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CN111253485A - 抗人tim-3单克隆抗体及其应用 - Google Patents

抗人tim-3单克隆抗体及其应用 Download PDF

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CN111253485A
CN111253485A CN201811459248.9A CN201811459248A CN111253485A CN 111253485 A CN111253485 A CN 111253485A CN 201811459248 A CN201811459248 A CN 201811459248A CN 111253485 A CN111253485 A CN 111253485A
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tim
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段清
刘礼乐
杨达志
徐丽娜
刘虎
卫培培
王倩
王远东
邵晓慧
胡少平
张瑜
吴建
王美玲
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Shanghai Pharmaexplorer Co Ltd
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Pharmaexplorer Ltd
Shanghai Pharmaexplorer Co Ltd
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Priority to US17/298,817 priority patent/US20220033501A1/en
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Abstract

本发明公开了一种靶向TIM‑3的抗体、其制备方法和用途。具体地，本发明公开了一种新的靶向TIM‑3的全人单克隆抗体。本发明还公开了制备所述的单克隆抗体的方法。本发明的单克隆抗体能够高特异性地结合TIM‑3抗原，其具有很高的亲和力并且具有显著抗肿瘤等活性。

Description

抗人TIM-3单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种TIM-3抗体及其制备方法和应用
背景技术
T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(TIM-3，HAVCR2)是一种有301个氨基酸的I型膜蛋白，是已知的主要免疫检查点(Immune Checkpoint)之一。TIM-3主要表达在活化的CD4+和CD8+T淋巴细胞，天然的调节性T细胞、NK细胞以及先天细胞(巨噬细胞、单核细胞和树突细胞)。据文献报道，TIM-3的配体包括磷脂酰丝氨酸(PtdSer)、半乳凝素-9(Gal-9)、高迁移率族蛋白1(HMGB1)和癌胚抗原细胞粘附分子1(CECAM1)。TIM-3通过与其配体的结合在调节免疫应答的各方面发挥作用。TIM-3与CECAM1的相互作用，抑制T细胞活化，促使T细胞耐受和耗竭。调节性T细胞和许多肿瘤细胞表达Gal-9蛋白，与TIM-3结合抑制效应T细胞的活化。HMGB1与TIM-3结合作用于抗原递呈细胞和先天细胞，减少损伤相关分子模式介导的炎症反应。TIM-3结合磷脂酰丝氨酸促进凋亡细胞的清除。
研究表明TIM-3表达的异常与许多疾病有密切的关系。有研究发现HIV，HCV感染的患者以及一些肿瘤患者，其T细胞TIM-3表达升高，介导T效应细胞的凋亡，传递负调节信号，从而导致免疫系统的紊乱，机体免疫功能瘫痪。另外，在多种小鼠肿瘤模型中的肿瘤浸润的淋巴细胞共表达TIM-3和PD-1，并且表现出功能的耗竭，丧失增殖以及分泌一些细胞因子(IL-2、TNF-α和IFN-γ)的能力。同时阻断PD-1与TIM-3信号通路相比单独阻断PD-1或TIM-3的信号通路，能更有效地抑制肿瘤生长。在人类很多肿瘤浸润的T细胞中，TIM-3+/PD-1+双阳性的CD8+T细胞比TIM-3-/PD-1+和TIM-3-/PD-1-的CD8+T细胞功能更加紊乱，分泌细胞因子的能力也更弱。
目前国内外仅有两个TIM-3抗体处于临床研究阶段，其他抗体药物仍处于发现和研究阶段，尚没有TIM-3抗体进入临床应用，急需开发出活性好、适应症广和产量高的TIM-3抗体。亟待开发活性更好的TIM-3抗体，进一步以提高治疗效果。抗体本身的活性受可变区序列和恒定区结构的影响。抗体的可变区序列决定了识别抗原的决定簇、结合亲和力及在体内代谢速率，都会影响其体内活性，甚至不同病患个人的临床效果。
目前TIM-3抗体的临床研究阶段主要用于恶性实体瘤和淋巴瘤的治疗，而且也主要集中于它和其他疗法或靶点药物的联合使用，开发适应症广的抗体从而扩大其适用的临床症状，亟待开发产量更高的TIM-3抗体以降低患者的治疗成本，惠及更多患者。此外，目前肿瘤免疫治疗价格昂贵，急需发明并且生产新的抗体以降低成本。
发明内容
为了克服目前缺少全人TIM-3抗体及现有TIM-3抗体在活性方面的缺点，本发明提供一种亲和力高、特异性强的TIM-3抗体及其制备方法和用途。
在本发明的第一方面，提供了一种抗体的重链可变区，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.10n+3所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO.10n+4所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO.10n+5所示的VH-CDR3；
其中，各n独立地为0、1、2、3、4、5或6；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留TIM-3结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO.10n+1所示的氨基酸序列，其中，n为0、1、2、3、4、5或6。
在本发明的第二方面，提供了一种抗体的重链，所述的重链具有如本发明的第一方面所述的重链可变区。
在另一优选例中，所述重链还包括重链恒定区。
在另一优选例中，所述重链恒定区为人源。
在另一优选例中，所述重链恒定区为人源抗体重链IgG4恒定区。
在本发明的第三方面，提供了一种抗体的轻链可变区，所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.10n+8所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO.10n+9所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO.10n+10所示的VL-CDR3；
其中，各n独立地为0、1、2、3、4、5或6；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留TIM-3结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述轻链可变区具有SEQ ID NO.10n+6所示的氨基酸序列，其中，n为0、1、2、3、4、5或6。
在本发明的第四方面，提供了一种抗体的轻链，所述的轻链具有如本发明的第三方面所述的轻链可变区。
在另一优选例中，所述轻链还包括轻链恒定区。
在另一优选例中，所述轻链恒定区为人源。
在另一优选例中，所述轻链恒定区为人源抗体轻链kappa恒定区。
在本发明的第五方面，提供了一种抗体，所述抗体具有：
(1)如本发明的第一方面所述的重链可变区；和/或
(2)如本发明的第三方面所述的轻链可变区；
或者，所述抗体具有：如本发明的第二方面所述的重链；和/或如本发明的第四方面所述的轻链，
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留TIM-3结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，上述任一CDR的氨基酸序列中包含经过添加、缺失、修饰和/或取代1、2或3个氨基酸的衍生CDR序列，并且使得含有所述衍生CDR序列的VH和VL所构成的衍生抗体能够保留与TIM-3结合的亲和力。
在另一优选例中，所述的衍生抗体与TIM-3结合的亲和力F1与相应非衍生的抗体与TIM-3结合的亲和力F0之比(F1/F0)为0.5-2，较佳地为0.7-1.5，和更佳地0.8-1.2。
在另一优选例中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量为1-5个(如1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)。
在另一优选例中，所述的经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留TIM-3结合亲和力的衍生序列为同源性或序列相同性为至少96％的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的抗体还包括重链恒定区和/或轻链恒定区。
在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源的，和/或所述的轻链恒定区为人源的。
在另一优选例中，所述重链恒定区为人源抗体重链IgG4恒定区，且所述轻链恒定区为人源抗体轻链kappa恒定区。
在另一优选例中，所述抗体选自下组：动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体、或其组合。
在另一优选例中，所述的嵌合抗体在人中的免疫原性Z1与非嵌合的抗体(如鼠源抗体)在人中的免疫原性Z0之比(Z1/Z0)为0-0.5，较佳地0-0.2，更佳地0-0.05(如0.001-0.05)。
在另一优选例中，所述的抗体是部分或全人源化、或全人的单克隆抗体。
在另一优选例中，所述的抗体为双链抗体、或单链抗体。
在另一优选例中，所述抗体为抗体全长蛋白、或抗原结合片段。
在另一优选例中，所述抗体为双特异性抗体、或多特异性抗体。
在另一优选例中，所述抗体具有选自下组的一个或多个特性：
(a)抑制肿瘤细胞迁移或转移；
(b)抑制肿瘤生长。
在另一优选例中，所述的抗体具有如本发明的第一方面所述的重链可变区和如本发明的第三方面所述的轻链可变区；
其中，所述的重链可变区和所述的轻链可变区包括选自下组的CDR：
Figure BDA0001888330740000041
Figure BDA0001888330740000051
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留TIM-3结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述的抗体具有如本发明的第一方面所述的重链可变区和如本发明的第三方面所述的轻链可变区；其中，
所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.3所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO.4所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO.5所示的VH-CDR3；
所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.8所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO.9所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO.10所示的VL-CDR3；
或
所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.13所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO.14所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO.15所示的VH-CDR3；
所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.18所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO.19所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO.20所示的VL-CDR3；
或
所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.23所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO.24所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO.25所示的VH-CDR3；
所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.28所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO.29所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO.30所示的VL-CDR3；
或
所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.33所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO.34所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO.35所示的VH-CDR3；
所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.38所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO.39所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO.40所示的VL-CDR3；
或
所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.43所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO.44所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO.45所示的VH-CDR3；
所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.48所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO.49所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO.50所示的VL-CDR3；
或
所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.53所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO.54所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO.55所示的VH-CDR3；
所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.58所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO.59所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO.60所示的VL-CDR3；
或
所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.63所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO.64所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO.65所示的VH-CDR3；
所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.68所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO.69所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO.70所示的VL-CDR3。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.1、11、21、31、41、51或61所示的氨基酸序列；和/或所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.6、16、26、36、46、56或66所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列；且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.21所示的氨基酸序列；且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.26所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.31所示的氨基酸序列；且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.36所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.41所示的氨基酸序列；且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.46所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.51所示的氨基酸序列；且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.56所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.61所示的氨基酸序列；且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.66所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的抗体选自下组：
Figure BDA0001888330740000071
Figure BDA0001888330740000081
在另一优选例中，所述重链可变区的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID NO.1、11、21、31、41、51或61所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性或序列相同性。
在另一优选例中，所述轻链可变区的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID NO.6、16、26、36、46、56或66所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性或序列相同性。
在本发明的第六方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白包括：
(i)如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在另一优选例中，所述的标签序列包括6His标签。
在另一优选例中，所述的重组蛋白(或多肽)包括融合蛋白。
在另一优选例中，所述的重组蛋白为单体、二聚体、或多聚体。
在另一优选例中，所述重组蛋白包括：
(i)选自下组的抗体，
抗体编号 克隆 VH序列编号 VL序列编号
1 7A4F10 1 6
2 18D2H2 11 16
3 134H3G6 21 26
4 215A8F2 31 36
5 34B6D8 41 46
6 39E5H1 51 56
7 57F4E5 61 66
以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在本发明的第七方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码选自下组的多肽：
(1)如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体；以及
(2)如本发明的第六方面所述的重组蛋白。
在另一优选例中，编码所述重链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO.2、12、22、32、42、52或62所示；和/或，编码所述轻链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO.7、17、27、37、47、57或67所示。
在另一优选例中，编码所述重链可变区序列的多核苷酸和编码所述轻链可变区序列的多核苷酸选自下组：
Figure BDA0001888330740000091
在本发明的第八方面，提供了一种载体，所述载体含有本发明的第七方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。
在本发明的第九方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明的第八方面所述的载体或基因组中整合有本发明的第七方面所述的多核苷酸。
在本发明的第十方面，提供了一种抗体偶联物，该抗体偶联物含有：
(a)抗体部分，所述抗体部分选自下组：如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体、或其组合；和(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。
在另一优选例中，所述的抗体部分与所述的偶联部分通过化学键或接头进行偶联。
在本发明的第十一方面，提供了一种免疫细胞，所述免疫细胞表达或在细胞膜外暴露有本发明的第五方面所述的抗体。
在另一优选例中，所述的免疫细胞包括NK细胞、T细胞。
在另一优选例中，所述的免疫细胞来自人或非人哺乳动物(如鼠)。
在本发明的第十二方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有：
(i)活性成分，所述活性成分选自下组：如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或其组合；以及
(ii)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物为液态制剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物包括0.01～99.99％的如本发明的第五方面所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或其组合和0.01～99.99％的药用载体，所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。
在本发明的第十三方面，提供了一种活性成分的用途，所述活性成分选自下组：如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或其组合，其中所述活性成分被用于(a)制备诊断试剂或试剂盒；和/或(b)制备预防和/或治疗与TIM-3表达或功能异常相关的疾病的药物。
在另一优选例中，所述的诊断试剂为检测片或检测板。
在另一优选例中，所述TIM-3表达或功能异常相关的疾病选自下组：肿瘤和自身免疫性疾病。
在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：黑色素瘤，间皮瘤，非小细胞肺癌，乳腺癌，肝癌，滑膜肉瘤，转移性结肠癌，肾癌，膀胱癌，前列腺癌，卵巢癌，丙型肝炎病毒慢性感染，晚期实体癌，消化器官恶性肿瘤，子宫内膜癌，复发黑色素瘤，头颈部鳞状细胞癌，皮肤T细胞淋巴瘤，输卵管癌，腹膜肿瘤，肌肉浸润性膀胱癌，广泛的阶段小细胞肺癌，成人急性髓细胞性白血病，非典型慢性粒细胞白血病，卵巢上皮细胞癌，B细胞慢性淋巴细胞白血病，皮肤B细胞非霍奇金淋巴瘤，眼内淋巴瘤，睾丸绒毛膜癌，神经母细胞瘤，食管癌。
在另一优选例中，所述自身免疫性疾病选自下组：系统性红斑狼疮、口眼干燥综合征、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、硬皮病、结节性多动脉炎、Wegener肉芽肿病、甲状腺功能亢进、胰岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、寻常天皰疮、类天皰疮、移植排斥。
在另一优选例中，所述诊断试剂或试剂盒用于：检测样品中TIM-3蛋白。
在另一优选例中，所述的诊断试剂或试剂盒用于诊断TIM-3相关疾病。
在另一优选例中，所述的诊断试剂或试剂盒用于检测样品中TIM-3蛋白。
在本发明的第十四方面，提供了一种体外检测(包括诊断性或非诊断性)样品中TIM-3蛋白的方法，所述方法包括步骤：
(1)在体外，将所述样品与如本发明的第五方面所述的抗体接触；
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在TIM-3蛋白。
在本发明的第十五方面，提供了一种体外检测样品中TIM-3蛋白的组合物，其包括如本发明的第五方面所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或其组合作为活性成分。
在本发明的第十六方面，提供了一种检测板，所述的检测板包括：基片(支撑板)和测试条，所述的测试条含有如本发明的第五方面所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或其组合。
在本发明的第十七方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括：
(1)第一容器，所述第一容器中含有本发明的抗体；和/或
(2)第二容器，所述第二容器中含有抗本发明抗体的二抗；
或者，
所述试剂盒含有如本发明的第十六方面所述的检测板。
在本发明的第十八方面，提供了一种重组多肽的制备方法，该方法包括：
(a)在适合表达的条件下，培养如本发明的第九方面所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是如本发明的第五方面所述的抗体或如本发明的第六方面所述的重组蛋白。
在本发明的第十九方面，提供了一种药物组合，包括：
(i)第一活性成分，所述第一活性成分包括如本发明的第五方面所述的抗体1、或如本发明的第六方面所述的重组蛋白、或如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、或如本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或如本发明的第十二方面所述的药物组合物、或其组合；
(ii)第二活性成分，所述第二活性成分包括第二抗体、或化疗剂。
在另一优选例中，所述第二抗体选自下组：CTLA4抗体、PD-1抗体。
在另一优选例中，所述的第二抗体为PD-1抗体。
在另一优选例中，所述化疗剂选自下组：多西他赛、卡铂、或其组合。
在本发明的第二十方面，提供了本发明的第五方面所述的抗体，或本发明的第六方面所述的重组蛋白、或本发明的第十方面所述的抗体偶联物、或本发明的第十一方面所述的免疫细胞、和/或本发明的第十二方面所述的药物组合物与第二抗体或化疗剂的组合在制备用于治疗TIM-3表达或功能异常相关的疾病的药物中的用途。
在另一优选例中，所述第二抗体选自下组：CTLA4抗体、PD-1抗体。
在另一优选例中，所述的第二抗体为PD-1抗体。
在本发明的第二十一方面，提供了一种治疗与TIM-3表达或功能异常相关的疾病的方法，向有需要的对象施用有效量的如本发明的第五方面所述的抗体、或如本发明的第六方面所述的重组蛋白、或如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、或如本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或如本发明的第十二方面所述的药物组合物、或其组合。
在另一优选例中，所述与TIM-3表达或功能异常相关的疾病为癌症。
在另一优选例中，所述的方法还包括：在施用第一活性成分之前、之中和/或之后，向所述对象施用安全有效量的第二抗体。
在另一优选例中，所述的第二抗体选自下组：PD-1抗体、CTLA4抗体。
在另一优选例中，所述的第二抗体为PD-1抗体。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了TIM-3-hFc蛋白与其商业化抗体的结合活性。
图2显示了TIM-3基因转染的HEK293细胞FACS检测结果。
图3显示了ELISA检测TIM-3-hFC蛋白免疫后小鼠血清抗体效价。
图4显示了酶联免疫吸附实验中TIM-3抗体与人TIM-3胞外区蛋白反应活性。
图5显示了酶联免疫吸附实验中TIM-3抗体与猴TIM-3胞外区蛋白反应活性。
图6显示了酶联免疫吸附实验中TIM-3抗体与鼠TIM-3胞外区蛋白反应活性。
图7显示了FACS检测TIM-3抗体与CHOK1-hTIM-3的结合反应。
图8显示了FACS检测TIM-3抗体与CHOK1-cTIM-3的结合反应。
图9显示了抗体在OKT3依赖的PBMC激活试验中对IFN-γ分泌的影响。
图10显示了酶联免疫吸附实验中全人TIM-3抗体与人TIM-3胞外区蛋白反应活性。
图11显示了酶联免疫吸附实验中全人TIM-3抗体与猴TIM-3胞外区蛋白反应活性。
图12显示了酶联免疫吸附实验中全人TIM-3抗体与鼠TIM-3胞外区蛋白反应活性。
图13显示了FACS检测全人TIM-3抗体与CHOK1-hTIM-3的结合反应。
图14显示了FACS检测全人TIM-3抗体与CHOK1-cTIM-3的结合反应。
图15显示了全人TIM-3抗体在淋巴细胞激活试验中对IFN-γ分泌的影响(捐赠人X)。
图16显示了全人TIM-3抗体在淋巴细胞激活试验中对IFN-γ分泌的影响(捐赠人Y)。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，以人源TIM-3作为免疫原，采用优化的杂交瘤技术制备TIM-3抗体。具体而言，本发明采用人源抗体转基因小鼠技术进行全人源抗体的制备，获得TIM-3抗体的先导抗体；再通过对先导抗体的初步生产、纯化和检定，获得具备抗体亲和力高、在人外周血单核细胞激活反应中显著增加IFN的表达水平等优异生物性特性的TIM-3抗体；然后通过分子生物学方法测序获知TIM-3抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。所述的TIM-3抗体与人源和猴源的TIM-3蛋白均具有高度亲和力，能在OKT3激活诱导的人外周血单核细胞中增加IFN的表达水平。本发明还提供了这些抗体的用途，包括但不仅限于抑制TIM-3与其配体介导的信号通路的负调控，激活肿瘤特异免疫反应，单独或与抗PD-1，CTLA-4单克隆抗体或其它抗肿瘤药物联合应用于用于肿瘤免疫治疗。在此基础上完成了本发明。
术语
本发明中，“VH-CDR1”与“CDR-H1”可互换使用，均指重链可变区的CDR1；“VH-CDR2”与“CDR-H2”可互换使用，均指重链可变区的CDR2；“VH-CDR3”与“CDR-H3”可互换使用，均指重链可变区的CDR3。“VL-CDR1”与“CDR-L1”可互换使用，均指轻链可变区的CDR1；“VL-CDR2”与“CDR-L2”可互换使用，均指轻链可变区的CDR2；“VL-CDR3”与“CDR-L3”可互换使用，均指轻链可变区的CDR3。
抗体
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。
一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
在本发明中，抗体包括用本领域技术人员熟知技术所制备的鼠的、嵌合的、人源化的或者全人的抗体。重组抗体，例如嵌合的和人源化的单克隆抗体，包括人的和非人的部分，可以通过标准的DNA重组技术获得，它们都是有用的抗体。嵌合抗体是一个分子，其中不同的部分来自不同的动物种，例如具有来自鼠的单克隆抗体的可变区，和来自人免疫球蛋白的恒定区的嵌合抗体(见例如美国专利4,816,567和美国专利4,816,397,在此通过引用方式整体引入本文)。人源化的抗体是指来源于非人物种的抗体分子，具有一个或多个来源于非人物种的互补决定区(CDRs)和来源于人免疫球蛋白分子的框架区域(见美国专利5,585,089，在此通过引用方式整体引入本文)。这些嵌合和人源化的单克隆抗体可以采用本领域熟知的DNA重组技术制备。
在本发明中，抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性、或者更多的多重特异性。
在本发明中，本发明的抗体还包括其保守性变异体，指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表19进行氨基酸替换而产生。
表19
最初的残基 代表性的取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
抗TIM-3的抗体
本发明中，所述抗体为抗TIM-3的抗体。本发明提供一种针对TIM-3的高特异性和高亲和力的抗体，其包括重链和轻链，所述重链含有重链可变区(VH)氨基酸序列，所述轻链含有轻链可变区(VL)氨基酸序列。
优选地，
所述的重链可变区(VH)具有选自下组的互补决定区CDR：
SEQ ID NO.10n+3所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO.10n+4所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO.10n+5所示的VH-CDR3；
其中，各n独立地为0、1、2、3、4、5或6；
所述的轻链可变区(VL)具有选自下组的互补决定区CDR：
SEQ ID NO.10n+8所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO.10n+9所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO.10n+10所示的VL-CDR3；
其中，各n独立地为0、1、2、3、4、5或6；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留TIM-3结合亲和力的衍生序列。
优选地，重链可变区(VH)包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.10n+3所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO.10n+4所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO.10n+5所示的VH-CDR3；
轻链可变区(VL)包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.10n+8所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO.10n+9所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO.10n+10所示的VL-CDR3；
各n独立地为0、1、2、3、4、5或6；较佳地n为0或1；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留TIM-3结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸序列所形成的序列优选为同源性或序列相同性为至少80％，较佳地至少85％，更佳地至少为90％，最佳地至少95％的氨基酸序列。
本领域普通技术人员公知的测定序列同源性或相同性的方法包括但不限于：计算机分子生物学(Computational Molecular Biology)，Lesk，A.M.编，牛津大学出版社，纽约，1988；生物计算：信息学和基因组项目(Biocomputing:Informatics and GenomeProjects)，Smith，D.W.编，学术出版社，纽约，1993；序列数据的计算机分析(ComputerAnalysis of Sequence Data)，第一部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编，HumanaPress，新泽西，1994；分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in MolecularBiology)，von Heinje，G.，学术出版社，1987和序列分析引物(Sequence AnalysisPrimer)，Gribskov，M.与Devereux，J.编M Stockton Press，纽约，1991和Carillo，H.与Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48:1073(1988)。测定相同性的优选方法要在测试的序列之间得到最大的匹配。测定相同性的方法编译在公众可获得的计算机程序中。优选的测定两条序列之间相同性的计算机程序方法包括但不限于：GCG程序包(Devereux，J.等，1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S，F.等，1990)。公众可从NCBI和其它来源得到BLASTX程序(BLAST手册，Altschul，S.等，NCBINLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.等，1990)。熟知的Smith Waterman算法也可用于测定相同性。
本发明中的抗体可以是全长蛋白(如IgG1,IgG2a,IgG2b或者IgG2c)，也可以是包含抗原抗体结合域的蛋白片段(例如Fab，F(ab’),sdAb,ScFv片段)。本发明中的抗体可以是野生型蛋白，也可以是经过特定突变已达到某种特定效果的突变型蛋白，例如利用突变消除抗体的效应子功能。
较佳地，本文所述抗体为抗体全长蛋白、抗原抗体结合域蛋白质片段、双特异性抗体、多特异性抗体、单链抗体(single chain antibody fragment，scFv)、单域抗体(singledomain antibody，sdAb)和单区抗体(Signle-domain antibody)中的一种或多种，以及上述抗体所制得的单克隆抗体或多克隆抗体。所述单克隆抗体可以由多种途径和技术进行研制，包括杂交瘤技术、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术等，主流是通过杂交瘤技术从野生型或转基因小鼠制备单克隆抗体。
所述的抗体全长蛋白为本领域常规的抗体全长蛋白，其包括重链可变区、轻链可变区、重链恒定区和轻链恒定区。所述的蛋白质的重链可变区和轻链可变区与人源重链恒定区和人源轻链恒定区构成全人源抗体全长蛋白。较佳地，所述的抗体全长蛋白为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
本发明的抗体可以是双链或单链抗体，并且可以是选自动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体，更优选为人源化抗体、人-动物嵌合抗体，更优选为全人源化抗体。
本发明所述抗体衍生物可以是单链抗体、和/或抗体片段，如：Fab、Fab'、(Fab')2或该领域内其他已知的抗体衍生物等，以及IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM抗体或其他亚型的抗体中的任意一种或几种。
所述的单链抗体为本领域常规的单链抗体，其包括重链可变区、轻链可变区和15～20个氨基酸的短肽。
其中，所述动物优选为哺乳动物，如鼠。
本发明抗体可以是靶向TIM-3(例如人TIM-3)的嵌合抗体、人源化抗体、CDR嫁接和/或修饰的抗体。
本发明上述内容中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，优选为不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的40％，更优选为不超过35％，更优选为1-33％，更优选为5-30％，更优选为10-25％，更优选为15-20％。
本发明上述内容中，更优选地，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，可以是1-7个，更优选为1-5个，更优选为1-3个，更优选为1-2个。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.1、11、21、31、41、51或61所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.6、16、26、36、46、56或66所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述靶向TIM-3的抗体的重链可变区(VH)氨基酸序列，和/或，轻链可变区氨基酸序列如下表20所示：
表20
抗体编号 VH序列编号 VL序列编号
1 1 6
2 11 16
3 21 26
4 31 36
5 41 46
6 51 56
7 61 66
在另一优选例中，所述靶向TIM-3的抗体为7A4F10、10D2H2、134H3G6、215A8F2、34B6D8、39E5H1、57F4E5。
在另一优选例中，所述靶向TIM-3的抗体为7A4F10。
在另一优选例中，所述靶向TIM-3的抗体为10D2H2。
重组蛋白
本发明还提供一种重组蛋白，其包括TIM-3抗体的重链CDR1(VH-CDR1)、重链CDR2(VH-CDR2)和重链CDR3(VH-CDR3)中的一种或多种，和/或，TIM-3抗体的轻链CDR1(VL-CDR1)、轻链CDR2(VL-CDR2)和轻链CDR3(VL-CDR3)中的一种或多种，
所述重链CDR1-3的序列如下：
SEQ ID NO.10n+3所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO.10n+4所示的VH-CDR2，
SEQ ID NO.10n+5所示的VH-CDR3；
所述轻链CDR1-3的序列如下：
SEQ ID NO.10n+8所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO.10n+9所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO.10n+10所示的VL-CDR3；
各n独立地为0、1、2、3、4、5或6；较佳地n为0或1；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留TIM-3结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸序列所形成的序列优选为同源性或序列相同性为至少80％，较佳地至少85％，更佳地至少为90％，最佳地至少95％的氨基酸序列。
在另一优选例中，本发明所述的重组蛋白包括TIM-3抗体的重链可变区和/或TIM-3抗体的轻链可变区，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.1、11、21、31、41、51或61所示的氨基酸序列；所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.6、16、26、36、46、56或66所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，本发明所述的重组蛋白包括TIM-3抗体的重链可变区和TIM-3抗体的轻链可变区，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.1、11、21、31、41、51或61所示的氨基酸序列，且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.6、16、26、36、46、56或66所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述重组蛋白及其包括的重链CDR1-3、轻链CDR1-3的氨基酸序列的序列编号如表21所示：
表21重链CDR1-3、轻链CDR1-3的氨基酸序列的序列编号
Figure BDA0001888330740000211
Figure BDA0001888330740000221
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留TIM-3结合亲和力的衍生序列。
较佳地，所述的重组蛋白还包括抗体重链恒定区和/或抗体轻链恒定区，所述的抗体重链恒定区为本领域常规，较佳地为大鼠源抗体重链恒定区或人源抗体重链恒定区，更佳地为人源抗体重链恒定区。所述的抗体轻链恒定区为本领域常规，较佳地为大鼠源轻链抗体恒定区或人源抗体轻链恒定区，更佳地为人源抗体轻链恒定区。
所述的重组蛋白为本领域常规的蛋白质，较佳地，其为抗体全长蛋白、抗原抗体结合域蛋白质片段、双特异性抗体、多特异性抗体、单链抗体(single chain antibodyfragment，scFv)、单域抗体(single domain antibody，sdAb)和单区抗体(Signle-domainantibody)中的一种或多种，以及上述抗体所制得的单克隆抗体或多克隆抗体。所述单克隆抗体可以由多种途径和技术进行研制，包括杂交瘤技术、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术等，主流是通过杂交瘤技术从野生型或转基因小鼠制备单克隆抗体。
所述的抗体全长蛋白为本领域常规的抗体全长蛋白，其包括重链可变区、轻链可变区、重链恒定区和轻链恒定区。所述的蛋白质的重链可变区和轻链可变区与人源重链恒定区和人源轻链恒定区构成全人源抗体全长蛋白。较佳地，所述的抗体全长蛋白为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
所述的单链抗体为本领域常规的单链抗体，其包括重链可变区、轻链可变区和15～20个氨基酸的短肽。
所述的抗原抗体结合域蛋白质片段为本领域常规的抗原抗体结合域蛋白质片段，其包括轻链可变区、轻链恒定区和重链恒定区的Fd段。较佳地，所述的抗原抗体结合域蛋白质片段为Fab和F(ab’)。
所述的单域抗体为本领域常规的单域抗体，其包括重链可变区和重链恒定区。
所述的单区抗体为本领域常规的单区抗体，其仅包括重链可变区。
其中，所述重组蛋白的制备方法为本领域常规的制备方法。所述制备方法较佳地为：从重组表达该蛋白质的表达转化体中分离获得或者通过人工合成蛋白质序列获得。所述的从重组表达该蛋白质的表达转化体中分离获得优选如下方法：将编码所述蛋白质并且带有点突变的核酸分子克隆到重组载体中，将所得重组载体转化到转化体中，得到重组表达转化体，通过培养所得重组表达转化体，即可分离纯化获得所述重组蛋白。
核酸
本发明还提供一种核酸，其编码上述的抗体(例如抗TIM-3的抗体)或重组蛋白或抗TIM-3的抗体的重链可变区或轻链可变区。
较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2、12、22、32、42、52或62所示；和/或，编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO.7、17、27、37、47、57或67所示。
更佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2、12、22、32、42、52或62所示；且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.7、17、27、37、47、57或67所示。
所述核酸的制备方法为本领域常规的制备方法，较佳地，包括以下的步骤：通过基因克隆技术获得编码上述蛋白质的核酸分子，或者通过人工全序列合成的方法得到编码上述蛋白质的核酸分子。
本领域技术人员知晓，编码上述蛋白质的氨基酸序列的碱基序列可以适当引入替换、缺失、改变、插入或增加来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对编码该蛋白序列基因的一个或多个碱基在保持抗体活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。
载体
本发明还提供一种包含所述核酸的重组表达载体。
其中所述重组表达载体可通过本领域常规方法获得，即：将本发明所述的核酸分子连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体为本领域常规的各种载体，只要其能够容载前述核酸分子即可。所述载体较佳地包括：各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等。
本发明还提供一种包含上述重组表达载体的重组表达转化体。
其中，所述重组表达转化体的制备方法为本领域常规的制备方法，较佳地为：将上述重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞为本领域常规的各种宿主细胞，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带所述的核酸可被有效表达即可。较佳地，所述宿主细胞为E.coli TG1或E.coliBL21细胞(表达单链抗体或Fab抗体)，或者HEK293或CHO细胞(表达全长IgG抗体)。将前述重组表达质粒转化至宿主细胞中，即可得本发明优选的重组表达转化体。其中所述转化方法为本领域常规转化方法，较佳地为化学转化法，热激法或电转法。
抗体的制备
本发明抗体或其片段的DNA分子的序列可以用常规技术，比如利用PCR扩增或基因组文库筛选等方法获得。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码所述的本发明的抗体(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。优选的动物细胞包括(但并不限于)：CHO-S、HEK-293细胞。
通常，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。然后用常规的免疫球蛋白纯化步骤，如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的抗体。
所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。比如，单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结合试验(如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来测定。单克隆抗体的结合亲和力例如可用Munson等,Anal.Biochem.,107:220(1980)的Scatchard分析来测定。
本发明的抗体可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
抗体-药物偶联物(ADC)
本发明还提供了基于本发明抗体的抗体偶联药物(antibody-drug conjugate，ADC)。
典型地，所述抗体偶联药物包括所述抗体、以及效应分子，所述抗体与所述效应分子偶联，并优选为化学偶联。其中，所述效应分子优选为具有治疗活性的药物。此外，所述效应分子可以是毒蛋白、化疗药物、小分子药物或放射性核素中的一种或多种。
本发明抗体与所述效应分子之间可以是通过偶联剂进行偶联。所述偶联剂的例子可以是非选择性偶联剂、利用羧基的偶联剂、肽链、利用二硫键的偶联剂中的任意一种或几种。所述非选择性偶联剂是指使效应分子和抗体形成共价键连接的化合物，如戊二醛等。所述利用羧基的偶联剂可以是顺乌头酸酐类偶联剂(如顺乌头酸酐)、酰基腙类偶联剂(偶联位点为酰基腙)中的任意一种或几种。
抗体上某些残基(如Cys或Lys等)用于与多种功能基团相连，其中包括成像试剂(例如发色基团和荧光基团)，诊断试剂(例如MRI对比剂和放射性同位素)，稳定剂(例如乙二醇聚合物)和治疗剂。抗体可以被偶联到功能剂以形成抗体-功能剂的偶联物。功能剂(例如药物，检测试剂，稳定剂)被偶联(共价连接)至抗体上。功能剂可以直接地、或者是通过接头间接地连接于抗体。
抗体可以偶联药物从而形成抗体药物偶联物(ADCs)。典型地，ADC包含位于药物和抗体之间的接头。接头可以是可降解的或者是不可降解的接头。可降解的接头典型地在细胞内环境下容易降解，例如在目标位点处接头发生降解，从而使药物从抗体上释放出来。合适的可降解的接头包括，例如酶降解的接头，其中包括可以被细胞内蛋白酶(例如溶酶体蛋白酶或者内体蛋白酶)降解的含有肽基的接头，或者糖接头例如，可以被葡糖苷酸酶降解的含葡糖苷酸的接头。肽基接头可以包括，例如二肽，例如缬氨酸-瓜氨酸，苯丙氨酸-赖氨酸或者缬氨酸-丙氨酸。其它合适的可降解的接头包括，例如，pH敏感接头(例如pH小于5.5时水解的接头，例如腙接头)和在还原条件下会降解的接头(例如二硫键接头)。不可降解的接头典型地在抗体被蛋白酶水解的条件下释放药物。
连接到抗体之前，接头具有能够和某些氨基酸残基反应的活性反应基团，连接通过活性反应基团实现。巯基特异性的活性反应基团是优选的，并包括：例如马来酰亚胺类化合物，卤代酰胺(例如碘、溴或氯代的)；卤代酯(例如碘、溴或氯代的)；卤代甲基酮(例如碘、溴或氯代)，苄基卤代物(例如碘、溴或氯代的)；乙烯基砜，吡啶基二硫化物；汞衍生物例如3,6-二-(汞甲基)二氧六环，而对离子是醋酸根、氯离子或者硝酸根；和聚亚甲基二甲基硫醚硫代磺酸盐。接头可以包括，例如，通过硫代丁二酰亚胺连接到抗体上的马来酰亚胺。
药物可以是任何细胞毒性，抑制细胞生长或者免疫抑制的药物。在实施方式中，接头连接抗体和药物，而药物具有可以和接头成键的功能性基团。例如，药物可以具有可以和连接物成键的氨基，羧基，巯基，羟基，或者酮基。在药物直接连接到接头的情况下，药物在连接到抗体之前，具有反应的活性基团。
有用的药物类别包括，例如，抗微管蛋白药物、DNA小沟结合试剂、DNA复制抑制剂、烷化试剂、抗生素、叶酸拮抗物、抗代谢药物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱等。特别有用的细胞毒性药物类的例子包括，例如，DNA小沟结合试剂、DNA烷基化试剂、和微管蛋白抑制剂、典型的细胞毒性药物包括、例如奥瑞他汀(auristatins)、喜树碱(camptothecins)、多卡霉素/倍癌霉素(duocarmycins)、依托泊甙(etoposides)、美登木素(maytansines)和美登素类化合物(maytansinoids)(例如DM1和DM4)、紫杉烷(taxanes)、苯二氮卓类(benzodiazepines)或者含有苯二氮卓的药物(benzodiazepine containingdrugs)(例如吡咯并[1,4]苯二氮卓类(PBDs)，吲哚啉苯并二氮卓类(indolinobenzodiazepines)和噁唑烷并苯并二氮卓类(oxazolidinobenzodiazepines))和长春花生物碱(vinca alkaloids)。
在本发明中，药物-接头可以用于在一个简单步骤中形成ADC。在其它实施方式中，双功能连接物化合物可以用于在两步或多步方法中形成ADC。例如，半胱氨酸残基在第一步骤中与接头的反应活性部分反应，并且在随后的步骤中，接头上的功能性基团与药物反应，从而形成ADC。
通常，选择接头上功能性基团，以利于特异性地与药物部分上的合适的反应活性基团进行反应。作为非限制性的例子，基于叠氮化合物的部分可以用于特异性地与药物部分上的反应性炔基基团反应。药物通过叠氮和炔基之间的1,3-偶极环加成，从而共价结合于接头。其它的有用的功能性基团包括，例如酮类和醛类(适合与酰肼类和烷氧基胺反应)，膦(适合与叠氮反应)；异氰酸酯和异硫氰酸酯(适合与胺类和醇类反应)；和活化的酯类，例如N-羟基琥珀酰亚胺酯(适合与胺类和醇类反应)。这些和其它的连接策略，例如在《生物偶联技术》，第二版(Elsevier)中所描述的，是本领域技术人员所熟知的。本领域技术人员能够理解，对于药物部分和接头的选择性反应，当选择了一个互补对的反应活性功能基团时，该互补对的每一个成员既可以用于接头，也可以用于药物。
本发明还提供了制备ADC的方法，可进一步地包括：将抗体与药物-接头化合物，在足以形成抗体偶联物(ADC)的条件下进行结合。
在某些实施方式中，本发明方法包括：在足以形成抗体-接头偶联物的条件下，将抗体与双功能接头化合物进行结合。在这些实施方式中，本发明方法还进一步地包括：在足以将药物部分通过接头共价连接到抗体的条件下，将抗体接头偶联物与药物部分进行结合。
在一些实施方式中，抗体药物偶联物ADC如下分子式所示：
Figure BDA0001888330740000281
其中：
Ab是抗体，
LU是接头；
D是药物；
而且下标p是选自1到8的值。
应用
本发明还提供了本发明抗体、抗体偶联物ADC、重组蛋白、和/或免疫细胞的用途，例如用于制备诊断制剂或制备药物。
较佳地，所述的药物是用于预防和/或治疗与TIM-3表达或功能异常相关的疾病的药物。
本发明抗体、ADC、重组蛋白、和/或免疫细胞的用途，包括(但并不限于)：
(i)诊断、预防和/或治疗肿瘤发生、生长和/或转移，尤其是TIM-3高表达的肿瘤。所述肿瘤包括(但并不限于)：黑色素瘤，间皮瘤，非小细胞肺癌，乳腺癌，肝癌，滑膜肉瘤，转移性结肠癌，肾癌，膀胱癌，前列腺癌，卵巢癌，丙型肝炎病毒慢性感染，晚期实体癌，消化器官恶性肿瘤，子宫内膜癌，复发黑色素瘤，头颈部鳞状细胞癌，皮肤T细胞淋巴瘤，输卵管癌，腹膜肿瘤，肌肉浸润性膀胱癌，广泛的阶段小细胞肺癌，成人急性髓细胞性白血病，非典型慢性粒细胞白血病，卵巢上皮细胞癌，B细胞慢性淋巴细胞白血病，皮肤B细胞非霍奇金淋巴瘤，眼内淋巴瘤，睾丸绒毛膜癌，神经母细胞瘤，食管癌。
(ii)诊断、预防和/或治疗自身免疫性疾病，所述自身免疫性疾病包括(但并不限于)：系统性红斑狼疮、口眼干燥综合征、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、硬皮病、结节性多动脉炎、Wegener肉芽肿病、甲状腺功能亢进、胰岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、寻常天皰疮、类天皰疮、移植排斥。
检测用途和试剂盒
本发明的抗体或其ADC可用于检测应用，例如用于检测样本，从而提供诊断信息。
本发明中，所采用的样本(样品)包括细胞、组织样本和活检标本。本发明使用的术语“活检”应包括本领域技术人员已知的所有种类的活检。因此本发明中使用的活检可以包括例如肿瘤的切除样本、通过内窥镜方法或器官的穿刺或针刺活检制备的组织样本。
本发明中使用的样本包括固定的或保存的细胞或组织样本。
本发明还提供了一种指含有本发明的抗体(或其片段)的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。在优选例中，本发明的抗体可以固定于检测板。
药物组合物
本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白或其ADC或相应的免疫细胞，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。
配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。典型地，本发明所述的药物组合物的给药途径较佳地为注射给药或口服给药。所述注射给药较佳地包括静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射等途径。所述的药物组合物为本领域常规的各种剂型，较佳地为固体、半固体或液体的形式，可以为水溶液、非水溶液或混悬液，更佳地为片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂或输注剂等。
本发明所述抗体也可以是由核苷酸序列在细胞内表达用于的细胞治疗，比如，所述抗体用于嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)等。
本发明所述的药物组合物是用于预防和/或治疗与TIM-3表达或功能异常相关的疾病的药物组合物。
本发明的药物组合物可直接用于结合TIM-3蛋白分子，因而可用于预防和治疗肿瘤等疾病。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的单克隆抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
本发明中，较佳地，本发明所述的药物组合物还包括一种或多种药用载体。所述的药用载体为本领域常规药用载体，所述的药用载体可以为任意合适的生理学或药学上可接受的药物辅料。所述的药物辅料为本领域常规的药物辅料，较佳的包括药学上可接受的赋形剂、填充剂或稀释剂等。更佳地，所述的药物组合物包括0.01～99.99％的上述蛋白质和0.01～99.99％的药用载体，所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。
本发明中，较佳地，所述的药物组合物的施用量为有效量，所述有效量为能够缓解或延迟疾病、退化性或损伤性病症进展的量。所述有效量可以以个体基础来测定，并将部分基于待治疗症状和所寻求结果的考虑。本领域技术人员可以通过使用个体基础等上述因素和使用不超过常规的实验来确定有效量。
使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约20毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明提供上述药物组合物在制备预防和/或治疗与TIM-3表达或功能异常相关的疾病的药物中的应用。较佳地，所述与TIM-3表达或功能异常相关的疾病为癌症和自身免疫性疾病。
检测样品中TIM-3蛋白的方法、组合物
本发明还提供一种检测样品中TIM-3蛋白(例如检测过表达TIM-3细胞)的方法，包括如下的步骤：上述的抗体与待检样品在体外接触，检测上述的抗体与所述待检样品是否结合形成抗原-抗体复合物即可。
所述的过表达的含义为本领域常规，指TIM-3蛋白在待检样品中的RNA或蛋白质的过表达(由于转录增加、转录后加工、翻译、翻译后加工以及蛋白质降解改变)，以及由于蛋白质运送模式改变(核定位增加)而导致的局部过表达和功能活性提高(如在底物的酶水解作用增加的情况下)。
本发明中，上述是否结合形成抗原-抗体复合物的检测方式是本领域常规的检测方式，较佳地为流式细胞实验(FACS)检测。
本发明提供一种检测样品中TIM-3蛋白的组合物，其包括上述的抗体、重组蛋白、抗体偶联物、免疫细胞、或其组合作为活性成分。较佳地，其还包括上述的抗体的功能片段组成的化合物作为活性成分。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明采用大鼠-人嵌合抗体转基因小鼠获得全人抗体，所获得抗体具有一系列的优异特征：
①可变区序列与现有抗体有差异(同源性<92％)；
②所获得抗体具有较强的亲和力；
③所获得抗体具有很好的刺激T细胞激活活性；
(2)本发明采用的转基因小鼠，与野生型小鼠比能够更容易获得全人源抗体，从而降低抗体的免疫原性；与全人抗体的转基因小鼠比，获得的抗体数量多、亲和力强，序列多样性好并且活性高；
(3)本发明采用杂交瘤技术获得抗体，与噬菌体库获得的抗体相比，抗体亲和力高，序列表达良好；
(4)本发明获得了序列不同的抗体，能够与TIM-3特异性结合，其结合活性低于纳摩尔，通过逆转TIM-3对T细胞激活活性的抑制，从而激活T细胞分泌IFN。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件(例如商品说明书)。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例中所述的室温为本领域常规的室温，一般为10～30℃。
实施例1：TIM-3特异性抗体的制备
(一)、免疫原的制备
制备包括胞外区TIM-3蛋白、TIM-3重组细胞株、TIM-3DNA载体的表达质粒等免疫原。
免疫原1)，将人源TIM-3蛋白胞外区氨基酸序列22-200(如序列表SEQ ID NO.71所示)克隆到带有人IgG Fc片段(hFc)的pCpC载体(购自Invitrogen，V044-50)并按已建立的标准分子生物学方法制备质粒，具体方法参见Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,and ManiatisT.(1989).Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition(Plainview,NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press)。对HEK293细胞(购自Invitrogen)进行瞬时转染(PEI，Polysciences)并使用FreeStyle TM 293(Invitrogen)在37℃下进行扩大培养。4天后收集细胞培养液，离心去除细胞成分，得含TIM-3蛋白胞外区的培养上清液。将培养上清液上样到蛋白A亲和层析柱(Mabselect Sure，购自GE Healthcare)，同时用紫外(UV)检测仪监测紫外吸收值(A280nm)的变化。上样后用PBS磷酸盐缓冲液(pH7.2)清洗蛋白亲和层析柱直到紫外吸收值回到基线，然后用0.1M甘氨酸盐酸(pH2.5)洗脱，收集从蛋白A亲和层析柱上洗脱下来的带hFc标签的TIM-3蛋白(TIM-3-hFc)，用PBS磷酸盐缓冲液(pH7.2)在4℃冰箱透析过夜。透析后的蛋白经0.22微米无菌过滤后分装于-80℃保存，即获得纯化的免疫原人TIM-3-hFc蛋白。免疫原TIM-3-hFc蛋白在使用前需要进行一系列质控检测，如检测其蛋白浓度、纯度、分子量和生物活性等。
其中，免疫原TIM-3-hFc与商业化抗TIM-3抗体的结合活性采用ELISA检测，具体为：
将带hFc标签的TIM-3蛋白(TIM-3-hFc，即免疫原)，用PBS稀释至1μg/mL，以100μl/孔加入ELISA微孔板，4℃孵育过夜。用ELISA封闭液(含1％BSA，pH7.4的PBS磷酸缓冲液，所述百分比为质量百分比)37℃封闭两小时后，再加入梯度稀释的与商业化抗TIM-3抗体，37℃温育1小时。所述商业化抗TIM-3抗体购自R&D system，商品号MAB2365。加入HRP(辣根过氧化物酶)标记的二抗，室温孵育30分钟后加入100微升/孔TMB显色液。室温孵育15分钟后，加入50微升1N盐酸终止显色反应，用ELISA读板机读取OD450nm读数。每个步骤之后都需要洗板。其中阴性对照抗体为rat IgG，结果如图1和表1所示。
表1 TIM-3-hFc蛋白与其商业化抗体的结合活性
Figure BDA0001888330740000331
从结果说明TIM-3与商业化抗TIM-3蛋白的抗体在蛋白水平的结合随抗体的浓度变化而变化。
免疫原2)，人源TIM-3全长氨基酸序列克隆到pIRES载体(购自Clontech)并制备质粒。对HEK293细胞系和CHOK1细胞系(均购自Invitrogen)进行质粒转染(转染使用X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent，购自Roche公司，货号Cat#06 366 236 001，并按说明书操作)后，在含0.5μg/ml嘌呤霉素的含10％(w/w)FBS的DMEM培养基中选择性培养2周，用有限稀释法在96孔培养板中进行亚克隆，并置于37℃，5％(v/v)CO2培养。大约2周后选择部分单克隆孔扩增到6孔板中。对扩增后的克隆用已知的TIM-3抗体染色，经流式细胞分析法进行筛选。选择长势较好、荧光强度较高、单克隆的细胞系继续扩大培养并液氮冻存，即获得免疫原TIM-3重组细胞株。具体选择结果如表2和图2所示，表2中阳性细胞(％)指阳性细胞占总细胞数目的百分比，MFI是所测细胞群的平均荧光强度值。图2说明，HEK293细胞有较高水平TIM-3的表达。
表2 TIM-3基因转染的HEK293细胞FACS筛选检测结果
Figure BDA0001888330740000341
免疫原3)，TIM-3全长氨基酸序列cDNA被克隆到pCDNA3.1载体并包被到1.0um金胶体子弹上，用Helios基因枪(Bio-rad)免疫。详细方法根据Helios基因枪说明书进行制定。
(二)、杂交瘤细胞的制备和抗体筛选
Harbour转基因小鼠引入了人免疫球蛋白可变区基因和大鼠免疫球蛋白恒定区基因，而小鼠本身的Ig表达则被沉默(F.G.Franklin,et al,patent#WO2010/070263Al)。该转基因小鼠经抗原免疫后能产生与正常小鼠(如Balb/c)相当的免疫反应和抗体效价。
A、免疫原1)免疫采用6～8周龄Harbour人源抗体转基因小鼠(购自北京维通利华公司)，小鼠在SPF条件下饲养。初次免疫时，免疫原TIM-3-hFc蛋白用弗氏完全佐剂乳化后腹腔注射0.25毫升，即每只小鼠注射100微克免疫原蛋白。加强免疫时，免疫原蛋白用弗氏不完全佐剂乳化后腹腔注射0.25毫升，即每只小鼠注射50微克免疫原蛋白。初次免疫与第一次加强免疫之间间隔2周，以后每次加强免疫之间间隔3周。每次加强免疫1周后采血，用ELISA和FACS检测血清中免疫原蛋白的抗体效价和特异性，结果如图3和表3所示。
表3 ELISA检测TIM-3-hFC蛋白免疫后小鼠血清抗体效价
Figure BDA0001888330740000351
表3说明，经TIM-3-hFc免疫的小鼠的免疫后血清对免疫原均有不同程度的结合，呈现抗原抗体反应，其中最高稀释度在一万左右。其中空白对照为1％(w/w)BSA，其中批次指第二次加强免疫后第七天的小鼠血清，表中的数据为OD450nm值。
B、免疫原2)免疫采用6～8周龄Harbour人源抗体转基因小鼠(购自北京维通利华公司)，小鼠在SPF条件下饲养。将得到的含人源TIM-3的HEK293-hTIM-3稳定细胞系在T-75细胞培养瓶中扩大培养至90％汇合度，吸尽培养基。用DMEM基础培养基(购自Invitrogen)洗涤2次，然后用无酶细胞解离液(购自Invitrogen)37℃处理直至细胞从培养皿壁上可脱落，收集细胞。用DMEM基础培养基洗涤2次，进行细胞计数后将细胞用磷酸盐缓冲液(pH7.2)稀释至2×107细胞每毫升。每只小鼠每次免疫时腹腔注射0.5毫升细胞悬液。第一次与第二次免疫之间间隔2周，以后每次免疫间隔3周。除第一次免疫以外，每次免疫1周后采血，用ELISA检测血清中抗体效价和特异性。
C、免疫原3)免疫采用6～8周龄Harbour人源抗体转基因小鼠(购自北京维通利华公司)，小鼠在SPF条件下饲养。所有小鼠经腹部用基因枪免疫3-4次，每次3-4枪，每枪1.0微克cDNA量。初次免疫与第一次加强免疫之间隔2周，以后每次免疫间隔3周。每次加强免疫7天后采血，用ELISA检测血清中抗体效价。
通常大部分小鼠经2-3次免疫后ELISA效价可达到1:1000以上。表3和图3为TIM-3-hFC蛋白免疫血清，用ELISA进行抗体效价检测的结果。
结果表明：以免疫原进行免疫，大部分小鼠经3次免疫后ELISA效价可达到1:1000以上，说明小鼠对免疫原产生较好的体液免疫反应，其脾细胞可以用来进行杂交瘤细胞制备。
效价符合要求的小鼠可选择进行细胞融合和杂交瘤制备。细胞融合前，小鼠最后一次免疫用每只50-100微克纯化的TIM-3-hFc腹腔注射。3-5天后处死小鼠，收集脾细胞。用DMEM基础培养基1000转每分钟离心清洗细胞3次，然后按活细胞数目5:1比率与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0混合(购自ATCC)，采用高效电融合或PEG方法(参见METHODS IN ENZYMOLOGY,VOL.220)进行细胞融合。融合后的细胞稀释到含20％胎牛血清、1×HAT的DMEM培养基中，所述百分比为质量百分比。然后按1×105/200微升每孔加入到96孔细胞培养板中，放入5％CO2、37℃培养箱中，所述百分比为体积百分比。14天后用ELISA和Acumen(微孔板细胞检测法)筛选细胞融合板上清，将ELISA中OD450nm>1.0和Acumen中MFI值>100的阳性克隆扩增到24孔板，在含10％(w/w)胎牛血清的DMEM(Invitrogen)的培养基中，在37℃，5％(v/v)CO2条件下扩大培养。培养3天后取24孔板中扩大培养的培养液进行离心，收集上清液，对上清液进行抗体亚型分析。用ELISA、FACS确定抗体对TIM-3蛋白和TIM-3阳性细胞的结合活性。
根据24孔板筛选结果，挑选ELISA实验中OD450nm>1.0、FACS实验中MFI值>100的杂交瘤细胞为符合条件的阳性克隆。选择符合条件的杂交瘤细胞用有限稀释法在96孔板进行亚克隆，在含10％(w/w)FBS的DMEM培养基中(购自Invitrogen)37℃，5％(v/v)CO2条件下培养。亚克隆后10天用ELISA和Acumen进行初步筛选，挑选阳性单克隆扩增到24孔板继续培养。3天后用FACS确定抗原结合阳性评估生物活性(评估标准为ELISA实验中OD450nm>1.0、FACS实验中MFI值>100)。
根据24孔板样品检测结果，阳性克隆在含10％(w/w)FBS的DMEM(购自Invitrogen)培养基中，在37℃，5％(v/v)CO2条件下进行扩大培养，细胞悬浮于冻存液[含有20％(w/w)FBS和10％(w/w)DMSO的DMEM]中，按常规方法液氮冻存即得本发明杂交瘤细胞，并可用于后续的抗体生产、纯化和氨基酸序列测定。
实施例2：嵌合抗体的鉴定
(一)酶联免疫吸附实验(ELISA)检测抗体与TIM-3蛋白的结合
将实施例1步骤中所述的人源TIM-3蛋白胞外区氨基酸序列22-200(如序列表SEQID NO.71所示)克隆到带有人IgG Fc片段(hFc)的pCpC载体，转染HEK293细胞，收集细胞培养液，纯化得到带hFc标签的人TIM-3蛋白(此处称为hTIM-3-hFc蛋白)；将猴源TIM-3蛋白胞外区氨基酸序列22-201(如序列表SEQ ID NO.72所示)克隆到带有人IgG Fc片段(hFc)的pCpC载体，转染HEK293细胞，收集细胞培养液，纯化得到带hFc标签的猴TIM-3蛋白(此处称为cTIM-3-hFc蛋白)；将鼠源TIM-3蛋白胞外区氨基酸序列22-191(如序列表SEQ ID NO.73所示)克隆到带有人IgG Fc片段(hFc)的pCpC载体，转染HEK293细胞，收集细胞培养液，纯化得到带hFc标签的鼠TIM-3蛋白(此处称为mTIM-3-hFc蛋白)。纯化的人、猴、鼠TIM-3胞外区蛋白(hTIM-3-hFc、cTIM-3-hFc、mTIM-3-hFc)用PBS稀释到终浓度1.0μg/ml,然后以100μl每孔加到96孔ELISA板。用塑料膜封好4℃孵育过夜，第二天用洗板液(PBS+0.01％Tween20)洗板2次，加入封闭液(PBS+0.01％Tween20+1％BSA)室温封闭1-2小时。倒掉封闭液，加入待测抗体样品50-100μl每孔,37℃孵育1-2小时后，用洗板液(PBS+0.01％Tween20)洗板2-3次.加入HRP(辣根过氧化物酶)标记的二抗，37℃孵育1-2小时后，用洗板液(PBS+0.01％Tween20)洗板2-3次。加入TMB底物100μl每孔，室温孵育15-30分钟后，加入终止液(1.0NHCl)100μl每孔。用ELISA读板机(TiterMax 384plus,Molecular Device)读取A450nm数值。结果如图4,图5和图6，表4,表5和表6所示，待测抗体可不同程度地结合人和猴TIM-3胞外区蛋白，不能结合鼠TIM-3蛋白。其中IgG对照为大鼠IgG，表中的数据为A450nm数值。
表4酶联免疫吸附实验中TIM-3抗体与人TIM-3胞外区蛋白反应活性
Figure BDA0001888330740000371
Figure BDA0001888330740000381
表5酶联免疫吸附实验中TIM-3抗体与猴TIM-3胞外区蛋白反应活性
Figure BDA0001888330740000382
表6酶联免疫吸附实验中TIM-3抗体与鼠TIM-3胞外区蛋白反应活性
Figure BDA0001888330740000383
Figure BDA0001888330740000391
(二)流式细胞实验(FACS)检测抗体与TIM-3表达细胞的结合
将实施例1所述含有编码人源TIM-3全长核苷酸序列的pIRES质粒转染CHOK1细胞株得含人TIM-3的CHOK1稳转细胞株(此处称为CHOK1-hTIM-3稳定细胞株)，将带有猴源TIM-3全长基因的pIRES质粒，转染CHOK1细胞株构建含猴TIM-3的CHOK1稳转细胞株(此处称为CHOK1-cTIM-3稳定细胞株)。将CHOK1-hTIM-3稳定细胞株和CHOK1-cTIM-3稳定细胞株在T-75细胞培养瓶中扩大培养至90％汇合度，吸尽培养基，用HBSS(Hanks'Balanced SaltSolution)洗涤1-2次，然后用无酶细胞解离液(Versene solution:Life technology)处理和收集细胞。用HBSS缓冲液洗涤细胞1-2次,进行细胞计数后将细胞用HBSS稀释至1-2x106细胞每毫升，加入1％山羊血清封闭液，冰上孵育20-30分钟，然后用HBSS离心洗涤2次。将收集的细胞用FACS缓冲液(HBSS+1％BSA)悬浮至2x106细胞/ml,按每孔100微升加入到96孔FACS反应板中，加入待测抗体样品每孔100微升，冰上孵育1-2小时。用FACS缓冲液离心洗涤2次，加入每孔100微升荧光(Alexa 488)标记的二抗，冰上孵育0.5-1.0小时。用FACS缓冲液离心洗涤2-3次，加入每孔100微升固定液(4％Paraformaldehyde)悬浮细胞，5-10分钟后用FACS缓冲液离心洗涤1-2次。用100微升FACS缓冲液悬浮细胞，用FACS(FACSCalibur,BD)检测和分析结果。结果如图7和图8，表7和表8所示，其中IgG对照为大鼠IgG，表中的数据为MFI所测细胞群的平均荧光强度值。结果表明：待测抗体可结合细胞表面的人或猴TIM-3蛋白。
表7 FACS检测TIM-3抗体与CHOK1-hTIM-3的结合反应
Figure BDA0001888330740000392
Figure BDA0001888330740000401
表8 FACS检测TIM-3抗体与CHOK1-cTIM-3的结合反应
Figure BDA0001888330740000402
(三)淋巴细胞刺激实验检测TIM-3抗体对淋巴细胞活性的影响
淋巴细胞刺激实验检测TIM-3抗体阻断TIM-3蛋白与其受体的结合从而解除其对T淋巴细胞活性的抑制，从而刺激T细胞的增殖。
1.Ficoll分离全血获取外周血单核淋巴细胞PBMC。
将新鲜获取的全血用磷酸缓冲液PBS以1:1的体积比例稀释得稀释后的全血，用无菌吸管轻轻将稀释后的全血铺平在Ficoll液面(购自GE Healthcare)，Ficoll与稀释后的全血的体积比为3:4，避免震荡混匀，以400g转速室温20℃梯度离心30分钟，离心后的离心管分为三层，上层为血浆，中间乳白色分层即为单核淋巴细胞。用无菌吸管轻轻吸取中间层细胞，收集至新的离心管，用PBS磷酸缓冲液稀释至三倍体积，100g转速室温离心10分钟，弃上清。将淋巴细胞用PBS磷酸缓冲液重悬至10mL，重复前面步骤取出血小板。最后将淋巴细胞重悬至10mL含有10％胎牛血清的多组份RPMI1640培养基(购自Invitrogen)备用，即为外周血单核淋巴细胞PBMC，所述百分比为质量百分比。
2.OKT3介导PBMC细胞的预刺激实验
商业化的OKT3抗体(eBioscience Cat#16-0037-81)用PBS稀释到终浓度1.0μg/ml，然后以2ml每孔加到6孔细胞培养板。用塑料膜封好4℃孵育过夜，第二天用PBS洗3次，将分离得到的PBMC细胞接种到6孔板中，于37℃、5％CO2培养箱培养72小时。
3.丝裂霉素处理CHOK1-OS8细胞
将抗人类CD3单抗OKT3的单链可变片段(scFv)融合至小鼠CD8a C-末端域(113-220)建构Τ细胞接合物，膜错定嵌合抗体(OS8)，该小鼠CD8a的C末端域包括较链、跨膜及胞质域，这样可以将抗CD3scFv片段错定至细胞表面作为T细胞激活物。将表达重组融合蛋白OS8的质粒转染CHOK1细胞株得到在细胞表面表达OS8(一种T细胞激活分子)的CHOK1稳转细胞株(此处称为CHOK1-OS8稳定细胞株)。使用前，将CHOK1-OS8细胞用10μg/mL丝裂霉素，37℃处2小时，用PBS洗3次以去除残留的丝裂霉素。
4.CHOK1-OS8介导的PBMC刺激实验
试验前，配制等体积比稀释的待测的TIM-3抗体，得待测样品溶液。
将预刺激的外周血单核淋巴细胞PBMC以1×105个细胞100微升每孔铺至96孔细胞培养板，然后将所述的待测样品溶液加入培养板，室温培养30分钟。最后加入CHOK1-OS8细胞，以2.5×104个细胞50微升每孔铺至96孔细胞培养板，保证每个反应孔200μL体积，将反应板于37℃、5％CO2培养箱培养20小时后收集上清，得细胞上清液，于-20℃冻存，所述百分比为体积百分比。
5.细胞上清中细胞因子白介素IFN酶联免疫吸附检测。
细胞上清中细胞因子干扰素IFN-γ酶联免疫吸附检测使用R&D system相关检测试剂盒human IFN-γDuoSet ELISA(DY285)，并按照说明书操作。除检测抗体外的所有检测试剂均由检测试剂盒提供。
测定细胞上清中细胞因子IFN-γ含量的酶联免疫吸附检测采用双抗夹心ELISA试剂盒(购自R&D Systems，IFN-γCat#DY285)。实验操作严格按照试剂盒说明书要求，所有检测试剂均由试剂盒提供。具体实验简述如下：将IFN-γ多克隆抗体包被于ELISA微孔板上，用塑料膜封好4℃孵育过夜，第二天用洗板液洗板4次，加入封闭液室温封闭1-2小时。用洗板液洗板4次，将步骤4获得的细胞上清液作为待测样品，加入标准品和待测样品室温孵育2小时。每孔加入400微升洗液，重复洗板4次；再加入抗人IFN-γ的辣根过氧化物酶标抗体，室温孵育2小时，与微孔板上的IFN-γ形成免疫复合物，清洗微孔；加入底物显色，避光室温30分钟，最终加入终止液，用酶标仪测定A450nm吸光度。
检测TIM-3抗体在所述PBMC刺激实验中对IFN-γ分泌的影响。结果如图9，和表9所示。其中IgG对照为大鼠IgG，表中的数据为IFN-γ值(pg/mL)。
表9 TIM-3抗体在OKT3依赖的PBMC激活试验中对IFN-γ分泌的影响
Figure BDA0001888330740000421
结果表明：在PBMC淋巴细胞刺激试验中待测抗体可使PBMC的IFN-γ分泌增强。
实施例3轻重链可变区氨基酸序列测定
总RNA分离：将实施例1亚克隆培养所得的上清液检验过抗原结合后(即经过实施例2的检定和活性测定后)，通过离心搜集5×107个杂交瘤细胞，加入1mL Trizol混匀并转移到1.5mL离心管中，室温静置5分钟。加0.2mL氯仿，振荡15秒，静置2分钟后于4℃，12000g离心5分钟，取上清转移到新的1.5mL离心管中。加入0.5mL异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10分钟后于4℃，12000g离心15分钟，弃上清。加入1mL 75％乙醇(所述百分比为体积百分比)，轻轻洗涤沉淀，4℃，12000g离心5分钟后弃上清，将沉淀物晾干，加入DEPC处理过的H2O溶解(55℃水浴促溶10分钟)，即得总RNA。
逆转录与PCR：取1μg总RNA，配置20μl体系，加入逆转录酶后于42℃反应60分钟，于7℃反应10分钟终止反应。配置50μl PCR体系，包括1μl cDNA、每种引物25pmol、1μl DNA聚合酶以及相配的缓冲体系、250μmol dNTPs。设置PCR程序，预变性95℃3分钟，变性95℃30秒，退火55℃30秒，延伸72℃35秒，35个循环后再额外于72℃延伸5分钟，得PCR产物。其中逆转录所用的试剂盒为PrimeScript RT Master Mix，购自Takara，货号RR036；PCR所用的试剂盒为Q5超保真酶，购自NEB，货号M0492。
克隆与测序：取5μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将检测阳性样品使用柱回收试剂盒纯化，其中回收试剂盒为
Figure BDA0001888330740000431
Gel&PCR Clean-up，购自MACHEREY-NAGEL，货号740609。进行连接反应：样品50ng，T载体50ng，连接酶0.5μl，缓冲液1μl，反应体系10μl，于16℃反应半小时得连接产物，其中连接的试剂盒为T4DNA连接酶，购自NEB，货号M0402；取5μl连接产物加入100μl的感受态细胞(Ecos 101competent cells，购自Yeastern，货号FYE607)中，冰浴5分钟。而后于42℃水浴热激1分钟，放回冰上1分钟后加入650μl无抗生素SOC培养基，于37℃摇床上以200RPM的速度复苏30分钟，取出200μl涂布于含抗生素的LB固体培养基上于37℃孵箱过夜培养。次日，使用T载体上引物M13F和M13R配置30μl PCR体系，进行菌落PCR，用移液器枪头蘸取菌落于PCR反应体系中吹吸，并吸出0.5μl点于另一块含100nM氨苄青霉素的LB固体培养皿上以保存菌株。PCR反应结束后，取出5μl进行琼脂糖凝胶电泳检测，将阳性样品进行测序。其中，测序的步骤参见Kabat，Sequences ofProteins of Immunological Interest，National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)。
测序结果见附录中本发明的序列信息，7个克隆的重链CDR1-3和轻链CDR1-3的序列信息见表18。
实施例4：全人抗体IgG转化和制备
(一)质粒构建与准备：实施例2已从杂交瘤细胞的培养上清液中获得了纯化的TIM-3抗体，并根据实施例3的测序结果明确了TIM-3抗体的重链可变区和轻链可变区序列。将TIM-3抗体的重链可变区序列重组到包含信号肽和人源重链抗体IgG4恒定区的表达载体(其中表达载体购买自Invitrogen)中，将TIM-3抗体的轻链可变区序列重组到包含信号肽和人源抗体轻链kappa恒定区的表达载体当中，得重组质粒并经测序验证(测序方法与实施例3中测序方法相同)。使用碱裂解法试剂盒(购自MACHEREY-NAGEL)中量抽提高纯度的重组质粒，质量为500μg以上，经0.22μm滤膜(购自Millopore)过滤，供转染使用。
(二)细胞转染：
在培养基Freestyle 293表达培养基(expression medium)(购自Invitrogen)培养293E细胞(购自Invitrogen)。摇床设置为37℃、130RPM，8％CO2(v/v)浓度。
Freestyle 293expression medium在转染时添加10％(v/v)F68(购自Invitrogen)至F68终浓度为0.1％(v/v)，得含0.1％(v/v)F68的Freestyle 293表达培养基，即培养基A。
取5mL培养基A和200μg/mL PEI(购自Sigma)混匀，得培养基B。取5mL培养基A和100μg/mL步骤(1)所得的重组质粒混匀，得培养基C。5分钟后将培养基B和培养基C合并混匀，静置15分钟，得混合液D。将10mL混合液D缓缓加入100mL含293E细胞的培养基Freestyle293expression medium中至293E的细胞密度为1.5×106/mL，边加边振荡，避免PEI过度集中，放入摇床培养。第二天加入蛋白胨至终浓度为0.5％(w/v)。第5～7天，测培养液抗体效价。第6～7天，离心(3500RPM，30分钟)收集上清，经0.22μm滤膜过滤，得滤好的细胞上清液，以供纯化。
(三)抗体纯化：对于连续生产的无内毒素的层析柱和Protein A填料(购自GE)，使用0.1M NaOH处理30分钟或者5个柱体积的0.5M NaOH冲洗。对于长期未使用的柱料和层析柱至少使用1M NaOH浸泡1h，用无内毒的水冲洗至中性，用10倍柱体积的1％(v/v)Triton×100对柱料清洗。使用5个柱体积的PBS(PBS磷酸缓冲液，pH7.2)进行平衡，将步骤(2)所得过滤好的细胞上清液上柱，必要时收集流穿液。上柱完成后，使用5倍柱体积的PBS清洗。用5倍柱体积的0.1M pH3.0的Glycine-HCl进行洗脱，收集洗脱液，并用0.5倍柱体积洗脱液的pH8.5的1M Tris-HCl(1.5M NaCl)中和，收获全人TIM-3抗体。上述所用溶液均需要新配置。收获全人TIM-3抗体后，在1×PBS中透析4小时，避免内毒素污染。透析结束后，使用分光光度或试剂盒测定浓度，使用HPLC-SEC测定抗体纯度，使用内毒素检测试剂盒(购自Lonza)检测抗体内毒素含量。
实施例5全人TIM-3抗体的鉴定
(一)酶联免疫吸附实验(ELISA)检测抗体与TIM-3蛋白的结合
结果如图10，图11和图12，表10，表11和表12所示。其中IgG对照为人IgG，表中的数据为A450nm数值。
表10酶联免疫吸附实验中全人TIM-3抗体与人TIM-3胞外区蛋白反应活性
Figure BDA0001888330740000451
表11酶联免疫吸附实验中全人TIM-3抗体与猴TIM-3胞外区蛋白反应活性
Figure BDA0001888330740000452
Figure BDA0001888330740000461
表12酶联免疫吸附实验中全人TIM-3抗体与鼠TIM-3胞外区蛋白反应活性
Figure BDA0001888330740000462
结果表明：全人TIM-3抗体可结合人和猴TIM-3胞外区蛋白，不能结合鼠TIM-3蛋白。各抗体活性相当，表明抗体与TIM-3结合能力较强。
(二)流式细胞实验(FACS)检测抗体与TIM-3表达细胞的结合
结果如图13和图14，表13和表14所示。其中IgG对照为人IgG，表中的数据为MFI所测细胞群的平均荧光强度值。
表13 FACS检测全人TIM-3抗体与CHOK1-hTIM-3的结合反应
Figure BDA0001888330740000463
Figure BDA0001888330740000471
表14 FACS检测全人TIM-3抗体与CHOK1-cTIM-3的结合反应
Figure BDA0001888330740000472
结果表明：全人TIM-3抗体可不同程度地结合细胞表面的人和猴TIM-3蛋白。
(三)淋巴细胞刺激实验检测TIM-3抗体对淋巴细胞活性的影响
淋巴细胞刺激实验检测TIM-3抗体阻断TIM-3蛋白与其受体的结合从而解除其对T淋巴细胞活性的抑制，从而刺激T细胞的增殖。
结果如图15和图16，表15和表16所示，本试验选用2位捐赠者的PBMC细胞，结果基本保持一致。其中hIgG对照为人IgG，表中的数据为IFN-γ值(pg/mL)。
表15全人TIM-3抗体在淋巴细胞激活试验中对IFN-γ分泌的影响(捐赠人X)
Figure BDA0001888330740000473
Figure BDA0001888330740000481
表16全人TIM-3抗体在淋巴细胞激活试验中对IFN-γ分泌的影响(捐赠人Y)
Figure BDA0001888330740000482
结果表明：在PBMC淋巴细胞刺激试验中待测抗体可不同程度地使PBMC的IFN-γ分泌增强。
(六)抗体亲和力检测试验
首先，选用AHC传感器，并且用缓冲液平衡传感器10min，然后用缓冲液将待测抗体稀释至5ug/ml，用传感器固化抗体3-5min，信号值高度1-2nm。再用缓冲液平衡传感器3min，接着将抗原蛋白稀释至100nM(最高浓度暂定100nM)，结合和解离传感器偶联的抗体。若得到足够的信号值，然后将抗原蛋白倍比稀释几个浓度梯度，分析抗体抗原的结合和解离。在每个循环结束后，传感器表面用10mM，PH 1.5的Glycine进行再生。动力学速率常数需减去空白对照，用global fit分析方法1：1结合模型进行数据拟合。解离平衡速率常数(KD)用以下公式计算：KD＝kd/ka。结果如表17所示。
表17抗TIM-3抗体亲和力的分析测定
Clone ID ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
7A4F10 1.11E+06 1.13E-03 1.01E-09
18D2H2 1.22E+06 3.13E-03 2.58E-09
34B6D8 1.15E+06 1.20E-03 1.05E-09
39E5H1 1.06E+06 1.55E-03 1.46E-09
57F4E5 1.60E+06 3.97E-03 2.48E-09
134H3G6 1.19E+06 4.83E-03 4.05E-09
215A8F2 9.65E+05 1.28E-04 1.33E-10
结果表明：所得全人TIM-3抗体的KD值均在纳摩(nM)水平，表明这些抗体对人TIM-3ECD均有较好的亲和力，其中，215A8F2抗体对人TIM-3ECD的亲和力最好。
讨论
全人抗体
单克隆抗体的应用是过去20年时间肿瘤治疗中最成功及最具变革意义的治疗手段之一。与传统化学药物相比，抗体药物具有更高的特异性及更低的毒性。虽然单抗药物取得了持续不断的成功，但仍面临诸多挑战。
鼠源单克隆抗体最大的缺陷则是它所诱发的HAMA(人抗鼠抗体)反应。因而，鼠单抗在肿瘤、器官移植等疾病的诊断和治疗上有较大的局限性；嵌合抗体仍保留着30％的鼠源序列，可引起不同程度的HAMA反应。临床显示不同的嵌合抗体有着不同程度的免疫原性；人源化抗体又称移植抗体。简单CDR移植常常导致抗原抗体亲和力下降，由于其仍至少具有10％的异源蛋白，在临床应用中还是受到不同程度的限制。因而有待于进一步研制更完善的治疗性抗体—完全人抗体。
1994年，美国Abgenix和Genpham两公司报告了利用转基因小鼠制备完全人抗体，从而解决了人体不能被随意免疫这一人抗体制备研究的难题。此后完全人抗体制备技术的不断发展成熟，所获人单克隆抗体已具有较强的抗肿瘤活性。H2L2转基因鼠是由和铂医药(上海)有限责任公司许可提供，鹿特丹大学医学中心(荷兰，鹿特丹)的Frank Grosveld教授实验室开发的转基因小鼠技术，产生具有完全人类可变区的由两条重链和两条轻链(H2L2)组成的传统四聚体抗体的小鼠。产生的抗体亲和力成熟，可变区完全人源化，具有优异的溶解性。基因工程小鼠技术是产生完全人类抗体的主要工具之一。
免疫治疗
癌症免疫治疗是指通过免疫系统达到对抗癌症目的的治疗方式。近来癌症免疫治疗备受关注，除了手术、化疗及放疗外，已成为癌症治疗的新手段。免疫检查点是指免疫系统中存在的一些抑制性信号通路，通过调节外周组织中免疫反应的持续性和强度避免组织损伤，并参与维持对于自身抗原的耐受。利用免疫检查点的抑制性信号通路抑制T细胞活性是肿瘤逃避免疫杀伤的重要机制。针对免疫检查点的阻断是众多激活抗肿瘤免疫的有效策略之一。
免疫检查点蛋白的抑制剂具有治疗各种肿瘤类型(如转移性黑素瘤，肺癌，乳腺癌，肾细胞癌等)的潜力。最近癌症免疫治疗方法的研究已经显示出可喜的成果，特别是对转移癌癌症病例。此外，癌症免疫治疗在治疗血液癌症方面具有巨大的潜力，包括霍奇金淋巴瘤，多发性骨髓瘤，骨髓发育不良综合征，非霍奇金淋巴瘤等。免疫检查点抑制剂引起的副作用是可以忽略的，可逆的和可控的，有效的免疫检查点抑制剂可以显着提高癌症患者的总生存期。免疫检查点抑制剂还可以与靶向治疗或常规放射治疗和化学疗法结合使用，并且这种组合疗法可有效治疗许多类型的癌症,可能是治疗或者治愈多种癌症的希望。
目前TIM-3抗体的临床研究主要用于恶性实体瘤和淋巴瘤的治疗，而且也主要集中于它和其他疗法或靶点药物的联合使用，开发适应症广的抗体从而扩大其适用的临床症状，包括不可切除的转移性黑色素瘤、晚期实体癌、乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、肾癌、胰腺癌、复发性胶质母细胞瘤、头颈癌、膀胱癌、转移性直结肠癌、胃肠道间质肿瘤、腺泡细胞癌、高级恶性固体肿瘤、非小细胞肺癌等。
本发明技术方案的优势：
治疗用单克隆抗体可由多种技术和途径进行研制，包括杂交瘤技术、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术等。但是通过杂交瘤技术从野生型或转基因小鼠制备单抗，仍然是目前治疗用单抗制备方法的主流。根据目前最新的单抗技术进展，本发明采用优化的杂交瘤技术来制备所需的抗TIM-3抗体。
①可以通过对野生型小鼠进行免疫获得抗体，但是需要对鼠源抗体进行人源化改造而获得人源化抗体，缺点在于改造后的抗体免疫原性可能更强、抗体结构可能会改变从而导致活性丢失或可生产性变差。
②可以通过对全人源转基因小鼠进行免疫获得全人抗体，但是所获得抗体的数量或亲和力会较差。
③可通过构建免疫小鼠抗体库用噬菌体展示技术对抗体进行表达和活性筛选，但是涉及到抗体重轻链的随机重新组合，会导致形成的抗体可生产性较差。
④可通过构建人源抗体库用噬菌体展示技术对抗体进行表达和活性筛选，但是因为未经免疫，所得抗体亲和力会较差。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
本发明的序列信息(包括本发明TIM-3抗体的CDR区氨基酸序列及其序列编号，本发明TIM-3抗体的重/轻链可变区的氨基酸和基因序列及其序列编号)见下表18
表18
Figure BDA0001888330740000521
Figure BDA0001888330740000531
Figure BDA0001888330740000541
Figure BDA0001888330740000551
注：
1.其中VH-CDR1为重链可变区-CDR1，VH-CDR2为重链可变区-CDR2，VH-CDR3为重链可变区-CDR3；其中VL-CDR1为轻链可变区-CDR1，VL-CDR2为轻链可变区-CDR2，VL-CDR3为轻链可变区-CDR3。
2.VH-aa是指重链可变区氨基酸序列，VH-nt是指重链可变区基因序列；VL-aa是指轻链可变区氨基酸序列，VL-nt是指重链可变区基因序列。
序列表
<110> 上海开拓者生物医药有限公司
钜川生物医药
<120> 抗人TIM-3单克隆抗体及其应用
<130> P2018-1445
<160> 73
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Thr His
20 25 30
Leu Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Gly Gly Ser Gly Ser Tyr Asp Asp Phe Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<210> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
gaagtgcaac tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcgg cctctggatt cacctttagg acccatctca taagttgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gactggagtg ggtcgcagct ataactggta gtggtggtag cacatactac 180
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ggttcgggga gttatgatga cttctggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
Thr His Leu Ile Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
Ala Ile Thr Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
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Gly
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
Asp Gly Gly Ser Gly Ser Tyr Asp Asp Phe
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<210> 6
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
Glu Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Val Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
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aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcctccgac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa a 321
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Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Tyr Leu Ala
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
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Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Thr
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Ala Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Gly Ser Asn Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
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Thr Val Ser Ser
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aactggtttg actactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcctca 348
<210> 13
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 13
Thr Tyr Trp Met Thr
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 14
Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Ala Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys
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Gly
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Gly Ser Asn Trp Phe Asp Tyr
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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Glu Thr Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Asn Gln Asn Val Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Phe Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Leu
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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Asp Ala Ser Thr Arg Ala Thr
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 21
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Asn Ile Lys Gln Ala Gly Thr Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Asn Ser Gly Ser Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 22
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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Gly
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 25
Gly Ser Asn Tyr Phe Asp Tyr
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 26
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Arg Gln Asn Phe Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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Arg Ala Arg Gln Asn Phe Tyr Ser Asn Leu Ala
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 29
Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
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Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
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Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
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Arg Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
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Arg Val Tyr Tyr Tyr Gly Pro Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu
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Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 32
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 32
caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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Gly Tyr Tyr Trp Asn
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<210> 34
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 34
Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Arg
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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Val Tyr Tyr Tyr Gly Pro Phe Asp Phe
1 5
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<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 36
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
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Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Arg
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Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
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Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
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Ile Asn Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
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Lys
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 37
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<400> 39
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
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Ala Asn Ile Lys Gln Gly Gly Gly Asp Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Thr Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 42
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 42
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgcgtctc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt acctattgga tgacctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagc ggctggagtg ggtggccaac ataaagcaag gtggaggtga taaatactat 180
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 46
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Met Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Tyr Asp Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Thr His Trp Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 47
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 47
gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctatgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgtttac gacaacttag cctggtacca gcagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccacca gggccactgg tatcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 240
gaagattttg cactttatta ctgtcagcag tatactcact ggccgatcac cttcggccaa 300
gggacacgac tggagattaa a 321
<210> 48
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 48
Arg Ala Ser Gln Ser Val Tyr Asp Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 49
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 49
Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr
1 5
<210> 50
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 50
Gln Gln Tyr Thr His Trp Pro Ile Thr
1 5
<210> 51
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 51
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Arg Gly Gly Ser Glu Arg Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gly Asp Asn Ala Lys Asn Ser Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 52
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 52
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agctattgga tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gactggagtg ggtggccaac ataaagcgag gtggaagtga gagatactat 180
gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccggagaca acgccaagaa ctcagtgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagaggctcc 300
aactggttcg acccctgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcctca 348
<210> 53
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 53
Ser Tyr Trp Met Ser
1 5
<210> 54
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 54
Asn Ile Lys Arg Gly Gly Ser Glu Arg Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 55
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 55
Gly Ser Asn Trp Phe Asp Pro
1 5
<210> 56
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 56
Glu Thr Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 57
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 57
gaaacagtga tgacgcagtc tccagccatc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgtttac agcaacttag cctggtacca acagaaactt 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccacca gggccactgg tatcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag tataataact ggccgatcac cttcggccaa 300
gggacacgac tggagattaa a 321
<210> 58
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 58
Arg Ala Ser Gln Ser Val Tyr Ser Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 59
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 59
Asp Ala Ser Thr Arg Ala Thr
1 5
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 60
Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Ile Thr
1 5
<210> 61
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 61
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Asn Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 62
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 62
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agctattgga tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaac ataaagcaag atgggagtga gaaatactat 180
gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca gcgccaagaa ctcactgtat 240
cttcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctatgt atttctgtgc gagagactcc 300
aacttctttg actactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcctca 348
<210> 63
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 63
Ser Tyr Trp Met Ser
1 5
<210> 64
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 64
Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 65
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 65
Asp Ser Asn Phe Phe Asp Tyr
1 5
<210> 66
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 66
Glu Thr Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Ser Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 67
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 67
gaaacagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcaacttag cctggtacca gcggaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatttt tcatccacca gggccactgg aatcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag tataataact ggccgctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 68
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 68
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 69
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 69
Phe Ser Ser Thr Arg Ala Thr
1 5
<210> 70
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 70
Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 71
<211> 301
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 71
Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Thr Arg Ser Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln
20 25 30
Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu
35 40 45
Val Pro Val Cys Trp Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly
50 55 60
Asn Val Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser
65 70 75 80
Arg Tyr Trp Leu Asn Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr
85 90 95
Ile Glu Asn Val Thr Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile
100 105 110
Gln Ile Pro Gly Ile Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val
115 120 125
Ile Lys Pro Ala Lys Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe
130 135 140
Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala
145 150 155 160
Glu Thr Gln Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile
165 170 175
Ser Thr Leu Ala Asn Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu
180 185 190
Arg Asp Ser Gly Ala Thr Ile Arg Ile Gly Ile Tyr Ile Gly Ala Gly
195 200 205
Ile Cys Ala Gly Leu Ala Leu Ala Leu Ile Phe Gly Ala Leu Ile Phe
210 215 220
Lys Trp Tyr Ser His Ser Lys Glu Lys Ile Gln Asn Leu Ser Leu Ile
225 230 235 240
Ser Leu Ala Asn Leu Pro Pro Ser Gly Leu Ala Asn Ala Val Ala Glu
245 250 255
Gly Ile Arg Ser Glu Glu Asn Ile Tyr Thr Ile Glu Glu Asn Val Tyr
260 265 270
Glu Val Glu Glu Pro Asn Glu Tyr Tyr Cys Tyr Val Ser Ser Arg Gln
275 280 285
Gln Pro Ser Gln Pro Leu Gly Cys Arg Phe Ala Met Pro
290 295 300
<210> 72
<211> 302
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 72
Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Thr Arg Ser Ser Glu Val Glu Tyr Ile Ala Glu Val Gly Gln
20 25 30
Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Ser Tyr Thr Pro Ala Pro Pro Gly Asn Leu
35 40 45
Val Pro Val Cys Trp Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Asp Cys Ser
50 55 60
Asn Val Val Leu Arg Thr Asp Asn Arg Asp Val Asn Asp Arg Thr Ser
65 70 75 80
Gly Arg Tyr Trp Leu Lys Gly Asp Phe His Lys Gly Asp Val Ser Leu
85 90 95
Thr Ile Glu Asn Val Thr Leu Ala Asp Ser Gly Val Tyr Cys Cys Arg
100 105 110
Ile Gln Ile Pro Gly Ile Met Asn Asp Glu Lys His Asn Val Lys Leu
115 120 125
Val Val Ile Lys Pro Ala Lys Val Thr Pro Ala Pro Thr Leu Gln Arg
130 135 140
Asp Leu Thr Ser Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Gly Glu His Gly
145 150 155 160
Pro Ala Glu Thr Gln Thr Pro Gly Ser Leu Pro Asp Val Asn Leu Thr
165 170 175
Val Ser Asn Phe Phe Cys Glu Leu Gln Ile Phe Thr Leu Thr Asn Glu
180 185 190
Leu Arg Asp Ser Gly Ala Thr Ile Arg Thr Ala Ile Tyr Ile Ala Ala
195 200 205
Gly Ile Ser Ala Gly Leu Ala Leu Ala Leu Ile Phe Gly Ala Leu Ile
210 215 220
Phe Lys Trp Tyr Ser His Ser Lys Glu Lys Thr Gln Asn Leu Ser Leu
225 230 235 240
Ile Ser Leu Ala Asn Ile Pro Pro Ser Gly Leu Ala Asn Ala Val Ala
245 250 255
Glu Gly Ile Arg Ser Glu Glu Asn Ile Tyr Thr Ile Glu Glu Asp Val
260 265 270
Tyr Glu Val Glu Glu Pro Asn Glu Tyr Tyr Cys Tyr Val Ser Ser Gly
275 280 285
Gln Gln Pro Ser Gln Pro Leu Gly Cys Arg Val Ala Met Pro
290 295 300
<210> 73
<211> 281
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 73
Met Phe Ser Gly Leu Thr Leu Asn Cys Val Leu Leu Leu Leu Gln Leu
1 5 10 15
Leu Leu Ala Arg Ser Leu Glu Asp Gly Tyr Lys Val Glu Val Gly Lys
20 25 30
Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Ser Tyr Thr Leu Pro Thr Ser Gly Thr Leu
35 40 45
Val Pro Met Cys Trp Gly Lys Gly Phe Cys Pro Trp Ser Gln Cys Thr
50 55 60
Asn Glu Leu Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asn Val Thr Tyr Gln Lys Ser
65 70 75 80
Ser Arg Tyr Gln Leu Lys Gly Asp Leu Asn Lys Gly Asp Val Ser Leu
85 90 95
Ile Ile Lys Asn Val Thr Leu Asp Asp His Gly Thr Tyr Cys Cys Arg
100 105 110
Ile Gln Phe Pro Gly Leu Met Asn Asp Lys Lys Leu Glu Leu Lys Leu
115 120 125
Asp Ile Lys Ala Ala Lys Val Thr Pro Ala Gln Thr Ala His Gly Asp
130 135 140
Ser Thr Thr Ala Ser Pro Arg Thr Leu Thr Thr Glu Arg Asn Gly Ser
145 150 155 160
Glu Thr Gln Thr Leu Val Thr Leu His Asn Asn Asn Gly Thr Lys Ile
165 170 175
Ser Thr Trp Ala Asp Glu Ile Lys Asp Ser Gly Glu Thr Ile Arg Thr
180 185 190
Ala Ile His Ile Gly Val Gly Val Ser Ala Gly Leu Thr Leu Ala Leu
195 200 205
Ile Ile Gly Val Leu Ile Leu Lys Trp Tyr Ser Cys Lys Lys Lys Lys
210 215 220
Leu Ser Ser Leu Ser Leu Ile Thr Leu Ala Asn Leu Pro Pro Gly Gly
225 230 235 240
Leu Ala Asn Ala Gly Ala Val Arg Ile Arg Ser Glu Glu Asn Ile Tyr
245 250 255
Thr Ile Glu Glu Asn Val Tyr Glu Val Glu Asn Ser Asn Glu Tyr Tyr
260 265 270
Cys Tyr Val Asn Ser Gln Gln Pro Ser
275 280

Claims (17)

1.一种抗体的重链可变区，其特征在于，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.10n+3所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO.10n+4所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO.10n+5所示的VH-CDR3；
其中，各n独立地为0、1、2、3、4、5或6；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留TIM-3结合亲和力的衍生序列。
2.一种抗体的重链，其特征在于，所述的重链具有如权利要求1所述的重链可变区。
3.一种抗体的轻链可变区，其特征在于，所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.10n+8所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO.10n+9所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO.10n+10所示的VL-CDR3；
其中，各n独立地为0、1、2、3、4、5或6；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留TIM-3结合亲和力的衍生序列。
4.一种抗体的轻链，其特征在于，所述的轻链具有如权利要求3所述的轻链可变区。
5.一种抗体，其特征在于，所述抗体具有：
(1)如权利要求1所述的重链可变区；和/或
(2)如权利要求3所述的轻链可变区；
或者，所述抗体具有：如权利要求2所述的重链；和/或如权利要求4所述的轻链，
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留TIM-3结合亲和力的衍生序列。
6.如权利要求5所述的抗体，其特征在于，所述的抗体具有如权利要求1所述的重链可变区和如权利要求3所述的轻链可变区；
其中，所述的重链可变区和所述的轻链可变区包括选自下组的CDR：
Figure FDA0001888330730000021
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留TIM-3结合亲和力的衍生序列。
7.如权利要求5所述的抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区含有SEQ IDNO.1、11、21、31、41、51或61所示的氨基酸序列；和/或所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.6、16、26、36、46、56或66所示的氨基酸序列。
8.如权利要求6所述的抗体，其特征在于，所述的抗体选自下组：
抗体编号 克隆 VH序列编号 VL序列编号 1 7A4F10 1 6 2 18D2H2 11 16 3 134H3G6 21 26 4 215A8F2 31 36 5 34B6D8 41 46 6 39E5H1 51 56 7 57F4E5 61 66
。
9.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白包括：
(i)如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5-8中任一项所述的抗体；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
10.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码选自下组的多肽：
(1)如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5-8中任一项所述的抗体；以及
(2)如权利要求9所述的重组蛋白。
11.如权利要求10所述的多核苷酸，其特征在于，编码所述重链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO.2、12、22、32、42、52或62所示；和/或，编码所述轻链可变区的多核苷酸如SEQ IDNO.7、17、27、37、47、57或67所示。
12.如权利要求11所述的多核苷酸，其特征在于，编码所述重链可变区序列的多核苷酸和编码所述轻链可变区序列的多核苷酸选自下组：
Figure FDA0001888330730000031
。
13.一种载体，其特征在于，所述载体含有本发明权利要求10-12中任一项所述的多核苷酸。
14.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求13所述的载体或基因组中整合有权利要求10-12中任一项所述的多核苷酸。
15.一种抗体偶联物，其特征在于，该抗体偶联物含有：
(a)抗体部分，所述抗体部分选自下组：如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5-8中任一项所述的抗体、或其组合；和
(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。
16.一种免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞表达或在细胞膜外暴露有权利要求5-8中任一项所述的抗体。
17.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有：
(i)活性成分，所述活性成分选自下组：如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5-8中任一项所述的抗体、如权利要求9所述的重组蛋白、如权利要求15所述的抗体偶联物、权利要求16所述的免疫细胞、或其组合；以及
(ii)药学上可接受的载体。
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