[go: up one dir, main page]

EA034605B1 - Новые лиганды rig-i и способы их получения - Google Patents

Новые лиганды rig-i и способы их получения Download PDF

Info

Publication number
EA034605B1
EA034605B1 EA201790916A EA201790916A EA034605B1 EA 034605 B1 EA034605 B1 EA 034605B1 EA 201790916 A EA201790916 A EA 201790916A EA 201790916 A EA201790916 A EA 201790916A EA 034605 B1 EA034605 B1 EA 034605B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
group
oligonucleotide
alkyl
modified
misc
Prior art date
Application number
EA201790916A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201790916A1 (ru
Inventor
Марион Гольдек
Яспер Ван Ден Борн
Янос Людвиг
Кристине Шуберт-Вагнер
Original Assignee
Райнише Фридрих-Вильхельмс-Универзитет Бонн
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Райнише Фридрих-Вильхельмс-Универзитет Бонн filed Critical Райнише Фридрих-Вильхельмс-Универзитет Бонн
Publication of EA201790916A1 publication Critical patent/EA201790916A1/ru
Publication of EA034605B1 publication Critical patent/EA034605B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A61K9/0021—Intradermal administration, e.g. through microneedle arrays, needleless injectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C07H1/02—Phosphorylation
    • C07H1/04—Introducing polyphosphoric acid radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/117—Nucleic acids having immunomodulatory properties, e.g. containing CpG-motifs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/17—Immunomodulatory nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3513—Protein; Peptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3515—Lipophilic moiety, e.g. cholesterol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3517—Marker; Tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3527—Other alkyl chain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/353—Nature of the modification linked to the nucleic acid via an atom other than carbon
    • C12N2310/3533—Halogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Organic Insulating Materials (AREA)
  • Electric Propulsion And Braking For Vehicles (AREA)

Abstract

Изобретение предлагает новые трифосфат-модифицированные олигонуклеотиды, которые можно использовать в качестве лигандов RIG-I, а также новый способ синтеза и очистки, позволяющий получать продукт с высоким выходом и чистотой, подходящей для фармацевтических применений.

Description

(57) Изобретение предлагает новые трифосфат-модифицированные олигонуклеотиды, которые можно использовать в качестве лигандов RIG-I, а также новый способ синтеза и очистки, позволяющий получать продукт с высоким выходом и чистотой, подходящей для фармацевтических применений.
Изобретение предлагает новые трифосфат-модифицированные олигонуклеотиды, которые можно использовать в качестве лигандов RIG-I, а также новый способ синтеза и очистки, позволяющий получать продукт с высоким выходом и чистотой, подходящей для фармацевтических применений.
Уровень техники изобретения
Schlee et al., Immunity, 2009, 31, 25-34 описывают двухцепочечные РНК с тупыми концами, несущие 5'-С-трифосфатный фрагмент на одной из цепей, которые действуют как мощные стимуляторы иммунной системы путем связывания геликазы RIG-I. Таким образом, существует потребность в простом и эффективном способе получения трифосфат-модифицированных олигонуклеотидов с высокой степенью чистоты, подходящей для фармацевтического применения.
Способы присоединения трифосфатных групп или их аналогов к группе 5'-OH нуклеозидных соединений хорошо известны в данной области. Ludwig J. et al., J. Org. Chem., 1989, 54, 631-635 раскрывают способ трифосфорилирования в растворе с получением 5'-O-трифосфатов нуклеозидов и их аналогов с использованием 2-хлор-4H-1,3,2-бензодиоксафосфорин-4-она в качестве фосфитилирующего реагента. Gaur R.K. et al., 1992, Tetrahedron Letters, 33, 3301-3304 описывают применение указанного способа на твердой фазе для синтеза 2'-O-метилрибонуклеозид-5'-O-трифосфатов и их Pa-тио-аналогов. В патенте США 6900308 B2 описан твердофазный синтез модифицированных нуклеозид-5'-O-трифосфатов как потенциальных противовирусных соединений, а в патентах США 7285658, 7598230 и 7807653 раскрываются трифосфатные аналоги нуклеозидов с модификациями в сахаре, нуклеотидном основании и в трифосфатном фрагменте.
В WO96/40159 описан способ получения кэпированных молекул РНК или аналогов РНК, где олигонуклеотид, представляющий собой РНК или аналог РНК, подвергают взаимодействию с фосфитилирующим реагентом, таким как 2-хлор-4H-1,3,2-бензодиоксафосфорин-4-он или его производное, с замещением в цикле. Полученное промежуточное соединение подвергают взаимодействию с фосфатом или пирофосфатом, или его солью, окисленным или гидролизованным. Ди- или трифосфорилированные РНК или аналоги РНК кэпируют путем взаимодействия с активированным m7G три-, ди- или монофосфатом или его аналогом.
В WO 2009/060281 описаны иммуностимулирующие аналоги олигорибонуклеотидов, содержащие модифицированные олигофосфатные фрагменты, а также способы получения таких соединений. Указанные способы включают в себя синтез олигонуклеотида на твердом носителе, взаимодействие нуклеотида, присутствующего на 5'-конце олигонуклеотида, с фосфитилирующим реагентом, таким как 2-хлор-4111,3,2-бензодиоксафосфорин-4-он, в подходящем растворителе и в присутствии основания, взаимодействие фосфитилированного олигонуклеотида с пирофосфатом или аналогом пирофосфата, окисление олигонуклеотида окисляющим реагентом и удаление защитной группы с олигонуклеотида с получением модифицированного олигонуклеотида, содержащего трифосфат или аналог трифосфата.
Электрофорез в полиакриламидном геле, описанный в WO 96/40159, можно использовать только для мелкомасштабного разделения. Разрешающая способность ионообменной хроматографии для 5'моно-, ди- и трифосфорилированных продуктов более длинных олигорибонуклеотидов является ограниченной.
Необходимость денатурирующих условий делает разделение трудоемкой задачей (Sproat, 1999; Zlatev, 2010; WO 2009/060281), кроме того, продукты обычно загрязнены n-1, n-2 последовательностями и их моно- и дифосфатами, т.е., являются недостаточно чистыми. Учитывая чувствительность лигандов RIG-I к точным терминальным структурам, указанные методы очистки не являются оптимальными для фармакологических приложений.
Таким образом, существует настоятельная потребность в новых трифосфорилированных олигонуклеотидах и их аналогах, в частности, обладающих селективностью в отношении RIG-I, а также в способах получения таких соединений.
Следовательно, настоящее изобретение предлагает новые 5'-трифосфорилированные олигонуклеотиды и их аналоги, которые можно получить в условиях крупномасштабного производства для потенциального клинического применения, а также удобный способ получения таких олигонуклеотидов. Кроме того, изобретение описывает модификации олигонуклеотидов, которые позволяют достичь, сохранить и/или улучшить селективность олигонуклеотидов в отношении RIG-I, или повысить их химическую стабильность.
Таким образом, первый аспект настоящего изобретения относится к модифицированному олигонуклеотиду формулы (I)
V5 V3V, и иII
Z—Υ—X—P—W3—P—W,~ P—W,—ON
I I I , ve v4 v2I где V1, V3 и V5 в каждом случае независимо выбраны из O, S и Se;
V2, V4 и V6 в каждом случае независимо выбраны из OH, OR1, SH, SR1, F, NH2, NHR1, N(R1)2 и BH3 -
- 1 034605
M+,
W1 обозначает O или S,
W2 обозначает O, S, NH или NR2,
W3 обозначает O, S, NH, NR2, CH2, CHHal или C(Hal)2,
R1, R2 и R3 выбраны из ^^алкила, C.'2-балкенила. ^^алкинила, C.'2-бацила или циклической группы, каждый из которых может быть необязательно замещен, или где два R1 вместе с атомом N, связанным с ними, могут образовывать цикл,
M+ обозначает катион,
X обозначает NH, NR3, O или S,
Z обозначает улавливаемый маркер или H,
Y обозначает связь или линкер, соединяющий улавливаемый маркер с X, и
ON обозначает олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере четыре структурных элемента, представляющих собой нуклеотиды или аналоги нуклеотидов.
Термин олигонуклеотид в контексте настоящей заявки охватывает соединения, содержащие несколько, например, по меньшей мере, четыре структурных элемента, представляющих собой нуклеотиды или аналоги нуклеотидов. Предпочтительно олигонуклеотид содержит б-100, например, 20-40 структурных элементов. Структурные элементы, представляющие собой нуклеотиды или аналоги нуклеотидов, могут содержать субъединицы из нуклеозидов или аналогов нуклеозидов, соединенные межсубъединичными связями. Нуклеозидные субъединицы включают в себя дезоксирибонуклеозидные субъединицы, рибонуклеозидные субъединицы и/или их аналоги, в частности, аналоги нуклеозидов, модифицированные по сахарному остатку и/или нуклеотидному основанию. Кроме того, олигонуклеотиды могут содержать структурные элементы, отличные от нуклеотидов, и/или другие концевые модификации и/или модификации боковых цепей.
В предпочтительных субъединицах, модифицированных по остатку сахара, 2'-OH рибонуклеозидной субъединицы замещают группой, выбранной из OR, R, галогена, SH, SR, NH2, NHR, NR2 или CN, где R обозначает С1-балкил, С2-балкенил или С2-балкинил, а галоген представляет собой F, Cl, Br или I. В других предпочтительных субъединицах, модифицированных по остатку сахара, рибоза может быть замещена, например, другим сахаром, например, пентозой, такой как арабиноза. Указанную модификацию сахара можно сочетать с описанными выше модификациями 2'-OH, например, с получением 2'фторарабинонуклеозидных субъединиц. Другие предпочтительные субъединицы, модифицированные по остатку сахара, включают в себя замкнутые нуклеозиды (LNA) или 2',3'-секонуклеозиды (UNA). В предпочтительных модифицированных по нуклеотидному основанию нуклеозидных структурных элементах вместо стандартного нуклеотидного основания используют нестандартное, например, не встречающееся в природе, нуклеотидное основание. Примеры нестандартных нуклеотидных оснований включают в себя производные урацила или цитозина, модифицированные по 5 положению, такие как 5-(2-амино)пропилурацил или 5-бромурацил; гипоксантин; 2,б-диаминопурин; производные аденина или гуанина, модифицированные по 8 положению, такие как 8-бромгуанин; деазануклеозиды, такие как 7-деазагуанин или 7деазааденин; O- и N-алкилированные нуклеотидные основания, такие как ^-метиладенин или N6,N6диметиладенин. Другие подходящие аналоги нуклеотидов могут быть выбраны из универсальных нуклеотидных аналогов, таких как 5-нитроиндол.
Межсубъединичная связь может представлять собой фосфодиэфирную связь, или модифицированную связь, такую как фосфоротиоатная, фосфородитиоатная, метилфосфонатная, фосфорамидатная, боранофосфатная, или другая модифицированная связь, известная специалистам в данной области техники.
Олигонуклеотид может быть выбран из дезоксирибонуклеотидов, рибонуклеотидов и аналогов олигонуклеотидов. Дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды и/или аналоги олигонуклеотидов могут быть химически модифицированы по нуклеозидной и/или рибозной субъединице, дезоксирибонуклеотида, рибонуклеотида и/или аналога олигонуклеотида. Аналоги дезоксирибонуклеотидов или рибонуклеотидов могут содержать, по меньшей мере, одну дезоксирибонуклеозидную или рибонуклеозидную субъединицу и, по меньшей мере, одну модифицированную нуклеозидную субъединицу и/или, по меньшей мере, одну модифицированную межсубъединичную связь, например, такую, как описано выше. Аналоги олигонуклеотидов также могут содержать в своей структуре модифицированные нуклеозидные субъединицы.
Олигонуклеотид может представлять собой одноцепочечную молекулу или двухцепочечную молекулу. Двухцепочечные олигонуклеотиды могут содержать полностью или частично комплементарные цепи. Двухцепочечные молекулы могут содержать тупые концы или по меньшей мере один липкий конец, например 5'- или 3'-липкий конец. Если липкие концы присутствуют, они предпочтительно располагаются на дистальном конце молекулы (по отношению к трифосфату/аналогу трифосфата). Двухцепочечные олигонуклеотиды также могут содержать шпилечную структуру, в которой дуплекс закрыт петлей на дистальном конце (по отношению к трифосфату/аналогу трифосфата). Петля может содержать нуклеотидные и/или не нуклеотидные структурные элементы, например, диольные структурные элементы, включающие в себя этиленгликольные фрагменты, такие как три(этилен)гликоль или гекса(этиленгликоль)гликоль; пропан-1,3-диол; додекан-1,12-диол; или 3,12-диокса-7,8-дитиатетрадекан- 2 034605
1,14-диол.
В предпочтительном варианте осуществления двухцепочечные молекулы содержат тупые концы, в особенности, на ближнем конце (по отношению к трифосфату/аналогу трифосфата).
В соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществления олигонуклеотид является двухцепочечным, причем длина каждой отдельной цепи составляет, по меньшей мере, 19 нуклеотидов. Двухцепочечный олигонуклеотид указанной длины с тупыми концами является особенно предпочтительным. В соответствии со следующим предпочтительным вариантом осуществления каждая цепь олигонуклеотида содержит в длину по меньшей мере от 19 до 50 нуклеотидов, от 19 до 30 нуклеотидов, от 20 до 30 нуклеотидов, от 22 до 28 нуклеотидов, особенно предпочтительно от 22 до 26 нуклеотидов.
Олигонуклеотид может содержать другие концевые модификации и/или модификации боковых цепей, которые могут включать в себя, например, ковалентное присоединение фрагментов, специфичных к определенным клеткам. Указанные фрагменты могут стимулировать клеточное или клеточноспецифическое поглощение и включают в себя, например, липиды, витамины, гормоны, пептиды, олигосахариды и их аналоги. Специфичные фрагменты, например, можно присоединить к модифицированным нуклеотидным основаниям или ненуклеотидным структурным элементам с помощью способов, известных специалистам в данной области.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления модификации обеспечивают и/или повышают селективность олигонуклеотида к определенной мишени. В особенно предпочтительном варианте осуществления обеспечивается и/или повышается селективность олигонуклеотида в отношении RIG-I. Методы определения селективности конкретного олигонуклеотида в отношении RIG-I описаны подробно в данном документе (см. раздел Примеры) и/или известны специалистам в данной области.
В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления химические модификации поддерживают или повышают химическую стабильность олигонуклеотида. Специалистам в данной области техники известны методы определения химической стабильности конкретного олигонуклеотида. Такие способы также описаны, например, в разделе примеры.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления химические модификации олигонуклеотидов независимо выбраны из группы, включающей в себя галогенирование, например, Fгалогенирование, 2'-С-алкилирование, например, 2'-С-метилирование, и/или введение фосфоротиоатных межнуклеотидных связей. В частности, F-галогенирование и введение фосфоротиоатных связей повышают устойчивость олигонуклеотида, тогда как 2'-С-метилирование обеспечивает или повышает селективность олигонуклеотида в отношении RIG-I. 2'-С-метилирование также позволяет изменить иммуногенность РНК. В предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид содержит только один или два участка 2'-С-метилирования на цепь, более предпочтительно один участок 2'-С-метилирования на цепь.
Замена 2'-F является особенно предпочтительной. Гидроксильную группу в 2'-положении рибозы заменяют на фтор. Замены 2'-F в РНК, в частности, приводят к повышенной стабильности, обусловленной устойчивостью к расщеплению нуклеазой. В другом варианте осуществления 2'-фтор-замещение может, например, усиливать RIG-I-зависимую стимуляцию иммунной системы.
В соответствии с настоящим описанием фосфоротиоатные соединения, как правило, представляют собой соединения, полученные в результате замены межнуклеотидных связей на фосфоротиоатные.
Фосфоротиоат-модифицированные соединения, несущие модификацию в концевом фрагменте олигонуклеотида, являются особенно предпочтительными. В процессе фосфоротиоатной модификации не участвующий в связывании атом кислорода мостикового фосфата основной цепи нуклеиновой кислоты заменяют на атом серы. Такая замена значительно снижает расщепление нуклеазами по данному положению и приводит к повышению стабильности нуклеотидной цепи.
В особенно предпочтительном варианте олигонуклеотид настоящего изобретения подвергают Fгалогенированию, метилированию, например, 2'-С-метилированию, а также введению фосфоротиоатных связей, в частности, на концевом фрагменте олигонуклеотида.
Идентификационные параметры конкретного олигонуклеотида зависят от последовательности и длины олигонуклеотида и могут быть определены для каждого конкретного олигонуклеотида. Специалистам в данной области техники хорошо известно, как осуществить такое определение.
Как указано выше, такие методы определения RIG-I-селективности и/или стабильности конкретного олигонуклеотида подробно описаны в настоящей заявке.
Олигонуклеотид формулы (I) или (IV) содержит группу трифосфат/аналог трифосфата. В данной группе V1, V3 и V5 независимо выбраны из O, S и Se. Предпочтительно V1, V3 и V5 обозначают O. V2, V4 и V6 в каждом случае независимо выбраны из OH, OR1, SH, SR1, F, NH2, NHR1, N(R1)2 и BH3 -M+. Предпочтительно V2, V4 и V6 обозначают OH. R1 может представлять собой С1-6алкил, С2-6алкенил, С2-6алкинил, С2-6ацил или циклическую группу, такую как С3-8цикло (гетеро) алкильная группа, С3-8цикло(гетеро)алкенильная группа, фенил или С5-6гетероарильная группа, где гетероатомы выбраны из N, O и S. Кроме того, два R1 вместе с атомом азота, с которым они связаны, могут образовывать цикл, например, 5- или 6членный цикл. R1 может также содержать заместители, такие как галоген, например, F, Cl, Br или I, O (галоген) С1-2алкил и, в случае циклических групп, (галоген)С1-6алкил. M+ может обозначать неорганиче- 3 034605 ский или органический катион, такой как катион щелочного металла, или катион аммония или амина.
W1 может обозначать O или S. Предпочтительно W1 обозначает O. W2 может обозначать O, S, NH или NR2. Предпочтительно W2 обозначает O. W3 может обозначать O, S, NH, NR2, CH2, CHHal или
C(Hal)2. Предпочтительно W3 обозначает O, CH2 или CF2. R2 может быть выбран из группы, описанной выше для R1. Hal может представлять собой F, Cl, Br или I.
В соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществления V1, V2, V3, V4, V5, V6, W1, W2 и W3 обозначают O.
Группу, представляющую собой трифосфат/аналог трифосфата, предпочтительно присоединяют к концу олигонуклеотида. Предпочтительно указанную группу присоединяют к 5'-концу олигонуклеотида, в частности, по 5'-OH 5'-концевого сахарного остатка.
Как указано в данном описании, Z обозначает улавливаемый маркер или H. Улавливаемый маркер Z можно функционально определить с помощью ряда приемлемых примеров, как описано ниже. Общее правило может включать в себя следующие положения: Z должен обеспечивать удобную очистку, и он должен удаляться в условиях, совместимых с требованиями стабильности рррРНК. Специалист в данной области может определить без лишний усилий, удовлетворяет ли данный маркер функциональному определению, или нет. Таким образом, специалистам в данной области известны такие улавливаемые маркеры, сведения о которых также можно получить, например, из примеров, подробно описанных в настоящей заявке.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления улавливаемый маркер Z выбран из длинноцепочечного алифатического остатка, партнера по нековалентному высокоаффинному связыванию, реакционноспособной химической группы, Q или NHC2-C24-алкила, где Q предпочтительно выбран из группы, включающей в себя H, аминокислоты, аналоги аминокислот, Q-C^^km, предпочтительно Cn-CM-алкил, пептиды и липиды. Однако в соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществления Z обозначает децил, т.е. C10 алкил.
Улавливаемый маркер Z в соответствии с настоящим изобретением представляет собой фрагмент, способный нековалентно или ковалентно взаимодействовать с улавливающим реагентом в условиях, которые позволяют проводить отделение соединения, содержащего улавливаемый маркер, например, олигонуклеотида (I), из других соединений, которые не содержат улавливаемый маркер. Предпочтительно улавливающий реагент представляет собой иммобилизованный реагент или реагент, который можно подвергать иммобилизации.
Подходящие улавливаемые маркеры включают в себя длинноцепочечные, такие как C8-24, предпочтительно C13-24, более предпочтительно О^Сп-алифатические алкильные остатки, например, октадецил, или другие липидные/липофильные остатки, такие как, например, холестерин, токоферол или тритил, и их производные. Однако в соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществления Z обозначает остаток децила. В данном случае содержащий трифосфат фрагмент можно улавливать и очищать на твердой фазе методом стандартной хроматографии на обращенной фазе, такого как ОФ-ВЭЖХ, или гидрофобной хроматографии (HIC). Улавливаемый маркер также может представлять собой перфторалкильный фрагмент, такой как 4-(1H,1H,2H,2H-перфтордецил)бензильный или 3-(перфтороктил)пропильный остаток, позволяющий специфически улавливать модифицированный олиготрифосфат на фтораффинном носителе, например, поставляемом Fluorous Technologies, Inc.
В другом варианте осуществления улавливаемый маркер может представлять собой первый член пары, способной к нековалентному высокоаффинному связыванию, такой как биотин, или аналог биотина, такой как детиобиотин, гаптен или антиген, который обладает высоким сродством (например, с константой связывания 10-6 л/моль или менее) к улавливающему реагенту, который представляет собой второй член пары, способной к нековалентному высокоаффинному связыванию, такой как стрептавидин, авидин или антитело.
В следующем варианте осуществления улавливаемый маркер может представлять собой первый член пары, способной к ковалентному связыванию, который может образовывать ковалентную связь с улавливающим реагентом, который представляет собой второй член пары, способной к ковалентному связыванию, где ковалентное связывание может быть обратимым или необратимым. В данном варианте осуществления улавливаемый маркер Z может представлять собой реакционноспособный химический фрагмент, такой как азидная или алкинильная группа, способная ковалентно взаимодействовать с улавливающим реагентом, содержащим комплементарную реакционноспособную группу, например, алкинильный или азидный фрагмент, соответственно, в случае реакции 3+2 циклоприсоединения Хьюсгена (так называемая клик-реакция, катализируемая Cu(I), или ее вариант, который протекает в отсутствии ионов Cu(I) с использованием сильно напряженного цикла, присутствующего, например, в производных циклооктина). Конкретным примером Z-Y-X в таком случае является пропаргиламино.
В другом варианте осуществления улавливаемый маркер может представлять собой химический фрагмент, который содержит дополнительную нуклеофильную группу, такую как вторая аминогруппа в реагенте типа NH2-Y -XH. Затем можно использовать широкий спектр подходящих электрофильных реагентов Z, таких как хлорформиат холестерина или N-гидроксисукцинимидные активированные эфиры биотина, обеспечивающие введение концевой группы в то время, как олигонуклеотид прикреплен к
- 4 034605 твердой фазе, что значительно расширяет сферу реакции присоединения концевой группы.
В предпочтительном варианте осуществления улавливаемый маркер представляет собой длинноцепочечный алкильный остаток, перфторалкильный фрагмент, азидную или алкинильную группу.
В следующем варианте осуществления настоящего изобретения олигонуклеотид может содержать второй улавливаемый маркер в другом положении, например, на 3'-конце. Первый и второй улавливаемые маркеры предпочтительно выбирают так, чтобы можно было провести очистку посредством двух независимых методов, позволяющих выделить вещество с очень высокой степенью чистоты. Например, первый улавливаемый маркер может представлять собой липофильную группу, которая взаимодействует с соответствующим хроматографическим носителем, а второй улавливаемый маркер может представлять собой биотин, который взаимодействует со стрептавидином.
Второй улавливаемый маркер удобно вводить во время синтеза олигорибонуклеотидов с использованием модифицированного CPG (стеклянный носитель с контролируемым размером пор).
Y обозначает химическую связь или линкер, такой как алкилен, предпочтительно ^^алкиленовый линкер, более предпочтительно C2-5алкиленовый линкер, или аралкиленовый линкер, необязательно содержащий гетероатомы или группы, содержащие гетероатомы, такие как O, S, NH, C=O или C=S, и/или необязательно содержащий связи C=C или C^C. В соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществления Y представляет собой связь.
В другом предпочтительном варианте осуществления линкер представляет собой полиалкиленоксид, предпочтительно поли-C2-C6-алкиленоксид, более предпочтительно поли-C2-C3-алкиленоксид. Среднечисленная молекулярная масса линкера может находиться в диапазоне 30-800 г/моль, предпочтительно 40-450 г/моль, более предпочтительно 40-250 г/моль. Линкер может представлять собой [CH2CHR4-O-]n, где n=1-10, предпочтительно n=1-7, более предпочтительно n=2-5, и еще более предпочтительно n=3. R4 может представлять собой H или Q-еалкил. Другие предпочтительные варианты Y показаны на фиг. 4. В предпочтительном варианте осуществления R4 обозначает H.
В соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществления,
X обозначает NH или O,
Y обозначает -K-((CHR1) m-CH2-O)n-R- или -(O-(CHR3)m3-CH2)ni-(O-(CHR2)m2-CH2)n2-(O-(CHRi)mi-CH2)n3-, и
K обозначает O или NH, m, m1, m2 и m3 независимо обозначают число от 1 до 12, предпочтительно от 1 до 8, более предпочтительно от 1 до 5 и еще более предпочтительно от 1 до 3, n, n1, n2 и n3 независимо обозначают число от 0 до 20, предпочтительно от 0 до 10, более предпочтительно от 0 до 5 и еще более предпочтительно от 0 до 3, и
R1, R2 и R3 независимо обозначают H, Q-еалкил, ^^алкенил, ^^алкинил, CYrann.i или циклическую группу, где каждая из указанных групп может быть необязательно замещена, и
R обозначает Cb^nra, ^^алкенил, ^^алкинил, ^^ацил или циклическую группу, где каждая из указанных групп может быть необязательно замещена. Предпочтительно R обозначает CH2CH2.
В соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществления Y имеет указанные выше значения, R1 и R2 обозначают H, n1 равен 0, а n2 и n3 равны 1. Другие предпочтительные варианты осуществления можно найти на фиг. 4.
В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления Y имеет указанные выше значения, R1, R2 и R3 обозначают H, а n1, n2 и n3 равны 1.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления X обозначает NH, K обозначает NH, a Y обозначает (CH2CH2O)n, где n имеет указанные выше значения, а K дополнительно замещен холестерин-QO)-, тритилом, или их производными.
В соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществления олигонуклеотида формулы (I), X обозначает NH или O, Y обозначает связь, a Z обозначает Q-C^-алкил или H, предпочтительно C10, Q или NHC2-C24^hm, где Q выбран из группы, включающей в себя H, аминокислоты, аналоги аминокислот, C1-C24-алкил, предпочтительно C12-C24-алкил, пептиды и липиды, а V1, V2, V3, V4, V5, V6, W1, W2 и W3 обозначают O.
В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления олигонуклеотида формулы (I), X обозначает NH или O, Y обозначает связь, Z обозначает децил или H, a V1, V2, V3, V4, V5, V6, W1, W2 и W3 предпочтительно обозначают O.
В следующем аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей модифицированный олигонуклеотид, описанный в данном документе.
Фармацевтическая композиция настоящего изобретения может дополнительно содержать фармацевтически приемлемые носители, разбавители и/или адъюванты. Используемый здесь термин носитель включает в себя носители, наполнители и/или стабилизаторы, которые являются нетоксичными для клеток или млекопитающих в используемых дозах и концентрациях. Как правило физиологически приемлемые носители представляют собой водные забуференные растворы или липосомы. Примеры физиологически приемлемых носителей включают в себя буферы, такие как фосфатный, цитратный и буферы на основе других органических кислот (однако для получения композиции настоящего изобретения
- 5 034605 предпочтительно используют фосфатный буфер); антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, низкомолекулярные (содержащие менее чем примерно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, такие как глюкоза, манноза или декстрины, огеливающие средства, такие как EDTA, сахара, спирты, такие как маннит или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN, полиэтилен или полиэтиленгликоль. В соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществления соединение настоящего изобретения растворяют в стерильной деионизированной воде.
Такой состав и/или такую композицию настоящего изобретения можно вводить субъекту, нуждающемуся в этом, в частности, человеку, в дозе, достаточной для лечения конкретных состояний, с помощью подходящих способов. Например, состав и/или композицию настоящего изобретения можно получить в виде фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемые носители, разбавители и/или адъюванты.
Терапевтическую эффективность и токсичность можно определить стандартными способами. Фармацевтическую композицию можно вводить системно, например, внутрибрюшинно, внутримышечно или внутривенно, или местно, например, интраназально, подкожно, внутрикожно или интратекально. Дозы вводимых состава и/или композиции, как правило, зависят от субъекта, подлежащего лечению, и от характерных особенностей субъекта, таких как масса субъекта, возраст субъекта, тип и степень тяжести заболевания или повреждения, подлежащего лечению, а также от способа введения и решения лечащего врача.
В предпочтительном варианте осуществления фармацевтическую композицию вводят внутрикожно. Особенно предпочтительно вводить композицию внутрикожно посредством татуировки, микроиглы и/или микроигольного пластыря.
Соединение настоящего изобретения предпочтительно растворяют и разбавляют до желаемой концентрации, используя стерильную деионизированную воду (очищенную воду), затем наносят на выбритую, продезинфицированную этанолом кожу с помощью пипеточного устройства и вводят в кожу путем татуировки.
В случае татуировки, например, водную фармацевтическую композицию настоящего изобретения вводят в кожу с помощью машинки для нанесения (медицинской) татуировки, оборудованной насадкой для нескольких игл (такой как 9-игольная одноразовая насадка).
Типичную процедуру нанесения татуировки проводят следующим образом: фармацевтическую композицию на водной основе наносят пипеткой на выбритую и очищенную этанолом кожу, после чего ее вводят в насадку для нескольких игл татуировочной машинки путем осторожного размещения работающего кончика иглы (работает со скоростью, соответствующей, например, 100-120 Гц, в частности, 100 Гц) в верхней части капли водной фармацевтической композиции. После того, как капля водной фармацевтической композиции полностью адсорбируется работающим кончиком иглы, и, следовательно, помещается между работающими иглами, работающий кончик осторожно перемещают назад и вперед по коже, удерживая заполненный игольный наконечник точно под углом 90 градусов к коже. С помощью данного метода водную фармацевтическую композицию полностью татуируют в кожу. Татуировка 50-100 мкл водной фармацевтической композиции на участке кожи 2-4 квадратных сантиметров обычно занимает 10-15 с. Преимущество такого способа введения по сравнению с однократной стандартной внутрикожной болюсной инъекцией заключается в том, что водную фармацевтическую композицию равномерно вводят на большом участке кожи, при этом композиция более равномерно и более точно распределяется на ткани-мишени: при использовании 9-игольного наконечника при 100 Гц в течение 10 с, данный метод обеспечивает 9000 внутрикожных инъекций, равномерно распределенных в обрабатываемой коже.
Конечно, специалист в данной области техники может модифицировать и корректировать данную процедуру, в зависимости от пациента или части тела, подлежащей обработке. Процедуру микроигольного введения можно проводить аналогично процедуре татуировки. Но при микроигольном введении наконечник для татуировки заменяют наконечником для микроиглы, что делает внутрикожное введение более поверхностным. Как правило, фармацевтическую композицию на водной основе наносят пипеткой на выбритую и очищенную этанолом кожу, а затем вводят внутрикожно при помощи наконечника для микроигл аналогично процедуре татуировки. При применении микроигл отсутствует необходимость предварительной адсорбции фармацевтической композиции между микроиглами.
Кроме того, для чрезкожной/внутрикожной доставки можно использовать микроигольные пластыри, покрытые или иным образом несущие фармацевтическую композицию. Специфическое преимущество данного способа заключается в том, что внутрикожное введение фармацевтической композиции может безопасно осуществлять сам реципиент без необходимости посещения больницы и/или медицинского вмешательства специалиста по татуировке/микроигольному введению. Данный способ значительно повышает гибкость схем лечения, позволяет использовать высоко персонализированные схемы лечения, уменьшить боль, связанную с обработкой, и снизить стоимость лечения. Указанные пластыри могут
- 6 034605 включать в себя, без ограничения, растворяющие или не растворяющие микроигольные пластыри, обеспечивающие контролируемую по времени, пролонгированную или болюсную чрезкожную доставку фармацевтической композиции.
Другой аспект настоящего изобретения относится к способу получения олигонуклеотида по любому из пп.1-15, включающему в себя следующие стадии:
(a) взаимодействие соединения формулы (IIa)
где V1, V3, V5, V4, V6, W1, W2 и W3 и ON имеют указанные выше значения и где ON защищен по меньшей мере одной защитной группой с окисляющим реагентом с получением соединения формулы (IIb) wT 4w,
V6,.J |^V2 vyN/N-ON l[b где V1, V3, V5 и V2, V4, V6, W1, W2 и W3 и ON имеют указанные выше значения и где ON защищен по меньшей мере одной защитной группой, (b) взаимодействие соединения формулы (IIb) с улавливающим реагентом формулы (III)
Z- Y-XH (III), где X, Z и Y имеют указанные выше значения и где X предпочтительно обозначает O, с получением продукта реакции, содержащего олигонуклеотид формулы (I), (c) удаление по меньшей мере одной защитной группы с ON и (d) приведение в контакт продукта реакции, полученного на стадии (b), с улавливающим реагентом, способным взаимодействовать с улавливаемым маркером, где приведение в контакт осуществляют в условиях, обеспечивающих отделение олигонуклеотида (I) от других веществ, содержащихся в указанном продукте реакции.
Вариант осуществления, в котором X обозначает O, является особенно предпочтительным.
Олигонуклеотид ON, используемый в способе настоящего изобретения, содержит по меньшей мере одну защитную группу. В соответствии с настоящим изобретением защитные группы используются, в частности, для защиты групп 2'-OH рибозной субъединицы используемого олигонуклеотида. Специалистам в данной области техники известны защитные группы, подходящие для синтеза, в особенности, специалистам, работающим в области синтеза нуклеотидов. Предпочтительно использовать защитные группы в положении 2'-OH рибозной субъединицы олигонуклеотида. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения в 2'-положении рибозной субъединицы используют защитные группы, чувствительные к фториду.
Особенно предпочтительными являются защитные группы 2'-O-TBDMS или 2'-O-TOM. В особенно предпочтительном варианте осуществления используют защитную группу TBDMS.
В частности, в процессе синтеза соединений, в которых X=O и которые обладают повышенной стабильностью связывания Z-Y-X-PPP, удаление защитных групп с 2'-OH можно проводить в широком диапазоне условий.
Все реагенты, обычно используемые для удаления защитных групп, можно использовать для отщепления защитной группы TBDMS. Например, можно использовать следующие реагенты:
(a) триэтиламинтригидрофторид, необязательно в сочетании с полярным растворителем, (b) триалкиламин, триэтиламинтригидрофторид и полярный растворитель, (c) пиридин-HF и другие аддукты гидрофторида и органических азотистых оснований, (d) фторид аммония, (e) фторид тетра-н-бутиламмония, (f) фторид тетраметиламмония, другие фториды тетраалкиламмония и их сочетания.
Стадию (c) предпочтительно проводят в условиях, которые не вызывают разрушение трифосфатного фрагмента, например, как подробно описано ниже.
Стадия (a) способа настоящего изобретения включает в себя взаимодействие циклических фрагментов Р^)-Р^)-Р(Ш) формулы (IIa) с окисляющим реагентом. Соединение формулы (IIa) можно получить с помощью стандартных методов, описанных в Ludwig et al., 1989, выше и Gaur et al., 1992, выше, а именно, путем взаимодействия 5'-концевой OH-группы олигонуклеотида с трифункциональным фосфитилирующим реагентом, таким как 2-хлор-4H-1,3,2-бензодиоксафосфорин-4-он, в подходящих условиях, например, в присутствии основания (такого как пиридин или диизопропилметиламин) и в подходящем растворителе, таком как диоксан или дихлорметан, с последующим взаимодействием с пирофосфатом
- 7 034605 (W3=O) или модифицированным пирофосфатом (W3 отличается от O и обозначает, например, CH2, CCl2, NH или CF2). Предпочтительно три-н-бутиламмониевую соль пирофосфата или модифицированного пирофосфата используют в ДМФ. Затем полученное циклическое промежуточное соединение P(III)-P(V) (IIa) окисляют в безводных условиях, например, пероксидом, таким как трет-бутилгидропероксид, гидропероксид кумола, (10-камфорсульфонил)оксазиридин. Альтернативно можно использовать комплекс фенилацетилдисульфида (V2=S) или боран-диизопропилэтиламина (V2=BH3), соответственно, с получением соответствующего циклического соединения формулы (IIb), содержащего на 5'-конце трифосфат/аналог трифосфата. Информацию по данной реакции также можно найти в WO 96/40159 или WO 2009/060281, содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки.
Стадию (a) реакции можно проводить, используя олигонуклеотид в растворе, или олигонуклеотид, присоединенный к твердой фазе, такой как органическая смола или стекло, такое как CPG. Олигонуклео тид может дополнительно содержать защитные группы, например, защитные группы для сахарных остатков или нуклеотидных оснований, хорошо известные специалистам в данной области. Предпочтительные примеры защитных групп включают в себя 2-цианоэтил для межнуклеозидной фосфодиэфирной или фосфоротиоатной связи, трет-бутилдиметилсилил, триизопропилсилилоксиметил или бис(ацетоксиэтокси)метил для 2'-гидроксильной группы рибозы, 4-трет-бутилфеноксиацетил или феноксиацетил, ацетил, изобутирил, бензоил для экзоциклической аминогруппы нуклеотидных оснований. Более предпочтительно стадию (a) проводят, используя олигонуклеотид, присоединенный к твердой фазе.
На стадии (b) способа настоящего изобретения соединение (IIb) подвергают взаимодействию с улавливающим реагентом формулы (III),
Z-Y-XH (III) где X обозначает группу, выбранную из NH, NR3 или O, а X и Y имеют указанные выше значения. R3 имеет значения, описанные выше для R1.
В частности, если X обозначает O, для раскрытия цикла можно использовать реагент с ограниченной нуклеофильностью, такой как деканол (см. фиг. 1, стадия 4). Такую стадию можно проводить при комнатной температуре, например, в течение 48 ч, с превращением циклотрифосфата в целевой сложный γ-эфир трифосфата.
На стадии (c) удаляют защитные группы с ON.
При проведении стадии (c), например, указанные выше реагенты (а) и (b) для удаления защитных групп можно использовать в условиях, включающих в себя, если X=O, время реакции от 20 мин до 180 мин, более предпочтительно от 60 мин до примерно 150 мин, в частности, примерно 120 мин, температуру реакции 60-70°C, в частности, примерно 65°C. Если X=NH, такие реакции исключаются вследствие разной стабильности связывания, или могут проводиться лишь в значительно худших условиях реакции, например, в течение 40 ч при комнатной температуре.
Стадия (d) способа настоящего изобретения включает в себя приведение в контакт продукта реакции, полученного на стадии (b), с улавливающим реагентом, способным взаимодействовать с улавливаемым маркером Z в условиях, обеспечивающих отделение олигонуклеотида (I), содержащего улавливаемый маркер, от других веществ, содержащиеся в продукте реакции. Перед стадией (d) олигонуклеотид (I), присоединенный к твердой фазе, отделяют от твердой фазы и подвергают частичному или полному удалению защитных групп. Улавливающий реагент предпочтительно иммобилизуют на подходящей подложке, такой как хроматографический носитель. Чтобы обеспечить отделение олигонуклеотида (I), содержащего улавливаемый маркер, от веществ, не содержащих улавливаемый маркер, продукты реакции, полученные на стадии (b), отщепляют от твердой фазы и подвергают удалению защитных групп, если это необходимо, после чего их разделяют, предпочтительно, с использованием хроматографического метода разделения, основанного на взаимодействии улавливаемого маркера Z с улавливающим реагентом. С помощью стадии разделения чистоту олигонуклеотида (I), которая обычно находится в диапазоне 25-70% по отношению к неочищенному веществу, в зависимости от длины и сложности последовательности, можно повысить до 90, 91, 92, 93, 94, 95% или более. Для исследования токсичности желательно, чтобы чистота составляла >85%, тогда как на последней стадии клинических испытаний чистота должна находиться в диапазоне, составляющем по меньшей мере 90-95%. Таким образом, настоящее изобретение предлагает способ получения рррРНК с высокой степенью чистоты, необходимой для проведения клинических испытаний на людях.
На стадии (d) улавливаемый маркер и способный взаимодействовать с ним улавливающий реагент предпочтительно выбирают из (i) гидрофобной или фторированной группы и хроматографического материала, обладающего сродством к гидрофобным или фторированным группам, такого как обращенная фаза или носитель, обладающий сродством к фтору; (ii) первого партнера по нековалентному высокоаффинному связыванию и второго комплементарного партнера по нековалентному высокоаффинному связыванию, (iii) первого партнера по ковалентному связыванию и второго комплементарного партнера по ковалентному связыванию, где первый партнер и второй партнер образуют ковалентные связи.
Улавливаемый маркер функционально определяют ниже с помощью ряда приемлемых примеров.
- 8 034605
Общее правило может включать в себя следующие положения: Z должен обеспечивать удобную очистку, и он должен удаляться в условиях, совместимых с требованиями стабильности рррРНК.
Кроме того, способ может дополнительно включать в себя стадию (e) удаления улавливаемого маркера с получением олигонуклеотида формулы (IV). В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, если X=O, получают соединение формулы (IV)a или (IV)b,
Vg
II II II
НО p—w3—P -W2—P— w,—ON(IVa)
VB V4V или
V* VsV„ и I’ii л™
ΗΥ·--о p—wa—P -w2—P—W,-— ON(IVb)
Vs V4V а если X=NH, получают соединение формулы (IV)a va vfc
II IIII (IVa)
V& V4V
Стадия (e) должна быть совместимой с требованиями стабильности конечного продукта, содержащего трифосфат, а также с требованиями стабильности межрибонуклеотидной связи. Такие требования могут включать в себя расщепление в слабокислой среде, если X обозначает NH, расщепление ионами серебра, если X обозначает S, расщепление тиолом, таким как дитиотреитол, приводящее к удалению тиирана, если Y-X-P содержит -S-S-CH2-CH2-O-P.
В других вариантах осуществления улавливаемый маркер Z не удаляют или удаляют не полностью. В таких вариантах осуществления маркер-содержащий олигонуклеотид можно использовать, например, в качестве фармацевтического средства.
В указанных вариантах осуществления реагент Z-Y-XH должен быть выбран из подгруппы Zостатков, функционально совместимых со структурными требованиями воспринимающего элемента RIG-I. Например, известно, что этим требованиям отвечает сочетание Z=децил-октадецил, Y=связь, X=NH или O.
Модифицированные олигонуклеотиды, содержащие трифосфат/аналог трифосфата, полученные по способу настоящего изобретения, сугубо подходят для фармацевтического применения вследствие их высокой чистоты. В особенно предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид (I) или (IV) является активатором геликазы RIG-I. Конкретные примеры подходящих активаторов RIG-I раскрыты в Schlee et al., 2009, выше, содержание которого включено в настоящее описание в качестве ссылки.
Описание рисунков
На фиг. 1 показано схематическое изображение синтеза сложноэфирных трифосфатных производных олигонуклеотидов.
На фиг. 2 показаны результаты анализа продуктов синтеза децил-О-рррРНК 24-мер (последовательность РНК: 5'-GACGCUGACCCUGAAGUUCAUCUU) методами ОФ-ВЭЖХ и ESI-ЖХ/МС.
(A) Хроматограммы ОФ-ВЭЖХ.
a) неочищенной реакционной смеси, содержащей 48% децил-O-рррРНК (время удерживания=14 мин),
b) чистой децил-О-рррРНК.
Колонка: Hamilton PRP-14,1*250, 10 мкм.
Градиент: 0-100% B в течение 18 мин, A=100 мМ TEAB; B=80% метанол, 100 мМ TEAB.
(B) ESI-MC профиль чистой децил-О-рррРНК зарегистрированный с использованием ОФ-ЖХ/МС (MB рассчитанный: 7987, обнаруженный: 7968).
На фиг. 3 показана очистка реакционной смеси, содержащей децил-О-рррРНК, в масштабе 1 мкмоль методом полупрепаративной ОФ-ВЭЖХ: децильный маркер обеспечивает эффективное отделение целевого продукта (фракция 3) от побочных продуктов, не содержащих маркера, включающих в себя последовательности, образовавшиеся в результате неполного синтеза, полноразмерную нефосфорилированную ОН-РНК и недериватизированную рррРНК.
Колонка: Hamilton PRP-17*250 мм, 10 мкм.
Градиент: 0-80% B в течение 50 мин, A=100 мМ TEAB; B=80% метанол, 100 мМ TEAB.
Фиг. 4 - особенно предпочтительные варианты Y.
- 9 034605
Фиг. 5 - скрининг 2'-О-метилирования позволяет выявить положения, отвечающие за селективность в отношении RIG-I.
Фиг. 6 - метилирование делает дуплекс RIG-I специфичным и высоко активным.
Фиг. 7 - концевые фосфоротиоаты увеличивают иммуногенность селективного дуплекса.
Фиг. 8 - отдельные замены 2'-фтор повышают активационный потенциал дуплекса в отношении RIG-I.
Фиг. 9 - многократная модификация OH дц-РНК OH-GFP2 приводит к сильному увеличению активационного потенциала в отношении RIG-I.
Фиг. 10 - повышение иммуногенности в результате модификаций скелета может передаваться трифосфорилированному дуплексу.
Фиг. 11 - показана схема способа настоящего изобретения с использованием диэтиленгликольмонобутилового эфира в качестве примера алкилполиэтиленгликоля как нуклеофильного реагента, используемого для раскрытия цикла.
Фиг. 12 - очистка методом ОФ-ВЭЖХ реакционной смеси C4-DEG-pppPHK, содержащей 45% C4DEG-pppPHK (пик соответствует объему градиента 88,4 мл) и 50% рррРНК (пик соответствует 77,5 мл) Колонка: Hamilton PRP-17^250 мм, 10 мкм, скорость потока 3 мл/мин. Градиент: 1-80% B в течение 50 мин, A=0,1 М TEAB; B=80% метанол, 0,1 М TEAB.
Фиг. 13 - спектр C4-DEG-рррРНК, полученный методом MALDI-TOF после очистки ВЭЖХ. Надлежащий массовый пик соответствует m/z 7972,6 (A).
На фиг. 14 показана схема синтеза рррРНК с использованием липофильного полиэфирного композитного маркера.
На фиг. 15 показаны очистка ВЭЖХ и результаты MALDI, относящиеся к фиг. 14 (последовательность РНК 5'-GACGCUGACCCUGAAGUUCAUCUU).
(A) ОФ-ВЭЖХ очистка CH-CONH-CH2CH2CH2-(O-CH2CH2)2-O-CH2CH2CH2-NHpppPHK.
Колонка: Hamilton PRP-14,1^250 мм, 10 мкм.
Градиент: 0-80% B в течение 50 мин; A=100 мМ TEAB, B=80% метанол, 100 мМ TEAB.
(B) MALDI-спектр неочищенной реакционной смеси после обессоливания демонстрирует присутствие C11-CONH-CH2CH2CH2-(O-CH2CH2)2-O-CH2CH2CH2-NHpppPHK (MB 8214,8).
(C) MALDI-спектр продукта гидролиза при pH=3,8 очищенной C11-CONH-CH2CH2CH2-(OCH2CH2)2-O-CH2CH2CH2-NHpppPHK (MB 7832,6).
На фиг. 16 показана схема синтеза холестерил-меченной рррРНК с необязательным отщеплением соответствующей рррРНК.
На фиг. 17 показаны очистка и анализ холестерил-меченной рррРНК (последовательность РНК: 5'GACGCUGACCCUGAAGUUCAUCUU):
(A) ОФ-ВЭЖХ очистка холестерил-CONH-CH2CH2-(O-CH2CH2)2-NH-ррр-РНК
Колонка: Hamilton PRP-14,1^250 мм, 10 мкм.
Градиент: 0-10% B в течение 5 мин, 10% B в течение 9 мин, 10-100% B в течение 33 мин; A=50 мМ TEAB, B=95% метанол, 50 мМ ТЕАВ.
(B) ОФ-ВЭЖХ анализ чистой холестерил-CONH-CH2CH2-(O-CH2CH2)2-NH-ррр-РНК.
Колонка: Hamilton PRP-14,1^250 мм, 10 мкм.
Градиент: 0-100% B в течение 18 мин, 100% B в течение 4 мин; A=50 мМ TEAB, B=95% метанол, 50 мМ TEAB.
(C) MALDI-спектр чистой холестерил-CONH-CH2CH2-(O-CH2CH2)2-NH-ррр-РНК.
Пик рррРНК (7827,3 Да) обусловлен PN-расщеплением в процессе ионизации.
Примеры
Пример 1. Получение 5'-децилЮ-трифосфата РНК.
Как указано на схеме (фиг. 1), процесс синтеза децилЮ-трифосфата РНК включает в себя следующие стадии:
1-4) 5'-ДецилЮ-трифосфат РНК.
Связанную с носителем, полностью защищенную 5'OH-РНК (1 мкмоль) сушат в течение 3 ч под вакуумом в колонке для синтеза, а затем промывают безводной смесью пиридин/диоксан (1:3, об/об, 4 мл). В атмосфере аргона свежеполученный 1М раствор 2-хлор-4H-1,3,2-бензодиоксафосфорин-4-она в безводном диоксане (100 мкл, 100 мкмоль) вводят в колбу, содержащую 2 мл безводной смеси пиридин/диоксан (1:3, об/об). Полученный 50 мМ фосфитилирующий раствор вводят в колонку для синтеза и медленно перемещают назад и вперед во время реакции, продолжающейся 30 мин. Затем получают раствор пирофосфата тетра(три-н-бутиламмония) путем смешивания 0,5М раствора пирофосфата бис (трин-бутиламмония) в ДМФ (1 мл, 0,5 ммоль) и три-н-бутиламина (238 мкл, 1 ммоль). Раствор пирофосфата пропускают через колонку и после вытеснения из колонки и отбрасывания избытка фосфитилирующего реагента оставшийся раствор пирофосфата продавливают вперед и назад с помощью двух шприцев. Через 10 мин колонку промывают безводным ацетонитрилом (3 мл). 5,5М раствор трет-бутилгидропероксида в декане (300 мкл) растворяют в безводном ацетонитриле (2 мл) и приводят в контакт с носителем для синтеза. Через 15 мин колонку промывают безводным ацетонитрилом (6 мл). Затем гомо- 10 034605 генный раствор N-метилимидазола (240 мкл, 3 ммоль), три-н-бутиламина (250 мкл, 1,1 ммоль) и Nдецилового спирта (2 мл, 10,5 ммоль) многократно продавливают назад и вперед через колонку и оставляют взаимодействовать в течение 48 ч, чтобы достичь превращения циклотрифосфата в децил-Oтрифосфат. Колонку промывают безводным ацетонитрилом (6 мл) и обрабатывают 0,1М раствором бикарбоната триэтиламмония (TEAB, 2 мл) в течение 20 мин, чтобы гидролизовать непрореагировавший циклотрифосфат и избежать неспецифической дериватизации при последующей процедуре удаления защитных групп. После очередной стадии промывки безводным ацетонитрилом (9 мл) носитель для синтеза сушат в потоке аргона.
5-6) Удаление защитных групп и очистка.
5'-Децил-O-трифосфат олигонуклеотида приводят в контакт со свежеприготовленным 40% водным раствором метиламина и концентрированным водным раствором аммиака (AMA, 1:1, об/об, 2 мл) с помощью двух шприцев. После расщепления в течение 30 мин раствор переносят в чистый флакон с завинчивающейся пробкой и носитель промывают AMA (1 мл). Объединенный раствор и раствор для промывания нагревают в течение 10 мин при 65°C. После охлаждения на льду раствор упаривают досуха и остаток сушат путем совместного упаривания с абсолютным этанолом. Защитные группы 2'-O-TBDMS можно удалить путем обработки тригидрофторидом триэтиламина (TEA.3HF) без значительной потери фрагмента модифицированного трифосфата. ДецилЮ-трифосфат олигонуклеотида повторно растворяют в свежеприготовленном растворе N-метилпирролидона/триэтиламина/TEA.3HF (NMP/TEA/TEA.3HF, 6:4:3, об/об, 325 мкл) и раствор нагревают при 65°C в течение 2 ч. Альтернативно для удаления защитных групп можно использовать раствор TEA.3HF в ДМСО (1:1, об/об, 600 мкл). После полного удаления защитных групп децилЮ-трифосфат олигонуклеотида осаждают из раствора для удаления защитных групп н-бутанолом и очищают методом ВЭЖХ. Липофильный децильный маркер позволяет отделить децилЮ-трифосфат от примесей, которые не содержат данный маркер, с помощью хроматографии на обращенной фазе. Продукт реакции наносят на колонку PRP-1 7*250 мм и разделяют в линейном градиенте от 0 до 100% буфера B в течение 50 мин при скорости потока 3 мл/мин. Буфер A представляет собой 100 мМ TEAB, а буфер B представляет собой 100 мМ TEAB в 80% метаноле. Фракции, содержащие продукт, собирают, упаривают и обессоливают путем многократного совместного упаривания с метанолом. Остаток растворяют в воде и превращают в натриевую соль путем осаждения этанолом в присутствии 0,3М хлорида натрия.
Пример 2. Получение 5'-рррРНК гамма 2-(2-бутоксиэтокси)этилового эфира (C4-DEG-pppPHK). Схема реакции, описанная в примере 2, показана на фиг. 11.
Стадия 1: 203 мг (1 ммоль) 2-хлор-4H-1,3,2-бензодиоксафосфорин-4-она растворяют в 1 мл сухого диоксана во флаконе с перегородкой емкостью 10 мл в атмосфере аргона.
Стадия 2: колонку для синтеза, содержащую полностью защищенную РНК, детитрилированную и тщательно промытую ацетонитрилом, сушат в вакууме в течение 12 ч. Содержимое колонки тщательно промывают путем многократного всасывания и выталкивания 2 мл раствора безводного диоксана в пиридине 3: 1 (об/об) в атмосфере аргона.
Стадия 3: во флакон вначале добавляют 2 мл смеси пиридин/диоксан, 3:1 об/об, и затем 100 мкл 1М раствор 2-хлор-4H-1,3,2-бензодиоксафосфорин-4-она в сухом диоксане с получением 50 мМ раствора фосфитилирующего реагента, такого как 2-хлор-4H-1,3,2-бензодиоксафосфорин-2-он, в смеси диоксан/пиридин, 3:1 (об/об). Раствор гомогенизируют путем осторожного встряхивания. Инициируют реакцию, пропуская раствор 2-хлор-4H-1,3,2-бензодиоксафосфорин-4-она из флакона через колонку для синтеза.
В процессе реакции в колонку для синтеза многократно засасывают с последующим выталкиванием раствор, содержащий 2-хлор-4H-1,3,2-бензодиоксафосфорин-4-он, чтобы обеспечить тесный контакт и тщательное перемешивание с РНК, иммобилизованной на твердой фазе. Время реакции 30 мин обычно позволяет достичь почти количественного превращения свободной группы 5'-OH олигомера, связанного с носителем, в диапазоне 20-40 нт.
Стадия 4: после протекания реакции в течение 30 мин диоксан/пиридиновый раствор, содержащий избыток фосфитилирующего реагента, выдавливают в контейнер для отходов, заполняют новый шприц перемешанной на вортексе смесью 1 мл 0,5М раствора (Bu3NH)2 пирофосфата в сухом ДМФА и 238 мкл (1 ммоль) сухого BU3N с получением 0,5 М раствора (Bu3N)4 пирофосфата. Данный раствор продавливают через колонку, тем самым заменяя диоксан/пиридиновый раствор. Большой избыток пирофосфата обеспечивает количественное превращение промежуточного соединения в циклический ангидрид P(III)P(V) IIA.
Стадия 5: колонку промывают 3 мл CH3CN, чтобы удалить DMF и избыток PPi, после чего реактор колонки заполняют сухим CH3CN.
Стадия 6: 300 мкл трет-BuOOH (5,5 М раствор в декане, Sigma-Aldrich) растворяют в 2 мл безводного CH3CN с получением примерно 0,7 М гомогенного раствора. Осуществляют контактирование носителя для синтеза с данным раствором в течение 15 мин с получением окисленного P(V) циклического ангидрида IIb.
Стадия 7: колонку промывают 3 мл сухого CH3CN, чтобы удалить лишнюю перекись, и заполняют
- 11 034605 ее сухим CH3CN.
Стадия 8: 2 мл сухого 2-(2-бутоксиэтокси)этанола (монобутиловый эфир диэтиленгликоля), содержащего 0,1М N-метилимидазол и 0,1М три-н-бутиламин, приводят в контакт с носителем в колонке.
Время контакта CPG со спиртом должно составлять по меньшей мере 48 ч при комнатной температуре.
Стадия 9: колонку тщательно промывают 9 мл ацетонитрила и затем осуществляют контактирование колонки с 2 мл 0,1М раствора TEAB (триэтиламмония бикарбоната) в воде в течение 1 часа, чтобы гидролизовать непрореагировавший циклотрифосфат.
Стадия 10: первая стадия удаления защитных групп: 1 мл раствора для удаления защитных групп (40% водный раствор метиламина/конц. водный раствор аммиака 1: 1 об/об, реагент AMA) пропускают через носитель 2-3 раза. После контактирования в течение 30 мин раствор переносят в новый флакон. Носитель промывают таким же объемом раствора для удаления защитных групп AMA и объединяют смывы. Объединенные раствор и смывы нагревают в течение 10 мин при 65°C. После охлаждения на льду раствор концентрируют до объема 300-500 мкл и затем упаривают досуха.
Стадия 11: удаление защитных групп 2'-O-TBDMS: Остаток сушат путем добавления 300 мкл сухого этанола и совместного упаривания, добавляют 1 мл сухого 1М раствора TBAF (тетра-н-бутиламмония фторид) в ТГФ, плотно закрывают и помещают на шейкер, где держат в течение 16 ч. Реакцию гасят добавлением 1 мл стерильного 1М водного раствора TEAB (триэтиламмония бикарбонат), после чего реакционную смесь обессоливают на колонке NAPTM-25 (для очистки нуклеиновых кислот), используя стерильную воду в качестве элюента. На данной стадии иногда необходимо провести фильтрацию через стерильный фильтр с размером пор 2 мкм. УФ-поглощающие фракции объединяют и упаривают до объема 150 мкл, затем добавляют 100 мл 1М TEAB, pH 8, и полученный раствор хранят в замороженном состоянии при температуре -20°C до проведения очистки методом ВЭЖХ.
Стадия 12: очистка методом ВЭЖХ: Продукт реакции из реакционной смеси 1-микромолярного масштаба, полученной на стадии 11, загружают в колонку 7*25 мм PRP-1 (Hamilton). Очистку проводят с использованием линейного градиента буфера В от 0 до 80% в течение 50 мин при скорости потока 3 мл/мин. Буфер A представляет собой 100 мМ раствор TEAB, а буфер B представляет собой 100 мМ раствор TEAB в смеси метанол/вода 8:2 об/об. Типичный пример очистки молекулы, содержащей 24 мономера, показан на фиг. 3. Сочетание 4-атомного алкильного маркера и остатка диэтиленгликоля является достаточным для практически полного отделения от рррРНК. Фракции, соответствующие пику при 88,4 мл, объединяют, упаривают на роторном испарителе и обессоливают путем нескольких совместных упариваний с сухим метанолом.
Пример 3. Дериватизация рррРНК с использованием липофильных полиэфирных композитных маркеров с предварительно полученными липофильными полиэфирными аминами.
В примере 3 используют липофильные полиэфирные амины структуры ZY-H для получения ZYNHpppPHK.
Часть A. Экономичный крупномасштабный способ получения липофильного полиэфирного амина.
Данную процедуру, которую можно проводить без колоночной флэш-хроматографии, обычно применяют для синтеза моноамидов из водорастворимых диаминов и метиловых эфиров липофильных карбоновых кислот.
Синтез №лаурил-4,7,10-триокса-1,13-тридекандиамина (соединение 3, фиг. 14): 4,7,10-триокса-1,13тридекандиамин (43,8 мл, 200 ммоль) растворяют в 32,5 мл метанола. Медленно при перемешивании добавляют метиловый эфир лауриновой кислоты (4,92 мл, 20 ммоль), после чего закрытую колбу держат при комнатной температуре в течение 5 дней. Метанол удаляют из реакционной смеси на роторном испарителе и остаток растворяют в 100 мл этилацетата. Избыток диамина удаляют путем экстракции водой (2*120 мл) и затем концентрированным раствором хлорида натрия (2*100 мл). Этилацетатную фазу упаривают и остаточное масло кристаллизуют при стоянии при -20°C с получением 6,8 г (17 ммоль) чистого N-лаурил 4,7,10-триокса-1,13 -тридекандиамина.
Часть B. Реакции открытия цикла на CPG-связанном циклотрифосфате РНК с использованием Nлаурил-4,7,10-триокса-1,13 -тридекандиамина.
CPG-связанный циклотрифосфат РНК (соединение 4, фиг. 14) синтезируют по способу, включающему в себя стадии 1-7, описанные в предыдущем примере 2. Реакцию открытия цикла в циклотрифосфате РНК, иммобилизованном на твердой фазе, проводят с использованием 0,08М раствора N-лаурил4,7,10-триокса-1,13-тридекандиамина в ацетонитриле. Раствор ацетонитрила приводят в контакт с CPG и держат в течение 3 ч при комнатной температуре, после чего носитель промывают 10 мл сухого ацетонитрила и продувают сухим аргоном. Отсоединение от носителя, удаление защитных групп и последующую обработку методом ВЭЖХ проводят в точном соответствии со стадиями 10-12 примера 2. Продукт 5 элюируют при концентрации метанола 75% (фиг. 15). Спектральный анализ реакционной смеси методом MALDI подтверждает структуру соединения 5 (MB 8214,8 Да, фиг. 15b).
Кроме того, маркер очистки можно удалить с получением соответствующего трифосфата олигонуклеотида: 100 нмоль н-лаурил-замещенного гамма амида (соединение 5, фиг. 14) растворяют в 400 мкл буфера для удаления защитных групп, pH 3,8, в пробирке Эппендорфа объемом 2 мл, которую затем герметично закрывают и нагревают при 60°C в течение 70 мин. В данных условиях происходит количест- 12 034605 венное расщепление фосфорамидатной связи соединения 5 при отсутствии деградации трифосфатного фрагмента. Реакционную смесь охлаждают на льду и затем добавляют 14 мкл стерильного 5М раствора
NaCl и 1,2 мл абсолютного этанола. Осадок собирают центрифугированием, промывают холодным этанолом, сушат на Speed Vac, растворяют в стерильной воде и хранят в замороженном состоянии при 20°C.
Спектральный анализ методом MALDI подтверждает предполагаемый MB продукта pppPHK (MB 7832 Да, фиг. 15C).
Пример 4. Способ дериватизации pppPHK в колонке с использованием липофильных полиэфирных композитных маркеров.
Пример 4 представляет собой двухстадийную процедуру дериватизации в колонке иммобилизованного олигонуклеотида HYNHpppPHK с получением ZYNHpppPHK.
Получение холестерил-меченного трифосфата РНК (Chl-CONH-CH2CH2-(O-CH2CH2)2-NH-ррр-РНК, соединение 4, фиг. 16).
Конъюгирование липофильного холестерильного маркера с трифосфатом РНК позволяет эффективно отделять продукт маркер-рррРНК от немеченных примесей методом ОФ-ВЭЖХ. Схема реакции получения холестерил-меченного трифосфата РНК показана на фиг. 16. На первой стадии связанную с носителем, полностью защищенную 5'OH-РНК превращают в промежуточное соединение циклический трифосфат (соединение 2, фиг. 16) по способу, описанному в стадиях 1-7 примера 2. Затем колонку промывают безводным ацетонитрилом (3 мл). 17 6 мкл 2,2'-(этилендиокси)диэтиламина (соединение 1, фиг. 16; 1,2 ммоль) растворяют в безводном ацетонитриле (1 мл) и полученный раствор приводят в контакт с носителем в колонке. Через 3 мин колонку промывают безводным ацетонитрилом (3 мл) и безводным дихлорметаном (6 мл). Затем амино-модифицированный трифосфат (т.е. соединение 3, фиг. 16) обрабатывают предварительно полученным раствором хлорформиата холестерина (36 мг, 80 мкмоль), N,Nдиизопропилэтиламина (13,9 мкл, 40 мкмоль) и 4-диметиламинопиридина (4,9 мг, 40 мкмоль) в безводном дихлорметане (5 мл) в течение 15 мин. Колонку промывают безводным дихлорметаном (3 мл) и безводным ацетонитрилом (6 мл) и сушат в потоке аргона. Чтобы осуществить отсоединение от носителя и удаление защитных групп, производное олигонуклеотида приводят в контакт со свежеприготовленным 40% водным раствором метиламина и концентрированным водным раствором аммиака (AMA, 1:1, об/об, 2 мл) с использованием двух шприцев. После реакции отсоединения, проводимой в течение 30 мин, раствор переносят во флакон с завинчивающейся крышкой, нагревают в течение 10 мин при 65°C и упаривают досуха. Остаток сушат путем совместного упаривания с абсолютным этанолом и обрабатывают 1М раствором фторида тетра-н-бутиламмония в ТГФ (1 мл, 1 ммоль) при встряхивании в течение 16 ч. После обессоливания на колонке NAP-25 холестерил-меченный трифосфат олигонуклеотида, с которого удалены все защитные группы, очищают методом ВЭЖХ, используя колонку с обращенной фазой (Hamilton PRP-1, 4,1^250 мм, фиг. 17A). Соединение 4 элюируют при концентрации метанола 95%, после чего предполагаемую структуру подтверждают методом MALDI (MB 8370,6 Да, фиг. 17C).
Иногда холестерильный маркер удаляют путем кислого гидролиза при pH 3,8 и 60°C с получением соответствующего трифосфата олигонуклеотида (соединение 5, фиг. 16), используя способ, описанный в примере 3.
Пример 5. Систематическое введение 2'-О-метилирования позволяет получить RIG-I-селективный дуплекс РНК.
Список сокращений и их расшифровка приведены в конце текста данной заявки.
Собственная РНК организма характеризуется наличием множества модификаций, которые могут оказывать влияние на функции РНК (тРНК и рРНК). Следовательно, 2'-О-метилирование может привести к изменению иммуногенности РНК. Поэтому селективный лиганд RIG-I не должен содержать более одного 2'-О-метилирования на цепь. Указанные свойства дуплекса РНК обеспечивают путем сочетания соответственно метилированных смысловой и антисмысловой цепей.
Скрининг 2'-О-метилирования позволяет выявить положения, отвечающие за селективность в отношении RIG-I (фиг. 5). Проводят полный скрининг 2'-О-метилирования смысловой (A) и антисмысловой (B) цепей OH-GFP2. Каждое положение модифицируют отдельно путем 2'-О-метилирования и полученные продукты используют для стимуляции RIG-I, TLR7 или TLR8. Чтобы осуществить стимуляцию RIG-I, мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) блокируют хлорохином и стимулируют путем липофекции дуплекса. IFNa измеряют через 20 ч после стимуляции методом ELISA. В случае TLR7 и TLR8 скринингу подвергают только соответствующую одну цепь, стимуляторную способность которой определяют на неблокированных PBMC. Одиночные цепи трансфицируют путем образования комплексов с поли-Е-аргинином и через 20 ч после трансфекции методом ELISA измеряют IFNa, чтобы определить активацию TLR7, и IL12p70, чтобы определить активацию TLR8. 100% индукция GFP2 в случае смысловой цепи соответствует 3085 пг/мл IFNa для RIG-I, 2758 пг/мл IFNa для TLR7 и 1206 пг/мл IL12p70 для TLR8. В случае антисмысловой цепи 100% GFP2 соответствует 2342 пг/мл IFNa для RIG-I, 1831 пг/мл IFNa для TLR7 и 3018 пг/мл IL12p70 для TLR8. Анализ влияния введения 2'-О-метилирования в конкретных положениях приведен в виде таблицы (фиг. 5). Эффекты нормализуют по немодифицированной цепи, используемой в качестве контроля. Белый=никаких изменений, желтый=уменьшение сти- 13 034605 муляции иммунной системы, красный=отсутствие стимуляции иммунной системы, зслсный=увсличснис стимуляции иммунной систсмы.
Кромс того, существуют данныс, что мстилированис в нскоторых положсниях дсласт дуплскс RIG-I спсцифичным и высоко активным.
Фиг. 6: (A) Антисмысловую цепь метилируют по положениям, нс оказывающим влияния на активацию RIG-I, и полученный дуплскс используют для стимуляции хлорохин-блокированных PBMC в концентрации 0,8 мкг/мл. IFNa измеряют методом ELISA через 20 ч после стимуляции. 100% OH-GFP2 соответствует 2729 пг/мл IFNa. (B) Смысловые и антисмысловые цепи, содержащие 2'-O-мстилированис в разных сочетаниях положений, гибридизуют и используют для стимуляции PBMC. В случае стимуляции RIG-I их блокируют хлорохином и трансфицируют липофектамином, в случае стимуляции TLR7 и TLR8 используют неблокированные PBMC, которые трансфицируют комплексами дуплексов с поли-Lаргинином. 100% IVT-2 соответствуют 4861 пг/мл IFNa для RIG-I, 100% 9,2S соответствует 1975 пг/мл IFNa для TLR7 и 771 пг/мл IL12p70 для TLR8. На (A) и (B) показаны средние значения ± SEM от 3 доноров.
Пример 6. Повышение активации RIG-I путем вставки РНК-стабилизирующих модификаций.
Терапия с помощью миРНК включает в себя введение в организм коротких фрагментов дцРНК, которые ингибируют образование определенного белка в клетках-мишенях. Проблемой, связанной с применением данной формы терапии, является высокая нестабильность дуплексов миРНК. РНК может легко разрушаться экзонуклеазами и эндонуклеазами в сыворотке в процессе транспортировки в клеткимишени.
Вполне вероятно, что значительная часть экзогенной РНК, используемой в терапевтических целях, дегенерирует в сыворотке и цитозоле субъекта, которому ее вводят.
Показано, что все модификации 5'-PTO оказывают положительное влияние на иммунную активность дуплекса, и что сочетание 5'PTO в смысловой и антисмысловой цепях приводит к максимальному увеличению активности (s15/as3 по сравнению с s15 PTO/as3 PTO; фиг. 7B). Следовательно, применение таких модификаций скелета РНК в RIG-I-селективных лигандах можно рассматривать как оказывающее благоприятное действие.
В частности, можно продемонстрировать, что 5'-фосфоротиоаты повышают иммуногенность селективного дуплекса.
Фиг. 7: (A) PBMC блокируют хлорохином и стимулируют дуплексами в концентрации 0,8 мкг/мл. Через 20 ч после стимуляции измеряют IFNa методом ELISA. 100% IVT2 соответствует 6138 пг/мл IFNA. (B) Указанные дуплексы титруют и используют для стимуляции RIG-I. PBMC блокируют хлорохином и трансфицируют дуплексами с использованием липофектамина. Через 20 ч после стимуляции в супернатанте измеряют IFNa методом ELISA. 100% 50 нм 3P-GFP2 соответствует 16044 пг/мл IFNA. Результаты показаны в виде среднего значения ±SEM от 4 доноров.
При разработке терапевтических миРНК проблему стабильности в сыворотке решают путем введения модификаций другого вида: введение в РНК 2'-фтор-замен приводит к повышению стабильности РНК, обусловленному увеличением устойчивости к нуклеазам. Однако было отмечено, что 2'-фторзамены могут активировать RIG-I-зависимую стимуляцию иммунной системы.
В частности, показано, что 5'-фосфоротиоаты увеличивают иммуногенность селективного дуплекса.
Однако в соответствии с настоящим изобретением было обнаружено, что отдельные 2'-фтор-замены увеличивают RIG-I-активирующий потенциал дуплекса.
В смысловой (A) и антисмысловой (B) цепях дуплекса каждое положение модифицируют по отдельности путем замены 2'-фтор (фиг. 8). Полученные дуплексы используют для стимуляции PBMC в концентрации 0,8 мкг/мл. Чтобы определить активацию RIG-I, РВМС блокируют и трансфицируют с использованием липофектамина, для стимуляции TLR7 и TLR8 используют неблокированные PBMC, которые трансфицируют дуплексами в комплексе с поли-Е-аргинином. Через 20 ч после стимуляции измеряют уровни цитокинов методом ELISA. 100% GFP2 в случае смысловой цепи соответствует 2407 пг/мл IFNa для RIG-I, 3281 пг/мл для пихтового TLR7 и 1990 пг/мл для TLR8. В случае антисмысловой цепи 100% GFP2 соответствует 4512 пг/мл IFNa для RIG-I, 4691 пг/мл IFNa для TLR7 и 1997 пг/мл IL12p70 для TLR8. Результаты приведены в виде средних значений ± SEM от 4 доноров.
Таким образом, очень важно получить дуплекс, обладающий максимально возможной активностью, которая могла бы компенсировать потерю РНК. В предыдущих абзацах было описано, как модификации РНК можно идентифицировать путем селективного связывания PTO и 2'-фтор-замен, приводящих к увеличению активности дуплекса.
Пример 7. Сочетание всех модификаций позволяет получить лиганд RIG-I, обладающий высокой иммуногенностью.
Чтобы проверить, приводит ли сочетание связывания PTO или 2'-фтор-замен с 2'-O-метилированием к повышению селективности, указанные модификации постадийно объединяют в дуплексе.
PBMC блокируют хлорохином и используют для стимуляции RIG-I. Используют дуплексы, полученные путем введения разных модификаций в OH-GFP2, а активацию RIG-I определяют через 20 ч после стимуляции путем измерения IFNa методом ELISA (фиг. 9). Дуплексы, несущие совокупность моди- 14 034605 фикаций, сравнивают либо с OH-GFP2 (A), либо с трифосфорилированным 3P-GFP2 (B). 100% IVT 4 соответствует 21305 пг/мл IFNa. Результаты приведены в виде средних значений ± SEM от 2 доноров.
Вначале в исходную РНК OH-GFP2 водят 2'-O-метилирование s15/as3 (OH-GFP2 oMet15S/oMet3as, фиг. 9) и затем сравнивают его с модификациями 5'-PTO в смысловой и антисмысловой цепях (OH-GFP2 РТО 5', фиг. 9A). Затем оба типа модификаций объединяют в дуплексе (OH-GFP2oMet15/oMet3 PTO, фиг. 9). И наконец, получают дуплекс, который дополнительно содержит три 2'-фтор-замены в положениях 7 и 23 смысловой цепи и в положении 13 антисмысловой цепи (OH-GFP2oMet15/3-F23/13-PTO, фиг. 9A). Сравнительное титрование указанных двойных цепей РНК демонстрирует, что на сегодняшний день олигонуклеотид OH-GFP2oMet15/3-F23/13-PTO, несущий несколько модификаций, превосходит другие дуплексы по активности. Чтобы лучше оценить активность дуплекса, его титруют и сравнивают с немодифицированным трифосфатом дуплекса (фиг. 9B). Обнаружено, что введение модификации позволяет изменить олигонуклеотид так, так чтобы его иммунная активность оставалась сравнимой с активностью его трифосфатного эквивалента (3P-GFP2, фиг. 9B).
Пример 8. Элементы можно переносить на систему 3P-дцРНК
Полную разработку RIG-I-селективного лиганда осуществляют на уровне OH последовательности GFP2. Хотя активность можно сильно увеличить путем соответствующих модификаций, трифосфорилирование лиганда дополнительно повышает его активность.
До сих пор было не ясно, можно ли просто переносить модификации с соответствующим позиционированием в систему 3P-GFP2.
Чтобы найти ответ на этот вопрос, получают дуплексы, которые содержат модификации, повышающие активность: в смысловой цепи 2'-O-метилирование по 15 основанию, 2'-фтор-замены по 7 и 23 основаниям и присоединение двух PTO на 5'- и 3'-концах (2S2F, фиг. 10). В антисмысловой цепи объединяют 2'-О-метилирование по 3 основанию, 2'-фтор-замену по 13 основанию и присоединение двух 5'PTO. Поскольку в смысловой цепи близость трифосфата препятствует присоединению двух 5'-PTO, дополнительно получают мульти-модифицированную смысловую цепь, не содержащую 5'-PTO (1S2F, фиг. 10).
Чтобы оценить повышение активности в результате трифосфорилирования, для каждого дуплекса получают 5'-гидроксильную и 5'-трифосфатную формы (OH и 3P, фиг. 10), которые сравнивают друг с другом путем стимуляционного титрования на PBMC.
Фиг. 10: (A) Синтезируют мультимодифицированные дуплексы, содержащие и не содержащие трифосфат. Титрование дозы проводят на PBMC, блокированных хлорохином. Через 20 ч после стимуляции активацию иммунной системы измеряют методом ELISA по уровню IFNa. Результаты приведены в виде средних значений ± SEM от 4 доноров. (B) На основе кривых титрования рассчитывают биологические значения EC50.
Обнаружено, что мультимодифицированные OH-дуплексы, независимо от наличия на одном или двух концах PTO, могут достигать пределов активности немодифицированного OH-GFP2 (OH Multi 1S2F, OH Multi 2S2F, OH-GFP2, фиг. 10). Дополнительное введение 5'-трифосфата в смысловой цепи приводит к дополнительному увеличению активности в 5 раз по сравнению с гидроксил-содержащими комплексами (3P-Multi 1S2F, 3P-Multi 2S2F, фиг. 10).
В результате было обнаружено, что разные модификации, приводящие к повышению активности, можно сочетать с трифосфорилированием олигонуклеотида с достижением положительного эффекта.
Прогрессивное увеличение уровня селективности (2'-O-метилирование) исходного дуплекса OHGFP2, увеличение активности путем стабилизирующих модификаций (присоединение PTO и 2'-фторзамены) и сродства к связывающему карману (трифосфат), приводит к получению активного и селективного лиганда RIG-I (3P-Multi 1S2f).
И наконец, путем вставки специфических модификаций можно получить 3P-дцРНК с максимальным повышением иммунностимулирующей активности. Такое увеличение иммуногенности позволяет поддерживать дозу лекарственного средства на низком уровне и компенсировать потери РНК, которые происходят в период от введения лекарственного средства до его проникновения в клетку.
- 15 034605
Олигонуклеотиды РНК
GkACGCUGAGCCUGAAGUUCAUCUU
GFP2s oMetl С UGCGACUGGGACUUCAAGUAGAA
GA^CGCUGACCCUGAAGUUCAUCUU
GFP2s 0Met2 c0 GCGACUGGGACUUCAAGUAGAA
- Nm= 2-ОСНз
GFP2S oMet23 GaCGCUGACCCUGAAGUUCAUCUKU
CUGCGACUGGGACUUCAAGUAGA A
GFP2s oMet24 GACGCUGACCCUGAAGUUCAUCUUm
CUGCGACUGGGACUUCAAGUAGAA '
GFP2asoMetl β acGCUGACCCUGAAGUUCAUCOT '+ i) . ' ' '
C-.UGCGACUGGGACUUCAAGUAGAA · ' ' . .. . . . .. . . . Nm-zOCHj
GFP2as oMet2 GA CGCUGACCCUGAAGUUCAUCUU ' ''' CU^GCGACUGSGACOTCAAGUAGAA
GFP2as oMet23 gacGCUGACCCUGAAGUUCAUCU V . . - CUGCGACPGGGACUO'CAAGffAGAaA.
GFP2asoMet24 . G>CGCTOAGCCaGaAGU0C^COT.
CUGCGACUGGGACUUCAAGUAGAAw ' .
OH-GFP2 multi oMet G AC G CUGAC С C U GAAGUUCA UCUU CsUGnCKGACUGaG^GaAHiCnUCAAG^AGAAa Nm= 2’-ОСНз
s20/as12 GACGCUGACCCU GAAGUUCAaUCUU. . . CUGCGACDGGGAaCWCAAGU AGAA N„<= 2-ОСНз
s20/as19 GACGCUGACCCUGAAGUUC A^UCUU CUGCGACUGGGACUUCAAGj.U AGAA Nnl= 2-OCH3
s15/as12 CGGCGACTGGGAffiCOTJ CAAGUAGAA .. . Nm=2’-OCH3
s15/as19 GACGCUGACCCUGAAOGUUC AUCUU CUGCGACUGGGACVU CAAGEUAGAA Nn,= 2’-OCH3
s20;as3 GAC GCUGACCCUGAAGUUCAJJCUU . : CUGSCGACUGGGACUUCAAGU AGAA ' ' : Nn,= 2'-OCH3
s15/as3 GAC GCUGACCCUGAAmGUUCAUCUU 7 CUG^CGACUGGGACUU CAAGUAGAA ' Nnl= 2-OCH3
s3-asl2 GACaGCUGACCCU GAAGUUCAUCUU : CUG CGACUGGGA^CUUCAAGUAGAA ' . . Nm=2-OCH3
s3/as19 GACnGCUGACCCUGAAGUUC AUCUU CUG CGACUGGGACUUCAAGBUAGA* Nffl= 2’-OCH3
Fsl GjACGCUGACCCUGAAGUUCAUCUU ' +' C UGCGACUGGGACUUCAAGUAGAA .
Fs2 . GAvCGCUGACCCUGAAG’JUCAUCUU .+ +- ' CU GCGACUGGGACUUCAAGUAGAA ' ''' ' '
N, “ ; I
Fs23 GACGCUGACCCUGAAGUUCAUC.UfU ' . GUGCGACUGGGACUjCAAGUAGA a. g ' ' . .
Fs24 GACGCUGACCCUGAAGUUCAUCOUr· ' ' CUGCGACUGGGACUUCAAGUAGAA . ; '
Fasl G ACGCUGACCCUGAAGUUCAUCUU CfUGCGACUGGGACUUCAAGUAGAA
Fas2 GA CGCUGACCCUGAAGUUCAUCOU CUrGCGACUGGGACUUCAAGUAGAA
Fas23 GACGCUGACCCUGAAGUUCAUCU UG ' · % · 4 < CTJGCGACUGGGACUUCAAGUAGAsA Nf=2'-F
Fas24 GACGCUGACCCUGAAGUUCAUCUU < CUGCGACUGGGACUUCAAGUAGAAf g v
- 16 034605
3P-GFP2 s15/as3 PTO s15PTO/as3 s 15 PTO as3 PTO
OH-GFP2 PTO 5’
OH-GFP2 oMet15/oMet3 PTO
OH-GFP2
F23s.'13as
GAC GCUbACCCUGAA-.GUUCAU€ U U CUGraCGACUGGGACOTJ CAAGUAG*A*A G*A*C GCUGACCCDGAAaGUUCAUCUU С U GmCGACUGGGACUU CAAGUAGAA G*A'*C GCUGACCCUGAAnGUU.CAUC U: U c u gecgacugggacuu caaguag*a*a G*A*CGCUGACCCUGAAGUGCAtrc U ϋ
G*A*C GCUGACCCUGAAnGUUCAUC U U C U G^CGACUGGGACOT CAAGUAG*A*A * = PTO
Nm=2-OCH3 * = PTO
Nm= 2’-OCH3 .
PTO
Nm= 2’-OCH3 = PTO * = PTO Nnl= 2:-OCH3
Nf-2’-F
OH-GFP2oMet15/3
F23G3 PTO
G*A*C GCUGjACCCUG AAmGUUCAUC UF U C U GeCGAC UGGGACfUU CAAGUAG** *A
3P-GFP2 1S2F
CUGsCGAC UGGGACtVU CAAGUAG*A *A
OH-GFP2 1S2F
GAC GCUGfACCCUG AAsGWCAUC*W*Tr CUGmCGAC UGGGACfUU CAAGUAG*A *A
3P-GFP22S2F ppp-G*A*C GCUGfACCCUG. AAkiGGVCAGC*Uf*G'
C ϋ GjjCGAC UGGGACfW CAAGUAG'A *A
OH-GFP2 2S2F
A*C GCUGfACCCUG AA!EGOTCAUG*nf-*U ϋ GjbCGAC UGGGACWU CAAGIJAG*A *A
Nf=2’-F * = PTO
Nm= 2-OCH3
Nf= 2'-F ’ = PTO
Nm=2’-OCH3
Nf=2-F ‘ = PTO
Nrtl= 2’-OCH3
Nf=2'-F .
* - PTO
N„= 2’-OCH3
Nf=2’-F * = PTO
Nm= 2-OCH3
- 17 034605
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> РАЙНИШЕ ФРИДРИХ-ВИЛЬХЕЛЬМС-УНИВЕРЗИТЕТ БОНН <120> НОВЫЕ ЛИГАНДЫ RIG-I И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ <130> 201590629 <140> РСТ/ЕР2013/070117 <141> 2013-09-26 <150> ЕР 12 186 444.1 <151> 2012-09-27 <160> 77 <170> Patentin version 3.3 <210> 1 <211> 24 <212> РНК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> нуклеотид несущий децил-О-ррр <400> 1 gacgcugacc cugaaguuca ucuu 24 <210> 2 <211> 24 <212> РНК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический <400>
gacgcugacc cugaaguuca ucuu <210>
<211>
<212>
<213>
РНК
Искусственный
- 18 034605 <220>
<223> Синтетический <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> нуклеотид несущий холестерил-ррр <400> 3 gacgcugacc cugaaguuca ucuu 24 <210> 4 <211> 24 <212> РНК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> нуклеотид несущий модифицированный Σ-’-Ο-Μθ <400> 4 gacgcugacc cugaaguuca ucuu 24 <210> 5 <211> 24 <212> РНК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический <400> 5 aagaugaacu ucagggucag cguc 24
<210> 6
<211> 24
<212> РНК
<213> Искусственный
<220>
<223> Синтетический
- 19 034605
<220>
<221> misc feature
<222> (2)..(2)
<223> нуклеотид несущий модифицированный 2’-О-Me
<400> 6
gacgcugacc cugaaguuca ucuu 24
<210> 7
<211> 24
<212> РНК
<213> Искусственный
<220>
<223> Синтетический
<400> 7
aagaugaacu ucagggucag cguc 24
<210> 8
<211> 24
<212> РНК
<213> Искусственный
<220>
<223> Синтетический
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> нуклеотид несущий модифицированный 2J-0-Me
<400> 8
gacgcugacc cugaaguuca ucuu 24
<210> 9
<211> 24
<212> РНК
<213> Искусственный
<220>
<223> Синтетический
<400> 9
aagaugaacu ucagggucag cguc 24
- 20 034605 <210> 10 <211> 24 <212> РНК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический <220>
<221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> нуклеотид несущий модифицированный г-’-О-Ме <400> 10 gacgcugacc cugaaguuca ucuu 24 <210> 11 <211> 24 <212> РНК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический <400> 11 aagaugaacu ucagggucag cguc 24 <210> 12 <211> 24 <212> РНК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический <400> 12 gacgcugacc cugaaguuca ucuu 24
<210> 13
<211> 24
<212> РНК
<213> Искусственный
<220>
<223> Синтетический
<220>
- 21 034605 <221>
<222>
<223>
misc_feature (24)..(24) нуклеотид несущий модифицированный г-’-О-Ме <400>
aagaugaacu ucagggucag cguc <210> 14 <211> 24 <212> РНК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический <400> 14 gacgcugacc cugaaguuca ucuu 24 <210> 15 <211> 24 <212> РНК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический <220>
<221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> нуклеотид несущий модифицированный г-’-О-Ме <400>
aagaugaacu ucagggucag cguc <210> 16 <211> 24 <212> РНК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический <400> 16 gacgcugacc cugaaguuca ucuu 24 <210> 17 <211> 24
- 22 034605 <212> РНК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический <220>
<221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> нуклеотид несущий модифицированный г-’-О-Ме <400> 17 aagaugaacu ucagggucag cguc 24 <210> 18 <211> 24 <212> РНК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический <400> 18 gacgcugacc cugaaguuca ucuu 24 <210> 19 <211> 24 <212> РНК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> нуклеотид несущий модифицированный г-’-О-Ме <400> 19 aagaugaacu ucagggucag cguc 24
<210> 20
<211> 24
<212> РНК
<213> Искусственный
<220>
- 23 034605 <223> Синтетический <400> 20 gacgcugacc cugaaguuca ucuu 24 <210> 21 <211> 24 <212> РНК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(1)
<223> нуклеотид несущий модифицированный 2·* -О-Ме
<220>
<221> misc feature
<222> (5)-.(5)
<223> нуклеотид несущий модифицированный 2’-О-Ме
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> нуклеотид несущий модифицированный 2’-О-Ме
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> нуклеотид несущий модифицированный 2’-О-Ме
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> нуклеотид несущий модифицированный 2’-О-Ме
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> нуклеотид несущий модифицированный 2’-О-Ме
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> нуклеотид несущий модифицированный 2J-0-Me
<220>
<221> misc_feature
- 24 034605 <222>
<223>
(24)..(24) нуклеотид несущий модифицированный г-’-О-Ме <400>
aagaugaacu ucagggucag cguc <210> 22 <211> 24 <212> РНК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический <220>
<221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> нуклеотид несущий модифицированный г-’-О-Ме <400> 22 gacgcugacc cugaaguuca ucuu 24 <210> 23 <211> 24 <212> РНК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический <220>
<221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> нуклеотид несущий модифицированный г-’-О-Ме <400>
aagaugaacu ucagggucag cguc <210> 24 <211> 24 <212> РНК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический
- 25 034605 <220>
<221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> нуклеотид несущий модифицированный г-’-О-Ме <400> 24 gacgcugacc cugaaguuca ucuu 24 <210> 25 <211> 24 <212> РНК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический <220>
<221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> нуклеотид несущий модифицированный г-’-О-Ме <400> 25 aagaugaacu ucagggucag cguc 24 <210> 26 <211> 24 <212> РНК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический <220>
<221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> нуклеотид несущий модифицированный г-’-О-Ме <400> 26 gacgcugacc cugaaguuca ucuu 24
<210> 27
<211> 24
<212> РНК
<213> Искусственный
<220>
<223> Синтетический
- 26 034605
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> нуклеотид несущий модифицированный 2’-О-Ме
<400> 27
aagaugaacu ucagggucag cguc 24
<210> 28
<211> 24
<212> РНК
<213> Искусственный
<220>
<223> Синтетический
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)--(15)
<223> нуклеотид несущий модифицированный 2’-О-Ме
<400> 28
gacgcugacc cugaaguuca ucuu 24
<210> 29
<211> 24
<212> РНК
<213> Искусственный
<220>
<223> Синтетический
<220>
<221> misc feature
<222> (6)-.(6)
<223> нуклеотид несущий модифицированный 2’-О-Ме
<400> 29
aagaugaacu ucagggucag cguc 24
<210> 30
<211> 24
<212> РНК
<213> Искусственный
- 27 034605
<220>
<223> Синтетический
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> нуклеотид несущий модифицированный 2’-О-Ме
<400> 30
gacgcugacc cugaaguuca ucuu 24
<210> 31
<211> 24
<212> РНК
<213> Искусственный
<220>
<223> Синтетический
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> нуклеотид несущий модифицированный 2’-О-Ме
<400> 31
aagaugaacu ucagggucag cguc 24
<210> 32
<211> 24
<212> РНК
<213> Искусственный
<220>
<223> Синтетический
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)-.(15)
<223> нуклеотид несущий модифицированный 2’-О-Ме
<400> 32
gacgcugacc cugaaguuca ucuu 24
<210> 33
<211> 24
<212> РНК
- 28 034605 <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический <220>
<221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> нуклеотид несущий модифицированный г-’-О-Ме <400> 33 aagaugaacu ucagggucag cguc 24 <210> 34 <211> 24 <212> РНК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический <220>
<221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> нуклеотид несущий модифицированный г-’-О-Ме <400> 34 gacgcugacc cugaaguuca ucuu 24 <210> 35 <211> 24 <212> РНК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический <220>
<221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> нуклеотид несущий модифицированный г-’-О-Ме <400> 35 aagaugaacu ucagggucag cguc 24 <210> 36
- 29 034605 <211> 24 <212> РНК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический <220>
<221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> нуклеотид несущий модифицированный г-’-О-Ме <400> 36 gacgcugacc cugaaguuca ucuu 24 <210> 37 <211> 24 <212> РНК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический <220>
<221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> нуклеотид несущий модифицированный г-’-О-Ме <400> 37 aagaugaacu ucagggucag cguc 24 <210> 38 <211> 24 <212> РНК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> нуклеотид являющийся модифицированным 2J-F <400> 38 gacgcugacc cugaaguuca ucuu 24
- 30 034605 <210> 39 <211> 24 <212> РНК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический <400> 39 aagaugaacu ucagggucag cguc 24 <210> 40 <211> 24 <212> РНК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический <220>
<221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> нуклеотид являющийся модифицированным 2J-F <400> 40 gacgcugacc cugaaguuca ucuu 24 <210> 41 <211> 24 <212> РНК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический <400> 41 aagaugaacu ucagggucag cguc 24
<210> 42
<211> 24
<212> РНК
<213> Искусственный
<220>
<223> Синтетический
- 31 034605 <220>
<221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> нуклеотид являющийся модифицированным 2J-F <400> 42 gacgcugacc cugaaguuca ucuu 24 <210> 43 <211> 24 <212> РНК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический <400>
aagaugaacu ucagggucag cguc <210> 44 <211> 24 <212> РНК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический <220>
<221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> нуклеотид являющийся модифицированным 2J-F <400> 44 gacgcugacc cugaaguuca ucuu 24 <210> 45 <211> 24 <212> PHK <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический <400>
aagaugaacu ucagggucag cguc <210> 46
- 32 034605 <211> 24 <212> РНК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический <400> 46 gacgcugacc cugaaguuca ucuu 24 <210> 47 <211> 24 <212> РНК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический <220>
<221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> нуклеотид являющийся модифицированным 2J-F <400> 47 aagaugaacu ucagggucag cguc 24 <210> 48 <211> 24 <212> РНК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический <400> 48 gacgcugacc cugaaguuca ucuu 24
<210> 49
<211> 24
<212> РНК
<213> Искусственный
<220>
<223> Синтетический
<220>
<221> misc_feature
- 33 034605 <222>
<223>
(23)..(23) нуклеотид являющийся модифицированным 2J-F <400>
aagaugaacu ucagggucag cguc <210> 50 <211> 24 <212> РНК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический <400> 50 gacgcugacc cugaaguuca ucuu 24 <210> 51 <211> 24 <212> РНК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический <220>
<221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> нуклеотид являющийся модифицированным 2J-F <400>
aagaugaacu ucagggucag cguc <210> 52 <211> 24 <212> РНК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический <400> 52 gacgcugacc cugaaguuca ucuu 24 <210> 53 <211> 24 <212> РНК
- 34 034605 <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> нуклеотид являющийся модифицированным 2J-F <400> 53 aagaugaacu ucagggucag cguc 24 <210> 54 <211> 24 <212> РНК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> нуклеотид несущий трифосфат <400> 54 gacgcugacc cugaaguuca ucuu 24 <210> 55 <211> 24 <212> РНК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический <400> 55 aagaugaacu ucagggucag cguc 24
<210> 56
<211> 24
<212> РНК
<213> Искусственный
<220>
<223> Синтетический
- 35 034605
<220> <221> <222> <223> misc_feature (13)..(13) нуклеотид несущий модифицированный 2’-О-Me
<400> 56
gacgcugacc cugaaguuca ucuu 24
<210> <211> <212> <213> 57 24 PHK Искусственный
<220> <223> Синтетический
<220> <221> <222> <223> misc feature (1)-.(2) нуклеотиды связанные фосфотиоатом
<220> <221> <222> <223> misc feature (2)..(3) нуклеотиды связанные фосфотиоатом
<220> <221> <222> <223> misc_feature (22)..(22) нуклеотид несущий модифицированный 2·*-О-Me
<400> 57
aagaugaacu ucagggucag cguc 24
<210> <211> <212> <213> 58 24 PHK Искусственный
<220> <223> Синтетический
<220> <221> <222> <223> misc feature (1)-.(2) нуклеотиды связанные фосфотиоатом
- 36 034605
<220> <221> <222> <223> misc feature (2)..(3) нуклеотиды связанные фосфотиоатом
<220> <221> <222> <223> misc_feature (15)-.(15) нуклеотид несущий модифицированный 2’-О-Me
<400> 58
gacgcugacc cugaaguuca ucuu 24
<210> <211> <212> <213> 59 24 PHK Искусственный
<220> <223> Синтетический
<220> <221> <222> <223> misc_feature (22)..(22) нуклеотид несущий модифицированный 2·*-О-Me
<400> 59
aagaugaacu ucagggucag cguc 24
<210> <211> <212> <213> 60 24 PHK Искусственный
<220> <223> Синтетический
<220> <221> <222> <223> misc feature (1)-.(2) нуклеотиды связанные фосфотиоатом
<220> <221> <222> <223> misc feature (2)..(3) нуклеотиды связанные фосфотиоатом
- 37 034605
<220> <221> <222> <223> misc_feature (15)--(15) нуклеотид несущий модифицированный г-’-О-Ме
<400> 60
gacgcugacc cugaaguuca ucuu 24
<210> <211> <212> <213> 61 24 РНК Искусственный
<220> <223> Синтетический
<220> <221> <222> <223> misc feature (1)-.(2) нуклеотиды связанные фосфотиоатом
<220> <221> <222> <223> misc feature (2)-.(3) нуклеотиды связанные фосфотиоатом
<220> <221> <222> <223> misc_feature (22)..(22) нуклеотид несущий модифицированный 2J-0-Me
<400> 61
aagaugaacu ucagggucag cguc 24
<210> <211> <212> <213> 62 24 РНК Искусственный
<220> <223> Синтетический
<220> <221> <222> <223> misc feature (1)-.(2) нуклеотиды связанные фосфотиоатом
<220>
- 38 034605 <221>
<222>
<223>
misc_feature (2)..(3) нуклеотиды связанные фосфотиоатом <400>
gacgcugacc cugaaguuca ucuu <210> 63 <211> 24 <212> РНК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> нуклеотиды связанные фосфотиоатом <220>
<221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> нуклеотиды связанные фосфотиоатом <400> 63 aagaugaacu ucagggucag cguc 24 <210> 64 <211> 24 <212> РНК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> нуклеотиды связанные фосфотиоатом <220>
<221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> нуклеотиды связанные фосфотиоатом <220>
<221> misc_feature
- 39 034605 <222>
<223>
(15)--(15) нуклеотид несущий модифицированный 2’-О-Ме <400>
gacgcugacc cugaaguuca ucuu <210> 65 <211> 24 <212> РНК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> нуклеотиды связанные фосфотиоатом <220>
<221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> нуклеотиды связанные фосфотиоатом <220>
<221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> нуклеотид несущий модифицированный 2·*-О-Ме <400> 65 aagaugaacu ucagggucag cguc 24 <210> 66 <211> 24 <212> РНК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический <220>
<221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> нуклеотид являющийся модифицированным 2J-F <400>
gacgcugacc cugaaguuca ucuu
- 40 034605
<210> <211> <212> <213> 67 24 PHK Искусственный
<220> <223> Синтетический
<220> <221> <222> <223> misc_feature (12)..(12) нуклеотид являющийся модифицированным 2J-F
<400> 67
aagaugaacu ucagggucag cguc 24
<210> <211> <212> <213> 68 24 PHK Искусственный
<220> <223> Синтетический
<220> <221> <222> <223> misc feature (1)-.(2) нуклеотиды связанные фосфотиоатом
<220> <221> <222> <223> misc feature (2)..(3) нуклеотиды связанные фосфотиоатом
<220> <221> <222> <223> misc_feature (7)..(7) нуклеотид являющийся модифицированным 2J-F
<220> <221> <222> <223> misc_feature (15)-.(15) нуклеотид несущий модифицированный 2’-О-Ме
<220> <221> <222> <223> misc_feature (23)..(23) нуклеотид являющийся модифицированным 2J-F
- 41 034605 <400> 68 gacgcugacc cugaaguuca ucuu 24 <210> 69 <211> 24 <212> PHK <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> нуклеотиды связанные фосфотиоатом <220>
<221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> нуклеотиды связанные фосфотиоатом <220>
<221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> нуклеотид являющийся модифицированным 2J-F <220>
<221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> нуклеотид несущий модифицированный 2’-О-Me <400> 69 aagaugaacu ucagggucag cguc 24 <210> 70 <211> 24 <212> PHK <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> нуклеотид несущий трифосфат
- 42 034605 <220>
<221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> нуклеотид являющийся модифицированным 2J-F <220>
<221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> нуклеотид несущий модифицированный г-’-О-Ме <220>
<221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> нуклеотиды связанные фосфотиоатом <220>
<221> misc_feature <222> (23)..(24) <223> нуклеотиды связанные фосфотиоатом <400> 70 gacgcugacc cugaaguuca ucuu 24 <210> 71 <211> 24 <212> РНК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> нуклеотиды связанные фосфотиоатом <220>
<221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> нуклеотиды связанные фосфотиоатом <220>
<221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> нуклеотид являющийся модифицированным 2J-F <220>
<221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> нуклеотид несущий модифицированный г-’-О-Ме
- 43 034605 <400> 71 aagaugaacu ucagggucag cguc 24 <210> 72 <211> 24 <212> PHK <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический <220>
<221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> нуклеотид являющийся модифицированным 2J-F <220>
<221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> нуклеотид несущий модифицированный 2’-О-Ме <220>
<221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> нуклеотиды связанные фосфотиоатом <220>
<221> misc_feature <222> (23)..(24) <223> нуклеотиды связанные фосфотиоатом <220>
<221> misc_feature <222> (23)..(24) <223> нуклеотиды связанные фосфотиоатом <220>
<221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> нуклеотид являющийся модифицированным 2J-F <400> 72 gacgcugacc cugaaguuca ucuu 24 <210> 73 <211> 24 <212> РНК <213> Искусственный
- 44 034605
<220> <223> Синтетический
<220> <221> <222> <223> misc feature (1)-.(2) нуклеотиды связанные фосфотиоатом
<220> <221> <222> <223> misc feature (2)..(3) нуклеотиды связанные фосфотиоатом
<220> <221> <222> <223> misc_feature (12)..(12) нуклеотид являющийся модифицированным 2J-F
<220> <221> <222> <223> misc_feature (22)..(22) нуклеотид несущий модифицированный 23 -О-Ме
<400> 73
aagaugaacu ucagggucag cguc 24
<210> <211> <212> <213> 74 24 РНК Искусственный
<220> <223> Синтетический
<220> <221> <222> <223> misc feature (1)-.(1) нуклеотид несущий трифосфат
<220> <221> <222> <223> misc feature (1)-.(2) нуклеотиды связанные фосфотиоатом
<220> <221> <222> <223> misc feature (2)..(3) нуклеотиды связанные фосфотиоатом
- 45 034605 <220>
<221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> нуклеотид являющийся модифицированным 2J-F <220>
<221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> нуклеотид несущий модифицированный 2J-0-Me <220>
<221> miscfeature <222> (22)..(23) <223> нуклеотиды связанные фосфотиоатом <220>
<221> misc_feature <222> (23)..(24) <223> нуклеотиды связанные фосфотиоатом <220>
<221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> нуклеотид являющийся модифицированным 2J-F <400> 74 gacgcugacc cugaaguuca ucuu 24 <210> 75 <211> 24 <212> РНК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> нуклеотиды связанные фосфотиоатом <220>
<221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> нуклеотиды связанные фосфотиоатом <220>
<221> misc_feature <222> (12)..(12)
- 46 034605 <223> нуклеотид являющийся модифицированным 2J-F <220>
<221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> нуклеотид несущий модифицированный г-’-О-Ме <400> 75 aagaugaacu ucagggucag cguc 24 <210> 76 <211> 24 <212> РНК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> нуклеотиды связанные фосфотиоатом <220>
<221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> нуклеотиды связанные фосфотиоатом <220>
<221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> нуклеотид являющийся модифицированным 2J-F <220>
<221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> нуклеотид несущий модифицированный г-’-О-Ме <220>
<221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> нуклеотиды связанные фосфотиоатом <220>
<221> misc_feature <222> (23)..(24) <223> нуклеотиды связанные фосфотиоатом <220>
<221> misc_feature
- 47 034605
<222> (23)..(23)
<223> нуклеотид являющийся модифицированным 2J-F
<400> 76
gacgcugacc cugaaguuca ucuu 24
<210> 77
<211> 24
<212> РНК
<213> Искусственный
<220>
<223> Синтетический
<220>
<221> misc feature
<222> (1)-.(2)
<223> нуклеотиды связанные фосфотиоатом
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(3)
<223> нуклеотиды связанные фосфотиоатом
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> нуклеотид являющийся модифицированным 2J-F
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> нуклеотид несущий модифицированный 2J-O-Me
<400> 77
aagaugaacu ucagggucag cguc
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (16)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Модифицированный олигонуклеотид формулы (I)
    V5 V3 и и и
    Z-Υ—X-P—W3—P—W2—P—W,—ON где V1, V3 и V5 в каждом случае независимо выбраны из O, S и Se;
    V2, V4 и V6 в каждом случае независимо выбраны из OH, OR1, SH, SR1, F, NH2, NHR1, N(R1)2 и BH3 -M+,
    W1 обозначает O или S,
    W2 обозначает O, S, NH или NR2,
    W3 обозначает O, S, NH, NR2, CH2, CHHal или C(Hal)2,
    R1, R2 и R3 выбраны из C1.6алкила, ^^алкенила, ^^алкинила, ^^ацила или циклической группы, каждый из которых может быть необязательно замещен, или где два R1 вместе с атомом N, связанным с ними, могут образовывать цикл,
    M+ обозначает катион,
    X обозначает NH или O,
    Z обозначает улавливаемый маркер или H, где улавливаемый маркер выбран из группы, состоящей из длинноцепочечного алифатического остатка; Q или NHC2-C24-алкила; перфторалкильной группы; азидной или алкинильной группы; первого партнера из пары по нековалентному связыванию, выбранного из биотина, дестиобиотина, гаптена и антигена; и химического фрагмента, содержащего вторую аминогруппу в реагенте типа NH2-Y-XH; холестерина; и хлороформиатной группы; и
    Q выбран из H, аминокислоты, ^-^-алкила, предпочтительно C12-C24-алкила, пептидов и липидов, Y обозначает -K-((CHR1)m-CH2-O)n-R-, и
    - 48 034605
    K обозначает NH, m обозначает число от 1 до 12, n обозначает число от 0 до 20,
    R1 обозначает H, С1-балкил, С2-балкенил, С2-балкинил, С2-Сб-аци.1 или циклическую группу, где каждая из указанных групп может быть необязательно замещена, и
    R обозначает С1-балкил, С2-балкенил, С2-балкинил, С2-Сб-ацил или циклическую группу, где каждая из указанных групп может быть необязательно замещена, и
    ON обозначает олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере четыре структурных элемента, представляющих собой нуклеотиды или аналоги нуклеотидов.
  2. 2. Модифицированный олигонуклеотид по п.1, где V1, V2, V3, V4, V5, V6, W1, W2 и W3 обозначают O.
  3. 3. Модифицированный олигонуклеотид по п.1 или 2, где Z обозначает длинноцепочечный алифатический остаток; Q или ЫНС2-С24-алкил, a Q выбран из группы, включающей в себя H, аминокислоты, С1-С24-алкил, С12-С24-алкил, пептиды и липиды.
  4. 4. Модифицированный олигонуклеотид по любому из пп.1-3, где олигонуклеотид выбран из группы, включающей в себя одноцепочечные или двухцепочечные дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды и аналоги олигонуклеотидов, которые необязательно могут быть химически модифицированными по нуклеозиду и/или рибозному остатку дезоксирибонуклеотида, рибонуклеотида или аналога олигонуклеотида.
  5. 5. Модифицированный олигонуклеотид по п.4, где олигонуклеотид является двухцепочечным, причем длина каждой цепи составляет по меньшей мере 19 нуклеотидов.
  6. 6. Модифицированный олигонуклеотид по п.4 или 5, где химические модификации поддерживают, обусловливают или повышают селективность олигонуклеотида, в частности селективность олигонуклеотида в отношении RIG-I, и/или где химические модификации поддерживают или повышают химическую стабильность олигонуклеотида.
  7. 7. Модифицированный олигонуклеотид по любому из пп.4-б, где химические модификации независимо выбраны из группы, включающей в себя галогенирование, 2'-О-алкилирование и/или введение по меньшей мере одной фосфоротиоатной межнуклеотидной связи.
  8. 8. Модифицированный олигонуклеотид по п.7, где химические модификации независимо выбраны из F-галогенирования, 2'-О-алкилирования по меньшей мере одной фосфоротиоатной межнуклеотидной связи.
  9. 9. Модифицированный олигонуклеотид по любому из пп.1-8, где X обозначает NH, Y обозначает -К-(СН2-СН2-О)П, K обозначает NH, n независимо обозначают число от 0 до 20 и где R дополнительно замещен холестерином-С(О)- или тритилом.
  10. 10. Модифицированный олигонуклеотид по любому из пп.1-8, в котором Y выбран из -ОДСЩ-СЩОД-СЩ-СЩ-, -О-ДОДт-СЩ-ОД-СЩ-СЩ-, -О-ДСт^-СЩ-ОД-СЩ-СЩ-, -ОДСЩ-СЩ-СЩ-О^-СЩСЩ-, -O-((CH2)m-CH2-CH2-O)n-CH2-CH2- и -О-ЦСт^-СЩ-СЩ-ОД-СЩ-СЩ-.
  11. 11. Модифицированный олигонуклеотид по любому из пп.1-10, где Z обозначает С1-С12-алкил, С10 и Q или NHC2-C24-алкил, где Q выбран из группы, включающей в себя H, аминокислоты, С1-С24-алкил, С12С24-алкил, пептиды и липиды, и V1, V2, V3, V4, V5, V6, W1, W2 и W3 обозначают О.
  12. 12. Модифицированный олигонуклеотид, где модифицированный олигонуклеотид представлен формулой (5)
    Η όοο |
    или формулой (4)
  13. 13. Фармацевтическая композиция, содержащая модифицированный олигонуклеотид по любому из пп.1-12.
  14. 14. Фармацевтическая композиция по п.13, предназначенная для внутрикожного введения.
  15. 15. Фармацевтическая композиция по п.14, предназначенная для введения путем татуировки, посредством микроигл и/или микроигольных пластырей.
  16. 16. Способ получения соединения формулы (IVa) или (IVb), включающий в себя следующие ста дии:
    - 49 034605 (а) взаимодействие соединения формулы (IIa)
    где V1, V3, V5, V4, V6, Wi, W2, W3 и ON имеют указанные в п.1 значения и где ON защищен по меньшей мере одной защитной группой с окисляющим реагентом с получением соединения формулы (IIb)
    где V15 V3, V5, и V2, V4, V6, W15 W2, W3 и ON имеют указанные в п.1 значения и где ON защищен по меньшей мере одной защитной группой, (b) взаимодействие соединения формулы (IIb) с улавливающим реагентом формулы (III)
    Z-Y-XH (III), где X, Z и Y имеют указанные в п.1 значения и где X предпочтительно обозначает O с получением продукта реакции, содержащего олигонуклеотид формулы (I), (c) удаление по меньшей мере одной защитной группы с ON и (d) приведение в контакт продукта реакции, полученного на стадии (b), с улавливающим реагентом, способным взаимодействовать с улавливаемым маркером, где приведение в контакт осуществляют в условиях, обеспечивающих отделение олигонуклеотида (I) от других веществ, содержащихся в указанном продукте реакции;
    где улавливаемый маркер выбран из группы, состоящей из длинноцепочечного алифатического остатка; Q или NHC2-C24-алкила; перфторалкильной группы; азидной или алкинильной группы; первого партнера из пары по нековалентному связыванию, выбранного из биотина, дестиобиотина, гаптена и антигена; и химического фрагмента, содержащего вторую аминогруппу в реагенте типа NH2-Y-XH; холестерина; и хлороформиатной группы; и
    Q выбран из H, аминокислоты, С1-С24-алкила, предпочтительно С12-С24-алкила, пептидов и липидов;
    где улавливаемый маркер представляет собой хроматографический материал, обладающий сродством к гидрофобным или фторированным группам, второй партнер комплементарного связывающего партнера пары с высокой аффинностью связывания, которая представляет собой стрептавидин, авидин или антитело, или азидную или алкинильную группу; и необязательно, дополнительные стадии:
    (e) удаления улавливаемого маркера с получением олигонуклеотида, причем, если X=O, получают соединение формулы (IV)a или (IV)b,
    Vs V*V
    II IIII
    НО——(|Va) va v4v или va Vt
    II IIII
    -P—Wf—ON(IVb)
    VB v4v а если X=NH, получают соединение формулы (IV^
    VBVb
    Ц0 p p (I Va)
    1 V4 V2
EA201790916A 2012-09-27 2013-09-26 Новые лиганды rig-i и способы их получения EA034605B1 (ru)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP12186444.1A EP2712870A1 (en) 2012-09-27 2012-09-27 Novel RIG-I ligands and methods for producing them

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201790916A1 EA201790916A1 (ru) 2017-08-31
EA034605B1 true EA034605B1 (ru) 2020-02-25

Family

ID=46940404

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201790916A EA034605B1 (ru) 2012-09-27 2013-09-26 Новые лиганды rig-i и способы их получения
EA201590629A EA028707B1 (ru) 2012-09-27 2013-09-26 Новые лиганды rig-i и способы их получения

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201590629A EA028707B1 (ru) 2012-09-27 2013-09-26 Новые лиганды rig-i и способы их получения

Country Status (32)

Country Link
US (3) US10059943B2 (ru)
EP (5) EP2712870A1 (ru)
JP (1) JP6313768B2 (ru)
KR (1) KR102182479B1 (ru)
CN (2) CN106279300B (ru)
AU (2) AU2013322620C1 (ru)
BR (2) BR122019023887B1 (ru)
CA (1) CA2885564C (ru)
CL (1) CL2015000752A1 (ru)
CY (1) CY1120660T1 (ru)
DK (1) DK2903997T3 (ru)
EA (2) EA034605B1 (ru)
ES (1) ES2679373T3 (ru)
HK (2) HK1209128A1 (ru)
HR (1) HRP20181114T1 (ru)
HU (1) HUE038811T2 (ru)
IL (1) IL237794B (ru)
LT (1) LT2903997T (ru)
MX (1) MX2015003787A (ru)
NZ (2) NZ706443A (ru)
PH (1) PH12015500644B1 (ru)
PL (1) PL2903997T3 (ru)
PT (1) PT2903997T (ru)
RS (1) RS57609B1 (ru)
SA (2) SA517380700B1 (ru)
SG (3) SG10201702028YA (ru)
SI (1) SI2903997T1 (ru)
TN (1) TN2015000104A1 (ru)
TR (1) TR201810231T4 (ru)
UA (1) UA117565C2 (ru)
WO (1) WO2014049079A1 (ru)
ZA (1) ZA201501718B (ru)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3342415B1 (en) 2006-08-08 2022-01-26 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Structure and use of 5' phosphate oligonucleotides
JP5689413B2 (ja) 2008-05-21 2015-03-25 ライニッシュ フリードリッヒ−ウィルヘルムズ−ユニバーシタット ボン 平滑末端を有する５’三リン酸オリゴヌクレオチドおよびその使用
EP2508530A1 (en) 2011-03-28 2012-10-10 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Purification of triphosphorylated oligonucleotides using capture tags
EP2712870A1 (en) 2012-09-27 2014-04-02 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Novel RIG-I ligands and methods for producing them
US9861574B2 (en) * 2013-04-09 2018-01-09 Duke University 2-fluoro-modified RNAs as immunostimulators
DE102015008536A1 (de) 2015-07-02 2017-01-05 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Diskontinuierliche Oligonukleotid-Liganden
EP3600342B1 (en) 2017-03-24 2021-06-23 Rigontec GmbH Method for designing rig-i ligands
WO2018187328A1 (en) 2017-04-03 2018-10-11 Duke University Compositions and methods for differential induction of cell death and interferon expression
CN112105733B (zh) 2018-04-19 2024-10-29 查美特制药公司 合成rig-i样受体激动剂
WO2019204179A1 (en) * 2018-04-20 2019-10-24 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel substituted rig-i agonists: compositions and methods thereof
TW202016301A (zh) 2018-05-07 2020-05-01 美商阿里拉姆製藥股份有限公司 肝外遞送技術
KR102373488B1 (ko) * 2019-02-22 2022-03-14 주식회사 레모넥스 면역활성 또는 암의 예방 또는 치료용 의약 조성물
EP3990635A1 (en) 2019-06-27 2022-05-04 Rigontec GmbH Design method for optimized rig-i ligands
KR20240043747A (ko) 2021-07-02 2024-04-03 예일 유니버시티 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법
AU2022340804A1 (en) 2021-08-31 2024-03-21 Gennao Bio, Inc. Compositions and methods for treating cancers
CN119421901A (zh) 2022-03-03 2025-02-11 耶鲁大学 人源化3e10抗体、其变体和抗原结合片段

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009060281A2 (en) * 2007-11-06 2009-05-14 Coley Pharmaceutical Gmbh Immune stimulatory oligoribonucleotide analogs containing modified oligophosphate moieties
WO2011028218A1 (en) * 2009-09-02 2011-03-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Process for triphosphate oligonucleotide synthesis
WO2012130886A1 (en) * 2011-03-28 2012-10-04 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Purification of triphosphorylated oligonucleotides using capture tags

Family Cites Families (217)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3534017A (en) 1967-03-14 1970-10-13 Kyowa Hakko Kogyo Kk Process for the preparation of nucleoside-5'-diphosphates and triphosphates and mono- and oligo-nucleotidyl-nucleoside-5'-diphosphates and triphosphates
US4210746A (en) 1978-08-10 1980-07-01 National Research Development Corporation Nucleotide inhibitor of protein synthesis
US4285605A (en) 1979-07-02 1981-08-25 International Business Machines Corporation Escapement mechanism and backspace mechanism for a moving paper carriage typewriter having dual pitch capability
FR2471785A1 (fr) 1979-12-21 1981-06-26 Fabre Sa Pierre Preparations immunostimulantes a base d'arn ribosomaux et procede de preparation des arn
DE3023787A1 (de) 1980-06-25 1982-01-21 Studiengesellschaft Kohle mbH, 4330 Mülheim Verfahren zur erhoehung der inkorporation und der expression von genetischem material in die kerne von intakten zellen mit hilfe von liposomen
EP0081099A3 (en) 1981-12-04 1983-08-10 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Capped oligonucleotide anti-viral agents
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US5194428A (en) 1986-05-23 1993-03-16 Worcester Foundation For Experimental Biology Inhibition of influenza virus replication by oligonucleotide phosphorothioates
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
ATE132190T1 (de) 1988-02-26 1996-01-15 Worcester Found Ex Biology Hemmung von htlv-iii durch exogene oligonukleotide
JP2976436B2 (ja) 1988-04-27 1999-11-10 味の素株式会社 新規オリゴリボヌクレオチド誘導体及び抗ウイルス剤への使用
EP0339842B1 (en) 1988-04-27 1996-11-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Novel oligoribonucleotide derivatives and application thereof to antiviral agents
DE3907562A1 (de) 1989-03-09 1990-09-13 Bayer Ag Antisense-oligonukleotide zur inhibierung der transaktivatorzielsequenz (tar) und der synthese des transaktivatorproteins (tat) aus hiv-1 und deren verwendung
WO1990014353A1 (en) 1989-05-18 1990-11-29 Microprobe Corporation Crosslinking oligonucleotides
US5134066A (en) 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
ATE157012T1 (de) 1989-11-03 1997-09-15 Univ Vanderbilt Verfahren zur in vivo-verabreichung von funktionsfähigen fremden genen
US5149797A (en) 1990-02-15 1992-09-22 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of rna and production of encoded polypeptides
HUT62658A (en) 1990-03-21 1993-05-28 Isis Pharmaceuticals Inc Reagent and process for modifying expression of gene by imitating rna
US5292875A (en) 1990-04-20 1994-03-08 Lynx Therapeutics, Inc. Method of synthesizing sulfurized oligonucleotide analogs
US5166195A (en) 1990-05-11 1992-11-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibitors of the human immunodeficiency virus phosphorothioate oligonucleotides
NZ239252A (en) 1990-08-09 1997-07-27 Genta Inc Reagent for attaching a psoralen-containing moiety to an oligonucleotide(derivative); oligonucleotide(derivative)-psoralen conjugates
JPH06501843A (ja) 1990-08-14 1994-03-03 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド アンチセンスオリゴヌクレオチドによるインフルエンザａ型ウイルス，アン・アーバｈ２ｎ２株の阻害
US5271941A (en) 1990-11-02 1993-12-21 Cho Chung Yoon S Antisense oligonucleotides of human regulatory subunit RI.sub.α of cAMP-dependent protein kinases
EP0579771A4 (en) 1991-03-27 1997-06-11 Res Corp Technologies Inc Single-stranded circular oligonucleotides
DE4110085A1 (de) 1991-03-27 1992-10-01 Boehringer Ingelheim Int 2'-o-alkyl-oligoribonukleotide, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung als antisense-oligonukleotide
US5646267A (en) 1991-08-05 1997-07-08 Polish Academy Of Sciences Method of making oligonucleotides and oligonucleotide analogs using phospholanes and enantiomerically resolved phospholane analogues
US7119184B2 (en) 1991-08-12 2006-10-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having A-DNA form and B-DNA form conformational geometry
US6369209B1 (en) 1999-05-03 2002-04-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having A-DNA form and B-DNA form conformational geometry
CA2121144C (en) 1991-10-15 2001-07-31 Phillip Dan Cook Oligonucleotides having chiral phosphorus linkages
NZ244820A (en) 1991-10-25 1994-01-26 Isis Pharmaceuticals Inc Oligonucleotide inhibitor of epstein-barr virus.
FR2685346B1 (fr) 1991-12-18 1994-02-11 Cis Bio International Procede de preparation d'arn double-brin, et ses applications.
US5644048A (en) 1992-01-10 1997-07-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Process for preparing phosphorothioate oligonucleotides
EP0642589A4 (en) 1992-05-11 1997-05-21 Ribozyme Pharm Inc METHOD AND REAGENT TO INHIBIT VIRAL REPLICATION.
US5606049A (en) 1992-06-03 1997-02-25 Genta Incorporated Method of preparing 2'-O-methyl cytidine monomers useful in oligomer synthesis
TW244371B (ru) 1992-07-23 1995-04-01 Tri Clover Inc
US5652355A (en) 1992-07-23 1997-07-29 Worcester Foundation For Experimental Biology Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
US6346614B1 (en) 1992-07-23 2002-02-12 Hybridon, Inc. Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
EP0651759B1 (en) 1992-07-23 2003-12-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Novel 2'-o-alkyl nucleosides and phosphoramidites processes for the preparation and uses thereof
IL108206A0 (en) 1993-01-06 1994-04-12 Univ Johns Hopkins Oligomers having improved stability at acid ph
CN1121721A (zh) 1993-01-25 1996-05-01 海布里顿公司 寡核苷酸烷基膦酸酯和烷基硫代膦酸酯
AU6632094A (en) 1993-04-19 1994-11-08 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
FR2705099B1 (fr) 1993-05-12 1995-08-04 Centre Nat Rech Scient Oligonucléotides phosphorothioates triesters et procédé de préparation.
WO1995003406A2 (en) 1993-07-19 1995-02-02 Gen-Probe Incorporated Enhancement of oligonucleotide inhibition of protein production, cell proliferation, and/or multiplication of infectious disease pathogens
JPH0799976A (ja) 1993-09-30 1995-04-18 Takeda Chem Ind Ltd 修飾オリゴヌクレオチド
US5801235A (en) 1994-05-25 1998-09-01 Hybridon, Inc. Oligonucleotides with anti-cytomegalovirus activity
CA2191192A1 (en) 1994-05-27 1995-12-07 Wayne M. Galbraith Use of oligonucleotide phosphorothioate for depleting complement and for reducing blood pressure
US5866699A (en) 1994-07-18 1999-02-02 Hybridon, Inc. Oligonucleotides with anti-MDR-1 gene activity
JPH10505094A (ja) 1994-09-07 1998-05-19 ハイブリドン・インコーポレイテッド オリゴヌクレオチドプロドラッグ
US5591721A (en) 1994-10-25 1997-01-07 Hybridon, Inc. Method of down-regulating gene expression
JPH08154687A (ja) 1994-12-12 1996-06-18 Yamanouchi Pharmaceut Co Ltd アンチセンスオリゴヌクレオチド及び抗ウイルス剤
CA2207593A1 (en) 1994-12-13 1996-06-20 John Gustofson Method and reagent for treatment of arthritic conditions, induction of graft tolerance and reversal of immune responses
CN1175281A (zh) 1994-12-22 1998-03-04 海布里登公司 立体特异性硫代磷酸寡核苷酸的合成
US6111095A (en) 1995-06-07 2000-08-29 Merck & Co., Inc. Capped synthetic RNA, analogs, and aptamers
GB9511720D0 (en) 1995-06-09 1995-08-02 Isis Innovation Oligonucleotide phosphorylation method and products
US20040234999A1 (en) 1996-04-02 2004-11-25 Farrar Gwenyth Jane Genetic suppression and replacement
US6127535A (en) 1997-11-05 2000-10-03 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Nucleoside triphosphates and their incorporation into oligonucleotides
EP1626086A2 (en) 1998-04-20 2006-02-15 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Double-stranded nucleic acid molecules with novel chemical compositions capable of modulating gene expression
WO1999055857A2 (en) 1998-04-29 1999-11-04 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Nucleoside triphosphates and their incorporation into ribozymes
EP1493818A3 (en) 1998-04-29 2006-02-15 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Nucleoside triphosphates and their incorporation into ribozymes
US6562798B1 (en) 1998-06-05 2003-05-13 Dynavax Technologies Corp. Immunostimulatory oligonucleotides with modified bases and methods of use thereof
US6344323B1 (en) 1998-09-16 2002-02-05 Vitagenix, Inc. Compositions and methods for inhibiting cox-2 expression and treating cox-2 associated disorders by using cox-2 antisense oligonucleotides
CA2403243A1 (en) 1999-08-31 2001-03-08 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid based modulators of gene expression
WO2001022990A2 (en) 1999-09-27 2001-04-05 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods related to immunostimulatory nucleic acid-induced interferon
US20020028784A1 (en) 2000-03-10 2002-03-07 Nest Gary Van Methods of preventing and treating viral infections using immunomodulatory polynucleotide sequences
DE10013600A1 (de) 2000-03-18 2002-01-10 Aventis Res & Tech Gmbh & Co Reaktive Monomere für die Oligonucleotid- und Polynucleotidsynthese, modifizierte Oligonucleotide und Polynucleotiden und ein Verfahren zu deren Herstellung
US6686461B1 (en) 2000-03-22 2004-02-03 Solulink Bioscience, Inc. Triphosphate oligonucleotide modification reagents and uses thereof
US20030077609A1 (en) 2001-03-25 2003-04-24 Jakobsen Mogens Havsteen Modified oligonucleotides and uses thereof
WO2003008432A1 (en) 2001-07-16 2003-01-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Process for the preparation of alpha modified nucleoside triphosphates and compounds therefrom
AU2002329667A1 (en) 2001-07-30 2003-02-17 Uta Griesenbach Specific inhibition of gene expression by small double stranded rnas
FR2832154B1 (fr) 2001-11-09 2007-03-16 Centre Nat Rech Scient Oligonucleotides inhibiteurs et leur utilisation pour reprimer specifiquement un gene
US20030203868A1 (en) 2002-02-06 2003-10-30 Bushman Frederic D. Inhibition of pathogen replication by RNA interference
EP1485395A4 (en) 2002-02-28 2011-04-13 Biota Scient Management NUCLEOTIDE MIMETICS AND PRODRUGS THEREOF
US20050222060A1 (en) 2002-03-15 2005-10-06 Bot Adrian L Compositions and methods to initiate or enhance antibody and major-histocompatibility class I or class II-restricted t cell responses by using immunomodulatory, non-coding rna motifs
JP4846200B2 (ja) 2002-04-04 2011-12-28 コーリー ファーマシューティカル ゲーエムベーハー 免疫賦活性ｇ、ｕ含有オリゴリボヌクレオチド
WO2003087368A2 (en) 2002-04-18 2003-10-23 Lynkeus Bio Tech Gmbh Means and methods for the specific modulation of target genes in the cns and the eye and methods for their identification
CA2484079A1 (en) 2002-04-26 2003-11-06 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Expression systems for stem-loop rna molecule having rnai effect
CA2388049A1 (en) 2002-05-30 2003-11-30 Immunotech S.A. Immunostimulatory oligonucleotides and uses thereof
CN1685063B (zh) 2002-08-12 2011-12-21 新英格兰生物实验室公司 与基因沉默相关的方法和组合物
US7109316B2 (en) 2002-08-23 2006-09-19 Ce Healthcare Bio-Sciences Corp. Oligonucleotide tagged nucleoside triphosphates (OTNTPs) for genetic analysis
JP2005537015A (ja) 2002-09-04 2005-12-08 ジョンソン アンド ジョンソン リサーチ プロプライアトリー リミテッド ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介するためにｄｓＤＮＡを使用する方法
SI1546182T1 (sl) 2002-09-11 2011-04-29 Genentech Inc Sestavki in postopki za diagnozo in zdravljenje tumorja
US7250496B2 (en) 2002-11-14 2007-07-31 Rosetta Genomics Ltd. Bioinformatically detectable group of novel regulatory genes and uses thereof
US8090542B2 (en) 2002-11-14 2012-01-03 Dharmacon Inc. Functional and hyperfunctional siRNA
US7790867B2 (en) 2002-12-05 2010-09-07 Rosetta Genomics Inc. Vaccinia virus-related nucleic acids and microRNA
US20130130231A1 (en) 2002-11-26 2013-05-23 Isaac Bentwich Bioinformatically detectable group of novel viral regulatory genes and uses thereof
US7696334B1 (en) 2002-12-05 2010-04-13 Rosetta Genomics, Ltd. Bioinformatically detectable human herpesvirus 5 regulatory gene
AU2004203749A1 (en) 2003-01-06 2004-07-22 Wyeth Compositions and methods for diagnosing and treating colon cancers
WO2004074441A2 (en) 2003-02-19 2004-09-02 Government Of The United States Of America Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services Amplification or overexpression of mll septin-like fusion (msf) and septin9 and methods related thereto
CN1176937C (zh) 2003-02-21 2004-11-24 复旦大学附属中山医院 一种双链rna及其用途
US20040261149A1 (en) 2003-02-24 2004-12-23 Fauquet Claude M. siRNA-mediated inhibition of gene expression in plant cells
US7381410B2 (en) 2003-03-12 2008-06-03 Vasgene Therapeutics, Inc. Polypeptide compounds for inhibiting angiogenesis and tumor growth
US7585967B2 (en) 2003-03-12 2009-09-08 Vasgene Therapeutics, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting angiogenesis and tumor growth
JP4755972B2 (ja) 2003-03-21 2011-08-24 サンタリス ファーマ アー／エス 短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）アナログ
WO2004085623A2 (en) 2003-03-24 2004-10-07 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education A compact synthetic expression vector comprising double-stranded dna molecules and methods of use thereof
US8969543B2 (en) 2003-04-03 2015-03-03 Bioneer Corporation SiRNA-hydrophilic polymer conjugates for intracellular delivery of siRNA and method thereof
US20050042641A1 (en) 2003-05-27 2005-02-24 Cold Spring Harbor Laboratory In vivo high throughput selection of RNAi probes
CA2527907A1 (en) 2003-06-03 2004-12-09 Benitec Australia Limited Double-stranded hairpin rnas for rnai
JPWO2004108921A1 (ja) 2003-06-06 2006-07-20 大日本住友製薬株式会社 核酸導入法
KR101137572B1 (ko) 2003-06-11 2012-05-30 이데라 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 안정화된 면역조절 올리고뉴클레오티드
FR2857013B1 (fr) 2003-07-02 2005-09-30 Commissariat Energie Atomique Petits arn interferents specifiques des sous-unites alpha, alpha prime et beta de la proteine kinase ck2 et leurs applications
WO2005084180A2 (en) 2003-12-19 2005-09-15 University Of Cincinnati Polyamides and polyamide complexes for delivery of oligonucleotide decoys
EP1747284A4 (en) 2004-02-06 2009-03-11 Wyeth Corp DIAGNOSTICS AND THERAPEUTICS OF CANCER
US20050182005A1 (en) 2004-02-13 2005-08-18 Tuschl Thomas H. Anti-microRNA oligonucleotide molecules
US8084599B2 (en) 2004-03-15 2011-12-27 City Of Hope Methods and compositions for the specific inhibition of gene expression by double-stranded RNA
US20070265220A1 (en) 2004-03-15 2007-11-15 City Of Hope Methods and compositions for the specific inhibition of gene expression by double-stranded RNA
CA2565685A1 (en) 2004-05-04 2005-12-15 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Compositions and methods for enhancing delivery of nucleic acids into cells and for modifying expression of target genes in cells
US20060035815A1 (en) 2004-05-04 2006-02-16 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Pharmaceutical compositions for delivery of ribonucleic acid to a cell
US20070218079A1 (en) 2004-05-12 2007-09-20 Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wissenschaften E.V. Method to induce rnai in prokaryotic organisms
AU2005259799A1 (en) 2004-07-02 2006-01-12 Protiva Biotherapeutics, Inc. Immunostimulatory siRNA molecules and uses therefor
WO2006016574A1 (ja) 2004-08-12 2006-02-16 Kumamoto University ＲＮＡｉを利用した抗腫瘍剤
ATE505540T1 (de) 2004-11-16 2011-04-15 Qiagen Gmbh Genabschaltung (gene silencing) durch hybride sens-dna und antisens-rna konstrukte, gekoppelt an ein peptid zur erleichterten aufnahme in zellen
EP1819365B1 (en) 2004-12-09 2014-07-02 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for inducing an immune response in a mammal and methods of avoiding an immune response to oligonucleotide agents such as short interfering RNAs
US8030473B2 (en) 2005-01-07 2011-10-04 State Of Oregon Acting By And Through The State Board Of Higher Education On Behalf Of Oregon State University Method to trigger RNA interference
WO2006078646A2 (en) 2005-01-18 2006-07-27 Caltagirone Gaetano T A class of supramolecular drug molecules and methods of identification and use thereof
US20060178334A1 (en) 2005-02-04 2006-08-10 City Of Hope Double-stranded and single-stranded RNA molecules with 5 ' triphosphates and their use for inducing interferon
JP4972538B2 (ja) 2005-02-07 2012-07-11 武田薬品工業株式会社 神経変性疾患の予防・治療剤
JP4645234B2 (ja) 2005-03-03 2011-03-09 和光純薬工業株式会社 架橋剤、それを用いた架橋方法、遺伝子発現調節方法および遺伝子機能調査方法
EP2360249A1 (en) 2005-03-31 2011-08-24 Calando Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of ribonucleotide reductase subunit 2 and uses thereof
MX2007012766A (es) 2005-04-12 2008-10-01 Intradigm Corp Composición y métodos de terapéuticos de arni para el tratamiento de cáncer y otras enfermedades de neovascularización.
US7893244B2 (en) 2005-04-12 2011-02-22 Intradigm Corporation Composition and methods of RNAi therapeutics for treatment of cancer and other neovascularization diseases
US20070066521A1 (en) 2005-04-13 2007-03-22 Fauquet Claude M Short RNA-binding proteins
WO2006119643A1 (en) 2005-05-12 2006-11-16 Replicor Inc. Anti-ocular angiogenesis molecules and their uses
WO2006122409A1 (en) 2005-05-16 2006-11-23 Replicor Inc. Antimicrobial molecules and their uses
WO2006128739A1 (en) 2005-06-01 2006-12-07 Polyplus-Transfection Sa Oligonucleotides for rna interference and biological applications thereof
WO2006130949A1 (en) 2005-06-08 2006-12-14 Replicor Inc. Anti amyloid-related disease molecules and their uses
AU2006267841B2 (en) 2005-07-07 2011-12-15 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Nucleic acid agents for downregulating H19, and methods of using same
CA2619533C (en) 2005-08-17 2014-02-04 Bioneer Corporation Sirna-hydrophilic polymer conjugates for intracellular delivery of sirna and method thereof
WO2007030619A2 (en) 2005-09-08 2007-03-15 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Pharmaceutical compositions for delivery of ribonucleic acid to a cell
US8076068B2 (en) 2005-09-14 2011-12-13 Gunther Hartmann Method for determining immunostimulatory activity of RNA oligonucleotides
EP1764107A1 (en) 2005-09-14 2007-03-21 Gunther Hartmann Compositions comprising immunostimulatory RNA oligonucleotides and methods for producing said RNA oligonucleotides
WO2007107304A2 (en) 2006-03-17 2007-09-27 Novosom Ag An efficient method for loading amphoteric liposomes with nucleic acid active substances
WO2007038788A2 (en) 2005-09-29 2007-04-05 The Cleveland Clinic Foundation Small interfering rnas as non-specific drugs
EP2395012B8 (en) 2005-11-02 2018-06-06 Arbutus Biopharma Corporation Modified siRNA molecules and uses thereof
WO2007086990A2 (en) 2005-11-17 2007-08-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Modulation of gene expression by oligomers targeted to chromosomal dna
WO2007070483A2 (en) 2005-12-12 2007-06-21 The University Of North Carolina At Chapel Hill Micrornas that regulate muscle cell proliferation and differentiation
WO2007080457A2 (en) 2005-12-30 2007-07-19 Institut Gustave Roussy Use of inhibitors of scinderin and/or of ephrin-a1 for treating tumors
JP5761911B2 (ja) 2006-04-07 2015-08-12 イデラ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッドＩｄｅｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． Ｔｌｒ７およびｔｌｒ８に対する安定化免疫調節ｒｎａ（ｓｉｍｒａ）化合物
DE602007013223D1 (de) 2006-06-01 2011-04-28 Trilink Biotechnologies San Diego Chemisch modifizierte oligonukleotidprimer zur nukleinsäureamplifikation
US20080091005A1 (en) 2006-07-20 2008-04-17 Visigen Biotechnologies, Inc. Modified nucleotides, methods for making and using same
EP2046954A2 (en) 2006-07-31 2009-04-15 Curevac GmbH NUCLEIC ACID OF FORMULA (I): GIXmGn, OR (II): CIXmCn, IN PARTICULAR AS AN IMMUNE-STIMULATING AGENT/ADJUVANT
EP3342415B1 (en) * 2006-08-08 2022-01-26 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Structure and use of 5' phosphate oligonucleotides
US20100035974A1 (en) 2006-10-04 2010-02-11 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs Compositions comprising a sirna and lipidic 4,5-disubstituted 2-deoxystreptamine ring aminoglycoside derivatives and uses thereof
EP2338499A1 (en) 2006-10-10 2011-06-29 Gunther Hartmann 5' triphosphate oligonucleotide induces anti-viral response
WO2008045576A2 (en) 2006-10-12 2008-04-17 Yijia Liu Compositions and methods of rnai therapeutics for treatment of cancer and other neovascularization diseases
CN101190944A (zh) 2006-12-01 2008-06-04 北京诺赛基因组研究中心有限公司 人类新细胞因子及其用途
US20110038849A1 (en) 2006-12-21 2011-02-17 Intradigm Corporation Inhibitory polynucleotide compositions and methods for treating cancer
US20130005028A1 (en) 2006-12-21 2013-01-03 Smith Larry R Activation of RIG-I Pathway
US7858772B2 (en) 2006-12-22 2010-12-28 Roche Molecular Systems, Inc. Compounds and methods for synthesis and purification of oligonucleotides
CA2675967A1 (en) 2007-01-16 2008-07-24 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusale M Nucleic acid constructs and methods for specific silencing of h19
US9249423B2 (en) 2007-02-02 2016-02-02 Yale University Method of de-differentiating and re-differentiating somatic cells using RNA
WO2008099396A1 (en) 2007-02-15 2008-08-21 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Use of h19-silencing nucleic acid agents for treating restenosis
JPWO2008102728A1 (ja) 2007-02-19 2010-05-27 国立大学法人京都大学 核酸導入用導電性基板および核酸導入方法
MY173854A (en) 2007-03-13 2020-02-25 Malaysian Palm Oil Board Expression regulatory elements
AU2008236566A1 (en) 2007-04-09 2008-10-16 Chimeros, Inc. Self-assembling nanoparticle drug delivery system
CN101088565A (zh) 2007-04-17 2007-12-19 华东师范大学 miRNA－34a的用途
CN101289486B (zh) * 2007-04-18 2012-05-30 上海吉凯基因化学技术有限公司 一种合成rna单体的方法
WO2008134593A1 (en) 2007-04-25 2008-11-06 President And Fellows Of Harvard College Molecular circuits
CA2684724A1 (en) 2007-05-01 2008-11-06 Santaris Pharma A/S Splice switching oligomers for tnf superfamily receptors and their use in treatment of disease
US9109012B2 (en) 2007-05-29 2015-08-18 Nature Technology Corporation Vectors and method for genetic immunization
CN102317303A (zh) 2007-07-31 2012-01-11 约翰·霍普金斯大学 用于肿瘤或感染性疾病的免疫预防或免疫治疗的多肽-核酸偶联物
US8367815B2 (en) 2007-08-28 2013-02-05 California Institute Of Technology Modular polynucleotides for ligand-controlled regulatory systems
WO2009038707A2 (en) 2007-09-17 2009-03-26 Ludwig Institute For Cancer Research , Ltd. Cancer-testis gene silencing agents and uses thereof
JP2011500005A (ja) 2007-10-11 2011-01-06 ユニバーシティー ヘルス ネットワーク ヒト造血幹細胞の生着を増加させるためのＳＩＲＰα−ＣＤ４７相互作用の調節およびそのための化合物
WO2009051659A2 (en) 2007-10-12 2009-04-23 Intradigm Corporation Therapeutic sirna molecules for reducing vegfr1 expression in vitro and in vivo
DE102007052114B4 (de) 2007-10-30 2011-01-05 T2Cure Gmbh Verfahren zur Modulation der Funktion, des Wachstums oder der Differenzierung einer Zelle
CN101983241A (zh) 2007-11-05 2011-03-02 波罗的科技发展有限公司 带有修饰碱基的寡核苷酸在核酸杂交中的应用
ES2545963T3 (es) 2007-11-06 2015-09-17 Sirnaomics, Inc. Terapéutica con ARNi multidirigidos para la cicatrización de heridas de la piel sin cicatriz
US8575121B2 (en) 2007-11-12 2013-11-05 The United States of America as represented by the Secetary of the Department of Health and Human Services Therapeutic applications of p53 isoforms in regenerative medicine, aging and cancer
ATE554186T1 (de) 2007-11-29 2012-05-15 Molecular Health Gmbh Eph-b4 spezifische sirna zur reduktion von epo- induziertem tumorzellwachstum während anämiebehandlung in krebspatienten, gewebeschutz- erythropoietin-rezeptor (nepor) und verfahren zu seiner verwendung
US8357501B2 (en) 2007-11-29 2013-01-22 Molecular Health Gmbh Tissue protective erythropoietin receptor (NEPOR) and methods of use
GB0725321D0 (en) 2007-12-31 2008-02-06 Syntaxin Ltd Delivery vehicles
ES2537703T3 (es) 2008-01-31 2015-06-11 Curevac Gmbh Ácidos nucleicos que comprenden la fórmula (NuGlXmGnNv)a y sus derivados como agentes/adyuvantes inmunoestimuladores
PT2518150E (pt) 2008-05-21 2015-12-02 Univ Bonn Oligonucleótido 5'-trisfosfato com extremidade cega e suas utilizações
JP5689413B2 (ja) * 2008-05-21 2015-03-25 ライニッシュ フリードリッヒ−ウィルヘルムズ−ユニバーシタット ボン 平滑末端を有する５’三リン酸オリゴヌクレオチドおよびその使用
CA2635187A1 (en) 2008-06-05 2009-12-05 The Royal Institution For The Advancement Of Learning/Mcgill University Oligonucleotide duplexes and uses thereof
WO2009151600A2 (en) 2008-06-10 2009-12-17 Tufts University Smad proteins control drosha-mediated mirna maturation
CN101632833B (zh) 2008-07-25 2013-11-06 上海市计划生育科学研究所 一种前列腺癌相关的基因及其用途
JP2012502040A (ja) * 2008-09-02 2012-01-26 アルニラム ファーマスーティカルズ インコーポレイテッド 三リン酸塩オリゴヌクレオチドの合成方法および誘導体
WO2010042751A2 (en) 2008-10-08 2010-04-15 Chimeros Inc. Chimeric therapeutics, compositions, and methods for using same
WO2010042742A2 (en) 2008-10-08 2010-04-15 Chimeros Inc. Chimeric therapeutics, compositions, and methods for using same
WO2010042755A2 (en) 2008-10-08 2010-04-15 Chimeros Inc. Chimeric therapeutics, compositions, and methods for using same
WO2010042749A2 (en) 2008-10-08 2010-04-15 Chimeros Inc. Chimeric therapeutics, compositions, and methods for using same
CN102264898B (zh) 2008-10-23 2013-10-16 国立大学法人东京大学 微小rna的功能抑制方法
WO2010062502A1 (en) 2008-11-03 2010-06-03 University Of Utah Research Foundation Carriers for the delivery of nucleic acids to cells and methods of use thereof
JP2012518997A (ja) 2009-02-26 2012-08-23 ジ・オハイオ・ステイト・ユニバーシティ・リサーチ・ファウンデイション 喫煙未経験者におけるマイクロｒｎａ、ならびに関連する材料および方法
US8987222B2 (en) 2009-04-08 2015-03-24 University Of Massachusetts Single nucleotide polymorphism (SNP) targeting therapies for the treatment of huntington'S disease
WO2010120874A2 (en) 2009-04-14 2010-10-21 Chimeros, Inc. Chimeric therapeutics, compositions, and methods for using same
US20100323018A1 (en) 2009-06-17 2010-12-23 Massachusetts Institute Of Technology Branched DNA/RNA monomers and uses thereof
ATE554749T1 (de) 2009-07-09 2012-05-15 Marina Biotech Inc Nachahmung von lipoproteinstrukturen
US9238811B2 (en) 2009-07-14 2016-01-19 Northeastern University siRNA phospholipid conjugate
US20140018354A9 (en) 2009-07-23 2014-01-16 Nathaniel Moorman Inhibitors of mtor kinase as anti-viral agents
WO2011028128A1 (en) * 2009-09-01 2011-03-10 Askim Frukt- Og Bærpresseri As Method to prevent oxidation of components in oil, and method to reduce the use of ethoxyquin to prevent oxidation of components in oil
EP2327783A1 (en) 2009-11-27 2011-06-01 Universitätsklinikum Freiburg Pharmaceutical composition comprising miRNA-100 and its use in the modulation of blood vessel growth
DE202009015670U1 (de) 2009-11-30 2011-04-14 Mcairlaid's Vliesstoffe Gmbh & Co. Kg Absorptionskörper zur Auflage auf Wunden
US20110247091A1 (en) 2010-03-26 2011-10-06 The Governors Of The University Of Alberta Transgenic Cells and Chickens Expressing RIG-I
WO2011133559A2 (en) 2010-04-19 2011-10-27 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Alpha tubulin acetyltransferase
CN102985546A (zh) 2010-05-04 2013-03-20 圣诺制药公司 TGF-beta和Cox-2抑制剂的联合及其治疗应用的方法
EP2385120A1 (en) 2010-05-04 2011-11-09 Justus-Liebig- Universitat Giessen Use of anti-miRNA antisense oligonucleotides for the treatment of pulmonary hypertension
CN101974529B (zh) 2010-09-21 2013-04-03 南京大学（苏州）高新技术研究院 含自由三磷酸基团的TGF-β特异性siRNA及其应用
WO2012056440A1 (en) 2010-10-28 2012-05-03 Nanodoc Ltd. COMPOSITIONS AND METHODS FOR ACTIVATING EXPRESSION BY A SPECIFIC ENDOGENOUS miRNA
WO2012056441A1 (en) 2010-10-28 2012-05-03 Nanodoc Ltd. Compositions and methods for specific cleavage of exogenous rna in a cell
CN102475892A (zh) 2010-11-22 2012-05-30 大连创达技术交易市场有限公司 作为制备抗癌药物的反义miRNA-210的用途
EP3695850A1 (en) 2010-12-30 2020-08-19 Samyang Biopharmaceuticals Corporation Carrier for negatively charged drugs comprising a cationic lipid and a preparation method thereof
US8461224B2 (en) 2011-03-04 2013-06-11 National Health Research Institutes Single monomer derived linear-like copolymer comprising polyethylenimine and poly(ethylene glycol) for nucleic acid delivery
US20140212503A1 (en) 2011-03-17 2014-07-31 Hyukjin Lee Delivery system
EP2729182A4 (en) 2011-07-04 2014-12-24 Commw Scient Ind Res Org NUCLEIC COMPLEX
EP2551354A1 (en) 2011-07-25 2013-01-30 Universität Heidelberg Functionalization of RNA oligonucleotides
US20130189367A1 (en) 2011-07-29 2013-07-25 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Nanovectors for targeted gene silencing and cytotoxic effect in cancer cells
EP2741783B1 (de) 2011-08-08 2017-03-22 Universität Regensburg Polyanion-nanokomplexe für therapeutische anwendungen
EP2765982A1 (de) 2011-10-11 2014-08-20 Hans Kosak Dimethylsulfoxid als lösungsmittel für nukleinsäuren
EP2765983A1 (de) 2011-10-11 2014-08-20 Hans Kosak Zusammensetzung zur einbringung von nukleinsäuren in zellen
US20140286998A1 (en) 2011-10-31 2014-09-25 Riboxx Gmbh Double-Stranded RNA For Immunostimulation
US9631192B2 (en) 2011-11-17 2017-04-25 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Auto-recognizing therapeutic RNA/DNA chimeric nanoparticles (NP)
WO2013153082A1 (en) 2012-04-10 2013-10-17 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for the treatment of nonalcoholic steatohepatitis
US20130302252A1 (en) 2012-05-11 2013-11-14 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Polyarginine-coated magnetic nanovector and methods of use thereof
EP2712870A1 (en) 2012-09-27 2014-04-02 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Novel RIG-I ligands and methods for producing them
WO2014124433A1 (en) 2013-02-11 2014-08-14 Oregon Health & Science University 5'-triphosphate oligoribonucleotides

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009060281A2 (en) * 2007-11-06 2009-05-14 Coley Pharmaceutical Gmbh Immune stimulatory oligoribonucleotide analogs containing modified oligophosphate moieties
WO2011028218A1 (en) * 2009-09-02 2011-03-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Process for triphosphate oligonucleotide synthesis
WO2012130886A1 (en) * 2011-03-28 2012-10-04 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Purification of triphosphorylated oligonucleotides using capture tags
EP2508530A1 (en) * 2011-03-28 2012-10-10 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Purification of triphosphorylated oligonucleotides using capture tags

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
IVAN ZLATEV, THOMAS LAVERGNE, FRANÇOISE DEBART, JEAN-JACQUES VASSEUR, MUTHIAH MANOHARAN, FRANÇOIS MORVAN: "Efficient Solid-Phase Chemical Synthesis of 5′-Triphosphates of DNA, RNA, and their Analogues", ORGANIC LETTERS, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, vol. 12, no. 10, 21 May 2010 (2010-05-21), pages 2190 - 2193, XP055005331, ISSN: 15237060, DOI: 10.1021/ol1004214 *
LEBEDEV A V; KOUKHAREVA I I; BECK T; VAGHEFI M M: "PREPARATION OF OLIGODEOXYNUCLEOTIDE 5'-TRIPHOSPHATES USING SOLID SUPPORT APPROACH", NUCLEOSIDES, NUCLEOTIDES AND NUCLEIC ACIDS., TAYLOR & FRANCIS, US, vol. 20, no. 4-7, 1 January 2001 (2001-01-01), US, pages 1403 - 1409, XP009081703, ISSN: 1525-7770, DOI: 10.1081/NCN-100002565 *
MARTIN SCHLEE, ROTH ANDREAS, HORNUNG VEIT, HAGMANN CRISTINA AMPARO, WIMMENAUER VERA, BARCHET WINFRIED, COCH CHRISTOPH, JANKE MARKU: "Recognition of 5′ Triphosphate by RIG-I Helicase Requires Short Blunt Double-Stranded RNA as Contained in Panhandle of Negative-Strand Virus", IMMUNITY, CELL PRESS, vol. 31, no. 1, 1 July 2009 (2009-07-01), pages 25 - 34, XP055032801, ISSN: 10747613, DOI: 10.1016/j.immuni.2009.05.008 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN104703996B (zh) 2018-01-12
BR112015006874A2 (pt) 2017-07-04
HUE038811T2 (hu) 2018-11-28
AU2017213455A1 (en) 2017-08-24
PL2903997T3 (pl) 2018-11-30
BR112015006874B1 (pt) 2023-04-18
US10072262B2 (en) 2018-09-11
MX2015003787A (es) 2015-11-09
SA517380700B1 (ar) 2019-04-04
NZ706443A (en) 2018-04-27
SG11201501961PA (en) 2015-04-29
SG10201912308SA (en) 2020-02-27
CL2015000752A1 (es) 2015-12-04
EP3398956A1 (en) 2018-11-07
TN2015000104A1 (en) 2016-06-29
EP2903997B1 (en) 2018-06-06
SG10201702028YA (en) 2017-04-27
US11142763B2 (en) 2021-10-12
US20180312841A1 (en) 2018-11-01
PH12015500644A1 (en) 2015-05-11
AU2013322620B2 (en) 2017-08-31
HK1214602A1 (zh) 2016-07-29
CN106279300A (zh) 2017-01-04
CA2885564C (en) 2019-08-20
CN106279300B (zh) 2020-07-10
KR102182479B1 (ko) 2020-11-24
SI2903997T1 (sl) 2018-11-30
EP2712870A1 (en) 2014-04-02
EA028707B1 (ru) 2017-12-29
RS57609B1 (sr) 2018-11-30
DK2903997T3 (en) 2018-07-30
AU2013322620C1 (en) 2017-12-14
ZA201501718B (en) 2015-12-23
JP2015532270A (ja) 2015-11-09
TR201810231T4 (tr) 2018-08-27
EP2903997A1 (en) 2015-08-12
AU2017213455B2 (en) 2019-02-14
LT2903997T (lt) 2018-10-10
EP2963050A1 (en) 2016-01-06
WO2014049079A1 (en) 2014-04-03
PT2903997T (pt) 2018-07-26
IL237794B (en) 2018-12-31
EP3398956B1 (en) 2021-11-03
EP4008722A1 (en) 2022-06-08
HK1209128A1 (en) 2016-03-24
KR20150059792A (ko) 2015-06-02
SA515360190B1 (ar) 2018-09-26
US10059943B2 (en) 2018-08-28
NZ736108A (en) 2018-12-21
US20150275217A1 (en) 2015-10-01
EA201590629A1 (ru) 2016-02-29
PH12015500644B1 (en) 2015-05-11
CN104703996A (zh) 2015-06-10
HRP20181114T1 (hr) 2018-10-19
UA117565C2 (uk) 2018-08-27
EA201790916A1 (ru) 2017-08-31
ES2679373T3 (es) 2018-08-24
AU2013322620A2 (en) 2015-04-09
AU2013322620A1 (en) 2015-04-02
CA2885564A1 (en) 2014-04-03
JP6313768B2 (ja) 2018-04-18
BR122019023887B1 (pt) 2023-03-14
CY1120660T1 (el) 2019-12-11
US20160152983A1 (en) 2016-06-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA034605B1 (ru) Новые лиганды rig-i и способы их получения
CN104781271B (zh) 具有生物可逆的基团的多核苷酸
KR101298493B1 (ko) 텔로머라제 억제를 위한 변형 올리고뉴클레오티드
JP2020524485A (ja) オリゴヌクレオチド組成物及びその使用方法
EP2845607A1 (en) Antisense oligonucleotides with improved pharmacokinetic properties
RU2740501C2 (ru) МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ, АКТИВИРУЮЩИЕ РНКазу Н
JP2023524812A (ja) リンカー化合物
CN117980003A (zh) 核酸的脂肪酸缀合物
TW202504618A (zh) 多聚體ｒｎａｉ藥劑結合物之肝臟遞送平台及其使用方法
CN119768186A (zh) 用于向cns组织递送治疗剂的脂质缀合物
KR20250024813A (ko) 치료제를 cns 조직으로 전달하기 위한 지질 접합체