например 2'-О-метилирование, и/или введение фосфоротиоатных межнуклеотидных связей. В частности, Р-галогенирование и введение фосфоротиоатных связей повышают устойчивость олигонуклеотида, тогда как 2'-О-метилирование обеспечивает или повышает селективность олигонуклеотида в отношении ΚΙΟ-Ι. 2'-О-Метилирование также позволяет изменить иммуногенность РНК. В предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид содержит только один или два участка 2'-О-метилирования на цепь, более предпочтительно один участок 2'-О-метилирования на цепь.

Замена 2'-Р является особенно предпочтительной. Гидроксильную группу в 2'-положении рибозы заменяют на фтор. Замены 2'-Р в РНК, в частности, приводят к повышенной стабильности, обусловленной устойчивостью к расщеплению нуклеазой. В другом варианте осуществления 2'-фтор-замещение может, например, усиливать ΚΙΟ-Ι-зависимую стимуляцию иммунной системы.

В соответствии с настоящим описанием фосфоротиоатные соединения, как правило, представляют собой соединения, полученные в результате замены межнуклеотидных связей на фосфоротиоатные.

Фосфоротиоат-модифицированные соединения, несущие модификацию в концевом фрагменте олигонуклеотида, являются особенно предпочтительными. В процессе фосфоротиоатной модификации не участвующий в связывании атом кислорода мостикового фосфата основной цепи нуклеиновой кислоты заменяют на атом серы. Такая замена значительно снижает расщепление нуклеазами по данному положению и приводит к повышению стабильности нуклеотидной цепи.

В особенно предпочтительном варианте олигонуклеотид настоящего изобретения подвергают Р-галогенированию, метилированию, например 2'-О-метилированию, а также введению фосфоротиоатных связей, в частности, на концевом фрагменте олигонуклеотида.

Идентификационные параметры конкретного олигонуклеотида зависят от последовательности и длины олигонуклеотида и могут быть определены для каждого конкретного олигонуклеотида. Специалистам в данной области техники хорошо известно, как осуществить такое определение.

- 3 028707

Как указано выше, такие методы определения КЮ-1-селективности и/или стабильности конкретного олигонуклеотида подробно описаны в настоящем изобретении.

Олигонуклеотид формулы (I) или (IV) содержит группу трифосфат/аналог трифосфата. В данной группе VI, ν₃ и ν₅ независимо выбраны из О, δ и δο. Предпочтительно VI, ν₃ и ν₅ обозначают О. ν₂, ν₄ и ν₆, в каждом случае независимо, выбраны из ОН, ОК¹, δΗ, δΚ¹, Р, ΝΗ2, ΝΗΚ¹, Ν(Κ.')2 и ВН₃ ^-М'. Предпочтительно ν2, ν4 и ν6 обозначают ОН. К¹ может представлять собой С1-6алкил, С_2-6алкенил, С₂₆алкинил, С_2-6ацил или циклическую группу, такую как С_3-8цикло(гетеро)алкильная группа, С_3-8цикло(гетеро)алкенильная группа, фенил или С_5-6гетероарильная группа, где гетероатомы выбраны из Ν, О и δ. Кроме того, два К¹ вместе с атомом азота, с которым они связаны, могут образовывать цикл, например 5- или 6-членный цикл. К¹ может также содержать заместители, такие как галоген, например Р, С1, Вг или I, О(галоген)С_1-2алкил и в случае циклических групп (галоген)С_1-2алкил. М⁺ может обозначать неорганический или органический катион, такой как катион щелочного металла, или катион аммония или амина.

может обозначать О или δ. Предпочтительно ν₁ обозначает О. ν₂ может обозначать О, δ, ΝΗ или ΝΚ². Предпочтительно ν2 обозначает О. ν3 может обозначать О, δ, ΝΗ, ΝΚ², СН2, СННа1 или С(На1)₂. Предпочтительно ν₃ обозначает О, СН₂ или СР₂. К² может быть выбран из группы, описанной выше для К¹. На1 может представлять собой Р, С1, Вг или I.

В соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществления ν₁, ν₂, ν₃, ν₄, ν₅, ν₆, ν₁, ν₂ и ν₃ обозначают О.

Группу, представляющую собой трифосфат/аналог трифосфата, предпочтительно присоединяют к концу олигонуклеотида. Предпочтительно указанную группу присоединяют к 5'-концу олигонуклеотида, в частности, по 5'-ОН 5'-концевого сахарного остатка.

Как указано в данном описании, Ζ обозначает улавливаемый маркер или Н. Улавливаемый маркер Ζ можно функционально определить с помощью ряда приемлемых примеров, как описано ниже. Общее правило может включать в себя следующие положения: Ζ должен обеспечивать удобную очистку, и он должен удаляться в условиях, совместимых с требованиями стабильности рррРНК. Специалист в данной области может определить без лишний усилий, удовлетворяет ли данный маркер функциональному определению или нет. Таким образом, специалистам в данной области известны такие улавливаемые маркеры, сведения о которых также можно получить, в частности, из примеров, подробно описанных в настоящем документе.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления улавливаемый маркер Ζ выбран из длинноцепочечного алифатического остатка, партнера по нековалентному высокоаффинному связыванию, реакционноспособной химической группы, О или ПНС₂-С₂₄ алкила, где О предпочтительно выбран из группы, включающей в себя Н, аминокислоты, аналоги аминокислот, С1-С24-алкил, предпочтительно С12-С24-алкил, пептиды и липиды. Однако в соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществления Ζ обозначает децил, т.е. С₁₀-алкил.

Улавливаемый маркер Ζ в соответствии с настоящим изобретением представляет собой фрагмент, способный нековалентно или ковалентно взаимодействовать с улавливающим реагентом в условиях, которые позволяют проводить отделение соединения, содержащего улавливаемый маркер, например, олигонуклеотида (I), из других соединений, которые не содержат улавливаемый маркер. Предпочтительно улавливающий реагент представляет собой иммобилизованный реагент или реагент, который можно подвергать иммобилизации.

Подходящие улавливаемые маркеры включают в себя длинноцепочечные, такие как С₈-С₂₄, предпочтительно С₁₃-С₂₄, более предпочтительно С₁₃-С₁₄ алифатические алкильные остатки, например октадецил, или другие липидные/липофильные остатки, такие как, например, холестерин, токоферол или тритил, и их производные. Однако в соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществления Ζ обозначает остаток децила. В данном случае содержащий трифосфат фрагмент можно улавливать и очищать на твердой фазе методом стандартной хроматографии на обращенной фазе, таким как ОФ-ВЭЖХ, или гидрофобной хроматографии (ШС). Улавливаемый маркер также может представлять собой перфторалкильный фрагмент, такой как 4-(1Н,1Н,2Н,2Н-перфтордецил)бензильный или 3-(перфтороктил)пропильный остаток, позволяющий специфически улавливать модифицированный олиготрифосфат на фтор-аффинном носителе, например, поставляемом Р1иогои8 Тесйпо1од1е8, Шс.

В другом варианте осуществления улавливаемый маркер может представлять собой первый член пары, способной к нековалентному высокоаффинному связыванию, такой как биотин, или аналог биотина, такой как детиобиотин, гаптен или антиген, который обладает высоким сродством (например, с константой связывания 10^-6 л/моль или менее) к улавливающему реагенту, который представляет собой второй член пары, способной к нековалентному высокоаффинному связыванию, такой как стрептавидин, авидин или антитело.

В следующем варианте осуществления улавливаемый маркер может представлять собой первый член пары, способной к ковалентному связыванию, который может образовывать ковалентную связь с улавливающим реагентом, который представляет собой второй член пары, способной к ковалентному связыванию, где ковалентное связывание может быть обратимым или необратимым. В данном варианте

- 4 028707 осуществления улавливаемый маркер Ζ может представлять собой реакционноспособный химический фрагмент, такой как азидная или алкинильная группа, способная ковалентно взаимодействовать с улавливающим реагентом, содержащим комплементарную реакционноспособную группу, например алкинильный или азидный фрагмент соответственно, в случае реакции 3+2 циклоприсоединения Хьюсгена (так называемая клик-реакция, катализируемая Си(1), или ее вариант, который протекает в отсутствие ионов Си(1) с использованием сильно напряженного цикла, присутствующего, например, в производных циклооктина). Конкретным примером Ζ-Υ-Χ в таком случае является пропаргиламино.

В другом варианте осуществления улавливаемый маркер может представлять собой химический фрагмент, который содержит дополнительную нуклеофильную группу, такую как вторая аминогруппа в реагенте типа ΝΗ₂-Υ-ΧΗ. Затем можно использовать широкий спектр подходящих электрофильных реагентов Ζ, таких как хлорформиат холестерина или Ν-гидроксисукцинимидные активированные эфиры биотина, обеспечивающие введение концевой группы, в то время как олигонуклеотид прикреплен к твердой фазе, что значительно расширяет сферу реакции присоединения концевой группы.

В предпочтительном варианте осуществления улавливаемый маркер представляет собой длинноцепочечный алкильный остаток, перфторалкильный фрагмент, азидную или алкинильную группу.

В следующем варианте осуществления настоящего изобретения олигонуклеотид может содержать второй улавливаемый маркер в другом положении, например, на З'-конце. Первый и второй улавливаемые маркеры предпочтительно выбирают так, чтобы можно было провести очистку посредством двух независимых методов, позволяющих выделить вещество с очень высокой степенью чистоты. Например, первый улавливаемый маркер может представлять собой липофильную группу, которая взаимодействует с соответствующим хроматографическим носителем, а второй улавливаемый маркер может представлять собой биотин, который взаимодействует со стрептавидином.

Второй улавливаемый маркер удобно вводить во время синтеза олигорибонуклеотидов с использованием модифицированного СРС (стеклянный носитель с контролируемым размером пор).

Υ обозначает химическую связь или линкер, такой как алкилен, предпочтительно С1_-6алкиленовый линкер, более предпочтительно С_2-5алкиленовый линкер, или аралкиленовый линкер, необязательно содержащий гетероатомы или группы, содержащие гетероатомы, такие как О, δ, ΝΗ, С=О или С=8, и/или необязательно содержащий связи С=С или СУС. В соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществления Υ представляет собой связь.

В другом предпочтительном варианте осуществления линкер представляет собой полиалкиленоксид, предпочтительно поли-С₂-С₆-алкиленоксид, более предпочтительно поли-С₂-С₃-алкиленоксид. Среднечисленная молекулярная масса линкера может находиться в диапазоне 30-800 г/моль, предпочтительно 40-450 г/моль, более предпочтительно 40-250 г/моль. Линкер может представлять собой [-СН₂СНК⁴-О-]п, где п=1-10, предпочтительно п=1-7, более предпочтительно п=2-5 и еще более предпочтительно п=3. К⁴ может представлять собой Н или С1-6алкил. Другие предпочтительные варианты Υ показаны на фиг. 4. В предпочтительном варианте осуществления К⁴ обозначает Н.

В соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществления

Χ обозначает ΝΗ или О,

Υ обозначает -К-((СНК¹)_т-СН₂-О)_п-К- или

-(О-(СНК³)тз-СН2)п1-(О-(СНК²)т2-СН2)п₂-(О-(СНК¹)_т1-СН2)пз- и

К обозначает О или ΝΗ, т, т1, т2 и т3 независимо обозначают число от 1 до 12, предпочтительно от 1 до 8, более предпочтительно от 1 до 5 и еще более предпочтительно от 1 до 3, п, п1, п2 и п3 независимо обозначают число от 0 до 20, предпочтительно от 0 до 10, более предпочтительно от 0 до 5 и еще более предпочтительно от 0 до 3, и

К¹, К² и К³ независимо обозначают Н, С_1-6алкил, С_2-6алкенил, С_2-6алкинил, С₂-С₆-ацил или циклическую группу, где каждая из указанных групп может быть необязательно замещена, и

К обозначает С_1-6алкил, С_2-6алкенил, С_2-6алкинил, С₂-С₆-ацил или циклическую группу, где каждая из указанных групп может быть необязательно замещена. Предпочтительно К обозначает СН₂СН₂.

В соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществления Υ имеет указанные выше значения, К¹ и К² обозначают Н, п₁ равен 0, а п₂ и п₃ равны 1. Другие предпочтительные варианты осуществления можно найти на фиг. 4.

В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления Υ имеет указанные выше значения, К¹, К² и К³ обозначают Н, а п₁, п₂ и п₃ равны 1.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления X обозначает ΝΗ, К обозначает ΝΗ, а Υ обозначает (СН2СН2О)п, где п имеет указанные выше значения, а К дополнительно замещен холестерин-С(О)-, тритилом или их производными.

В соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществления олигонуклеотида формулы (I) X обозначает ΝΗ или О, Υ обозначает связь, а Ζ обозначает С₁-С₁₂-алкил или Н, предпочтительно С₁₀, О или ΝΗ-С^См-алкил, где О выбран из группы, включающей в себя Н, аминокислоты, аналоги аминокислот, С₁-С₂₄-алкил, предпочтительно С₁₂-С₂₄-алкил, пептиды и липиды, а ν₁, ν₂, ν₃, ν₄, ν₅, ν₆, ν₁, \ν₂ и \ν₃ обозначают О.

- 5 028707

В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления олигонуклеотида формулы (I) X обозначает ΝΗ или О, Υ обозначает связь, Ζ обозначает децил или Н, а VI, У₂, У₃, У₄, У₅, У₆, А_ь А₂ и А₃ предпочтительно обозначают О.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей модифицированный олигонуклеотид, описанный в данном документе.

Фармацевтическая композиция настоящего изобретения может дополнительно содержать фармацевтически приемлемые носители, разбавители и/или адъюванты. Используемый здесь термин носитель включает в себя носители, наполнители и/или стабилизаторы, которые являются нетоксичными для клеток или млекопитающих в используемых дозах и концентрациях. Как правило, физиологически приемлемые носители представляют собой водные забуференные растворы или липосомы. Примеры физиологически приемлемых носителей включают в себя буферы, такие как фосфатный, цитратный и буферы на основе других органических кислот (однако для получения композиции настоящего изобретения предпочтительно используют фосфатный буфер); антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, низкомолекулярные (содержащие менее чем примерно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, такие как глюкоза, манноза или декстрины, огеливающие средства, такие как ΕΌΤΆ, сахара, спирты, такие как маннит или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как ΤΑΕΕΝ, полиэтилен или полиэтиленгликоль. В соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществления соединение настоящего изобретения растворяют в стерильной деионизированной воде.

Такой состав и/или такую композицию настоящего изобретения можно вводить субъекту, нуждающемуся в этом, в частности человеку, в дозе, достаточной для лечения конкретных состояний, с помощью подходящих способов. Например, состав и/или композицию настоящего изобретения можно получить в виде фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемые носители, разбавители и/или адъюванты.

Терапевтическую эффективность и токсичность можно определить стандартными способами. Фармацевтическую композицию можно вводить системно, например внутрибрюшинно, внутримышечно или внутривенно, или местно, например интраназально, подкожно, внутрикожно или интратекально. Дозы вводимых состава и/или композиции, как правило, зависят от субъекта, подлежащего лечению, и от характерных особенностей субъекта, таких как масса субъекта, возраст субъекта, тип и степень тяжести заболевания или повреждения, подлежащего лечению, а также от способа введения и решения лечащего врача.

В предпочтительном варианте осуществления фармацевтическую композицию вводят внутрикожно. Особенно предпочтительно вводить композицию внутрикожно посредством татуировки, микроиглы и/или микроигольного пластыря.

Соединение настоящего изобретения предпочтительно растворяют и разбавляют до желаемой концентрации, используя стерильную деионизированную воду (очищенную воду), затем наносят на выбритую, продезинфицированную этанолом кожу с помощью пипеточного устройства и вводят в кожу путем татуировки.

В случае татуировки, например, водную фармацевтическую композицию настоящего изобретения вводят в кожу с помощью машинки для нанесения (медицинской) татуировки, оборудованной насадкой для нескольких игл (такой как 9-игольная одноразовая насадка).

Типичную процедуру нанесения татуировки проводят следующим образом: фармацевтическую композицию на водной основе наносят пипеткой на выбритую и очищенную этанолом кожу, после чего ее вводят в насадку для нескольких игл татуировочной машинки путем осторожного размещения работающего кончика иглы (работает со скоростью, соответствующей, например, 100-120 Гц, в частности, 100 Гц) в верхней части капли водной фармацевтической композиции. После того как капля водной фармацевтической композиции полностью адсорбируется работающим кончиком иглы, и, следовательно, помещается между работающими иглами, работающий кончик осторожно перемещают назад и вперед по коже, удерживая заполненный игольный наконечник точно под углом 90° к коже. С помощью данного метода водную фармацевтическую композицию полностью татуируют в кожу. Татуировка 50-100 мкл водной фармацевтической композиции на участке кожи 2-4 см² обычно занимает 10-15 с. Преимущество такого способа введения по сравнению с однократной стандартной внутрикожной болюсной инъекцией заключается в том, что водную фармацевтическую композицию равномерно вводят на большом участке кожи, при этом композиция более равномерно и более точно распределяется на ткани-мишени: при использовании 9-игольного наконечника при 100 Гц в течение 10 с данный метод обеспечивает 9000 внутрикожных инъекций, равномерно распределенных в обрабатываемой коже.

Конечно, специалист в данной области техники может модифицировать и корректировать данную процедуру, в зависимости от пациента или части тела, подлежащей обработке. Процедуру микроигольного введения можно проводить аналогично процедуре татуировки. Но при микроигольном введении наконечник для татуировки заменяют наконечником для микроиглы, что делает внутрикожное введение

- 6 028707 более поверхностным. Как правило, фармацевтическую композицию на водной основе наносят пипеткой на выбритую и очищенную этанолом кожу, а затем вводят внутрикожно при помощи наконечника для микроигл аналогично процедуре татуировки. При применении микроигл отсутствует необходимость предварительной адсорбции фармацевтической композиции между микроиглами.

Кроме того, для чрескожной/внутрикожной доставки можно использовать микроигольные пластыри, покрытые или иным образом несущие фармацевтическую композицию. Специфическое преимущество данного способа заключается в том, что внутрикожное введение фармацевтической композиции может безопасно осуществлять сам реципиент без необходимости посещения больницы и/или медицинского вмешательства специалиста по татуировке/микроигольному введению. Данный способ значительно повышает гибкость схем лечения, позволяет использовать высокоперсонализированные схемы лечения, уменьшить боль, связанную с обработкой, и снизить стоимость лечения. Указанные пластыри могут включать в себя, без ограничения, растворяющие или нерастворяющие микроигольные пластыри, обеспечивающие контролируемую по времени, пролонгированную или болюсную чрескожную доставку фармацевтической композиции.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу получения олигонуклеотида по любому из пп.1-15, включающему в себя следующие стадии:

(а) взаимодействие соединения формулы 11а ''У'

ΟΝ

Па где ν₁, ν₃, ν₄, ν₅, ν₆, ^2, и ΟΝ имеют указанные выше значения и ΟΝ защищен по меньшей мере одной защитной группой, с окисляющим реагентом с получением соединения формулы 1ГЬ ^νν₂ ^Уе\1 ΙχΧ² /^р<

ν₅/ V, νν,-ΟΝ _||Ь где ν₁, ν₃, ν₅ и ν₂, ν₄, ν₆, ^₁, ^₂, ^₃ и ΟΝ имеют указанные выше значения и ΟΝ защищен по меньшей мере одной защитной группой;

(b) взаимодействие соединения формулы (ГГЬ) с улавливающим реагентом формулы (ГГГ)

Ζ-Υ-ΧΗ (III), где X, Ζ и Υ имеют указанные выше значения и где X предпочтительно обозначает Ο, с получением продукта реакции, содержащего олигонуклеотид формулы (Г), (c) удаление по меньшей мере одной защитной группы с ΟΝ и (ά) приведение в контакт продукта реакции, полученного на стадии (Ь), с улавливающим реагентом, способным взаимодействовать с улавливаемым маркером, где приведение в контакт осуществляют в условиях, обеспечивающих отделение олигонуклеотида (Г) от других веществ, содержащихся в указанном продукте реакции.

Вариант осуществления, в котором X обозначает Ο, является особенно предпочтительным.

Олигонуклеотид ΟΝ, используемый в способе настоящего изобретения, содержит по меньшей мере одну защитную группу. В соответствии с настоящим изобретением защитные группы используются, в частности, для защиты групп 2'-ОН рибозной субъединицы используемого олигонуклеотида. Специалистам в данной области техники известны защитные группы, подходящие для синтеза, в особенности, специалистам, работающим в области синтеза нуклеотидов. Предпочтительно использовать защитные группы в положении 2'-ОН рибозной субъединицы олигонуклеотида. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения в 2'-положении рибозной субъединицы используют защитные группы, чувствительные к фториду.

Особенно предпочтительными являются защитные группы 2'-Ο-ΤΒΌΜ8 или 2'-Ο-ΤΟΜ. В особенно предпочтительном варианте осуществления используют защитную группу ΤΒΌΜ8.

В частности, в процессе синтеза соединений, в которых Х^ и которые обладают повышенной стабильностью связывания Ζ-Υ-Χ-РРР, удаление защитных групп с 2'-ОН можно проводить в широком диапазоне условий.

Все реагенты, обычно используемые для удаления защитных групп, можно использовать для отщепления защитной группы ΤΒΌΜ8. Например, можно использовать следующие реагенты:

(a) триэтиламинтригидрофторид, необязательно в сочетании с полярным растворителем;

(b) триалкиламин, триэтиламинтригидрофторид и полярный растворитель;

- 7 028707 (с) пиридин-НР и другие аддукты гидрофторида и органических азотистых оснований;

(ί) фторид аммония;

(е) фторид тетра-н-бутиламмония;

(ί) фторид тетраметиламмония, другие фториды тетраалкиламмония и их сочетания.

Стадию (с) предпочтительно проводят в условиях, которые не вызывают разрушение трифосфатного фрагмента, например, как подробно описано ниже.

Стадия (а) способа настоящего изобретения включает в себя взаимодействие циклических фрагментов Р(У)-Р(У)-Р(Ш) формулы (11а) с окисляющим реагентом. Соединение формулы (11а) можно получить с помощью стандартных методов, описанных в Ιτιί\νΐ« е! а1., 1989, выше и Сайг е! а1., 1992, выше, а именно, путем взаимодействия 5'-концевой ОН-группы олигонуклеотида с трифункциональным фосфитилирующим реагентом, таким как 2-хлор-4Н-1,3,2-бензодиоксафосфорин-4-он, в подходящих условиях, например в присутствии основания (такого как пиридин или диизопропилметиламин), и в подходящем растворителе, таком как диоксан или дихлорметан, с последующим взаимодействием с пирофосфатом (^₃=О) или модифицированным пирофосфатом (^₃ отличается от О и обозначает, например, СН₂, СС1₂, ΝΗ или СР₂). Предпочтительно три-н-бутиламмониевую соль пирофосфата или модифицированного пирофосфата используют в ДМФ. Затем полученное циклическое промежуточное соединение Р(Ш)-Р(У) (11а) окисляют в безводных условиях, например, пероксидом, таким как третбутилгидропероксид, гидропероксид кумола, (10-камфорсульфонил)оксазиридин. Альтернативно, можно использовать комплекс фенилацетилдисульфида (У₂=8) или боран-диизопропилэтиламина (У₂=ВН₃) соответственно, с получением соответствующего циклического соединения формулы (ПЬ), содержащего на 5'-конце трифосфат/аналог трифосфата. Информацию по данной реакции также можно найти в Ж4 96/40159 или Ж4 2009/060281, содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Стадию (а) реакции можно проводить, используя олигонуклеотид в растворе, или олигонуклеотид, присоединенный к твердой фазе, такой как органическая смола или стекло, такое как СРС. Олигонуклеотид может дополнительно содержать защитные группы, например защитные группы для сахарных остатков или нуклеотидных оснований, хорошо известные специалистам в данной области. Предпочтительные примеры защитных групп включают в себя 2-цианоэтил для межнуклеозидной фосфодиэфирной или фосфоротиоатной связи, трет-бутилдиметилсилил, триизопропилсилилоксиметил или бис(ацетоксиэтокси)метил для 2'-гидроксильной группы рибозы, 4-трет-бутилфеноксиацетил или феноксиацетил, ацетил, изобутирил, бензоил для экзоциклической аминогруппы нуклеотидных оснований. Более предпочтительно стадию (а) проводят, используя олигонуклеотид, присоединенный к твердой фазе.

На стадии (Ь) способа настоящего изобретения соединение (ПЬ) подвергают взаимодействию с улавливающим реагентом формулы (III)

Ζ-Υ-ΧΗ (III) где X обозначает группу, выбранную из ΝΗ, ΝΚ³ или О, а X и Υ имеют указанные выше значения. К³ имеет значения, описанные выше для К¹.

В частности, если X обозначает О, для раскрытия цикла можно использовать реагент с ограниченной нуклеофильностью, такой как деканол (см. фиг. 1, стадия 4). Такую стадию можно проводить при комнатной температуре, например, в течение 48 ч, с превращением циклотрифосфата в целевой сложный γ-эфир трифосфата.

На стадии (с) удаляют защитные группы с ΟΝ.

При проведении стадии (с), например, указанные выше реагенты (а) и (Ь) для удаления защитных групп можно использовать в условиях, включающих в себя, если Х=О, время реакции от 20 до 180 мин, более предпочтительно от 60 до примерно 150 мин, в частности примерно 120 мин, температуру реакции 60-70°С, в частности примерно 65°С. Если Χ=ΝΗ, такие реакции исключаются вследствие разной стабильности связывания или могут проводиться лишь в значительно худших условиях реакции, например, в течение 40 ч при комнатной температуре.

Стадия (ί) способа настоящего изобретения включает в себя приведение в контакт продукта реакции, полученного на стадии (Ь), с улавливающим реагентом, способным взаимодействовать с улавливаемым маркером Ζ в условиях, обеспечивающих отделение олигонуклеотида (I), содержащего улавливаемый маркер, от других веществ, содержащиеся в продукте реакции. Перед стадией (ί) олигонуклеотид (I), присоединенный к твердой фазе, отделяют от твердой фазы и подвергают частичному или полному удалению защитных групп. Улавливающий реагент предпочтительно иммобилизуют на подходящей подложке, такой как хроматографический носитель. Чтобы обеспечить отделение олигонуклеотида (I), содержащего улавливаемый маркер, от веществ, не содержащих улавливаемый маркер, продукты реакции, полученные на стадии (Ь), отщепляют от твердой фазы и подвергают удалению защитных групп, если это необходимо, после чего их разделяют предпочтительно с использованием хроматографического метода разделения, основанного на взаимодействии улавливаемого маркера Ζ с улавливающим реагентом. С помощью стадии разделения чистоту олигонуклеотида (I), которая обычно находится в диапазоне 25-70% по отношению к неочищенному веществу, в зависимости от длины и сложности последователь- 8 028707 ности, можно повысить до 90, 91, 92, 93, 94, 95% или более. Для исследования токсичности желательно, чтобы чистота составляла >85%, тогда как на последней стадии клинических испытаний чистота должна находиться в диапазоне, составляющем по меньшей мере 90-95%. Таким образом, настоящее изобретение предлагает способ получения рррРНК с высокой степенью чистоты, необходимой для проведения клинических испытаний на людях.

На стадии (б) улавливаемый маркер и способный взаимодействовать с ним улавливающий реагент предпочтительно выбирают из (ΐ) гидрофобной или фторированной группы и хроматографического материала, обладающего сродством к гидрофобным или фторированным группам, такого как обращенная фаза или носитель, обладающий сродством к фтору; (и) первого партнера по нековалентному высокоаффинному связыванию и второго комплементарного партнера по нековалентному высокоаффинному связыванию; (ΐΐΐ) первого партнера по ковалентному связыванию и второго комплементарного партнера по ковалентному связыванию, где первый партнер и второй партнер образуют ковалентные связи.

Улавливаемый маркер функционально определяют ниже с помощью ряда приемлемых примеров. Общее правило может включать в себя следующие положения: Ζ должен обеспечивать удобную очистку, и он должен удаляться в условиях, совместимых с требованиями стабильности рррРНК.

Кроме того, способ может дополнительно включать в себя стадию (е) удаления улавливаемого маркера с получением олигонуклеотида формулы (IV). В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, если Х=О, получают соединение формулы (Ινα) или (Ινδ):

(1Уа) или (1УЬ) а если Χ=ΝΗ, получают соединение формулы (Ινα)

(ΐν₃) ν₄ ν₂

Стадия (е) должна быть совместимой с требованиями стабильности конечного продукта, содержащего трифосфат, а также с требованиями стабильности межрибонуклеотидной связи. Такие требования могут включать в себя расщепление в слабокислой среде, если X обозначает ΝΗ, расщепление ионами серебра, если X обозначает δ, расщепление тиолом, таким как дитиотреитол, приводящее к удалению тиирана, если Υ-Χ-Ρ содержит -3-3-СН₂-СН₂-О-Р.

В других вариантах осуществления улавливаемый маркер Ζ не удаляют или удаляют не полностью. В таких вариантах осуществления маркер-содержащий олигонуклеотид можно использовать, например, в качестве фармацевтического средства.

В указанных вариантах осуществления реагент Ζ-Υ-ΧΗ должен быть выбран из подгруппы Ζ-остатков, функционально совместимых со структурными требованиями воспринимающего элемента ΡΙΘ-Ι. Например, известно, что этим требованиям отвечает сочетание Ζ=децил-октадецил, Υ=связь, Χ=ΝΗ или О.

Модифицированные олигонуклеотиды, содержащие трифосфат/аналог трифосфата, полученные по способу настоящего изобретения, сугубо подходят для фармацевтического применения вследствие их высокой чистоты. В особенно предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид (I) или (IV) является активатором геликазы ΡΙΘ-Ι. Конкретные примеры подходящих активаторов ΚΙΘ-Ι раскрыты в ЗеЫее е! а1., 2009, выше, содержание которого включено в настоящее описание в качестве ссылки.

- 9 028707

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показано схематическое изображение синтеза сложноэфирных трифосфатных производных олигонуклеотидов.

На фиг. 2 показаны результаты анализа продуктов синтеза децил-О-рррРНК 24-мер (последовательность РНК: 5'-ОЛСОСиОАСССиОЛЛОииСЛиСии) методами ОФ-ВЭЖХ и Е81-ЖХ/МС.

(A) Хроматограммы ОФ-ВЭЖХ:

a) неочищенной реакционной смеси, содержащей 48% децил-О-рррРНК (время удерживания= 14 мин),

b) чистой децил-О-рррРНК.

Колонка: НатШои РКР-1 4,1x250, 10 мкм.

Градиент: 0-100% В в течение 18 мин, А=100 мМ ТЕАВ; В=80% метанол, 100 мМ ТЕАВ.

(B) ΕδΙ-МС профиль чистой децил-О-рррРНК, зарегистрированный с использованием ОФ-ЖХ/МС (МВ рассчитанный: 7987, обнаруженный: 7968).

На фиг. 3 показана очистка реакционной смеси, содержащей децил-О-рррРНК, в масштабе 1 мкмоль методом полупрепаративной ОФ-ВЭЖХ: децильный маркер обеспечивает эффективное отделение целевого продукта (фракция 3) от побочных продуктов, не содержащих маркера, включающих в себя последовательности, образовавшиеся в результате неполного синтеза, полноразмерную нефосфорилированную ОН-РНК и недериватизированную рррРНК.

Колонка: НатШои РКР-1 7x250 мм, 10 мкм.

Градиент: 0-80% В в течение 50 мин, А=100 мМ ТЕАВ; В=80% метанол, 100 мМ ТЕАВ.

Фиг. 4: Особенно предпочтительные варианты Υ.

Фиг. 5: Скрининг 2'-О-метилирования позволяет выявить положения, отвечающие за селективность в отношении КЮ-Ι.

Фиг. 6: Метилирование делает дуплекс КЮ-Ι специфичным и высокоактивным.

Фиг. 7: Концевые фосфоротиоаты увеличивают иммуногенность селективного дуплекса.

Фиг. 8: Отдельные замены 2'-фтор повышают активационный потенциал дуплекса в отношении КЮ-Ι.

Фиг. 9: Многократная модификация ОН дц-РНК ОН-ОГР2 приводит к сильному увеличению активационного потенциала в отношении КЮ-Ι.

Фиг. 10: Повышение иммуногенности в результате модификаций скелета может передаваться трифосфорилированному дуплексу.

Фиг. 11: Показана схема способа настоящего изобретения с использованием диэтиленгликольмонобутилового эфира в качестве примера алкилполиэтиленгликоля как нуклеофильного реагента, используемого для раскрытия цикла.

Фиг. 12: Очистка методом ОФ-ВЭЖХ реакционной смеси С4-ЭЕО-рррРНК, содержащей 45% С4-ЭЕО-рррРНК (пик соответствует объему градиента 88,4 мл) и 50% рррРНК (пик соответствует 77,5 мл) Колонка: НатШои РКР-1 7x250 мм, 10 мкм, скорость потока 3 мл/мин.

Градиент: 1-80% В в течение 50 мин, А=0,1 М ТЕАВ; В=80% метанол, 0,1 М ТЕАВ.

Фиг. 13: Спектр С4-ЭЕО-рррРНК, полученный методом ΜΛΕΌΙ-ΤΟΓ после очистки ВЭЖХ. Надлежащий массовый пик соответствует т/ζ 7972,6 (А).

На фиг. 14 показана схема синтеза рррРНК с использованием липофильного полиэфирного композитного маркера.

На фиг. 15 показаны очистка ВЭЖХ и результаты ΜΛΕΌΙ, относящиеся к фиг. 14 (последовательность рнк 5'-олСОСиолСССиоллоииСлиСии).

(Л) ОФ-ВЭЖХ очистка С11-СОХН-СН₂СН₂СН₂-(О-СН₂СН₂)₂-О-СН₂СН₂СН₂-МН-рррРНК.

Колонка: НатШои РКР-14,1х250 мм, 10 мкм.

Градиент: 0-80% В в течение 50 мин; А=100 мМ ТЕАВ, В=80% метанол, 100 мМ ТЕАВ.

(B) МЛт-спектр неочищенной реакционной смеси после обессоливания демонстрирует присутствие С11-СОХН-СН₂СН₂СН₂-(О-СН₂СН₂)₂-О-СН₂СН₂СН₂-МН-рррРНК (МВ 8214,8).

(C) МЛЬ-Э Ι-спектр продукта гидролиза при рН=3,8 очищенной

С11-СОМН-СН₂СН₂СН₂-(О-СН₂СН₂)₂-О-СН₂СН₂СН₂-МН-рррРНК (МВ 7832,6).

На фиг. 16 показана схема синтеза холестерил-меченой рррРНК с необязательным отщеплением соответствующей рррРНК.

На фиг. 17 показаны очистка и анализ холестерил-меченой рррРНК (последовательность РНК: 5'-олСОСиолСССиоллоииСлиСии):

(Л) ОФ-ВЭЖХ очистка холестерил-СОМН-СН₂СН₂-(О-СН₂СН₂)₂-МН-ррр-РНК.

Колонка: НатШои РКР-1 4,1x250 мм, 10 мкм.

Градиент: 0-10% В в течение 5 мин, 10% В в течение 9 мин, 10-100% В в течение 33 мин; А=50 мМ ТЕАВ, В=95% метанол, 50 мМ ТЕАВ.

(В) ОФ-ВЭЖХ анализ чистой холестерил-СОХН-СН₂СН₂-(О-СН₂СН₂)₂-НН-ррр-РНК.

Колонка: НатШои РКР-1 4,1x250 мм, 10 мкм.

- 10 028707

Градиент: 0-100% В в течение 18 мин, 100% В в течение 4 мин; А=50 мМ ТЕАВ, В=95% метанол, 50 мМ ТЕАВ.

(С) ΜΑΕΌΙ-спектр чистой холестерил-СОЫН-СН₂СН₂-(О-СН₂СН₂)₂-ЫН-ррр-РНК.

Пик рррРНК (7827,3 Да) обусловлен ΡΝ-расщеплением в процессе ионизации.

Примеры

Пример 1. Получение 5'-децил-О-трифосфата РНК.

Как указано на схеме (фиг. 1), процесс синтеза децил-О-трифосфата РНК включает в себя следующие стадии:

1-4) 5'-Децил-О-трифосфат РНК.

Связанную с носителем, полностью защищенную 5'ОН-РНК (1 мкмоль) сушат в течение 3 ч под вакуумом в колонке для синтеза, а затем промывают безводной смесью пиридин/диоксан (1:3, об./об., 4 мл). В атмосфере аргона свежеполученный 1 М раствор 2-хлор-4Н-1,3,2-бензодиоксафосфорин-4-она в безводном диоксане (100 мкл, 100 мкмоль) вводят в колбу, содержащую 2 мл безводной смеси пиридин/диоксан (1:3, об./об.). Полученный 50 мМ фосфитилирующий раствор вводят в колонку для синтеза и медленно перемещают назад и вперед во время реакции, продолжающейся 30 мин. Затем получают раствор пирофосфата тетра(три-н-бутиламмония) путем смешивания 0,5 М раствора пирофосфата бис-(три-н-бутиламмония) в ДМФ (1 мл, 0,5 ммоль) и три-н-бутиламина (238 мкл, 1 ммоль). Раствор пирофосфата пропускают через колонку и после вытеснения из колонки и отбрасывания избытка фосфитилирующего реагента оставшийся раствор пирофосфата продавливают вперед и назад с помощью двух шприцев. Через 10 мин колонку промывают безводным ацетонитрилом (3 мл). 5,5 М раствор третбутилгидропероксида в декане (300 мкл) растворяют в безводном ацетонитриле (2 мл) и приводят в контакт с носителем для синтеза. Через 15 мин колонку промывают безводным ацетонитрилом (6 мл). Затем гомогенный раствор Ν-метилимидазола (240 мкл, 3 ммоль), три-н-бутиламина (250 мкл, 1,1 ммоль) и Ν-децилового спирта (2 мл, 10,5 ммоль) многократно продавливают назад и вперед через колонку и оставляют взаимодействовать в течение 48 ч, чтобы достичь превращения циклотрифосфата в децил-О-трифосфат. Колонку промывают безводным ацетонитрилом (6 мл) и обрабатывают 0,1 М раствором бикарбоната триэтиламмония (ТЕАВ, 2 мл) в течение 20 мин, чтобы гидролизовать непрореагировавший циклотрифосфат и избежать неспецифической дериватизации при последующей процедуре удаления защитных групп. После очередной стадии промывки безводным ацетонитрилом (9 мл) носитель для синтеза сушат в потоке аргона.

5-6) Удаление защитных групп и очистка.

5'-Децил-О-трифосфат олигонуклеотида приводят в контакт со свежеприготовленным 40% водным раствором метиламина и концентрированным водным раствором аммиака (АМА, 1:1, об./об., 2 мл) с помощью двух шприцев. После расщепления в течение 30 мин раствор переносят в чистый флакон с завинчивающейся пробкой и носитель промывают АМА (1 мл). Объединенный раствор и раствор для промывания нагревают в течение 10 мин при 65°С. После охлаждения на льду раствор упаривают досуха и остаток сушат путем совместного упаривания с абсолютным этанолом. Защитные группы 2'-Ο-ΤΒΌΜδ можно удалить путем обработки тригидрофторидом триэтиламина (ΤΕΑ-3ΗΡ) без значительной потери фрагмента модифицированного трифосфата. Децил-О-трифосфат олигонуклеотида повторно растворяют в свежеприготовленном растворе Ы-метилпирролидона/триэтиламина/ТЕА-3НР (ΝΜΡ/ΤΕΑ/ΤΕΑ-3ΗΡ, 6:4:3, об./об., 325 мкл) и раствор нагревают при 65°С в течение 2 ч. Альтернативно, для удаления защитных групп можно использовать раствор ΤΕΑ об/об 3НР в ДМСО (1:1, об./об., 600 мкл). После полного удаления защитных групп децил-О-трифосфат олигонуклеотида осаждают из раствора для удаления защитных групп н-бутанолом и очищают методом ВЭЖХ. Липофильный децильный маркер позволяет отделить децил-О-трифосфат от примесей, которые не содержат данный маркер, с помощью хроматографии на обращенной фазе. Продукт реакции наносят на колонку РКР-1 7x250 мм и разделяют в линейном градиенте от 0 до 100% буфера В в течение 50 мин при скорости потока 3 мл/мин. Буфер А представляет собой 100 мМ ТЕАВ, а буфер В представляет собой 100 мМ ТЕАВ в 80% метаноле. Фракции, содержащие продукт, собирают, упаривают и обессоливают путем многократного совместного упаривания с метанолом. Остаток растворяют в воде и превращают в натриевую соль путем осаждения этанолом в присутствии 0,3 М хлорида натрия.

Пример 2. Получение 5' рррРНК гамма 2-(2-бутоксиэтокси)этилового эфира (С4-ЭЕО-рррРНК).

Схема реакции, описанная в примере 2, показана на фиг. 11.

Стадия 1: 203 мг (1 ммоль) 2-хлор-4Н-1,3,2-бензодиоксафосфорин-4-она растворяют в 1 мл сухого диоксана во флаконе с перегородкой емкостью 10 мл в атмосфере аргона.

Стадия 2: Колонку для синтеза, содержащую полностью защищенную РНК, детитрилированную и тщательно промытую ацетонитрилом, сушат в вакууме в течение 12 ч. Содержимое колонки тщательно промывают путем многократного всасывания и выталкивания 2 мл раствора безводного диоксана в пиридине 3:1 (об./об.) в атмосфере аргона.

Стадия 3: Во флакон вначале добавляют 2 мл смеси пиридин/диоксан, 3:1 об./об., и затем 100 мкл 1 М раствор 2-хлор-4Н-1,3,2-бензодиоксафосфорин-4-она в сухом диоксане с получением 50 мМ раство- 11 028707 ра фосфитилирующего реагента, такого как 2-хлор-4Н-1,3,2-бензодиоксафосфорин-2-он, в смеси диоксан/пиридин, 3:1 (об./об.). Раствор гомогенизируют путем осторожного встряхивания. Инициируют реакцию, пропуская раствор 2-хлор-4Н-1,3,2-бензодиоксафосфорин-4-она из флакона через колонку для синтеза.

В процессе реакции в колонку для синтеза многократно засасывают с последующим выталкиванием раствор, содержащий 2-хлор-4Н-1,3,2-бензодиоксафосфорин-4-он, чтобы обеспечить тесный контакт и тщательное перемешивание с РНК, иммобилизованной на твердой фазе. Время реакции 30 мин обычно позволяет достичь почти количественного превращения свободной группы 5'-ОН олигомера, связанного с носителем, в диапазоне 20-40 нт.

Стадия 4: После протекания реакции в течение 30 мин диоксан/пиридиновый раствор, содержащий избыток фосфитилирующего реагента, выдавливают в контейнер для отходов, заполняют новый шприц перемешанной на вортексе смесью 1 мл 0,5 М раствора (Βυ₃ΝΗ)₂ пирофосфата в сухом ДМФА и 238 мкл (1 ммоль) сухого Βυ₃Ν с получением 0,5 М раствора (Βυ₃Ν)₄ пирофосфата. Данный раствор продавливают через колонку, тем самым заменяя диоксан/пиридиновый раствор. Большой избыток пирофосфата обеспечивает количественное превращение промежуточного соединения в циклический ангидрид Р(Ш)-Р(У) ПА.

Стадия 5: Колонку промывают 3 мл СН₃СЛ, чтобы удалить ΌΜΡ и избыток ΡΡί, после чего реактор колонки заполняют сухим СН₃СЛ.

Стадия 6: 300 мкл трет-ВиООН (5,5 М раствор в декане, Зфта-АИпсН) растворяют в 2 мл безводного СН₃СЛ с получением примерно 0,7 М гомогенного раствора. Осуществляют контактирование носителя для синтеза с данным раствором в течение 15 мин с получением окисленного Р(У) циклического ангидрида ПЬ.

Стадия 7: Колонку промывают 3 мл сухого СН₃СЛ, чтобы удалить лишнюю перекись, и заполняют ее сухим ί'Ή,ί’Ν.

Стадия 8: 2 мл сухого 2-(2-бутоксиэтокси)этанола (монобутиловый эфир диэтиленгликоля), содержащего 0,1 М Ν-метилимидазол и 0,1 М три-н-бутиламин, приводят в контакт с носителем в колонке. Время контакта СРС со спиртом должно составлять по меньшей мере 48 ч при комнатной температуре.

Стадия 9: Колонку тщательно промывают 9 мл ацетонитрила и затем осуществляют контактирование колонки с 2 мл 0,1 М раствора ТЕАВ (триэтиламмония бикарбоната) в воде в течение 1 ч, чтобы гидролизовать непрореагировавший циклотрифосфат.

Стадия 10. Первая стадия удаления защитных групп: 1 мл раствора для удаления защитных групп (40% водный раствор метиламина/конц. водный раствор аммиака 1:1 об./об., реагент АМА) пропускают через носитель 2-3 раза. После контактирования в течение 30 мин раствор переносят в новый флакон. Носитель промывают таким же объемом раствора для удаления защитных групп АМА и объединяют смывы. Объединенные раствор и смывы нагревают в течение 10 мин при 65°С. После охлаждения на льду раствор концентрируют до объема 300-500 мкл и затем упаривают досуха.

Стадия 11. Удаление защитных групп 2'-Ο-ΤΒΌΜδ: Остаток сушат путем добавления 300 мкл сухого этанола и совместного упаривания, добавляют 1 мл сухого 1 М раствора ΤΒΑΕ (тетра-н-бутиламмония фторид) в ТГФ, плотно закрывают и помещают на шейкер, где держат в течение 16 ч. Реакцию гасят добавлением 1 мл стерильного 1 М водного раствора ТЕАВ (триэтиламмония бикарбонат), после чего реакционную смесь обессоливают на колонке ΝΑΡΤΜ-25 (для очистки нуклеиновых кислот), используя стерильную воду в качестве элюента. На данной стадии иногда необходимо провести фильтрацию через стерильный фильтр с размером пор 2 мкм. УФ-поглощающие фракции объединяют и упаривают до объема 150 мкл, затем добавляют 100 мл 1 М ТЕАВ, рН 8 и полученный раствор хранят в замороженном состоянии при температуре -20°С до проведения очистки методом ВЭЖХ.

Стадия 12. Очистка методом ВЭЖХ: Продукт реакции из реакционной смеси 1-микромолярного масштаба, полученной на стадии 11, загружают в колонку 7x25 мм РКР-1 (НатШоп). Очистку проводят с использованием линейного градиента буфера В от 0 до 80% в течение 50 мин при скорости потока 3 мл/мин. Буфер А представляет собой 100 мМ раствор ТЕАВ, а буфер В представляет собой 100 мМ раствор ТЕАВ в смеси метанол/вода 8:2 об./об. Типичный пример очистки молекулы, содержащей 24 мономера, показан на фиг. 3. Сочетание 4-атомного алкильного маркера и остатка диэтиленгликоля является достаточным практически для полного отделения от рррРНК. Фракции, соответствующие пику при 88,4 мл, объединяют, упаривают на роторном испарителе и обессоливают путем нескольких совместных упариваний с сухим метанолом.

Пример 3. Дериватизация рррРНК с использованием липофильных полиэфирных композитных маркеров с предварительно полученными липофильными полиэфирными аминами.

В примере 3 используют липофильные полиэфирные амины структуры ΖΥ-Η для получения ΖΥΝΗ-рррРНК.

Часть А: Экономичный крупномасштабный способ получения липофильного полиэфирного амина

Данную процедуру, которую можно проводить без колоночной флэш-хроматографии, обычно применяют для синтеза моноамидов из водорастворимых диаминов и метиловых эфиров липофильных карбоновых кислот.

- 12 028707

Синтез М-лаурил-4,7,10-триокса-1,13-тридекандиамина (соединение 3, фиг. 14.): 4,7,10-триокса1,13-тридекандиамин (43,8 мл, 200 ммоль) растворяют в 32,5 мл метанола. Медленно при перемешивании добавляют метиловый эфир лауриновой кислоты (4,92 мл, 20 ммоль), после чего закрытую колбу держат при комнатной температуре в течение 5 дней. Метанол удаляют из реакционной смеси на роторном испарителе и остаток растворяют в 100 мл этилацетата. Избыток диамина удаляют путем экстракции водой (2x120 мл) и затем концентрированным раствором хлорида натрия (2x100 мл). Этилацетатную фазу упаривают и остаточное масло кристаллизуют при стоянии при -20°С с получением 6,8 г (17 ммоль) чистого Ν-лаурил 4,7,10-триокса-1,13-тридекандиамина.

Часть В: Реакции открытия цикла на СРС-связанном циклотрифосфате РНК с использованием ^лаурил-4,7,10-триокса-1,13 -тридекандиамина.

СРО-связанный циклотрифосфат РНК (соединение 4, фиг. 14) синтезируют по способу, включающему в себя стадии 1-7, описанные в предыдущем примере 2. Реакцию открытия цикла в циклотрифосфате РНК, иммобилизованном на твердой фазе, проводят с использованием 0,08 М раствора Ν-лаурил4,7,10-триокса-1,13-тридекандиамина в ацетонитриле. Раствор ацетонитрила приводят в контакт с СРО и держат в течение 3 ч при комнатной температуре, после чего носитель промывают 10 мл сухого ацетонитрила и продувают сухим аргоном. Отсоединение от носителя, удаление защитных групп и последующую обработку методом ВЭЖХ проводят в точном соответствии со стадиями 10-12 примера 2. Продукт 5 элюируют при концентрации метанола 75% (фиг. 15). Спектральный анализ реакционной смеси методом МАЬИ1 подтверждает структуру соединения 5 (МВ 8214,8 Да, фиг. 15Ь).

Кроме того, маркер очистки можно удалить с получением соответствующего трифосфата олигонуклеотида: 100 нмоль н-лаурил-замещенного гамма амида (соединение 5, фиг. 14) растворяют в 400 мкл буфера для удаления защитных групп, рН 3,8, в пробирке Эппендорфа объемом 2 мл, которую затем герметично закрывают и нагревают при 60°С в течение 70 мин. В данных условиях происходит количественное расщепление фосфорамидатной связи соединения 5 при отсутствии деградации трифосфатного фрагмента. Реакционную смесь охлаждают на льду и затем добавляют 14 мкл стерильного 5 М раствора Ναί'Ί и 1,2 мл абсолютного этанола. Осадок собирают центрифугированием, промывают холодным этанолом, сушат на §рееб Уас, растворяют в стерильной воде и хранят в замороженном состоянии при -20°С.

Спектральный анализ методом МАЬИ1 подтверждает предполагаемый МВ продукта рррРНК (МВ 7832 Да, фиг. 15С).

Пример 4. Способ дериватизации рррРНК в колонке с использованием липофильных полиэфирных композитных маркеров.

Пример 4 представляет собой двухстадийную процедуру дериватизации в колонке иммобилизованного олигонуклеотида ΗΥΝΗ рррРНК с получением ΖΥΝΗ-рррРНК.

Получение холестерил-меченого трифосфата РНК (СЬ1-СΟNΗ-СΗ₂СΗ₂-(Ο-СΗ₂СΗ₂)₂-NΗ-ррр-РНК, соединение 4, фиг. 16)

Конъюгирование липофильного холестерильного маркера с трифосфатом РНК позволяет эффективно отделять продукт маркер-рррРНК от немеченных примесей методом ОФ-ВЭЖХ. Схема реакции получения холестерил-меченого трифосфата РНК показана на фиг. 16. На первой стадии связанную с носителем, полностью защищенную 5'ОН-РНК превращают в промежуточное соединение циклический трифосфат (соединение 2, фиг. 16) по способу, описанному в стадиях 1-7 примера 2. Затем колонку промывают безводным ацетонитрилом (3 мл). 176 мкл 2,2'-(этилендиокси)диэтиламина (соединение 1, фиг. 16; 1,2 ммоль) растворяют в безводном ацетонитриле (1 мл) и полученный раствор приводят в контакт с носителем в колонке. Через 3 мин колонку промывают безводным ацетонитрилом (3 мл) и безводным дихлорметаном (6 мл). Затем аминомодифицированный трифосфат (т.е. соединение 3, фиг. 16) обрабатывают предварительно полученным раствором хлорформиата холестерина (36 мг, 80 мкмоль), Ν,Ν-диизопропилэтиламина (13,9 мкл, 40 мкмоль) и 4-диметиламинопиридина (4,9 мг, 40 мкмоль) в безводном дихлорметане (5 мл) в течение 15 мин. Колонку промывают безводным дихлорметаном (3 мл) и безводным ацетонитрилом (6 мл) и сушат в потоке аргона. Чтобы осуществить отсоединение от носителя и удаление защитных групп, производное олигонуклеотида приводят в контакт со свежеприготовленным 40% водным раствором метиламина и концентрированным водным раствором аммиака (АМА, 1:1, об./об., 2 мл) с использованием двух шприцев. После реакции отсоединения, проводимой в течение 30 мин, раствор переносят во флакон с завинчивающейся крышкой, нагревают в течение 10 мин при 65°С и упаривают досуха. Остаток сушат путем совместного упаривания с абсолютным этанолом и обрабатывают 1 М раствором фторида тетра-н-бутиламмония в ТГФ (1 мл, 1 ммоль) при встряхивании в течение 16 ч. После обессоливания на колонке ΝΑΡ-25 холестерил-меченый трифосфат олигонуклеотида, с которого удалены все защитные группы, очищают методом ВЭЖХ, используя колонку с обращенной фазой (НатШои РРР-1, 4,1x250 мм, фиг. 17А). Соединение 4 элюируют при концентрации метанола 95%, после чего предполагаемую структуру подтверждают методом МАИИ1 (МВ 8370,6 Да, фиг. 17С).

Иногда холестерильный маркер удаляют путем кислого гидролиза при рН 3,8 и 60°С с получением соответствующего трифосфата олигонуклеотида (соединение 5, фиг. 16), используя способ, описанный в

- 13 028707 примере 3.

Пример 5. Систематическое введение 2'-О-метилирования позволяет получить К1С-1-селективный дуплекс РНК.

Список сокращений и их расшифровка приведены в конце данного описания.

Собственная РНК организма характеризуется наличием множества модификаций, которые могут оказывать влияние на функции РНК (тРНК и рРНК). Следовательно, 2'-О-метилирование может привести к изменению иммуногенности РНК. Поэтому селективный лиганд К1С-1 не должен содержать более одного 2'-О-метилирования на цепь. Указанные свойства дуплекса РНК обеспечивают путем сочетания соответственно метилированных смысловой и антисмысловой цепей.

Скрининг 2'-О-метилирования позволяет выявить положения, отвечающие за селективность в отношении К1С-1 (фиг. 5). Проводят полный скрининг 2'-О-метилирования смысловой (А) и антисмысловой (В) цепей ОН-СРР2. Каждое положение модифицируют отдельно путем 2'-О-метилирования и полученные продукты используют для стимуляции К1С-1, ТЬК7 или ТЬК8. Чтобы осуществить стимуляцию К1С-1, мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) блокируют хлорохином и стимулируют путем липофекции дуплекса. ΙΡΝα измеряют через 20 ч после стимуляции методом ЕЫ8А. В случае ТЬК7 и ТЬК8 скринингу подвергают только соответствующую одну цепь, стимуляторную способность которой определяют на неблокированных РВМС. Одиночные цепи трансфицируют путем образования комплексов с поли-Ь-аргинином и через 20 ч после трансфекции методом ЕЫ§А измеряют ΙΡΝα, чтобы определить активацию ТЬК7, и 1Ь12р70, чтобы определить активацию ТЬК8. 100% индукция СРР2 в случае смысловой цепи соответствует 3085 пг/мл ΙΡΝα для К1С-1, 2758 пг/мл ΙΡΝα для ТЬК7 и 1206 пг/мл 1Ь12р70 для ТЬК8. В случае антисмысловой цепи 100% СРР2 соответствует 2342 пг/мл ΙΡΝα для КЮ-Ι, 1831 пг/мл ΙΡΝα для ТЬК7 и 3018 пг/мл !ЕЧ2р70 для ТЬК8. Анализ влияния введения 2'-О-метилирования в конкретных положениях приведен в виде таблицы (фиг. 5). Эффекты нормализуют по немодифицированной цепи, используемой в качестве контроля. Белый=никаких изменений, желтый=уменьшение стимуляции иммунной системы, красный=отсутствие стимуляции иммунной системы, зеленый=увеличение стимуляции иммунной системы.

Кроме того, существуют данные, что метилирование в некоторых положениях делает дуплекс КЮ-Ι специфичным и высоко активным.

Фиг. 6: (А) Антисмысловую цепь метилируют по положениям, не оказывающим влияния на активацию КЮ-Ι, и полученный дуплекс используют для стимуляции хлорохин-блокированных РВМС в концентрации 0,8 мкг/мл. ΙΡΝα измеряют методом ЕЫ8А через 20 ч после стимуляции. 100% ОН-СΡР2 соответствует 2729 пг/мл ΙΡΝα. (В) Смысловые и антисмысловые цепи, содержащие 2'-О-метилирование в разных сочетаниях положений, гибридизуют и используют для стимуляции РВМС. В случае стимуляции КЮ-Ι их блокируют хлорохином и трансфицируют липофектамином, в случае стимуляции ТЬК7 и ТЬК8 используют неблокированные РВМС, которые трансфицируют комплексами дуплексов с поли-Ьаргинином. 100% РУТ-2 соответствуют 4861 пг/мл ΙΡΝα для КЮ-Ι. 100% 9.28 соответствует 1975 пг/мл ΙΡΝα для ТЬК7 и 771 пг/мл Ю12р70 для ТЬК8. На (А) и (В) показаны средние значения ± §ЕМ от 3 доноров.

Пример 6. Повышение активации КЮ-Ι путем вставки РНК-стабилизирующих модификаций.

Терапия с помощью миРНК включает в себя введение в организм коротких фрагментов дцРНК, которые ингибируют образование определенного белка в клетках-мишенях. Проблемой, связанной с применением данной формы терапии, является высокая нестабильность дуплексов миРНК. РНК может легко разрушаться экзонуклеазами и эндонуклеазами в сыворотке в процессе транспортировки в клеткимишени.

Вполне вероятно, что значительная часть экзогенной РНК, используемой в терапевтических целях, дегенерирует в сыворотке и цитозоле субъекта, которому ее вводят.

Показано, что все модификации 5'-РТО оказывают положительное влияние на иммунную активность дуплекса, и что сочетание 5'РТО в смысловой и антисмысловой цепях приводит к максимальному увеличению активности (815/а83 по сравнению с 815 РТО/а§3 РТО; фиг. 7В). Следовательно, применение таких модификаций скелета РНК в КЮЧ-селективных лигандах можно рассматривать как оказывающее благоприятное действие.

В частности, можно продемонстрировать, что 5'-фосфоротиоаты повышают иммуногенность селективного дуплекса.

Фиг. 7: (А) РВМС блокируют хлорохином и стимулируют дуплексами в концентрации 0,8 мкг/мл. Через 20 ч после стимуляции измеряют ΙΡΝα методом ЕЫ8А. 100% ГУТ2 соответствует 6138 пг/мл ΙΡΝΑ. (В) Указанные дуплексы титруют и используют для стимуляции КЮ-Ι. РВМС блокируют хлорохином и трансфицируют дуплексами с использованием липофектамина. Через 20 ч после стимуляции в супернатанте измеряют ΙΡΝα методом ЕЫ8А. 100% 50 нм 3Р-СΡР2 соответствует 16044 пг/мл ΙΡΝΑ. Результаты показаны в виде среднего значения ± §ЕМ от 4 доноров.

При разработке терапевтических миРНК проблему стабильности в сыворотке решают путем введения модификаций другого вида: введение в РНК 2'-фтор-замен приводит к повышению стабильности

- 14 028707

РНК, обусловленному увеличением устойчивости к нуклеазам. Однако было отмечено, что 2'-фторзамены могут активировать ΚΙΟ-Ι-зависимую стимуляцию иммунной системы.

В частности, показано, что 5'-фосфоротиоаты увеличивают иммуногенность селективного дуплекса.

Однако в соответствии с настоящим изобретением было обнаружено, что отдельные 2'-фтор-замены увеличивают ΚΙΟ-Ι-активирующий потенциал дуплекса.

В смысловой (А) и антисмысловой (В) цепях дуплекса каждое положение модифицируют по отдельности путем замены 2'-фтор (фиг. 8). Полученные дуплексы используют для стимуляции РВМС в концентрации 0,8 мкг/мл. Чтобы определить активацию ΚΙΟ-Ι, РВМС блокируют и трансфицируют с использованием липофектамина, для стимуляции ТЬК7 и ТЬК8 используют неблокированные РВМС, которые трансфицируют дуплексами в комплексе с поли-Ь-аргинином. Через 20 ч после стимуляции измеряют уровни цитокинов методом ЕЫ§А. 100% 0РР2 в случае смысловой цепи соответствует 2407 пг/мл ΙΡΝα для ΚΙΟ-Ι, 3281 пг/мл для пихтового ТЬК.7 и 1990 пг/мл для ТЬК8. В случае антисмысловой цепи 100% 0РР2 соответствует 4512 пг/мл ΙΡΝα для ΚΙΟ-Ι, 4691 пг/мл ΙΡΝα для ТЬК7 и 1997 пг/мл ГЬ12р70 для ТЬК8. Результаты приведены в виде средних значений ± §ЕМ от 4 доноров.

Таким образом, очень важно получить дуплекс, обладающий максимально возможной активностью, которая могла бы компенсировать потерю РНК. В предыдущих абзацах было описано, как модификации РНК можно идентифицировать путем селективного связывания РТО и 2'-фтор-замен, приводящих к увеличению активности дуплекса.

Пример 7. Сочетание всех модификаций позволяет получить лиганд КЮ-Ι, обладающий высокой иммуногенностью

Чтобы проверить, приводит ли сочетание связывания РТО или 2'-фтор-замен с 2'-О-метилированием к повышению селективности, указанные модификации постадийно объединяют в дуплексе.

РВМС блокируют хлорохином и используют для стимуляции КЮ-Ι. Используют дуплексы, полученные путем введения разных модификаций в ОН-ОРР2, а активацию КЮ-Ι определяют через 20 ч после стимуляции путем измерения ΙΡΝα методом ЕЫ8А (фиг. 9). Дуплексы, несущие совокупность модификаций, сравнивают либо с ОН-ОРР2 (А), либо с трифосфорилированным 3Р-ОРР2 (В). 100% ТУТ 4 соответствует 21305 пг/мл ΙΡΝα. Результаты приведены в виде средних значений ± §ЕМ от 2 доноров.

Вначале в исходную РНК ОН-ОРР2 водят 2'-О-метилирование 815/а§3 (ОН-ОРР2 оМеП5§/оМе!3а8, фиг. 9) и затем сравнивают его с модификациями 5'-РТО в смысловой и антисмысловой цепях (ОН-ОРР2 РТО 5', фиг. 9А). Затем оба типа модификаций объединяют в дуплексе (ОН-ОРР2оМе115§/оМе13 РТО, фиг. 9). И наконец, получают дуплекс, который дополнительно содержит три 2'-фтор-замены в положениях 7 и 23 смысловой цепи и в положении 13 антисмысловой цепи (ОН-ОРР2оМе115§/3-Р23/13-РТО, фиг. 9А). Сравнительное титрование указанных двойных цепей РНК демонстрирует, что на сегодняшний день олигонуклеотид ОН-ОРР2оМе115§/3-Р23/13-РТО, несущий несколько модификаций, превосходит другие дуплексы по активности. Чтобы лучше оценить активность дуплекса, его титруют и сравнивают с немодифицированным трифосфатом дуплекса (фиг. 9В). Обнаружено, что введение модификации позволяет изменить олигонуклеотид так, так чтобы его иммунная активность оставалась сравнимой с активностью его трифосфатного эквивалента (3Р-ОРР2, фиг. 9В).

Пример 8. Элементы можно переносить на систему 3Р-дцРНК.

Полную разработку ΚΙΟ-Ι-селективного лиганда осуществляют на уровне ОН последовательности ОРР2. Хотя активность можно сильно увеличить путем соответствующих модификаций, трифосфорилирование лиганда дополнительно повышает его активность.

До сих пор было не ясно, можно ли просто переносить модификации с соответствующим позиционированием в систему ЗР-ОРР2.

Чтобы найти ответ на этот вопрос, получают дуплексы, которые содержат модификации, повышающие активность: в смысловой цепи 2'-О-метилирование по 15 основанию, 2'-фтор-замены по 7 и 23 основаниям и присоединение двух РТО на 5'- и 3'-концах (2§2Р, фиг. 10). В антисмысловой цепи объединяют 2'-О-метилирование по 3 основанию, 2'-фтор-замену по 13 основанию и присоединение двух 5'-РТО. Поскольку в смысловой цепи близость трифосфата препятствует присоединению двух 5'-РТО, дополнительно получают мульти-модифицированную смысловую цепь, не содержащую 5'-РТО (182Р, фиг. 10).

Чтобы оценить повышение активности в результате трифосфорилирования, для каждого дуплекса получают 5'-гидроксильную и 5'-трифосфатную формы (ОН и 3Р, фиг. 10), которые сравнивают друг с другом путем стимуляционного титрования на РВМС.

Фиг. 10: (А) Синтезируют мультимодифицированные дуплексы, содержащие и не содержащие трифосфат. Титрование дозы проводят на РВМС, блокированных хлорохином. Через 20 ч после стимуляции активацию иммунной системы измеряют методом ЕЫ8А по уровню ΙΓΝα. Результаты приведены в виде средних значений ± §ЕМ от 4 доноров. (В) На основе кривых титрования рассчитывают биологические значения ЕС50.

- 15 028707

Обнаружено, что мультимодифицированные ОН-дуплексы, независимо от наличия на одном или двух концах РТО, могут достигать пределов активности немодифицированного ОН-ОРР2 (ОН Ми1й 182Р, ОН Ми1й 282Р, ОН-ОРР2, фиг. 10). Дополнительное введение 5'-трифосфата в смысловой цепи приводит к дополнительному увеличению активности в 5 раз по сравнению с гидроксил-содержащими комплексами (3Р-Ми1й 182Р, 3Р-Ми1й 282Р, фиг. 10).

В результате было обнаружено, что разные модификации, приводящие к повышению активности, можно сочетать с трифосфорилированием олигонуклеотида с достижением положительного эффекта.

Прогрессивное увеличение уровня селективности (2'-О-метилирование) исходного дуплекса ОН-ОРР2, увеличение активности путем стабилизирующих модификаций (присоединение РТО и 2'-фтор-замены) и сродства к связывающему карману (трифосфат), приводит к получению активного и селективного лиганда ΚΙΟ-Ι (3Р-Ми1й 182ί).

И наконец, путем вставки специфических модификаций можно получить 3Р-дцРНК с максимальным повышением иммунностимулирующей активности. Такое увеличение иммуногенности позволяет поддерживать дозу лекарственного средства на низком уровне и компенсировать потери РНК, которые происходят в период от введения лекарственного средства до его проникновения в клетку.

Олигонуклеотиды РНК еиАсссисдсссисААетисдисии ' ' - ту' с исссАсисббасицсААспАбйА сА^сссисАсссисААсиисАисип си бссАсисббАсиисААбЦАСАА

Ν_Πι= 2-ОСНз сАС9СцсАсссисАА(заисАнси_ки сисссАсисссАСиисААсиАеА а ?

САСбсиеАсссибААоиисАисии_т . . < _: < ... . _:: . .. / / сисссАсцсбСАсписААбЦАБАА ·: с дсссисАсссисАдсиисАисиц .. .

С_сгиОСеАСи(ЗСБАСиЦСААСТЖС-АА' .'. '' . . ‘

.. . . ... . . Νπτ'- ζ -ОСпз ОРР2& оМеП

ОРР25 оМе!2

СРР2з оМе!23

СРР25 оМе!24

ОРР2аз оМеМ

- 16 028707

Я1В111Ж1® Й1ВИй®1Я8ЖяЯИЯВ 1ΙΜΙ811111111111ΙΒΙ|||»||!··Ι1

ЗРР2зз оМе123 ЗгРзаз οΜθ124 ΟΗ-ΘΡΡ2 ти1й оМе!	1 ^^1®й||вв|1^0И!ВИИ11В111!11В11111В СОССбАСОСССАСиОСААСПАСАгА (1ЖйВ1#1Яя1И ' сисссАспссбАсшсААОТАбАА» .· с ас с сисле с с и с&АсиисА исто СпиСиСвСАсисЕ^биАиСписжеъ^АбААа	Ит-2-ОСНз
з20/аз'12	з 1А18Й1Я1!1К81^ I ^1в1я1Я11^в11Ив1Я1Ж11!|1811111	Νηι= 2’-ОСНз
з20/аз19	еАсссисАсс:сисААбиис Алисии сибССАсисссАсшгсААСпЛ асаа	Мт= 2’-ОСН3
	/ сассспйасссп сААаСипсАисип з сиссеАсиссбА-сиц сааспасаа	. Мт= 2’-ОСН3
515/аз19	бАС(зеиеАсссибААяеиос аоспп ' з : . / / сосседсиссбАсии саасепасаа	:1Чт=2’-ОСН3
з20''азЗ .	< с ас ссисАССсисААсиисАвисии ·. : сисАСбАсисзсАсиисААси аааа	Νη,= 2’-ОСН3
з 15 /азЗ	сдс есисдсеспсААйбппеАпспп сибиссАсисесдсип сааспасаа	Νηι= 2-ОСН3
53/3512	сАС-есиедссси еААбПОСАОСпи . : - СПС ССАСПСССАаСППСААСиАСАА .	Ыт=2-ОСН3
53/0519	бАсвссисАССсисААсиис лисии сие ебАсовесАсипсААбнцАСАА	Νηι= 2'-ОСНз
Рз!	СгАСбСПСАСССПСААбОПСАПСОТ . г; исссАсиоссАсиисйАсидбАА
Рз2	САг-ссспсАССсисААсиис/лиспи '.' 8 · · / СП СССАСПСССАСииСААбиАСАА : :

Ν, - ? Η

Рз23	'бАСССПбАСССОСААбиПСАПСПрП ' ' ' . Н Ц .СПСССАСПСССАСииСААСПАОА А : . .
Рз24	САСССПСАСССПСААСППСАПСиПр . ί споссАсисссАсиисААСТАСАА :
Газ1	33·· СзАСеСПСАСеСПСААеППСАПСПНз / уЗззз'зз з сгиссбАсисссАсиисААсиАбАА
Раз2	са сбсобАССсисААбиисАисин сиРссбАсисббАсппеААспдбАА:
Раз23	ЕАСССиСАСССибААСПИСАПСИ: П' : ' : СПСССАСиСССАСииСААСиАбАгА	. Νρ=2'-Ρ
Раз24	еАСбсибАесотсААбписАПспи· ' < СПССбАСПебСАСППСААСиАЙААг ' ' з з

- 17 028707

3Ρ-ΟΙ-Ρ2 .

515/азЗ РТО . 5ΐ5 ΡΤ0/&53

5'Ιΰ РТО'азЗ РТО

ΟΗ-ΘΡΡ2 РТО 5’.

ΟΗ-ΘΓΡ2 оМеГ15/оМе13 РТО

·. ОН-СРР2 . ' . Р23з/13аЗ

ОН-6РР2оМеТ15/3 Ρ23Ο3 РТО

ЗР-СРР2 Ί82Ρ

ОН-СЕР2 182Р

ЗР-ОЕР2 252Р ррр-еАсзсизАсссиеААЗцисАцсиц. ' ' сиссзАсиззоАсиисААзиАОАА ^: йао осиоАсссизАА-зиисАпе и и зио_ис^АсисзеАсии сааоцаз*а*а е’А*с есисАсссисААдСиисАисии ' з и ехоАсисзоАСои саасдазаа.· ' з*а* с зсизАССсисААтлЗиислис и и с и СлСЗАсиессАсии саасцаз*а*а з*А*;сзсизАссспеААзиасАис и. а ... :

С и -СС8АС3383АСШСААЗЦА0*А*А :

с*а*с зсизАсссизААиЗиислис и и с и с^ссАсиссзАсии сааотас*а*а

ЗАСЗС1ЮАСССЦЗ ААЗииСАЮТгги . .

зизссАзиззсАс_гиисААсиАбА·а. :

з*а*с зсозуАсссиз ААлзиислис п_? и с и Зоселе исзсАс_гии сааснас*а *а ррр -сас есисг-АССсис' ладиислис *и_г * и . ОЦСаСЗАС иСЗЗАСкЦа ΟΑΑΟϋΑΟΛΑ *А сас зсизкАсссис АА_изш7САис*и_?*и· . сиЗйСЗАс иссоАСрпи саасцасна *а ' ррр-е*а* с ссисгАсссиа ^;АА_исиисАис*о?*ч

ОН-СРР2 252Р с*а*с ссис_гАсссис ААрзинсАис^ц^и с и ЗйСсас изезАсуии саастзасоа *а ⁴ = РТО

Ν_ηι= 2’-ОСН₃ “-РТО

.. Мш-гсрсНз -^{: 4} = РТО

Ν_η,= 2’-ОСН₃

ΙϋΙβΙΙΙ * - РТО

М_т= 2^!-ОСНз

Ν^2'-Ρ '

Ν_Ρ-2Ύ ⁴ = РТО

Ν„,= 2^!-ОСН₃ М_Р^.2’-Р .

¹ -РТО

Ν_ηι~ 2^:-ОСН₃ . Н_Р= 2-Р ‘ = РТО

М_т=2’-ОСНз .<.Ν_Ρ;~2’·-Ρ .·./

ΙΙΙΙΙίΙΒΐ···

Ν_Μ=2'-0ΟΗ₃ .

Ν^2Ύ .

* = РТО

Н_Я!= 2’-ОСНз

Claims (9)

1. Олигонуклеотид, содержащий смысловую цепь и антисмысловую цепь, где смысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность ⁵' САСзсисАсссисААзиисАисии 3'? и антисмысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность ³' сисссАсисссАсиисААсиАСАА 5'? и олигонуклеотид также содержит по меньшей мере один трифосфат на 5'-конце и по меньшей мере одну модификацию, выбранную из группы, включающей в себя 2'-О-метилирование, введение 2'-фтор и фосфоротиоатной связи.

2. Олигонуклеотид по п.1, который содержит по меньшей мере один трифосфат на 5'-конце смысловой цепи.

3. Олигонуклеотид по любому из пп.1, 2, где модификация представляет собой введение 2'-Ометила, а смысловая цепь и/или антисмысловая цепь содержат по меньшей мере один 2'-Ометилированный рибонуклеотид, предпочтительно нуклеотид представляет собой нуклеотид 3, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 смысловой цепи или любое сочетание указанных нуклеотидов и/или нуклеотид представляет собой нуклеотид 3, 4, 9, 10, 14, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23 антисмысловой цепи или любое сочетание указанных нуклеотидов; более предпочтительно нуклеотид представляет собой нуклеотид 3, 10, 15, 17 и 22 смысловой цепи или любое сочетание указанных нуклеотидов и/или нуклеотид представляет собой нуклеотид 3, 18 или 23 антисмысловой цепи или любое сочетание указанных нуклеотидов, причем положение нуклеотида в вышеуказанных смысловой цепи и антисмысловой цепи рассчитывают слева направо; наиболее предпочтительно олигонуклеотид выбран из группы, включающей в себя олигонуклеотид §15/а§3, содержащий смысловую цепь, содержащую нуклеотидную последовательность 5' зАсссисАССсизАА_тсиисАисии з'_{? и} антисмысловую цепь, содержащую нуклеотидную последовательность 3' сиСпСЗАсисссАсиисААсиАСАА 5', где нуклеотид с индексом т является 2'-О-метилированным; олигонуклеотид §20/а§3, содержащий смысловую цепь, содержащую нуклеотидную последовательность 5^л оАсссисАсссисААоиисА_тисии 3'_9И антисмысловую цепь, содержащую нуклеотидную последовательность 3' сиСтСОАсисссАсиисААсиАСАА 5\ где нуклеотид с индексом т является 2'-О-метилированным; олигонуклеотид §3/а§12, содержащий смысловую цепь, содержащую нуклеотидную последовательность

- 18 028707

5' сАс_тссисАсссисААсиисАисии з', _и антисмысловую цепь, содержащую нуклеотидную последовательность 3' сиесеАсиеееА_тсиисААеиАеАА 5'_? где нуклеотид с индексом т является 2'-О-метилированным; олигонуклеотид 53/аз19, содержащий смысловую цепь, содержащую нуклеотидную последовательность 5' сАстссисАсссисААсиисАисии з'_?и антисмысловую цепь, содержащую нуклеотидную последовательность

3' сисссАсисссАсиисААс_тиАСАА 5' где нуклеотид с индексом т является 2'-О-метилированным; олигонуклеотид з15/аз12, содержащий смысловую цепь, содержащую нуклеотидную последовательность

5' 0АсссисАсссисАА_тсиисАисии з'_?и антисмысловую цепь, содержащую нуклеотидную последовательность 3' сисссАсисссАтСиисААсилсАА 5'_? где нуклеотид с индексом т является 2'-О-метилированным; олигонуклеотид з20/аз19, содержащий смысловую цепь, содержащую нуклеотидную последовательность 5' сАсссисАсссисААсиисА_тисии з\_и антисмысловую цепь, содержащую нуклеотидную последовательность

3' сисссАсиссслсиисААс_тилсАА 5' где нуклеотид с индексом т является 2'-О-метилированным; олигонуклеотид з20/аз12, содержащий смысловую цепь, содержащую нуклеотидную последовательность

5' 0АсссисАсссисААсиисА_тисии з^л?и антисмысловую цепь, содержащую нуклеотидную последовательность 3' сисссАсисссА_гасиисААсиАСАА 5' _? где нуклеотид с индексом т является 2'-О-метилированным; олигонуклеотид з15/аз19, содержащий смысловую цепь, содержащую нуклеотидную последовательность

5' сАсссисАсссисААтОиисАисии з\_и антисмысловую цепь, содержащую нуклеотидную последовательность

3' сисссАсисссАсиисААстиАСАА 5' где нуклеотид с индексом т является 2'-О-метилированным.

4. Олигонуклеотид по любому из пп.1-3, где модификация представляет собой введение 2'-фтор, а смысловая цепь и/или антисмысловая цепь содержат по меньшей мере один 2'-фтор-рибонуклеотид, предпочтительно нуклеотид представляет собой нуклеотид 2, 4, 7, 9, 10, 11, 16, 19, 21, 22, 23 или 24 смысловой цепи или любое сочетание указанных нуклеотидов и/или нуклеотид представляет собой нуклеотид 4, 5, 6, 13, 14, 18 или 24 антисмысловой цепи или любое сочетание указанных нуклеотидов; более предпочтительно нуклеотид представляет собой нуклеотид 4, 7, 9, 10, 11, 21, 23 или 24 смысловой цепи или любое сочетание указанных нуклеотидов и/или нуклеотид представляет собой нуклеотид 5, 13 или 14 антисмысловой цепи или любое сочетание указанных нуклеотидов, причем положение нуклеотида в вышеуказанных смысловой цепи и антисмысловой цепи рассчитывают слева направо; кроме того, олигонуклеотид предпочтительно содержит смысловую цепь, содержащую нуклеотидную последовательность

5' (ЗАсссисгАсссисААсиисАисиги з\_и антисмысловую цепь, содержащую нуклеотидную последовательность

3' сисссАсисссАс_£иисААсиАСАА 5' где нуклеотид с индексом £ содержит фрагмент 2'-фтор.

5. Олигонуклеотид по любому из пп.1-4, где модификация представляет собой введение фосфотиоатной связи, а смысловая цепь и/или антисмысловая цепь содержат по меньшей мере одну фосфотиоатную связь, предпочтительно каждая из смысловой цепи и/или антисмысловой цепи содержит по меньшей мере две фосфотиоатные связи, более предпочтительно олигонуклеотид выбран из группы, включающей в себя олигонуклеотид, содержащий смысловую цепь, содержащую нуклеотидную последовательность

5' сАсссислсссисААсиислисртоиртои 3' _и антисмысловую цепь, содержащую нуклеотидную последовательность

3' сиссслсисссАсиисААсиАСртоАртоА 5 а олигонуклеотид, содержащий смысловую цепь, содержащую нуклеотидную последовательность

- 19 028707

5' сАсссисАсссисААсиислисртоиртои 3' антисмысловую цепь, содержащую нуклеотидную последовательность

3' СртоиртоСССАСиСССАСииСААСиАСАА 5'· олигонуклеотид, содержащий смысловую цепь, содержащую нуклеотидную последовательность

5' СртоАртосесисАсссисАлсиислисии 3' _и антисмысловую цепь, содержащую нуклеотидную последовательность

3' СиСССАСиОССАСииСААОЦАОртоАртоА 5'· олигонуклеотид, содержащий смысловую цепь, содержащую нуклеотидную последовательность

5' ОртоАртоСссисАсссисААсиисАисии 3' _и антисмысловую цепь, содержащую нуклеотидную последовательность

3' СртоиртоСССАСиСССАСииСААСиАСАА 5% олигонуклеотид, содержащий смысловую цепь, содержащую нуклеотидную последовательность

5' Ср_ТоАр_ТоСссисАсссисААсиисАиср_Тоиргои 3' _и антисмысловую цепь, содержащую нуклеотидную последовательность

3' СртоиртоСССАСиСССАСииСААСиАСртоАртоА 5'· олигонуклеотид, содержащий смысловую цепь, содержащую нуклеотидную последовательность

5' САсссисАсссисААсиисАиср_ТОиртои 3' _и антисмысловую цепь, содержащую нуклеотидную последовательность

3' СртоиртоСССАСиСССАСииСААСиАСртоАртоА 5'· олигонуклеотид, содержащий смысловую цепь, содержащую нуклеотидную последовательность

5' СртоАртосесислсссисААсиисАисии 3' _и антисмысловую цепь, содержащую нуклеотидную последовательность

3' СртоиртоСССАСиСССАСииСААСиАСртоАртоА 5';

олигонуклеотид, содержащий смысловую цепь, содержащую нуклеотидную последовательность

5' СртоАртоСссисАсссисААсиисАисртоиртои 3' _и антисмысловую цепь, содержащую нуклеотидную последовательность 3' СиСССАСиСССАСииСААСиАСртоАртоА 5'_; олигонуклеотид, содержащий смысловую цепь, содержащую нуклеотидную последовательность

5' СртоАртоСссисАсссисААсиисАисртоИртои 3' _и антисмысловую цепь, содержащую нуклеотидную последовательность

3' СртоиртоСССАСиСССАСииСААСиАСАА 5' где индекс РТО между двумя нуклеотидами свидетельствует о том, что два указанных нуклеотида соединены фосфотиоатной связью.

6. Олигонуклеотид по любому из пп.1-5, где олигонуклеотид выбран из группы, включающей в себя олигонуклеотид, содержащий смысловую цепь, содержащую нуклеотидную последовательность

5^Л сАсзсисАсссизлАшСиислисртоиртои 3' антисмысловую цепь, содержащую нуклеотидную последовательность 3' СиСтССАСиСССАСииСААСиАСртоАртоА 5'_? где нуклеотид с индексом т является 2'-О-метилированным; а индекс РТО между двумя нуклеотидами свидетельствует о том, что два указанных нуклеотида соединены фосфотиоатной связью;

смысловая цепь содержит на 5'-конце трифосфат; олигонуклеотид, содержащий смысловую цепь, содержащую нуклеотидную последовательность

5^Л САсссисгАсссисААсиисАисрроиГргои з^г и антисмысловую цепь, содержащую нуклеотидную последовательность где нуклеотид с индексом £ содержит фрагмент 2'-О-фтор; а индекс РТО между двумя нуклеотидами свидетельствует о том, что два указанных нуклеотида соединены фосфотиоатной связью;

смысловая цепь содержит на 5'-конце трифосфат; олигонуклеотид, содержащий смысловую цепь, содержащую нуклеотидную последовательность

- 20 028707

5' сАсссие_£АсссисАА_гасиисАиср_Тои_£ртои з\ _и антисмысловую цепь, содержащую нуклеотидную последовательность 3' СиС_тССАСиСССАС_£ииСААСиАСртоАр_ТОА 5' где нуклеотид с индексом т является 2'-О-метилированным; нуклеотид с индексом £ содержит фрагмент 2'-О-фтор; а индекс РТО между двумя нуклеотидами свидетельствует о том, что два указанных нуклеотида соединены фосфотиоатной связью;

смысловая цепь содержит на 5'-конце трифосфат;

предпочтительно олигонуклеотид, содержащий смысловую цепь, содержащую нуклеотидную последовательность

5' сАсссис_£АсссисАА_тсиисАиср_Тои_£РТОи з'_?и антисмысловую цепь, содержащую нуклеотидную последовательность где нуклеотид с индексом т является 2'-О-метилированным; нуклеотид с индексом £ содержит фрагмент 2'-О-фтор;

а индекс РТО между двумя нуклеотидами свидетельствует о том, что два указанных нуклеотида соединены фосфотиоатной связью;

смысловая цепь содержит на 5'-конце трифосфат.

7. Фармацевтическая композиция, содержащая модифицированный олигонуклеотид по любому из пп.1-6.

8. Фармацевтическая композиция по п.7, предназначенная для внутрибрюшинного, внутримышечного, внутривенного, интраназального, подкожного, внутрикожного или интратекального введения.

9. Фармацевтическая композиция по п.7, предназначенная для внутрикожного введения, в частности, путем татуировки, посредством микроигл и/или микроигольных пластырей.