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TWI501777B - 人類抗ｃｄ２７單株抗體 - Google Patents

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TWI501777B
TWI501777B TW099146686A TW99146686A TWI501777B TW I501777 B TWI501777 B TW I501777B TW 099146686 A TW099146686 A TW 099146686A TW 99146686 A TW99146686 A TW 99146686A TW I501777 B TWI501777 B TW I501777B
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Description

人類抗CD27單株抗體
本發明係關於一種特異性識別由含有未結合半乳糖之O-結合型糖鏈的CD27基因編碼之多肽且與該多肽之細胞外區域結合的人類化抗體或該抗體片段、產生該人類化抗體之融合瘤、編碼該人類化抗體之DNA、含有該DNA之載體、將該載體轉形而獲得之轉形體、使用該融合瘤或轉形體之人類化抗體或該抗體片段之製造方法、以及含有該人類化抗體或抗體片段之診斷藥、或含有該人類化抗體或抗體片段作為有效成分之治療藥。
近年來，報告有如下事例：隨著各種疾病之發病或病情之發展，與此疾病或病情相關之細胞所表現之蛋白質上所附加的糖鏈結構會發生變化。該事例中之代表例為：於超過80%之人類之癌症種類中可見表現之O-結合型(絲胺酸/蘇胺酸型)糖鏈抗原之一的Tn抗原、與於該Tn抗原上附加有唾液酸之唾液酸化Tn抗原之表現(非專利文獻2)。
已知該等糖鏈抗原於正常細胞中幾乎未見表現，現正研究將其作為癌特異性疫苗療法之標靶分子而應用於醫療(非專利文獻1)。該等癌特異性糖鏈抗原之表現受構成存在於生物體內之複雜之糖鏈生物合成途徑與糖鏈代謝途徑的酶活性控制。作為其一例，已知有：於癌細胞中，編碼與糖鏈生物合成途徑相關之蛋白質的基因之表現形式發生變化，結果使糖鏈生物合成途徑中斷之例等。
已知Tn抗原係正常細胞中之O-結合型糖鏈之生物合成途徑之中間產物，係於蛋白質胺基酸序列中之特定之絲胺酸(Ser)殘基或蘇胺酸(Thr)殘基之側鏈上所存在的羥基上α結合有N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)之結構(GalNAcα-Sar/Thr)。
藉由核心1β3半乳糖轉移酶(core 1β3Gal-T,T-synthatase)之活性，使1分子半乳糖轉移至Tn抗原之非還原末端側，進行正常型之O-結合型糖鏈(TF抗原等)之生物合成。於複數種癌細胞株中，細胞內之核心1β3半乳糖轉移酶之活性降低，結果使糖鏈之生物合成途徑中斷，認為此情況係由Tn抗原或唾液酸化Tn抗原之表現所致。
於癌細胞內核心1β3半乳糖轉移酶之活性降低之機制複雜，至今仍未完全闡明。但是，推測其機制之一為：編碼核心1β3半乳糖轉移酶之活性表現所必需之特定伴侶蛋白(Cosmc)的基因發生變異，結果使細胞內之核心1β3半乳糖轉移酶活性大幅度降低(非專利文獻6)。
由於複數種癌症中共同可見Tn抗原之表現，故認為細胞內之糖鏈生物合成途徑或糖鏈代謝途徑之異常係導致其細胞內所表現之大量之不同糖蛋白質上所附加之糖鏈結構發生共同變化之主要原因。
已知糖鏈結構之變化與病情之發展密切相關之疾病係以癌症為代表。又，除癌症以外，作為已知糖鏈結構之變化與病情之發展密切相關之疾病，已知有IgA腎病。所謂IgA腎病，係指以作為免疫球蛋白之一種的免疫球蛋白A(IgA)於腎絲球體之系膜區域沈積為顆粒狀之病理現象為特徵之慢性絲球體腎炎，於1968年由Berger首次提出(非專利文獻2)。
IgA腎病係患者數約占日本國內之慢性絲球體腎炎患者數之一半的代表性腎炎。據稱，約四成被診斷為IgA腎病之患者於其後20年以內會轉為末期腎衰竭，而不得不進行人工透析及腎移植等。如此IgA腎病一般被視為預後不良之疾病，並且尚未確立臨床上證明有效之治療法。
已知於IgA腎病之患者體內，兩種IgA同型(IgA1與IgA2)中主要是IgA1沈積於腎臟。又，作為此沈積之原因之一，報告有：不存在於IgA2分子內而存在於IgA1分子內之鉸鏈區域所附加之O結合型糖鏈之結構由正常型變為Tn抗原或唾液酸化Tn抗原(非專利文獻3、非專利文獻4)。
現已證明：若自IgA1鉸鏈區域所附加之O-結合型糖鏈缺失半乳糖而變為Tn抗原或唾液酸化Tn抗原，則IgA1分子之自身凝聚功能亢進，並且IgA1分子於腎系膜區域之沈積亢進(非專利文獻5)。
此外報告有：於自IgA腎病患者單獨分離出之IgA產生細胞中，Cosmc之表現量降低會導致核心1β3半乳糖轉移酶活性降低(非專利文獻6)。
即，於IgA腎病患者體內之IgA產生細胞中，糖鏈生物合成途徑被中斷，結果變得無法產生具有正常型糖鏈之IgA1，代之產生糖鏈缺乏型IgA1。作為IgA腎病之發病機制之一，現提出有該糖鏈缺乏型IgA1沈積於腎絲球體內，結果引起炎症之機制。
一般而言，IgA係由血液中之B細胞、或由B細胞分化而成之漿細胞產生。已知漿細胞係B細胞分化之最終階段，分佈於次級淋巴組織、全身之黏膜組織及骨髓等中，雖產生大量之抗體，但產生IgA之漿細胞主要分佈於黏膜組織中。
另一方面，已知於次級淋巴組織之生髮中心(germinal center)，獲得高親和性IgA抗體產生能力之B細胞純系分化為記憶B細胞或漿細胞，分佈於全身之標靶器官而長期持續產生抗體。
然而，關於與IgA腎病之發病相關的產生糖鏈缺乏IgA之細胞於B細胞分化過程之哪個階段產生，又，產生糖鏈缺乏IgA之B細胞或漿細胞分佈於體內之哪個組織，尚未明確。
作為於B細胞或漿細胞中進行表現之細胞膜表面分子而已知之蛋白質中，作為O-結合型糖鏈所結合之分子之一，已知有CD27(非專利文獻7)。CD27分子係屬於腫瘤壞死因子受體(TNFR)超級家族之分子量約為55 kDa之I型膜蛋白質，其係以兩個單體利用二硫鍵連接而成之二聚物之形式存在(非專利文獻8)。
已知CD27除了於漿細胞、B細胞中表現以外，亦於一部分T淋巴細胞中表現，尤其是於B細胞之分化過程中分化為記憶B細胞及漿細胞時表現上升。雖然已知結合有O-結合型糖鏈之CD27於該等分化過程之細胞中表現，但糖鏈所結合之胺基酸殘基尚不明確(非專利文獻9)。
作為CD27之配體分子，已知有TNF家族之一的CD70。CD70與於一部分B細胞或T細胞中表現之CD27結合，導入細胞增殖訊號，或促進B細胞之抗體產生(非專利文獻10)。
又，已知CD27不僅於正常細胞中表現亢進，於數種癌細胞中亦表現亢進。作為表現CD27之癌症種類，現報告有：被套細胞淋巴癌(mantle cell lymphoma)、慢性淋巴性白血病、小淋巴性白血病、包氏淋巴瘤(burkitt lymphoma)、濾泡性淋巴瘤(follicular lymphoma)、黏膜相關淋巴組織淋巴瘤(MALT lymphoma)、瀰漫性大細胞淋巴瘤(diffuse large cell lymphoma)及漿細胞瘤等各種非何傑金氏淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)(非專利文獻11)。
已知於多種癌細胞中，可見如上所述含有Tn抗原或唾液酸化Tn抗原等糖鏈的糖鏈缺乏蛋白質之表現。
作為特異性識別CD27之抗體，報告有：藉由對自Sezary症候群(Sezary syndrome)患者單獨分離出之白血病細胞進行免疫而獲得之S152抗體(非專利文獻8)。但是，S152抗體對於正常B細胞及T細胞亦顯示出親和性。迄今為止尚未發現特異性識別含有未結合半乳糖之O-結合型糖鏈之CD27分子的抗體。
已知，一般將非人類抗體、例如小鼠抗體等投予人類時，該抗體會被識別為異物，而於人體內誘導產生針對小鼠抗體之人類抗體(Human Anti Mouse Antibody：HAMA)。
已知HAMA與所投予之小鼠抗體發生反應，會引起副作用(非專利文獻12~15)，或加速小鼠抗體自體內之消失(非專利文獻16~18)，而導致小鼠抗體之治療效果降低(非專利文獻19、20)。
為了解決該等問題，目前正嘗試利用基因重組技術，由非人類抗體製作人類型嵌合抗體及人類化抗體。
就投予人類方面而言，人類化抗體與小鼠抗體等非人類抗體相比，具有各種優點。例如報告有：於使用猴子之實驗中，其免疫原性與小鼠抗體相比有所降低，血中半衰期延長(非專利文獻21、非專利文獻22)。即，人類化抗體與非人類抗體相比，於人體內之副作用較少，可期待長時間維持其治療效果。
又，由於人類化抗體係利用基因重組技術而製作，故而可製成各種形態之分子。例如，若使用γ1亞型作為人類抗體之重鏈(以下記為H鏈)恆定區域(以下記為C區域)(將H鏈C區域記為CH)，則可製作出抗體依賴性細胞毒殺活性(以下記為ADCC活性)等效應功能(effector function)較高之人類化抗體(非專利文獻23)，且與小鼠抗體相比，可期待血中半衰期之延長(非專利文獻24)。
尤其是在自體內去除Tn抗原型CD27陽性細胞之治療中，由於係經由抗體使效應細胞集聚於標靶細胞附近而特異性毒殺標靶細胞，故而經由抗體之Fc區域(抗體重鏈之鉸鏈區域以後之區域)之補體依賴性細胞毒殺活性(以下記為CDC活性)及ADCC活性等細胞毒殺活性較為重要。為了在對人類之治療中發揮細胞毒殺活性，而期待使用人類型嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體(非專利文獻25、26)。
此外，對於人類化抗體，近來隨著蛋白質工程學、基因工程學之進步，亦可製作出Fab、Fab'、F(ab')2 、單鏈抗體(以下記為scFv)(非專利文獻27)、雙鏈化V區域片段(以下記為Diabody)(非專利文獻28)、二硫鍵穩定化V區域片段(以下記為dsFv)(非專利文獻29)及含有CDR之肽(非專利文獻30)等分子量較小之抗體片段。該等抗體片段於向標靶組織之轉移性方面優於完整之抗體分子(非專利文獻31)。
[先前技術文獻] [非專利文獻]
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如上所述，迄今為止尚未發現特異性識別含有未結合半乳糖之O-結合型糖鏈的CD27分子之抗體。特異性識別含有未結合半乳糖之O-結合型糖鏈的CD27分子之抗體對於與含有未結合半乳糖之O-結合型糖鏈之CD27相關的疾病之診斷及治療等非常有效。
因此，本發明之目的在於提供一種特異性識別含有未結合半乳糖之O-結合型糖鏈之CD27且與CD27之細胞外區域結合的單株抗體或其使用方法。
本發明之人類化抗體或該抗體片段係特異性識別由含有未結合半乳糖之O-結合型糖鏈的CD27基因編碼之多肽(以下記為CD27)之細胞外區域且與該細胞外區域結合之單株抗體。
藉由使用本發明之人類化抗體或該抗體片段對表現有糖鏈缺乏CD27或該多肽之細胞進行檢測或定量，可診斷與糖鏈缺乏CD27相關之疾病。
又，由於本發明之人類化抗體或該抗體片段可與糖鏈缺乏CD27多肽之細胞外區域結合，故而可適宜地用於檢測表現該多肽之細胞。尤其是由於本發明之抗體或該抗體片段可與糖鏈缺乏CD27之細胞外區域結合，故而可較佳地用於檢測於細胞膜上保持並表現天然型立體結構之CD27的流式細胞儀之分析。
此外，為本發明之人類化抗體或該抗體片段且具有效應活性之抗體或該抗體片段可於活體外及活體外毒殺表現有糖鏈缺乏CD27多肽之細胞。又，由於此種本發明之人類化抗體或該抗體片段可毒殺、減少生物體內之糖鏈缺乏CD27多肽表現細胞，故而可尤其有效地用作治療劑。
本發明係關於如下之(1)~(23)。(1)一種人類化抗體或其抗體片段，該抗體之VH係含有序列編號58~60所表示之CDR1~3的胺基酸序列之VH，且抗體之VL係含有序列編號61~63所表示之CDR1~3的胺基酸序列之VL，其可識別並結合由含有未結合半乳糖之O-結合型糖鏈的CD27基因編碼之多肽之細胞外區域。(2)如(1)之人類化抗體或其抗體片段，其中人類化抗體之VH含有導入有選自將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第48號之Val置換為Ile、將第49號之Ser置換為Ala、將第77號之Asn置換為Gly、將第93號之Val置換為Thr、將第97號之Ala置換為Thr、及將第117號之Thr置換為Val之修飾中的至少1種修飾之胺基酸序列，且人類化抗體之VL含有導入有選自將序列編號97所表示之胺基酸序列中的第21號之Ile置換為Leu、將第40號之Pro置換為Leu、將第58號之Val置換為Ile、將第85號之Thr置換為Ala、及將第87號之Tyr置換為Phe之修飾中的至少1種修飾之胺基酸序列。(3)如(1)之人類化抗體或其抗體片段，其中人類化抗體之VH含有序列編號96、105及107中之任一個胺基酸序列，且人類化抗體之VL含有序列編號97所表示之胺基酸序列。(4)一種DNA，其編碼如(1)至(3)中任一項之人類化抗體或該抗體片段。(5)一種重組體載體，其含有如(4)之DNA。(6)一種轉形株，其係將如(5)之重組體載體導入宿主細胞中而獲得。(7)一種如(1)至(3)中任一項之人類化抗體或該抗體片段之製造方法，其係於培養基中培養如(6)之轉形株，使如(1)至(3)中任一項之人類化抗體或該抗體片段生成蓄積於培養物中，再自該培養物中採集抗體或該抗體片段。(8)一種含有未結合半乳糖之O-結合型糖鏈的CD27之免疫學檢測或測定方法，其使用如(1)至(3)中任一項之人類化抗體或該抗體片段。(9)一種含有未結合半乳糖之O-結合型糖鏈的CD27之檢測試劑，其含有如(1)至(3)中任一項之人類化抗體或該抗體片段。(10)一種與含有未結合半乳糖之O-結合型糖鏈的CD27相關之疾病之診斷藥，其含有如(1)至(3)中任一項之人類化抗體或該抗體片段。(11)如(10)之診斷藥，其中與含有未結合半乳糖之O-結合型糖鏈的CD27相關之疾病為IgA腎病。(12)如(10)之診斷藥，其中與含有未結合半乳糖之O-結合型糖鏈的CD27相關之疾病為癌。(13)一種與含有未結合半乳糖之O-結合型糖鏈的CD27相關之疾病之治療藥，其含有如(1)至(3)中任一項之人類化抗體或抗體片段作為有效成分。(14)如(13)之治療藥，其中與含有未結合半乳糖之O-結合型糖鏈的CD27相關之疾病為IgA腎病。(15)如(13)之治療藥，其中與含有未結合半乳糖之O-結合型糖鏈的CD27相關之疾病為癌。(16)一種與含有未結合半乳糖之O-結合型糖鏈的CD27相關之疾病之診斷方法，其包括：使用如(1)至(3)中任一項之人類化抗體或該抗體片段，對表現含有未結合半乳糖之O-結合型糖鏈的CD27之細胞進行檢測或測定。(17)一種與含有未結合半乳糖之O-結合型糖鏈的CD27相關之疾病之診斷方法，其包括：使用如(1)至(3)中任一項之人類化抗體或該抗體片段，對含有未結合半乳糖之O-結合型糖鏈的CD27進行檢測或測定。(18)如(16)或(17)之診斷方法，其中與含有未結合半乳糖之O-結合型糖鏈的CD27相關之疾病為IgA腎病。(19)如(16)或(17)之診斷方法，其中與含有未結合半乳糖之O-結合型糖鏈的CD27相關之疾病為癌。(20)一種如(1)至(3)中任一項之人類化抗體或該抗體片段之用途，其係用於製造與含有未結合半乳糖之O-結合型糖鏈的CD27相關之疾病之診斷藥。(21)一種如(1)至(3)中任一項之人類化抗體或該抗體片段之用途，其係用於製造與含有未結合半乳糖之O-結合型糖鏈的CD27相關之疾病之治療藥。(22)如(20)或(21)之人類化抗體或該抗體片段之用途，其中與含有未結合半乳糖之O-結合型糖鏈的CD27相關之疾病為IgA腎病。(23)如(20)或(21)之人類化抗體或該抗體片段之用途，其中與含有未結合半乳糖之O-結合型糖鏈的CD27相關之疾病為癌。
本發明係關於一種特異性識別由含有未結合半乳糖之O-結合型糖鏈的CD27基因編碼之多肽(以下亦記為CD27)之細胞外區域，且與該細胞外區域結合之單株抗體(以下，亦稱為本發明之人類化抗體、本發明之抗體)。
作為CD27基因，若為編碼CD27之基因則可為任意，可列舉含有序列編號1所示之鹼基序列之基因。又，與包含序列編號1所示之鹼基序列之DNA於嚴格條件下進行雜交，且編碼具有CD27之功能的多肽之基因等亦包含在本發明之CD27基因中。
所謂於嚴格條件下進行雜交之DNA，係指以具有序列編號1所示之鹼基序列之DNA作為探針，藉由菌落雜交法(colony hybridization method)、溶菌斑雜交法(plaque hybridization method)、南方墨點雜交法(southern blot hybridization method)及DNA微陣列法等所獲得之可雜交之DNA。
具體而言，可列舉可藉由如下方式進行鑑定之DNA：使用固定有源自經雜交之菌落或溶菌斑之DNA、或者具有該序列之PCR產物或者寡聚DNA的過濾器或載玻片，於0.7~1.0 mol/L之氯化鈉存在下，於65℃下進行雜交後，使用0.1~2倍濃度之SSC溶液(1倍濃度之SSC溶液之組成含有150 mmol/L氯化鈉、15 mmol/L檸檬酸鈉)，於65℃之條件下清洗過濾器或者載玻片。
雜交可依據[Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Secand Edition(Cold Spring) Harbor Laboratory Press,1989]、Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons,1987-1997)、[DNA Cloning 1: Core Techniques,A Practical Approach,Second Edition(Oxford) University,1995]等所記載之方法進行。
作為可雜交之DNA，較佳為與序列編號1所示之鹼基序列具有至少60%以上之同源性之DNA，更佳為具有80%以上之同源性之DNA，更佳為具有95%以上之同源性之DNA。
對於編碼真核生物之蛋白質的基因之鹼基序列，常常可見基因之多型。本發明中所使用之CD27基因亦包括由於基因之多型而使鹼基序列產生微小變異之基因。
作為CD27，可列舉：具有序列編號2所示之胺基酸序列之多肽，包含序列編號2所示之胺基酸序列中有1個以上之胺基酸缺失、置換或附加之胺基酸序列且具有CD27之功能的多肽，以及包含與序列編號2所示之胺基酸序列具有較佳為60%以上、更佳為80%以上、更佳為90%以上、最佳為95%以上之同源性之胺基酸序列且具有CD27之功能的多肽等。
具有序列編號2所示之胺基酸序列中有1個以上之胺基酸缺失、置換、或附加之胺基酸序列的多肽可藉由如下方式獲得：使用[Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition(Cold Spring Harbor) Laboratory Press,1989]及Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons,1987-1997)、Nucleic Acids Research,10,6487(1982)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,79,6409(1982)、Gene,34,315(1985)、Nucleic Acids Research,13,4431(1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,82,488(1985)等所記載之部位特異性變異導入法，對例如編碼具有序列編號2所示之胺基酸序列之多肽的DNA導入部位特異性變異。
缺失、置換或附加之胺基酸之數量並無特別限定，較佳為1個~數十個、例如1~20個胺基酸，更佳為1個~數個、例如1~5個胺基酸。
本發明所記載之同源性之數值除特別明示之情形以外，可為使用從業者公知之同源性檢索程式所算出之數值，對於鹼基序列，可列舉使用BLAST[J. Mol. Biol.,215,403(1990)]中預設之參數所算出之數值等，對於胺基酸序列，可列舉使用BLAST2[Nucleic Acids Res.,25,3389(1997);Genome Res.,7,648(1997);http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.html]中預設之參數所算出之數值等。
作為預設之參數，G(Cost to open gap，起始空隙罰分)於鹼基序列之情形時為5，於胺基酸序列之情形時為11；-E(Cost to extend gap，延伸空隙罰分)於鹼基序列之情形時為2，於胺基酸序列之情形時為1；-q(Penalty for nucleotide mismatch，核酸錯配罰分)為-3；-r(reward for nucleotide match，核酸匹配得分)為1；-e(expect value，期望值)為10；-W(wordsize，字長)於鹼基序列之情形時為11個殘基，於胺基酸序列之情形時為3個殘基；-y(Dropoff(X) for blast extensions in bits，blast延伸下降值域)於blastn之情形時為20，於blastn以外之程式時為7，-X(X dropoff value for gapped alignment in bits，空隙比對之下降值(位元))為15，及-Z(final X dropoff value for gapped alignment in bits，最終空隙比對之下降值(位元))於blastn之情形時為50，於blastn以外之程式時為25(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/html/blastcgihelp.html)。
包含序列編號2所示之胺基酸序列之部分序列的多肽可藉由從業者公知之方法來製作，例如可藉由使編碼序列編號2所示之胺基酸序列的DNA之一部缺失，並對導入有含有其之表現載體的轉形體進行培養而製作。
又，基於如此製作之多肽或DNA，藉由與上述相同之方法，可獲得具有序列編號2所示之胺基酸序列之部分序列中有1個以上之胺基酸缺失、置換或附加之胺基酸序列的多肽。
所謂CD27之細胞外區域，可列舉與文獻[The Journal of Immunology,147,3165(1991)]中預測之細胞外區域之第1號~第171號相當的區域等。
本發明中，所謂由含有未結合半乳糖之O-結合型糖鏈的CD27基因編碼之多肽之細胞外區域，只要為含有未結合半乳糖之O-結合型糖鏈的CD27，則可為任意者。具體而言，例如可列舉由含有未結合半乳糖之O-結合型糖鏈的序列編號1所示之鹼基序列編碼的CD27之細胞外區域。
所謂O-結合型糖鏈，係指於蛋白質之絲胺酸(Ser)或蘇胺酸(Thr)之胺基酸殘基中，經由各胺基酸側鏈中所含之-OH基而結合有糖鏈的結構。
O-結合型糖鏈中，將於多肽上之Ser或Thr胺基酸側鏈之-OH基上結合有N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)的O-結合型糖鏈稱為黏蛋白型糖鏈。作為O-結合型糖鏈之具體例，可列舉T抗原、唾液酸化T抗原、Tn抗原及唾液酸化Tn抗原等(表1)。
本發明中，所謂未結合半乳糖之O-結合型糖鏈，係指經由蛋白質之Ser或Thr之胺基酸殘基之-OH基而結合的N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)上未結合半乳糖(Gal)之O-結合型糖鏈。具體而言，例如可列舉上述Tn抗原及唾液酸化Tn抗原。
未結合半乳糖之O-結合型糖鏈係正常O-結合型糖鏈之合成途徑中之中間產物，通常於正常細胞之糖蛋白質中幾乎不存在，而於癌及腎病等某些特定疾病中確認表現。
以下，於本發明中，有時將未結合半乳糖之O-結合型糖鏈記載為異常糖鏈，將結合有異常糖鏈之蛋白質記載為糖鏈缺乏蛋白質，將結合有異常糖鏈之CD27記載為糖鏈缺乏CD27。
作為O-結合型糖鏈所結合之多肽之胺基酸殘基，例如可列舉：CD27蛋白質之細胞外區域之胺基酸序列中之絲胺酸(Ser)及蘇胺酸(Thr)之胺基酸殘基。
又，對於O-結合型糖鏈所結合之多肽之胺基酸殘基，可使用NetOGlyc3.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)等序列檢索軟體來確認結合O-結合型糖鏈之共有序列。或者，可藉由對具有O-結合型糖鏈之糖蛋白質進行質譜(MS)分析，而確定具體之糖鏈結合部位。
本發明中，作為CD27蛋白質上之O-結合型糖鏈所結合之多肽之胺基酸殘基，雖然CD27蛋白質之胺基酸序列中之任意Ser或Thr殘基均可結合O-結合型糖鏈，但較佳可列舉：包含選自序列編號2所表示之CD27蛋白質之第118號之Thr、第127號之Ser、第129號之Thr、第132號之Ser、第133號之Ser、第137號之Ser、第143號之Thr、第149號之Ser、第156號之Thr、第162號之Thr、第173號之Thr、第175號之Ser及第176號之Thr中的至少1個胺基酸殘基之糖鏈結合部位。
作為每1分子CD27蛋白質之細胞外區域所結合之O-結合型糖鏈之數量，只要至少1個Ser殘基或Thr殘基上結合有O-結合型糖鏈即可，O-結合型糖鏈之數量並無限定。
作為本發明之表達有含有未結合半乳糖之O-結合型糖鏈的CD27(以下，記載為糖鏈缺乏CD27)之細胞之取得方法，例如可藉由向如下細胞株中導入編碼CD27之DNA而製作糖鏈缺乏CD27表現細胞，該細胞株係於O-結合型糖鏈合成過程中使於多肽上之Ser/Thr所結合的N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)上附加Gal之酶、與該酶之活性相關之蛋白質、或與尿苷二磷酸半乳糖(uridine 5'-diphospate-galactose，尿苷二磷酸半乳糖)之輸送相關的蛋白質等之活性降低或缺損者。
又，例如亦可藉由使唾液酸酶及半乳糖苷酶等糖鏈切斷酶作用於表現含有正常O型糖鏈之CD27的細胞，而製作具有未結合半乳糖之O-結合型糖鏈的CD27表現細胞。
作為於多肽上之Ser或Thr所結合之GalNAc上附加Gal的酶之具體例，可列舉：β1,3-半乳糖轉移酶(β1,3-galactosyl transferase)[The Journal of Biological Chemistry,277,178-186(2002)]等。
又，作為與於多肽上之Ser或Thr所結合之GalNAc上附加Gal的酶之活性相關之蛋白質，可列舉：作為與該酶之蛋白質摺疊相關的伴侶蛋白之Cosmc[Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,99,16613-16618(2002)]等。
源自IgA腎病患者之CD27表現細胞由於使編碼於多肽上之Ser/Thr所結合的GalNAc上附加Gal之酶、與該酶之活性相關之蛋白質、或與尿苷二磷酸半乳糖之輸送相關的蛋白質等之DNA上產生附加、缺失或置換等，而使酶之活性降低或缺損，故而可用作CD27表現細胞。
作為與尿苷二磷酸半乳糖之輸送相關之蛋白質，例如可列舉尿苷二磷酸半乳糖轉運蛋白(UDP-Galactose transporter)等。作為尿苷二磷酸半乳糖轉運蛋白之活性降低或缺損之細胞株，例如可列舉Lec8細胞[Glycobiology,1,307-14(1991)]等。
本發明中，作為表現糖鏈缺乏CD27之細胞，例如可列舉：內在性地存在於人類體內之細胞、由內在性地存在於人類體內之細胞建立的細胞株、或藉由基因重組技術獲得之細胞等。
較佳可列舉：如上所述之於O-結合型糖鏈合成過程中使於多肽上之Ser/Thr所結合的GalNAc上附加Gal之酶、與該酶之活性相關之蛋白質、或與尿苷二磷酸半乳糖之輸送相關的蛋白質等之活性降低或缺損之細胞株，具有相同之性質且內在性地存在於人類體內之細胞等。
作為內在性地存在於人類體內之細胞，較佳為於O-結合型糖鏈合成過程中使於多肽上之Ser/Thr所結合的GalNAc上附加Gal之酶、與該酶之活性相關之蛋白質、或與尿苷二磷酸半乳糖之輸送相關的蛋白質等之活性降低或缺損之細胞株。
具體而言，例如可列舉IgA腎病患者體內或癌患者體內之表現CD27蛋白質之細胞。作為該細胞，例如可列舉：藉由活體組織切片等所獲得之免疫相關細胞或腫瘤細胞中之表現CD27蛋白質之細胞。
作為藉由基因重組技術所獲得之細胞，例如可列舉：藉由製作於O-結合型糖鏈合成過程中使於多肽上之Ser/Thr所結合的GalNAc上附加Gal之酶、與該酶之活性相關之蛋白質、或與尿苷二磷酸半乳糖之輸送相關的蛋白質等之活性降低或缺損之宿主細胞，並將含有編碼目標多肽之cDNA的表現載體導入宿主細胞中，而表現糖鏈缺乏CD27之細胞。
作為宿主細胞，具體而言，例如可列舉：尿苷二磷酸半乳糖轉運蛋白之活性降低之Lec8細胞，或藉由β1,3-半乳糖轉移酶、或與該酶活性相關之Comsc伴侶蛋白之異常而使酶之活性降低或缺損之源自IgA腎病患者之IgA抗體表現細胞等。
此外，作為製作糖鏈缺乏CD27蛋白質之方法，例如可列舉：使用上述CD27表現細胞，來表現及純化糖鏈缺乏CD27蛋白質之方法等。
作為取得糖鏈缺乏CD27蛋白質之方法，例如可藉由以CD27蛋白質與其他物質以融合蛋白質之形式進行表現並純化而取得糖鏈缺乏CD27蛋白質。
作為與CD27蛋白質融合之物質，例如可列舉：抗體恆定區域、抗體Fc區域、GST標籤、組胺酸標籤(亦稱為His標籤)及Myc標籤等多肽等。該融合蛋白質可藉由使用蛋白質A、鎳管柱及特異性抗體管柱等親和性管柱而分離純化。
本發明之單株抗體或該抗體片段對藉由上述方式獲得之糖鏈缺乏CD27細胞或糖鏈缺乏CD27具有結合活性。
本發明之抗體或該抗體片段與糖鏈缺乏CD27蛋白質結合之情況例如可藉由如下方法確認：使用公知之免疫學檢測法、較佳為螢光細胞染色法等，來確認表現有特定抗原之細胞與針對特定抗原之抗體之結合性。
又，亦可組合公知之免疫學檢測法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice,Third edition,Academic Press(1996)、Antibodies-A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)、單株抗體實驗指南講談社科學(1987)]等而確認。
作為本發明之單株抗體，可列舉：利用融合瘤所產生之抗體、及利用由含有抗體基因之表現載體轉形而成之轉形體所產生之基因重組抗體。
融合瘤例如可藉由如下方式製備：製備表現上述糖鏈缺乏CD27之細胞等作為抗原，自利用該抗原進行免疫之動物誘導具有抗原特異性之抗體產生細胞，進而使該抗體產生細胞與骨髓瘤細胞相融合。藉由培養該融合瘤，或將該融合瘤細胞投予至動物而使該動物患上腹水癌，再對該培養液或腹水進行分離、純化，可取得糖鏈缺乏CD27抗體。
作為利用抗原進行免疫之動物，只要可製作融合瘤則可使用任何動物，適宜使用小鼠、大鼠、倉鼠及兔子等。又，由此種動物取得具有抗體產生能力之細胞，於體外對該細胞實施免疫後，使其與骨髓瘤細胞融合而製作之融合瘤所產生的抗體等亦包含在本發明之抗體中。
所謂單株抗體係單株之抗體產生細胞所分泌之抗體，其僅識別一個抗原決定位(亦稱為抗原決定基)，且構成單株抗體之胺基酸序列(1次結構)均一。
作為抗原決定位，例如可列舉：識別且結合單株抗體之單一胺基酸序列、包含胺基酸序列之立體結構、結合有糖鏈之胺基酸序列、及包含結合有糖鏈之胺基酸序列的立體結構等。作為本發明之單株抗體之抗原決定位，可列舉糖鏈缺乏CD27蛋白質之立體結構。
作為本發明之單株抗體，只要為識別且結合糖鏈缺乏CD27之細胞外區域的單株抗體則可為任意抗體，具體而言，例如可列舉：單株抗體KM4026、KM4027、KM4028、KM4030及KM4031等。
更具體而言，例如可列舉：利用融合瘤KM4026所產生之單株抗體KM4026、與單株抗體KM4026競爭而與糖鏈缺乏CD27之細胞外區域結合之單株抗體、及結合單株抗體KM4026之糖鏈缺乏CD27細胞外區域所存在的抗原決定位所結合之單株抗體。
作為本發明之單株抗體，例如亦可列舉：利用融合瘤KM4027所產生之單株抗體KM4027、與單株抗體KM4027競爭而與糖鏈缺乏CD27之細胞外區域結合之單株抗體、及結合單株抗體KM4027之糖鏈缺乏CD27細胞外區域所存在的抗原決定位所結合之單株抗體。
作為本發明之單株抗體，例如亦可列舉：利用融合瘤KM4028所產生之單株抗體KM4028、與單株抗體KM4028競爭而與糖鏈缺乏CD27之細胞外區域結合的單株抗體、及結合單株抗體KM4028之糖鏈缺乏CD27細胞外區域所存在的抗原決定位所結合之單株抗體。
又，作為本發明之單株抗體，例如亦可列舉：利用融合瘤KM4030所產生之單株抗體KM4030、與單株抗體KM4030競爭而與糖鏈缺乏CD27之細胞外區域結合之單株航體、及結合單株抗體KM4030之糖鏈缺乏CD27細胞外區域所存在的抗原決定位所結合之單株抗體。
作為本發明之單株抗體，進而可列舉：利用融合瘤KM4031所產生之單株抗體KM4031、與單株抗體KM4031競爭而與糖鏈缺乏CD27之細胞外區域結合之單株抗體、及結合單株抗體KM4031之糖鏈缺乏CD27細胞外區域所存在的抗原決定位所結合之單株抗體等。
作為與本發明之單株抗體發生競爭反應的單株抗體，具體可列舉：如上所述與各種單株抗體對糖鏈缺乏CD27之細胞外區域所存在的抗原決定位具有競爭反應之單株抗體。
又，作為本發明之單株抗體所結合之抗原決定位所結合的單株抗體，具體可列舉：如上所述各種單株抗體所識別之存在於糖鏈缺乏CD27細胞外區域的抗原決定位所結合之單株抗體。
融合瘤KM4030係於2008年6月5日，基於布達佩斯條約，以FERM BP-10976寄存於獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物寄存中心(305-8566日本茨城縣築波市東1丁目1番地1中央第6)。
作為基因重組抗體，例如包括：人類型嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體及該抗體片段等藉由基因重組技術所製造之抗體。於基因重組抗體中，具有抗原結合活性、抗原性較低、且血中半衰期延長者作為治療藥較佳。
人類型嵌合抗體係指包含非人類抗體之重鏈可變區域(以下，記為VH)及輕鏈可變區域(以下，記為VL)、與人類抗體之重鏈恆定區域(以下，記為CN)及輕鏈恆定區域(以下，記為CL)的抗體。
本發明之人類型嵌合抗體可藉由如下方式製造。即，自本發明之特異性識別糖鏈缺乏CD27且與該細胞外區域結合之單株抗體、或者產生特異性識別糖鏈缺乏CD27且與該細胞外區域結合之單株抗體的融合瘤，取得編碼VH及VL之cDNA，將其分別插入至具有編碼人類抗體之CH及CL的基因之動物細胞用表現載體中而構建人類型嵌合抗體表現載體，再將該載體導入動物細胞中，使抗體表現而製作本發明之人類型嵌合抗體。
作為人類型嵌合抗體之CH，只要屬於人類免疫球蛋白(以下，記為hIg)則可為任意者，較佳為hIgG型者。此外，可使用屬於hIgG型之hIgG1、hIgG2、hIgG3及hIgG4等亞型中之任一者。
又，作為人類型嵌合抗體之CL，只要屬於hIg則可為任意者，可使用κ型或λ型者。
作為本發明之人類型嵌合抗體，可列舉以下之(1)~(5)之人類型嵌合抗體。(1)抗體之VH為序列編號25所表示之胺基酸序列，且抗體之VL為序列編號35所表示之胺基酸序列的人類型嵌合抗體(2)抗體之VH為序列編號26所表示之胺基酸序列，且抗體之VL為序列編號36所表示之胺基酸序列的人類型嵌合抗體(3)抗體之VH為序列編號27所表示之胺基酸序列，且抗體之VL為序列編號37所表示之胺基酸序列的人類型嵌合抗體(4)抗體之VH為序列編號28所表示之胺基酸序列，且抗體之VL為序列編號38所表示之胺基酸序列的人類型嵌合抗體(5)抗體之VH為序列編號29所表示之胺基酸序列，且抗體之VL為序列編號39所表示之胺基酸序列的人類型嵌合抗體
又，作為本發明之人類型嵌合抗體，可列舉以下之(1)~(5)之人類型嵌合抗體。(1)抗體之VH為含有序列編號40~42所表示之CDR1~3之胺基酸序列的VH，且抗體之VL為含有序列編號43~45所表示之CDR1~3之胺基酸序列的VL之人類型嵌合抗體(2)抗體之VH為含有序列編號46~48所表示之CDR1~3之胺基酸序列的VH，且抗體之VL為含有序列編號49~51所表示之CDR1~3之胺基酸序列的VL之人類型嵌合抗體(3)抗體之VH為含有序列編號52~54所表示之CDR1~3之胺基酸序列的VH，且抗體之VL含有序列編號55~57所表示之CDR1~3之胺基酸序列的人類型嵌合抗體(4)抗體之VH為含有序列編號58~60所表示之CDR1~3之胺基酸序列的VH，且抗體之VL為含有序列編號61~63所表示之CDR1~3之胺基酸序列的VL之人類型嵌合抗體(5)抗體之VH為含有序列編號64~66所表示之CDR1~3之胺基酸序列的VH，且抗體之VL為含有序列編號67~69所表示之CDR1~3之胺基酸序列的VL之人類型嵌合抗體
人類化抗體係指將非人類抗體之VH及VL之CDR之胺基酸序列移植到人類抗體之VH及VL之適當位置而成的抗體，亦稱為人類型CDR移植抗體、改型抗體(reshaped antibody)。
本發明之人類化抗體可藉由如下方式製造：將由產生本發明之特異性識別糖鏈缺乏CD27蛋白質且與該細胞外區域結合之單株抗體的融合瘤所產生之非人類抗體之VH及VL之CDR之胺基酸序列移植到任意之人類抗體之VH及VL之構架(以下，記為FR)，構建編碼所獲得之抗體可變區域(以下，記為V區域)的cDNA，將其分別插入至具有編碼人類抗體之CH及CL之基因的動物細胞用表現載體中而構建人類化抗體表現載體，再導入動物細胞中，藉此使抗體表現。
本發明之人類抗體之VH及VL之FR之胺基酸序列只要為源自人類抗體之VH及VL之FR之胺基酸序列，則可使用任意者。例如可使用蛋白質結構資料庫(Protein Data Bank)等資料庫中所登錄之人類抗體之VH及HL之FR之胺基酸序列、或Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept. Health and Human Services(1991)等中所記載之人類抗體之VH及VL之FR之各亞群之共同胺基酸序列等。
作為本發明之人類化抗體之CH，只要屬於hIg則可為任意者，較佳為hIgG型者。此外，可使用屬於hIgG型之hIgG1、hIgG2、hIgG3及hIgG4等亞型中之任一者。
又，作為本發明之人類化抗體之CL，只要屬於hIg則可為任意者，可使用κ型或λ型者。
作為本發明之人類化抗體，可列舉以下之(1)~(5)之人類化抗體。(1)抗體之VH之CDR1~3為序列編號40~42所表示之胺基酸序列，且抗體之VL之CDR1~3為序列編號43~45所表示之胺基酸序列的人類化抗體(2)抗體之VH之CDR1~3為序列編號46~48所表示之胺基酸序列，且抗體之VL之CDR1~3為序列編號49~51所表示之胺基酸序列的人類化抗體(3)抗體之VH之CDR1~3為序列編號52~54所表示之胺基酸序列，且抗體之VL之CDR1~3為序列編號55~57所表示之胺基酸序列的人類化抗體(4)抗體之VH之CDR1~3為序列編號58~60所表示之胺基酸序列，且抗體之VL之CDR1~3為序列編號61~63所表示之胺基酸序列的人類化抗體(5)抗體之VH之CDR1~3為序列編號64~66所表示之胺基酸序列，且抗體之VL之CDR1~3為序列編號67~69所表示之胺基酸序列的人類化抗體
此外，作為本發明之人類化抗體，具體而言，較佳為含有以下之(a) VH及(b) VL之至少一者的人類化抗體。再者，以下之(a)及(b)中，所導入之修飾之數量並無限制。(a)含有序列編號96所表示之胺基酸序列，或序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser、第48號之Val、第49號之Ser、第77號之Asn、第93號之Val、第97號之Ala及第117號之Thr被置換為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的VH(b)含有序列編號97所表示之胺基酸序列，或序列編號97所表示之胺基酸序列中的第21號之Ile、第40號之Pro、第58號之Val、第85號之Thr、及第87號之Tyr被置換為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的VL
作為本發明之人類化抗體所含之VH，例如可列舉：含有序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser、第48號之Val、第49號之Ser、第77號之Asn、及第97號之Ala被置換為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的VH。
其中，作為本發明之人類化抗體所含之VH，較佳為以下之(1)及(2)。(1)含有序列編號96所表示之胺基酸序列中的第48號之Val、第49號之Ser、及第97號之Ala被置換為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的VH(2)含有序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser、及第97號之Ala被置換為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的VH
作為上述VH之胺基酸序列，可列舉：導入有選自將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第48號之Val置換為Ile、將第49號之Ser置換為Ala、將第77號之Asn置換為Gly、將第93號之Val置換為Thr、將第97號之Ala置換為Thr、及將第117號之Thr置換為Val之修飾中的至少1種修飾之胺基酸序列。
作為上述VH之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下之導入有1~7個修飾之胺基酸序列。
作為導入有7個修飾之VH之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉：將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第48號之Val置換為Ile、將第49號之Ser置換為Ala、將第77號之Asn置換為Gly、將第93號之Val置換為Thr、將第97號之Ala置換為Thr、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列。
作為導入有6個修飾之VH之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下之(1)~(7)之胺基酸序列。(1)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第48號之Val置換為Ile、將第49號之Ser置換為Ala、將第77號之Asn置換為Gly、將第93號之Val置換為Thr、及將第97號之Ala置換為Thr之胺基酸序列(2)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第48號之Val置換為Ile、將第49號之Ser置換為Ala、將第77號之Asn置換為Gly、將第93號之Val置換為Thr、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(3)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第48號之Val置換為Ile、將第49號之Ser置換為Ala、將第77號之Asn置換為Gly、將第97號之Ala置換為Thr、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(4)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第48號之Val置換為Ile、將第49號之Ser置換為Ala、將第93號之Val置換為Thr、將第97號之Ala置換為Thr、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(5)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第48號之Val置換為Ile、將第77號之Asn置換為Gly、將第93號之Val置換為Thr、將第97號之Ala置換為Thr、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(6)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第49號之Ser置換為Ala、將第77號之Asn置換為Gly、將第93號之Val置換為Thr、將第97號之Ala置換為Thr、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(7)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第48號之Val置換為Ile、將第49號之Ser置換為Ala、將第77號之Asn置換為Gly、將第93號之Val置換為Thr、將第97號之Ala置換為Thr、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列
作為導入有5個修飾之VH之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下之(1)~(21)之胺基酸序列。(1)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第49號之Ser置換為Ala、將第77號之Asn置換為Gly、將第93號之Val置換為Thr、將第97號之Ala置換為Thr、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(2)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第48號之Val置換為Ile、將第77號之Asn置換為Gly、將第93號之Val置換為Thr、將第97號之Ala置換為Thr、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(3)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第48號之Val置換為Ile、將第49號之Ser置換為Ala、將第93號之Val置換為Thr、將第97號之Ala置換為Thr、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(4)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第48號之Val置換為Ile、將第49號之Ser置換為Ala、將第77號之Asn置換為Gly、將第97號之Ala置換為Thr、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(5)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第48號之Val置換為Ile、將第49號之Ser置換為Ala、將第77號之Asn置換為Gly、將第93號之Val置換為Thr、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(6)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第48號之Val置換為Ile、將第49號之Ser置換為Ala、將第77號之Asn置換為Gly、將第93號之Val置換為Thr、及將第97號之Ala置換為Thr之胺基酸序列(7)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第77號之Asn置換為Gly、將第93號之Val置換為Thr、將第97號之Ala置換為Thr、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(8)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第49號之Ser置換為Ala、將第93號之Val置換為Thr、將第97號之Ala置換為Thr、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(9)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第49號之Ser置換為Ala、將第77號之Asn置換為Gly、將第97號之Ala置換為Thr、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(10)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第49號之Ser置換為Ala、將第77號之Asn置換為Gly、將第93號之Val置換為Thr、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(11)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第49號之Ser置換為Ala、將第77號之Asn置換為Gly、將第93號之Val置換為Thr、及將第97號之Ala置換為Thr之胺基酸序列(12)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第48號之Val置換為Ile、將第93號之Val置換為Thr、將第97號之Ala置換為Thr、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(13)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第48號之Val置換為Ile、將第77號之Asn置換為Gly、將第97號之Ala置換為Thr、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(14)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第48號之Val置換為Ile、將第77號之Asn置換為Gly、將第93號之Val置換為Thr、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(15)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第48號之Val置換為Ile、將第77號之Aen置換為Gly、將第93號之Val置換為Thr、及將第97號之Ala置換為Thr之胺基酸序列(16)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第48號之Val置換為Ile、將第49號之Ser置換為Ala、將第97號之Ala置換為Thr、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(17)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第48號之Val置換為Ile、將第49號之Ser置換為Ala、將第93號之Val置換為Thr、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(18)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第48號之Val置換為Ile、將第49號之Ser置換為Ala、將第93號之Val置換為Thr、及將第97號之Ala置換為Thr之胺基酸序列(19)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第48號之Val置換為Ile、將第49號之Ser置換為Ala、將第77號之Asn置換為Gly、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(20)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第48號之Val置換為Ile、將第49號之Ser置換為Ala、將第77號之Asn置換為Gly、及將第97號之Ala置換為Thr之胺基酸序列(21)將序列編碼96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第48號之Val置換為Ile、將第49號之Ser置換為Ala、將第77號之Asn置換為Gly、及將第93號之Val置換為Thr之胺基酸序列
作為導入有4個修飾之VH之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下之(1)~(35)之胺基酸序列。(1)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第77號之Asn置換為Gly、將第93號之Val置換為Thr、將第97號之Ala置換為Thr、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(2)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第49號之Ser置換為Ala、將第93號之Val置換為Thr、將第97號之Ala置換為Thr、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(3)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第49號之Ser置換為Ala、將第77號之Asn置換為Gly、將第97號之Ala置換為Thr、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(4)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第49號之Ser置換為Ala、將第77號之Asn置換為Gly、將第93號之Val置換為Thr、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(5)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第49號之Ser置換為Ala、將第77號之Asn置換為Gly、將第93號之Val置換為Thr、及將第97號之Ala置換為Thr之胺基酸序列(6)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第48號之Val置換為Ile、將第93號之Val置換為Thr、將第97號之Ala置換為Thr、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(7)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第48號之Val置換為Ile、將第77號之Asn置換為Gly、將第97號之Ala置換為Thr、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(8)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第48號之Val置換為Ile、將第77號之Asn置換為Gly、將第93號之Val置換為Thr、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(9)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第48號之Val置換為Ile、將第77號之Asn置換為Gly、將第93號之Val置換為Thr、及將第97號之Ala置換為Thr之胺基酸序列(10)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第48號之Val置換為Ile、將第49號之Ser置換為Ala、將第97號之Ala置換為Thr、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(11)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第48號之Val置換為Ile、將第49號之Ser置換為Ala、將第93號之Val置換為Thr、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(12)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第48號之Val置換為Ile、將第49號之Ser置換為Ala、將第93號之Val置換為Thr、及將第97號之Ala置換為Thr之胺基酸序列(13)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第48號之Val置換為Ile、將第49號之Ser置換為Ala、將第77號之Asn置換為Gly、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(14)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第48號之Val置換為Ile、將第49號之Ser置換為Ala、將第77號之Asn置換為Gly、及將第97號之Ala置換為Thr之胺基酸序列(15)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第48號之Val置換為Ile、將第49號之Ser置換為Ala、將第77號之Asn置換為Gly、及將第93號之Val置換為Thr之胺基酸序列(16)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第93號之Val置換為Thr、將第97號之Ala置換為Thr、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(17)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第77號之Asn置換為Gly、將第97號之Ala置換為Thr、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(18)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第77號之Asn置換為Gly、將第93號之Val置換為Thr、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(19)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第77號之Asn置換為Gly、將第93號之Val置換為Thr、及將第97號之Ala置換為Thr之胺基酸序列(20)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第49號之Ser置換為Ala、將第97號之Ala置換為Thr、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(21)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第49號之Ser置換為Ala、將第93號之Val置換為Thr、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(22)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第49號之Ser置換為Ala、將第93號之Val置換為Thr、及將第97號之Ala置換為Thr之胺基酸序列(23)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第49號之Ser置換為Ala、將第77號之Asn置換為Gly、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(24)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、第49號之Ser置換為Ala、將第77號之Asn置換為Gly、及將第97號之Ala置換為Thr之胺基酸序列(25)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第49號之Ser置換為Ala、將第77號之Asn置換為Gly、及將第93號之Val置換為Thr之胺基酸序列(26)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第48號之Val置換為Ile、將第97號之Ala置換為Thr、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(27)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第48號之Val置換為Ile、將第93號之Val置換為Thr、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(28)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第48號之Val置換為Ile、將第93號之Val置換為Thr、及將第97號之Ala置換為Thr之胺基酸序列(29)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第48號之Val置換為Ile、將第77號之Asn置換為Gly、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(30)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第48號之Val置換為Ile、將第77號之Asn置換為Gly、及將第97號之Ala置換為Thr之胺基酸序列(31)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第48號之Val置換為Ile、將第77號之Asn置換為Gly、及將第93號之Val置換為Thr之胺基酸序列(32)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第48號之Val置換為Ile、將第49號之Ser置換為Ala、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(33)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第48號之Val置換為Ile、將第49號之Ser置換為Ala、及將第97號之Ala置換為Thr之胺基酸序列(34)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第48號之Val置換為Ile、將第49號之Ser置換為Ala、及將第93號之Val置換為Thr之胺基酸序列(35)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第48號之Val置換為Ile、將第49號之Ser置換為Ala、及將第77號之Asn置換為Gly之胺基酸序列作為導入有3個修飾之VH之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下之(1)~(35)之胺基酸序列。(1)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第48號之Val置換為Ile、及將第49號之Ser置換為Ala之胺基酸序列(2)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第48號之Val置換為Ile、及將第77號之Asn置換為Gly之胺基酸序列(3)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第48號之Val置換為Ile、及將第93號之Val置換為Thr之胺基酸序列(4)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第48號之Val置換為Ile、及將第97號之Ala置換為Thr之胺基酸序列(5)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第48號之Val置換為Ile、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(6)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第49號之Ser置換為Ala、及將第77號之Asn置換為Gly之胺基酸序列(7)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第49號之Ser置換為Ala、及將第93號之Val置換為Thr之胺基酸序列(8)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第49號之Ser置換為Ala、及將第97號之Ala置換為Thr之胺基酸序列(9)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第49號之Ser置換為Ala、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(10)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第77號之Asn置換為Gly、及將第93號之Val置換為Thr之胺基酸序列(11)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第77號之Asn置換為Gly、及將第97號之Ala置換為Thr之胺基酸序列(12)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第77號之Asn置換為Gly、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(13)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第93號之Val置換為Thr、及將第97號之Ala置換為Thr之胺基酸序列(14)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第93號之Val置換為Thr、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(15)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第97號之Ala置換為Thr、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(16)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第48號之Val置換為Ile、將第49號之Ser置換為Ala、及將第77號之Asn置換為Gly之胺基酸序列(17)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第48號之Val置換為Ile、將第49號之Ser置換為Ala、及將第93號之Val置換為Thr之胺基酸序列(18)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第48號之Val置換為Ile、將第49號之Ser置換為Ala、及將第97號之Ala置換為Thr之胺基酸序列(19)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第48號之Val置換為Ile、將第49號之Ser置換為Ala、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(20)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第48號之Val置換為Ile、將第77號之Asn置換為Gly、及將第93號之Val置換為Thr之胺基酸序列(21)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第48號之Val置換為Ile、將第77號之Asn置換為Gly、及將第97號之Ala置換為Thr之胺基酸序列(22)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第48號之Val置換為Ile、將第77號之Asn置換為Gly、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(23)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第48號之Val置換為Ile、將第93號之Val置換為Thr、及將第97號之Ala置換為Thr之胺基酸序列(24)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第48號之Val置換為Ile、將第93號之Val置換為Thr、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(25)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第48號之Val置換為Ile、將第97號之Ala置換為Thr、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(26)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第49號之Ser置換為Ala、將第77號之Asn置換為Gly、及將第93號之Val置換為Thr之胺基酸序列(27)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第49號之Ser置換為Ala、將第77號之Asn置換為Gly、及將第97號之Ala置換為Thr之胺基酸序列(28)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第49號之Ser置換為Ala、將第77號之Asn置換為Gly、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(29)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第49號之Ser置換為Ala、將第93號之Val置換為Thr、及將第97號之Ala置換為Thr之胺基酸序列(30)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第49號之Ser置換為Ala、將第93號之Val置換為Thr、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(31)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第49號之Ser置換為Ala、將第97號之Ala置換為Thr、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(32)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第77號之Asn置換為Gly、將第93號之Val置換為Thr、及將第97號之Ala置換為Thr之胺基酸序列(33)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第77號之Asn置換為Gly、將第93號之Val置換為Thr、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(34)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第77號之Asn置換為Gly、將第97號之Ala置換為Thr、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(35)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第93號之Val置換為Thr、將第97號之Ala置換為Thr、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列作為導入有2個修飾之VH之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下之(1)~(21)之胺基酸序列。
(1)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、及將第48號之Val置換為Ile之胺基酸序列(2)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、及將第49號之Ser置換為Ala之胺基酸序列(3)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、及將第77號之Asn置換為Gly之胺基酸序列(4)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、及將第93號之Val置換為Thr之胺基酸序列(5)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、及將第97號之Ala置換為Thr之胺基酸序列(6)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(7)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第48號之Val置換為Ile、及將第49號之Ser置換為Ala之胺基酸序列(8)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第48號之Val置換為Ile、及將第77號之Asn置換為Gly之胺基酸序列(9)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第48號之Val置換為Ile、及將第93號之Val置換為Thr之胺基酸序列(10)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第48號之Val置換為Ile、及將第97號之Ala置換為Thr之胺基酸序列(11)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第48號之Val置換為Ile、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(12)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第49號之Ser置換為Ala、及將第77號之Asn置換為Gly之胺基酸序列(13)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第49號之Ser置換為Ala、及將第93號之Val置換為Thr之胺基酸序列(14)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第49號之Ser置換為Ala、及將第97號之Ala置換為Thr之胺基酸序列(15)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第49號之Ser置換為Ala、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(16)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第77號之Asn置換為Gly、及將第93號之Val置換為Thr之胺基酸序列(17)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第77號之Asn置換為Gly、及將第97號之Ala置換為Thr之胺基酸序列(18)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第77號之Asn置換為Gly、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(19)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第93號之Val置換為Thr、及將第97號之Ala置換為Thr之胺基酸序列(20)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第93號之Val置換為Thr、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列(21)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第97號之Ala置換為Thr、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列作為導入有1個修飾之VH之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下之(1)~(7)之胺基酸序列。
(1)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn之胺基酸序列(2)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第48號之Val置換為Ile之胺基酸序列(3)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第49號之Ser置換為Ala之胺基酸序列(4)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第77號之Asn置換為Gly之胺基酸序列(5)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第93號之Val置換為Thr之胺基酸序列(6)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第97號之Ala置換為Thr之胺基酸序列(7)將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第117號之Thr置換為Val之胺基酸序列作為更具體之本發明之人類化抗體之VH之胺基酸序列，可列舉序列編號96、105及107所表示之胺基酸序列。
作為本發明之人類化抗體所含之VL，例如可列舉：含有序列編號97所表示之胺基酸序列中的第21號之Ile、第40號之Pro、第58號之Val、第85號之Thr、及第87號之Tyr被置換為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的VL。
其中，作為本發明之人類化抗體所含之VL，較佳為序列編號97所表示之胺基酸序列中的第40號之Pro、第58號之Val、及第87號之Tyr被置換為其他胺基酸殘基之胺基酸序列。作為上述VL之胺基酸序列，可列舉：導入有選自由將序列編號97所表示之胺基酸序列中的第21號之Ile置換為Leu、將第40號之Pro置換為Leu、將第58號之Val置換為Ile、將第85號之Thr置換為Ala、及將第87號之Tyr置換為Phe之修飾中的至少1種修飾之胺基酸序列。作為上述VH之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下之導入有1~5個修飾之胺基酸序列。作為導入有5個修飾之VH之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉：將序列編號97所表示之胺基酸序列中的第21號之Ile置換為Leu、將第40號之Pro置換為Leu、將第58號之Val置換為Ile、將第85號之Thr置換為Ala、及將第87號之Tyr置換為Phe之胺基酸序列等。
作為導入有4個修飾之VL之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下之(1)~(5)之胺基酸序列。(1)將序列編號97所表示之胺基酸序列中的第40號之Pro置換為Leu、將第58號之Val置換為Ile、將第85號之Thr置換為Ala、及將第87號之Tyr置換為Phe之胺基酸序列(2)將序列編號97所表示之胺基酸序列中的第21號之Ile置換為Leu、將第58號之Val置換為Ile、將第85號之Thr置換為Ala、及將第87號之Tyr置換為Phe之胺基酸序列(3)將序列編號97所表示之胺基酸序列中的第21號之Ile置換為Leu、將第40號之Pro置換為Leu、將第85號之Thr置換為Ala、及將第87號之Tyr置換為Phe之胺基酸序列(4)將序列編號97所表示之胺基酸序列中的第21號之Ile置換為Leu、將第40號之Pro置換為Leu、將第58號之Val置換為Ile、及將第87號之Tyr置換為Phe之胺基酸序列(5)將序列編號97所表示之胺基酸序列中的第21號之Ile置換為Leu、將第40號之Pro置換為Leu、將第58號之Val置換為Ile、及將第85號之Thr置換為Ala之胺基酸序列作為導入有3個修飾之VL之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下之(1)~(9)之胺基酸序列。
(1)將序列編號97所表示之胺基酸序列中的第21號之Ile置換為Leu、將第40號之Pro置換為Leu、及將第58號之Val置換為Ile之胺基酸序列(2)將序列編號97所表示之胺基酸序列中的第21號之Ile置換為Leu、將第40號之Pro置換為Leu、及將第85號之Thr置換為Ala之胺基酸序列(3)將序列編號97所表示之胺基酸序列中的第21號之Ile置換為Leu、將第40號之Pro置換為Leu、及將第87號之Tyr置換為Phe之胺基酸序列(4)將序列編號97所表示之胺基酸序列中的第21號之Ile置換為Leu、將第58號之Val置換為Ile、及將第85號之Thr置換為Ala之胺基酸序列(5)將序列編號97所表示之胺基酸序列中的第21號之Ile置換為Leu、將第58號之Val置換為Ile、及將第87號之Tyr置換為Phe之胺基酸序列(6)將序列編號97所表示之胺基酸序列中的第21號之Ile置換為Leu、將第85號之Thr置換為Ala、及將第87號之Tyr置換為Phe之胺基酸序列(7)將序列編號97所表示之胺基酸序列中的第40號之Pro置換為Leu、將第58號之Val置換為Ile、及將第85號之Thr置換為Ala之胺基酸序列(8)將序列編號97所表示之胺基酸序列中的第40號之Pro置換為Leu、將第58號之Val置換為Ile、及將第87號之Tyr置換為Phe之胺基酸序列(9)將序列編號97所表示之胺基酸序列中的第58號之Val置換為Ile、將第85號之Thr置換為Ala、及將第87號之Tyr置換為Phe之胺基酸序列作為導入有2個修飾之VL之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下之(1)~(10)之胺基酸序列。
(1)將序列編號97所表示之胺基酸序列中的第21號之Ile置換為Leu、及將第40號之Pro置換為Leu之胺基酸序列(2)將序列編號97所表示之胺基酸序列中的第21號之Ile置換為Leu、及將第58號之Val置換為Ile之胺基酸序列(3)將序列編號97所表示之胺基酸序列中的第21號之Ile置換為Leu、及將第85號之Thr置換為Ala之胺基酸序列(4)將序列編號97所表示之胺基酸序列中的第21號之Ile置換為Leu、及將第87號之Tyr置換為Phe之胺基酸序列(5)將序列編號97所表示之胺基酸序列中的第40號之Pro置換為Leu、及將第58號之Val置換為Ile之胺基酸序列(6)將序列編號97所表示之胺基酸序列中的第40號之Pro置換為Leu、及將第85號之Thr置換為Ala之胺基酸序列(7)將序列編號97所表示之胺基酸序列中的第40號之Pro置換為Leu、及將第87號之Tyr置換為Phe之胺基酸序列(8)將序列編號97所表示之胺基酸序列中的第58號之Val置換為Ile、及將第85號之Thr置換為Ala之胺基酸序列(9)將序列編號97所表示之胺基酸序列中的第58號之Val置換為Ile、及將第87號之Tyr置換為Phe之胺基酸序列(10)將序列編號97所表示之胺基酸序列中的第85號之Thr置換為Ala、及將第87號之Tyr置換為Phe之胺基酸序列作為導入有1個修飾之VL之胺基酸序列，具體而言，可列舉：將序列編號97所表示之胺基酸序列中的第21號之Ile置換為Leu之胺基酸序列、將第40號之Pro置換為Leu之胺基酸序列、將第58號之Val置換為Ile之胺基酸序列、將第85號之Thr置換為Ala之胺基酸序列、及將第87號之Tyr置換為Phe之胺基酸序列。
作為更具體之本發明之人類化抗體之VL，可列舉序列編號97所表示之胺基酸序列。
又，作為本發明之人類化抗體之具體例，可列舉以下之(1)~(5)之抗體。(1)包含含有序列編號96所示之胺基酸序列之可變區域之H鏈及含有序列編號97所示之胺基酸序列之可變區域之L鏈的至少一者之人類化抗體(2)包含含有序列編號101所示之胺基酸序列之可變區域之H鏈及含有序列編號97所示之胺基酸序列之可變區域之L鏈的至少一者之人類化抗體(3)包含含有序列編號103所示之胺基酸序列之可變區域之H鏈及含有序列編號97所示之胺基酸序列之可變區域之L鏈的至少一者之人類化抗體(4)包含含有序列編號105所示之胺基酸序列之可變區域之H鏈及含有序列編號97所示之胺基酸序列之可變區域之L鏈的至少一者之人類化抗體(5)包含含有序列編號107所示之胺基酸序列之可變區域之H鏈及含有序列編號97所示之胺基酸序列之可變區域之L鏈的至少一者之人類化抗體人類抗體原本係指內在性地存在於人類體內之抗體，亦包括自藉由近來之基因工程學、細胞工程學及發育工程學之技術進步而製作之人類抗體噬菌體基因庫(phage library)及產生人類抗體之基因轉殖動物所獲得的抗體等。
作為內在性地存在於人類體內之抗體，例如可將人類周邊血液淋巴細胞單獨分離，使其感染EB病毒等而實現不朽化(immortalization)，並進行選殖，藉此可培養產生該抗體之淋巴細胞，自培養上清液中純化該抗體。人類抗體噬菌體基因庫係藉由將自人類B細胞製備之抗體基因插入噬菌體基因中，使Fab、scFv等抗體片段表現於噬菌體表面的基因庫。根據該基因庫，以針對固定有抗原之受質的結合活性作為指標，可回收於表面表現有具有所需抗原結合活性之抗體片段的噬菌體。該抗體片段亦可進而藉由基因工程學手法而轉化為包含2條完整之H鏈及L鏈的人類抗體分子。產生人類抗體之基因轉殖動物係指將人類抗體基因組入至細胞內之動物。具體而言，例如可將人類抗體基因導入小鼠ES細胞中，將該ES細胞移植至小鼠之早期胚(early embryo)後，使之發育，藉此製作產生人類抗體之基因轉殖小鼠。
作為由產生人類抗體之基因轉殖動物製作人類抗體之製作方法，可利用通常之人類以外之動物所進行之融合瘤製作方法，取得產生人類抗體之融合瘤並進行培養，藉此於培養上清液中產生並蓄積人類抗體。於構成上述抗體或抗體片段之胺基酸序列中缺失、附加、置換或插入有1個以上之胺基酸，且具有與上述抗體或其抗體片段相同之活性的抗體或其抗體片段亦包含在本發明之抗體或其抗體片段中。
缺失、置換、插入及/或附加之胺基酸之數量為1個以上，該數量並無特別限定，係藉由分子選殖第2版(Molecular Cloning 2nd edition)、分子生物學現行規範(Current Protocols in Molecular Biology)、Nucleic Acids Research,10,6487(1982)、Proc,Natl. Acad. Sci.,USA,79,6409(1982)、Gene,34,315(1985)、Nucleic Acids Research,13,4431(1985)、Proc. Natl. Acad. Sci.,USA,82,488(1985)等中所記載之部位特異性變異導入法等公知之技術可缺失、置換或者附加之程度之數量。例如為1~數十個，較佳為1~20個，更佳為1~10個，更佳為1~5個。
上述抗體之胺基酸序列中缺失、置換、插入或附加有1個以上之胺基酸殘基係表示如下。表示於同一序列中之任意、且1個或者複數個胺基酸序列中缺失、置換、插入或附加有1個或複數個胺基酸殘基。又，存在同時發生缺失、置換、插入或附加之情形，亦存在置換、插入或附加之胺基酸殘基為天然型與非天然型之任一者之情形。作為天然型胺基酸殘基，例如可列舉：L-丙胺酸、L-天冬醯胺、L-天冬醯胺酸、L-麩醯胺、L-麩醯胺酸、甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-白胺酸、L-離胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸及L-半胱胺酸等。以下，揭示可相互置換之胺基酸殘基之較佳例。包含於同一群中之胺基酸殘基可相互置換。
A：白胺酸、異白胺酸、正白胺酸、纈胺酸、正纈胺酸、丙胺酸、2-胺基丁酸、甲硫胺酸、O-甲基絲胺酸、第三丁基甘胺酸、第三丁基丙胺酸、環己基丙胺酸B群：天冬醯胺酸、麩醯胺酸、異天冬醯胺酸、異麩醯胺酸、2-胺基己二酸、2-胺基辛二酸C群：天冬醯胺、麩醯胺D群：離胺酸、精胺酸、鳥胺酸、2,4-二胺基丁酸、2,3-二胺基丙酸E群：脯胺酸、3-羥基脯胺酸、4-羥基脯胺酸F群：絲胺酸、蘇胺酸、高絲胺酸G群：苯丙胺酸、酪胺酸作為本抗體之效應活性，例如可列舉ADCC活性、CDC活性、抗體依賴性細胞吞噬活性(antibody dependent cellular phagocytosis，ADCP)及噬菌素化效果等，可藉由各種方法進行控制。
作為控制效應活性之方法，例如可列舉：控制抗體之Fc區域所結合之糖鏈之方法、對抗體之Fc區域之胺基酸殘基進行胺基酸修飾之方法等。作為控制抗體之Fc區域所結合之糖鏈之方法，例如可列舉：藉由去除IgG抗體之第297號糖鏈而降低ADCC、CDC活性之方法[Molecular Immunology,32,1311,(1995)、國際公開第2008/030564號]，及降低半乳糖對抗體之Fc區域的結合而降低CDC活性之方法等。
又，作為控制抗體之Fc區域所結合之糖鏈之方法，例如可列舉：產生含有如下糖鏈之抗體之方法，該糖鏈係於IgG抗體之Fc區域之第297號之天冬醯胺所結合的N-結合型糖鏈中，於結合有糖鏈之基部之N-乙醯基葡萄糖胺(GlcNAc)上未結合岩藻糖(fucose)者(US 7,214,775、US 6,946,292)；產生含有使平分型GlcNAc(bisecting GlcNAc)相結合而成之糖鏈的抗體之方法[Nature Biotechnology,17,176(1999)]；產生具有使非還原末端所結合之半乳糖(Gal)相結合而成之糖鏈的抗體之方法[Hum. Antfbod. Hybridomas,5,143-151,(1994)]等方法。
作為對抗體之Fc區域之胺基酸殘基進行胺基酸修飾之方法，例如可列舉：藉由對抗體之Fc區域進行胺基酸修飾而控制效應活性之方法(J. B. C.,277,26733-26740,2002、US 6,737,056、US 7,297,775、US 2007/0020260、國際公開第2005/070963號)、及藉由進行抗體之Fc區域之各亞型間的區域交換而控制效應活性之方法(國際公開第2007/011041號)等。
作為本發明之抗體片段，可列舉：Fab、Fab'、F(ab')2 、scFv、diabody及dsFv等。作為本發明之抗體片段，可列舉：含有Fab、F(ab')2 、Fab'、scFv、diabody、dsFv及CDR之肽等。Fab係於利用作為蛋白質分解酶之木瓜酶處理IgG而獲得之片段中(於H鏈之第224號之胺基酸殘基處切斷)，H鏈之N末端側約一半與L鏈全部以二硫鍵結合而成之分子量約為5萬的具有抗原結合活性之抗體片段。本發明之Fab可利用作為蛋白質分解酶之木瓜酶對本發明之特異性識別糖鏈缺乏CD27蛋白質且與該細胞外區域結合之單株抗體進行處理而獲得。或者，可藉由將編碼該抗體之Fab之DNA插入原核生物用表現載體或真核生物用表現載體中，再將該載體導入原核生物或真核生物中進行表現而製造。
F(ab')2 係利用胃蛋白酶將IgG之鉸鏈區域之2個二硫鍵之下部分解而獲得的2個Fab區域利用鉸鏈部分相結合而構成之分子量約為10萬之具有抗原結合活性之片段。
本發明之F(ab')2 可利用作為蛋白質分解酶之胃蛋白酶對本發明之特異性識別糖鏈缺乏CD27蛋白質且與該細胞外區域結合之單株抗體進行處理而獲得。或者，可使下述Fab'以硫醚鍵或二硫鍵進行結合而製作。
Fab'係將上述F(ab')2 之鉸鏈區域之二硫鍵切斷而成之分子量約為5萬的具有抗原結合活性之抗體片段。本發明之Fab'可利用作為還原劑之二硫代蘇糖醇對本發明之特異性識別糖鏈缺乏CD27蛋白質且與該細胞外區域結合之F(ab')2 進行處理而獲得。或者，可藉由將編碼該抗體之Fab'片段之DNA插入原核生物用表現載體或真核生物用表現載體中，再將該載體導入原核生物或真核生物中進行表現而製造。
scFv係使用適當之肽連接子(以下記為P)將1條VH與1條VL連接而成的VH-P-VL或者VL-P-VH多肽，且係具有抗原結合活性之抗體片段。
本發明之scFv可藉由取得編碼本發明之特異性識別糖鏈缺乏CD27蛋白質且與該細胞外區域結合之單株抗體的VH及VL之cDNA，構建編碼scFv之DNA，將該DNA插入原核生物用表現載體或真核生物用表現載體中，再將該表現載體導入原核生物或真核生物中進行表現而製造。
diabody係將scFV二聚化而成之抗體片段，且係具有二價之抗原結合活性之抗體片段。二價之抗原結合活性可相同，亦可將一方設為不同之抗原結合活性。
本發明之diabody可藉由取得本發明之特異性識別糖鏈缺乏CD27蛋白質且與該細胞外區域結合之單株抗體，以P之胺基酸序列之長度成為8個殘基以下之方式構建編碼scFv之DNA，將該DNA插入原核生物用表現載體或真核生物用表現載體中，再將該表現載體導入原核生物或真核生物中進行表現而製造。dsFv係指經由該半胱胺酸殘基間之二硫鍵使將VH及VL中之各1個胺基酸殘基置換為半胱胺酸殘基而成的多肽相結合而成者。欲置換為半胱胺酸殘基之胺基酸殘基可依據Reiter等人所揭示之方法[Protein Engineering,7,697(1994)]，根據抗體之立體結構預測進行選擇。本發明之dsFv可藉由取得編碼本發明之特異性識別糖鏈缺乏CD27蛋白質且與該細胞外區域結合之單株抗體的VH及VL之cDNA，構建編碼dsFv之DNA，將該DNA插入原核生物用表現載體或真核生物用表現載體中，再將該表現載體導入原核生物或真核生物中進行表現而製造。含有CDR之肽係含有VH或VL之CDR之至少1個區域以上而構成。含有複數個CDR之肽可直接或經由適當之肽連接子而結合。
本發明之含有CDR之肽可藉由構建編碼本發明之特異性識別糖鏈缺乏CD27蛋白質且與該細胞外區域結合之單株抗體的VH及VL之CDR之DNA，將該DNA插入原核生物用表現載體或真核生物用表現載體中，再將該表現載體導入原核生物或真核生物中進行表現而製造。又，含有CDR之肽亦可藉由Fmoc法(茀基甲氧羰基法)及tBoc法(第三丁氧羰基法)等化學合成法而製造。
本發明包括與如下抗體之結合體(conjugate)，該抗體係以化學或基因工程學方法於本發明之特異性識別糖鏈缺乏CD27蛋白質且與該細胞外區域結合之單株抗體或抗體片段上結合藥劑、蛋白質及放射性同位素等而成者。本發明之結合體可藉由利用化學手法[抗體工程入門、金光修著、地人書館(1994)]，於本發明之特異性識別糖鏈缺乏CD27蛋白質且與該細胞外區域結合之單株抗體或其抗體片段之H鏈或L鏈之N末端側或C末端側、抗體或其抗體片段中之適當之置換基或側鏈、進而抗體或其抗體片段中之糖鏈等上結合藥劑、蛋白質、放射性同位素等而製造。
又，本發明之結合體亦可藉由如下之基因工程學手法製造：將編碼本發明之特異性識別糖鏈缺乏CD27蛋白質且與該細胞外區域結合之單株抗體或其抗體片段的DNA，與編碼欲結合之蛋白質的DNA相結合，並插入至表現載體中，再將該表現載體導入原核生物或真核生物之宿主細胞。作為藥劑，例如可列舉：化療藥物、抗體醫藥、免疫刺激劑(immunostimulant)及高分子之藥劑等。作為蛋白質，例如可列舉：細胞介素、增殖因子及毒素蛋白質等。
進而，與抗體或該抗體片段結合之藥劑亦可為前驅藥之形態。本發明之所謂前驅藥，係指利用存在於腫瘤環境中之酶等進行化學修飾，而轉化為具有毒殺癌細胞作用之物質的藥劑。
作為化療藥物，例如亦包括：烷基化劑、亞硝基尿素劑、代謝拮抗劑、抗癌性抗生素、源自植物之生物鹼、定位異構轉化酶抑制劑、激素療法劑、激素拮抗劑、芳香環轉化酶抑制劑、P糖蛋白抑制劑、鉑錯合物衍生物、M期抑制劑及激酶抑制劑等中之任何化療藥物。
作為化療藥物，例如可列舉：Amifostine(Ethyol)、順鉑、達卡巴仁(Aacarbazine，DTIC)、可美淨(Dactinomycin)、氮芥(mechlorethamine、nitrogen mustard)、鏈佐星(streptozocin)、環磷酸醯胺(cyclophosphamide)、異環磷醯胺(ifosfamide)、卡莫司汀(carmustine，BCNU)、洛莫司汀(lomustine，CCNU)、多柔比星(doxorubicin、adriamycin)、微脂體多柔比星(doxil)、表柔比星(epirubicin)、吉西他濱(健擇)、唐黴素、微脂體唐黴素(daunoxome)、甲苄肼、絲裂黴素(mitomycin)、阿糖胞苷(cytarabine)、依託泊苷(etoposide)、甲胺喋呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、長春花鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)、博來黴素(bleomycin)、道諾黴素(daunomycin)、培洛黴素(peplomycin)、雌莫司汀(estramustine)、太平洋紫杉醇(紫杉醇鹼)、歐洲紫杉醇(剋癌易)、普留淨(aldesleukin)、樂拿舒(asparaginase)、補束剋(busulfan)、卡鉑(carboplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、奈達鉑(nedaplatin)、克拉屈濱(cladribine)、喜樹鹼(camptothecin)、CPT-11(抗癌妥)、10-羥基-7-乙基喜樹鹼(SN38)、氟尿苷(floxuridine)、福達樂(fludarabine)、羥基脲、異環磷醯胺(ifosfamide)、艾達黴素(idarubicin)、美司鈉(mesna)、抗癌妥(irinotecan)、拓撲替康(nogitecan)、雙羥蒽醌(mitoxantrone)、拓撲替康(topotecan)、柳菩林(leuprolide)、甲地孕酮(megestrol)、美法侖(melphalan)、巰基嘌呤(mercaptopurine)、羥基碳醯胺、普卡黴素(plicamycin)、米托坦(mitotane)、培門冬酶(pegaspargase)、噴司他丁(pentostatin)、哌泊溴烷(pipobroman)、鏈佐星(streptozocin)、泰莫西芬(tamoxifen)、戈舍瑞林(goserelin)、柳菩林(leuprorelin)、氟他胺(flutamide)、替尼泊苷(teniposide)、睾內酯(testolactone)、硫鳥嘌呤(thioguanine)、塞替哌(thiotepa)、烏拉莫司汀(uracil mustard)、長春瑞濱(vinorelbine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、氫化可體松(hydrocortisone)、潑尼松龍(prednisolone)、甲潑尼龍(methylprednisolone)、長春地辛(vindesine)、尼莫司汀(nimustine)、司莫司汀(semustine)、卡培他濱(capecitabine)、雷替曲塞(tomudex)、阿紮胞苷(azacitidine)、UFT(替加氟-尿嘧啶)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、吉非替尼(艾瑞莎)、依麥替尼布(STI571)、埃羅替尼(Erlotinib)、Flt3抑制劑、管內皮生長因子受體(vascular endothellal growth facotr receptor，VEGFR)抑制劑、纖維芽細胞生長因子受體(fibroblast growth factor receptor，FGFR)抑制劑、上皮細胞生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)抑制劑(艾瑞莎、得舒緩等)根赤殼菌素(radicicol)、17-烯丙胺基-17-去甲氧基格爾德黴素(17-AAG)、雷帕黴素(rapamycin)、安吖啶(amsacrine)、全反式維生素A酸(all-trans retinoic acid)、沙利竇邁(thalidomide)、安美達錠(anastrozole)、法倔唑(Fadrozole)、來曲唑(letrozole)、依西美坦(exemestane)、硫蘋果酸金鹽(gold thiomalate)、D青黴胺(D-penicillamine)、布西拉明(bucillamine)、硫唑嘌呤(azathioprine)、咪唑利賓(mizoribine)、環孢靈(cyclosporin)、雷帕黴素(rapamycin)、氫化可體松(hydrocortisone)、貝沙羅汀(塔革雷汀)、泰莫西芬(tamoxifen)、地塞美松(dexamethasone)、黃體素類、雌激素類、阿那曲唑(瑞寧得)、柳菩林(leuplin)、阿斯匹林、吲哚美辛(indomethacin)、塞來考昔(celecoxib)、硫唑嘌呤(azathioprine)、青黴胺(penicillamine)、硫蘋果酸金鹽(gold thiomalate)、馬來酸氯苯那敏(chlorpheniramine maleate)、氯苯那敏(chlorpheniramine)、氯馬斯汀(clemastine)、全反式維生素A酸(tretinoin)、貝沙羅汀(bexarotene)、砷、硼替左米(bortezomib)、安樂普諾(allopurinol)、吉妥單抗(gemtuzumab)、替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)、碘131標記托西莫單抗(iodine-131 tositumomab)、塔革雷汀(targretin)、奧唑米星(ozogamicin)、克拉黴素(clarithromycin)、亞葉酸(leucovorin)、異環磷醯胺(ifosfamide)、酮康唑(ketoconazole)、氨苯哌酮(aminoglutethimide)、舒拉明(suramin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、美登醇(Maytansinoid)及其衍生物等。作為使化療藥物與抗體結合之方法，例如可列舉：經由戊二醛使化療藥物與抗體之胺基之間結合的方法、及經由水溶性碳二醯亞胺使化療藥物之胺基與抗體之羧基結合的方法等。
作為抗體醫藥，例如可列舉針對如下抗原之抗體：藉由與抗體結合而誘導細胞凋亡之抗原、與腫瘤之病情形成相關之抗原或調節免疫功能之抗原、及與病變部位之血管新生相關之抗原。
作為藉由與抗體結合而誘導細胞凋亡之抗原，例如可列舉：表面抗原分化簇(Cluster of differentiation)(以下記載為CD)19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CDw78、CD79a、CD79b、CD80(B7.1)、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85、CD86(B7.2)、人類白細胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)第II型、EGFR等。
作為與腫瘤之病情形成相關之抗原或調節免疫功能之抗原，例如可列舉：CD4、CD40、CD40配體、B7家族分子(例如CD80、CD86、CD274、B7-DC、B7-H2、B7-H3及B7-H4等)、B7家族分子之配體(例如CD28、CTLA-4、ICOS、PD-1及BTLA等)、OX-40、OX-40配體、CD137、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)受體家族分子(例如DR4、DR5、TNFR1及TNFR2等)、腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor，TRAIL)家族分子、TRAIL家族分子之受體家族(TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRAIL-R3、TRAIL-R4)、核因子KB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand，RANK)、RANK配體、CD25、葉酸受體4、細胞介素[介白素-1α(以下，將介白素記為IL)、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、轉化生長因子(transforming growth factor，TGF)β、TNFα等]、該等細胞介素之受體、趨化激素(例如SLC、ELC、I-309、TARC、MDC及CTACK等)、該等趨化激素之受體。
作為抑制病變部位之血管新生的抗體之抗原，例如可列舉：血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、促血管生成素(Angiopoietin)、纖維母細胞生長因子(fibroblast growth factor，FGF)、EGF、血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、類胰島素生長因子(insulin-like growth factor，IGF)、促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)、TGFβ、IL-8、Ephilin、SDF-1等、及該等之受體。
免疫刺激劑可為作為免疫佐劑(immunoadjuvant)而已知之天然物，關於具體例，作為使免疫亢進之藥劑，可列舉：β-1,3-葡聚糖(例如香菇多糖及西佐喃等)、α半乳糖基腦醯胺(KRN7000)、菌體粉末(例如必醫你舒(picibanil)及卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin，BCG)等)、菌體萃取物(例如雲芝多糖等)。作為高分子之藥劑，例如可列舉：聚乙二醇(以下記為PEG)、白蛋白、葡聚糖(dextran)、聚氧乙烯、苯乙烯-馬來酸共聚物、聚乙烯基吡咯啶酮、吡喃共聚物及羥丙基甲基丙烯醯胺等。藉由使該等高分子藥劑與抗體或抗體片段結合，可期待如下效果：(1)對化學、物理或生物等各種因子之穩定性之提高、(2)血漿半衰期之顯著延長、(3)免疫原性之消失、抗體產生之抑制等[生物交聯醫藥品，廣川書店(1993)]。作為使PEG與抗體結合之方法，例如可列舉與PEG化修飾試劑進行反應之方法等[生物結合醫藥品，廣川書店(1993)]。作為PEG化修飾試劑，例如可列舉：離胺酸之ε-胺基之修飾劑(日本專利特開昭61-178926號公報)、天冬醯胺酸及麩胺酸之羧基之修飾劑(日本專利特開昭56-23587號公報)及精胺酸之胍基之修飾劑(日本專利特開平2-117920號公報)等。
作為細胞介素或增殖因子，若為使NK細胞、巨噬細胞及嗜中性白細胞等細胞亢進的細胞介素或增殖因子，則可為任意者，例如可列舉：干擾素(以下記為IFN)-α、INF-β、INF-γ、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、顆粒細胞刺激因子(G-CSF)、顆粒細胞-巨噬細胞刺激因子(GM-CSF)、巨噬細胞刺激因子(M-CSF)等。作為毒素蛋白質，例如可列舉：賴胺酸、白喉毒素及ONTAK等，亦包括為了調節毒性而對蛋白質導入變異而成之蛋白質毒素。作為放射性同位素，例如可列舉：131I、125I、90Y、64Cu、199Tc、77Lu、211At、Re186、Re188、In111等。放射性同位素可藉由氯胺T法等而與抗體直接結合。又，亦可使螯合放射性同位素之物質與抗體結合。作為螯合劑，可列舉甲基苄基二乙三胺五乙酸(methylbenzyldiethylene-triaminepentaacetic acid，MX-DTPA)等。
於本發明中，可將本發明中使用之抗體與1種以上之其他藥劑組合投予，亦可將本發明中使用之抗體與放射線照射組合。作為其他藥劑，可列舉：上述化療藥物、抗體醫藥、免疫刺激劑、細胞介素或增殖因子等。作為放射線照射，包括：X線及γ線等光子(電磁波)照射，電子束、質子束及重粒子束等粒子束照射等。作為組合投予之方法，可與本發明中使用之抗體同時投予，又，亦可於本發明中使用之抗體之投予前後進行投予。
本發明之檢測方法、定量方法、檢測試劑、定量試劑或診斷藥，可列舉利用特定之標記物來標記本發明之抗體而使用的方法。作為標記物，可列舉通常之免疫學檢測或測定法中使用之標記物，可列舉：鹼性磷酸酶、過氧化酶、螢光酶等酶，吖啶酯、咯吩等發光物質，螢光素異硫氰酸鹽(fluorescein isothiocyanate，FITC)、三甲基羅丹明(RITC)等螢光物質等。以下，具體說明本發明之抗體之製造方法。
1.單株抗體之製造方法(1)抗原之製備藉由以下記載之方法，將含有編碼CD27全長或其部分長度之cDNA的表現載體導入至於O-結合型糖鏈合成過程中於多肽上之Ser/Thr上所結合的GalNAc上附加Gal之酶、與該酶之活性相關之蛋白質、或與尿苷二磷酸半乳糖(UDP galactose)之輸送相關的蛋白質等之活性降低或缺損之酵母、昆蟲細胞、動物細胞等，藉此可獲得表現有成為抗原之糖鏈缺乏CD27或者糖鏈缺乏CD27之細胞。
又，亦可採用自於細胞膜上或培養液中大量表現糖鏈缺乏CD27的各種源自人類之培養細胞、人類組織等，純化糖鏈缺乏CD27而製備抗原之方法，或者亦可製備具有糖鏈缺乏CD27之部分序列的合成肽並將其用作抗原。進而，可藉由於試管內，於使用無糖鏈附加能力之大腸桿菌等原核生物進行表現、純化而獲得之CD27上附加糖鏈，而獲得糖鏈缺乏CD27。
又，同樣地，藉由於具有正常之O-結合型糖鏈合成過程之酵母、昆蟲細胞、動物細胞等宿主細胞中導入含有編碼CD27全長或其部分長度之cDNA的表現載體，可取得表現有具有正常之O-結合型糖鏈之CD27的細胞，可自該細胞純化具有正常之O-結合型糖鏈之CD27蛋白質。
藉由上述方式獲得之糖鏈缺乏CD27、具有正常O-結合型糖鏈之CD27的蛋白質或表現細胞可用於篩選目標抗體、確認所取得之抗體對抗原之反應性。作為本發明中使用之多肽，可使用Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)或Current Protocols IN Molecular Biology,John Wiley & Sons(1987-1997)等中所記載之方法等，使編碼該多肽之DNA於宿主細胞中進行表現而製造。例如可藉由以下方法製造。首先，藉由將編碼全長多肽之cDNA插入至適當之表現載體之啟動子之下游，而製作重組載體。此時，若有必要，亦可以全長cDNA為基礎而製備含有編碼多肽之部分的適當長度之DNA片段，並使用該DNA片段代替上述全長cDNA。繼而，可藉由將該重組載體導入適於該表現載體之宿主細胞，而獲得產生多肽之轉形體。
作為宿主細胞，只要為大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞及動物細胞等具有附加O-結合型糖鏈之能力且可表現目標基因者，則可使用任意者。作為表現載體，係使用可於所使用之宿主細胞中自主複製或可組入染色體中，且於可轉錄編碼多肽之DNA的位置具有適當之啟動子者。
於使用大腸桿菌等原核生物作為宿主細胞之情形時，含有編碼本發明中使用之多肽的DNA而成之重組載體較佳為可於原核生物中可自主複製，同時含有啟動子、核糖體結合序列、本發明中使用之DNA及轉錄終止序列的載體。該重組載體亦可進而含有控制啟動子之基因。
作為表現載體，例如可列舉：pBTrp2、pBTac1、pBTac2(均為Roche Diagnostics公司製造)、pKK233-2(Pharmacia公司製造)、pSE280(Invitrogen公司製造)、pGEMEX-1(Promega公司製造)、pQE-8(QIAGEN公司製造)、pKYP10(日本專利特開昭58-110600)、pKYP200[Agricultural Biological Chemistry,48,669(1984)]、pLSA1[Agric. Biol. Chem.,53,277(1989)]、pGEL1[Proc. Natl. Acad. Sci. USA,82,4306(1985)]、pBluescript II SK(-)　(Stratagene公司製造)、pTrs30[由大腸桿菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)製備]、pTrs32[由大腸桿菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)製備]、pGHA2[由大腸桿菌IGHA2(FERM BP-400)製備，日本專利特開昭60-221091]、pGKA2[由大腸桿菌IGKA2(FERM BP-6798)製備，日本專利特開昭60-221091]、pTerm2(US 4686191、US 4939094、US 5160735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pEG400[J. Bacteriol.,172,2392(1990)]、pGEX(Pharmacia公司製造)、pET系統(Novagen公司製造)、pME18SFL3等。
作為啟動子，只要為可於所使用之宿主細胞中發揮功能者則可為任意者。例如可列舉：trp啟動子(Ptrp)、lac啟動子、PL啟動子、PR啟動子、T7啟動子等源自大腸桿菌或噬菌體等之啟動子。又，亦可使用將2個Ptrp串聯而成之串聯啟動子、tac啟動子、lac T7啟動子、let I啟動子等之類的人工設計改變而成之啟動子等。
又，作為上述重組載體，較佳為使用將作為核糖體結合序列之Shine-Dalgarno序列與起始密碼子之間調節為適當之距離(例如6~18個鹼基)的質粒。於編碼本發明中使用之多肽的DNA之鹼基序列中，可以成為最適合於宿主內之表現的密碼子之方式置換鹼基，藉此可提高目標多肽之產生率。進而，轉錄終止序列對於表現上述重組載體中之基因並非必需，較佳為緊接結構基因配置轉錄終止序列。
作為宿主細胞，可列舉屬於埃希氏菌屬等之微生物，例如：大腸桿菌XL1-Blue、大腸桿菌XL2-Blue、大腸桿菌DH1、大腸桿菌MC1000、大腸桿菌KY3276、大腸桿菌W1485、大腸桿菌JM109、大腸桿菌HB101、大腸桿菌No.49、大腸桿菌W3110、大腸桿菌NY49、大腸桿菌DH5α等。
作為重組載體之導入方法，只要為向上述宿主細胞中導入DNA之方法，則可使用任意方法，例如可列舉：使用鈣離子之方法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA,69,2110(1972)]、Gene,17,107(1982)或Molecular & General Genetics,168,111(1979)中所記載之方法等。於使用動物細胞作為宿主之情形時，作為表現載體，例如可列舉：pcDNAI、pcDM8(由Funakoshi公司銷售)、pAGE107[日本專利特開平3-22979號公報，Cytotechnology,3,133,(1990)]、pAS3-3(日本專利特開平2-227075號公報)、pCDM8[Nature,329,840,(1987)]、pcDNAI/Amp(Invitrogen公司製造)、pcDNA3.1(Invitrogen公司製造)、pREP4(Invitrogen公司製造)、pAGE103[J. Biochemistry,101,1307(1987)]、pAGE210、pME18SFL3、pKANTEX93[國際公開第97/10354]等。作為啟動子，只要為可於動物細胞中發揮功能者，則可使用任意者，例如可列舉：巨細胞病毒(CMV)之IE(immediate early，即刻早期)基因之啟動子、SV40之初期啟動子、反轉錄病毒之啟動子、金屬硫蛋白啟動子、熱休克啟動子、SRα啟動子、莫洛尼鼠類白血病病毒(moloney murine leukemia virus)之啟動子及促進子等。又，亦可將人類CMV之IE基因之促進子與啟動子併用。作為宿主細胞，只要為於糖鏈合成途徑中使於多肽上之Ser/Thr上所結合的N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)上附加Gal之酶、與該酶之活性相關之蛋白質、或與尿苷-5'-二磷酸半乳糖(uridine 5'-diphospate-galactose，UDP-galactose)之輸送相關的蛋白質等之活性降低或缺損之細胞株，則可為任意者。具體可列舉作為尿苷二磷酸半乳糖轉運蛋白缺失之中國倉鼠細胞(CHO細胞)的Lec8變異體[ACS Symp. Ser. 128,214](1980))。
進而可使用與糖鏈合成途徑相關之酶、輸送蛋白質之活性未缺失，但使如下等酶、輸送蛋白質之功能降低或者缺失之細胞株：尿苷二磷酸半乳糖轉運蛋白(別名UDP-galactose translocator，UGALT)、或者核心1合成酶，糖蛋白N-乙醯半乳糖胺3-β-半乳糖基轉移酶(core 1 synthase,glycoprotein-n-acetylgalactosamine 3-beta-galactosyltransferase，C1GALT1，別名核心1 β-3-gal-t、t合成酶)或者C1GALT1特異性伴侶蛋白(C1GALT1-specific chaperone 1，c1galt1c1，別名核心1β-3-半乳糖基轉移酶特異性分子伴侶蛋白(COSMC)、C1GALT2)。作為與糖鏈合成途徑相關之酶、輸送蛋白質之活性未缺失的細胞，例如可列舉：Burkitt's淋巴瘤細胞(Namalwa細胞)、作為猴子細胞之COS細胞、作為中國倉鼠細胞之CHO細胞、HBT5637(日本專利特開昭63-299)等。
作為降低基因功能之方法，例如可列舉：反義法、核酸酶法[Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,96,1886(1999)]、同源重組法[Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994)、Gene Targeting,A Practical Approach,IRL Press at Oxford University Press(1993)]、RNA-DNA寡核苷酸(RNA-DNA oligonucleotide，RDO)法、RNA干涉(RNA interference，RNAi)法[Nature,391,806,(1998)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95,15502,(1998)、Nature,395,854,(1998)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,96,5049,(1999)、Cell,95,1017,(1998)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,96,1451,(1999) roc. Natl. Acad. Sci. USA,95,13959,(1998)、Nature Cell Biol.,2,70,(2000)]、使用反轉錄病毒之方法及使用轉位子之方法[Nature Genetics,25,35,(2000)]等。作為載體之導入方法，只要為向動物細胞中導入DNA之方法，則可使用任意方法，例如可列舉：電穿孔法[Cytotechnology,3,133(1990)]、磷酸鈣法(日本專利特開平2-227075號公報)及脂質體轉染法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA,84,7413(1987)]等。作為基因之表現方法，除直接表現以外，亦可依據Molecular Cloning，A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)中所記載之方法等，進行分泌產生及融合蛋白質表現等。在源自真核生物之細胞中進行表現之情形時，可獲得附加有糖或糖鏈之多肽。
將藉由以上方式獲得之轉形體於培養基中進行培養，使該多肽生成蓄積於培養物中，再自該培養物進行採集，藉此可製造多肽。將該轉形體於培養基中進行培養之方法可依據宿主培養所使用之通常方法而進行。
於對利用使用有誘導性啟動子作為啟動子之重組載體進行轉形之微生物進行培養時，視需要亦可於培養基中添加誘導子(inducer)。例如於對利用使用有lac啟動子之重組載體進行轉形之微生物進行培養時，亦可於培養基中添加異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside)等，於對利用使用有trp啟動子之重組載體進行轉形之微生物進行培養時，亦可於培養基中添加吲哚丙烯酸等。
作為培養以動物細胞作為宿主而獲得之轉形體的培養基，可使用通常使用之RPMI1640培養基[The Journal of the American Medical Association,199,519(1967)]、Eagle之MEM培養基[Science,122,501(1952)]、杜貝可改良MEM培養基[Virology,8,396(1959)]、199培養基[Proc. Soc. Exp. Biol.Med.,73,1(1950)]或向該等培養基中添加FCS等而成之培養基等。培養通常於pH值6~8、30~40℃、5% CO2 之存在下等條件下進行1~7天。又，於培養中視需要亦可於培養基中添加康黴素、青黴素等抗生素。
如上所述，依據通常之培養方法，對源自保有組入有編碼本發明中使用之多肽之DNA的重組載體之微生物、動物細胞等之轉形體進行培養，使該多肽生成蓄積，並自該培養物進行採集，藉此可製造本發明所使用之多肽。作為基因之表現方法，除直接表現以外，亦可依據Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)中所記載之方法等，進行分泌產生、融合蛋白質表現等。作為多肽之生產方法，有產生於宿主細胞內之方法、分泌至宿主細胞外之方法、及產生於宿主細胞外膜上之方法，可藉由改變所使用之宿主細胞、及所產生之多肽之結構等，而選擇適當之方法。
於使多肽產生於宿主細胞內或宿主細胞外膜上之情形時，可藉由使用Paulson等人之方法[J. Biol. Chem.,264,17619(1989)]、Lowe等人之方法[Proc. Natl. Acad. Sci.,USA,86,8227(1989)、Genes Develop.,4,1288(1990)]、或日本專利特開平05-336963及國際公開94/23021等所記載之方法，使該基因產物分泌至宿主細胞外。又，亦可依據日本專利特開平2-227075號公報中所記載之方法，利用使用有二氫葉酸還原酶基因等之基因擴增系而使產生量上升。
多肽例如藉由如下方式進行單獨分離、純化。於使多肽以溶解狀態表現於細胞內之情形時，於培養完畢後藉由離心分離回收細胞，懸浮於水系緩衝液中之後，利用超音波粉碎機、弗氏細胞破碎儀(French press)、Manton-Gaulin均質機(Manton-Gaulin homogenizer)、球磨機等將細胞粉碎，而獲得無細胞萃取液。
可單獨或組合使用通常之酶之單獨分離純化法，自藉由將上述無細胞萃取液離心分離所獲得之上清液獲得純化標準品，所述酶之單獨分離純化法係溶劑萃取法、利用硫酸銨等之鹽析法、脫鹽法、利用有機溶劑之沈澱法、使用二乙胺基乙基(DEAE)-瓊脂糖、DIAION HPA-75(三菱化學公司製造)等樹脂之陰離子交換層析法及使用S-瓊脂糖FF(Pharmacia公司製造)等樹脂之陽離子交換層析法、使用丁基瓊脂糖、苯基瓊脂糖等樹脂之疏水性層析法、使用分子篩之凝膠過濾法、親和層析法、層析聚焦法、以及等電聚焦電泳(isoelectric focusing electrophoresis)等電泳法等。又，於多肽在細胞內形成不溶體而進行表現之情形時，同樣地將細胞回收後粉碎，並進行離心分離，藉此以沈澱組分之形式回收該多肽之不溶體。利用蛋白質改性劑使所回收之該多肽之不溶體可溶化。藉由稀釋或透析該可溶化液，使該多肽恢復至正常之立體結構後，可藉由與上述相同之單獨分離純化法獲得多肽之純化標準品。又，本發明中使用之多肽亦可藉由Fmoc法(茀基甲氧羰基法)及tBoc法(第三丁氧基羰基法)等化學合成法而製造。又，亦可利用Advanced ChemTech公司、PerkinElmer公司、Pharmacia公司、Protein Technology Instrument公司、Synthecell-Vega公司、PerSeptive公司、島津製作所等之肽合成機進行化學合成。
(2)動物之免疫與抗體產生細胞之製備對3~20週齡之小鼠、大鼠或倉鼠免疫藉由上述方式製備之抗原，採集該等動物之脾臟、淋巴結、周邊血液中之抗體產生細胞。又，於免疫原性較低，上述動物體內未見充分之抗體效價提昇之情形時，亦有使用CD27敲出動物作為被免疫動物之方法。
免疫係藉由向動物之皮下或者靜脈內或腹腔內一併投予適當之佐劑[例如Freund之完全佐劑(Complete Freund's Adjuvant)及氫氧化鋁與百日咳菌疫苗等]與抗原而進行。於抗原為部分肽之情形時，係與BSA(牛血清白蛋白)及KLH(Keyhole Limpet Hemocyanin，匙孔血藍蛋白)等載體蛋白質製成結合體，並將其用作免疫原。抗原之投予係第1次投予後以1~2週為間隔進行5~10次。於各投予後第3~第7天自眼底靜脈叢採血，藉由酶免疫測定法[Antibodies-A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988]等調查其血清與抗原之反應。提供其血清對用於免疫之抗原顯示出充分之抗體效價的小鼠、大鼠或倉鼠作為脾臟細胞之供給源。當供於脾臟細胞與骨髓瘤細胞之融合時，於抗原物質之最終投予後第3~第7天，自經免疫之小鼠、大鼠或倉鼠摘取脾臟，採集脾臟細胞。將脾臟於MEM培養基(日水製藥公司製造)中切細，用鑷子擢碎，並進行離心分離(1200 rpm，5分鐘)後，去除上清液，利用Tris-氯化銨緩衝液(pH值7.65)處理1~2分鐘而去除紅細胞，利用MEM培養基清洗3次而提供融合用脾臟細胞。
(3)骨髓瘤細胞之製備骨髓瘤細胞係使用自小鼠獲得之株化細胞。例如，可使用8-氮鳥嘌呤耐性小鼠(源自BALB/c)骨髓瘤細胞株P3-X63Ag8-U1(P3-U1)[Current Topics in Microbiology and Immunology,18,1(1978)]、P3-NS1/1-Ag41(NS-1)[European J. Immunology,6,511(1976)]、-SP2/O-Ag14(SP-2)[Nature,276,269(1978)]、P3-X63-Ag8653(653)[J. Immunology,123,1548(1979)]、P3-X63-Ag8(X63)[Nature,256,495(1975)]等。上述細胞株係於添加有8-氮鳥嘌呤培養基[向於RPMI-1640培養基中添加有麩醯胺(1.5 mM)、2-巰基乙醇(5×10-5 M)、健達黴素(10 μg/mL)及胎牛血清(FCS)的培養基(以下稱為正常培養基)中進而添加8-氮鳥嘌呤(15 μg/mL)而成之培養基]中進行繼代，並於細胞融合3~4天前於正常培養基中進行繼代，而於融合當天確保2×107 個以上之細胞數。
(4)細胞融合將上述抗體產生細胞與骨髓瘤細胞利用MEM培養基或PBS(磷酸氫二鈉1.83 g、磷酸二氫鉀0.21 g、食鹽7.65 g、蒸餾水1升、pH值7.2)充分清洗，以細胞數成為抗體產生細胞：骨髓瘤細胞=5~10:1之方式進行混合，並離心分離(1200 rpm，5分鐘)後，去除上清液，將沈澱之細胞群充分擢碎後，一邊攪拌，一邊於37℃下添加聚乙二醇-1000(PEG-1000)2 g、MEM 2 mL及二甲基亞碸0.7 mL之混液0.2~1 mL/108 抗體產生細胞，每隔1~2分鐘添加MEM培養基1~2 mL，數次後，以總量成為50 mL之方式添加MEM培養基。離心分離(900 rpm，5分鐘)後，去除上清液，緩慢地將細胞擢碎後，吸入刻度吸管，將細胞吹出使其緩慢地懸浮於HAT培養基[於正常培養基中添加有次黃嘌呤(10-4 mol/L)、胸苷(1.5×10-5 mol/L)及胺基喋呤(4×10-7 mol/L)之培養基]100 mL中。將該懸浮液以100 μL/孔分注至96孔培養盤中，於5% CO2 培養箱中於37℃下培養7~14天。
培養後，取培養上清液之一部分，藉由下述之結合分析(binding assay)等，使其與含有本發明中使用之多肽的抗原進行反應，選擇不與不含多肽之抗原發生反應者。又，繼而藉由限制稀釋法重複選殖2次[第1次係使用HT培養基(自HAT培養基中去除胺基喋呤之培養基)，第2次係使用正常培養基]，選擇可見穩定且較強之抗體效價者作為單株抗體產生融合瘤株。(5)單株抗體之製備對經異十九烷處理[腹腔內投予2,6,10,14-四甲基十五烷(Pristane)0.5 mL並飼養2週]之8~10週齡之小鼠或裸小鼠，以2×106 ~5×107 細胞/隻腹腔內注射(4)中獲得之抗CD27單株抗體產生融合瘤細胞。融合瘤經10~21天腹水癌化。自上述小鼠採集腹水，進行離心分離(3,000 rpm，5分鐘)並去除固體成分後，利用40~50%硫酸銨進行鹽析後，進行辛酸沈澱法、利用DEAE-瓊脂糖管柱、蛋白質A-管柱或者凝膠過濾管柱之純化，收集IgG或者IgM組分，而製成純化單株抗體。
抗體之亞型之確定係使用亞型鑑定試劑盒並藉由酶免疫測定法而進行。蛋白量之定量係藉由勞立法(Lowry method)並根據280 nm下之吸光度而算出。(6)結合分析抗原係使用如下者：自藉由本項(1)所記載之方法，將含有編碼本發明中使用之CD27多肽的cDNA之表現載體導入大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞、動物細胞等中而獲得之基因導入細胞或重組蛋白質、或人類組織所獲得之純化多肽或部分肽。
於抗原為部分肽之情形時，係與BSA(牛血清白蛋白)及KLH(Keyhole Limpet hemocyanin)等載體蛋白質製成結合體而使用。將該等抗原分注至96孔培養盤中並固相化後，分注被免疫動物血清、產生單株抗體之融合瘤之培養上清液或者純化抗體作為第1抗體而進行反應。利用PBS或PBS-0.05% Tween充分清洗後，分注生物素、酶、經化學發光物質或放射線化合物等標記之抗免疫球蛋白抗體作為第2抗體而進行反應。利用PBS-Tween充分清洗後，進行與第2抗體之標記物質對應之反應。
與識別含有未結合半乳糖之O-結合型糖鏈的CD27且與該細胞外區域結合之單株抗體競爭之抗體，可藉由向上述結合分析系中添加被檢測抗體進行反應而取得。即，於添加有被檢測抗體時，可藉由篩選抑制單株抗體之結合的抗體，而取得在與糖鏈缺乏CD27之細胞外區域結合方面，與所取得之單株抗體競爭之單株抗體。又，與識別糖鏈缺乏CD27且與該細胞外區域結合之單株抗體所識別之抗原決定位相結合的抗體，可藉由如下方式取得：鑑定上述結合分析系所取得之抗體之抗原決定位，製作所鑑定出之抗原決定位之部分糖鏈結合肽、或模擬抗原決定位之立體結構的糖鏈結合肽等，並進行免疫。2.基因重組抗體之製作作為基因重組抗體之製作例，以下揭示人類型嵌合抗體及人類化抗體之製作方法。
(1)基因重組抗體表現用載體之構建所謂基因重組抗體表現用載體，係指組入有編碼人類抗體之CH及CL的DNA之動物細胞用表現載體，其可藉由於動物細胞用表現載體中分別選殖編碼人類抗體之CH及CL之DNA而構建。
人類抗體之C區域可使用任意之人類抗體之CH及CL。例如可列舉：人類抗體之γ1亞型之CH及K型之CL等。作為編碼人類抗體之CH及CL的DNA，可使用包含外顯子與內含子之染色體DNA，亦可使用cDNA，較佳為使用cDNA。作為動物細胞用表現載體，只要為可組入並表現編碼人類抗體之C區域之基因者，則可使用任意者。例如可列舉：pAGE107[Cytotechnol.,3,133(1990)]、pAGE103[J. Biochem.,101,1307(1987)]、pHSG274[Gene,27,223(1984)]、pKCR[Proc. Natl. Acad. Sci. USA,78,1527(1981)]、pSG1bd2-4[Cytotechnol.,4,173(1990)]及pSE1UK1Sed1-3[Cytotechnol.,13,79(1993)]等。
作為動物細胞用表現載體所使用之啟動子，例如可列舉：SV40之初期啟動子[J. Biochem.,101,1307(1987)]、莫洛尼鼠類白血病病毒之LTR[Biochem. Biophys. Res. Commun.,14萬9960(1987)]、免疫球蛋白H鏈之啟動子[Cell,41,479(1985)]。又，作為動物細胞用表現載體所使用之促進子，例如可列舉促進子[Cell,33,717(1983)]等。基因重組抗體表現用載體可使用抗體H鏈及L鏈存在於不同載體上之類型、或存在於同一載體上之類型(串聯型)中之任意者，但就構建基因重組抗體表現載體之容易度、導入至動物細胞中之容易度、以及動物細胞內之抗體H鏈及L鏈之表現量達到均衡等方面而言，較佳為串聯型基因重組抗體表現用載體[J. Immunol. Methods,167,271(1994)]。
作為串聯型基因重組抗體表現用載體，例如可列舉：pKANTEX93[國際公開第97/10354號]及pEE18[Hybridoma,17,559(1998)]等。(2)編碼源自人類以外之動物的抗體之V區域的cDNA之取得及胺基酸序列之分析編碼非人類抗體之VH及VL之cDNA可藉由以下方式取得。
自產生非人類抗體之融合瘤細胞萃取mRNA，合成cDNA。將所合成之cDNA於噬菌體及質粒等載體上進行選殖，而製作cDNA基因庫。使用編碼小鼠抗體之C區域部分或V區域部分之DNA作為探針，自該基因庫分別單獨分離具有編碼VH或VL之cDNA的重組噬菌體或重組質粒。分別確定重組噬菌體或重組質粒上之目標小鼠抗體之VH或VL之全鹼基序列，自鹼基序列分別推測VH或VL之全胺基酸序列。
作為人類以外之動物，只要可製作小鼠、大鼠、倉鼠及兔子等之融合瘤細胞，則可使用任意動物。作為由融合瘤細胞製備全RNA之方法，例如可列舉：硫氰酸胍-三氟乙酸銫法[Methods in Enzymol.,154,3(1987)]等。又，作為試劑盒，例如可列舉RNA easy kit(QIAGEN公司製造)等。
作為由全RNA製備mRNA之方法，例如可列舉寡聚(dT)固定化纖維素管柱法[Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)]等。又，作為試劑盒，例如可列舉OligoTM-dT30<Super>mRNA純化試劑盒(Takara公司製造)等。作為由融合瘤細胞製備mRNA之試劑盒，例如可列舉：Fast Track mRNA分離試劑盒(Invitrogen公司製造)及Quick Prep mRNA純化試劑盒(Pharmacia公司製造)等。作為cDNA之合成及cDNA基因庫製作法，例如可列舉：常規方法方法[Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)；Current Protocols in Molecular Biology,Supplement 1-34]。又，作為市售之試劑盒，例如可列舉使用cDNA合成及質粒選殖用Super ScriptTM質粒系統(Invitrogen公司製造)及ZAP-cDNA合成試劑盒(Stratagene公司製造)之方法等。
於製作cDNA基因庫時，組入以自融合瘤細胞萃取之mRNA作為模板而合成之cDNA的載體只要為可組入該cDNA之載體，則可使用任意者。
例如可使用：ZAP Express[Strategies,5,58(1992)]、pBluescript II SK(+)[Nucleic Acids Research,17,9494(1989)]、λZAPII(Stratagene公司製造)、λgt10、λgt11(1985)]、Lambda BlueMid(Clontech公司製造)、λExCell、pT7T3 18U(Pharmacia公司製造)、pcD2[Mol. Cell. Biol.,3,280(1983)]及pUC18[Gene,33,103(1985)]等。作為導入由噬菌體或質粒載體構建之cDNA基因庫的大腸桿菌，只要為可導入、表現及維持該cDNA基因庫者，則可使用任意者。
例如可使用：XL1-Blue MRF'[Strategies,5,81(1992)]、C600[Genetics,39,440(1954)]、Y1088、Y1090[Science,222,778(1983)]、NM522[J. Mol. Biol.,166,1(1983)]、K802[J. Mol. Biol.,16,118(1966)]及JM105[Gene,38,275(1985)]等。作為編碼源自cDNA基因庫之非人類抗體之VH或VL的cDNA純系之選擇法，可藉由如下方法選擇：使用有經同位素或螢光標記之探針的菌落雜交法或溶菌斑雜交法[Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)]。又，亦可製備引子，以由mRNA合成之cDNA或cDNA基因庫作為模板，藉由聚合酶鏈鎖反應[以下記為PCR法，Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989);Current Protocols in Molecular Biology,Supplement 1-34]，而製備編碼VH或VL之cDNA。
利用適當之限制酶等，將藉由上述方法選擇之cDNA切斷後，於pBluescript SK(-)(Stratagene公司製造)等質粒上進行選殖，進行通常使用之鹼基序列分析方法、例如Sanger,F.等人之雙脫氧法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA,74,5463(1977)]等之反應，使用鹼基序列自動分析裝置、例如A. L. F. DNA定序儀(Pharmacia公司製造)等進行分析，藉此可確定該cDNA之鹼基序列。藉由自所確定之鹼基序列分別推測VH及VL之全胺基酸序列，並與現有之抗體之VH及VL之全胺基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept. Health and Human Services(1991)]進行比較，可分別確認所取得之cDNA編碼了含有分泌訊號序列之抗體的VH及VL之完整之胺基酸序列。
關於含有分泌訊號序列之抗體的VH及VL之完整之胺基酸序列，藉由與現有之抗體之VH及VL之全胺基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept. Health and Human Services(1991)]進行比較，可推測分泌訊號序列之長度及N末端胺基酸序列，進而可得知此等所屬之亞群。又，VH及VL之各CDR之胺基酸序列亦可藉由與現有之抗體之VH及VL之胺基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept. Health and Human Services(1991)]進行比較而找出。
進而，使用VH及VL之完整之胺基酸序列，對任意之資料庫、例如SWISS-PROT及PIR-Protein等進行BLAST法[J. Mol. Biol.,215,403(1990)]等之序列之同源性檢索，可確認所使用之胺基酸序列是否新穎。(3)人類型嵌合抗體表現載體之構建於本項2之(1)中所記載之基因重組抗體表現用載體之編碼人類抗體之CH或CL的各基因之上游分別選殖分別編碼非人類抗體之VH或VL之cDNA，可構建人類型嵌合抗體表現載體。
例如，為了將編碼非人類抗體之VH或VL的cDNA之3'末端側、與人類抗體之CH或CL之5'末端側連接，而製作以連接部分之鹼基序列編碼適當之胺基酸且成為適當之限制酶識別序列之方式設計的VH及VL之cDNA。以將所製作之VH及VL之cDNA以適當形式分別表現於本項2之(1)中所記載之人類化抗體表現用載體之編碼人類抗體之CH或CL的各基因之上游的方式分別進行選殖，可構建人類型嵌合抗體表現載體。又，亦可使用兩端具有適當之限制酶之識別序列的合成DNA，並藉由PCR法分別對編碼非人類抗體VH或VL之cDNA進行擴增，而將該等分別選殖於本項2之(1)中所記載之基因重組抗體表現用載體上。
(4)編碼人類化抗體之V區域的cDNA之構建編碼人類化抗體之VH或VL之cDNA可藉由以下方式構建。首先，分別選擇移植非人類抗體之VH或VL之CDR之胺基酸序列的人類抗體之VH或VL之構架區域(以下記為FR)之胺基酸序列。作為所選擇之FR之胺基酸序列，只要為源自人類抗體者，則可為任意者。
例如可列舉：蛋白質資料庫(Protein Data Bank)等資料庫中所登錄之人類抗體之FR之胺基酸序列、人類抗體之FR之各亞群之同源胺基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept. Health and Human Services(1991)]等。
為了抑制抗體之結合活性降低，而選擇與原抗體之VH或VL之FR之胺基酸序列具有儘可能高之同源性(至少60%以上)的FR之胺基酸序列。其次，於所選擇之人類抗體之VH或VL之FR之胺基酸序列上分別移植原抗體之CDR之胺基酸序列，而分別設計人類化抗體之VH或VL之胺基酸序列。
考慮到可見於抗體之基因之鹼基序列中的密碼子之使用頻率[Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept. Health and Human Services(1991)]，而將所設計之胺基酸序列變換為DNA序列，分別設計編碼人類化抗體之VH或VL之胺基酸序列的DNA序列。基於所設計之DNA序列而合成包含100個鹼基前後之長度的數條合成DNA，並使用此等進行PCR法。於該情形時，較佳為根據PCR之反應效率及可合成之DNA之長度而設計H鏈、L鏈均為6條之合成DNA。
又，藉由在位於兩端之合成DNA之5'末端導入適當之限制酶之識別序列，可於本項2之(1)中所構建之人類化抗體表現用載體上容易地選殖編碼人類化抗體之VH或VL之cDNA。
於PCR反應後，將擴增產物分別選殖於pBluescript SK(-)(Stratagene公司製造)等質粒上，藉由本項2之(2)中所記載之方法確定鹼基序列，而取得具有編碼所需人類化抗體之VH或VL之胺基酸序列的DNA序列之質粒。
(5)人類化抗體之V區域之胺基酸序列之修飾已知人類化抗體於僅將非人類抗體之VH及VL之CDR移植至人類抗體之VH及VL之FR上時，其抗原結合活性與原非人類抗體相比有所降低[BIO/TECHNOLOGY,9,266(1991)]。認為其原因為：於原非人類抗體之VH及VL中，不僅CDR，而且FR內之胺基酸殘基亦直接或間接地與抗原結合活性相關，因此若藉由人類化而將非人類抗體之FR之胺基酸殘基置換為人類抗體之FR之胺基酸殘基，則抗原結合活性會降低。
為了解決該問題而採用如下方法：對於人類化抗體，鑑定人類抗體之VH及VL之FR之胺基酸序列中直接地和與抗原之結合相關的胺基酸殘基、與CDR之胺基酸殘基相互作用之胺基酸殘基、及維持抗體之立體結構而間接地和與抗原之結合相關的胺基酸殘基，並將此等胺基酸殘基置換為原非人類抗體之胺基酸殘基，藉此使降低之抗原結合活性上升[BIO/TECHNOLOGY,9,266(1991)]。於人類化抗體之製作中，為了高效率地鑑定此等與抗原結合活性相關之FR之胺基酸殘基，而藉由X射線結晶分析[J. Mol. Biol.,112,535(1977)]或電腦模擬[ProteinEngineering,7,1501(1994)]等來構建及分析抗體之立體結構。
該等抗體之立體結構之資訊可帶來大量對人類化抗體之製作有益之資訊，但另一方面，可應用於所有抗體之人類化抗體之製作法尚未確立，目前之現狀為，需要針對各抗體製作數種修飾體，進行各自與抗原結合活性之相關性之研究等各種錯誤嘗試。人類抗體之VH及VL之FR之胺基酸殘基可藉由使用修飾用合成DNA並利用本項2之(4)中所記載之PCR法進行修飾。針對PCR後之擴增產物，藉由本項2之(2)中所記載之方法，確定鹼基序列，而確認實施有目標修飾。(6)人類化抗體表現載體之構建可於本項2之(1)中所記載之基因重組抗體表現用載體之編碼人類抗體之CH或CL的各基因之上游，分別選殖所構建之編碼基因重組抗體之VH或VL的cDNA，而構建人類化抗體表現載體。
例如，可於本項2之(4)及(5)中構建人類化抗體之VH或VL時所使用之合成DNA中，在位於兩端之合成DNA之5'末端導入適當之限制酶之識別序列，藉此以如下方式分別進行選殖：此等以適當之形式表現於本項2之(1)中所記載之人類化抗體表現用載體之編碼人類抗體之CH或CL的各基因之上游。
(7)基因重組抗體之短暫表現(transient expression)為了有效地評價所製作之多種人類化抗體之抗原結合活性，可使用本項2之(3)及(6)中所記載之基因重組抗體表現載體、或修飾此等而成之表現載體，進行基因重組抗體之短暫表現。作為導入表現載體之宿主細胞，只要為可表現基因重組抗體之宿主細胞，則可使用任何細胞。其中，較佳為根據其表現量之高度，一般使用COS-7細胞(ATCC CRL1651)[Methods in Nucleic Acids Res.,CRC press,283(1991)]。
作為向COS-7細胞中導入表現載體之方法，例如可列舉：DEAE-葡聚糖法[Methods in Nucleic Acids Res.,CRC press,283(1991)]、脂質體轉染法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA,84,7413(1987)]等。於導入表現載體後，培養上清液中之基因重組抗體之表現量及抗原結合活性可藉由酶免疫抗體法[以下記為ELISA法，Monoclonal Antibodies-Principles and practice,Third edition,Academic Press(1996)、Antibodies-A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)、單株抗體實驗指南　講談社科學(1987)]等進行測定。(8)基因重組抗體之穩定表現可藉由將本項2之(3)及(6)中所記載之基因重組抗體表現載體導入適當之宿主細胞中，而獲得穩定地表現基因重組抗體之轉形株。
作為向宿主細胞中導入表現載體之方法，可列舉電穿孔法[日本專利特開平2-257891、Cytotechnology,3,133(1990)]等。
作為導入基因重組抗體表現載體之宿主細胞，只要為可表現基因重組抗體之宿主細胞，則可使用任何細胞。例如可列舉：小鼠SP2/0-Ag14細胞(ATCC CRL1581)、小鼠P3X63-Ag8. 653細胞(ATCC CRL1580)、2種作為中國倉鼠卵巢細胞之CHO/dhFr-細胞(ATCC CRL9096)及CHO/DG44細胞[Somatic Cell and Molecular Genetics,12,555(1986)]、獲得凝集素耐性之Lec13[Somatic Cell and Molecular Genetics,12,55(1986)]、α1,6-岩藻糖轉移酶基因缺失之CHO細胞(國際公開第05/35586號、國際公開第02/31140號)及大鼠YB2/3HL. P2. G11. 16Ag. 20細胞(ATCC CRL1662)等。
除上述宿主細胞以外，亦可使用：與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖之合成相關的酶等蛋白質、和N-糖苷鍵複合型糖鏈之還原末端之N-乙醯基葡萄糖胺之6位與岩藻糖之1位α鍵結之糖鏈修飾相關的酶等蛋白質、或與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖向高爾基體之輸送相關的蛋白質等之活性降低或缺損之宿主細胞，較佳為國際公開第05/35586號、國際公開第02/31140號等中所記載之α1,6-岩藻糖轉移酶基因缺失之CHO細胞等。
於導入表現載體後，穩定地表現基因重組抗體之轉形株可藉由依據日本專利特開平2-257891號公報中所揭示之方法，於含有G418硫酸鹽(以下記為G418，SIGMA公司製造)等藥劑之動物細胞培養用培養基中進行培養而選擇。作為動物細胞培養用培養基，可使用：RPMI1640培養基(Invitrogen公司製造)、GIT培養基(日本製藥公司製造)、EX-CELL301培養基(JRH公司製造)、IMDM培養基(Invitrogen公司製造)、Hybridoma-SFM培養基(Invitrogen公司製造)、或向該等培養基中添加胎牛血清(以下記為FCS)等各種添加物而成之培養基等。藉由將所獲得之轉形株於培養基中進行培養，可使基因重組抗體表現蓄積於培養上清液中。培養上清液中之基因重組抗體之表現量及抗原結合活性可藉由ELISA法等進行測定。又，轉形株可依據日本專利特開平2-257891號公報中所揭示之方法，利用DHFR擴增系等，使基因重組抗體之表現量上升。
基因重組抗體可使用蛋白質A管柱自轉形株之培養上清液中純化[Monoclonal Antibodies-Principles and practice,Third edition,Academic Press(1996)、Antibodies-A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]。又，此外可使用通常用於蛋白質純化之純化方法。例如可將凝膠過濾、離子交換層析法及超濾等組合進行而進行純化。
經純化之基因重組抗體之H鏈、L鏈或抗體分子整體之分子量可藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳[以下記為SDS-PAGE，Nature,227,680(1970)]及西方墨點法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice,Third edition,Academic Press(1996)、Antibodies-A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory(1988)]等進行測定。3.本發明之抗體或抗體片段之活性評價經純化之本發明之抗體或抗體片段之反應特異性可藉由下述方式進行評價。可將表現正常型糖鏈之細胞、及如下細胞株作為宿主，而分別製作使編碼CD27之鹼基序列(序列編號1)表現之CD27表現細胞，該細胞株係於O-結合型糖鏈合成過程中，於多肽上之Ser/Thr上所結合的GalNAc上附加Gal之酶、與該酶之活性相關之蛋白質或與尿苷二磷酸半乳糖(UDP-galactose)之輸送相關的蛋白質等之活性降低或缺損者。
如此製作表現有具有正常O-結合型糖鏈之CD27之細胞、表現有糖鏈缺乏CD27之細胞，可藉由ELISA法及螢光抗體法[Cancer Immunol. Immunother.,36,373(1993)]等測定各表現CD27之細胞株與純化抗體之反應性。又，可藉由將CD27之細胞外區域製成融合蛋白質等可溶化體，分別於上述宿主細胞中進行表現，並於適當之條件下進行純化，而分別製備保持立體結構之CD27可溶型蛋白質。作為融合蛋白質，可列舉：將CD27蛋白質與抗體恆定區域(亦稱為Fc)、GST標籤、組胺酸標籤(亦稱為His標籤)或Myc標籤等其他多肽融合而成者。該融合蛋白質可藉由使用蛋白質A、鎳管柱、特異性抗體管柱等親和性管柱進行分離純化。
亦可藉由利用表面離體子共振(SPR)之BIAcoreTM、ELISA法及免疫沈澱法等測定該等純化CD27可溶型蛋白質與純化抗體之反應性[Monoclonal Antibodies-Principles and practice,Third edition,Academic Press(1996)、Antibodies-A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]。針對表現糖鏈缺乏CD27之培養細胞株的細胞毒殺活性,可藉由公知之方法[Cancer Immunol. Immunother.,36,373(1993)]測定CDC活性及ADCC活性等，並進行評價。4.使用本發明之特異性識別糖鏈缺乏CD27且與該細胞外區域結合之單株抗體抗體或其抗體片段的疾病之診斷方法藉由使用本發明之抗體或該抗體片段來檢測或定量表現有糖鏈缺乏CD27或該多肽之細胞，可診斷與糖鏈缺乏CD27相關之疾病。
作為與糖鏈缺乏CD27相關之疾病，只要為於生物體內可見表現糖鏈缺乏CD27多肽之細胞的疾病，則包括任何疾病。具體可列舉IgA腎病或癌。作為癌，例如可列舉源自B或T細胞分化過程之癌。具體而言，例如可列舉：被套細胞淋巴癌、慢性淋巴性白血病、小淋巴性白血病、包氏淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、黏膜相關淋巴組織淋巴瘤、瀰漫性大細胞淋巴瘤及漿細胞瘤等各種非何傑金氏淋巴瘤等。
於本發明中，作為成為檢測或測定糖鏈缺乏CD27多肽之對象的生物樣本，只要為組織細胞、血液、血漿、血清、胰液、尿、糞便、組織液及培養液等可能含有該多肽者，則並無特別限定。與糖鏈缺乏CD27相關之疾病中，例如IgA腎病之診斷可藉由以下方式進行。針對自複數名健康人之生物體所採集之生物樣本，使用本發明之抗體或該抗體片段、或該等之衍生物，並使用下述免疫學手法，進行糖鏈缺乏CD27多肽之檢測或測定，而確認健康人之生物樣本中之該多肽之表現量。同樣地調查受檢者之生物樣本中該多肽之表現量，將其表現量與健康人之表現量進行比較。於受檢者之該多肽之表現量與健康人相比有所增加之情形時，可診斷為IgA腎病，或將來罹患IgA腎病之可能性較高。與糖鏈缺乏CD27相關之疾病中，例如癌之診斷可藉由以下方式進行。
針對自複數名健康人之生物體所採集之生物樣本，使用本發明之抗體或該抗體片段、或該等之衍生物，並使用下述免疫學手法，進行糖鏈缺乏CD27之檢測或測定，而確認健康人之生物樣本中之該多肽之表現量。同樣地調查受檢者之生物樣本中該多肽之表現量，將其表現量與健康人之表現量進行比較。於受檢者之該多肽之表現量與健康人相比有所增加之情形時，可診斷癌為陽性。
含有本發明之抗體或該抗體片段、或該等之衍生物的診斷藥，亦可根據目標之診斷方法，而含有用於進行抗原抗體反應之試劑、該反應之檢測用試劑。作為用於進行抗原抗體反應之試劑，例如可列舉緩衝劑及鹽等。作為檢測用試劑，可列舉：抗體或者該抗體片段、或該等之衍生物、或識別該等之衍生物的經標記之二次抗體、標記物之受質等通常之免疫學檢測或測定法中所使用之試劑。
於本發明中，作為檢測或測定糖鏈缺乏CD27之量的方法，可列舉任意之公知方法。例如可列舉免疫學檢測及測定方法等。所謂免疫學檢測或測定方法，係指使用經標記之抗原或抗體來檢測或測定抗體量或抗原量之方法。作為免疫學檢測或測定方法，可列舉：放射性物質標記免疫抗體法(RIA)、酶免疫測定法(EIA或ELISA)、螢光免疫測定法(FIA)、發光免疫測定法(luminescent immunoassay)、西方墨點法及物理化學手法(例如TIA、LAPIA、PCIA等)等。作為放射性物質標記免疫抗體法(RIA)，例如可列舉：使抗原或表現有抗原之細胞等與本發明之抗體或該抗體片段反應，進而與經放射線標記之抗免疫球蛋白抗體或結合片段反應後，利用閃爍計數器等進行測定之方法。作為酶免疫測定法(ELA或ELISA)，例如可列舉：使抗原或表現有抗原之細胞等與本發明之抗體或該抗體片段反應，進而與經標記之抗免疫球蛋白抗體或結合片段反應後，利用吸光光度計測定顯色色素之方法；例如可使用三明治ELISA法等。
作為酶免疫測定法中使用之標記物，如上所述，可使用任意之公知(石川榮次等人編纂，酶免疫測定法，醫學書院)之酶標記。例如可使用：鹼性磷酸酶標記、過氧化酶標記、螢光酶標記及生物素標記等。三明治ELISA法係使抗體與固相結合後，捕捉欲檢測或測定之抗原，使被捕捉之抗原與第2抗體進行反應的方法。於該ELISA法中，準備係識別欲檢測或測定之抗原的抗體或抗體片段且抗原識別部位不同之2種抗體，其後，使一種抗體或抗體片段預先吸附於培養盤(例如96孔培養盤)上，再利用FITC等螢光物質、過氧化酶等酶、生物素等標記第2抗體或抗體片段。
使吸附有上述抗體之培養盤與自生物體內分離之細胞或其粉碎液、組織或其粉碎液、細胞培養上清液、血清、胸水、腹水、眼液等進行反應後，與經標記之單株抗體或抗體片段反應，並進行與標記物質對應之檢測反應。於藉由上述方法測定試驗樣本中之抗原濃度之情形時，可根據階段性地稀釋濃度已知之抗原而製作之校正曲線，算出試驗樣本中之抗原濃度。
作為三明治ELISA法中使用之抗體，例如可使用多株抗體、單株抗體中之任一者，亦可使用：Feb、Fab'、F(ab)2 等抗體片段。作為三明治ESA法中使用之2種抗體之組合，可為識別不同抗原決定位之單株抗體或抗體片段之組合，亦可為多株抗體與單株抗體或抗體片段之組合。
作為螢光免疫測定法(FIA)，可列舉文獻[MonoclonalAntibodies-Principles and practice,Third edition,Academic Press(1996)、單株抗體實驗指南講談社科學(1987)]等中所記載之方法。作為螢光免疫測定法中使用之標記物，如上所述，可使用任意之公知(川生明著，螢光抗體法，Soft Science社)之螢光標記。例如可使用FITC標記及RITC標記等。作為發光免疫測定法(luminescent immunoassay)，例如可使用[Monoclonal Antibodies-Principles and practice,Third edition,Academic Press(1996)、單株抗體實驗指南講談社科學(1987)]等中所記載之方法進行。作為發光免疫測定法中使用之標記物，如上所述，可使用任意之公知[今井一洋編纂，生物發光與化學發光，廣川書店，臨床檢查42(1998)]之發光體標記。例如可使用：吖啶酯標記及咯吩標記等。
西方墨點法係如下方法：藉由SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳[Antibodies-A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory,1988)]將抗原或表現抗原之細胞等分步分離後，將該凝膠轉漬至PVDF膜或硝化纖維素膜上，使該膜與識別抗原之抗體或抗體片段反應，進而與經FITC等螢光物質、過氧化酶等酶、生物素等標記之抗小鼠IgG抗體或結合片段反應後，使該標記可見化，藉此進行確認。以下揭示西方墨點法之一例。
將表現有具有序列編號2所示之胺基酸序列的多肽之細胞或組織溶解，於還原條件下以每條泳道之蛋白質量為0.1~30 μg之條件藉由SDS-PAGE法進行泳動。將泳動之蛋白質轉印至PVDF膜上，於室溫下使其與含有1% BSA之PBS(以下記為BSA-PBS)反應30分鐘而進行阻斷操作。在此，使本發明之單株抗體反應，利用含有0.05%之Tween-20之PBS(以下記為Tween-PBS)進行清洗，於室溫下使其與經過氧化酶標記之山羊抗小鼠IgG反應2小時。利用Tween-PBS進行清洗，使用ECLTM西方墨點偵測試劑(Amersham公司製造)等檢測結合有單株抗體之條帶，藉此可檢測具有序列編號2所示之胺基酸序列的多肽。作為西方墨點之檢測中所使用之抗體，係使用可與未保持天然型立體結構之多肽相結合之抗體。所謂物理化學手法，具體而言，係藉由如下方式進行：使用本發明之抗體或該抗體片段，使結合缺失作為抗原之半乳糖的O型糖鏈之CD27與本發明之抗體或該抗體片段結合，而形成凝聚體，並檢測該凝聚體。
作為此外之物理化學手法，例如可列舉：毛細管法、單向免疫擴散法(single radial immunodiffusion)、免疫比濁法(turbidimetric immunoassay)及乳膠免疫比濁法等[臨床檢查法提要，金原出版，499(1998)]。例如於乳膠免疫比濁法中，若使用使抗體或抗原過敏之粒徑為0.1~1 μm左右之聚苯乙烯乳膠等載體，利用對應之抗原或抗體引起抗原抗體反應，則反應液中之散射光增加，透射光減少。藉由測定吸光度或積分球濁度而檢測該變化，可測定試驗樣本中之抗原濃度等。
本發明之抗體或該抗體片段由於可與糖鏈缺乏CD27多肽之細胞外區域結合，故而適用於表現有該多肽之細胞之檢測。表現有該多肽之細胞之檢測可採用公知之免疫學檢測法，較佳為使用免疫沈澱法、免疫細胞染色法、及免疫組織染色法等。又，亦可採用使用FMAT8100HTS系統(Appliedbiosystems公司製造)之螢光抗體染色法等。所謂免疫沈澱法，係指使表現有該多肽之細胞等與本發明之單株抗體或抗體片段反應後，添加蛋白質G-岩藻糖等具有與免疫球蛋白特異性結合之能力的載體，而使抗原抗體複合體沈澱之方法。或者，亦可藉由如下方法來進行。
於ELISA用96孔培養盤上固定上述本發明之抗體或該抗體片段後，藉由BSA-PBS進行阻斷。於為抗體未經純化之狀態之例如融合瘤株培養上清液等未經純化之狀態之情形時，係將抗小鼠免疫球蛋白或者大鼠免疫球蛋白或蛋白質A或者G等預先固定在ELISA用96孔培養盤上，並利用BSA-PBS進行阻斷後，分注融合瘤株培養上清液而進行結合。
去除BSA-PBS，利用PBS充分地清洗後，使之與表現有具有序列編號2所示之胺基酸序列的多肽之細胞或組織之溶解液進行反應。利用SDS-PAGE用樣本緩衝液，自充分地清洗後之培養盤萃取免疫沈澱物，並藉由上述西方墨點法進行檢測。
所謂免疫細胞染色法及免疫組織染色法係指螢光抗體染色法(流式細胞儀)，該螢光抗體染色法係視情況為改良抗體之通透性而利用界面活性劑及甲醇等對表現有抗原之細胞或組織等進行處理後，使之與本發明之抗體反應，進而與施加有FITC等螢光標記、過氧化酶等酶標記、生物素標記等的抗免疫球蛋白抗體或結合片段反應後，使該標記可見化，利用顯微鏡進行顯微，或使經螢光標記之抗體與細胞反應，再利用流式細胞儀進行分析。例如，可使用文獻[Monoclonal Antibodies-Principles and practice,Third edition,Academic Press(1996)、單株抗體實驗指南講談社科學(1987)]等中所記載之方法來進行。
尤其是，由於本發明之抗體或該抗體片段可與糖鏈缺乏CD27之細胞外區域結合，故而可較佳地用於檢測在細胞膜上保持天然型立體結構而表現之CD27的流式細胞儀之分析。又，藉由使用利用螢光抗體染色法之原理的FMAT8100HTS系統(Appliedbiosystems公司製造)，可在不將所形成之抗體-抗原複合體、和與抗體-抗原複合體之形成無關的游離之抗體或抗原分離的情況下測定抗原量或抗體量。
5.使用本發明之特異性識別、結合糖鏈缺乏CD27多肽之單株抗體或該抗體片段的疾病之治療方法本發明之特異性識別糖鏈缺乏CD27多肽且與該細胞外區域結合之單株抗體或其抗體片段，可用於與糖鏈缺乏CD27多肽相關之疾病之治療。
作為與糖鏈缺乏CD27多肽相關之疾病，只要為於生物體內可見表現該多肽之細胞的疾病，則可為任意疾病，例如可列舉IgA腎病及癌等。進而，作為該疾病，亦可列舉：罹患IgA腎病，呈現腎病症候群之疾病及呈現腎衰竭之疾病。作為癌，例如可列舉：源自造血器官之腫瘤(亦稱為血液癌)及源自上皮之實體癌。作為血液癌，具體而言，例如可列舉：白血病及淋巴瘤(Hodgkin lymphoma、non-Hodgkin lymphoma)多發性骨髓瘤等。
作為具體之非何傑金氏淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)，例如可列舉：被套細胞淋巴癌、慢性淋巴性白血病、小淋巴性白血病、包氏淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、黏膜相關淋巴組織淋巴瘤、瀰漫性大細胞淋巴瘤及漿細胞瘤等。
作為實體癌，具體而言，例如可列舉：乳癌、子宮癌、大腸癌、胃癌、卵巣癌、肺癌、腎臟癌、直腸癌、甲狀腺癌、子宮頸癌、小腸癌、攝護腺癌及胰臟癌等。作為本發明之治療劑，可列舉以本發明之抗體或該抗體片段作為有效成分之癌治療劑。具有ADCC活性及CDC活性等效應活性之癌治療劑、以及藉由細胞凋亡誘導作用之癌治療劑等亦包含在本發明之治療劑中。
本發明之抗體或該抗體片段由於可識別表現於細胞膜上之糖鏈缺乏CD27多肽，故而可識別生物體內存在之表現有糖鏈缺乏CD27多肽之細胞。因此，為本發明之抗體或該抗體片段且具有效應活性之抗體或該抗體片段，可於活體內及活體外毒殺表現有糖鏈缺乏CD27多肽之細胞。又，此種本發明之抗體或該抗體片段由於可毒殺生物體內之糖鏈缺乏CD27多肽表現細胞而使其減少，故而可特別有效地用作治療劑。
含有本發明之抗體或該抗體片段、或該等之衍生物的治療劑可為僅含有作為有效成分之該抗體或者該抗體片段、或該等之衍生物者，但通常期待與藥理學上所容許之1種以上之載體一併混合，而提供藉由於製劑學之技術領域中已知之任意方法所製造之醫藥製劑。投予途徑較佳為使用治療時最有效之途徑，可列舉：經口投予、或口腔內、呼吸道內、直腸內、皮下、肌肉內及靜脈內等非經口投予。於採用抗體或肽製劑之情形時，較佳可列舉靜脈內投予。
作為投予形態，例如可列舉：噴霧劑、膠囊劑、錠劑、顆粒劑、糖漿劑、乳劑、栓劑、注射劑、軟膏及貼劑等。作為適於經口投予之製劑，例如可列舉：乳劑、糖漿劑、膠囊劑、錠劑、散劑、顆粒劑等。乳劑及糖漿劑之類的液體製備物可使用水、蔗糖、山梨糖醇及果糖等糖類，聚乙二醇及聚丙二醇等二醇類，芝麻油、橄欖油及大豆油等油類，對羥基苯甲酸酯類等防腐劑，草莓香料及胡椒薄荷等香料類等作為添加劑而製造。
膠囊劑、錠劑、散劑及顆粒劑等可使用乳糖、葡萄糖、蔗糖及甘露糖醇等賦形劑，澱粉及海藻酸鈉等崩散劑，硬脂酸鎂及滑石粉等潤滑劑，聚乙烯醇、羥丙基纖維素及明膠等黏合劑，脂肪酸酯等界面活性劑，以及甘油等塑化劑等作為添加劑而製造。
作為適於非經口投予之製劑，例如可列舉：注射劑、栓劑及噴霧劑等。注射劑係使用包含鹽溶液及葡萄糖溶液以及兩者之混合物的載體等而製備。栓劑係使用可可油脂、氫化脂肪或羧酸等載體而製備。又，噴霧劑係使用該抗體或抗體片段本身，或者使用不會刺激使用者之口腔及呼吸道黏膜且使該抗體或抗體片段以微細粒子之形式分散而使其變得容易吸收的載體等而製備。作為載體，具體而言，可例示：乳糖、甘油等。根據抗體或抗體片段及所使用之載體之性質，可為氣霧劑及乾粉劑等製劑。又，該等非經口劑中亦可添加於經口劑中作為添加劑而例示之成分。
投予量或投予次數根據目標治療效果、投予方法、治療時間、年齡、體重等而有所不同，通常成人每日10 μg/kg~8 mg/kg。
根據本發明，可提供特異性識別含有未結合半乳糖之O-結合型糖鏈之CD27且與該細胞外區域結合之單株抗體或該抗體片段、產生該抗體之融合瘤、編碼該抗體之DNA、含有該DNA而成之載體、將該載體轉形而獲得之轉形體、使用該融合瘤或轉形體之抗體或該抗體片段之製造方法、以及含有該抗體或抗體片段作為有效成分之與CD27相關之疾病之診斷藥或治療藥。以下，藉由實施例更加具體地說明本發明，但本發明並不限定於下述實施例。
[實施例][實施例1]含有未結合半乳糖之O-結合型糖鏈的可溶型CD27細胞外區域之製作(以下有時亦記載為糖鏈缺乏CD27)(1)人類CD27基因之選殖按照以下程序，由自Clontech公司購買之源自人類周邊血液之cDNA基因庫中單獨分離出編碼CD27之基因。於1倍濃度之BD Advantage PCR緩衝液(Clontech公司製造)及1倍濃度之含有隨附dNTP之反應液中，使用25 ng之源自人類周邊血液單核細胞之單鏈cDNA、0.2 μmol/L之cd27fw(序列編號3)、0.2 μmol/L之cd27809B(序列編號4)及1倍濃度之Advantage 2 PCR聚合酶混合物(Clontech公司製造)，於合計為50 μL之條件下進行PCR反應。
反應條件係以98℃下15秒鐘、68℃下30秒鐘為一個循環，進行30個循環。藉由2%瓊脂糖凝膠電泳將該反應液分離後，使用TOPO TA選殖試劑盒(Invitrogen公司製造)並依據隨附之使用說明書將約1 kbp之PCR產物插入至pCR-2.1載體中。使用插入有PCR擴增片段之質粒將大腸桿菌轉形，製備自各純系獲得之質粒，並確認DNA序列，結果取得具有序列編號1所記載之DNA序列的pCR 2.1 CD27(圖1)。(2)將具有人類CD27細胞外區域之基因選殖而成之質粒之構建其次，藉由進行以下所示之PCR反應，而將編碼去除存在於C末端側之跨膜區域的CD27之cDNA單獨分離。於含有0.2 mmol/L之dNTPs、1 mmol/L氯化鎂之反應液中，使用1 ng之pCR 2.1 CD27、1 μmol/L之CD27-A(序列編號5)、1 μmol/L之CD27-B(序列編號6)及2.5單位之KOD聚合酶(東洋紡公司製造)，於合計為50 μL，以98℃下15秒鐘、68℃下30秒鐘為一個循環而進行25個循環之條件下進行PCR反應。
藉由2%瓊脂糖凝膠電泳將該反應液分離後，使用Zero Blunt PCR選殖試劑盒(Invitrogen公司製造)並依據隨附之使用說明書，將約600 bp之PCR產物導入至pCR-Blunt載體中。將由具有本人類CD27細胞外區域之基因選殖而成之質粒設為pCRCD27axb(圖2)(3)具有變異型人類IgG4Fc區域之載體pBShCγ4SP之構建使用國際公開第97/10354號中所記載之具有編碼野生型人類IgG4亞型之C區域的cDNA之質粒pBShCγ4，而具有構建野生型人類IgG4亞型之C區域(鉸鏈區域)之第108號之Ser被置換為Pro之變異型人類IgG4亞型的C區域之質粒pBShCγ4SP。已知，藉由進行本修飾，可使經由IgG鉸鏈區域之二聚物之形成變得穩定(Mol. Immunol.,30,105,1993)。
製備含有1 ng之質粒pBShCγ4之50 μL反應液[10 mM Tris-HCl(pH值8.3)、50 mM之氯化鉀、1.5 mM氯化鎂、0.001%明膠、200 μM之dNTPs、0.5 μM之引子1(序列編號7)、0.5 μM之引子2(序列編號8)及2單位之TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶]作為模板，使用GeneAmp PCR system 9700(PerkinElmer公司製造)，以94℃下2分鐘、55℃下2分鐘、72℃下2分鐘為一個循環而進行30個循環。使用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen公司製造)並依據隨附之使用說明書將反應液純化後，利用制限酶EcoT14I(TAKARA BIO公司製造)進行處理，並藉由0.8%瓊脂糖凝膠電泳進行分離後，使用QIAquick Gel萃取試劑盒(Qiagen公司製造)並依據隨附之使用說明書回收擴增片段。
利用制限酶EcoT14I將質粒pBShCγ4切斷後，藉由鹼性磷酸酶(TAKARA BIO公司製造)處理而去除5'末端之磷酸，同樣地藉由0.8%瓊脂糖凝膠電泳進行分離後，使用QIAquick Gel萃取試劑盒並依據隨附之使用說明書回收質粒片段。將所回收之擴增片段與源自質粒pBShCγ4之質粒片段連接，而構建含有目標cDNA之質粒pBShCγ4SP(圖3)。
(4)含有人類IgG4Fc之部分序列的cDNA之選殖藉由進行以下所示之PCR反應，而將編碼於5'末端具有制限酶BamHI位點且於3'末端具有SalI制限酶之人類IgG4Fc的DNA片段擴增。於含有0.2 mmol/L之dNTPs、1 mmol/L氯化鎂之反應液中，使用25 ng之上述(3)中所構建之pBShCγ4SP、1 μmol/L之g4A(序列編號9)、1 μmol/L之g4B(序列編號10)及2.5單位之KOD聚合酶(東洋紡公司製造)，於合計為50 μL之條件下進行PCR反應。反應條件係以98℃下15秒鐘、68℃下30秒鐘為一個循環而進行25個循環。藉由2%瓊脂糖凝膠電泳將該反應液分離後，使用Zero Blunt PCR選殖試劑盒(Invitrogen公司製造)並依據隨附之使用說明書將約700 bp之PCR產物導入至pCR-Blunt載體中。將本質粒設為pCRIgG4FcBamHISalI(圖4)。
(5)動物細胞用表現載體pKANTEX XhoI/SalI之構建利用制限酶XhoI(TARARA BIO公司製造)及制限酶SalI(TAKARA BIO公司製造)將國際公開第97/10354號中所記載之人類化抗體表現載體pKANTEX93消化後，藉由0.8%瓊脂糖凝膠電泳進行分離，其後使用Gel萃取試劑盒(Qiagen公司製造)回收約9.8 kbp之質粒片段。使用DNA連接試劑盒(TAKARA BIO公司製造)將所回收之DNA片段之5'及3'末端連接，使用所獲得之重組質粒DNA將大腸桿菌DH5α株(東洋紡績公司製造)轉形。使用QIAprep Spin小量提取試劑盒(Qiagen公司製造)，自所獲得之複數個安比西林耐性菌落中單獨分離出重組質粒DNA，藉由制限酶NotI(TAKARA BIO公司製造)及KpnI(TAKARA BIO公司製造)消化確認抗體L鏈之表現單元已去除。將該質粒命名為pKANTEX XhoI/SalI(圖5)。
(6)可溶型CD27細胞外區域表現質粒pKANTEX CD27IgG4Fc之製作將使用NotI及BamHI消化上述(2)中所製作之pCR 2.1 CD27axb而獲得的約600 bp之片段、及使用BamHI及SalI消化上述(3)中所製作之pCRIgG4FcBamHISalI而獲得的約700 bp之DNA片段，與使用NotI及SalI消化上述(5)中所獲得之pKANTEX XhoI/SalI而獲得的約8.8 kbp之DNA片段相連接，藉此獲得用於表現CD27-Fc之質粒pKANTEX CD27IgG4Fc(圖6)。由本質粒編碼之可溶型CD27-Fc融合蛋白質(以下有時亦記載為CD27-Fc)之基因序列記載於序列編號11，將胺基酸序列記載於序列編號12。將使用該表現載體進行轉形之大腸桿菌接種至100 mL之LB培養基中，培養一晚後將其回收，使用Qiafilter Plasmid midi kit(Qiagen公司製造)並依據隨附之操作說明書將質粒純化。純化後，藉由制限酶AatII消化使30 μg之質粒載體線狀化。線狀化後，進行苯酚/氯仿萃取、乙醇沈澱，並溶解於濃度為1/10之TE緩衝液(1 mM之Tris HCl(三羥甲基胺基甲烷鹽酸鹽)，0.1 mM之EDTA)後，測定DNA濃度，供基因導入。
(7) CD27-Fc之表現向CHO/DG44細胞(Somatic Cell and Molecular Genetics,12,555(1986)，以下記為DG44)或者Lec8細胞中導入CD27-Fc表現質粒pKANTEX CD27IgG4Fc，係依據電穿孔法[Cytotechnology,3,133(1990)]並按照以下程序進行。首先，使於添加有基本培養基[10%胎牛透析血清(Invitrogen公司)及50 μg/mL之健大黴素(Nacalai Tesque公司)及1×HT supplement(Invitrogen公司製造)之伊思考夫改良杜貝可培養基(Iscove's Modified Dulbecco's Medium，Invitrogen公司)]中進行繼代之DG44細胞懸浮於K-PBS緩衝液[137 mmol/L之KCl、2.7 mmol/L之NaCl、8.1 mmol/L之Na2 HPO4 、1.5 mmol/L之KH2 PO4 、4.0 mmol/L之MgCl2 ]，製成8×106 個/mL而製備細胞懸浮液。
將所製備之細胞懸浮液200 μL(1.8×106 個)與10 μg上述(6)中所製備之線狀化質粒pKANTEXCD27IgG4Fc混合。其中，Lec8細胞之繼代係於未添加1×HT supplement之基本培養基(以下記為HT-培養基)中進行。將該細胞DNA混合液轉移至Gene Pulser Cuvette(電極間距2 mm)(BIO-RAD公司)中之後，使用基因導入裝置Gene Pulser(BIO-RAD公司)，於脈衝電壓為0.35 KV、電容為250 μF之條件下進行基因導入。
將該細胞懸浮液混合至10 mL之HT-培養基[添加有10%胎牛透析血清(Invitrogen公司製造)及50 μg/mL健大黴素(Nacalai Tesque公司)之伊思考夫改良杜貝可培養基(Invitrogen公司製造)]中，並接種至75 cm2 接著細胞用燒瓶(Greiner公司製造)中，於37℃、5% CO2 培養箱內進行培養。培養3天後，以最終濃度成為0.5 mg/mL之方式添加G418(Sigma公司製造)，進一步培養10天。
10天後，於182 cm2 接著細胞用燒瓶(Greiner公司製造)中進行繼代，持續培養直至達到融合。於達到融合之時刻，將培養基換成無血清培養基EXCELL301(JRH Bioscience公司製造)，培養1週後，回收培養上清液，藉由下文記載之方法進行純化。
(8)CD27-Fc之純化將(7)中經培養之培養上清液於3000 rpm、4℃之條件下進行10分鐘離心分離，回收上清液後，使用孔徑為0.22 μm之PES膜(Asahi Techno Glass公司製造)對上清液進行過濾。向直徑為0.8 cm之管柱中填充0.5 mL之Mab Select(Amersham Pharmacia Biotech公司製造)，並依序通入純化水3.0 mL及0.2 M之硼酸-0.15 M之NaCl緩衝液(pH 7.5)(以下記為硼酸緩衝液)3.0 mL。進而，藉由依序利用0.1 M之檸檬酸緩衝液(pH值3.5)2.0 mL及硼酸緩衝液1.5 mL進行清洗，而進行載體之平衡化。其次，將上述培養上清液通入管柱後，利用硼酸緩衝液3.0 mL進行清洗。清洗後，使用0.1 M之檸檬酸緩衝液(pH值3.5)1.25 mL使載體上所吸附之抗體溶出。溶出係以250 μL為一組分，分5個組分取得。其次，進行所獲得之純化組分之SDS-PAGE分析，合併確認有目標蛋白質之溶出的組分，使用PBS緩衝液，於4℃下進行一晝夜透析。
透析後，回收CD27-Fc溶液，使用孔徑為0.22 μm之Millex GV(MILLIPORE公司)進行殺菌過濾後，使用吸光光度計(SHIMADZU UV-1700)測定280 nm之吸光度(OD280 nm)，算出CD27-Fc濃度(OD280 nm=1.0換算為0.68 mg/mL：由εM=134655、MW=92840算出)。自源自各宿主細胞之CD27-Fc表現細胞、約300 mL之無血清培養液上清液，獲得3.6 mg之源自Lec8之CD27-Fc、2.2 mg之源自CHO/DG44之CD27-Fc。針對各蛋白質進行溶出組分之SDS-PAGE之分析，將結果示於圖7。其結果為：於還原條件下，以DG44作為宿主之情形時，於分子量約為65 kDa之位置觀察到CD27-Fc，以Lec8作為宿主之情形時，於分子量約為48 kDa之位置觀察到CD27-Fc。另一方面，於非還原條件下，於還原條件下所見之條帶之約2倍之分子量的位置觀察到各自之條帶，由此確認CD27-Fc係以二聚物之形式存在。
9)糖鏈結構之確認向利用PBS將上述(8)中所純化之CD27-Fc稀釋至10倍而獲得的溶液16 μL中，添加5倍濃度之SDS樣本緩衝液4 μL後，於90℃下處理5分鐘，將獲得者供於SDS-PAGE。電泳係使用5-20%之SDS-聚丙烯醯胺凝膠e-PAGEL(ATTO公司製造，Cat. No. E-T520L)，於ATTO RAPIDAS Mini-Slab電泳槽中，以20 mA/片之電流進行90分鐘電泳。向PVDF膜(Millipore Immobilon公司製造，Cat. No. IPVH304F0)上轉印係使用ATTO Holize Blot，於180 mA、90分鐘之條件下進行。藉由將轉印後之膜浸入含有101%BSA之PBS(以下記為101% BSA-PBS)中，於4℃下靜置一晚而進行阻斷。其後，添加使用1%B SA-PBS製備為5 μg/mL之抗RCAS1抗體純系22-1-1(MBL公司製造，Cat. No. D060-3)，於室溫下反應2小時。使用0.05% Tween-20-PBS(和光純藥公司製造，Cat. No. 167-11515)於室溫下清洗30分鐘後，與利用1% BSA-PBS稀釋2000倍之2次抗體過氧化酶標記兔抗小鼠免疫球蛋白(DAKO公司製造，Cat. No. P0161)於室溫下反應1小時。
使用0.05% Tween-20-PBS於室溫下清洗30分鐘後，使用ECL西方墨點偵測試劑(Amersham Pharmacia Biotech公司製造，Cat. No. RPN2106)進行檢測。將其結果示於圖8。根據SDS-PAGE分析之結果可明確：源自DG44之CD27-Fc之分子量大於源自Lec8之CD27-Fc之分子量，以DG44細胞與Lec8細胞作為宿主細胞時，CD27-Fc上所結合之糖鏈結構不同。又，已明確，抗RCAS1抗體22-1-1可識別作為O-結合型糖鏈之Tn抗原，已知其為抗Tn抗體[J. B. C.,278,22998-23007,(2003)]。作為抗Tn抗體之抗RCAS-1抗體純系22-1-1雖然完全不與源自DG44之CD27-Fc結合，但會特異性地與源自Lec8之CD27-Fc結合。已確認由Lec8生產之CD27-Fc上結合有作為未結合半乳糖之O型糖鏈的Tn抗原。
[實施例2]於細胞膜上表現CD27之CHO細胞之製作
(1)CD27表現質粒pKANTEX CD27之構建藉由以下所示之PCR反應，製作自實施例1中所製作之pCR 2.1 CD27去除基因表現不需要之cDNA部分而獲得的cDNA片段。於含有0.2 mmol/L之dNTPs、1 mmol/L之氯化鎂之反應液中，使用1 ng之pCR 2.1 CD27、1 μmol/L之CD27-A(序列編號5)、1 μmol/L之CD27-C(序列編號13)及2.5單位之KOD聚合酶(東洋紡公司製造)，於合計為50 μL之條件下進行PCR反應。反應條件係以98℃下15秒鐘、68℃下30秒鐘為一個循環而進行25個循環。藉由2%瓊脂糖凝膠電泳將該反應液分離後，使用Zero Blunt PCR選殖試劑盒(Invitrogen公司製造)並依據隨附之使用說明書將約800 bp之PCR產物導入至pCR-Blunt載體中，而取得具有序列編號1所記載之DNA序列的pCR27axc(圖9)。其次，藉由將利用制限酶NotI及制限酶SalI消化pCR27axc而獲得之約780 bp之DNA片段，與利用制限酶NotI及制限酶SalI消化實施例1中所製作之pKANTEX XhoI/SalI而獲得之約8.9 kbp之DNA片段相連接，而構建用於表現CD27之質粒pKANTEX CD27(圖10)。
將由本質粒編碼之CD27基因序列示於序列編號1，將由該基因轉譯之胺基酸序列示於序列編號2。將使用該表現載體進行轉形之大腸桿菌接種至100 mL之LB培養基中，並培養一晚。培養後，回收菌體，使用Qiafilter質粒中量提取試劑盒(Qiafilter Plasmid midi kit，Qiagen公司製造)並依據隨附之操作說明將質粒純化。純化後，藉由制限酶AatII消化使30 μg之質粒載體線狀化。線狀化後，進行苯酚/氯仿萃取、乙醇沈澱，並溶解於濃度為1/10之TE緩衝液(1 mM之Tris HCl，0.1 mM之EDTA)中後，測定濃度，並進行基因導入。(2) CD27表現質粒pKANTEX CD27之導入藉由將上述(1)中所製作之CD27表現質粒pKANTEX CD27導入至Lec8細胞及CHO/DG44細胞中，而建立表現CD27之Lec8細胞及DG44細胞。除使用pKANTEXCD27作為所導入之質粒以外，藉由實施例1所記載之方法實施。其中，基因導入後之細胞係懸浮於HT-培養基30 mL中，以成為100 μL/孔之方式接種至3個96孔培養盤中。接種2天後，將培養基換成含有500 μg/mL之G418的繼代用培養基，並培養10天。10天後，將培養基換成含有50 nM之MTX(Sigma aldrich公司製造)之HT-培養基，而取得MTX耐性株。將源自Lec8株之CD27表現株命名為CD27/Lec8-4，另一方面，將源自DG44細胞之CD27表現細胞命名為CD27/DG44-8。
(3) CD27表現細胞之確認為了確認(2)中所製作之CD27表現細胞之CD27表現，而使用流式細胞儀(FCM)，藉由下述方式進行分析。分取CD27表現細胞1~5×106 個置於15 mL試管(Becton Dickinson公司製造)中，並進行離心分離(1500 rpm，5分鐘)後，去除上清液，懸浮於含有50 μL之1%牛血清白蛋白的PBS緩衝液[以下，記載為1% BSA-PBS(Kohjin-Bio公司製造)]中。添加經PC5標記之抗CD27小鼠單株抗體(Beckman Coulter公司製造，Cat. No. 6607107)、或者PC5標記小鼠IgG1同型對照(Beckman Coulter，Cat. No. 6607012) 10 μL作為1次抗體，於冰溫下反應60分鐘。反應後，利用1 mL之1% BSA-PBS清洗2次後，將細胞懸浮於500 μL之1% BSA-PBS中，利用流式細胞儀(FCM)(Becton Dickinson公司製造)測定螢光強度。將其結果示於圖11。如圖11所示，確認CD27/Lec8-4及CD27/DG44-8於細胞膜上表現有大致相同程度之CD27。[實施例3]針對含有未結合半乳糖之O-結合型糖鏈的CD27之單株抗體(以下記為抗糖鏈缺乏CD27單株抗體)之製作(1)免疫原之製備將50 μg之實施例1中獲得之由Lec8株生產之CD27-Fc與2 mg氫氧化鋁佐劑(Antibodies-A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,p99、1988)及百日咳疫苗(千葉縣血清研究所製)1×109 細胞一併投予給3隻4週齡雌SD大鼠。
自投予2週後起，每週投予1次50 μg之由Lec8株生產之CD27-Fc，合計投予3次。自尾靜脈部分採血，藉由使用ABI8200蜂巢式偵測系統(Applied Bio公司製造)或流式細胞儀(Cytomics FC500 MPL，Beckman Coulter公司製造)之螢光細胞染色法測定所獲得之抗血清之結合活性，於最終免疫3天後自顯示出充分之抗體效價的小鼠摘取脾臟。將脾臟於MEM(Minimum Essential Medium)培養基(日水製藥公司製造)中切細，用鑷子擢碎，並進行離心分離(1200 rpm，5分鐘)。藉由向所獲得之沈澱組分中添加Tris-氯化銨緩衝液(pH值7.6)並處理1~2分鐘，而去除紅細胞。利用MEM培養基將所獲得之沈澱組分(細胞組分)清洗3次，用於細胞融合。(2)結合ELISA用於結合ELISA之抗原分別使用實施例1中所獲得之由Lec8株生產之CD27-Fc及DG44細胞生產CD27-Fc。於96孔之ELISA用培養盤(Greiner公司)中，以50 μL/孔分注5 μg/mL之上述CD27-Fc蛋白質，並於4℃下放置一晚進行吸附。
清洗該培養盤後，以100 μL/孔添加1% BSA-PBS，於室溫下放置1小時，而阻斷殘留之活性基。放置後，去除1%BSA-PBS，於該培養盤中以50 μL/孔分注被免疫動物抗血清或者融合瘤培養上清液作為一次抗體，並放置2小時。將該培養盤以0.05%聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單月桂酸酯[(ICI公司商標Tween 20相當品：和光純藥公司製造)]-PBS(以下記為Tween-PBS)加以清洗後，以50 μL/孔添加過氧化酶標記兔抗大鼠免疫球蛋白(Zymed公司)作為2次抗體，並於室溫下放置1小時。
利用Tween-PBS清洗該培養盤後，添加ABTS[2,2-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)銨(2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid))]受質液[1 mmol/L之ABTS-0.1 mol/L檸檬酸緩衝液(pH值4.2)，0.1% H2 O2 ]，使之顯色並使用螢光分析儀(Emax：Molecular Devices公司)測定OD415 nm之吸光度。(3)螢光細胞染色法(ABI8200蜂巢式偵測系統分析)使用實施例2中製作之CD27/Lec8-4及CD27/DG44-8作為分析用細胞。利用0.05% Trypsin溶液(Invitrogen公司製造)將於添加有50 nM之MTX及500 ng/mL之G418的繼代用培養基中進行繼代而獲得之CD27/Lec8-4及CD27/DG44-8剝離，以1×104 個/100 μL培養基/孔接種至ABI8200用黑色96孔培養盤中，並培養1晚。
於該培養盤中以10 μL/孔分注被免疫大鼠抗血清或者融合瘤培養上清液作為一次抗體，並以100 μL/孔添加ALEXA647標記抗大鼠免疫球蛋白G(H+L)(Invitrogen公司製造)作為2次抗體，於遮光下放置4小時。利用ABI8200蜂巢式偵測系統(Applied Bio公司製造)測定由雷射光633 He/Ne激發之650~685 nm之螢光。
(4)螢光細胞染色法(流式細胞儀分析)使用實施例2中所製作之CD27/Lec8-4及CD27/DG44-8作為分析用細胞。使用0.02% EDTA溶液(Nacalai Tesque公司製造)將使用於添加有50 nM之MTX及500 μg/mL之G418的HT-培養基進行繼代而獲得之CD27/Lec8-4及CD27/DG44-8剝離後，利用PBS清洗各細胞。清洗後，使1~5×105 個細胞懸浮於50 μL之1% BSA-PBS中後，以50 μL/孔分注被免疫大鼠抗血清或者融合瘤培養上清液作為1次抗體，於冰溫下使之反應30分鐘。又，使用牛血清白蛋白、小鼠IgG1同型對照(Cosmo Bio公司製造)及大鼠IgG2a同型對照(Cosmo Bio公司製造)作為陰性對照，且使用抗RCAS1抗體22-1-1(MBL公司製造)及抗CD27小鼠單株抗體(Beckman Coulter公司製造)作為陽性對照，同時進行反應。
反應後，使用PBS離心分離2次而清洗細胞，以50 μL/孔添加ALEXA488標記抗大鼠免疫球蛋白G(H+L)(Invitrogen公司製造)作為2次抗體，於冰溫、遮光下反應30分鐘。再次使用PBS進行2次離心分離而清洗細胞後，使其懸浮於500 μL之1% BSA-PBS中，並利用流式細胞儀(Beckman Coulter公司製造，Cytomics FC500 MPL)測定由雷射光488 nm氬激發之510~530 nm之螢光。(5)小鼠骨髓瘤細胞之製備將8-氮鳥嘌呤耐性小鼠骨髓瘤細胞株P3X63Ag8U.1(P3-U1：自ATCC購買)於正常培養基(10% FCS RPMI培養基)中進行培養，於細胞融合時確保2×107 個以上之細胞，於細胞融合時作為母株供給。
(6)融合瘤之製作將上述(1)中所獲得之小鼠脾臟細胞與上述(5)中所獲得之骨髓瘤細胞以成為10:1之方式混合，並進行離心分離(250×g，5分鐘)。將所獲得之沈澱組分之細胞群充分擢碎後，一邊攪拌，一邊於37℃下對每108個小鼠脾臟細胞添加聚乙二醇-1000(PEG-1000) 1 g、MEM培養基1 mL及二甲基亞碸0.35 mL之混液0.5 mL，每1~2分鐘向該懸浮液中添加1 mL之MEM培養基數次後，進而添加MEM培養基，使總量成為50 mL。
將該懸浮液離心分離(900 rpm，5分鐘)，將所獲得之沈澱組分之細胞緩慢擢碎後，利用刻度吸管吸入吸出該細胞，並緩慢地懸浮於HAT培養基[於添加有10%胎牛血清之RPMI培養基中添加有HAT Media Supplement(Invitrogen公司製造)之培養基]100 mL中。將該懸浮液以200 μL/孔分注至96孔培養盤中，於5%CO2 培養箱中，於37℃下培養8~10天。培養後，使用上述(3)及上述(4)中記載之螢光細胞染色法，使培養上清液與CD27/Lec8-4進行反應，選擇不與CD27/DG44-8及Lec8細胞反應之孔，藉由限制稀釋法由此孔中所含之細胞進行2次選殖，而取得單細胞純系。
結果確立產生與糖鏈缺乏CD27特異性結合之單株抗體KM4030或KM4031之融合瘤KM4030及KM4031(圖12)。藉由相同之方法確立產生與糖鏈缺乏CD27特異性反應之單株抗體KM4026、KM4027或KM4028之融合瘤KM4026、KM4027及KM4028。
該等產生與糖鏈缺乏CD27特異性結合之單株抗體的融合瘤可藉由如下方式取得：藉由利用與糖鏈合成途徑相關之酶、輸送蛋白質之活性未缺失之DG44株及尿苷二磷酸半乳糖轉運蛋白之活性降低或缺失之Lec8株，而製作分別表現有正常糖鏈CD27及糖鏈缺乏CD27之重組細胞，設計出能夠篩選不與正常糖鏈CD27表現細胞及Lec8株結合而僅與糖鏈缺乏CD27表現細胞特異性結合之單株抗體的系統，進行約6000孔之規模之篩選分析。
(7)單株抗體之純化以5~20×106 細胞/隻對經異十九烷處理之7週齡裸雌小鼠(ICR)腹腔內注射上述(6)中所獲得之融合瘤株。10~21天後，自藉由使融合瘤腹水癌化而積存有腹水之小鼠採集腹水(1~8 mL/隻)。使用針筒過濾器(孔徑5 μm)過濾該腹水，而去除固體成分。純化IgG單株抗體係藉由辛酸沈澱法[Antibodies-A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]進行純化而取得。單株抗體之亞型之確認係藉由使用亞型鑑定試劑盒(rat monoclonal antibody isotyping kit,DS Pharma Biomedical公司製造)之結合ELISA而進行。結果明確，各抗體之亞型為：抗糖鏈缺乏CD27單株抗體KM4026為大鼠IgG2a型，抗糖鏈缺乏CD27單株抗體KM4027為大鼠IgG2b型，抗糖鏈缺乏CD27單株抗體KM4028為大鼠IgG1型，抗糖鏈缺乏CD27單株抗體KM4030為大鼠IgG2a型，及抗糖鏈缺乏CD27單株抗體KM4031為大鼠IgG1型。
[實施例4]
抗糖鏈缺乏CD27特異性單株抗體之反應性之研究使用下述所示之競爭ELISA系統，進行抗糖鏈缺乏CD27單株抗體KM4030及KM4031之反應特異性之研究。以5 μg/mL之濃度將實施例1中所獲得之由Lec8株生產之CD27-Fc以50 μL/孔分注至96孔之ELISA培養盤(Greiner公司製造)中，於4℃下放置一晚而進行吸附。清洗該培養盤後，以200 μL/孔添加1% BSA-PBS並於室溫下放置1小時，而將殘留之活性基阻斷。放置後，去除1% BSA-PBS，於該培養盤中以50 μL/孔分注經稀釋之抗糖鏈缺乏CD27單株抗體KM4030純化抗體或KM4031純化抗體作為一次抗體。
同時，以20、2、0.2、0.02 μg/mL之濃度添加由Lec8生產之CD27-Fc蛋白質、由DG44生產之CD27-Fc蛋白質或者人類免疫球蛋白作為結合競爭物質，而使抗體與結合競爭物質共存。
將培養盤於室溫下放置2小時後，利用0.05%聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單月桂酸酯[(ICI公司商標Tween 20相當品：和光純藥公司製造)]-PBS(以下記為Tween-PBS)進行清洗後，以50 μL/孔添加過氧化酶標記兔抗大鼠免疫球蛋白(Zymed公司製造)作為2次抗體，並於室溫下放置1小時。
利用Tween-PBS清洗該培養盤後，添加ABTS[2,2-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)銨]受質液[1 mmol/L之ABTS-0.1 mol/L之檸檬酸緩衝液(pH值4.2)，0.1% H2 O2 ]，使之顯色後，使用螢光分析儀(Emax：Molecular Devices公司)測定OD415 nm之吸光度。將抗糖鏈缺乏CD27單株抗體KM4030及KM4031之競爭ELISA之結果示於圖13。其結果明確，由DG44生產之CD27-Fc及人類免疫球蛋白不會抑制抗糖鏈缺乏CD27單株抗體KM4030及KM4031與結合有Tn抗原之CD27-Fc之結合，但會抑制結合有Tn抗原之CD27-Fc。又，抗糖鏈缺乏CD27單株抗體KM4026、KM4027及KM4028亦獲得相同之結果。根據以上內容明確，本發明之抗糖鏈缺乏CD27單株抗體KM4026、KM4027、KM4028、KM4030及KM4031可特異性識別糖鏈缺乏CD27。
將抗糖鏈缺乏CD27單株抗體KM4026、KM4027、K M4028、K M4030及KM4031之由Biacore測得之抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體與糖鏈缺乏CD27-Fc之結合活性的評價結果示於圖28(A)及(B)。結合活性之測定係使用Biacore T100(GE Healthcare Bioscience公司製造)，並使用表面離體子共振法(SPR法)而進行。
使用胺偶合試劑盒(Amine Coupling Kit，Biacore公司製造)並依據隨附之操作說明，藉由胺偶合法，將抗人類IgG4抗體(Pharmingen公司製造)固定在CM5感測晶片(GE Healthcare Bioscience公司製造)上。對實施例1(7)中所獲得之DG44產生CD27-Fc，添加使用Prozyme Glyco酶糖基化試劑盒(Prozyme公司製造)及ProO-Link Extender Deglycosylation Plus(Prozyme公司製造)之唾液酸酶A或者β(1-4)半乳糖苷酶並依據隨附之操作說明進行糖鏈消化酶處理的Tn抗原型CD27-Fc或者唾液酸化Tn抗原型CD27-Fc，以於固定有抗人類IgG4抗體之晶片上成為200~250 RU(共振單位)之方式進行捕獲。
其後，使自20000 ng/mL起以5個階段稀釋之測定樣本(抗糖鏈缺乏CD27單株抗體KM4026、KM4027、KM4028、KM4030及KM4031)以30 μL/min之流速於晶片上流動，取得各濃度之感應圖，再使用裝置隨附之分析軟體Biacore T100 Evaluation software(Biacore公司製造)進行分析。其結果明確，抗糖鏈缺乏CD27單株抗體對Tn抗原型CD27-Fc及唾液酸化Tn抗原型CD27-Fc顯示出結合活性。根據以上內容明確，本發明之抗糖鏈缺乏CD27單株抗體對Tn抗原及唾液酸化Tn抗原均可結合。
[實施例5]編碼抗糖鏈缺乏CD27單株抗體之可變區域的cDNA之單獨分離、分析(1)由抗糖鏈缺乏CD27單株抗體產生融合瘤細胞製備mRNA使用RNAeasy迷你試劑盒(QIAGEN公司製造)及OligotexTM-dT30<Super>mRNA純化試劑盒(TaKaRa公司製造)並依據各自隨附之使用說明書，由實施例3中所取得之各融合瘤KM4026、KM4027、KM4028、KM4030及KM4031各5×107 ~1×108 個細胞製備各抗糖鏈缺乏CD27單株抗體之mRNA。(2)抗糖鏈缺乏CD27單株抗體之H鏈及L鏈可變區域之基因選殖使用BD SMART RACE cDNA擴增試劑盒(BD Biosciences公司製造)並依據隨附之使用說明書，由實施例5(1)中所取得之單株抗體之mRNA取得cDNA。以所取得之cDNA作為模板，使用大鼠IgG1特異性引子(序列編號14)、大鼠IgG2a特異性引子(序列編號15)、大鼠IgG2b特異性引子(序列編號16)、或大鼠CH1特異性引子(序列編號17)分別進行PCR反應，而擴增各抗體之重鏈可變區域(以下記為VH)之cDNA片段。又，使用大鼠Ig(κ)特異性引子(序列編號18)及(序列編號19)代替抗體之各亞型特異性引子而進行PCR，擴增各抗體之輕鏈可變區域(以下記為VL)之cDNA片段。用於擴增KM4026、KM4030、KM4031之VL及VH的PCR反應，係使用Advantage 2 PCR試劑盒(Clontech公司製造)並依據隨附之使用說明書而進行，用於擴增KM4027、KM4028之VL及VH的PCR反應係使用KOD Plus聚合酶(東洋紡公司製造)並依據隨附之使用說明書而進行。其次，為了進行選殖而確定鹼基序列，藉由瓊脂糖凝膠電泳將所取得之PCR產物分離後，使用TOPO TA選殖試劑盒(Invitrogen公司製造)並依據隨附之使用說明書將源自KM4026、KM4030、KM4031之PCR產物插入至pCR載體中，使用定序用Zero Blunt TOPO PCR選殖試劑盒(Invitrogen公司製造)並依據隨附之使用說明書將源自KM4027、KM4028之PCR產物插入至pCR載體中。使用插入有PCR擴增片段之質粒將大腸桿菌轉形，製備由各純系所獲得之質粒，並確認DNA序列。其結果，取得含有cDNA之5'末端存在推測為起始密碼子之ATG序列的完全長度之VH之cDNA的質粒及含有VL之cDNA的質粒。將選殖之概略示於圖14。
(3)抗CD27單株抗體可變區域之基因序列之分析將實施例5(2)中所獲得之質粒所含的抗糖鏈缺乏CD27單株抗體KM4026、KM4027、KM4028、KM4030及KM4031之VH之全鹼基序列示於序列編號20至序列編號24，將含有該由序列推測之訊號序列的VH之全胺基酸序列示於序列編號25至序列編號29，又，將VL之全鹼基序列示於序列編號30至序列編號34，將含有由該序列推測之訊號序列的VL之全胺基酸序列示於序列編號35至序列編號39。又，藉由將各單株抗體之VH及VL之CDR與現有抗體之胺基酸序列進行比較而對其進行鑑定。將抗糖鏈缺乏CD27單株抗體KM4026之VH之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列分別示於序列編號40、序列編號41及序列編號42，將VL之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列分別示於序列編號43、序列編號44及序列編號45。
將抗糖鏈缺乏CD27單株抗體KM4027之VH之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列分別示於序列編號46、序列編號47及序列編號48，將VL之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列分別示於序列編號49、序列編號50及序列編號51。將抗糖鏈缺乏CD27單株抗體KM4028之VH之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列分別示於序列編號52、序列編號53及序列編號54，將VL之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列分別示於序列編號55、序列編號56及序列編號57。將抗糖鏈缺乏CD27單株抗體KM4030之VH之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列分別示於序列編號58、序列編號59及序列編號60，將VL之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列分別示於序列編號61、序列編號62及序列編號63。將抗糖鏈缺乏CD27單株抗體KM4031之VH之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列分別示於序列編號64、序列編號65及序列編號66，將VL之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列分別示於序列編號67、序列編號68及序列編號69。
[實施例6]抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體之製作(1)抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體表現載體之構建本發明中製作之嵌合抗體係於實施例5(3)中所獲得之抗CD27大鼠單株抗體之重鏈及輕鏈之可變區域分別連接US97/10354中所揭示之人類IgG1之重鏈恆定區域及人類κ之輕鏈恆定區域而成的嵌合抗體。
作為方法，係使用含有實施例5(3)中所獲得之各單株抗體之VL或VH的pCR載體、與含有US97/10354中所記載之人類IgG1之重鏈恆定區域及人類κ之輕鏈恆定區域的抗體表現載體pKANTEX93，藉由以下方式構建抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體表現載體(圖15、圖16、圖17、圖18)。使用10 ng之含有KM4026、KM4027、KM4028、KM4030、KM4031之VL或VH的pCR載體作為模板，製備含有10×KOD Plus緩衝液2 μL、2 mmol/L之dNTP 2 μL、25 mmol/L之硫酸鎂1 μL、KOD Plus聚合酶(東洋紡公司製造)1 μL、對各抗CD27單株抗體之VL及VH具有特異性之10μmol/L之引子各1 μL的總量為20 μL之溶液。使用該製備溶液，以於94℃下加熱5分鐘後、於94℃下反應1分鐘、於68℃下反應2分鐘為一個循環而進行30個循環之PCR反應。
將KM4026之VL之引子示於序列編號70及71，將VH之引子示於序列編號72及73，將KM4027之VL之引子示於序列編號74及75，將VH之引子示於序列編號76及77，將KM4028之VL之引子示於序列編號78及79，將VH之引子示於序列編號80及81，將KM4030之VL之引子示於序列編號82及83，將VH之引子示於序列編號84及85，將KM4031之VL之引子示於序列編號86及87，將VH之引子示於序列編號88及89。
各PCR反應產物係藉由1%瓊脂糖凝膠電泳進行分離後，回收特異性PCR擴增條帶，使用定序用Zero Blunt TOPO PCR選殖試劑盒(Invitrogen公司製造)並依據隨附之使用說明書而插入至pCR Blunt-TOPO載體中。所獲得之各抗體之VL係使用制限酶EcoRI(New England Biolabs公司製造)及BsiWI(New England Biolabs公司製造)將其消化，而取得VL之EcoRI-BsiWI片段。又，各抗體之VH係使用制限酶NotI(New England Biolabs公司製造)及ApaI(New England Biolabs公司製造)將其消化，而取得NotI-ApaI片段。使用Ligation High(東洋紡公司製造)並依據隨附之使用說明書，使抗CD27單株抗體KM4026、KM4027、KM4028、KM4030或KM4031之VL之各EcoRI-BsiWI片段，與利用制限酶EcoRI及BsiWI將pKANTEX93消化而獲得之DNA片段相連接。使用連接而成之DNA片段將大腸桿菌DH5α(東洋紡公司製造)，製備由各純系獲得之質粒，使用BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit(PE Biosystems公司製造)並依據隨附之使用說明書進行反應後，利用同一公司之定序儀ABI PRISM3700分析鹼基序列。
其結果，取得插入有編碼抗CD27單株抗體KM4026、KM4027、KM4028、KM4030或KM4031之VL的cDNA的pKANTEX93。繼而，使用Ligation High(東洋紡公司製造)並依據隨附之使用說明書，使抗CD27單株抗體KM4026、KM4027、KM4028、KM4030或KM4031之VH之各NotI-ApaI片段，與利用制限酶NotI及ApaI消化插入有抗CD27單株抗體之各VL的pKANTEX93而獲得之DNA片段相連接。使用連接而成之DNA片段將大腸桿菌DH5α(東洋紡公司製造)轉形，製備由各純系所獲得之質粒，使用BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit(PE Biosystems公司製造)並依據隨附之使用說明書進行反應後，利用同一公司之定序儀ABI PRISM3700分析鹼基序列。
其結果，取得分別插入有編碼抗CD27單株抗體KM4026、KM4027、KM4028、KM4030或KM4031之VL及VH的cDNA之抗CD27嵌合抗體表現載體。(2)使用動物細胞之抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體之表現使用上述(1)中所獲得之抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體表現載體，藉由常法[Antibody Engineering,A Practical Guide，W. H. Freeman and Company(1992)]進行抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體於動物細胞中之表現，而取得產生抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體(嵌合型KM4026、嵌合型KM4028、嵌合型KM4030及嵌合型KM4031)之轉形株。作為進行表現之動物細胞株，係使用將α1,6-岩藻糖轉移酶(FUT8)之基因雙重敲出之CHO/DG44細胞株(以下記為FUT8敲出CHO細胞)。已知於該宿主細胞株中表現之抗體之N-結合型複合型糖鏈之核心部分未附加有岩藻糖(國際公開第2002/31140號)。
(3)純化嵌合抗體之取得藉由通常之培養法培養上述(2)中所獲得之轉形株嵌合型KM4026、嵌合型KM4028、嵌合型KM4030及嵌合型KM4031後，回收細胞懸浮液，於3000 rpm、4℃之條件下進行20分鐘離心分離，回收培養上清液後，使其通過孔徑為0.22 μm之Millex GV過濾器而進行過濾殺菌。藉由與實施例1(7)相同之方法並使用Mab Select，自所獲得之培養上清液純化抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體嵌合型KM4026、嵌合型KM4028、嵌合型KM4030及嵌合型KM4031。
(4)抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體之岩藻糖含量測定依據國際公開第2002/31140號所記載之方法，調查各抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體之Fc區域之N-結合複合型糖鏈之還原末端所存在的N-乙醯基葡萄糖胺之6位未與岩藻糖之1位α鍵結的糖鏈之比例。將結果示於表2。
如表2所示，明確實施例6(3)中所製作之嵌合抗體未附加有岩藻糖。
[實施例7]抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體之活性評價於以下之(1)至(3)中，進行實施例6中所獲得之抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體嵌合型KM4026、嵌合型KM4028、嵌合型KM4030及嵌合型KM4031之活性評價。
(1)利用Biacore之抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體對人類糖鏈缺乏CD27-Fc之結合活性評價為了於反應動力學上分析抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體嵌合型KM4026、嵌合型KM4028、嵌合型KM4030對人類糖鏈缺乏CD27-Fc之結合活性，而使用表面離體子共振法(SPR法)進行結合活性測定。以下之操作全部使用Biacore T100(GE Healthcare Bioscience公司製造)進行。藉由胺偶合法將實施例1(7)中所獲得之源自Lec8之CD27-Fc固定於CM5感測晶片(GE Healthcare Bioscience公司製造)上。自9 μg/mL起以3倍稀釋為一個階段而製備成5個濃度的測定樣本(嵌合型KM4026、嵌合型KM4028、嵌合型KM4030及嵌合型KM4031)，依據Single Kinetics之自動程式，將該測定樣本以低濃度至高濃度之順序連續添加至固定有CD27-Fc之晶片上並進行測定。使用裝置隨附之分析軟體Biacore T100 Evaluation software(Biacore公司製造)，二價分析物(Bivalent Analyte)模式進行分析，算出各抗體對人類糖鏈缺乏CD27-Fc之結合速度常數ka及解離速度常數kd。將所獲得之各抗體之結合速度常數ka1、解離速度常數kd1及解離常數KD(kd1/ka1)之計算結果示於表3。
如表3所示，嵌合型KM4026、嵌合型KM4028、嵌合型KM4030及嵌合型KM4031對於人類糖鏈缺乏CD27-Fc均顯示出1×10-8 至1×10-9 mol/L之高親和性。
(2)利用螢光細胞染色法(流式細胞儀分析)之抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體之反應特異性評價使用藉由與實施例2相同之方法所製作之CD27/DG44-4細胞、CD27/Lec8-4細胞及Lec8細胞作為分析用細胞。使用0.02% EDTA溶液，將使用添加有500 μg/mL之G418之HT-培養基進行繼代的CD27/DG44-4及使用添加有50 nmol/L之MTX及500 μg/mL之G418之HT-培養基進行繼代的CD27/Lec8-4剝離後，利用PBS清洗各細胞。清洗後，將5×105 個細胞懸浮於50 μL之1% BSA-PBS中後，以50 μL/孔分注將抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體(嵌合型KM4026、嵌合型KM4028、嵌合型KM4030及嵌合型KM4031)製備成0.02、0.2、2及10 μg/mL的抗體液作為1次抗體，於冰溫下反應1小時。
陽性對照係使用作為抗Tn抗體之抗RCAS1小鼠抗體22-1-1(MBL公司製造)及抗CD27小鼠抗體O323(Santa Cruz biotechnology公司製造)。反應後，使用PBS進行2次離心分離而清洗細胞，以50 μL/孔添加ALEXA Fluoro 488標記抗人類免疫球蛋白G(H+L)、ALEXA Fluoro 488標記抗小鼠免疫球蛋白G(H+L)或者ALEXA Fluoro 488標記抗人類免疫球蛋白M(μ)作為2次抗體，於冰溫、遮光下反應30分鐘。再次使用PBS進行2次離心分離而清洗細胞後，將其懸浮於500 μL之1% BSA-PBS中，利用流式細胞儀(Beckman Coulter公司製造，Cytomics FC500 MPL)測定由雷射光488 nm氬激發之510~530 nm之螢光。將結果示於圖19(A)~(C)。其結果確定，抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體均不與Lec8細胞及CD27/DG44-4細胞結合，僅與表現有糖鏈缺乏CD27之CD27/Lec8-4細胞結合。
根據以上內容明確，本發明之抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體嵌合型KM4026、嵌合型KM4028、嵌合型KM4030及嵌合型KM4031可特異性識別表現於細胞表面之糖鏈缺乏CD27。
(3)抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體之抗體依賴性細胞毒殺活性(ADCC活性)之評價藉由以下所示之方法，測定抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體嵌合型KM4026、嵌合型KM4028、嵌合型KM4030及嵌合型KM4031對實施例2中所製作之CD27/Lec8-4細胞之ADCC活性。
(3)-1　標靶細胞懸浮液之製備使用0.02% EDTA溶液，將使用添加有50 nmol/L之MTX及500 μg/mL之G418的HT-培養基進行繼代之CD27/Lec8-4細胞剝離後，利用PBS進行清洗，再利用含有完成5%透析之胎牛血清(dFBS)(Invitrogen公司製造)且不含酚紅之RPMI1640培養基(Invitrogen公司製造)(以下記為ADCC用培養基)進行清洗，利用同一培養基製備成最佳濃度而製成標靶細胞懸浮液。(3)-2　效應細胞懸浮液之製備周邊血液單核細胞(Peripheral blood mononuclear cell:PBMC)係藉由以下所示之方法自健康人周邊血液進行分離。使用加入有0.5 mL肝素鈉注射液N「Shimizu」(清水製藥公司製造)之注射器，自健康人採集健康人周邊血液50 mL。
於分注於15 mL試管中之3 mL之Mono-Poly Resolving Medium(DS Pharma Biomedical公司製造)之上，輕緩地疊層3.5 mL所採集之周邊血液，於400×g、制動解除、室溫之條件下離心分離20分鐘，而將單核細胞層分離。使用ADCC用培養基將如此獲得之單核細胞組分清洗2次，利用同一培養基製備成最佳細胞數而製成效應細胞懸浮液。(3)-3　ADCC活性之測定使用LDH-Cytotoxic Test Wako(Wako公司製造)，依據隨附之說明書，按照以下順序進行測定。
於96孔U底培養盤(FALCON公司製造)之各孔中，以50 μL/孔分注以10倍稀釋將各抗體自30　μg/mL稀釋至0.003 μg/mL之濃度的抗體液，其次以1×104 細胞/50 μL/孔分注(3)-1中所製備之標靶細胞懸浮液，最後以2.5×105 細胞/50 μL/孔分注(3)-2中所製備之效應細胞懸浮液，使總量成為150 μL，於37℃下反應4小時。由此，以效應細胞(E)與標靶細胞(T)之比例為25:1之條件進行實驗。ADCC活性係根據下式求出。將結果示於圖20。
(式)ADCC活性(%)={([受檢體之吸光度]-[標靶細胞自然游離之吸光度]-[效應細胞自然游離之吸光度])/([標靶細胞全游離之吸光度]-[標靶細胞自然游離之吸光度])}×100其結果，抗體之Fc區域之N-結合複合型糖鏈上未結合核心岩藻糖的抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體嵌合型KM4026、嵌合型KM4028、嵌合型KM4030及嵌合型KM4031均對CD27/Lec8-4細胞顯示出高ADCC活性。根據以上內容明確，本發明之抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體嵌合型KM4026、嵌合型KM4028、嵌合型KM4030及嵌合型KM4031均對表現有糖鏈缺乏CD27之細胞具有高ADCC活性。
(4)抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體之抗體依賴性細胞毒殺活性(CDC活性)之評價藉由以下所示之方法，測定抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體嵌合型KM4026、嵌合型KM4028、嵌合型KM4030及嵌合型KM4031對實施例2中所製作之CD27/Lec8-4細胞之CDC活性。
利用PBS清洗CD27/Lec8-4細胞後，利用含有10% dFBS之RPMI1640培養基進行清洗，利用同一培養基製備成最佳濃度而製成標靶細胞懸浮液。以每1孔成為5×104 個之方式，將標靶細胞懸浮液以50 μL/孔分注至96孔平底培養盤(Greiner公司製造)中，進而添加製備成適當濃度之抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體溶液及人類補體(SIGMA公司製造)，製備成總量為150 μL/孔。又，分別準備不含抗體之反應孔(0%細胞毒殺活性孔)作為陰性對照，準備不含細胞之反應孔(100%細胞毒殺活性孔)作為陽性對照。於37℃、5% CO2 培養箱中進行2小時反應。
反應完畢後，於各反應孔中添加15 μL之WST-1試劑(Roche公司製造)，使其於37℃下反應4小時左右，使用螢光分析儀(Emax)測定各孔之吸光度(OD450 nm~OD690 nm)。根據下式，由各孔之吸光度算出CDC活性(細胞毒殺活性[%])。將結果示於圖21。(式)CDC活性(細胞毒殺活性[%])={1-(反應孔之吸光度-100%裂解孔之吸光度)/(0%裂解孔之吸光度-100%裂解孔之吸光度)}×100其結果，本發明所取得之抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體嵌合型KM4026、嵌合型KM4028、嵌合型KM4030及嵌合型KM4031均顯示出CDC活性。
[實施例8]於細胞膜上表現食蟹猴CD27之CHO細胞之製作(1)食蟹猴CD27基因之選殖按照以下順序，自源自食蟹猴周邊血液之RNA單獨分離編碼CD27之基因。以使用Trizol(Invitrogen公司製造)自食蟹猴周邊血液單獨分離之RNA作為模板，製備含有3.3 μg之該RNA、1 μL之SuperScriptIIIfirst strand試劑盒(Invitrogen公司製造)所隨附之寡聚dT、1 μL之dNTP Mix的總量為5 μL之溶液。
使該製備溶液於65℃下反應5分鐘後，於冰上驟冷1分鐘，其後添加2 μL之SuperScriptIIIfirst strand試劑盒所隨附之10×RT緩衝液、2 μL之DTT、1 μL之RNase OUT、1 μL之RT，於50℃下進行50分鐘反轉錄反應。反應後，於85℃下加熱5分鐘而使反轉錄酶失活後，添加1 μL之SuperScriptIIIfirst strand試劑盒所隨附之RNase H，於37℃下反應20分鐘，而使RNA完全分解。該源自食蟹猴周邊血液之單鏈cDNA於使用前係於-20℃下保存。以上述所製作之源自食蟹猴周邊血液之單鏈cDNA作為模板，製備含有1.25 μL之該單鏈cDNA、2.5 μL之10×KOD Plus緩衝液、2.5 μL之2 mmol/L之dNTP、1 μL之25 mmol/L之硫酸鎂、0.5 μL之KOD Plus聚合酶(東洋紡公司製造)、20 pmol之由恆河猴CD27之5'側非轉譯區域序列設計之mfCD27_5UTR(序列編號90)與20 pmol之由恆河猴CD27之3'側非轉譯區域序列設計之mfCD27_3UTR(序列編號91)的總量為25 μL之溶液。
使用該製備溶液，於94℃下加熱5分鐘後，以於94℃下反應30秒鐘、於68℃下反應2分鐘為一個循環而進行30個循環之PCR反應。藉由1%瓊脂糖凝膠電泳將該反應液分離後，使用定序用Zero Blunt TOPO PCR選殖試劑盒(Invitrogen公司製造)並依據隨附之使用說明書將約800 bp之PCR產物插入至pCR Blunt-TOPO載體中。
使用插入有PCR擴增片段之載體將大腸桿菌DH5α(東洋紡公司製造)轉形，製備由各純系獲得之質粒，使用BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit(PE Biosystems公司製造)並依據隨附之使用說明書進行反應後，利用同一公司之定序儀ABI PRISM3700分析鹼基序列。結果取得選殖有編碼食蟹猴CD27之cDNA(序列編號92)的質粒pCR mfCD27(圖22)。(2)猴CD27表現質粒pKANTEX mfCD27His之構建藉由以下方法製作於C末端附加有His標籤之食蟹猴CD27表現載體pKANTEX mfCD27His。以pCR mfCD27作為模板，製備含有10 ng之pCR mfCD27、5 μL之10×KOD Plus緩衝液、5 μL之2 mmol/L之dNTP、2 μL之25 mmol/L之硫酸鎂、1 μL之KOD Plus聚合酶(東洋紡公司製造)、0.2 μL之100 μmol/L之mfCD27toKAN_5(序列編號93)及0.2 μL之mfCD27HisKAN_3(序列編號94)的總量為50 μL之溶液。
使用該製備溶液，於94℃下加熱5分鐘後，以於94℃下反應30秒鐘、於68℃下反應2分鐘為一個循環而進行30個循環之PCR反應。藉由1%瓊脂糖凝膠電泳將該反應液分離後，使用定序用Zero Blunt TOPO PCR選殖試劑盒(Invitrogen公司製造)並依據隨附之使用說明書將約800 bp之PCR產物插入至pCR Blunt-TOPO載體中。使用插入有PCR擴增片段之載體將大腸桿菌DH5α(東洋紡公司製造)轉形，製備由各純系獲得之質粒，使用BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit(PE Biosystems公司製造)並依據隨附之使用說明書進行反應後，利用同一公司之定序儀ABI PRISM3700分析鹼基序列。
結果取得於C末端附加有His標籤之選殖有編碼食蟹猴CD27之cDNA(序列編號95)的質粒pCR mfCD27His(圖23)。使用Ligation High(東洋紡公司製造)並依據隨附之使用說明書，使利用制限酶NotI及SalI(TAKARA BIO公司製造)消化pCR mfCD27His而獲得之約800 bp之DNA片段、與利用制限酶NotI及SalI(TAKARA BIO公司製造)消化實施例2中所製作之pKANTEX CD27而獲得之約10 kbp之DNA片段相連接。
使用連接而成之DNA片段將大腸桿菌DH5α(東洋紡公司製造)轉形，製備由各純系獲得之質粒，使用BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit(PE Biosystems公司製造)並依據隨附之使用說明書進行反應後，利用同一公司之定序儀ABI PRISM3700分析鹼基序列。
結果取得於C末端附加有His標籤之用於表現食蟹猴CD27之質粒pKANTEX mfCD27His(圖24)。將使用pKANTEX mfCD27His進行轉形之DH5α(東洋紡公司製造)接種至200 mL之LB培養基中，並培養一晚。培養後，回收菌體，使用QIAfilter Plasmid Midi kit(Qiagen公司製造)並依據隨附之使用說明書將質粒純化。利用制限酶AatII(New England Biolabs公司製造)消化經純化之質粒50 μg，而將其線狀化。(3)猴CD27表現質粒pKANTEX mfCD27His之導入藉由將上述(2)中所製作之食蟹猴CD27表現質粒pKANTEX mfCD27His導入至Lec8細胞及CHO/DG44細胞中，而建立表現食蟹猴CD27之Lec8細胞及DG44細胞。除使用pKANTEX mfCD27His作為進行導入之質粒以外，藉由實施例1(6)所記載之方法實施。其中，基因導入後之細胞係懸浮於HT-培養基30 mL中，以成為100 μL/孔之方式接種至3個96孔培養盤中。
接種1天後，將培養基換成含有500 μg/mL之G418的繼代用培養基，並培養10天，而取得G418耐性純系株。將源自Lec8株之食蟹猴CD27表現株記載為食蟹猴CD27/Lec8細胞，另一方面，將源自DG44細胞之食蟹猴CD27表現細胞記載為食蟹猴CD27/DG44細胞。[實施例9]抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體對猴CD27蛋白質之交差反應性評價使用實施例8中所製作之食蟹猴CD27/DG44細胞、食蟹猴CD27/Lec8細胞作為分析用細胞。
(1)利用螢光細胞染色法(流式細胞儀分析)之抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體對猴CD27表現細胞之反應性評價藉由以下方法測定抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體嵌合型KM4026、嵌合型KM4028、嵌合型KM4030及嵌合型KM4031對食蟹猴CD27表現細胞之結合活性。使用0.02% EDTA溶液，將使用添加有500 μg/mL G418之HT-培養基進行繼代的食蟹猴CD27/DG44細胞及食蟹猴CD27/Lec8細胞剝離後，利用PBS清洗各細胞。清洗後，將5×105 個細胞懸浮於50 μL之1% BSA-PBS中後，以50 μL/孔分注將抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體(嵌合型KM4026、嵌合型KM4028、嵌合型KM4030及嵌合型KM4031)製備成10 μg/mL之抗體液作為1次抗體，於冰溫下反應1小時。
使用抗CD27小鼠抗體O323作為陽性對照。反應後，使用PBS離心分離2次而清洗細胞，以50 μL/孔添加ALEXA Fluoro 488標記抗人類免疫球蛋白G(H+L)或者ALEXA Fluoro 488標記抗小鼠免疫球蛋白G(H+L)(均為BioLegend公司製造)作為2次抗體，於冰溫、遮光下反應30分鐘。再次使用PBS進行2次離心分離而清洗細胞後，將其懸浮於500 μL之1% BSA-PBS中，利用流式細胞儀(Beckman Coulter公司製造，Cytomics FC500 MPL)測定由雷射光488 nm氬激發之510~530 nm之螢光。將結果示於圖25。其結果明確，抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體嵌合型KM4030及嵌合型KM4031可與表現有糖鏈缺乏CD27之食蟹猴CD27/Lec8細胞發生反應。
另一方面，抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體嵌合型KM4026及嵌合型KM4028對食蟹猴CD27/Lec8細胞之反應性輕微。又，確認抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體均不與食蟹猴CD27/DG44細胞結合。(2)抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體對猴CD27表現細胞之ADCC活性之評價使用0.02% EDTA溶液，將使用添加有500 μg/mL之G418之HT-培養基進行繼代的食蟹猴CD27/Lec8細胞剝離後，利用PBS進行清洗，其後利用ADCC用培養基進行清洗，利用同一培養基製備成最佳濃度而製成標靶細胞懸浮液。又，效應細胞懸浮液之製備及ADCC活性之測定係藉由與實施例7相同之方法進行。將結果示於圖26。其結果，抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體嵌合型KM4026、嵌合型KM4028、嵌合型KM4030及嵌合型KM4031均對含有未結合半乳糖之O-結合型糖鏈的食蟹猴CD27/Lec8細胞(糖鏈缺乏食蟹猴CD27細胞)顯示出ADCC活性。根據以上內容明確，本發明之抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體嵌合型KM4026、嵌合型KM4028、嵌合型KM4030及嵌合型KM4031均對糖鏈缺乏食蟹猴CD27細胞顯示出交差反應性。各抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體對糖鏈缺乏食蟹猴CD27之反應性可見強弱，提示該等所識別之抗原決定位存在差異。
又，使用實施例2中所製作之人類CD27/Lec8細胞及實施例8中所製作之食蟹猴CD27/Lec8細胞中之藉由流式細胞儀分析確認細胞表面上之CD27表現量大致相同之細胞，測定抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體嵌合型KM4030之ADCC活性。效應細胞懸浮液係由同一健康人周邊血液製備。將結果示於圖27。
其結果提示，糖鏈缺乏CD27嵌合抗體嵌合型KM4030對食蟹猴CD27/Lec8細胞與人類CD27/Lec8細胞顯示出同等之ADCC活性。
[實施例10]人類化抗體之製作(1)抗糖鏈缺乏CD27人類化抗體之VH及VL之胺基酸序列之設計藉由以下方式設計抗糖鏈缺乏CD27人類化抗體之VH之胺基酸序列。
首先，選擇用於移植序列編號58、59及60所表示之抗糖鏈缺乏CD27大鼠單株抗體KM4030VH之CDR1~3之胺基酸序列的人類抗體之VH之FR之胺基酸序列。序列分析系統係使用GCG Package(Genetics Computer Group公司製造)，藉由BLASTP法(Nucleic Acid Res.,25,3389(1997))，自現有之蛋白質之胺基酸資料庫檢索與抗糖鏈缺乏CD27大鼠單株抗體KM4030同源性較高之人類抗體。
比較同源性分數與實際之胺基酸序列之同源性，結果SWISSPROT資料庫存取編號BAH04525、人類抗流行性感冒病毒中和性單株抗體庫(The repertoire of neutralizing monoclonal antibodies against H3N2 influenza viruses in human，以下稱為BAH04525)顯示出83.9%，係同源性最高之人類抗體，因此選擇該抗體之FR之胺基酸序列。
於藉由以上方式所確定之人類抗體之FR之胺基酸序列之適宜位置移植序列編號58~60所示之抗糖鏈缺乏CD27大鼠單株抗體KM4030之VH之CDR之胺基酸序列。藉此，設計序列編號96所表示之抗糖鏈缺乏CD27人類化抗體之VH之胺基酸序列HV0。其次，藉由以下方式設計抗糖鏈缺乏CD27人類化抗體之VL之胺基酸序列。
選擇用於移植序列編號61~63各自所表示之抗糖鏈缺乏CD27大鼠單株抗體KM4030VL之CDR1~3之胺基酸序列的人類抗體之VL之FR之胺基酸序列。Kabat等人將現有之各種人類抗體之VL根據其胺基酸序列之同源性分類為亞群(HSGI~IV)，該等亞群之每個均報告有共同序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept. Health and Human Services(1991)]。因此，實施人類抗體之VL之亞群I~IV之共同序列之FR之胺基酸序列與抗糖鏈缺乏CD27大鼠抗體KM4030之VL之FR之胺基酸序列之同源性檢索。同源性檢索之結果為：HSGI、HSGII、HSGIII、及HSGIV之同源性分別為86.3%、60.0%、73.8%、73.8%。因此，KM4030VL之FR之胺基酸序列與亞群I之同源性最高。
基於以上結果，於人類抗體之VL之亞群I之共同序列之FR之胺基酸序列之適宜位置移植抗糖鏈缺乏CD27大鼠單株抗體KM4030之VL之CDR之胺基酸序列。
但是，序列編號38所記載之抗糖鏈缺乏CD27大鼠單株抗體KM4030之VL之胺基酸序列中之第124號之Leu雖然並非Kabat等人所列舉之人類抗體FR之胺基酸序列之相當部位中使用頻度最高之胺基酸殘基，但為使用頻度相對較高之胺基酸殘基，因此決定使用上述抗糖鏈缺乏CD27大鼠單株抗體KM4030之胺基酸序列中可見之胺基酸殘基。以此方式設計序列編號97所表示之抗糖鏈缺乏CD27人類化抗體之VL之胺基酸序列LV0。
上述所設計之抗糖鏈缺乏CD27人類化抗體之VH之胺基酸序列HV0及VL之胺基酸序列LV0係於所選擇之人類抗體之FR之胺基酸序列僅移植有抗糖鏈缺乏CD27大鼠單株抗體KM4030之CDR之胺基酸序列的序列。但是，通常於製作人類化抗體之情形時，僅將大鼠抗體之CDR之胺基酸序列移植至人類抗體之FR時，結合活性降低之情形居多。因此，為了避免結合活性降低，而於移植CDR之胺基酸序列之同時，修飾人類抗體與大鼠抗體之間有所不同之FR之胺基酸殘基中認為可影響結合活性之胺基酸殘基。
因此，本實施例亦藉由以下方式鑑定認為可影響結合活性之FR之胺基酸殘基。首先，使用電腦模擬之手法，構建由上述所設計之抗糖鏈缺乏CD27人類化抗體之VH之胺基酸序列HV0及VL之胺基酸序列LV0所組成的抗體V區域(HV0LV0)之立體結構。關於立體結構座標之製作及立體結構之顯示，係使用軟體Discovery Studio(Accelrys公司製造)並依據隨附之使用說明書而進行。又，亦藉由相同之方式構建抗糖鏈缺乏CD27大鼠單株抗體KM4030之V區域之立體結構之電腦模型。進而，於HV0LV0之VH及VL之FR之胺基酸序列中，選擇與抗糖鏈缺乏CD27大鼠抗體KM4030不同之胺基酸殘基，製作對抗糖鏈缺乏CD27大鼠單株抗體KM4030之胺基酸殘基進行修飾之胺基酸序列，同樣地構建立體結構模型。
對該等所製作之抗糖鏈缺乏CD27大鼠單株抗體KM4030、HV0LV0及修飾體之V區域之立體結構進行比較，鑑定預測可影響抗體之結合活性的胺基酸殘基。其結果，作為HV0LV0之FR之胺基酸殘基中認為使抗原結合部位之立體結構發生變化而影響抗體之結合活性的胺基酸殘基，HV0係選擇第30號之Ser、第48號之Val、第49號之Ser、第77號之Asn、第93號之Val、第97號之Ala及第117號之Thr，LV0係選擇第21號之Ile、第40號之Pro、第58號之Val、第85號之Thr、及第87號之Tyr。利用該等所選擇之胺基酸殘基中之至少1種以上之胺基酸序列修飾抗糖鏈缺乏CD27大鼠單株抗體KM4030之相同部位所存在之胺基酸殘基，而設計具有各種修飾之人類化抗體之VH及VL。
具體而言，係對抗體VH導入將序列編號96所表示之胺基酸序列之第30號之Ser置換為Asn、將第48號之Val置換為Ile、將第49號之Ser置換為Ala、將第77號之Asn置換為Gly、將第93號之Val置換為Thr、將第97號之Ala置換為Thr、及將第117號之Thr置換為Val之胺基酸修飾中之至少1種修飾。
又，對VL導入將序列編號97所表示之胺基酸序列之第21號之Ile置換為Leu、將第40號之Pro置換為Leu、將第58號之Val置換為Ile、將第85號之Thr置換為Ala、及將第87號之Tyr置換為Phe之胺基酸修飾中之至少1種修飾。設計HV0LV0之FR中所存在的修飾至少1種胺基酸殘基的HV2LV0、HV3LV0、HV5LV0、及HV7LV0之可變區域之胺基酸序列，將H鏈可變區域HV2、HV3、HV5、及HV7之胺基酸序列分別示於序列編號101、103、105、及107。(2)抗糖鏈缺乏CD27人類化抗體之製作及評價編碼抗糖鏈缺乏CD27人類化抗體之可變區域的胺基酸序列之DNA於利用編碼抗糖鏈缺乏CD27大鼠單株抗體KM4030之VH或VL的胺基酸序列之DNA中所使用之密碼子進行胺基酸修飾之情形時，係使用哺乳動物細胞中高頻度使用之密碼子而製作。
將編碼抗糖鏈缺乏CD27人類化抗體之HV0及LV0之胺基酸序列的DNA序列分別示於序列編號98、99，又，將編碼經胺基酸修飾之可變區域HV2、HV3、HV5、及HV7之胺基酸序列的DNA序列分別示於序列編號100、102、104、及106。
(3)編碼抗糖鏈缺乏CD27人類化抗體之VH的cDNA之構建藉由全合成，而製作編碼本實施例(1)中所設計之序列編號98、104及106所表示之抗糖鏈缺乏CD27人類化抗體之VH的胺基酸序列HV0、HV5及HV7之cDNA。(4)編碼抗糖鏈缺乏CD27人類化抗體之VL的cDNA之構建藉由全合成，而製作編碼本實施例(1)中所設計之序列編號99所表示之抗糖鏈缺乏CD27人類化抗體之VL的胺基酸序列LV0之cDNA。(5)抗糖鏈缺乏CD27人類化抗體表現載體之構建於國際公開第97/10354號中所記載之人類化抗體表現用載體pKANTEX93之適當位置，插入編碼本實施例(2)及(3)中所獲得之HV0、HV5、HV7中之任一者的cDNA、及編碼LV0之cDNA，而構建各種抗糖鏈缺乏CD27人類化抗體表現載體。
(6)抗糖鏈缺乏CD27人類化抗體之使用動物細胞的穩定表現及純化抗體之取得抗糖鏈缺乏CD27人類化抗體之使用動物細胞的穩定表現及由培養上清液純化抗體，係藉由與實施例6(2)及(3)中所記載之方法相同之方法進行。其結果製作出以下3種抗體：抗體之VH包含HV0且VL包含LV0之抗糖鏈缺乏CD27人類化抗體HV0LV0、抗體之VH包含HV5且VL包含LV0之HV5LV0、及抗體之VH包含HV7且VL包含LV0之HV7LV0。
[實施例11]抗糖鏈缺乏CD27人類化抗體之活性評價於以下之(1)至(5)中，對實施例6中所獲得之抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體KM4030、及實施例10中所獲得之抗糖鏈缺乏CD27人類化抗體HV0LV0、HV5LV0及HV7LV0之活性進行評價。
(1)利用Biacore之抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體及人類化抗體對人類糖鏈缺乏CD27-Fc之結合活性評價為了於反應動力學上分析抗糖鏈缺乏CD27人類化抗體對人類糖鏈缺乏CD27之結合活性，而使用BIACORE T100(BIACORE公司製造)並藉由與實施例7(1)相同之方式進行測定。將其結果所獲得之各抗體之結合速度常數Ka1、解離速度常數Kd1及解離常數KD(Kd1/Ka1)示於表4。又，將感應圖示於圖29。
如表4所示，人類化抗體HV0LV0、HV5LV0及HV7LV0均顯示出2×10-9 mol/L之高親和性，保持有與抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體KM4030同等程度之抗原結合活性。
(2)利用螢光細胞染色法(流式細胞儀分析)之抗糖鏈缺乏CD27人類化抗體之反應特異性評價藉由與實施倒7(2)相同之方式測定抗糖鏈缺乏CD27人類化抗體之反應特異性。關於細胞株，係使用藉由與實施例2相同之方法所製作之抗原表現量為大致相同程度之CD27/DG44-4細胞及CD27/Lec8-M19細胞作為分析細胞。1次抗體係以最終濃度成為0.0001、0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、1及10 μg/mL之方式製備抗糖鏈缺乏CD27人類化抗體HV0LV0、HV5LV0或者HV7LV0而使用。將其結果示於圖30(A)及圖30(B)。
其結果，抗糖鏈缺乏CD27人類化抗體HV0LV0、HV5LV0及HV7LV0均不與CD27/DG44-4細胞結合，僅可見與表現有糖鏈缺乏CD27之CD27/Lec8-M19細胞之結合。又，抗糖鏈缺乏CD27人類化抗體對表現有糖鏈缺乏CD27之CD27/Lec8-M19細胞的反應性與抗糖鏈缺乏CD27嵌合型KM4030抗體大致相同。
(3)抗糖鏈缺乏CD27人類化抗體之抗體依賴性細胞毒殺活性(ADCC活性)之評價藉由與實施例7(3)相同之方式測定抗糖鏈缺乏CD27人類化抗體HV0LV0、HV5LV0及HV7LV0之ADCC活性。標靶細胞係使用藉由與實施例2相同之方法所製作之CD27/DG44-4細胞及CD27/Lec8-M19細胞。又，於效應細胞(E)與標靶細胞(T)之比例為12.5：1之條件下進行實驗。將其結果示於圖31。
其結果，人類化抗體HV0LV0與抗糖鏈缺乏CD27嵌合型KM4030抗體相比，ADCC活性有少許降低，但抗糖鏈缺乏CD27人類化抗體HV5LV0及HV7LV0顯示出與抗糖鏈缺乏CD27嵌合型KM4030抗體大致相同或其以上之ADCC活性。(4)抗糖鏈缺乏CD27人類化抗體之補體依賴性細胞毒殺活性(CDC活性)之評價藉由與實施例7(4)相同之方法測定抗糖鏈缺乏CD27人類化抗體HVOLV0、HV5LV0及HV7LV0之CDC活性。抗體係以最終濃度成為100 μg/mL之方式製備。將其結果示於圖32。
其結果，本發明所取得之抗糖鏈缺乏CD27人類化抗體HV0LV0、HV5LV0及HV7LV0顯示出強於抗糖鏈缺乏CD27嵌合型KM4030抗體之CDC活性。
(5)抗糖鏈缺乏CD27人類化抗體對猴CD27蛋白質48之交差反應性評價藉由與實施例9(1)相同之方式，利用螢光細胞染色法(流式細胞儀分析)測定抗糖鏈缺乏CD27人類化抗體HV0LV0、HV5LV0及HV7LV0對食蟹猴CD27表現細胞之結合活性。食蟹猴CD27表現細胞係使用實施例8中所製作之食蟹猴CD27/DG44細胞、食蟹猴CD27/Lec8細胞。將其結果示於圖33(A)及圖33(B)。
其結果，抗糖鏈缺乏CD27人類化抗體HV0LV0、HV5LV0及HV7LV0均不與食蟹猴CD27/DG44細胞結合。另一方面，對於表現有糖鏈缺乏CD27之食蟹猴CD27/Lec8細胞，抗糖鏈缺乏CD27人類化抗體HV0LV0、HV5LV0及HV7LV0表現出與抗糖鏈缺乏CD27嵌合型KM4030抗體同等之反應性。根據以上內容明確，抗糖鏈缺乏CD27人類化抗體HV0LV0、HV5LV0及HV7LV0均對糖鏈缺乏食蟹猴CD27細胞顯示出交差反應性。
融合瘤KM4030係於2008年6月5日，基於布達佩斯條約，以FERM BP-10976寄存於獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物寄存中心(日本茨城縣築波市東1丁目1番地1中央第6)(WO 2010/001908)。雖然本發明已參考具體實施進行詳細描述，但是本領域技術人員均明瞭，凡在本發明之精神及範圍之內所作的任何修改及改進等均應包含在本發明之保護範圍內。本申請係基於2009年12月29日申請之美國臨時申請案第61/290,542號，其全部內容通過引用結合在本申請中。所有引用文件均以全文引用之方式引用於本申請中。
[寄存編號]
IPOD FREM BP-10976
[序列表自由內容]
序列編號1-人類CD27鹼基序列
序列編號2-人類CD27胺基酸序列
序列編號3-人工序列之描述：CD27前置引子
序列編號4-人工序列之描述：CD27809B
序列編號5-人工序列之描述：CD27-A引子
序列編號6-人工序列之描述：CD27-B引子
序列編號7-人工序列之描述：引子1
序列編號8-人工序列之描述：引子2
序列編號9-人工序列之描述：g4A引子
序列編號10-人工序列之描述：g4B引子
序列編號11-人工序列之描述：CD27-Fc蛋白質鹼基序列
序列編號12-人工序列之描述：CD27-Fc蛋白質胺基酸序列
序列編號13-人工序列之描述：CD27-C引子
序列編號14-人工序列之描述：大鼠IgG1特異性引子
序列編號15-人工序列之描述：大鼠IgG2a特異性引子
序列編號16-人工序列之描述：大鼠IgG2b特異性引子
序列編號17-人工序列之描述：大鼠CH1特異性引子
序列編號18-人工序列之描述：大鼠Ig(κ)特異性引子1
序列編號19-人工序列之描述：大鼠Ig(κ)特異性引子2
序列編號20-KM4026 VH鹼基序列
序列編號21-KM4027 VH鹼基序列
序列編號22-KM4028 VH鹼基序列
序列編號23-KM4030 VH鹼基序列
序列編號24-KM4031 VH鹼基序列
序列編號25-KM4026 VH胺基酸序列
序列編號26-KM4027 VH胺基酸序列
序列編號27-KM4028 VH胺基酸序列
序列編號28-KM4030 VH胺基酸序列
序列編號29-KM4031 VH胺基酸序列
序列編號30-KM4026 VL鹼基序列
序列編號31-KM4027 VL鹼基序列
序列編號32-KM4028 VL鹼基序列
序列編號33-KM4030 VL鹼基序列
序列編號34-KM4031 VL鹼基序列
序列編號35-KM4026 VL胺基酸序列
序列編號36-KM4027 VL胺基酸序列
序列編號37-KM4028 VL胺基酸序列
序列編號38-KM4030 VL胺基酸序列
序列編號39-KM4031 VL胺基酸序列
序列編號40-KM4026 VH CDR1
序列編號41-KM4026 VH CDR2
序列編號42-KM4026 VH CDR3
序列編號43-KM4026 VL CDR1
序列編號44-KM4026 VL CDR2
序列編號45-KM4026 VL CDR3
序列編號46-KM4027 VH CDR1
序列編號47-KM4027 VH CDR2
序列編號48-KM4027 VH CDR3
序列編號49-KM4027 VL CDR1
序列編號50-KM4027 VL CDR2
序列編號51-KM4027 VL CDR3
序列編號52-KM4028 VH CDR1
序列編號53-KM4028 VH CDR2
序列編號54-KM4028 VH CDR3
序列編號55-KM4028 VL CDR1
序列編號56-KM4028 VL CDR2
序列編號57-KM4028 VL CDR3
序列編號58-KM4030 VH CDR1
序列編號59-KM4030 VH CDR2
序列編號60-KM4030 VH CDR3
序列編號61-KM4030 VL CDR1
序列編號62-KM4030 VL CDR2
序列編號63-KM4030 VL CDR3
序列編號64-KM4031 VH CDR1
序列編號65-KM4031 VH CDR2
序列編號66-KM4030 VH CDR3
序列編號67-KM4031 VL CDR1
序列編號68-KM4031 VL CDR2
序列編號69-KM4031 VL CDR3
序列編號70-人工序列之描述：KM4026 VL嵌合引子1
序列編號71-人工序列之描述：KM4026 VL嵌合引子2
序列編號72-人工序列之描述：KM4026 VH嵌合引子1
序列編號73-人工序列之描述：KM4026 VH嵌合引子2
序列編號74-人工序列之描述：KM4027 VL嵌合引子1
序列編號75-人工序列之描述：KM4027 VL嵌合引子2
序列編號76-人工序列之描述：KM4027 VH嵌合引子1
序列編號77-人工序列之描述：KM4027 VH嵌合引子2
序列編號78-人工序列之描述：KM4028 VL嵌合引子1
序列編號79-人工序列之描述：KM4028 VL嵌合引子2
序列編號80-人工序列之描述：KM4028 VH嵌合引子1
序列編號81-人工序列之描述：KM4028 VH嵌合引子2
序列編號82-人工序列之描述：KM4030 VL嵌合引子1
序列編號83-人工序列之描述：KM4030 VL嵌合引子2
序列編號84-人工序列之描述：KM4030 VH嵌合引子1
序列編號85-人工序列之描述：KM4030 VH嵌合引子2
序列編號86-人工序列之描述：KM4031 VL嵌合引子1
序列編號87-人工序列之描述：KM4031 VL嵌合引子2
序列編號88-人工序列之描述：KM4031 VH嵌合引子1
序列編號89-人工序列之描述：KM4031 VH嵌合引子2
序列編號90-人工序列之描述：引子mfCD27_5UTR
序列編號91-人工序列之描述：引子mfCD27_3UTR
序列編號92-食蟹猴CD27 cDNA序列
序列編號93-人工序列之描述：引子mfCD27toKAN_5
序列編號94-人工序列之描述：引子mfCD27HisKAN_3
序列編號95-人工序列之描述：附帶His標籤之食蟹猴CD27 cDNA序列
序列編號96-人工序列之描述：KM4030 HV0胺基酸序列
序列編號97-人工序列之描述：KM4030 LV0胺基酸序列
序列編號98-人工序列之描述：KM4030 HV0鹼基序列
序列編號99-人工序列之描述：KM4030 LV0鹼基序列
序列編號100-人工序列之描述：KM4030 HV2鹼基序列
序列編號101-人工序列之描述：KM4030 HV2胺基酸序列
序列編號102-人工序列之描述：KM4030 HV3鹼基序列
序列編號103-人工序列之描述：KM4030 HV3胺基酸序列
序列編號104-人工序列之描述：KM4030 HV5鹼基序列
序列編號105-人工序列之描述：KM4030 HV5胺基酸序列
序列編號106-人工序列之描述：KM4030 HV7鹼基序列
序列編號107-人工序列之描述：KM4030 HV7胺基酸序列
<110>　日商協和醱酵麒麟有限公司
<120>　人類抗CD27單株抗體
<130>　W500862
<140>　099146686
<141>　2010-12-29
<150>　61/290,542
<151>　2009-12-29
<160>　107
<170>　PatentIn第3.3版
<210>　1
<211>　783
<212>　DNA
<213>　智人
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..(783)
<223>　人類CD27 DNA序列
<400>　1
<210>　2
<211>　260
<212>　PRT
<213>　智人
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<211>　65
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：CD27前置引子
<400>　3
<210>　4
<211>　29
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：CD27809B
<400>　4
<210>　5
<211>　65
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：CD27-A引子
<400>　5
<210>　6
<211>　29
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：CD27-B引子
<400>　6
<210>　7
<211>　62
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：引子1
<400>　7
<210>　8
<211>　60
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：引子2
<400>　8
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<211>　35
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：g4A引子
<400>　9
<210>　10
<211>　32
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：g4B引子
<400>　10
<210>　11
<211>　1248
<212>　DNA
<21a>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：CD27-Fc蛋白質
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..(1248)
<223>　CD27-Fc融合蛋白質DNA序列
<400>　11
<210>　12
<211>　415
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成構建
<400>　12
<210>　13
<211>　30
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：CD27-C引子
<400>　13
<210>　14
<211>　27
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：大鼠IgG1特異性引子
<400>　14
<210>　15
<211>　28
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：大鼠IgG2a特異性引子
<400>　15
<210>　16
<211>　28
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：大鼠IgG2b特異性引子
<400>　16
<210>　17
<211>　24
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：大鼠CH1特異性引子
<400>　17
<210>　18
<211>　31
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：大鼠Ig(κ)特異性引子1
<400>　18
<210>　19
<211>　29
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：大鼠Ig(κ)特異性引子2
<400>　19
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<212>　DNA
<213>　溝鼠
<400>　20
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<211>　411
<212>　DNA
<213>　溝鼠
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<211>　411
<212>　DNA
<213>　溝鼠
<400>　22
<210>　23
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<212>　DNA
<213>　溝鼠
<400>　23
<210>　24
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<212>　DNA
<213>　溝鼠
<400>　24
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<212>　PRT
<213>　溝鼠
<400>　25
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<212>　PRT
<213>　溝鼠
<400>　26
<210>　27
<211>　137
<212>　PRT
<213>　溝鼠
<400>　27
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<212>　PRT
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<212>　PRT
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<212>　DNA
<213>　溝鼠
<400>　31
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<211>　399
<212>　DNA
<213>　溝鼠
<400>　32
<210>　33
<211>　381
<212>　DNA
<213>　溝鼠
<400>　33
<210>　34
<211>　399
<212>　DNA
<213>　溝鼠
<400>　34
<210>　35
<211>　133
<212>　PRT
<213>　溝鼠
<400>　35
<210>　36
<211>　133
<212>　PRT
<213>　溝鼠
<400>　36
<210>　37
<211>　133
<212>　PRT
<213>　溝鼠
<400>　37
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<212>　PRT
<213>　溝鼠
<400>　38
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<211>　133
<212>　PRT
<213>　溝鼠
<400>　39
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<212>　PRT
<213>　溝鼠
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<212>　PRT
<213>　溝鼠
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<212>　PRT
<213>　溝鼠
<400>　42
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<211>　17
<212>　PRT
<213>　溝鼠
<400>　43
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<212>　PRT
<213>　溝鼠
<400>　44
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<211>　9
<212>　PRT
<213>　溝鼠
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<211>　5
<212>　PRT
<213>　溝鼠
<400>　46
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<211>　17
<212>　PRT
<213>　溝鼠
<400>　47
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<212>　PRT
<213>　溝鼠
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<211>　17
<212>　PRT
<213>　溝鼠
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<210>　50
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<212>　PRT
<213>　溝鼠
<400>　50
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<212>　PRT
<213>　溝鼠
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<211>　5
<212>　PRT
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<400>　52
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<212>　PRT
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<400>　53
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<211>　10
<212>　PRT
<213>　溝鼠
<400>　54
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<211>　16
<212>　PRT
<213>　溝鼠
<400>　55
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<211>　7
<212>　PRT
<213>　溝鼠
<400>　56
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<212>　PRT
<213>　溝鼠
<400>　57
<210>　58
<211>　5
<212>　PRT
<213>　溝鼠
<400>　58
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<211>　17
<212>　PRT
<213>　溝鼠
<400>　59
<210>　60
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<212>　PRT
<213>　溝鼠
<400>　60
<210>　61
<211>　11
<212>　PRT
<213>　溝鼠
<400>　61
<210>　62
<211>　7
<212>　PRT
<213>　溝鼠
<400>　62
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<212>　PRT
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<400>　63
<210>　64
<211>　5
<212>　PRT
<213>　溝鼠
<400>　64
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<211>　16
<212>　PRT
<213>　溝鼠
<400>　65
<210>　66
<211>　9
<212>　PRT
<213>　溝鼠
<400>　66
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<211>　17
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<213>　溝鼠
<400>　67
<210>　68
<211>　11
<212>　PRT
<213>　溝鼠
<400>　68
<210>　69
<211>　9
<212>　PRT
<213>　溝鼠
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<210>　70
<211>　49
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：KM4026 VL引子1
<400>　70
<210>　71
<211>　39
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：KM4026 VL引子2
<400>　71
<210>　72
<211>　51
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：KM4026 VH引子1
<400>　72
<210>　73
<211>　49
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：KM4026 VH引子2
<400>　73
<210>　74
<211>　45
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：KM4027 VL引子1
<400>　74
<210>　75
<211>　34
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：KM4027 VL引子2
<400>　75
<210>　76
<211>　47
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：KM4027 VH引子1
<400>　76
<210>　77
<211>　45
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：KM4027 VH引子2
<400>　77
<210>　78
<211>　45
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：KM4028 VL引子1
<400>　78
<210>　79
<211>　34
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：KM4028 VL引子2
<400>　79
<210>　80
<211>　47
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：KM4028 VH引子1
<400>　80
<210>　81
<211>　45
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：KM4028 VH引子2
<400>　81
<210>　82
<211>　49
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：KM4030 VL引子1
<400>　82
<210>　83
<211>　39
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：KM4030 VL引子2
<400>　83
<210>　84
<211>　52
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：KM4030 VH引子1
<400>　84
<210>　85
<211>　49
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：KM4030 VH引子2
<400>　85
<210>　86
<211>　49
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：KM4031 VL引子1
<400>　86
<210>　87
<211>　39
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：KM4031 VL引子2
<400>　87
<210>　88
<211>　52
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：KM4031 VH引子1
<400>　88
<210>　89
<211>　49
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：KM4031 VH引子2
<400>　89
<210>　90
<211>　30
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：mfCD27_5UTR
<400>　90
<210>　91
<211>　30
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：mfCD27_3UTR
<400>　91
<210>　92
<211>　783
<212>　DNA
<213>　食蟹猴
<400>　92
<210>　93
<211>　71
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　mfCD27toKAN_5
<400>　93
<210>　94
<211>　56
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：mfCD27HisKAN_3
<400>　94
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<211>　801
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：附帶His標籤之食蟹猴CD27 cDNA序列
<400>　95
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<211>　123
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：KM4030 HV0胺基酸序列
<400>　96
<210>　97
<211>　107
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：KM4030 LV0胺基酸序列
<400>　97
<210>　98
<211>　369
<212>　DNA
<215>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：KM4030 HV0 DNA序列
<400>　98
<210>　99
<211>　321
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：KM4030 LV0 DNA序列
<400>　99
<210>　100
<211>　369
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：KM4030 HV2 DNA序列
<400>　100
<210>　101
<211>　123
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：KM4030 HV2胺基酸序列
<400>　101
<210>　102
<211>　369
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：KM4030 HV3 DNA序列
<400>　102
<210>　103
<211>　123
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：HV3胺基酸序列
<400>　103
<210>　104
<211>　369
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：KM4030 HV5 DNA序列
<400>　104
<210>　105
<211>　123
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：KM4030 HV5胺基酸序列
<400>　105
<210>　106
<211>　369
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：KM4030 HV7 DNA序列
<400>　106
<210>　107
<211>　123
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：KM4030 HV7胺基酸序列
<400>　107
圖1係表示含有編碼人類CD27蛋白質之DNA序列的質粒載體pCR2.1 CD27之製作方法。
圖2係表示含有編碼人類CD27蛋白質之細胞外區域之DNA序列的質粒載體pCR CD27 axb之製作方法。
圖3係表示具有人類IgG4恆定區域之胺基酸經置換之變異型人類IgG4Fc區域的質粒載體pBShCγ4SP之製作方法。
圖4係表示含有變異型人類IgG4Fc區域之DNA序列中插入有限制酶識別序列之DNA序列的質粒載體pCRIgG4Fc BamHISalI之製作方法。
圖5係表示插入CD27-Fc之DNA序列的pKANTEX XhoI/SalI之製作方法。
圖6係表示CD27-Fc蛋白質表現載體pKANTEX CD27-hIgG4Fc之製作方法。
圖7(a)及(b)係表示以CHO/DG44細胞及Lec8細胞作為宿主細胞而表現之CD27-Fc蛋白質之SDS-PAGE分析之結果。
圖7(a)係表示未添加β-巰基乙醇之非還原狀態，圖7(b)係表示添加有β-巰基乙醇之還原狀態。圖7(a)及(b)均自左起表示標記物、Lec8細胞及CHO/DG44細胞之部分(fraction)。
圖8(a)係表示以CHO/DG44細胞及Lec8細胞作為宿主細胞而表現之CD27-Fc蛋白質之SDS-PAGE分析之結果。又，圖8(b)係表示以CHO/DG44細胞及Lec8細胞作為宿主細胞而表現之CD27-Fc蛋白質之西方墨點法分析之結果。圖8(a)及(b)均自左側泳道起表示標記物、CHO/DG44細胞及Lec8細胞之樣本。西方墨點法係使用抗RCAS1抗體22-1-1抗體進行染色。
圖9係表示含有編碼動物細胞表現用之CD27蛋白質之DNA的質粒載體pCR CD27 axc之製作方法。
圖10係表示動物細胞表現載體pKANTEX CD27之製作方法。
圖11(a)及(b)係表示抗CD27單株抗體對CD27表現CHO/DG44細胞、及CD27表現Lec8細胞的流式細胞儀分析之結果。圖11(a)係針對CD27/Lec8-4之直方圖之結果，圖11(b)係針對CD27/DG44-8之直方圖之結果。該等直方圖均以縱軸表示細胞數，以橫軸表示螢光強度。
圖12(a)及(b)係表示使用螢光細胞染色法測定抗糖鏈缺乏CD27單株抗體KM4030及KM4031對Lec8細胞、CD27/Lec8-4細胞及CD27/DG44-8細胞之結合活性而獲得之結果。圖12(a)表示使用ABI蜂巢式偵測系統之測定結果，縱軸表示螢光強度，橫軸表示所反應之抗體。圖12(b)表示使用流式細胞儀(FCM)之測定結果，縱軸表示平均螢光強度，橫軸表示所反應之抗體。
圖13(a)及(b)係表示抗糖鏈缺乏CD27單株抗體KM4030及KM4031之競爭ELISA之結果。圖13(a)表示抗糖鏈缺乏CD27單株抗體KM4030之反應性，圖13(b)表示抗糖鏈缺乏CD27單株抗體KM4031之反應性，縱軸表示細胞增殖，橫軸表示抗體濃度。
圖14(a)及(b)係表示抗糖鏈缺乏CD27單株抗體之基因選殖方法。
圖15係表示抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體表現載體之製作方法。
圖16係表示抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體表現載體之製作方法。
圖17係表示抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體表現載體之製作方法。
圖18係表示抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體表現載體之製作方法。
圖19(A)(a)及(b)係表示使用流式細胞儀(FCM)測定各種抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體嵌合型KM4026(◇)、嵌合型KM4028(△)、嵌合型KM4030(○)、嵌合型KM4031(□)對CD27/Lec8-4細胞之結合活性之結果。又，圖19(A)(b)係表示使用流式細胞儀(FCM)測定市售抗CD27抗體O323(●)對CD27/Lec8-4細胞之結合活性之結果。縱軸表示平均螢光強度，橫軸表示所反應之抗體之最終濃度。
圖19(B)(a)係表示使用流式細胞儀(FCM)測定各種抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體嵌合型KM4026(◇)、嵌合型KM4028(△)、嵌合型KM4030(○)、嵌合型KM4031(□)對CD27/DG44-4細胞之結合活性之結果。又，圖19(B)(b)係表示使用流式細胞儀(FCM)測定市售抗CD27抗體O323(●)對CD27/DG44-4細胞之結合活性之結果。縱軸表示平均螢光強度，橫軸表示所反應之抗體之最終濃度。
圖19(C)(a)係表示使用流式細胞儀(FCM)測定各種抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體嵌合型KM4026(◇)、嵌合型KM4028(△)、嵌合型KM4030(○)、嵌合型KM4031(□)對Lec8細胞之結合活性之結果。又，圖19(C)(b)係表示使用流式細胞儀(FCM)測定市售抗Tn抗體22-1-1(■)對Lec8細胞之結合活性之結果。縱軸表示平均螢光強度，橫軸表示所反應之抗體之最終濃度。
圖20係表示各種抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體嵌合型KM4026(◇)、嵌合型KM4028(△)、嵌合型KM4030(○)及嵌合型KM4031(□)對CD27/Lec8-4細胞之抗體依賴性細胞毒殺活性(ADCC活性)。縱軸表示細胞毒殺活性(%)，橫軸表示各抗體之最終濃度。
圖21係表示各種抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體嵌合型KM4026、嵌合型KM4028、嵌合型KM4030及嵌合型KM4031對CD27/Lec8-4細胞之補體依賴性細胞毒殺活性(CDC活性)。縱軸表示細胞毒殺活性(%)，橫軸表示所反應之抗體。
圖22係表示含有編碼食蟹猴CD27蛋白質之DNA的質粒載體pCR mfCD27之製作方法。
圖23係表示含有編碼食蟹猴CD27蛋白質之DNA的質粒載體mfCD27His之製作方法。
圖24係表示食蟹猴CD27表現載體pKANTEX mfCD27His之製作方法。
圖25係表示使用流式細胞儀(FCM)測定各種抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體嵌合型KM4026、嵌合型KM4028、嵌合型KM4030、嵌合型KM4031及市售抗CD27抗體O323對食蟹猴CD27/Lec8細胞或食蟹猴CD27/DG44細胞之結合活性之結果。縱軸表示平均螢光強度，橫軸表示所反應之抗體。
圖26係表示各種抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體嵌合型KM4026(◆)、嵌合型KM4028(▲)、嵌合型KM4030(●)及嵌合型KM4031(■)對食蟹猴CD27/Lec8細胞之抗體依賴性細胞毒殺活性(ADCC活性)。縱軸表示細胞毒殺活性(%)，橫軸表示各抗體之最終濃度。
圖27係表示各種抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體嵌合型KM4030對食蟹猴CD27/Lec8細胞(●)或者人類CD27/Lec8細胞(○)之抗體依賴性細胞毒殺活性(ADCC活性)。縱軸表示細胞毒殺活性(%)，橫軸表示各抗體之最終濃度。
圖28(A)(a)係表示抗糖鏈缺乏CD27抗體KM4026對糖鏈缺乏CD27-Fc(Tn抗原型CD27-Fc)之結合的Biacore感應圖。圖28(A)(b)係表示抗糖鏈缺乏CD27抗體KM4027對糖鏈缺乏CD27-Fc(Tn抗原型CD27-Fc)之結合的Biacore感應圖。圖28(A)(c)係表示抗糖鏈缺乏CD27抗體KM4028對糖鏈缺乏CD27-Fc(Tn抗原型CD27-Fc)之結合的Biacore感應圖。圖28(A)(d)係表示抗糖鏈缺乏CD27抗體KM4030對糖鏈缺乏CD27-Fc(Tn抗原型CD27-Fc)之結合的Biacore感應圖。圖28(A)(e)係表示抗糖鏈缺乏CD27抗體KM4031對糖鏈缺乏CD27-Fc(Tn抗原型CD27-Fc)之結合的Biacore感應圖。縱軸表示RU(resonance unit，共振單位)，橫軸表示反應時間(秒)。
圖28(B)(a)係表示抗糖鏈缺乏CD27抗體KM4026對唾液酸化Tn抗原型CD27-Fc之結合的Biacore感應圖。圖28(B)(b)係表示各種抗糖鏈缺乏CD27抗體KM4027對唾液酸化Tn抗原型CD27-Fc之結合的Biacore感應圖。圖28(B)(c)係表示抗糖鏈缺乏CD27抗體KM4028對唾液酸化Tn抗原型CD27-Fc之結合的Biacore感應圖。圖28(B)(d)係表示抗糖鏈缺乏CD27抗體KM4030對唾液酸化Tn抗原型CD27-Fc之結合的Biacore感應圖。圖28(B)(e)係表示抗糖鏈缺乏CD27抗體KM4031對唾液酸化Tn抗原型CD27-Fc之結合的Biacore感應圖。縱軸表示RU(resonance unit，共振單位)，橫軸表示反應時間(秒)。
圖29(a)係表示抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體KM4030對糖鏈缺乏CD27-Fc(Tn抗原型CD27-Fc)之結合的Biacore感應圖。圖29(b)係表示人類化抗體HV0LV0對糖鏈缺乏CD27-Fc(Tn抗原型CD27-Fc)之結合的Biacore感應圖。圖29(c)係表示人類化抗體HV5LV0對糖鏈缺乏CD27-Fc(Tn抗原型CD27-Fc)之結合的Biacore感應圖。圖29(d)係表示人類化抗體HV7LV0對糖鏈缺乏CD27-Fc(Tn抗原型CD27-Fc)之結合的Biacore感應圖。縱軸表示RU(resonance unit，共振單位)，橫軸表示反應時間(秒)。
圖30(A)係表示使用流式細胞儀(FCM)測定抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體KM4030(○)及抗糖鏈缺乏CD27人類化抗體HV0LV0(□)、HV5LV0(△)、HV7LV0(◇)對CD27/Lec8-M19細胞之結合活性之結果。縱軸表示平均螢光強度，橫軸表示所反應之抗體之最終濃度。
圖30(B)係表示使用流式細胞儀(FCM)測定抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體KM4030(○)及抗糖鏈缺乏CD27人類化抗體HV0LV0(□)、HV5LV0(△)、HV7LV0(◇)對CD27/DG44-4細胞之結合活性之結果。縱軸表示平均螢光強度，橫軸表示所反應之抗體之最終濃度。
圖31係表示抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體KM4030(○)及抗糖鏈缺乏CD27人類化抗體HV0LV0(□)、HV5LV0(△)、HV7LV0(◇)對CD27/Lec8-M19細胞之抗體依賴性細胞毒殺活性(ADCC活性)。縱軸表示細胞毒殺活性(%)，橫軸表示各抗體之最終濃度。
圖32係表示抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體KM4030(○)及抗糖鏈缺乏CD27人類化抗體HV0LV0(□)、HV5LV0(△)、HV7LV0(◇)對CD27/Lec8-M19細胞之補體依賴性細胞毒殺活性(CDC活性)。縱軸表示細胞毒殺活性(%)，橫軸表示所反應之抗體。
圖33(A)係表示使用流式細胞儀(FCM)測定抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體KM4030(○)及抗糖鏈缺乏CD27人類化抗體HV0LV0(□)、HV5LV0(△)、HV7LV0(◇)對食蟹猴CD27/Lec8細胞之結合活性之結果。縱軸表示平均螢光強度，橫軸表示所反應之抗體之最終濃度。
圖33(B)係表示使用流式細胞儀(FCM)測定抗糖鏈缺乏CD27嵌合抗體KM4030(○)及抗糖鏈缺乏CD27人類化抗體HV0LV0(□)、HV5LV0(△)、HV7LV0(◇)對食蟹猴CD27/DG44細胞之結合活性之結果。縱軸表示平均螢光強度，橫軸表示所反應之抗體之最終濃度。
(無元件符號說明)

Claims (9)

  1. 一種人類化抗體或其抗體片段，該抗體之VH係含有分別以序列編號58~60表示之CDR1~3的胺基酸序列之VH，且抗體之VL係含有分別以序列編號61~63表示之CDR1~3的胺基酸序列之VL，其可識別並結合由含有未結合半乳糖之O結合型糖鏈的CD27基因編碼之多肽之細胞外區域。
  2. 如請求項1之人類化抗體或其抗體片段，其中(a)人類化抗體之VH含有導入有選自將序列編號96所表示之胺基酸序列中的第30號之Ser置換為Asn、將第48號之Val置換為Ile、將第49號之Ser置換為Ala、將第77號之Asn置換為Gly、將第93號之Val置換為Thr、將第97號之Ala置換為Thr、及將第117號之Thr置換為Val之修飾中的至少1種修飾之胺基酸序列，且人類化抗體之VL含有導入有選自將序列編號97所表示之胺基酸序列中的第21號之Ile置換為Leu、將第40號之Pro置換為Leu、將第58號之Val置換為Ile、將第85號之Thr置換為Ala、及將第87號之Tyr置換為Phe之修飾中的至少1種修飾之胺基酸序列；或者(b)人類化抗體之VH含有序列編號96、105及107中之任一個胺基酸序列，且人類化抗體之VL含有序列編號97所表示之胺基酸序列。
  3. 一種DNA，其編碼如請求項1之人類化抗體或該抗體片段。
  4. 一種重組體載體，其含有如請求項3之DNA。
  5. 一種轉形株，其係將如請求項4之重組體載體導入宿主細胞中而獲得。
  6. 一種如請求項1之抗體或該抗體片段之製造方法，其係於培養基中培養如請求項5之轉形株，使如請求項1之人類化抗體或該抗體片段生成蓄積於培養物中，再自該培養物中採集抗體或該抗體片段。
  7. 一種含有未結合半乳糖之O結合型糖鏈的CD27之檢測試劑，其含有如請求項1之人類化抗體或該抗體片段。
  8. 一種與含有未結合半乳糖之O結合型糖鏈的CD27相關之疾病之診斷或治療藥，其含有如請求項1之人類化抗體或該抗體片段。
  9. 如請求項8之診斷或治療藥，其中與含有未結合半乳糖之O-結合型糖鏈的CD27相關之疾病為IgA腎病或癌。
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