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KR20170070228A - 항인간 Gas6 모노클로날 항체 - Google Patents

항인간 Gas6 모노클로날 항체 Download PDF

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KR20170070228A
KR20170070228A KR1020177013557A KR20177013557A KR20170070228A KR 20170070228 A KR20170070228 A KR 20170070228A KR 1020177013557 A KR1020177013557 A KR 1020177013557A KR 20177013557 A KR20177013557 A KR 20177013557A KR 20170070228 A KR20170070228 A KR 20170070228A
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South Korea
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seq
gas6
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KR1020177013557A
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유코 우베
츠요시 야마다
유지 야마자키
가나메 기무라
아키코 하리구치
신야 오가와
Original Assignee
교와 핫꼬 기린 가부시키가이샤
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Publication date
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Abstract

본 발명은, 인간 Growth Arrest Specific 6(hGas6)에 특이적으로 결합하는 항체이며, 인간 Gas6의 314, 315 및 316번째의 아미노산 잔기 중, 적어도 하나의 아미노산 잔기에 결합하는 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편, 상기 항체 또는 항체 단편을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 형질 전환 세포, 상기 항체 또는 항체 단편의 제조 방법, 상기 항체 또는 항체 단편을 포함하는 Gas6의 검출 또는 측정용 시약, 상기 항체 또는 항체 단편을 유효 성분으로서 포함하는 Gas6 관련 질환의 치료약 또는 진단약, 또는 Gas6 관련 질환의 치료약 또는 진단약의 제조를 위한 상기 항체 또는 항체 단편의 용도에 관한 것이다.

Description

항인간 Gas6 모노클로날 항체{ANTI HUMAN Gas6 MONOCLONAL ANTIBODY}
[관련 출원]
본 명세서는, 본원의 우선권의 기초인 미국 가출원 US62/066,687(2014년 10월 21일 출원)의 명세서에 기재된 내용을 포함한다. 본 발명은, 인간 Growth Arrest Specific 6(성장 정지 특이적 6; hGas6)에 특이적으로 결합하는 항체이며, 인간 Gas6의 314, 315 및 316번째의 아미노산 잔기 중, 적어도 하나의 아미노산 잔기에 결합하는 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편, 상기 항체 또는 항체 단편을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 형질 전환 세포, 상기 항체 또는 항체 단편의 제조 방법, 상기 항체 또는 항체 단편을 사용한 Gas6의 검출 또는 측정용 시약, 상기 항체 또는 항체 단편을 유효 성분으로서 포함하는 Gas6 관련 질환의 치료약 또는 진단약, 또는 Gas6 관련 질환의 치료약 또는 진단약의 제조를 위한 상기 항체 또는 항체 단편의 용도에 관한 것이다.
Growth Arrest Specific 6(Gas6) 유전자(AXL tyrosine kinase receptor ligand(AXL 티로신 키나아제 수용체 리간드); AXLLG라고도 불림)는, 혈청 기아 상태의 세포에서 발현이 항진되는 유전자의 하나로서 1998년에 클로닝되었다(비특허문헌 1). Gas6은, 678 아미노산으로 구성되고, N 말단측에서 γ-carboxy glutamic acid(γ-카르복시 글루탐산; Gla) 도메인, epidermal growth factor(표피 성장 인자; EGF) 유사 도메인 및 두 개의 laminin G-type(라미닌 G-타입; LG) 도메인을 포함하는 sex hormone binding globulin(성 호르몬 결합 글로불린; SHBG) 유사 도메인의 3개의 도메인을 포함하는 단백질이다(비특허문헌 2).
Gas6은 단백질 S와 아미노산 서열의 상동성이 높아(44％), 단백질 S와 동일한 비타민 K 의존성의 Gla 단백질 패밀리로 분류된다. Gla란, 글루탐산 잔기의 γ 위치의 탄소가, γ-glutamyl carboxylase(γ-글루타밀 카르복실라아제; GGCX)에 의해 카르복실화된 것이다(비특허문헌 3). Gla화되지 않은 Gas6은, Gla화된 Gas6에 비해 수용체와의 결합 활성이 10분의 1 정도까지 저하되고(비특허문헌 4) 생리 활성도 저하된다. 또한, C 말단의 SHBG 도메인은, 수용체 Axl과 결합하는 도메인인 것으로 알려져 있다(비특허문헌 5).
다른 비타민 K 의존성 단백질인 프로트롬빈이나 제X 인자 등은 주로 간장에서 합성되지만, Gas6은 간장에서는 mRNA가 거의 검출되지 않는다(비특허문헌 2). 인간에 있어서는 폐, 장, 골수, 내피에서의 mRNA 발현이 관찰되고 있는 것 외에, 마우스에 있어서는 심장이나 위, 신장에 있어서 mRNA의 발현이 확인되고 있다. 또한, 단백질 레벨에서는 인간의 혈장 중에 13 내지 23ng/mL로 존재하는 것이 확인되고 있고, 연령이나 성별에 의한 편중은 없는 것으로 밝혀졌다. 그 밖에, Gas6 녹아웃(KO) 마우스의 임신, 출산은 정상이고, 출생한 새끼의 체중이나 크기나 번식 능력에 문제가 없는 것으로 보고되어 있다(비특허문헌 6).
Gas6의 수용체로서는, Axl(Axl receptor tyrosine kinase(Axl 수용체 티로신 키나아제)), Sky(Rse, Tyro3(Tyro3 protein tyrosine kinase(Tyro3 단백질 티로신 키나아제))), Mer TK(Mer tyrosine kinase protooncogene(Mer 티로신 키나아제 원종양유전자))의 3종이 알려져 있다. 이들 3개의 수용체는 모두 1회 막 관통형의 티로신 키나아제이며, 세포 외 도메인은 두 개의 이뮤노글로불린(immunoglobulin) 유사 도메인에 이어 두 개의 fibronectin(피브로넥틴)-III 유사 도메인으로 구성되어 있다(비특허문헌 7). Gas6과 이들 3종의 수용체의 친화성은 매우 높다. 문헌에 의해 보고되어 있는 해리 상수(Kd값)는 상이하지만, 친화성이 높은 것으로는 Axl에서 5×10-11M, Sky에서 3×10-11M, Mer에서 3×10-10M으로 보고되어 있다(비특허문헌 8).
Gas6이나 Axl은, 신장 질환에서 그의 발현량이 항진되는 것으로 알려져 있다(비특허문헌 9, 10). 또한, 진행성 사구체 신장염 모델인 NTN 모델을 사용한 시험에서는, 야생형 마우스와 비교하여, Gas6 KO 마우스에서는 현저한 병태 억제가 확인되고 있다. 또한, Gas6 KO 마우스에서 억제된 병태는, Gas6을 투여함으로써 다시 악화되는 것이 확인되었다(비특허문헌 11). 또한, 메산지움 증식성 사구체 신장염과 유사한 병태를 나타내는 Thy1 신장염 래트의 신장에서는, 병태 야기에 의한 Gas6과 Axl의 발현의 항진이 확인되고 있으며, Thy1 신장염 래트에 Axl의 Fc체를 투여한 실험에서는, 병태가 대폭으로 개선되는 것이 확인되었다(비특허문헌 12). 만성 질환인 I형 당뇨병성 신증(STZ) 모델에 있어서도, Gas6 KO 마우스에서는 병태가 억제되는 것이 확인되었다(비특허문헌 13). Gas6의 중화에 의한 신장 질환의 악화가 억제되는 작용 기서로서는, PDGF의 발현 및 메산지움 세포의 증식 억제(비특허문헌 14), 항염증 작용(비특허문헌 15) 또는 항혈소판 작용(비특허문헌 16, 17) 등이 보고되어 있다.
또한, 근년, Gas6 및 Gas6 수용체와 암의 병태와의 관계에 대해서도, 다수 보고되어 있다(비특허문헌 18, 19, 20, 21).
지금까지, 항인간 Gas6 모노클로날 항체로서는, WG1(특허문헌 1) 및 CNTO300(비특허문헌 22)이 알려져 있다. WG1 및 CNTO300은, in vitro(시험관 내)에서 Gas6과 그의 수용체인 Axl과의 결합을 저해하는 활성을 갖는 것이 보고되어 있다. 또한, 기타의 Gas6 중화 항체에 대해서는 알려져 있지 않다.
US7547767
Cell 54, 787-793(1988) Mol Cell Biol 13, 4976-4985(1993) Journal of Thrombosis and Haemostasis 3, 1873-1878(2005) FEBS Lett 408, 306-310(1997) EMBO J 25, 80-87, (2006) Nat Med 7, 215-221, (2001) J Thromb Haemost 3, 733-741, (2005) Biochem J 387, 727-735, (2005) Am J Kidney Dis 43, 286-295(2004) Transplant 27: 4166-4172(2012) J Clin Invest 110, 239-246, doi:10.1172/jci14861(2002) Am J Pathol 158, 1423-1432, (2001) The Journal of biological chemistry 278, 20, 18229-18234(2003) The Journal of biological chemistry 276, 45, 42364-42369(2001) Blood 111, 8, 4096-4105(2008) The Journal of Clinical Investigation 115, 237-246(2005) Nature Medicine 7, 2, 215-221(2001) The Journal of Clinical Investigation 123, 8, 3231-3242(2013) Expert Opin Ther Targets.14, 19, 1073-1090(2010) Nature genetics 44, 8, 852-860(2012) JOURNAL OF CELLULAR PHYSIOLOGY 204, 36-44(2005) Biochem. J., 727-735 387(2005)
본 발명의 과제는, 인간 Gas6의 특정 부위에 특이적으로 결합하고, 높은 중화 활성을 갖는 신규 항인간 Gas6 모노클로날 항체, 및 상기 항체를 이용한 Gas6 관련 질환의 치료약 및 진단약을 제공하는 데 있다.
상기 과제를 해결하기 위한 수단으로서, 본 발명은 인간 Gas6의 314, 315 및 316번째 중, 적어도 하나의 아미노산 잔기에 결합하는 인간 Gas6 모노클로날 항체를 제공한다.
즉, 본 발명은 이하의 (1) 내지 (19)에 관한 것이다.
(1) 인간 Gas6의 314, 315 및 316번째의 아미노산 잔기 중, 적어도 하나의 아미노산 잔기에 결합하는 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편.
(2) 모노클로날 항체가, 인간 Gas6의 314, 315 및 316번째의 아미노산 잔기에 결합하는 모노클로날 항체인, (1)에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편.
(3) 모노클로날 항체가, 하기 (a) 내지 (e)로부터 선택되는 어느 하나의 항체인, (1) 또는 (2)에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편.
(a) 항체의 VH의 CDR1 내지 3의 아미노산 서열이 각각 서열 번호 79, 80 및 81에 기재된 아미노산 서열이며, 또한 VL의 CDR1 내지 3의 아미노산 서열이 각각 서열 번호 82, 83 및 84에 기재된 아미노산 서열인 항체.
(b) 항체의 VH의 CDR1 내지 3의 아미노산 서열이 각각 서열 번호 85, 86 및 87에 기재된 아미노산 서열이며, 또한 VL의 CDR1 내지 3의 아미노산 서열이 각각 서열 번호 88, 89 및 90에 기재된 아미노산 서열인 항체.
(c) 상기 (a) 또는 (b)에 기재된 항체와, 인간 Gas6에 대한 결합에 있어서 경합하는 항체.
(d) 상기 (a) 또는 (b)에 기재된 항체가 결합하는 에피토프를 포함하는 에피토프에 결합하는 항체, 즉, 상기 (a) 또는 (b)에 기재된 항체가 결합하는 에피토프를 포함하는 에피토프에 대한 결합에 있어서 경합하는 항체.
(e) 상기 (a) 또는 (b)에 기재된 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 즉, 상기 (a) 또는 (b)에 기재된 항체가 결합하는 에피토프에 대한 결합에 있어서 경합하는 항체.
(4) 모노클로날 항체가, 하기 (a) 내지 (e)로부터 선택되는 어느 하나의 항체인, (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편.
(a) 항체의 VH의 아미노산 서열이 서열 번호 69에 기재된 아미노산 서열이며, 또한 VL의 아미노산 서열이 서열 번호 72에 기재된 아미노산 서열인 항체.
(b) 항체의 VH의 아미노산 서열이 서열 번호 75에 기재된 아미노산 서열이며, 또한 VL의 아미노산 서열이 서열 번호 78에 기재된 아미노산 서열인 항체.
(c) 항체의 VH의 아미노산 서열이 서열 번호 135에 기재된 아미노산 서열이며, 또한 VL의 아미노산 서열이 서열 번호 123에 기재된 아미노산 서열인 항체.
(d) 항체의 VH의 아미노산 서열이 서열 번호 195에 기재된 아미노산 서열이며, 또한 VL의 아미노산 서열이 서열 번호 174에 기재된 아미노산 서열인 항체.
(e) 항체의 VH의 아미노산 서열이 서열 번호 186에 기재된 아미노산 서열이며, 또한 VL의 아미노산 서열이 서열 번호 180에 기재된 아미노산 서열인 항체.
(5) 모노클로날 항체가 유전자 재조합 항체인 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편.
(6) 유전자 재조합 항체가, 인간형 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체로부터 선택되는 유전자 재조합 항체인, (5)에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편.
(7) 항체 단편이, Fab, Fab', (Fab')2, 단일쇄 항체(scFv), 이량체화 V 영역(diabody), 디술피드 안정화 V 영역(dsFv) 및 CDR을 포함하는 펩티드로부터 선택되는, (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 기재된 항체 단편.
(8) (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 해당 항체 단편을 코딩하는 염기 서열을 갖는 핵산.
(9) (8)에 기재된 핵산을 포함하는 형질 전환 세포.
(10) (9)에 기재된 세포를 배지에서 배양하고, 배양액으로부터 해당 항체 또는 해당 항체 단편을 채취하는 것을 포함하는, (1) 내지 (7)에 기재된 항체 또는 해당 항체 단편의 제조 방법.
(11) (1) 내지 (7)에 기재된 항체 또는 해당 항체 단편을(원한다면 약리학적으로 허용될 수 있는 담체와 함께) 포함하는, Gas6의 검출 또는 측정용 시약.
(12) (1) 내지 (7)에 기재된 항체 또는 해당 항체 단편을 유효 성분으로서 (원한다면 약리학적으로 허용될 수 있는 담체와 함께) 포함하는, Gas6 관련 질환의 치료약.
(13) Gas6 관련 질환이 신장 또는 암 질환인, (12)에 기재된 치료약.
(14) 신장 질환이 진행성 사구체 신장염, 메산지움 증식성 사구체 신장염, 당뇨병성 신증 또는 IgA 신증인, (13)에 기재된 치료약.
(15) 암 질환이 폐암, 유방암, 난소암, 전립선암, 췌장암, 신장암 또는 교모세포종인, (13)에 기재된 치료약.
(16) (1) 내지 (7)에 기재된 항체 또는 해당 항체 단편을 유효 성분으로서 (원한다면 약리학적으로 허용될 수 있는 담체와 함께) 포함하는, Gas6 관련 질환의 진단약.
(17) (1) 내지 (7)에 기재된 항체 또는 해당 항체 단편을 사용하여 Gas6의 검출 또는 측정을 하는 것을 포함하는, Gas6 관련 질환의 진단 방법.
(18) Gas6 관련 질환의 치료약의 제조를 위한, (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 해당 항체 단편의 용도.
(19) Gas6 관련 질환의 진단약의 제조를 위한, (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 해당 항체 단편의 용도.
본 발명의 모노클로날 항체는, 인간 Gas6의 특정 부위에 특이적으로 결합하고, Gas6과 Gas6 수용체의 결합을 저해하며, Gas6 수용체 발현 세포 내에서의 시그널 전달의 활성화를 억제하거나, Gas6 수용체 발현 세포의 세포 증식의 항진을 억제한다. 그 때문에, 본 발명의 모노클로날 항체는, Gas6 관련 질환의 치료약 및 진단약으로서 이용할 수 있다.
도 1은, 취득한 항Gas6 모노클로날 항체의 각종 항원에 대한 결합성을 ELISA로 측정한 결과이다. ELISA는 N=2로 실시하고, 그래프에는 그 평균값을 나타내었다. 어느 그래프도, 종축에 흡광도, 횡축에 항체 농도(μg/mL)를 나타내었다. 항원으로서, (A) 인간 Gas6-F, (B) 게잡이 원숭이 Gas6-F, (C) 래트 Gas6-F, (D) 마우스 Gas6-F, (E) BAP-F, (F) Protein S(단백질 S)를 사용하였다. ○가 KM5320-mKG1 항체, □가 KM5321-mKG1 항체, ▲가 CNTO 항체의 결과이다.
도 2는, 항Gas6 모노클로날 항체에 대해서, 각종 Gas6과 Axl의 결합 저해 활성((A) 인간, (B) 래트, (C) 마우스, (D) 게잡이 원숭이)을 평가한 결과이다. 실험은 N=2로 실시하고, 그래프에는 그 평균값을 나타내었다. 어느 그래프도, 종축에 흡광도, 횡축에 항체 농도(ng/mL)를 나타내었다. ○가 KM5320-mKG1 항체, ■가 KM5321-mKG1 항체, ▲가 CNTO 항체의 결과이다.
도 3은, 리포터 측정에 의해, 항Gas6 모노클로날 항체의 세포 내 시그널 전달에 대한 작용을 평가한 결과이다. 실험은 N=3으로 실시하고, 그래프에는 그 평균값을 나타내었다. 또한, 에러 바에는 표준 편차(SD)값을 사용하였다. 그래프의 종축에 발광 강도, 횡축에 세포에 강제 발현시킨 Gas6 수용체를 나타내었다. 흰 바는 KM5320-mKG1 항체, 가로선을 넣은 바는 KM5321-mKG1 항체, 검은 바는 아이소타입 컨트롤, 사선을 넣은 바는 배지만의 결과이다.
도 4는, 항Gas6 모노클로날 항체에 대해서, 인간 Gas6에 의한 Akt의 인산화 레벨의 항진에 대한 작용을 웨스턴 블롯팅에 의해 평가한 결과이다. 도면 중의 hGas6이라고 기재한 항목에 대해서는, 0.1μg/mL의 hGas6을 첨가했을 때를 +, hGas6을 첨가하지 않았을 때를 -로 나타내었다. 도면 중의 Ab라고 기재한 항목은, 웰에 첨가한 피검 물질을 나타내었다. KM5320은 KM5320-mKG1 항체, KM5321은 KM5321-mKG1 항체, isotype(아이소타입)은 IgG1 isotype control(아이소타입 컨트롤)(음성 대조), Axl-hFc는 Axl 수용체의 세포 외 도메인과 인간 IgG1 항체의 Fc 영역의 융합 단백질(양성 대조)을 나타낸다. 각 피검 물질명의 하부에 기재된 수치는 농도(μg/mL)를 나타낸다. 도면 중의 Axl, Akt 및 p-Akt는, 각각 Axl 수용체, Akt 단백질 및 인산화 Akt 단백질을 나타낸다.
도 5는, 본 발명의 항Gas6 모노클로날 항체 KM5320 항체, KM5321 항체와 CNTO 항체가 hGas6에 경합하여 결합할 것인지 여부를 평가한 결과이다. 실험은 N=2로 실시하고, 그래프에는 그 평균값을 나타내었다. 그래프의 종축에 흡광도, 횡축에 항체 농도(μg/mL)를 나타내었다. ◇는 1％ BSA-PBS(완충액)만, ■는 CNTO 항체, ▲는 KM5320-mKG1 항체, ×는 KM5321-mKG1 항체의 결과이다.
도 6은, 항Gas6 모노클로날 항체에 대해서, 암 세포의 세포 증식 억제 활성을 평가한 결과이다. 그래프의 종축은 형광량, 횡축은 웰에 첨가한 샘플명을 나타내었다. 도면 중의 Gas6은 hGas6-F, Axl-Fc는 Axl 수용체의 세포 외 도메인과 IgG1 항체의 인간 Fc의 융합 단백질(양성 대조), KM5320은 KM5320-rKG1 항체, KM5321은 KM5321-rKG1 항체, DNP는 항DNP 항체(음성 대조)를 나타낸다.
도 7은, 시그널 서열을 포함하지 않은 KM5320 항체의 경쇄 가변 영역 및 KM5320 인간화 항체(이하, hzKM5320 항체라고 기재함)의 경쇄 가변 영역(LV0, LV1a, LV1b, LV2a, LV2b, LV3, LV5, LV6)의 아미노산 서열을 나타낸다. 각 서열 중의 프레임으로 둘러싸인 영역은, CDR의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 8은, 시그널 서열을 포함하지 않은 KM5320 항체의 중쇄 가변 영역 및 hzKM5320 항체의 중쇄 가변 영역(HV0, HV1, HV2, HV3a, HV3b, HV3c, HV4, HV6, HV8)의 아미노산 서열을 나타낸다. 각 서열 중의 프레임으로 둘러싸인 영역은, CDR의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 9는, 시그널 서열을 포함하지 않은 KM5321 항체의 경쇄 가변 영역 및 KM5321 인간화 항체(이하, hzKM5321 항체라고 기재함)의 경쇄 가변 영역(LV0, LV1a, LV1b, LV1c, LV3, LV4, LV6, LV7a, LV7b, LV9)의 아미노산 서열을 나타낸다. 각 서열 중의 프레임으로 둘러싸인 영역은, CDR의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 10은, 시그널 서열을 포함하지 않은 KM5321 항체의 중쇄 가변 영역 및 hzKM5321 항체의 중쇄 가변 영역(HV0, HV1, HV2a, HV2b, HV3a, HV3b, HV4a, HV4b, HV5, HV7)의 아미노산 서열을 나타낸다. 각 서열 중의 프레임으로 둘러싸인 영역은 CDR의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 11은, (A) KM5320 키메라 항체 및 hzKM5320 항체, (B) KM5321 키메라 항체 및 hzKM5321 항체의, 인간 Gas6 단백질에 대한 결합 활성을 나타낸다. 실험은 N=2로 실시하고, 그래프에는 그 평균값을 나타내었다. 어느 그래프도, 종축에 흡광도, 횡축에 항체 농도(ng/mL)를 나타내었다. (A)는, ■가 KM5320 키메라 항체, ◇가 hzKM5320 LV5HV2, ●가 hzKM5320 LV1bHV0, ○가 음성 대조 항DNP 항체를 나타낸다. (B)는, ■가 KM5321 키메라 항체, ◇가 hzKM5321 LV6HV2b, ●가 hzKM5321 LV7bHV0, ○가 음성 대조 항DNP 항체를 나타낸다.
도 12는, (A) KM5320 키메라 항체 및 hzKM5320 항체, (B) KM5321 키메라 항체 및 hzKM5321 항체의, 인간 Gas6 단백질과 Axl의 결합 저해 활성을 나타낸다. 실험은 N=2로 실시하고, 그래프에는 그 평균값을 나타내었다. 어느 그래프도, 종축에 흡광도, 횡축에 항체 농도(ng/mL)를 나타내었다. (A)는, ■가 KM5320 키메라 항체, ◇가 hzKM5320 LV5HV2, ●가 hzKM5320 LV1bHV0, ○가 음성 대조 항DNP 항체를 나타낸다. (B)는, ■가 KM5321 키메라 항체, ◇가 hzKM5321 LV6HV2b, ●가 hzKM5321 LV7bHV0, ○가 음성 대조 항DNP 항체를 나타낸다.
본 발명은, 인간 Gas6의 아미노산 서열 314, 315 및 316번째의 아미노산 잔기 중, 적어도 하나의 아미노산 잔기에 결합하는 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편에 관한 것이다. 구체적으로는, 인간 Gas6의 아미노산 서열의 SHBG 도메인에 존재하는 314, 315 및 316번째의 아미노산 잔기 중, 적어도 하나의 아미노산 잔기에 결합하는 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편, 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간 Gas6의 314, 315 및 316번째의 아미노산 잔기 중, 적어도 하나의 아미노산 잔기에 결합하는 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편에 관한 것이다. 본 발명의 항체로서는, 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간 Gas6의 314번째의 아미노산 잔기에 결합하는 항체, 315번째의 아미노산 잔기에 결합하는 항체, 316번째의 아미노산 잔기에 결합하는 항체, 314 및 315번째의 아미노산 잔기에 결합하는 항체, 314 및 316번째의 아미노산 잔기에 결합하는 항체, 315 및 316번째의 아미노산 잔기에 결합하는 항체, 또는 314, 315 및 316번째의 아미노산 잔기에 결합하는 항체를 들 수 있다.
또한, 본 발명의 항체로서 구체적으로는, 하기 (a) 내지 (e)로부터 선택되는 어느 하나의 항체를 들 수 있다.
(a) 항체의 중쇄 가변 영역(Heavy chain variable region)(이하, VH라고 칭함)의 상보성 결정 영역(Complementarity Determining Region)(이하, CDR이라고 칭함) 1 내지 3의 아미노산 서열이 각각 서열 번호 79, 80 및 81에 기재된 아미노산 서열이며, 또한 경쇄 가변 영역(Light chain variable region)(이하, VL이라고 칭함)의 CDR1 내지 3의 아미노산 서열이 각각 서열 번호 82, 83 및 84에 기재된 아미노산 서열인 항체.
(b) 항체의 VH의 CDR1 내지 3의 아미노산 서열이 각각 서열 번호 85, 86 및 87에 기재된 아미노산 서열이며, 또한 VL의 CDR1 내지 3의 아미노산 서열이 각각 서열 번호 88, 89 및 90에 기재된 아미노산 서열인 항체.
(c) 상기 (a) 또는 (b)에 기재된 항체와, 인간 Gas6에 대한 결합에 있어서 경합하는 항체.
(d) 상기 (a) 또는 (b)에 기재된 항체가 결합하는 에피토프를 포함하는 에피토프에 결합하는 항체.
(e) 상기 (a) 또는 (b)에 기재된 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체.
본 발명에 있어서, 상기 (a)에 기재된 항체 중, 항체의 VH의 CDR1 내지 3의 아미노산 서열이 각각 서열 번호 79, 80 및 81에 기재된 아미노산 서열이며, 또한 VL의 CDR1 내지 3의 아미노산 서열이 각각 서열 번호 82, 83 및 84에 기재된 아미노산 서열인 항체의 일 형태로서는, 마우스 항인간 Gas6 모노클로날 항체 KM5320-mKG1, 항인간 Gas6 마우스-래트 키메라 KM5320-rKG1 및 항인간 Gas6 인간화 항체 hzKM5320 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a)에 기재된 항체 중, 항체의 VH의 CDR1 내지 3의 아미노산 서열이 각각 서열 번호 85, 86 및 87에 기재된 아미노산 서열이며, 또한 VL의 CDR1 내지 3의 아미노산 서열이 각각 서열 번호 88, 89 및 90에 기재된 아미노산 서열인 항체의 일 형태로서는, 마우스 항인간 Gas6 모노클로날 항체 KM5321-mKG1, 항인간 Gas6 마우스-래트 키메라 항체 KM5321-rKG1, 항인간 Gas6 인간화 항체 hzKM5321 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 (c)의 항체란, 상기 (a)에 기재된 항체를 제1 항체, 그리고 제1 항체가 결합하는 에피토프를 제1 에피토프라 한 경우, 당해 제1 에피토프를 포함하는, 제2 에피토프에 결합하는 제2 항체를 말한다.
또한, 본 발명의 항체로서, 구체적으로는, 하기 (a) 내지 (e)로부터 선택되는 어느 하나의 항체도 들 수 있다.
(a) 항체의 VH의 아미노산 서열이 서열 번호 69에 기재된 아미노산 서열이며, 또한 VL의 아미노산 서열이 서열 번호 72에 기재된 아미노산 서열인 항체.
(b) 항체의 VH의 아미노산 서열이 서열 번호 75에 기재된 아미노산 서열이며, 또한 VL의 아미노산 서열이 서열 번호 78에 기재된 아미노산 서열인 항체.
(c) 항체의 VH의 아미노산 서열이 서열 번호 135에 기재된 아미노산 서열이며, 또한 VL의 아미노산 서열이 서열 번호 123에 기재된 아미노산 서열인 항체.
(d) 항체의 VH의 아미노산 서열이 서열 번호 195에 기재된 아미노산 서열이며, 또한 VL의 아미노산 서열이 서열 번호 174에 기재된 아미노산 서열인 항체.
(e) 항체의 VH의 아미노산 서열이 서열 번호 186에 기재된 아미노산 서열이며, 또한 VL의 아미노산 서열이 서열 번호 180에 기재된 아미노산 서열인 항체.
상기 (a)의 항체의 일 형태로서는, KM5320-mKG1, KM5320-rKG1 등을 들 수 있다. 상기 (b)의 항체의 일 형태로서는, KM5321-mKG1, KM5321-rKG1 등을 들 수 있다. 상기 (c)의 항체의 일 형태로서는, 항인간 Gas6 인간화 항체 hzKM5320 LV5HV2 등을 들 수 있다. 상기 (d)의 항체의 일 형태로서는, 항인간 Gas6 인간화 항체 hzKM5321 LV6HV2b 등을 들 수 있다. 상기 (e)의 항체의 일 형태로서는, 항인간 Gas6 인간화 항체 hzKM5321 LV7bHV0 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, Growth Arrest-Specific 6(Gas6)은, AXL receptor kinase ligand(AXLLG) 또는 AXL stimulatory factor(AXL 자극 인자; AXSF)라고도 한다.
본 발명에 있어서 인간 Gas6으로서는, 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열 또는 NCBI 액세션 번호 NP_000811의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열 또는 NCBI 액세션 번호 NP_000811의 아미노산 서열에 있어서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하며, 또한 인간 Gas6의 기능을 갖는 폴리펩티드, 또는 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열 또는 NCBI 액세션 번호 NP_000811의 아미노산 서열과 60％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 더욱 바람직하게는 90％ 이상, 특히 바람직하게는 95％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며 또한 인간 Gas6의 기능을 갖는 폴리펩티드 등을 들 수 있다.
서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열 또는 NCBI 액세션 번호 NP_000811로 표시되는 아미노산 서열에 있어서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는, 부위 특이적 변이 도입법[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons(1987-1997), Nucleic acids Research, 10, 6487(1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982), Gene, 34, 315(1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431(1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488(1985)] 등을 사용하여, 예를 들어 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에, 부위 특이적 변이를 도입함으로써 얻을 수 있다.
결실, 치환 또는 부가되는 아미노산의 수는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 1개 내지 수십개, 예를 들어 1 내지 20개, 보다 바람직하게는 1개 내지 몇 개, 예를 들어 1 내지 5개의 아미노산이다.
인간 Gas6을 코딩하는 유전자로서는, 서열 번호 3에 기재된 염기 서열, NCBI 액세션 번호 NM_000820의 염기 서열을 들 수 있다. 서열 번호 3에 기재된 염기 서열 또는 NM_000820의 염기 서열에 있어서, 1 이상의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기 서열을 포함하며, 또한 인간 Gas6의 기능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는DNA를 포함하는 유전자, 서열 번호 3에 기재된 염기 서열 또는 NM_000820의 염기 서열과 적어도 60％ 이상의 상동성을 갖는 염기 서열, 바람직하게는 80％ 이상의 상동성을 갖는 염기 서열, 더욱 바람직하게는 95％ 이상의 상동성을 갖는 염기 서열을 포함하며, 또한 인간 Gas6의 기능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 유전자, 또는 서열 번호 3에 기재된 염기 서열 또는 NM_000820의 염기 서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건 하에서 하이브리다이즈되는 DNA을 포함하며, 또한 인간 Gas6의 기능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 등도 본 발명의 인간 Gas6을 코딩하는 유전자에 함유된다.
엄격한 조건 하에서 하이브리다이즈되는 DNA로서는, 서열 번호 3에 기재된 염기 서열 또는 NM_000820의 염기 서열을 포함하는 DNA를 프로브로 사용한, 콜로니ㆍ하이브리다이제이션법, 플라크ㆍ하이브리다이제이션법, 서던 블롯ㆍ하이브리다이제이션법 또는 DNA 마이크로어레이법 등에 의해 얻어지는 하이브리다이즈 가능한 DNA를 말한다. 구체적으로는, 하이브리다이즈된 콜로니 또는 플라크 유래의 DNA, 또는 해당 서열을 갖는 PCR 산물 또는 올리고 DNA를 고정화한 필터 또는 슬라이드 글래스를 사용하여, 0.7 내지 1.0mol/L의 염화나트륨 존재 하, 65℃에서 하이브리다이제이션법[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons(1987-1997), DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University, (1995)]을 행한 후, 0.1 내지 2배 농도의 SSC 용액(1배 농도의 SSC 용액의 조성은, 150mmol/L 염화나트륨, 15mmol/L 시트르산나트륨을 포함함)을 사용하여, 65℃ 조건 하에서 필터 또는 슬라이드 글래스를 세정함으로써 동정할 수 있는 DNA를 들 수 있다. 하이브리다이즈 가능한 DNA로서는 서열 번호 3에 기재된 염기 서열 또는 NM_000820의 염기 서열과 적어도 60％ 이상의 상동성을 갖는 DNA, 바람직하게는 80％ 이상의 상동성을 갖는 DNA, 더욱 바람직하게는 95％ 이상의 상동성을 갖는 DNA를 들 수 있다.
진핵 생물의 단백질을 코딩하는 유전자의 염기 서열에는, 종종 유전자의 다형이 확인된다. 본 발명에 있어서 사용되는 유전자에, 이러한 다형에 의해 염기 서열에 소규모 변이가 발생한 유전자도 본 발명의 인간 Gas6을 코딩하는 유전자에 함유된다.
본 발명에 있어서의 상동성의 수치는, 특별히 명시한 경우를 제외하고, 당업자에게 공지된 상동성 검색 프로그램을 사용하여 산출되는 수치이면 되지만, 염기 서열에 대해서는, BLAST[J. Mol. Biol., 215, 403(1990)]에 있어서 디폴트의 파라미터를 사용하여 산출되는 수치 등, 아미노산 서열에 대해서는, BLAST2[Nucleic Acids Res., 25, 3389(1997), Genome Res., 7, 649(1997), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.htmL]에 있어서 디폴트의 파라미터를 사용하여 산출되는 수치 등을 들 수 있다.
디폴트의 파라미터로서는, G(Cost to open gap)가 염기 서열인 경우에는 5, 아미노산 서열인 경우에는 11, -E(Cost to extend gap)가 염기 서열인 경우에는 2, 아미노산 서열인 경우에는 1, -q(Penalty for nucleotide mismatch)가 -3, -r(reward for nucleotide match)이 1, -e(expect value)가 10, -W(wordsize)가 염기 서열인 경우에는 11 잔기, 아미노산 서열인 경우에는 3 잔기, -y[Dropoff(X) for blast extensions in bits]가 blastn인 경우에는 20, blastn 이외의 프로그램이면 7, -X(X dropoff value for gapped alignment in bits)가 15 및 -Z(final X dropoff value for gapped alignment in bits)가 blastn인 경우에는 50, blastn 이외의 프로그램이면 25이다(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/htmL/blastcgihelp.htmL).
서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열 또는 NCBI 액세션 번호 NP_000811의 아미노산 서열의 부분 서열을 포함하는 폴리펩티드는, 당업자에게 공지된 방법에 의해 제작할 수 있다. 구체적으로는, 서열 번호 4의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA의 일부를 결실시키고, 이것을 포함하는 발현 벡터를 도입한 형질 전환체를 배양함으로써 제작할 수 있다. 또한, 상기와 동일한 방법에 의해, 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열 또는 NCBI 액세션 번호 NP_000811의 아미노산 서열에 있어서 1 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 얻을 수 있다. 또한, 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열 또는 NCBI 액세션 번호 NP_000811의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열 또는 NCBI 액세션 번호 NP_000811의 아미노산 서열에 있어서 1 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는, 플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc)법, t-부틸옥시카르보닐(tBoc)법 등의 화학 합성법에 의해 제조할 수도 있다.
본 발명에 있어서의 모노클로날 항체로서는, 하이브리도마에 의해 생산되는 항체, 또는 항체 유전자를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 형질 전환체에 의해 생산되는 유전자 재조합 항체를 들 수 있다.
모노클로날 항체란, 단일 클론의 항체 생산 세포가 분비하는 항체이며, 단 하나의 에피토프(항원 결정기라고도 함)를 인식하고, 모노클로날 항체를 구성하는 아미노산 서열(1차 서열)이 균일하다.
에피토프란, 모노클로날 항체가 인식하고, 결합하는 단일 아미노산 서열, 아미노산 서열을 포함하는 입체 구조, 번역 후 수식에 의해 수식된 아미노산 서열 및 해당 아미노산 서열을 포함하는 입체 구조 등을 들 수 있다.
번역 후 수식으로 의해 수식된 아미노산 서열로서는, 당쇄가 OH 치환기를 갖는 Tyr 및 Ser에 결합한 O 결합형 당쇄, NH2 치환기를 갖는 Gln 및 Asn에 결합한 N 결합형 당쇄, 및 황산 분자가 OH 치환기를 갖는 Tyr에 결합한 황산기 등이 결합된 아미노산 서열을 들 수 있다.
본 발명의 항체가 결합하는 인간 Gas6 상에 존재하는 아미노산 잔기 또는 에피토프로서는, Gas6 수용체와의 결합 부분의 에피토프, 인간 Gas6의 SHBG 도메인에 존재하는 에피토프, 인간 Gas6의 아미노산 서열의 SHBG 도메인에 존재하는 314, 315 및 316번째로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프, 인간 Gas6의 아미노산 서열의 SHBG 도메인에 존재하는 314, 315 및 316번째를 포함하는 에피토프를 들 수 있다.
본 발명의 항체가 인간 Gas6에 결합하는 것은, 고상 샌드위치법 등을 사용한 방사성면역 측정, 또는 효소 면역 측정법(ELISA) 등을 사용한 인간 Gas6에 대한 공지된 면역학적 검출법, 또는 Bicacore 시스템(지이 헬스케어(GE Healthcare)사제) 등을 사용한 표면 플라즈몬 공명법 등으로 확인할 수 있다. 또한, 공지된 면역학적 검출법[Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press(1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988), 단일 클론 항체 실험 매뉴얼, 고단샤 사이언티픽(1987)] 등을 조합하여 확인할 수도 있다.
본 발명의 항체가 결합하는 인간 Gas6의 아미노산 잔기 또는 에피토프는, 인간 Gas6의 일부 도메인을 결실시킨 결손체, 다른 단백질 유래의 도메인과 치환시킨 변이체 및 인간 Gas6의 부분 펩티드 단편 등을 사용하여 항체의 결합 실험을 행함으로써 결정할 수 있다. 또는, 본 발명의 항체가 결합하는 인간 Gas6의 아미노산 잔기 또는 에피토프는, 단백질 분해효소로 소화한 인간 Gas6의 펩티드 단편에 본 발명의 항체를 첨가하고, 기지의 질량 분석법을 사용하여 에피토프 맵핑을 행함으로써도 결정할 수 있다.
또한, 본 발명의 항체로서 구체적으로는, 인간 Gas6의 아미노산 서열 314, 315 및 316번째의 아미노산 잔기 중, 적어도 하나의 아미노산 잔기에 결합한 결과, 인간 Gas6에 대하여 결합 활성 및 중화 활성을 갖는 항체를 들 수 있다.
인간 Gas6의 기능으로서는, Gas6이 Gas6 수용체에 결합하고, 당해 수용체를 활성화시킨 결과, 세포 내 시그널 전달의 활성화, 세포 증식의 항진을 일으키는 것으로 알려져 있다.
본 발명에 있어서, Gas6 수용체로서 구체적으로는 Axl, Sky, Mer TK 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서 중화 활성이란, 인간 Gas6의 기능을 저해하는 것이며, 상술한 Gas6 수용체 활성화, 및 활성화에 수반하는 다양한 반응을 저해하는 활성을 말한다. 구체적으로는, Gas6과 Gas6 수용체의 결합을 저해한 결과, Gas6 수용체의 활성을 저해하는 활성, Gas6 첨가에 의한 Gas6 수용체 발현 세포 내에서의 시그널 전달의 활성화를 억제하는 활성, 또는 Gas6 첨가에 의한 Gas6 수용체 발현 세포의 세포 증식의 항진을 억제하는 활성 등을 들 수 있다.
본 발명의 항체가, Gas6에 특이적으로 결합하는 것, 및 Gas6과 Gas6 수용체의 결합을 저해하는 활성을 갖는 것은, ELISA 등의 공지된 면역학적 검출법, Biacore(등록 상표) 시스템 (지이 헬스케어사제) 등을 사용한 표면 플라즈몬 공명법 또는 이들을 조합함으로써 확인할 수 있다.
본 발명의 항체가 Gas6 결합에 의한 Gas6 수용체 발현 세포 내에서의 시그널 전달의 활성화를 억제하는 활성을 갖는 것은, 공지된 리포터 측정을 사용하여 특정 유전자 산물의 발현량을 검출하거나, 웨스턴 블롯팅법 또는 플로우 사이토미터 등을 사용하여 특정 시그널 전달 물질의 인산화 레벨을 검출함으로써 확인할 수 있다. 또는, 마이크로어레이를 사용하여, 유전자의 활성화 상태 또는 발현량을 망라적으로 검출하거나 함으로써도 확인할 수 있다.
본 발명의 항체가, Gas6에 의한 Gas6 수용체 발현 세포의 세포 증식의 항진을 억제하는 활성을 갖는 것은, 공지된 세포 증식 측정법을 사용하여 확인할 수 있다. 공지된 세포 증식 측정법이란, 구체적으로는 MTT나 WST-1 등의 테트라졸륨염을 사용하여 세포 생존 활성을 측정하는 방법 또는 [3H]-티미딘 등의 방사성 동위체를 사용하여 세포 내에서의 DNA 합성을 측정하는 방법 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 본 발명의 모노클로날 항체가 갖는 높은 결합 활성 또는 높은 중화 활성이란, 공지된 항인간 Gas6 항체 또는 시판되고 있는 항인간 Gas6 항체가 갖는 hGas6에 대한 결합 활성 또는 중화 활성과 비교하여, 결합 활성 또는 중화 활성이 강한 것을 말한다. 구체적으로는, 본 발명의 항hGas6 모노클로날 항체는, 항hGas6 모노클로날 항체 WG1(US7, 547, 767)과 비교하여, hGas6에 대한 높은 결합 활성 및 높은 중화 활성을 갖는 것을 말한다.
항체 분자는 이뮤노글로불린(이하, Ig라고 표기함)라고도 칭해지고, 인간 항체는, 분자 구조의 차이에 따라서, IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 및 IgM의 아이소타입으로 분류된다. 아미노산 서열의 상동성이 비교적 높은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 총칭하여 IgG라고도 한다.
항체 분자는 중쇄(Heavy chain, 이하 H쇄라고 기재함) 및 경쇄(Light chain, 이하 L쇄라고 기재함)라고 불리는 폴리펩티드로 구성된다. 또한, H쇄는 N 말단측으로부터 H쇄 가변 영역(VH라고도 표기됨), H쇄 정상 영역(CH라고도 표기됨), L쇄는 N 말단측으로부터 L쇄 가변 영역(VL이라고도 표기됨), L쇄 정상 영역(CL이라고도 표기됨)의 각 영역에 의해, 각각 구성된다. CH는 각 서브클래스마다, α, δ, ε, γ 및 μ쇄가 각각 알려져 있다. CH는 또한, N 말단측으로부터 CH1 도메인, 힌지 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인의 각 도메인에 의해 구성된다. 도메인이란, 항체 분자의 각 폴리펩티드를 구성하는 기능적인 구조 단위를 말한다. 또한, CH2 도메인과 CH3 도메인을 아울러 Fc 영역 또는 간단히 Fc라고 한다. CL은, Cλ쇄 및 Cκ쇄가 알려져 있다.
본 발명에 있어서의 CH1 도메인, 힌지 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 Fc 영역은, EU 인덱스[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services(1991)]에 의해, N 말단으로부터의 아미노산 잔기의 번호로 특정할 수 있다. 구체적으로는, CH1은 EU 인덱스 118 내지 215번의 아미노산 서열, 힌지는 EU 인덱스 216 내지 230번의 아미노산 서열, CH2는 EU 인덱스 231 내지 340번의 아미노산 서열, CH3은 EU 인덱스 341 내지 447번의 아미노산 서열로 각각 특정된다.
본 발명의 항체로서는, 특히 유전자 공학적으로 제작된 마우스 항체, 래트 항체, 인간형 키메라 항체(이하, 간단히 키메라 항체라고도 약기함), 인간화 항체[인간형 상보성 결정 영역(Complementarity Determining Region; CDR) 이식 항체라고도 함] 및 인간 항체 등의 유전자 재조합 항체도 포함된다.
키메라 항체란, 인간 이외의 동물(비인간 동물)의 항체의 VH 및 VL과, 인간 항체의 CH 및 CL을 포함하는 항체를 의미한다. 비인간 동물로서는, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 등, 하이브리도마를 제작하는 것이 가능하다면, 어떠한 것도 사용할 수 있다.
하이브리도마란, 비인간 동물에 항원을 면역시켜 취득된 B 세포와, 마우스 등에서 유래되는 미엘로마 세포를 세포 융합시켜 얻어지는, 원하는 항원 특이성을 갖는 모노클로날 항체를 생산하는 세포를 말한다. 따라서, 하이브리도마가 생산하는 항체를 구성하는 가변 영역은, 비인간 동물 항체의 아미노산 서열을 포함한다.
인간형 키메라 항체는, 모노클로날 항체를 생산하는 비인간 동물 세포 유래의 하이브리도마로부터, 해당 모노클로날 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA를 취득하고, 인간 항체의 CH 및 CL을 코딩하는 DNA를 갖는 동물 세포용 발현 벡터에 각각 삽입하여 인간형 키메라 항체 발현 벡터를 구축하여, 동물 세포에 도입함으로써 발현시켜, 제조할 수 있다.
인간화 항체란, 비인간 동물 항체의 VH 및 VL의 CDR의 아미노산 서열을 인간 항체의 VH 및 VL의 대응하는 CDR에 이식한 항체를 말한다. VH 및 VL의 CDR 이외의 영역은 프레임워크 영역(이하, FR이라 표기함)이라고 칭해진다.
인간화 항체는, 비인간 동물 항체의 VH의 CDR의 아미노산 서열과 임의의 인간 항체의 VH의 FR의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 아미노산 서열을 코딩하는 cDNA와, 비인간 동물 항체의 VL의 CDR의 아미노산 서열과 임의의 인간 항체의 VL의 FR의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 아미노산 서열을 코딩하는 cDNA를 구축하고, 인간 항체의 CH 및 CL을 코딩하는 DNA를 갖는 동물 세포용 발현 벡터에 각각 삽입하여 인간화 항체 발현 벡터를 구축하여, 동물 세포에 도입함으로써 발현시켜, 제조할 수 있다.
본 발명의 인간화 항체로서는, 구체적으로는, KM5320에 대해서는, CDR1 내지 3이 각각 서열 번호 79 내지 81로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VH를 포함하며, 또한 CDR1 내지 3이 각각 서열 번호 82 내지 84로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VL을 포함하는 인간화 항체를 들 수 있다. KM5321에 대해서는, CDR1 내지 3이 각각 서열 번호 85 내지 87로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VH를 포함하며, 또한 CDR1 내지 3이 각각 서열 번호 88 내지 90으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VL을 포함하는 인간화 항체를 들 수 있다.
본 발명의 인간화 항체로서, 구체적으로는, KM5320에 대해서, 이하의 (a) VL 및 (b) VH 중 적어도 한쪽을 포함하는 인간화 항체가, KM5321에 대해서, 이하의 (c) VL 및 (d) VH 중 적어도 한쪽을 포함하는 인간화 항체를 들 수 있다.
(a) 서열 번호 105로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 105로 표시되는 아미노산 서열 중의 2번째의 Val, 15번째의 Leu, 46번째의 Leu, 73번째의 Leu, 78번째의 Leu 및 87번째의 Tyr로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VL
(b) 서열 번호 129로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 129로 표시되는 아미노산 서열의 2번째의 Val, 9번째의 Ser, 20번째의 Val, 38번째의 Arg, 46번째의 Glu, 77번째의 Ser, 93번째의 Val 및 95번째의 Tyr으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VH
(c) 서열 번호 156으로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 156으로 표시되는 아미노산 서열 중의 4번째의 Leu, 13번째의 Ala, 15번째의 Val, 43번째의 Ala, 64번째의 Gly, 73번째의 Leu, 78번째의 Leu, 85번째의 Thr 및 104번째의 Val로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VL
(d) 서열 번호 186으로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 186으로 표시되는 아미노산 서열의 2번째의 Val, 9번째의 Ser, 38번째의 Arg, 46번째의 Glu, 79번째의 Ser, 93번째의 Val 및 112번째의 Val로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VH
또한, 본 발명의 KM5320 인간화 항체에 포함되는 VL로서는, 이하의 (1) 내지 (7)의 VL이 바람직하다.
(1) 서열 번호 105로 표시되는 아미노산 서열 중의 2번째의 Val, 15번째의 Leu, 46번째의 Leu, 73번째의 Leu, 78번째의 Leu 및 87번째의 Tyr이, 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VL
(2) 서열 번호 105로 표시되는 아미노산 서열 중의 2번째의 Val, 46번째의 Leu, 73번째의 Leu, 78번째의 Leu 및 87번째의 Tyr이, 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VL
(3) 서열 번호 105로 표시되는 아미노산 서열 중의 46번째의 Leu, 73번째의 Leu 및 87번째의 Tyr이, 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VL
(4) 서열 번호 105로 표시되는 아미노산 서열 중의 15번째의 Leu 및 73번째의 Leu가, 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VL
(5) 서열 번호 105로 표시되는 아미노산 서열 중의 78번째의 Leu 및 87번째의 Tyr이, 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VL
(6) 서열 번호 105로 표시되는 아미노산 서열 중의 78번째의 Leu가, 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VL
(7) 서열 번호 105로 표시되는 아미노산 서열 중의 87번째의 Tyr이, 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VL
상기 VL의 아미노산 서열로서는, 예를 들어 서열 번호 105로 표시되는 아미노산 서열 중의 2번째의 Val을 Ile로, 15번째의 Leu를 Ala로, 46번째의 Leu를 Val로, 73번째의 Leu를 Phe로, 78번째의 Leu를 Val로, 그리고 87번째의 Tyr을 Phe로 치환하는 개변으로부터 선택되는 적어도 하나의 개변이 도입된 아미노산 서열을 들 수 있다.
6개의 개변이 도입된 VL의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는, 예를 들어 서열 번호 105로 표시되는 아미노산 서열 중의 2번째의 Val을 Ile로, 15번째의 Leu를 Ala로, 46번째의 Leu를 Val로, 73번째의 Leu를 Phe로, 78번째의 Leu를 Val로, 그리고 87번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열을 들 수 있다.
5개의 개변이 도입된 VL의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는, 예를 들어 이하의 (1) 내지 (4)의 아미노산 서열을 들 수 있다.
(1) 서열 번호 105로 표시되는 아미노산 서열 중의 2번째의 Val을 Ile로, 46번째의 Leu를 Val로, 73번째의 Leu를 Phe로, 78번째의 Leu를 Val로, 그리고 87번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
(2) 서열 번호 105로 표시되는 아미노산 서열 중의 2번째의 Val을 Ile로, 15번째의 Leu를 Ala로, 46번째의 Leu를 Val로, 73번째의 Leu를 Phe로, 그리고 87번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
(3) 서열 번호 105로 표시되는 아미노산 서열 중의 2번째의 Val을 Ile로, 15번째의 Leu를 Ala로, 73번째의 Leu를 Phe로, 78번째의 Leu를 Val로, 그리고 87번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
(4) 서열 번호 105로 표시되는 아미노산 서열 중의 15번째의 Leu를 Ala로, 46번째의 Leu를 Val로, 73번째의 Leu를 Phe로, 78번째의 Leu를 Val로, 그리고 87번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
4개의 개변이 도입된 VL의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는, 예를 들어 이하의 (1) 내지 (4)의 아미노산 서열을 들 수 있다.
(1) 서열 번호 105로 표시되는 아미노산 서열 중의 46번째의 Leu를 Val로, 73번째의 Leu를 Phe로, 78번째의 Leu를 Val로, 그리고 87번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
(2) 서열 번호 105로 표시되는 아미노산 서열 중의 2번째의 Val을 Ile로, 73번째의 Leu를 Phe로, 78번째의 Leu를 Val로, 그리고 87번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
(3) 서열 번호 105로 표시되는 아미노산 서열 중의 2번째의 Val을 Ile로, 46번째의 Leu를 Val로, 73번째의 Leu를 Phe로, 그리고 78번째의 Leu를 Val로 치환한 아미노산 서열
(4) 서열 번호 105로 표시되는 아미노산 서열 중의 2번째의 Val을 Ile로, 15번째의 Leu를 Ala로, 73번째의 Leu를 Phe로, 그리고 87번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
3개의 개변이 도입된 VL의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는, 예를 들어 이하의 (1) 내지 (4)의 아미노산 서열을 들 수 있다.
(1) 서열 번호 105로 표시되는 아미노산 서열 중의 46번째의 Leu를 Val로, 73번째의 Leu를 Phe로, 그리고 87번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
(2) 서열 번호 105로 표시되는 아미노산 서열 중의 15번째의 Leu를 Ala로, 46번째의 Leu를 Val로, 그리고 87번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
(3) 서열 번호 105로 표시되는 아미노산 서열 중의 15번째의 Leu를 Ala로, 46번째의 Leu를 Val로, 그리고 78번째의 Leu를 Val로 치환한 아미노산 서열
(4) 서열 번호 105로 표시되는 아미노산 서열 중의 46번째의 Leu를 Val로, 73번째의 Leu를 Phe로, 그리고 78번째의 Leu를 Val로 치환한 아미노산 서열
2개의 개변이 도입된 VL의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는, 예를 들어 이하의 (1) 내지 (4)의 아미노산 서열을 들 수 있다.
(1) 서열 번호 105로 표시되는 아미노산 서열 중의 78번째의 Leu를 Val로, 그리고 87번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
(2) 서열 번호 105로 표시되는 아미노산 서열 중의 15번째의 Leu를 Ala로, 그리고 73번째의 Leu를 Phe로 치환한 아미노산 서열
(3) 서열 번호 105로 표시되는 아미노산 서열 중의 46번째의 Leu를 Val로, 그리고 78번째의 Leu를 Val로 치환한 아미노산 서열
(4) 서열 번호 105로 표시되는 아미노산 서열 중의 2번째의 Val을 Ile로, 그리고 15번째의 Leu를 Ala로 치환한 아미노산 서열
1개의 개변이 도입된 VL의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는, 예를 들어 이하의 (1) 내지 (4)의 아미노산 서열을 들 수 있다.
(1) 서열 번호 105로 표시되는 아미노산 서열 중의 2번째의 Val을 Ile로 치환한 아미노산 서열
(2) 서열 번호 105로 표시되는 아미노산 서열 중의 46번째의 Leu를 Val로 치환한 아미노산 서열
(3) 서열 번호 105로 표시되는 아미노산 서열 중의 78번째의 Leu를 Val로 치환한 아미노산 서열
(4) 서열 번호 105로 표시되는 아미노산 서열 중의 87번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
또한, 본 발명의 KM5320 인간화 항체에 포함되는 VH로서는, 이하의 (1) 내지 (8)의 VH가 바람직하다.
(1) 서열 번호 129로 표시되는 아미노산 서열 중의 2번째의 Val, 9번째의 Ser, 20번째의 Val, 38번째의 Arg, 46번째의 Glu, 77번째의 Ser, 93번째의 Val 및 95번째의 Tyr이, 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 VH
(2) 서열 번호 129로 표시되는 아미노산 서열 중의 9번째의 Ser, 20번째의 Val, 38번째의 Arg, 46번째의 Glu, 93번째의 Val 및 95번째의 Tyr이, 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 VH
(3) 서열 번호 129로 표시되는 아미노산 서열 중의 9번째의 Ser, 46번째의 Glu, 93번째의 Val 및 95번째의 Tyr이, 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 VH
(4) 서열 번호 129로 표시되는 아미노산 서열 중의 46번째의 Glu, 93번째의 Val 및 95번째의 Tyr이, 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 VH
(5) 서열 번호 129로 표시되는 아미노산 서열 중의 2번째의 Val, 20번째의 Val 및 95번째의 Tyr이, 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 VH
(6) 서열 번호 129로 표시되는 아미노산 서열 중의 9번째의 Ser, 38번째의 Arg 및 46번째의 Glu가, 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 VH
(7) 서열 번호 129로 표시되는 아미노산 서열 중의 93번째의 Val 및 95번째의 Tyr이, 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 VH
(8) 서열 번호 129로 표시되는 아미노산 서열 중의 46번째의 Glu가, 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 VH
상기 VH의 아미노산 서열로서는, 예를 들어 서열 번호 129로 표시되는 아미노산 서열 중의 2번째의 Val을 Ile로, 9번째의 Ser을 Pro로, 20번째의 Val을 Ile로, 38번째의 Arg를 Lys로, 46번째의 Glu를 Lys로, 77번째의 Ser을 Thr로, 93번째의 Val을 Thr로, 그리고 95번째의 Tyr을 Phe로 치환하는 개변으로부터 선택되는 적어도 하나의 개변이 도입된 아미노산 서열을 들 수 있다.
8개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는, 예를 들어 서열 번호 129로 표시되는 아미노산 서열 중의, 2번째의 Val을 Ile로, 9번째의 Ser을 Pro로, 20번째의 Val을 Ile로, 38번째의 Arg를 Lys로, 46번째의 Glu를 Lys로, 77번째의 Ser을 Thr로, 93번째의 Val을 Thr로, 그리고 95번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열을 들 수 있다.
6개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는, 예를 들어 이하의 (1) 내지 (4)의 아미노산 서열을 들 수 있다.
(1) 서열 번호 129로 표시되는 아미노산 서열 중의, 20번째의 Val을 Ile로, 38번째의 Arg를 Lys로, 46번째의 Glu를 Lys로, 77번째의 Ser을 Thr로, 93번째의 Val을 Thr로, 그리고 95번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
(2) 서열 번호 129로 표시되는 아미노산 서열 중의, 2번째의 Val을 Ile로, 9번째의 Ser을 Pro로, 20번째의 Val을 Ile로, 38번째의 Arg를 Lys로, 77번째의 Ser을 Thr로, 그리고 93번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(3) 서열 번호 129로 표시되는 아미노산 서열 중의, 9번째의 Ser을 Pro로, 20번째의 Val을 Ile로, 38번째의 Arg를 Lys로, 46번째의 Glu를 Lys로, 93번째의 Val을 Thr로, 그리고 95번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
(4) 서열 번호 129로 표시되는 아미노산 서열 중의, 9번째의 Ser을 Pro로, 38번째의 Arg를 Lys로, 46번째의 Glu를 Lys로, 77번째의 Ser을 Thr로, 93번째의 Val을 Thr로, 그리고 95번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
4개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는, 예를 들어 이하의 (1) 내지 (4)의 아미노산 서열을 들 수 있다.
(1) 서열 번호 129로 표시되는 아미노산 서열 중의, 9번째의 Ser을 Pro로, 20번째의 Val을 Ile로, 46번째의 Glu를 Lys로, 그리고 93번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(2) 서열 번호 129로 표시되는 아미노산 서열 중의, 9번째의 Ser을 Pro로, 46번째의 Glu를 Lys로, 93번째의 Val을 Thr로, 그리고 95번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
(3) 서열 번호 129로 표시되는 아미노산 서열 중의, 20번째의 Val을 Ile로, 46번째의 Glu를 Lys로, 93번째의 Val을 Thr로, 그리고 95번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
(4) 서열 번호 129로 표시되는 아미노산 서열 중의, 38번째의 Arg를 Lys로, 46번째의 Glu를 Lys로, 93번째의 Val을 Thr로, 그리고 95번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
3개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는, 예를 들어 이하의 (1) 내지 (4)로부터 선택되는 1개의 아미노산 서열을 들 수 있다.
(1) 서열 번호 129로 표시되는 아미노산 서열 중의, 2번째의 Val을 Ile로, 20번째의 Val을 Ile로, 그리고 95번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
(2) 서열 번호 129로 표시되는 아미노산 서열 중의, 9번째의 Ser을 Pro로, 38번째의 Arg를 Lys로, 그리고 46번째의 Glu를 Lys로 치환한 아미노산 서열
(3) 서열 번호 129로 표시되는 아미노산 서열 중의, 46번째의 Glu를 Lys로, 93번째의 Val을 Thr로, 그리고 95번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
(4) 서열 번호 129로 표시되는 아미노산 서열 중의, 9번째의 Ser을 Pro로, 38번째의 Arg를 Lys로, 그리고 95번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
2개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는, 예를 들어 이하의 (1) 내지 (4)의 아미노산 서열을 들 수 있다.
(1) 서열 번호 129로 표시되는 아미노산 서열 중의, 9번째의 Ser을 Pro로, 그리고 38번째의 Arg를 Lys로 치환한 아미노산 서열
(2) 서열 번호 129로 표시되는 아미노산 서열 중의, 20번째의 Val을 Ile로, 그리고 77번째의 Ser을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(3) 서열 번호 129로 표시되는 아미노산 서열 중의, 46번째의 Glu를 Lys 및 95번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
(4) 서열 번호 129로 표시되는 아미노산 서열 중의, 93번째의 Val을 Thr로, 그리고 95번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
1개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는, 예를 들어 이하의 (1) 내지 (4)의 아미노산 서열을 들 수 있다.
(1) 서열 번호 129로 표시되는 아미노산 서열 중의, 20번째의 Val을 Ile로 치환한 아미노산 서열
(2) 서열 번호 129로 표시되는 아미노산 서열 중의, 38번째의 Arg를 Lys로 치환한 아미노산 서열
(3) 서열 번호 129로 표시되는 아미노산 서열 중의, 46번째의 Glu를 Lys로 치환한 아미노산 서열
(4) 서열 번호 129로 표시되는 아미노산 서열 중의, 95번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
또한, 본 발명의 KM5320 인간화 항체의 구체예로서는, 이하의 (1) 내지 (3)의 인간화 항체 등을 들 수 있다.
(1) 항체의 VH가 서열 번호 135로 표시되는 아미노산 서열 및/또는 항체의 VL이 서열 번호 123으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체
(2) 항체의 VH가 도 8에 나타낸 어느 아미노산 서열 및/또는 항체의 VL이 서열 번호 123으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체
(3) 항체의 VH가 서열 번호 135로 표시되는 아미노산 서열 및/또는 항체의 VL이 도 7에 나타낸 어느 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체
또한, 본 발명의 KM5321 인간화 항체에 포함되는 VL로서는, 이하의 (1) 내지 (7)의 VL이 바람직하다.
(1) 서열 번호 156으로 표시되는 아미노산 서열 중의 4번째의 Leu, 13번째의 Ala, 15번째의 Val, 43번째의 Ala, 64번째의 Gly, 73번째의 Leu, 78번째의 Leu, 85번째의 Thr 및 104번째의 Val이, 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VL
(2) 서열 번호 156으로 표시되는 아미노산 서열 중의 13번째의 Ala, 15번째의 Val, 64번째의 Gly, 73번째의 Leu, 78번째의 Leu, 85번째의 Thr 및 104번째의 Val이, 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VL
(3) 서열 번호 156으로 표시되는 아미노산 서열 중의 13번째의 Ala, 15번째의 Val, 43번째의 Ala, 73번째의 Leu, 78번째의 Leu 및 85번째의 Thr이, 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VL
(4) 서열 번호 156으로 표시되는 아미노산 서열 중의 13번째의 Ala, 15번째의 Val, 73번째의 Leu 및 78번째의 Leu가, 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VL
(5) 서열 번호 156으로 표시되는 아미노산 서열 중의 15번째의 Val, 78번째의 Leu 및 85번째의 Thr이, 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VL
(6) 서열 번호 156으로 표시되는 아미노산 서열 중의 13번째의 Ala 및 43번째의 Ala가, 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VL
(7) 서열 번호 156으로 표시되는 아미노산 서열 중의 43번째의 Ala가, 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VL
상기 VL의 아미노산 서열로서는, 예를 들어 서열 번호 156으로 표시되는 아미노산 서열 중의 4번째의 Leu를 Val로, 13번째의 Ala를 Val로, 15번째의 Val을 Thr로, 43번째의 Ala를 Pro로, 64번째의 Gly를 Ser로, 73번째의 Leu를 Phe로, 78번째의 Leu를 Thr로, 85번째의 Thr을 Asp로, 그리고 104번째의 Val을 Leu로 치환하는 개변으로부터 선택되는 적어도 하나의 개변이 도입된 아미노산 서열을 들 수 있다.
9개의 개변이 도입된 VL의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는, 예를 들어 서열 번호 156으로 표시되는 아미노산 서열 중의 4번째의 Leu를 Val로, 13번째의 Ala를 Val로, 15번째의 Val을 Thr로, 43번째의 Ala를 Pro로, 64번째의 Gly를 Ser로, 73번째의 Leu를 Phe로, 78번째의 Leu를 Thr로, 85번째의 Thr을 Asp로, 그리고 104번째의 Val을 Leu로 치환한 아미노산 서열을 들 수 있다.
7개의 개변이 도입된 VL의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는, 예를 들어 이하의 (1) 내지 (4)의 아미노산 서열을 들 수 있다.
(1) 서열 번호 156으로 표시되는 아미노산 서열 중의 4번째의 Leu를 Val로, 13번째의 Ala를 Val로, 64번째의 Gly를 Ser로, 73번째의 Leu를 Phe로, 78번째의 Leu를 Thr로, 85번째의 Thr을 Asp로, 그리고 104번째의 Val을 Leu로 치환한 아미노산 서열
(2) 서열 번호 156으로 표시되는 아미노산 서열 중의 13번째의 Ala를 Val로, 15번째의 Val을 Thr로, 43번째의 Ala를 Pro로, 64번째의 Gly를 Ser로, 73번째의 Leu를 Phe로, 78번째의 Leu를 Thr로, 그리고 85번째의 Thr을 Asp로 치환한 아미노산 서열
(3) 서열 번호 156으로 표시되는 아미노산 서열 중의 4번째의 Leu를 Val로, 15번째의 Val을 Thr로, 43번째의 Ala를 Pro로, 64번째의 Gly를 Ser로, 78번째의 Leu를 Thr로, 85번째의 Thr을 Asp로, 그리고 104번째의 Val을 Leu로 치환한 아미노산 서열
(4) 서열 번호 156으로 표시되는 아미노산 서열 중의 4번째의 Leu를 Val로, 15번째의 Val을 Thr로, 43번째의 Ala를 Pro로, 64번째의 Gly를 Ser로, 73번째의 Leu를 Phe로, 78번째의 Leu를 Thr로, 그리고 85번째의 Thr을 Asp로 치환한 아미노산 서열
6개의 개변이 도입된 VL의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는, 예를 들어 이하의 (1) 내지 (4)의 아미노산 서열을 들 수 있다.
(1) 서열 번호 156으로 표시되는 아미노산 서열 중의 4번째의 Leu를 Val로, 15번째의 Val을 Thr로, 43번째의 Ala를 Pro로, 64번째의 Gly를 Ser로, 85번째의 Thr을 Asp로, 그리고 104번째의 Val을 Leu로 치환한 아미노산 서열
(2) 서열 번호 156으로 표시되는 아미노산 서열 중의 13번째의 Ala를 Val로, 15번째의 Val을 Thr로, 43번째의 Ala를 Pro로, 64번째의 Gly를 Ser로, 78번째의 Leu를 Thr로, 그리고 85번째의 Thr을 Asp로 치환한 아미노산 서열
(3) 서열 번호 156으로 표시되는 아미노산 서열 중의 15번째의 Val을 Thr로, 43번째의 Ala를 Pro로, 64번째의 Gly를 Ser로, 73번째의 Leu를 Phe로, 78번째의 Leu를 Thr로, 그리고 85번째의 Thr을 Asp로 치환한 아미노산 서열
(4) 서열 번호 156으로 표시되는 아미노산 서열 중의 13번째의 Ala를 Val로, 43번째의 Ala를 Pro로, 64번째의 Gly를 Ser로, 73번째의 Leu를 Phe로, 78번째의 Leu를 Thr로, 그리고 85번째의 Thr을 Asp로 치환한 아미노산 서열
4개의 개변이 도입된 VL의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는, 예를 들어 이하의 (1) 내지 (4)의 아미노산 서열을 들 수 있다.
(1) 서열 번호 156으로 표시되는 아미노산 서열 중의 4번째의 Leu를 Val로, 13번째의 Ala를 Val로, 15번째의 Val을 Thr로, 그리고 43번째의 Ala를 Pro로 치환한 아미노산 서열
(2) 서열 번호 156으로 표시되는 아미노산 서열 중의 13번째의 Ala를 Val로, 15번째의 Val을 Thr로, 43번째의 Ala를 Pro로, 그리고 85번째의 Thr을 Asp로 치환한 아미노산 서열
(3) 서열 번호 156으로 표시되는 아미노산 서열 중의 13번째의 Ala를 Val로, 15번째의 Val을 Thr로, 73번째의 Leu를 Phe로, 그리고 78번째의 Leu를 Thr로 치환한 아미노산 서열
(4) 서열 번호 156으로 표시되는 아미노산 서열 중의 13번째의 Ala를 Val로, 15번째의 Val을 Thr로, 73번째의 Leu를 Phe로, 그리고 85번째의 Thr을 Asp로 치환한 아미노산 서열
3개의 개변이 도입된 VL의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는, 예를 들어 이하의 (1) 내지 (4)의 아미노산 서열을 들 수 있다.
(1) 서열 번호 156으로 표시되는 아미노산 서열 중의 13번째의 Ala를 Val로, 15번째의 Val을 Thr로, 그리고 73번째의 Leu를 Phe로 치환한 아미노산 서열
(2) 서열 번호 156으로 표시되는 아미노산 서열 중의 13번째의 Ala를 Val로, 73번째의 Leu를 Phe로, 그리고 85번째의 Thr을 Asp로 치환한 아미노산 서열
(3) 서열 번호 156으로 표시되는 아미노산 서열 중의 15번째의 Val을 Thr로, 78번째의 Leu를 Thr로, 그리고 85번째의 Thr을 Asp로 치환한 아미노산 서열
(4) 서열 번호 156으로 표시되는 아미노산 서열 중의 43번째의 Ala를 Pro로, 73번째의 Leu를 Phe로, 그리고 78번째의 Leu를 Thr로 치환한 아미노산 서열
2개의 개변이 도입된 VL의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는, 예를 들어 이하의 (1) 내지 (4)의 아미노산 서열을 들 수 있다.
(1) 서열 번호 156으로 표시되는 아미노산 서열 중의 13번째의 Ala를 Val로, 그리고 15번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(2) 서열 번호 156으로 표시되는 아미노산 서열 중의 13번째의 Ala를 Val로, 그리고 43번째의 Ala를 Pro로 치환한 아미노산 서열
(3) 서열 번호 156으로 표시되는 아미노산 서열 중의 15번째의 Val을 Thr로, 그리고 85번째의 Thr을 Asp로 치환한 아미노산 서열
(4) 서열 번호 156으로 표시되는 아미노산 서열 중의 43번째의 Ala를 Pro로, 그리고 64번째의 Gly를 Ser로 치환한 아미노산 서열
1개의 개변이 도입된 VL의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는, 예를 들어 이하의 (1) 내지 (4)의 아미노산 서열을 들 수 있다.
(1) 서열 번호 156으로 표시되는 아미노산 서열 중의 13번째의 Ala를 Val로 치환한 아미노산 서열
(2) 서열 번호 156으로 표시되는 아미노산 서열 중의 43번째의 Ala를 Pro로 치환한 아미노산 서열
(3) 서열 번호 156으로 표시되는 아미노산 서열 중의 73번째의 Leu를 Phe로 치환한 아미노산 서열
(4) 서열 번호 156으로 표시되는 아미노산 서열 중의 85번째의 Thr을 Asp로 치환한 아미노산 서열
또한, 본 발명의 KM5321 인간화 항체에 포함되는 VH로서는, 이하의 (1) 내지 (8)의 VH가 바람직하다.
(1) 서열 번호 186으로 표시되는 아미노산 서열 중의 2번째의 Val, 9번째의 Ser, 38번째의 Arg, 46번째의 Glu, 79번째의 Ser, 93번째의 Val 및 112번째의 Val이, 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 VH
(2) 서열 번호 186으로 표시되는 아미노산 서열 중의 2번째의 Val, 38번째의 Arg, 46번째의 Glu, 79번째의 Ser 및 112번째의 Val이, 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 VH
(3) 서열 번호 186으로 표시되는 아미노산 서열 중의 2번째의 Val, 9번째의 Ser, 79번째의 Ser 및 112번째의 Val이, 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 VH
(4) 서열 번호 186으로 표시되는 아미노산 서열 중의 9번째의 Ser, 46번째의 Glu 및 93번째의 Val이, 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 VH
(5) 서열 번호 186으로 표시되는 아미노산 서열 중의 38번째의 Arg, 46번째의 Glu 및 93번째의 Val이, 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 VH
(6) 서열 번호 186으로 표시되는 아미노산 서열 중의 38번째의 Arg 및 46번째의 Glu가, 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 VH
(7) 서열 번호 186으로 표시되는 아미노산 서열 중의 9번째의 Ser 및 93번째의 Val이, 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 VH
(8) 서열 번호 186으로 표시되는 아미노산 서열 중의 46번째의 Glu가, 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 VH
상기 VH의 아미노산 서열로서는, 예를 들어 서열 번호 186으로 표시되는 아미노산 서열 중의 2번째의 Val을 Ile로, 9번째의 Ser을 Pro로, 38번째의 Arg를 Lys로, 46번째의 Glu를 Lys로, 79번째의 Ser을 Ala로, 93번째의 Val을 Thr로, 그리고 112번째의 Val을 Ile로 치환하는 개변으로부터 선택되는 적어도 하나의 개변이 도입된 아미노산 서열을 들 수 있다.
7개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는, 예를 들어 서열 번호 186으로 표시되는 아미노산 서열 중의, 2번째의 Val을 Ile로, 9번째의 Ser을 Pro로, 38번째의 Arg를 Lys로, 46번째의 Glu를 Lys로, 79번째의 Ser을 Ala로, 93번째의 Val을 Thr로, 그리고 112번째의 Val을 Ile로 치환한 아미노산 서열을 들 수 있다.
5개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는, 예를 들어 이하의 (1) 내지 (4)의 아미노산 서열을 들 수 있다.
(1) 서열 번호 186으로 표시되는 아미노산 서열 중의, 2번째의 Val을 Ile로, 9번째의 Ser을 Pro로, 38번째의 Arg를 Lys로, 46번째의 Glu를 Lys로, 그리고 112번째의 Val을 Ile로 치환한 아미노산 서열
(2) 서열 번호 186으로 표시되는 아미노산 서열 중의, 2번째의 Val을 Ile로, 38번째의 Arg를 Lys로, 46번째의 Glu를 Lys로, 79번째의 Ser을 Ala로, 그리고 112번째의 Val을 Ile로 치환한 아미노산 서열
(3) 서열 번호 186으로 표시되는 아미노산 서열 중의, 2번째의 Val을 Ile로, 38번째의 Arg를 Lys로, 46번째의 Glu를 Lys로, 79번째의 Ser을 Ala로, 그리고 93번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(4) 서열 번호 186으로 표시되는 아미노산 서열 중의, 9번째의 Ser을 Pro로, 38번째의 Arg를 Lys로, 46번째의 Glu를 Lys로, 93번째의 Val을 Thr로, 그리고 112번째의 Val을 Ile로 치환한 아미노산 서열
4개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는, 예를 들어 이하의 (1) 내지 (4)의 아미노산 서열을 들 수 있다.
(1) 서열 번호 186으로 표시되는 아미노산 서열 중의, 2번째의 Val을 Ile로, 9번째의 Ser을 Pro로, 79번째의 Ser을 Ala로, 그리고 112번째의 Val을 Ile로 치환한 아미노산 서열
(2) 서열 번호 186으로 표시되는 아미노산 서열 중의, 9번째의 Ser을 Pro로, 38번째의 Arg를 Lys로, 46번째의 Glu를 Lys로, 그리고 79번째의 Ser을 Ala로 치환한 아미노산 서열
(3) 서열 번호 186으로 표시되는 아미노산 서열 중의, 9번째의 Ser을 Pro로, 38번째의 Arg를 Lys로, 46번째의 Glu를 Lys로, 그리고 93번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(4) 서열 번호 186으로 표시되는 아미노산 서열 중의, 9번째의 Ser을 Pro로, 46번째의 Glu를 Lys로, 79번째의 Ser을 Ala로, 그리고 112번째의 Val을 Ile로 치환한 아미노산 서열
3개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는, 예를 들어 이하의 (1) 내지 (4)의 아미노산 서열을 들 수 있다.
(1) 서열 번호 186으로 표시되는 아미노산 서열 중의, 9번째의 Ser을 Pro로, 46번째의 Glu를 Lys로, 그리고 93번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(2) 서열 번호 186으로 표시되는 아미노산 서열 중의, 2번째의 Val을 Ile로, 38번째의 Arg를 Lys로, 그리고 46번째의 Glu를 Lys로 치환한 아미노산 서열
(3) 서열 번호 186으로 표시되는 아미노산 서열 중의, 38번째의 Arg를 Lys로, 46번째의 Glu를 Lys로, 그리고 79번째의 Ser을 Ala로 치환한 아미노산 서열
(4) 서열 번호 186으로 표시되는 아미노산 서열 중의, 38번째의 Arg를 Lys로, 46번째의 Glu를 Lys로, 그리고 93번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
2개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는, 예를 들어 이하의 (1) 내지 (4)의 아미노산 서열을 들 수 있다.
(1) 서열 번호 186으로 표시되는 아미노산 서열 중의, 38번째의 Arg를 Lys로, 그리고 46번째의 Glu를 Lys로 치환한 아미노산 서열
(2) 서열 번호 186으로 표시되는 아미노산 서열 중의, 9번째의 Ser을 Pro로, 그리고 93번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(3) 서열 번호 186으로 표시되는 아미노산 서열 중의, 9번째의 Ser을 Pro로, 그리고 38번째의 Arg를 Lys로 치환한 아미노산 서열
(4) 서열 번호 186으로 표시되는 아미노산 서열 중의, 79번째의 Ser을 Ala로, 그리고 93번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
1개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는, 예를 들어 이하의 (1) 내지 (4)의 아미노산 서열을 들 수 있다.
(1) 서열 번호 186으로 표시되는 아미노산 서열 중의, 9번째의 Ser을 Pro로 치환한 아미노산 서열
(2) 서열 번호 186으로 표시되는 아미노산 서열 중의, 38번째의 Arg를 Lys로 치환한 아미노산 서열
(3) 서열 번호 186으로 표시되는 아미노산 서열 중의, 46번째의 Glu를 Lys로 치환한 아미노산 서열
(4) 서열 번호 186으로 표시되는 아미노산 서열 중의, 93번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
또한, 본 발명의 KM5321 인간화 항체의 구체예로서는, 이하의 (1) 내지 (6)의 인간화 항체 등을 들 수 있다.
(1) 항체의 VH가 서열 번호 195로 표시되는 아미노산 서열 및/또는 항체의 VL이 서열 번호 174로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체
(2) 항체의 VH가 도 10에 나타낸 어느 아미노산 서열 및/또는 항체의 VL이 서열 번호 174로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체
(3) 항체의 VH가 서열 번호 195로 표시되는 아미노산 서열 및/또는 항체의 VL이 도 9에 나타낸 어느 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체
(4) 항체의 VH가 서열 번호 186으로 표시되는 아미노산 서열 및/또는 항체의 VL이 서열 번호 180으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체
(5) 항체의 VH가 도 10에 나타낸 어느 아미노산 서열 및/또는 항체의 VL이 서열 번호 180으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체
(6) 항체의 VH가 서열 번호 186으로 표시되는 아미노산 서열 및/또는 항체의 VL이 도 9에 나타낸 어느 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체
인간 항체는, 원래, 인체 내에서 천연적으로 존재하는 항체를 말하지만, 최근 유전자 공학적, 세포 공학적, 발생 공학적인 기술의 진보에 의해 제작된 인간 항체 파지 라이브러리 및 인간 항체 생산 트랜스제닉 동물로부터 얻어지는 항체 등도 포함된다.
인간 항체는, 인간 이뮤노글로불린 유전자를 유지하는 마우스(Tomizuka K. et. al., Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 722-7, 2000.)에 원하는 항원을 면역시킴으로써 취득할 수 있다. 또한, 인간 유래의 B 세포로부터 항체 유전자를 증폭시킨 phage display(파지 디스플레이) 라이브러리를 사용함으로써, 원하는 결합 활성을 갖는 인간 항체를 선택하는 것으로, 면역을 행하지 않고 인간 항체를 취득할 수 있다(Winter G. et. al., Annu Rev Immunol. 12:433-55. 1994). 또한, EB 바이러스를 사용하여 인간 B 세포를 불사화함으로써, 원하는 결합 활성을 갖는 인간 항체를 생산하는 세포를 제작하여, 인간 항체를 취득할 수 있다(Rosen A. et. al., Nature 267, 52-54. 1977).
인체 내에 존재하는 항체는, 예를 들어 인간 말초혈로부터 단리된 임파구를 EB 바이러스 등을 감염시킴으로써 불사화한 후, 클로닝함으로써, 해당 항체를 생산하는 임파구를 얻을 수 있고, 해당 임파구를 배양한 배양물 중에서 해당 항체를 정제할 수 있다.
인간 항체 파지 라이브러리는, 인간 B 세포로부터 조제한 항체 유전자를 파지 유전자에 삽입함으로써 Fab, scFv 등의 항체 단편을 표면에 발현시킨 파지의 라이브러리이다. 해당 라이브러리로부터, 항원을 고정화한 기질에 대한 결합 활성을 지표로 하여 원하는 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편을 발현하고 있는 파지를 회수할 수 있다. 해당 항체 단편은, 또한 유전자 공학적 방법에 의해, 2개의 완전한 H쇄 및 2개의 완전한 L쇄를 포함하는 인간 항체 분자로도 변환할 수 있다.
인간 항체 생산 트랜스제닉 동물은, 인간 항체 유전자가 숙주 동물의 염색체 내에 조립된 동물을 말한다. 구체적으로는, 마우스 ES 세포에 인간 항체 유전자를 도입하고, 해당 ES 세포를 다른 마우스의 초기 배에 이식 후, 발생시킴으로써 인간 항체 생산 트랜스제닉 동물을 제작할 수 있다. 인간 항체 생산 트랜스제닉 동물로부터의 인간 항체의 제작 방법은, 통상의 인간 이외의 포유 동물에서 행해지고 있는 하이브리도마 제작 방법에 의해 인간 항체 생산 하이브리도마를 취득하고, 배양함으로써 배양물 중에 인간 항체를 생산 축적시킬 수 있다.
본 발명의 항체 VH 및 VL의 아미노산 서열로서는, 인간 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열, 비인간 동물 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열, 또는 비인간 동물 항체의 CDR을, 임의의 인간 항체의 프레임워크에 이식한 인간화 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열 중 어느 것이든 좋다. 구체적으로는, 하이브리도마가 생산하는 비인간 동물 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열, 인간화 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열, 인간 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열 등을 들 수 있다.
본 발명의 항체에 있어서의 CL의 아미노산 서열로서는, 인간 항체의 아미노산 서열 또는 비인간 동물 항체의 아미노산 서열 중 어느 것이든 좋지만, 인간 항체의 아미노산 서열 Cκ 또는 Cλ가 바람직하다.
본 발명의 항체 CH로서는, 이뮤노글로불린에 속하면 어떠한 것이어도 되지만, 바람직하게는 IgG 클래스에 속하는 서브클래스, γ1(IgG1), γ2(IgG2), γ3(IgG3), γ4(IgG4)를 모두 사용할 수 있다.
본 발명의 항체로서는, Fc와 항체 단편이 결합한 Fc 융합 단백질, Fc와 천연에 존재하는 리간드 또는 수용체가 결합한 Fc 융합 단백질(이뮤노어드헤신이라고도 함), 복수개의 Fc 영역을 융합시킨 Fc 융합 단백질 등도 본 발명에 포함된다. 또한, 항체를 안정화시키기 위해서 그리고 혈중 반감기를 제어하기 위해서, 아미노산 잔기를 개변한 Fc 영역 등도 본 발명의 항체에 사용할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 해당 항체 단편은, 번역 후 수식된 어떠한 아미노산 잔기를 포함하는 항체도 포함한다. 번역 후 수식으로서는, 예를 들어 H쇄의 C 말단에 있어서의 리신 잔기의 결실[리신 클리핑(lysine clipping)], 및 폴리펩티드의 N 말단에 있어서의 글루타민 잔기의 피로글루타민(pyroGlu)으로의 변환 등을 들 수 있다[Beck et al, Analytical Chemistry, 85, 715-736(2013)].
본 발명에 있어서 항체 단편으로서는, Fab, Fab', F(ab')2, scFv, diabody, dsFv, 복수개의 CDR을 포함하는 펩티드 등을 들 수 있다.
Fab는, IgG 항체를 단백질 분해효소 파파인으로 처리하여 얻어지는 단편 중 (H쇄의 224번째 아미노산 잔기에서 절단됨), H쇄의 N 말단측 약 절반과 L쇄 전체가 디술피드 결합(S-S 결합)으로 결합한, 분자량 약 5만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.
F(ab')2는, IgG를 단백질 분해효소 펩신으로 처리하여 얻어지는 단편 중 (H쇄의 234번째 아미노산 잔기에서 절단됨), Fab가 힌지 영역의 S-S 결합을 통해 결합된 것보다 약간 큰, 분자량 약 10만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.
Fab'는, 상기 F(ab')2의 힌지 영역의 S-S 결합을 절단한, 분자량 약 5만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.
scFv는, 1개의 VH와 1개의 VL을 4개의 Gly 및 1개의 Ser 잔기를 포함하는 링커(G4S)를 임의의 개수 연결시킨 링커 펩티드 등의 적당한 펩티드 링커(P)를 사용하여 연결한, VH-P-VL 내지는 VL-P-VH 폴리펩티드로, 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.
Diabody는, 항원 결합 특이성이 동일하거나 또는 다른 scFv가 2량체를 형성한 항체 단편으로, 동일한 항원에 대한 2가의 항원 결합 활성 또는 다른 항원에 대한 특이적인 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.
dsFv는, VH 및 VL 중 각각 1 아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 치환한 폴리펩티드를 해당 시스테인 잔기 사이의 S-S 결합을 통해 결합시킨 것을 말한다.
CDR을 포함하는 펩티드는, VH 또는 VL의 CDR의 적어도 1 영역 이상을 포함하여 구성된다. 복수개의 CDR을 포함하는 펩티드는, CDR끼리를 직접 또는 적당한 펩티드 링커를 통해 결합시킬 수 있다. 본 발명의 개변 항체의 VH 및 VL의 CDR을 코딩하는 DNA를 구축하고, 해당 DNA를 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하여, 해당 발현 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜, 제조할 수 있다. 또한, CDR을 포함하는 펩티드는, Fmoc법 또는 tBoc법 등의 화학 합성법에 의해 제조할 수도 있다.
본 발명의 모노클로날 항체에는, 본 발명의 인간 Gas6에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그의 항체 단편에 방사성 동위 원소, 저분자 약제, 고분자 약제, 단백질 또는 항체 의약 등을 화학적 또는 유전자 공학적으로 결합시킨 항체의 유도체를 포함한다.
항체의 유도체는, 본 발명의 인간 Gas6에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그의 항체 단편의 H쇄 또는 L쇄의 N 말단측, C 말단측, 항체 분자 중의 적당한 치환기 또는 측쇄, 및 당쇄 등에, 방사성 동위 원소, 저분자 약제, 고분자 약제, 면역 부활제, 단백질, 항체 의약 또는 핵산 의약 등을 화학적 방법[항체 공학 입문, 치진쇼칸(1994)]에 의해 결합시킴으로써 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 인간 Gas6에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그의 항체 단편을 코딩하는 DNA와, 결합시키고자 하는 단백질 또는 항체 의약을 코딩하는 DNA를 연결시켜 발현 벡터에 삽입하여, 해당 발현 벡터를 적당한 숙주 세포에 도입하여, 발현시키는 유전자 공학적 방법으로부터 제조할 수 있다.
방사성 동위 원소로서는, 111In, 131I, 125I, 90Y, 64Cu, 99Tc, 77Lu 또는 211At 등을 들 수 있다. 방사성 동위 원소는, 클로라민 T법 등에 의해 항체에 직접 결합시킬 수 있다. 또한, 방사성 동위 원소를 킬레이트하는 물질을 항체에 결합시켜도 된다. 킬레이트제로서는, 1-이소티오시아네이트벤질-3-메틸디에틸렌트리아민펜타아세트산(MX-DTPA) 등을 들 수 있다.
저분자 약제로서는, 알킬화제, 니트로소우레아제, 대사 길항제, 항생 물질, 식물 알칼로이드, 토포이소메라아제 저해제, 호르몬 요법제, 호르몬 길항제, 아로마타아제 저해제, P당단백 저해제, 백금 착체 유도체, M기 저해제, 또는 키나아제 저해제 등의 항암제[임상 종양학, 암과 화학요법사(1996)], 또는 히드로코르티손, 프레드니손 등의 스테로이드제, 아스피린, 인도메타신 등의 비스테로이드제, 금 티오말레이트, 페니실라민 등의 면역 조절제, 사이클로포스파미드, 아자티오프린 등의 면역 제어제, 말레산클로르페니라민, 또는 클레마스틴과 같은 항히스타민제 등의 항염증제[염증과 항염증 요법, 의치약 출판 주식회사(1982)] 등을 들 수 있다.
항암제로서는, 아미포스틴(에티올), 시스플라틴, 다카르바진(DTIC), 닥티노마이신, 메클로레타민(나이트로젠 머스타드), 스트렙토조신, 시클로포스파미드, 이포스파미드, 카르무스틴(BCNU), 로무스틴(CCNU), 독소루비신(아드리아마이신), 에피루비신, 겜시타빈(겜자르), 다우노루비신, 프로카르바진, 마이토마이신, 시타라빈, 에토포시드, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 플루오로우라실, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 블레오마이신, 다우노마이신, 페플로마이신, 에스트라무스틴, 파클리탁셀(탁솔), 도세탁셀(탁소테레), 알데스류킨, 아스파라기나아제, 부술판, 카르보플라틴, 옥살리플라틴, 네다플라틴, 클라드리빈, 캄토테신, 10-히드록시-7-에틸-캄토테신(SN38), 플록스우리딘, 플루다라빈, 히드록시우레아, 이다루비신, 메스나, 이리노테칸(CPT-11), 노기테칸, 미톡산트론, 토포테칸, 류프롤리드, 메게스트롤, 멜팔란, 머캅토푸린, 히드록시카르바미드, 플리카마이신, 미토탄, 페가스파르가아제, 펜토스타틴, 피포브로만, 타목시펜, 고세렐린, 류프롤레닌, 플루타미드, 테니포시드, 테스토락톤, 티오구아닌, 티오테파, 우라실머스타드, 비노렐빈, 클로람부실, 히드로코르티손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 빈데신, 니무스틴, 세무스틴, 카페시타빈, 토무덱스, 아자시티딘, UFT, 옥살리플라틴, 게피티니브(이렛사), 이마티니브(STI571), 에를로티니브, FMS-like tyrosine kinase 3(FMS-유사 티로신 키나아제 3; Flt3) 저해제, vascular endothelial growth factor receptor(혈관 내피 성장 인자 수용체; VEGFR) 저해제, fibroblast growth factor receptor(섬유모세포 성장 인자 수용체; FGFR) 저해제, 이렛사, 타세바 등의 epidermal growth factor receptor(표피 성장 인자; EGFR) 저해제, 라디시콜, 17-알릴아미노-17-데메톡시겔다나마이신, 라파마이신, 암사크린, 올-트랜스레티노산, 탈리도마이드, 레날리도마이드, 아나스트로졸, 파드로졸, 레트로졸, 엑세메스탄, 금 티오말레이트, D-페니실라민, 부실라민, 아자티오프린, 미조리빈, 시클로스포린, 라파마이신, 히드로코르티손, 벡사로텐(타그레틴), 타목시펜, 덱사메타손, 프로게스틴류, 에스트로겐류, 아나스트로졸(아리미덱스), 류플린, 아스피린, 인도메타신, 셀레콕시브, 페니실라민, 금 티오말레이트, 말레산클로르페니라민, 클로르페니라민, 클레마스틴, 트레티노인, 벡사로텐, 비소, 보르테조밉, 알로푸리놀, 칼리케아마이신, 이브리투모맙 티욱세탄, 타르그레틴, 오조가민, 클라리트로마이신, 류코보린, 케토코나졸, 아미노글루테티미드, 수라민, 메이탄시노이드 또는 그의 유도체 등을 들 수 있다.
저분자 약제와 항체를 결합시키는 방법으로서는, 글루타르알데히드를 통해 약제와 항체의 아미노기 사이를 결합시키는 방법, 또는 수용성 카르보디이미드를 통해 약제의 아미노기와 항체의 카르복실기를 결합시키는 방법 등을 들 수 있다.
고분자 약제로서는, 폴리에틸렌글리콜(이하, PEG라고 표기함), 알부민, 덱스트란, 폴리옥시에틸렌, 스티렌말레산 공중합체, 폴리비닐피롤리돈, 피란 공중합체, 또는 히드록시프로필메타크릴아미드 등을 들 수 있다. 이들 고분자 화합물을 항체 또는 그의 항체 단편에 결합시킴으로써, (1) 화학적, 물리적 또는 생물적인 다양한 인자에 대한 안정성의 향상, (2) 혈중 반감기의 현저한 연장, (3) 면역원성의 소실 또는 항체 생산의 억제 등의 효과가 기대된다[바이오 컨쥬게이트 의약품, 히로카와 쇼텐(1993)]. 예를 들어, PEG와 항체를 결합시키는 방법으로서는, PEG화 수식 시약과 반응시키는 방법 등을 들 수 있다[바이오 컨쥬게이트 의약품, 히로카와 쇼텐(1993)]. PEG화 수식 시약으로서는, 리신의 ε-아미노기에 대한 수식제(일본 특허 공개 소61-178926), 아스파라긴산 및 글루탐산의 카르복실기에 대한 수식제(일본 특허 공개 소56-23587), 또는 아르기닌의 구아니디노기에 대한 수식제(일본 특허 공개 평2-117920) 등을 들 수 있다.
면역 부활제로서는, 이뮤노아주반트로서 알려져 있는 천연물이어도 되고, 구체예로서는, 면역을 항진시키는 약제가, β(1→3)글루칸(렌티난, 쉬조필란) 또는 α갈락토실세라마이드(KRN7000) 등을 들 수 있다.
단백질로서는, NK 세포, 매크로파지, 또는 호중구 등의 면역 담당 세포를 활성화시키는 사이토카인 또는 증식 인자, 또는 독소 단백질 등을 들 수 있다.
사이토카인 또는 증식 인자로서는, 예를 들어 인터페론(이하, IFN이라고 기재함)-α, IFN -β, IFN -γ, 인터류킨(이하, IL이라고 기재함)-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립구/매크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF) 또는 매크로파지 콜로니 자극 인자(M-CSF) 등을 들 수 있다. 독소 단백질로서는, 리신, 디프테리아 톡신 또는 ONTAK 등을 들 수 있고, 독성을 조절하기 위해 단백질에 변이를 도입한 단백 독소도 포함된다.
항체 의약으로서는, 항체의 결합에 의해 아폽토시스가 유도되는 항원, 종양의 병태 형성에 관계되는 항원 또는 면역 기능을 조절하는 항원, 병변 부위의 혈관 신생에 관여하는 항원에 대한 항체를 들 수 있다.
항체의 결합에 의해 아폽토시스가 유도되는 항원으로서는, cluster of differentiation(분화 클러스터; 이하, CD라고 기재함) 19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80(B7.1), CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85, CD86(B7.2), human leukocyte antigen(인간 백혈구 항원; HLA)-Class II 또는 Epidermal Growth Factor Receptor(EGFR) 등을 들 수 있다.
종양의 병태 형성에 관계되는 항원 또는 면역 기능을 조절하는 항체의 항원으로서는, CD4, CD40, CD40 리간드, B7 패밀리 분자(CD80, CD86, CD274, B7-DC, B7-H2, B7-H3 또는 B7-H4), B7 패밀리 분자의 리간드(CD28, CTLA-4, ICOS, PD-1 또는 BTLA), OX-40, OX-40 리간드, CD137, tumor necrosis factor(종양 괴사 인자; TNF) 수용체 패밀리 분자(DR4, DR5, TNFR1 또는 TNFR2), TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor(TNF-관련 아폽토시스-유도 리간드 수용체; TRAIL) 패밀리 분자, TRAIL 패밀리 분자의 수용체 패밀리(TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3 또는 TRAIL-R4), receptor activator of nuclear factor kappa B ligand(핵 인자 카파 B 리간드의 수용체 활성자; RANK), RANK 리간드, CD25, 엽산 수용체, 사이토카인[IL-1α, IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, transforming growth factor(형질전환 성장 인자; TGF) β, 또는 TNFα 등], 이들 사이토카인의 수용체, 케모카인(SLC, ELC, I-309, TARC, MDC, 또는 CTACK 등), 또는 이들 케모카인의 수용체를 들 수 있다.
병변 부위의 혈관 신생을 저해하는 항체의 항원으로서는, vascular endothelial growth factor(혈관 내피 성장 인자 수용체;VEGF), angiopoietin(안지오포이에틴), fibroblast growth factor(섬유모세포 성장 인자 수용체; FGF), EGF, hepatocyte growth factor(간세포 성장 인자; HGF), platelet-derived growth factor(혈소판-유래 성장 인자; PDGF), insulin-like growth factor(인슐린-유사 성장 인자; IGF), erythropoietin(에리트로포이에틴; EPO), TGFβ, IL-8, ephrin(에프린), SDF-1, 또는 이들의 수용체 등을 들 수 있다.
단백질 또는 항체 의약과의 융합 항체는, 모노클로날 항체 또는 항체 단편을 코딩하는 cDNA에 단백질 또는 항체 의약에 포함되는 항체를 코딩하는 cDNA를 연결시켜, 융합 항체를 코딩하는 DNA를 구축하고, 해당 DNA를 원핵 생물 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하여, 해당 발현 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜, 융합 항체를 제조할 수 있다.
핵산 의약으로서는, 유전자의 기능을 제어함으로써 생체에 작용하는 small interference ribonucleic acid(소형 간섭 리보핵산; siRNA)나 microRNA 등의 핵산을 포함하는 의약품을 들 수 있다. 예를 들어, Th17 세포의 마스터 전사 인자 RORγt를 억제하는 핵산 의약과의 컨쥬게이트를 생각할 수 있다.
본 발명의 항체 유도체를 검출 방법, 측정 방법 또는 진단 방법에 사용하는 경우, 또는 본 발명의 항체 유도체를 검출용 시약, 측정용 시약 또는 진단약으로서 사용하는 경우에, 당해 항체에 결합하는 약제로서는, 통상의 면역학적 검출 또는 측정법에서 사용되는 표지체를 들 수 있다. 표지체로서는, 알칼리 포스파타아제, 퍼옥시다아제 또는 루시페라아제 등의 효소, 아크리디늄에스테르, 또는 로핀 등의 발광 물질, 또는 플루오레세인(FITC), 또는 테트라메틸로다민이소티오시아네이트(RITC) 등의 형광 물질 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명은, 인간 Gas6에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그의 항체 단편을 유효 성분으로서 함유하는, 인간 Gas6 관련 질환의 치료약에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 인간 Gas6에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그의 항체 단편을 투여하는 것을 포함하는, 인간 Gas6 관련 질환의 치료 방법에 관한 것이다.
인간 Gas6 관련 질환으로서는, 인간 Gas6 또는 인간 Gas6 수용체가 관여하는 질환이면 어떠한 것이어도 되고, 예를 들어 신장 질환이나 암 질환을 들 수 있다. 신장 질환으로서는, 사구체 신장염, IgA 신증, 당뇨병성 신증 등을 들 수 있다. 사구체 신장염으로서는, 진행성 사구체 신장염, 메산지움 증식성 사구체 신장염 등을 들 수 있다. 또한, 암 질환으로서 구체적으로는, 폐암, 유방암, 난소암, 전립선암, 췌장암, 신장암, 교모세포종 등을 들 수 있다. 다른 질환으로서는, 혈전 색전증, 허혈성 질환, 정맥 혈전 색전증, 동맥 혈전증, 정맥 혈전증, 폐한전증, 재협착, 당뇨병성 혈관 장애 또는 동종 이식 아테롬성 동맥 경화증 등을 들 수 있다.
본 발명의 항체 또는 해당 항체 단편을 함유하는 치료제는, 유효 성분으로서의 해당 항체 또는 해당 항체 단편만을 포함하는 것이어도 되지만, 통상은 약리학적으로 허용되는 1 이상의 담체와 함께 혼합하여, 제제학의 기술 분야에 있어서 공지된 임의의 방법에 의해 제조한 의약 제제로서 제공하는 것이 바람직하다.
투여 경로는, 치료시에 가장 효과적인 것을 사용하는 것이 바람직하고, 경구 투여 또는 구강 내, 기도 내, 직장 내, 피하, 근육 내 또는 정맥 내 등의 비경구 투여를 들 수 있고, 바람직하게는 정맥 내 투여를 들 수 있다. 투여 형태로서는, 분무제, 캡슐제, 정제, 산제, 과립제, 시럽제, 유제, 좌제, 주사제, 연고 또는 테이프제 등을 들 수 있다.
투여량 또는 투여 횟수는, 목적으로 하는 치료 효과, 투여 방법, 치료 기간, 연령 및 체중 등에 따라서 상이하지만, 통상 성인 1일당 10μg/kg 내지 10mg/kg이다.
본 발명은 인간 Gas6에 결합하는 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 함유하는, Gas6의 검출 또는 측정용 시약, 또는 인간 Gas6에 결합하는 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 사용한 Gas6의 검출 또는 측정 방법에 관한 것이다. 본 발명에 있어서 인간 Gas6을 검출 또는 측정하는 방법으로서는, 임의의 공지된 방법을 들 수 있다. 예를 들어, 면역학적 검출 또는 측정 방법 등을 들 수 있다.
면역학적 검출 또는 측정 방법이란, 표지를 실시한 항원 또는 항체를 사용하여, 항체량 또는 항원량을 검출 또는 측정하는 방법이다. 면역학적 검출 또는 측정 방법으로서는, 방사성 물질 표지 면역 항체법(RIA), 효소 면역 측정법(EIA 또는 ELISA), 형광 면역 측정법(FIA), 발광 면역 측정법(luminescent immunoassay), 웨스턴 블롯법 또는 물리 화학적 방법 등을 들 수 있다.
본 발명은 인간 Gas6에 결합하는 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 유효 성분으로서 함유하는, Gas6 관련 질환의 진단약, 또는 인간 Gas6에 결합하는 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 사용하여 Gas6의 검출 또는 측정을 행하는 것을 포함하는, Gas6 관련 질환의 진단 방법에 관한 것이다. 본 발명의 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 사용하여, 상기 방법에 따라서 인간 Gas6이 발현한 세포를 검출 또는 측정함으로써, 인간 Gas6이 관련되는 질환을 진단할 수 있다.
본 발명에 있어서 인간 Gas6을 검출 또는 측정하는 대상이 되는 생체 시료로서는, 조직, 세포, 혈액, 혈장, 혈청, 췌액, 오줌, 분변, 조직액 또는 배양액 등, 인간 Gas6 또는 인간 Gas6이 발현하고 있는 세포를 포함할 가능성이 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다.
본 발명의 모노클로날 항체 또는 그의 항체 단편을 함유하는 진단약은, 목적으로 하는 진단법에 따라서, 항원 항체 반응을 행하기 위한 시약, 해당 반응의 검출용 시약을 포함해도 된다. 항원 항체 반응을 행하기 위한 시약으로서는, 완충제, 염 등을 들 수 있다. 검출용 시약으로서는, 해당 모노클로날 항체 또는 그의 항체 단편을 인식하는 표지된 이차 항체, 또는 표지에 대응한 기질 등의 통상의 면역학적 검출 또는 측정법에 사용되는 시약을 들 수 있다.
또한, 본 발명은 Gas6 관련 질환의 치료약 또는 진단약의 제조를 위한, 항인간 Gas6 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편의 용도에 관한 것이다.
이하에, 본 발명의 항체의 제조 방법, 질환의 치료 방법 및 질환의 진단 방법에 대해서, 구체적으로 설명한다.
1. 항체의 제조 방법
(1) 항원의 조제
항원이 되는 인간 Gas6은, 인간 Gas6 전체 길이 또는 그의 부분 길이를 코딩하는 cDNA를 포함하는 발현 벡터를, 대장균, 효모, 곤충 세포 또는 동물 세포 등에 도입한 인간 Gas6 발현 세포로부터 정제함으로써 얻어진다. 또한, 인간 Gas6을 다량으로 발현하고 있는 각종 인간 세포주, 인간 세포, 인간 조직 등으로부터 인간 Gas6을 정제함으로써도 얻을 수 있다. 또한, Fmoc법 또는 tBoc법 등의 화학 합성법에 의해 인간 Gas6의 부분 서열을 갖는 합성 펩티드를 조제하여, 항원으로 사용할 수도 있다. 인간 Gas6 또는 인간 Gas6의 부분 서열을 갖는 합성 펩티드에는, C 말단 또는 N 말단에 FLAG 또는 His 등의 공지된 태그가 부가되어 있어도 된다.
본 발명에서 사용되는 인간 Gas6은, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)나 Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons(1987-1997) 등에 기재된 방법 등을 사용하여, 예를 들어 이하의 방법에 의해, 해당 인간 Gas6을 코딩하는 DNA를 숙주 세포 중에서 발현시켜, 제조할 수 있다.
먼저, 인간 Gas6을 코딩하는 부분을 포함하는 완전 길이 cDNA를 적당한 발현 벡터의 프로모터의 하류에 삽입함으로써, 재조합 벡터를 제작한다. 상기 완전 길이 cDNA 대신에, 완전 길이 cDNA를 바탕으로 하여 조제된, 폴리펩티드를 코딩하는 부분을 포함하는 적당한 길이의 DNA 단편을 사용해도 된다. 이어서, 얻어진 해당 재조합 벡터를, 해당 발현 벡터에 적합한 숙주 세포에 도입함으로써, 폴리펩티드를 생산하는 형질 전환체를 얻을 수 있다.
발현 벡터로서는, 사용되는 숙주 세포에 있어서의 자율 복제 또는 염색체 중으로의 조립이 가능하여, 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 전사할 수 있는 위치에, 적당한 프로모터를 함유하고 있는 것이면 모두 사용할 수 있다.
숙주 세포로서는, 대장균 등의 에스케리키아(Escherichia)속 등에 속하는 미생물, 효모, 곤충 세포 또는 동물 세포 등, 목적으로 하는 유전자를 발현할 수 있는 것이면 모두 사용할 수 있다.
대장균 등의 원핵 생물을 숙주 세포로서 사용하는 경우, 재조합 벡터는, 원핵 생물 중에서 자율 복제가 가능한 동시에, 프로모터, 리보솜 결합 서열, 인간 Gas6을 코딩하는 부분을 포함하는 DNA, 및 전사 종결 서열을 포함하는 벡터인 것이 바람직하다. 또한, 해당 재조합 벡터에는, 전사 종결 서열은 반드시 필요한 것은 아니지만, 구조 유전자의 바로 아래에 전사 종결 서열을 배치하는 것이 바람직하다. 또한, 해당 재조합 벡터에는, 프로모터를 제어하는 유전자를 포함하고 있어도 된다.
해당 재조합 벡터로서는, 리보솜 결합 서열인 샤인ㆍ달가노 서열(SD 서열이라고도 함)과 개시 코돈의 사이를 적당한 거리(예를 들어 6 내지 18 염기)로 조절한 플라스미드를 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 해당 인간 Gas6을 코딩하는 DNA의 염기 서열로서는, 숙주 내에서의 발현에 최적인 코돈이 되도록 염기를 치환할 수 있고, 이것에 의해 목적으로 하는 인간 Gas6의 생산율을 향상시킬 수 있다.
발현 벡터로서는, 사용되는 숙주 세포 중에서 기능을 발휘할 수 있는 것이면 모두 사용할 수 있는데, 예를 들어, pBTrp2, pBTac1, pBTac2(이상, 로슈ㆍ다이아그노스틱스사제), pKK233-2(파마시아사제), pSE280(인비트로젠사제), pGEMEX-1(프로메가사제), pQE-8(퀴아젠사제), pKYP10(일본 특허 공개 소58-110600), pKYP200[Agricultural Biological Chemistry, 48, 669(1984)], pLSA1[Agric. Biol. Chem., 53, 277(1989)], pGEL1[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306(1985)], pBluescript II SK(-)(스트라타진사제), pTrs30[대장균 JM109/pTrS30(FERM BP-5407)으로부터 조제], pTrs32[대장균 JM109/pTrS32(FERM BP-5408)로부터 조제], pGHA2[대장균 IGHA2(FERM BP-400)로부터 조제, 일본 특허 공개 소60-221091], pGKA2[대장균 IGKA2(FERM BP-6798)로부터 조제, 일본 특허 공개 소60-221091], pTerm2(US4686191, US4939094, US5160735), pSupex, pUB110, pTP5, pC194, pEG400[J. Bacteriol., 172, 2392(1990)], pGEX(파마시아사제), pET 시스템(노바젠사제), 또는 pME18SFL3 등을 들 수 있다.
프로모터로서는, 사용되는 숙주 세포 중에서 기능을 발휘할 수 있는 것이면 어떠한 것이어도 된다. 예를 들어, trp 프로모터(Ptrp), lac 프로모터, PL 프로모터, PR 프로모터 또는 T7 프로모터 등의, 대장균이나 파지 등에서 유래되는 프로모터를 들 수 있다. 또한, Ptrp를 2개 직렬시킨 탠덤 프로모터, tac 프로모터, lacT7 프로모터 또는 let I 프로모터 등의 인위적으로 설계 개변된 프로모터 등도 사용할 수 있다.
숙주 세포로서는, 예를 들어 대장균 XL1-Blue, 대장균 XL2-Blue, 대장균 DH1, 대장균 MC1000, 대장균 KY3276, 대장균 W1485, 대장균 JM109, 대장균 HB101, 대장균 No.49, 대장균 W3110, 대장균 NY49 또는 대장균 DH5α 등을 들 수 있다.
숙주 세포로의 재조합 벡터의 도입 방법으로서는, 사용되는 숙주 세포에 DNA를 도입하는 방법이면 모두 사용할 수 있고, 예를 들어, 칼슘 이온을 사용하는 방법[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110(1972), Gene, 17, 107(1982), Molecular & General Genetics, 168, 111(1979)]을 들 수 있다.
동물 세포를 숙주로서 사용하는 경우, 발현 벡터로서는, 동물 세포 중에서 기능을 발휘할 수 있는 것이면 모두 사용할 수 있고, 예를 들어, pcDNAI, pCDM8(후나코시사제), pAGE107[일본 특허 공개 평3-22979; Cytotechnology, 3, 133(1990)], pAS3-3(일본 특허 공개 평2-227075), pCDM8[Nature, 329, 840(1987)], pcDNAI/Amp(인비트로젠사제), pcDNA3.1(인비트로젠사제), pREP4(인비트로젠사제), pAGE103[J. Biochemistry, 101, 1307(1987)], pAGE210, pME18SFL3, pKANTEX93(WO97/10354), N5KG1val(US6, 001, 358), INPEP4(Biogen-IDEC사제) 및 트랜스포존 벡터(WO2010/143698) 등을 들 수 있다.
프로모터로서는, 동물 세포 중에서 기능을 발휘할 수 있는 것이면 모두 사용할 수 있는데, 예를 들어, 사이토메갈로 바이러스(CMV)의 극초기(immediate early; IE) 유전자의 프로모터, SV40의 초기 프로모터, 레트로바이러스의 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 히트 쇼크 프로모터, SRα 프로모터, 또는 몰로니 마우스 백혈병 바이러스의 프로모터 또는 인핸서를 들 수 있다. 또한, 인간 CMV의 IE 유전자의 인핸서를 프로모터와 함께 사용해도 된다.
숙주 세포로서는, 인간 백혈병 세포 Namalwa 세포, 원숭이 세포 COS 세포, 차이니즈ㆍ햄스터 난소 세포 CHO 세포(Journal of Experimental Medicine, 108, 945(1958); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 1275(1968); Genetics, 55, 513(1968); Chromosoma, 41, 129(1973); Methods in Cell Science, 18, 115(1996); Radiation Research, 148, 260(1997); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216(1980); Proc. Natl. Acad. Sci., 60, 1275(1968); Cell, 6, 121(1975); Molecular Cell Genetics, Appendix I, II(pp.883-900);), 디히드로엽산 환원효소 유전자(이하, dhfr이라고 표기함)가 결손된 CHO 세포(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216(1980)), CHO-K1(ATCC CCL-61), DUkXB11(ATCC CCL-9096), Pro-5(ATCC CCL-1781), CHO-S(Life Technologies, Cat#11619), Pro-3, 래트 미엘로마 세포YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(또는 YB2/0이라고도 함), 마우스 미엘로마 세포 NSO, 마우스 미엘로마 세포 SP2/0-Ag14, 시리안 햄스터 세포 BHK 또는 HBT5637(일본 특허 공개 소63-000299) 등을 들 수 있다.
숙주 세포로의 재조합 벡터의 도입 방법으로서는, 동물 세포에 DNA를 도입하는 방법이면 모두 사용할 수 있고, 예를 들어, 일렉트로포레이션법[Cytotechnology, 3, 133(1990)], 인산칼슘법(일본 특허 공개 평2-227075) 또는 리포펙션법[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413(1987)] 등을 들 수 있다.
이상과 같이 하여 얻어지는 인간 Gas6을 코딩하는 DNA를 조립한 재조합 벡터를 보유하는 미생물, 또는 동물 세포 등의 유래의 형질 전환체를 배지 중에서 배양하고, 배양액 중에 해당 인간 Gas6을 생성 축적시키고, 해당 배양액으로부터 채취함으로써, 인간 Gas6을 제조할 수 있다. 해당 형질 전환체를 배지 중에서 배양하는 방법은, 숙주의 배양에 사용되는 통상의 방법에 따라서 행할 수 있다.
진핵 생물 유래의 세포에서 발현시켰을 경우에는, 당 또는 당쇄가 부가된 인간 Gas6을 얻을 수 있다.
또한, Gas6의 Gla 도메인에 γ-카르복시 글루탐산 잔기(Gla)가 결합된 Gas6 단백질을 제작하기 위해서, 글루탐산 잔기의 γ-카르복실화에 관여하는 효소인 비타민 K 에폭시드 환원효소(VKOR)나 γ-글루타밀 카르복실라아제(GGCX)를 도입한 세포를 사용할 수도 있다. 바람직하게는, 환원형 비타민 K의 유도를 촉진시키기 위해 비타민 K 에폭시드 환원효소 복합 서브유닛 1(VKORC1) 및 GGCX의 양쪽을 도입한 세포를 사용하는 것이 바람직하다.
또한, VKOR, VKORC1 및 GGCX로서는, 효율적으로 Gas6에 Gla 잔기를 도입할 수 있으면 어느 효소여도 되고, 인간, 래트, 마우스 등 어느 종의 효소를 사용해도 되며, 사용되는 숙주 세포에 따라서 선택하여 사용할 수 있다. 바람직하게는, 인간 또는 래트의 VKORC1 및 GGCX의 유전자를 도입한 세포를 사용하여, Gla화된 Gas6을 제작할 수 있다.
유도성 프로모터를 사용한 재조합 벡터로 형질 전환한 미생물을 배양할 때에는, 필요에 따라서 인듀서를 배지에 첨가해도 된다. 예를 들어, lac 프로모터를 사용한 재조합 벡터로 형질 전환한 미생물을 배양할 경우에는 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 등을, trp 프로모터를 사용한 재조합 벡터로 형질 전환한 미생물을 배양할 경우에는 인돌아크릴산 등을 배지에 첨가해도 된다.
동물 세포를 숙주로 하여 얻어진 형질 전환체를 배양하는 배지로서는, 일반적으로 사용되고 있는 RPMI1640 배지[The Journal of the American Medical Association, 199, 519(1967)], Eagle의 MEM 배지[Science, 122, 501(1952)], 둘베코(Dulbecco) 개변 MEM 배지[Virology, 8, 396(1959)], 199 배지[Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1(1950)], Iscove's Modified Dulbecco's Medium(이스코브 개변 둘베코 배지; IMDM) 배지, 또는 이것들 배지에 소태아 혈청(FBS) 등을 첨가한 배지 등을 들 수 있다. 배양은, 통상 pH 6 내지 8, 30 내지 40℃, 5％ CO2 존재 하 등의 조건 하에서 1 내지 7일간 행한다. 또한, 배양 중에 필요에 따라서, 카나마이신, 페니실린 등의 항생 물질을 배지에 첨가해도 된다.
인간 Gas6을 코딩하는 유전자의 발현 방법으로서는, 직접 발현 이외에, 분비 생산 또는 융합 단백질 발현 등의 방법[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]을 사용할 수 있다.
인간 Gas6의 생산 방법으로서는, 숙주 세포 내에 생산시키는 방법, 숙주 세포 외에 분비시키는 방법, 또는 숙주 세포 외막 상에 생산시키는 방법이 있고, 사용되는 숙주 세포나, 생산시키는 인간 Gas6의 구조를 바꿈으로써, 적절한 방법을 선택할 수 있다.
인간 Gas6이 숙주 세포 내 또는 숙주 세포 외막 상에 생산되는 경우, 폴슨 등의 방법[J. Biol. Chem., 264, 17619(1989)], 로우 등의 방법[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227(1989), Genes Develop., 4, 1288(1990)], 일본 특허 공개 평05-336963 또는 WO94/23021 등에 기재된 방법을 사용함으로써, 인간 Gas6을 숙주 세포 외로 적극적으로 분비시킬 수 있다.
또한, 디히드로엽산 환원효소 유전자 등을 사용한 유전자 증폭계(일본 특허 공개 평2-227075)를 이용하여 인간 Gas6의 생산량을 상승시킬 수도 있다.
얻어진 인간 Gas6은, 예를 들어 이하와 같이 하여 단리, 정제할 수 있다.
인간 Gas6이 세포 내에 용해 상태로 발현한 경우에는, 배양 종료 후에 세포를 원심 분리에 의해 회수하고, 수계 완충액에 현탁 후, 초음파 파쇄기, 프렌치 프레스, 맨톤-가울린(Manton-Gaulin) 호모게나이저 또는 다이노 밀 등을 사용하여 세포를 파쇄하여, 무세포 추출액을 얻는다. 해당 무세포 추출액을 원심 분리함으로써 얻어지는 상청으로부터, 통상의 단백질 단리 정제법, 즉, 용매 추출법, 황산암모늄 등에 의한 염석법, 탈염법, 유기 용매에 의한 침전법, 디에틸아미노에틸(DEAE)-세파로오스, DIAION HPA-75(미쯔비시 가가꾸사제) 등의 레진을 사용한 음이온 교환 크로마토그래피법, S-Sepharose(S-세파로오스) FF(파마시아사제) 등의 레진을 사용한 양이온 교환 크로마토그래피법, 부틸세파로오스, 페닐세파로오스 등의 레진을 사용한 소수성 크로마토그래피법, 분자체를 사용한 겔 여과법, 친화성 크로마토그래피법, 크로마토포커싱법, 또는 등전점 전기 영동 등의 전기 영동법 등의 방법을 단독 또는 조합하여 사용하여, 정제 표품을 얻을 수 있다.
인간 Gas6이 세포 내에 불용체를 형성하여 발현한 경우에는, 상기와 동일하게 세포를 회수 후 파쇄하고, 원심 분리를 행함으로써, 침전 분획으로서 해당 인간 Gas6의 불용체를 회수한다. 회수한 해당 인간 Gas6의 불용체를 단백질 변성제로 가용화한다. 해당 가용화 액을 희석 또는 투석함으로써, 해당 인간 Gas6을 정상적인 입체 구조로 되돌린 후, 상기와 동일한 단리 정제법에 의해 폴리펩티드의 정제 표품을 얻을 수 있다.
인간 Gas6 또는 그의 당 수식체 등의 유도체가 세포 외로 분비된 경우에는, 배양 상청에 있어서 해당 인간 Gas6 또는 그의 당 수식체 등의 유도체를 회수할 수 있다. 해당 배양물을 상기와 동일하게 원심 분리 등의 방법에 의해 처리함으로써 가용성 분획을 취득하고, 해당 가용성 분획으로부터, 상기와 동일한 단리 정제법을 사용함으로써, 정제 표품을 얻을 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서 사용되는 인간 Gas6은, Fmoc법 또는 tBoc법 등의 화학 합성법에 의해서도 제조할 수 있다. 또한, 어드반스트 켐텍사제, 퍼킨ㆍ엘머사제, 파마시아사제, 프로테인 테크놀로지 인스트루먼트사제, 신세셀-베가(Synthecell-Vega)사제, 퍼셉티브사제, 또는 시마즈 세이사꾸쇼사제 등의 펩티드 합성기를 이용하여 화학 합성할 수도 있다.
(2) 동물의 면역과 융합용 항체 생산 세포의 조제
3 내지 20주령의 마우스, 래트 또는 햄스터 등의 동물에, (1)에서 얻어지는 항원을 면역시켜, 그 동물의 비장, 림프절, 말초혈 중의 항체 생산 세포를 채취한다. 또한, 마우스 Gas6 녹아웃 마우스를 피면역 동물로서 사용할 수도 있다.
면역은, 동물의 피하 또는 정맥 내 또는 복강 내에, 예를 들어 프로인트의 완전 아주반트, 또는 수산화알루미늄 겔과 백일해균 백신 등의 적당한 아주반트와 함께 항원을 투여함으로써 행한다. 항원이 부분 펩티드일 경우에는, BSA(소혈청 알부민), 또는 KLH(키홀 림펫 헤모시아닌(Key hole Limpet hemocyanin)) 등의 캐리어 단백질과 컨쥬게이트를 제작하고, 이것을 면역원으로서 사용한다.
항원의 투여는, 1회째 투여 후, 1 내지 2주일 간격으로 5 내지 10회 행한다. 각 투여 후 3 내지 7일째에 안저 정맥총으로부터 채혈하고, 그 혈청의 항체값을 효소 면역 측정법[Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)] 등을 사용하여 측정한다. 면역에 사용한 항원에 대하여 그 혈청이 충분한 항체값을 나타낸 동물을 융합용 항체 생산 세포의 공급원으로 한다.
항원의 최종 투여 후 3 내지 7일째에, 면역시킨 동물로부터 비장 등의 항체 생산 세포를 포함하는 조직을 적출하고, 항체 생산 세포를 채취한다. 비장 세포를 사용하는 경우에는, 비장을 세단하여 푼 후, 원심 분리하고, 또한 적혈구를 제거하여 융합용 항체 생산 세포를 취득한다.
(3) 골수종 세포의 조제
골수종 세포로서는, 마우스로부터 얻어진 주화 세포를 사용하고, 예를 들어 8-아자구아닌 내성 마우스(BALB/c 유래) 골수종 세포주 P3-X63Ag8-U1(P3-U1)[Current Topics in Microbiology and Immunology, 18, 1(1978)], P3-NS1/1-Ag41(NS-1)[European J. Immunology, 6, 511(1976)], SP2/0-Ag14(SP-2)[Nature, 276, 269(1978)], P3-X63-Ag8653(653)[J. Immunology, 123, 1548(1979)], 또는 P3-X63-Ag8(X63)[Nature, 256, 495(1975)] 등이 사용된다.
해당 골수종 세포는, 정상 배지[글루타민, 2-머캅토에탄올, 겐타마이신, FBS 및 8-아자구아닌을 첨가한 RPMI1640 배지]에서 계대하고, 세포 융합의 3 내지 4일 전에 정상 배지에 계대하여, 융합 당일 2×107개 이상의 세포수를 확보한다.
(4) 세포 융합과 모노클로날 항체 생산 하이브리도마의 조제
(2)에서 얻어지는 융합용 항체 생산 세포와 (3)에서 얻어지는 골수종 세포를 최소 필수 배지(Minimum Essential Medium; MEM) 배지 또는 PBS(인산이나트륨 1.83g, 인산일칼륨 0.21g, 식염 7.65g, 증류수 1리터, pH 7.2)로 잘 세정하고, 세포수가, 융합용 항체 생산 세포:골수종 세포=5 내지 10:1이 되도록 혼합하고, 원심 분리한 후, 상청을 제거한다. 침전된 세포군을 잘 푼 후, 폴리에틸렌글리콜-1000(PEG-1000), MEM 배지 및 디메틸술폭시드의 혼합액을 37℃에서, 교반하면서 첨가한다. 또한 1 내지 2분간마다 MEM 배지 1 내지 2mL를 몇 회 첨가한 후, MEM 배지를 첨가하여 전량이 50mL가 되도록 한다. 원심 분리 후, 상청을 제거한다. 침전된 세포군을 서서히 푼 후, 융합용 항체 생산 세포에 HAT 배지[히포크산틴, 티미딘 및 아미노프테린을 첨가한 정상 배지] 중에 서서히 세포를 현탁시킨다. 이 현탁액을 5％ CO2 인큐베이터 내, 37℃에서 7 내지 14일간 배양한다.
배양 후, 배양 상청의 일부를 빼내어, 후술하는 결합 측정 등의 하이브리도마의 선택 방법에 의해, 인간 Gas6을 포함하는 항원에 반응하고, 인간 Gas6을 포함하지 않은 항원에 반응하지 않는 세포군을 선택한다. 또한, 후술하는 경합 측정 등에 의해, 인간 Gas6과 Axl 등의 Gas6 수용체의 결합을 저해하는 항인간 Gas6 항체를 생산하는 하이브리도마 세포군을 선택한다. 이어서, 한계 희석법에 의해 클로닝을 행하여, 안정하며 강한 항체값이 확인된 것을 모노클로날 항체 생산 하이브리도마로서 선택한다.
(5) 정제 모노클로날 항체의 조제
프리스탄 처리[2,6,10,14-테트라메틸펜타데칸(Pristane) 0.5mL를 복강 내 투여하고, 2주일 사육함]된 8 내지 10주령의 마우스 또는 누드 마우스에, (4)에서 얻어지는 모노클로날 항체 생산 하이브리도마를 복강 내에 주사한다. 10 내지 21일만에 하이브리도마는 복수(復水) 암화(癌化)한다. 이 마우스로부터 복수를 채취하고, 원심 분리하여 고형분을 제거 후, 40 내지 50％ 황산암모늄으로 염석하고, 카프릴산 침전법, DEAE-세파로오스 칼럼, 단백질 A-칼럼 또는 겔 여과 칼럼에 의한 정제를 행하여, IgG 또는 IgM 분획을 모아, 정제 모노클로날 항체로 한다.
또한, (4)에서 얻어지는 모노클로날 항체 생산 하이브리도마를, 10％ FBS를 첨가한 RPMI1640 배지 등에서 배양한 후, 원심 분리에 의해 상청을 제거하고, Hybridoma(하이브리도마) SFM 배지에 현탁시켜, 3 내지 7일간 배양한다. 얻어진 세포 현탁액을 원심 분리하여, 얻어진 상청으로부터 단백질 A-칼럼 또는 단백질 G-칼럼에 의한 정제를 행하여, IgG 분획을 모아, 정제 모노클로날 항체를 얻을 수도 있다. 또한, Hybridoma SFM 배지에는 5％ 다이고 GF21을 첨가할 수도 있다.
항체의 서브클래스의 결정은, 서브클래스 타이핑 키트를 사용하여 효소 면역 측정법에 의해 행한다. 단백질량의 정량은, 로리법 또는 280nm에서의 흡광도로부터 산출한다.
(6) 모노클로날 항체의 선택
모노클로날 항체의 선택은 이하에 나타내는 효소 면역 측정법에 의한 결합 측정 또는 경합 측정 등에 의해 행한다. 이들 방법 이외에, Biacore(등록 상표)에 의한 Kinetics(키네틱스) 해석 등에 의해 모노클로날 항체를 선택할 수도 있다. 또한, 공지된 방법[The Prostate, 67, 1163(2007)]에 의해, 항체의 표적 항원을 동정함으로써 모노클로날 항체를 선택할 수도 있다.
(6-a) 결합 측정
항원으로서는, (1)에서 얻어지는 인간 Gas6을 코딩하는 cDNA를 포함하는 발현 벡터를 대장균, 효모, 곤충 세포 또는 동물 세포 등에 도입하여 얻어진 재조합 단백질, 또는 인간 조직으로부터 얻은 정제 폴리펩티드 또는 부분 펩티드 등을 사용한다. 항원이 재조합 단백질일 경우에는, FLAG 또는 His 등의 태그가 부가되어 있어도 된다. 항원이 부분 펩티드일 경우에는, BSA 또는 KLH 등의 캐리어 단백질과 컨쥬게이트를 제작하여, 이것을 사용한다.
항원을 96웰 플레이트 등의 플레이트에 분주하고, 고상화한 후, 제1 항체로서 혈청, 하이브리도마의 배양 상청 또는 정제 모노클로날 항체 등의 피검 물질을 분주하여, 반응시킨다. PBS 또는 PBS-Tween 등으로 잘 세정한 후, 제2 항체로서 비오틴, 효소, 화학 발광 물질 또는 방사선 화합물 등으로 표지한 항 이뮤노글로불린 항체를 분주하여 반응시킨다. PBS-Tween으로 잘 세정한 후, 제2 항체의 표지 물질에 따른 반응을 행하여, 면역원에 대하여 특이적으로 반응하는 모노클로날 항체를 선택한다.
또한, 본 발명의 인간 Gas6에 결합하는 모노클로날 항체가 결합하는 에피토프를 포함하는 에피토프에 결합하는 항체는, 상술한 결합 측정계에서 취득된 항체의 에피토프를 공지된 방법으로 동정하고, 동정한 에피토프를 포함하는 합성 펩티드 등을 제작하고, 면역시킴으로써 취득할 수 있다.
또한, 본 발명의 인간 Gas6에 결합하는 모노클로날 항체가 결합하는 에피토프와, 동일한 에피토프에 결합하는 항체는, 상술한 결합 측정계에서 취득된 항체의 에피토프를 동정하고, 동정한 에피토프의 부분적인 합성 펩티드, 또는 에피토프의 입체 구조에 의태(擬態)시킨 합성 펩티드 등을 제작하고, 면역시킴으로써 취득할 수 있다.
(6-b) 경합 측정
(1)에 기재된 방법에 준하여, 인간 Axl 세포 외 도메인과 인간 IgG1 중쇄 정상 영역 융합 단백질(hAxl-hFc)을 조정한다. hAxl-hFc는, 인간 Axl 세포 외 도메인과 IgG1 중쇄 정상 영역의 사이에 적당한 제한효소 인식 서열을 갖고 있어도 된다. 얻어진 hAxl-hFc를 96웰 플레이트에 분주하고, 고상화한다. 이어서, 하이브리도마 배양 상청 또는 정제 모노클로날 항체 등의 피검 물질 및 (1)에서 얻어지는 태그를 붙인 hGas6의 혼합 용액을 웰에 분주하여, 반응시킨다. PBS 또는 PBS-Tween 등으로 잘 세정한 후, 검출용 항체로서 비오틴, 효소, 화학 발광 물질 또는 방사선 화합물 등으로 표지한 상기 태그에 대한 항체를 분주하여 반응시킨다. PBS-Tween으로 잘 세정한 후, 검출용 항체의 표지 물질에 따른 반응을 행하여, hGas6과 hAxl-hFc의 결합을 저해하는 모노클로날 항체를 선택한다.
(6-c) Biacore(등록 상표)에 의한 키네틱스 해석
Biacore(등록 상표) T100을 사용하여, 항원과 피검 물질 사이의 결합에 있어서의 키네틱스를 측정하고, 그 결과를 기기 부속의 해석 소프트웨어로 해석한다. 항마우스 IgG 항체를 센서 칩 CM5에 아민 커플링법에 의해 고정시킨 후, 하이브리도마 배양 상청 또는 정제 모노클로날 항체 등의 피검 물질을 흘려, 적당량 결합시키고, 또한 농도 기지의 복수개 농도의 항원을 흘리고, 결합, 해리를 측정한다. 얻어진 데이터를 기기 부속의 소프트웨어를 사용하여, 1:1 결합 모델에 의해 키네틱스 해석을 행하고, 각종 파라미터를 취득한다. 또는, 인간 Gas6, 해당 부분 펩티드, 해당 부분 펩티드를 캐리어 단백질과 컨쥬게이팅시킨 것을 센서 칩 상에, 예를 들어 아민 커플링법에 의해 고정시킨 후, 농도 기지의 복수개 농도의 정제 모노클로날 항체를 흘리고, 결합 및 해리를 측정한다. 얻어진 데이터를 기기 부속의 소프트웨어를 사용하여, 2가 결합 모델에 의한 키네틱스 해석을 행하고, 각종 파라미터를 취득한다.
2. 유전자 재조합 항체의 제작
유전자 재조합 항체의 제작예로서, 이하에 인간형 키메라 항체 및 인간화 항체의 제작 방법을 나타낸다.
(1) 유전자 재조합 항체 발현용 벡터의 구축
유전자 재조합 항체 발현용 벡터는, 인간 항체의 CH 및 CL을 코딩하는 DNA가 조립된 동물 세포용 발현 벡터이며, 동물 세포용 발현 벡터에 인간 항체의 CH 및 CL을 코딩하는 DNA를 각각 클로닝함으로써 구축할 수 있다.
인간 항체의 C 영역은 임의의 인간 항체의 CH 및 CL을 사용할 수 있다. 예를 들어, 인간 항체의 γ1 서브클래스의 CH 및 κ 클래스의 CL 등을 사용한다. 인간 항체의 CH 및 CL을 코딩하는 DNA에는, cDNA를 사용하지만, 엑손과 인트론을 포함하는 염색체 DNA를 사용할 수도 있다. 동물 세포용 발현 벡터에는, 인간 항체의 C 영역을 코딩하는 유전자를 조립하여 발현할 수 있는 것이면 어떠한 것이라도 사용할 수 있다. 예를 들어, pAGE107[Cytotechnol., 3, 133(1990)], pAGE103[J. Biochem., 101, 1307(1987)〕, pHSG274[Gene, 27, 223(1984)], pKCR[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1527(1981)], pSG1bd2-4[Cytotechnol., 4, 173(1990)], 또는 pSE1UK1Sed1-3[Cytotechnol., 13, 79(1993)] 등을 사용한다. 동물 세포용 발현 벡터 중 프로모터와 인핸서에는, SV40의 초기 프로모터[J. Biochem., 101, 1307(1987)], 몰로니 마우스 백혈병 바이러스 LTR[Biochem. Biophys. Res. Commun., 149, 960(1987)] 또는 이뮤노글로불린 H쇄의 프로모터[Cell, 41, 479(1985)]와 인핸서[Cell, 33, 717(1983)] 등을 사용한다.
유전자 재조합 항체 발현용 벡터에는, 유전자 재조합 항체 발현 벡터의 구축 용이성, 동물 세포로의 도입 용이성, 동물 세포 내에서의 항체 H쇄 및 L쇄의 발현량의 밸런스가 균형을 이루는 등의 점에서, 항체 H쇄 및 L쇄가 동일 벡터 상에 존재하는 타입(탠덤형)의 유전자 재조합 항체 발현용 벡터[J. Immunol. Methods, 167, 271(1994)]를 사용하지만, 항체 H쇄 및 L쇄가 따로 따로의 벡터 상에 존재하는 타입을 사용할 수도 있다. 탠덤형 유전자 재조합 항체 발현용 벡터에는, pKANTEX93(WO97/10354), pEE18[Hybridoma, 17, 559(1998)] 등을 사용한다.
(2) 인간 이외의 동물 유래의 항체 V 영역을 코딩하는 cDNA의 취득 및 아미노산 서열의 해석
비인간 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA의 취득 및 아미노산 서열의 해석은 이하와 같이 하여 행할 수 있다.
비인간 항체를 생산하는 하이브리도마 세포로부터 mRNA를 추출하여, cDNA를 합성한다. 합성한 cDNA를 파지 또는 플라스미드 등의 벡터에 클로닝하여 cDNA 라이브러리를 제작한다. 해당 라이브러리로부터, 마우스 항체의 C 영역 부분 또는 V 영역 부분을 코딩하는 DNA를 프로브로서 사용하여, VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA를 갖는 재조합 파지 또는 재조합 플라스미드를 각각 단리한다. 재조합 파지 또는 재조합 플라스미드 상의 목적으로 하는 마우스 항체의 VH 또는 VL의 전체 염기 서열을 각각 결정하고, 염기 서열로부터 VH 또는 VL의 전체 아미노산 서열을 각각 추정한다.
비인간 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 제작하는 인간 이외의 동물에는, 마우스, 래트, 햄스터 또는 토끼 등을 사용하지만, 하이브리도마 세포를 제작하는 것이 가능하다면, 어떠한 동물도 사용할 수 있다.
하이브리도마 세포로부터의 전체 RNA의 조제에는, 티오시안산구아니딘-트리플루오로아세트산세슘법[Methods in Enzymol., 154, 3(1987)], 또는 RNA easy kit(퀴아젠사제) 등의 키트 등을 사용한다.
전체 RNA로부터의 mRNA의 조제에는, 올리고(dT) 고정화 셀룰로오스 칼럼법[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)], 또는 Oligo-dT30<Super> mRNA Purification(등록 상표) Kit(다카라바이오사제) 등의 키트 등을 사용한다. 또한, Fast Track mRNA Isolation(패스트 트랙 mRNA 단리)(등록 상표) Kit(인비트로젠사제), 또는 Quick Prep mRNA Purification(등록 상표) Kit(파마시아사제) 등의 키트를 사용하여 하이브리도마 세포로부터 mRNA를 조제할 수도 있다.
cDNA의 합성 및 cDNA 라이브러리의 제작에는, 공지된 방법[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989), Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1, John Wiley & Sons(1987-1997)], 또는 SuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning(인비트로젠사제), 또는 ZAP-cDNA Synthesis(등록 상표) Kit(스트라타진사제) 등의 키트 등을 사용한다.
cDNA 라이브러리의 제작시, 하이브리도마 세포로부터 추출한 mRNA를 주형으로 하여 합성한 cDNA를 조립하는 벡터에는, 해당 cDNA를 조립할 수 있는 벡터라면 어떠한 것이라도 사용할 수 있다. 예를 들어, ZAP Express[Strategies, 5, 58(1992)], pBluescript II SK(+)[Nucleic Acids Research, 17, 9494(1989)], λZAPII(Stratagene사제), λgt10, λgt11[DNA Cloning: A Practical Approach, I, 49(1985)], Lambda BlueMid(클론테크사제), λExCell, pT7T3-18U(파마시아사제), pCD2[Mol. Cell. Biol., 3, 280(1983)], 또는 pUC18[Gene, 33, 103(1985)] 등을 사용한다.
파지 또는 플라스미드 벡터에 의해 구축되는 cDNA 라이브러리를 도입하는 대장균에는, 해당 cDNA 라이브러리를 도입, 발현 및 유지할 수 있는 것이면 어떠한 것이라도 사용할 수 있다. 예를 들어, XL1-Blue MRF'[Strategies, 5, 81(1992)], C600[Genetics, 39, 440(1954)], Y1088, Y1090[Science, 222, 778(1983)], NM522[J. Mol. Biol., 166, 1(1983)], K802[J. Mol. Biol., 16, 118(1966)], 또는 JM105[Gene, 38, 275(1985)] 등을 사용한다.
cDNA 라이브러리로부터의 비인간 항체의 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA 클론의 선택에는, 동위 원소 또는 형광 표지한 프로브를 사용한 콜로니ㆍ하이브리다이제이션법, 또는 플라크ㆍ하이브리다이제이션법[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)] 등을 사용한다.
또한, 프라이머를 조제하고, mRNA로부터 합성한 cDNA 또는 cDNA 라이브러리를 주형으로 하여, Polymerase Chain Reaction(폴리메라아제 연쇄 반응)법[이하, PCR법이라 표기함, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989), Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1, John Wiley & Sons(1987-1997)]을 행함으로써 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA를 조제할 수도 있다.
선택된 cDNA를, 적당한 제한효소 등으로 절단 후, pBluescript SK(-)(스트라타진사제) 등의 플라스미드에 클로닝하고, 통상 사용되는 염기 서열 해석 방법 등에 의해 해당 cDNA의 염기 서열을 결정한다. 염기 서열 해석 방법에는, 예를 들어 디데옥시법[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463(1977)] 등의 반응을 행한 후, ABI PRISM3700(PE 바이오시스템즈사제) 또는 A.L.F.DNA 시퀀서(파마시아사제) 등의 염기 서열 자동 분석 장치 등을 사용한다.
결정된 염기 서열로부터 VH 및 VL의 전체 아미노산 서열을 각각 추정하고, 기지의 항체의 VH 및 VL의 전체 아미노산 서열[Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services(1991)]과 비교함으로써, 취득한 cDNA가 분비 시그널 서열을 포함하는 항체의 VH 및 VL의 완전한 아미노산 서열을 코딩하고 있는 지를 각각 확인한다. 분비 시그널 서열을 포함하는 항체의 VH 및 VL의 완전한 아미노산 서열에 대해서는, 기지의 항체의 VH 및 VL의 전체 아미노산 서열[Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services(1991)]과 비교함으로써, 분비 시그널 서열의 길이 및 N 말단 아미노산 서열을 추정할 수 있고, 나아가 그것들이 속하는 서브그룹을 알 수 있다. 또한, VH 및 VL의 각 CDR의 아미노산 서열에 대해서도, 기지의 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열[Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services(1991)]과 비교함으로써 알아낼 수 있다.
또한, 얻어진 VH 및 VL의 완전한 아미노산 서열을 사용하여, 예를 들어 SWISS-PROT 또는 PIR-Protein 등의 임의의 데이터베이스에 대하여 BLAST법[J. Mol. Biol., 215, 403(1990)] 등의 상동성 검색을 행하여, VH 및 VL의 완전한 아미노산 서열이 신규한 것인지를 확인할 수 있다.
(3) 인간형 키메라 항체 발현 벡터의 구축
(1)에서 얻어지는 유전자 재조합 항체 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 또는 CL을 코딩하는 각각의 유전자의 상류에, 각각 비인간 항체의 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA를 각각 클로닝함으로써, 인간형 키메라 항체 발현 벡터를 구축할 수 있다.
비인간 항체의 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA의 3' 말단측과, 인간 항체의 CH 또는 CL의 5' 말단측을 연결하기 위해서, 연결 부분의 염기 서열이 적절한 아미노산을 코딩하며, 또한 적당한 제한효소 인식 서열이 되도록 설계한 VH 및 VL의 cDNA를 제작한다. 제작된 VH 및 VL의 cDNA를, (1)에서 얻어지는 유전자 재조합 항체 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 또는 CL을 코딩하는 각각의 유전자의 상류에 그것들이 적절한 형태로 발현하도록 각각 클로닝하여, 인간형 키메라 항체 발현 벡터를 구축한다.
또한, 비인간 항체 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA를, 적당한 제한효소의 인식 서열을 양단에 갖는 합성 DNA를 사용하여 PCR법에 의해 각각 증폭하여, (1)에서 얻어지는 유전자 재조합 항체 발현용 벡터에 클로닝할 수도 있다.
(4) 인간화 항체의 V 영역을 코딩하는 cDNA의 구축
인간화 항체의 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA는, 이하와 같이 하여 구축할 수 있다.
비인간 항체의 VH 또는 VL의 CDR의 아미노산 서열을 이식하기 위한, 인간 항체의 VH 또는 VL의 FR의 아미노산 서열을 각각 선택한다. 선택하는 FR의 아미노산 서열에는, 인간 항체 유래의 것이면, 어느 것이라도 사용할 수 있다. 예를 들어, Protein Data Bank(단백질 데이터 뱅크) 등의 데이터베이스에 등록되어 있는 인간 항체의 FR의 아미노산 서열, 또는 인간 항체의 FR의 각 서브그룹의 공통 아미노산 서열[Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services(1991)] 등을 사용한다. 항체의 결합 활성의 저하를 억제하기 위해서, 원래 항체의 VH 또는 VL의 FR의 아미노산 서열과 가능한 한 높은 상동성(적어도 60％ 이상)의 FR의 아미노산 서열을 선택한다.
이어서, 선택한 인간 항체의 VH 또는 VL의 FR의 아미노산 서열에, 원래 항체의 CDR의 아미노산 서열을 각각 이식하여, 인간화 항체의 VH 또는 VL의 아미노산 서열을 각각 설계한다. 설계한 아미노산 서열을 항체의 유전자 염기 서열에서 보이는 코돈의 사용 빈도[Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services(1991)]를 고려하여 DNA 서열로 변환하여, 인간화 항체의 VH 또는 VL의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 각각 설계한다.
설계한 DNA 서열에 기초하여, 100 염기 전후의 길이를 포함하는 몇 개의 합성 DNA를 합성하고, 그것들을 사용하여 PCR 반응을 행한다. 이 경우, PCR 반응에서의 반응 효율 및 합성 가능한 DNA의 길이로부터, 바람직하게는 VH, VL 각각에 대하여 각 6개의 합성 DNA를 설계한다. 또한, 양단에 위치하는 합성 DNA의 5' 또는 3' 말단에 적당한 제한효소의 인식 서열을 도입함으로써, 인간화 항체의 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA를, (1)에서 얻어지는 유전자 재조합 항체 발현용 벡터에 용이하게 클로닝할 수 있다.
PCR 반응 후, 증폭 산물을 pBluescript SK(-)(스트라타진사제) 등의 플라스미드에 각각 클로닝하고, (2)에 기재된 방법과 동일한 방법에 의해, 염기 서열을 결정하여, 원하는 인간화 항체의 VH 또는 VL의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 갖는 플라스미드를 취득한다.
또는, 설계한 DNA 서열에 기초하여, VH 전체 길이 및 VL 전체 길이를 각각 1개의 장쇄 DNA로서 합성한 것을, 상기 PCR 증폭 산물 대신에 사용할 수도 있다. 또한, 합성 장쇄 DNA의 양단에 적당한 제한효소의 인식 서열을 도입함으로써, 인간화 항체의 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA를, (1)에서 얻어지는 유전자 재조합 항체 발현용 벡터에 용이하게 클로닝할 수 있다.
(5) 인간화 항체의 V 영역의 아미노산 서열의 개변
인간화 항체는, 비인간 항체의 VH 및 VL의 CDR만을 인간 항체의 VH 및 VL의 FR에 이식하는 것만으로는, 그 항원 결합 활성은 원래의 비인간 항체에 비해 저하된다[BIO/TECHNOLOGY, 9, 266(1991)]. 인간화 항체에서는, 인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열 중에서, 직접 항원과의 결합에 관여하고 있는 아미노산 잔기, CDR의 아미노산 잔기와 상호 작용하는 아미노산 잔기, 및 항체의 입체 구조를 유지하고, 간접적으로 항원과의 결합에 관여하고 있는 아미노산 잔기를 동정하여, 그들 아미노산 잔기를 원래의 비인간 항체의 아미노산 잔기로 치환함으로써, 저하된 항원 결합 활성을 상승시킬 수 있다.
항원 결합 활성에 관계되는 FR의 아미노산 잔기를 동정하기 위해서, X선 결정 해석[J. Mol. Biol., 112, 535(1977)] 또는 컴퓨터 모델링[Protein Engineering, 7, 1501(1994)] 등을 사용함으로써, 항체의 입체 구조의 구축 및 해석을 행할 수 있다. 또한, 각각의 항체에 대하여 몇 종의 개변체를 제작하고, 각각의 항원 결합 활성과의 상관을 검토하는 것을 반복하여, 시행 착오함으로써 필요한 항원 결합 활성을 갖는 인간화 항체를 취득할 수 있다.
인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 잔기는, 개변용 합성 DNA를 사용하여 (4)에 기재된 PCR 반응을 행함으로써, 개변시킬 수 있다. PCR 반응 후의 증폭 산물에 대해서 (2)에 기재된 방법에 의해, 염기 서열을 결정하고, 목적으로 하는 개변이 실시된 것을 확인한다.
(6) 인간화 항체 발현 벡터의 구축
(1)에서 얻어지는 유전자 재조합 항체 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 또는 CL을 코딩하는 각각의 유전자의 상류에, 구축된 유전자 재조합 항체의 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA를 각각 클로닝하여, 인간화 항체 발현 벡터를 구축할 수 있다.
예를 들어, (4) 및 (5)에서 얻어지는 인간화 항체의 VH 또는 VL을 구축할 때 사용하는 합성 DNA 중, 양단에 위치하는 합성 DNA의 5' 또는 3' 말단에 적당한 제한효소의 인식 서열을 도입함으로써, (1)에서 얻어지는 인간화 항체 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 또는 CL을 코딩하는 각각의 유전자의 상류에 그것들이 적절한 형태로 발현하도록 각각 클로닝한다.
(7) 유전자 재조합 항체의 일과성 발현
(3) 및 (6)에서 얻어지는 유전자 재조합 항체 발현 벡터, 또는 그것들을 개변한 발현 벡터를 사용하여 유전자 재조합 항체의 일과성 발현을 행하여, 제작한 다종류의 인간형 키메라 항체, 인간화 항체의 항원 결합 활성을 효율적으로 평가할 수 있다.
발현 벡터를 도입하는 숙주 세포에는, 유전자 재조합 항체를 발현할 수 있는 숙주 세포라면, 어떠한 세포라도 사용할 수 있지만, 예를 들어 COS-7 세포[American Type Culture Collection(ATCC) 번호: CRL1651]를 사용한다[Methods in Nucleic Acids Res., CRC press, 283(1991)].
COS-7 세포로의 발현 벡터의 도입에는, DEAE-덱스트란법[Methods in Nucleic Acids Res., CRC press(1991)], 또는 리포펙션법[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413(1987)] 등을 사용한다.
발현 벡터의 도입 후, 배양 상청 중의 유전자 재조합 항체의 발현량 및 항원 결합 활성은 효소 면역 항체법[Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press(1996), Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988), 단일 클론 항체 실험 매뉴얼, 고단샤 사이언티픽(1987)] 등을 사용하여 측정한다.
(8) 유전자 재조합 항체를 안정적으로 발현하는 형질 전환주의 취득과 유전자 재조합 항체의 조제
(3) 및 (6)에서 얻어진 유전자 재조합 항체 발현 벡터를 적당한 숙주 세포에 도입함으로써 유전자 재조합 항체를 안정적으로 발현하는 형질 전환주를 얻을 수 있다.
숙주 세포로의 발현 벡터의 도입에는, 일렉트로포레이션법[일본 특허 공개 평2-257891, Cytotechnology, 3, 133(1990)] 등을 사용한다.
유전자 재조합 항체 발현 벡터를 도입하는 숙주 세포에는, 유전자 재조합 항체를 발현시킬 수 있는 숙주 세포라면, 어떠한 세포라도 사용할 수 있다. 예를 들어, CHO-K1(ATCC CCL-61), DUKXB11(ATCC CCL-9096), Pro-5(ATCC CCL-1781), CHO-S(Life Technologies, Cat #11619), 래트 미엘로마 세포 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(ATCC 번호: CRL1662 또는 YB2/0이라고도 함), 마우스 미엘로마 세포 NS0, 마우스 미엘로마 세포 SP2/0-Ag14(ATCC 번호: CRL1581), 마우스 P3X63-Ag8.653 세포(ATCC 번호: CRL1580), 디히드로엽산 환원효소 유전자(Dihydroforate Reductase, 이하, dhfr이라고 표기함)가 결손된 CHO 세포[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216(1980)] 등을 사용한다.
또한, 세포 내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 등의 단백질 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코오스의 1위치가 α 결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소 등의 단백질, 또는 세포 내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질 등의 활성이 저하 또는 결실된 숙주 세포, 예를 들어 α1,6-푸코오스 전이효소 유전자가 결손된 CHO 세포(WO2005/035586, WO02/31140), 렉틴 내성을 획득한 Lec13[Somatic Cell and Molecular genetics, 12, 55(1986)] 등을 사용할 수도 있다.
발현 벡터의 도입 후, 유전자 재조합 항체를 안정적으로 발현하는 형질 전환주는, G418 황산염(이하, G418이라고 표기함) 등의 약제를 포함하는 동물 세포 배양용 배지에서 배양함으로써 선택한다(일본 특허 공개 평2-257891).
동물 세포 배양용 배지에는, RPMI1640 배지(인비트로젠사제), GIT 배지(닛본 세야꾸사제), EX-CELL301 배지(JRH사제), IMDM 배지(인비트로젠사제), Hybridoma-SFM 배지(인비트로젠사제), 또는 이들 배지에 FBS 등의 각종 첨가물을 첨가한 배지 등을 사용한다. 얻어진 형질 전환주를 배지 중에서 배양함으로써 배양 상청 중에 유전자 재조합 항체를 발현 축적시킨다. 배양 상청 중의 유전자 재조합 항체의 발현량 및 항원 결합 활성은 ELISA법 등에 의해 측정할 수 있다. 또한, dhfr 유전자 증폭계(일본 특허 공개 평2-257891) 등을 이용하여, 형질 전환주가 생산하는 유전자 재조합 항체의 발현량을 향상시킬 수 있다.
유전자 재조합 항체는, 형질 전환주의 배양 상청으로부터 단백질 A-칼럼을 사용하여 정제한다[Monoclonal Antibodies - Principles and practice, Third edition, Academic Press(1996), Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]. 또한, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피 및 한외 여과 등의 단백질의 정제에서 사용되는 방법을 조합할 수도 있다.
정제한 유전자 재조합 항체의 H쇄, L쇄 또는 항체 분자 전체의 분자량은, 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법[Nature, 227, 680(1970)], 또는 웨스턴 블롯팅법[Monoclonal Antibodies - Principles and practice, Third edition, Academic Press(1996), Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)] 등을 사용하여 측정할 수 있다.
3. 정제 모노클로날 항체 또는 그의 항체 단편의 활성 평가
정제한 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그의 항체 단편의 활성 평가는, 이하와 같이 행할 수 있다.
인간 Gas6에 대한 결합 활성은, 상술한 1-(6a)에 기재된 결합 측정 및 (6c)에 기재된 Biacore(등록 상표) 시스템 등을 사용한 표면 플라즈몬 공명법을 사용하여 측정한다. 또한, 형광 항체법[Cancer Immunol. Immunother., 36, 373(1993)] 등을 사용하여 측정할 수 있다.
인간 Gas6과 Gas6 수용체의 결합 저해 활성은, 예를 들어 상술한 1-(6b)에 기재된 경합 측정을 사용하여 측정할 수 있다.
4. 본 발명의 항인간 Gas6 모노클로날 항체 또는 그의 항체 단편을 사용한 질환의 치료 방법
본 발명의 모노클로날 항체 또는 그의 항체 단편은, 인간 Gas6 의존적인 세포 증식, 병변 등 Gas6이 관련되는 질환이면, 어떤 인간 Gas6 관련 질환의 치료에도 사용할 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체 또는 그의 항체 단편을 함유하는 치료제는, 유효 성분으로서의 해당 항체 또는 해당 항체 단편만을 포함하는 것이어도 되지만, 통상은 약리학적으로 허용되는 1 이상의 담체와 함께 혼합하여, 제제학의 기술 분야에 있어서 공지된 방법에 의해 제조한 의약 제제로서 제공된다.
투여 경로에는, 경구 투여, 또는 구강 내, 기도 내, 직장 내, 피하, 근육 내 또는 정맥 내 등의 비경구 투여를 들 수 있고, 투여 형태로서는, 분무제, 캡슐제, 정제, 산제, 과립제, 시럽제, 유제, 좌제, 주사제, 연고 또는 테이프제 등을 들 수 있다.
경구 투여에 적당한 제제는 유제, 시럽제, 캡슐제, 정제, 산제 또는 과립제 등이다.
유제 또는 시럽제와 같은 액체 조제물은, 물, 자당, 소르비톨 또는 과당 등의 당류, 폴리에틸렌글리콜 또는 프로필렌글리콜 등의 글리콜류, 호마유, 올리브유 또는 대두유 등의 유류, p-히드록시벤조산에스테르류 등의 방부제, 또는 스트로베리 플레이버 또는 페퍼민트 등의 플레이버류 등을 첨가제로서 사용하여 제조한다.
캡슐제, 정제, 산제 또는 과립제 등은, 유당, 포도당, 자당 또는 만니톨 등의 부형제, 전분 또는 알긴산나트륨 등의 붕괴제, 스테아르산마그네슘 또는 탈크 등의 활택제, 폴리비닐알코올, 히드록시프로필셀룰로오스 또는 젤라틴 등의 결합제, 지방산 에스테르 등의 계면 활성제 또는 글리세린 등의 가소제 등을 첨가제로서 사용하여 제조한다.
비경구 투여에 적당한 제제로서는, 주사제, 좌제 또는 분무제 등이다.
주사제는, 염 용액, 포도당 용액, 또는 그 양자의 혼합물을 포함하는 담체 등을 사용하여 제조한다.
좌제는 카카오 버터, 수소화 지방 또는 카르복실산 등의 담체를 사용하여 제조한다.
분무제는 수용자의 구강 및 기도 점막을 자극하지 않으며, 또한 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그의 항체 단편을 미세한 입자로서 분산시켜, 흡수를 용이하게 하게 하는 담체 등을 사용하여 제조한다. 담체로서는, 예를 들어 유당 또는 글리세린 등을 사용한다. 또한, 에어로졸 또는 드라이 파우더로서 제조할 수도 있다.
또한, 상기 비경구제에 있어서도, 경구 투여에 적당한 제제이며 첨가제로서 예시된 성분을 첨가할 수도 있다.
5. 본 발명의 항인간 Gas6 모노클로날 항체 또는 그의 항체 단편을 사용한 질환의 진단 방법
본 발명의 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 사용하여, 인간 Gas6 또는 인간 Gas6이 발현한 세포를 검출 또는 측정함으로써, 인간 Gas6 관련 질환을 진단할 수 있다.
인간 Gas6 관련 질환인 신장 또는 암 질환의 진단은, 예를 들어 환자 체내에 존재하는 인간 Gas6을 면역학적 방법에 의해 검출 또는 측정하여 행할 수 있다. 또한, 환자 체내의 세포에 발현하고 있는 인간 Gas6을 플로우 사이토메트리 등의 면역학적 방법을 사용하여 검출함으로써 진단을 행할 수 있다.
면역학적 방법이란, 표지를 실시한 항원 또는 항체를 사용하여, 항체량 또는 항원량을 검출 또는 측정하는 방법이다. 예를 들어, 방사성 물질 표지 면역 항체법, 효소 면역 측정법, 형광 면역 측정법, 발광 면역 측정법, 웨스턴 블롯법 또는 물리 화학적 방법 등을 사용한다.
방사성 물질 표지 면역 항체법은, 예를 들어 항원 또는 항원을 발현한 세포 등에, 본 발명의 항체 또는 해당 항체 단편을 반응시키고, 추가로 방사선 표지를 실시한 항 이뮤노글로불린 항체 또는 결합 단편을 반응시킨 후, 신틸레이션 카운터 등으로 측정한다.
효소 면역 측정법은, 예를 들어 항원 또는 항원을 발현한 세포 등에, 본 발명의 항체 또는 해당 항체 단편을 반응시키고, 추가로 표지를 실시한 항 이뮤노글로불린 항체 또는 결합 단편을 반응시킨 후, 발색 색소를 흡광 광도계로 측정한다. 예를 들어 샌드위치 ELISA법 등을 사용한다. 효소 면역 측정법에서 사용되는 표지체로서는, 공지[효소 면역 측정법, 이가꾸 쇼인(1987)]된 효소 표지를 사용할 수 있다.
예를 들어, 알칼리 포스파타아제 표지, 퍼옥시다아제 표지, 루시페라아제 표지, 또는 비오틴 표지 등을 사용한다. 샌드위치 ELISA법은, 고상에 항체를 결합시킨 후, 검출 또는 측정 대상인 항원을 포획시키고, 포획된 항원에 제2 항체를 반응시키는 방법이다. 해당 ELISA 법에서는, 검출 또는 측정하고자 하는 항원을 인식하는 항체 또는 항체 단편이며, 항원 인식 부위가 다른 2종류의 항체를 준비하고, 그 중, 제1 항체 또는 항체 단편을 미리 플레이트(예를 들어, 96웰 플레이트)에 흡착시키고, 다음으로 제2 항체 또는 항체 단편을 FITC 등의 형광 물질, 퍼옥시다아제 등의 효소, 또는 비오틴 등으로 표지해둔다. 상기 항체가 흡착된 플레이트에, 생체 내에서 분리된, 세포 또는 그의 파쇄액, 조직 또는 그의 파쇄액, 세포 배양 상청, 혈청, 흉수, 복수 또는 안액 등을 반응시킨 후, 표지한 모노클로날 항체 또는 항체 단편을 반응시켜, 표지 물질에 따른 검출 반응을 행한다. 농도 기지의 항원을 단계적으로 희석하여 제작한 검량선으로부터, 피검 샘플 중의 항원 농도를 산출한다. 샌드위치 ELISA법에 사용되는 항체로서는, 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체 중 어느 것을 사용해도 되고, Fab, Fab' 또는 F(ab)2 등의 항체 프래그먼트를 사용해도 된다. 샌드위치 ELISA법에서 사용되는 2종류의 항체의 조합으로서는, 다른 에피토프를 인식하는 모노클로날 항체 또는 항체 단편의 조합이어도 되고, 폴리클로날 항체와 모노클로날 항체 또는 항체 단편과의 조합이어도 된다.
형광 면역 측정법은, 문헌 [Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press(1996), 단일 클론 항체 실험 매뉴얼, 고단샤 사이언티픽(1987)] 등에 기재된 방법으로 측정한다. 형광 면역 측정법에서 사용되는 표지체로서는, 공지[형광 항체법, 소프트 사이언스사(1983)]된 형광 표지를 사용할 수 있다. 예를 들어, FITC 또는 RITC 등을 사용한다.
발광 면역 측정법은 문헌 [생물 발광과 화학 발광 임상 검사 42, 히로카와 쇼텐(1998)] 등에 기재된 방법으로 측정한다. 발광 면역 측정법에서 사용하는 표지체로서는, 공지된 발광체 표지를 들 수 있고, 아크리디늄에스테르, 로핀 등을 사용한다.
웨스턴 블롯법은, 항원 또는 항원을 발현한 세포 등을 SDS(도데실황산나트륨)-PAGE(폴리아크릴아미드 겔)[Antibodies - A Laboratory ManualCold Spring Harbor Laboratory(1988)]로 분획한 후, 해당 겔을 폴리불화비닐리덴(PVDF)막 또는 니트로셀룰로오스막에 블롯팅하여, 해당 막에 항원을 인식하는 항체 또는 항체 단편을 반응시키고, 추가로 FITC 등의 형광 물질, 퍼옥시다아제 등의 효소 표지 또는 비오틴 표지 등을 실시한 항마우스 IgG 항체 또는 결합 단편을 반응시킨 후, 해당 표지를 가시화함으로써 측정한다.
일례를 이하에 나타내었다. 서열 번호 4의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 발현하고 있는 세포나 조직을 용해시키고, 환원 조건 하에서 레인당 단백량으로서 0.1 내지 30μg을 SDS-PAGE법에 의해 영동한다. 영동된 단백질을 PVDF막에 전달하고, 1 내지 10％ BSA를 포함하는 PBS(이하, BSA-PBS라고 표기함)에 실온에서 30분간 반응시켜 블로킹 조작을 행한다. 여기서 본 발명의 모노클로날 항체를 반응시키고, 0.05 내지 0.1％의 Tween-20을 포함하는 PBS(이하, Tween-PBS라고 표기함)로 세정하고, 퍼옥시다아제 표지한 염소 항마우스 IgG를 실온에서 2시간 반응시킨다. Tween-PBS로 세정하고, ECL Western Blotting Detection Reagents(ECL 웨스턴 블롯팅 검출 시약)(아머샴제) 등을 사용하여 모노클로날 항체가 결합한 밴드를 검출함으로써, 서열 번호 4의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 검출한다. 웨스턴 블롯팅에서의 검출에 사용되는 항체로서는, 천연형 입체 구조를 유지하고 있지 않은 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항체가 사용된다.
물리 화학적 방법은, 예를 들어 항원인 인간 Gas6과 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그의 항체 단편을 결합시킴으로써 응집체를 형성시키고, 이 응집체를 검출함으로써 행한다. 이 밖에 물리 화학적 방법으로서, 모세관법, 일차원 면역 확산법, 면역 비탁법 또는 라텍스 면역 비탁법[임상 검사법 제요, 가네하라 슈판(1998)] 등을 사용할 수도 있다. 라텍스 면역 비탁법은, 항체 또는 항원을 감작시킨, 입경 0.1 내지 1㎛ 정도의 폴리스티렌 라텍스 등의 담체를 사용하여, 대응하는 항원 또는 항체에 의해 항원 항체 반응을 일어나게 하면, 반응액 내의 산란광은 증가되고, 투과광은 감소된다. 이 변화를 흡광도 또는 적분구 탁도로서 검출함으로써 피검 샘플 중의 항원 농도 등을 측정한다.
인간 Gas6이 발현하고 있는 세포의 검출 또는 측정은, 공지된 면역학적 검출법을 사용할 수 있지만, 그 중에서도, 면역 침강법, 면역 세포 염색법, 면역 조직 염색법 또는 형광 항체 염색법 등을 사용하는 것이 바람직하다.
면역 침강법은, 인간 Gas6을 발현한 세포 등을 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그의 항체 단편과 반응시킨 후, 단백질 G-세파로오스 등의 이뮤노글로불린에 특이적인 결합능을 갖는 담체를 첨가하여 항원 항체 복합체를 침강시킨다. 또는 이하와 같은 방법에 의해서도 행할 수 있다. ELISA용 96웰 플레이트에 상술한 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그의 항체 단편을 고상화한 후, BSA-PBS에 의해 블로킹한다. 항체가, 예를 들어 하이브리도마 배양 상청 등의 정제되지 않은 상태일 경우에는, 항마우스 이뮤노글로불린, 항래트 이뮤노글로불린, 단백질-A 또는 단백질-G 등을 미리 ELISA용 96웰 플레이트에 고상화하고, BSA-PBS로 블로킹한 후, 하이브리도마 배양 상청을 분주하여 결합시킨다. 이어서, BSA-PBS를 버리고 PBS로 잘 세정한 후, 인간 Gas6을 발현하고 있는 세포나 조직의 용해액을 반응시킨다. 잘 세정한 후의 플레이트로부터 면역 침강물을 SDS-PAGE용 샘플 버퍼로 추출하고, 상기 웨스턴 블롯팅에 의해 검출한다.
면역 세포 염색법 또는 면역 조직 염색법은, 항원을 발현한 세포 또는 조직 등을, 경우에 따라서는 항체의 통과성을 높이기 위해 계면 활성제나 메탄올 등으로 처리한 후, 본 발명의 모노클로날 항체와 반응시키고, 추가로 FITC 등의 형광 표지, 퍼옥시다아제 등의 효소 표지 또는 비오틴 표지 등을 실시한 항 이뮤노글로불린 항체 또는 그 결합 단편과 반응시킨 후, 해당 표지를 가시화하고, 현미경으로 관찰하는 방법이다. 또한, 형광 표지의 항체와 세포를 반응시켜, 플로우 사이토미터로 해석하는 형광 항체 염색법[Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press(1996), 단일 클론 항체 실험 매뉴얼, 고단샤 사이언티픽(1987)]에 의해 검출을 행할 수 있다. 특히, 인간 Gas6에 결합하는, 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그의 항체 단편은, 형광 항체 염색법에 의해 천연형의 입체 구조를 유지하여 발현하고 있는 세포의 검출을 행할 수 있다.
또한, 형광 항체 염색법 중, FMAT8100HTS 시스템(어플라이드 바이오시스템사제) 등을 사용한 경우에는, 형성된 항체-항원 복합체와, 항체-항원 복합체의 형성에 관여하지 않은 유리 항체 또는 항원을 분리하는 일 없이, 항원량 또는 항체량을 측정할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 하기 실시예로 한정되는 것은 아니다.
실시예
[실시예 1] Gas6 녹아웃(이하, KO라고 기재함) 마우스의 입수
타코닉사에서 Gas6 헤테로 KO 마우스의 정자를 구입하였다. 구입한 Gas6 헤테로 KO 마우스의 백그라운드는 129/SvEv-C57BL/6이었다. 닛폰 클레아사에서, 당해 Gas6에 헤테로 KO 마우스의 정자를 C57BL/6NJcl 마우스의 난자와 체외 수정시킨 후, 레시피언트 마우스에 수정란을 이식하여 새끼를 얻었다. 얻어진 새끼에 대하여 공지된 방법으로 유전자형 결정(genotyping)을 행하여 Gas6 유전자가 녹아웃되어 있는 것을 확인하고, Gas6 호모 KO 마우스를 얻었다.
[실시예 2] 각종 Gas6 재조합체의 제작
면역 및 스크리닝에 사용하기 위해서, 이하에 기재하는 방법으로, C 말단에 FLAG-tag를 부가한 인간, 게잡이 원숭이, 래트 및 마우스의 Gas6 재조합 단백질을 제작하였다. 이하, 각각 hGas6-F, cGas6-F, rGas6-F 및 mGas6-F라고 기재한다.
(1) hGas6-F 발현 벡터의 구축
hGas6-F 유전자 서열이 조립된 동물 세포 발현 벡터는, 인간 Gas6의 유전자 서열(서열 번호 3, GenBank 액세션 번호: NM_000820)이 조립된 플라스미드(Invitrogen(인비트로젠)사제)로부터 이하와 같이 제작하였다.
hGas6-F 유전자를 포함하는 DNA 단편은, 상기 플라스미드를 주형으로 하여, 프라이머 1, 2(서열 번호 1, 2)를 사용한 폴리메라아제 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭시켰다. PCR은, 주형 플라스미드, 각 10pmol의 상기 2종류의 프라이머, 및 KOD FX(도요보사제)를 포함하는 20μL의 반응액을 조제하고, 94℃에서 2분간 보온한 후, 94℃에서 15초간, 58℃에서 30초간 및 68℃에서 2.5분간을 1사이클로 하여 30사이클 반응시켰다. 얻어진 PCR 산물을 아가로오스 겔 전기 영동에 제공하고, QIAquick Gel Extraction Kit(퀴아젠사제)를 사용하여 약 2kbp의 증폭 DNA 단편(hGas6-F 유전자를 포함하는 DNA 단편)을 회수하였다. 얻어진 증폭 DNA 단편을, ZERO BLUNT TOPO PCR CLONING KIT(인비로젠사제)를 사용하여 pCR4-Blunt-TOPO 벡터에 삽입하여, 플라스미드 pCR4-hGas6-F를 포함하는 반응액을 얻었다. 당해 반응액을 사용하여 통상의 방법으로 대장균 DH5α주(TOYOBO(도요보)사제)를 형질 전환시키고, 얻어진 형질 전환체로부터, 플라스미드 pCR4-hGas6-F를 추출하였다. 얻어진 pCR4-hGas6-F에 대해서는, PCR에 기인하는 변이가 없는 삽입 유전자 서열을 갖는 클론을 선택하고, 이후의 실험에 사용하였다.
이어서, pCR4-hGas6-F를 제한효소 EcoRI 및 BamHI로 효소 처리하였다. 반응액을 아가로오스 겔 전기 영동에 제공한 후, QIAquick Gel Extraction Kit를 사용하여 약 2kbp의 DNA 단편(이하, hGas6-F-EcoRI-BamHI라고 기재함)을 회수하였다. 동일하게, 동물 세포 발현용 벡터 pKANTEX93(WO97/10354)을 EcoRI 및 BamHI로 효소 처리하였다. 반응액을 아가로오스 겔 전기 영동에 제공한 후, QIAquick Gel Extraction Kit를 사용하여 약 9.3kbp의 DNA 단편(이하, pKANTEX93-EcoRI-BamHI라고 기재함)을 회수하였다. 얻어진 2종류의 DNA 단편을 Ligation High ver. 2(도요보사제)를 사용하여 연결시키고, 당해 반응액을 사용하여 대장균 DH5α주(TOYOBO)를 형질 전환시켰다. 얻어진 형질 전환체로부터 hGas6-F 동물 세포 발현 벡터인 pKANTEX-hGas6-F를 얻었다.
(2) cGas6-F 발현 벡터의 구축
cGas6-F 유전자가 조립된 동물 세포 발현 벡터를, 이하의 방법으로 구축하였다. 먼저, 첫째로 게잡이 원숭이 Gas6 유전자의 클로닝을 행하였다. 게잡이 원숭이 Gas6 유전자를 포함하는 DNA 단편은 PCR에 의해 증폭시켰다. PCR은, 주형인 게잡이 원숭이 폐 유래의 cDNA(CytoMol사제), 각 10pmol의 프라이머 3, 4(서열 번호 5, 6), KOD-plus-(도요보사제), 및 2％ DMSO를 포함하는 20μL의 반응액을 조제하고, 94℃에서 2분간 보온한 후, 94℃에서 15초간, 65℃에서 30초간 및 68℃에서 2.5분간을 1사이클로 하여 35사이클 행하였다. 이후에는 (1)과 동일한 방법으로, pCR4-Blunt-TOPO 벡터에 증폭 DNA 단편(cGas6 유전자를 포함하는 DNA 단편)을 삽입한 플라스미드 pCR4-cGas6을 얻었다. 얻어진 플라스미드에 대하여 통상의 방법으로 시퀀스 해석을 행하여, 얻어진 게잡이 원숭이 Gas6의 염기 서열을 서열 번호 7에, 당해 염기 서열로부터 추정되는 게잡이 원숭이 Gas6의 아미노산 서열을 서열 번호 8에 나타내었다.
계속해서, cGas6-F 유전자를 포함하는 DNA 단편을 PCR법에 의해 증폭시키고, 동물 세포 발현용 벡터 pKANTEX93에 조립하였다. PCR은, 주형인 pCR4-Gas6, 각 10pmol의 프라이머 5, 6(서열 번호 9, 10), 및 PrimeSTAR HS DNA Polymerase(다카라바이오사제)를 포함하는 20μL의 반응액을 조제하고, 94℃에서 5분간 보온한 후, 98℃에서 10초간, 68℃에서 2분 20초간을 1사이클로 하여 35사이클을 행하였다.
얻어진 PCR 산물 및 pKANTEX93으로부터, (1)과 동일한 방법으로 제한효소 소화시킨 DNA 단편(cGas6-F-EcoRI-BamHI 및 pKANTEX93-EcoRI-BamHI)을 회수하였다. 얻어진 2종류의 DNA 단편을, In-Fusion HD Cloning Kit(클론텍사제)를 사용하여 연결시키고, (1)과 동일한 방법으로 cGas6-F 동물 세포 발현용 벡터 pKANTEX-cGas6-F를 취득하였다. 얻어진 벡터에 대해서는, PCR에 기인하는 변이가 없는 삽입 유전자를 갖는 클론을 선택하고, 이후의 실험에 사용하였다.
(3) rGas6-F 발현 벡터의 구축
rGas6-F 유전자가 조립된 동물 세포 발현 벡터를 이하의 방법으로 제작하였다.
rGas6-F 유전자를 포함하는 DNA 단편은, PCR법에 의해 증폭시켰다. PCR은, 주형인 래트 심장 또는 간장 유래의 cDNA(다카라바이오사제), 각 10pmol의 프라이머 7, 8(서열 번호 11, 12), 및 KOD FX(도요보사제)을 포함하는 20μL의 반응액을 조제하고, 94℃에서 2분간 보온한 후, 94℃에서 15초간, 58℃에서 30초간, 및 68℃에서 2.5분간을 1사이클로 하여 30사이클 행하였다.
(1)과 동일한 방법으로, pCR4-Blunt-TOPO 벡터에 PCR로 증폭시킨 DNA 단편(rGas6-F 유전자를 포함하는 DNA 단편)을 삽입하여, 플라스미드 pCR4-rGas6-F를 얻었다. 얻어진 플라스미드가 갖는 래트 Gas6의 염기 서열은, GenBank 액세션 번호: NM_057100으로 표시되는 래트 Gas6의 염기 서열(서열 번호 13)과 일치하고, PCR에 기인하는 유전자 변이가 발생하지 않은 것을 확인하였다.
얻어진 pCR4-rGas6-F를 바탕으로 하고, (1)과 동일한 방법으로, pKANTEX93에 rGas6-F 유전자를 삽입하여, rGas6-F 동물 세포 발현 벡터인 pKANTEX-rGas6-F를 얻었다.
(4) mGas6-F 발현 벡터의 구축
mGas6-F 유전자가 조립된 동물 세포 발현 벡터를, 이하에 기재하는 방법으로 제작하였다.
mGas6-F 유전자를 포함하는 DNA 단편을 PCR에 의해 증폭시켰다. PCR은, 주형인 마우스 신장 또는 폐 유래의 cDNA(ambion사제), 각 10pmol의 프라이머 7, 9(서열 번호 11 및 15)의 프라이머, 및 KOD FX(도요보사제)를 포함하는 20μL의 반응액을 조제하고, 94℃에서 2분간 보온한 후, 94℃에서 15초간, 58℃에서 30초간, 및 68℃에서 2.5분간을 1사이클로 하여 30사이클 행하였다. (1)과 동일한 방법으로, pCR4-Blunt-TOPO 벡터에 PCR로 증폭시킨 DNA 단편(mGas6-F 유전자를 포함하는 DNA 단편)을 삽입하여, 플라스미드 pCR4-mGas6-F를 얻었다. 얻어진 플라스미드가 갖는 마우스 Gas6의 염기 서열은, GenBank 액세션 번호: NM_019521로 표시되는 마우스 Gas6의 염기 서열(서열 번호 16)과 일치하고, PCR에 기인하는 유전자 변이가 발생하지 않은 것을 확인하였다. 얻어진 pCR4-mGas6-F를 바탕으로 하고, (1)과 동일한 방법으로 pKANTEX93에 mGas6-F 유전자를 삽입하여, mGas6-F 동물 세포 발현 벡터인 pKANTEX-mGas6-F를 얻었다.
(5) hGas6-F 안정 발현 세포주의 수립
hGas6-F의 안정 발현 세포주를 수립하기 위해서, (1)에서 제작한 hGas6-F 발현 벡터 pKANTEX-hGas6-F를, 일렉트로포레이션법[사이토테크놀로지, 3, 133(199)]을 사용하고, 이하와 같이 하여 dhfr이 결손된 CHO 세포[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216(1980)]에 도입하였다.
세포의 배양은, 통상 계대에는 기초 배지[10％ 투석 FBS(GIBCO사제), 1×HT 용액(invitrogen사제), 50μg/mL Gentamicin(겐타마이신)(나카라이테스크사제)을 포함하는 IMDM(Invitrogen사제)]를 사용하였다. 유전자 도입 후의 세포의 선발시에는 50nM, 200nM 또는 500nM의 methotrexate hydrate(메토트렉세이트 수화물)(Sigma-Aldrich사제)(이하, MTX라고 기재함)를 포함하는 기초 배지(MTX 배지)를 사용하였다. 어느 세포도, 37℃, 5％ CO2 조건 하에서 정치 배양하였다.
10μg의 pKANTEX-hGas6-F를 포함하는 플라스미드 용액[(1)에서 얻어진 pKANTEX-hGas6-F를 멸균수에 용해시킨 용액]을 일렉트로포레이션용 큐벳트(Bio-Rad사제)에 첨가하였다. 해당 큐벳트에 K-PBS[137mmol/L의 KCl, 2.7mmol/L의 NaCl, 8.1mmol/L의 Na2HPO4, 1.5mmol/L의 KH2PO4, 4.0mmol/L의 MgCl2를 혼합시킨 용매]로 조제한 8×106개/mL의 세포 현탁액을 첨가하고, 혼화한 후, Gene Pulser(BIO-RAD)를 사용하여 펄스 전압 350V, 전기 용량 250μF의 조건에서 유전자 도입을 행하였다.
유전자 도입 후의 세포 현탁액을 50mL의 HT 용액을 포함하지 않은 기초 배지에 현탁시켜, 96웰 플레이트 5장에 100μL/웰로 파종하였다. 배양 개시 14일 후에 배지를 50nM MTX 배지로, 22일째에 200nM MTX 배지로 교환하고, MTX 내성 세포주의 선발을 행하였다. 배양 35일째에, 콜로니가 확인된 세포주에 대해서, human Gas6 ELISA kit(R&D사제)를 사용하여, 배양 상청 중의 hGas6-F의 발현량을 측정하였다. hGas6-F의 발현량이 높은 주를 24웰 플레이트로 확대시키고, 배양 개시 42일 후에 배지를 500nM MTX 배지로 교환하였다. 500nM MTX 내성 세포주에 대해서, 상기와 동일한 방법으로, 배양 상청의 hGas6-F의 발현량을 측정하고, 가장 hGas6-F의 발현량이 높은 주를 hGas6-F 안정 발현 세포주로서 선택하였다.
(6) cGas6-F, rGas6-F 및 mGas6-F 안정 발현 세포주의 제작
(2) 내지 (4)에서 제작한 pKANTEX-cGas6-F, pKANTEX-rGas6-F 및 pKANTEX-mGas6을, (5)와 동일한 방법으로 숙주 세포에 도입하여, cGas6-F, rGas6-F 및 mGas6-F 안정 발현 세포주를 수립하였다.
상기 벡터는, 모두 제한효소 MulI를 사용하여 효소 처리함으로써 선상화시켰다. 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전에 의해 해당 선상화 벡터를 정제하고, 멸균수에 용해시켜 실험에 제공하였다.
배양 상청 중의 cGas6-F의 발현량은, human Gas6 ELISA kit(R&D사제)를 사용하여 측정하였다. 또한, rGas6-F 및 mGas6-F의 발현량은, mouse Gas6 ELISA kit(R&D사제)를 사용하여 측정하였다.
(7) 래트 VKOR 및 인간 GGCX 발현 탠덤 벡터의 구축
활성형 Gas6 단백질을 취득하기 위해서는, Gas6의 Gla 도메인에 포함되는 글루탐산 잔기의 γ위치의 탄소가, Gla화 수식 관련 효소인 GGCX에 의해 카르복실화될 필요가 있다. 또한, GGCX의 활성화에는, 환원 비타민 K가 필수적이고, 환원 비타민 K는, VKOR(vitamin K epoxide reductase complex subunit 1(비타민 K 에폭시드 환원효소 복합 서브유닛 1))에 의해 비타민 K 에폭시드가 환원될 수 있다[Journal of Thrombosis and Haemostasis 3, 1873-1878(2005)]. 따라서, 활성형 Gas6을 얻기 위해서, 인간 GGCX(이하, hGGCX라고 기재함) 및 래트 VKOR(이하, rVKOR라고 기재함) 발현 벡터를 제작하였다.
먼저, (1)과 동일한 방법으로 rVKOR 유전자를 pCR4-Blunt-TOPO 벡터에 조립하여, 플라스미드 pCR4-rVKOR을 취득하였다. PCR은, 주형인 래트 간장 유래의 cDNA(다카라바이오사제), 각 10pmol의 프라이머 10, 11(서열 번호 18, 19)의 프라이머 및 KOD-plus-(도요보사제)를 포함하는 반응액을 조제하여 실험에 제공하였다. 얻어진 플라스미드가 갖는 rVKOR 유전자 서열은, GenBank 액세션 번호 NM_203335로 표시되는 래트 VKOR의 염기 서열(서열 번호 20)과 일치하여, PCR에 기인하는 유전자 변이는 발생하지 않은 것을 확인하였다.
제한효소 HindIII 및 SmaI로 효소 처리한 pCR4-rVKOR을, 동 제한효소로 처리한 pAGE249 발현 벡터(J. Biol. Chem., 278, 3466-3473, 2003)에, (1)과 동일한 방법으로 삽입하여 pAGE-rVKOR을 얻었다. pAGE-rVKOR을 제한효소 ClaI로 효소 처리하고, 5' 말단을 인산화한 2종의 합성 올리고 DNA(프라이머 18, 19)(서열 번호 38, 39)를 어닐링시켜, (1)과 동일한 방법으로 pAGE-rVKOR에 XhoI 효소 사이트를 삽입한 벡터 pAGE-rVKOR(XhoI)을 얻었다.
(1)과 동일한 방법으로, hGGCX 유전자를 pCR4-Blunt-TOPO 벡터에 조립한 플라스미드 pCR4-hGGCX를 취득하였다. PCR은, 인간 간장 유래의 cDNA(ambion사제)를 주형으로 하여, 10pmol의 프라이머 12, 13(서열 번호 22, 23)의 프라이머 및 KOD-plus-(도요보사제)를 포함하는 반응액을 조제하여 실험에 제공하였다. 얻어진 플라스미드가 갖는 hGGCX 유전자 서열은, GenBank 액세션 번호 NM_000821로 표시되는 hGGCX 유전자 서열(서열 번호 24)의 145번째의 시토신이 알라닌으로 치환된 서열이었다. 그러나, 이들 염기 서열에 의해 코딩되는 hGGCX의 아미노산 서열은 동일하였기 때문에, 취득한 플라스미드를 이후의 실험에 사용하였다.
제한효소 SalI 및 SmaI로 효소 소화한 pCR4-hGGCX를, 동 제한효소로 처리한 pAGE249 발현 벡터에 (1)과 동일한 방법으로 삽입하여 pAGE-hGGCX를 얻었다.
pAGE-rVKOR(XhoI)과 pAGE-hGGCX를 각각 XhoI로 효소 처리하고, (1)과 동일한 방법으로 pAGE249 유래의 프로모터 영역을 포함하는 hGGCX 단편을 pAGE-rVKOR(XhoI)에 삽입하여 pAGE-VKOR-hGGCX를 얻었다.
(8) 각종 Gas6-F 안정 발현 세포주로의 pAGE-VKOR-hGGCX의 도입
활성형의 각종 Gas6-F의 안정 발현주를 제작하기 위해서, (5)와 동일한 방법으로, (5) 및 (6)에서 제작한 각종 Gas6-F 안정 발현 세포주에 (7)에서 제작한 Gla화 수식 관련 효소 발현 벡터 pAGE-VKOR-hGGCX를 도입하였다.
유전자 도입 후의 세포 현탁액을, 10mL의 500nM MTX 배지에 현탁시키고, 125cm2 플라스크에 파종하였다. 다음날에, 배지를 MTXㆍ하이그로마이신 배지[500μg/mL의 하이그로마이신(Wako사제)을 포함하는 500mM MTX 배지]로 교환하고, 배양 개시 약 1개월 후에 175cm2 플라스크에 확대 배양하였다. 얻어진 세포주를 활성형의 각종 Gas6-F 안정 발현 세포주라고 기재한다.
(9) 각종 Gas6-F의 정제
(8)에서 수립한 활성형의 각종 Gas6-F 안정 발현 세포주를, MTXㆍ하이그로마이신 배지에 현탁시키고, 접착 세포용 플라스크에서 3일간 배양하였다. 이어서, 배지를 무혈청 배양지[EX-CELL 302(Sigma-Aldrich사제)에 6mM L-Glutamine(L-글루타민)(인비트로젠사제), 100ng/mL 비타민 K3(나카라이테스크사제), 500nM MTX, 500μg/mL 하이그로마이신, 100nM 3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt(3,3',5-트리요오도-L-티로닌 나트륨염)(Sigma-Aldrich사제) 및 50μg/mL Gentamicin을 첨가한 배지]로 교환하고, 5일간 배양한 후, 배지를 회수하였다. 회수한 배지를 원심 분리하고, 얻어진 배양 상청을 0.22㎛ 필터(Thermo Scientific사제)를 사용하여 멸균 여과하였다.
회수한 배양 상청을 사용하여 각종 Gas6-F를 정제하였다. 정제에는 ANTI-FLAG M2 Affinity Gel(친화성 겔)(Sigma-Aldrich사제)을 충전시킨 오픈 칼럼을 사용하였다. 칼럼에 배양 상청을 첨가한 후, 평형화 완충액[50mM Tris(나카라이테스크사제), 150mM NaCl(나카라이테스크사제), 0.5％ 폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우레이트(나카라이테스크사제)(pH 8.2)]을 사용하여 칼럼을 세정하였다. 계속해서, 폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우레이트를 포함하지 않은 평형화 완충액을 사용하여 칼럼을 세정한 후, 용출 완충액[0.1M 글리신(나카라이테스크사제)(pH 3.5), 또는 3M 염화마그네슘(나카라이테스크사제)]을 사용하여 각종 Gas6-F를 용출시켰다. 얻어진 각종 Gas6-F 용액은, NAP(GE 헬스케어사제)를 사용하여, 완충액을 Gas6용 완충액(20mM Tris(트리스), 150mM NaCl, pH 8.2)으로 치환하고, 0.22㎛ 필터를 사용하여 멸균 여과한 후, 시험에 사용하였다.
단백질의 흡광 계수는, 몰 흡광 계수를 분자량으로 나눔으로써 산출하였다(Protein Science, 4, 2411-2423(1995)). hGas6-F 및 cGas6-F의 흡광 계수는 0.95였다. 또한, rGas6-F 및 mGas6-F의 흡광 계수는 0.89였다. 단백질 용액 중의 단백 농도는, Nanodrop(Thermo Scientific사제)을 사용하여 측정하였다.
[실시예 3] Axl 세포 외 도메인과 IgG1 중쇄 정상 영역과의 복합체의 제작
(1) 인간 Axl 세포 외 도메인과 인간 IgG1 중쇄 정상 영역과의 복합체(이하, hAxl-hFc라고 기재함) 발현 벡터의 구축
hAxl-hFc 유전자 서열이 조립된 동물 세포 발현용 벡터를 이하의 방법으로 제작하였다.
hAxl-hFc를 포함하는 유전자 서열(서열 번호 28)의 전체 합성을 행하여, pMD19-hAxl-hFc를 얻었다(다카라바이오사). 서열 번호 28로 표시되는 염기 서열은, 5' 말단으로부터 BglII 및 MluI 제한효소 인식 서열, 인간 Axl의 세포 외 도메인을 코딩하는 염기 서열(서열 번호 26으로 표시되는 인간 Axl 전체 길이를 코딩하는 염기 서열 중, 1 내지 1314번째까지의 염기 서열), BamHI, SalI 및 EcoRI 제한효소 인식 서열 그리고 인간 IgG1 중쇄 정상 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함한다.
pMD19-hAxl-hFc 및 동물 세포 발현 벡터 pKTABEX-Tc26.2(WO2013/005649)를 제한효소 BglII 및 BamHI로 효소 처리하고, 반응액을 아가로오스 겔 전기 영동에 제공한 후, QIAquick Gel Extraction Kit를 사용하여 각각 약 2kbp의 DNA 단편(이하, hAxl-hFc-BglII-BamHI라고 기재함) 및 약 9.6kbp의 DNA 단편(이하, pKTABEX -BglII-BamHI라고 기재함)을 얻었다.
상기 2종류의 DNA 단편을 Ligation High ver. 2(도요보사제)를 사용하여 결합시키고, 실시예 2(1)과 동일한 방법으로 hAxl-hFc 재조합체 발현 벡터 pKTABEX-hAxl-hFc를 얻었다.
(2) 원숭이 Axl 세포 외 도메인과 인간 IgG1 중쇄 정상 영역과의 복합체(이하, cAxl-hFc라고 기재함) 발현 벡터의 구축
cAxl-hFc의 조제에 필요한 발현 벡터를 구축하였다. 먼저, 실시예 2(1)과 동일한 방법으로, 게잡이 원숭이 Axl 유전자를 pCR4-Blunt-TOPO 벡터에 조립한 플라스미드를 취득하였다. PCR은, 주형인 게잡이 원숭이 신장 유래의 cDNA(CytoMol사제), 각 10pmol의 프라이머 14, 15(서열 번호 30, 31), KOD-FX(도요보사제), 및 2％ DMSO를 포함하는 20μL의 반응액을 조제하고, 94℃에서 2분간 보온한 후, 94℃에서 15초간, 60℃에서 30초간 및 68℃에서 3.5분간을 1사이클로 하여 30사이클 행하였다. 얻어진 플라스미드가 갖는 게잡이 원숭이 Axl의 염기 서열을 서열 번호 32에 나타내었다. 또한, 당해 염기 서열로부터 추정되는 게잡이 원숭이 Axl의 아미노산 서열을 서열 번호 33에 나타내었다.
계속해서, 얻어진 플라스미드를 주형으로 하여 PCR을 행함으로써, 게잡이 원숭이 Axl 세포 외 도메인을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 DNA 단편을 증폭시켰다. PCR은, 주형 플라스미드, 프라이머 16, 17(서열 번호 34, 35)을 각 10pmol 및 PrimeSTAR HS DNA Polymerase(다카라바이오사제)를 포함하는 20μL의 반응액을 조제하고, 94℃에서 5분간 보온한 후, 94℃에서 15초간, 55℃에서 10초간, 68℃에서 1분 40초간을 1사이클로 하여 30사이클 행하였다. PCR 산물을 아가로오스 겔 전기 영동에 제공하고, QIAquick Gel Extraction Kit(퀴아젠사제)를 사용하여 약 1.3kbp의 DNA 단편(이하, cAxl-BglII-EcoRI라고 기재함)을 얻었다.
또한, (1)에서 제작한 pKTABEX-hAxl-hFc를, 제한효소 BglII 및 EcoRI로 효소 처리하였다. 반응액을 아가로오스 겔 전기 영동에 제공한 후, QIAquick Gel Extraction Kit를 사용하여 약 9.6kbp의 DNA 단편(이하, pKTABEX-hFc-BglII-EcoRI라고 기재함)을 얻었다.
마지막으로, In-Fusion HD Cloning Kit(클론텍사제)를 사용하여 pKTABEX-hFc-BglII-EcoRI에 cAxl-BglII-EcoRI를 삽입하여, cAxl-hFc 재조합체 발현 벡터 pKTABEX-cAxl-hFc를 얻었다. pKTABEX-cAxl-hFc가 갖는 cAxl-hFc의 염기 서열을 서열 번호 36에, 당해 염기 서열로부터 추정되는 cAxl-hFc의 아미노산 서열을 서열 번호 37에 나타내었다.
(3) 래트 Axl 세포 외 도메인과 인간 IgG1 중쇄 정상 영역과의 복합체(이하, rAxl-hFc라고 기재함) 발현 벡터의 구축
rAxl-hFc의 조제에 필요한 발현 벡터를 이하에 기재하는 방법으로 구축하였다. GenScript(진스크립트)사에서, 래트 Axl의 세포 외 도메인의 염기 서열을 전체 합성하여, pUC57 플라스미드에 조립한 pUC57-rAxl을 얻었다. 래트 Axl의 세포 외 도메인의 염기 서열은, 서열 번호 40으로 표시되는 래트 Axl의 염기 서열(GenBank 액세션 번호 NM_0317941)의 1 내지 1329번째의 염기를 사용하였다.
계속해서, pUC57-rAxl을 바탕으로 하여, (2)와 동일한 방법으로, rAxl-hFc 재조합체 발현 벡터 pKTABEX-rAxl-hFc를 얻었다. PCR은, 주형으로서 pUC57-rAxl, 각 10pmol의 프라이머 20, 21(서열 번호 42, 43), 및 PrimeSTAR HS DNA Polymerase(다카라바이오사제)를 포함하는 20μL의 반응액을 조제하고, 94℃에서 5분간 보온한 후, 94℃에서 15초간, 55℃에서 10초간, 68℃에서 1분 40초간을 1사이클로 하여 30사이클 행하였다. rAxl-hFc의 염기 서열을 서열 번호 40에, 당해 염기 서열로부터 추정되는 rAxl-hFc의 아미노산 서열을 서열 번호 41에 나타내었다.
(4) 마우스 Axl 세포 외 도메인과 마우스 IgG1 중쇄 정상 영역과의 복합체(이하, mAxl-mFc라고 기재함) 발현 벡터의 구축
mAxl-mFc의 조제에 필요한 발현 벡터를 이하에 기재하는 방법으로 구축하였다. 다카라바이오사에서, 서열 번호 48로 나타낸 mAxl-mFc를 포함하는 염기 서열을 전체 합성하여, pMD19 플라스미드에 조립한 pMD19-mAxl-mFc를 얻었다. mAxl-mFc는, 5' 말단으로부터 BglII 및 MluI 인식 서열, 마우스 Axl의 세포 외 도메인을 코딩하는 염기 서열(서열 번호 46으로 표시되는 마우스 Axl의 염기 서열 중, 1 내지 1329번째의 염기 서열), BamHI, SalI 및 EcoRI 인식 서열 그리고 마우스 IgG1 중쇄 정상 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함한다. pMD19-mAxl-mFc를 제한효소 BglII 및 BamHI로 효소 처리하고, (1)과 동일한 방법으로 pKTABEX-Tc26.2에 삽입하여, mAxl-mFc 재조합체 발현 벡터 pKTABEX-mAxl-mFc를 얻었다.
(5) hAxl-hFc 및 mAxl-mFc 안정 발현 세포주의 제작
hAxl-hFc 및 mAxl-mFc의 안정 발현주를 제작하기 위해서, 숙주 세포에 발현 벡터를 도입하였다. hAxl-hFc 및 mAxl-mFc 발현용 숙주 세포로서 CHO-K1(리켄)을 사용하였다. 세포 배양에 대해서는, 통상 계대에는, 4mM L-Glutamine(invitrogen사제) 및 50)μg/mL Gentamicin(나카라이테스크사제)을 포함하는 EX-CELL 325 PF(니치레이 바이오사이언스사제)(기초 배지)를 사용하였다. 또한, 유전자 도입주의 선발시에는 3μg/mL Cycloheximide Ready Made Solution(시클로헥시미드 레디 메이드 용액)(SIGMA사제)을 포함하는 기초 배지(CHX 배지)를 사용하였다. 어느 세포도 37℃, 5％ CO2 조건 하에서 진탕 배양하였다.
세포로의 유전자 도입은, 실시예 2(5)와 동일한 방법으로 행하였다.
(1)에서 취득한 10μg의 pKTABEX-hAxl-hFc, 20μg의 트랜스포사제 발현 벡터(WO2010/143698)(이하, TPEX_pMug라고 기재함)를 포함하는 용액을 일렉트로포레이션용 큐벳트(Gene Pulser cuvette, Bio-Rad사제)에 첨가하였다. PBS로 조제한 4×106개/mL의 CHO-K1 세포 현탁액을 해당 큐벳트에 400μL 첨가하였다. 큐벳트 중의 세포 현탁액을 혼화한 후, Gene Pulser(BIO-RAD)를 사용하여 펄스 전압 300V, 전기 용량 500μF의 조건에서 유전자 도입을 행하였다.
유전자 도입 후, 큐벳트 중의 세포를 20mL의 기초 배지에 현탁시켜, 96웰 플레이트 1장에 200μL/웰로 파종하였다. 배양 개시 4일 후에 배지를 CHX 배지로 교환하고, 유전자 도입주의 선발을 행하였다. 배양 29일째에 배지가 노랗게 변색된 세포주를 24웰로 확대시키고, 추가로 3일간 배양한 상청을 사용하여 hAxl-hFc의 발현량을 이하에 기재하는 방법으로 측정하였다.
hAxl-hFc의 발현량을 측정하기 위해서, 이하의 ELISA를 행하였다. 96웰 플레이트(Nunc사제)에, 1차 항체로서, PBS로 750배 희석한 Goat anti-human(염소 항-인간) IgG(H&L)(American Qualex사제)를 50μL/웰로 분주하고, 4℃에서 밤새 정치하여 고상화하였다. 플레이트를 0.05 내지 0.1％의 Tween-20을 포함하는 PBS(이하, Tween20-PBS라고 표기함)(Wako사제)로 5회 세정하고, 1％ BSA를 포함하는 PBS(이하, 1％ BSA-PBS라고 표기함)(나카라이테스크사제)를 100μL/웰로 ELISA 플레이트에 분주하고, 실온에서 2시간 정치함으로써 블로킹을 행하였다. 플레이트를 Tween20-PBS(Wako사제)로 5회 세정하고, 검체로서 1％ BSA-PBS로 희석한 배양 상청을 50μL/웰로 분주하고, 1시간 정치하였다. 표준품에는 공지된 인간 IgG1 항체를 사용하였다. Tween20-PBS(Wako사제)로 5회 세정한 후, 2차 항체로서, 1％ BSA-PBS로 2000배 희석한 Goat anti-human IgG(H&L)-HRP(American Qualex사제)를 50μL/웰로 분주하고, 1시간 정치하였다. Tween20-PBS에 의한 세정 후, ABTS(2,2-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline)-6-sulfonic acid(2,2-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린)-6-술폰산))(Thermo Fisher사제)를 50μL/웰로 분주하여 발색시켰다. 5％ SDS 용액을 50μL/웰로 분주하여 발색을 정지시켰다. 샘플 파장 415nm, 레퍼런스 파장 490nm에 있어서의 흡광도(415nm-490nm)를 플레이트 리더를 사용하여 측정하였다.
hAxl-hFc 발현량이 높은 주를 6웰 플레이트로부터 125mL 삼각 플라스크에 순차 확대시키고, 다시 hAxl-hFc 발현량을 측정하였다. 그 결과, 가장 발현량이 높은 세포주를 hAxl-hFc 안정 발현 세포주로서 선택하였다.
동일하게, (4)에서 취득한 pKTABEX-mAxl-mFc를 사용하여, mAxl-mFc 안정 발현 세포주를 얻었다. mAxl-mFc의 발현량은, 상기와 동일하게 ELISA법으로 측정을 행하였다. 1차 항체로서, PBS로 100배 희석한 Polyclonal Rabbit Anti-mouse Immunoglobulins(폴리클로날 토끼 항-마우스 이뮤노글로불린)(Dako사제)을 사용하고, 2차 항체로서 1％ BSA-PBS로 400배로 희석한 Polyclonal Rabbit Anti-mouse Immunoglobulins HRP(Dako사제)를 사용하였다. 표준품에는 공지된 마우스 IgG1 항체를 사용하였다.
(6) cAxl-hFc 및 rAxl-hFc 일과성 발현 세포주의 제작
cAxl-hFc 및 rAxl-hFc의 일과성 발현주를 제작하기 위해서, 숙주 세포에 발현 벡터를 도입하였다.
cAxl-hFc 및 rAxl-hFc 발현용 숙주 세포로서 CHO-S(Life Tecnologies사제)를 사용하였다. 세포의 계대에는 4mM L-Glutamine(invitrogen사제)을 포함하는 FreeStyle(프리스타일) CHO(invitrogen사제)를 사용하고, 37℃, 5％ CO2 조건 하에서 진탕 배양하였다.
(2)에서 제작한 1.25mg의 pKTABEX-cAxl-hFc를 20mL의 Opti-Pro SFM(invitrogen사제)에, 또한 1.25mL의 FreeStyle MAX Reagent(프리스타일 MAX 시약)(invitrogen사제)를 20mL의 OptiPro SFM에 각각 용해시키고, 실온에서 5분간 방치하였다. 상기 2액을 혼합하고, 실온에서 15분간 방치하였다. 해당 혼합 용액을 CHO-S 배양액에 적하하여, cAxl-hFc 일과성 발현 세포주를 얻었다. 동일하게 하여, (3)에서 제작한 pKTABEX-rAxl-hFc를 사용하여, rAxl-hFc 일과성 발현 세포주를 얻었다.
(7) 각종 Axl-hFc 및 mAxl-mFc의 정제
(5)에서 취득한 hAxl-hFc 및 mAxl-mFc 안정 발현 세포주를, 공지된 단백질 발현용 배지에 현탁시키고, 삼각 플라스크에서 7일간 배양한 후, 배양 상청을 회수하였다. 회수한 배양 상청을 원심 분리하고, 얻어진 배양 상청을 0.22㎛ 필터를 사용하여 여과함으로써 hAxl-hFc를 포함하는 배양 상청을 조제하였다. 동일한 방법으로, mAxl-mFc를 포함하는 배양 상청을 조제하였다.
또한, (6)에서 취득한 cAxl-hFc 및 rAxl-hFc 일과성 발현 세포주를 4mM의 L-Glutamine(invitrogen사제)을 첨가한 FreeStyle CHO(invitrogen사제)에 현탁시키고, 삼각 플라스크에서 5일간 배양한 후, 배양 상청을 회수하였다. 회수한 배양 상청을 원심 분리하고, 얻어진 배양 상청을 0.22㎛ 필터를 사용하여 여과함으로써 cAxl-hFc를 포함하는 배양 상청을 조제하였다. 동일한 방법으로, rAxl-hFc를 포함하는 배양 상청을 조제하였다.
조제한 배양 상청으로부터, 통상의 방법에 의해 각종 Axl-Fc를 정제하였다. 레진은 HiTrap MabSelect SuRe(GE 헬스케어사제)를 사용하였다. 얻어진 정제 단백질 용액은 0.22㎛ 필터를 사용하여 멸균 여과한 후, 시험에 사용하였다. 실시예 2(9)에 기재된 방법을 사용하여, 각 단백질의 흡광 계수를 산출하였다. hAxl-hFc, mAxl-mFc, cAxl-hFc 및 rAxl-hFc의 흡광 계수는, 각각 1.38, 1.54, 1.42 및 1.8이었다.
[실시예 4] 선행 항인간 Gas6 모노클로날 항체의 제작
(1) CNTO 항체 발현 벡터의 제작
US7547767 특허 명세서에 기재되어 있는 항Gas6 모노클로날 항체 WG1의 VH 및 VL의 염기 서열(US7547767 특허 명세서의 SEQ ID NO: 25, 27)을 바탕으로 하여, 당해 항체(이하, CNTO 항체라고 기재함)의 발현 벡터를 이하에 기재하는 방법으로 제작하였다. IDT사에서, CNTO 항체의 VH 및 VL의 염기 서열의 전체 합성을 행하여, 적당한 플라스미드에 조립하였다. CNTO 항체의 VH 및 VL의 염기 서열을, 각각 서열 번호 61, 63에 기재하였다. 또한, CNTO 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열을, 각각 서열 번호 62, 64에 기재하였다. US7547767에 있어서 서열 번호 25로 표시되는 WG1의 VH의 염기 서열의 305번째가 N으로 기재되어 있었기 때문에, 카바트(Kabat)의 인간 항체 서열 정보(Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept Health and Human Services(1991)) 및 305번째의 염기와 코돈을 형성하는 304, 306번째의 염기 서열로부터, 305번째의 염기로서 티미딘을 사용하였다. 발현용 벡터 pKANTEX93(WO97/10354)의 적당한 위치에 공지된 방법으로 CNTO 항체의 유전자 서열을 삽입하여, CNTO 항체 발현 벡터인 pKANTEX-CNTO를 구축하였다.
(2) CNTO 항체 안정 발현 세포주의 제작
실시예 2(5)와 동일한 방법으로, dhfr이 결손된 CHO 세포에, (1)에서 조제한 pKANTEX-CNTO를 도입하여, CNTO 항체 안정 발현 세포주를 제작하였다.
(3) CNTO 항체의 정제
(2)에서 취득한 CNTO 항체 안정 발현 세포주를, 500nM MTX 배지에 현탁시키고, 접착 세포용 플라스크에서 3일간 배양하였다. 이어서, 배지를 EX-CELL 302(6mM L-Glutamine, 100nM 3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt, 50μg/mL Gentamicin을 포함함)로 교환하고, 5일간 배양한 후, 배양 상청을 회수하였다. 회수한 배양 상청을 원심 분리하고, 상청을 0.22㎛ 필터를 사용하여 여과함으로써 CNTO 항체를 포함하는 배양 상청을 조제하였다.
조제한 배양 상청으로부터, 통상의 방법으로 CNTO 항체를 정제하였다. 레진은 MabSelect SuRe(GE 헬스케어사제)를 사용하였다. 얻어진 CNTO 항체는, 0.22㎛ 필터를 사용하여 멸균 여과한 후, 시험에 사용하였다. CNTO 항체의 흡광 계수는 1.43이었다.
[실시예 5] 항인간 Gas6 모노클로날 항체의 제작
(1) 동물에 대한 면역과 항체 생산 세포의 조제
실시예 2(9)에서 제작한 hGas6-F 또는 rGas6-F를, 실시예 1에서 얻어진 KO 마우스에 면역시켰다. 마우스의 면역에는, 아주반트로서 수산화알루미늄(Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p99, 1988) 및 백일해 백신(나카라이테스크사제)을 사용하였다.
구체적으로는, 1마리당 80μL의 수산화알루미늄 및 5μL의 백일해 백신을 사용하여, hGas6-F 또는 rGas6-F와의 현탁액을 조제하였다. 1마리당 30μg의 hGas6-F 또는 rGas6-F가 투여되도록, 해당 현탁액을 KO 마우스의 복강 내에 투여하였다.
아주반트는 첫회의 면역만 사용하고, 면역은 최종 부스트를 포함하여 총 4회 행하였다. hGas6-F만을 면역에 사용한 군과, rGas6-F와 hGas6-F를 교대로 투여하는 군으로 나누고, 각 4마리씩 면역을 행하였다. 최종 면역 4일 후에 비장을 적출하였다. 적출한 비장을 MEM 배지(인비트로젠사제) 중에서 세단한 후, 비장 세포 분획을 원심 분리(1200rpm, 5분간)에 의해 회수하였다. 얻어진 비장 세포 분획은, 적혈구를 포함하는 점에서, RED Blood Cell Lysing Buffer(적혈구 용해 버퍼)(시그마사제)를 첨가하고, 37℃에서 반응시켜 적혈구를 제거하였다. 얻어진 비장 세포는, MEM 배지로 2회 세정한 후, 세포 융합에 제공하였다.
(2) 마우스 골수종 세포의 조제
8-아자구아닌 내성 마우스 골수종 세포주 P3X63Ag8U.1(P3-U1: ATCC로부터 구입)을 10％ FCS(MOREGATE BIOTECH사제)를 포함하는 RPMI1640(Wako사제)에서 배양하고, 세포 융합의 친주로서 사용하였다.
(3) 하이브리도마의 제작
(1)에서 얻어진 마우스 비장 세포와 (2)에서 얻어진 골수종 세포를 8:1의 비율로 혼합하고, 원심 분리(1200rpm, 5분간)하였다. 얻어진 침전 분획(세포군)에 대하여, 0.5mL의 폴리에틸렌글리콜-1000(로슈ㆍ다이아그노스틱스사제)을 온화하게 흔들면서 서서히 첨가하였다. 이어서, 37℃의 수욕 중에서 해당 세포액에 1mL의 MEM을 1분 간격으로 5회 첨가하고, 마지막으로 45mL의 MEM을 첨가하였다. 그 후, 원심 분리(900rpm, 5분간)하였다. 얻어진 침전 분획(세포군)을 HAT 배지(10％ 소태아 혈청을 첨가한 RPMI1640 배지에, HAT Media Supplement(HAT 배지 보충제)(인비트로젠사제)를 첨가한 배지)에 현탁시키고, 비장 세포수를 1.5×107개/plate(플레이트)로 조제하였다. 해당 세포 현탁액을 96웰 플레이트에 200μL씩 파종하고, 37℃, 5％ CO2의 조건 하에서 배양하였다. 웰 내의 세포가 스크리닝에 적합한 세포수가 되기 전날에, HAT 배지를 사용하여 배지를 교환하였다.
(4) 하이브리도마의 스크리닝
(3)에서 제작한 하이브리도마에 대해서, 인간 및 래트의 Gas6과 Axl의 결합을 저해하는 항체를 생산하는 하이브리도마를, 이하에 기재하는 경합 ELISA법으로 선택하였다.
먼저, 96웰의 ELISA용 플레이트(Nunc사제)에, 2μg/mL의 hAxl-hFc 용액(실시예 3(7)에서 취득한 hAxl-hFc 용액을, PBS(나카라이테스크사제)로 희석한 용액)을 50μL/웰로 분주하고, 4℃에서 밤새 정치하여 흡착시켰다. 해당 플레이트를 Tween20-PBS로 5회 세정한 후, 1％ BSA-PBS(나카라이테스크사제)를 300μL/웰 첨가하고, 실온에서 1시간 정치하여 블로킹하며, Tween20-PBS(Wako사제)로 5회 세정하였다.
이어서, 이하의 방법으로 조제한 반응액을 해당 플레이트에 50μL/웰로 분주하고, 실온에서 1시간 정치한 후, Tween20-PBS로 5회 세정하였다. 반응액은, 100ng/mL의 hGas6-F 용액(실시예 2(9)에서 얻어진 hGas6-F 용액을 1％ BSA-PBS로 희석한 용액)을 하이브리도마의 배양 상청 또는 하이브리도마용 배지(음성 대조)와 등량씩 혼합하여, 4℃에서 30분 정치함으로써 조제하였다.
이어서, 검출용 항체로서 1％ BSA-PBS로 2000배 희석한 Monoclonal ANTI-FLAG M2-Peroxidase(HRP) antibody produced in mouse(마우스에서 생산된 모노클로날 항-FLAG M2-퍼옥시다아제(HRP) 항체)(Sigma-Aldrich)를 50μL/웰로 분주하고, 실온에서 1시간 정치하였다. 이 플레이트를 Tween20-PBS로 5회 세정하고, TMB(Sigma-Aldrich사제)를 50μL/웰 첨가하여 반응시켰다. 적당한 시점에서 1N 염산(Wako사제)을 50μL/웰 첨가하여 반응을 정지시키고, 각 웰의 용액에 대해서, 샘플 파장 450nm, 레퍼런스 파장 570nm에 있어서의 흡광도(450nm-570nm)를 플레이트 리더를 사용하여 측정하였다.
본 측정계에 있어서는, hGas6과 hAxl의 결합을 저해하는 항체가 하이브리도마 배양 상청 중에 포함되어 있는 경우, 해당 배양 상청을 첨가한 웰의 흡광도는, 음성 대조를 첨가한 웰의 흡광도보다도 저하된다. 따라서, 음성 대조를 첨가한 웰보다도 흡광도가 낮은 웰을 선택하고, 당해 웰에 첨가한 배양 상청에 대응하는 하이브리도마를 선택하였다.
동일한 방법으로, rGas6과 rAxl의 결합을 저해하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 선택하였다. 샘플로서 실시예 2(9), 실시예 3(7)에서 얻어진 rGas6-F, rAxl-hFc를 사용하였다.
(5) 고상 항원을 사용한 Gas6 결합 활성 측정 ELISA
이하에 기재하는 항원 결합 ELISA법에 의해, (4)에서 선택한 하이브리도마의 배양 상청 중의 항체가, hGas6-F 및 rGas6-F에 결합하고, hGas6과 상동성이 높은 인간 Protein S 및 FLAG-tag(BAP-F)에는 결합하지 않는 것을 확인하였다.
ELISA용 플레이트에 흡착시키는 항원으로서, 실시예 2(9)에서 정제한 hGas6-F, rGas6-F, hGas6과 상동성이 높은 Human Protein S(인간 단백질 S)(인간 혈청 유래, Enzyme Research Laboratories사제) 또는 Carboxy-terminal FLAG-BAP Fusion Protein(카르복시-말단 FLAG-BAP 융합 단백질)(이하, BAP-F라고 기재함)(Sigma-Aldrich사제)을 사용하였다.
먼저, 96웰의 ELISA용 플레이트(Nunc사제)에, 2μg/mL의 상기 항원 용액(각 항원을 PBS(나카라이테스크사제)로 조제한 것)을 50μL/웰로 분주하고, 4℃에서 밤새 정치하여 흡착시켰다. Tween20-PBS로 5회 세정한 후, 1％ BSA-PBS(나카라이테스크사제)를 300μL/웰 첨가하고, 실온에서 1시간 정치하여 블로킹하며, Tween20-PBS(Wako사제)로 5회 세정하였다. 이어서, 피검 물질로서 하이브리도마의 배양 상청을 50μL/웰로 분주하고, 실온에서 1시간 정치한 후, Tween20-PBS로 5회 세정하였다. 이어서, 1％ BSA-PBS를 사용하여 2000배로 희석한 polyclonal goat anti-mouse immunoglobulins/HRP(Dako, P0447)를 50μL/웰로 분주하고, 실온에서 1시간 정치하였다. 플레이트를 Tween20-PBS로 5회 세정하고, TMB(Sigma-Aldrich사제)를 50μL/웰 첨가하여 반응시키고, 적당한 시점에서, 1N 염산(Wako사제)을 50μL/웰 첨가하여 반응을 정지시키고, 샘플 파장 450nm, 레퍼런스 파장 570nm에 있어서의 흡광도(450nm-570nm)를 플레이트 리더(Spectra Max, Molecular Devices사제)를 사용하여 측정하였다.
(6) 하이브리도마의 클론화
(4) 및 (5)에서 선택한 하이브리도마는, 클로닝용 배지(10％ 소태아 혈청, 1％ HT Supplement(인비트로젠사제), 0.2％ Gentamicin Sulfate Solution(겐타마이신 황산염 용액)(나카라이테스크사제)을 첨가한, S 클론ㆍ클로닝 미디엄(에이디아사제))을 사용하여 한계 희석하고, 96웰 플레이트에 파종하여 클론화를 행하였다. 클론화는 1회만 행하였다. 이상의 조작에 의해, 인간 및 래트 Gas6에 결합하고, 또한 인간 및 래트 Gas6과 Axl의 결합을 저해하는 활성을 갖는 항체를 생산하는 하이브리도마를 2주 단리하였다.
(7) 하이브리도마로부터의 항체 취득
(6)에서 단리한 하이브리도마를, 세포 밀도가 1×107개/100mL가 되도록 부유 플라스크에 파종하였다. 배지에는 5％의 Fetal Bovine Serum-Ultra Low IgG(소태아 혈청-울트라 로우 IgG)(인비트로젠사제)를 포함하는 Hybridoma SFM 배지(인비트로젠사제)를 사용하였다. 세포를 37℃에서 7일간 정치 배양한 후, 세포를 포함하는 배지를 회수하였다. 회수한 배지를 원심 분리하고, 얻어진 배양 상청을 0.22㎛ 필터를 사용하여 여과하였다.
필터로 여과한 배양 상청으로부터, 통상의 방법을 사용하여 하이브리도마 유래의 항인간 Gas6 마우스 모노클로날 항체 KM5320 항체(이하, KM5320-mKG1 항체라고도 기재함), KM5321 항체(이하, KM5321-mKG1 항체라고도 기재함)를 정제하였다. 레진은 Protein G Sepharose 4 Fast Flow(단백질 G 세파로오스 4 패스트 플로우)(GE Healthcare사제)를 사용하였다. 얻어진 항체 용액은, 0.22㎛ 필터를 사용하여 멸균한 후, 실험에 사용하였다. 실시예 2(9)에 기재된 방법으로 흡광 계수를 산출하면, KM5320-mKG1 항체, KM5321-mKG1 항체의 흡광 계수는, 각각 1.54와 1.45였다.
[실시예 6] 부유 항원을 사용한 Gas6 결합 활성 평가
이하에 기재된 경합 ELISA법을 사용하여, 보다 천연에 가까운 상태의 각종 Gas6에 대한 취득 항체의 결합성을 확인하였다.
먼저, 96웰의 ELISA용 플레이트(Nunc사제)에, 2μg/mL의 항FLAG 항체[Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse(마우스에서 생산된 모노클로날 항-FLAG M2 항체)(Sigma-Aldrich사제)를, PBS(나카라이테스크사제)로 희석한 것]를 50μL/웰로 분주하고, 4℃에서 밤새 정치하여 흡착시켰다. 고상화 액을 제거한 후, 1％ BSA-PBS(나카라이테스크사제)를 300μL/웰 첨가하고, 실온에서 1시간 정치하여 블로킹하고, Tween20-PBS(Wako사제)로 5회 세정하였다.
이어서, 1μg/mL의 각종 Gas6-F 또는 BAP-F 용액[실시예 2(9)에서 얻어진 각종 Gas6-F 용액 또는 BAP-F(Sigma-Aldrich사제)를, 1％ BSA-PBS로 희석시킨 것] 50μL/웰로 분주하고, 실온에서 1시간 정치한 후, Tween20-PBS로 5회 세정하였다. 계속해서, KM5320-mKG, KM5321-mKG 및 CNTO 항체를 Biotin Labeling Kit(비오틴 라벨링 키트)-NH2(도진도(DOJINDO)사제)로 비오틴화하고, 1％ BSA-PBS로 적당한 농도로 조제한 것을 50μL/웰로 분주하고, 실온에서 1시간 정치하였다. 이 플레이트를 Tween20-PBS로 5회 세정한 후, 1％ BSA-PBS로 200배 희석한 Streptavidin HRP Conjugate(스트렙타비딘 HRP 컨쥬게이트)(R&D사제)를 50μL/웰로 분주하고, 실온에서 1시간 정치하였다. 이 플레이트를 Tween20-PBS로 5회 세정하고, TMB(Sigma-Aldrich사제)를 50μL/웰 첨가하여 반응시키고, 적당한 시점에서, 1N 염산(Wako사제)을 50μL/웰 첨가하여 반응을 정지시키고, 샘플 파장 450nm, 레퍼런스 파장 570nm에 있어서의 흡광도(450nm-570nm)를, 플레이트 리더를 사용하여 측정하였다.
또한, 취득 항체의 인간 단백질 S에 대한 결합 활성은, 실시예 5(5)와 동일한 방법으로 측정하였다. 샘플에는, 피검 물질로서 상기에서 조제한 비오틴화 KM5320-mKG, KM5321-mKG 및 CNTO 항체를 1％ BSA-PBS로 적당한 농도로 희석하여 사용하였다. 2차 검출 시약으로서, 1％ BSA-PBS로 200배 희석한 Streptavidin HRP Conjugate(R&D사제)를 사용하였다.
결과를 도 1에 기재한다. KM5320-mKG1 항체 및 KM5321-mKG1 항체는, 인간 Gas6-F, 원숭이 Gas6-F, 래트 Gas6-F 및 마우스 Gas6-F에 결합하고, 인간 Protein S 및 BAP-F에는 결합하지 않았다. 이 결과로부터, KM5320-mKG1 항체 및 KM5321-mKG1 항체는, 인간 Gas6, 원숭이 Gas6, 래트 Gas6 및 마우스 Gas6에 특이적으로 결합하는 항체인 것으로 나타났다.
또한, KM5320-mKG1 항체 및 KM5321-mKG1 항체의 인간 Gas6-F에 대한 결합 활성은, 항체 농도 0.0003μg/mL에서 검출되고, 0.04μg/mL에서 최대 활성에 달하였다. 한편, CNTO 항체의 인간 Gas6-F에 대한 결합 활성은, 항체 농도 0.04μg/mL에서 검출되고, 5μg/mL에서도 KM5320-mKG1 항체 및 KM5321-mKG1의 최대 활성의 절반 이하의 활성밖에 나타나지 않았다(도 1-A). 이 결과로부터, KM5320-mKG1 항체 및 KM5321-mKG1 항체는, CNTO 항체보다도 강력하게 각종 Gas6에 결합하는 것이 나타났다.
[실시예 7] 항Gas6 모노클로날 항체의 Gas6과 Axl의 결합 저해 활성 평가
KM5320-mKG1 항체, KM5321-mKG1 항체 및 CNTO 항체에 대해서, 실시예 5(4)와 동일한 방법으로, 각종 Gas6과 Axl의 결합 저해 활성을 측정하였다. 반응액에는, 100ng/mL의 각종 Gas6-F 용액(실시예 2(9)에서 얻어진 각종 Gas6-F 용액을 1％ BSA-PBS로 희석한 용액)과 최종 농도의 2배 농도의 각 항체 용액(실시예 4(3) 및 실시예 5(7)에서 얻어진 항체 용액을 1％ BSA-PBS로 희석한 것)을 등량씩 혼합한 것을 사용하였다.
결과를 도 2에 기재한다. KM5320-mKG1 항체, KM5321-mKG1 항체는, 인간, 원숭이, 래트 및 마우스 Gas6과 각각의 종 유래의 Axl과의 결합을 저해하였다. KM5320-mKG1 항체에서는, 50ng/mL의 인간 Gas6에 대하여, 약 200ng/mL의 항체를 첨가했을 때에, 인간 Gas6과 인간 Axl의 결합을 거의 완전히 저해하였다. 인간 Gas6의 분자량이 약 70kDa, 항체의 분자량이 약 140 내지 150kDa인 점에서, 이 결과는, 항체와 Gas6이 2:1의 몰농도비일 때에, KM5320-mKG1 항체는, 인간 Gas6과 인간 Axl의 결합을 완전히 저해하는 것이 나타났다. 동일하게, KM5321-mKG1 항체에서는, 50ng/mL의 인간 Gas6에 대하여, 약 60ng/mL의 항체를 첨가했을 때에, 인간 Gas6과 인간 Axl의 결합을 거의 완전히 저해하였다. 이 결과로부터, 항체와 Gas6이 1:2의 몰농도비일 때에, KM5321-mKG1 항체는, 인간 Gas6과 인간 Axl의 결합을 완전히 저해하는 것이 나타났다. 1분자의 항체에는 최대 2분자의 항원이 결합하기 때문에, KM5321-mKG1 항체는 매우 강한 결합 활성을 갖는 것으로 나타났다.
한편, CNTO 항체는, 검토한 항체 농도에 있어서, 각종 Gas6과 Axl의 결합을 전혀 저해하지 않았다.
이상으로부터, KM5320-mKG1 항체, KM5321-mKG1 항체는, CNTO 항체보다도 강력한 중화 활성을 갖는 것이 나타났다.
[실시예 8] Gas6 의존적인 세포 내 시그널에 대한 취득 항체의 작용
Gas6의 수용체로서는, Axl 이외에, Sky 및 Mer이 알려져 있다. Gas6이 세포 상에서 발현한 당해 수용체에 결합하면, 세포 내에서는 당해 수용체를 통한 시그널 전달 경로가 활성화된다. 이 세포 내 시그널 전달에 대한 취득 항체의 작용을 확인하기 위해서, Gas6 수용체의 강제 발현 세포주를 사용한 리포터 측정을 실시하였다.
당해 Gas6 수용체의 강제 발현 세포주에는, Gas6 수용체의 하류 시그널 전달에 관여하는 전사 인자의 하나인, Egr1(Early Growth Response 1)의 인식 서열을 포함하는 벡터를 도입하였다. 또한, 벡터 중의 Egr1 인식 서열의 하류에는 루시페라아제 유전자를 조립하였다. 본 측정계에서는, Gas6이 상기 세포주 상의 Gas6 수용체에 결합하면, 세포 내에서 시그널 전달 경로가 활성화되어, Egr-1의 발현이 증가한다. Egr1은 Egr1 인식 서열에 결합하고, 루시페라아제 유전자의 발현을 증가시킨다. 따라서, 생합성된 루시페라아제의 발광 강도를 검출함으로써, Gas6 첨가에 의한 세포 내 시그널 전달 경로의 활성화 상태를 확인할 수 있다.
(1) Gas6 수용체 발현 벡터의 구축
먼저, 인간 Axl의 발현 벡터를 구축하였다.
당해 벡터는, 서열 번호 26으로 표시되는 인간 Axl의 유전자 서열(GeneCopoeia사제)(GenBank 액세션 번호 NM_021913)이 조립된 플라스미드를 주형으로 하여 이하에 기재하는 방법으로 제작하였다. 주형 플라스미드, 각 10pmol의 프라이머 22, 23(서열 번호 50, 51) 및 PrimeSTAR HS DNA Polymerase(다카라바이오사제)를 포함하는 20μL의 반응액을 조제하고, 94℃에서 5분간 보온한 후, 98℃에서 10초간, 55℃에서 5초간, 72℃에서 3분 30초간을 1사이클로 하여 30사이클의 PCR을 행하였다. 얻어진 PCR 산물을 아가로오스 겔 전기 영동에 제공하고, QIAquick Gel Extraction Kit(퀴아젠사제)를 사용하여 약 2.7kbp의 증폭 DNA 단편(hAxl의 염기 서열을 포함하는 DNA 단편)을 회수하였다. 또한, 공지된 적당한 동물 세포 발현 벡터를 EcoRI 및 BamHI로 효소 소화시키고, 아가로오스 겔 전기 영동에 제공한 후, QIAquick Gel Extraction Kit를 사용하여 목적으로 하는 DNA 단편을 회수하였다. 얻어진 2종류의 DNA 단편을 In-Fusion HD Cloning Kit(클론텍사제)를 사용하여 결합시켜, hAxl 재조합체 발현 벡터를 얻었다. 얻어진 발현 벡터 중에 포함되는 인간 Axl 유전자 서열에 대하여 해석한 결과, 서열 번호 26으로 표시되는 인간 Axl 유전자의 1546번째의 시토신이 티미딘으로 치환되어 있었다. 그러나, 어느 염기 서열에 대해서도, 추정되는 아미노산 서열이 동일(GenBank 액세션 번호 NP_068713)하며, 동일한 염기 서열의 유전자 다형이 존재하는 점에서, 본 서열을 이후의 실험에 사용하였다.
동일한 방법으로 인간 Sky 유전자를 적당한 공지된 동물 세포 발현 벡터에 조립하여, 인간 Sky 재조합체 발현 벡터를 조제하였다. PCR의 주형으로서, 서열 번호 52로 표시되는 인간 Sky 유전자 서열(GenBank 액세션 번호 NM_006293)이 조립된 플라스미드(인비트로젠사제)를 사용하였다. PCR에는, 상기 주형 플라스미드, 각 10pmol의 프라이머 24, 25(서열 번호 54, 55) 및 PrimeSTAR Max DNA Polymerase(다카라바이오사제)를 포함하는 20μL의 반응액을 조제하고, 98℃에서 10분간 보온한 후, 98℃에서 10초간, 55℃에서 5초간, 72℃에서 1분 30초간을 1사이클로 하여 30사이클의 PCR을 행하였다. 얻어진 발현 벡터에 포함되는 인간 Sky의 염기 서열에 대하여 해석한 결과, 서열 번호 52로 표시되는 인간 Sky의 염기 서열의 2168번째의 티미딘이 시토신으로 치환되어 있었다. 그러나, 어느 염기 서열에 대해서도, 추정되는 아미노산 서열이 동일(GenBank 액세션 번호 NP_06284)하며, 동일한 염기 서열의 유전자 다형이 존재하는 점에서, 본 서열을 사용하기로 하였다.
동일한 방법으로 인간 Mer 유전자를 적당한 공지된 동물 세포 발현 벡터에 조립하여, 인간 Mer 재조합체 발현 벡터를 조제하였다. PCR의 주형 플라스미드로서, 서열 번호 56으로 표시되는 인간 Mer 유전자 서열, (GenBank 액세션 번호 NM_006343)이 조립된 플라스미드(GeneCopoeia사제)를 사용하였다. PCR은, 상기 주형 플라스미드, 각 10pmol의 프라이머 26, 27(서열 번호 58, 59) 및 PrimeSTAR Max DNA Polymerase(다카라바이오사제)를 포함하는 20μL의 반응액을 조제하고, 98℃에서 10분간 보온한 후, 98℃에서 10초간, 55℃에서 5초간, 72℃에서 5초간을 1사이클로 하여 30사이클의 PCR을 행하였다.
(2) 숙주 세포로의 Gas6 수용체 발현 벡터 및 루시페라아제 리포터 벡터의 도입
상기 (1)에서 제작한 3종류의 Gas6 수용체 발현 벡터 및 리포터 벡터를 이하에 기재하는 방법으로 숙주 세포 HEK293F 세포(인비트로젠사)에 도입하였다. 세포 배양의 배지는, FreeStyle 293 Expression Medium(프리스타일 293 발현 배지)(invitrogen사제)을 사용하고, 37℃, 5％ CO2 조건 하에서 진탕 배양하였다. 리포터 벡터는, 마우스의 Egr1 인식 서열(서열 번호 60)을 루시페라아제 리포터 벡터인 pGL3 벡터(프로메가사제)에 삽입한 pGL3-mEgr1을 사용하였다(Nature 444, 770-774, 2006, PNAS85(21), 7857-61, 1988).
각 Gas6 수용체 발현 벡터 및 pGL3-mEgr1을 Opti-Pro SFM(invitrogen사제)에, 또한 293fectin Transfection Reagent(293펙틴 형질감염 시약)(invitrogen사제)를 OptiPro SFM에 각각 용해시키고, 실온에서 5분간 방치하였다. 상기 2액을 혼합하고, 실온에서 20분간 방치한 후, HEK293F 세포 배양액에 적하하고, 5시간 진탕 배양하였다. 이렇게 하여 얻어진 세포주를 각각, 인간 Axl-mEgr1 전사 인자 프로모터의 리포터 세포주, 인간 Sky-mEgr1 전사 인자 프로모터의 리포터 세포주, 인간 Mer-mEgr1 전사 인자 프로모터의 리포터 세포주라고 기재한다.
(3) 리포터 측정
(2)에서 제작한 3종의 Gas6 수용체(Axl, Sky 또는 Mer-mEgr1 전사 인자 프로모터의 리포터 세포주를 1.6×104개/웰이 되도록 96웰 흑색 플레이트에 80μL씩 파종하였다. 이어서, 80μg/mL(최종 농도의 10배 농도의 KM5320-mKG1 또는 KM5321-mKG1을 포함하는 배지[실시예 5(7)에서 얻은 항체 용액을 FreeStyle 293 Expression Medium(invitrogen사제)로 희석한 것]를 10μL/웰로 첨가하고, 1시간 정치 배양하였다. 아이소타입 컨트롤로서, 상기와 동일한 방법으로 조정한 80μg/mL의 IgG1 isotype control(purified mouse monoclonal IgG1(정제된 마우스 모노클로날 IgG1), R&D사제)을 포함하는 배지를 10μL/웰로 첨가하였다.
계속해서, 20μg/mL(최종 농도의 10배 농도)의 hGas6-F를 포함하는 배지[실시예 2(9)에서 조제한 hGas6-F 용액을 FreeStyle 293 Expression Medium으로 희석한 것]를 10μL/웰로 첨가하고, 정치 배양하였다. 또한, 음성 대조로서 상기 세포주와 배지만을 첨가한 웰도 준비하였다. 12 내지 14시간 후에 화학 발광 시약(Steady Glo Luciferase assay system(스테디 글로 루시페라아제 측정계), 프로메가사제)을 100μL/웰로 첨가하고, 루미노미터(Veritas사제)를 사용하여 각 웰의 발광 강도를 측정하였다.
결과를 도 3에 기재한다. hGas6-F와 Isotype control을 첨가했을 때는, 어느 Gas6 수용체 강제 발현 세포에 있어서도, 배지만을 첨가했을 때와 비교하여 발광 강도가 3배 정도 증가하였다. 한편, hGas6-F와 KM5320-mKG1 또는 KM5321-mKG1을 첨가했을 때는, 배지만을 첨가했을 때와 동일한 정도의 발광 강도를 나타내었다.
상술한 바와 같이, 본 측정계에서는 세포 내 시그널 전달 경로의 활성화에 따라서, 검출되는 루시페라아제의 발광 강도가 증가된다. 따라서, 인간 Gas6을 각종 Gas6 수용체 강제 발현 세포주에 첨가하면, 세포 내 시그널 전달 경로가 활성화되는 것, 및 KM5320-mKG1, KM5321-mKG1은 모두 당해 활성화를 저해하는 것으로 나타났다.
또한, 실시예 7과 동일한 방법으로 계산하면, KM5320-mKG1 항체, KM5321-mKG1 항체는 모두, 항체와 Gas6이 2:1의 몰농도에서, Gas6에 의한 세포 내 시그널 전달 경로의 활성화를 완전히 저해하였다. 이로부터, KM5320-mKG1 항체, KM5321-mKG1 항체는 매우 강한 중화 활성을 갖는 것이 나타났다.
[실시예 9] 인간 신장 메산지움 세포에 있어서의 인산화 시그널에 대한 본원 발명의 항인간 Gas6 모노클로날 항체의 작용
실시예 8보다도 생체에 가까운 조건 하에서, Gas6과 Gas6 수용체의 결합에 의해 발생하는 세포 내 시그널에 대한 취득 항체의 작용을 확인하였다. Gas6의 결합에 의해 Gas6 수용체가 활성화되면, 당해 수용체 발현 세포 내에서 Akt가 인산화되는 것으로 알려져 있다. 그 때문에, 각 Gas6 수용체를 천연적으로 발현하고 있는 인간 신장 메산지움 세포(Sciencell사제, 이하, 간단히 인간 메산지움 세포라고 기재함)를 사용하여, 이하에 기재하는 방법으로 Gas6 첨가에 의한 Akt의 인산화 레벨을 검출하였다.
인간 메산지움 세포에 Axl, Sky, Mer의 각 Gas6 수용체가 발현하고 있는 것은, 공지된 방법으로 FACS 해석을 행함으로써 확인하였다. FACS 해석에 대해서, 각 Gas6 수용체의 검출에는, 각각, Anti-Axl antibody(항-Axl 항체)(abcam사제, MM0098-2N33), Human Dtk MAb(R&D사제, Clone 96201), Human Mer MAb(R&D사제, Clone 125518)를 사용하였다. 2차 항체에는 Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG(H+L) Antibody(알렉사 플루오르 488 염소 항-마우스 IgG(H+L) 항체)(invitrogen사제)를 사용하였다.
인간 메산지움 세포를 Mesangial Cell Medium(메산지움 세포 배지)(Sciencell사제, 이하, MCM이라고 기재함)에 2％ FBS 및 1％ mesangial cell growth supplement(메산지움 세포 성장 보충제)(MCM에 첨부한 것)를 첨가한 배지에 현탁시키고, 0.5×104개/웰이 되도록 12웰 플레이트에 파종하여, 37℃, 5％ CO2 조건 하에서 정치 배양하였다. 2일 후에, 배지를 첨가물을 포함하지 않은 MCM으로 교환하여 정치 배양하였다. 1일 후에, 웰을 MCM으로 1회 세정하고, 400μL/웰의 MCM을 새롭게 첨가하였다.
이어서, MCM으로 최종 농도의 10배 농도가 되도록 희석한 실시예 4(3)에서 조제한 항체 샘플, hAXL-hFc 및 아이소타입 컨트롤 항체를 50μL/웰로 첨가하여, 1시간 정치 배양하였다. 아이소타입 컨트롤 항체(음성 대조)에는 IgG1 isotype control(purified mouse monoclonal IgG1, R&D사제)을 사용하였다. 계속해서, MCM으로 최종 농도(0.1μg/mL)의 10배 농도가 되도록 희석한, hGas6-F 또는 MCM만을 50μL/웰 첨가하고, 10분간 정치 배양하였다. 얼음 상에서 배지를 제거하고, Protease inhibitor cocktail(프로테아제 억제제 칵테일)(시그마 알드리치사제)을 포함하는 PBS로 세정 후, Protease inhibitor cocktail과 2-머캅토에탄올(나카라이테스크사제)을 포함하는 PBS로 5배 희석한 Lane Marker Non-Reducing Sample Buffer(레인 마커 비-환원 샘플 버퍼)(Thermo Fisher사제)를 120μL/웰 첨가하였다.
각 웰 중의 샘플을 회수하고, 95℃에서 10분간 가열하였다. 가열 후의 샘플을 eㆍ파젤(5 내지 20％, ATTO사제)에 제공한 후, SDS 아크릴아미드 겔 전기 영동법에 의해 단백질을 분리하였다. 분리 후, 단백질을 세미드라이 블롯법으로 PVDF막에 전사하고, 웨스턴 블롯팅을 행하였다. 1차 항체에는, 항Akt 항체(Cell Signaling사제, #4691)를 1000배 희석, 또는 항Phospho-Akt(Ser273) 항체(Cell Signaling사제, #4060)를 2000배 희석한 것을 사용하였다. 2차 항체에는 항토끼 IgG 항체-HRP(dako사제, P0448)를 사용하였다. 상기 항체의 희석에는, 5％의 ECL Blocking Agent(블로킹제)(GE 헬스케어사제)를 포함하는 1×TBST(Santa Cruz사제)를 사용하였다. 발색 기질에는 ECL Select Western Blotting Detection Reagent(ECL 셀렉트 웨스턴 블롯팅 검출 시약)(GE 헬스케어사제)를 사용하고, ImageQuant LAS500(GE 헬스케어사제)을 사용하여 화학 발광을 검출하였다.
결과를 도 4에 기재한다. 메산지움 세포에 hGas6을 첨가하면, Akt의 인산화 레벨이 항진되었다. 한편, hAXL-hFc, KM5320-mKG1 항체 및 KM5321-mKG1 항체는, 모두 hGas6에 의한 Akt의 인산화 레벨의 항진을, 농도 의존적으로 억제하였다. 또한, Isotype control은, hGas6에 의한 Akt의 인산화 레벨의 항진을 억제하지 않았다.
이 결과로부터, KM5320-mKG1 항체, KM5321-mKG1 항체는, 원래 Gas6 수용체를 발현하고 있는 인간 메산지움 세포에 있어서도, hGas6 첨가에 의해 발생하는 세포 내 시그널 전달 경로의 활성화를 저해하는 것이 나타났다.
[실시예 10] 본원 발명의 항인간 Gas6 모노클로날 항체와 항인간 Gas6 모노클로날 항체 CNTO 항체와의 경합 저해 실험
취득 항체와 CNTO 항체가 경합하여 인간 Gas6에 결합하는지 여부를, 경합 ELISA를 사용하여 확인하였다.
경합 ELISA는 이하에 기재하는 방법으로 행하였다. 96웰의 ELISA용 플레이트(Nunc사제)에, Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse(Sigma- Aldrich사제)를, PBS(나카라이테스크사제)로 2μg/mL로 조제한 것을 50μL/웰로 분주하고, 4℃에서 밤새 정치하여 흡착시켰다. 고상화 액을 제거한 후, 1％ BSA-PBS(나카라이테스크사제)를 300μL/웰 첨가하고, 실온에서 1시간 정치하여 블로킹하며, Tween20-PBS(Wako사제)로 5회 세정하였다. 이어서, hGas6-F를 1％ BSA-PBS 로 1μg/mL의 농도로 조제한 것을 50μL/웰로 분주하고, 실온에서 1시간 정치하였다.
이어서, 실시예 4(3)에서 조제한 CNTO 항체를 Biotin Labeling Kit-NH2(DOJINDO사제)로 비오틴화하고, 최종 농도(2μg/mL)의 2배 농도가 되도록 1％ BSA-PBS로 희석하여, 비오틴화 CNTO 항체 용액을 조정하였다. 또한, 피검 물질로서 실시예 5(7)에서 조제한 미표지의 KM5320-mKG1 항체, KM5321-mKG1 항체, 및 실시예 4(3)에서 조제한 미표지의 CNTO300을 최종 농도의 2배 농도가 되도록 1％ BSA-PBS로 희석하고, 각각을 비오틴화 CNTO 항체 용액과 등량씩 혼합하여, 실온에서 1시간 정치하였다. 플레이트를, Tween20-PBS로 5회 세정한 후, 상기 혼합 샘플을 50μL/웰로 분주하여, 실온에서 1시간 정치하였다.
상기 플레이트를 Tween20-PBS로 5회 세정한 후, 1％ BSA-PBS로 200배 희석한 Streptavidin HRP Conjugate(R&D사제)를 50μL/웰로 분주하고, 실온에서 1시간 정치하였다. 플레이트를 Tween20-PBS로 5회 세정하고, TMB(Sigma-Aldrich사제)를 50μL/웰 첨가하여 발색시키고, 적당한 발색이 얻어진 시점에서, 1N 염산(Wako사제)을 50μL/웰 첨가하고, 샘플 파장 450nm, 레퍼런스 파장 570nm에 있어서의 흡광도(450nm-570nm)를 플레이트 리더를 사용하여 측정하였다.
결과를 도 5에 기재한다. CNTO 항체를 피검 물질로 한 경우에는, 음성 대조보다도 흡광도가 저하되었다. 한편, KM5320-mKG1 항체, KM5321-mKG1 항체를 피검 물질로 한 경우에는, 음성 대조와 동일한 정도의 흡광도였다. 피검 물질인 상기 미표지의 Gas6 모노클로날 항체가, 비오틴화 CNTO 항체와 경합하여 인간 Gas6에 결합할 때, 검출되는 흡광도가 음성 대조보다도 저하된다. 따라서, KM5320-mKG1 항체 및 KM5321-mKG1 항체와 CNTO 항체는, 경합하지 않고 hGas6에 결합하는 것으로 나타났다.
[실시예 11] 항인간 Gas6 모노클로날 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 유전자 서열의 단리
(1) 항인간 Gas6 모노클로날 항체 생산 하이브리도마 세포로부터의 총 RNA의 조제
5×106개의 KM5320-mKG1 항체, KM5321-mKG1 항체를 각각 생산하는 하이브리도마로부터, RNAeasy Mini kit(QIAGEN사제) 및 QIA shredder(QIAGEN사제)를 사용하여, 총 RNA를 조제하였다.
(2) 항인간 Gas6 모노클로날 항체의 VH 및 VL의 유전자 클로닝
(1)에서 취득한 1μg의 총 RNA로부터, SMARTer RACE cDNA Amplification Kit(증폭 키트)(Clontech사제)를 사용하여, cDNA를 제작하였다. 얻어진 cDNA를 주형으로 하여, 키트가 첨부된 유니버설 프라이머 A mix(정방향 프라이머를 함유함)와, 마우스 IgG1 중쇄 정상 영역을 코딩하는 역방향 프라이머(프라이머 28(서열 번호 65)) 및 PrimeSTAR Max DNA Polymerase(다카라바이오사제)를 포함하는 25μL의 반응액을 조제하여, PCR을 행하였다. PCR은, 98℃에서 10초간 보온한 후, 98℃에서 10초간, 55℃에서 5초간, 및 72℃에서 5초간을 1사이클로 하여 30사이클 행하여, 각 항체의 VH의 유전자를 포함하는 DNA 단편을 증폭시켰다.
또한, 유니버설 프라이머 A와 마우스 Ig(κ) 특이적인 프라이머(프라이머 29(서열 번호 66))를 사용하여 동일하게 PCR을 행하고, 각 항체의 VL의 유전자를 포함하는 DNA 단편을 증폭시켰다. PCR 산물을 아가로오스 겔 전기 영동에 제공하고, QIAquick Gel Extraction Kit(퀴아젠사제)를 사용하여 증폭 DNA 단편을 회수하였다. 얻어진 증폭 DNA 단편을, ZERO BLUNT TOPO PCR CLONING KIT(인비로젠사제)를 사용하여 pCR4-Blunt-TOPO 벡터에 삽입하고, 실시예 2(1)과 동일한 방법으로 플라스미드를 취득하였다. 얻어진 플라스미드의 염기 서열을 해석하여, cDNA의 5' 말단에 개시 코돈으로 추정되는 ATG 서열이 존재하는 완전 길이의 VH cDNA 및 VL cDNA가 취득된 것을 확인하였다.
(3) 항인간 Gas6 모노클로날 항체 V 영역의 유전자 서열의 해석
(2)에서 얻어진 KM5320-mKG1 항체의 VH의 전체 염기 서열을 서열 번호 67에, 해당 서열로부터 추정된, 시그널 서열을 포함한 VH의 전체 아미노산 서열을 서열 번호 68에, 서열 번호 68에 나타낸 아미노산 서열로부터 시그널 서열을 제외한 아미노산 서열을 서열 번호 69에 각각 나타내었다. 또한, KM5320-mKG1 항체의 VL의 전체 염기 서열을 서열 번호 70에, 해당 서열로부터 추정된, 시그널 서열을 포함한 VL의 전체 아미노산 서열을 서열 번호 71에, 서열 번호 71에 나타낸 아미노산 서열로부터 시그널 서열을 제외한 아미노산 서열을 서열 번호 72에 각각 나타내었다.
KM5321-mKG1 항체의 VH의 전체 염기 서열을 서열 번호 73에, 해당 서열로부터 추정된, 시그널 서열을 포함한 VH의 전체 아미노산 서열을 서열 번호 74에, 서열 번호 74에 나타낸 아미노산 서열로부터 시그널 서열을 제외한 아미노산 서열을 서열 번호 75에 각각 나타내었다. 또한, KM5321-mKG1 항체의 VL의 전체 염기 서열을 서열 번호 76에, 해당 서열로부터 추정된, 시그널 서열을 포함한 VL의 전체 아미노산 서열을 서열 번호 77에, 서열 번호 77에 나타낸 아미노산 서열로부터 시그널 서열을 제외한 서열을 서열 번호 78에 각각 나타내었다.
기지의 마우스 항체의 서열 데이터[SEQUENCES of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services(1991)]와의 비교로부터, 단리된 각각의 cDNA는 분비 시그널 서열을 포함하는 KM5320-mKG1 항체, KM5321-mKG1 항체를 코딩하는 완전 길이 cDNA인 것을 확인하였다.
각 모노클로날 항체의 VH 및 VL의 CDR을, 기지의 항체의 아미노산 서열과 비교함으로써 동정하였다. KM5320-mKG1 항체의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 서열 번호 79, 80 및 81에, VL의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 서열 번호 82, 83 및 84에 각각 나타내었다. KM5321-mKG1 항체의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 서열 번호 85, 86 및 87에, VL의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 서열 번호 88, 89 및 90에 각각 나타내었다.
[실시예 12] 항인간 Gas6 마우스-래트 키메라 항체의 조제
이하에 기재하는 방법으로 항Gas6 마우스 모노클로날 항체 KM5320-mKG1 항체 및 KM5321-mKG1 항체로부터 마우스-래트 IgG1 키메라 항체(이하, 간단히 래트 키메라 항체라고 약기함)를 제작하였다. 이하, 각각의 래트 키메라 항체를 KM5320-rKG1 항체 및 KM5321-rKG1 항체라고 기재한다.
(1) 래트 키메라 항체 발현 벡터의 구축
공지된 적당한 동물 세포 발현 벡터의 적당한 위치에, KM5320-rKG1 항체의 중쇄 전체 길이의 염기 서열(서열 번호 91) 및 경쇄 전체 길이의 염기 서열(서열 번호 93)을 통상의 방법을 사용하여 탠덤으로 조립하였다. 서열 번호 91로 표시되는 KM5320-rKG1 항체의 중쇄 전체 길이의 염기 서열은, KM5320 항체의 VH의 전체 염기 서열(서열 번호 67) 및 래트 IgG1 중쇄 정상 영역을 포함하는 유전자 서열을 포함한다. 또한, 서열 번호 93으로 표시되는 KM5320-rKG1 항체의 경쇄 전체 길이의 염기 서열은, KM5320 항체의 VL의 전체 염기 서열(서열 번호 70)과 래트 Ig(κ) 정상 영역을 포함하는 유전자 서열을 포함한다.
동일하게 하여, 공지된 적당한 동물 세포 발현 벡터의 적당한 위치에, KM5321-rKG1 항체의 중쇄 전체 길이의 염기 서열(서열 번호 95) 및 경쇄 전체 길이의 염기 서열(서열 번호 97)을 통상의 방법을 사용하여 탠덤으로 조립하였다. 서열 번호 95로 표시되는 KM5321-rKG1 항체의 중쇄 전체 길이의 염기 서열은, KM5321 항체의 VH의 전체 염기 서열(서열 번호 73) 및 래트 IgG1 중쇄 정상 영역을 포함하는 유전자 서열을 포함한다. 또한, 서열 번호 97로 표시되는 KM5321-rKG1 항체의 경쇄 전체 길이의 염기 서열은, KM5321 항체의 VL의 전체 염기 서열(서열 번호 76) 및 래트 Ig(κ) 정상 영역을 포함하는 유전자 서열을 포함한다.
(2) 래트 키메라 항체 안정 발현 세포주의 제작
(1)에서 제작한 발현 벡터를, 실시예 2(5) 및 통상의 방법에 준하여, CHO-K1 세포(European Collection of Cell Cultures; ECACC)에 도입하여, 래트 키메라 항체 안정 발현 세포주를 제작하였다.
(3) 래트 키메라 항체의 정제
(2)에서 제작한 래트 키메라 항체 안정 발현 세포를, 공지된 단백질 발현용 배지에서 몇일간 배양하고, 배양 상청을 회수하였다. 실시예 3(7) 및 공지된 방법에 준하여, 회수한 배양 상청으로부터 KM5320-rKG1 및 KM5321-rKG1을 정제하였다. 실시예 2(9)에 기재된 방법에 준하여 항체의 흡광도를 측정하면, KM5320-rKG1 항체의 흡광 계수는 1.54, KM5321-rKG1 항체의 흡광 계수는 1.45였다.
얻어진 래트 키메라 항체에 대해서는, 실시예 6 및 실시예 7과 동일한 방법으로, hGas6에 대한 결합 활성 및 hGas6과 hAxl-Fc의 결합을 저해하는 활성이, 각각의 친항체와 동등한 것을 확인하였다.
[실시예 13] 항인간 Gas6 모노클로날 항체의 에피토프 해석
취득 항체의 에피토프를 해석하기 위해서, 인간 Gas6 도메인 결손체 및 당해 단백질의 아미노산의 일부를 알라닌으로 치환한 변이 단백질을 조제하고, 취득 항체의 결합 활성의 변화를 확인하였다.
(1) 인간 Gas6 변이체(도메인 결손체) 발현 벡터의 조제
hGas6으로부터 Gla 도메인을 제거하고, 또한 C 말단에 FLAG 태그 및 His 태그를 부가한 Gas6 변이체(이하, hGas6-FH라고 기재함)를 취득하기 위해서, 이하에 기재한 방법으로 당해 단백질의 발현 벡터를 제작하였다.
진스크립트사에서, 서열 번호 99로 표시되는 염기 서열(hGas6-delta)을 전체 합성하여, 적당한 플라스미드에 조립하였다. 서열 번호 99로 표시되는 염기 서열은, 5' 말단으로부터 EcoRI 인식 서열, hGas6-FH의 염기 서열 및 BamHI 인식 서열을 포함한다. hGas6-FH의 염기 서열은, 서열 번호 3으로 표시되는 hGas6의 염기 서열 중, 91번째로부터 273번째까지의 염기 서열을 제거하고, 3' 말단에 공지된 FLAG 태그 및 His 태그를 코딩하는 염기 서열을 결합시킨 염기 서열이다.
얻어진 플라스미드 및 동물 세포 발현용 벡터 INPEP4(Biogen-IDEC사제)를 EcoRI 및 BamHI로 효소 처리하고, 실시예 2(1)과 동일한 방법으로, hGas6-FH 발현 벡터인 INPEP-hGas6-FH를 얻었다.
(2) 인간 Gas6 변이체(알라닌 치환체) 발현 벡터의 조제
(1)에 기재한 hGas6-FH의 아미노산 서열 중, 서열 번호 4로 표시되는 인간 Gas6의 전체 길이 아미노산 서열에 314번째의 류신, 315번째의 글루타민, 316번째의 프롤린과 대응하는 아미노산을 모두 알라닌으로 치환한 변이체(이하 hGas6-FH-L314A, Q315A, P316A 또는 간단히 알라닌 치환체라고 기재함)의 발현 벡터를 제작하였다.
상기 알라닌 변이체를 발현하는 벡터는, 이하에 기재하는 방법으로 (1)에서 제작한 INPEP-hGas6-FH로 부위 특이적 변이 도입을 행함으로써 제작하였다. 주형인 INPEP-hGas6-FH, 각 10pmol의 프라이머 30, 31(서열 번호 101, 102) 및 PrimeSTAR Max DNA Polymerase(다카라바이오사제)를 포함하는 25μL의 반응액을 조제하여 PCR을 행하였다. PCR은 98℃에서 10초간 보온한 후, 98℃에서 10초간, 55℃에서 5초간, 및 72℃에서 5초간을 1사이클로 하여 30사이클 행하여, 각 변이체의 염기 서열을 포함하는 DNA 단편을 증폭시켰다. PCR 산물에 DpnI를 첨가하고, 37℃에서 1시간 제한효소 처리함으로써, 변이가 삽입되지 않은 주형 벡터의 소화를 행하였다. DpnI 소화 후의 PCR 산물을 대장균 DH5α에 도입하고, 얻어진 형질 전환체로부터, 원하는 변이가 삽입된 유전자를 갖는 플라스미드를 얻었다.
(3) 인간 Gas6 변이체 일과성 발현 세포주의 조제
인간 Gas6 변이체(hGas6-F 및 알라닌 치환체)의 발현 세포주의 조제에는, Expi293 세포(invitrogen사제)를 사용하였다. 세포 배양의 배지에는 Expi293TM Expression Medium(invitrogen사제)을 사용하고, 37℃, 5％ CO2 조건 하에서 진탕 배양하였다. Expi293 세포에, (1), (2)에서 제작한 각종 인간 Gas6 변이체 발현 벡터를 도입하여, 각종 인간 Gas6 변이체의 일과성 발현 세포주를 얻었다. 세포로의 발현 벡터의 도입에는, ExpiFectamine 293 Transfection Kit(invitrogen사제)를 첨부 문서에 따라서 사용하였다.
(4) 각종 인간 Gas6 변이체를 포함하는 배양 상청으로부터의 인간 Gas6 변이체 정제
(3)에서 취득한 각종 인간 Gas6 변이체 일과성 발현 세포주를, ExpiFectamine 293 Transfection Kit(invitrogen사제)의 첨부 문서에 따라서, 4일간 배양하여 배지를 회수하였다. 회수한 배지를 원심 분리하고, 얻어진 배양 상청을 0.22㎛ 필터를 사용하여 여과함으로써 각종 인간 Gas6 변이체를 포함하는 배양 상청을 조제하였다.
배양 상청은, 실시예 2(9)과 동일한 방법으로 ANTI-FLAG M2 Affinity Gel(Sigma-Aldrich사제)을 사용하여 정제하였다. 용출 완충액에는 3M 염화마그네슘(나카라이테스크사제)을 사용하고, 얻어진 인간 Gas6 변이체 용액의 완충액은 PBS(나카라이테스크사제)로 치환하며, 0.22㎛ 필터를 사용하여 멸균 여과한 후, 시험에 사용하였다.
(5) 각종 인간 Gas6 변이체에 대한 취득 항체의 결합 활성 평가
취득 항체가 결합하는 Gas6의 에피토프를 결정하기 위해서, (4)에서 정제한 각종 인간 Gas6 변이체에 대한 결합 활성을 실시예 6에 기재된 방법에 준하여 평가하였다. 실험은 N=2로 행하고, 얻어진 흡광도의 평균값이 0.1 이하일 때를 결합하지 않는다고 판정하고, 2 이상일 때를 결합한다고 판정하였다.
항원 샘플에는, 실시예 2(9)에서 조제한 hGas6-F 및 (3)에서 조제한 각종 인간 Gas6 변이체를 사용하였다. 항체 샘플에는 실시예 12(3)에서 조제한 KM5320-rKG1 및 KM5321-rKG1 항체를 Biotin Labeling Kit-NH2(DOJINDO사제)로 비오틴화한 것을, 1％ BSA-PBS로 1μg/mL가 되도록 희석하여 사용하였다. 또한, 양성 대조로서 anti-human(항-인간) Gas6(R&D사제, DY885)을 1％ BSA-PBS로 0.2ng/mL가 되도록 희석하여 사용하였다.
결과를 표 1에 기재한다. 항체가 각 항원에 결합했을 때를 ○, 결합하지 않았을 때를 X로 나타내었다.
Figure pct00001
KM5320-rKG1 및 KM5321-rKG1 항체는, hGas6-F 및 hGas6-FH에 동일한 정도의 강도로 결합하였다. 한편, 이 항체는, hGas6-FH-L314A, Q315A, P316A에 결합하지 않았다. 이상으로부터, KM5320-rKG1 및 KM5321-rKG1 항체는, 서열 번호 4로 표시되는 인간 Gas6의 전체 길이 아미노산 서열 중, 314번째의 류신, 315번째의 글루타민, 316번째의 프롤린의 적어도 어느 하나에 결합하는 것으로 나타났다.
[실시예 14] 항인간 Gas6 모노클로날 항체의 암 세포주의 증식 억제 활성 평가
Gas6 의존적인 암 세포 증식에 대한 항인간 Gas6 모노클로날 항체의 작용을 확인하기 위해서, 3종류의 인간 암 세포주를 사용하여 세포 증식 분석을 행하였다.
췌장암 세포주 Panc-1 세포(American Type Culture Collection), 악성 흑색종 세포주 A375 세포(다이니폰 세야꾸), 위암 세포주 MKN7 세포(리켄 셀 뱅크)를 사용하여 증식 분석을 행하였다. 각 세포에 있어서의 Gas6 수용체의 발현 유무는, 플로우 사이토미터를 사용하여 실시예 9와 동일한 방법으로 측정하여, 각각, Axl과 Mer, Axl과 Sky, Axl과 Sky가 발현하고 있음을 확인하였다.
Panc-1 세포, A375 세포를 DMEM(life Technologies사제)에 10％ FBS(life Technologies사제)를 첨가한 배지에 현탁, MKN7 세포를 RPMI 1640(life Technologies사제)에 10％ FBS를 첨가한 배지에 현탁시켰다. 각 세포 현탁액을, 각각 2.0×104, 1.0×104, 0.6×104개/웰이 되도록 96웰 플레이트에 파종하여, 37℃, 5％ CO2 조건 하에서 정치 배양하였다. 1일 후에, 배지를 FBS 무첨가의 것으로 교환하여 정치 배양하였다. 1일 후에 배지를 버리고, FBS 무첨가의 배지에서 하기 최종 농도로 조정한 피검체를 200μL/웰씩 첨가하여 정치 배양하였다. 피검체는 최종 농도 1μg/ml의 hGas6-F 및 최종 농도 20μg/ml의 hAxl-hFc, KM5320-rKG1 항체, KM5321-rKG1 항체 및 공지된 방법으로 제작한 항-디니트로페닐히드라진(dinitrophenylhydrazine; DNP) 항체(Motoki K et.al., Clin. Cancer Res.11, 3126-3135, 2005)를 사용하였다. 또한, 음성 대조로서 상기 배지로 20배 희석한 PBS를 사용하였다. 3일 후에 배지를 버리고, Cell Titer-Glo Substrate(셀 타이터 글로 기질)(프로메가사제)에 부속되어 있는 Cell Titer-Glo Buffer(셀 타이터 글로 버퍼)로 용해시킨 Cell Titer-Glo Reagent(셀 타이터 글로 시약)를 50μL/웰 첨가하고, 쉐이커로 1분간 교반, 실온에서 10분간 정치한 후, 발광을 검출하였다.
Panc-1 세포에 대하여 얻어진 결과를 도 6에 기재한다. Panc-1 세포에 hGas6을 첨가하면, PBS를 첨가했을 때보다 세포수가 약 2배로 증가하였다. 이에 비해, KM5320-rKG1과 KM5321-rKG1은, hGas6에 의한 세포 증식의 항진을 PBS와 동일한 정도까지 억제하였다. 항DNP 항체는 hGas6에 의한 세포 증식의 항진에 영향을 미치지 않았다. 또한, Panc-1 세포 이외의 다른 2세포주에 대해서도 동일한 결과였다. 이 결과로부터, KM5320-rKG1과 KM5321-rKG1은, Gas6 수용체를 발현하고 있는 암 세포주에 있어서도, hGas6 의존적인 세포 증식을 억제하는 것이 나타났다.
[실시예 15] KM5320, KM5321 인간화 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 설계
(1) KM5320 인간화 항체의 VL 및 VH의 아미노산 서열의 설계
이하에 기재하는 방법으로, KM5320 인간화 항체의 각종 VL 및 VH의 아미노산 서열을 설계하였다. 이후의 기술에서는 다양한 VL, VH의 아미노산 서열을 갖는 KM5320 인간화 항체의 총칭으로서, hzKM5320 항체로 기재한다.
제일 먼저, KM5320 항체의 CDR의 아미노산 서열의 이식에 적합한 기지의 인간 항체의 FR의 아미노산을 선택하기 위해서, The National Center for Biotechnology Information(미국 국립 생물 공학 정보 센터)이 제공하는 BLASTP 데이터베이스에 의해, VL 및 VH 각각에 대해서, KM5320 항체의 프레임워크(이하, FR라고 기재함)의 아미노산 서열과 상동성이 높은 기지의 인간 항체의 FR의 아미노산 서열을 검색하였다.
그 결과, GenBank 액세션 넘버 AAW69164.1(anti-tetanus toxoid immunoglobulin light chain variable region(항파상풍 톡소이드 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역)) 및 DDBJ 액세션 넘버 BAC01510.1(immunoglobulin heavy chain VHDJ region(이뮤노글로불린 중쇄 VHDJ 영역))로 표시되는 아미노산 서열(이하, 각각 AAW69164.1, BAC01510.1이라고 기재함)의 FR의 아미노산 서열이 각각 KM5320 항체의 VL 및 VH의 FR의 아미노산 서열과 가장 상동성이 높았다.
따라서, AAW69164.1의 FR의 아미노산 서열의 적절한 위치에, 각각 서열 번호 82, 83, 84로 표시되는 KM5320의 VL의 CDR1 내지 3의 아미노산 서열을 이식하고, hzKM5320 LV0(서열 번호 105)을 설계하였다. 또한, BAC01510.1의 FR의 아미노산 서열의 적절한 위치에, 각각 서열 번호 79, 80, 81로 표시되는 KM5320 VH의 CDR1 내지 3의 아미노산 서열을 이식하고, hzKM5320 HV0(서열 번호 129)을 설계하였다.
상기한 바와 같이 설계한 hzKM5320 LV0 및 hzKM5320 HV0은, 선택한 인간 항체의 FR의 아미노산 서열에, 마우스 모노클로날 항체인 KM5320 유래의 CDR의 아미노산 서열만을 이식한 아미노산 서열이다.
그러나, 일반적으로, 인간화 항체를 제작하는 경우에는, 단순히 설치류 유래 항체의 CDR의 아미노산 서열을 인간 항체의 FR의 아미노산 서열에 이식하는 것만으로는, 인간화 항체의 결합 활성이 저하되어 버리는 경우가 많다. 이러한 결합 활성의 저하를 회피하기 위해서, CDR의 아미노산 서열의 이식과 함께, 인간 항체와 설치류 항체에서 상이한 FR의 아미노산 잔기 중, 항체의 결합 활성에 영향을 준다고 생각되는 아미노산 잔기를 개변시키는 것이 행해지고 있다.
따라서, 본 실시예에 있어서도, 항체의 결합 활성에 영향을 준다고 생각되는 FR의 아미노산 잔기를 이하와 같이 하여 동정하고, 개변시켰다.
먼저, 상기에서 설계한 hzKM5320 LV0 및 hzKM5320 HV0을 각각 VL, VH에 갖는 항체를 hzKM5320 LV0HV0 항체 또는 간단히 hzKM5320 LV0HV0으로 기재한다. 다른 hzKM5320 항체에 대해서도 동일한 방법으로 기재한다. hzKM5320 LV0HV0 항체의 가변 영역의 삼차원 구조를 컴퓨터 모델링의 방법을 사용하여 구축하였다. 삼차원 구조 좌표 제작 및 삼차원 구조의 표시에는, Discovery Studio(악셀리스사)를 사용하였다. 또한, KM5320 항체의 가변 영역의 삼차원 구조의 컴퓨터 모델도 동일하게 하여 구축하였다.
또한, hzKM5320 LV0HV0 항체의 VL 및 VH의 FR의 아미노산 서열 중에서, KM5320 항체와 상이한 아미노산 잔기를, KM5320 항체의 동일한 부위에 존재하는 아미노산 잔기로 치환한 아미노산 서열을 제작하고, 동일하게 삼차원 구조 모델을 구축하였다.
이들 제작한 KM5320 항체, hzKM5320 LV0HV0 항체 및 개변체의 가변 영역의 삼차원 구조를 비교하여, 항체의 결합 활성에 영향을 준다고 예측되는 아미노산 잔기를 동정하였다.
그 결과, hzKM5320 LV0HV0 항체의 가변 영역의 FR의 아미노산 잔기 중에서, 항원 결합 부위의 삼차원 구조를 변화시키고, 항체의 결합 활성에 영향을 준다고 생각되는 아미노산 잔기로서, VL에서는, 서열 번호 105로 표시되는 아미노산 서열의 2번째의 Val, 15번째의 Leu, 46번째의 Leu, 73번째의 Leu, 78번째의 Leu 및 87번째의 Tyr을, VH는, 서열 번호 129로 표시되는 아미노산 서열의 2번째의 Val, 9번째의 Ser, 20번째의 Val, 38번째의 Arg, 46번째의 Glu, 77번째의 Ser, 93번째의 Val, 및 95번째의 Tyr을, 각각 선택하였다.
이들 선택된 아미노산 잔기 중, 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기를, KM5320 항체의 동일한 부위에 존재하는 아미노산 잔기로 치환하여, 다양한 개변을 갖는 인간화 항체의 VL 및 VH를 설계하였다.
구체적으로는, VL에 대해서는, 서열 번호 105로 표시되는 아미노산 서열의 2번째 Val을 Ile로, 15번째 Leu를 Ala로, 46번째 Leu를 Val로, 73번째 Leu를 Phe로, 78번째 Leu를 Val로, 그리고 87번째 Tyr을 Phe로 치환하는 아미노산 개변 중, 적어도 하나의 개변을 도입하였다.
이에 의해, hzKM5320 항체의 VL로서, hzKM5320 LV0(서열 번호 105), LV1a(서열 번호 108), LV1b(서열 번호 111), LV2a(서열 번호 114), LV2b(서열 번호 117), LV3(서열 번호 120), LV5(서열 번호 123) 및 LV6(서열 번호 126)을 설계하고, 각각의 아미노산 서열을 도 7에 나타내었다.
또한, VH에 대해서는, 서열 번호 129로 표시되는 아미노산 서열의 2번째의 Val을 Ile에, 9번째의 Ser을 Pro로, 20번째의 Val을 Ile로, 38번째의 Arg를 Lys로, 46번째의 Glu를 Lys로, 77번째의 Ser을 Thr로, 93번째의 Val을 Thr로, 그리고 95번째의 Tyr을 Phe로 치환하는 아미노산 개변 중 적어도 하나의 개변을 도입하였다.
이에 의해, hzKM5320 항체의 VH로서, hzKM5320 HV0(서열 번호 129), HV1(서열 번호 132), HV2(서열 번호 135), HV3a(서열 번호 138), HV3b(서열 번호 141), HV3c(서열 번호 144), HV4(서열 번호 147), HV6(서열 번호 150) 및 HV8(서열 번호 153)을 설계하고, 각각의 아미노산 서열을 도 8에 나타내었다.
(2) KM5321 인간화 항체의 VL 및 VH의 아미노산 서열의 설계
KM5321 인간화 항체의 각종 VL 및 VH의 아미노산 서열에 대해서도, 실시예 15(1)과 동일한 방법으로 설계하였다. 이후의 기술에서는, 다양한 VL, VH의 아미노산 서열을 갖는 KM5321 인간화 항체의 총칭으로서, hzKM5321 항체라고 기재한다.
GenBank 액세션 넘버 AAW67414.1(rotavirus-specific intestinal-homing antibody light chain variable region(로타바이러스-특이적 장-귀소 항체 경쇄 가변 영역))로 표시되는 인간 항체의 VL의 FR의 아미노산 서열의 적절한 위치에, KM5321 항체의 VL의 CDR1 내지 3의 아미노산 서열(각각 서열 번호 88, 89, 90)을 이식함으로써 hzKM5321 LV0(서열 번호 156)을 설계하였다.
또한, EMBL 액세션 넘버 CAJ13496.1(immunoglobulin heavy chain variable region)로 표시되는 인간 항체의 FR의 아미노산 서열의 적절한 위치에, KM5321 항체 VH의 CDR1 내지 3의 아미노산 서열(각각 서열 번호 85, 86, 87)을 이식함으로써 hzKM5321 HV0(서열 번호 186)을 설계하였다.
hzKM5321 항체의 결합 활성에 영향을 준다고 생각되는 FR의 아미노산 잔기에 대해서도, hzKM5320 항체의 경우와 동일한 방법으로 VL, VH에 대하여 각각 선택하였다. 선택한 아미노산 잔기 중, 적어도 하나 이상의 아미노산 서열을 KM5321 항체의 동일한 부위에 존재하는 아미노산 잔기로 치환하여, 다양한 개변을 갖는 인간화 항체의 VL 및 VH를 설계하였다.
구체적으로는, VL에 대해서는, 서열 번호 156으로 표시되는 아미노산 서열의 4번째의 Leu를 Val로, 13번째의 Ala를 Val로, 15번째의 Val을 Thr로, 43번째의 Ala를 Pro로, 64번째의 Gly를 Ser로, 73번째의 Leu를 Phe로, 78번째의 Leu를 Thr로, 85번째의 Thr을 Asp로, 그리고 104번째의 Val을 Leu로 치환하는 아미노산 개변 중, 적어도 하나의 개변을 도입하였다.
이에 의해, hzKM5321 항체의 VL로서, hzKM5321 LV0(서열 번호 156), LV1a(서열 번호 159), LV1b(서열 번호 162), LV1c(서열 번호 165), LV3(서열 번호 168), LV4(서열 번호 171), LV6(서열 번호 174), LV7a(서열 번호 177), LV7b(서열 번호 180) 및 LV9(서열 번호 183)을 설계하고, 각각의 아미노산 서열을 도 9에 나타내었다.
또한, VH에 대해서는, 서열 번호 186으로 표시되는 아미노산 서열의 2번째의 Val을 Ile로, 9번째의 Ser을 Pro로, 38번째의 Arg을 Lys로, 46번째의 Glu를 Lys로, 79번째의 Ser을 Ala로, 93번째의 Val을 Thr로, 그리고 112번째의 Val을 Ile로 치환하는 아미노산 개변 중, 적어도 하나의 개변을 도입하였다.
이에 의해, hzKM5321 항체의 VH로서, hzKM5321 HV0(서열 번호 186), HV1(서열 번호 189), HV2a(서열 번호 192), HV2b(서열 번호 195), HV3a(서열 번호 198), HV3b(서열 번호 201), HV4a(서열 번호 204), HV4b(서열 번호 207), HV5(서열 번호 210) 및 HV7(서열 번호 213)을 설계하고, 각각의 아미노산 서열을 도 10에 도시하였다.
이후의 기술에 있어서는, hzKM5321 LV0 및 hzKM5321 HV0을 각각 VL, VH에 갖는 항체를 hzKM5321 LV0HV0 항체 또는 hzKM5321 LV0HV0이라고 기재한다. 기타의hzKM5321 항체에 대해서도 동일한 방법으로 기재한다.
(3) 인간화 항체의 가변 영역 유전자의 설계
인간화 항체(hzKM5320, hzKM5321 항체)의 가변 영역의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열은, 동물 세포에서 고빈도로 사용되는 코돈을 사용하여 설계하였다. 이들 염기 서열을 사용하여, 인간화 항체의 발현 벡터를 구축하고, 인간화 항체를 발현시켰다.
[실시예 16] hzKM5320, hzKM5321 항체의 발현 벡터의 구축
표 2에 나타낸 hzKM5320, hzKM5321 항체의 발현 벡터를, 이하에 기재하는 방법으로 구축하였다.
Figure pct00002
먼저, 표 3에 기재된 각 인간화 항체의 시그널 서열을 포함하는 가변 영역 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열에 대해서, 필요한 유전자 단편을 Fasmac사에서 합성하였다.
Figure pct00003
상기 합성 유전자 단편과, 적당한 항체 분비 시그널을 도입한 인간 κ쇄 정상 영역의 발현 벡터(EcoNI/BsiWI 처리) 및 인간 중쇄 정상 영역의 발현 벡터(FspAI/NheI 처리)를 사용하여, In-Fuision HD Cloning Kit(클론텍사)에 의해 벡터로의 서브클로닝을 행하였다. 대장균 DH5α 컴피턴트 셀(다카라바이오사)을 형질 전환하여, 얻어진 플라스미드의 시퀀스를 확인하였다. 올바른 염기 서열이 삽입된 플라스미드를 생산하는 대장균의 콜로니를 선발하고, NucleoBond Xtra Midi EF 키트(다카라바이오사)를 사용하여 플라스미드를 조제하였다.
EU index S228P, L235E 및 R409K의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 변이 인간 IgG4 정상 영역을 포함하는 항인간 Gas6 인간화 항체를 발현시키기 위해서, 인간 중쇄 정상 영역의 발현 벡터로서, N5KG1 벡터(미국 특허 제6,001,358호) 중의 경쇄 정상 영역 및 중쇄 정상 영역을 코딩하는 염기 서열을, 제한효소 Bgl2 및 BamHI를 사용하여 제거하고, 이 부분을 상기 변이 인간 IgG4의 정상 영역을 코딩하는 염기 서열로 치환한 벡터를 사용하였다.
[실시예 17] hzKM5320, hzKM5321 항체의 일과성 발현 및 정제
제작한 인간화 항체를, Expi293F Expression System Kit(Life Technologies사제)를 사용하여 일과성으로 발현시켰다. 플라스미드의 도입 방법은 첨부 서류를 따랐다. 경쇄 발현 벡터와 중쇄 발현 벡터는, 1:2의 비율로 혼합하여 도입하였다.
플라스미드 도입 후의 세포를, 120mL의 배양액 중에서, 37℃, 5％ CO2, 125rpm의 조건 하에서, 3일간 배양하였다. 그 후, 세포 배양액의 원심 분리를 행하고, 0.2㎛ 필터(Thermo Scientific사)를 통과시켜 배양 상청을 회수하였다.
배양 상청으로부터 MabSelect SuRe(GE Healthcare사제)를 사용한 친화성 정제에 의해, 정제 항체를 취득하였다. 구체적으로는, 칼럼에 충전시킨 레진을 PBS로 평형화시킨 후, 당해 칼럼에 배양 상청을 첨가하고, PBS로 2회 세정하며, Wash(세척) 버퍼 1(1M NaCl을 갖는 PBS), Wash 버퍼 2(20mM 시트르산, 50mM NaCl, pH 5.0)로 각 1회 세정 후, 용출 버퍼(20mM 시트르산, 50mM NaCl, pH 3.4)를 사용하여 항체를 용출시켰다. 얻어진 항체 용액에 중화 버퍼(1M 인산-NaOH, pH 7.0)를 1/10량 첨가하여 중화시키고, NAP25(GE Healthcare사제)를 사용하여 항체 용액의 용매를 보존 버퍼(10mM 시트르산, 150mM NaCl, pH 6.0)로 치환하였다. 버퍼 치환 후의 항체 용액에 대해서, Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units(아미콘 울트라-4 원심분리 필터 유닛)(밀리포어사제)를 사용하여 한외 여과에 의한 농축을 행하고, Nanodrop(Thermo Scientific사)을 사용하여 흡광도 A280을 측정하고, 항체 용액의 농도 측정과 조정을 행하였다.
[실시예 18] Biacore(등록 상표)에 의한 hzKM5320, hzKM5321 항체의 인간 Gas6 단백질에 대한 결합 활성 평가
실시예 16에 기재된 방법에 준하여, KM5320 및 KM5321의 가변 영역 아미노산 서열을, EU index S228P, L235E, R409K의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 변이 인간 IgG4 정상 영역에 결합시킨 인간형 키메라 항체(이하 각각 KM5320 키메라 항체, KM5321 키메라 항체라고 기재함)를 제작하였다. 이들 키메라 항체와, 실시예 17에서 얻어진 hzKM5320, hzKM5321 항체의 인간 Gas6에 대한 결합 활성을 비교하는 것을 목적으로 하여, 실시예 2에서 제작한 인간 Gas6을 사용하고, 표면 플라즈몬 공명법(SPR법)에 의한 결합성 시험을 실시하였다. 측정 기기로서, Biacore(등록 상표) T100(GE Healthcare사제)을 사용하였다.
Anti-human IgG antibody(항-인간 IgG 항체)를, Human Antibody Capture Kit(인간 항체 포획 키트)(GE Healthcare사제)를 사용하여, 첨부 문서에 따라서 CM5 센서 칩(GE Healthcare사제)에 고정화하였다. 유동 세포에, 1μg/mL로 조제한 피검 항체를 10μL/min의 유속으로 10초간 첨가하였다. 계속해서, 애널라이트로서 10μg/mL부터 5회의 단계 희석으로 3배씩 희석시킨 인간 Gas6 단백질 용액(0.1％ BSA를 포함하는 HBS-EP+로 희석)을 30μL/min분의 유속으로 첨가하고, 각 항체와 애널라이트와의 결합 반응을 2분간, 해리 반응을 10분간 측정하였다. 측정은 싱글 사이클 키네틱스법으로 행하였다. 얻어진 센서 그램은, Bia Evaluation Software(GE Healthcare사제)를 사용하여 해석하고, 각 항체의 속도론 정수를 산출하였다.
본 측정의 예비 시험에 있어서, 장시간에 걸쳐 수많은 항체의 결합 활성을 측정하는 동안, 동일한 항체이어도, 측정의 전반보다 후반에서 측정된 ka값 쪽이 저하되는 것이 밝혀졌다. 이 현상은, 애널라이트로서 사용한 인간 Gas6 단백질이, 측정 중에 서서히 바이알에 흡착되어, 실질적인 농도가 감소되기 때문에 발생한다고 생각되었다. 애널라이트의 바이알에 대한 흡착이 측정 결과에 끼치는 영향을 배제하기 위해서, 본 측정에서는, 바이알에 인간 Gas6 단백질 용액을 첨가한 후 충분한 시간 정치시켜, 인간 Gas6 단백질의 바이알에 대한 흡착이 플랫에 도달한 상태에서, 각 항체에 대한 결합 활성의 측정을 개시하였다.
산출된 KM5320 키메라 항체 및 hzKM5320 항체의 인간 Gas6에 대한 결합 속도 상수(ka)의 최솟값, 해리 속도 상수(kd) 및 해리 상수[kd/ka=KD]의 최댓값을 표 4에 기재하였다. KM5321 키메라 항체 및 hzKM5321 항체에 대해서도 동일한 방법으로 결합 활성을 측정하고, 얻어진 결과를 표 6에 기재하였다.
또한, KM5320 키메라 항체, hzKM5320 LV5HV2 항체 및 hzKM5320 LV1bHV0 항체에 대해서만, 다시 SPR법에 의한 결합성 시험을 행하고, ka, kd 및 KD를 산출한 결과를 표 5에 기재하였다. 재시험에서는, 상술한 시험과 같이 바이알에 첨가한 애널라이트를 충분한 시간 정치하는 것이 아니라, 측정하는 항체의 수와 애널라이트 농도의 변동을 저감시키고, 단시간(몇 시간 이내)에 측정을 행하였다. 애널라이트는, 10μg/mL부터 3회의 단계 희석으로 3배씩 희석시킨 Gas6 단백질 용액(0.1％ BSA를 포함하는 HBS-EP+로 희석)을 사용하였다. 이에 의해, 애널라이트의 바이알에 대한 흡착을 최소한으로 하여, 상술한 시험보다도 정확한 ka, KD의 값을 산출할 수 있다.
KM5321 키메라 항체 및 hzKM5321 LV6HV2b 항체 및 hzKM5321 LV7bHV0 항체에 대해서도 동일한 방법으로 결합 활성을 다시 측정하고, 얻어진 결과를 표 7에 기재하였다.
표 4로부터, KM5320 키메라 항체와 각종 hzKM5320 항체의 ka값은 모두 동일한 정도였다. hzKM5320 LV0HV0 항체는 KM5320 키메라 항체와 비교해서 kd값이 약 6배로 증가하였고, 거기에 따른 KD값도 10배 이상 증가하였지만, 다른 hzKM5320 항체 중 반수 이상의 항체에서는, KM5320 키메라 항체에 대한 KD값의 증가가 2배 정도로 억제되어 있었다.
또한, 표 6으로부터 KM5321 키메라 항체와 각종 hzKM5321 항체의 ka값은 모두 동일한 정도였다. hzKM5321 LV0HV0 항체는 KM5321 키메라 항체와 비교해서 kd값, KD값이 약 3배로 증가했지만, 다른 hzKM5321 항체 중 3분의 1 이상의 항체에서는, KM5321 키메라 항체에 대한 KD값의 증가가 2배 정도로 억제되어 있었다.
이상으로부터, KM5320, KM5321 항체의 CDR을 인간 항체의 FR에 이식했을 뿐인 hzKM5320 LV0HV0 항체, hzKM5321 LV0HV0 항체에서는, KM5320, KM5321 키메라 항체와 비교하여 Gas6 단백질에 대한 결합 활성이 대폭으로 저하되는 것이 밝혀졌다. 그러나, hzKM5320 LV0HV0, hzKM5321 LV0HV0 항체의 FR의 아미노산 잔기의 일부를, KM5320 항체, KM5321 항체의 FR의 동일한 장소에 존재하는 아미노산 잔기로 치환함으로써, 상기한 항체의 결합 활성의 저하가 억제되어, KM5320, KM5321 키메라 항체의 50％ 정도의 결합 활성을 유지하고 있는 복수개의 인간화 항체를 제작할 수 있었다.
또한, 표 5로부터, KM5320 키메라 항체의 KD값이 0.73nM인 것에 반해, hzKM5320 LV5HV2 항체의 KD값은 1.29nM이며, 표 4의 결과와 동일하게, hzKM5320 LV5HV2 항체는, KM5320 키메라 항체의 50％ 이상의 결합 활성을 유지하고 있는 것이 확인되었다. 또한 표 7로부터, KM5321 키메라 항체의 KD값이 0.2nM인 것에 반해, hzKM5321 LV6HV2b 항체의 KD값이 0.48nM, hzKM5321 LV7bHV0 항체의 KD값이 0.40nM이며, 이들 인간화 항체는, KM5321 키메라 항체의 50％ 정도의 결합 활성을 유지하고 있는 것이 다시 확인되었다.
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00007
[실시예 19] ELISA에 의한 hzKM5320, hzKM5321 항체의 인간 Gas6 단백질에 대한 결합 활성 평가
실시예 6에 기재된 방법에 준하여, hzKM5320 항체와 hzKM5321 항체의 인간 Gas6 단백질에 대한 결합 활성을 ELISA로 측정하였다. 키메라 항체 및 인간화 항체는 정상 영역이 인간 유래 항체이기 때문에, 2차 항체로서 1％ BSA-PBS로 3000배 희석한 Goat anti Human IgG(H&L) Ads to Ms, Rb, Bv, Ho Horseradish Peroxidase(Ms, Rb, Bv, Ho 양고추냉이 퍼옥시다아제에 대한 염소 항-인간 IgG(H&L) Ads)(American Qualex사제, A110PD)를 포함하는 용액을 사용하였다. 측정값의 백그라운드를 저감시키기 위해서, 2차 항체 희석액은, 항DNP 마우스 IgG1 항체 50μg/mL와 혼합한 것을 실온에서 1시간 인큐베이팅한 것을 사용하였다. 얻어진 결과를 도 11에 도시한다. 도 11의 그래프에 대해서, 항체마다 각 농도에 있어서의 흡광값으로부터 Logistic(로지스틱) 곡선에 의한 커브 피팅을 행하고, 통계 해석 언어 R(Ver. 3.02)을 사용하여 KM5320, KM5321 키메라 항체 및 hzKM5320, hzKM5321 항체의 결합 EC50값 및 그의 SE값을 산출하였다. 결과를 표 8에 나타낸다. hzKM5320 LV5HV2 항체는, KM5320 키메라 항체와 동일한 정도의 결합 활성을 나타내었다. 또한, hzKM5321 LV6HV2b, LV7bHV0 항체도, KM5321 키메라 항체와 동일한 정도의 결합 활성을 나타내었다.
Figure pct00008
[실시예 20] hzKM5320, hzKM5321 항체의 인간 Gas6 단백질과 Axl의 결합 저해 활성 평가
실시예 7과 동일한 방법으로, hzKM5320, hzKM5321 항체의 인간 Gas6 단백질과 Axl의 결합 저해 활성을 측정하였다. 얻어진 결과를 도 12에 나타낸다. 도 12의 그래프에 대해서, 항체마다 각 농도에 있어서의 ELISA의 흡광값으로부터 Logistic 곡선에 의한 커브 피팅을 행하고, 통계 해석 언어 R을 사용하여 KM5320, KM5321 키메라 항체 및 hzKM5320, hzKM5321 항체의 결합 저해의 IC50값 및 그 SE값을 산출하였다. 결과를 표 9에 나타낸다. hzKM5320 LV5HV2 항체는, KM5320 키메라 항체의 7할 정도의 결합 저해 활성을 유지하고 있는 것이 밝혀졌다. 또한, hzKM5321 LV6HV2b 항체 및 hzKM5321 LV7bHV0 항체는, KM5321 키메라 항체와 동일한 정도의 결합 저해 활성을 유지하고 있는 것이 밝혀졌다.
Figure pct00009
본 발명의 모노클로날 항체는 신장 또는 암 질환 등의 Gas6 관련 질환의 치료 및 진단에 유용하다.
본 명세서 중에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로서 본 명세서 중에 원용하는 것으로 한다.
서열 번호 1-인공 서열의 설명: 프라이머 1
서열 번호 2-인공 서열의 설명: 프라이머 2
서열 번호 5-인공 서열의 설명: 프라이머 3
서열 번호 6-인공 서열의 설명: 프라이머 4
서열 번호 9-인공 서열의 설명: 프라이머 5
서열 번호 10-인공 서열의 설명: 프라이머 6
서열 번호 11-인공 서열의 설명: 프라이머 7
서열 번호 12-인공 서열의 설명: 프라이머 8
서열 번호 15-인공 서열의 설명: 프라이머 9
서열 번호 18-인공 서열의 설명: 프라이머 10
서열 번호 19-인공 서열의 설명: 프라이머 11
서열 번호 22-인공 서열의 설명: 프라이머 12
서열 번호 23-인공 서열의 설명: 프라이머 13
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서열 번호 197-합성 구축물
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서열 번호 200-합성 구축물
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서열 번호 212-합성 구축물
서열 번호 213-인공 서열의 설명: 시그널 서열을 제외한 hzKM5321 HV7의 아미노산 서열
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sequence : primer 5 <400> 9 cccacaagct gaattcgcca ccatggcccc ttcgc 35 <210> 10 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence : primer 6 <400> 10 cgcgactagt ggatccctac ttgtcgtcgt cgtccttgta gtcggctgcg gcgggctcca 60 cgg 63 <210> 11 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence : primer 7 <400> 11 ccggaattcg ccaccatgcc gccaccgccc gggc 34 <210> 12 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence : primer 8 <400> 12 gccggatccc tacttgtcgt cgtcgtcctt gtagtcggct gtgacgtgct ccac 54 <210> 13 <211> 2025 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220> <221> CDS <222> (1)..(2025) <400> 13 atg ccg cca ccg ccc ggg ccc acc gcc gcc ctg ggc act gcg ctt ctg 48 Met Pro Pro Pro Pro Gly Pro Thr Ala Ala Leu Gly Thr Ala Leu Leu 1 5 10 15 ctg ctc ctg ctg gcc tcc gag tct tcg cac act gtg ctg ttg cgg gcg 96 Leu Leu Leu Leu Ala Ser Glu Ser Ser His Thr Val Leu Leu Arg Ala 20 25 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1776 Leu Arg Asp Gly Glu Ala Thr Leu Glu Val Asp Gly Thr Lys Gly Gln 580 585 590 agc gaa gtg agc acc gca cag ctg cag gag cga ctg gac ctg ctt aag 1824 Ser Glu Val Ser Thr Ala Gln Leu Gln Glu Arg Leu Asp Leu Leu Lys 595 600 605 aca cgt ctg caa ggc tcc gtg ctc acc ttt gtg ggg ggc ctg cca gat 1872 Thr Arg Leu Gln Gly Ser Val Leu Thr Phe Val Gly Gly Leu Pro Asp 610 615 620 gta caa gtg act tcc aca ccc gtc acg gcg ttc tac cgt gga tgc atg 1920 Val Gln Val Thr Ser Thr Pro Val Thr Ala Phe Tyr Arg Gly Cys Met 625 630 635 640 act ctg gag gta aac ggg aag acc ctg gac ctg gat acg gcc tcc tac 1968 Thr Leu Glu Val Asn Gly Lys Thr Leu Asp Leu Asp Thr Ala Ser Tyr 645 650 655 aag cac agt gac atc acc tcc cac tcc tgc ccg cct gtg gag cac gtc 2016 Lys His Ser Asp Ile Thr Ser His Ser Cys Pro Pro Val Glu His Val 660 665 670 aca gcc tag 2025 Thr Ala <210> 14 <211> 674 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 14 Met Pro Pro Pro Pro Gly Pro Thr Ala Ala Leu Gly Thr Ala Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Ala Ser Glu 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gag aac gac ccc 240 Glu Val Cys Ser Lys Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asn Asp Pro 65 70 75 80 gag acg gag tat ttc tat cca cga tat caa gag tgc atg aga aaa tat 288 Glu Thr Glu Tyr Phe Tyr Pro Arg Tyr Gln Glu Cys Met Arg Lys Tyr 85 90 95 ggc agg cct gaa gaa aaa aac cca gat ttc gcc aaa tgt gtt cag aac 336 Gly Arg Pro Glu Glu Lys Asn Pro Asp Phe Ala Lys Cys Val Gln Asn 100 105 110 ttg cct gac cag tgc acc cca aac cct tgt gat aag aag ggt act cat 384 Leu Pro Asp Gln Cys Thr Pro Asn Pro Cys Asp Lys Lys Gly Thr His 115 120 125 atc tgc caa gac ctc atg ggc aac ttc ttc tgc gtg tgc aca gat ggc 432 Ile Cys Gln Asp Leu Met Gly Asn Phe Phe Cys Val Cys Thr Asp Gly 130 135 140 tgg gga ggc cgg ctc tgt gac aaa gat gtc aat gag tgt gtc cag aag 480 Trp Gly Gly Arg Leu Cys Asp Lys Asp Val Asn Glu Cys Val Gln Lys 145 150 155 160 aat ggg ggc tgc agc cag gtc tgc cac aac aaa cca gga agc ttc caa 528 Asn Gly Gly Cys Ser Gln Val Cys His Asn Lys Pro Gly Ser Phe Gln 165 170 175 tgt gcc tgc cat agt ggc ttc tcg ctt gca tca gac ggc cag acc tgc 576 Cys Ala Cys His Ser Gly Phe Ser Leu Ala Ser Asp Gly Gln Thr Cys 180 185 190 caa gat atc gat gaa tgc aca gac tca gac acc tgt ggg gac gcg cga 624 Gln Asp Ile Asp Glu Cys Thr Asp Ser Asp Thr Cys Gly Asp Ala Arg 195 200 205 tgc aag aac ttg cca ggc tcc tac tct tgc ctc tgc gat gag gga tat 672 Cys Lys Asn Leu Pro Gly Ser Tyr Ser Cys Leu Cys Asp Glu Gly Tyr 210 215 220 aca tac agc tcc aag gag aag acc tgc caa gat gtg gac gag tgc cag 720 Thr Tyr Ser Ser Lys Glu Lys Thr Cys Gln Asp Val Asp Glu Cys Gln 225 230 235 240 cag gat cgc tgt gag cag acc tgt gtc aac tcc cca ggc agc tat acc 768 Gln Asp Arg Cys Glu Gln Thr Cys Val Asn Ser Pro Gly Ser Tyr Thr 245 250 255 tgc cac tgt gat ggg cga ggg ggc cta aaa cta tcc cca gac atg gat 816 Cys His Cys Asp Gly Arg Gly Gly Leu Lys Leu Ser Pro Asp Met Asp 260 265 270 act tgt gag gac atc tta cca tgt gtg ccc ttc agc atg gcc aag agc 864 Thr Cys Glu Asp Ile Leu Pro Cys Val Pro Phe Ser Met Ala Lys Ser 275 280 285 gtg aag tcc ttg tac ctg ggc cgc atg ttc agc ggg acc ccc gtg att 912 Val Lys Ser Leu Tyr Leu Gly Arg Met Phe Ser Gly Thr Pro Val Ile 290 295 300 aga cta cgc ttc aag agg ctt cag cct acc agg ctg ctg gct gaa ttt 960 Arg Leu Arg Phe Lys Arg Leu Gln Pro Thr Arg Leu Leu Ala Glu Phe 305 310 315 320 gac ttc cgc act ttt gac cct gaa gga gtc ctc ttc ttc gct gga ggc 1008 Asp Phe Arg Thr Phe Asp Pro Glu Gly Val Leu Phe Phe Ala Gly Gly 325 330 335 cgt tca gac agc acc tgg att gtc ctg ggc cta aga gct ggg cgg ctt 1056 Arg Ser Asp Ser Thr Trp Ile Val Leu Gly Leu Arg Ala Gly Arg Leu 340 345 350 gag ctg cag ctt cgg tac aat ggc gtt ggg cgc atc acc agc agc ggg 1104 Glu Leu Gln Leu Arg Tyr Asn Gly Val Gly Arg Ile Thr Ser Ser Gly 355 360 365 cca acc atc aac cac ggc atg tgg caa act atc tcc gtg gaa gag ctg 1152 Pro Thr Ile Asn His Gly Met Trp Gln Thr Ile Ser Val Glu Glu Leu 370 375 380 gaa cgt aac ctt gtc atc aag gtc aac aaa gat gct gta atg aag atc 1200 Glu Arg Asn Leu Val Ile Lys Val Asn Lys Asp Ala Val Met Lys Ile 385 390 395 400 gcg gta gct ggg gag ctg ttt cag ctg gag agg ggc ctc tat cac ctg 1248 Ala Val Ala Gly Glu Leu Phe Gln Leu Glu Arg Gly Leu Tyr His Leu 405 410 415 aat ctc acc gtg ggc ggc att ccc ttc aag gag agt gag ctc gtc cag 1296 Asn Leu Thr Val Gly Gly Ile Pro Phe Lys Glu Ser Glu Leu Val Gln 420 425 430 ccg att aac cct cgc ctg gat ggg tgc atg agg agt tgg aac tgg ctg 1344 Pro Ile Asn Pro Arg Leu Asp Gly Cys Met Arg Ser Trp Asn Trp Leu 435 440 445 aac ggg gaa gac agc gcc atc cag gag aca gtc aag gca aac aca aaa 1392 Asn Gly Glu Asp Ser Ala Ile Gln Glu Thr Val Lys Ala Asn Thr Lys 450 455 460 atg cag tgc ttc tct gtg aca gaa agg ggc tcc ttc ttc ccg ggg aat 1440 Met Gln Cys Phe Ser Val Thr Glu Arg Gly Ser Phe Phe Pro Gly Asn 465 470 475 480 gga ttt gct acc tac agg ctc aac tac acc cga aca tcg ctg gat gtc 1488 Gly Phe Ala Thr Tyr Arg Leu Asn Tyr Thr Arg Thr Ser Leu Asp Val 485 490 495 ggc acg gaa acc acc tgg gaa gtt aaa gtt gtg gct cgg atc cgc cct 1536 Gly Thr Glu Thr Thr Trp Glu Val Lys Val Val Ala Arg Ile Arg Pro 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<223> Description of the artificial sequence : primer 11 <400> 19 ggcccgggtc agggcttttt gaccttgtgt tctggc 36 <210> 20 <211> 486 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220> <221> CDS <222> (1)..(486) <400> 20 atg ggc acc acc tgg agg agc cct gga cgt ttg cgg ctt gca cta tgc 48 Met Gly Thr Thr Trp Arg Ser Pro Gly Arg Leu Arg Leu Ala Leu Cys 1 5 10 15 ctc gct ggc cta gcc ctc tca ctg tac gca ctg cac gtg aag gcg gcg 96 Leu Ala Gly Leu Ala Leu Ser Leu Tyr Ala Leu His Val Lys Ala Ala 20 25 30 cgc gcc cgc aat gag gat tac cgc gcg ctc tgc gac gtg ggc acg gcc 144 Arg Ala Arg Asn Glu Asp Tyr Arg Ala Leu Cys Asp Val Gly Thr Ala 35 40 45 atc agc tgt tcc cgc gtc ttc tcc tct cgg tgg ggc cgg ggc ttt ggg 192 Ile Ser Cys Ser Arg Val Phe Ser Ser Arg Trp Gly Arg Gly Phe Gly 50 55 60 ctg gtg gag cat gtg tta gga gct gac agc atc ctc aac caa tcc aac 240 Leu Val Glu His Val Leu Gly Ala Asp Ser Ile Leu Asn Gln Ser Asn 65 70 75 80 agc ata ttt ggt tgc atg ttc tac acc ata cag ctg ttg tta ggt tgc 288 Ser Ile Phe Gly Cys Met Phe Tyr Thr Ile Gln Leu Leu Leu Gly Cys 85 90 95 ttg agg gga cgt tgg gcc tct atc cta ctg atc ctg agt tcc ctg gtg 336 Leu Arg Gly Arg Trp Ala Ser Ile Leu Leu Ile Leu Ser Ser Leu Val 100 105 110 tct gtc gct ggt tct ctg tac ctg gcc tgg atc ctg ttc ttt gtc ctg 384 Ser Val Ala Gly Ser Leu Tyr Leu Ala Trp Ile Leu Phe Phe Val Leu 115 120 125 tat gat ttc tgc att gtt tgc atc acc acc tat gcc atc aat gcg ggc 432 Tyr Asp Phe Cys Ile Val Cys Ile Thr Thr Tyr Ala Ile Asn Ala Gly 130 135 140 ctg atg ttg ctt agc ttc cag aag gtg cca gaa cac aag gtc aaa aag 480 Leu Met Leu Leu Ser Phe Gln Lys Val Pro Glu His Lys Val Lys Lys 145 150 155 160 ccc tga 486 Pro <210> 21 <211> 161 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 21 Met Gly Thr Thr Trp Arg Ser Pro Gly Arg Leu Arg Leu Ala Leu Cys 1 5 10 15 Leu Ala Gly Leu Ala Leu Ser Leu Tyr Ala Leu His Val Lys Ala Ala 20 25 30 Arg Ala Arg Asn Glu Asp Tyr Arg Ala Leu Cys Asp Val Gly Thr Ala 35 40 45 Ile Ser Cys Ser Arg Val Phe Ser Ser Arg Trp Gly Arg Gly Phe Gly 50 55 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Pro Ser Ser Asp Lys 1 5 10 15 gta cag aaa gac aag gct gaa ctg atc tca ggg ccc agg cag gac agc 96 Val Gln Lys Asp Lys Ala Glu Leu Ile Ser Gly Pro Arg Gln Asp Ser 20 25 30 cga ata ggg aaa ctc ttg ggt ttt gag tgg aca gat ttg tcc agt tgg 144 Arg Ile Gly Lys Leu Leu Gly Phe Glu Trp Thr Asp Leu Ser Ser Trp 35 40 45 cgg agg ctg gtg acc ctg ctg aat cga cca acg gac cct gca agc tta 192 Arg Arg Leu Val Thr Leu Leu Asn Arg Pro Thr Asp Pro Ala Ser Leu 50 55 60 gct gtc ttt cgt ttt ctt ttt ggg ttc ttg atg gtg cta gac att ccc 240 Ala Val Phe Arg Phe Leu Phe Gly Phe Leu Met Val Leu Asp Ile Pro 65 70 75 80 cag gag cgg ggg ctc agc tct ctg gac cgg aaa tac ctt gat ggg ctg 288 Gln Glu Arg Gly Leu Ser Ser Leu Asp Arg Lys Tyr Leu Asp Gly Leu 85 90 95 gat gtg tgc cgc ttc ccc ttg ctg gat gcc cta cgc cca ctg cca ctt 336 Asp Val Cys Arg Phe Pro Leu Leu Asp Ala Leu Arg Pro Leu Pro Leu 100 105 110 gac tgg atg tat ctt gtc tac acc atc atg ttt ctg ggg gca ctg ggc 384 Asp Trp Met Tyr Leu Val Tyr Thr Ile Met Phe Leu Gly Ala Leu Gly 115 120 125 atg atg ctg ggc ctg tgc tac cgg ata agc tgt gtg tta ttc ctg ctg 432 Met Met Leu Gly Leu Cys Tyr Arg Ile Ser Cys Val Leu Phe Leu Leu 130 135 140 cca tac tgg tat gtg ttt ctc ctg gac aag aca tca tgg aac aac cac 480 Pro Tyr Trp Tyr Val Phe Leu Leu Asp Lys Thr Ser Trp Asn Asn His 145 150 155 160 tcc tat ctg tat ggg ttg ttg gcc ttt cag cta aca ttc atg gat gca 528 Ser Tyr Leu Tyr Gly Leu Leu Ala Phe Gln Leu Thr Phe Met Asp Ala 165 170 175 aac cac tac tgg tct gtg gac ggt ctg ctg aat gcc cat agg agg aat 576 Asn His Tyr Trp Ser Val Asp Gly Leu Leu Asn Ala His Arg Arg Asn 180 185 190 gcc cac gtg ccc ctt tgg aac tat gca gtg ctc cgt ggc cag atc ttc 624 Ala His Val Pro Leu Trp Asn Tyr Ala Val Leu Arg Gly Gln Ile Phe 195 200 205 att gtg tac ttc att gcg ggt gtg aaa aag ctg gat gca gac tgg gtt 672 Ile Val Tyr Phe Ile Ala Gly Val Lys Lys Leu Asp Ala Asp Trp Val 210 215 220 gaa ggc tat tcc atg gaa tat ttg tcc cgg cac tgg ctc ttc agt ccc 720 Glu Gly Tyr Ser Met Glu Tyr Leu Ser Arg His Trp Leu Phe Ser Pro 225 230 235 240 ttc aaa ctg ctg ttg tct gag gag ctg act agc ctg ctg gtc gtg cac 768 Phe Lys Leu Leu Leu Ser Glu Glu Leu Thr Ser Leu Leu Val Val His 245 250 255 tgg ggt ggg ctg ctg ctt gac ctc tca gct ggt ttc ctg ctc ttt ttt 816 Trp Gly Gly Leu Leu Leu Asp Leu Ser Ala Gly Phe Leu Leu Phe Phe 260 265 270 gat gtc tca aga tcc att ggc ctg ttc ttt gtg tcc tac ttc cac tgc 864 Asp Val Ser Arg Ser Ile Gly Leu Phe Phe Val Ser Tyr Phe His Cys 275 280 285 atg aat tcc cag ctt ttc agc att ggt atg ttc tcc tac gtc atg ctg 912 Met Asn Ser Gln Leu Phe Ser Ile Gly Met Phe Ser Tyr Val Met Leu 290 295 300 gcc agc agc cct ctc ttc tgc tcc cct gag tgg cct cgg aag ctg gtg 960 Ala Ser Ser Pro Leu Phe Cys Ser Pro Glu Trp Pro Arg Lys Leu Val 305 310 315 320 tcc tac tgc ccc cga agg ttg caa caa ctg ttg ccc ctc aag gca gcc 1008 Ser Tyr Cys Pro Arg Arg Leu Gln Gln Leu Leu Pro Leu Lys Ala Ala 325 330 335 cct cag ccc agt gtt tcc tgt gtg tat aag agg agc cgg ggc aaa agt 1056 Pro Gln Pro Ser Val Ser Cys Val Tyr Lys Arg Ser Arg Gly Lys Ser 340 345 350 ggc cag aag cca ggg ctg cgc cat cag ctg gga gct gcc ttc acc ctg 1104 Gly Gln Lys Pro Gly Leu Arg His Gln Leu Gly Ala Ala Phe Thr Leu 355 360 365 ctc tac ctc ctg gag cag cta ttc ctg ccc tat tct cat ttt ctc acc 1152 Leu Tyr Leu Leu Glu Gln Leu Phe Leu Pro Tyr Ser His Phe Leu Thr 370 375 380 cag ggc tat aac aac tgg aca aat ggg ctg tat ggc tat tcc tgg gac 1200 Gln Gly Tyr Asn Asn Trp Thr Asn Gly Leu Tyr Gly Tyr Ser Trp Asp 385 390 395 400 atg atg gtg cac tcc cgc tcc cac cag cac gtg aag atc acc tac cgt 1248 Met Met Val His Ser Arg Ser His Gln His Val Lys Ile Thr Tyr Arg 405 410 415 gat ggc cgc act ggc gaa ctg ggc tac ctt aac cct ggg gta ttt aca 1296 Asp Gly Arg Thr Gly Glu Leu Gly Tyr Leu Asn Pro Gly Val Phe Thr 420 425 430 cag agt cgg cga tgg aag gat cat gca gac atg ctg aag caa tat gcc 1344 Gln Ser Arg Arg Trp Lys Asp His Ala Asp Met Leu Lys Gln Tyr Ala 435 440 445 act tgc ctg agc cgc ctg ctt ccc aag tat aat gtc act gag ccc cag 1392 Thr Cys Leu Ser Arg Leu Leu Pro Lys Tyr Asn Val Thr Glu Pro Gln 450 455 460 atc tac ttt gat att tgg gtc tcc atc aat gac cgc ttc cag cag agg 1440 Ile Tyr Phe Asp Ile Trp Val Ser Ile Asn Asp Arg Phe Gln Gln Arg 465 470 475 480 att ttt gac cct cgt gtg gac atc gtg cag gcc gct tgg tca ccc ttt 1488 Ile Phe Asp Pro Arg Val Asp Ile Val Gln Ala Ala Trp Ser Pro Phe 485 490 495 cag cgc aca tcc tgg gtg caa cca ctc ttg atg gac ctg tct ccc tgg 1536 Gln Arg Thr Ser Trp Val Gln Pro Leu Leu Met Asp Leu Ser Pro Trp 500 505 510 agg gcc aag tta cag gaa atc aag agc agc cta gac aac cac act gag 1584 Arg Ala Lys Leu Gln Glu Ile Lys Ser Ser Leu Asp Asn His Thr Glu 515 520 525 gtg gtc ttc att gca gat ttc cct gga ctg cac ttg gag aat ttt gtg 1632 Val Val Phe Ile Ala Asp Phe Pro Gly Leu His Leu Glu Asn Phe Val 530 535 540 agt gaa gac ctg ggc aac act agc atc cag ctg ctg cag ggg gaa gtg 1680 Ser Glu Asp Leu Gly Asn Thr Ser Ile Gln Leu Leu Gln Gly Glu Val 545 550 555 560 act gtg gag ctt gtg gca gaa cag aag aac cag act ctt cga gag gga 1728 Thr Val Glu Leu Val Ala Glu Gln Lys Asn Gln Thr Leu Arg Glu Gly 565 570 575 gaa aaa atg cag ttg cct gct ggt gag tac cat aag gtg tat acg aca 1776 Glu Lys Met Gln Leu Pro Ala Gly Glu Tyr His Lys Val Tyr Thr Thr 580 585 590 tca cct agc cct tct tgc tac atg tac gtc tat gtc aac act aca gag 1824 Ser Pro Ser Pro Ser Cys Tyr Met Tyr Val Tyr Val Asn Thr Thr Glu 595 600 605 ctt gca ctg gag caa gac ctg gca tat ctg caa gaa tta aag gaa aag 1872 Leu Ala Leu Glu Gln Asp Leu Ala Tyr Leu Gln Glu Leu Lys Glu Lys 610 615 620 gtg gag aat gga agt gaa aca ggg cct cta ccc cca gag ctg cag cct 1920 Val Glu Asn Gly Ser Glu Thr Gly Pro Leu Pro Pro Glu Leu Gln Pro 625 630 635 640 ctg ttg gaa ggg gaa gta aaa ggg ggc cct gag cca aca cct ctg gtt 1968 Leu Leu Glu Gly Glu Val Lys Gly Gly Pro Glu Pro Thr Pro Leu Val 645 650 655 cag acc ttt ctt aga cgc caa caa agg ctc cag gag att gaa cgc cgg 2016 Gln Thr Phe Leu Arg Arg Gln Gln Arg Leu Gln Glu Ile Glu Arg Arg 660 665 670 cga aat act cct ttc cat gag cga ttc ttc cgc ttc ttg ttg cga aag 2064 Arg Asn Thr Pro Phe His Glu Arg Phe Phe Arg Phe Leu Leu Arg Lys 675 680 685 ctc tat gtc ttt cgc cgc agc ttc ctg atg act tgt atc tca ctt cga 2112 Leu Tyr Val Phe Arg Arg Ser Phe Leu Met Thr Cys Ile Ser Leu Arg 690 695 700 aat ctg ata tta ggc cgt cct tcc ctg gag cag ctg gcc cag gag gtg 2160 Asn Leu Ile Leu Gly Arg Pro Ser Leu Glu Gln Leu Ala Gln Glu Val 705 710 715 720 act tat gca aac ttg aga ccc ttt gag gca gtt gga gaa ctg aat ccc 2208 Thr Tyr Ala Asn Leu Arg Pro Phe Glu Ala Val Gly Glu Leu Asn Pro 725 730 735 tca aac acg gat tct tca cat tct aat cct cct gag tca aat cct gat 2256 Ser Asn Thr Asp Ser Ser His Ser Asn Pro Pro Glu Ser Asn Pro Asp 740 745 750 cct gtc cac tca gag ttc tga 2277 Pro Val His Ser Glu Phe 755 <210> 25 <211> 758 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Met Ala Val Ser Ala Gly Ser Ala Arg Thr Ser Pro Ser Ser Asp Lys 1 5 10 15 Val Gln Lys Asp Lys Ala Glu Leu Ile Ser Gly Pro Arg Gln Asp Ser 20 25 30 Arg Ile Gly Lys Leu Leu Gly 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Ser Leu Leu Val Val His 245 250 255 Trp Gly Gly Leu Leu Leu Asp Leu Ser Ala Gly Phe Leu Leu Phe Phe 260 265 270 Asp Val Ser Arg Ser Ile Gly Leu Phe Phe Val Ser Tyr Phe His Cys 275 280 285 Met Asn Ser Gln Leu Phe Ser Ile Gly Met Phe Ser Tyr Val Met Leu 290 295 300 Ala Ser Ser Pro Leu Phe Cys Ser Pro Glu Trp Pro Arg Lys Leu Val 305 310 315 320 Ser Tyr Cys Pro Arg Arg Leu Gln Gln Leu Leu Pro Leu Lys Ala Ala 325 330 335 Pro Gln Pro Ser Val Ser Cys Val Tyr Lys Arg Ser Arg Gly Lys Ser 340 345 350 Gly Gln Lys Pro Gly Leu Arg His Gln Leu Gly Ala Ala Phe Thr Leu 355 360 365 Leu Tyr Leu Leu Glu Gln Leu Phe Leu Pro Tyr Ser His Phe Leu Thr 370 375 380 Gln Gly Tyr Asn Asn Trp Thr Asn Gly Leu Tyr Gly Tyr Ser Trp Asp 385 390 395 400 Met Met Val His Ser Arg Ser His Gln His Val Lys Ile Thr Tyr Arg 405 410 415 Asp Gly Arg Thr Gly Glu Leu Gly Tyr Leu Asn Pro Gly Val Phe Thr 420 425 430 Gln Ser Arg Arg Trp Lys Asp His Ala Asp Met Leu Lys Gln Tyr Ala 435 440 445 Thr Cys Leu Ser Arg Leu Leu Pro Lys Tyr Asn 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cag gtt cag gga gag ccc 192 Gly Leu Thr Gly Thr Leu Arg Cys Gln Leu Gln Val Gln Gly Glu Pro 50 55 60 ccc gag gta cat tgg ctt cgg gat gga cag atc ctg gag ctc gcg gac 240 Pro Glu Val His Trp Leu Arg Asp Gly Gln Ile Leu Glu Leu Ala Asp 65 70 75 80 agc acc cag acc cag gtg ccc ctg ggt gag gat gaa cag gat gac tgg 288 Ser Thr Gln Thr Gln Val Pro Leu Gly Glu Asp Glu Gln Asp Asp Trp 85 90 95 ata gtg gtc agc cag ctc aga atc acc tcc ctg cag ctt tcc gac acg 336 Ile Val Val Ser Gln Leu Arg Ile Thr Ser Leu Gln Leu Ser Asp Thr 100 105 110 gga cag tac cag tgt ttg gtg ttt ctg gga cat cag acc ttc gtg tcc 384 Gly Gln Tyr Gln Cys Leu Val Phe Leu Gly His Gln Thr Phe Val Ser 115 120 125 cag cct ggc tat gtt ggg ctg gag ggc ttg cct tac ttc ctg gag gag 432 Gln Pro Gly Tyr Val Gly Leu Glu Gly Leu Pro Tyr Phe Leu Glu Glu 130 135 140 ccc gaa gac agg act gtg gcc gcc aac acc ccc ttc aac ctg agc tgc 480 Pro Glu Asp Arg Thr Val Ala Ala Asn Thr Pro Phe Asn Leu Ser Cys 145 150 155 160 caa gct cag gga ccc cca gag ccc gtg gac cta ctc tgg ctc cag gat 528 Gln Ala Gln Gly Pro Pro Glu Pro Val Asp Leu Leu Trp Leu Gln Asp 165 170 175 gct gtc ccc ctg gcc acg gct cca ggt cac ggc ccc cag cgc agc ctg 576 Ala Val Pro Leu Ala Thr Ala Pro Gly His Gly Pro Gln Arg Ser Leu 180 185 190 cat gtt cca ggg ctg aac aag aca tcc tct ttc tcc tgc gaa gcc cat 624 His Val Pro Gly Leu Asn Lys Thr Ser Ser Phe Ser Cys Glu Ala His 195 200 205 aac gcc aag ggg gtc acc aca tcc cgc aca gcc acc atc aca gtg ctc 672 Asn Ala Lys Gly Val Thr Thr Ser Arg Thr Ala Thr Ile Thr Val Leu 210 215 220 ccc cag cag ccc cgt aac ctc cac ctg gtc tcc cgc caa ccc acg gag 720 Pro Gln Gln Pro Arg Asn Leu His Leu Val Ser Arg Gln Pro Thr Glu 225 230 235 240 ctg gag gtg gct tgg act cca ggc ctg agc ggc atc tac ccc ctg acc 768 Leu Glu Val Ala Trp Thr Pro Gly Leu Ser Gly Ile Tyr Pro Leu Thr 245 250 255 cac tgc acc ctg cag gct gtg ctg tca gac gat ggg atg ggc atc cag 816 His Cys Thr Leu Gln Ala Val Leu Ser Asp Asp Gly Met Gly Ile Gln 260 265 270 gcg gga gaa cca gac ccc cca gag gag ccc ctc acc tcg caa gca tcc 864 Ala Gly Glu Pro Asp Pro Pro Glu Glu Pro Leu Thr Ser Gln Ala Ser 275 280 285 gtg ccc ccc cat cag ctt cgg cta ggc agc ctc cat cct cac acc cct 912 Val Pro Pro His Gln Leu Arg Leu Gly Ser Leu His Pro His Thr Pro 290 295 300 tat cac atc cgc gtg gca tgc acc agc agc cag ggc ccc tca tcc tgg 960 Tyr His Ile Arg Val Ala Cys Thr Ser Ser Gln Gly Pro Ser Ser Trp 305 310 315 320 acc cac tgg ctt cct gtg gag acg ccg gag gga gtg ccc ctg ggc ccc 1008 Thr His Trp Leu Pro Val Glu Thr Pro Glu Gly Val Pro Leu Gly Pro 325 330 335 cct gag aac att agt gct acg cgg aat ggg agc cag gcc ttc gtg cat 1056 Pro Glu Asn Ile Ser Ala Thr Arg Asn Gly Ser Gln Ala Phe Val His 340 345 350 tgg caa gag ccc cgg gcg ccc ctg cag ggt acc ctg tta ggg tac cgg 1104 Trp Gln Glu Pro Arg Ala Pro Leu Gln Gly Thr Leu Leu Gly Tyr Arg 355 360 365 ctg gcg tat caa ggc cag gac acc cca gag gtg cta atg gac ata ggg 1152 Leu Ala Tyr Gln Gly Gln Asp Thr Pro Glu Val Leu Met Asp Ile Gly 370 375 380 cta agg caa gag gtg acc ctg gag ctg cag ggg gac ggg tct gtg tcc 1200 Leu Arg Gln Glu Val Thr Leu Glu Leu Gln Gly Asp Gly Ser Val Ser 385 390 395 400 aat ctg aca gtg tgt gtg gca gcc tac act gct gct ggg gat gga ccc 1248 Asn Leu Thr Val Cys Val Ala Ala Tyr Thr Ala Ala Gly Asp Gly Pro 405 410 415 tgg agc ctc cca gta ccc ctg gag gcc tgg cgc cca ggg caa gca cag 1296 Trp Ser Leu Pro Val Pro Leu Glu Ala Trp Arg Pro Gly Gln Ala Gln 420 425 430 cca gtc cac cag ctg gtg aag gaa cct tca act cct gcc ttc tcg tgg 1344 Pro Val His Gln Leu Val Lys Glu Pro Ser Thr Pro Ala Phe Ser Trp 435 440 445 ccc tgg tgg tat gta ctg cta gga gca gtc gtg gcc gct gcc tgt gtc 1392 Pro Trp Trp Tyr Val Leu Leu Gly Ala Val Val Ala Ala Ala Cys Val 450 455 460 ctc atc ttg gct ctc ttc ctt gtc cac cgg cga aag aag gag acc cgt 1440 Leu Ile Leu Ala Leu Phe Leu Val His Arg Arg Lys Lys Glu Thr Arg 465 470 475 480 tat gga gaa gtg ttt gaa cca aca gtg gaa aga ggt gaa ctg gta gtc 1488 Tyr Gly Glu Val Phe Glu Pro Thr Val Glu Arg Gly Glu Leu Val Val 485 490 495 agg tac cgc gtg cgc aag tcc tac agt cgt cgg acc act gaa gct acc 1536 Arg Tyr Arg Val Arg Lys Ser Tyr Ser Arg Arg Thr Thr Glu Ala Thr 500 505 510 ttg aac agc ctg ggc atc agt gaa gag ctg aag gag aag ctg cgg gat 1584 Leu Asn Ser Leu Gly Ile Ser Glu Glu Leu Lys Glu Lys Leu Arg Asp 515 520 525 gtg atg gtg gac cgg cac aag gtg gcc ctg ggg aag act ctg gga gag 1632 Val Met Val Asp Arg His Lys Val Ala Leu Gly Lys Thr Leu Gly Glu 530 535 540 gga gag ttt gga gct gtg atg gaa ggc cag ctc aac cag gac gac tcc 1680 Gly Glu Phe Gly Ala Val Met Glu Gly Gln Leu Asn Gln Asp Asp Ser 545 550 555 560 atc ctc aag gtg gct gtg aag acg atg aag att gcc atc tgc acg agg 1728 Ile Leu Lys Val Ala Val Lys Thr Met Lys Ile Ala Ile Cys Thr Arg 565 570 575 tca gag ctg gag gat ttc ctg agt gaa gcg gtc tgc atg aag gaa ttt 1776 Ser Glu Leu Glu Asp Phe Leu Ser Glu Ala Val Cys Met Lys Glu Phe 580 585 590 gac cat ccc aac gtc atg agg ctc atc ggt gtc tgt ttc cag ggt tct 1824 Asp His Pro Asn Val Met Arg Leu Ile 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Ala Lys Met Pro Val Lys Trp Ile Ala Ile Glu Ser 705 710 715 720 cta gct gac cgt gtc tac acc agc aag agc gat gtg tgg tcc ttc ggg 2208 Leu Ala Asp Arg Val Tyr Thr Ser Lys Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly 725 730 735 gtg aca atg tgg gag att gcc aca aga ggc caa acc cca tat ccg ggc 2256 Val Thr Met Trp Glu Ile Ala Thr Arg Gly Gln Thr Pro Tyr Pro Gly 740 745 750 gtg gag aac agc gag att tat gac tat ctg cgc cag gga aat cgc ctg 2304 Val Glu Asn Ser Glu Ile Tyr Asp Tyr Leu Arg Gln Gly Asn Arg Leu 755 760 765 aag cag cct gcg gac tgt ctg gat gga ctg tat gcc ttg atg tcg cgg 2352 Lys Gln Pro Ala Asp Cys Leu Asp Gly Leu Tyr Ala Leu Met Ser Arg 770 775 780 tgc tgg gag cta aat ccc cag gac cgg cca agt ttt aca gag ctg cgg 2400 Cys Trp Glu Leu Asn Pro Gln Asp Arg Pro Ser Phe Thr Glu Leu Arg 785 790 795 800 gaa gat ttg gag aac aca ctg aag gcc ttg cct cct gcc cag gag cct 2448 Glu Asp Leu Glu Asn Thr Leu Lys Ala Leu Pro Pro Ala Gln Glu Pro 805 810 815 gac gaa atc ctc tat gtc aac atg gat gag ggt gga ggt tat cct gaa 2496 Asp Glu Ile Leu Tyr Val Asn Met Asp Glu Gly Gly Gly Tyr Pro Glu 820 825 830 ccc cct gga gct gca gga gga gct gac ccc cca acc cag cca gac cct 2544 Pro Pro Gly Ala Ala Gly Gly Ala Asp Pro Pro Thr Gln Pro Asp Pro 835 840 845 aag gat tcc tgt agc tgc ctc act gcg gct gag gtc cat cct gct gga 2592 Lys Asp Ser Cys Ser Cys Leu Thr Ala Ala Glu Val His Pro Ala Gly 850 855 860 cgc tat gtc ctc tgc cct tcc aca acc cct agc ccc gct cag cct gct 2640 Arg Tyr Val Leu Cys Pro Ser Thr Thr Pro Ser Pro Ala Gln Pro Ala 865 870 875 880 gat agg ggc tcc cca gca gcc cca ggg cag gag gat ggt gcc tga 2685 Asp Arg Gly Ser Pro Ala Ala Pro Gly Gln Glu Asp Gly Ala 885 890 <210> 27 <211> 894 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Met Ala Trp Arg Cys Pro Arg Met Gly Arg Val Pro Leu Ala Trp Cys 1 5 10 15 Leu Ala Leu Cys Gly Trp Ala Cys Met Ala Pro Arg Gly Thr Gln Ala 20 25 30 Glu Glu Ser Pro Phe Val Gly Asn Pro Gly Asn Ile Thr Gly Ala Arg 35 40 45 Gly Leu Thr Gly Thr Leu Arg Cys Gln Leu Gln Val Gln Gly Glu Pro 50 55 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Ser Ala Pro Ala Phe Ser Trp 435 440 445 ccc tgg tgg tat ata ctg cta gga gca gtc gtg gcc gct gcc tgt gtc 1392 Pro Trp Trp Tyr Ile Leu Leu Gly Ala Val Val Ala Ala Ala Cys Val 450 455 460 ctc atc ttg gct ctc ttc ctt gtc cac cgg cga aag aag gag acc cgt 1440 Leu Ile Leu Ala Leu Phe Leu Val His Arg Arg Lys Lys Glu Thr Arg 465 470 475 480 tat gga gaa gtg ttc gag cca aca gtg gaa aga ggt gaa ctg gta gtc 1488 Tyr Gly Glu Val Phe Glu Pro Thr Val Glu Arg Gly Glu Leu Val Val 485 490 495 agg tac cgc gtg cgc aag tcc tac agt cgc cgg acc act gaa gct acc 1536 Arg Tyr Arg Val Arg Lys Ser Tyr Ser Arg Arg Thr Thr Glu Ala Thr 500 505 510 ttg aac agc ctg ggc atc agt gaa gag ctg aag gag aag ctg cgg gat 1584 Leu Asn Ser Leu Gly Ile Ser Glu Glu Leu Lys Glu Lys Leu Arg Asp 515 520 525 gtg atg gtg gac cgg cac aag gtg gcc ctg ggg aag act ctg gga gaa 1632 Val Met Val Asp Arg His Lys Val Ala Leu Gly Lys Thr Leu Gly Glu 530 535 540 gga gag ttt gga gcc gtg atg gaa ggc cag ctc aac cag gac gac tcc 1680 Gly Glu Phe Gly Ala Val Met Glu Gly Gln Leu Asn Gln Asp Asp Ser 545 550 555 560 atc ctc aag gtg gct gtg aag aca atg aag att gcc atc tgc aca agg 1728 Ile Leu Lys Val Ala Val Lys Thr Met Lys Ile Ala Ile Cys Thr Arg 565 570 575 tca gag ctg gag gat ttc ctg agt gaa gca gtc tgc atg aag gaa ttc 1776 Ser Glu Leu Glu Asp Phe Leu Ser Glu Ala Val Cys Met Lys Glu Phe 580 585 590 gac cat ccc aat gtc atg agg ctc atc ggt gtc tgt ttc cag ggt tct 1824 Asp His Pro Asn Val Met Arg Leu Ile Gly Val Cys Phe Gln Gly Ser 595 600 605 gaa cga gag agc ttt cca gca cct gtg gtc atc tta cct ttc atg aag 1872 Glu Arg Glu Ser Phe Pro Ala Pro Val Val Ile Leu Pro Phe Met Lys 610 615 620 cat gga gac cta cac agc ttc ctc ctc tat tcc cgg ctt ggg gac cag 1920 His Gly Asp Leu His Ser Phe Leu Leu Tyr Ser Arg Leu Gly Asp Gln 625 630 635 640 cca gtg tac ctg ccc act cag atg cta gtg aag ttc atg gcg gac atc 1968 Pro Val Tyr Leu Pro Thr Gln Met Leu Val Lys Phe Met Ala Asp Ile 645 650 655 gcc agt ggc atg gaa tat ctg agt acc aag aga ttc ata cac cgg gac 2016 Ala Ser Gly Met Glu Tyr Leu Ser Thr Lys Arg Phe Ile His Arg Asp 660 665 670 ctg gcg gcc agg aac tgc atg ctg aat gag aac atg tcc gtg tgt gtg 2064 Leu Ala Ala Arg Asn Cys Met Leu Asn Glu Asn Met Ser Val Cys Val 675 680 685 gcg gac ttc ggg ctc tcc aag aag atc tac aac ggg gac tac tac cgc 2112 Ala Asp Phe Gly Leu Ser Lys Lys Ile Tyr Asn Gly Asp Tyr Tyr Arg 690 695 700 cag gga cgt atc gcc aag atg cca gtc aag tgg att gcc att gag agt 2160 Gln Gly Arg Ile Ala Lys Met Pro Val Lys Trp Ile Ala Ile Glu Ser 705 710 715 720 cta gct gac cgt gtc tac acg agc aag agt gat gtg tgg tcc ttc ggg 2208 Leu Ala Asp Arg Val Tyr Thr Ser Lys Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly 725 730 735 gtg aca atg tgg gag att gcc aca aga ggc caa acc cca tat cca ggc 2256 Val Thr Met Trp Glu Ile Ala Thr Arg Gly Gln Thr Pro Tyr Pro Gly 740 745 750 gtg gag aac agc gag att tat gac tat ctg cgc cag gga aat cgc ctg 2304 Val Glu Asn Ser Glu Ile Tyr Asp Tyr Leu Arg Gln Gly Asn Arg Leu 755 760 765 aag cag cct gcg gac tgt ctg gat gga ctg tat gcc ttg atg tcg cgg 2352 Lys Gln Pro Ala Asp Cys Leu Asp Gly Leu Tyr Ala Leu Met Ser Arg 770 775 780 tgc tgg gag cta aat ccc cag gac cgg cca agt ttt aca gag ctg cgg 2400 Cys Trp Glu Leu Asn Pro Gln Asp Arg Pro Ser Phe Thr Glu Leu Arg 785 790 795 800 gaa gat ttg gag aac aca ctg aag gcc ttg cct cct gcc cag gag cct 2448 Glu Asp Leu Glu Asn Thr Leu Lys Ala Leu Pro Pro Ala Gln Glu Pro 805 810 815 gac gaa atc ctc tat gtc aac atg gat gaa ggt gga ggt tat cct gaa 2496 Asp Glu Ile Leu Tyr Val Asn Met Asp Glu Gly Gly Gly Tyr Pro Glu 820 825 830 cct ccc ggc gct gct gga gga gct gac ccc cca acc cag cta gac cct 2544 Pro Pro Gly Ala Ala Gly Gly Ala Asp Pro Pro Thr Gln Leu Asp Pro 835 840 845 aag gat tcc tgt agc tgc ctc act tcg gct gag gtc cat cct gct gga 2592 Lys Asp Ser Cys Ser Cys Leu Thr Ser Ala Glu Val His Pro Ala Gly 850 855 860 cgc tat gtc ctc tgc cct tcc aca gcc cct agc ccc gct cag cct gct 2640 Arg Tyr Val Leu Cys Pro Ser Thr Ala Pro Ser Pro Ala Gln Pro Ala 865 870 875 880 gat agg ggc tcc cca gca gcc cca ggg cag gag gat ggc gcc tga 2685 Asp Arg Gly Ser Pro Ala Ala Pro Gly Gln Glu Asp Gly Ala 885 890 <210> 33 <211> 894 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 33 Met Ala Trp Arg Cys Pro Arg Met Gly Arg Val Pro Leu Ala Trp Cys 1 5 10 15 Leu Ala Leu Cys Gly Trp Val Cys Met Ala Pro Arg Gly Thr Gln Ala 20 25 30 Glu Glu Ser Pro Phe Val Gly Asn Pro Gly Asn Ile Thr Gly Ala Arg 35 40 45 Gly Leu Thr Gly Thr Leu Arg Cys Gln Leu Gln Val Gln Gly Glu Pro 50 55 60 Pro Glu Val His Trp Leu Arg Asp Gly Gln Ile Leu Glu Leu Ala Asp 65 70 75 80 Ser Thr Gln Thr Gln Val Pro Leu Gly Glu Asp Glu Gln Asp Asp Trp 85 90 95 Ile Val Val Ser Gln Leu Arg Ile Ala Ser Leu Gln Leu Ser Asp Ala 100 105 110 Gly Gln Tyr Gln Cys Leu Val Phe Leu Gly His Gln Asn Phe Val Ser 115 120 125 Gln Pro Gly Tyr Val Gly Leu Glu Gly Leu Pro Tyr Phe Leu Glu Glu 130 135 140 Pro Glu Asp Arg Thr Val Ala Ala Asn Thr Pro Phe Asn Leu Ser Cys 145 150 155 160 Gln Ala Gln Gly Pro Pro Glu Pro Val Asp Leu Leu Trp Leu Gln Asp 165 170 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gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc 1392 Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 450 455 460 cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca 1440 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 465 470 475 480 tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac 1488 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 485 490 495 tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg 1536 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 500 505 510 gag gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc 1584 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 515 520 525 ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc 1632 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 530 535 540 aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa 1680 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 545 550 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816 Val Leu Ser Asn Asp Gly Val Gly Val Trp Leu Gly Lys Ser Asp Pro 260 265 270 cct gaa gaa ccc ctc acc gtg caa gta tca gtg ccc ccc cac cag ctt 864 Pro Glu Glu Pro Leu Thr Val Gln Val Ser Val Pro Pro His Gln Leu 275 280 285 cgg ctg gaa aag ctc ctt cct cac acc cca tat cac atc cgg gta tcc 912 Arg Leu Glu Lys Leu Leu Pro His Thr Pro Tyr His Ile Arg Val Ser 290 295 300 tgc act agc agc cag ggc ccc tca cct tgg acc cac tgg ctt cct gtg 960 Cys Thr Ser Ser Gln Gly Pro Ser Pro Trp Thr His Trp Leu Pro Val 305 310 315 320 gag acc acg gag gga gtg ccc ttg ggt ccc cct gag aac gtt agc gcc 1008 Glu Thr Thr Glu Gly Val Pro Leu Gly Pro Pro Glu Asn Val Ser Ala 325 330 335 atg cgg aat ggg agc cag gcc ctc gtg cgt tgg cag gag cca agg gag 1056 Met Arg Asn Gly Ser Gln Ala Leu Val Arg Trp Gln Glu Pro Arg Glu 340 345 350 ccc ttg cag ggc acc ctg tta ggg tac cgg ctg gca tat cga ggc cag 1104 Pro Leu Gln Gly Thr Leu Leu Gly Tyr Arg Leu Ala Tyr Arg Gly Gln 355 360 365 gac acc ccc gag gta ctt atg gat ata ggg cta act cga gag gtg acc 1152 Asp Thr Pro Glu Val Leu Met Asp Ile Gly Leu Thr Arg Glu Val Thr 370 375 380 ttg gaa ctt cgg ggg gac agg cct gtg gct aac ctg act gtg tct gtg 1200 Leu Glu Leu Arg Gly Asp Arg Pro Val Ala Asn Leu Thr Val Ser Val 385 390 395 400 gca gcc tat acc tca gct ggg gat ggg ccc tgg agc ctt cct gtg ccc 1248 Ala Ala Tyr Thr Ser Ala Gly Asp Gly Pro Trp Ser Leu Pro Val Pro 405 410 415 cta gag ccc tgg cgc cca ggg caa gga cag cca ctc cac cat ctg gtg 1296 Leu Glu Pro Trp Arg Pro Gly Gln Gly Gln Pro Leu His His Leu Val 420 425 430 agt gaa ccc cca cct ccc gcc ttc tcg tgg cct tgg tgg tat gta ctg 1344 Ser Glu Pro Pro Pro Pro Ala Phe Ser Trp Pro Trp Trp Tyr Val Leu 435 440 445 ctg gga gca ctt gtg gcc gcc gcc tgt gtc ctt atc ttg acc ctg ttc 1392 Leu Gly Ala Leu Val Ala Ala Ala Cys Val Leu Ile Leu Thr Leu Phe 450 455 460 ctt gtc cat cgg agg aag aag gag acg aga tat ggg gag gtg ttc gag 1440 Leu Val His Arg Arg Lys Lys Glu Thr Arg Tyr Gly Glu Val Phe Glu 465 470 475 480 cca act gtg gaa agg ggt gaa ctg gta gtc agg tac cgt gcc cga aag 1488 Pro Thr Val Glu Arg Gly Glu Leu Val Val Arg Tyr Arg Ala Arg Lys 485 490 495 tcc tac agt cgc cgg acc acg gaa gcc acc ttg aac agt ctg ggc atc 1536 Ser Tyr Ser Arg Arg Thr Thr Glu Ala Thr Leu Asn Ser Leu Gly Ile 500 505 510 agc gaa gag ctg aag gag aaa cta cga gac gtc atg gta gat cgg cat 1584 Ser Glu Glu Leu Lys Glu Lys Leu Arg Asp Val Met Val Asp Arg His 515 520 525 aag gtg gcc ttg ggg aag acc ctg gga gag gga gaa ttt ggt gct gtg 1632 Lys Val Ala Leu Gly Lys Thr Leu Gly Glu Gly Glu Phe Gly Ala Val 530 535 540 atg gag ggc cag ctc aac cag gat gac tcc atc ctc aag gtc gct gtg 1680 Met Glu Gly Gln Leu Asn Gln Asp Asp Ser Ile Leu Lys Val Ala Val 545 550 555 560 aag acc atg aaa att gcc atc tgc aca aga tca gag ctg gag gat ttc 1728 Lys Thr Met Lys Ile Ala Ile Cys Thr Arg Ser Glu Leu Glu Asp Phe 565 570 575 ctg agt gaa gct gtc tgc atg aag gaa ttt gac cac ccc aac gtc atg 1776 Leu Ser Glu Ala Val Cys Met Lys Glu Phe Asp His Pro Asn Val Met 580 585 590 agg ctc att ggc gtc tgt ttc cag ggt tct gac cga gag ggt ttc cca 1824 Arg Leu Ile Gly Val Cys Phe Gln Gly Ser Asp Arg Glu Gly Phe Pro 595 600 605 gaa ccg gtg gtc atc ttg cct ttc atg aaa cat gga gac ctc cac agt 1872 Glu Pro Val Val Ile Leu Pro Phe Met Lys His Gly Asp Leu His Ser 610 615 620 ttc ctc ctg tac tcg cgg ctc ggg gac cag cca gtg ttc ctg ccc act 1920 Phe Leu Leu Tyr Ser Arg Leu Gly Asp Gln Pro Val Phe Leu Pro Thr 625 630 635 640 cag atg cta gtg aag ttt atg gcc gac att gcc agt ggc atg gag tac 1968 Gln Met Leu Val Lys Phe Met Ala Asp Ile Ala Ser Gly Met Glu Tyr 645 650 655 ctc agt acc aag aga ttc ata cac cgg gac cta gct gcc agg aac tgc 2016 Leu Ser Thr Lys Arg Phe Ile His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys 660 665 670 atg ctg aat gag aac atg tcc gtg tgc gtg gca gac ttc ggg ctc tcc 2064 Met Leu Asn Glu Asn Met Ser Val Cys Val Ala Asp Phe Gly Leu Ser 675 680 685 aag aag atc tac aat ggg gat tac tac cgc caa ggg cgc att gcc aag 2112 Lys Lys Ile Tyr Asn Gly Asp Tyr Tyr Arg Gln Gly Arg Ile Ala 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Met Trp Glu Ile Met Thr Arg Gly Gln Thr Pro Tyr Ala Gly Ile 725 730 735 gaa aac gct gag att tac aac tac ctc att ggc ggg aac cgc ctg aaa 2256 Glu Asn Ala Glu Ile Tyr Asn Tyr Leu Ile Gly Gly Asn Arg Leu Lys 740 745 750 cag cct ccg gag tgt atg gag gac gtg tat gat ctc atg tac cag tgc 2304 Gln Pro Pro Glu Cys Met Glu Asp Val Tyr Asp Leu Met Tyr Gln Cys 755 760 765 tgg agt gct gac ccc aag cag cgc ccg agc ttt act tgt ctg cga atg 2352 Trp Ser Ala Asp Pro Lys Gln Arg Pro Ser Phe Thr Cys Leu Arg Met 770 775 780 gaa ctg gag aac atc ttg ggc cag ctg tct gtg cta tct gcc agc cag 2400 Glu Leu Glu Asn Ile Leu Gly Gln Leu Ser Val Leu Ser Ala Ser Gln 785 790 795 800 gac ccc tta tac atc aac atc gag aga gct gag gag ccc act gcg gga 2448 Asp Pro Leu Tyr Ile Asn Ile Glu Arg Ala Glu Glu Pro Thr Ala Gly 805 810 815 ggc agc ctg gag cta cct ggc agg gat cag ccc tac agt ggg gct ggg 2496 Gly Ser Leu Glu Leu Pro Gly Arg Asp Gln Pro Tyr Ser Gly Ala Gly 820 825 830 gat ggc agt ggc atg ggg gca gtg ggt ggc act ccc agt gac tgt cgg 2544 Asp Gly Ser Gly Met Gly Ala Val Gly Gly Thr Pro Ser Asp Cys Arg 835 840 845 tac ata ctc acc ccc gga ggg ctg gct gag cag cca ggg cag gca gag 2592 Tyr Ile Leu Thr Pro Gly Gly Leu Ala Glu Gln Pro Gly Gln Ala Glu 850 855 860 cac cag cca gag agt ccc ctc aat gag aca cag agg ctt ttg ctg ctg 2640 His Gln Pro Glu Ser Pro Leu Asn Glu Thr Gln Arg Leu Leu Leu Leu 865 870 875 880 cag caa ggg cta ctg cca cac agt agc tgt tag 2673 Gln Gln Gly Leu Leu Pro His Ser Ser Cys 885 890 <210> 53 <211> 890 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Met Ala Leu Arg Arg Ser Met Gly Arg Pro Gly Leu Pro Pro Leu Pro 1 5 10 15 Leu Pro Pro Pro Pro Arg Leu Gly Leu Leu Leu Ala Ala Leu Ala Ser 20 25 30 Leu Leu Leu Pro Glu Ser Ala Ala Ala Gly Leu Lys Leu Met Gly Ala 35 40 45 Pro Val Lys Leu Thr Val Ser Gln Gly Gln Pro Val Lys Leu Asn Cys 50 55 60 Ser Val Glu Gly Met Glu Glu Pro Asp Ile Gln Trp Val Lys Asp Gly 65 70 75 80 Ala Val Val Gln Asn Leu Asp Gln Leu Tyr Ile Pro Val Ser Glu Gln 85 90 95 His Trp Ile Gly Phe Leu Ser Leu Lys Ser Val Glu Arg Ser Asp Ala 100 105 110 Gly Arg Tyr Trp Cys Gln Val Glu Asp Gly Gly Glu Thr Glu Ile Ser 115 120 125 Gln Pro Val Trp Leu Thr Val Glu Gly Val Pro Phe Phe Thr Val Glu 130 135 140 Pro Lys Asp Leu Ala Val Pro Pro Asn Ala Pro Phe Gln Leu Ser Cys 145 150 155 160 Glu Ala Val Gly Pro Pro Glu Pro Val Thr Ile Val Trp Trp Arg Gly 165 170 175 Thr Thr Lys Ile Gly Gly Pro Ala Pro Ser Pro Ser Val Leu Asn Val 180 185 190 Thr Gly Val Thr Gln Ser Thr Met Phe Ser Cys Glu Ala His Asn Leu 195 200 205 Lys Gly Leu Ala Ser Ser Arg Thr Ala Thr Val His Leu Gln Ala Leu 210 215 220 Pro Ala Ala Pro Phe Asn Ile Thr Val Thr Lys Leu Ser Ser Ser Asn 225 230 235 240 Ala Ser Val Ala Trp Met Pro Gly Ala Asp Gly Arg Ala Leu Leu Gln 245 250 255 Ser Cys Thr Val Gln Val Thr Gln Ala Pro Gly Gly Trp Glu Val Leu 260 265 270 Ala Val Val Val Pro Val Pro Pro Phe Thr Cys Leu Leu Arg Asp Leu 275 280 285 Val Pro Ala Thr Asn Tyr Ser Leu Arg Val Arg Cys Ala Asn Ala Leu 290 295 300 Gly Pro Ser Pro Tyr Ala Asp Trp Val Pro Phe Gln Thr Lys Gly Leu 305 310 315 320 Ala Pro Ala Ser Ala Pro Gln Asn Leu His Ala Ile Arg Thr Asp Ser 325 330 335 Gly Leu Ile Leu Glu Trp Glu Glu Val Ile Pro Glu Ala Pro Leu Glu 340 345 350 Gly Pro Leu Gly Pro Tyr Lys Leu Ser Trp Val Gln Asp Asn Gly Thr 355 360 365 Gln Asp Glu Leu Thr Val Glu Gly Thr Arg Ala Asn Leu Thr Gly Trp 370 375 380 Asp Pro Gln Lys Asp Leu Ile Val Arg Val Cys Val Ser Asn Ala Val 385 390 395 400 Gly Cys Gly Pro Trp Ser Gln Pro Leu Val Val Ser Ser His Asp Arg 405 410 415 Ala Gly Gln Gln Gly Pro Pro His Ser Arg Thr Ser Trp Val Pro Val 420 425 430 Val Leu Gly Val Leu Thr Ala Leu Val Thr Ala Ala Ala Leu Ala Leu 435 440 445 Ile Leu Leu Arg Lys Arg Arg Lys Glu Thr Arg Phe Gly Gln Ala Phe 450 455 460 Asp Ser Val Met Ala Arg Gly Glu Pro Ala Val His Phe Arg Ala Ala 465 470 475 480 Arg Ser Phe Asn Arg Glu Arg Pro Glu Arg Ile Glu Ala Thr Leu Asp 485 490 495 Ser Leu Gly Ile Ser Asp Glu Leu Lys Glu Lys Leu Glu Asp Val Leu 500 505 510 Ile Pro Glu Gln Gln Phe Thr Leu Gly Arg Met Leu Gly Lys Gly Glu 515 520 525 Phe Gly Ser Val Arg Glu Ala Gln Leu Lys Gln Glu Asp Gly Ser Phe 530 535 540 Val Lys Val Ala Val Lys Met Leu Lys Ala Asp Ile Ile Ala Ser Ser 545 550 555 560 Asp Ile Glu Glu Phe Leu Arg Glu Ala Ala Cys Met Lys Glu Phe Asp 565 570 575 His Pro His Val Ala Lys Leu Val Gly Val Ser Leu Arg Ser Arg Ala 580 585 590 Lys Gly Arg Leu Pro Ile Pro Met Val Ile Leu Pro Phe Met Lys His 595 600 605 Gly Asp Leu His Ala Phe Leu Leu Ala Ser Arg Ile Gly Glu Asn Pro 610 615 620 Phe Asn Leu Pro Leu Gln Thr Leu Ile Arg Phe Met Val Asp Ile Ala 625 630 635 640 Cys Gly Met Glu Tyr Leu Ser Ser Arg Asn Phe Ile His Arg Asp Leu 645 650 655 Ala Ala Arg Asn Cys Met Leu Ala Glu Asp Met Thr Val Cys Val Ala 660 665 670 Asp Phe Gly Leu Ser Arg Lys Ile Tyr Ser Gly Asp Tyr Tyr Arg Gln 675 680 685 Gly Cys Ala Ser Lys Leu Pro Val Lys Trp Leu Ala Leu Glu Ser Leu 690 695 700 Ala Asp Asn Leu Tyr Thr Val Gln Ser Asp Val Trp Ala Phe Gly Val 705 710 715 720 Thr Met Trp Glu Ile Met Thr Arg Gly Gln Thr Pro Tyr Ala Gly Ile 725 730 735 Glu Asn Ala Glu Ile Tyr Asn Tyr Leu Ile Gly Gly Asn Arg Leu Lys 740 745 750 Gln Pro Pro Glu Cys Met Glu Asp Val Tyr Asp Leu Met Tyr Gln Cys 755 760 765 Trp Ser Ala Asp Pro Lys Gln Arg Pro Ser Phe Thr Cys Leu Arg Met 770 775 780 Glu Leu Glu Asn Ile Leu Gly Gln Leu Ser Val Leu Ser Ala Ser Gln 785 790 795 800 Asp Pro Leu Tyr Ile Asn Ile Glu Arg Ala Glu Glu Pro Thr Ala Gly 805 810 815 Gly Ser Leu Glu Leu Pro Gly Arg Asp Gln Pro Tyr Ser Gly Ala Gly 820 825 830 Asp Gly Ser Gly Met Gly Ala Val Gly Gly Thr Pro Ser Asp Cys Arg 835 840 845 Tyr Ile Leu Thr Pro Gly Gly Leu Ala Glu Gln Pro Gly Gln Ala Glu 850 855 860 His Gln Pro Glu Ser Pro Leu Asn Glu Thr Gln Arg Leu Leu Leu Leu 865 870 875 880 Gln Gln Gly Leu Leu Pro His Ser Ser Cys 885 890 <210> 54 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence : primer 24 <400> 54 ctcactatag aattcgccac catggcgctg aggcg 35 <210> 55 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence : primer 25 <400> 55 caataaacaa gttggatccc taacagctac tgtg 34 <210> 56 <211> 3000 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(3000) <400> 56 atg ggg ccg gcc ccg ctg ccg ctg ctg ctg ggc ctc ttc ctc ccc gcg 48 Met Gly Pro Ala Pro Leu Pro Leu Leu Leu Gly Leu Phe Leu Pro Ala 1 5 10 15 ctc tgg cgt aga gct atc act gag gca agg gaa gaa gcc aag cct tac 96 Leu Trp Arg Arg Ala Ile Thr Glu Ala Arg Glu Glu Ala Lys Pro Tyr 20 25 30 ccg cta ttc ccg gga cct ttt cca ggg agc ctg caa act gac cac aca 144 Pro Leu Phe Pro Gly Pro Phe Pro Gly Ser Leu Gln Thr Asp His Thr 35 40 45 ccg ctg tta tcc ctt cct cac gcc agt ggg tac cag cct gcc ttg atg 192 Pro Leu Leu Ser Leu Pro His Ala Ser Gly Tyr Gln Pro Ala Leu Met 50 55 60 ttt tca cca acc cag cct gga aga cca cat aca gga aac gta gcc att 240 Phe Ser Pro Thr Gln Pro Gly Arg Pro His Thr Gly Asn Val Ala Ile 65 70 75 80 ccc cag gtg acc tct gtc gaa tca aag ccc cta ccg cct ctt gcc ttc 288 Pro Gln Val Thr Ser Val Glu Ser Lys Pro Leu Pro Pro Leu Ala Phe 85 90 95 aaa cac aca gtt gga cac ata ata ctt tct gaa cat aaa ggt gtc aaa 336 Lys His Thr Val Gly His Ile Ile Leu Ser Glu His Lys Gly Val Lys 100 105 110 ttt aat tgc tca atc agt gta cct aat ata tac cag gac acc aca att 384 Phe Asn Cys Ser Ile Ser Val Pro Asn Ile Tyr Gln Asp Thr Thr Ile 115 120 125 tct tgg tgg aaa gat ggg aag gaa ttg ctt ggg gca cat cat gca att 432 Ser Trp Trp Lys Asp Gly Lys Glu Leu Leu Gly Ala His His Ala Ile 130 135 140 aca cag ttt tat cca gat gat gaa gtt aca gca ata atc gct tcc ttc 480 Thr Gln Phe Tyr Pro Asp Asp Glu Val Thr Ala Ile Ile Ala Ser Phe 145 150 155 160 agc ata acc agt gtg cag cgt tca gac aat ggg tcg tat atc tgt aag 528 Ser Ile Thr Ser Val Gln Arg Ser Asp Asn Gly Ser Tyr Ile Cys Lys 165 170 175 atg aaa ata aac aat gaa gag atc gtg tct gat ccc atc tac atc gaa 576 Met Lys Ile Asn Asn Glu Glu Ile Val Ser Asp Pro Ile Tyr Ile Glu 180 185 190 gta caa gga ctt cct cac ttt act aag cag cct gag agc atg aat gtc 624 Val Gln Gly Leu Pro His Phe Thr Lys Gln Pro Glu Ser Met Asn Val 195 200 205 acc aga aac aca gcc ttc aac ctc acc tgt cag gct gtg ggc ccg cct 672 Thr Arg Asn Thr Ala Phe Asn Leu Thr Cys Gln Ala Val Gly Pro Pro 210 215 220 gag ccc gtc aac att ttc tgg gtt caa aac agt agc cgt gtt aac gaa 720 Glu Pro Val Asn Ile Phe Trp Val Gln Asn Ser Ser Arg Val Asn Glu 225 230 235 240 cag cct gaa aaa tcc ccc tcc gtg cta act gtt cca ggc ctg acg gag 768 Gln Pro Glu Lys Ser Pro Ser Val Leu Thr Val Pro Gly Leu Thr Glu 245 250 255 atg gcg gtc ttc agt tgt gag gcc cac aat gac aaa ggg ctg acc gtg 816 Met Ala Val Phe Ser Cys Glu Ala His Asn Asp Lys Gly Leu Thr Val 260 265 270 tcc aag gga gtg cag atc aac atc aaa gca att ccc tcc cca cca act 864 Ser Lys Gly Val Gln Ile Asn Ile Lys Ala Ile Pro Ser Pro Pro Thr 275 280 285 gaa gtc agc atc cgt aac agc act gca cac agc att ctg atc tcc tgg 912 Glu Val Ser Ile Arg Asn Ser Thr Ala His Ser Ile Leu Ile Ser Trp 290 295 300 gtt cct ggt ttt gat gga tac tcc ccg ttc agg aat tgc agc att cag 960 Val Pro Gly Phe Asp Gly Tyr Ser Pro Phe Arg Asn Cys Ser Ile Gln 305 310 315 320 gtc aag gaa gct gat ccg ctg agt aat ggc tca gtc atg att ttt aac 1008 Val Lys Glu Ala Asp Pro Leu Ser Asn Gly Ser Val Met Ile Phe Asn 325 330 335 acc tct gcc tta cca cat ctg tac caa atc aag cag ctg caa gcc ctg 1056 Thr Ser Ala Leu Pro His Leu Tyr Gln Ile Lys Gln Leu Gln Ala Leu 340 345 350 gct aat tac agc att ggt gtt tcc tgc atg aat gaa ata ggc tgg tct 1104 Ala Asn Tyr Ser Ile Gly Val Ser Cys Met Asn Glu Ile Gly Trp Ser 355 360 365 gca gtg agc cct tgg att cta gcc agc acg act gaa gga gcc cca tca 1152 Ala Val Ser Pro Trp Ile Leu Ala Ser Thr Thr Glu Gly Ala Pro Ser 370 375 380 gta gca cct tta aat gtc act gtg ttt ctg aat gaa tct agt gat aat 1200 Val Ala Pro Leu Asn Val Thr Val Phe Leu Asn Glu Ser Ser Asp Asn 385 390 395 400 gtg gac atc aga tgg atg aag cct ccg act aag cag cag gat gga gaa 1248 Val Asp Ile Arg Trp Met Lys Pro Pro Thr Lys Gln Gln Asp Gly Glu 405 410 415 ctg gtg ggc tac cgg ata tcc cac gtg tgg cag agt gca ggg att tcc 1296 Leu Val Gly Tyr Arg Ile Ser His Val Trp Gln Ser Ala Gly Ile Ser 420 425 430 aaa gag ctc ttg gag gaa gtt ggc cag aat ggc agc cga gct cgg atc 1344 Lys Glu Leu Leu Glu Glu Val Gly Gln Asn Gly Ser Arg Ala Arg Ile 435 440 445 tct gtt caa gtc cac aat gct acg tgc aca gtg agg att gca gcc gtc 1392 Ser Val Gln Val His Asn Ala Thr Cys Thr Val Arg Ile Ala Ala Val 450 455 460 acc aga ggg gga gtt ggg ccc ttc agt gat cca gtg aaa ata ttt atc 1440 Thr Arg Gly Gly Val Gly Pro Phe Ser Asp Pro Val Lys Ile Phe Ile 465 470 475 480 cct gca cac ggt tgg gta gat tat gcc ccc tct tca act ccg gcg cct 1488 Pro Ala His Gly Trp Val Asp Tyr Ala Pro Ser Ser Thr Pro Ala Pro 485 490 495 ggc aac gca gat cct gtg ctc atc atc ttt ggc tgc ttt tgt gga ttt 1536 Gly Asn Ala Asp Pro Val Leu Ile Ile Phe Gly Cys Phe Cys Gly Phe 500 505 510 att ttg att ggg ttg att tta tac atc tcc ttg gcc atc aga aaa aga 1584 Ile Leu Ile Gly Leu Ile Leu Tyr Ile Ser Leu Ala Ile Arg Lys Arg 515 520 525 gtc cag gag aca aag ttt ggg aat gca ttc aca gag gag gat tct gaa 1632 Val Gln Glu Thr Lys Phe Gly Asn Ala Phe Thr Glu Glu Asp Ser Glu 530 535 540 tta gtg gtg aat tat ata gca aag aaa tcc ttc tgt cgg cga gcc att 1680 Leu Val Val Asn Tyr Ile Ala Lys Lys Ser Phe Cys Arg Arg Ala Ile 545 550 555 560 gaa ctt acc tta cat agc ttg gga gtc agt gag gaa cta caa aat aaa 1728 Glu Leu Thr Leu His Ser Leu Gly Val Ser Glu Glu Leu Gln Asn Lys 565 570 575 cta gaa gat gtt gtg att gac agg aat ctt cta att ctt gga aaa att 1776 Leu Glu Asp Val Val Ile Asp Arg Asn Leu Leu Ile Leu Gly Lys Ile 580 585 590 ctg ggt gaa gga gag ttt ggg tct gta atg gaa gga aat ctt aag cag 1824 Leu Gly Glu Gly Glu Phe Gly Ser Val Met Glu Gly Asn Leu Lys Gln 595 600 605 gaa gat ggg acc tct ctg aaa gtg gca gtg aag acc atg aag ttg gac 1872 Glu Asp Gly Thr Ser Leu Lys Val Ala Val Lys Thr Met Lys Leu Asp 610 615 620 aac tct tca cag cgg gag atc gag gag ttt ctc agt gag gca gcg tgc 1920 Asn Ser Ser Gln Arg Glu Ile Glu Glu Phe Leu Ser Glu Ala Ala Cys 625 630 635 640 atg aaa gac ttc agc cac cca aat gtc att cga ctt cta ggt gtg tgt 1968 Met Lys Asp Phe Ser His Pro Asn Val Ile Arg Leu Leu Gly Val Cys 645 650 655 ata gaa atg agc tct caa ggc atc cca aag ccc atg gta att tta ccc 2016 Ile Glu Met Ser Ser Gln Gly Ile Pro Lys Pro Met Val Ile Leu Pro 660 665 670 ttc atg aaa tac ggg gac ctg cat act tac tta ctt tat tcc cga ttg 2064 Phe Met Lys Tyr Gly Asp Leu His Thr Tyr Leu Leu Tyr Ser Arg Leu 675 680 685 gag aca gga cca aag cat att cct ctg cag aca cta ttg aag ttc atg 2112 Glu Thr Gly Pro Lys His Ile Pro Leu Gln Thr Leu Leu Lys Phe Met 690 695 700 gtg gat att gcc ctg gga atg gag tat ctg agc aac agg aat ttt ctt 2160 Val Asp Ile Ala Leu Gly Met Glu Tyr Leu Ser Asn Arg Asn Phe Leu 705 710 715 720 cat cga gat tta gct gct cga aac tgc atg ttg cga gat gac atg act 2208 His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Met Leu Arg Asp Asp Met Thr 725 730 735 gtc tgt gtt gcg gac ttc ggc ctc tct aag aag att tac agt ggc gat 2256 Val Cys Val Ala Asp Phe Gly Leu Ser Lys Lys Ile Tyr Ser Gly Asp 740 745 750 tat tac cgc caa ggc cgc att gct aag atg cct gtt aaa tgg atc gcc 2304 Tyr Tyr Arg Gln Gly Arg Ile Ala Lys Met Pro Val Lys Trp Ile Ala 755 760 765 ata gaa agt ctt gca gac cga gtc tac aca agt aaa agt gat gtg tgg 2352 Ile Glu Ser Leu Ala Asp Arg Val Tyr Thr Ser Lys Ser Asp Val Trp 770 775 780 gca ttt ggc gtg acc atg tgg gaa ata gct acg cgg gga atg act ccc 2400 Ala Phe Gly Val Thr Met Trp Glu Ile Ala Thr Arg Gly Met Thr Pro 785 790 795 800 tat cct ggg gtc cag aac cat gag atg tat gac tat ctt ctc cat ggc 2448 Tyr Pro Gly Val Gln Asn His Glu Met Tyr Asp Tyr Leu Leu His Gly 805 810 815 cac agg ttg aag cag ccc gaa gac tgc ctg gat gaa ctg tat gaa ata 2496 His Arg Leu Lys Gln Pro Glu Asp Cys Leu Asp Glu Leu Tyr Glu Ile 820 825 830 atg tac tct tgc tgg aga acc gat ccc tta gac cgc ccc acc ttt tca 2544 Met Tyr Ser Cys Trp Arg Thr Asp Pro Leu Asp Arg Pro Thr Phe Ser 835 840 845 gta ttg agg ctg cag cta gaa aaa ctc tta gaa agt ttg cct gac gtt 2592 Val Leu Arg Leu Gln Leu Glu Lys Leu Leu Glu Ser Leu Pro Asp Val 850 855 860 cgg aac caa gca gac gtt att tac gtc aat aca cag ttg ctg gag agc 2640 Arg Asn Gln Ala Asp Val Ile Tyr Val Asn Thr Gln Leu Leu Glu Ser 865 870 875 880 tct gag ggc ctg gcc cag ggc tcc acc ctt gct cca ctg gac ttg aac 2688 Ser Glu Gly Leu Ala Gln Gly Ser Thr Leu Ala Pro Leu Asp Leu Asn 885 890 895 atc gac cct gac tct ata att gcc tcc tgc act ccc cgc gct gcc atc 2736 Ile Asp Pro Asp Ser Ile Ile Ala Ser Cys Thr Pro Arg Ala Ala Ile 900 905 910 agt gtg gtc aca gca gaa gtt cat gac agc aaa cct cat gaa gga cgg 2784 Ser Val Val Thr Ala Glu Val His Asp Ser Lys Pro His Glu Gly Arg 915 920 925 tac atc ctg aat ggg ggc agt gag gaa tgg gaa gat ctg act tct gcc 2832 Tyr Ile Leu Asn Gly Gly Ser Glu Glu Trp Glu Asp Leu Thr Ser Ala 930 935 940 ccc tct gct gca gtc aca gct gaa aag aac agt gtt tta ccg ggg gag 2880 Pro Ser Ala Ala Val Thr Ala Glu Lys Asn Ser Val Leu Pro Gly Glu 945 950 955 960 aga ctt gtt agg aat ggg gtc tcc tgg tcc cat tcg agc atg ctg ccc 2928 Arg Leu Val Arg Asn Gly Val Ser Trp Ser His Ser Ser Met Leu Pro 965 970 975 ttg gga agc tca ttg ccc gat gaa ctt ttg ttt gct gac gac tcc tca 2976 Leu Gly Ser Ser Leu Pro Asp Glu Leu Leu Phe Ala Asp Asp Ser Ser 980 985 990 gaa ggc tca gaa gtc ctg atg tga 3000 Glu Gly Ser Glu Val Leu Met 995 <210> 57 <211> 999 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Met Gly Pro Ala Pro Leu Pro Leu Leu Leu Gly Leu Phe Leu Pro Ala 1 5 10 15 Leu Trp Arg Arg Ala Ile Thr Glu Ala Arg Glu Glu Ala Lys Pro Tyr 20 25 30 Pro Leu Phe Pro Gly Pro Phe Pro Gly Ser Leu Gln Thr Asp His Thr 35 40 45 Pro Leu Leu Ser Leu Pro His Ala Ser Gly Tyr Gln Pro Ala Leu Met 50 55 60 Phe Ser Pro Thr Gln Pro Gly Arg Pro His Thr Gly Asn Val Ala Ile 65 70 75 80 Pro Gln Val Thr Ser Val Glu Ser Lys Pro Leu Pro Pro Leu Ala Phe 85 90 95 Lys His Thr Val Gly His Ile Ile Leu Ser Glu His Lys Gly Val Lys 100 105 110 Phe Asn Cys Ser Ile Ser Val Pro Asn Ile Tyr Gln Asp Thr Thr Ile 115 120 125 Ser Trp Trp Lys Asp Gly Lys Glu Leu Leu Gly Ala 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Leu Gln Ala Leu 340 345 350 Ala Asn Tyr Ser Ile Gly Val Ser Cys Met Asn Glu Ile Gly Trp Ser 355 360 365 Ala Val Ser Pro Trp Ile Leu Ala Ser Thr Thr Glu Gly Ala Pro Ser 370 375 380 Val Ala Pro Leu Asn Val Thr Val Phe Leu Asn Glu Ser Ser Asp Asn 385 390 395 400 Val Asp Ile Arg Trp Met Lys Pro Pro Thr Lys Gln Gln Asp Gly Glu 405 410 415 Leu Val Gly Tyr Arg Ile Ser His Val Trp Gln Ser Ala Gly Ile Ser 420 425 430 Lys Glu Leu Leu Glu Glu Val Gly Gln Asn Gly Ser Arg Ala Arg Ile 435 440 445 Ser Val Gln Val His Asn Ala Thr Cys Thr Val Arg Ile Ala Ala Val 450 455 460 Thr Arg Gly Gly Val Gly Pro Phe Ser Asp Pro Val Lys Ile Phe Ile 465 470 475 480 Pro Ala His Gly Trp Val Asp Tyr Ala Pro Ser Ser Thr Pro Ala Pro 485 490 495 Gly Asn Ala Asp Pro Val Leu Ile Ile Phe Gly Cys Phe Cys Gly Phe 500 505 510 Ile Leu Ile Gly Leu Ile Leu Tyr Ile Ser Leu Ala Ile Arg Lys Arg 515 520 525 Val Gln Glu Thr Lys Phe Gly Asn Ala Phe Thr Glu Glu Asp Ser Glu 530 535 540 Leu Val Val Asn Tyr Ile Ala Lys Lys Ser Phe Cys Arg 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Met Leu Pro 965 970 975 Leu Gly Ser Ser Leu Pro Asp Glu Leu Leu Phe Ala Asp Asp Ser Ser 980 985 990 Glu Gly Ser Glu Val Leu Met 995 <210> 58 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence : primer 26 <400> 58 ctcactatag aattcgccac catggggccg gccccgctgc 40 <210> 59 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence : primer 27 <400> 59 caataaacaa gttggatcct cacatcagga cttctgagcc ttc 43 <210> 60 <211> 1027 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 60 aacagatcct ggcggggact taggactgac ctagaacaat cagggttccg caatccaggt 60 ccccaaaggt gggatcctca accgcaggac ggagggaata gcctttcgat tctgggtggt 120 gcattggaag ccccaggctc taaaaccccc aacctactga ctggtggccg agtatgcacc 180 cgactgctag ctaggcagtg tcccaagaac cagtagccaa atgtcttggc ctcagttttc 240 ccggtgacac ctggaaagtg accctgccat tagtagaggc tcaggtcagg gccccgcctc 300 tcctgggcgg cctctgccct agcccgccct gccgctcctc ctctccgcag gctcgctccc 360 acggtccccg aggtgggcgg gtgagcccag gatgacggct gtagaacccc ggcctgactc 420 gccctcgccc ccgcgccggg cctgggcttc cctagcccag ctcgcacccg ggggccgtcg 480 gagccgccgc gcgcccagct ctacgcgcct ggcgccctcc ccacgcgggc gtccccgact 540 cccgcgcgcg ctcaggctcc cagttgggaa ccaaggaggg ggaggatggg ggggggggtg 600 tgcgccgacc cggaaacgcc atataaggag caggaaggat cccccgccgg aacagacctt 660 atttgggcag cgccttatat ggagtggccc aatatggccc tgccgcttcc ggctctggga 720 ggaggggcga gcgggggttg gggcgggggc aagctgggaa ctccaggcgc ctggcccggg 780 aggccactgc tgctgttcca atactaggct ttccaggagc ctgagcgctc gcgatgccgg 840 agcgggtcgc agggtggagg tgcccaccac tcttggatgg gagggcttca cgtcactccg 900 ggtcctcccg gccggtcctt ccatattagg gcttcctgct tcccatatat ggccatgtac 960 gtcacggcgg aggcgggccc gtgctgttcc agacccttga aatagaggcc gattcgggga 1020 gtcgcga 1027 <210> 61 <211> 438 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence : CNTO VH <220> <221> CDS <222> (1)..(438) <400> 61 atg gag ttt ggg ctg acc tgg gtt ttc ctc gtt gct ctt tta aga ggt 48 Met Glu Phe Gly Leu Thr 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<211> 378 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence : CNTO VL <220> <221> CDS <222> (1)..(378) <400> 63 atg tcg cca tca caa ctc att ggg ttt ctg ctg ctc tgg gtt cca gcc 48 Met Ser Pro Ser Gln Leu Ile Gly Phe Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala 1 5 10 15 tcc agg ggt gaa att gtg ctg act cag tct cca gac ttt cag tct gtg 96 Ser Arg Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val 20 25 30 act cca aag gag aag gtc acc atc acc tgc cgg gcc agt cag agc att 144 Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile 35 40 45 ggt agt agc tta cac tgg tac cag cag aaa cca gat cag tct cca aag 192 Gly Ser Ser Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys 50 55 60 ctc ctc atc aag tat gct tcc cag tcc ttc tca ggg gtc ccc tcg agg 240 Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg 65 70 75 80 ttc agt ggc agt gga tct ggg aca gat ttc acc ctc acc atc aat agc 288 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser 85 90 95 ctg gaa gct gaa gat gct gca gcg tat tac tgt cat cag agt agt agt 336 Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Ser 100 105 110 tta ccg tac act ttt ggc cag ggg acc aag ctg gag atc aaa 378 Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 64 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 64 Met Ser Pro Ser Gln Leu Ile Gly Phe Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala 1 5 10 15 Ser Arg Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val 20 25 30 Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile 35 40 45 Gly Ser Ser Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys 50 55 60 Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser 85 90 95 Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Ser 100 105 110 Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 65 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence : primer 28 <400> 65 ccagggtcac catggagtta gtttgggcag 30 <210> 66 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence : primer 29 <400> 66 ctaacactca ttcctgttga agctcttgac aa 32 <210> 67 <211> 414 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence : KM5320 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(414) <400> 67 atg gat tgg ctg tgg aac ttg cta ttc ctg atg gca gct gcc caa agt 48 Met Asp Trp Leu Trp Asn Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser 1 5 10 15 gcc caa gca cag atc cag ttg gtg cag tct gga cct gag ctg aag aag 96 Ala Gln Ala Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys 20 25 30 cct gga gag aca gtc aag atc tcc tgc aag gct tct ggg tat acc ttc 144 Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 aca aac tat gga atg aac tgg gtg aag cag gct cca gga aag ggt tta 192 Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 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Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Asp Gly Tyr Tyr Gly Thr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 70 <211> 381 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence : KM5320 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(381) <400> 70 atg aag tca cag acc cag gtc ttc gta ttt cta ctg ctc tgt gtg tct 48 Met Lys Ser Gln Thr Gln Val Phe Val Phe Leu Leu Leu Cys Val Ser 1 5 10 15 ggt gct cat ggg agt att gtg atg acc cag act ccc aaa ttc ctg ctt 96 Gly Ala His Gly Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu 20 25 30 gta tca gca gga gac agg gtt acc ata acc tgc aag gcc agt cag agt 144 Val Ser Ala Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser 35 40 45 gtg agt aat gat gta gct tgg tac caa cag aag cca ggg cag tct cct 192 Val Ser Asn Asp Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro 50 55 60 aaa gtg ctg ata tac tat gca tcc aat cgc tac act gga gtc cct gat 240 Lys Val Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp 65 70 75 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caa agt 48 Met Asp Trp Leu Trp Asn Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser 1 5 10 15 atc caa gca cag atc cag ttg gtg cag tct gga cct gag ctg aag aag 96 Ile Gln Ala Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys 20 25 30 cct gga gag aca gtc aag atc tcc tgc agg gct tct ggg tat acc ttc 144 Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 aca aac tat gga atg aac tgg gtg aag cag gct cca gga aag ggt tta 192 Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 aag tgg atg ggc tgg ata aac acc aac act gga gag cca act tat act 240 Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr 65 70 75 80 gaa gag ttc aag gga cgg ttt gcc ttc tct ttg gag acc tct gcc act 288 Glu Glu Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Thr 85 90 95 act gcc tat ttg cag atc aac gac ctc aaa aat gag gac acg gct aca 336 Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asp Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr 100 105 110 tat ttc tgt gca aga gat gag gga tgg ttt gtt tac tgg ggc caa ggg 384 Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Glu Gly Trp Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly 115 120 125 act ctg atc act gtc tct gca 405 Thr Leu Ile Thr Val Ser Ala 130 135 <210> 74 <211> 135 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 74 Met Asp Trp Leu Trp Asn Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser 1 5 10 15 Ile Gln Ala Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr 65 70 75 80 Glu Glu Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Thr 85 90 95 Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asp Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr 100 105 110 Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Glu Gly Trp Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly 115 120 125 Thr Leu Ile Thr Val Ser Ala 130 135 <210> 75 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of KM5321 VH excluding signal sequence <400> 75 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asp Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Glu Gly Trp Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Ile 100 105 110 Thr Val Ser Ala 115 <210> 76 <211> 381 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence : KM5321 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(381) <400> 76 atg ctc tca cta gct cct ctc ctc agc ctt ctt ctc ctc tgt gtc tct 48 Met Leu Ser Leu Ala Pro Leu Leu Ser Leu Leu Leu Leu Cys Val Ser 1 5 10 15 gat tct agg gca gaa aca act gtg acc cag tct cca gca tcc ctg tcc 96 Asp Ser Arg Ala Glu Thr Thr Val Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser 20 25 30 gtg gct aca gga gaa aaa gtc act atc aga tgc ata acc agt act gat 144 Val Ala Thr Gly Glu Lys Val Thr Ile Arg Cys Ile Thr Ser Thr Asp 35 40 45 att gat gat gat atg aac tgg tac caa cag aag cca ggg gaa cct cct 192 Ile Asp Asp Asp Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Pro Pro 50 55 60 aag ctc ctt att tca gaa ggc aat act ctt cgt cct gga gtc cca tcc 240 Lys Leu Leu Ile Ser Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 cga ttc tcc agc agt ggc tat ggc aca gat ttt gtt ttt aca att gaa 288 Arg Phe Ser Ser Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Val Phe Thr Ile Glu 85 90 95 aac acg ctc tca gaa gat gtt gca gat tac tac tgt ttg caa act gat 336 Asn Thr Leu Ser Glu Asp Val Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Thr Asp 100 105 110 agc gtg cct ctc acg ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag ctg aaa 381 Ser Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 115 120 125 <210> 77 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 77 Met Leu Ser Leu Ala Pro Leu Leu Ser Leu Leu Leu Leu Cys Val Ser 1 5 10 15 Asp Ser Arg Ala Glu Thr Thr Val Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser 20 25 30 Val Ala Thr Gly Glu Lys Val Thr Ile Arg Cys Ile Thr Ser Thr Asp 35 40 45 Ile Asp Asp Asp Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Pro Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Ser Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Ser Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Val Phe Thr Ile Glu 85 90 95 Asn Thr Leu Ser Glu Asp Val Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Thr Asp 100 105 110 Ser Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 115 120 125 <210> 78 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of KM5321 VL excluding signal sequence <400> 78 Glu Thr Thr Val Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ala Thr Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Arg Cys Ile Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp 20 25 30 Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro 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<400> 82 Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Ala 1 5 10 <210> 83 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of KM5320 VL CDR2 <400> 83 Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr 1 5 <210> 84 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of KM5320 VL CDR3 <400> 84 Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Trp Thr 1 5 <210> 85 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of KM5321 VH CDR1 <400> 85 Asn Tyr Gly Met Asn 1 5 <210> 86 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of KM5321 VH CDR2 <400> 86 Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Glu Glu Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 87 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of KM5321 VH CDR3 <400> 87 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Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys 20 25 30 cct gga gag aca gtc aag atc tcc tgc aag gct tct ggg tat acc ttc 144 Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 aca aac tat gga atg aac tgg gtg aag cag gct cca gga aag ggt tta 192 Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 aag tgg atg ggc tgg ata aac act gag act gga gag cca aca tat tct 240 Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ser 65 70 75 80 gat gac ttc aag gga cgg ttt gcc ttc tct ttg gaa acc tct gcc acc 288 Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Thr 85 90 95 act gcc tat ttg cag atc aac aac ctc aga aat gag gac atg gct aca 336 Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Arg Asn Glu Asp Met Ala Thr 100 105 110 tat ttc tgt gca aga gag gat ggt tac tac ggt act ttg gac tac tgg 384 Tyr Phe Cys Ala Arg Glu Asp Gly Tyr Tyr Gly Thr Leu Asp Tyr Trp 115 120 125 ggt caa gga acc tca gtc acc gtc tcc tca gct gaa aca aca gcc ccg 432 Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Glu Thr Thr Ala Pro 130 135 140 tct gtc tat cca ctg gct cct gga act gct ctc aaa agt aac tcc atg 480 Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Thr Ala Leu Lys Ser Asn Ser Met 145 150 155 160 gtg acc ctg gga tgc ctg gtc aag ggc tat ttc cct gag cca gtc acc 528 Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 165 170 175 gtg acc tgg aac tct gga gcc ctg tcc agc ggt gtg cac acc ttc cca 576 Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro 180 185 190 gct gtc ctg cag tct ggg ctc tac act ctc acc agc tca gtg act gta 624 Ala Val Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Leu Thr Ser Ser Val Thr Val 195 200 205 ccc tcc agc acc tgg ccc agc cag acc gtc acc tgc aac gta gcc cac 672 Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His 210 215 220 ccg gcc agc agc acc aag gtg gac aag aaa att gtg ccc aga aac tgt 720 Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asn Cys 225 230 235 240 gga ggt gat tgc aag cct tgt ata tgt aca ggc tca gaa gta tca tct 768 Gly Gly Asp Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Gly Ser Glu Val Ser Ser 245 250 255 gtc ttc atc ttc ccc cca aag ccc aaa gat gtg ctc acc atc act ctg 816 Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu 260 265 270 act cct aag gtc acg tgt gtt gtg gta gac att agc cag gac gat ccc 864 Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Gln Asp Asp Pro 275 280 285 gag gtc cat ttc agc tgg ttt gta gat gac gtg gaa gtc cac aca gct 912 Glu Val His Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala 290 295 300 cag act cga cca cca gag gag cag ttc aac agc act ttc cgc tca gtc 960 Gln Thr Arg Pro Pro Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val 305 310 315 320 agt gaa ctc ccc atc ctg cac cag gac tgg ctc aat ggc agg acg ttc 1008 Ser Glu Leu Pro Ile Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Arg Thr Phe 325 330 335 aga tgc aag gtc acc agt gca gct ttc cca tcc ccc atc gag aaa acc 1056 Arg Cys Lys Val Thr Ser Ala Ala Phe Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr 340 345 350 atc tcc aaa ccc gaa ggc aga aca caa gtt ccg cat gta tac acc atg 1104 Ile Ser Lys Pro Glu Gly Arg Thr Gln Val Pro His Val Tyr Thr Met 355 360 365 tca cct acc aag gaa gag atg acc cag aat gaa gtc agt atc acc tgc 1152 Ser Pro Thr Lys Glu Glu Met Thr Gln Asn Glu Val Ser Ile Thr Cys 370 375 380 atg gta aaa ggc ttc tat ccc cca gac att tat gtg gag tgg cag atg 1200 Met Val Lys Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Tyr Val Glu Trp Gln Met 385 390 395 400 aac ggg cag cca cag gaa aac tac aag aac act cca cct acg atg gac 1248 Asn Gly Gln Pro Gln Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Pro Pro Thr Met Asp 405 410 415 aca gat ggg agt tac ttc ctc tac agc aag ctc aat gtg aag aag gaa 1296 Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Asn Val Lys Lys Glu 420 425 430 aaa tgg cag cag gga aac acg ttc acg tgt tct gtg ctg cat gaa ggc 1344 Lys Trp Gln Gln Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly 435 440 445 ctg cac aac cac cat act gag aag agt ctc tcc cac tct ccg ggt aaa 1392 Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 450 455 460 tga 1395 <210> 92 <211> 464 <212> 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165 170 175 gat ggt gtc ctg gac agt gtt act gat cag gac agc aaa gac agc acg 576 Asp Gly Val Leu Asp Ser Val Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 tac agc atg agc agc acc ctc tcg ttg acc aag gct gac tat gaa agt 624 Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Ser Leu Thr Lys Ala Asp Tyr Glu Ser 195 200 205 cat aac ctc tat acc tgt gag gtt gtt cat aag aca tca tcc tca ccc 672 His Asn Leu Tyr Thr Cys Glu Val Val His Lys Thr Ser Ser Ser Pro 210 215 220 gtc gtc aag agc ttc aac agg aat gag tgt tag 705 Val Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 225 230 <210> 94 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 94 Met Lys Ser Gln Thr Gln Val Phe Val Phe Leu Leu Leu Cys Val Ser 1 5 10 15 Gly Ala His Gly Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu 20 25 30 Val Ser Ala Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Val Ser Asn Asp Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro 50 55 60 Lys Val Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp 65 70 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Claims (19)

  1. 인간 Gas6의 아미노산 서열 314, 315 및 316번째의 아미노산 잔기 중, 적어도 하나의 아미노산 잔기에 결합하는 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편.
  2. 제1항에 있어서, 모노클로날 항체가, 인간 Gas6의 314, 315 및 316번째의 아미노산 잔기에 결합하는 모노클로날 항체인, 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 모노클로날 항체가, 하기 (a) 내지 (e)로부터 선택되는 어느 하나의 항체인, 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편.
    (a) 항체의 중쇄(이하, H쇄라고 약기함) 가변 영역(이하, VH라고 약기함)의 상보성 결정 영역(complementarity determining region; CDR, 이하 CDR이라고 약기함) 1 내지 3의 아미노산 서열이 각각 서열 번호 79, 80 및 81에 기재된 아미노산 서열이며, 또한 경쇄(이하, L쇄라고 약기함) 가변 영역(이하, VL이라고 약기함)의 CDR1 내지 3의 아미노산 서열이 각각 서열 번호 82, 83 및 84에 기재된 아미노산 서열인 항체.
    (b) 항체의 VH의 CDR1 내지 3의 아미노산 서열이 각각 서열 번호 85, 86 및 87에 기재된 아미노산 서열이며, 또한 VL의 CDR1 내지 3의 아미노산 서열이 각각 서열 번호 88, 89 및 90에 기재된 아미노산 서열인 항체.
    (c) 상기 (a) 또는 (b)에 기재된 항체와, 인간 Gas6에 대한 결합에 있어서 경합하는 항체.
    (d) 상기 (a) 또는 (b)에 기재된 항체가 결합하는 에피토프를 포함하는 에피토프에 결합하는 항체.
    (e) 상기 (a) 또는 (b)에 기재된 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체가, 하기 (a) 내지 (e)로부터 선택되는 어느 하나의 항체인, 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편.
    (a) 항체의 VH의 아미노산 서열이 서열 번호 69에 기재된 아미노산 서열이며, 또한 VL의 아미노산 서열이 서열 번호 72에 기재된 아미노산 서열인 항체.
    (b) 항체의 VH의 아미노산 서열이 서열 번호 75에 기재된 아미노산 서열이며, 또한 VL의 아미노산 서열이 서열 번호 78에 기재된 아미노산 서열인 항체.
    (c) 항체의 VH의 아미노산 서열이 서열 번호 135에 기재된 아미노산 서열이며, 또한 VL의 아미노산 서열이 서열 번호 123에 기재된 아미노산 서열인 항체.
    (d) 항체의 VH의 아미노산 서열이 서열 번호 195에 기재된 아미노산 서열이며, 또한 VL의 아미노산 서열이 서열 번호 174에 기재된 아미노산 서열인 항체.
    (e) 항체의 VH의 아미노산 서열이 서열 번호 186에 기재된 아미노산 서열이며, 또한 VL의 아미노산 서열이 서열 번호 180에 기재된 아미노산 서열인 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체가 유전자 재조합 항체인, 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편.
  6. 제5항에 있어서, 유전자 재조합 항체가, 인간형 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체로부터 선택되는 유전자 재조합 항체인, 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 단편이, Fab, Fab', (Fab')2, 단일쇄 항체(scFv), 이량체화 V 영역(diabody), 디술피드 안정화 V 영역(dsFv) 및 CDR을 포함하는 펩티드로부터 선택되는, 항체 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 해당 항체 단편을 코딩하는 염기 서열을 갖는 핵산.
  9. 제8항에 기재된 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 형질 전환 세포.
  10. 제9항에 기재된 세포를 배지에서 배양하고, 배양액으로부터 해당 항체 또는 해당 항체 단편을 채취하는 것을 포함하는, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 해당 항체 단편의 제조 방법.
  11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 해당 항체 단편을 포함하는, Gas6의 검출 또는 측정용 시약.
  12. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 해당 항체 단편을 유효 성분으로서 포함하는, Gas6 관련 질환의 치료약.
  13. 제12항에 있어서, Gas6 관련 질환이 신장 또는 암 질환인, 치료약.
  14. 제13항에 있어서, 신장 질환이 사구체 신장염, 당뇨병성 신증 또는 IgA 신증인, 치료약.
  15. 제13항에 있어서, 암 질환이 폐암, 유방암, 난소암, 전립선암, 췌장암, 신장암 또는 교모세포종인, 치료약.
  16. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 해당 항체 단편을 유효 성분으로서 포함하는, Gas6 관련 질환의 진단약.
  17. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 해당 항체 단편을 사용하여 Gas6의 검출 또는 측정을 하는 것을 포함하는, Gas6 관련 질환의 진단 방법.
  18. Gas6 관련 질환의 치료약의 제조를 위한, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 해당 항체 단편의 용도.
  19. Gas6 관련 질환의 진단약의 제조를 위한, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 해당 항체 단편의 용도.
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