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KR101846590B1 - 항 ｔｉｍ-3 항체 - Google Patents

항 ｔｉｍ-3 항체 Download PDF

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KR101846590B1
KR101846590B1 KR1020127032260A KR20127032260A KR101846590B1 KR 101846590 B1 KR101846590 B1 KR 101846590B1 KR 1020127032260 A KR1020127032260 A KR 1020127032260A KR 20127032260 A KR20127032260 A KR 20127032260A KR 101846590 B1 KR101846590 B1 KR 101846590B1
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KR
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antibody
amino acid
acid sequence
seq
tim
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신이치로 다카야나기
히토미 도무라
도모노리 다와라
요시마사 이나가키
츠구오 구보타
고이치 아카시
요시카네 기쿠시게
Original Assignee
교와 핫꼬 기린 가부시키가이샤
고쿠리쓰다이가쿠호진 규슈다이가쿠
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Publication date
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Abstract

본 발명은, 인간 TIM-3 발현 세포가 관여하는 질환에 대하여, 인간 TIM-3의 세포외 영역의 아미노산 배열 또는 그의 입체 구조에 결합하며, 항체 의존적 세포 상해 활성(ADCC 활성) 등의 이펙터 활성이 높은 항 인간 TIM-3 항체를 제공한다. 본 발명은, 인간 TIM-3의 세포외 영역의 아미노산 배열 또는 그의 입체 구조에 결합하며 ADCC 활성을 발휘하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편, 상기 항체를 생산하는 하이브리도마, 상기 항체를 코딩하는 DNA, 상기 DNA를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 도입해서 얻어지는 형질 전환체, 상기 하이브리도마 또는 상기 형질 전환체를 사용하는 항체 또는 상기 항체 단편의 제조 방법, 상기 항체 또는 상기 항체 단편을 유효 성분으로 하는 치료약 및 진단약을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명은, 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편과 경합하는 항 인간 TIM-3 항체를 탐색함으로써, 높은 ADCC 활성을 나타내는 항 인간 TIM-3 항체에 관한 것이다.

Description

항 ＴＩＭ-3 항체{ANTI-TIM-3 ANTIBODY}
본 발명은, T 세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인 함유 분자-3(T-cell immunoglobulin and mucin domain containing molecule-3; 이하, TIM-3이라고 기재함)의 세포외 영역에 결합하며 항체 의존적 세포 상해 활성(antibody-dependent cellular cytotoxicity, 이하 ADCC 활성이라고 기재함)을 발휘하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편, 상기 항체를 생산하는 하이브리도마, 상기 항체를 코딩하는 DNA, 상기 DNA를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 도입해서 얻어지는 형질 전환체, 상기 하이브리도마 또는 상기 형질 전환체를 사용하는 항체 또는 상기 항체 단편의 제조 방법, 상기 항체 또는 상기 항체 단편을 유효 성분으로 하는 치료약 및 진단약에 관한 것이다.
TIM 유전자 패밀리는 마우스에서는 8개, 인간에게서는 3개의 유전자로 구성되며, 각각 11번 염색체와 5q33 영역에 존재한다(비특허문헌 1). 이들 유전자 영역은, 자가 면역 질환 및 알레르기 질환에 관련된다. TIM 단백질은 구조적으로 보존된 면역글로불린 가변체[immunoglobulin variable(IgV)] 도메인 및 뮤신 도메인을 갖는 I형 막관통 단백질이다.
TIM 단백질은, 당초 T 세포 상에 특이적으로 발현하며 그의 활성을 직접적으로 제어하고 있는 것으로 생각되어 왔지만, 최근에는 항원 제시 세포 상에서의 발현 및 기능도 보고되고 있다(비특허문헌 2). 결정 구조 해석에 의해, TIM 단백질은 보존된 구조를 가지며, IgV 도메인 내에 리간드 결합 부위를 갖는 것으로 알려져 있다.
TIM-3은, Th2 세포에 발현하지 않고 마우스 Th1 세포 특이적으로 발현하는 분자로서 동정되었다(비특허문헌 3). TIM-3의 DNA 배열, 아미노산 배열 및 입체 구조는, 공적 데이터 베이스 상에 공개되어 있으며, 예를 들어 NM_032782, NM_134250(젠뱅크(GenBank)) 등의 검색 번호로부터 참조 가능하다. TIM-3은, 별칭 HAVCR2라고도 불린다.
TIM-3은, 인간에게서도, 마우스와 마찬가지로 T 세포에 발현하고 있으며, 매크로파지 또는 수상 세포 등 대식 세포에도 발현하고 있다. TIM-3은, 리간드가 되는 단백질(예를 들어, 갈렉틴-9)과의 결합에 의해, Th1 세포에 아포토시스를 유도하는 등의 메커니즘으로 Th1 응답을 저해하고, 예를 들어 말초성 관용을 유도한다.
인간 TIM-3에 대한 siRNA에 의한 발현의 감약 또는 블로킹 항체에 의한 저해에 의해, CD4 양성 T 세포로부터의 인터페론 γ(IFNγ) 분비의 항진 등이 인정되고 있으며, TIM-3이 인간 T 세포에서의 저해적인 역할을 하는 것을 지지하고 있다. 또한, 대식 세포 상에서는, TIM-3은 아포토시스 세포를 인식하는 수용체로서 기능한다.
임상 검체를 사용한 해석에서는, 자가 면역 질환 환자 유래의 CD4 양성 T 세포에서는 TIM-3의 발현이 보이지 않았다. 특히, 다발성 경화증 환자의 뇌척수액 유래의 T 세포 클론에서는, 정상인 유래의 클론에 비해 TIM-3의 발현이 낮고, IFNγ의 분비가 높았다(비특허문헌 4). 또한, TIM-3은, 알레르기 또는 천식질환과의 관련도 시사되어 있다(특허문헌 1 및 2).
또한, 급성 골수성 백혈병(이하, AML이라고 기재함)의 조혈 줄기 세포와 정상적인 조혈 줄기 세포의 마이크로어레이 해석으로부터, AML 줄기 세포 상에는 TIM-3이 발현하고 있어, 혈액 종양과의 관련도 나타나 있다(비특허문헌 5 및 특허문헌 3).
지금까지 확립되어 있는 항 TIM-3 모노클로날 항체로는, 항 인간 TIM-3 래트 모노클로날 항체(클론 344823, 알앤디 시스템즈(R&D Systems)사제), 항 인간 TIM-3 마우스 모노클로날 항체(클론 F38-2E2, 이바이오사이언스(eBioscience)사제) 등이 알려져 있다.
국제 공개 96/27603호 국제 공개 2003/063792호 국제 공개 2009/091547호
Hafler DA 외, J Exp Med. 205:2699-701(2008) Anderson AC 외, Science 318:1141-3(2007) Monney L 외, Nature 415:536-41.(2002) Koguchi K 외, J Exp Med. 203:1413-8.(2006) Majeti R 외, Proc Natl Acad Sci USA. 2009 Mar 3;106(9):3396-401.
그러나, ADCC 활성을 갖는 인간 TIM-3에 대한 모노클로날 항체는 알려져 있지 않다. 따라서, 본 발명은, 인간 TIM-3의 세포외 영역의 아미노산 배열 또는 그의 입체 구조에 결합하며 ADCC 활성을 발휘하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 제공하는 것을 과제로 한다. 또한, 본 발명은, 상기 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편과 경합하는 항 인간 TIM-3 항체를 탐색함으로써, 높은 ADCC 활성을 갖는 항 인간 TIM-3 항체를 제공하는 것을 과제로 한다.
또한, 본 발명은, 상기 항체를 생산하는 하이브리도마, 상기 항체를 코딩하는 DNA, 상기 DNA를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 도입해서 얻어지는 형질 전환체, 상기 하이브리도마 또는 상기 형질 전환체를 사용하는 항체 또는 상기 항체 단편의 제조 방법, 상기 항체 또는 상기 항체 단편을 유효 성분으로 하는 치료약 및 진단약을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명의 요지는 이하와 같다.
(1) 이하의 (i) 내지 (iii)에서 선택되는 하나의 항체와 경합하여 인간 TIM-3의 세포외 영역에 결합하는 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편.
(i) 상보성 결정 영역(complementarity determining region; 이하, CDR이라고 기재함) 1 내지 3이 각각 배열 번호 1 내지 3으로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 항체의 중쇄(이하, H쇄라고 기재함)를 포함하고, CDR 1 내지 3이 각각 배열 번호 4 내지 6으로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 항체의 경쇄(이하, L쇄라고 기재함)를 포함하는 항체
(ii) CDR 1 내지 3이 각각 배열 번호 11 내지 13으로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 항체의 H쇄를 포함하고, CDR 1 내지 3이 각각 배열 번호 14 내지 16으로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 항체의 L쇄를 포함하는 항체
(iii) CDR 1 내지 3이 각각 배열 번호 21 내지 23으로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 항체의 H쇄를 포함하고, CDR 1 내지 3이 각각 배열 번호 24 내지 26으로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 항체의 L쇄를 포함하는 항체
(2) 상기 (i) 내지 (iii)에서 선택되는 하나의 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체인, (1)에 기재된 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편.
(3) 이하의 (a) 또는 (b)의 항체와, 경합하여 인간 TIM-3의 세포외 영역에 결합하는 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편.
(a) 배열 번호 8로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 항체의 VH를 포함하고, 배열 번호 10으로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 항체의 VL을 포함하는 항체
(b) 배열 번호 18로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 항체의 VH를 포함하고, 배열 번호 20으로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 항체의 VL을 포함하는 항체
(4) 상기 (a) 또는 (b)의 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체인, (3)에 기재된 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편.
(5) 유전자 재조합 항체인, (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편.
(6) 인간형 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체에서 선택되는 유전자 재조합 항체인, (5)에 기재된 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편.
(7) 이하의 (i) 내지 (iii)에서 선택되는 하나의 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편.
(i) CDR 1 내지 3이 각각 배열 번호 1 내지 3으로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 항체의 H쇄를 포함하고, CDR 1 내지 3이 각각 배열 번호 4 내지 6으로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 항체의 L쇄를 포함하는 모노클로날 항체 및 상기 항체 단편.
(ii) CDR 1 내지 3이 각각 배열 번호 11 내지 13으로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 항체의 H쇄를 포함하고, CDR 1 내지 3이 각각 배열 번호 14 내지 16으로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 항체의 L쇄를 포함하는 모노클로날 항체 및 상기 항체 단편.
(iii) CDR 1 내지 3이 각각 배열 번호 21 내지 23으로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 항체의 H쇄를 포함하고, CDR 1 내지 3이 각각 배열 번호 24 내지 26으로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 항체의 L쇄를 포함하는 모노클로날 항체 및 상기 항체 단편.
(8) 이하의 (a) 또는 (b)인 모노클로날 항체 및 상기 항체 단편.
(a) 배열 번호 8로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 항체의 VH를 포함하고, 배열 번호 10으로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 항체의 VL을 포함하는 모노클로날 항체 및 상기 항체 단편.
(b) 배열 번호 18로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 항체의 VH를 포함하고, 배열 번호 20으로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 항체의 VL을 포함하는 모노클로날 항체 및 상기 항체 단편.
(9) 배열 번호 53으로 나타내는 인간 TIM-3의 IgV 도메인의 아미노산 배열 중, 67번 내지 105번째의 아미노산 배열, 67번 내지 96번째의 아미노산 배열 또는 67번 내지 87번째의 아미노산 배열에 결합하는 모노클로날 항체 및 상기 항체 단편.
(10) Fab, Fab', F(ab')2, 단일쇄 항체(scFv), 2량체화 V영역(diabody), 디술피드 안정화 V영역(dsFv) 및 CDR을 포함하는 펩티드에서 선택되는 항체 단편인, (1) 내지 (9) 중 어느 하나에 기재된 항체 단편.
(11) (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편을 코딩하는 DNA.
(12) (11)에 기재된 DNA를 함유하는 재조합체 벡터.
(13) (12)에 기재된 재조합체 벡터를 숙주 세포에 도입해서 얻어지는 형질 전환주.
(14) (13)에 기재된 형질 전환주를 배지에 배양하고, 배양물 중에 (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편을 생성 축적시키고, 배양물로부터 상기 항체 또는 상기 항체 단편을 채취하는 것을 특징으로 하는, (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편의 제조 방법.
(15) (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편을 사용하는 인간 TIM-3의 면역학적 검출 또는 측정 방법.
(16) (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편을 포함하는 인간 TIM-3의 검출 또는 측정용 시약.
(17) (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편을 포함하는 인간 TIM-3 양성 세포가 관여하는 질환의 진단약.
(18) (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편을 사용하여 인간 TIM-3 양성 세포를 검출 또는 측정하는 것을 포함하는, 인간 TIM-3 양성 세포가 관여하는 질환의 진단 방법.
(19) (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편을 사용하여 인간 TIM-3을 검출 또는 측정하는 것을 포함하는, 인간 TIM-3 양성 세포가 관여하는 질환의 진단 방법.
(20) 인간 TIM-3 양성 세포가 관여하는 질환의 진단약을 제조하기 위한, (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편의 용도.
(21) (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편을 포함하는 인간 TIM-3 양성 세포가 관여하는 질환의 치료약.
(22) (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편을 사용하여 인간 TIM-3 양성 세포의 세포사를 유도하는 것을 포함하는, 인간 TIM-3 양성 세포가 관여하는 질환의 치료 방법.
(23) 인간 TIM-3 양성 세포가 관여하는 질환의 치료약을 제조하기 위한, (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편의 용도.
본 발명의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편은, 인간 TIM-3의 세포외 영역에서의 특정한 아미노산 배열 또는 그의 입체 구조를 특이적으로 인식하고, 상기 세포외 영역에 결합한다. 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편이 인식하는 인간 TIM-3의 세포외 영역의 아미노산 배열 또는 그의 입체 구조는, 종래의 항 TIM-3 모노클로날 항체가 인식하는 아미노산 배열 또는 그의 입체 구조와 상이하며, 이에 의해 높은 ADCC 활성을 발휘할 수 있는 것으로 생각된다. 인간 TIM-3의 세포외 영역에 특이적으로 결합하며 높은 ADCC 활성을 갖는 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편은, 인간 TIM-3 양성 세포가 관여하는 질환의 치료 및 진단 등에 매우 유용하다.
또한, 본 발명은, 상기 항체를 생산하는 하이브리도마, 상기 항체를 코딩하는 DNA, 상기 DNA를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 도입해서 얻어지는 형질 전환체, 상기 하이브리도마 또는 상기 형질 전환체를 사용하는 항체 또는 상기 항체 단편의 제조 방법, 상기 항체 또는 상기 항체 단편을 유효 성분으로 하는 치료약 및 진단약을 제공할 수 있다.
도 1은 설계한 8213 항체의 H쇄 가변 영역 HV0, HV3, HV4, HV5, HV6, HV7, HV8, HV10, HV12의 아미노산 배열을 나타낸다.
도 2는 설계한 8213 항체의 L쇄 가변 영역 LV0, LV2, LV4, LV5, LV6, LV7, LV9의 아미노산 배열을 나타낸다.
본 발명에서의 인간 TIM-3으로는, 배열 번호 53 또는 젠뱅크 검색 번호 NM_032782로 나타내는 아미노산 배열을 포함하며 인간 TIM-3의 기능을 갖는 폴리펩티드, 및 배열 번호 53 또는 젠뱅크 검색 번호 NM_032782로 나타내는 아미노산 배열과 60% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 배열을 갖는 폴리펩티드, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 배열을 포함하며 인간 TIM-3의 기능을 갖는 폴리펩티드 등을 들 수 있다.
배열 번호 53 또는 젠뱅크 검색 번호 NM_032782로 나타내는 아미노산 배열에서 1 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 배열을 갖는 폴리펩티드를 얻는 방법으로는, 부위 특이적 변이 도입법 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Current Protocols inmolecular Biology, John Wiley&Sons(1987-1997); Nucleic Acids Research, 10, 6487(1982); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409, (1982); Gene, 34, 315(1985); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488(1985)] 등을 사용하여, 예를 들어 배열 번호 53으로 나타내는 아미노산 배열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 부위 특이적 변이를 도입하는 방법을 들 수 있다.
결실, 치환 또는 부가되는 아미노산의 수는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 1개 내지 수십 개, 예를 들어 1 내지 20개, 보다 바람직하게는 1개 내지 수 개, 예를 들어 1 내지 5개의 아미노산이다.
인간 TIM-3을 코딩하는 유전자로는, 배열 번호 52 또는 젠뱅크 검색 번호 NM_032782로 나타내는 염기 배열을 들 수 있다. 배열 번호 52 또는 젠뱅크 검색 번호 NM_032782로 나타내는 염기 배열에서 하나 이상의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기 배열을 포함하며 인간 TIM-3의 기능을 갖는 폴리펩티트를 코딩하는 DNA를 포함하는 유전자, 배열 번호 52 또는 젠뱅크 검색 번호 NM_032782로 나타내는 염기 배열과 적어도 60% 이상의 상동성을 갖는 염기 배열, 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖는 염기 배열, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 염기 배열을 포함하며 인간 TIM-3의 기능을 갖는 폴리펩티트를 코딩하는 DNA를 포함하는 유전자, 및 배열 번호 52 또는 젠뱅크 검색 번호 NM_032782로 나타내는 염기 배열을 갖는 DNA와 엄격한(stringent) 조건하에서 하이브리다이즈하는 DNA를 포함하며 인간 TIM-3의 기능을 갖는 폴리펩티트를 코딩하는 DNA를 포함하는 유전자 등도 본 발명의 인간 TIM-3을 코딩하는 유전자에 포함된다.
엄격한 조건하에서 하이브리다이즈하는 DNA로는, 배열 번호 52 또는 젠뱅크 검색 번호 NM_032782로 나타내는 염기 배열을 갖는 DNA를 프로브에 사용한, 콜로니·하이브리다이제이션법, 플라크·하이브리다이제이션법, 서던 블롯·하이브리다이제이션법, 또는 DNA 마이크로어레이법 등에 의해 얻어지는 하이브리다이즈 가능한 DNA를 의미한다.
구체적으로는, 하이브리다이즈한 콜로니 또는 플라크 유래의 DNA, 또는 상기 배열을 갖는 PCR 산물 또는 올리고 DNA를 고정화한 필터 또는 슬라이드 유리를 사용하여 0.7 내지 1.0mol/L의 염화나트륨 존재하에 65℃에서 하이브리다이제이션 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Current Protocols inmolecular Biology, John Wiley&Sons(1987-1997); DNA Cloning 1:Coretechniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University, (1995)]을 행한 후, 0.1 내지 2배 농도의 SSC 용액(1배 농도의 SSC 용액의 조성은, 150mmol/L 염화나트륨, 15mmol/L 시트르산나트륨을 포함함)을 사용하고, 65℃ 조건하에서 필터 또는 슬라이드 유리를 세정함으로써 동정할 수 있는 DNA를 들 수 있다.
상기 하이브리다이즈 가능한 DNA로는, 배열 번호 52 또는 젠뱅크 검색 번호 NM_032782로 나타내는 염기 배열과 적어도 60% 이상의 상동성을 갖는 DNA, 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖는 DNA, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 DNA를 들 수 있다.
진핵 생물의 단백질을 코딩하는 유전자의 염기 배열에는, 종종 유전자의 다형이 확인된다. 본 발명에서 사용되는 유전자에 이러한 다형에 의해 염기 배열에 소규모의 변이를 발생시킨 유전자도, 본 발명의 TIM-3을 코딩하는 유전자에 포함된다.
본 발명에서의 상동성의 수치는, 특별히 명시했을 경우를 제외하고, 당업자에게 공지인 상동성 검색 프로그램을 사용하여 산출되는 수치이며 되는데, 염기 배열에 대해서는 BLAST [J. Mol. Biol., 215, 403(1990)]에서 디폴트의 파라미터를 사용하여 산출되는 수치 등, 아미노산 배열에 대해서는 BLAST2 [Nucleic Acids Res., 25, 3389(1997), Genome Res., 7, 649(1997), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.html]에서 디폴트의 파라미터를 사용하여 산출되는 수치 등을 들 수 있다.
디폴트의 파라미터로는, G(Cost to open gap)가 염기 배열의 경우에는 5, 아미노산 배열의 경우에는 11, -E(Cost to extend gap)가 염기 배열의 경우에는 2, 아미노산 배열의 경우에는 1, -q(Penalty for nucleotide mismatch)가 -3, -r(reward for nucleotide match)이 1, -e(expect value)가 10, -W(wordsize)가 염기 배열의 경우에는 11 잔기, 아미노산 배열의 경우에는 3 잔기, -y[Dropoff(X) for blast extensions in bits]가 blastn의 경우에는 20, blastn 이외의 프로그램에서는 7, -X(X dropoff value forgapped alignment in bits)가 15, 및 Z(final X dropoff value for gapped alignment in bits)가 blastn의 경우에는 50, blastn 이외의 프로그램에서는 25이다 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/html/blastcgihelp.html).
배열 번호 53 또는 젠뱅크 검색 번호 NM_032782로 나타내는 아미노산 배열의 부분 배열을 포함하는 폴리펩티드는, 당업자에게 공지된 방법에 의해 제조할 수 있고, 예를 들어 배열 번호 52로 나타내는 아미노산 배열을 코딩하는 DNA의 일부를 결실시키고, 이것을 포함하는 발현 벡터를 도입한 형질 전환체를 배양함으로써 제조할 수 있다.
또한, 상기의 방법으로 제조되는 폴리펩티드 또는 DNA에 기초하여, 상기와 마찬가지의 방법에 의해 배열 번호 53 또는 젠뱅크 검색 번호 NM_032782로 나타내는 아미노산 배열의 부분 배열에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 배열을 갖는 폴리펩티드를 얻을 수 있다.
또한, 배열 번호 53 또는 젠뱅크 검색 번호 NM_032782로 나타내는 아미노산 배열의 부분 배열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 배열 번호 53 또는 젠뱅크 검색 번호 NM_032782로 나타내는 아미노산 배열의 부분 배열에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 배열을 갖는 폴리펩티드는, 플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc)법, t-부틸옥시카르보닐(tBoc)법 등의 화학 합성법에 의해 제조할 수도 있다.
본 발명에서의 인간 TIM-3의 세포외 영역으로는, 예를 들어 배열 번호 53으로 나타내는 상기 폴리펩티드의 아미노산 배열을 공지의 막관통 영역 예측 프로그램 SOSUI (http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/sosui_submit.html), TMHMM ver.2 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/), ExPASy 프로테오믹스 서버(Proteomics Server) (http://Ca.expasy.org/) 또는 SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/) 등을 사용하여 예측된 영역 등을 들 수 있다.
본 발명에서의 인간 TIM-3의 세포외 영역의 아미노산 배열로는, SMART에서 예측되는 세포외 도메인인, 배열 번호 53으로 나타내는 아미노산 배열의 1번째부터 201번째까지를 들 수 있다.
본 발명에서의 인간 TIM-3의 세포외 영역의 입체 구조로는, 배열 번호 53 또는 젠뱅크 검색 번호 NM_032782로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 인간 TIM-3의 세포외 영역이 천연 상태로 취할 수 있는 구조와 동등한 구조를 갖고 있으면 어느 구조든지 상관없다. 인간 TIM-3의 세포외 영역이 천연 상태로 취할 수 있는 입체 구조란, 세포막 상에 발현하고 있는 인간 TIM-3의 천연형의 입체 구조를 말한다.
본 발명에서 인간 TIM-3의 기능으로는, 리간드가 되는 단백질(예를 들어, 갈렉틴-9)과의 결합에 의해, Th1 세포에 아포토시스를 유도하는 등의 메커니즘으로 Th1 응답을 저해하고, 예를 들어 말초성 관용을 유도하는 것을 말한다. 또한, 대식 세포 상에서는, 수용체로서 아포토시스 세포를 인식하는 것을 말한다.
본 발명의 모노클로날 항체(이하, 본 발명의 항체라고도 함) 또는 그 항체 단편이 인간 TIM-3의 세포외 영역의 아미노산 배열 또는 그의 입체 구조에 결합하는 것은, 고상 샌드위치법 등을 사용한 방사 면역 측정법(radioimmunoassay), 또는 효소 면역 측정법(ELISA) 등을 사용한 인간 TIM-3을 발현한 세포에 대한 공지의 면역학적 검출법, 바람직하게는 형광 세포 염색법 등의 특정한 항원을 발현한 세포와 특정 항원에 대한 항체의 결합성을 조사할 수 있는 방법에 의해 확인할 수 있다.
예를 들어, FMAT8100HTS 시스템(어플라이드 바이오 시스템사제) 등을 사용하는 형광 항체 염색법 [Cancer Immunol. Immunother., 36, 373(1993)], 유세포분석기(flow cytometry)를 사용하는 형광 세포 염색법, 또는 비아코어(Biacore) 시스템(GE 헬스케어사제) 등을 사용한 표면 플라스몬 공명 등의 방법을 들 수 있다.
또한, 공지의 면역학적 검출법 [Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press(1996); Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988); 단일 클론 항체 실험 매뉴얼, 고단샤 사이언티픽(1987)] 등을 조합해서 확인할 수도 있다.
인간 TIM-3을 발현한 세포로는, 상기 TIM-3을 발현하고 있다면 어느 쪽의 세포라도 좋으며, 예를 들어 인간 체내에 천연으로 존재하는 세포, 인간 체내에 천연으로 존재하는 세포로부터 수립된 세포주, 또는 유전자 재조합 기술에 의해 얻어진 세포 등을 들 수 있다.
인간 체내에 천연으로 존재하는 세포로는, 예를 들어 암, 자가 면역 질환 또는 알레르기성 질환의 환자 체내에서 상기 TIM-3이 발현하고 있는 세포를 들 수 있으며, 구체적으로는 Th1 세포, 매크로파지 및 수상 세포 등을 들 수 있다.
인간 체내에 천연으로 존재하는 세포로부터 수립된 세포주로는, 예를 들어 상기한 암 환자로부터 얻어진 상기 TIM-3이 발현하고 있는 세포를 주화해서 얻어진 세포주 중, 상기 TIM-3을 발현하고 있는 세포주를 들 수 있다. 예를 들어, 인간으로부터 수립된 세포주인 급성 골수성 백혈병 유래 세포주 KG-1 [미국 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection; ATCC) 번호:CCL-246] 또는 버킷 림프종 유래 세포주 다우디(Daudi) (ATCC 번호:CCL-213) 등을 들 수 있다.
유전자 재조합 기술에 의해 얻어진 세포로는, 구체적으로는 예를 들어 상기 TIM-3을 코딩하는 cDNA를 포함하는 발현 벡터를 곤충 세포 또는 동물 세포 등에 도입함으로써 얻어지는 상기 TIM-3을 발현한 세포 등을 들 수 있다.
또한 본 발명은, 인간 TIM-3의 세포외 영역의 아미노산 배열 또는 그의 입체 구조에 결합하며 ADCC 활성을 발휘하는 모노클로날 항체에 관한 것이다.
본 발명에서의 ADCC 활성이란, 세포 표면의 인간 TIM-3에 결합한 항체가 Fc 부분을 통해 주로 자연 살해 세포(natural killer cell; 이하, NK 세포라고 표기함) 표면의 FcγRIIIa에 결합하고, 그 결과 NK 세포로부터 방출되는 퍼포린 또는 그란자임 등의 세포 상해성 분자에 의해 발생하는 세포 융해 반응이다 [Clark M, Chemical Immunology, 65, 88(1997); Gorter A 외, Immunol. Today, 20, 576(1999)].
본 발명의 항체로는, 인간 TIM-3의 세포외 영역의 아미노산 배열 또는 그의 입체 구조를 인식하며 상기 세포외 영역에 결합하는 항체 또는 그 항체 단편, 또는 인간 TIM-3의 세포외 영역의 아미노산 배열 또는 그의 입체 구조에 결합하며 ADCC 활성을 갖는 모노클로날 항체 또는 항체 단편이면 어느 항체든 포함된다.
본 발명의 항체로는, 구체적으로는 배열 번호 53으로 나타내는 인간 TIM-3의 아미노산 배열에서의 1번째 내지 201번째의 아미노산 배열을 포함하는 세포외 영역 중, 바람직하게는 67번째 내지 105번째의 아미노산 배열, 보다 바람직하게는 67번째 내지 96번째의 아미노산 배열, 더욱 바람직하게는 67번째 내지 87번째의 아미노산 배열에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 배열 또는 그의 입체 구조에 결합하는 항체를 들 수 있다.
상기 항체로서, 구체적으로는 이하의 (i) 내지 (iii)의 모노클로날 항체 및 그 항체 단편을 들 수 있다.
(i) 상보성 결정 영역(complementarity deterining region; 이하, CDR이라고 기재함) 1 내지 3이 각각 배열 번호 1 내지 3으로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 항체의 중쇄(이하, H쇄라고 기재함)를 포함하고, CDR 1 내지 3이 각각 배열 번호 4 내지 6으로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 항체의 경쇄(이하, L쇄라고 기재함)를 포함하는 모노클로날 항체 및 그 항체 단편
(ii) CDR 1 내지 3이 각각 배열 번호 11 내지 13으로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 항체의 H쇄를 포함하고, CDR 1 내지 3이 각각 배열 번호 14 내지 16으로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 항체의 L쇄를 포함하는 모노클로날 항체 및 그 항체 단편
(iii) CDR 1 내지 3이 각각 배열 번호 21 내지 23으로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 항체의 H쇄를 포함하고, CDR 1 내지 3이 각각 배열 번호 24 내지 26으로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 항체의 L쇄를 포함하는 모노클로날 항체 및 그 항체 단편
또한, 본 발명의 모노클로날 항체로서 보다 구체적으로는, 이하의 (a) 및 (b)의 모노클로날 항체 및 그 항체 단편을 들 수 있다.
(a) 배열 번호 8로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 항체의 VH를 포함하고, 배열 번호 10으로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 항체의 VL을 포함하는 모노클로날 항체 및 그 항체 단편
(b) 배열 번호 18로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 항체의 VH를 포함하고, 배열 번호 20으로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 항체의 VL을 포함하는 모노클로날 항체 및 그 항체 단편
또한, 본 발명의 모노클로날 항체로는, 상기 모노클로날 항체와 경합하여 인간 TIM-3의 세포외 영역의 아미노산 배열 또는 그의 입체 구조에 결합하는 모노클로날 항체 및 그 항체 단편, 및 상기 모노클로날 항체가 결합하는 인간 TIM-3의 세포외 영역 상에 존재하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체 및 그 항체 단편을 들 수 있다.
본 발명에서, 모노클로날 항체와 경합하는 항체란, 본 발명의 모노클로날 항체와 동일 또는 부분적으로 동일한 인간 TIM-3의 세포외 영역에 에피토프(항원 결정기라고도 함)를 가지며, 상기 에피토프에 결합하는 항체를 말한다. 본 발명의 모노클로날 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체란, 본 발명의 모노클로날 항체가 인식하는 인간 TIM-3의 아미노산 배열과 동일한 배열을 인식해서 결합하는 항체를 말한다.
본 발명의 모노클로날 항체로는, 하이브리도마에 의해 생산되는 항체, 또는 항체 유전자를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환한 형질 전환체에 의해 생산되는 유전자 재조합 항체를 들 수 있다.
모노클로날 항체란, 단일 클론의 항체 생산 세포가 분비되는 항체이며, 단 하나의 에피토프(항원 결정기라고도 함)를 인식하며, 모노클로날 항체를 구성하는 아미노산 배열(1차 구조)이 균일한 것이 특징이다.
에피토프로는, 예를 들어 모노클로날 항체가 인식하고 결합하는 단일한 아미노산 배열, 아미노산 배열을 포함하는 입체 구조, 당쇄가 결합한 아미노산 배열 및 당쇄가 결합한 아미노산 배열을 포함하는 입체 구조 등을 들 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체는, 배열 번호 53으로 나타내는 인간 TIM-3의 세포외 영역의 아미노산 배열 중, 22번째 내지 131번째의 아미노산 배열로 나타내는 인간 TIM-3의 IgV 도메인의 아미노산 배열에 결합하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 본 발명의 모노클로날 항체가 결합하는 아미노산 배열은, 배열 번호 53의 67번째 내지 105번째의 아미노산 배열인 것이 바람직하고, 67번째 내지 96번째의 아미노산 배열인 것이 보다 바람직하고, 67번째 내지 87번째의 아미노산 배열인 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 모노클로날 항체가 결합하는 에피토프는, 배열 번호 53으로 나타내는 인간 TIM-3의 세포외 영역의 아미노산 배열 중, 22번째 내지 131번째의 아미노산 배열로 나타내는 인간 TIM-3의 IgV 도메인에 포함되는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 본 발명의 모노클로날 항체가 결합하는 에피토프는, 67번째 내지 105번째의 아미노산 배열 중에 포함되는 것이 바람직하고, 67번째 내지 96번째까지의 아미노산 배열 중에 포함되는 것이 보다 바람직하고, 67번째 내지 87번째까지의 아미노산 배열 중에 포함되는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 모노클로날 항체가 결합하는 에피토프의 아미노산 배열은, 인간 TIM-3의 IgV 도메인의 아미노산 배열 중, 배열 번호 53의 67번째 내지 87번째의 아미노산에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 것이 바람직하고, 67번째, 74번째, 76번째, 78번째, 79번째, 81번째, 83번째 및 85번째의 아미노산에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 것이 보다 바람직하다.
또한, 본 발명의 모노클로날 항체가 결합하는 에피토프의 아미노산 배열은, 인간 TIM-3의 IgV 도메인의 아미노산 배열 중, 배열 번호 53의 67번째 내지 87번째의 아미노산 배열에서 선택되는 적어도 연속된 2 이상의 아미노산을 포함하는 것이 바람직하고, 67번째, 74번째, 76번째, 78번째, 79번째, 81번째, 83번째 및 85번째의 아미노산에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산을 포함하고, 배열 번호 53의 67번째 내지 87번째의 아미노산 배열에서 선택되는 적어도 연속된 2 이상의 아미노산을 포함하는 것이 보다 바람직하다.
구체적으로는, 본 발명의 모노클로날 항체가 결합하는 에피토프의 아미노산 배열로는, 배열 번호 53의 67번째 내지 74번째의 아미노산을 포함하는 아미노산 배열, 67번째 내지 76번째의 아미노산을 포함하는 아미노산 배열, 67번째 내지 78번째의 아미노산을 포함하는 아미노산 배열, 67번째 내지 79번째의 아미노산을 포함하는 아미노산 배열, 67번째 내지 81번째의 아미노산을 포함하는 아미노산 배열, 67번째 내지 83번째의 아미노산을 포함하는 아미노산 배열, 67번째 내지 85번째의 아미노산을 포함하는 아미노산 배열,
74번째 내지 76번째의 아미노산을 포함하는 아미노산 배열, 74번째 내지 78번째의 아미노산을 포함하는 아미노산 배열, 74번째 내지 79번째의 아미노산을 포함하는 아미노산 배열, 74번째 내지 81번째의 아미노산을 포함하는 아미노산 배열, 74번째 내지 83번째의 아미노산을 포함하는 아미노산 배열, 74번째 내지 85번째의 아미노산을 포함하는 아미노산 배열,
76번째 내지 78번째의 아미노산을 포함하는 아미노산 배열, 76번째 내지 79번째의 아미노산을 포함하는 아미노산 배열, 76번째 내지 81번째의 아미노산을 포함하는 아미노산 배열, 76번째 내지 83번째의 아미노산을 포함하는 아미노산 배열, 76번째 내지 85번째의 아미노산을 포함하는 아미노산 배열,
78번째 내지 79번째의 아미노산을 포함하는 아미노산 배열, 78번째 내지 81번째의 아미노산을 포함하는 아미노산 배열, 78번째 내지 83번째의 아미노산을 포함하는 아미노산 배열, 78번째 내지 85번째의 아미노산을 포함하는 아미노산 배열,
79번째 내지 81번째의 아미노산을 포함하는 아미노산 배열, 79번째 내지 83번째의 아미노산을 포함하는 아미노산 배열, 79번째 내지 85번째의 아미노산을 포함하는 아미노산 배열,
81번째 내지 83번째의 아미노산을 포함하는 아미노산 배열, 81번째 내지 85번째의 아미노산을 포함하는 아미노산 배열, 또는
83번째 내지 85번째의 아미노산을 포함하는 아미노산 배열 등을 들 수 있다.
하이브리도마는, 예를 들어 상기의 인간 TIM-3을 발현한 세포 등을 항원으로서 조제하고, 상기 항원을 면역한 동물로부터 항원 특이성을 갖는 항체 생산 세포를 유도하고, 또한 상기 항체 생산 세포와 골수종 세포를 융합시킴으로써 조제할 수 있다. 상기 하이브리도마를 배양하거나, 또는 상기 하이브리도마 세포를 동물에 투여해서 상기 동물을 복수 암화시키고, 상기 배양액 또는 복수를 분리, 정제함으로써 항 TIM-3 모노클로날 항체를 취득할 수 있다.
항원을 면역하는 동물로는, 하이브리도마를 제조하는 것이 가능하다면 어떠한 것이나 사용할 수 있는데, 바람직하게는 마우스, 래트, 햄스터, 닭 또는 토끼 등이 사용된다. 또한, 이와 같은 동물로부터 항체 생산능을 갖는 세포를 취득하고, 상기 세포에 시험관내(in vitro)에서 면역을 실시한 후에, 골수종 세포와 융합해서 제조한 하이브리도마가 생산하는 항체 등도 본 발명의 항체에 포함된다.
본 발명에서 유전자 재조합 항체로는, 인간형 키메라 항체, 인간형 CDR 이식 항체, 인간 항체 또는 항체 단편 등 유전자 재조합에 의해 제조되는 항체를 포함한다. 유전자 재조합 항체에 있어서, 모노클로날 항체의 특징을 갖고 항원성이 낮으며 혈중 반감기가 연장된 것은, 치료약으로서 바람직하다. 유전자 재조합 항체는, 예를 들어 상기 본 발명의 모노클로날 항체를 유전자 재조합 기술을 사용하여 개변한 것을 들 수 있다.
인간형 키메라 항체는, 인간 이외의 동물의 항체의 VH 및 VL과 인간 항체의 중쇄 정상 영역(이하, CH라고 기재함) 및 경쇄 정상 영역(이하, CL이라고 기재함)을 포함하는 항체를 말한다. 본 발명의 인간형 키메라 항체는, 인간 TIM-3을 특이적으로 인식하며 상기 세포외 영역의 아미노산 배열 또는 그의 입체 구조에 결합하는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마로부터 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA를 취득하고, 인간 항체의 CH 및 CL을 코딩하는 유전자를 갖는 동물 세포용 발현 벡터에 각각 삽입해서 인간형 키메라 항체 발현 벡터를 구축하고, 동물 세포에 도입함으로써 발현시켜서 제조할 수 있다.
인간형 키메라 항체의 CH로는, 인간 면역글로불린(이하, hIg라고 표기함)에 속하면 어떠한 것이라도 좋지만, 바람직하게는 hIgG 클래스의 것이 사용되고, 또한 hIgG 클래스에 속하는 hIgG1, hIgG2, hIgG3 또는 hIgG4와 같은 서브클래스 모두를 사용할 수 있다. 또한, 인간형 키메라 항체의 CL로는, hIg에 속하면 어느 것이라도 좋으며, κ 클래스 또는 λ 클래스의 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 인간형 키메라 항체로서 구체적으로는, 배열 번호 28로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 항체의 VH를 포함하고, 배열 번호 30으로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 항체의 VL을 포함하는 키메라 항체를 들 수 있다.
또한, 본 발명의 키메라 항체로는, 본 발명의 모노클로날 항체와 경합하여 인간 TIM-3의 세포외 영역의 아미노산 배열 또는 그의 입체 구조에 결합하는 키메라 항체, 및 상술한 키메라 항체가 결합하는 인간 TIM-3의 세포외 영역 상에 존재하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 키메라 항체를 들 수 있다.
인간형 CDR 이식 항체란, 인간화 항체라고도 하며, 인간 이외의 동물의 항체의 VH 및 VL의 CDR의 아미노산 배열을 인간 항체의 VH 및 VL의 적절한 위치에 이식한 항체를 말한다. 본 발명의 인간형 CDR 이식 항체는, 인간 TIM-3을 특이적으로 인식하며 상기 세포외 영역의 아미노산 배열 또는 그의 입체 구조에 결합하는 인간 이외의 동물의 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마로부터 생산되는 인간 이외의 동물의 항체의 VH 및 VL의 CDR의 아미노산 배열을 임의의 인간 항체의 VH 및 VL의 프레임워크 영역(이하, FR이라고 표기함)에 이식한 V 영역을 코딩하는 cDNA를 구축하고, 인간 항체의 CH 및 CL을 코딩하는 유전자를 갖는 동물 세포용 발현 벡터에 각각 삽입해서 인간형 CDR 이식 항체 발현 벡터를 구축하고, 동물 세포에 도입함으로써 발현시켜서 제조할 수 있다.
인간형 CDR 이식 항체의 CH로는, hIg에 속하면 어떠한 것이라도 좋지만, 바람직하게는 hIgG 클래스의 것이 사용되고, 또한 hIgG 클래스에 속하는 hIgG1, hIgG2, hIgG3 또는 hIgG4와 같은 서브클래스 모두를 사용할 수 있다. 또한, 인간형 CDR 이식 항체의 CL로는, hIg에 속하면 어느 것이라도 좋으며, κ 클래스 또는 λ 클래스의 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 인간형 CDR 이식 항체로는, 구체적으로는 CDR 1 내지 3이 배열 번호 21 내지 23으로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 항체의 VH를 포함하고, CDR 1 내지 3이 배열 번호 24 내지 26으로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 항체의 VL을 포함하는 인간화 항체를 들 수 있다.
본 발명의 인간화 항체로서, 구체적으로는 이하의 (a) VH 및 (b) VL 중 적어도 한쪽을 포함하는 인간화 항체를 들 수 있다.
(a) 배열 번호 67의 아미노산 배열, 또는 배열 번호 67의 아미노산 배열의 12번째의 Lys, 20번째의 Val, 38번째의 Arg, 40번째의 Ala, 48번째의 Met, 67번째의 Arg, 68번째의 Val, 70번째의 Ile, 72번째의 Ala, 74번째의 Thr, 98번째의 Arg 및 113번째의 Val에서 선택되는 적어도 1개의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 배열을 포함하는 항체의 VH
(b) 배열 번호 69의 아미노산 배열, 또는 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 11번째의 Leu, 13번째의 Ala, 15번째의 Val, 36번째의 Tyr, 43번째의 Ala, 44번째의 Pro, 46번째의 Leu, 71번째의 Phe 및 85번째의 Thr에서 선택되는 적어도 1개의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 배열을 포함하는 항체의 VL
또한, 본 발명의 인간화 항체에 포함되는 VH로는, 이하의 (1) 내지 (8)이 바람직하다.
(1) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 12번째의 Lys, 20번째의 Val, 38번째의 Arg, 40번째의 Ala, 48번째의 Met, 67번째의 Arg, 68번째의 Val, 70번째의 Ile, 72번째의 Ala, 74번째의 Thr, 98번째의 Arg 및 113번째의 Val이 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 배열을 포함하는 VH
(2) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 12번째의 Lys, 38번째의 Arg, 40번째의 Ala, 48번째의 Met, 67번째의 Arg, 68번째의 Val, 70번째의 Ile, 72번째의 Ala, 74번째의 Thr 및 98번째의 Arg가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 배열을 포함하는 VH
(3) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 20번째의 Val, 38번째의 Arg, 48번째의 Met, 68번째의 Val, 70번째의 Ile, 72번째의 Ala, 98번째의 Arg 및 113번째의 Val이 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 배열을 포함하는 VH
(4) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg, 40번째의 Ala, 48번째의 Met, 67번째의 Arg, 72번째의 Ala, 74번째의 Thr 및 98번째의 Arg가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 배열을 포함하는 VH
(5) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 12번째의 Lys, 67번째의 Arg, 68번째의 Val, 72번째의 Ala, 74번째의 Thr 및 98번째의 Arg가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 배열을 포함하는 VH
(6) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg, 40번째의 Ala, 48번째의 Met, 67번째의 Arg 및 98번째의 Arg가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 배열을 포함하는 VH
(7) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg, 48번째의 Met, 67번째의 Arg 및 74번째의 Thr이 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 배열을 포함하는 VH
(8) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg, 48번째의 Met 및 98번째의 Arg가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 배열을 포함하는 VH
상기 VH의 아미노산 배열로는, 예를 들어 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 12번째의 Lys를 Val로, 20번째의 Val을 Leu로, 38번째의 Arg를 Lys로, 40번째의 Ala를 Arg로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 68번째의 Val을 Ala로, 70번째의 Ile를 Leu로, 72번째의 Ala를 Val로, 74번째의 Thr을 Lys로, 98번째의 Arg를 Gly로, 또는 113번째의 Val을 Leu로 치환하는 개변에서 선택되는 적어도 1개의 개변이 도입된 아미노산 배열을 들 수 있다.
12개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 배열로는, 구체적으로는 예를 들어 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 12번째의 Lys를 Val로, 20번째의 Val을 Leu로, 38번째의 Arg를 Lys로, 40번째의 Ala를 Arg로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 68번째의 Val을 Ala로, 70번째의 Ile를 Leu로, 72번째의 Ala를 Val로, 74번째의 Thr을 Lys로, 98번째의 Arg를 Gly로, 및 113번째의 Val을 Leu로 치환한 아미노산 배열을 들 수 있다.
11개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 배열로는, 구체적으로는 예를 들어 이하의 (1) 내지 (12)의 아미노산 배열을 들 수 있다.
(1) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 20번째의 Val을 Leu로, 38번째의 Arg를 Lys로, 40번째의 Ala를 Arg로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 68번째의 Val을 Ala로, 70번째의 Ile를 Leu로, 72번째의 Ala를 Val로, 74번째의 Thr을 Lys로, 98번째의 Arg를 Gly로, 및 113번째의 Val을 Leu로 치환한 아미노산 배열
(2) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 12번째의 Lys를 Val로, 38번째의 Arg를 Lys로, 40번째의 Ala를 Arg로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 68번째의 Val을 Ala로, 70번째의 Ile를 Leu로, 72번째의 Ala를 Val로, 74번째의 Thr을 Lys로, 98번째의 Arg를 Gly로, 및 113번째의 Val을 Leu로 치환한 아미노산 배열
(3) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 12번째의 Lys를 Val로, 20번째의 Val을 Leu로, 40번째의 Ala를 Arg로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 68번째의 Val을 Ala로, 70번째의 Ile를 Leu로, 72번째의 Ala를 Val로, 74번째의 Thr을 Lys로, 98번째의 Arg를 Gly로, 및 113번째의 Val을 Leu로 치환한 아미노산 배열
(4) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 12번째의 Lys를 Val로, 20번째의 Val을 Leu로, 38번째의 Arg를 Lys로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 68번째의 Val을 Ala로, 70번째의 Ile를 Leu로, 72번째의 Ala를 Val로, 74번째의 Thr을 Lys로, 98번째의 Arg를 Gly로, 및 113번째의 Val을 Leu로 치환한 아미노산 배열
(5) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 12번째의 Lys를 Val로, 20번째의 Val을 Leu로, 38번째의 Arg를 Lys로, 40번째의 Ala를 Arg로, 67번째의 Arg를 Lys로, 68번째의 Val을 Ala로, 70번째의 Ile를 Leu로, 72번째의 Ala를 Val로, 74번째의 Thr을 Lys로, 98번째의 Arg를 Gly로, 및 113번째의 Val을 Leu로 치환한 아미노산 배열
(6) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 12번째의 Lys를 Val로, 20번째의 Val을 Leu로, 38번째의 Arg를 Lys로, 40번째의 Ala를 Arg로, 48번째의 Met를 Ile로, 68번째의 Val을 Ala로, 70번째의 Ile를 Leu로, 72번째의 Ala를 Val로, 74번째의 Thr을 Lys로, 98번째의 Arg를 Gly로, 및 113번째의 Val을 Leu로 치환한 아미노산 배열
(7) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 12번째의 Lys를 Val로, 20번째의 Val을 Leu로, 38번째의 Arg를 Lys로, 40번째의 Ala를 Arg로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 70번째의 Ile를 Leu로, 72번째의 Ala를 Val로, 74번째의 Thr을 Lys로, 98번째의 Arg를 Gly로, 및 113번째의 Val을 Leu로 치환한 아미노산 배열
(8) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 12번째의 Lys를 Val로, 20번째의 Val을 Leu로, 38번째의 Arg를 Lys로, 40번째의 Ala를 Arg로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 68번째의 Val을 Ala로, 72번째의 Ala를 Val로, 74번째의 Thr을 Lys로, 98번째의 Arg를 Gly로, 및 113번째의 Val을 Leu로 치환한 아미노산 배열
(9) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 12번째의 Lys를 Val로, 20번째의 Val을 Leu로, 38번째의 Arg를 Lys로, 40번째의 Ala를 Arg로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 68번째의 Val을 Ala로, 70번째의 Ile를 Leu로, 74번째의 Thr을 Lys로, 98번째의 Arg를 Gly로, 및 113번째의 Val을 Leu로 치환한 아미노산 배열
(10) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 12번째의 Lys를 Val로, 20번째의 Val을 Leu로, 38번째의 Arg를 Lys로, 40번째의 Ala를 Arg로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 68번째의 Val을 Ala로, 70번째의 Ile를 Leu로, 72번째의 Ala를 Val로, 98번째의 Arg를 Gly로, 및 113번째의 Val을 Leu로 치환한 아미노산 배열
(11) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 12번째의 Lys를 Val로, 20번째의 Val을 Leu로, 38번째의 Arg를 Lys로, 40번째의 Ala를 Arg로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 68번째의 Val을 Ala로, 70번째의 Ile를 Leu로, 72번째의 Ala를 Val로, 74번째의 Thr을 Lys로, 및 113번째의 Val을 Leu로 치환한 아미노산 배열
(12) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 12번째의 Lys를 Val로, 20번째의 Val을 Leu로, 38번째의 Arg를 Lys로, 40번째의 Ala를 Arg로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 68번째의 Val을 Ala로, 70번째의 Ile를 Leu로, 72번째의 Ala를 Val로, 74번째의 Thr을 Lys로, 및 98번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 배열
10개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 배열로는, 구체적으로는 예를 들어 이하의 (1) 내지 (8)의 아미노산 배열을 들 수 있다.
(1) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 12번째의 Lys를 Val로, 38번째의 Arg를 Lys로, 40번째의 Ala를 Arg로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 68번째의 Val을 Ala로, 70번째의 Ile를 Leu로, 72번째의 Ala를 Val로, 74번째의 Thr을 Lys로, 및 98번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 배열
(2) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 12번째의 Lys를 Val로, 20번째의 Val을 Leu로, 38번째의 Arg를 Lys로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 68번째의 Val을 Ala로, 70번째의 Ile를 Leu로, 72번째의 Ala를 Val로, 74번째의 Thr을 Lys로, 및 98번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 배열
(3) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 20번째의 Val을 Leu로, 38번째의 Arg를 Lys로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 68번째의 Val을 Ala로, 70번째의 Ile를 Leu로, 72번째의 Ala를 Val로, 74번째의 Thr을 Lys로, 98번째의 Arg를 Gly로, 및 113번째의 Val을 Leu로 치환한 아미노산 배열
(4) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 12번째의 Lys를 Val로, 38번째의 Arg를 Lys로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 68번째의 Val을 Ala로, 70번째의 Ile를 Leu로, 72번째의 Ala를 Val로, 74번째의 Thr을 Lys로, 98번째의 Arg를 Gly로, 및 113번째의 Val을 Leu로 치환한 아미노산 배열
(5) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 20번째의 Val을 Leu로, 38번째의 Arg를 Lys로, 40번째의 Ala를 Arg로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 68번째의 Val을 Ala로, 70번째의 Ile를 Leu로, 72번째의 Ala를 Val로, 74번째의 Thr을 Lys로, 및 98번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 배열
(6) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg를 Lys로, 40번째의 Ala를 Arg로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 68번째의 Val을 Ala로, 70번째의 Ile를 Leu로, 72번째의 Ala를 Val로, 74번째의 Thr을 Lys로, 98번째의 Arg를 Gly로, 및 113번째의 Val을 Leu로 치환한 아미노산 배열
(7) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 12번째의 Lys를 Val로, 20번째의 Val을 Leu로, 38번째의 Arg를 Lys로, 40번째의 Ala를 Arg로, 48번째의 Met를 Ile로, 68번째의 Val을 Ala로, 70번째의 Ile를 Leu로, 72번째의 Ala를 Val로, 98번째의 Arg를 Gly로, 및 113번째의 Val을 Leu로 치환한 아미노산 배열
(8) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 12번째의 Lys를 Val로, 38번째의 Arg를 Lys로, 40번째의 Ala를 Arg로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 68번째의 Val을 Ala로, 70번째의 Ile를 Leu로, 72번째의 Ala를 Val로, 74번째의 Thr을 Lys로, 및 98번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 배열
8개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 배열로는, 구체적으로는 예를 들어 이하의 (1) 내지 (13)의 아미노산 배열을 들 수 있다.
(1) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 20번째의 Val을 Leu로, 38번째의 Arg를 Lys로, 48번째의 Met를 Ile로, 68번째의 Val을 Ala로, 70번째의 Ile를 Leu로, 72번째의 Ala를 Val로, 98번째의 Arg를 Gly로, 및 113번째의 Val을 Leu로 치환한 아미노산 배열
(2) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg를 Lys로, 48번째의 Met를 Ile로, 68번째의 Val을 Ala로, 70번째의 Ile를 Leu로, 72번째의 Ala를 Val로, 74번째의 Thr을 Lys로, 98번째의 Arg를 Gly로, 및 113번째의 Val을 Leu로 치환한 아미노산 배열
(3) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg를 Lys로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 68번째의 Val을 Ala로, 70번째의 Ile를 Leu로, 72번째의 Ala를 Val로, 98번째의 Arg를 Gly로, 및 113번째의 Val을 Leu로 치환한 아미노산 배열
(4) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg를 Lys로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 68번째의 Val을 Ala로, 70번째의 Ile를 Leu로, 72번째의 Ala를 Val로, 74번째의 Thr을 Lys로, 및 98번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 배열
(5) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg를 Lys로, 40번째의 Ala를 Arg로, 48번째의 Met를 Ile로, 68번째의 Val을 Ala로, 70번째의 Ile를 Leu로, 72번째의 Ala를 Val로, 98번째의 Arg를 Gly로, 및 113번째의 Val을 Leu로 치환한 아미노산 배열
(6) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg를 Lys로, 40번째의 Ala를 Arg로, 48번째의 Met를 Ile로, 68번째의 Val을 Ala로, 70번째의 Ile를 Leu로, 72번째의 Ala를 Val로, 74번째의 Thr을 Lys로, 및 98번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 배열
(7) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg를 Lys로, 40번째의 Ala를 Arg로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 68번째의 Val을 Ala로, 70번째의 Ile를 Leu로, 72번째의 Ala를 Val로, 및 98번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 배열
(8) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 20번째의 Val를 Leu로, 38번째의 Arg를 Lys로, 48번째의 Met를 Ile로, 68번째의 Val을 Ala로, 70번째의 Ile를 Leu로, 72번째의 Ala를 Val로, 74번째의 Thr을 Lys로, 및 98번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 배열
(9) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 20번째의 Val을 Leu로, 38번째의 Arg를 Lys로, 40번째의 Ala를 Arg로, 48번째의 Met를 Ile로, 68번째의 Val을 Ala로, 70번째의 Ile를 Leu로, 72번째의 Ala를 Val로, 및 98번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 배열
(10) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 20번째의 Val을 Leu로, 38번째의 Arg를 Lys로, 48번째의 Met를 Ile로, 68번째의 Val을 Ala로, 70번째의 Ile를 Leu로, 72번째의 Ala를 Val로, 98번째의 Arg를 Gly로, 및 113번째의 Val을 Leu로 치환한 아미노산 배열
(11) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 12번째의 Lys를 Val로, 38번째의 Arg를 Lys로, 48번째의 Met를 Ile로, 68번째의 Val을 Ala로, 70번째의 Ile를 Leu로, 72번째의 Ala를 Val로, 74번째의 Thr을 Lys로, 및 98번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 배열
(12) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 12번째의 Lys를 Val로, 38번째의 Arg를 Lys로, 40번째의 Ala를 Arg로, 48번째의 Met를 Ile로, 68번째의 Val을 Ala로, 70번째의 Ile를 Leu로, 72번째의 Ala를 Val로, 및 98번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 배열
(13) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 12번째의 Lys를 Val로, 20번째의 Val을 Leu로, 38번째의 Arg를 Lys로, 48번째의 Met를 Ile로, 68번째의 Val을 Ala로, 70번째의 Ile를 Leu로, 72번째의 Ala를 Val로, 및 98번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 배열
7개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 배열로는, 구체적으로는 예를 들어 이하의 (1) 내지 (11)의 아미노산 배열을 들 수 있다.
(1) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg를 Lys로, 40번째의 Ala를 Arg로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 72번째의 Ala를 Val로, 74번째의 Thr을 Lys로, 및 98번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 배열
(2) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg를 Lys로, 48번째의 Met를 Ile로, 68번째의 Val을 Ala로, 70번째의 Ile를 Leu로, 72번째의 Ala를 Val로, 74번째의 Thr을 Lys로, 및 98번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 배열
(3) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg를 Lys로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 70번째의 Ile를 Leu로, 72번째의 Ala를 Val로, 74번째의 Thr을 Lys로, 및 98번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 배열
(4) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg를 Lys로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 68번째의 Val을 Ala로, 72번째의 Ala를 Val로, 74번째의 Thr을 Lys로, 및 98번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 배열
(5) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg를 Lys로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 68번째의 Val을 Ala로, 70번째의 Ile를 Leu로, 72번째의 Ala를 Val로, 및 98번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 배열
(6) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg를 Lys로, 40번째의 Ala를 Arg로, 48번째의 Met를 Ile로, 70번째의 Ile를 Leu로, 72번째의 Ala를 Val로, 74번째의 Thr을 Lys로, 및 98번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 배열
(7) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg를 Lys로, 40번째의 Ala를 Arg로, 48번째의 Met를 Ile로, 68번째의 Val을 Ala로, 72번째의 Ala를 Val로, 74번째의 Thr을 Lys로, 및 98번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 배열
(8) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg를 Lys로, 40번째의 Ala를 Arg로, 48번째의 Met를 Ile로, 68번째의 Val을 Ala로, 70번째의 Ile를 Leu로, 72번째의 Ala를 Val로, 및 98번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 배열
(9) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg를 Lys로, 40번째의 Ala를 Arg로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 72번째의 Ala를 Val로, 74번째의 Thr을 Lys로, 및 98번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 배열
(10) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg를 Lys로, 40번째의 Ala를 Arg로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 70번째의 Ile를 Leu로, 72번째의 Ala를 Val로, 및 98번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 배열
(11) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg를 Lys로, 40번째의 Ala를 Arg로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 68번째의 Val을 Ala로, 72번째의 Ala를 Val로, 및 98번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 배열
6개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 배열로는, 구체적으로는 예를 들어 이하의 (1) 내지 (16)의 아미노산 배열을 들 수 있다.
(1) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 12번째의 Lys를 Val로, 67번째의 Arg를 Lys로, 68번째의 Val을 Ala로, 72번째의 Ala를 Val로, 74번째의 Thr을 Lys로, 및 98번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 배열
(2) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 12번째의 Lys를 Val로, 20번째의 Val을 Leu로, 38번째의 Arg를 Lys로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 및 98번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 배열
(3) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 12번째의 Lys를 Val로, 38번째의 Arg를 Lys로, 40번째의 Ala를 Arg로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 및 98번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 배열
(4) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 12번째의 Lys를 Val로, 38번째의 Arg를 Lys로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 68번째의 Val을 Ala로, 및 98번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 배열
(5) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 12번째의 Lys를 Val로, 38번째의 Arg를 Lys로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 72번째의 Ala를 Val로, 및 98번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 배열
(6) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 12번째의 Lys를 Val로, 38번째의 Arg를 Lys로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 74번째의 Thr을 Lys로, 및 98번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 배열
(7) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 20번째의 Val을 Leu로, 38번째의 Arg를 Lys로, 40번째의 Ala를 Arg로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 및 98번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 배열
(8) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 20번째의 Val을 Leu로, 38번째의 Arg를 Lys로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 68번째의 Val을 Ala로, 및 98번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 배열
(9) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 20번째의 Val을 Leu로, 38번째의 Arg를 Lys로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 72번째의 Ala를 Val로, 및 98번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 배열
(10) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 20번째의 Val을 Leu로, 38번째의 Arg를 Lys로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 74번째의 Thr을 Lys로, 및 98번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 배열
(11) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg를 Lys로, 40번째의 Ala를 Arg로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 68번째의 Val을 Ala로, 및 98번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 배열
(12) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg를 Lys로, 40번째의 Ala를 Arg로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 72번째의 Ala를 Val로, 및 98번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 배열
(13) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg를 Lys로, 40번째의 Ala를 Arg로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 74번째의 Thr을 Lys로, 및 98번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 배열
(14) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg를 Lys로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 68번째의 Val을 Ala로, 72번째의 Ala를 Val로, 및 98번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 배열
(15) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg를 Lys로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 68번째의 Val을 Ala로, 74번째의 Thr을 Lys로, 및 98번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 배열
(16) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg를 Lys로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 72번째의 Ala를 Val로, 74번째의 Thr을 Lys로, 및 98번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 배열
5개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 배열로는, 구체적으로는 예를 들어 이하의 (1) 내지 (7)의 아미노산 배열을 들 수 있다.
(1) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg를 Lys로, 40번째의 Ala를 Arg로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 및 98번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 배열
(2) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 12번째의 Lys를 Val로, 38번째의 Arg를 Lys로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 및 98번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 배열
(3) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 20번째의 Val을 Leu로, 38번째의 Arg를 Lys로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 및 98번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 배열
(4) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg를 Lys로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 68번째의 Val을 Ala로, 및 98번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 배열
(5) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg를 Lys로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 70번째의 Ile를 Leu로, 및 98번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 배열
(6) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg를 Lys로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 72번째의 Ala를 Val로, 및 98번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 배열
(7) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg를 Lys로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 74번째의 Thr을 Lys로, 및 98번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 배열
4개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 배열로는, 구체적으로는 예를 들어 이하의 (1) 내지 (8)의 아미노산 배열을 들 수 있다.
(1) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg를 Lys로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 및 74번째의 Thr을 Lys로 치환한 아미노산 배열
(2) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 12번째의 Lys를 Val로, 38번째의 Arg를 Lys로, 48번째의 Met를 Ile로, 및 67번째의 Arg를 Lys로 치환한 아미노산 배열
(3) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 20번째의 Val을 Leu로, 38번째의 Arg를 Lys로, 48번째의 Met를 Ile로, 및 67번째의 Arg를 Lys로 치환한 아미노산 배열
(4) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg를 Lys로, 40번째의 Ala를 Arg로, 48번째의 Met를 Ile로, 및 67번째의 Arg를 Lys로 치환한 아미노산 배열
(5) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg를 Lys로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 및 68번째의 Val을 Ala로 치환한 아미노산 배열
(6) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg를 Lys로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 및 70번째의 Ile를 Leu로 치환한 아미노산 배열
(7) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg를 Lys로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 및 72번째의 Ala를 Val로 치환한 아미노산 배열
(8) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg를 Lys로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 및 98번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 배열
3개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 배열로는, 구체적으로는 예를 들어 이하의 (1) 내지 (9)의 아미노산 배열을 들 수 있다.
(1) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg를 Lys로, 48번째의 Met를 Ile로, 및 98번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 배열
(2) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 12번째의 Lys를 Val로, 38번째의 Arg를 Lys로, 및 48번째의 Met를 Ile로 치환한 아미노산 배열
(3) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 20번째의 Val을 Leu로, 38번째의 Arg를 Lys로, 및 48번째의 Met를 Ile로 치환한 아미노산 배열
(4) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg를 Lys로, 40번째의 Ala를 Arg로, 및 48번째의 Met를 Ile로 치환한 아미노산 배열
(5) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg를 Lys로, 48번째의 Met를 Ile로, 및 67번째의 Arg를 Lys로 치환한 아미노산 배열
(6) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg를 Lys로, 48번째의 Met를 Ile로, 및 68번째의 Val을 Ala로 치환한 아미노산 배열
(7) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg를 Lys로, 48번째의 Met를 Ile로, 및 70번째의 Ile를 Leu로 치환한 아미노산 배열
(8) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg를 Lys로, 48번째의 Met를 Ile로, 및 72번째의 Ala를 Val로 치환한 아미노산 배열
(9) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg를 Lys로, 48번째의 Met를 Ile로, 및 74번째의 Thr을 Lys로 치환한 아미노산 배열
2개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 배열로는, 구체적으로는 예를 들어 이하의 (1) 내지 (21)의 아미노산 배열을 들 수 있다.
(1) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 12번째의 Lys를 Val로, 및 38번째의 Arg를 Lys로 치환한 아미노산 배열
(2) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 20번째의 Val을 Leu로, 및 38번째의 Arg를 Lys로 치환한 아미노산 배열
(3) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg를 Lys로, 및 40번째의 Ala를 Arg로 치환한 아미노산 배열
(4) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg를 Lys로, 및 48번째의 Met를 Ile로 치환한 아미노산 배열
(5) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg를 Lys로, 및 67번째의 Arg를 Lys로 치환한 아미노산 배열
(6) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg를 Lys로, 및 68번째의 Val을 Ala로 치환한 아미노산 배열
(7) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg를 Lys로, 및 70번째의 Ile를 Leu로 치환한 아미노산 배열
(8) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg를 Lys로, 및 72번째의 Ala를 Val로 치환한 아미노산 배열
(9) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg를 Lys로, 및 74번째의 Thr을 Lys로 치환한 아미노산 배열
(10) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg를 Lys로, 및 98번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 배열
(11) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg를 Lys로, 및 113번째의 Val을 Leu로 치환한 아미노산 배열
(12) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 12번째의 Lys를 Val로, 및 48번째의 Met를 Ile로 치환한 아미노산 배열
(13) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 20번째의 Val을 Leu로, 및 48번째의 Met를 Ile로 치환한 아미노산 배열
(14) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 40번째의 Ala를 Arg로, 및 48번째의 Met를 Ile로 치환한 아미노산 배열
(15) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 48번째의 Met를 Ile로, 및 67번째의 Arg를 Lys로 치환한 아미노산 배열
(16) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 48번째의 Met를 Ile로, 및 68번째의 Val을 Ala로 치환한 아미노산 배열
(17) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 48번째의 Met를 Ile로, 및 70번째의 Ile를 Leu로 치환한 아미노산 배열
(18) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 48번째의 Met를 Ile로, 및 72번째의 Ala를 Val로 치환한 아미노산 배열
(19) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 48번째의 Met를 Ile로, 및 74번째의 Thr을 Lys로 치환한 아미노산 배열
(20) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 48번째의 Met를 Ile로, 및 98번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 배열
(21) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 48번째의 Met를 Ile로, 및 113번째의 Val을 Leu로 치환한 아미노산 배열
1개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 배열로는, 구체적으로는 예를 들어 이하의 (1) 내지 (12)의 아미노산 배열을 들 수 있다.
(1) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 12번째의 Lys를 Val로 치환한 아미노산 배열
(2) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 20번째의 Val을 Leu로 치환한 아미노산 배열
(3) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 38번째의 Arg를 Lys로 치환한 아미노산 배열
(4) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 40번째의 Ala를 Arg로 치환한 아미노산 배열
(5) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 48번째의 Met를 Ile로 치환한 아미노산 배열
(6) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 67번째의 Arg를 Lys로 치환한 아미노산 배열
(7) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 68번째의 Val을 Ala로 치환한 아미노산 배열
(8) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 70번째의 Ile를 Leu로 치환한 아미노산 배열
(9) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 72번째의 Ala를 Val로 치환한 아미노산 배열
(10) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 74번째의 Thr을 Lys로 치환한 아미노산 배열
(11) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 98번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 배열
(12) 배열 번호 67의 아미노산 배열 중의 113번째의 Val을 Leu로 치환한 아미노산 배열
또한, 본 발명의 인간화 항체에 포함되는 VL로는, 이하의 (1) 내지 (6)이 바람직하다.
(1) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 11번째의 Leu, 13번째의 Ala, 15번째의 Val, 36번째의 Tyr, 43번째의 Ala, 44번째의 Pro, 46번째의 Leu, 71번째의 Phe 및 85번째의 Thr이 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 배열을 포함하는 VL
(2) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 11번째의 Leu, 15번째의 Val, 36번째의 Tyr, 44번째의 Pro, 46번째의 Leu, 71번째의 Phe 및 85번째의 Thr이 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 배열을 포함하는 VL
(3) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 15번째의 Val, 36번째의 Tyr, 44번째의 Pro, 46번째의 Leu, 71번째의 Phe 및 85번째의 Thr이 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 배열을 포함하는 VL
(4) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 36번째의 Tyr, 43번째의 Ala, 44번째의 Pro, 46번째의 Leu 및 85번째의 Thr이 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 배열을 포함하는 VL
(5) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 15번째의 Val, 36번째의 Tyr, 46번째의 Leu 및 71번째의 Phe가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 배열을 포함하는 VL
(6) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 36번째의 Tyr 및 44번째의 Pro가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 배열을 포함하는 VL
상기 VL의 아미노산 배열로는, 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 11번째의 Leu를 Met로, 13번째의 Ala를 Val로, 15번째의 Val을 Leu로, 36번째의 Tyr을 Leu로, 43번째의 Ala를 Ser로, 44번째의 Pro를 Phe로, 46번째의 Leu를 Gly로, 71번째의 Phe를 Tyr로, 및 85번째의 Thr을 Asp로 치환하는 개변에서 선택되는 적어도 1개의 개변이 도입된 아미노산 배열을 들 수 있다.
9개의 개변이 도입된 VL의 아미노산 배열로는, 구체적으로는 예를 들어 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 11번째의 Leu를 Met로, 13번째의 Ala를 Val로, 15번째의 Val을 Leu로, 36번째의 Tyr을 Leu로, 43번째의 Ala를 Ser로, 44번째의 Pro를 Phe로, 46번째의 Leu를 Gly로, 71번째의 Phe를 Tyr로, 및 85번째의 Thr을 Asp로 치환한 아미노산 배열을 들 수 있다.
8개의 개변이 도입된 VL의 아미노산 배열로는, 구체적으로는 예를 들어 이하의 (1) 내지 (9)의 아미노산 배열을 들 수 있다.
(1) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 13번째의 Ala를 Val로, 15번째의 Val을 Leu로, 36번째의 Tyr을 Leu로, 43번째의 Ala를 Ser로, 44번째의 Pro를 Phe로, 46번째의 Leu를 Gly로, 71번째의 Phe를 Tyr로, 및 85번째의 Thr을 Asp로 치환한 아미노산 배열
(2) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 11번째의 Leu를 Met로, 15번째의 Val을 Leu로, 36번째의 Tyr을 Leu로, 43번째의 Ala를 Ser로, 44번째의 Pro를 Phe로, 46번째의 Leu를 Gly로, 71번째의 Phe를 Tyr로, 및 85번째의 Thr을 Asp로 치환한 아미노산 배열
(3) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 11번째의 Leu를 Met로, 13번째의 Ala를 Val로, 36번째의 Tyr을 Leu로, 43번째의 Ala를 Ser로, 44번째의 Pro를 Phe로, 46번째의 Leu를 Gly로, 71번째의 Phe를 Tyr로, 및 85번째의 Thr을 Asp로 치환한 아미노산 배열
(4) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 11번째의 Leu를 Met로, 13번째의 Ala를 Val로, 15번째의 Val을 Leu로, 43번째의 Ala를 Ser로, 44번째의 Pro를 Phe로, 46번째의 Leu를 Gly로, 71번째의 Phe를 Tyr로, 및 85번째의 Thr을 Asp로 치환한 아미노산 배열
(5) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 11번째의 Leu를 Met로, 13번째의 Ala를 Val로, 15번째의 Val을 Leu로, 36번째의 Tyr을 Leu로, 44번째의 Pro를 Phe로, 46번째의 Leu를 Gly로, 71번째의 Phe를 Tyr로, 및 85번째의 Thr을 Asp로 치환한 아미노산 배열
(6) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 11번째의 Leu를 Met로, 13번째의 Ala를 Val로, 15번째의 Val을 Leu로, 36번째의 Tyr을 Leu로, 43번째의 Ala를 Ser로, 46번째의 Leu를 Gly로, 71번째의 Phe를 Tyr로, 및 85번째의 Thr을 Asp로 치환한 아미노산 배열
(7) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 11번째의 Leu를 Met로, 13번째의 Ala를 Val로, 15번째의 Val을 Leu로, 36번째의 Tyr을 Leu로, 43번째의 Ala를 Ser로, 44번째의 Pro를 Phe로, 71번째의 Phe를 Tyr로, 및 85번째의 Thr을 Asp로 치환한 아미노산 배열
(8) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 11번째의 Leu를 Met로, 13번째의 Ala를 Val로, 15번째의 Val을 Leu로, 36번째의 Tyr을 Leu로, 43번째의 Ala를 Ser로, 44번째의 Pro를 Phe로, 46번째의 Leu를 Gly로, 및 85번째의 Thr을 Asp로 치환한 아미노산 배열
(9) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 11번째의 Leu를 Met로, 13번째의 Ala를 Val로, 15번째의 Val을 Leu로, 36번째의 Tyr을 Leu로, 43번째의 Ala를 Ser로, 44번째의 Pro를 Phe로, 46번째의 Leu를 Gly로, 및 71번째의 Phe를 Tyr로 치환한 아미노산 배열
7개의 개변이 도입된 VL의 아미노산 배열로는, 구체적으로는 예를 들어 이하의 (1) 내지 (9)의 아미노산 배열을 들 수 있다.
(1) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 11번째의 Leu를 Met로, 15번째의 Val을 Leu로, 36번째의 Tyr을 Leu로, 44번째의 Pro를 Phe로, 46번째의 Leu를 Gly로, 71번째의 Phe를 Tyr로, 및 85번째의 Thr을 Asp로 치환한 아미노산 배열
(2) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 15번째의 Val을 Leu로, 36번째의 Tyr을 Leu로, 43번째의 Ala를 Ser로, 44번째의 Pro를 Phe로, 46번째의 Leu를 Gly로, 71번째의 Phe를 Tyr로, 및 85번째의 Thr을 Asp로 치환한 아미노산 배열
(3) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 11번째의 Leu를 Met로, 36번째의 Tyr을 Leu로, 43번째의 Ala를 Ser로, 44번째의 Pro를 Phe로, 46번째의 Leu를 Gly로, 71번째의 Phe를 Tyr로, 및 85번째의 Thr을 Asp로 치환한 아미노산 배열
(4) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 11번째의 Leu를 Met로, 15번째의 Val을 Leu로, 43번째의 Ala를 Ser로, 44번째의 Pro를 Phe로, 46번째의 Leu를 Gly로, 71번째의 Phe를 Tyr로, 및 85번째의 Thr을 Asp로 치환한 아미노산 배열
(5) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 11번째의 Leu를 Met로, 15번째의 Val을 Leu로, 36번째의 Tyr을 Leu로, 44번째의 Pro를 Phe로, 46번째의 Leu를 Gly로, 71번째의 Phe를 Tyr로, 및 85번째의 Thr을 Asp로 치환한 아미노산 배열
(6) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 11번째의 Leu를 Met로, 15번째의 Val을 Leu로, 36번째의 Tyr을 Leu로, 43번째의 Ala를 Ser로, 46번째의 Leu를 Gly로, 71번째의 Phe를 Tyr로, 및 85번째의 Thr을 Asp로 치환한 아미노산 배열
(7) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 11번째의 Leu를 Met로, 15번째의 Val을 Leu로, 36번째의 Tyr을 Leu로, 43번째의 Ala를 Ser로, 44번째의 Pro를 Phe로, 71번째의 Phe를 Tyr로, 및 85번째의 Thr을 Asp로 치환한 아미노산 배열
(8) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 11번째의 Leu를 Met로, 15번째의 Val을 Leu로, 36번째의 Tyr을 Leu로, 43번째의 Ala를 Ser로, 44번째의 Pro를 Phe로, 46번째의 Leu를 Gly로, 및 85번째의 Thr을 Asp로 치환한 아미노산 배열
(9) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 11번째의 Leu를 Met로, 15번째의 Val을 Leu로, 36번째의 Tyr을 Leu로, 43번째의 Ala를 Ser로, 44번째의 Pro를 Phe로, 46번째의 Leu를 Gly로, 및 71번째의 Phe를 Tyr로 치환한 아미노산 배열
6개의 개변이 도입된 VL의 아미노산 배열로는, 구체적으로는 예를 들어 이하의 (1) 내지 (6)의 아미노산 배열을 들 수 있다.
(1) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 15번째의 Val을 Leu로, 36번째의 Tyr을 Leu로, 44번째의 Pro를 Phe로, 46번째의 Leu를 Gly로, 71번째의 Phe를 Tyr로, 및 85번째의 Thr을 Asp로 치환한 아미노산 배열
(2) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 36번째의 Tyr을 Leu로, 43번째의 Ala를 Ser로, 44번째의 Pro를 Phe로, 46번째의 Leu를 Gly로, 71번째의 Phe를 Tyr로, 및 85번째의 Thr을 Asp로 치환한 아미노산 배열
(3) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 15번째의 Val을 Leu로, 36번째의 Tyr을 Leu로, 43번째의 Ala를 Ser로, 44번째의 Pro를 Phe로, 46번째의 Leu를 Gly로, 및 85번째의 Thr을 Asp로 치환한 아미노산 배열
(4) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 11번째의 Leu를 Met로, 36번째의 Tyr을 Leu로, 44번째의 Pro를 Phe로, 46번째의 Leu를 Gly로, 71번째의 Phe를 Tyr로, 및 85번째의 Thr을 Asp로 치환한 아미노산 배열
(5) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 11번째의 Leu를 Met로, 36번째의 Tyr을 Leu로, 43번째의 Ala를 Ser로, 44번째의 Pro를 Phe로, 46번째의 Leu를 Gly로, 및 85번째의 Thr을 Asp로 치환한 아미노산 배열
(6) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 11번째의 Leu를 Met로, 13번째의 Ala를 Val로, 36번째의 Tyr을 Leu로, 44번째의 Pro를 Phe로, 46번째의 Leu를 Gly로, 및 85번째의 Thr을 Asp로 치환한 아미노산 배열
5개의 개변이 도입된 VL의 아미노산 배열로는, 구체적으로는 예를 들어 이하의 (1) 내지 (7)의 아미노산 배열을 들 수 있다.
(1) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 36번째의 Tyr을 Leu로, 43번째의 Ala를 Ser로, 44번째의 Pro를 Phe로, 46번째의 Leu를 Gly로, 및 85번째의 Thr을 Asp로 치환한 아미노산 배열
(2) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 15번째의 Val을 Leu로, 36번째의 Tyr을 Leu로, 43번째의 Ala를 Ser로, 44번째의 Pro를 Phe로, 및 46번째의 Leu를 Gly로 치환한 아미노산 배열
(3) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 15번째의 Val을 Leu로, 36번째의 Tyr을 Leu로, 44번째의 Pro를 Phe로, 46번째의 Leu를 Gly로, 및 71번째의 Phe를 Tyr로 치환한 아미노산 배열
(4) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 15번째의 Val을 Leu로, 36번째의 Tyr을 Leu로, 44번째의 Pro를 Phe로, 46번째의 Leu를 Gly로, 및 85번째의 Thr을 Asp로 치환한 아미노산 배열
(5) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 36번째의 Tyr을 Leu로, 43번째의 Ala를 Ser로, 44번째의 Pro를 Phe로, 46번째의 Leu를 Gly로, 및 71번째의 Phe를 Tyr로 치환한 아미노산 배열
(6) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 36번째의 Tyr을 Leu로, 43번째의 Ala를 Ser로, 44번째의 Pro를 Phe로, 46번째의 Leu를 Gly로, 및 85번째의 Thr을 Asp로 치환한 아미노산 배열
(7) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 36번째의 Tyr을 Leu로, 44번째의 Pro를 Phe로, 46번째의 Leu를 Gly로, 71번째의 Phe를 Tyr로, 및 85번째의 Thr을 Asp로 치환한 아미노산 배열
4개의 개변이 도입된 VL의 아미노산 배열로는, 구체적으로는 예를 들어 이하의 (1) 내지 (10)의 아미노산 배열을 들 수 있다.
(1) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 15번째의 Val을 Leu로, 36번째의 Tyr을 Leu로, 46번째의 Leu를 Gly로, 및 71번째의 Phe를 Tyr로 치환한 아미노산 배열
(2) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 15번째의 Val을 Leu로, 36번째의 Tyr을 Leu로, 44번째의 Pro를 Phe로, 및 46번째의 Leu를 Gly로 치환한 아미노산 배열
(3) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 15번째의 Val을 Leu로, 36번째의 Tyr을 Leu로, 44번째의 Pro를 Phe로, 및 71번째의 Phe를 Tyr로 치환한 아미노산 배열
(4) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 15번째의 Val을 Leu로, 36번째의 Tyr을 Leu로, 44번째의 Pro를 Phe로, 및 85번째의 Thr을 Asp로 치환한 아미노산 배열
(5) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 15번째의 Val을 Leu로, 36번째의 Tyr을 Leu로, 46번째의 Leu를 Gly로, 및 85번째의 Thr을 Asp로 치환한 아미노산 배열
(6) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 15번째의 Val을 Leu로, 36번째의 Tyr을 Leu로, 71번째의 Phe를 Tyr로, 및 85번째의 Thr을 Asp로 치환한 아미노산 배열
(7) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 36번째의 Tyr을 Leu로, 44번째의 Pro를 Phe로, 46번째의 Leu를 Gly로, 및 71번째의 Phe를 Tyr로 치환한 아미노산 배열
(8) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 36번째의 Tyr을 Leu로, 44번째의 Pro를 Phe로, 46번째의 Leu를 Gly로, 및 85번째의 Thr을 Asp로 치환한 아미노산 배열
(9) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 36번째의 Tyr을 Leu로, 44번째의 Pro를 Phe로, 71번째의 Phe를 Tyr로, 및 85번째의 Thr을 Asp로 치환한 아미노산 배열
(10) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 36번째의 Tyr을 Leu로, 46번째의 Leu를 Gly로, 71번째의 Phe를 Tyr로, 및 85번째의 Thr을 Asp로 치환한 아미노산 배열
3개의 개변이 도입된 VL의 아미노산 배열로는, 구체적으로는 예를 들어 이하의 (1) 내지 (7)의 아미노산 배열을 들 수 있다.
(1) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 11번째의 Leu를 Met로, 36번째의 Tyr을 Leu로, 및 44번째의 Pro를 Phe로 치환한 아미노산 배열
(2) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 13번째의 Ala를 Val로, 36번째의 Tyr을 Leu로, 및 44번째의 Pro를 Phe로 치환한 아미노산 배열
(3) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 15번째의 Val을 Leu로, 36번째의 Tyr을 Leu로, 및 44번째의 Pro를 Phe로 치환한 아미노산 배열
(4) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 36번째의 Tyr을 Leu로, 43번째의 Ala를 Ser로, 및 44번째의 Pro를 Phe로 치환한 아미노산 배열
(5) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 36번째의 Tyr을 Leu로, 44번째의 Pro를 Phe로, 및 46번째의 Leu를 Gly로 치환한 아미노산 배열
(6) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 36번째의 Tyr을 Leu로, 44번째의 Pro를 Phe로, 및 71번째의 Phe를 Tyr로 치환한 아미노산 배열
(7) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 36번째의 Tyr을 Leu로, 44번째의 Pro를 Phe로, 및 85번째의 Thr을 Asp로 치환한 아미노산 배열
2개의 개변이 도입된 VL의 아미노산 배열로는, 구체적으로는 예를 들어 이하의 (1) 내지 (15)의 아미노산 배열을 들 수 있다.
(1) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 36번째의 Tyr을 Leu로, 및 44번째의 Pro를 Phe로 치환한 아미노산 배열
(2) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 11번째의 Leu를 Met로, 및 36번째의 Tyr을 Leu로 치환한 아미노산 배열
(3) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 13번째의 Ala를 Val로, 및 36번째의 Tyr을 Leu로 치환한 아미노산 배열
(4) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 15번째의 Val을 Leu로, 및 36번째의 Tyr을 Leu로 치환한 아미노산 배열
(5) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 36번째의 Tyr을 Leu로, 및 43번째의 Ala를 Ser로 치환한 아미노산 배열
(6) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 36번째의 Tyr을 Leu로, 및 46번째의 Leu를 Gly로 치환한 아미노산 배열
(7) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 36번째의 Tyr을 Leu로, 및 71번째의 Phe를 Tyr로 치환한 아미노산 배열
(8) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 36번째의 Tyr을 Leu로, 및 85번째의 Thr을 Asp로 치환한 아미노산 배열
(9) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 11번째의 Leu를 Met로, 및 44번째의 Pro를 Phe로 치환한 아미노산 배열
(10) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 13번째의 Ala를 Val로, 및 44번째의 Pro를 Phe로 치환한 아미노산 배열
(11) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 15번째의 Val을 Leu로, 및 44번째의 Pro를 Phe로 치환한 아미노산 배열
(12) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 43번째의 Ala를 Ser로, 및 44번째의 Pro를 Phe로 치환한 아미노산 배열
(13) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 44번째의 Pro를 Phe로, 및 46번째의 Leu를 Gly로 치환한 아미노산 배열
(14) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 44번째의 Pro를 Phe로, 및 71번째의 Phe를 Tyr로 치환한 아미노산 배열
(15) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 44번째의 Pro를 Phe로, 및 85번째의 Thr을 Asp로 치환한 아미노산 배열
1개의 개변이 도입된 VL의 아미노산 배열로는, 구체적으로는 예를 들어 이하의 (1) 내지 (9)의 아미노산 배열을 들 수 있다.
(1) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 11번째의 Leu를 Met로 치환한 아미노산 배열
(2) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 13번째의 Ala를 Val로 치환한 아미노산 배열
(3) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 15번째의 Val을 Leu로 치환한 아미노산 배열
(4) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 36번째의 Tyr을 Leu로 치환한 아미노산 배열
(5) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 43번째의 Ala를 Ser로 치환한 아미노산 배열
(6) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 44번째의 Pro를 Phe로 치환한 아미노산 배열
(7) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 46번째의 Leu를 Gly로 치환한 아미노산 배열
(8) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 71번째의 Phe를 Tyr로 치환한 아미노산 배열
(9) 배열 번호 69의 아미노산 배열 중의 85번째의 Thr을 Asp로 치환한 아미노산 배열
또한, 본 발명의 인간화 항체의 구체예로는, 항체의 VH가 배열 번호 67 및/또는 항체의 VL이 배열 번호 69의 아미노산 배열을 포함하는 인간화 항체, 항체의 VH가 배열 번호 67 및/또는 항체의 VL이 도 2에서 나타내는 어느 하나의 아미노산 배열을 포함하는 인간화 항체, 또는 항체의 VH가 도 1에서 나타내는 어느 하나의 아미노산 배열 및/또는 항체의 VL이 배열 번호 69의 아미노산 배열을 포함하는 인간화 항체 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 인간화 항체로는, 본 발명의 모노클로날 항체와 경합하여 인간 TIM-3의 세포외 영역의 아미노산 배열 또는 그의 입체 구조에 결합하는 인간화 항체 및 상술한 인간화 항체가 결합하는 인간 TIM-3의 세포외 영역 상에 존재하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 인간화 항체를 들 수 있다.
인간 항체는, 원래 인간 체내에 천연으로 존재하는 항체를 말하지만, 최근의 유전자 공학적, 세포 공학적, 발생 공학적인 기술의 진보에 의해 제조된 인간 항체 파지 라이브러리 및 인간 항체 생산 형질전환 동물로부터 얻어지는 항체 등도 포함된다.
인간 체내에 천연으로 존재하는 항체는, 예를 들어 인간 말초혈 림프구를 단리하고, EB 바이러스 등을 감염시켜 불사화하고 클로닝함으로써 상기 항체를 생산하는 림프구를 배양할 수 있고, 배양 상청 중으로부터 상기 항체를 정제할 수 있다.
인간 항체 파지 라이브러리는, 인간 B 세포로부터 조제한 항체 유전자를 파지 유전자에 삽입함으로써 Fab, scFv 등의 항체 단편을 파지 표면에 발현시킨 라이브러리이다. 상기 라이브러리로부터, 항원을 고정화한 기질에 대한 결합 활성을 지표로 해서 원하는 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편을 표면에 발현하고 있는 파지를 회수할 수 있다. 상기 항체 단편은, 또한 유전자 공학적 방법에 의해 2개의 완전한 H쇄 및 2개의 완전한 L쇄를 포함하는 인간 항체 분자로도 변환할 수 있다.
인간 항체 생산 형질전환 동물은, 인간 항체 유전자가 세포 내에 내장된 동물을 의미한다. 구체적으로는, 예를 들어 마우스 ES 세포에 인간 항체 유전자를 도입하고, 상기 ES 세포를 마우스의 초기 배에 이식한 후, 발생시킴으로써 인간 항체 생산 형질전환 마우스를 제조할 수 있다. 인간 항체 생산 형질전환 동물로부터의 인간 항체는, 통상의 인간 이외의 동물에서 행해지고 있는 하이브리도마 제조 방법을 사용하여 인간 항체 생산 하이브리도마를 취득하고 배양하는 것으로 배양 상청 중에 인간 항체를 생산 축적시킴으로써 제조할 수 있다.
상술한 항체 또는 항체 단편을 구성하는 아미노산 배열에 있어서 1개 이상의 아미노산이 결실, 부가, 치환 또는 삽입되고, 상술한 항체 또는 그 항체 단편과 마찬가지의 활성을 갖는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편도, 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편에 포함된다.
결실, 치환, 삽입 및/또는 부가되는 아미노산의 수는 1개 이상이며, 그 수는 특별히 한정되지 않지만, 부위 특이적 변이 도입법 [Molecular Cloning 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Current Protocols inmolecular Biology, John Wiley & Sons(1987-1997); Nucleic Acids Research, 10, 6487(1982); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982); Gene, 34, 315(1985); Nucleic Acids Research, 13, 4431(1985); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488(1985)] 등의 주지의 기술에 의해, 결실, 치환 또는 부가할 수 있을 정도의 수다. 예를 들어, 바람직하게는 1 내지 수십개, 보다 바람직하게는 1 내지 20개, 더욱 바람직하게는 1 내지 10개, 특히 바람직하게는 1 내지 5개다.
상기의 항체의 아미노산 배열에 있어서 1개 이상의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 또는 부가되었다는 것은, 다음의 경우를 나타낸다. 즉, 동일 배열 중의 임의이며 하나 또는 복수인 아미노산 배열 중에서, 하나 또는 복수의 아미노산 잔기의 결실, 치환, 삽입 또는 부가가 있는 것을 의미한다. 또한, 결실, 치환, 삽입 또는 부가가 동시에 발생하는 경우도 있고, 치환, 삽입 또는 부가되는 아미노산 잔기는 천연형과 비천연형 모두의 경우도 있다.
천연형 아미노산 잔기로는, 예를 들어 L-알라닌, L-아스파라긴, L-아스파라긴산, L-글루타민, L-글루타민산, 글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-류신, L-라이신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린, 또는 L-시스테인 등을 들 수 있다.
이하에, 서로 치환 가능한 아미노산 잔기의 바람직한 예를 나타낸다. 동일 군에 포함되는 아미노산 잔기는 서로 치환 가능하다.
A군:류신, 이소류신, 노르류신, 발린, 노르발린, 알라닌, 2-아미노부탄산, 메티오닌, O-메틸세린, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 시클로헥실알라닌
B군:아스파라긴산, 글루타민산, 이소아스파라긴산, 이소글루타민산, 2-아미노아디프산, 2-아미노수베린산
C군:아스파라긴, 글루타민
D군:라이신, 아르기닌, 오르니틴, 2,4-디아민부탄산, 2,3-디아미노프로피온산
E군:프롤린, 3-히드록시프롤린, 4-히드록시프롤린
F군:세린, 트레오닌, 호모세린
g군:페닐알라닌, 티로신
본 발명에서, 항체 단편으로는, Fab, F(ab')2, Fab', 단일쇄 항체(scFv), 2량체화 V 영역(diabody), 디술피드 안정화 V 영역(dsFv) 및 CDR을 포함하는 펩티드 등을 들 수 있다.
Fab는, IgG를 단백질 분해 효소인 파파인으로 처리해서 얻어지는 단편 중(H쇄의 224번째의 아미노산 잔기에서 절단됨), H쇄의 N 말단측 약 절반과 L쇄 전체가 디술피드 결합으로 결합한 분자량 약 5만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.
본 발명의 Fab는, 인간 TIM-3을 특이적으로 인식하며 상기 세포외 영역의 아미노산 배열 또는 그의 입체 구조에 결합하는 모노클로날 항체를 파파인으로 처리해서 얻을 수 있다. 또한, 상기 항체의 Fab를 코딩하는 DNA를 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하여, 상기 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜서 Fab를 제조할 수도 있다.
F(ab')2는, IgG의 힌지 영역의 2개의 디술피드 결합의 하부를 단백질 분해 효소인 펩신으로 분해해서 얻어진, 2개의 Fab 영역이 힌지 부분에서 결합하여 구성된 분자량 약 10만의 항원 결합 활성을 갖는 단편이다.
본 발명의 F(ab')2는, 인간 TIM-3을 특이적으로 인식하며 상기 세포외 영역의 아미노산 배열 또는 그의 입체 구조에 결합하는 모노클로날 항체를 펩신으로 처리해서 얻을 수 있다. 또한, 하기의 Fab'를 티오에테르 결합 또는 디술피드 결합시켜서 제조할 수도 있다.
Fab'는, 상기 F(ab')2의 힌지 영역의 디술피드 결합을 절단한 분자량 약 5만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. 본 발명의 Fab'는, 본 발명의 인간 TIM-3을 특이적으로 인식하며 상기 세포외 영역의 아미노산 배열 또는 그의 입체 구조에 결합하는 F(ab')2를 디티오트레이톨 등의 환원제로 처리해서 얻을 수 있다. 또한, 상기 항체의 Fab' 단편을 코딩하는 DNA를 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하여, 상기 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜서 Fab'를 제조할 수도 있다.
scFv는, 1개의 VH와 1개의 VL을 적당한 펩티드 링커(이하, P라고 표기함)를 사용하여 연결한 VH-P-VL 또는 VL-P-VH 폴리펩티드에서 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.
본 발명의 scFv는, 본 발명의 인간 TIM-3을 특이적으로 인식하며 상기 세포외 영역의 아미노산 배열 또는 그의 입체 구조에 결합하는 모노클로날 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA를 취득하여, scFv를 코딩하는 DNA를 구축하고, 상기 DNA를 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하여, 상기 발현 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜서 제조할 수 있다.
diabody는, scFv가 2량체화한 항체 단편으로, 2가의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. 2가의 항원 결합 활성은 동일할 수도 있고, 한쪽을 상이한 항원 결합 활성으로 할 수도 있다.
본 발명의 diabody는, 본 발명의 인간 TIM-3을 특이적으로 인식하며 상기 세포외 영역의 아미노산 배열 또는 그의 입체 구조에 결합하는 모노클로날 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA를 취득하여, scFv를 코딩하는 DNA를 펩티드 링커의 아미노산 배열의 길이가 8 잔기 이하로 되도록 구축하고, 상기 DNA를 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하여, 상기 발현 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜서 제조할 수 있다.
dsFv는, VH 및 VL 중의 각각 1 아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 치환한 폴리펩티드를 상기 시스테인 잔기간의 디술피드 결합을 통해서 결합시킨 것을 말한다. 시스테인 잔기로 치환하는 아미노산 잔기는 기지의 방법 [Protein Engineering, 7, 697(1994)]에 따라서 항체의 입체 구조 예측에 기초하여 선택할 수 있다.
본 발명의 dsFv는, 본 발명의 인간 TIM-3을 특이적으로 인식하며 상기 세포외 영역의 아미노산 배열 또는 그의 입체 구조에 결합하는 모노클로날 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA를 취득하여, dsFv를 코딩하는 DNA를 구축하고, 상기 DNA를 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하여, 상기 발현 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜서 제조할 수 있다.
CDR을 포함하는 펩티드는, VH 또는 VL의 CDR의 적어도 1 영역 이상을 포함해서 구성된다. 복수의 CDR을 포함하는 펩티드는, 직접 또는 적당한 펩티드 링커를 통해서 결합시킬 수 있다.
본 발명의 CDR을 포함하는 펩티드는, 본 발명의 인간 TIM-3을 특이적으로 인식하며 상기 세포외 영역의 아미노산 배열 또는 그의 입체 구조에 결합하는 모노클로날 항체의 VH 및 VL의 CDR을 코딩하는 DNA를 구축하고, 상기 DNA를 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하여, 상기 발현 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜서 제조할 수 있다. 또한, CDR을 포함하는 펩티드는, Fmoc법 또는 tBoc법 등의 화학 합성법에 의해 제조할 수도 있다.
본 발명의 모노클로날 항체에는, 본 발명의 인간 TIM-3의 세포외 영역의 아미노산 배열 또는 그의 입체 구조를 특이적으로 인식하며 상기 세포외 영역에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편에 방사성 동위 원소, 저분자 약제, 고분자 약제, 단백질 또는 항체 의약 등을 화학적 또는 유전자 공학적으로 결합시킨 항체의 유도체를 포함한다.
본 발명에서의 항체의 유도체는, 본 발명의 인간 TIM-3의 세포외 영역의 아미노산 배열 또는 그의 입체 구조를 특이적으로 인식하며 상기 세포외 영역에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편의 H쇄 또는 L쇄의 N 말단측 또는 C 말단측, 항체 또는 그 항체 단편 중의 적당한 치환기 또는 측쇄, 나아가 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편 중의 당쇄 등에, 방사성 동위 원소, 저분자 약제, 고분자 약제, 면역 부활제, 단백질 또는 항체 의약 등을 화학적 방법 [항체 공학 입문, 치진쇼칸(1994)]에 의해 결합시킴으로써 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 인간 TIM-3의 세포외 영역의 아미노산 배열 또는 그의 입체 구조를 특이적으로 인식하며 상기 세포외 영역에 결합하는 모노클로날 항체 또는 항체 단편을 코딩하는 DNA와, 결합시키고자 하는 단백질 또는 항체 의약을 코딩하는 DNA를 연결시켜서 발현 벡터에 삽입하고, 상기 발현 벡터를 적당한 숙주 세포에 도입하여 발현시키는 유전자 공학적 방법으로 제조할 수 있다.
방사성 동위 원소로는, 예를 들어 131I, 125I, 90Y, 64Cu, 99Tc, 77Lu 또는 211At 등을 들 수 있다. 방사성 동위 원소는, 클로라민 T법 등에 의해 항체에 직접 결합시킬 수 있다. 또한, 방사성 동위 원소를 킬레이트하는 물질을 항체에 결합시킬 수도 있다. 킬레이트제로는, 1-이소티오시아네이트벤질-3-메틸디에틸렌트리아민펜타아세트산(MX-DTPA) 등을 들 수 있다.
저분자 약제로는, 예를 들어 알킬화제, 니트로소우레아제, 대사 길항제, 항생 물질, 식물 알칼로이드, 토포이소머라아제 저해제, 호르몬 요법제, 호르몬 길항제, 아로마타제 저해제, P당 단백 저해제, 백금 착체 유도체, M기 저해제 또는 키나아제 저해제 등의 항암제[임상 종양학, 암과 화학 요법사(1996)], 또는 하이드로코르티손, 프레드니손 등의 스테로이드제, 아스피린, 인도메타신 등의 비스테로이드제, 금 티오말레이트, 페니실라민 등의 면역 조절제, 사이클로포스파미드, 아자티오푸린 등의 면역 억제제, 말레인산클로로페닐아민 또는 클레마스틴과 같은 항히스타민제 등의 항염증제[염증과 항염증 요법, 이시야쿠 출판 주식회사(1982)] 등을 들 수 있다.
항암제로는, 예를 들어 아미포스틴(에티올), 시스플라틴, 다카바진(DTIC), 닥티노마이신, 메클로레타민(나이트로젠 머스터드), 스토렙토조신, 시클로포스파미드, 이포스파미드, 카르무스틴(BCNU), 로무스틴(CCNU), 독소르비신(아드리아마이신), 에피루비신, 겜시타빈(겜자르), 다우노루비신, 프로카르바진, 마이토마이신, 시타라빈, 에토포시드, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 플루오로우라실, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 블레오마이신, 다우노마이신, 페플로마이신, 에스트라무스틴, 파클리탁셀(탁솔), 도세탁셀(탁소티어), 알데스류킨, 아스파라기나아제, 부술판, 카르보플라틴, 옥살리플라틴, 네다플라틴, 클라드리빈, 캄프토테신, 10-히드록시-7-에틸-캄프토테신(SN38), 플록수리딘, 플루다라빈, 히드록시우레아, 이포스파미드, 이다루비신, 메스나, 이리노테칸(CPT-11), 노기테칸, 미톡산트론, 토포테칸, 루플로라이드, 메게스트롤, 멜파란, 메르캅토푸린, 히드록시카르바미드, 플리카마이신, 미토탄, 페가스파르가제, 펜토스타틴, 피포브로만, 스토렙토조신, 타목시펜, 고세렐린, 류프로렐린, 플루타미드, 테니포시드, 테스토락톤, 티오구아닌, 티오테파, 우라실머스터드, 비노렐빈, 클로람부실, 하이드로코르티손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 빈데신, 니무스틴, 세무스틴, 카페시타빈, 토무덱스, 아자시티딘, UFT, 옥살로플라틴, 게피티니브(이레사), 이마티니브(STI571), 엘로티니브, FMS 유사 티로신 키나아제 3(FMS-like-tyrosine kinase 3; Flt3) 저해제, 혈관 내피 성장 인자 수용체(Vascular endothelialgrowth factor receptor; VEGFR) 저해제, 섬유모세포 성장 인자 수용체(fibroblastgrowth factor receptor; FGFR) 저해제, 이레사, 타세바 등의 표피 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor; EGFR) 저해제, 라디시콜, 17-알릴아미노-17-데메톡시겔다나마이신, 라파마이신, 암사크린, 올 트랜스 레티노인산, 탈리도마이드, 아나스트로졸, 파드로졸, 레트로졸, 엑시메스탄, 금 티오말레이트, D-페니실라민, 부실라민, 아자티오푸린, 미조리빈, 시클로스포린, 라파마이신, 하이드로코르티손, 벡사로텐(타그레틴), 타목시펜, 덱사메타존, 프로게스틴류, 에스트로겐류, 아나스트로졸(아리미덱스), 류푸린, 아스피린, 인도메타신, 셀레콕시브, 아자티오푸린, 페니실라민, 금 티오말레이트, 말레인산클로로페닐아민, 클로로페닐아민, 클레마스틴, 트레티노인, 벡사로텐, 비소, 보르테조미브, 알로푸리놀, 칼리케아마이신, 이브리투모마브 튜세탄, 타르그레틴, 오조가민, 클라리스로마이신, 로이코보린, 이포스파미드, 케토코나졸, 아미노글루테티미드, 수라민, 메토트렉세이트, 마이탄시노이드, 또는 그의 유도체 등을 들 수 있다.
저분자 약제와 항체를 결합시키는 방법으로는, 예를 들어 글루타르알데히드를 통해 약제와 항체의 아미노기 사이를 결합시키는 방법, 또는 수용성 카르보디이미드를 통해 약제의 아미노기와 항체의 카르복실기를 결합시키는 방법 등을 들 수 있다.
고분자 약제로는, 예를 들어 폴리에틸렌글리콜(이하, PEG라고 표기함), 알부민, 덱스트란, 폴리옥시에틸렌, 스티렌 말레인산 코폴리머, 폴리비닐피롤리돈, 피란 코폴리머 또는 히드록시프로필메타크릴아미드 등을 들 수 있다. 이들 고분자 화합물을 항체 또는 항체 단편에 결합시킴으로써, (1) 화학적, 물리적 또는 생물적인 다양한 인자에 대한 안정성의 향상, (2) 혈중 반감기의 현저한 연장, (3) 면역원성의 소실 또는 항체 생산의 억제 등의 효과가 기대된다 [바이오 컨쥬게이트 의약품, 히로카와서점(1993)]. 예를 들어, PEG와 항체를 결합시키는 방법으로는, PEG화 수식 시약과 반응시키는 방법 등을 들 수 있다 [바이오 컨쥬게이트 의약품, 히로카와서점(1993)]. PEG화 수식 시약으로는, 라이신의 e-아미노기에 대한 수식제(일본 특허 출원 공개 (소)61-178926호 공보), 아스파라긴산 및 글루타민산의 카르복실기에 대한 수식제(일본 특허 출원 공개 (소)56-23587호 공보), 또는 아르기닌의 구아니디노기에 대한 수식제(일본 특허 출원 공개 (평)2-117920호 공보) 등을 들 수 있다.
면역 부활제로는, 예를 들어 면역 아쥬반트로서 알려져 있는 천연물일 수도 있고, 구체예로는 면역을 항진하는 약제, β(1→3)글루칸(렌티난, 시조피란), 또는 α갈락토실세라미드 등을 들 수 있다.
단백질로는, 예를 들어 NK 세포, 매크로파지 또는 호중구 등의 면역 담당 세포를 활성화하는 사이토카인 또는 증식 인자, 또는 독소 단백질 등을 들 수 있다.
사이토카인 또는 증식 인자로는, 예를 들어 IFNα, IFNβ, IFNγ, 인터로이킨(이하, IL이라고 기재함)-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립구/매크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 또는 매크로파지 콜로니 자극 인자(M-CSF) 등을 들 수 있다.
독소 단백질로는, 예를 들어 라이신, 디프테리아톡신 또는 ONTAK 등을 들 수 있고, 독성을 조절하기 위해 단백질에 변이를 도입한 단백 독소도 포함된다.
항체 의약으로는, 예를 들어 항체의 결합에 의해 아포토시스가 유도되는 항원, 종양의 병태 형성에 관계되는 항원 또는 면역 기능을 조절하는 항원, 병변 부위의 혈관 신생에 관여하는 항원에 대한 항체를 들 수 있다.
항체의 결합에 의해 아포토시스가 유도되는 항원으로는, 예를 들어 분화 클러스터(Cluster of differentiation; 이하, CD라고 기재함)19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80(B7.1), CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85, CD86(B7.2), 인간 류코사이트 항원(human leukocyte antigen; HLA)-클래스 II, 또는 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 등을 들 수 있다.
종양의 병태 형성에 관계되는 항원 또는 면역 기능을 조절하는 항체의 항원으로는, 예를 들어 CD40, CD40 리간드, B7 패밀리 분자(CD80, CD86, CD274, B7-DC, B7-H2, B7-H3, 또는 B7-H4), B7 패밀리 분자의 리간드(CD28, CTLA-4, ICOS, PD-1, 또는 BTLA), OX-40, OX-40 리간드, CD137, 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor; TNF) 수용체 패밀리 분자(DR4, DR5, TNFR1, 또는 TNFR2), TNF 관련 아포토시스 유발 리간드 수용체(TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor; TRAIL) 패밀리 분자, TRAIL 패밀리 분자의 수용체 패밀리(TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3, 또는 TRAIL-R4), 핵 인자 카파 B의 수용체 활성체(receptor activator of nuclear factor kappa B; RANK), RANK 리간드, CD-25, 엽산 수용체 4, 사이토카인[IL-1α, IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, 전환 성장 인자(transforminggrowth factor; TGF)β, 또는 TNFα 등], 이들 사이토카인의 수용체, 케모카인(SLC, ELC, I-309, TARC, MDC, 또는 CTACK 등), 또는 이들 케모카인의 수용체를 들 수 있다.
병변 부위의 혈관 신생을 저해하는 항체의 항원으로는, 예를 들어 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 안지오포이에틴, 섬유모세포 성장 인자(FGF), EGF, 혈소판 유도 성장 인자(platelet-derivedgrowth factor; PDGF), 인슐린 유사 성장 인자(insulin-likegrowth factor; IGF), 에리트로포이에틴(EPO), TGFβ, IL-8, 에필린, SDF-1, 또는 이들의 수용체 등을 들 수 있다.
단백질 또는 항체 의약과의 융합 항체는, 모노클로날 항체 또는 항체 단편을 코딩하는 cDNA에 단백질을 코딩하는 cDNA를 연결시켜, 융합 항체를 코딩하는 DNA를 구축하고, 상기 DNA를 원핵 생물 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하여, 상기 발현 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜서 융합 항체를 제조할 수 있다.
상기 항체의 유도체를 검출 방법, 정량 방법, 검출용 시약, 정량용 시약 또는 진단약으로서 사용할 경우에, 본 발명의 인간 TIM-3의 세포외 영역의 아미노산 배열 또는 그의 입체 구조를 특이적으로 인식하며 상기 세포외 영역에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편에 결합하는 약제로는, 통상의 면역학적 검출 또는 측정법에서 사용되는 표지체를 들 수 있다.
표지체로는, 예를 들어 알칼리 포스파타아제, 퍼옥시다아제 또는 루시페라아제 등의 효소, 아크리디늄에스테르 또는 로핀 등의 발광 물질, 또는 플루오레세인이소티오시아네이트(FITC) 또는 테트라메틸로다민이소티오시아네이트(RITC) 등의 형광 물질 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명은, 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 유효 성분으로서 함유하는 TIM-3 양성 세포가 관여하는 질환의 치료약에 관한 것이다.
TIM-3 양성 세포가 관여하는 질환으로는, TIM-3이 발현하고 있는 세포가 관여하는 질환이면 어떠한 것이라도 좋고, 예를 들어 암, 자가 면역 질환, 알레르기성 질환을 들 수 있다.
암으로는, 예를 들어 혈액암, 유방암, 자궁암, 대장암, 식도암, 위암, 난소암, 폐암, 신장암, 직장암, 갑상선암, 자궁경부암, 소장암, 전립선암 또는 췌장암 등을 들 수 있고, 바람직하게는 혈액암, 식도암, 위암, 대장암, 간암 또는 전립선암을 들 수 있다.
혈액암으로는, 예를 들어 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia, AML), 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia, CML), 골수 이형성 증후군(myelodysplasticsyndromes, MDS), 다발성 골수종(multiple myeloma), 피부 T 세포성 림프종(cutaneous T cell lymphoma, CTCL), 말초 T 세포성 림프종(peripheral T cell lymphoma, PTCL), 미분화 대세포형 림프종(anaplastic large cell lymphoma, ALCL), 급성 림프성 백혈병(acute lympatic leukemia, ALL), 만성 림프성 백혈병(chronic lympatic leukemia, CLL), 기타 림프성 백혈병, NK 세포 림프종, 호지킨 림프종, 또는 버킷 림프종을 비롯한 비호지킨 림프종 등을 들 수 있다.
자가 면역 질환으로는, 예를 들어 관절 류마티즘, 건선, 크론병, 강직성 척추염, 다발성 경화증, I형 당뇨병, 간염, 심근염, 시그렌 증후군, 이식후 거부 반응 자가 면역성 용혈성 빈혈, 수포성류천포창, 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 전신성 에리테마토데스(SLE), 중증 근무력증, 천포창 및 악성 빈혈 등을 들 수 있다.
알레르기성 질환으로는, 예를 들어 급성 또는 만성 기도 과민증, 기관지 천식, 아토피성 피부염, 알레르기성 비염, 두드러기, PIE 증후군, 음식물 알레르기, 화분병, 알레르기성 코, 기관지 천식, 아토피성 피부염 및 아나필락시 쇼크 등을 들 수 있다.
본 발명의 치료제로는, 상술한 본 발명의 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편을 유효 성분으로서 함유한다.
본 발명의 항체 또는 상기 항체 단편, 또는 이들의 유도체를 함유하는 치료제는, 유효 성분으로서의 상기 항체 또는 상기 항체 단편, 또는 이들의 유도체만을 포함하는 것일 수도 있지만, 통상은 약리학적으로 허용되는 하나 이상의 담체와 함께 혼합하여, 제제학의 기술 분야에서 공지인 임의의 방법에 의해 제조한 의약 제제로서 제공하는 것이 바람직하다.
투여 경로는, 치료시에 있어서 가장 효과적인 것을 사용하는 것이 바람직하며, 경구 투여, 또는 구강내, 기도내, 직장내, 피하, 근육내 또는 정맥내 등의 비경구 투여를 들 수 있고, 바람직하게는 정맥내 투여를 들 수 있다.
투여 형태로는, 예를 들어 분무제, 캡슐제, 정제, 산제(散劑), 과립제, 시럽제, 유제, 좌약제, 주사제, 연고 또는 테이프제 등을 들 수 있다.
투여량 또는 투여 횟수는, 목적하는 치료 효과, 투여 방법, 치료 기간, 연령 및 체중 등에 따라 다르지만, 통상 성인 1일당 10μg/kg 내지 10mg/kg이다.
또한, 본 발명은, TIM-3의 세포외 영역의 아미노산 배열 또는 그의 입체 구조를 특이적으로 인식하며 상기 세포외 영역에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 유효 성분으로서 함유하는 TIM-3의 면역학적 검출 또는 측정 방법, TIM-3의 면역학적 검출용 또는 측정용 시약, TIM-3이 발현하는 세포의 면역학적 검출 또는 측정 방법 및 TIM-3 양성 세포가 관여하는 질환의 진단약에 관한 것이다.
본 발명에서 TIM-3의 양을 검출 또는 측정하는 방법으로는, 임의의 공지의 방법을 들 수 있다. 예를 들어, 면역학적 검출 또는 측정 방법 등을 들 수 있다.
면역학적 검출 또는 측정 방법이란, 표지를 실시한 항원 또는 항체를 사용하여 항체량 또는 항원량을 검출 또는 측정하는 방법이다. 면역학적 검출 또는 측정 방법으로는, 방사성 물질 표지 면역 항체법(RIA), 효소 면역 측정법(EIA 또는 ELISA), 형광 면역 측정법(FIA), 발광 면역 측정법(luminescent immunoassay), 웨스턴블로트법 또는 물리화학적 방법 등을 들 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편을 사용하여 TIM-3이 발현한 세포를 검출 또는 측정함으로써, TIM-3이 관련되는 질환을 진단할 수 있다.
상기 폴리펩티드가 발현하고 있는 세포의 검출에는, 공지의 면역학적 검출법을 사용할 수 있지만, 면역 침강법, 형광 세포 염색법, 면역 조직 염색법, 또는 면역 조직 염색법 등이 바람직하게 사용된다. 또한, FMAT8100HTS 시스템(어플라이드 바이오 시스템사제) 등의 형광 항체 염색법 등도 사용할 수 있다.
본 발명에서 TIM-3을 검출 또는 측정하는 대상이 되는 생체 시료로는, 조직 세포, 혈액, 혈장, 혈청, 췌액, 소변, 대변, 조직액 또는 배양액 등, TIM-3이 발현한 세포를 포함할 가능성이 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다.
본 발명의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편, 또는 이들의 유도체를 함유하는 진단약은, 원하는 진단법에 따라서 항원 항체 반응을 행하기 위한 시약, 상기 반응의 검출용 시약을 포함할 수도 있다. 항원 항체 반응을 행하기 위한 시약으로는, 예를 들어 완충제, 염 등을 들 수 있다. 검출용 시약으로는, 예를 들어 상기 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편, 또는 이들의 유도체를 인식하는 표지된 2차 항체, 또는 표지에 대응한 기질 등의 통상의 면역학적 검출 또는 측정법에 사용되는 시약을 들 수 있다.
이하에, 본 발명의 항체의 제조 방법, 질환의 치료 방법 및 질환의 진단 방법에 대해서 구체적으로 설명한다.
1. 모노클로날 항체의 제조 방법
(1) 항원의 조제
항원이 되는 TIM-3 또는 TIM-3을 발현시킨 세포는, TIM-3 전체 길이 또는 그의 부분 길이를 코딩하는 cDNA를 포함하는 발현 벡터를 대장균, 효모, 곤충 세포 또는 동물 세포 등에 도입함으로써 얻을 수 있다. 또한, TIM-3을 다량으로 발현하고 있는 각종 인간 종양 배양 세포, 인간 조직 등으로부터 TIM-3을 정제하여 얻을 수 있다. 또한, 상기 종양 배양 세포 또는 상기 조직 등을 그대로 항원으로서 사용할 수도 있다. 또한, Fmoc법, 또는 tBoc법 등의 화학 합성법에 의해 TIM-3의 부분 배열을 갖는 합성 펩티드를 조제하여 항원에 사용할 수도 있다.
본 발명에서 사용되는 TIM-3은, 문헌 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989) 또는 Current Protocols inmolecular Biology, John Wiley & Sons(1987-1997)] 등에 기재된 방법 등을 사용하여, 예를 들어 이하의 방법에 의해 상기 TIM-3을 코딩하는 DNA를 숙주 세포 중에서 발현시켜서 제조할 수 있다.
우선, TIM-3을 코딩하는 부분을 포함하는 완전 길이 cDNA를 적당한 발현 벡터의 프로모터의 하류에 삽입함으로써, 재조합 벡터를 제조한다. 상기 완전 길이 cDNA 대신에, 완전 길이 cDNA를 기초로 해서 조제된, 폴리펩티드를 코딩하는 부분을 포함하는 적당한 길이의 DNA 단편을 사용할 수도 있다. 다음으로, 얻어진 상기 재조합 벡터를 상기 발현 벡터에 적합한 숙주 세포에 도입함으로써, 폴리펩티드를 생산하는 형질 전환체를 얻을 수 있다.
발현 벡터로는, 사용하는 숙주 세포에서의 자율 복제 또는 염색체 중으로의 끼워넣기가 가능해서, 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 전사할 수 있는 위치에 적당한 프로모터를 함유하고 있는 것이면 모두 사용할 수 있다.
숙주 세포로는, 대장균 등의 에쉐리키아속 등에 속하는 미생물, 효모, 곤충 세포, 또는 동물 세포 등, 목적하는 유전자를 발현할 수 있는 것이면 모두 사용할 수 있다.
대장균 등의 원핵 생물을 숙주 세포로서 사용할 경우, 재조합 벡터는 원핵 생물 중에서 자율 복제가 가능한 동시에, 프로모터, 리보솜 결합 배열, TIM-3을 코딩하는 부분을 포함하는 DNA 및 전사 종결 배열을 포함하는 벡터인 것이 바람직하다. 또한, 상기 재조합 벡터에는, 전사 종결 배열은 반드시 필요하지 않지만, 구조 유전자의 바로 아래에 전사 종결 배열을 배치하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 재조합 벡터에는, 프로모터를 제어하는 유전자를 포함시킬 수도 있다.
상기 재조합 벡터로는, 리보솜 결합 배열인 샤인·달가르노 배열(SD 배열이라고도 함)과 개시 코돈과의 사이를 적당한 거리(예를 들어 6 내지 18 염기)로 조절한 플라스미드를 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 TIM-3을 코딩하는 DNA의 염기 배열로는, 숙주 내에서의 발현에 최적인 코돈이 되도록 염기를 치환할 수 있고, 이에 의해 목적하는 TIM-3의 생산율을 향상시킬 수 있다.
발현 벡터로는, 사용하는 숙주 세포 중에서 기능을 발휘할 수 있는 것이면 모두 사용할 수 있고, 예를 들어 pBTrp2, pBTac1, pBTac2(이상, 로슈·다이아그노스틱사제), pKK233-2(파마시아사제), pSE280(인비트로젠사제), pGEMEX-1(프로 메가사제), pQE-8(키아겐사제), pKYP10(일본 특허 출원 공개 (소)58-110600호 공보), pKYP200[Agricultural Biological Chemistry, 48, 669(1984)], pLSA1[Agric Biol. Chem., 53, 277(1989)], pGEL1[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306(1985)], 피블루스크립트 II SK(-)(스트라타진사제), pTrs30[대장균 JM109/pTrS30(FERM BP-5407)으로부터 조제], pTrs32[대장균 JM109/pTrS32(FERM BP-5408)로부터 조제], pGHA2[대장균 IGHA2(FERM BP-400)로부터 조제, 일본 특허 출원 공개 (소)60-221091호 공보], pGKA2[대장균 IGKA2(FERM BP6798)로부터 조제, 일본 특허 출원 공개 (소)60-221091호 공보], pTerm2(US4686191, US4939094, US5160735), pSupex, pUB110, pTP5, pC194, pEG400[J.Bacteriol., 172, 2392(1990)], pGEX(파마시아사제), pET 시스템(노바젠사제), 또는 pME18SFL3 등을 들 수 있다.
프로모터로는, 사용하는 숙주 세포 중에서 기능을 발휘할 수 있는 것이면 어떠한 것이라도 좋다. 예를 들어, trp 프로모터(Ptrp), lac 프로모터, PL 프로모터, PR 프로모터 또는 T7 프로모터 등 대장균 또는 파지 등에서 유래하는 프로모터를 들 수 있다. 또한, Ptrp를 2개 직렬시킨 탠덤 프로모터, tac 프로모터, lacT7 프로모터 또는 let I 프로모터 등 인위적으로 설계 개변된 프로모터 등도 사용할 수 있다.
숙주 세포로는, 예를 들어 대장균 XL-1Blue, 대장균 XL2-Blue, 대장균 DH1, 대장균 MC1000, 대장균 KY3276, 대장균 W1485, 대장균 JM109, 대장균 HB101, 대장균 No.49, 대장균 W3110, 대장균 NY49, 또는 대장균 DH5α 등을 들 수 있다.
숙주 세포에 대한 재조합 벡터의 도입 방법으로는, 사용하는 숙주 세포에 DNA를 도입하는 방법이면 모두 사용할 수 있고, 예를 들어 칼슘 이온을 사용하는 방법 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110(1972); Gene, 17, 107(1982); Molecular & General Genetics, 168, 111(1979)]을 들 수 있다.
동물 세포를 숙주로서 사용할 경우, 발현 벡터로는, 동물 세포 중에서 기능을 발휘할 수 있는 것이면 모두 사용할 수 있고, 예를 들어 pcDNA I, pcDM8(후나코시사제), pAGE107[일본 특허 출원 공개 (평)3-22979호 공보;Cytotechnology, 3, 133(1990)], pAS3-3(일본 특허 출원 공개 (평)2-227075호 공보), pcDM8[Nature, 329, 840(1987)], pcDNA I/Amp(인비트로젠사제), pcDNA 3.1(인비트로젠사제), pREP4(인비트로젠사제), pAGE103[J. Biochemistry, 101, 1307(1987)], pAGE210, pME18SFL3, 또는 pKANTEX93(국제 공개 제97/10354호) 등을 들 수 있다.
프로모터로는, 동물 세포 중에서 기능을 발휘할 수 있는 것이면 모두 사용할 수 있고, 예를 들어 사이토메갈로바이러스(CMV)의 즉기 초기(immediate early; IE) 유전자의 프로모터, SV40의 초기 프로모터, 레트로바이러스의 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 히트 쇼크 프로모터, SRα 프로모터, 또는 몰로니 마우스 백혈병 바이러스의 프로모터 또는 인핸서를 들 수 있다. 또한, 인간 CMV의 IE 유전자의 인핸서를 프로모터와 함께 사용할 수도 있다.
숙주 세포로는, 예를 들어 인간 백혈병 세포 나말와(Namalwa) 세포, 원숭이 세포 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 세포 CHO 세포(Journal of Experimental Medicine, 108, 945(1958); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 1275(1968); Genetics, 55, 513(1968); Chromosoma, 41, 129(1973); Methods in Cell Science, 18, 115(1996); Radiation Research, 148, 260(1997); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216(1980); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 1275(1968); Cell, 6, 121(1975); Molecular Cellgenetics, Appendix I, II(pp.883-900)), CHO/DG44, CHO-K1(ATCC 번호:CCL-61), DUkXB11(ATCC 번호:CCL-9096), Pro-5(ATCC 번호:CCL-1781), CHO-S(라이프 테크놀로지스(Life Technologies), Cat#11619), Pro-3, 래트 미엘로마 세포 YB2/3HL. P2. G11. 16Ag. 20(또는 YB2/0이라고도 함), 마우스 미엘로마 세포 NSO, 마우스 미엘로마 세포 SP2/0-Ag14, 시리안 햄스터 세포 BHK 또는 HBT5637(일본 특허 출원 공개 (소)63-000299호 공보) 등을 들 수 있다.
숙주 세포에 대한 재조합 벡터의 도입 방법으로는, 동물 세포에 DNA를 도입하는 방법이면 모두 사용할 수 있다. 예를 들어, 전기영동법 [Cytotechnology, 3, 133(1990)], 인산칼슘법 (일본 특허 출원 공개 (평)2-227075호 공보), 또는 리포펙션법 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413(1987)] 등을 들 수 있다.
이상과 같이 해서 얻어지는 TIM-3을 코딩하는 DNA를 내장한 재조합 벡터를 보유하는 미생물 또는 동물 세포 등 유래의 형질 전환체를 배지에 배양하고, 배양물 중에 상기 TIM-3을 생성 축적시키고, 상기 배양물로부터 채취함으로써, TIM-3을 제조할 수 있다. 상기 형질 전환체를 배지에 배양하는 방법은, 숙주의 배양에 사용되는 통상의 방법에 따라서 행할 수 있다.
진핵 생물 유래의 세포에서 발현시켰을 경우에는, 당 또는 당쇄가 부가된 TIM-3을 얻을 수 있다.
유도성의 프로모터를 사용한 재조합 벡터로 형질 전환한 미생물을 배양할 때에는, 필요에 따라서 인듀서를 배지에 첨가할 수도 있다. 예를 들어, lac 프로모터를 사용한 재조합 벡터로 형질 전환한 미생물을 배양할 경우에는 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 등을, trp 프로모터를 사용한 재조합 벡터로 형질 전환한 미생물을 배양할 경우에는 인돌아크릴산 등을 배지에 첨가할 수도 있다.
동물 세포를 숙주로 해서 얻어진 형질 전환체를 배양하는 배지로는, 예를 들어 일반적으로 사용되고 있는 RPMI1640 배지 [The Journal of the American Medical Association, 199, 519(1967)], 이글(Eagle)의 MEM 배지 [Science, 122, 501(1952)], 둘베코 개변 MEM 배지 [Virology, 8, 396(1959)], 199 배지 [Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1(1950)], 이스코브의 개변 둘베코 미디움(Iscove's Modified Dulbecco's Medium; IMDM) 배지, 또는 이들 배지에 소태아 혈청(FBS) 등을 첨가한 배지 등을 들 수 있다. 배양은, 통상 pH6 내지 8, 30 내지 40℃, 5% CO2 존재하 등의 조건하에서 1 내지 7일간 행한다. 또한, 배양 중 필요에 따라 카나마이신 또는 페니실린 등의 항생 물질을 배지에 첨가할 수도 있다.
TIM-3을 코딩하는 유전자의 발현 방법으로는, 직접 발현 이외에, 분비 생산 또는 융합 단백질 발현 등의 방법 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]을 사용할 수 있다.
TIM-3의 생산 방법으로는, 숙주 세포 내에 생산시키는 방법, 숙주 세포 외로 분비시키는 방법 또는 숙주 세포외 막 상에 생산시키는 방법이 있으며, 사용하는 숙주 세포 또는 생산시키는 TIM-3의 구조를 변경함으로써 적절한 방법을 선택할 수 있다.
TIM-3이 숙주 세포내 또는 숙주 세포외 막 상에 생산되는 경우, 폴슨 등의 방법 [J. Biol. Chem., 264, 17619(1989)], 로우 등의 방법 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227(1989); Genes Develop., 4, 1288(1990)], 일본 특허 출원 공개 (평)05-336963호 공보 또는 국제 공개 제94/23021호 등에 기재된 방법을 사용함으로써, TIM-3을 숙주 세포 외로 적극적으로 분비시킬 수 있다.
또한, 디히드로엽산 환원 효소 유전자 등을 사용한 유전자 증폭계(일본 특허 출원 공개 (평)2-227075호 공보)를 사용하여 TIM-3의 생산량을 상승시킬 수도 있다.
얻어진 TIM-3은, 예를 들어 이하와 같이 해서 단리, 정제할 수 있다.
TIM-3이 세포 내에 용해 상태로 발현한 경우에는, 배양 종료 후에 세포를 원심 분리에 의해 회수하고, 수계 완충액에 현탁한 후, 초음파 파쇄기, 프렌치 프레스, 맨톤 고올린 호모게나이저 또는 다이노밀 등을 사용하여 세포를 파쇄하여, 무세포 추출액을 얻는다.
상기 무세포 추출액을 원심 분리함으로써 얻어지는 상청으로부터, 통상의 단백질의 단리 정제법, 즉 용매 추출법, 황산암모늄 등에 의한 염석법, 탈염법, 유기 용매에 의한 침전법, 디에틸아미노에틸(DEAE)-세파로스, DIAION HPA-75(미츠비시 가가쿠사제) 등의 레진을 사용한 음이온 교환 크로마토그래피법, S-세파로스 FF(파마시아사제) 등의 레진을 사용한 양이온 교환 크로마토그래피법, 부틸세파로스, 페닐세파로스 등의 레진을 사용한 소수성 크로마토그래피법, 분자체를 사용한 겔 여과법, 친화성 크로마토그래피법, 크로마토 포커싱법, 또는 등전점 전기영동 등의 전기영동법 등의 방법을 단독 또는 조합해서 사용하여, 정제 표품을 얻을 수 있다.
TIM-3이 세포 내에 불용체를 형성해서 발현한 경우에는, 상기와 마찬가지로 세포를 회수한 후 파쇄하고, 원심 분리를 행함으로써, 침전 획분으로서 상기 TIM-3의 불용체를 회수한다. 회수한 상기 TIM-3의 불용체를 단백질 변성제로 가용화한다. 상기 가용화액을 희석 또는 투석함으로써, 상기 TIM-3을 정상적인 입체 구조로 복귀시킨 후, 상기와 마찬가지의 단리 정제법에 의해 폴리펩티드의 정제 표품을 얻을 수 있다.
TIM-3 또는 그의 당 수식체 등의 유도체가 세포 외로 분비된 경우에는, 배양 상청에서 상기 TIM-3 또는 그의 당 수식체 등 유도체를 회수할 수 있다. 상기 배양물을 상기와 마찬가지로 원심 분리 등의 방법에 의해 처리함으로써 가용성 획분을 취득하고, 상기 가용성 획분으로부터 상기와 마찬가지의 단리 정제법을 사용함으로써 정제 표품을 얻을 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용되는 TIM-3은, Fmoc법 또는 tBoc법 등의 화학 합성법에 의해서도 제조할 수 있다. 또한, 어드반스트켐텍사제, 퍼킨엘머사제, 파마시아사제, 프로테인테크놀로지인스트루먼트사제, 신서셀베가사제, 퍼셉티브사제, 또는 시마츠 세이사쿠쇼사제 등의 펩티드 합성기를 이용해서 화학 합성할 수도 있다.
(2) 동물의 면역과 융합용 항체 생산 세포의 조제
3 내지 20주령의 마우스, 래트 또는 햄스터 등의 동물에, (1)에서 얻어지는 항원을 면역하고, 그 동물의 비장, 림프절, 말초혈 중의 항체 생산 세포를 채취한다. 또한, 면역원성이 낮아 상기의 동물에서 충분한 항체값의 상승이 인정되지 않을 경우에는, TIM-3 녹아웃 마우스를 피면역 동물로서 사용할 수도 있다.
면역은, 동물의 피하, 정맥내 또는 복강내에, 예를 들어 프로인드의 완전 아쥬반트, 또는 수산화알루미늄 겔과 백일해균 백신 등의 적당한 아쥬반트와 함께 항원을 투여함으로써 행한다. 항원이 부분 펩티드일 경우에는, BSA(소혈청 알부민), 또는 KLH(열쇠구멍 삿갓조개 헤모시아닌; Keyhole Limpet Hemocyanin) 등의 캐리어 단백질과 컨쥬게이트를 제조하고, 이것을 면역원으로서 사용한다.
항원의 투여는, 1회째의 투여 후 1 내지 2주일 간격으로 5 내지 10회 행한다. 각 투여 후 3 내지 7일째에 안저 정맥총에서 채혈하고, 그 혈청의 항체값을 효소 면역 측정법 [Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)] 등을 사용하여 측정한다. 면역에 사용한 항원에 대하여, 그 혈청이 충분한 항체값을 나타낸 동물을 융합용 항체 생산 세포의 공급원으로 한다.
항원의 최종 투여 후 3 내지 7일째에, 면역한 동물로부터 비장 등의 항체 생산 세포를 포함하는 조직을 적출하고, 항체 생산 세포를 채취한다. 비장 세포를 사용할 경우에는, 비장을 세단, 해리한 후, 원심 분리하고, 또한 적혈구를 제거해서 융합용 항체 생산 세포를 취득한다.
(3) 골수종 세포의 조제
골수종 세포로는, 마우스로부터 얻어진 주화 세포를 사용하고, 예를 들어 8-아자구아닌 내성 마우스(Balb/C 유래) 골수종 세포주 P3-X63Ag8-U1(P3-U1)[Current Topics in Microbiology and Immunology, 18, 1(1978)], P3-NS1/1Ag41(NS-1) [European J. Immunology, 6, 511(1976)], SP2/0-Ag14(SP-2)[Nature, 276, 269(1978)], P3-X63-Ag8653(653)[J. Immunology, 123, 1548(1979)], 또는 P3-X63-Ag8(X63)[Nature, 256, 495(1975)] 등이 사용된다.
상기 골수종 세포는, 정상 배지 [글루타민, 2-메르캅토 에탄올, 젠타마이신, FBS 및 8-아자구아닌을 가한 RPMI1640 배지]에서 계대하고, 세포 융합의 3 내지 4일 전에 정상 배지로 계대하여, 융합 당일 2×107개 이상의 세포수를 확보한다.
(4) 세포 융합과 모노클로날 항체 생산 하이브리도마의 조제
(2)에서 얻어지는 융합용 항체 생산 세포와 (3)에서 얻어지는 골수종 세포를 기초 필수 미디움(Minimum Essential Medium; MEM) 배지 또는 PBS(인산2나트륨 1.83g, 인산1칼륨 0.21g, 식염 7.65g, 증류수 1리터, pH7.2)로 충분히 세정하고, 세포수가 융합용 항체 생산 세포:골수종 세포=5 내지 10:1이 되도록 혼합하고, 원심 분리한 후, 상청을 제거한다.
침전된 세포군을 충분히 해리한 후, 폴리에틸렌글리콜-1000(PEG-1000), MEM 배지 및 디메틸술폭시드의 혼합액을 37℃에서 교반하면서 가한다. 또한 1 내지 2분간마다 MEM 배지 1 내지 2mL를 수회 가한 후, MEM 배지를 가해서 전량이 50mL가 되도록 한다. 원심 분리 후, 상청을 제거한다. 침전된 세포군을 천천히 해리한 후, 융합용 항체 생산 세포에 HAT 배지 [하이포크산틴, 티미딘 및 아미노프테린을 가한 정상 배지] 중에 천천히 세포를 현탁한다. 이 현탁액을 5% CO2 인큐베이터 중 37℃에서 7 내지 14일간 배양한다.
배양 후, 배양 상청의 일부를 발취하고, 후술하는 바인딩 어세이 등의 하이브리도마 선택 방법에 의해 TIM-3을 포함하는 항원에 반응시켜, TIM-3을 포함하지 않는 항원에 반응하지 않는 세포군을 선택한다. 다음으로, 한계 희석법에 의해 클로닝을 2회 반복하여 [1회째는 HT 배지(HAT 배지에서 아미노프테린을 제거한 배지), 2회째는 정상 배지를 사용한다], 안정적이고 강한 항체값이 인정된 것을 모노클로날 항체 생산 하이브리도마로서 선택한다.
(5) 정제 모노클로날 항체의 조제
프리스탄 처리 [2,6,10,14-테트라메틸펜타데칸(Pristane) 0.5mL를 복강내 투여하고, 2주간 사육한다]한 8 내지 10주령의 마우스 또는 누드 마우스에, (4)에서 얻어지는 모노클로날 항체 생산 하이브리도마를 복강내에 주사한다. 10 내지 21일이면 하이브리도마는 복수 암화한다. 이 마우스로부터 복수를 채취하고, 원심 분리해서 고형분을 제거한 후, 40 내지 50% 황산암모늄으로 염석하고, 카프릴산 침전법, DEAE-세파로스 칼럼, 프로테인 A 칼럼 또는 겔 여과 칼럼에 의한 정제를 행하여, IgG 또는 IgM 획분을 모아 정제 모노클로날 항체로 한다.
또한, (4)에서 얻어지는 모노클로날 항체 생산 하이브리도마를, 10% FBS를 첨가한 RPMI1640 배지 등에서 배양한 후, 원심 분리에 의해 상청을 제거하고, 하이브리도마-SFM 배지에 현탁하고, 3 내지 7일간 배양한다. 얻어진 세포 현탁액을 원심 분리하고, 얻어진 상청으로부터 프로테인 A 칼럼 또는 프로테인 G 칼럼에 의한 정제를 행하여, IgG 획분을 모아 정제 모노클로날 항체를 얻을 수도 있다. 또한, 하이브리도마-SFM 배지에는 5% 다이고 GF21을 첨가할 수도 있다.
항체의 서브클래스의 결정은, 서브클래스 타이핑 키트를 사용하여 효소 면역 측정법에 의해 행한다. 단백량의 정량은, 롤리법 또는 280nm에서의 흡광도로부터 산출한다.
(6) 모노클로날 항체의 선택
모노클로날 항체의 선택은 이하에 나타내는 효소 면역 측정법에 의한 바인딩 어세이 및 비아코어에 의한 키네틱스 해석에 의해 행한다.
(6-a) 바인딩 어세이
항원으로는, (1)에서 얻어지는 TIM-3을 코딩하는 cDNA를 포함하는 발현 벡터를 대장균, 효모, 곤충 세포 또는 동물 세포 등에 도입해서 얻어진 유전자 도입 세포, 재조합형 단백질, 또는 인간 조직으로부터 얻은 정제 폴리펩티드 또는 부분 펩티드 등을 사용한다. 항원이 부분 펩티드일 경우에는, BSA 또는 KLH 등의 캐리어 단백질과 컨쥬게이트를 제조하고, 이것을 사용한다.
항원을 96웰 플레이트 등의 플레이트에 분주하고, 고상화한 후, 제1 항체로서 혈청, 하이브리도마의 배양 상청 또는 정제 모노클로날 항체 등의 피검 물질을 분주하고, 반응시킨다. PBS 또는 PBS-트윈(Tween) 등으로 충분히 세정한 후, 제2 항체로서 비오틴, 효소, 화학 발광 물질 또는 방사선 화합물 등으로 표지한 항 면역글로불린 항체를 분주하고, 반응시킨다. PBS-트윈으로 충분히 세정한 후, 제2 항체의 표지 물질에 따른 반응을 행하여, 면역원에 대해 특이적으로 반응하는 모노클로날 항체를 선택한다.
또한, 본 발명의 항 TIM-3 모노클로날 항체와 경합하여 TIM-3에 결합하는 모노클로날 항체는, 상술한 바인딩 어세이계에 피검 항체를 첨가해서 반응시킴으로써 취득할 수 있다. 즉, 피검 항체를 가했을 때에 모노클로날 항체의 결합이 저해되는 항체를 스크리닝함으로써, TIM-3의 세포외 영역의 아미노산 배열 또는 그의 입체 구조에 대한 결합에 대해서, 취득한 모노클로날 항체와 경합하는 모노클로날 항체를 취득할 수 있다.
또한, 본 발명의 TIM-3의 세포외 영역의 아미노산 배열 또는 그의 입체 구조에 결합하는 모노클로날 항체가 인식하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체는, 상술한 바인딩 어세이계에서 취득된 항체의 에피토프를 동정하고, 동정한 에피토프의 부분적인 합성 펩티드, 또는 에피토프의 입체 구조에 의태시킨 합성 펩티드 등을 제조하고, 면역함으로써, 취득할 수 있다.
(6-b) 비아코어에 의한 키네틱스 해석
비아코어 T100을 사용하여, 항원과 피검물 사이의 결합에서의 키네틱스를 측정하고, 그 결과를 기기 부속의 해석 소프트웨어로 해석한다. 항 마우스 IgG 항체를 센서 칩 CM5에 아민 커플링법에 의해 고정한 후, 하이브리도마 배양 상청 또는 정제 모노클로날 항체 등의 피검 물질을 흐르게 하여 적당량 결합시키고, 또한 농도를 알고 있는 복수 농도의 항원을 흐르게 하고, 결합, 해리를 측정한다.
얻어진 데이터를 기기 부속의 소프트웨어를 사용하여 1:1 바인딩 모델에 의해 키네틱스 해석을 행하여, 각종 파라미터를 취득한다. 또는, 인간 TIM-3을 센서 칩 상에 예를 들어 아민 커플링법에 의해 고정한 후, 농도를 알고 있는 복수 농도의 정제 모노클로날 항체를 흐르게 하고, 결합, 해리를 측정한다. 얻어진 데이터를 기기 부속의 소프트웨어를 사용하여 바이밸런트(bivalent) 바인딩 모델에 의해 키네틱스 해석을 행하여, 각종 파라미터를 취득한다.
2. 유전자 재조합 항체의 제조
유전자 재조합 항체의 제조예로서, 이하에 인간형 키메라 항체 및 인간형 CDR 이식 항체의 제조 방법을 나타낸다.
(1) 유전자 재조합 항체 발현용 벡터의 구축
유전자 재조합 항체 발현용 벡터는, 인간 항체의 CH 및 CL을 코딩하는 DNA가 내장된 동물 세포용 발현 벡터이며, 동물 세포용 발현 벡터에 인간 항체의 CH 및 CL을 코딩하는 DNA를 각각 클로닝함으로써 구축할 수 있다.
인간 항체의 C 영역은 임의의 인간 항체의 CH 및 CL을 사용할 수 있다. 예를 들어, 인간 항체의 γ1 서브클래스의 CH 및 κ 클래스의 CL 등을 사용한다. 인간 항체의 CH 및 CL을 코딩하는 DNA로는, cDNA를 사용하지만, 엑손과 인트론으로 이루어지는 염색체 DNA를 사용할 수도 있다.
동물 세포용 발현 벡터로는, 인간 항체의 C 영역을 코딩하는 유전자를 내장해서 발현할 수 있는 것이면 어떠한 것이라도 사용할 수 있다. 예를 들어, pAGE107 [Cytotechnol., 3, 133(1990)], pAGE103 [J. Biochem., 101, 1307(1987)], pHSG274 [Gene, 27, 223(1984)], pKCR [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1527(1981)], pSG1bd2-4 [Cytotechnol., 4, 173(1990)], 또는 pSE1UK1Sed1-3 [Cytotechnol., 13, 79(1993)] 등을 사용한다.
동물 세포용 발현 벡터 중 프로모터와 인핸서로는, SV40의 초기 프로모터 [J. Biochem., 101, 1307(1987)], 몰로니 마우스 백혈병 바이러스 LTR [Biochem. Biophys. Res. Commun., 149, 960(1987)], 또는 면역글로불린 H쇄의 프로모터 [Cell, 41, 479(1985)]와 인핸서 [Cell, 33, 717(1983)] 등을 사용한다.
유전자 재조합 항체 발현용 벡터로는, 유전자 재조합 항체 발현 벡터의 구축의 용이함, 동물 세포에 대한 도입의 용이함, 동물 세포 내에서의 항체 H쇄 및 L쇄의 발현량의 밸런스가 균형잡히는 등의 점에서, 항체 H쇄 및 L쇄가 동일한 벡터 상에 존재하는 타입(탠덤형)의 유전자 재조합 항체 발현용 벡터 [J. Immunol. Methods, 167, 271(1994)]를 사용하지만, 항체 H쇄 및 L쇄가 별개의 벡터 상에 존재하는 타입을 사용할 수도 있다. 탠덤형의 유전자 재조합 항체 발현용 벡터로는, pKANTEX93 (국제 공개 제97/10354호 공보), pEE18 [Hybridoma, 17, 559(1998)] 등을 사용한다.
(2) 인간 이외의 동물 유래의 항체의 V 영역을 코딩하는 cDNA의 취득 및 아미노산 배열의 해석
비인간 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA의 취득 및 아미노산 배열의 해석은 이하와 같이 해서 행할 수 있다.
비인간 항체를 생산하는 하이브리도마 세포로부터 mRNA를 추출하고, cDNA를 합성한다. 합성한 cDNA를 파지 또는 플라스미드 등의 벡터에 클로닝해서 cDNA 라이브러리를 제조한다.
상기 라이브러리로부터, 마우스 항체의 C 영역 부분 또는 V 영역 부분을 코딩하는 DNA를 프로브로서 사용하여, VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA를 갖는 재조합 파지 또는 재조합 플라스미드를 각각 단리한다. 재조합 파지 또는 재조합 플라스미드 상의 목적하는 마우스 항체의 VH 또는 VL의 전체 염기 배열을 각각 결정하여, 염기 배열로부터 VH 또는 VL의 전체 아미노산 배열을 각각 추정한다.
비인간 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 제조하는 인간 이외의 동물로는, 마우스, 래트, 햄스터 또는 토끼 등을 사용하지만, 하이브리도마 세포를 제조하는 것이 가능하다면 어떠한 동물이나 사용할 수 있다.
하이브리도마 세포로부터의 전체 RNA의 조제에는, 티오시안산구아니딘-트리플루오로아세트산세슘법 [Methods in Enzymol., 154, 3(1987)], 또는 RNA 이지 키트(easy kit)(키아겐사제) 등의 키트 등을 사용한다.
전체 RNA로부터의 mRNA의 조제에는, 올리고(dT) 고정화 셀룰로오스 칼럼법 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)], 또는 올리고-dT30 <수퍼> mRNA 정제 키트(Oligo-dT30 <Super> mRNA Purification Kit)(다카라 바이오사제) 등의 키트 등을 사용한다. 또한, 패스트 트랙 mRNA 단리 키트(Fast Track mRNA Isolation Kit)(인비트로젠사제), 또는 퀵프렙 mRNA 정제 키트(QuickPrep mRNA Purification Kit)(파마시아사제) 등의 키트를 사용하여 하이브리도마 세포로부터 mRNA를 조제할 수도 있다.
cDNA의 합성 및 cDNA 라이브러리의 제조에는, 공지의 방법 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Current Protocols inmolecular Biology, Supplement 1, John Wiley & Sons(1987-1997)], 또는 cDNA 합성 및 플라스미드 클로닝을 위한 수퍼스크립트 플라스미드 시스템(SuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning)(인비트로젠사제), 또는 ZAP-cDNA 합성 키트(ZAP-cDNA Synthesis Kit)(스트라타진사제) 등의 키트 등을 사용한다.
cDNA 라이브러리의 제조시 하이브리도마 세포로부터 추출한 mRNA를 주형으로 해서 합성한 cDNA를 내장하는 벡터로는, 상기 cDNA를 끼워넣을 수 있는 벡터이면 어떠한 것이라도 사용할 수 있다. 예를 들어, ZAP 익스프레스(ZAP ExPress) [Strategies, 5, 58(1992)], 피블루스크립트(pBluescript) II SK(+) [Nucleic Acids Research, 17, 9494(1989)], λZAPII(스트라타진사제), λgt10, λgt11 [DNA Cloning:A Practical Approach, I, 49(1985)], 람다 블루미드(Lambda BlueMid)(클론테크사제), λEx Cell, pT7T3-18U(파마시아사제), pcD2 [Mol. Cell. Biol., 3, 280(1983)], 또는 pUC18 [Gene, 33, 103(1985)] 등을 사용한다.
파지 또는 플라스미드 벡터에 의해 구축되는 cDNA 라이브러리를 도입하는 대장균으로는, 상기 cDNA 라이브러리를 도입, 발현 및 유지할 수 있는 것이면 어떠한 것이라도 사용할 수 있다. 예를 들어, XL-1Blue MRF [Strategies, 5, 81(1992)], C600 [Genetics, 39, 440(1954)], Y1088, Y1090 [Science, 222, 778(1983)], NM522 [J. Mol. Biol., 166, 1(1983)], K802 [J. Mol. Biol., 16, 118(1966)], 또는 JM105 [Gene, 38, 275(1985)] 등을 사용한다.
cDNA 라이브러리로부터의 비인간 항체의 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA 클론의 선택에는, 아이소토프 또는 형광 표지한 프로브를 사용한 콜로니·하이브리다이제이션법, 또는 플라크·하이브리다이제이션법 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)] 등을 사용한다.
또한, 프라이머를 조제하고, mRNA로부터 합성한 cDNA 또는 cDNA 라이브러리를 주형으로 해서, 폴리머라아제 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction)법 [이하, PCR법이라고 표기함; Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Current Protocols inmolecular Biology, Supplement 1, John Wiley & Sons(1987-1997)]을 행함으로써 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA를 조제할 수도 있다.
선택된 cDNA를 적당한 제한 효소 등으로 절단한 후, 피블루스크립트 SK(-)(스트라타진사제) 등의 플라스미드에 클로닝하고, 통상 사용되는 염기 배열 해석 방법 등에 의해 상기 cDNA의 염기 배열을 결정한다. 염기 배열 해석 방법에는, 예를 들어 디데옥시법 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463(1977)] 등의 반응을 행한 후, ABI PRISM3700(PE 바이오 시스템즈사제) 또는 A. L. F. DNA 시퀀서(파마시아사제) 등의 염기 배열 자동 분석 장치 등을 사용한다.
결정한 염기 배열로부터 VH 및 VL의 전체 아미노산 배열을 각각 추정하고, 기지의 항체의 VH 및 VL의 전체 아미노산 배열 [A. L. F. DNA, US Dept. Health and Human Services(1991)]과 비교함으로써, 취득한 cDNA가 분비 시그널 배열을 포함하는 항체의 VH 및 VL의 완전한 아미노산 배열을 코딩하고 있는지를 각각 확인한다.
분비 시그널 배열을 포함하는 항체의 VH 및 VL의 완전한 아미노산 배열에 관해서는, 기지의 항체의 VH 및 VL의 전체 아미노산 배열 [A. L. F. DNA, US Dept. Health and Human Services(1991)]과 비교함으로써, 분비 시그널 배열의 길이 및 N 말단 아미노산 배열을 추정할 수 있으며, 나아가 그것들이 속하는 서브 그룹을 알 수 있다. 또한, VH 및 VL의 각 CDR의 아미노산 배열에 대해서도, 기지의 항체의 VH 및 VL의 아미노산 배열 [A. L. F. DNA, US Dept. Health and Human Services(1991)]과 비교함으로써 알아낼 수 있다.
또한, 얻어진 VH 및 VL의 완전한 아미노산 배열을 사용하여, 예를 들어 SWISS-PROT 또는 PIR-프로테인(Protein) 등의 임의의 데이터 베이스에 대해 BLAST법 [J. Mol. Biol., 215, 403(1990)] 등의 상동성 검색을 행하여, VH 및 VL의 완전한 아미노산 배열이 신규인 것인지를 확인할 수 있다.
(3) 인간형 키메라 항체 발현 벡터의 구축
(1)에서 얻어지는 유전자 재조합 항체 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 또는 CL을 코딩하는 각각의 유전자의 상류에, 각각 비인간 항체의 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA를 각각 클로닝함으로써, 인간형 키메라 항체 발현 벡터를 구축할 수 있다.
비인간 항체의 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA의 3' 말단측과, 인간 항체의 CH 또는 CL의 5' 말단측을 연결하기 위해서, 연결 부분의 염기 배열이 적절한 아미노산을 코딩하며 적당한 제한 효소 인식 배열이 되도록 설계한 VH 및 VL의 cDNA를 제조한다.
제조된 VH 및 VL의 cDNA를 (1)에서 얻어지는 인간형 CDR 이식 항체 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 또는 CL을 코딩하는 각각의 유전자의 상류에 그것들이 적절한 형태로 발현하도록 각각 클로닝하여, 인간형 키메라 항체 발현 벡터를 구축한다.
또한, 비인간 항체 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA를 적당한 제한 효소의 인식 배열을 양단부에 갖는 합성 DNA를 사용하여 PCR법에 의해 각각 증폭하고, (1)에서 얻어지는 유전자 재조합 항체 발현용 벡터에 클로닝할 수도 있다.
(4) 인간형 CDR 이식 항체의 V 영역을 코딩하는 cDNA의 구축
인간형 CDR 이식 항체의 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA는, 이하와 같이 해서 구축할 수 있다.
비인간 항체의 VH 또는 VL의 CDR의 아미노산 배열을 이식하는 인간 항체의 VH 또는 VL의 FR의 아미노산 배열을 각각 선택한다. 선택하는 FR의 아미노산 배열로는, 인간 항체 유래의 것이라면 어느 것이라도 사용할 수 있다.
예를 들어, 프로테인 데이터 뱅크(Protein Data Bank) 등의 데이터 베이스에 등록되어 있는 인간 항체의 FR의 아미노산 배열, 또는 인간 항체의 FR의 각 서브 그룹의 공통 아미노산 배열 [A. L. F. DNA, US Dept. Health and Human Services(1991)] 등을 사용한다. 항체의 결합 활성의 저하를 억제하기 위해서, 원래의 항체의 VH 또는 VL의 FR의 아미노산 배열과 가능한 한 높은 상동성(적어도 60% 이상)의 FR의 아미노산 배열을 선택한다.
다음으로, 선택한 인간 항체의 VH 또는 VL의 FR의 아미노산 배열에, 원래의 항체의 CDR의 아미노산 배열을 각각 이식하여, 인간형 CDR 이식 항체의 VH 또는 VL의 아미노산 배열을 각각 설계한다. 설계한 아미노산 배열을 항체의 유전자의 염기 배열에 나타나는 코돈의 사용 빈도 [A. L. F. DNA, US Dept. Health and Human Services(1991)]를 고려해서 DNA 배열로 변환하여, 인간형 CDR 이식 항체의 VH 또는 VL의 아미노산 배열을 코딩하는 DNA 배열을 각각 설계한다.
설계한 DNA 배열에 기초하여, 100 염기 전후의 길이로 이루어지는 몇 개의 합성 DNA를 합성하고, 그것들을 사용하여 PCR 반응을 행한다. 이 경우, PCR 반응에서의 반응 효율 및 합성 가능한 DNA의 길이로부터, 바람직하게는 H쇄, L쇄 모두 6개의 합성 DNA를 설계한다.
또한, 양단부에 위치하는 합성 DNA의 5' 말단에 적당한 제한 효소의 인식 배열을 도입함으로써, (1)에서 얻어지는 인간형 CDR 이식 항체 발현용 벡터에 용이하게 인간형 CDR 이식 항체의 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA를 클로닝할 수 있다.
또는, 설계한 DNA 배열에 기초하여, 1개의 DNA로서 합성된 각 H쇄, L쇄 전체 길이 합성 DNA를 사용함으로써 실시할 수 있다.
PCR 반응 후, 증폭 산물을 피블루스크립트 SK(-)(스트라타진사제) 등의 플라스미드에 각각 클로닝하고, (2)에 기재된 방법과 마찬가지의 방법에 의해 염기 배열을 결정하고, 원하는 인간형 CDR 이식 항체의 VH 또는 VL의 아미노산 배열을 코딩하는 DNA 배열을 갖는 플라스미드를 취득한다.
(5) 인간형 CDR 이식 항체의 V 영역의 아미노산 배열의 개변
인간형 CDR 이식 항체는, 비인간 항체의 VH 및 VL의 CDR만을 인간 항체의 VH 및 VL의 FR에 이식한 것만으로는, 그의 항원 결합 활성은 원래의 비인간 항체에 비해 저하한다 [BIO/TECHNOLOGY, 9, 266(1991)].
인간형 CDR 이식 항체에서는, 인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 배열 중에서 직접 항원과의 결합에 관여하고 있는 아미노산 잔기, CDR의 아미노산 잔기와 상호 작용하는 아미노산 잔기 및 항체의 입체 구조를 유지하고, 간접적으로 항원과의 결합에 관여하고 있는 아미노산 잔기를 동정하고, 그것들의 아미노산 잔기를 원래의 비인간 항체의 아미노산 잔기로 치환함으로써, 저하한 항원 결합 활성을 상승시킬 수 있다.
항원 결합 활성에 관계되는 FR의 아미노산 잔기를 동정하기 위해서, X선 결정 해석[J. Mol. Biol., 112, 535(1977)] 또는 컴퓨터 모델링[Protein Engineering, 7, 1501(1994)] 등을 사용함으로써, 항체의 입체 구조의 구축 및 해석을 행할 수 있다. 또한, 각각의 항체에 대해서 복수종의 개변체를 제조하고, 각각의 항원 결합 활성과의 상관을 검토하는 것을 반복하고 시행 착오함으로써 필요한 항원 결합 활성을 갖는 개변 인간형 CDR 이식 항체를 취득할 수 있다.
인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 잔기는, 개변용 합성 DNA를 사용하여 (4)에 기재된 PCR 반응을 행함으로써 개변시킬 수 있다. PCR 반응 후의 증폭 산물에 대해서 (2)에 기재된 방법에 의해 염기 배열을 결정하고, 목적하는 개변이 실시된 것을 확인한다.
(6) 인간형 CDR 이식 항체 발현 벡터의 구축
(1)에서 얻어지는 유전자 재조합 항체 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 또는 CL을 코딩하는 각각의 유전자의 상류에, 구축한 유전자 재조합 항체의 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA를 각각 클로닝하여, 인간형 CDR 이식 항체 발현 벡터를 구축할 수 있다.
예를 들어, (4) 및 (5)에서 얻어지는 인간형 CDR 이식 항체의 VH 또는 VL을 구축할 때에 사용하는 합성 DNA 중 양단부에 위치하는 합성 DNA의 5' 말단에 적당한 제한 효소의 인식 배열을 도입함으로써, (1)에서 얻어지는 인간형 CDR 이식 항체 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 또는 CL을 코딩하는 각각의 유전자의 상류에 그것들이 적절한 형태로 발현하도록 각각 클로닝한다.
(7) 유전자 재조합 항체의 일과성 발현
(3) 및 (6)에서 얻어지는 유전자 재조합 항체 발현 벡터 또는 그것들을 개변한 발현 벡터를 사용하여 유전자 재조합 항체의 일과성 발현을 행하여, 제조한 다종류의 인간형 CDR 이식 항체의 항원 결합 활성을 효율적으로 평가할 수 있다.
발현 벡터를 도입하는 숙주 세포로는, 유전자 재조합 항체를 발현할 수 있는 숙주 세포라면 어떠한 세포라도 사용할 수 있지만, 예를 들어 COS-7 세포(ATCC 번호:CRL1651)를 사용한다 [Methods in Nucleic Acids Res., CRC Press, 283(1991)].
COS-7 세포에 대한 발현 벡터의 도입에는, DEAE-덱스트란법 [Methods in Nucleic Acids Res., CRC Press,(1991)], 또는 리포펙션법 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413(1987)] 등을 사용한다.
발현 벡터의 도입 후, 배양 상청 중의 유전자 재조합 항체의 발현량 및 항원 결합 활성은 효소 면역 항체법 [Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press(1996); Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988); 단일 클론 항체 실험 매뉴얼, 고단샤 사이언티픽(1987)] 등을 사용하여 측정한다.
(8) 유전자 재조합 항체를 안정적으로 발현하는 형질 전환주의 취득과 유전자 재조합 항체의 조제
(3) 및 (6)에서 얻어진 유전자 재조합 항체 발현 벡터를 적당한 숙주 세포에 도입함으로써 유전자 재조합 항체를 안정적으로 발현하는 형질 전환주를 얻을 수 있다.
숙주 세포에 대한 발현 벡터의 도입에는, 전기영동법 [일본 특허 출원 공개 (평)2-257891호 공보; Cytotechnology, 3, 133(1990)] 등을 사용한다.
유전자 재조합 항체 발현 벡터를 도입하는 숙주 세포로는, 유전자 재조합 항체를 발현시킬 수 있는 숙주 세포라면 어떠한 세포라도 사용할 수 있다. 예를 들어, CHO-K1(ATCC 번호:CCL-61), DUkXB11(ATCC 번호:CCL-9096), Pro-5(ATCC 번호:CCL-1781), CHO-S(라이프 테크놀로지스, Cat#11619), 래트 미엘로마 세포 YB2/3HL. P2. G11. 16Ag. 20(또는 YB2/0이라고도 함), 마우스 미엘로마 세포 NSO, 마우스 미엘로마 세포 SP2/0-Ag14(ATCC 번호:CRL1581), 마우스 P3-X63-Ag8653 세포(ATCC 번호:CRL1580), 디히드로엽산 환원 효소 유전자가 결손된 CHO 세포[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216(1980)], 렉틴 내성을 획득한 Lec13[Somatic Cell and Molecular Genetics, 12, 55(1986)], α1,6-푸코스 전이 효소 유전자가 결손된 CHO 세포(국제 공개 제2005/035586호; 국제 공개 제02/31140호), 래트 YB2/3HL. P2. G11. 16Ag. 20 세포(ATCC 번호:CRL1662) 등을 사용한다.
또한, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 등의 단백질 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코스의 1 위치가 α 결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소 등의 단백질, 또는 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질 등의 활성이 저하 또는 결실된 숙주 세포, 예를 들어 α1,6-푸코스 전이 효소 유전자가 결손된 CHO 세포(국제 공개 제2005/035586호; 국제 공개 제02/31140호) 등을 사용할 수도 있다.
발현 벡터의 도입 후, 유전자 재조합 항체를 안정적으로 발현하는 형질 전환주는, G418 황산염 등의 약제를 포함하는 동물 세포 배양용 배지에서 배양함으로써 선택한다(일본 특허 출원 공개 (평)2-257891호 공보).
동물 세포 배양용 배지로는, RPMI1640 배지(인비트로젠사제), GIT 배지(니혼세이야쿠사제), EX-CELL301 배지(JRH사제), IMDM 배지(인비트로젠사제), 하이브리도마-SFM 배지(인비트로젠사제), 또는 이들 배지에 FBS 등의 각종 첨가물을 첨가한 배지 등을 사용한다.
얻어진 형질 전환주를 배지 중에서 배양함으로써 배양 상청 중에 유전자 재조합 항체를 발현 축적시킨다. 배양 상청 중의 유전자 재조합 항체의 발현량 및 항원 결합 활성은 ELISA법 등에 의해 측정할 수 있다. 또한, 형질 전환주는, DHFR 증폭계(일본 특허 출원 공개 (평)2-257891호 공보) 등을 이용해서 유전자 재조합 항체의 발현량을 상승시킬 수 있다.
유전자 재조합 항체는, 형질 전환주의 배양 상청으로부터 프로테인 A 칼럼을 사용하여 정제한다 [Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press(1996); Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]. 또한, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피 및 한외 여과 등의 단백질의 정제에서 사용되는 방법을 조합할 수도 있다.
정제한 유전자 재조합 항체의 H쇄, L쇄 또는 항체 분자 전체의 분자량은, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법 [Nature, 227, 680(1970)], 또는 웨스턴블로트법 [Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press(1996); Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)] 등을 사용하여 측정할 수 있다.
3. 정제 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편의 활성 평가
정제한 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편의 활성 평가는, 이하와 같이 행할 수 있다.
TIM-3 발현 세포주에 대한 결합 활성은, 상술한 1-(6a) 기재의 바인딩 어세이 및 (6b) 기재의 비아코어 시스템 등을 사용한 표면 플라스몬 공명법을 사용하여 측정한다. 또한, 형광 항체법 [Cancer Immunol. Immunother., 36, 373(1993)] 등을 사용하여 측정할 수 있다.
항원 양성 배양 세포주에 대한 보체 의존성 상해 활성(이하, CDC 활성이라고 기재함), 또는 ADCC 활성은 공지의 측정 방법 [Cancer Immunol. Immunother., 36, 373(1993)]에 의해 측정한다.
4. 항체의 이펙터 활성을 제어하는 방법
본 발명의 항 TIM-3 모노클로날 항체의 이펙터 활성을 제어하는 방법으로는, 항체의 Fc 영역의 297번째의 아스파라긴(Asn)에 결합하는 N 결합 복합형 당쇄의 환원 말단에 존재하는 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)에 α1,6 결합하는 푸코스(코어 푸코스라고도 함)의 양을 제어하는 방법 (국제 공개 제2005/035586호; 국제 공개 제2002/31140호; 국제 공개 제00/61739호), 또는 항체의 Fc 영역의 아미노산 잔기를 개변함으로써 제어하는 방법 등이 알려져 있다. 본 발명의 항 TIM-3 모노클로날 항체에는 어느 방법을 사용해도 이펙터 활성을 제어할 수 있다.
이펙터 활성이란, 항체의 Fc 영역을 통해서 야기되는 항체 의존성의 활성을 말하며, ADCC 활성, CDC 활성, 또는 매크로파지 또는 수상 세포 등의 식세포에 의한 항체 의존성 식세포작용(Antibody-dependent phagocytosis, ADP 활성) 등이 알려져 있다.
항체의 Fc의 N 결합 복합형 당쇄의 코어 푸코스의 함량을 제어함으로써, 항체의 이펙터 활성을 증가 또는 저하시킬 수 있다. 항체의 Fc에 결합하고 있는 N 결합 복합형 당쇄에 결합하는 푸코스의 함량을 저하시키는 방법으로는, α1,6-푸코스 전이 효소 유전자가 결손된 CHO 세포를 사용하여 항체를 발현함으로써, 푸코스가 결합하지 않은 항체를 취득할 수 있다. 푸코스가 결합하지 않은 항체는 높은 ADCC 활성을 갖는다.
한편, 항체의 Fc에 결합하고 있는 N 결합 복합형 당쇄에 결합하는 푸코스의 함량을 증가시키는 방법으로는, α1,6-푸코스 전이 효소 유전자를 도입한 숙주 세포를 사용하여 항체를 발현시킴으로써, 푸코스가 결합하고 있는 항체를 취득할 수 있다. 푸코스가 결합하고 있는 항체는, 푸코스가 결합하지 않은 항체보다 낮은 ADCC 활성을 갖는다.
또한, 항체의 Fc 영역의 아미노산 잔기를 개변함으로써 ADCC 활성 또는 CDC 활성을 증가 또는 저하시킬 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2007/0148165호 명세서에 기재된 Fc 영역의 아미노산 배열을 사용함으로써, 항체의 CDC 활성을 증가시킬 수 있다. 또한, 미국 특허 제6,737,056호 명세서, 미국 특허 제7,297,775호 명세서 또는 미국 특허 제7,317,091호 명세서에 기재된 아미노산 개변을 행함으로써, ADCC 활성 또는 CDC 활성을 증가시키거나 저하시킬 수도 있다.
또한, 상술한 방법을 조합하여 하나의 항체에 사용함으로써, 항체의 이펙터 활성이 제어된 항체를 취득할 수 있다.
5. 본 발명의 항 TIM-3 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 사용한 질환의 치료 방법
본 발명의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편은, TIM-3 양성 세포가 관여하는 질환의 치료에 사용할 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편 또는 이들의 유도체를 함유하는 치료제는, 유효 성분으로서의 상기 항체 또는 상기 항체 단편 또는 이들의 유도체만을 포함하는 것일 수도 있지만, 통상은 약리학적으로 허용되는 하나 이상의 담체와 함께 혼합하여 제제학의 기술 분야에서 공지된 방법에 의해 제조한 의약 제제로서 제공된다.
투여 경로로는, 예를 들어 경구 투여, 또는 구강내, 기도내, 직장내, 피하, 근육내 또는 정맥내 등의 비경구 투여를 들 수 있다. 투여 형태로는, 예를 들어 분무제, 캡슐제, 정제, 산제, 과립제, 시럽제, 유제, 좌약제, 주사제, 연고 또는 테이프제 등을 들 수 있다.
경구 투여에 적당한 제제로는, 예를 들어 유제, 시럽제, 캡슐제, 정제, 산제 또는 과립제 등을 들 수 있다.
유제 또는 시럽제와 같은 액체 조제물은, 물, 자당, 소르비톨 또는 과당 등의 당류, 폴리에틸렌글리콜 또는 프로필렌글리콜 등의 글리콜류, 참기름, 올리브유 또는 대두유 등의 유류, p-히드록시벤조산에스테르류 등의 방부제, 또는 스트로베리 플레이버 또는 페퍼민트 등의 플레이버류 등을 첨가제로서 사용하여 제조한다.
캡슐제, 정제, 산제 또는 과립제 등은, 유당, 포도당, 자당 또는 만니톨 등의 부형제, 전분 또는 알긴산나트륨 등의 붕괴제, 스테아르산마그네슘 또는 탈크 등의 활택제, 폴리비닐알코올, 히드록시프로필셀룰로오스 또는 젤라틴 등의 결합제, 지방산에스테르 등의 계면 활성제 또는 글리세린 등의 가소제 등을 첨가제로서 사용하여 제조한다.
비경구 투여에 적당한 제제로는, 예를 들어 주사제, 좌약제 또는 분무제 등을 들 수 있다.
주사제는 염 용액, 포도당 용액, 또는 그 양자의 혼합물을 포함하는 담체 등을 사용하여 제조한다.
좌약제는 카카오 지방, 수소화 지방 또는 카르복실산 등의 담체를 사용하여 제조한다.
분무제는 수용자의 구강 및 기도 점막을 자극하지 않으며 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 미세한 입자로서 분산시켜서 흡수를 용이하게 하는 담체 등을 사용하여 제조한다. 담체로는, 예를 들어 유당 또는 글리세린 등을 사용한다. 또한, 에어로졸 또는 드라이 파우더로서 제조할 수도 있다.
또한, 상기 비경구제에서도, 경구 투여에 적당한 제제에서 첨가제로서 예시한 성분을 첨가할 수도 있다.
6. 본 발명의 항 TIM-3 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 사용한 질환의 진단 방법
본 발명의 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편을 사용하여, TIM-3 또는 TIM-3이 발현한 세포를 검출 또는 측정함으로써, TIM-3이 관련된 질환을 진단할 수 있다.
TIM-3이 관련된 질환의 하나인 암의 진단은, 예를 들어 이하와 같이 TIM-3의 검출 또는 측정해서 행할 수 있다.
환자 체내의 암 세포에 발현하고 있는 TIM-3을 유세포분석기 등의 면역학적 방법을 사용하여 검출함으로써 진단을 행할 수 있다.
면역학적 방법이란, 표지를 실시한 항원 또는 항체를 사용하여 항체량 또는 항원량을 검출 또는 측정하는 방법이다. 예를 들어, 방사성 물질 표지 면역 항체법, 효소 면역 측정법, 형광 면역 측정법, 발광 면역 측정법, 웨스턴블로트법 또는 물리화학적 방법 등을 사용한다.
방사성 물질 표지 면역 항체법은, 예를 들어 항원 또는 항원을 발현한 세포 등에 본 발명의 항체 또는 상기 항체 단편을 반응시키고, 또한 방사선 표지를 실시한 항 면역글로불린 항체 또는 결합 단편을 반응시킨 후, 신틸레이션 카운터 등으로 측정한다.
효소 면역 측정법은, 예를 들어 항원 또는 항원을 발현한 세포 등에 본 발명의 항체 또는 상기 항체 단편을 반응시키고, 또한 표지를 실시한 항 면역글로불린 항체 또는 결합 단편을 반응시킨 후, 발색 색소를 흡광 광도계로 측정한다. 예를 들어 샌드위치 ELISA법 등을 사용한다.
효소 면역 측정법에서 사용하는 표지체로는, 공지 [효소 면역 측정법, 이가쿠쇼인(1987)]의 효소 표지를 사용할 수 있다. 예를 들어, 알칼리 포스파타아제 표지, 퍼옥시다아제 표지, 루시페라아제 표지, 또는 비오틴 표지 등을 사용한다.
샌드위치 ELISA법은, 고상에 항체를 결합시킨 후, 검출 또는 측정 대상인 항원을 트랩시키고, 트랩된 항원에 제2 항체를 반응시키는 방법이다. 상기 ELISA법에서는, 검출 또는 측정하고자 하는 항원을 인식하는 항체 또는 항체 단편으로서 항원 인식 부위가 서로 다른 2종류의 항체를 준비하고, 그 중 제1 항체 또는 항체 단편을 미리 플레이트(예를 들어, 96웰 플레이트)에 흡착시키고, 다음으로 제2 항체 또는 항체 단편을 FITC 등의 형광 물질, 퍼옥시다아제 등의 효소 또는 비오틴 등으로 표지해 둔다.
상기의 항체가 흡착된 플레이트에, 생체내로부터 분리된 세포 또는 그의 파쇄액, 조직 또는 그의 파쇄액, 세포 배양 상청, 혈청, 흉수, 복수 또는 안액 등을 반응시킨 후, 표지한 모노클로날 항체 또는 항체 단편을 반응시켜, 표지 물질에 따른 검출 반응을 행한다. 농도를 알고 있는 항원을 단계적으로 희석해서 제작한 검량선으로부터, 피검 샘플 중의 항원 농도를 산출한다.
샌드위치 ELISA법에 사용하는 항체로는, 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체 중 어느 것을 사용해도 되며, Fab, Fab' 또는 F(ab')2 등의 항체 프래그먼트를 사용해도 된다. 샌드위치 ELISA법에서 사용하는 2종류의 항체의 조합으로는, 서로 다른 에피토프를 인식하는 모노클로날 항체 또는 항체 단편의 조합일 수도 있고, 폴리클로날 항체와 모노클로날 항체 또는 항체 단편과의 조합일 수도 있다.
형광 면역 측정법은, 문헌 [Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press(1996); 단일 클론 항체 실험 매뉴얼, 고단샤 사이언티픽(1987)] 등에 기재된 방법으로 측정한다. 형광 면역 측정법에서 사용하는 표지체로는, 예를 들어 공지 [형광 항체법, 소프트 사이언스사(1983)]의 형광 표지를 들 수 있다. 예를 들어 FITC, 또는 RITC 등을 들 수 있다.
발광 면역 측정법은 문헌 [생물 발광과 화학 발광 임상 검사 42, 히로카와서점(1998)] 등에 기재된 방법으로 측정한다. 발광 면역 측정법에서 사용하는 표지체로는, 예를 들어 공지의 발광체 표지를 들 수 있으며, 아크리디늄에스테르, 로핀 등을 들 수 있다.
웨스턴블로트법은, 항원 또는 항원을 발현한 세포 등을 SDS(도데실황산나트륨)-PAGE [Antibodies-A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]로 분획한 후, 상기 겔을 폴리불화비닐리덴(PVDF)막 또는 니트로셀룰로오스막에 블로팅하고, 상기 막에 항원을 인식하는 항체 또는 항체 단편을 반응시키고, 또한 FITC 등의 형광 물질, 퍼옥시다아제 등의 효소 표지 또는 비오틴 표지 등을 실시한 항 마우스 IgG 항체 또는 결합 단편을 반응시킨 후, 상기 표지를 가시화함으로써 측정한다. 일례를 이하에 나타낸다.
배열 번호 53으로 나타내는 아미노산 배열을 갖는 폴리펩티드를 발현하고 있는 세포 또는 조직을 용해하고, 환원 조건하에서 레인당의 단백량으로서 0.1 내지 30μg을 SDS-PAGE법에 의해 영동한다. 영동된 단백질을 PVDF막에 트랜스퍼하고 1 내지 10% BSA를 포함하는 PBS(이하, BSA-PBS라고 표기함)에 실온에서 30분간 반응시켜 블로킹 조작을 행한다.
여기서 본 발명의 모노클로날 항체를 반응시키고, 0.05 내지 0.1%의 트윈-20을 포함하는 PBS(이하, 트윈-PBS라고 표기함)로 세정하고, 퍼옥시다아제 표지한 염소 항 마우스 IgG를 실온에서 2시간 반응시킨다. 트윈-PBS로 세정하고, ECL 웨스턴 블로팅 검출 시약(Western Blotting Detection Reagents)(아머샴사제) 등을 사용하여 모노클로날 항체가 결합한 밴드를 검출함으로써, 배열 번호 53으로 나타내는 아미노산 배열을 갖는 폴리펩티드를 검출한다. 웨스턴블로팅에서의 검출에 사용되는 항체로는, 천연형의 입체 구조를 유지하지 않고 있는 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항체가 사용된다.
물리화학적 방법은, 예를 들어 항원인 TIM-3과 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 결합시킴으로써 응집체를 형성시키고, 이 응집체를 검출함으로써 행한다. 그 밖에 물리화학적 방법으로서, 예를 들어 모세관법, 1차원 면역 확산법, 면역 비탁법 또는 라텍스 면역 비탁법 [임상 검사법 제요, 카네하라 출판(1998)] 등을 들 수 있다.
라텍스 면역 비탁법은, 항체 또는 항원을 감작시킨 입경 0.1 내지 1㎛ 정도의 폴리스티렌 라텍스 등의 담체를 사용하며, 대응하는 항원 또는 항체에 의해 항원 항체 반응을 일으키면, 반응액 중의 산란광은 증가하고, 투과광은 감소한다. 이 변화를 흡광도 또는 적분구 탁도로서 검출함으로써 피검 샘플 중의 항원 농도 등을 측정한다.
한편, TIM-3이 발현하고 있는 세포의 검출 또는 측정은, 공지의 면역학적 검출법을 사용할 수 있는데, 예를 들어 바람직하게는 면역 침강법, 면역 세포 염색법, 면역 조직 염색법 또는 형광 항체 염색법 등을 들 수 있다.
면역 침강법은, TIM-3을 발현한 세포 등을 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편과 반응시킨 후, 프로테인 G-세파로스 등의 면역글로불린에 특이적인 결합능을 갖는 담체를 가해서 항원 항체 복합체를 침강시킨다. 또는 이하와 같은 방법에 의해서도 행할 수 있다. ELISA용 96웰 플레이트에 상술한 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 고상화한 후, BSA-PBS에 의해 블로킹한다.
항체가, 예를 들어 하이브리도마 배양 상청 등의 정제되어 있지 않은 상태일 경우에는, 항 마우스 면역글로불린, 항 래트 면역글로불린, 프로테인 A 또는 프로테인 G 등을 미리 ELISA용 96웰 플레이트에 고상화하고, BSA-PBS로 블로킹한 후, 하이브리도마 배양 상청을 분주하여 결합시킨다. 다음으로, BSA-PBS를 버리고 PBS로 충분히 세정한 후, TIM-3을 발현하고 있는 세포 또는 조직의 용해액을 반응시킨다. 충분히 세정한 후의 플레이트로부터 면역 침강물을 SDS-PAGE용 샘플 버퍼로 추출하고, 상기의 웨스턴블로팅에 의해 검출한다.
면역 세포 염색법 또는 면역 조직 염색법은, 항원을 발현한 세포 또는 조직 등을 경우에 따라서는 항체의 통과성을 좋게 하기 위해서 계면 활성제 또는 메탄올 등으로 처리한 후, 본 발명의 모노클로날 항체와 반응시키고, 또한 FITC 등의 형광 표지, 퍼옥시다아제 등의 효소 표지 또는 비오틴 표지 등을 실시한 항 면역글로불린 항체 또는 그 결합 단편과 반응시킨 후, 상기 표지를 가시화하고, 현미경으로 현경하는 방법이다.
또한, 형광 표지의 항체와 세포를 반응시켜, 유세포분석기로 해석하는 형광 항체 염색법 [Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press(1996); 단일 클론 항체 실험 매뉴얼, 고단샤 사이언티픽(1987)]에 의해 검출을 행할 수 있다.
특히, TIM-3의 세포외 영역의 아미노산 배열 또는 그의 입체 구조에 결합하는 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편은, 형광 항체 염색법에 의해 천연형의 입체 구조를 유지해서 발현하고 있는 세포를 검출할 수 있다.
또한, 형광 항체 염색법 중 FMAT8100HTS 시스템(어플라이드 바이오 시스템사제) 등을 사용했을 경우에는, 형성된 항체-항원 복합체와, 항체-항원 복합체의 형성에 관여하지 않는 유리의 항체 또는 항원을 분리하지 않고, 항원량 또는 항체량을 측정할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 하기 실시예에 한정되는 것이 아니다.
실시예
[실시예 1]
(인간 TIM-3 cDNA의 분자 클로닝과 안정 발현주 제조)
인간 TIM-3의 cDNA는 인간 MTC 패널(클론테크사제)을 주형으로 ExTaq(다카라 바이오사제)를 사용한 PCR법에 의해 증폭했다. 프라이머는, TIM-3 Fw2(배열 번호 31) 및 TIM-3 Re2(배열 번호 32)를 사용했다. 얻어진 PCR 산물을 pGEM-T 이지 벡터(Easy vector)(프로메가(Promega)사제)에 삽입하고, TOP10 원 샷(TOP10 One Shot)(인비트로젠사제)으로 형질 전환해서 증폭시킨 후, 미니프렙법에 의해 플라스미드 DNA를 추출했다.
정제한 플라스미드 DNA에 대해서, 프라이머 TIM-3 Fw2 및 TIM-3 Re2를 사용한 DNA 배열 해석을 행하여, 젠뱅크 검색 번호 NM_032782의 코딩 영역과 동일한 염기 배열을 갖는 클론을 선정했다. 선정한 클론의 인서트를 pMCs-IRES-GFP 벡터(셀 바이오랩(CELL BIOLABS)사제)로 재조합하여(hTIM-3/pMCs-IG), 레트로바이러스 구축 시스템 암포(Retrovirus Constructive System Ampho)(다카라 바이오사제)를 사용하여, 인간 TIM-3 레트로바이러스를 조제했다.
이 인간 TIM-3 레트로바이러스를, 미리 유세포분석기 해석으로 내재적으로 TIM-3이 발현하지 않았음을 확인한 주르카트(Jurkat) 세포(ATCC 번호:CRL-2063), EoL-1 세포(리켄 셀 뱅크(RIKEN CELL BANK) 번호:RCB0641) 및 L929 세포(시그마알드리치사제)에 각각 감염시켰다. 복수회의 계대 후, FACSAria(비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences)사제)로 TIM-3 양성 세포를 채취했다. 또한 복수회의 계대 후, 다시 FACSAria로 TIM-3 양성 세포를 채취함으로써, 인간 TIM-3 안정 발현 세포주를 제조했다.
[실시예 2]
(가용형 세포막외 인간 TIM-3 인간 Fc 융합 단백질 발현 벡터의 조제)
인간 TIM-3의 세포외 영역을 코딩하는 cDNA를 실시예 1에서 구축한 hTIM-3/pMCs-IG를 주형으로 ExTaq(다카라 바이오사제)를 사용한 PCR법으로 증폭했다. 프라이머는 pMCs-Fw(배열 번호 33) 및 TIM3ED-FcReXba(배열 번호 34)를 사용했다.
얻어진 PCR 산물을 pTracer-CMV-FLAG-인간 Fc 벡터[pTracer-CMV(인비트로젠사제)의 Xba I 부위와 Apa I 부위에 FLAG 및 인간 IgG1의 Fc 영역을 도입한 개변 벡터]에 삽입하고, TOP10 원 샷(인비트로젠사제)으로 형질 전환해서 증폭시킨 후, 미니프렙법에 의해 플라스미드 DNA(sTIM-3-FLAG-Fc/pTracerCMV)를 추출했다.
정제한 sTIM-3-FLAG-Fc/pTracerCMV는, T7(배열 번호 35) 및 hTIM-3 Fw1(배열 번호 36)을 프라이머로 한 DNA 배열 해석에 의해, 젠뱅크 검색 번호 NM_032782의 당해 영역과 동일한 염기 배열을 갖는 것을 확인했다. 인서트(EcoRI 인식 부위의 뒤에서부터 ApaI 인식 부위 직전까지)의 배열은 배열 번호 37과 같았다.
[실시예 3]
(가용형 세포막외 인간 TIM-3 발현 벡터의 조제)
인간 TIM-3의 세포외 영역을 코딩하는 cDNA를 실시예 2에서 구축한 sTIM-3-FLAG-Fc/pTracerCMV를 주형으로 ExTaq(다카라 바이오사제)를 사용한 PCR법으로 증폭했다. 프라이머는 TIM-3 Fw2(배열 번호 31) 및 TIM3ED-FLAG4aa(배열 번호 39)를 사용했다.
다음으로, 얻어진 PCR 산물을 주형으로, TIM-3 Fw2(배열 번호 31) 및 C-FLAG-NotR2(배열 번호 40)를 프라이머로 한 ExTaq(다카라 바이오사제)에 의한 PCR법에 의해 FLAG 에피토프를 연결했다. 얻어진 PCR 산물을 pGEM-T 이지 벡터(프로메가사제)에 삽입하고, TOP10 원 샷(인비트로젠사제)로 형질 전환해서 증폭시킨 후, 미니프렙법에 의해 플라스미드 DNA(sTIM-3-FLAG/pEF6 Myc_HisC)를 추출했다.
정제한 sTIM-3-FLAG/pEF6 Myc_HisC는, T7(배열 번호 35) 및 BGH-R(배열 번호 41)을 프라이머로 한 DNA 배열 해석에 의해, 젠뱅크 검색 번호 NM_032782의 당해 영역과 동일한 염기 배열을 갖는 것을 확인했다. 인서트(Not I 인식 부위의 뒤에서부터 Not I 인식 부위 직전까지)의 배열은 배열 번호 42와 같았다.
[실시예 4]
(가용형 세포막외 인간 TIM-3 인간 Fc 융합 단백질 및 가용형 세포막외 인간 TIM-3의 조제)
실시예 2 및 실시예 3에서 얻어진 sTIM-3-FLAG-Fc/pTracerCMV 플라스미드 DNA 및 sTIM-3-FLAG/pEF6 Myc_HisC 플라스미드 DNA를 각각 HEK293F 세포(인비트로젠사제)에 도입하고, 일과성으로 발현시켰다. 6일 후, 세포 상청을 회수하고, 단백 정제에 사용했다.
가용형 세포막외 인간 TIM-3 인간 Fc 융합 단백질 또는 가용형 세포막외 인간 TIM-3을 포함하는 배양 상청을 유전자 도입으로부터 6일 후에 원심 분리에 의해 회수하고, 항 FLAG M2 아가로스 어피니티겔(Anti-FLAG M2 Agarose Affinitygel)(시그마사제)을 사용하여 제조한 항 FLAG 칼럼과 FLAG 펩티드(시그마사제)를 사용하여 매뉴얼에 따라 정제했다.
용출액을 분획하고, 각 프랙션을 환원 조건하에서 SDS-PAGE 후, 은 염색 및 웨스턴블로팅을 행했다. 웨스턴블로팅에는, 항FLAG M2 항체(시그마사제)와 알칼리 포스파타아제 표지 토끼 항 마우스 면역글로불린 항체(다코사제)를 사용했다. 목적하는 단백질이 인정된 프랙션을 아미콘 울트라-410K(밀리포어사제)를 사용하여 농축하고, 수퍼덱스(Superdex) 200gp(GE 헬스케어사제)를 사용하여 겔 여과 크로마토그래피를 행했다.
분획하고, 각 프랙션을 환원 조건하에서 SDS-PAGE 후, 은 염색 및 웨스턴블로팅을 행했다. 목적하는 단백질이 인정된 프랙션을 농축하고, PBS 0.5mL로 세정했다. 구멍 직경 0.22㎛의 멤브레인 필터 MILLEX-GV(밀리포어사제)로 여과 멸균하여, 가용형 세포막외 인간 TIM-3 인간 Fc 융합 단백질 또는 가용형 세포막외 인간 TIM-3을 얻었다. 엔도톡신 측정용 전용 시약인 리뮬러스 ES-II 키트 와코(와코쥰야쿠사제)를 사용하여 정제도를 측정하여, 충분히 정제되어 있음을 확인했다.
[실시예 5]
(인간 항체 생산 마우스의 제조)
면역에 사용한 마우스는, 내인성 Ig 중쇄 및 κ 경쇄 파괴의 양자에 대해서 호모 접합체의 유전적 배경을 갖고 있으며, 인간 Ig 중쇄 유전자 자리를 포함하는 14번 염색체 단편(SC20) 및 인간 Igκ쇄 트랜스진(KCo5)을 동시에 유지한다. 이 마우스는 인간 Ig 중쇄 유전자 자리를 갖는 계통 A의 마우스와, 인간 Igκ쇄 트랜스진을 갖는 계통 B의 마우스의 교배에 의해 제조되었다.
계통 A는, 내인성 Ig 중쇄 및 κ 경쇄 파괴의 양자에 대해서 호모 접합체이고, 자손 전달 가능한 14번 염색체 단편(SC20)을 유지하는 마우스 계통이며, 예를 들어 토모즈카 등의 보고 [Tomizuka. et al., Proc Natl Acad Sci USA., 2000 Vol97:722]에 기재되어 있다.
또한, 계통 B는 내인성 Ig 중쇄 및 κ 경쇄 파괴의 양자에 대해서 호모 접합체이고, 인간 Igκ쇄 트랜스진(KCo5)을 유지하는 마우스 계통(형질전환 마우스)이며, 예를 들어 피쉬와일드(Fishwild) 등의 보고 [Nat Biotechnol, 1996, 14:845]에 기재되어 있다.
계통 A의 수컷 마우스와 계통 B의 암컷 마우스, 또는 계통 A의 암컷 마우스와 계통 B의 수컷 마우스의 교배에 의해 얻어진, 혈청 중에 인간 Ig 중쇄 및 κ 경쇄가 동시에 검출되는 개체 [Ishida & Lonberg, IBC's 11th Antibody Engineering, Abstract 2000]를 이하의 면역 실험에 사용했다. 또한, 상기 인간 항체 생산 마우스(이하, KM 마우스라고 기재함)는, 계약을 체결함으로써 협화 발효 기린 주식회사로부터 입수 가능하다.
[실시예 6]
(인간 TIM-3에 대한 인간 모노클로날 항체의 제조)
본 실시예에서의 모노클로날 항체의 제조은, 단일 클론 항체 실험 조작 입문(안도타미에 외, 고단샤 발행, 1991년) 등에 기재되어 있는 바와 같은 일반적 방법에 따라서 조제했다. 면역원으로서의 TIM-3은, 실시예 1에서 얻어진 TIM-3 발현 L929 세포 또는 실시예 4에서 얻어진 가용형 세포막외 인간 TIM-3 인간 Fc 융합 단백질을 사용했다. 피면역 동물은, 상기 KM 마우스를 사용했다.
우선, KM 마우스에, TIM-3 발현 L929 세포를 마우스 1마리당 1×107개 복강내에 면역했다. 첫회 면역으로부터 이후, 동일 세포를 3회 또는 그 이상 면역했다. 비장을 취득기는 3일 전에, 실시예 4에서 얻어진 가용형 세포막외 인간 TIM-3 인간 Fc 융합 단백질 20μg/마우스 개체를 꼬리 정맥 투여했다. 면역된 마우스로부터 비장을 외과적으로 취득한 후, PBS 4mL 중에 비장을 넣고, 메쉬(셀 스트레이너:팔콘사제) 상에서 시린지의 피스톤을 사용하여 으깼다.
메쉬를 통과한 세포 현탁액을 원심 분리해서 세포를 침전시킨 후, 적혈구 세정 버퍼(Red Blood Cell Lysing Buffer)(시그마사제) 1mL로 재현탁했다. 실온에서 5분간의 인큐베이션 후, 50단위/mL 페니실린, 50μg/mL 스트렙토마이신을 포함하는 무혈청 DMEM 배지(인비트로젠사제)(이하, 무혈청 DMEM 배지라고 기재함) 10mL를 가하고, 원심 분리에 의해 세포를 침전시켰다.
침전된 세포를 다시 무혈청 DMEM 배지에 현탁했다. 한편, 미엘로마 세포 SP2/0(ATCC 번호:CRL-1581)은 10% FCS(인비트로젠사제), 50단위/mL 페니실린, 50μg/mL 스트렙토마이신을 포함하는 DMEM 배지(인비트로젠사제)(이하, 혈청 포함 DMEM 배지라고 기재함)에서 37℃, 5% 탄산 가스 존재하에서 세포 농도가 1×106세포/mL를 초과하지 않도록 배양했다.
SP2/0 세포를 비장 유래 세포와 마찬가지로 무혈청 DMEM 배지 10mL로 세정하고, 무혈청 DMEM 배지에 현탁했다. 이들 비장 유래 세포의 현탁액과 마우스 미엘로마 현탁액을 세포수 5:1로 혼합하고, 원심 분리한 후, 상청을 완전하게 제거했다. 이 펠릿에, 융합제로서 50%(w/v) 폴리에틸렌글리콜 1500(베링거맨하임사제) 1mL를 피펫의 끝으로 펠릿을 교반하면서 천천히 첨가한 후, 미리 37℃로 가온해 둔 무혈청 DMEM 배지 1mL를 천천히 첨가했다. 또한 5mL 및 10mL의 무혈청 DMEM 배지를 천천히 첨가했다. 그 후, 37℃, 5% 탄산 가스 존재하에서 5분간 정치했다.
원심 분리 후, 상청을 제거해서 얻어진 융합 세포를, 10% FCS(인비트로젠사제), 페니실린-스트렙토마이신-글루타민(인비트로젠사제, 카탈로그 번호 10378-016을 100배 희석), IL-6(5ng/mL), 2-메르캅토에탄올(인비트로젠사제, 카탈로그 번호 21985-023을 1000배 희석)을 포함하는 DMEM 배지(인비트로젠사제)(이하, IL-6 포함 DMEM 배지라고 기재함) 50mL에 현탁하고, 37℃, 5% 탄산 가스 존재하에서 배양했다.
다음날, 세포를 피펫팅에 의해 회수하고, 원심 분리에 의해 침전된 세포 펠릿을 10mL의 IL-6 포함 DMEM 배지에 재현탁했다. 다음날, 하이포크산틴-아미노프테린-티미딘(이하, HAT라고 기재함, 시그마사제)을 첨가하고, 약 7 내지 10일 후에 배양 상청을 회수하여, 하이브리도마 스크리닝에 사용했다.
[실시예 7]
(인간 TIM-3에 대한 마우스 모노클로날 항체의 제조)
본 실시예에서의 모노클로날 항체의 제조은, 단일 클론 항체 실험 조작 입문(안도타미에 외, 고단샤 발행, 1991년) 등에 기재되어 있는 바와 같은 일반적 방법에 따라서 조제했다. 면역원으로서의 TIM-3은, 실시예 1에서 얻어진 TIM-3 발현 L929 세포 또는 실시예 4에서 얻어진 가용형 세포막외 인간 TIM-3을 사용했다. 피면역 동물은, Balb/C 마우스(일본 찰스·리버사에서 구입)를 사용했다.
우선, Balb/C 마우스에, TIM-3 발현 L929 세포를 마우스 1마리당 1×107개 복강내에 면역했다. 첫회 면역으로부터 이후, 동일 세포를 3회 또는 그 이상 면역했다. 비장을 취득하기 3일 전에, 실시예 4에서 얻어진 가용형 세포막외 인간 TIM-320μg/마우스 개체를 꼬리 정맥 투여했다. 면역된 마우스로부터 비장을 외과적으로 취득한 후, PBS 4mL 중에 비장을 넣고, 메쉬(셀 스트레이너:팔콘사제) 상에서 시린지의 피스톤을 사용하여 으깼다.
메쉬를 통과한 세포 현탁액을 원심 분리해서 세포를 침전시킨 후, 적혈구 세정 버퍼(시그마사제) 1mL로 재현탁했다. 실온에서 5분간의 인큐베이션 후, 무혈청 DMEM 배지 10mL를 가하고, 원심 분리에 의해 세포를 침전시켰다. 침전된 세포를 다시 무혈청 DMEM 배지에 현탁했다. 한편, 미엘로마 세포 SP2/0(ATCC 번호:CRL-1581)는 혈청 포함 DMEM 배지에서 37℃, 5% 탄산 가스 존재하에서 세포 농도가 1×106세포/mL를 초과하지 않도록 배양했다.
SP2/0 세포를 비장 유래 세포와 마찬가지로 무혈청 DMEM 배지 10mL로 세정하고, 무혈청 DMEM 배지에 현탁했다. 이들 비장 유래 세포의 현탁액과 마우스 미엘로마 현탁액을 세포수 5:1로 혼합하고, 원심 분리한 후, 상청을 완전하게 제거했다. 이 펠릿에, 융합제로서 50%(w/v) 폴리에틸렌글리콜 1500(베링거맨하임사제) 1mL를 피펫의 끝으로 펠릿을 교반하면서 천천히 첨가한 후, 미리 37℃로 가온해 둔 무혈청 DMEM 배지 1mL를 천천히 첨가했다.
이 세포 현탁액에 5mL의 무혈청 DMEM 배지를 천천히 첨가한 후, 10mL의 무혈청 DMEM 배지를 더 첨가하고, 37℃, 5% 탄산 가스 존재하에서 5분간 정치했다. 원심 분리 후, 상청을 제거해서 얻어진 융합 세포를, IL-6 포함 DMEM 배지 50mL에 현탁하여, 37℃, 5% 탄산 가스 존재하에서 배양했다. 다음날, 세포를 피펫팅에 의해 회수하고, 원심 분리에 의해 침전된 세포 펠릿을 10mL의 IL-6 포함 DMEM 배지에 재현탁했다. 다음날, HAT(시그마사제)를 첨가하고, 약 7 내지 10일 후 배양 상청을 회수하여 하이브리도마 스크리닝에 사용했다.
[실시예 8]
(인간 TIM-3에 결합하는 인간 및 마우스 모노클로날 항체 생산 하이브리도마의 스크리닝)
실시예 6 및 7에서 제조한 세포 상청을 사용하여 하이브리도마의 스크리닝을 행했다. 방법은, 인간 TIM-3 안정 발현 세포주를 이용한 유세포분석법으로 행했다. 우선, 실시예 1에서 얻어진 인간 TIM-3 발현 주르카트 세포 또는 EoL-1 세포를 스테이닝 미디움(2% FCS 및 0.05% 아지화나트륨을 포함하는 PBS)으로 세정하고, 1mL당 1×107개가 되도록 다시 스테이닝 미디움으로 현탁했다. 세포 현탁액을 96웰 플레이트에 10μL씩 옮겼다.
또한, 하이브리도마의 상청 50μL를 가하고, 4℃, 30분간 정치했다. 스테이닝 미디움으로 2회 세정한 후, 스테이닝 미디움으로 200배 희석한 표지 항체를 50μL씩 가하고, 4℃, 30분간 정치했다. 표지 항체는, 인간 모노클로날 항체에 대해서는 염소 F(ab')2 항 인간 IgG(γ쇄 특이적)-R-PE(서던 바이오테크사제)를, 마우스 모노클로날 항체에 대해서는 염소 F(ab')2 항 마우스 IgG(H+L)R-PE(서던 바이오테크사제)를 사용했다.
스테이닝 미디움으로 2회 세정한 후, FACSCalibur(비디 바이오사이언시즈사제)로 해석하여, 1차 스크리닝으로 했다. 포지티브 클론을 확대 배양한 후, FACSAria(비디 바이오사이언시즈사제)로 클론 소팅하여, 하이포크산틴-티미딘(이하, HT라고 기재함, 시그마사제)을 포함한 IL-6 포함 DMEM 배지에서 약 7일 배양했다.
회수한 상청에 대해 1차 스크리닝과 마찬가지로 스크리닝을 행하고, 항 인간 TIM-3 인간 모노클로날 항체 생산 하이브리도마 및 항 인간 TIM-3 마우스 모노클로날 항체 생산 하이브리도마를 클로닝하여, 모노클로날 항체의 정제에 사용했다.
[실시예 9]
(하이브리도마 유래 모노클로날 항체의 정제)
실시예 8에서 취득한 항 인간 TIM-3 인간 또는 마우스 모노클로날 항체 생산 하이브리도마로부터, 항 TIM-3 인간 또는 마우스 모노클로날 항체를 정제했다. 간단하게는, CELLine 항체 생산 시스템(비디 바이오사이언시즈사제)을 사용하여 고농도로 항 TIM-3 항체를 포함하는 하이브리도마 상청을 조제하고, 항 인간 TIM-3 모노클로날 항체를 정제했다. 우선, 클론화된 하이브리도마를 무혈청 배양지에 순화시키기 위해서, HT를 포함한 IL-6 포함 DMEM 배지와 BD 세포 MAb 무혈청 배양지(비디 바이오사이언시즈사제)를 1:1로 혼합한 배지에서 수일간 배양하고, 1:2로 혼합한 배지에서 수일간 더 배양했다.
그 후, BD 세포 MAb 무혈청 배양지(비디 바이오사이언시즈사제)에서 배양하여, 하이브리도마를 무혈청화했다. 무혈청화한 하이브리도마는 CL-1000 플라스크 등에서 매뉴얼에 따라 배양하고, 고농도로 항 TIM-3 항체를 포함하는 하이브리도마 상청을 회수했다. 하이브리도마 상청으로부터의 항체 정제는 프로테인 A를 사용한 표준적인 방법으로 실시했다.
구체적으로는, MabSelect(GE 헬스케어사제)를 오픈 칼럼에 채우고, PBS로 2배 희석한 상청을 통과시키고, 0.1mol/L Glycin-HCl(pH2.7)을 사용하여 용출하고, 아미콘 울트라(밀리포어사제)를 사용하여 농축했다. 그 후, NAP-5 칼럼(GE 헬스케어사제)으로 PBS로 치환하여 여과 멸균함으로써, 정제 항 인간 TIM-3 인간 모노클로날 항체를 4클론(512 항체, 644 항체, 4545 항체, 4177 항체), 정제 항 인간 TIM-3 마우스 모노클로날 항체를 1클론(8213 항체) 취득했다.
[실시예 10]
(항 TIM-3 인간 모노클로날 항체의 아이소 타입의 결정)
실시예 9에서 얻어진 항 TIM-3 인간 모노클로날 항체의 아이소 타입은, 항원 고상 ELISA법 및 유세포분석법에 의해 결정했다.
구체적으로는, 항원 고상 ELISA법에서는, 우선, 실시예 4에서 얻어진 가용형 세포막외 인간 TIM-3을 1μg/mL 카르보네이트-바이카르보네이트 버퍼(시그마사제)로 조제한 것을 50μL, ELISA용 96 구멍 마이크로 플레이트(팩시소르프(Maxisorp), 눙크사제)의 각 웰에 가했다. 4℃에서 밤새 인큐베이트하여, 가용형 세포막외 인간 TIM-3을 마이크로 플레이트에 흡착시켰다.
상청을 버린 후, TBS 중 수퍼블록 블로킹 버퍼(SuperBlock Blocking Buffer in TBS)(피어스(PIERCE)사제)를 가하고, 실온에서 10분간 인큐베이트하고, 하이브리도마 배양 상청 50μL를 더 첨가하고, 실온에서 30분간 인큐베이트했다. 각 웰을 0.1% 트윈-20 함유 트리스 완충 생리식염수(TBS-T)로 세정한 후, HRP로 표지된 마우스 항 인간 IgG1 항체, 마우스 항 인간 IgG2 항체, 마우스 항 인간 IgG3 항체 또는 마우스 항 인간 IgG4 항체(10% 수퍼블록 블로킹 버퍼 함유 TBS-T로 각각 2000, 2000, 2000, 4000배 희석한 것; 서던 바이오테크사제)를 각각 50μL 가하고, 실온하에서 30분간 인큐베이트했다.
각 웰을 TBS-T로 세정하고, 기질 완충액(TMB, DAKO사제)을 50μL 가하고, 실온하에서 20분간 인큐베이트한 후, 0.5mol/L 황산(와코쥰야쿠 고교 가부시키가이샤제)을 50μL 가하여 반응을 정지시켰다. 파장 450nm(참조 파장 570nm)에서의 흡광도를 마이크로플레이트 리더(베르사맥스(VersaMax), 몰레큘러 디바이스사제)로 측정했다.
또한, 유세포분석법에서는, 우선 실시예 1에서 얻어진 인간 TIM-3 발현 주르카트 세포를 스테이닝 미디움으로 세정한 후, 하이브리도마의 상청 50μL를 가하여, 4℃, 30분간 정치했다. 세정 후, 스테이닝 미디움으로 100배 정도로 희석한 마우스 항 인간 IgG1-PE, 마우스 항 인간 IgG2-PE, 마우스 항 인간 IgG3(Hinge)-PE 및 마우스 항 인간 IgG 4(Fc)-PE(모두 서던 바이오테크사제)를 각각 50μL씩 가하고, 4℃, 30분간 정치하고, FACSCalibur(비디 바이오사이언시즈사제)로 해석했다.
이상의 결과로부터, 512 항체, 644 항체, 4545 항체의 아이소 타입은 각각, IgG1, IgG4, IgG2인 것이 명확해졌다.
[실시예 11]
(인간 TIM-3에 대한 마우스 모노클로날 항체의 아이소 타입의 결정)
실시예 9에서 얻어진 항 인간 TIM-3 마우스 모노클로날 항체의 아이소 타입은, 아이소스트립 마우스 모노클로날 항체 아이소타이핑 키트(IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit)(로슈·다이아그노스틱사제)를 사용하여 결정했다. 실시예 8에서 얻어진 항 TIM-3 항체를 포함하는 하이브리도마 상청을 사용하여, 매뉴얼에 따라서 조작했다. 그 결과, 8213 항체의 아이소 타입은 IgG2b인 것이 명확해졌다.
[실시예 12]
(항 TIM-3 모노클로날 항체 유전자의 단리)
실시예 9에서 취득된 항 인간 TIM-3 인간 또는 마우스 모노클로날 항체 생산 하이브리도마로부터 항 TIM-3 인간 또는 마우스 모노클로날 항체 유전자를 단리했다. 전체 RNA의 추출은, 클론화한 하이브리도마로부터 고순도 RNA 단리 키트(High Pure RNA Isolation Kit)(로슈·다이아그노스틱사제)를 사용하여 매뉴얼에 따라 실시했다. 항체 cDNA의 가변 영역의 클로닝은, SMART RACE cDNA 증폭 키트(클론테크사제)를 사용하여, 첨부의 설명서에 따라서 행했다.
인간 모노클로날 항체 중쇄(VH)의 PCR에는, UPM(SMART RACE cDNA 증폭 키트;클론테크사제)과 프라이머 hh-6(배열 번호 44)을 사용하고, 또한 이 반응액의 일부를 주형으로 해서, NUP(SMART RACE cDNA 증폭 키트;클론테크사제)와 프라이머 hh-3(배열 번호 45)을 사용했다. PCR 산물을 제로 블런트(Zero Blunt) TOPO PCR 클로닝 키트(인비트로젠사제) 등을 사용하여 클로닝하고, 벡터의 유니버설 프라이머(예를 들어, T7 또는 M13R 프라이머)를 사용하여 염기 배열 및 아미노산 배열을 해석했다.
그 결과, 512 항체의 VH는 염기 배열이 배열 번호 54, 아미노산 배열이 55로 나타내고, 644 항체의 VH는 염기 배열이 배열 번호 58, 아미노산 배열이 59로 나타내고, 4545 항체의 VH는 염기 배열이 배열 번호 7, 아미노산 배열이 배열 번호 8로 나타내고, 4177 항체의 VH는 염기 배열이 배열 번호 17, 아미노산 배열이 배열 번호 18로 나타내는 것이 명확해졌다. 얻어진 각 가변 영역과 인간 IgG1의 정상 영역을 발현 벡터 N5KG1(바이오진 아이디이씨사(Biogen IDEC Inc)제)에 끼워넣어 연결했다.
인간 모노클로날 항체 경쇄(VL)의 PCR에는, UPM(SMART RACE cDNA 증폭 키트;클론테크사제)과 프라이머 hk-2(배열 번호 46)를 사용하고, 또한 이 반응액의 일부를 주형으로 해서 NUP(SMART RACE cDNA 증폭 키트;클론테크사제)와 프라이머 hk-6(배열 번호 47)을 사용했다. PCR 산물을 제로 블런트 TOPO PCR 클로닝 키트(인비트로젠사제) 등을 사용하여 클로닝하고, 벡터의 유니버설 프라이머(예를 들어, T7 또는 M13R 프라이머)를 사용하여 염기 배열 및 아미노산 배열을 해석했다.
그 결과, 512 항체의 VL은 염기 배열이 배열 번호 56, 아미노산 배열이 57로 나타내고, 644 항체의 VL은 염기 배열이 배열 번호 60, 아미노산 배열이 61로 나타내고, 4545 항체의 VL은 염기 배열이 배열 번호 9, 아미노산 배열이 배열 번호 10으로 나타내고, 4177 항체의 VH는 염기 배열이 배열 번호 19, 아미노산 배열이 배열 번호 20으로 나타내는 것이 명확해졌다. 얻어진 각 가변 영역과 κ쇄의 정상 영역을 발현 벡터 N5KG1(바이오진 아이디이씨사제)에 끼워넣어 연결했다.
마우스 모노클로날 항체 중쇄(VH)의 PCR에는, UPM(SMART RACE cDNA 증폭 키트;클론테크사제)과 프라이머 mH_Rv1(배열 번호 48)을 사용하고, 또한 이 반응액의 일부를 주형으로 해서 NUP(SMART RACE cDNA 증폭 키트;클론테크사)와 프라이머 mH_Rv2(배열 번호 49)를 사용했다.
PCR 산물을 제로 블런트 TOPO PCR 클로닝 키트(인비트로젠사제) 등을 사용하여 클로닝하고, 벡터의 유니버설 프라이머(예를 들어, T7 또는 M13R 프라이머)를 사용하여 염기 배열 및 아미노산 배열을 해석했다.
그 결과, 8213 항체의 VH는 염기 배열이 배열 번호 27, 아미노산 배열이 배열 번호 28로 나타내는 것이 명확해졌다. 얻어진 가변 영역과 마우스 IgG2a 정상 영역을 연결하고, 발현 벡터 N5KG1(바이오진 아이디이씨사제)에 끼워넣었다.
마우스 모노클로날 항체 경쇄(VL)의 PCR에는, UPM(SMART RACE cDNA 증폭 키트;클론테크사제)과 프라이머 mK_Rv1(배열 번호 50)을 사용하고, 또한 이 반응액의 일부를 주형으로 해서 NUP(SMART RACE cDNA 증폭 키트;클론테크사제)와 프라이머 mK_Rv2(배열 번호 51)를 사용했다. PCR 산물을 제로 블런트 TOPO PCR 클로닝 키트(인비트로젠사제) 등을 사용하여 클로닝하고, 벡터의 유니버설 프라이머(예를 들어, T7 또는 M13R 프라이머)를 사용하여 염기 배열 및 아미노산 배열을 해석했다.
그 결과, 8213 항체의 VL은 염기 배열이 배열 번호 29, 아미노산 배열이 배열 번호 30으로 나타내는 것이 명확해졌다. 얻어진 가변 영역과 마우스 κ쇄의 정상 영역을 연결하고, 상술한 8213 항체의 VH를 내장한 발현 벡터에 삽입했다.
또한, 음성 컨트롤로서 항 디니트로페놀(DNP) 인간 IgG1 항체를 얻기 위해서, 항중쇄(VH)의 염기 배열(배열 번호 62), 항체 경쇄(VL)의 염기 배열(배열 번호 64), 인간 IgG1 및 κ쇄의 정상 영역을 발현 벡터 N5KG1(바이오진 아이디이씨사제)에 끼워넣었다.
[실시예 13]
(재조합 항 TIM-3 인간 모노클로날 데푸코스 항체의 정제)
실시예 12에서 구축한 재조합형 항체 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하여, 재조합형 항체 발현 세포를 제조했다. 발현을 위한 숙주 세포는, 이미 알려져 있는 보고에 따라서 FUT8-/-CHO 세포를 사용했다 (Clin Cancer Res 2006:12(9)Iida et al.). 우선, 실시예 12에서 얻어진 512, 644, 4545 또는 4177의 발현 벡터를 프리스타일TM MAX 시약(FreeStyleTM MAX Reagent)(인비트로젠사제)를 사용하여 FUT8-/-CHO 세포에 각각 도입했다. FUT8-/-CHO 세포는, 쉐이커를 사용하여 CO2 5%, 37℃의 환경하에서 배양하고, 약 5일 후에 배양 상청을 회수했다.
회수한 배양 상청을 프로테인 A(GE 헬스케어사제) 및 정제량에 따라서 0.8×40cm 칼럼(바이오래드사제) 등을 사용하고, 흡착 완충액으로서 PBS, 용출 완충액으로서 0.02mol/L 구연산나트륨 완충액(pH2.7, 50mmol/L NaCl)을 사용하여 친화도 정제했다. 용출 획분은 0.2mol/L 인산나트륨 완충액(pH7.0)을 첨가했다.
조제된 항체 용액은, NAP-25(GE 헬스케어사제) 및 아미콘 울트라(10000컷트, 밀리포어사제)를 사용하여 PBS로 치환 및 농축하고, 여과 멸균한 후, 재조합 항 TIM-3 인간 모노클로날 데푸코스 항체(512 항체, 644 항체, 4545 항체, 4177 항체)를 얻었다. 리뮬러스 ES-II 키트 와코(와코쥰야쿠사제)를 사용하여 정제도를 측정하여, 충분히 정제되어 있음을 확인했다.
또한, 실시예 12에서 얻어진 항 DNP 항체의 발현 벡터를 CHO-DG44 세포에 도입했다. CHO-DG44 세포는, 쉐이커를 사용하여 CO2 5%, 37℃의 환경하에서 배양하고, 약 5일 후에 배양 상청을 회수했다. 회수한 배양 상청을 마찬가지로 정제 프로테인 A(GE 헬스케어사제) 및 정제량에 따라서 0.8×40cm 칼럼(바이오래드사제) 등을 사용하고, 흡착 완충액으로서 PBS, 용출 완충액으로서 0.02mol/L 구연산나트륨 완충액(pH2.7, 50mmol/L NaCl)을 사용하여 친화도 정제했다. 용출 획분은 0.2mol/L 인산나트륨 완충액(pH7.0)을 첨가했다. 조제된 항체 용액은, NAP-25(GE 헬스케어사제) 및 아미콘 울트라(10000컷트, 밀리포어사제)를 사용하여 PBS로 치환 및 농축하고, 여과 멸균한 후, 재조합 항 DNP 항체를 얻었다. 리뮬러스 ES-II 키트 와코(와코쥰야쿠사제)를 사용하여 정제도를 측정하여, 충분히 정제되어 있음을 확인했다.
[실시예 14]
(재조합 항 TIM-3 마우스 모노클로날 항체의 정제)
실시예 12에서 얻어진 8213 항체의 발현 벡터는, 293 펙틴(인비트로젠사제)을 사용하여 HEK293F 세포(인비트로젠사제)에 도입했다. HEK293F 세포는, 쉐이커를 사용하여 CO2 5%, 37℃의 환경하에서 배양하고, 약 5일 후에 배양 상청을 회수했다. 회수한 배양 상청을 프로테인 A(GE 헬스케어사제) 및 정제량에 따라서 0.8×40 cm 칼럼(바이오래드사제) 등을 사용하고, 흡착 완충액으로서 PBS, 용출 완충액으로서 0.02mol/L 구연산나트륨 완충액(pH2.7, 50mmol/L NaCl)을 사용하여 친화도 정제했다.
용출 획분은 0.2mol/L 인산나트륨 완충액(pH7.0)을 첨가했다. 조제된 항체 용액은, NAP-25(GE 헬스케어사제) 및 아미콘 울트라(10000컷트, 밀리포어사제)를 사용하여 PBS로 치환 및 농축하고, 여과 멸균한 후, 재조합 항 TIM-3 마우스 모노클로날 항체(8213 항체)를 얻었다. 리뮬러스 ES-II 키트 와코(와코쥰야쿠사제)를 사용하여 정제도를 측정하여, 충분히 정제되어 있음을 확인했다.
[실시예 15]
(정제 모노클로날 항체의 형광 표지)
하이브리도마 유래 모노클로날 항체 및 재조합 모노클로날 항체의 형광 표지는, 알렉사 플루오르 647 모노클로날 항체 라벨링 키트(알렉사 플루오르 647 Monoclonal Antibody Labeling Kit)(인비트로젠사제)를 사용하여 매뉴얼에 따라 실시했다. 표지 조작 후, TIM-3 발현 세포에 대한 FACSCalibur(비디 바이오사이언시즈사제)에 의해, 각 항체가 알렉사 플루오르 647(이하, Alexa-647이라고 기재함)로 표지되어 있는 것을 확인했다.
[실시예 16]
(경합 시험에 의한 에피토프 분류-1)
실시예 13 및 14에서 얻어진 항체 및 시판의 항 TIM-3 항체인 344823 항체(클론 344823, 알앤디 시스템즈사제)의 에피토프의 관계를 경합 시험으로 검토했다. 간단하게는, 피검 항체를 실시예 1에서 얻어진 TIM-3 발현 세포에 반응시켜, 표지한 별도의 항 TIM-3 항체가 TIM-3 발현 세포에 더 결합할 수 있는지를 유세포분석법으로 평가했다.
제1 단계로서, 실시예 13 및 14에서 제조한 모노클로날 항체(512 항체, 644 항체, 4545 항체, 4177 항체, 8213 항체)와 344823 항체의 경합 유무를 각각 검토했다. 우선, 스테이닝 미디움으로 세정한 인간 TIM-3 발현 EoL-1 세포와 친주 EoL-1 세포에 정제한 피검 모노클로날 항체(512 항체, 644 항체, 4545 항체, 4177 항체, 8213 항체)를 각각 반응시켰다(4℃ 30분간). 최종 농도는 10μg/mL로 했다. 계속해서, PE 표지 344823 항체(클론 344823, 알앤디 시스템즈사제)를 첨가하여 반응시켰다(4℃ 30분간). 스테이닝 미디움으로 세정한 후, 7-AAD(비디 바이오사이언시즈사제)를 가하여, FACSCalibur(비디 바이오사이언시즈사제)로 해석했다.
그 결과, 양성 대조로서 사용한 염소 유래 항 인간 TIM-3 폴리클로날 항체(알앤디 시스템즈사제) 및 644 항체는 PE 표지 344823 항체의 TIM-3 발현 세포에 대한 결합을 거의 완전하게 저해했다. 한편, 512, 4545 및 8213 항체는 PE 표지 344823 항체의 TIM-3 발현 세포에 대한 결합을 저해하지 않았다. 또한, 4177 항체는, PE 표지 344823 항체의 TIM-3 발현 세포에 대한 결합을 저해했지만, 그 저해는 644 항체에 비하면 매우 낮았다. 따라서, 644 항체는 344823 항체와 경합하는 한편, 512, 4545 및 8213 항체는 344823 항체와 경합하지 않고, 4177 항체는 344823 항체와 경합하지만, 그 경합은 부분적인 것임이 명확해졌다.
제2 단계로서, 지금까지 테스트한 항 TIM-3 모노클로날 항체 중, 344823 항체와 경합하지 않는 512, 4545 및 8213 항체의 경합 유무를 검토했다. 방법은, 표지 항체로서 실시예 15에서 얻어진 Alexa-647 표지 512 항체 또는 Alexa-647 표지 8213 항체를 사용한 것 외에는, 제1 단계와 마찬가지로 했다. 그 결과, 4545 및 8213 항체는, Alexa-647 표지 512 항체의 TIM-3 발현 세포에 대한 결합을 저해하지 않았다.
한편, 4545 항체는, Alexa-647 표지 8213 항체의 TIM-3 발현 세포에 대한 결합을 저해했다. 따라서, 4545 항체와 8213 항체는 경합하는 한편, 이들 2 항체는 512 항체와 경합하지 않는 것이 명확해졌다. 이 결과는, 512 항체는, 344823 항체 및 8213 항체와 상이한 에피토프를 인식하는 것을 시사하고 있다.
제3 단계로서, 제1 단계에서 344823 항체와 부분적으로 경합하는 것이 명확해진 4177 항체에 대하여, 512 및 8213 항체와의 경합 유무를 검토했다. 방법은, 제2 단계와 마찬가지로 했다. 그 결과, 4177 항체는, Alexa-647 표지 512 항체의 TIM-3 발현 세포에 대한 결합을 저해하지 않는 한편, Alexa-647 표지 8213 항체의 TIM-3 발현 세포에 대한 결합을 저해한 점에서, 4177 항체는 512 항체와 경합하지 않고, 8213 항체와 경합하는 것이 명확해졌다.
이상의 결과로부터, 실시예 13 및 14에서 얻어진 5 항체 중, 644 항체는 344823 항체가 인식하는 에피토프의 근방을 인식하고, 512 항체는 344823 항체 또는 다른 4 항체(644 항체, 4545 항체, 4177 항체, 8213 항체)가 인식하는 에피토프와 상이한 에피토프를 인식하는 것이 시사되었다.
또한, 8213 항체는 344823 항체 또는 512 항체가 인식하는 에피토프와는 다른 에피토프를 인식하는 것이 시사되었다. 4545 항체는 이 8213 항체가 인식하는 에피토프의 근방을 인식하는 것이 시사되었다. 한편, 4177 항체는 8213 항체가 인식하는 에피토프의 근방과 함께, 344823 항체가 인식하는 에피토프의 근방도 약간은 인식하는 것이 시사되었다.
[실시예 17]
(재조합 항 TIM-3 인간 모노클로날 데푸코스 항체에 의한 항체 의존적 세포 상해 활성 시험)
항체를 통한 세포성의 세포 상해 활성은, 항체의 존재하에서 이펙터로서 인간 말초혈 유래 단핵구(Peripheral Blood Mononuclear Cells; 이하, PBMC라고 기재함)를 사용하여, 표적 세포에 대한 ADCC 활성의 측정을 실시했다. 우선, 건강한 지원자로부터 말초혈을 채취하고, 항응고제를 첨가했다. 이 혈액을 피콜-플라크 플러스(Ficoll-Plaque Plus)(GE 헬스케어사제) 상에 정치하고, 계면을 흐트러뜨리지 않도록 대형 원심 분리기(CF9RX, 히타치코키사제)를 사용하여 2000rpm으로 20분간 원심 분리했다.
세포가 포함되는 중간층을 모아 PBS를 사용하여 세정하고, 900rpm 20분간의 원심 분리에 의해 혈소판을 제거한 것을 PBMC로서 측정에 사용했다. 다음으로, 표적 세포로 사용하는 다우디(Daudi) 세포와 PBMC를 이펙터/표적 비=50으로 혼합했다.
실시예 13 및 14에서 얻어진 재조합 항 TIM-3 인간 모노클로날 데푸코스 항체(512 항체, 644 항체, 4545 항체, 4177 항체) 및 인간 IgG1 컨트롤로서 항 DNP 항체를 각각 배지에 현탁하여, 최종 농도 1μg/mL, 토털 100μL가 되도록 첨가했다. 혼합 후, 37℃, 5% CO2 존재하에서 4시간 배양했다. 배지 중에 방출된 LDH량으로부터, 표적 세포의 용해도를 평가했다. LDH의 측정과 용해도의 산출은, 사이톡스 96 비방사성 세포독성 어세이(CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay)(프로메가사제)를 사용하여 매뉴얼에 따랐다. 유의차 검정은 표준적인 스튜던트 t 검정(Student's t-test)을 사용하고, 위험률(p)이 0.05 이하인 것을 유의하게 다른 것으로 했다.
다우디 세포에 대한 ADCC 활성을 측정한 결과, 항 DNP 항체와 비교하여, 4545 항체 및 4177 항체는 표적 세포 용해율의 현저한 증가가 인정되었다. 이 결과는, 항 TIM-3 마우스 항체 8213, 및 항 TIM-3 마우스 항체 8213과 경합하는 항 TIM-3 항체는, 높은 ADCC 활성을 갖는 것을 시사하고 있다.
마찬가지로, 실시예 13에서 얻어진, 재조합 항 TIM-3 인간 모노클로날 데푸코스 항체(4545 항체, 4177 항체), 시판 항 인간 TIM-3 모노클로날 항체인 344823 항체, 및 네거티브 컨트롤로서 항 DNP 항체를 사용하여, 마찬가지로 ADCC 활성의 측정을 실시했다.
우선, 건강한 지원자로부터 말초혈을 채취하고, 항응고제를 첨가했다. 이 혈액을 피콜-플라크 플러스(GE 헬스케어사제) 상에 정치하고, 계면을 흐트러뜨리지 않도록 대형 원심 분리기(CF9RX, 히타치코키사제)를 사용하여 2000rpm으로 20분간 원심 분리했다. 세포가 포함되는 중간층을 모으고, PBS를 사용하여 세정하고, 900rpm 20분간의 원심 분리에 의해 혈소판을 제거한 것을 PBMC로서 측정에 사용했다.
다음으로, 표적 세포에 사용하는 다우디 세포와 PBMC를 이펙터/표적 비=25로 혼합했다. 4545 항체, 4177 항체, 344823 항체, 항 DNP 항체 및 PBS를 배지에 현탁하여, 최종 농도 1μg/mL, 토털 100μL가 되도록 첨가했다. 혼합 후, 37℃, 5% CO2 존재하에서 4시간 배양했다. 배지 중에 방출된 LDH량으로부터, 표적 세포의 용해도를 평가했다.
LDH의 측정과 용해도의 산출은, 사이톡스 96 비방사성 세포독성 어세이(프로메가사제)를 사용하고, 매뉴얼에 따랐다. 유의차 검정은 표준적인 스튜던트 t 검정을 사용하고, 위험률(p)이 0.05 이하인 것을 유의하게 다른 것으로 했다. 다우디 세포에 대한 ADCC 활성을 측정한 결과, 4545 항체 및 4177 항체는, 항 DNP 항체와 비교하여 표적 세포 용해율의 유의한 증가가 인정되었다. 한편, 344823 항체는, 항 DNP 항체 및 PBS와 비교하여 표적 세포 용해율의 유의한 증가는 인정되지 않았다.
[실시예 18]
(항 TIM-3 항체를 사용한 결합 해리 상수의 산출)
항 TIM-3 항체의 결합 해리 상수를 표면 플라스몬 공명의 원리에 의한 해석 장치(Biacore, GE 헬스케어사제)를 사용하여 해석했다. 간단하게는, 항 인간 항체 또는 항 마우스 항체를 CM5 센서 칩에 고상화하고, 다음으로 항 TIM-3 인간 또는 마우스 항체를 흐르게 하여 결합시키고, 계속해서 실시예 4에서 제조한 가용형 세포막외 인간 TIM-3을 흐르게 함으로써, 항 TIM-3 항체에 대한 TIM-3의 결합 해리를 관찰했다. 전체 실험 공정을 통해, 기본적으로는 GE 헬스케어사의 결합 해리 상수 산출을 위한 실험 방법을 참조했다.
구체적으로는, 센서 칩은 CM5(리서치 그레이드, GE 헬스케어사제)를 사용했다. 우선, CM5 칩을 400mmol/L EDC(N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드)와 100mmol/L NHS(N-히드록시숙신이미드)를 등량 혼합한 것을 CM5 칩에 흐르게 하여 활성화시켰다. 다음으로, 인간 항체 캡처 키트(Human Antibody Capture Kit)(GE 헬스케어사제) 부속의 항 인간 항체를 키트 부속의 용액에 희석하고 흐르게 하여, CM5 칩에 인간 항체에 대한 항체를 필요량 고상화시켰다.
또한, 마우스 항체에 관해서는, 마우스 항체 캡처 키트(Mouse Antibody Capture Kit)(GE 헬스케어사제) 부속의 마우스 항체에 대한 항체를 키트 부속의 용액에 희석하고 흐르게 하여, CM5 칩에 필요량 고상화시켰다. 다음으로, 1mol/L 에탄올아민 히드로클로라이드를 흐르게 하여, 활성화한 칩 표면을 블로킹하여 불활화시켰다.
다음으로, 항 TIM-3 항체를 1 플로우 셀에 1종류씩 HBS-EP 버퍼(GE 헬스케어사제)에 희석하고 흐르게 하여, 고상화된 인간 항체에 대한 항체 또는 마우스 항체에 대한 항체에 결합시켰다. 다음으로, 가용형 세포막외 인간 TIM-3을 흐르게 하였다. 결합한 항 TIM-3 항체 및 가용형 세포막외 인간 TIM-3을 해리시키기 위해서, 인간 항체 캡처 키트 부속의 3mol/L MgCl2, 또는 마우스 항체 캡처 키트 부속의 pH1.7 글리신-HCl을 키트 부속의 양을 흐르게 하였다.
여기까지의 공정을 1 스텝으로 하고, 마찬가지의 공정을 가용형 세포막외 인간 TIM-3에 대해서 복수의 농도로 반복함으로써, 결합 해리 상수를 산출하기 위한 데이터(센서 그램)를 취득했다. 분석물질로서 흐르게 한 가용형 세포막외 인간 TIM-3의 농도는, 280nm의 흡광도를 측정하여 1mg/mL를 1.4OD로서 산출했다.
가용형 세포막외 인간 TIM-3의 분자량은, 전기영동의 영동도로부터 약 42.8kDa로 산출했다. 해석은, 비아에밸루에이션(Biaevaluation) 소프트(GE 헬스케어사제)를 사용하고, 비아에밸루에이션 소프트웨어 핸드북을 참조했다. 구체적으로는, 키네틱스 해석의 동시 해석을 실시하고, 기본적으로 1:1 랭뮈어 결합(Langmuir Binding)의 반응 모델을 채용해서 피팅하여 결합 속도 상수(Ka) 및 해리 속도 상수(Kd)를 산출하고, Kd/Ka의 계산에 의해 해리 상수(KD)값을 산출했다.
항 인간 TIM-3 인간 모노클로날 항체의 KD값은, 대부분의 항체에서 10-9mol/L 오더가 되었다. 이것으로부터, TIM-3을 표적으로 한 ADCC 활성과 결합 친화성의 사이에 상관은 인정되지 않았다.
항 인간 TIM-3 마우스 모노클로날 항체는, 관찰한 한에 있어서(예를 들어 해리상을 30분 정도 관찰), 항원인 가용형 세포막외 인간 TIM-3과의 해리가 인정되지 않았다. 이것으로부터, 인간 TIM-3에 대하여 매우 높은 결합성을 갖는 모노클로날 항체를 제조할 수 있음이 나타났다.
[실시예 19]
(경합 시험에 의한 에피토프 분류-2)
항 TIM-3 항체인 512 항체, 644 항체, 4545 항체, 8213 항체, 344823 항체, F38-2E2 항체, 및 컨트롤인 항 DNP 항체의 에피토프를 경합 시험으로 검토했다. 간단하게는, 미표지의 피검 항체를 실시예 1에서 얻어진 TIM-3 발현 세포에 반응시켜, 형광 표지한 별도의 항 TIM-3 항체가 TIM-3 발현 세포에 더 결합할 수 있는지를 유세포분석법으로 평가했다.
스테이닝 미디움으로 세정한 인간 TIM-3 발현 EoL-1 세포에 정제한 피검 모노클로날 항체[항 DNP 항체, 512 항체, 644 항체, 4545 항체, 8213 항체, 344823 항체(알앤디 시스템즈사제), F38-2E2 항체(임게넥스(Imgenex)사제)]를 각각 반응시켰다(4℃ 30분간). 최종 농도는 10μg/mL로 했다. 계속해서, Alexa-647 또는 APC 표지 항 TIM-3 항체[344823 항체(알앤디 시스템즈사), F38-2E2 항체(이바이오사이언스사제)]를 첨가하여 반응시켰다(4℃ 30분간). 스테이닝 미디움으로 세정한 후, 7-AAD(비디 바이오사이언시즈사제)를 가하고, FACSCalibur(비디 바이오사이언시즈사제)로 해석했다.
결과를 표 1에 나타낸다. 표 1에서, 미표지 항 TIM-3 항체가 결합한 TIM-3 발현 세포에 대한 결합이 네거티브 컨트롤과 동일 정도로 인정되었을 경우를 "+", 미표지 항 TIM-3 항체가 결합한 TIM-3 발현 세포에 대한 결합이 감약하지만 인정되었을 경우를 "+/-", 미표지 항 TIM-3 항체가 결합한 TIM-3 발현 세포에 대한 결합이 인정되지 않았을 경우를 "-"로 나타냈다.
Figure 112012102327552-pct00001
표 1에 나타낸 바와 같이, Alexa-647 표지 512 항체는, 그 밖의 미표지 항 TIM-3 항체가 결합한 TIM-3 발현 세포에 대한 결합이 인정된 점에서, 644 항체, 4545 항체, 8213 항체, 344823 항체, F38-2E2 항체와는 경합하지 않는 독립된 에피토프를 인식하는 것이 시사되었다.
Alexa-647 표지 644 항체는, 미표지 항 TIM-3 항체 344823 항체 또는 F38-2E2 항체가 결합한 TIM-3 발현 세포에 대한 결합이 인정되지 않거나 또는 감약한 점에서, 344823 항체, F38-2E2 항체와 경합하는 서로 근접한 에피토프를 인식하는 것이 시사되었다.
Alexa-647 표지 4545 항체는, 미표지 항 TIM-3 항체 8213 항체가 결합한 TIM-3 발현 세포에 대한 결합이 인정되지 않은 점에서, 8213 항체와 경합하는 서로 근접한 에피토프를 인식하는 것이 시사되었다.
Alexa-647 표지 8213 항체는, 미표지 항 TIM-3 항체 4545 항체가 결합한 TIM-3 발현 세포에 대한 결합이 인정되지 않은 점에서, 4545 항체와 경합하는 서로 근접한 에피토프를 인식하는 것이 시사되었다.
APC 표지 344823 항체는, 미표지 항 TIM-3 항체 644 항체 또는 F38-2E2 항체가 결합한 TIM-3 발현 세포에 대한 결합이 인정되지 않거나 또는 감약한 점에서, 644 항체 또는 F38-2E2 항체와 경합하는 서로 근접한 에피토프를 인식하는 것이 시사되었다.
APC 표지 F38-2E2 항체는, 미표지 항 TIM-3 항체 644 항체 또는 344823 항체가 결합한 TIM-3 발현 세포에 대한 결합이 인정되지 않은 점에서, 644 항체 또는 344823 항체와 경합하는 서로 근접한 에피토프를 인식하는 것이 시사되었다.
[실시예 20]
(마우스 TIM-3 cDNA의 분자 클로닝)
마우스 TIM-3의 cDNA는 실시예 1과 마찬가지로 취득했다. Balb/c 마우스 유래 골수 세포로부터 고순도 RNA 단리 키트(로슈사제)를 사용하여 전체 RNA를 추출하고, 써모스크립트 RT-PCR 시스템(ThermoScript RT-PCR System)(인비트로젠사제)을 사용하여 주형 cDNA를 합성했다. 프라이머는, mTim-3 Fw3(배열 번호 70) 및 mTim-3 Re3(배열 번호 71)을 사용했다. pGEM-T 이지 벡터(프로메가사제)에 삽입한 후, DNA 배열 해석에 의해, 젠뱅크 검색 번호 AF450241의 코딩 영역과 동일한 염기 배열을 갖는 클론을 선정했다.
선정한 클론을 주형으로 한 PCR에 의해, pEF6/Myc-HisC 벡터(인비트로젠사제)의 NotI 부위에 삽입했다(mTim-3/pEF6 Myc_HisC). PCR의 프라이머로는, mTim-3 Fw4NotI(배열 번호 72) 및 mTim-3 Re4NotI(배열 번호 73)를 사용했다.
[실시예 21]
(hTim-3/pEF6 Myc_HisC의 구축)
실시예 1에서 제조한 hTIM-3/pMCs-IG 플라스미드 DNA와 pEF6 Myc_HisC를 각각 NotI로 소화하여, 인간 TIM-3 발현 pEF6 Myc_HisC 벡터를 구축했다(hTim-3/pEF6 Myc_HisC). DNA 배열 해석을 행하여, 젠뱅크 검색 번호 NM_032782의 코딩 영역과 동일한 염기 배열을 갖는 것을 확인했다.
[실시예 22]
(항 인간 TIM-3 항체의 마우스 TIM-3 항체에 대한 교차성 평가)
실시예 20 및 실시예 21에서 제조한 mTim-3/pEF6 Myc_HisC, hTim-3/pEF6 Myc_HisC 플라스미드 DNA, 및 컨트롤인 빈 벡터를 실시예 4와 마찬가지로 HEK293F 세포에 각각 트랜스펙션했다. 2일 후, 실시예 15와 마찬가지로 Alexa-647 표지한 항 인간 TIM-3 항체(512 항체, 644 항체, 4545 항체, 8213 항체), APC 표지 시판 항 인간 TIM-3 항체(344823 항체 및 F38-2E2 항체) 및 PE 표지 시판 항 마우스 TIM-3 항체(RMT3-23 항체, 바이오 레전드사제)의 인간 TIM-3 및 마우스 TIM-3에 대한 결합성을 유세포분석법으로 평가했다.
그 결과, 512 항체, 644 항체, 4545 항체, 8213 항체, 344823 항체 및 F38-2E2 항체는 인간 TIM-3 발현 293F 세포에만 결합했다. 한편, RMT3-23 항체는 마우스 TIM-3 발현 293F 세포에만 결합했다. 이것으로부터, 512 항체, 644 항체, 4545 항체, 8213 항체, 344823 항체 및 F38-2E2 항체는 마우스 TIM-3에는 교차 반응하지 않음을 알았다.
[실시예 23]
(IgV 도메인을 마우스 TIM-3으로 치환한 TIM-3 키메라 단백질 발현계의 구축)
hTim-3/pEF6 Myc_HisC 플라스미드 DNA를 주형으로 해서 hTIM3+mIgV_vecR1 프라이머(배열 번호 74) 및 hTIM3+mIgV_vecF1 프라이머(배열 번호 75)를 사용하고, PrimeSTAR GXL DNA 폴리머라아제(다카라 바이오사제)를 사용한 PCR로 증폭했다. mTim-3/pEF6 Myc_HisC 플라스미드 DNA를 주형으로 해서 hTIM3+mIgV_insF1 프라이머(배열 번호 76) 및 hTIM3+mIgV_insR1 프라이머(배열 번호 77)를 사용하고, PrimeSTAR GXL DNA 폴리머라아제(다카라 바이오사제)를 사용한 PCR로 증폭했다.
얻어진 2개의 PCR 산물을 GENEART 심리스 클로닝 앤드 어셈블리 키트(GENEART seamless cloning and assembly kit)(인비트로젠사제)를 사용하여 결합시켰다. 형질 전환체로부터 얻어진 클론의 배열을 해석하여, 목적하는 배열인 것을 확인했다(IgV 키메라 TIM-3/pEF6 Myc_HisC, 배열 번호 78).
[실시예 24]
(뮤신 도메인을 마우스 TIM-3으로 치환한 TIM-3 키메라 단백질 발현계의 구축)
hTim-3/pEF6 Myc_HisC 플라스미드 DNA를 주형으로 해서 hTIM3+mMucin_vecR2 프라이머(배열 번호 80) 및 hTIM3+mMucin_vecF2 프라이머(배열 번호 81)를 사용하고, PrimeSTAR GXL DNA 폴리머라아제(다카라 바이오사제)를 사용한 PCR로 증폭했다. mTim-3/pEF6 Myc_HisC 플라스미드 DNA를 주형으로 해서 hTIM3+mMucin_insF2 프라이머(배열 번호 82) 및 hTIM3+mMucin_insR2 프라이머(배열 번호 83)를 사용하고, PrimeSTAR GXL DNA 폴리머라아제(다카라 바이오사제)를 사용한 PCR로 증폭했다.
얻어진 2개의 PCR 산물을 GENEART 심리스 클로닝 앤드 어셈블리 키트(인비트로젠사제)를 사용하여 결합시켰다. 형질 전환체로부터 얻어진 클론의 배열을 해석하여, 목적하는 배열인 것을 확인했다(뮤신 키메라 TIM-3/pEF6 Myc_HisC, 배열 번호 84).
[실시예 25]
(IgV 도메인을 마우스 TIM-3으로 치환한 TIM-3 키메라 단백질 및 뮤신 도메인을 마우스 TIM-3으로 치환한 TIM-3 키메라 단백질에 대한 항 TIM-3 항체의 결합성 평가)
실시예 23 및 24에서 제조한 IgV 키메라 TIM-3/pEF6 Myc_HisC, 뮤신 키메라 TIM-3/pEF6 Myc_HisC, hTim-3/pEF6 Myc_HisC, mTim-3/pEF6 Myc_HisC 플라스미드 DNA, 및 컨트롤인 빈 벡터를 실시예 4와 마찬가지로 HEK293F 세포에 트랜스펙션했다. 2일 후, 실시예 22와 마찬가지로 항 TIM-3 항체의 결합성을 유세포분석법으로 평가했다.
그 결과, 512 항체, 644 항체, 4545 항체, 8213 항체, 4177 항체, 344823 항체 및 F38-2E2 항체는, 인간 TIM-3 발현 세포와 뮤신 키메라 TIM-3 발현 세포에만 결합했다. 한편, RMT3-23 항체는 마우스 TIM-3 발현 세포와 IgV 키메라 TIM-3 발현 세포에만 결합했다.
이것으로부터, 테스트한 모든 항 인간 TIM-3 항체(512 항체, 644 항체, 4545 항체, 8213 항체, 4177 항체, 344823 항체, F38-2E2 항체) 및 마우스 TIM-3 항체(RMT3-23 항체)는 IgV 도메인을 인식하는 것으로 나타났다.
[실시예 26]
(TIM-3 키메라 22-47/pEF6 Myc_HisC의 구축)
인간 TIM-3(배열 번호 53)의 22 내지 47번째에 상당하는 아미노산을 마우스 TIM-3으로 치환한 TIM-3 키메라 단백질을 발현시키기 위한 발현 벡터(이하, TIM-3 키메라 22-47이라고 기재함)를 구축했다. 방법은, 실시예 21에서 제조한 hTim-3/pEF6 Myc_HisC 플라스미드 DNA를 주형으로, hTIM3 키메라 22-47F1 프라이머(배열 번호 86) 및 hTIM3 키메라 22-47R1 프라이머(배열 번호 87)를 사용하고, PrimeSTAR GXL DNA 폴리머라아제(다카라 바이오사제)를 사용한 PCR로 증폭했다.
얻어진 PCR 산물을 주형으로, hTIM3 키메라 22-47F2 프라이머(배열 번호 88) 및 hTIM3 키메라 22-47R2 프라이머(배열 번호 89)를 사용하고, PrimeSTAR GXL DNA 폴리머라아제(다카라 바이오사제)를 사용한 PCR로 증폭했다.
얻어진 PCR 산물을 주형으로, hTIM3 키메라 22-47F3 프라이머(배열 번호 90) 및 hTIM3 키메라 22-47R3 프라이머(배열 번호 91)를 사용하고, PrimeSTAR GXL DNA 폴리머라아제(다카라 바이오사제)를 사용한 PCR로 증폭했다.
3번째의 PCR로 얻어진 PCR 산물을 DpnI(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)사제)로 소화한 후, 아가로스 전기영동했다. DNA를 추출하고, GENEART 심리스 클로닝 앤드 어셈블리 키트(인비트로젠사제)를 사용하여 결합시켰다. 형질 전환체로부터 얻어진 클론의 배열을 해석하여, 목적하는 배열인 것을 확인했다(TIM-3 키메라 22-47/pEF6 Myc_HisC, 배열 번호 92).
[실시예 27]
(TIM-3 키메라 57-66/pEF6 Myc_HisC의 구축)
인간 TIM-3(배열 번호 53)의 57 내지 66번째에 상당하는 아미노산을 마우스 TIM-3으로 치환한 TIM-3 키메라 단백질을 발현시키기 위한 발현 벡터(이하, TIM-3 키메라 57-66이라고 기재함)를 구축했다. 방법은, 실시예 21에서 제조한 hTim-3/pEF6 Myc_HisC 플라스미드 DNA를 주형으로, T4 폴리뉴클레오티드 키나아제(뉴 잉글랜드 바이오랩스사제)를 사용하여 인산화한 hTIM3 키메라 57-66F 프라이머(배열 번호 94) 및 hTIM3 키메라 57-66R 프라이머(배열 번호 95)를 사용하고, PrimeSTAR GXL DNA 폴리머라아제(다카라 바이오사제)를 사용한 PCR로 증폭했다.
얻어진 PCR산물을 DpnI(뉴 잉글랜드 바이오랩스사제)로 소화한 후, 아가로스 전기영동했다. DNA를 추출하여, 리가패스트TM 래피드 DNA 리게이션 시스템(LigaFastTM Rapid DNA Ligation System)(프로메가사제)을 사용하여 결합시켰다. 형질 전환체로부터 얻어진 클론의 배열을 해석하여, 목적하는 배열인 것을 확인했다(TIM-3 키메라 57-66/pEF6 Myc_HisC, 배열 번호 96).
[실시예 28]
(TIM-3 키메라 67-105/pEF6 Myc_HisC의 구축)
인간 TIM-3(배열 번호 53)의 67 내지 105번째에 상당하는 아미노산을 마우스 TIM-3으로 치환한 TIM-3 키메라 단백질을 발현시키기 위한 발현 벡터(이하, TIM-3 키메라 67-105라고 기재함)를 구축했다. hTim-3/pEF6 Myc_HisC 플라스미드 DNA를 주형으로 해서 hTIM3 키메라 67-105F 프라이머(배열 번호 98) 및 hTIM3 키메라 67-105R 프라이머(배열 번호 99)를 사용하고, PrimeSTAR GXL DNA 폴리머라아제(다카라 바이오사제)를 사용한 PCR로 증폭했다.
mTim-3/pEF6 Myc_HisC 플라스미드 DNA를 주형으로 해서 mTIM3 키메라 67-105F 프라이머(배열 번호 100) 및 mTIM3 키메라 67-105R 프라이머(배열 번호 101)를 사용하고, PrimeSTAR GXL DNA 폴리머라아제(다카라 바이오사제)를 사용한 PCR로 증폭했다. 얻어진 2개의 PCR 산물을 GENEART 심리스 클로닝 앤드 어셈블리 키트(인비트로젠사제)를 사용하여 결합시켰다. 형질 전환체로부터 얻어진 클론의 배열을 해석하여, 목적하는 배열인 것을 확인했다(TIM-3 키메라 67-105/pEF6 Myc_HisC, 배열 번호 102).
[실시예 29]
(TIM-3 키메라 74-81/pEF6 Myc_HisC의 구축)
인간 TIM-3(배열 번호 53)의 74 내지 81번째에 상당하는 아미노산을 마우스 TIM-3으로 치환한 TIM-3 키메라 단백질을 발현시키기 위한 발현 벡터(이하, TIM-3 키메라 74-81이라고 기재함)를 구축했다. 방법은, 실시예 21에서 제조한 hTim-3/pEF6 Myc_HisC 플라스미드 DNA를 주형으로, hTIM3 키메라 74-81F 프라이머(배열 번호 104) 및 hTIM3 키메라 74-81R 프라이머(배열 번호 105)를 사용하고, PrimeSTAR GXL DNA 폴리머라아제(다카라 바이오사제)를 사용한 PCR로 증폭했다.
얻어진 PCR 산물을 DpnI(뉴 잉글랜드 바이오랩스사제)로 소화한 후, 아가로스 전기영동했다. DNA를 추출하고, GENEART 심리스 클로닝 앤드 어셈블리 키트(인비트로젠사제)를 사용하여 결합시켰다. 형질 전환체로부터 얻어진 클론의 배열을 해석하여, 목적하는 배열인 것을 확인했다(TIM-3 키메라 74-81/pEF6 Myc_HisC, 배열 번호 106).
[실시예 30]
(TIM-3 키메라 88-96/pEF6 Myc_HisC의 구축)
인간 TIM-3(배열 번호 53)의 88 내지 96번째에 상당하는 아미노산을 마우스 TIM-3으로 치환한 TIM-3 키메라 단백질을 발현시키기 위한 발현 벡터(이하, TIM-3 키메라 88-96이라고 기재함)를 구축했다. 방법은, 실시예 21에서 제조한 hTim-3/pEF6 Myc_HisC 플라스미드 DNA를 주형으로, hTIM3 키메라 88-96F 프라이머(배열 번호 108) 및 hTIM3 키메라 88-96R 프라이머(배열 번호 109)를 사용하고, PrimeSTAR GXL DNA 폴리머라아제(다카라 바이오사제)를 사용한 PCR로 증폭했다.
얻어진 PCR 산물을 DpnI(뉴 잉글랜드 바이오랩스사제)로 소화한 후, 아가로스 전기영동했다. DNA를 추출하고, GENEART 심리스 클로닝 앤드 어셈블리 키트(인비트로젠사제)를 사용하여 결합시켰다. 형질 전환체로부터 얻어진 클론의 배열을 해석하여, 목적하는 배열인 것을 확인했다(TIM-3 키메라 88-96/pEF6 Myc_HisC, 배열 번호 110).
[실시예 31]
(TIM-3 키메라 96-105/pEF6 Myc_HisC의 구축)
인간 TIM-3(배열 번호 53)의 96 내지 105번째에 상당하는 아미노산을 마우스 TIM-3으로 치환한 TIM-3 키메라 단백질을 발현시키기 위한 발현 벡터(이하, TIM-3 키메라 96-105라고 기재함)를 구축했다. 방법은, 실시예 21에서 제조한 hTim-3/pEF6 Myc_HisC 플라스미드 DNA를 주형으로, hTIM3 키메라 96-105F 프라이머(배열 번호 112) 및 hTIM3 키메라 96-105R 프라이머(배열 번호 113)를 사용하고, PrimeSTAR GXL DNA 폴리머라아제(다카라 바이오사제)를 사용한 PCR로 증폭했다.
얻어진 PCR 산물을 DpnI(뉴 잉글랜드 바이오랩스사제)로 소화한 후, 아가로스 전기영동했다. DNA를 추출하고, GENEART 심리스 클로닝 앤드 어셈블리 키트(인비트로젠사제)를 사용하여 결합시켰다. 형질 전환체로부터 얻어진 클론의 배열을 해석하여, 목적하는 배열인 것을 확인했다(TIM-3 키메라 96-105/pEF6 Myc_HisC, 배열 번호 114).
[실시예 32]
(IgV 도메인의 일부를 마우스 TIM-3으로 치환한 TIM-3 키메라 단백질에 대한 항 TIM-3 항체의 결합성 평가)
실시예 26 내지 31에서 제조한 각종 TIM-3 키메라 단백질의 발현 벡터, 및 컨트롤인 빈 벡터를 실시예 4와 마찬가지로 HEK293F 세포에 각각 트랜스펙션했다. 도입된 발현 벡터 및 당해 벡터에 의해 발현하는 TIM-3 키메라 단백질은 다음과 같다.
(1) TIM-3 키메라 22-47:인간 TIM-3(배열 번호 53)의22 내지 47번째에 상당하는 아미노산을 마우스 TIM-3으로 치환한 TIM-3 키메라 단백질
(2) TIM-3 키메라 57-66:인간 TIM-3(배열 번호 53)의 57 내지 66번째에 상당하는 아미노산을 마우스 TIM-3으로 치환한 TIM-3 키메라 단백질
(3) TIM-3 키메라 67-105:인간 TIM-3(배열 번호 53)의 67 내지 105번째에 상당하는 아미노산을 마우스 TIM-3으로 치환한 TIM-3 키메라 단백질
(4) TIM-3 키메라 74-81:인간 TIM-3(배열 번호 53)의 74 내지 81번째에 상당하는 아미노산을 마우스 TIM-3으로 치환한 TIM-3 키메라 단백질
(5) TIM-3 키메라 88-96:인간 TIM-3(배열 번호 53)의 88 내지 96번째에 상당하는 아미노산을 마우스 TIM-3으로 치환한 TIM-3 키메라 단백질
(6) TIM-3 키메라 96-105:인간 TIM-3(배열 번호 53)의 96 내지 105번째에 상당하는 아미노산을 마우스 TIM-3으로 치환한 TIM-3 키메라 단백질
트랜스펙션한 2일 후, 실시예 22와 마찬가지로 항 TIM-3 항체의 결합성을 유세포분석법으로 평가했다.
그 결과를 표 2에 나타낸다. 표 2에서, 트랜스펙션한 세포에 대한 항체의 결합이 인정되었을 경우를 "+", 트랜스펙션한 세포에 대한 항체의 결합이 감약하지만 인정되었을 경우를 "+/-", 트랜스펙션한 세포에 대한 항체의 결합이 인정되지 않았을 경우를 "-"로 나타냈다.
Figure 112012102327552-pct00002
표 2에 나타낸 바와 같이, 4545 항체 및 8213 항체는, TIM-3 키메라 22-47, TIM-3 키메라 57-66, TIM-3 키메라 88-96, TIM-3 키메라 96-105를 트랜스펙션한 세포에 결합했다. 한편, TIM-3 키메라 67-105를 트랜스펙션한 세포에 결합하지 않았다.
512 항체는, TIM-3 키메라 57-66, TIM-3 키메라 88-96, TIM-3 키메라 96-105, TIM-3 키메라 67-105 및 TIM-3 키메라 74-81을 트랜스펙션한 세포에 결합했다. 한편, TIM-3 키메라 22-47을 트랜스펙션한 세포에 결합하지 않았다.
644 항체, 344823 항체 및 F38-2E2 항체는, TIM-3 키메라 22-47, TIM-3 키메라 88-96, TIM-3 키메라 96-105, TIM-3 키메라 67-105 및 TIM-3 키메라 74-81을 트랜스펙션한 세포에 결합했다. 한편, TIM-3 키메라 57-66을 트랜스펙션한 세포에 결합하지 않았다.
4177 항체는, TIM-3 키메라 88-96, TIM-3 키메라 96-105 및 TIM-3 키메라 74-81을 트랜스펙션한 세포에 결합했다. 또한, TIM-3 키메라 22-47, TIM-3 키메라 57-66, TIM-3 키메라 67-105를 트랜스펙션한 세포에 약하게 결합했다.
이상의 결과와 실시예 16 및 실시예 19의 결과로부터, 4545 항체 및 8213 항체는, 인간 TIM-3의 67 내지 87번째의 아미노산에 결합하는 것으로 나타났다. 또한, TIM-3 키메라 74-81을 트랜스펙션한 세포에 결합하지 않는 점에서, 4545 항체 및 8213 항체의 인간 TIM-3에 대한 결합에 필요한 아미노산이 74번째 내지 81번째의 아미노산에 포함되어 있는 것으로 시사되었다.
또한, 512 항체는 인간 TIM-3의 47번째까지의 아미노산에 결합하는 것, 644 항체, 344823 항체 및 F38-2E2 항체는 인간 TIM-3의 57 내지 66번째의 아미노산에 결합하는 것으로 시사되었다.
또한, 4177 항체는, 4545 항체 또는 8213 항체는 결합하는 한편 512 항체, 644 항체, 344823 항체 및 F38-2E2 항체는 결합하지 않는, 인간 TIM-3의 67 내지 87번째의 아미노산에 포함되는 아미노산 중 74 내지 81번째를 제외한 아미노산에도 결합하는 것으로 시사되었다.
[실시예 33]
(항 인간 TIM-38213 항체 인간화 항체의 제조)
(1) 8213 항체 인간화 항체의 VH 및 VL의 아미노산 배열의 설계
8213 항체 인간화 항체의 VH의 아미노산 배열을 이하와 같이 해서 설계했다. 8213 항체 VH의 CDR 1 내지 3의 아미노산 배열(배열 번호 21 내지 23)의 이식에 적합한 인간 항체의 VH의 FR의 아미노산 배열을 이하와 같이 해서 선택했다.
카바트 등은, 기지의 다양한 인간 항체의 VH를 그 아미노산 배열의 상동성으로부터 서브 그룹(HSG I 내지 III)으로 분류하고, 그들 서브 그룹마다 공통 배열을 보고하고 있다 [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services(1991)]. 따라서, 인간 항체의 VH의 서브 그룹 I 내지 III의 공통 배열의 FR의 아미노산 배열과 8213 항체 VH의 FR의 아미노산 배열의 상동성 검색을 실시했다.
상동성을 검색한 결과, HSGI, HSGII 및 HSGIII의 상동성은 각각 77.0%, 55.2%, 58.6%이었다. 따라서, 8213 항체 VH의 FR의 아미노산 배열은 서브 그룹 I과 가장 높은 상동성을 갖고 있었다.
이상의 결과로부터, 인간 항체의 VH의 서브 그룹 I의 공통 배열의 FR의 아미노산 배열의 적절한 위치에, 8213 항체 VH의 CDR의 아미노산 배열(배열 번호 21 내지 23)을 이식했다. 이와 같이 하여, 배열 번호 67로 나타내는 항 인간 TIM-38213 항체 인간화 항체의 VH의 아미노산 배열 8213 항체 HV0을 설계했다.
다음으로, 8213 항체 인간화 항체의 VL의 아미노산 배열을 이하와 같이 해서 설계했다. 8213 항체 VL의 CDR 1 내지 3의 아미노산 배열(배열 번호 24 내지 26)을 이식에 적합한 인간 항체의 VL의 FR의 아미노산 배열을 이하와 같이 해서 선택했다.
카바트 등은, 기지의 다양한 인간 항체의 VL을 그 아미노산 배열의 상동성으로부터 서브 그룹(HSG I 내지 IV)으로 분류하고, 그들 서브 그룹마다 공통 배열을 보고하고 있다 [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services(1991)]. 따라서, 인간 항체의 VL의 서브 그룹 I 내지 IV의 공통 배열의 FR의 아미노산 배열과 8213 항체 VL의 FR의 아미노산 배열의 상동성 검색을 실시했다.
상동성을 검색한 결과, HSGI, HSGII, HSGIII 및 HSGIV의 상동성은 각각 76.3%, 61.3%, 61.3%, 68.8%이었다. 따라서, 8213 항체 VL의 FR의 아미노산 배열은 서브 그룹 I과 가장 높은 상동성을 갖고 있었다.
이상의 결과로부터, 인간 항체의 VL의 서브 그룹 I의 공통 배열의 FR의 아미노산 배열의 적절한 위치에, 8213 항체 VL의 CDR의 아미노산 배열(배열 번호 24 내지 26)을 이식했다. 이와 같이 하여, 배열 번호 69로 나타내는 항 인간 TIM-38213 항체 인간화 항체의 VL의 아미노산 배열 8213 항체 LV0을 설계했다.
상기에서 설계한 8213 항체 인간화 항체의 VH의 아미노산 배열 8213 항체 HV0 및 VL의 아미노산 배열 8213 항체 LV0은, 선택한 인간 항체의 FR의 아미노산 배열에 마우스 모노클로날 항체인 8213 항체의 CDR의 아미노산 배열만을 이식한 배열이다.
그러나, 일반적으로 인간화 항체를 제조할 경우에는, 단순히 인간 항체의 FR에 마우스 항체의 CDR의 아미노산 배열을 이식하는 것만으로는 결합 활성이 저하하는 경우가 많다. 이러한 결합 활성의 저하를 회피하기 위해서, CDR의 아미노산 배열의 이식과 동시에, 인간 항체와 마우스 항체에서 서로 다른 FR의 아미노산 잔기 중, 결합 활성에 영향을 주는 것으로 생각되는 아미노산 잔기를 개변하는 것이 행해지고 있다. 따라서, 본 실시예에서도, 결합 활성에 영향을 주는 것으로 생각되는 FR의 아미노산 잔기를 이하와 같이 해서 동정하여 개변하는 것으로 했다.
우선, 상기에서 설계한 8213 항체 인간화 항체의 VH의 아미노산 배열 8213 항체 HV0 및 VL의 아미노산 배열 8213 항체 LV0을 포함하는 항체 V 영역(이하, HV0LV0이라고 기재함)의 3차원 구조를 컴퓨터 모델링의 방법을 사용하여 구축했다. 3차원 구조 좌표 제조 및 3차원 구조의 표시에는, 디스커버리 스튜디오(Discovery Studio)(액셀리스사)를 사용했다. 또한, 8213 항체의 V 영역의 3차원 구조의 컴퓨터 모델도 마찬가지로 하여 구축했다.
또한, HV0LV0의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 배열 중에서 8213 항체와 상이한 아미노산 잔기를 선택하고, 8213 항체의 아미노산 잔기로 개변한 아미노산 배열을 제조하여, 마찬가지로 3차원 구조 모델을 구축했다. 이들 제조한 8213 항체, HV0LV0 및 개변체의 각 V 영역의 3차원 구조를 비교하여, 항체의 결합 활성에 영향을 주는 것으로 예측되는 아미노산 잔기를 동정했다.
그 결과, HV0LV0의 FR의 아미노산 잔기 중에서 항원 결합 부위의 3차원 구조를 변화시켜서, 항체의 결합 활성에 영향을 주는 것으로 생각되는 아미노산 잔기로서, 8213 항체 HV0에서는 12번째의 Lys, 20번째의 Val, 38번째의 Arg, 40번째의 Ala, 48번째의 Met, 67번째의 Arg, 68번째의 Val, 70번째의 Ile, 72번째의 Ala, 74번째의 Thr, 98번째의 Arg 및 113번째의 Val을, 8213 항체 LV0에서는 11번째의 Leu, 13번째의 Ala, 15번째의 Val, 36번째의 Tyr, 43번째의 Ala, 44번째의 Pro, 46번째의 Leu, 71번째의 Phe 및 85번째의 Thr을 각각 선택했다.
이들 선택한 아미노산 잔기 중 적어도 1개 이상의 아미노산 배열을 8213 항체의 동일한 부위에 존재하는 아미노산 잔기로 개변하여, 다양한 개변을 갖는 인간화 항체의 VH 및 VL을 설계했다.
구체적으로는, VH에 대해서는, 배열 번호 67의 아미노산 배열의 12번째의 Lys를 Val로, 20번째의 Val을 Leu로, 38번째의 Arg를 Lys로, 40번째의 Ala를 Arg로, 48번째의 Met를 Ile로, 67번째의 Arg를 Lys로, 68번째의 Val을 Ala로, 70번째의 Ile를 Leu로, 72번째의 Ala를 Val로, 74번째의 Thr을 Lys로, 98번째의 Arg를 Gly로 또는 113번째의 Val을 Leu로 치환하는 아미노산 개변 중 적어도 1개의 개변을 도입했다.
또한, VL에 대해서는, 배열 번호 69의 아미노산 배열의 11번째의 Leu를 Met로, 13번째의 Ala를 Val로, 15번째의 Val을 Leu로, 36번째의 Tyr을 Leu로, 43번째의 Ala를 Ser로, 44번째의 Pro를 Phe로, 46번째의 Leu를 Gly로, 71번째의 Phe를 Tyr로 및 85번째의 Thr을 Asp로 치환하는 아미노산 개변 중 적어도 1개의 개변을 도입했다.
HV0LV0의 FR에 존재하는 적어도 1개의 아미노산 잔기를 개변한 8213 항체 인간화 항체의 항체 V 영역으로서, HV0LV0, HV0LV2, HV0LV4, HV0LV5, HV0LV6, HV0LV7, HV0LV9, HV3LV0, HV3LV2, HV3LV4, HV3LV5, HV3LV6, HV3LV7, HV3LV9, HV4LV0, HV4LV2, HV4LV4, HV4LV5, HV4LV6, HV4LV7, HV4LV9, HV5LV0, HV5LV2, HV5LV4, HV5LV5, HV5LV6, HV5LV7, HV5LV9, HV6LV0, HV6LV2, HV6LV4, HV6LV5, HV6LV6, HV6LV7, HV6LV9, HV7LV0, HV7LV2, HV7LV4, HV7LV5, HV7LV6, HV7LV7, HV7LV9, HV8LV0, HV8LV2, HV8LV4, HV8LV5, HV8LV6, HV8LV7, HV8LV9, HV10LV0, HV10LV2, HV10LV4, HV10LV5, HV10LV6, HV10LV7, HV10LV9, HV12LV0, HV12LV2, HV12LV4, HV12LV5, HV12LV6, HV12LV7 및 HV12LV9를 각각 설계했다.
H쇄 가변 영역 HV3, HV4, HV5, HV6, HV7, HV8, HV10, HV12, 및 L쇄 가변 영역 LV2, LV4, LV5, LV6, LV7, LV9의 아미노산 배열을 각각 도 1 및 2에 도시했다.
(2) 8213 항체 인간화 항체의 제조
8213 항체 인간화 항체의 가변 영역의 아미노산 배열을 코딩하는 DNA는, 8213 항체 VH 및 8213 항체 VL의 아미노산 배열을 코딩하는 DNA(배열 번호 27, 29)에서 사용되고 있는 코돈을 사용하여 설계하고, 아미노산 개변을 행할 경우에는, 포유 동물 세포에서 높은 빈도로 사용되는 코돈을 사용하여 설계해서 각각 제조했다.
이들 DNA 배열을 사용하여, 항체 발현 벡터의 구축 및 인간화 항체의 발현을 행했다.
본 발명을 특정한 형태를 사용하여 상세하게 설명했지만, 본 발명의 의도와 범위를 벗어나지 않고 다양한 변경 및 변형이 가능한 것은, 당업자에게 있어서 명백하다. 또한 본 출원은, 2010년 6월 11일자로 출원된 미국 가출원(61/353836)에 기초하고 있으며, 그 전체가 인용에 의해 원용된다.
본 발명에 따르면, 인간 TIM-3의 세포외 영역의 아미노산 배열 또는 그의 입체 구조에 결합하며 ADCC 활성을 발휘하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편, 상기 항체를 생산하는 하이브리도마, 상기 항체를 코딩하는 DNA, 상기 DNA를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 도입해서 얻어지는 형질 전환체, 상기 하이브리도마 또는 상기 형질 전환체를 사용하는 항체 또는 상기 항체 단편의 제조 방법, 상기 항체 또는 상기 항체 단편을 유효 성분으로 하는 치료약 및 진단약을 제공할 수 있다.
배열 번호 1:인간 4545 H쇄 CDR 1의 아미노산 배열
배열 번호 2:인간 4545 H쇄 CDR 2의 아미노산 배열
배열 번호 3:인간 4545 H쇄 CDR 3의 아미노산 배열
배열 번호 4:인간 4545 L쇄 CDR 1의 아미노산 배열
배열 번호 5:인간 4545 L쇄 CDR 2의 아미노산 배열
배열 번호 6:인간 4545 L쇄 CDR 3의 아미노산 배열
배열 번호 11:인간 4177 H쇄 CDR 1의 아미노산 배열
배열 번호 12:인간 4177 H쇄 CDR 2의 아미노산 배열
배열 번호 13:인간 4177 H쇄 CDR 3의 아미노산 배열
배열 번호 14:인간 4177 L쇄 CDR 1의 아미노산 배열
배열 번호 15:인간 4177 L쇄 CDR 2의 아미노산 배열
배열 번호 16:인간 4177 L쇄 CDR 3의 아미노산 배열
배열 번호 21:마우스 8213 H쇄 CDR 1의 아미노산 배열
배열 번호 22:마우스 8213 H쇄 CDR 2의 아미노산 배열
배열 번호 23:마우스 8213 H쇄 CDR 3의 아미노산 배열
배열 번호 24:마우스 8213 L쇄 CDR 1의 아미노산 배열
배열 번호 25:마우스 8213 L쇄 CDR 2의 아미노산 배열
배열 번호 26:마우스 8213 L쇄 CDR 3의 아미노산 배열
배열 번호 31:프라이머 TIM-3 Fw2의 염기 배열
배열 번호 32:프라이머 TIM-3 Re2의 염기 배열
배열 번호 33:프라이머 pMCs-Fw의 염기 배열
배열 번호 34:프라이머 TIM3ED-FcReXba의 염기 배열
배열 번호 35:프라이머 T7의 염기 배열
배열 번호 36:프라이머 hTIM-3 Fw1의 염기 배열
배열 번호 37:인서트 hTIM-3 ECD Fc 융합(fusion)의 염기 배열
배열 번호 38:인서트 hTIM-3 ECD Fc 융합의 아미노산 배열
배열 번호 39:프라이머 TIM3ED-FLAG4aa의 염기 배열
배열 번호 40:프라이머 C-FLAG-NotR2의 염기 배열
배열 번호 41:프라이머 BGH-R의 염기 배열
배열 번호 42:인서트 hTIM-3 ECD의 염기 배열
배열 번호 43:인서트 hTIM-3 ECD의 아미노산 배열
배열 번호 44:프라이머 hh-6의 염기 배열
배열 번호 45:프라이머 hh-3의 염기 배열
배열 번호 46:프라이머 hk-2의 염기 배열
배열 번호 47:프라이머 hk-6의 염기 배열
배열 번호 48:프라이머 mH_Rv1의 염기 배열
배열 번호 49:프라이머 mH_Rv2의 염기 배열
배열 번호 50:프라이머 mK_Rv1의 염기 배열
배열 번호 51:프라이머 mK_Rv2의 염기 배열
배열 번호 66:8213 항체 HV0 가변 영역의 염기 배열
배열 번호 67:8213 항체 HV0 가변 영역의 아미노산 배열
배열 번호 68:8213 항체 LV0 가변 영역의 염기 배열
배열 번호 69:8213 항체 LV0 가변 영역의 아미노산 배열
배열 번호 70:프라이머 mTim-3 Fw3의 염기 배열
배열 번호 71:프라이머 mTim-3 Re3의 염기 배열
배열 번호 72:프라이머 mTim-3 Fw4NotI의 염기 배열
배열 번호 73:프라이머 mTim-3 Re4NotI의 염기 배열
배열 번호 74:프라이머 hTIM3＋mIgV_vecR1의 염기 배열
배열 번호 75:프라이머 hTIM3＋mIgV_vecF1의 염기 배열
배열 번호 76:프라이머 hTIM3＋mIgV_insF1의 염기 배열
배열 번호 77:프라이머 hTIM3＋mIgV_insR1의 염기 배열
배열 번호 78:인서트 IgV 키메라 TIM-3/pEF6 Myc_HisC의 염기 배열
배열 번호 79:인서트 IgV 키메라 TIM-3/pEF6 Myc_HisC의 아미노산 배열
배열 번호 80:프라이머 hTIM3＋mMucin_vecR2의 염기 배열
배열 번호 81:프라이머 hTIM3＋mMucin_vecF2의 염기 배열
배열 번호 82:프라이머 hTIM3＋mMucin_insF2의 염기 배열
배열 번호 83:프라이머 hTIM3＋mMucin_insR2의 염기 배열
배열 번호 84:인서트 뮤신 키메라 TIM-3/pEF6 Myc_HisC의 염기 배열
배열 번호 85:인서트 뮤신 키메라 TIM-3/pEF6 Myc_HisC의 아미노산 배열
배열 번호 86:프라이머 hTIM3 키메라 22-47F1의 염기 배열
배열 번호 87:프라이머 hTIM3 키메라 22-47R1의 염기 배열
배열 번호 88:프라이머 hTIM3 키메라 22-47F2의 염기 배열
배열 번호 89:프라이머 hTIM3 키메라 22-47R2의 염기 배열
배열 번호 90:프라이머 hTIM3 키메라 22-47F3의 염기 배열
배열 번호 91:프라이머 hTIM3 키메라 22-47R3의 염기 배열
배열 번호 92:인서트 TIM-3 키메라 22-47/pEF6 Myc_HisC의 염기 배열
배열 번호 93:인서트 TIM-3 키메라 22-47/pEF6 Myc_HisC의 아미노산 배열
배열 번호 94:프라이머 hTIM3 키메라 57-66F의 염기 배열
배열 번호 95:프라이머 hTIM3 키메라 57-66R의 염기 배열
배열 번호 96:인서트 TIM-3 키메라 57-66/pEF6 Myc_HisC의 염기 배열
배열 번호 97:인서트 TIM-3 키메라 57-66/pEF6 Myc_HisC의 아미노산 배열
배열 번호 98:프라이머 hTIM3 키메라 67-105F의 염기 배열
배열 번호 99:프라이머 hTIM3 키메라 67-105R의 염기 배열
배열 번호 100:프라이머 mTIM3 키메라 67-105F의 염기 배열
배열 번호 101:프라이머 mTIM3 키메라 67-105R의 염기 배열
배열 번호 102:인서트 TIM-3 키메라 67-105/pEF6 Myc_HisC의 염기 배열
배열 번호 103:인서트 TIM-3 키메라 67-105/pEF6 Myc_HisC의 아미노산 배열
배열 번호 104:프라이머 hTIM3 키메라 74-81F의 염기 배열
배열 번호 105:프라이머 hTIM3 키메라 74-81R의 염기 배열
배열 번호 106:인서트 TIM-3 키메라 74-81/pEF6 Myc_HisC의 염기 배열
배열 번호 107:인서트 TIM-3 키메라 74-81/pEF6 Myc_HisC의 아미노산 배열
배열 번호 108:프라이머 hTIM3 키메라 88-96F의 염기 배열
배열 번호 109:프라이머 hTIM3 키메라 88-96R의 염기 배열
배열 번호 110:인서트 TIM-3 키메라 88-96/pEF6 Myc_HisC의 염기 배열
배열 번호 111:인서트 TIM-3 키메라 88-96/pEF6 Myc_HisC의 아미노산 배열
배열 번호 112:프라이머 hTIM3 키메라 96-105F의 염기 배열
배열 번호 113:프라이머 hTIM3 키메라 96-105R의 염기 배열
배열 번호 114:인서트 TIM-3 키메라 96-105/pEF6 Myc_HisC의 염기 배열
배열 번호 115:인서트 TIM-3 키메라 96-105/pEF6 Myc_HisC의 아미노산 배열
SEQUENCE LISTING <110> Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Kyushu University, National University Corporation <120> Anti-TIM-3 antibody <130> W502531 <150> US61/353836 <151> 2010-06-11 <160> 115 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Human4545 H-chain CDR1 <400> 1 Arg Gly Gly Tyr Tyr Trp Asn 1 5 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Human4545 H-chain CDR2 <400> 2 Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Human4545 H-chain CDR3 <400> 3 Asp His Tyr Ser Ser Ser Trp Thr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Human4545 L-chain CDR1 <400> 4 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Human4545 L-chain CDR2 <400> 5 Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Human4545 L-chain CDR3 <400> 6 Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Thr 1 5 <210> 7 <211> 420 <212> DNA <213> Homo 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Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala 100 105 110 gtg tat tac tgt gcg aga gat cat tat agc agc agc tgg acc ttt gac 384 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp His Tyr Ser Ser Ser Trp Thr Phe Asp 115 120 125 tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca 420 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 8 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Phe Ser Arg Gly 20 25 30 Gly Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Asp His Tyr Ser Ser Ser Trp Thr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 9 <211> 381 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(381) <400> 9 atg gaa gcc cca gct cag ctt ctc ttc ctc ctg cta ctc tgg ctc cca 48 Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 gat acc acc gga gaa att gtg ttg aca cag tct cca gcc acc ctg tct 96 Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30 ttg tct cca ggg gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt 144 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 gtt agc agc tac tta gcc tgg tac caa cag aaa cct ggc cag gct ccc 192 Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 50 55 60 agg ctc ctc atc tat gat gca tcc aac agg gcc act ggc atc cca gcc 240 Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala 65 70 75 80 agg ttc agt ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc 288 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 agc cta gag cct gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt cag cag cgt agc 336 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser 100 105 110 aac tgg cct ccg acg ttc ggc cag ggg acc aag ctg gag atc aaa 381 Asn Trp Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 10 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Human4177 H-chain CDR1 <400> 11 Ser Tyr Tyr Trp Ser 1 5 <210> 12 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Human4177 H-chain CDR2 <400> 12 Tyr Ile Phe His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 13 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial 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45 agt agt tac tac tgg agc tgg atc cgg cag ccc cca ggg aag gga ctg 192 Ser Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 gag tgg att ggg tat atc ttt cac agt ggg agc acc aac tac aac ccc 240 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Phe His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro 65 70 75 80 tcc ctc aag agt cga gtc acc ata tca gta gac acg tcc aag aac cag 288 Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln 85 90 95 ttc tcc ctg aag ctg agc tct gtg acc gct gcg gac acg gcc gtg tat 336 Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr 100 105 110 tac tgt gcg aga gat ggg gag tat ttc gat atg ttg act ggt ttt gac 384 Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Glu Tyr Phe Asp Met Leu Thr Gly Phe Asp 115 120 125 tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca 420 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 18 <211> 140 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Phe His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Gly Glu Tyr Phe Asp Met Leu Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 19 <211> 387 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(387) <400> 19 atg gac atg agg gtc ctc gct cag ctc ctg ggg ctc ctg ctg ctc tgt 48 Met Asp Met Arg Val Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys 1 5 10 15 ttc cca ggt gcc aga tgt gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tca 96 Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 ctg tct gca tct gta gga gac aga gtc acc atc act tgt cgg gcg agt 144 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 cag ggt att agc agc tgg tta gcc tgg tat cag cag aaa cca gag aaa 192 Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys 50 55 60 gcc cct aag tcc ctg atc tat gct gca tcc agt ttg caa agt ggg gtc 240 Ala Pro Lys Ser Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val 65 70 75 80 cca tca agg ttc agc ggc agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc 288 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 85 90 95 atc agc agc ctg cag cct gaa gat ttt gca act tat tac tgc caa cag 336 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 100 105 110 tat aat agt tac cct cgg acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc 384 Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 115 120 125 aaa 387 Lys <210> 20 <211> 129 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 21 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mouse8213 H-chain CDR1 <400> 21 Ser Tyr Trp Met His 1 5 <210> 22 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mouse8213 H-chain CDR2 <400> 22 Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Thr <210> 23 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mouse8213 H-chain CDR3 <400> 23 Gly Tyr Tyr Leu Tyr Phe Asp Tyr 1 5 <210> 24 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mouse8213 L-chain CDR1 <400> 24 His Ala Ser Gln Gly Ile Arg Ile Asn Ile Gly 1 5 10 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mouse8213 L-chain CDR2 <400> 25 His Gly Thr Asn Leu Glu Asp 1 5 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mouse8213 L-chain CDR3 <400> 26 Val Gln Tyr Gly Gln Phe Pro Trp Thr 1 5 <210> 27 <211> 408 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(408) <400> 27 atg gga tgg agc tat atc atc ctc ttt ttg gta gca aca gcg aca gat 48 Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Asp 1 5 10 15 gtc cac tcc cag gtc caa ctg cag cag cct ggg gct gaa ctg gtg aag 96 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys 20 25 30 cct ggg gct tca gtg aag ctg tcc tgc aag gct tct ggc tac acc ttc 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 acc agc tac tgg atg cac tgg gtg aag cag agg cct gga caa ggc ctt 192 Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 gag tgg att gga gag att aat cct agc aac ggt cgt act aac tac aat 240 Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 gag aag ttc aag acc aag gcc aca ctg act gta gac aaa tcc tcc agc 288 Glu Lys Phe Lys Thr Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 aca gcc tac atg caa ctc agc agc ctg aca tct gag gac tct gcg gtc 336 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 tat tac tgt gcg ggg ggt tac tac ctc tac ttt gac tac tgg ggc caa 384 Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Tyr Tyr Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 ggc acc act ctc aca gtc tcc tca 408 Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 28 <211> 136 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 28 Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Asp 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Glu Lys Phe Lys Thr Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Tyr Tyr Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 29 <211> 387 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(387) <400> 29 atg gac atg atg gtc ctt gct cag ttt ctt gca ttc ttg ttg ctt tgg 48 Met Asp Met Met Val Leu Ala Gln Phe Leu Ala Phe Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 ttt cca ggt gca aca tgt gac atc ctg atg acc caa tct cca tcc tcc 96 Phe Pro Gly Ala Thr Cys Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 atg tct gta tct ctg gga gac aca gtc aac atc act tgc cat gca agt 144 Met Ser Val Ser Leu Gly Asp Thr Val Asn Ile Thr Cys His Ala Ser 35 40 45 cag ggc att agg att aat ata ggg tgg ttg cag cag aag cca ggg aaa 192 Gln Gly Ile Arg Ile Asn Ile Gly Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60 tca ttt aag ggc ctg atc tat cat gga acc aac ttg gaa gat gga gtt 240 Ser Phe Lys Gly Leu Ile Tyr His Gly Thr Asn Leu Glu Asp Gly Val 65 70 75 80 cca tca agg ttc agt ggc agt gga tct gga cca gat tat tct ctc acc 288 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Pro Asp Tyr Ser Leu Thr 85 90 95 atc agc agc ctg gaa tct gaa gat ttt gca gac tat tac tgt gta cag 336 Ile Ser Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Gln 100 105 110 tat ggt cag ttt ccg tgg acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa atg 384 Tyr Gly Gln Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Met 115 120 125 aaa 387 Lys <210> 30 <211> 129 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 30 Met Asp Met Met Val Leu Ala Gln Phe Leu Ala Phe Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Phe Pro Gly Ala Thr Cys Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Met Ser Val Ser Leu Gly Asp Thr Val Asn Ile Thr Cys His Ala Ser 35 40 45 Gln Gly Ile Arg Ile Asn Ile Gly Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60 Ser Phe Lys Gly Leu Ile Tyr His Gly Thr Asn Leu Glu Asp Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Pro Asp Tyr Ser Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Gln 100 105 110 Tyr Gly Gln Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Met 115 120 125 Lys <210> 31 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer TIM-3 Fw2 <400> 31 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ccc tgc ttc tac acc cca gcc gcc cca 145 Val Gly Gln Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro 30 35 40 45 ggg aac ctc gtg ccc gtc tgc tgg ggc aaa gga gcc tgt cct gtg ttt 193 Gly Asn Leu Val Pro Val Cys Trp Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe 50 55 60 gaa tgt ggc aac gtg gtg ctc agg act gat gaa agg gat gtg aat tat 241 Glu Cys Gly Asn Val Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr 65 70 75 tgg aca tcc aga tac tgg cta aat ggg gat ttc cgc aaa gga gat gtg 289 Trp Thr Ser Arg Tyr Trp Leu Asn Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val 80 85 90 tcc ctg acc ata gag aat gtg act cta gca gac agt ggg atc tac tgc 337 Ser Leu Thr Ile Glu Asn Val Thr Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys 95 100 105 tgc cgg atc caa atc cca ggc ata atg aat gat gaa aaa ttt aac ctg 385 Cys Arg Ile Gln Ile Pro Gly Ile Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu 110 115 120 125 aag ttg gtc atc aaa cca gcc aag gtc acc cct gca ccg act cgg cag 433 Lys Leu Val Ile Lys Pro Ala Lys Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln 130 135 140 aga gac ttc act gca gcc ttt cca agg atg ctt acc acc agg gga cat 481 Arg Asp Phe Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His 145 150 155 ggc cca gca gag aca cag aca ctg ggg agc ctc cct gat ata aat cta 529 Gly Pro Ala Glu Thr Gln Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu 160 165 170 aca caa ata tcc aca ttg gcc aat gag tta cgg gac tct aga ttg gcc 577 Thr Gln Ile Ser Thr Leu Ala Asn Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala 175 180 185 aat gac tta cgg gac tct gga gca acc atc aga tct aga gca gac tac 625 Asn Asp Leu Arg Asp Ser Gly Ala Thr Ile Arg Ser Arg Ala Asp Tyr 190 195 200 205 aag gac gac gat gac aag act agt gac aaa act cac aca tgc cca ccg 673 Lys Asp Asp Asp Asp Lys Thr Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 210 215 220 tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc 721 Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 225 230 235 cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca 769 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 240 245 250 tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac 817 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 255 260 265 tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg 865 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 270 275 280 285 gag gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc 913 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 290 295 300 ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc 961 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 305 310 315 aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa 1009 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 320 325 330 ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag 1057 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu 335 340 345 gag atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc 1105 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 350 355 360 365 tat ccc agc gac atc gcc gcg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag 1153 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Ala Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 370 375 380 aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc 1201 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 385 390 395 ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg 1249 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 400 405 410 aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac 1297 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 415 420 425 acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa tga 1333 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 430 435 440 <210> 38 <211> 440 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 38 Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Thr Arg Ser Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln 20 25 30 Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu 35 40 45 Val Pro Val Cys Trp Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly 50 55 60 Asn Val Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser 65 70 75 80 Arg Tyr Trp Leu Asn Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr 85 90 95 Ile Glu Asn Val Thr Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile 100 105 110 Gln Ile Pro Gly Ile Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val 115 120 125 Ile Lys Pro Ala Lys Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe 130 135 140 Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala 145 150 155 160 Glu Thr Gln Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile 165 170 175 Ser Thr Leu Ala Asn Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu 180 185 190 Arg Asp Ser Gly Ala Thr Ile Arg Ser Arg Ala Asp Tyr Lys Asp Asp 195 200 205 Asp Asp Lys Thr Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 210 215 220 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 225 230 235 240 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 245 250 255 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 260 265 270 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 275 280 285 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 290 295 300 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 305 310 315 320 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 325 330 335 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 340 345 350 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 355 360 365 Asp Ile Ala Ala Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 370 375 380 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 385 390 395 400 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 405 410 415 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 420 425 430 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 39 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer TIM3ED-FLAG4aa <400> 39 gtccttgtag tctctgatgg ttgctccaga 30 <210> 40 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer C-FLAG-NotR2 <400> 40 aaaagcggcc gctcacttgt cgtcatcgtc cttgtagtc 39 <210> 41 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer BGH-R <400> 41 tagaaggcac agtcgagg 18 <210> 42 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Insert hTIM-3 ECD <220> <221> CDS <222> (19)..(645) <400> 42 gggaattcga ttgccacc atg ttt tca cat ctt ccc ttt gac tgt gtc ctg 51 Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu 1 5 10 ctg ctg ctg ctg cta cta ctt aca agg tcc tca gaa gtg gaa tac aga 99 Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Thr Arg Ser Ser Glu Val Glu Tyr Arg 15 20 25 gcg gag gtc ggt cag aat gcc tat ctg ccc tgc ttc tac acc cca gcc 147 Ala Glu Val Gly Gln Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala 30 35 40 gcc cca ggg aac ctc gtg ccc gtc tgc tgg ggc aaa gga gcc tgt cct 195 Ala Pro Gly Asn Leu Val Pro Val Cys Trp Gly Lys Gly Ala Cys Pro 45 50 55 gtg ttt gaa tgt ggc aac gtg gtg ctc agg act gat gaa agg gat gtg 243 Val Phe Glu Cys Gly Asn Val Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Val 60 65 70 75 aat tat tgg aca tcc aga tac tgg cta aat ggg gat ttc cgc aaa gga 291 Asn Tyr Trp Thr Ser Arg Tyr Trp Leu Asn Gly Asp Phe Arg Lys Gly 80 85 90 gat gtg tcc ctg acc ata gag aat gtg act cta gca gac agt ggg atc 339 Asp Val Ser Leu Thr Ile Glu Asn Val Thr Leu Ala Asp Ser Gly Ile 95 100 105 tac tgc tgc cgg atc caa atc cca ggc ata atg aat gat gaa aaa ttt 387 Tyr Cys Cys Arg Ile Gln Ile Pro Gly Ile Met Asn Asp Glu Lys Phe 110 115 120 aac ctg aag ttg gtc atc aaa cca gcc aag gtc acc cct gca ccg act 435 Asn Leu Lys Leu Val Ile Lys Pro Ala Lys Val Thr Pro Ala Pro Thr 125 130 135 cgg cag aga gac ttc act gca gcc ttt cca agg atg ctt acc acc agg 483 Arg Gln Arg Asp Phe Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg 140 145 150 155 gga cat ggc cca gca gag aca cag aca ctg ggg agc ctc cct gat ata 531 Gly His Gly Pro Ala Glu Thr Gln Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp Ile 160 165 170 aat cta aca caa ata tcc aca ttg gcc aat gag tta cgg gac tct aga 579 Asn Leu Thr Gln Ile Ser Thr Leu Ala Asn Glu Leu Arg Asp Ser Arg 175 180 185 ttg gcc aat gac tta cgg gac tct gga gca acc atc aga gac tac aag 627 Leu Ala Asn Asp Leu Arg Asp Ser Gly Ala Thr Ile Arg Asp Tyr Lys 190 195 200 gac gat gac gac aag tga 645 Asp Asp Asp Asp Lys 205 <210> 43 <211> 208 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 43 Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Thr Arg Ser Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln 20 25 30 Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu 35 40 45 Val Pro Val Cys Trp Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly 50 55 60 Asn Val Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser 65 70 75 80 Arg Tyr Trp Leu Asn Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr 85 90 95 Ile Glu Asn Val Thr Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile 100 105 110 Gln Ile Pro Gly Ile Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val 115 120 125 Ile Lys Pro Ala Lys Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe 130 135 140 Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala 145 150 155 160 Glu Thr Gln Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile 165 170 175 Ser Thr Leu Ala Asn Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu 180 185 190 Arg Asp Ser Gly Ala Thr Ile Arg Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 195 200 205 <210> 44 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer hh-6 <400> 44 ggtccgggag atcatgaggg tgtcctt 27 <210> 45 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer hh-3 <400> 45 gtgcacgccg ctggtcaggg cgcctg 26 <210> 46 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer hk-2 <400> 46 gttgaagctc tttgtgacgg gcgagc 26 <210> 47 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer hk-6 <400> 47 tggcgggaag atgaagacag atggtg 26 <210> 48 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer mH_Rv1 <400> 48 attttgtcga cckyggtsyt gctggcyggg tg 32 <210> 49 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer mH_Rv2 <400> 49 gcacacyrct ggacagggat ccagagttcc 30 <210> 50 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer mK_Rv1 <400> 50 ttgaagctct tgacaatggg tgaagttgat 30 <210> 51 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer mK_Rv2 <400> 51 gtaggtgctg tctttgctgt cctgatcagt 30 <210> 52 <211> 906 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(906) <400> 52 atg ttt tca cat ctt ccc ttt gac tgt gtc ctg ctg ctg ctg ctg cta 48 Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 cta ctt aca agg tcc tca gaa gtg gaa tac aga gcg gag gtc ggt cag 96 Leu Leu Thr Arg Ser Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln 20 25 30 aat gcc tat ctg ccc tgc ttc tac acc cca gcc gcc cca ggg aac ctc 144 Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu 35 40 45 gtg ccc gtc tgc tgg ggc aaa gga gcc tgt cct gtg ttt gaa tgt ggc 192 Val Pro Val Cys Trp Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly 50 55 60 aac gtg gtg ctc agg act gat gaa agg gat gtg aat tat tgg aca tcc 240 Asn Val Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser 65 70 75 80 aga tac tgg cta aat ggg gat ttc cgc aaa gga gat gtg tcc ctg acc 288 Arg Tyr Trp Leu Asn Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr 85 90 95 ata gag aat gtg act cta gca gac agt ggg atc tac tgc tgc cgg atc 336 Ile Glu Asn Val Thr Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile 100 105 110 caa atc cca ggc ata atg aat gat gaa aaa ttt aac ctg aag ttg gtc 384 Gln Ile Pro Gly Ile Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val 115 120 125 atc aaa cca gcc aag gtc acc cct gca ccg act cgg cag aga gac ttc 432 Ile Lys Pro Ala Lys Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe 130 135 140 act gca gcc ttt cca agg atg ctt acc acc agg gga cat ggc cca gca 480 Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala 145 150 155 160 gag aca cag aca ctg ggg agc ctc cct gat ata aat cta aca caa ata 528 Glu Thr Gln Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile 165 170 175 tcc aca ttg gcc aat gag tta cgg gac tct aga ttg gcc aat gac tta 576 Ser Thr Leu Ala Asn Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu 180 185 190 cgg gac tct gga gca acc atc aga ata ggc atc tac atc gga gca ggg 624 Arg Asp Ser Gly Ala Thr Ile Arg Ile Gly Ile Tyr Ile Gly Ala Gly 195 200 205 atc tgt gct ggg ctg gct ctg gct ctt atc ttc ggc gct tta att ttc 672 Ile Cys Ala Gly Leu Ala Leu Ala Leu Ile Phe Gly Ala Leu Ile Phe 210 215 220 aaa tgg tat tct cat agc aaa gag aag ata cag aat tta agc ctc atc 720 Lys Trp Tyr Ser His Ser Lys Glu Lys Ile Gln Asn Leu Ser Leu Ile 225 230 235 240 tct ttg gcc aac ctc cct ccc tca gga ttg gca aat gca gta gca gag 768 Ser Leu Ala Asn Leu Pro Pro Ser Gly Leu Ala Asn Ala Val Ala Glu 245 250 255 gga att cgc tca gaa gaa aac atc tat acc att gaa gag aac gta tat 816 Gly Ile Arg Ser Glu Glu Asn Ile Tyr Thr Ile Glu Glu Asn Val Tyr 260 265 270 gaa gtg gag gag ccc aat gag tat tat tgc tat gtc agc agc agg cag 864 Glu Val Glu Glu Pro Asn Glu Tyr Tyr Cys Tyr Val Ser Ser Arg Gln 275 280 285 caa ccc tca caa cct ttg ggt tgt cgc ttt gca atg cca tag 906 Gln Pro Ser Gln Pro Leu Gly Cys Arg Phe Ala Met Pro 290 295 300 <210> 53 <211> 301 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Thr Arg Ser Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln 20 25 30 Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu 35 40 45 Val Pro Val Cys Trp Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly 50 55 60 Asn Val Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser 65 70 75 80 Arg Tyr Trp Leu Asn Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr 85 90 95 Ile Glu Asn Val Thr Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile 100 105 110 Gln Ile Pro Gly Ile Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val 115 120 125 Ile Lys Pro Ala Lys Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe 130 135 140 Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala 145 150 155 160 Glu Thr Gln Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile 165 170 175 Ser Thr Leu Ala Asn Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu 180 185 190 Arg Asp Ser Gly Ala Thr Ile Arg Ile Gly Ile Tyr Ile Gly Ala Gly 195 200 205 Ile Cys Ala Gly Leu Ala Leu Ala Leu Ile Phe Gly Ala Leu Ile Phe 210 215 220 Lys Trp Tyr Ser His Ser Lys Glu Lys Ile Gln Asn Leu Ser Leu Ile 225 230 235 240 Ser Leu Ala Asn Leu Pro Pro Ser Gly Leu Ala Asn Ala Val Ala Glu 245 250 255 Gly Ile Arg Ser Glu Glu Asn Ile Tyr Thr Ile Glu Glu Asn Val Tyr 260 265 270 Glu Val Glu Glu Pro Asn Glu Tyr Tyr Cys Tyr Val Ser Ser Arg Gln 275 280 285 Gln Pro Ser Gln Pro Leu Gly Cys Arg Phe Ala Met Pro 290 295 300 <210> 54 <211> 426 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(426) <400> 54 atg gag ttt ggg ctg agc tgg gtt ttc ctc gtt gct ctt tta aga ggt 48 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly 1 5 10 15 gtc cag tgt cag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc gtg gtc cag 96 Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln 20 25 30 cct ggg agg tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcg tct gga ttc acc ttc 144 Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 aat agc tat ggc atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag ggg ctg 192 Asn Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 gag tgg gtg gca gtt ata tgg tat gat gga agt aat aaa tac tat gga 240 Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Gly 65 70 75 80 gac tcc gtg aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aag aac 288 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 acg ctg tat ctg caa atg aac agc ctg aga gcc gag gac acg gct gtg 336 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 tat tac tgt gcg ata tgg ttc ggg gag atg ttt tcc gaa tac ttc cag 384 Tyr Tyr Cys Ala Ile Trp Phe Gly Glu Met Phe Ser Glu Tyr Phe Gln 115 120 125 cac tgg ggc cag ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tca gct agc 426 His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 130 135 140 <210> 55 <211> 142 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln 20 25 30 Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Asn Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Gly 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Ile Trp Phe Gly Glu Met Phe Ser Glu Tyr Phe Gln 115 120 125 His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 130 135 140 <210> 56 <211> 393 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(393) <400> 56 atg gac atg agg gtc ccc gct cag ctc ctg ggg ctt ctg ctg ctc tgg 48 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 ctc cca ggt gcc aga tgt gcc atc cag ttg acc cag tct cca tcc tcc 96 Leu Pro Gly Ala Arg Cys Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 ctg tct gca tct gta gga gac aga gtc acc atc act tgc cgg gca agt 144 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 cag ggc att agc agt gct tta gcc tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa 192 Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60 gct cct aag ctc ctg atc tat gat gcc tcc agt ttg gaa agt ggg gtc 240 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val 65 70 75 80 cca tca agg ttc agc ggc agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc 288 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 85 90 95 atc agc agc ctg cag cct gaa gat ttt gca act tat tac tgt caa cag 336 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 100 105 110 ttt aat agt tac cct ctc act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag atc 384 Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 115 120 125 aaa cgt acg 393 Lys Arg Thr 130 <210> 57 <211> 131 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Pro Gly Ala Arg Cys Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 100 105 110 Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 115 120 125 Lys Arg Thr 130 <210> 58 <211> 432 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(432) <400> 58 atg gag ttt ggg ctg agc tgg gtt ttc ctt gtt gct att ata aaa ggt 48 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Ile Lys Gly 1 5 10 15 gtc cag tgt cag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc ttg gtc aag 96 Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys 20 25 30 cct gga ggg tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc 144 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 agt gac tac tac atg agc tgg atc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg 192 Ser Asp Tyr Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 gag tgg gtt tca ttc att agt agt agt ggt agt atc ata tac tac gca 240 Glu Trp Val Ser Phe Ile Ser Ser Ser Gly Ser Ile Ile Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 gac tct gtg aag ggc cga ttc acc atc tcc agg gac aac gcc aag aac 288 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 85 90 95 tca ctg tat ctg caa atg aac agc ctg aga gcc gag gac acg gct gtg 336 Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 tat tac tgt gcg aga gat ggg tat agc agc agt tgg tat tac tac ggt 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Tyr Ser Ser Ser Trp Tyr Tyr Tyr Gly 115 120 125 atg gac gtc tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca gct agc 432 Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 130 135 140 <210> 59 <211> 144 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Ile Lys Gly 1 5 10 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acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt 144 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 gtt agc agc agc tac tta gcc tgg tac cag cag aaa cct ggc cag gct 192 Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 50 55 60 ccc agg ctc ctc atc tat ggt gca tcc agc agg gcc act ggc atc cca 240 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro 65 70 75 80 gac agg ttc agt ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc 288 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 agc aga ctg gag cct gaa gat ttt gca gtg tat tac tgt cag cag tat 336 Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr 100 105 110 ggt agc tca ccg ctc act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag atc aaa 384 Gly Ser Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 cgt acg 390 Arg Thr 130 <210> 61 <211> 130 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 50 55 60 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro 65 70 75 80 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr 100 105 110 Gly Ser Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Arg Thr 130 <210> 62 <211> 414 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(414) <400> 62 atg gac tgg acc tgg agc atc ctt ttc ttg gtg gca gca gca aca ggt 48 Met Asp Trp Thr Trp Ser Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 gcc cac tcc cag gtt cag ctg gtg cag tct gga gct gag gtg aag aag 96 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 cct ggg gcc tca gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct ggt tac acc ttt 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 acc agc tat ggt atc agc tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt 192 Thr Ser Tyr Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 gag tgg atg gga tgg atc agc gct tac aat ggt aac aca aac tat gca 240 Glu Trp Met Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala 65 70 75 80 cag aag ctc cag ggc aga gtc acc atg acc aca gac aca tcc acg agc 288 Gln Lys Leu Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 aca gcc tac atg gag ctg agg agc ctg aga tct gac gac acg gcc gtg 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 tat tac tgt gcg aga tgg gat agc agc agc tgg tcc ttt gac tac tgg 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Asp Ser Ser Ser Trp Ser Phe Asp Tyr Trp 115 120 125 ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca 414 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 63 <211> 138 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Met Asp Trp Thr Trp Ser Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala 65 70 75 80 Gln Lys Leu Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Asp Ser Ser Ser Trp Ser Phe Asp Tyr Trp 115 120 125 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 64 <211> 390 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(390) <400> 64 atg gac atg agg gtc ctc gct cag ctc ctg ggg ctc ctg ctg ctc tgt 48 Met Asp Met Arg Val Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys 1 5 10 15 ttc cca ggt gcc aga tgt gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tca 96 Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 ctg tct gca tct gta gga gac aga gtc acc atc act tgt cgg gcg agt 144 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 cag ggt att agc agc tgg tta gcc tgg tat cag cag aaa cca gag aaa 192 Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys 50 55 60 gcc cct aag tcc ctg atc tat gct gca tcc agt ttg caa agt ggg gtc 240 Ala Pro Lys Ser Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val 65 70 75 80 cca tca agg ttc agc ggc agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc 288 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 85 90 95 atc agc agc ctg cag cct gaa gat ttt gca act tat tac tgc caa cag 336 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 100 105 110 tat aat agt tac ccg tac act ttt ggc cag ggg acc aag ctg gag atc 384 Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 115 120 125 aaa cgt 390 Lys Arg 130 <210> 65 <211> 130 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 Met Asp Met Arg Val Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys 1 5 10 15 Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Ser Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 100 105 110 Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 115 120 125 Lys Arg 130 <210> 66 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HV0 Mouse8213 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(351) <400> 66 cag gtc caa ctg gtg cag tct ggg gct gaa gtg aag aag cct ggg gct 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag gtg tcc tgc aag gct tct ggc tac acc ttc acc agc tac 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 tgg atg cac tgg gtg cgg cag gcg cct gga caa ggc ctt gag tgg atg 144 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 gga gag att aat cct agc aac ggt cgt act aac tac aat gag aag ttc 192 Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 aag acc cgg gtc aca atc act gca gac aca tcc acc agc aca gcc tac 240 Lys Thr Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gaa ctc agc agc ctg cga tct gag gac act gcg gtc tat tac tgt 288 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg cgg ggt tac tac ctc tac ttt gac tac tgg ggc caa ggc acc ctg 336 Ala Arg Gly Tyr Tyr Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 gtc aca gtc tcc tca 351 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 67 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 67 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Thr Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Tyr Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 68 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> LV0 Mouse8213 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 68 gac atc cag atg acc caa tct cca tcc tcc ttg tct gca tct gtg gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac cga gtc acc atc act tgc cat gca agt cag ggc att agg att aat 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Gly Ile Arg Ile Asn 20 25 30 ata ggg tgg tat cag cag aag cca ggg aaa gca cct aag ctc ctg atc 144 Ile Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tat cat gga acc aac ttg gaa gat gga gtt cca tca agg ttc agt ggc 192 Tyr His Gly Thr Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct gga aca gat ttc act ctc acc atc agc agc ctg caa cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gca acc tat tac tgt gta cag tat ggt cag ttt ccg tgg 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Gln Tyr Gly Gln Phe Pro Trp 85 90 95 acg ttc ggt cag ggc acc aag ctg gaa atc aaa 321 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 69 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 69 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Gly Ile Arg Ile Asn 20 25 30 Ile Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr His Gly Thr Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Gln Tyr Gly Gln Phe Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 70 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer mTim-3 Fw3 <400> 70 ctacacagag ctgtccttgg at 22 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer mTim-3 Re3 <400> 71 tttctcagtg gctgtggtca 20 <210> 72 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer mTim-3 Fw4NotI <400> 72 aattgcggcc gccaccatgt tttcaggtct tac 33 <210> 73 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer mTim-3 Re4NotI <400> 73 aattgcggcc gctcaggatg gctgctggct 30 <210> 74 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer hTIM3+mIgV_vecR1 <400> 74 ggaccttgta agtagtagca 20 <210> 75 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer hTIM3+mIgV_vecF1 <400> 75 gccaaggtca cccctgcacc ga 22 <210> 76 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer hTIM3+mIgV_insF1 <400> 76 ctacttacaa ggtccttgga agatggttat aaggt 35 <210> 77 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer hTIM3+mIgV_insR1 <400> 77 aggggtgacc ttggctgctt tgatgtctaa tttca 35 <210> 78 <211> 909 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> IgV chimeraTIM-3/pEF6 Myc_HisC <220> <221> CDS <222> (1)..(909) <400> 78 atg ttt tca cat ctt ccc ttt gac tgt gtc ctg ctg ctg ctg ctg cta 48 Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 cta ctt aca agg tcc ttg gaa gat ggt tat aag gtt gag gtt ggt aaa 96 Leu Leu Thr Arg Ser Leu Glu Asp Gly Tyr Lys Val Glu Val Gly Lys 20 25 30 aat gcc tat ctg ccc tgc agt tac act cta cct aca tct ggg aca ctt 144 Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Ser Tyr Thr Leu Pro Thr Ser Gly Thr Leu 35 40 45 gtg cct atg tgc tgg ggc aag gga ttc tgt cct tgg tca cag tgt acc 192 Val Pro Met Cys Trp Gly Lys Gly Phe Cys Pro Trp Ser Gln Cys Thr 50 55 60 aat gag ttg ctc aga act gat gaa aga aat gtg aca tat cag aaa tcc 240 Asn Glu Leu Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asn Val Thr Tyr Gln Lys Ser 65 70 75 80 agc aga tac cag cta aag ggc gat ctc aac aaa gga gat gtg tct ctg 288 Ser Arg Tyr Gln Leu Lys Gly Asp Leu Asn Lys Gly Asp Val Ser Leu 85 90 95 atc ata aag aat gtg act ctg gat gac cat ggg acc tac tgc tgc agg 336 Ile Ile Lys Asn Val Thr Leu Asp Asp His Gly Thr Tyr Cys Cys Arg 100 105 110 ata cag ttc cct ggt ctt atg aat gat aaa aaa tta gaa ctg aaa tta 384 Ile Gln Phe Pro Gly Leu Met Asn Asp Lys Lys Leu Glu Leu Lys Leu 115 120 125 gac atc aaa gca gcc aag gtc acc cct gca ccg act cgg cag aga gac 432 Asp Ile Lys Ala Ala Lys Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp 130 135 140 ttc act gca gcc ttt cca agg atg ctt acc acc agg gga cat ggc cca 480 Phe Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro 145 150 155 160 gca gag aca cag aca ctg ggg agc ctc cct gat ata aat cta aca caa 528 Ala Glu Thr Gln Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln 165 170 175 ata tcc aca ttg gcc aat gag tta cgg gac tct aga ttg gcc aat gac 576 Ile Ser Thr Leu Ala Asn Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp 180 185 190 tta cgg gac tct gga gca acc atc aga ata ggc atc tac atc gga gca 624 Leu Arg Asp Ser Gly Ala Thr Ile Arg Ile Gly Ile Tyr Ile Gly Ala 195 200 205 ggg atc tgt gct ggg ctg gct ctg gct ctt atc ttc ggc gct tta att 672 Gly Ile Cys Ala Gly Leu Ala Leu Ala Leu Ile Phe Gly Ala Leu Ile 210 215 220 ttc aaa tgg tat tct cat agc aaa gag aag ata cag aat tta agc ctc 720 Phe Lys Trp Tyr Ser His Ser Lys Glu Lys Ile Gln Asn Leu Ser Leu 225 230 235 240 atc tct ttg gcc aac ctc cct ccc tca gga ttg gca aat gca gta gca 768 Ile Ser Leu Ala Asn Leu Pro Pro Ser Gly Leu Ala Asn Ala Val Ala 245 250 255 gag gga att cgc tca gaa gaa aac atc tat acc att gaa gag aac gta 816 Glu Gly Ile Arg Ser Glu Glu Asn Ile Tyr Thr Ile Glu Glu Asn Val 260 265 270 tat gaa gtg gag gag ccc aat gag tat tat tgc tat gtc agc agc agg 864 Tyr Glu Val Glu Glu Pro Asn Glu Tyr Tyr Cys Tyr Val Ser Ser Arg 275 280 285 cag caa ccc tca caa cct ttg ggt tgt cgc ttt gca atg cca tag 909 Gln Gln Pro Ser Gln Pro Leu Gly Cys Arg Phe Ala Met Pro 290 295 300 <210> 79 <211> 302 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 79 Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Thr Arg Ser Leu Glu Asp Gly Tyr Lys Val Glu Val Gly Lys 20 25 30 Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Ser Tyr Thr Leu Pro Thr Ser Gly Thr Leu 35 40 45 Val Pro Met Cys Trp Gly Lys Gly Phe Cys Pro Trp Ser Gln Cys Thr 50 55 60 Asn Glu Leu Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asn Val Thr Tyr Gln Lys Ser 65 70 75 80 Ser Arg Tyr Gln Leu Lys Gly Asp Leu Asn Lys Gly Asp Val Ser Leu 85 90 95 Ile Ile Lys Asn Val Thr Leu Asp Asp His Gly Thr Tyr Cys Cys Arg 100 105 110 Ile Gln Phe Pro Gly Leu Met Asn Asp Lys Lys Leu Glu Leu Lys Leu 115 120 125 Asp Ile Lys Ala Ala Lys Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp 130 135 140 Phe Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro 145 150 155 160 Ala Glu Thr Gln Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln 165 170 175 Ile Ser Thr Leu Ala Asn Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp 180 185 190 Leu Arg Asp Ser Gly Ala Thr Ile Arg Ile Gly Ile Tyr Ile Gly Ala 195 200 205 Gly Ile Cys Ala Gly Leu Ala Leu Ala Leu Ile Phe Gly Ala Leu Ile 210 215 220 Phe Lys Trp Tyr Ser His Ser Lys Glu Lys Ile Gln Asn Leu Ser Leu 225 230 235 240 Ile Ser Leu Ala Asn Leu Pro Pro Ser Gly Leu Ala Asn Ala Val Ala 245 250 255 Glu Gly Ile Arg Ser Glu Glu Asn Ile Tyr Thr Ile Glu Glu Asn Val 260 265 270 Tyr Glu Val Glu Glu Pro Asn Glu Tyr Tyr Cys Tyr Val Ser Ser Arg 275 280 285 Gln Gln Pro Ser Gln Pro Leu Gly Cys Arg Phe Ala Met Pro 290 295 300 <210> 80 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer hTIM3+mMucin_vecR2 <400> 80 tggtttgatg accaacttca g 21 <210> 81 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer hTIM3+mMucin_vecF2 <400> 81 ataggcatct acatcggagc agg 23 <210> 82 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer hTIM3+mMucin_insF2 <400> 82 ttggtcatca aaccagccaa ggtcactcca gctca 35 <210> 83 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer hTIM3+mMucin_insR2 <400> 83 gatgtagatg cctattctga tcgtttctcc agagt 35 <210> 84 <211> 876 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mucin chimeraTIM-3/pEF6 Myc_HisC <220> <221> CDS <222> (1)..(876) <400> 84 atg ttt tca cat ctt ccc ttt gac tgt gtc ctg ctg ctg ctg ctg cta 48 Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 cta ctt aca agg tcc tca gaa gtg gaa tac aga gcg gag gtc ggt cag 96 Leu Leu Thr Arg Ser Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln 20 25 30 aat gcc tat ctg ccc tgc ttc tac acc cca gcc gcc cca ggg aac ctc 144 Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu 35 40 45 gtg ccc gtc tgc tgg ggc aaa gga gcc tgt cct gtg ttt gaa tgt ggc 192 Val Pro Val Cys Trp Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly 50 55 60 aac gtg gtg ctc agg act gat gaa agg gat gtg aat tat tgg aca tcc 240 Asn Val Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser 65 70 75 80 aga tac tgg cta aat ggg gat ttc cgc aaa gga gat gtg tcc ctg acc 288 Arg Tyr Trp Leu Asn Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr 85 90 95 ata gag aat gtg act cta gca gac agt ggg atc tac tgc tgc cgg atc 336 Ile Glu Asn Val Thr Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile 100 105 110 caa atc cca ggc ata atg aat gat gaa aaa ttt aac ctg aag ttg gtc 384 Gln Ile Pro Gly Ile Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val 115 120 125 atc aaa cca gcc aag gtc act cca gct cag act gcc cat ggg gac tct 432 Ile Lys Pro Ala Lys Val Thr Pro Ala Gln Thr Ala His Gly Asp Ser 130 135 140 act aca gct tct cca aga acc cta acc acg gag aga aat ggt tca gag 480 Thr Thr Ala Ser Pro Arg Thr Leu Thr Thr Glu Arg Asn Gly Ser Glu 145 150 155 160 aca cag aca ctg gtg acc ctc cat aat aac aat gga aca aaa att tcc 528 Thr Gln Thr Leu Val Thr Leu His Asn Asn Asn Gly Thr Lys Ile Ser 165 170 175 aca tgg gct gat gaa att aag gac tct gga gaa acg atc aga ata ggc 576 Thr Trp Ala Asp Glu Ile Lys Asp Ser Gly Glu Thr Ile Arg Ile Gly 180 185 190 atc tac atc gga gca ggg atc tgt gct ggg ctg gct ctg gct ctt atc 624 Ile Tyr Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Gly Leu Ala Leu Ala Leu Ile 195 200 205 ttc ggc gct tta att ttc aaa tgg tat tct cat agc aaa gag aag ata 672 Phe Gly Ala Leu Ile Phe Lys Trp Tyr Ser His Ser Lys Glu Lys Ile 210 215 220 cag aat tta agc ctc atc tct ttg gcc aac ctc cct ccc tca gga ttg 720 Gln Asn Leu Ser Leu Ile Ser Leu Ala Asn Leu Pro Pro Ser Gly Leu 225 230 235 240 gca aat gca gta gca gag gga att cgc tca gaa gaa aac atc tat acc 768 Ala Asn Ala Val Ala Glu Gly Ile Arg Ser Glu Glu Asn Ile Tyr Thr 245 250 255 att gaa gag aac gta tat gaa gtg gag gag ccc aat gag tat tat tgc 816 Ile Glu Glu Asn Val Tyr Glu Val Glu Glu Pro Asn Glu Tyr Tyr Cys 260 265 270 tat gtc agc agc agg cag caa ccc tca caa cct ttg ggt tgt cgc ttt 864 Tyr Val Ser Ser Arg Gln Gln Pro Ser Gln Pro Leu Gly Cys Arg Phe 275 280 285 gca atg cca tag 876 Ala Met Pro 290 <210> 85 <211> 291 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 85 Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Thr Arg Ser Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln 20 25 30 Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu 35 40 45 Val Pro Val Cys Trp Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly 50 55 60 Asn Val Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser 65 70 75 80 Arg Tyr Trp Leu Asn Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr 85 90 95 Ile Glu Asn Val Thr Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile 100 105 110 Gln Ile Pro Gly Ile Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val 115 120 125 Ile Lys Pro Ala Lys Val Thr Pro Ala Gln Thr Ala His Gly Asp Ser 130 135 140 Thr Thr Ala Ser Pro Arg Thr Leu Thr Thr Glu Arg Asn Gly Ser Glu 145 150 155 160 Thr Gln Thr Leu Val Thr Leu His Asn Asn Asn Gly Thr Lys Ile Ser 165 170 175 Thr Trp Ala Asp Glu Ile Lys Asp Ser Gly Glu Thr Ile Arg Ile Gly 180 185 190 Ile Tyr Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Gly Leu Ala Leu Ala Leu Ile 195 200 205 Phe Gly Ala Leu Ile Phe Lys Trp Tyr Ser His Ser Lys Glu Lys Ile 210 215 220 Gln Asn Leu Ser Leu Ile Ser Leu Ala Asn Leu Pro Pro Ser Gly Leu 225 230 235 240 Ala Asn Ala Val Ala Glu Gly Ile Arg Ser Glu Glu Asn Ile Tyr Thr 245 250 255 Ile Glu Glu Asn Val Tyr Glu Val Glu Glu Pro Asn Glu Tyr Tyr Cys 260 265 270 Tyr Val Ser Ser Arg Gln Gln Pro Ser Gln Pro Leu Gly Cys Arg Phe 275 280 285 Ala Met Pro 290 <210> 86 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> 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Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 cta ctt aca agg tcc ttg gaa gat ggt tat aag gtt gag gtt ggt aaa 96 Leu Leu Thr Arg Ser Leu Glu Asp Gly Tyr Lys Val Glu Val Gly Lys 20 25 30 aat gcc tat ctg ccc tgc agt tac act cta cct aca tct ggg aca ctt 144 Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Ser Tyr Thr Leu Pro Thr Ser Gly Thr Leu 35 40 45 gtg ccc gtc tgc tgg ggc aaa gga gcc tgt cct gtg ttt gaa tgt ggc 192 Val Pro Val Cys Trp Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly 50 55 60 aac gtg gtg ctc agg act gat gaa agg gat gtg aat tat tgg aca tcc 240 Asn Val Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser 65 70 75 80 aga tac tgg cta aat ggg gat ttc cgc aaa gga gat gtg tcc ctg acc 288 Arg Tyr Trp Leu Asn Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr 85 90 95 ata gag aat gtg act cta gca gac agt ggg atc tac tgc tgc cgg atc 336 Ile Glu Asn Val Thr Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile 100 105 110 caa atc cca ggc ata atg aat gat gaa aaa ttt aac ctg aag ttg gtc 384 Gln Ile Pro Gly Ile Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val 115 120 125 atc aaa cca gcc aag gtc acc cct gca ccg act cgg cag aga gac ttc 432 Ile Lys Pro Ala Lys Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe 130 135 140 act gca gcc ttt cca agg atg ctt acc acc agg gga cat ggc cca gca 480 Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala 145 150 155 160 gag aca cag aca ctg ggg agc ctc cct gat ata aat cta aca caa ata 528 Glu Thr Gln Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile 165 170 175 tcc aca ttg gcc aat gag tta cgg gac tct aga ttg gcc aat gac tta 576 Ser Thr Leu Ala Asn Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu 180 185 190 cgg gac tct gga gca acc atc aga ata ggc atc tac atc gga gca ggg 624 Arg Asp Ser Gly Ala Thr Ile Arg Ile Gly Ile Tyr Ile Gly Ala Gly 195 200 205 atc tgt gct ggg ctg gct ctg gct ctt atc ttc ggc gct tta att ttc 672 Ile Cys Ala Gly Leu Ala Leu Ala Leu Ile Phe Gly Ala Leu Ile Phe 210 215 220 aaa tgg tat tct cat agc aaa gag aag ata cag aat tta agc ctc atc 720 Lys Trp Tyr Ser His Ser Lys Glu Lys Ile Gln Asn Leu Ser Leu Ile 225 230 235 240 tct ttg gcc aac ctc cct ccc tca gga ttg gca aat gca gta gca gag 768 Ser Leu Ala Asn Leu Pro Pro Ser Gly Leu Ala Asn Ala Val Ala Glu 245 250 255 gga att cgc tca gaa gaa aac atc tat acc att gaa gag aac gta tat 816 Gly Ile Arg Ser Glu Glu Asn Ile Tyr Thr Ile Glu Glu Asn Val Tyr 260 265 270 gaa gtg gag gag ccc aat gag tat tat tgc tat gtc agc agc agg cag 864 Glu Val Glu Glu Pro Asn Glu Tyr Tyr Cys Tyr Val Ser Ser Arg Gln 275 280 285 caa ccc tca caa cct ttg ggt tgt cgc ttt gca atg cca tag 906 Gln Pro Ser Gln Pro Leu Gly Cys Arg Phe Ala Met Pro 290 295 300 <210> 93 <211> 301 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 93 Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Thr Arg Ser Leu Glu Asp Gly Tyr Lys Val Glu Val Gly Lys 20 25 30 Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Ser Tyr Thr Leu Pro Thr Ser Gly Thr Leu 35 40 45 Val Pro Val Cys Trp Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly 50 55 60 Asn Val Val Leu Arg 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192 Val Pro Val Cys Trp Gly Lys Gly Phe Cys Pro Trp Ser Gln Cys Thr 50 55 60 aat gag gtg ctc agg act gat gaa agg gat gtg aat tat tgg aca tcc 240 Asn Glu Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser 65 70 75 80 aga tac tgg cta aat ggg gat ttc cgc aaa gga gat gtg tcc ctg acc 288 Arg Tyr Trp Leu Asn Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr 85 90 95 ata gag aat gtg act cta gca gac agt ggg atc tac tgc tgc cgg atc 336 Ile Glu Asn Val Thr Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile 100 105 110 caa atc cca ggc ata atg aat gat gaa aaa ttt aac ctg aag ttg gtc 384 Gln Ile Pro Gly Ile Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val 115 120 125 atc aaa cca gcc aag gtc acc cct gca ccg act cgg cag aga gac ttc 432 Ile Lys Pro Ala Lys Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe 130 135 140 act gca gcc ttt cca agg atg ctt acc acc agg gga cat ggc cca gca 480 Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala 145 150 155 160 gag aca cag aca ctg ggg agc ctc cct gat ata aat cta aca caa ata 528 Glu Thr Gln Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile 165 170 175 tcc aca ttg gcc aat gag tta cgg gac tct aga ttg gcc aat gac tta 576 Ser Thr Leu Ala Asn Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu 180 185 190 cgg gac tct gga gca acc atc aga ata ggc atc tac atc gga gca ggg 624 Arg Asp Ser Gly Ala Thr Ile Arg Ile Gly Ile Tyr Ile Gly Ala Gly 195 200 205 atc tgt gct ggg ctg gct ctg gct ctt atc ttc ggc gct tta att ttc 672 Ile Cys Ala Gly Leu Ala Leu Ala Leu Ile Phe Gly Ala Leu Ile Phe 210 215 220 aaa tgg tat tct cat agc aaa gag aag ata cag aat tta agc ctc atc 720 Lys Trp Tyr Ser His Ser Lys Glu Lys Ile Gln Asn Leu Ser Leu Ile 225 230 235 240 tct ttg gcc aac ctc cct ccc tca gga ttg gca aat gca gta gca gag 768 Ser Leu Ala Asn Leu Pro Pro Ser Gly Leu Ala Asn Ala Val Ala Glu 245 250 255 gga att cgc tca gaa gaa aac atc tat acc att gaa gag aac gta tat 816 Gly Ile Arg Ser Glu Glu Asn Ile Tyr Thr Ile Glu Glu Asn Val Tyr 260 265 270 gaa gtg gag gag ccc aat gag tat tat tgc tat gtc agc agc agg cag 864 Glu Val Glu Glu Pro Asn Glu Tyr Tyr Cys Tyr Val Ser Ser Arg Gln 275 280 285 caa ccc tca caa cct ttg ggt tgt cgc ttt gca atg cca tag 906 Gln Pro Ser Gln Pro Leu Gly Cys Arg Phe Ala Met Pro 290 295 300 <210> 97 <211> 301 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 97 Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Thr Arg Ser Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln 20 25 30 Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu 35 40 45 Val Pro Val Cys Trp Gly Lys Gly Phe Cys Pro Trp Ser Gln Cys Thr 50 55 60 Asn Glu Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser 65 70 75 80 Arg Tyr Trp Leu Asn Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr 85 90 95 Ile Glu Asn Val Thr Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile 100 105 110 Gln Ile Pro Gly Ile Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val 115 120 125 Ile Lys Pro Ala Lys Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe 130 135 140 Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala 145 150 155 160 Glu Thr Gln Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile 165 170 175 Ser Thr Leu Ala Asn Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu 180 185 190 Arg Asp Ser Gly Ala Thr Ile Arg Ile Gly Ile Tyr Ile Gly Ala Gly 195 200 205 Ile Cys Ala Gly Leu Ala Leu Ala Leu Ile Phe Gly Ala Leu Ile Phe 210 215 220 Lys Trp Tyr Ser His Ser Lys Glu Lys Ile Gln Asn Leu Ser Leu Ile 225 230 235 240 Ser Leu Ala Asn Leu Pro Pro Ser Gly Leu Ala Asn Ala Val Ala Glu 245 250 255 Gly Ile Arg Ser Glu Glu Asn Ile Tyr Thr Ile Glu Glu Asn Val Tyr 260 265 270 Glu Val Glu Glu Pro Asn Glu Tyr Tyr Cys Tyr Val Ser Ser Arg Gln 275 280 285 Gln Pro Ser Gln Pro Leu Gly Cys Arg Phe Ala Met Pro 290 295 300 <210> 98 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer hTIM3chimera67-105F <400> 98 ctggatgacc atgggatcta ctgctgccgg atcc 34 <210> 99 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer hTIM3chimera67-105R <400> 99 atcagttctg agcaacacgt tgccacattc aaa 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aaa tcc 240 Asn Val Leu Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asn Val Thr Tyr Gln Lys Ser 65 70 75 80 agc aga tac cag cta aag ggc gat ctc aac aaa gga gat gtg tct ctg 288 Ser Arg Tyr Gln Leu Lys Gly Asp Leu Asn Lys Gly Asp Val Ser Leu 85 90 95 atc ata aag aat gtg act ctg gat gac cat ggg atc tac tgc tgc cgg 336 Ile Ile Lys Asn Val Thr Leu Asp Asp His Gly Ile Tyr Cys Cys Arg 100 105 110 atc caa atc cca ggc ata atg aat gat gaa aaa ttt aac ctg aag ttg 384 Ile Gln Ile Pro Gly Ile Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu 115 120 125 gtc atc aaa cca gcc aag gtc acc cct gca ccg act cgg cag aga gac 432 Val Ile Lys Pro Ala Lys Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp 130 135 140 ttc act gca gcc ttt cca agg atg ctt acc acc agg gga cat ggc cca 480 Phe Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro 145 150 155 160 gca gag aca cag aca ctg ggg agc ctc cct gat ata aat cta aca caa 528 Ala Glu Thr Gln Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln 165 170 175 ata tcc aca ttg gcc aat gag tta cgg gac tct aga ttg gcc aat gac 576 Ile Ser Thr Leu Ala Asn Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp 180 185 190 tta cgg gac tct gga gca acc atc aga ata ggc atc tac atc gga gca 624 Leu Arg Asp Ser Gly Ala Thr Ile Arg Ile Gly Ile Tyr Ile Gly Ala 195 200 205 ggg atc tgt gct ggg ctg gct ctg gct ctt atc ttc ggc gct tta att 672 Gly Ile Cys Ala Gly Leu Ala Leu Ala Leu Ile Phe Gly Ala Leu Ile 210 215 220 ttc aaa tgg tat tct cat agc aaa gag aag ata cag aat tta agc ctc 720 Phe Lys Trp Tyr Ser His Ser Lys Glu Lys Ile Gln Asn Leu Ser Leu 225 230 235 240 atc tct ttg gcc aac ctc cct ccc tca gga ttg gca aat gca gta gca 768 Ile Ser Leu Ala Asn Leu Pro Pro Ser Gly Leu Ala Asn Ala Val Ala 245 250 255 gag gga att cgc tca gaa gaa aac atc tat acc att gaa gag aac gta 816 Glu Gly Ile Arg Ser Glu Glu Asn Ile Tyr Thr Ile Glu Glu Asn Val 260 265 270 tat gaa gtg gag gag ccc aat gag tat tat tgc tat gtc agc agc agg 864 Tyr Glu Val Glu Glu Pro Asn Glu Tyr Tyr Cys Tyr Val Ser Ser Arg 275 280 285 cag caa ccc tca caa cct ttg ggt tgt 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cat ggc cca gca 480 Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala 145 150 155 160 gag aca cag aca ctg ggg agc ctc cct gat ata aat cta aca caa ata 528 Glu Thr Gln Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile 165 170 175 tcc aca ttg gcc aat gag tta cgg gac tct aga ttg gcc aat gac tta 576 Ser Thr Leu Ala Asn Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu 180 185 190 cgg gac tct gga gca acc atc aga ata ggc atc tac atc gga gca ggg 624 Arg Asp Ser Gly Ala Thr Ile Arg Ile Gly Ile Tyr Ile Gly Ala Gly 195 200 205 atc tgt gct ggg ctg gct ctg gct ctt atc ttc ggc gct tta att ttc 672 Ile Cys Ala Gly Leu Ala Leu Ala Leu Ile Phe Gly Ala Leu Ile Phe 210 215 220 aaa tgg tat tct cat agc aaa gag aag ata cag aat tta agc ctc atc 720 Lys Trp Tyr Ser His Ser Lys Glu Lys Ile Gln Asn Leu Ser Leu Ile 225 230 235 240 tct ttg gcc aac ctc cct ccc tca gga ttg gca aat gca gta gca gag 768 Ser Leu Ala Asn Leu Pro Pro Ser Gly Leu Ala Asn Ala Val Ala Glu 245 250 255 gga att cgc tca gaa gaa aac atc 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Gly Ile Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val 115 120 125 Ile Lys Pro Ala Lys Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe 130 135 140 Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala 145 150 155 160 Glu Thr Gln Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile 165 170 175 Ser Thr Leu Ala Asn Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu 180 185 190 Arg Asp Ser Gly Ala Thr Ile Arg Ile Gly Ile Tyr Ile Gly Ala Gly 195 200 205 Ile Cys Ala Gly Leu Ala Leu Ala Leu Ile Phe Gly Ala Leu Ile Phe 210 215 220 Lys Trp Tyr Ser His Ser Lys Glu Lys Ile Gln Asn Leu Ser Leu Ile 225 230 235 240 Ser Leu Ala Asn Leu Pro Pro Ser Gly Leu Ala Asn Ala Val Ala Glu 245 250 255 Gly Ile Arg Ser Glu Glu Asn Ile Tyr Thr Ile Glu Glu Asn Val Tyr 260 265 270 Glu Val Glu Glu Pro Asn Glu Tyr Tyr Cys Tyr Val Ser Ser Arg Gln 275 280 285 Gln Pro Ser Gln Pro Leu Gly Cys Arg Phe Ala Met Pro 290 295 300 <210> 112 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer hTIM3chimera96-105F <400> 112 gaatgtgact ctggatgacc atgggatcta ctgct 35 <210> 113 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer hTIM3chimera96-105R <400> 113 tccagagtca cattctttat gatcagggac acatc 35 <210> 114 <211> 906 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TIM-3 chimera 96-105/pEF6 Myc_HisC <220> <221> CDS <222> (1)..(906) <400> 114 atg ttt tca cat ctt ccc ttt gac tgt gtc ctg ctg ctg ctg ctg cta 48 Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 cta ctt aca agg tcc tca gaa gtg gaa tac aga gcg gag gtc ggt cag 96 Leu Leu Thr Arg Ser Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln 20 25 30 aat gcc tat ctg ccc tgc ttc tac acc cca gcc gcc cca ggg aac ctc 144 Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu 35 40 45 gtg ccc gtc tgc tgg ggc aaa gga gcc tgt cct gtg ttt gaa tgt ggc 192 Val Pro Val Cys Trp Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly 50 55 60 aac gtg gtg ctc agg act gat gaa agg gat gtg aat tat tgg aca tcc 240 Asn Val Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr 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Ala Met Pro 290 295 300 <210> 115 <211> 301 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 115 Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Thr Arg Ser Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln 20 25 30 Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu 35 40 45 Val Pro Val Cys Trp Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly 50 55 60 Asn Val Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser 65 70 75 80 Arg Tyr Trp Leu Asn Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Ile 85 90 95 Ile Lys Asn Val Thr Leu Asp Asp His Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile 100 105 110 Gln Ile Pro Gly Ile Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val 115 120 125 Ile Lys Pro Ala Lys Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe 130 135 140 Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala 145 150 155 160 Glu Thr Gln Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile 165 170 175 Ser Thr Leu Ala Asn Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp 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Claims (23)

  1. 이하의 (i) 내지 (iii)에서 선택되는 하나의 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편.
    (i) CDR 1 내지 3이 각각 배열 번호 1 내지 3으로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 항체의 H쇄를 포함하고, CDR 1 내지 3이 각각 배열 번호 4 내지 6으로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 항체의 L쇄를 포함하는 모노클로날 항체 및 상기 항체 단편;
    (ii) CDR 1 내지 3이 각각 배열 번호 11 내지 13으로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 항체의 H쇄를 포함하고, CDR 1 내지 3이 각각 배열 번호 14 내지 16으로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 항체의 L쇄를 포함하는 모노클로날 항체 및 상기 항체 단편;
    (iii) CDR 1 내지 3이 각각 배열 번호 21 내지 23으로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 항체의 H쇄를 포함하고, CDR 1 내지 3이 각각 배열 번호 24 내지 26으로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 항체의 L쇄를 포함하는 모노클로날 항체 및 상기 항체 단편.
  2. 이하의 (a) 또는 (b)인 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편.
    (a) 배열 번호 8로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 항체의 VH를 포함하고, 배열 번호 10으로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 항체의 VL을 포함하는 모노클로날 항체 및 상기 항체 단편;
    (b) 배열 번호 18로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 항체의 VH를 포함하고, 배열 번호 20으로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 항체의 VL을 포함하는 모노클로날 항체 및 상기 항체 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 배열 번호 53으로 나타내는 인간 TIM-3의 IgV(면역글로불린 가변체; immunoglobulin variable) 도메인의 아미노산 배열 중, 67번 내지 105번째의 아미노산 배열, 67번 내지 96번째의 아미노산 배열 또는 67번 내지 87번째의 아미노산 배열에 결합하는 것인 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 유전자 재조합 항체인 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편.
  5. 제4항에 있어서, 인간형 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체에서 선택되는 유전자 재조합 항체인 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, Fab, Fab', F(ab')2, 단일쇄 항체(scFv), 2량체화 V영역(diabody), 디술피드 안정화 V영역(dsFv) 및 CDR을 포함하는 펩티드에서 선택되는 항체 단편.
  7. 제1항 또는 제2항에 기재된 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편을 코딩하는 DNA.
  8. 제7항에 기재된 DNA를 함유하는 재조합체 벡터.
  9. 제8항에 기재된 재조합체 벡터를 숙주 세포에 도입해서 얻어지는 형질 전환주.
  10. 제1항 또는 제2항에 기재된 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편을 코딩하는 DNA를 함유하는 재조합체 벡터를 숙주 세포에 도입해서 얻어지는 형질 전환주를 배지에 배양하고, 배양물 중에 상기 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편을 생성 축적시키고, 배양물로부터 상기 항체 또는 상기 항체 단편을 채취하는 것을 특징으로 하는, 제1항 또는 제2항에 기재된 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편의 제조 방법.
  11. 제1항 또는 제2항에 기재된 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편을 사용하는 인간 TIM-3의 면역학적 검출 또는 측정 방법.
  12. 제1항 또는 제2항에 기재된 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편을 포함하는 인간 TIM-3의 검출 또는 측정용 시약.
  13. 제1항 또는 제2항에 기재된 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편을 포함하는 암, 자가 면역 질환 또는 알레르기성 질환의 진단약.
  14. 제1항 또는 제2항에 기재된 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편을 사용하여 인간 TIM-3 양성 세포를 검출 또는 측정하는 것을 포함하는, 암, 자가 면역 질환 또는 알레르기성 질환을 진단하는데 필요한 정보를 제공하는 방법.
  15. 제1항 또는 제2항에 기재된 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편을 사용하여 인간 TIM-3을 검출 또는 측정하는 것을 포함하는, 암, 자가 면역 질환 또는 알레르기성 질환을 진단하는데 필요한 정보를 제공하는 방법.
  16. 제1항 또는 제2항에 기재된 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편을 포함하는 암, 자가 면역 질환 또는 알레르기성 질환의 치료약.
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