KR101089904B1 - 트란스타이레틴 안정화 및 트란스타이레틴 미스폴딩 저해용조성물 및 방법 - Google Patents

Abstract

트란스타이레틴 테트라머의 자연 상태의 운동 안정화는 트란스타이레틴 미스폴딩을 저해하는 유효한 기작이다. 트란스타이레틴 미스폴딩은 트란스타이레틴 아밀로이드 질환에서 중요한 역할을 하기 때문에, 그러한 미스폴딩의 저해는 그러한 질환의 유효한 치료 또는 예방으로서 사용될 수 있다. 특정한 트란스타이레틴 안정화 화합물 뿐 아니라 치료 방법들, 검색 방법들이 기재된다.

Description

트란스타이레틴 안정화 및 트란스타이레틴 미스폴딩 저해용 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR STABILIZING TRANSTHYRETIN AND INHIBITING TRANSTHYRETIN MISFOLDING}

관련된 출원에 대한 교차 레퍼런스

본 출원은 2002년 12월 19일 출원된, 미국 가출원 번호 60/435,079에 대한 우선권 주장 출원이고 그것의 모든 내용은 여기에 레퍼런스로 삽입된다.

연방 지원 연구에 대한 기재

여기에 기재된 일부 연구 지원에 사용된 기금은 국립 보건원에 의한 인증 번호 NIH DK 46335에 의하여 제공되었다. 정부는 그 발명에 대한 일정 권리를 갖는다.

기술 분야

본 발명은 일반적으로 단백질 미스폴딩에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 트란스타이레틴 안정화 및 트란스타이레틴 미스폴딩 저해 및 그것에 관련된 아밀로이드 질환들 치료용 조성물 및 방법을 제공한다.

트란스타이레틴(Transthyretin, TTR)은 혈청과 뇌 척수액에 존재하는 55 kDa의 호모테트라머 단백질이다. TTR의 기능은 L-타이록신(T₄)과 홀로-레티놀 결합 단백질(RBP)을 이송시키는 것이다. TTR은 인간에서 질환 병리를 일으키는 소 섬유들과 다른 응집체로 전환될 수 있는 20개 이상의 비동질성(nonhomologous) 아밀로이드 형성 단백질 중 하나이다. 이 질환들은 단백질 응집으로 인한 기능의 손실에 의해 야기되는 것으로보이지 않는다. 대신에, 응집은 아직 밝혀지지 않은 기작에 의해 신경/세포 기능 장애를 야기하는 것을 나타낸다.

변성 조건하에서 속도 결정 야생형 TTR 테트라머 해리 및 바른 단량체 미스폴딩은 노인성 전신성 아밀로이드증(SSA)을 야기하는 것으로 추정하는 아밀로이드로 착오결합(misassembly)을 가능하게 한다. 80개 이상의 TTR 변이체 중 하나의 해리 및 미스폴딩은 가족성 아밀로이드 다발신경변증(polyneuropathy; FAP) 및 가족성 아밀로이드 심근증(FAC)을 일으킨다.

TTR 테트라머는 두 C2 대칭 T₄-결합 자리를 가지고 있다. T₄의 네가티브적 협동 결합이 TTR 테트라머를 안정화시키고 아밀로이드 소 섬유 형성을 저해하는 것으로 알려졌다. 불행하게도, 타이로이드-결합 글로불린(TBG)은 TTR과 비교하여 T₄에 대한 더 큰 친화도를 가지기 때문에 인간 혈청에서 1% 이하의 TTR이 그것에 결합한 T₄를 가지고 있다. 또한 T₄의 혈청 농도는 TTR 농도(3.6-7.2μM)에 비하여 상대적으로 낮다(0.1μM).

발명의 요약

본 발명은 트란스타이레틴의 자연 상태의 운동 안정화가 단백질 미스폴딩을 저해한다는 발견에 적어도 부분적으로 기초한다. 이 발견은 단백질 미스폴딩이 트란스타이레틴 아밀로이드 병을 포함하여 다양한 질환의 과정에서 역할을 하기 때문에 중요하다. 트란스타이레틴 미스폴딩을 저해하여 그러한 질환에 개입할 수 있고, 증상을 완화할 수 있고 또는 일부 경우에는 그 질환을 예방하거나 치료할 수 있다.
트란스타이레틴의 자연 상태의 운동 안정화가 효과적으로 미스폴딩을 저해한다는 발견은 잠재적으로 높은 특이성 및 낮은 독성을 갖는 치료 조성물의 개발을 가능케한다. 따라서 비록 트란스타이레틴을 안정화하는 능력을 갖는 예시적인 바이아릴 약제들이 여기에 공지되었지만 단백질을 선택적으로 안정화하는 다른 약제들을 고안할 수 있다. 예를 들면, 여기에 기술된 것과 같이 트란스타이레틴에 결합에 대한 높은 선택성을 가지고 트란스타이레틴의 자연 상태를 안정화하는 폴리염화 바이페닐들, 디푸루니살(diflunisal) 유사체들(analogs), 또는 벤조사졸(benzoxazoles)들을 디자인하고 제조할 수 있다.

일 측면에서 본 발명은 트란스타이레틴 테트라머의 해리를 저해하거나 감소시키는 화합물의 검색하는 방법을 나타낸다. 본 발명은 후보 화합물로 트란스타이레틴 테트라머를 접촉하는 단계; 및 상기 후보 화합물이 트란스타이레틴 테트라머의 해리와 관련된 활성화 에터지를 증가시켜 트란스타이레틴 테트라머의 해리를 저해 또는 감소하는지 여부를 결정하는 단계와 같은 상기 단계들을 포함할 수 있다. 본 방법은 선택적으로 소섬유(fibril) 형성을 저해하는 후보 화합물의 능력을 측정하는 부가적인 단계를 포함할 수 있다.

일 구체예에서 본 방법은 상기 화합물이 트란스타이레틴 테트라머의 해리 전이 상태를 불안정화하여 트란스타이레틴 테트라머의 해리를 저해하는지를 결정하는 단계를 포함한다. 또 다른 구체예에서 본 방법은 상기 화합물이 트란스타이레틴 테트라머의 안정화에 의하여 트란스타이레틴 테트라머의 해리를 저해하는지를 결정하는 단계를 포함한다.

그러한 방법에 사용된 상기 후보 화합물은 선택적으로 소 분자들일 수 있다. 그러한 소 분자는 테트라머 결합을 통하여 트란스타이레틴의 자연 상태를 안정화할 수 있고 그것에 의하여 운동 안정화 기작을 통하여 변성 및 생리적 조건하에서 해리 및 아밀로이드증을 늦춘다. 상기 화합물은 선택적으로 10.6μM의 농도에서 투여된 경우에 인간 혈액에서 TTR에 대한 0.1 초과하는 결합 당량을 나타낸다.

소(small) 분자는 선택적으로 1500이하의 분자량을 가질 수 있고 트란스타이레틴에 비(non)- 또는 포지피브하게 협동적으로 결합하고 2.3kcal/mol 이상의 결합에너지를 준다. 소 분자는 Kd1 및 Kd2〈100nM(예를 들어, 〈10nM) 및/또는 높은 혈장 농도를 나타낼 수 있고 모두는 2.0kcal/mol을 초과하는 단백질 안정화에 기여한다. 소 분자는 또 아밀로이드증의 수율을 감소시키고 산-매개 또는 메탄올 매개 아밀로이드형성(amyloidogenesis)의 속도를 감소시키고 또는 우레아 매개 TTR 해리 속도를 감소시킬 수 있다.

몇몇 구체예에서 소 분자는 바이페닐 아민, 바이페닐, 오심 에테르(oxime ether), 벤자졸(benzazole) 또는 한쪽은 산과 페놀과 같은 친수성 기를 다른 쪽은 할로겐 또는 알킬과 같은 소수성 기들을 포함하는 두 방향족 링으로 구성된 다른 구조들을 포함한다. 일 구체예에서, 후보 화합물은 한 링은 친수성 치환기(들)를 포함하고 다른 것은 소수성 치환기들을 가지는 바이아릴이거나 모든 두 링들이 적어도 한 친수성 치환기를 포함하는 다이아릴이다. 친수성 그룹은 페놀, COOH, 벤질 알코올, 보론(boronic) 산 또는 에스테르, 테느라졸, 알데히드 또는 수화 알데히드 또는 단백질과 직접 또는 물 매개 수소-결합을 통하여 수소 결합 공여체 또는 수용체로 작용하는 작용기일 수 있다.

상기 바이아릴은 페놀, 카르복실기 또는 알콜 및 일부 경우에는 TTR 내의 할로겐 결합 포켓에 상보적인 할로겐을 포함하는 친수성 작용기성을 가지며 치환된 양 링을 가지는 대칭적 바이아릴일 수 있고 예를 들어 하기 기능성 3-Cl, 4-OH,5-C1 및 3'-C1, 4'-OH, 5'-Cl을 갖는 바이아릴이다. 일 구체예에서 바이아릴의 적어도 한 링은 2,4-디후로로(difluoro) 또는 3,5-디후호로 또는 2,6-디후로로 또는 3,5-디클로로(dichloro) 또는 3-C1, 4-OH, 5-C1 또는 3-F, 4-OH, 5-F, 3-COOH, 4-OH 또는 3-OH 또는 3-COOH 또는 4-COOH 또는 3-CH20H 또는 4-CH20H 치환체들이다. 예시적인 바이아릴(biaryl)은 적어도 한 링이 3-C1, 4-OH, 5-C1 또는 2-Cl, 3-C1, 4-OH, 5-Cl 또는 3,4-DiCl, 또는 2,3,4-트리클로로 또는 2,3,4,5-테트라클로로를 포함하는OH 및/또는 Cl 치환체를 포함하는 예를 들어 수산화된(hydroxylated) 폴리염화 바이페닐과 같은 폴리염화 바이페닐이다. 염소 이외의 할로겐이 후보 화합물로 사용될 수 있다. 그 후보 화합물은 벤족사졸(benzoxazole)이다.

일 구체예에서 상기 후보 화합물은 디푸루니살(diflunisal) 아나로그이다. 여러 디푸루니살 아나로그 뿐 아니라 디푸루니살의 구조가 여기에 기재된다. 상기 디푸루니살(diflunisal) 아나로그는 선택적으로 디푸루니살과 비교하여 감소된 NSAID 활성을 가지거나 NSAID 활성이 없다. 예를 들어 상기 디푸루니살 (diflunisal) 아나로그는 디푸루니살과 비교하여 감소된 사이클로옥시겐네이즈 저해제 활성을 가지거나 사이클로옥시겐네이즈 저해제 활성이 없다.

일 구체예에서 본 방법은 디푸루니살(diflunisal) 아나로그가 NSAID 활성을 나타내는지를 결정하는 부가적인 단계를 포함한다. 예를 들어, 본 방법은 디푸루니살(diflunisal) 아나로그가 사이클로오시겐네이즈 저해제 활성을 나타내는지를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 검색 방법들에 사용된 상기 트란스타이레틴은 야생형 트란스타이레틴 또는 가족성 아밀로이드 말초신경변증 또는 가족성 아밀로이드 심근증과 같은 트란스타이레틴 아밀로이드 질환의 발생과 우연하게 관련된 자연 발생적 트란스타이레틴 돌연변이체일 수 있다. 예시적인 자연 발생적 트란스타이레틴 돌연변이체는 V122I, V30M, L55P (상기 변이체 명명법은 야생형과 비교하여 열거된 아미노산 위치에서 치환을 묘사한다; 예를 들어 Saraiva 외. (2001) Hum.Mut. 17: 493-503 참조).

본 발명은 또한 조직 또는 생체액 내의 트란스타이레틴의 안정화하여 미스폴딩을 저해하는 방법을 제공한다.

일반적으로, 본 방법은 트란스타이레틴에 결합하고 트란스타이레틴 테트라머의 자연 상태의 운동 안정화에 의하여 트란스타이레틴 테트라머의 해리를 저해하는 여기에 기재된 한 화합물의 안정화된 양을 포함하는 조성물을 조직 또는 생체액에 투여하는 것을 포함한다.

따라서 병든 조직에서 트란스타이레틴을 안정화하는 방법들은 미스폴딩을 완화하고 관련된 질환의 증상을 완화하고 질환에 따라서는 그 질환의 치료에 기여할 수 있다. 본 발명은 조직 및/또는 세포 내에서 트란스타이레틴 미스폴딩의 저해를 예상한다. 미스폴딩의 정도 및 따라서 본 방법들에 의하여 달성된 저해의 정도는 실시예에 기재된 방법과 같은 여러 방법들에 의하여 평가될 수 있다.

그러므로, 또 다른 측면에서 본 발명은 트란스타이레틴 테트라머의 자연 상태의 운동 안정화에 의하여 트란스타이레틴 테트라머의 해리를 저해하는 치료적으로 유효한 량의 화합물을 트란스타이레틴 아밀로이드 질환을 갖는 것으로 진단된 대상에 투여하는 것을 포함하는 트란스타이레틴 아밀로이드 질환 치료 방법을 포함한다.

일 구체예에서 본 발명은 트란스타이레틴 테트라머의 해리를 저해하는 치료적으로 유효한 량의 디푸루니살 아나로그(예를 들어 트란스타이레틴 테트라머의 해리를 저해하는 디푸루니살 아나로그)을 트란스타이레틴 아밀로이드 질환을 갖는 것으로 진단된 대상에 투여하는 것을 포함하는 트란스타이레틴 아밀로이드 질환 치료 방법이다. 디푸루니살 아나로그는 선택적으로 디푸루니살과 비교하여 감소된 NSAID 활성(예를 들어 사이클로옥시겐네이즈 저해제 활성)을 가지거나 NSAID 활성(예를 들어 사이클로옥시겐네이즈 저해제 활성)이 없다.

또 다른 구체예에서 본 발명은 트란스타이레틴 테트라머의 해리를 저해하는 치료적으로 유효한 량의 폴리염화 바이페닐(예를 들어 트란스타이레틴 테트라머의 해리를 저해하는 폴리염화 바이페닐)을 트란스타이레틴 아밀로이드 질환을 갖는 것으로 진단된 대상에 투여하는 것을 포함하는 트란스타이레틴 아밀로이드 질환 치료 방법이다. 상기 폴리염화 바이페닐은 수산화된 폴리염화 바이페닐일 수 있다.

또 다른 구체예에서 본 발명은 트란스타이레틴 테트라머의 해리를 저해하는 치료적으로 유효한 량의 벤족사졸(예를 들어 트란스타이레틴 테트라머의 해리를 저해하는 벤족사졸)을 트란스타이레틴 아밀로이드 질환을 갖는 것으로 진단된 대상에 투여하는 것을 포함하는 트란스타이레틴 아밀로이드 질환 치료 방법이다.

상기 트란스타이레틴 아밀로이드 질환은 예를 들어 가족성 아밀로이드 말초신경병증, 가족성 아밀로이드 심근증,또는 노인성 전신성 아밀로이드증일 수 있다.

본 방법들에서 치료된 대상은 비록 본 발명의 원칙이 본 발명은 모든 포유류에 대해서 효과적이다라는 것을 나태내는 것으로 이해되지만 인간 대상일 수 있다. 본 내용에서 "포유류"는 트란스타이레틴 미스폴딩과 관련된 질환들의 치료가 바람직한 포유류 종, 특히 농업 및 가축 포유류 종들을 포함한다.

여기에 기재된 화합물들(예를 들어 디푸루니 아나로그, 폴리염화 바이페닐 또는 벤족사졸과 같은 바이아릴 화합물들)은 상기 화합물을 포함하는 약학 조성물로 제조하기 위하여 약학적으로 수용가능하게 조제화될 수 있다. 그들이 조성물들, 담체, 희석액 및 약제들에 속하는 것과 같이 여기에 사용된 "약학적으로 수용가능한", "생리학적으로 허용될 수 있는" 및 그것의 문법상 변이체는 상호교환적으로 사용되고 그 물질은 바람직하지 않은 생리적 효과들의 생성없이 포유류에 대하여 투여할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명은 또한 트란스타이레틴 아밀로이드 질환(예를 들어 가족성 아밀로이드 말초신경병증, 가족성 아밀로이드 심근증,또는 노인성 전신성 아밀로이드증)의 치료에 대하여 여기에 기재된 화합물 또는 약학 조성물의 일부의 사용을 포함한다.

본 발명은 또한 트란스타이레틴 아밀로이드 질환(예를 들어 가족성 아밀로이드 말초신경병증, 가족성 아밀로이드 심근증,또는 노인성 전신성 아밀로이드증)의 치료에 대한 약제의 제조에서 여기에 기재된 화합물 또는 약학 조성물의 일부의 사용을 포함한다.

여기에 기재된 화합물들과 치료 방법들은 TTR 아밀로이드증(amyloidosis)에 현재 이용가능한 치료법들에 비하여 현저한 잇점을 제공한다. TTR 아밀로이드증은 전형적으로 10년 내에 사망에 이르고 현재까지 불치의 병으로 간주된다. 간장 이식 수술은 간장이 전형적으로 아밀로이드형성 TTR의 기원이므로 가족성의 경우들에서 WT 대립 유전자(allele)에 의해 상기 질환-관련 대립 유전자를 대체하는 효과적인 방법이다. 간장 이식 수술은 유전자 치료의 형태로 효과적이지만 그것의 문제가 없는 것이 아니다. 이식 수술은 수령인과 기증자 양쪽 모두에 대한 수술의 필요, 장 기간 이식 후 면역 억제 치료, 기증자의 부족, 그것의 높은 비용 및 그들의 질환의 진행때문에 좋은 후보자가 되지 않은 다수의 TTR 아밀로이드증 환자들에 의하여 복잡하게 된다. 불행하게도, WT TTR은 종종 축적이 계속되므로 심지어 간 이식 후에도 일부 가족성 환자들내에 심장 아밀로이드증 진행된다. 맥락막 총에 의한 그것의 합성으로 인하여 이식에 의해 TTR의 중추 신경계(CNS) 축적이 또한 완화되지 아니한다. 이식 수술은 WT TTR의 축적때문에 80 이상의 사람의 약 25 %에 영향을 주는 가장 일반적인 TTR 질환인 노인성 전신성 아밀로이드증(SSA)에 대한 생존할 수 있는 옵션이 아니다.

다르게 규정되지 않는 한, 여기에 사용된 모두 기술적이고 과학적 용어는 이 발명이 속하는 당업자 중 하나에 의하여 일반적으로 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다. 비록 여기에 기재된 것과 유사 또는 동잉ㄹ한 방법들 및 재료들이 본 발명의 실행 또는 테스트에서 사용될 수 있지만 더 바람직한 방법들 및 재료들을 하기에서 기재한다. 여기에 언급된 모든 출판물들, 특허 출원서들, 특허들, 및 다른 참고문헌들은 그들의 전체에서 참고문헌에 의하여 삽입된다. 분쟁의 경우에 정의를 포함하는 본 발명의 출원서는 조절될 것이다. 또 재료, 방법들 및 실시예들은 단지 예시적이고 제한하려는 것이 아니다.

본 발명의 다른 특징과 잇점들은 하기 상세한 설명 및 청구항들로부터 명백할 것이다.

발명의 상세한 설명

적어도 일부 아밀로이드 질환들은 궁극적으로 섬유(fibrillar) 교차-β-시트 사차 구조를 만드는 20개 이상의 비동족성 단백질 또는 단백질 절편들 중 하나의 축적에 의하여 야기되는 것으로 보인다. 트란스타이레틴과 같이 정상적으로 접힌 단백질에서 아밀로이드 소섬유(fibril)의 형성은 결합능력이 있는 중간체를 생산하는 단백질 미스폴딩이 필요하다. 트란스타이레틴(TTR) 아밀로이드형성의 과정은 세가지 다른 아밀로이드 질환들-노인성 전신성 아밀로이드증(SSA), 가족성 아밀로이드 말초신경병증(FAP) 및 가족성 아밀로이드 심근증(FAC)을 야기하는 것처럼 보인다.

SSA는 야생형 TTR의 절편과 연관되었지만 FAP와 FAC는 80 이상의 TTR 변이체 중의 하나의 아밀로이드형성에 의해 야기된다. 예를 들어 이들 각각은 참고문헌으로 그 전체가 삽입된 Colon, W.; Kelly, J. W. Biochemistry 1992, 31, 8654-60; Kelly, J. W. Curr.Opin. Struct.Biol. 1996, 6, 11-7; Liu, K.; 외 Nat Struct.Biol. 2000,7, 754-7;Westermark, P.; 외 Proc.Biol . 2000,7, 754-7 ;Westermark, P.; 외 Proc .Natl. Acad.Sci. U. S. A. 1990,87, 2843-5 ; Saraiva, M. J.;외 J. Clin. Invest. 1985, 76,2171-7; Jacobson, D. R.; 외 N. Engl. J Med. 1997, 336, 466-73; Buxbaum, J. N.; Tagoe, C. E. Ann.Rev. Med. 2000,51, 543-569; 및 Saraiva, M. J. Hum. Mutat. 1995, 5, 191-6을 참고.

TTR는 타이로이드 호르몬(T4)이 혈장과 CSF에서 결합할 수 있는 다이머-다이머 인터페이스에서 두 동일한 후넬 모양의 결합 자리들을 갖는 2,2,2 대칭에 의한 특징을 갖는 55 kDa 호모테트라머이다. TTR은 전형적으로 1 이하 당량의 홀로 레티놀 결합 단백질에 결합한다. 단량체 내의 3차 구조 변화에 의하여 수반되는 테트라머의 단량체로의 해리를 포함하는 TTR 미스폴딩은 착오결합할 수 있는 단백질을 궁극적으로 아밀로이드로 만든다. FAP에 대한 가능한 치료는 혈액 내의 변이체 TTR을 야생형(WT) 단백질로 대체하는 간 이식에 의하여 매개되는 유전자 치료를 채택한다. 이 접근법은 WT TTR의 계속된 축적때문에 FAC에 대하여 효과적이지 않을 것이고 또한 WT TTR의 과정이 원인이 되는 것으로 보이는 SSA의 치료에도 유용하지 않을 것이다. 간 이식 치료법은 이 TTR이 맥락막 총에 의하여 합성되기 때문에 CNS 질환을 야기하는 연수막(leptomeninge)에서 아밀로이드 소섬유를 축적하는 약 10개의 TTR 변이체에 대해서도 실패할 것이다.그러므로, 일반적인 비침해적인 의약 기초한 치료 전략을 개발하는 것이 바람직하다. 상기 약품은 비단백질, 비펩타이드 또는 비 핵산 기초한 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어 이들 각각은 참고문헌으로 그 전체가 삽입된 Blake, C. C.; 외. J. Mol.Biol. 1978, 121, 339-56;Wojtczak, A.; 외 Acta Crystallogr., Sect.D 1996,758-810 ; Monaco, H. L.; Rizzi, M.; Coda, A.Science 1995, 268,1039-41 ; Lai, Z.; Colon, W.; Kelly, J.W. Biochemistry 1996,35, 6470-82; Holmgren,G.;외 Lancet 1993, 341, 1113-6; Suhr, O.B.; Ericzon, B.G.; Friman,S.Liver Transpl. 2002, 8,787-94;Dubrey, S.W.;외 Transplatation 1997, 64, 74-80; Yazaki, M.; 외. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000, 274, 702-6; 및 Cornwell, C.G.III; 외, Am. J. of Med. 1983, 75, 618-623 참고.

트란스타이레틴 아밀로이드 소섬유 형성을 저해하는 디푸루니살 아나로그 합성

아밀로이드 소섬유 형성을 일으키는 TTR 미스폴딩은 테트라머의 T4-매개 안정화에 의하여 저해될 수 있다. 일부 구조적으로 다양한 테트라 안정화제의 계열은 TTR 내에서 하나 또는 양쪽의 T4 자리에 결합하고 T4 호르몬의 가능한 부작용없이 아밀로이드증을 에방한다. 이들 테트라머 안정화 화합물들은 안정화 상태 결합 및 안정화를 통하여 테트라머 해리와 관련된 운동 장벽을 증가시켜서 작용을 나타내는 후루페나믹산(flufenamic acid), 디크로페낙(diclofenac),후루르비프로펜 (flurbiprofen) 및 디푸루니살(diflunisal)을 포함한다. TTR은 혈장에서 T4의 2차 운반체이기 때문에 TTR의 T4 결합 능력의 95% 이상이 이용되지 않은채 남아 있고, 이들 자리에 타겟되는 테트라머 안정화 화합물의 투여를 가능케한다. 디푸루니살은 사이클로옥시게네이즈-2 억제제이기 때문에 장기간 투여는 위장관 부작용을 일으킬 수 있다. 따라서 NSAID 활성이 감소되거나 없지만 혈장에서 TTR에 대한 높은 친화도를 갖는 디푸루니살 아나로그가 바람직하다. 이 목적을 향한 첫 단계는 아밀로이드 소섬유 형성의 저해제로 디후루니살 아나로그의 고안 및 합성이다. 예를 들어 이들 각각은 참고문헌으로 그 전체가 삽입된 Miroy, G. J.; 외 Proc.Natl. Acad. Sci. U. S. A.1996,93, 15051-6; Klabunde, T.;외 Nat. Struct.Biol. 2000,7,312-21; Baures,P.W.;Peterson,S.A.;Kelly, J.W.Bioorg.Med.Chem 1998,6,1389-401;Petrassi,H.M.;외 J.Am.Chem.Soc.2000,122, 2178-2192; Baures,P.W.;외 Bioorg.Med.Chem 1999,7,1339-47; Sacchettini, J.C.;Kelly, J.W.Nat.Rev.Drug Disc. 2002,1,267-275; Oza, V.B.;외 J.Med.Chem.2002,45, 321-32; Bartalena,L.;Robbins, J.Clin.Lab.Med. 1993,13,583-98; Aldred, A.R.;Brack,C.M.;Schreiber, G. Comp.Biochem.Physiol. B Biochem.Mol. Biol. 1995, 111, 1-15; 및 Mao, H.Y.;외 J.Am.Chem.Soc.2001,123, 10429-10435 참고.

TTR 테트라머의 소단위들은 세 수직 C2-축들에 의하여 관련된다. 도 1은 저해제의 카르복실기가 Lys 15 및 15'의 입실론-암모니움과 정전기적 상호작용에 관여하는 전방(forward) 결합 모드를 나타내는 TTR의 T4 결합 자리의 도식적 묘사를 나타낸다. 4차 구조 인터페이스에 의하여 생성된 두 동일한 T4 결합 자리는 결정학적 C2 대칭축에 수직인 두 C2 축에 의하여 상호교환된다. 각 T4 결합 자리는 내부 및 외부 결합 구역(cavity)로 분리될 수 있다. 예를 들어 참고문헌으로 그 전체가 삽입된 Blake, C. C.; Oatley,S.J. Nature 1977, 268, 115-20 참고. 내부 결합 구역은 Leu 17, Ala 108, Val 121, 및 Thr 119의 곁 사슬에 의하여 구성된 HBP 3 및 3'으로 지정된 한 쌍의 할로겐 결합 포켓(HBP)를 포함한다. 각 소단위체로부터 네 Ser 117 곁사슬의 집합은 두 동일한 결합 자리들 사이의 인터페이스와 가장 안쪽 지역을 한정한다. 그 Ser 117 하이드록시 기들은 화합물의 상보적으로 기능성(예를 들어 아밀로이드 형성의 저해제)을 주는 수소결합 공여체 또는 수용체 또는 물 분자를 통하여 화합물과 정전기 결합을 매개하는 작용을 할 수 있다. 바깥쪽 결합자리는 HBP 1 및 1' 을 구성하지만, HBP 2 및 2'은 내부 및 외부 결합 구역의 인터페이스에 위치한다. Lys 15 및 15'의 입실론-아모니움 기들은 바깥쪽 결합 구역의 맨 바깥 지역을 한정하여 화합물에 대하여 음이온 치환기들과 정전기적 상호작용을 하게한다.많은 TTR 테트라머 안정화 화합물들은 바깥 결합 포켓에 위치한 친수성 페닐 링에 대한 음이온 치환체들이 Lys 15 입실론-아모니움 기들과 정전기적 상호작용에 관여하는 전방 결합 모드로 결합한다.전방 결합 모드에서 소수성 페닐 링(종종 할로겐으로 치환된)은 내부 결합 포켓을 차지할 수 있다.그러나, 반대쪽 방향성에서 결합(반대 결합 모드)의 예도 관찰되었다.

반대 결합 모드에서 친수성 방향족 고리는 내부 지역에 위치할 수 있어서 카르복실기가 Ser 117 및 Ser 117'과 수소 결합하게 한다. 반대 결합 모드에서 할로겐 치환된 소수성 링은 외부 구역에 위치할 수 있다.

디푸루니살(Diflunisal) TTR 산-매개 아밀로이드형성을 감소시킬 수 있다. 디푸루니살의 구조(실시예 2 참고)는 TTR 아밀로이드형성을 저해할 수 있는 새로운 화합물들을 고안하는데 기초로 사용될 수 있다. 예를 들면, Verbeeck R. K.; 외 Biochem. Pharm.1980, 29,571-576; 및 Nuernberg, B.; Kohler, G.; Brune, K. Clin.Pharmacokin 77.1991,20,81-89 참고.

그 화합물은 다음 화학식을 가질 수 있다.

여기서 Ar^l은 아릴기 또는 헤테로아릴기, Ar^l은 하나 이상의: 할로, -R^l, -OR^l, -OC(=O)R^l,-OC(=O)OR^l,-OC(=O)NHR¹, -SR¹, -S(=O)R^l, -S(=O)₂R¹, -C(=O)R¹, -CO₂R¹, -C(=O)NHR¹, -NR¹R², -NHC(=O)R¹, -NHC(=O)NHR¹, -NHC(=O)OR¹, 또는 -NHS(=0)₂R'로 선택적으로 치환된 것이다.

Ar²는 아릴기 또는 헤테로아릴기, Ar²는 하나 이상의: 할로, -R^l, -OR^l, -OC(=O)R^l,-OC(=O)OR^l,-OC(=O)NHR¹, -SR¹, -S(=O)R^l, -S(=O)₂R¹, -C(=O)R¹, -CO₂R¹, -C(=O)NHR¹, -NR¹R², -NHC(=O)R¹, -NHC(=O)NHR¹, -NHC(=O)OR¹, 또는 -NHS(=0)₂R'로 선택적으로 치환된 것이다.

각 R^l는 독립적으로 수소, 또는 치환된 또는 비치환된 알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 알케닐, 사이클로알케닐, 헤테로사이클로알케닐, 알키닐, 아릴기, 또는 헤테로아릴기이다.

각 R²는 독립적으로 수소, 또는 치환된 또는 비치환된 알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 알케닐, 사이클로알케닐, 헤테로사이클로알케닐, 알키닐, 아릴기, 또는 헤테로아릴기이다.

일부 조건하에서는 Ar^l은 치환된 또는 비치환된 페닐기일 수 있다. Ar²는 독립적으로 치환된 또는 비치환된 페닐기일 수 있다. Ar^l과 Ar²는 동시에 치환된 또는 비치환된 페닐기일 수 있다. 그 치환기들은 치환기들은 불소, 염소, 하이드록시, -CO₂H,-CO₂Me,-OMe,-CH₂0H, 또는 포르밀일 수 있다. R¹은 저급 알킬기일 수 있다.

그 화합물들은 무기 또는 유기 산들 및 염기들로부터 유래한 약학적으로 수용가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 그러한 산성 염들은 아세테이트, 아디페이트(adipate), 알기네이트(alginate), 아스파테이트, 안식향산, 벤젠설포네이트(benzenesulfonate), 중황산, 부티르산, 구연산, 캄포레이트(camphorate), 캄포르설포네이트(camphorsulfonate), 사이클로펜탄프로피오네이트(cyclopentanepropionate), 디글루코네이트(digluconate), 도데실설페이트(dodecylsulfate), 에탄설포네이트(ethanesulfonate), 후마레이트(fumarate), 글루코헵타노에이트(glucoheptanoate), 글리세로포스페이트(glycerophosphate), 헤미설페이트(hemisulfate), 헵타노에이트(heptanoate), 헥사노에이트(hexanoate), 염산, 하이드로브로마이드(hydrobromide), 하이드로아이오다이드(hydroiodide), 2-하이드록시에탄설포네이트(hydroxyethanesulfonate), 젓산, 말레이에트(maleate), 메탄설포네이트(methanesulfonate), 2-나프탈렌설포네이트(naphthalenesulfonate), 니코티네이트(nicotinate), 옥실산, 파모에이트(pamoate), 펙틴에이트, 퍼설페이트(persulfate), 3 페닐기-프로피오네이트, 파그레이트(picrate), 피바레이트(pivalate), 프로피오네이트(propionate), 숙신산(succinate), 주석산, 사이오시아네이트(thiocyanate), 토실레이트(tosylate) 및 운데카노에이트(undecanoate)를 포함한다. 염기 염들은 암모늄 염들, 나트륨, 칼륨 염과 같은 알카리 금속염들, 칼슘과 마그네슘 염들과 같은 알칼리 토금속 염들, 디사이클로헥실아민(dicyclohexylamine) 염들, N-메틸-D-글루카민(glucamine)과 같은 유기 염기를 갖는 염들 및 아르기닌, 라이신 등과 같은 아미노산을 갖는 염들을 포함한다. 또한, 염기 질소를 포함하는 기들은 그룹은 보다 낮은 할로겐화 알킬, 같은 메틸기, 에틸, 프로필기, 및 부틸 염화물, 브로마이드 및 아이오다이드와 같은 저급 알킬 할라이드;디메틸, 디에틸, 디부틸 및 디아밀(diamyl) 황산염과 같은 디알킬(dialkyl) 황산염, 데실, 라우릴, 미리스틸 및 스테아일 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드와 같은 긴 체인 할라이드, 벤질 및 펜에틸(phenethyl) 브로마이드 및 다른 것들과 같은 아르알킬(aralkyl) 할라이드와 같은 시약들로 4차화(quaternize)될 수 있다. 수용성 또는 지용성 또는 현탁 생산물들이 그것에 의하여 얻어진다.

그 화합물들은 TTR 테트라머를 안정화시킬 수 있고 TTR 아밀로이드의 형성을 저해할 수 있다. 그 화합물들은 미묘한 구조 변화에 의하여 특징지워진 디후루니살의 아나로그들일 수 있다. 그 화합물들은 그것들이 TTR 아밀로이드 억제와 관련이 있기때문에 구조-활성 관계를 평가하는데 사용될 수 있다. 할로겐들, 카르복실기, 아실, 알콕시(alkoxy) 및 수산기들을 포함하는 치환 패턴들과 치환기들의 수는 변화될 수 있다.

화합물들의 다른 군들로부터 온 구조-활성 데이타는 카르복실기 치환기 또는 유사한 음이온 또는 수소결합 기들은 Lys 15 및 15'의 입실론-암모늄 기들과 정전기적 상호작용 또는 Ser 117 및 117'과 수소결합 상호작용에 관여하는 것이 가능하기에 중요한 것 같은 반면에 할로겐 치환된 소수성 고리는 TTR의 할로겐 결합 포켓을 보상(compliment)한다. 2-플루오르-, 4-플루오르-, 3,5-디플루오르-, 2,4-디플루오르- 및 2,6-디플루오르-를 포함하는 플루오르와 염소-치환된 아릴기 모두는 평가될 수 있다. 요오드가 치환된 아릴기는 그들의 불안정성 및 타이록신 작용제로 작용할 가능성때문에 덜 바람직할 수 있다. 카르복실(음이온) 치환체는 소섬유 저해 및 플라즈마 결합 선택성에 대한 그것의 영향을 평가하기 위하여 몇몇 아나로그들에서는 없을 수 있다.알데히드 또는 알코올 작용기를 포함하는 화합물들은 결합 선택성 및 아밀로이드 소섬유 저해에 대한 비전하된 수소 결합 수용체 및 공여체의 영향을 평가하기 위하여 합성될 수 있다. 알데히드의 겜(gem)-디올 형태는원리 결합 종들일 수 있다.

대체로, 그 화합물들은 공지 기술 방법에 의하여 합성될 수 있다.

그 화합물을 제조하는 한 방법은 스즈끼 커플링이다:

예를 들면, 바이페닐 화합물은 브로모벤젠 또는 아이오도벤젠과 페닐기 보론산의 스즈끼 커플링에 의하여 형성될 수 있다. 화합물의 제조동안 부산물의 형성을 회피하기 위하여 적당한 보호기들이 필요할 수 있다. 예를 들면, 아미노 치환기는 트리푸로로에세틸 또는 터셜리(tert)-부톡시카르보닐(butoxycarbonyl)과 같은 적당한 아미노 보호기에 의하여 보호될 수 있다. 다른 보호기들 및 반응 조건은 T. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, (3rd, 1999, John Wiley & Sons, New York, N.Y.)에서 발견될 수 있다.

약학 조성물들

여기에 기재된 화합물들(예를 들어 디푸루니살 아나로그들, 폴리염화 바이페닐들, 또는 벤족사졸들)은 경구, 비경구, 흡입, 스프페이, 국소, 직장, 비강,구강, 질 또는 이식된 레저버를 통하여 투여될 수 있다. 여기에 사용된 "비경구적"이란 용어는 여기에 사용하였습니다 포함하다 피하, 정맥, 근육내, 관절내(intra-articular), 활액내(intra-synovial), 간내(intrastemal), 경막내(intrathecal), 간장내, 손상내(intralesional) 및 두개내(intracranial) 주사 또는 주입 기술을 포함한다.

상기 약학 조성물은 어느 약학적으로 수용가능한 담체와 함께 상기 화합물들 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 유도체를 포함할 수 있다. 여기에 사용된 "담체"라는 용어는 수용가능한 어쥬번트 및 베히클을 포함한다.

본 발명의 조성물로 사용될 수 있는 약학적으로 수용가능한 담체는 이온 교환수지, 알루미나, 알루미늄 스테아르산염, 레시틴, 인간 혈청 알부민과 같은 혈청 단백질들, 인산, 글라이신, 소르빅산, 칼륨 소르베이트와 같은 버퍼 물질, 포화 식물 지방산, 물, 염들의 글리세라이드 혼합물, 또는 프로타민 황산염, 인산 수소 이나트륨, 칼륨 수소 인산염, 염화 나트륨, 아연 염들, 콜로이드성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트(trisilicate), 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로오스 기초 물질, 폴리에틸렌 글라이콜, 카르복실메틸셀룰로오스 나트륨, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 폴리머들, 폴폴리에틸렌 글리콜 및 울 지방을 포함하나 이에 한정되지 아니한다.

약학 조성물은 예를 들어 살균한 주사 가능한 수용성 또는 유성 서스펜션과 같은 살균한 주사가능한 제제의 형태일 수 있다. 이 서스펜션은 적당한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제제화가 가능할 수 있다. 이 살균한 주사가능한 제제는 예를 들어 기밀 보호 조치를 한 주사 가능한 물질 준비는 또한 1,3-부탄디올내의 용액으로서와 같은 비독성 비경구 수용가능한 희석제 및 용매내에 살균한 주사가능한 용액 또는 서스펜젼일 수 있다. 채택될 수 있는 그 수용가능한 베히클 및 용매들 중에 물, 링거액 및 등장 염화 나트륨 용액이다. 추가로, 살균한 고정유들은 용매 또는 현탁 매질로 통상적으로 채택된다. 이 목적을 위해, 합성 모노- 또는 다이-글리세라이드를 포함하는 어떠한 혼합한 고정유를 채택할 수 잇다. 올레산 및 그것의 글리세리라이드 유도체와 같은 지방산들은 올리브유 또는 아주까리 기름과 같은 천연 약학적으로 수용가능한 오일, 특히 그들의 폴리옥시에틸레이트된 형태에서와 같이 주사가능한 제제에 사용될 수 있다. 이 기름 용액 또는 서스펜젼들은 또한 긴 사슬 알코올 희석제 또는 분산제를 포함할 수 있다.

상기 약학 조성물들은 구두로 받아들일 만한 어떠한 복용량 서식에 구두로 관리될 지도 모릅니다 그러나 않는다 제한됩니다 에, 캡슐들, 타블렛들, 수용성 서스펜션들 또는 용액들을 포함하나 이에 한정되지 아니하는 경구 수용가능한 투여 형태로 경구 투여될 수 있다. 경구 사용용 타블렛들의 경우에 통상적으로 사용되는 담체는 유당과 옥수수 전분을 포함한다. 마그네슘 스테아르산염과 같은 윤활제들은 또한 전형적으로 첨가된다. 캡슐 형태의 경구 투여를 위하여 유용한 희석제는 유당과 건조 옥수수 전분을 포함한다. 수용성 서스펜션들이 구강 투여에 필요한 경우에 활성 성분은 에멀젼화제 및 서스펜션제와 함께 결합된다. 필요한 경우에 일부 감미료, 향료 또는 착색제들이 또한 첨가될 수 있다.

대안적으로 상기 약학 조성물은 직장 투여를 위하여 좌약의 형태로 투여될 수 있다. 이것들은 상온에서 고체이고 직장 온도에서 액체여서 직장에서 그 약물을 방출하는 비자극인 첨가제로 그 약제를 혼합하여 제조될 수 있다. 그러한 물질들은 카카오 버터, 밀납 및 폴리에틸렌 글리콜들을 포함한다.

상기 약학 조성물들은 또한 국소적으로 특히 치료 목표가 눈, 피부 및 장관의 하부를 포함하는 국소적 적용에 의하여 접근 가능한 지역 또는 기관들을 포함하는 경우에 투여될 수 있다. 적당한 국소적 제제들은 이들 지역 또는 기관들의 각각에 대하여 용이하게 제조될 수 있다.

장관 아래부분에 대한 국소 적용은 직장 좌약 제제화(위쪽 참고) 또는 적당한 관장 제제화에서 실행될 수 있다. 국소적으로-경피 패치들도 사용될 수 있다. 국소 적용을 위하여 상기 약학 조성물들은 하나 이상의 담체 내에 현탁 또는 용해된 활성 성분을 포함하는 적당한 연고로 제제화될 수 있다. 화합물들의 국소 투여용 담체는 광유, 액체 바셀린(petrolatum), 흰 바셀린, 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌 화합물, 에멀젼화 왁스 및 물을 포함하나 이에 한정되지 아니한다. 대안적으로 상기 약학 조성물들은 하나 이상의 담체 내에 현탁 또는 용해된 활성 성분을 포함하는 적당한 로션 또는 크림으로 제제화될 수 있다. 적당한 담체는 광유, 소르비탄 모로스테아레이트, 폴리솔베티트 60, 세틸 에스테르 왁스, 세테아릴(cetearyl) 알코올, 2-옥틸도데카놀(octyldodecanol), 벤질 알코올 및 물을 포함하나 이에 한정되지 아니한다.

안약 사용을 위하여, 상기 약학 조성물들은 등장 pH 조절된 살균 식염수내의 미세 서스펜젼으로 또는 바람직하게는 벤질알코늄 클로라이드와 같은 보존제 또는 그 보존제없이 등장 pH 조절된 살균 식염수내의 용액으로 제제화될 수 있다. 대안적으로 안약 사용을 위하여, 그 약학 조성물들은 바셀린과 같은 연고내로 제제화될 수 있다.

그 약학 조성물들은 비강 에어로졸 또는 분무기(nebulizer), 건조 분말 흡입기 또는 정량분사 흡입제의 사용을 통하여 흡입에 의하여 투여될 수 있다. 그러한 조성물들은 약학 제제화의 분야에서 주지된 기술에 따라 제조되고 벤질 알코올 또는 다른 적당한 보존제, 생체이용률을 높이는 흡수 촉진제, 불화탄소 및/또는 다른 통상적인 용해 또는 분산제들을 포함하는 식염수에서 용액으로 제조될 수 있다. 단일 투여 형태를 생성하는 담체 물질들로 결합될 수 있는 활성 성분의 양은 투여되는 숙주 및 투여의 특정 형태에 따라 변화할 것이다. 그러나, 특정 환자에 대한 특정한 투여 및 치료 처방은 채택되는 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적 건강상태, 성, 식사, 배출의 투여 속도 시간, 의약 혼합 및 치료하는 의사의 판단 및 치료되는 특정 질환의 정도를 포함하는 여러 인자에 의존할 것으로 이해되어야 한다.활성 성분의 양은 만약 있다면 그 성분이 동시-투여되는 치료 또는 예방제에 의존할 수 있다. 약학 조성물의 유효량은 치료된 환자에 대한 치료효과를 주는데 필요한 양이고 저해제의 특성, 환자의 크기, 치료 목적, 치료되는 병리학의 성질, 사용된 특정 약학 조성물 및 치료하는 의사의 판단과 같은 여러 인자들에 의존할 것이다. 참고문헌으로 Freireich 외, Cancer Chemother.Rep. 1966,50, 219 및 Scientific Tables, Geigy Pharmaceuticals, Ardley, New York, 1970, 537 참고.하루 활성 성분의 약 0.001에서 약 100mg/kg체중 사이, 활성 성분의 약 0.1에서 약 10mg/kg체중 사이의 복용량 수준이 유용할 것이다.

하기는 본 발명의 실행의 실시예들이다 그들은 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다.

도 1은 트란스타이레틴의 T4 결합 자리를 묘사하는 구성도이다.

도 2A와 2B는 여러 저해제들의 존재하에서 트란스타이레틴 풀어짐의 시간 경과를 묘사하는 그래프들이다.

도 3A와 3B는 여러 저해제들의 존재하에서 소섬유 형성의 시간 경과를 묘사하는 그래프들이다.

도 4A와 4B는 여러 저해제들의 존재하에서 소섬유 형성의 시간 경과를 묘사하는 그래프들이다.

도 5는 혈장에서 트란스타이레틴에 결합에 대해 검색된 폴리염화 바이페닐들의 구조를 묘사한다.

도 6은 이 비트로에서 아밀로이드 소섬유 저해 특성을 갖는 것으로 평가된 혈장에서 트란스타이레틴에 결합하는 수산화된 폴리염화 바이페닐의 구조를 묘사한다.

도 7은 벤족사졸 화합물들에 의한 트란스타이레틴 소섬유 형성의 저해를 묘사하는 그래프이다. 벤족사졸 상의 카르복실의 위치는 좌측 면에 보여지는 반면에 C (2) 페닐 고리는 아래쪽에 보여진다. 바들(bars)은 소섬유 형성 퍼센트(ff), 즉 저해제의 부존재하에서 트란스타이레틴에 의하여 형성된 양(100%로 정의)과 비교하여 벤족사졸 화합물의 존재(7.2μM)하에서 트란스타이레틴에 의하여 형성된 소섬유의 양을 나타낸다.

도 8은 인간 혈장에서 배양 후에 트란스타이레틴에 결합된 벤족사졸의 당량을 묘사하는 그래프이다. 레진-결합된 항체로 면역침전법은 트란스타이레틴을 잡는데 사용되었다. 레진으로부터 트란스타이레틴을 분리한 후에 트란스타이레틴 및 저해제의 양들을 HPLC 크로마토그램에서 그들의 피크하에서 면적으로부터 정량화되었다. s의 최대 가능 값은 2이다. 화합물 번호들은 아래 축에 보인다. 얇은 수직 선은 측정 오차를 나타낸다.

도 9는 저해제없이 또는 3.6μM의 화합물들 20,21, 또는 27 또는 1.8μM의 화합물 20의 존재하에서 6 M 요소에서 wt 트란스타이레틴(1.8μM)에 대한 시간 함수(t)로 해리를 묘사하는 그래프이다.

도 10은 트란스타이레틴에 결합된 화합물 20의 X-레이 공동 크리스탈 구조를 묘사한다. 할로겐 결합 포켓의 쌍에서와 같이 여러 소단위에서 동등한 잔기들은 프라임과 언프라임된 잔기 번호들로 구별된다.

실시예 1: 단백질 잘못 접힘(protein misfolding) 에너지론에 의한 트랜스타이레틴 아밀로이드 질병(transthyretin amyloid disease)의 예방

아밀로이드증(amyloidosis)을 비롯한 수백종의 인간 질병은 단백질 잘못 접힘과 연관되어 있다. 트랜스타이레틴(TTR) 아밀로이드 병리를 악화시키거나(예를 들어, Val30→Met30(V30M) 및 Leu55→Pro55(L55P)), 완화시키는(Thrl19→Metl19(T119M)) 80개의 가족성 돌연변이는 중요한 기계론적 통찰력을 제공한다. 현재까지 특징이 밝혀진 모든 질병과 연관된 돌연변이는 TTR 테트라머를 불안정화 시키고, 많은 돌연변이가 속도 결정 테트라머 해리 속도에 영향을 미치며, 이때 고속은 아밀로이드증을 가속화시키고 저속은 이들 지연시킨다. 본 발명자들은 부분적인 단량체 변성에 요구되는 초기 잘못 접힘 발생(테트라머 해리)을 급격히 저하시켜서 아밀로이드 및 기타 집성체로 잘못 조립할 수 있는 저분자 TTR 아밀로이드 억제제를 개발하기 위해 Tl19M이 V30M 화합물 이형접합체에서 질병을 예방하는 기작을 이용하였다.

트랜스-억제 기작을 보다 잘 이해하기 위해 하이브리드 테트라머를 단리하였다. 30M(또는 L55P)에 관한 Tl19M 서브유닛 화학적 양을 증가시키면, 산-중재 피브릴 형성을 위한 최대 pH를 보다 낮은 pH로 이동시키고, 생리학적으로 허용 가능한 pH 값(4.0 초과)에서 전반적인 아밀로이드 수율을 감소시켰으며, 산-유도(pH 4.4) 및 메탄올-중재 아밀로이드 생성 속도를 감속시켰다. 몇몇 저분자 TTR 아밀로이드 피브릴 억제제가 발견되었으며, 미국 식품의약국(U.S> Food and Drug Administration: FDA)에 의해 승인된 2종의 약물(억제제 8 및 10)을 비롯한 이의 하위부류가 본원에서 연구되었다(문헌[Sacchettini et al., Nature Rev. Drug Discovery 1,267 (2002)]). 야생형(WT) TTR 피브릴 형성 수율 및 속도에 대한 저분자 억제제 결합의 영향은 Tl19M 서브유닛 결합과 유사하다. 그러나, 피브릴 형성을 위한 보다 낮은 pH 최적치로의 이동은 모든 억제제에서 관측되지 않았다. 이들 억제제는 단량체가 아닌 TTR 테트라머 내의 2개의 등가의 티록신(T4) 부위에 결합함으로써 작용한다.

테트라머 해리 속도는 해리 속도의 5×105 배의 속도를 갖는 풀림 전이 (unfolding transition)에 느린 4변수 구조 변화를 결합함으로써 측정되었다(문헌[Hammarstrom et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16427(2002)]). 변성-검출 해리는 사용된 우레아의 농도(6.0M 초과)는 재접힘(refoling)을 지지하지 못한다. V30M(또는 L55P) 서브유닛에 대해 Tl19M 서브유닛 화학적 양(1.8M 초과)을 증가시키면, 3개의 상이한 변성 환경(산성 pH, 수성 메탄올 또는 우레아)에서 극적인 TTR 테트라머 해리 감속(아밀로이드 생성에 대한 속도 결정)을 나타냈으며, 이는 질병 예방의 기원을 설명하였다.

억제제 6 내지 억제제 10(1.8 및 3.6μM)의 존제하의 WT TTR 테트라머(1.8μM) 해리 속도의 측정은 모든 TTR-억제제 복합체에 있어서 농도 의존적으로 느려짐을 나타냈다. 테트라머 해리의 초기 속도는 대략적을 2종의 억제제(TㆍI₂)에 결합된 테트라머의 몰분율(mole fraction)에 반비례하였다. 억제제 6, 7 및 9(1.8μM)의 경우에, 단일 지수함수(single exponential function)의 크기는 리간드 결합되지 않은 테트라머의 해리(및 보다 적은 정도의 TㆍI)와 일차적으로 연관되어 있으며, 이는 TㆍI₂가 6M 우레아에서 테트라머 해리를 막았다는 것을 의미한다. 대조적으로, 억제제 8 및 10에 대한 TㆍI₂의 형성은 우레아에서 테트라머가 실질적으로 해리되는 것을 막지 못하였으며, 이는 결합만으로는 불충분하다는 것을 의미한다. 억제제 6, 7, 및 9(3.6M)의 경우에 관측된 효율적인 억제는 2.3kcal/mol(Delta Gl = RT ln([TㆍI]/[T]) = RT ln([I]/Kdl) 및 Delta G2 = RT ln([TㆍI₂]/[T]) = RT ln[I]2/(Kd1*Kd2))을 초과하는 유리 에너지(free energy)에 의해 TㆍI₂ 복합체를 안정화시키는 결합 에너지(binding energy)로부터 유래하였다. 2.7kcal/mol에 의해 T에 대한 TㆍI₂를 안정화시키면, TTR 테트라머 해리 속도에서 200배 감속도로 변형될 수 있다. 억제제 8 및 10(3.6μM)의 강력하고 음성 협주적 결합은 제 2 부위(TㆍI₂, μM 해리 상수)에 대한 결합에 대해 TTR을 추가적으로 안정화시킬 수 없었다는 것을 나타냈다. 억제제 6, 7 및 9의 μM 해리 상수(Kdl 및 Kd2)는, 상기 억제제가 해리 전이 상태에 결합하지 못하여 이를 유사하게 안정화시키지 못하였다면 바닥-상태 안정화(2.3kcal/mol 초과)는 TTR 테트라머 해리를 위한 활성화 장벽을 실질적으로 증가시키기에 충분할 수 있다는 것을 확실케 할 수 있었다. TㆍI₂와 TㆍI 복합체로부터의 억제제 해리 속도는 억제제 6, 7 및 9의 효율에서 하나의 역할을 할 수 있었다. 억제제로 포화된 TTR은 항체 수지에 의해 고정화되었고, 상기 항체 수지 위에서 수성 완충액을 6 내지 10의 효과적인 해리 속도를 평가하기 위해 5.0㎖/분으로 통과하였다. 최고의 억제제는 가장 낮은 명백한 해리 속도를 갖는 것이었다. 억제제의 존재하에 아밀로이드 생성 속도(산성 조건)와 테트라머 해리 속도(우레아에서) 사이에는 매우 양호한 관계가 성립할 지라도, 이는 본 경우에 존재할 필요는 없다. 아밀로이드 생성은 해리 이후에 농도 의존적 잘못 조립을 필요로 한다. 따라서, 저분자는, 특히 상기 억제제가 단량체성 아밀로이드 생성 중간체의 농도를 낮게 유지할 수 있는 경우(3.6μM 미만)에 일반적으로 테트라머 해리보다 피브릴 형성을 억제하는데 더욱 효과적일 것이며, 이때 피브릴 형성은 매우 불충분하다. 종종, 우레아에서 측정된 테트라머 해리 속도는 산성 조건하에서 억제제의 효율의 순위 결정(rank ordering)을 정확히 예상하기 못할 것이다. 예를 들어, FDA-승인 약물인 디푸루니살(diflunisal)(8)은 테트라머 해리 억제제보다 양호한 아밀로이드 억제제였다. 이러한 관측에 대한 가능한 설명은, Kd1 및/또는 Kd2가 우레아(18)에서보다 산성에서 보다 낮다는 것이다. 또한, 몇몇 억제제는 생리학적 조건하에서 측정된 이들의 결합 상수가 제시할 수 있는 것 보다 변성 조건하에서 보다 양호하게 작용한다. 예를 들어 화합물 9는 억제제 9가 7의 10배 및 83배의 Kdl 및 Kd2 값(생리학적 조건하에서 측정됨)을 각각 가질지라도 억제제 7보다 테트라머 해리(우레아) 및 피브릴 형성(산)을 억제하는데 보다 효과적이거나 유사한 효과를 가졌다. 따라서, 생리학적 조건하에서가 아닌 다양한 변성 조건하에서 잘못 접힌 억제제를 효율을 판단하는 것이 중요하다.

T19M 트랜스-억제제 서브유닛의 테트라머로의 포함(그렇지 않는 경우에 질병-연관 서브유닛으로 구성됨)은 테트라머성 바닥 상태를 전이 상태보다 큰 정도로 안정화시키고/시키거나(저분자 억제제의 경우에서와 같이), 해리의 전이 상태를 불안정화시킴으로써 테트라머의 해리 속도를 감속시킬 수 있다. 이들 가능성을 구분하기 위해, 본 발명자들은 WT와 Tl19M 동종테트라머의 재구성 동력학(reconstitution kinetics)을 비교하였다. T119M 단량체의 재접힘은 신속하며, WT TTR 단량체의 접힘 속도의 오차 범위 내에 있다. 그러나, T119M 접힌 단량체의 재조립(reassembly)은 우레아 희석액에 의해 개시된 WT TTR 단량체의 테트라머화보다 20배 정도 느렸다. 재조립 과정은 이상성(biphasic)으로서, 조립 경로에서의 관측 가능한 중간체(아마도 이량체)의 존재로 인해 설명될 수 있다. 반대 방향에서, Tl19M 테트라머는 WT TTR 테트라머에 의해 나타나는 속도의 1/37 속도로 해리된다. 이들 동력학 효과는 3차 구조의 안정성 및/또는 테트라머 안정성의 차이에 기여하지 않을 수 있다. WT 및 Tl19M 단량체의 열역학적 안정성의 직접적 비교(엔지니어링(engineering)된 단량체성 TTR 구조(M-TTR)를 이용함)는 해리와 조립 각각을 설명하기 위해 요구되는 2.1 및 2.7kcal/mol보다 훨씬 낮은 단지 0.4kcal/mol의 잘못 접힘에 대한 유리 에너지 델타 델타 G에서의 차이를 나타냈다. T119M 및 WT TTR의 열역학적 주기 분석은 T119M이 테트라머 안정화에 의해서가 아닌 약 3.1kcal/mol에 의해 해리 전이 상태를 불안정화시킴으로서 테트라머의 해리를 억제한다는 것을 밝혔다. 이러한 분석에 따라, T119M 테트라머는 WT에 대해 0.9kcal/mol에 의해 실제로 불안정화되며, 이는 동력학적 안정화 기작을 추가로 지지하는 것이다. WT 및 Tl19M 테트라머 해리 사이의 유리 에너지 차이는 우레아에서의 Tl19M 변성이 TTR이 변성된 상태가 되는 매우 긴 잠복기(수주)를 필요로 하기 때문에 우레아-중재 잘못 접힘을 통해 측정될 수 없다. 구아니디늄 클로라이드(GdmCl)와 구아니디늄 티오시아네이트(GdmSCN) 변성 곡선의 비교는, WT TTR이 T119M에서보다 GdmCl 변성에 대해 더욱 내성을 갖는 것으로 나타나는 반면, GdmSCN에서는 반대 결과가 사실로 증명되었다. 변성 중간점에서의 이들 차이는 차등 음이온 안정화에 기여할 수 있으며, 이는 이들 정량적 분석이 이들 카오트로프(chaotrope)에서 불가능할 지라도 단백질의 실제 열역학적 안정성이 매우 유사하다는 것을 제시한다.

T119M 트랜스-억제는 주로 해리 전이 속도의 불안정화에 의해 중재되며, 이 량체-이량체 계면에 T119M의 배치와 일치한다. 3.1kcal/mol에 의해 해리 전이 상태 에너지를 증가시키면, 활성화 장벽이 극복될 수 없기 때문에 테트라머 해리가 효과적으로 억제된다(해리 상수의 절반값(tl/2)은 42시간에서 1,500시간 초과까지 증가한다). 저분자 결합이 테트라머 안정화(전이 상태 안정화에 대해)를 통해 중재될 지라도, 이는 농도 의존적으로 테트라머 해리와 연관된 활성화 장벽을 유사하게 증가시킨다. 안정화의 정도는 저분자 해리 상수(Kdl 및 Kd2)가 가능한 한 낮고 억제제의 농도가 가능한 한 높은 경우에 최대이다. 바닥 상태 안정화를 위해 본 실험에 사용된 농도는 많은 경구용으로 이용 가능한 약물에 있어서 플라즈마에서 관측되는 농도에 필적한다.

저준자 결합 및 트랜스-억제는 TTR 피브릴 형성의 속도 결정 단계인 테트라머 해리와 연관된 활성화 에너지를 증가시킨다. 이러한 유추법(유사체y)을 확립하는 것이 중요한데, 이는 트랜스-억제가 V30M 화합물 이형접합체에서 질병을 억제하는 것으로 공지되어 있기 때문이다. 원형 상태(native state)의 열역학적 안정화는, 작은 잘못 접힌 올리고머(oligomer)가 신경 독성을 갖는다는 최근의 증거를 고려하면 특히 매혹적인 전략이다. 저분자 결합제를 발견하거나, 잘못 접히려는 경향이 있는 다른 병리학적으로 관련된 단백질의 에너지 조망(energy landscape)을 조율하는 트랜스-억제 방법을 개발하는 것이 현재 고려되어야 한다.

실시예 2: 디푸루니살 유사체는 트랜스타이레틴의 원형 상태를 안정화시키고 트랜스타이레틴 아밀로이드 피브릴 형성 억제제이다.

디푸루니살(1)은 트랜스타이레틴 (TTR) 아밀로이드 생성을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 특정 조건(예를 들어, 3.6μM TTR, 3.6μM 디푸루니살, pH 4.4, 72시간 및 37℃)하에서 디푸루니살은 TTR 아밀로이드 생성을 63% 정도 감소시킨다. 이들 조건하에, 디푸루니살 농도를 (7.2μM까지) 배가하면, 아밀로이드 생성이 97% 정도 감소된다. 디푸루니살은 현재까지 보고된 보다 양호한 아밀로이드 피브릴 억제제 중 하나이고, 경구 투여된 디푸루니살은 생체 이용성이 매우 높으며, 250㎎의 투여량으로 100μM 초과하는 서방형 플라즈마 농도를 1일 2회 투여할 수 있다. 디푸루니살이 사이클로옥시게나제-2 억제제이므로, 장기간 투여는 위장내 부작용을 초래할 수 있다. 따라서, 감소되거나 존재하지 않은 NSAID 활성을 갖지만 혈장에서 TTR에 대한 높은 친화도(affinity)를 나타내는 디푸루니살의 유사체들은 선택적으로는 바람직하다. 따라서, 디푸루니살의 구조는 TTR 아밀로이드 생성을 억제할 수 있는 새로운 화합물을 디자인하기 위한 기반으로서 사용될 수 있다(예를 들어,문헌[Verbeeck, R. K.; et al. Biochem. Pharm. 1980, 29, 571-576] 및 문헌[Nuernberg, B.; Koehler, G.; Brune, K. Clin. Pharmacokin. 1991, 20, 81-89] 참조).

디푸루니살 유사체는 아릴 할라이드와 아릴 붕소산 사이의 Pb-중재 스즈키 커플링(스즈키 커플링)을 이용하여 합성되었다. 유사체 2 내지 20의 합성은 반응식 1에 도시된 바와 같이 아세트산 무수물 및 피리딘과 3- 또는 4-요오도페놀의 아세틸화 이후에 표준 스즈키 커플링 반응 조건 하에 적절한 플루오로페닐 붕소산과의 스즈키 커플링에 의해 달성된다. Na0 및 MeOH(젬플렌 조건)에 의한 에스테르의 제거는 페놀 2 내지 10을 제공한다(예를 들어, 문헌[Miyaura, N.; Yanagi, T.; Suzuki, A. Synth. Commun. 1981, 11, 513-519], 문헌[Sharp, M.J.; Snieckus, V. Tetrahedron Lett. 1985, 26, 5997-6000], 문헌[Sharp, M.J.; Cheng, W.; Snieckus, V. Tetrahedron Lett. 1987, 28, 5093-5096], 문헌[Pozsgay, V.; Nanasi, P.; Neszmelyi, A. Carbohydr. Res. 1981, 90, 215-231], 문헌[Jendralla, H.; Chen, L.-J. Synthesis 1990; 827-833], 및 문헌[Kelm, J.; Strauss, K. Spectrochim. Acta, Part A 1981, 37, 689-692] 참조, 상기 문헌 각각은 본원에서 전체가 참고로 인용됨).

반응식 1

디푸루니살 유사체(11)는 반응식 2에 도시된 바와 같이 고체상 방법을 이용하여 합성되었다. 3-요오도벤조산은 에스테르 결합을 통해 왕 수지(Wang resin)에 커플링되며, 이어 2,4-디플루오로페닐 붕소산에 커플링되며, TFA :CH₂Cl₂의 1:1 혼합물에 의해 수지에서 개열되었다(예를 들어, 문헌[Guiles, J.W.; Johnson, S.G.; Murray, W.V. J. Org. Chem. 1996, 61, 5169-5171] 참조, 이는 본원에서 전체가 참고로 인용됨).

반응식 2

반응식 3에서 도시된 바와 같이, 카복실레이트-함유 기재(12 내지 22)는 표준 스즈키 커플링 조건(상기 참조)을 이용하여 적절한 플루오로페닐 붕소산과 메틸-3-브로모벤조에이트 또는 메틸-4-브로모벤조에이트(둘 모두는 시판됨)의 커플링에 의해 조립되었다. 이어, 상기 에스테르는 LiOH-H₂O와 비누화되어 상응하는 카복실레이트를 제공하였다(예를 들어, 문헌[Bumagin, N.A.; Bykov, V.V. Tetrahedron 1997, 53, 14437-14450], 문헌[Ananthakrishnanadar, P.; Kannan, N. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2 1982, 1305-1308], 문헌[Homsi, F.; Nozaki, K.; Hiyama, T. Tetrahedron Lett. 2000, 41, 5869-5872], 및 문헌[Hajduk, P.J.; et al. J. Med. Chem. 1997, 40, 3144-3150] 참조, 상기 문헌 각각은 본원에서 전체가 참고로 인용됨).

반응식 3

5-요오도살시실산은 TMS-CH₂N₂를 이용하여 에스테르화되었고, 페놀은 MeI를 이용하여 메틸 에테르로 전환되었다. 보호된 살시실산은 다양한 플루오로페닐 붕 소산과 커플링되었고, 후속적으로 LiOH-H₂O 비누화 및 BBr3 탈메틸화에 의해 탈-보호되어 반응식 4에 되시된 바와 같은 살시실산 유도체(23 내지 27)를 제공하였다(예를 들어, 문헌[ Nicolaou, K.C.; et al. Chem. Eur. J. 1999, 5, 2602-2621], 및 문헌[Chu-Moyer, M.Y.; et al. J. Med. Chem. 2002, 45, 511-528] 참조).

반응식 4

3',5'-디할로-4'-하이드록실-함유 유사체(28 내지 31)는 먼저 메틸 에테르(MeI 및 K₂CO₃)로서 시판되는 브로모페놀을 보호함으로써 합성되었다. (메톡시카보 닐페닐) 붕소산과의 스즈키 커플링은 결과적으로 완전히 보호된 바이페닐 기재를 형성하였다. BBr₃-중재 메틸 에테르 개열 및 LiOH-H₂O에 의한 비누화는 반응식 5에 도시된 바와 같은 완전히 작용화된 디푸루니살 유사체(28 내지 31)를 제공하였다.

반응식 5

디푸루니살의 메틸 에테르 및 메틸 에스테르 유사체는 TMS-디아조메탄과 카복실산의 에스테르화에 의해 합성되어 화합물(32)을 제공하였으며, 선택적으로는 MeI 및 K₂CO₃과의 에스테르화, 및 LiOHㆍH₂O와의 에스테르 가수분해에 의해 합성되 어 화합물(33)을 제공하였다(반응식 6 참조).

반응식 6

일련의 할로겐화 바이페닐(34 내지 38)은 반응식 7에 도시된 바와 같은 일련의 할로겐-함유 붕소산과 요오도벤젠의 스즈키 커플링에 의해 조립되었다(예를 들어, 문헌[Patrick, T.B.; Willaredt, R.P. DeGonia, D.J. J. Org. Chem. 1985, 50, 2232-2235], 문헌[Kuchar, M.; et al. Collection of Czechoslovak Chemical Communications 1988, 53, 1862-1872], 문헌[Allen, K.J.; Bolton, R.; Williams, G.H. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2 1983, 691-695], 문헌[Nakada, M.; et al. Bull. Chem. Soc. Jpn. 1989, 62, 3122-3126], 및 문헌[Weingarten, H. J. Org. Chem. 1961, 26, 730-733] 참조, 상기 문헌 각각은 본원에서 전체가 참고로 인용됨).

반응식 7

염소화 아릴 알데하이드는 반응식 8에 도시된 바와 같이 3,5-디클로로요오도벤젠 및 2-, 3- 또는 4-포르밀페닐 붕소산을 이용하여 조립되었다. 할로겐 치환체가 없는 알데하이드(42-44)는 유사하게 제조되었다. 알데하이드(39 내지 41)는 아세톤/물 중의 KMnO4와 산화되어 상응하는 카복실산(45 내지 47)을 제조하거나, MeOH 중의 NaBH4와 환원되어 상응하는 벤질 알코올(48 내지 50)을 제공하였다(반응식 8). NaBH4 및 MeOH에 의한 비-염소화 알데하이드(42 내지 44)의 환원은 바이페닐 벤질성 알코올(51 내지 53)을 제조하였다(예를 들어, 문헌[Song, X.P.; He, H.T.; Siahaan, T.J. Org. Lett. 2002, 4, 549-552], 문헌[Nicolaou, K.C.; et al. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 9313-9323], 문헌[Hashizume, H.; et al. Chem. Pharm. Bull. 1994, 42, 512-520], 문헌[Indolese, A.F. Tetrahedron Lett. 1997, 38, 3513-3516], 문헌[Pridgen, L.N.; Snyder, L.; Prol, J. J. Org Chem. 1989, 54, 1523-1526], 문헌[Huang. C.G. ;Beveridge, K.A.; Wan, P. J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 7676-7684], 문헌[Wendeborn, S.; et al. Synlett. 1998, 6, 671-675], 문헌[Stevens, C.V.; Peristeropoulou, M.; De Kimpe, N. Tetrahedron 2001, 57, 7865-7870], 문헌[Tanaka, K.; Kishigami, S.; Toda, F. J. Org. Chem. 1990, 55, 2981-2983], 문헌[Clive, D.L.J.; Kang, S.Z. J. Org. Chem. 2001, 66, 6083-6091] 참조, 상기 문헌 각각은 본원에서 전체가 참고로 인용됨).

반응식 8

3',5'-디플루오로포르밀-작용화 바이페닐(54 및 55)은 반응식 9에 도시된 바와 같이 2- 또는 3-요오도벤즈알데하이드와 3,5-디플루오로페닐 붕소산의 스즈키 커플링을 통해서 합성되었다. 모든 기타 억제제는 유사한 방법 및 이전에 보고된 방법에 의해 합성되었다. 화합물(10, 21, 35, 36 및 43)은 시판되고 있다.

반응식 9

시약 및 용매는 알드리히(Aldrich), 란카스터(Lancaster), 아크로스(Acros), 콤비-플록스(Combi-Blocks), 매트릭스(Matrix) 및 파이자-바우어(Pfaltz-Bauer)로부터 구입하였다. THF 및 CH₂Cl₂는 Al₂0₃ 상에서 통과함으로써 건조되었다. 기타 용매 및 시약은 상업 제조사로부터 구입하였고, 달리 언급하지 않는 한 추가의 정제없이 사용하였다. 반응은, 이엠 사이언스(EM Science)로부터 구입한 형광 표시판(fluorescent indicator)이 장착된 실리카겔 60 F254 예비-코팅된 플레이트 상의 분석용 박막 크로마토그래피(thin layer chromatography; TLC)에 의해 모니터링(monitoring)되었다. TLC 플레이트의 시각화(visualization)는 UV 조사, 포스포몰리브산 처리, 이후에 가열에 의해 달성되거나, 세륨(IV) 암모니움 몰리브세이트 처 리, 이후의 가열에 의해 달성되었다. 플래시 크로마토그래피(Flash chromatography)는 이엠 사이언스로부터의 실리카겔 60(230 내지 400 메쉬(mesh))을 이용하여 수행되었다. 원문에서 이끌어낸 결론에 필수적인 새로운 화합물의 순도는 HPLC에 의해 결정되었다. 순상(순상) HPLC는 워터스 600(Waters 600) 펌프/제어기, 워터스 996 포토다이오드 어레이 검출기(photodiode array detector) 및 워터스 노바팩 실리카 컬럼(Waters NovaPak silica column) 에 의해 수행되었다. 사용된 용매 시스템은 헥산 및 에틸 아세테이트이었고, 농도 구배는 30분에 걸쳐 50:50 헥산:에틸 아세테이트에서 0:100 헥산:에틸 아세테이트로 유출되었다. 역상(역상) HPLC는 워터스 600 펌프/제어기, 워터스 2487 이중 파장 검출기 및 바이댁()Vydac 단백질 및 펩타이드 C18 컬럼에 의해 수행되었다. 용매 시스템 A는 0.5% 트리플루오로아세트산을 갖는 95:5 물:아세토니트릴이고, 용매 B는 0.5% 트리플루오로아세트산을 갖는 5:95 물:아세토니트릴이었다. 농도 구배는 20분에 걸쳐 100:0 A:B에서 0:100 A:B로 유출되었으며, 부가적으로 10분에 걸쳐 100% B로 유지하였다. 원편광 이색성 분광법(circular dichroism spectroscopy)은 AVIV 기구 분광기(Instruments spectrometer, model 202SF) 상에서 수행되었다. NMR 스펙트럼은 400MHz의 양성자 주파수(proton frequency)에서 바리안(Varian) FT NMR 분광기 상에 기록되었다. 양성자 화학적 이동(Proton chemical shift)은 달리 언급하지 않는 한 내부 화학적 이동 표준치(7.26ppm)로서 CHCl3을 참고하여 ppm 단위로 기록되었다. 커플링 상수는 헤르츠(Hz) 단위로 기록된다. 탄소 화학적 이동은 달리 언급하지 않는 한 내부 화학적 이동 표준치(77.23ppm)로서 CDCl3을 참고하여 ppm 단위로 기록된다. 모든 질량 스펙트럼은 The Scripps Research Institute Center for Mass Spectrometry 또는 University of Illinois Mass Spectrometry Laboratory에서 수득되었다.

화합물(2 내지 10)은 반응식 1에 따라 제조되었다. 0.05M의 농도를 얻기 위해 충분한 톨루엔에 용해된 적절한 아세트산 요오도페닐 에스테르(1.0 당량)의 용액에 붕소산에 대해 0.6M 용액을 얻기 위해 EtOH에 용해된 페닐 붕소산(1.1당량)의 용액을 첨가하였다. Na₂CO₃의 2M 수용액을 첨가하여 아세트산-요오도페닐 에스테르에 대해 0.03M의 최종 반응 농도를 얻은 후, Pd (PPh₃)₄(4.0mol%)를 첨가하였다. 반응물은 Ar 하에 20시간 동안 가열 환류시켰다. 반응이 끝났을 때에 실온까지 냉각시키고, CH₂Cl₂(2회)로 추출하고, 염수(1회)로 세척하고, MgSO₄ 상에서 건조시키고, 진공하에 농축하였다. 잔류물은 플래쉬 크로마토그래피(10:1 헥산:에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 아세틸화 바이페닐을 수득하였다.

NaO의 촉매량을 MeOH 중의 아세틸화 바이페닐의 용액에 첨가하여 0.3M의 최종 반응 농도를 제공하였다. 반응물을 Ar 하에 실온에서 12시간 동안 교반하였으며, 그 이후에 다우웩스(Dowex) 50W-X8 양이온 교환 수지(cation exchange resin)를 첨가하여 반응 혼합물을 중성화하였다. 상기 수지를 여과하고, 여과액을 진공하에 농축하였으며, 이를 플래쉬 크로마토그래피(3:1 헥산:에틸 아세테이트)하여 백색 고체로서 하이드록시바이페닐 생성물을 22 내지 75%의 수율로 제조하였다.

2',4'-디플루오로바이페닐-3-올(2). ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz)δ 9.63 (br s, 1H), 7.54 (td, 1H, J=8.9, 6.7Hz), 7.34 (ddd, 1H, J=11.1, 9.2, 2.6Hz), 7.27 (m, 1H), 7.17 (tdd, 1H, J=8.3, 2.6, 1.2Hz), 6.92 (m, 2H), 6.81 (ddd, 1H, J=8.1, 2.5, 1.0Hz). ¹³C NMR (DMSO-d₆, 100MHz)δ 162.8, 160.3, 157.4, 135.4, 131.8, 129.7, 119.4, 115.6, 114.9, 111.9, 104.4. HRESIMS: C₁₂F₈F₂O(M-H)에 대한 산정치: 205.0466, 실험치: 205.0465, 순상 HPLC 보유 시간: 10.5분, 역상 HPLC 보유 시간: 1.3분, 순도: 99%초과.

2',4'-디플루오로바이페닐-4-올(3). ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz)δ 7.49 (td, 1H, J=9.4, 8.6Hz), 7.34 (AA'XX', 2H, J_AA'=J_XX'=2.5Hz, J_XA=8.7Hz,J_X'A'=8.5Hz, J_X'A=0.3Hz, J_XA'=0.3Hz, v _A=v _A'=2934.1Hz,v _X=v _X'=2746.2Hz), 7.28 (ddd, 2H, J=11.3, 9.4, 2.6Hz), 7.13 (dddd, 1H, J=8.3, 7.5, 2.8, 1.0Hz), 6.87 (AA'XX', 2H, 상기와 같음). ¹³C NMR (DMSO-d₆, 100MHz)δ 162.3, 160.0, 157.2, 131.4, 129.9, 124.8, 115.4, 111.8, 104.3. HRESIMS: C₁₂F₈F₂O(M-H)에 대한 산정치: 205.0464, 실험치: 205.0465, 순상 HPLC 보유 시간: 11.2분, 역상 HPLC 보유 시간: 12.6분, 순도: 98% 초과.

3',5'-디플루오로바이페닐-3-올(8). ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz)δ 9.65 (br s, 1H), 7.34(m, 2H), 7.28 (t, 1H, J=7.9Hz), 7.19 (tt, 1H, J=9.1, 2.2Hz), 7.13 (ddd, 1H, J=7.8, 1.8, 1.0Hz), 7.08 (t, 1H, J=2.1Hz), 6.86 (ddd, 1H, J=8.0, 2.4, 1.0Hz). ¹³C NMR (DMSO-d₆, 100MHz)δ 162.9, 158.0, 144.1, 139.1, 130.1, 117.6, 115.7, 109.7, 102.6. HRESIMS: C₁₂F₈F₂O(M-H)에 대한 산정치: 205.0465, 실험치: 205.0468, 순상 HPLC 보유 시간: 11.4분, 역상 HPLC 보유 시간: 12.9분, 순도: 99%초과.

3',5'-디플루오로바이페닐-4-올(9). ¹H NMR (CDCL₃, 400 MHz)δ 7.44 (AA'XX', 2H, J_AA'=J_XX'=3.0Hz, J_XA=8.0Hz, J_X'A'=8.5Hz, J_X'A=0.7Hz, J_XA'=0.5Hz, v _A=v _A'=2973.8Hz, v _X=v _X'=2766.0Hz), 7.05 (dtd, 2H, J=6.6, 2.4, 0.7Hz), 6.92 (AA'XX', 2H, 상기와 같음), 6.74 (tt, 1H, J=8.9, 2.4Hz), 5.11 (s, 1H). ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz)δ 164.7, 156.1, 144.2, 131.8, 128.6, 116.1, 109.6, 102.1. HRESIMS: C₁₃F₈C_l2O₂(M-H)에 대한 산정치: 205.0465, 실험치: 205.0465, 순상 HPLC 보유 시간: 10.8분, 역상 HPLC 보유 시간: 12.9분, 순도: 99% 초과.

2',4'-디플루오로바이페닐-3-카복실산(11). 상기 화합물(11)은 반응식 2에 따라 제조하였다. 3-요오도벤조산(200㎎, 0.81mmol), DIEA(140㎕, 0.81mmol), EDClㆍHCl 및 HOBt을 CH₂Cl₂(10㎖)에서 팽창된 왕 수지(265㎎, 0.67mmol, 2.53mmol/g) 용액에 첨가하였다. 실온에서 22시간 동안 펩타이드 셰이커(peptide shaker) 상에서 격렬하게 흔든 후에, 용매를 제거하고, 수지를 DMF(10㎖로 3회)로 세척하고, 진공하에 완전히 건조시켰다.

2,4-디플루오로페닐 붕소산(112㎎, 0.71mmol), K₂CO₃(98㎎, 0.71mmol) 및 Pd₂(dba)₃(4㎎, 0.01mmol)을 DMF(2㎖)에서 팽창된 작용화 왕 수지(140mg, 0.35mmol) 용액에 첨가하였다. 실온에서 교반한 후, 반응물을 여과하고, 수지를 DMF(3회), H₂O(3회), CH₂Cl₂(3회) 및 MeOH(3회)로 세척하고, 진공하에 완전히 건조시켰다.

TFA:CH₂Cl₂(3mL 1:1)의 용액을 작용화 수지(140mg, 0.35mmol)에 첨가하고, 실온에서 13시간 동안 펩타이드 셰이커 상에서 격렬하게 교반하였다. 교반이 끝난 후, 반응물을 여과하고, 수지를 CH₂Cl₂(3회)로 세척하고, 여액을 진공하에 농축하였으며, 플래쉬 크로마토그래피(2:1 헥산:에틸 아세테이트, 0.5% 아세트산)에 의해 정제하여 백색 고체로서 화합물(11)(81mg, 100%)을 수득하였다. ¹H NMR (DMSO-d₆, 400MHz)δ 13.19 (br s, 1H), 8.07 (q, 1H, J=1.7Hz), 7.99 (dt, 1H, J= 7.9, 1.6Hz), 7.78 (dq, 1H, J=7.8, 1.3Hz), 7.64 (m, 2H), 7.40 (ddd, 1H, J=11.1, 8.8, 2.5Hz), 7.22 (tdd, 1H, J=8.4, 2.8, 1.0Hz). ¹³C NMR (DMSO-d₆, 100MHz)δ 167.0, 160.7, 160.4, 134.5, 133.0, 132.0, 131.3, 129.4, 129.1, 128.7, 123.9, 112.2, 104.6. HRESIMS: C₁₃H₈F₂O₂(M-H)에 대한 산정치: 233.0414, 실험치: 205.0465, 순상 HPLC 보유 시간: 13.7분, 역상 HPLC 보유 시간: 12.5분, 순도: 99% 초과.

반응식 3에 따라 화합물(12 내지 22)을 제조하였다. 0.1M의 농도를 얻기 위해 충분한 톨루엔에 용해된 적절한 메틸 브로모벤조에이트(1.0당량)의 용액에 EtOH에 용해된 페닐 붕소산(2.0당량)의 용액을 첨가하여 붕소산 1.0M 용액을 수득하였다. Na₂CO₃의 2M 수용액을 첨가하여 브로모벤조에이트에 대해 0.06M의 최종 반응 농도를 얻은 후, Pd(PPh₃)₄(10.0mol%)를 첨가하였다. 반응물을 Ar 하에 25시간 동안 70℃에서 교반하고, 교반이 끝난 후, 실온까지 냉각시키고, CH₂Cl₂(2회)로 추출하고, 염수(1회)로 세척하고, MgSO₄ 상에서 건조시키고, 진공하에 농축하였다. 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피(10:1 헥산:에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 메틸 에스테르를 수득하였다.

0.06M의 농도로 THF:MeOH:H₂O(1:1:1) 중의 메틸 에스테르(1.0당량)의 용액에 LiOH-H₂O(3.0당량)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 4시간 동안 교반하고, 교반이 끝난 후, 30% HCl로 산성화시키고, 에틸 아세테이트(5ml, 3회)로 추출하고, MgSO₄ 상에서 건조시키고, 진공하에 농축하였다. 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피(CH₂C1₂, 1% MeOH, 0.2% 아세트산)에 의해 정제하여 백색 고체로서 6-93%의 수율로 바이페닐 카복실산을 수득하였다.

2',4'-디플루오로바이페닐-4-카복실산(12). ¹H NMR (DMSO-d₆, 400MHz)δ 13.09 (br s, 1H), 8.04 (AA'XX', 2H, J_AA'=J_XX'=2.0Hz, J_XA=J_X'A'=8.0Hz, J_X'A=J_XA'=0.7Hz, v _A=v _A'=3213.3Hz, v _X=v _X'=3056.2Hz), 7.65 (AA'XX', 2H, 상기와 같음), 7.63 (m, 1H), 7.38 (ddd, 1H, J=11.2, 9.0, 2.8Hz), 7.21(td, 1H, J=8.4, 2.2Hz). ¹³C NMR (DMSO-d₆, 100MHz)δ 167.1, 160.8, 158.0, 138.6, 132.1, 130.1, 129.6, 129.0, 123.9, 112.2, 104.7. HRESIMS: C₁₃H8F₂O₂(M-H)에 대한 산정치: 233.0414, 실험치: 233.0407. 순상 HPLC 보유 시간: 13.3분. 역상 HPLC 보유 시간: 12.6분. 순도: 99%초과.

2'-플루오로바이페닐-3-카복실산(15). ¹H NMR (DMSO-d₆, 400MHz)δ 8.18 (q, 1H, J=1.4Hz), 8.03 (dt, 1H, J=7.8, 1.3Hz), 7.76 (dq, 1H, J=7.7, 1.5Hz), 7.55 (t, 1H, J=7.8Hz), 7.48 (td, 1H, J=7.8, 1.7Hz), 7.38 (dddd, 1H, J=8.3, 7.5, 5.1, 1.8Hz), 7.26 (td, 1H, J=7.6, 1.3Hz), 7.20 (ddd, 1H, J=11.0, 8.2, 1.2Hz). ¹³C NMR (CD₃0D, 100MHz)δ 169.7, 161.2, 137.5, 134.6, 132.4, 132.0, 131.3, 130.1, 129.9, 129.5, 126.0, 117.2. HRESIMS: C₁₃H₉FO₂(M-H)에 대한 산정치: 215.0508, 실험치: 215.0498. 순상 HPLC 보유 시간: 10.6분. 역상 HPLC 보유 시간: 12.1분. 순도: 99%초과.

2'-플루오로바이페닐-4-카복실산(16). ¹H NMR (DMSO-d₆, 400MHz)δ 13.10 (br s, 1H), 8.05(AA'XX', 2H, J_AA'=J_XX'=1.7Hz, J_XA=J_X'A'=8.5Hz, J_X'A=J_XA'=0.3Hz, v _A=v _A'=3217.9Hz, v _X=v _X'=3070.0Hz), 7.67 (AA'XX', 2H, 상기와 같음), 7.58 (td, 1H, J=8.0, 1.8Hz), 7.34 (m, 1H). ¹³C NMR (DMSO-d₆, 100MHz)δ 167.1, 159.1, 139.4, 130.8, 130.3, 130.2, 129.6, 129.0, 127.3, 125.1, 116.2. HRESIMS: C₁₃H₉FO₂(M-H)에 대한 산정치: 215.0508, 실험치: 215.0515. 순상 HPLC 보유 시간: 12.3분. 역상 HPLC 보유 시간: 12.2분. 순도: 99%초과.

3',5'-디플루오로바이페닐-3-카복실산(17). ¹H NMR (아세톤-d₆, 400MHz)δ 8.30 (td, 1H, J=2,0. 5Hz), 8.10 (dtd, 1H, J=7.6, 1.1, 0.5Hz), 7.97 (ddd, 1H, J=7.8, 2.0, 1.1Hz), 7.64 (td, 1H, J=7.8, 0.6Hz), 7.39 (m, 2H), 7.06 (tt, 1H, J=9.3, 2.4Hz). ¹³C NMR (아세톤-d₆, 100MHz)δ 167.4, 165.6, 163.2, 144.6, 139.8, 132.5, 132.4, 130.6, 130.3, 128.9, 111.0, 103.7. HRESIMS: C₁₃H₈F₂O₂(M-H)에 대한 산정치: 233.0414, 실험치: 233.0425. 순상 HPLC 보유 시간: 13.5분. 역상 HPLC 보유 시간: 12.7분. 순도: 99%초과.

3',5'-디플루오로바이페닐-4-카복실산(18). ¹H NMR (DMSO-d₆, 400MHz)δ 13.15 (br s, 1H), 8.02 (d, 2H, J=8.2Hz), 7.85 (d, 2H, J=8.5Hz), 7.49 (m, 2H), 7.26 (tt, 1H, J=9.4, 2.4Hz). ¹³C NMR (DMSO-d₆, 100MHz)δ 166.4, 164.1, 161.7, 142.6, 141.6, 130.9, 130.0, 127.1, 110.2, 103.5. HRESIMS: C₁₃H₈F₂O₂(M-H)에 대한 산정치: 233.0414, 실험치: 233.0423. 순상 HPLC 보유 시간: 13.0분. 역상 HPLC 보유 시간: 12.8분. 순도: 99% 초과.

2',6'-디플루오로바이페닐-3-카복실산(19). ¹H NMR (DMSO-d₆, 400MHz)δ 8.03 (dt, 1H, J=7.8, 1.6Hz), 8.00 (m, 1H), 7.72 (dt, 1H, J=7.8, 1.4Hz), 7.64 (t, 1H, J=7.7Hz), 7.53 (m, 1H), 7.26 (t, 2H, J=8.3Hz). ¹³C NMR (DMSO-d₆, 100MHz)δ 167.7, 158.7, 135.0, 132.2, 131.4, 131.1, 129.9, 129.5, 129.5, 112.8, 110.9. HRESIMS: C₁₃H₈F₂O₂(M-H)에 대한 산정치: 233.0414, 실험치: 233.0410. 순상 HPLC 보유 시간: 12.1분. 역상 HPLC 보유 시간: 12.1분. 순도: 97% 초과.

2',6'-디플루오로바이페닐-4-카복실산(20). ¹H NMR (DMSO-d₆, 400MHz)δ 8.06(AA'XX', 2H, J_AA'=J_XX'=2.0Hz, J_XA=J_X'A'=8.0Hz, J_X'A=J_XA'=0.7Hz, v _A=v _A'=3243.6Hz, v _X=v _X'=3018.6Hz), 7.60 (AA'XX', 2H, 상기와 같음), 7.54 (m, 1H), 7.27 (t, 2H, J=8.3Hz). ¹³C NMR (DMSO-d₆, 100MHz)δ 171.0, 164.0, 134.1, 125.7, 122.0, 121.9, 121.1, 103.4. HRESIMS: C₁₃H₈F₂O₂(M-H)에 대한 산정치: 233.0414, 실험치: 233.0425. 순상 HPLC 보유 시간: 14.5분. 역상 HPLC 보유 시간: 12.1분. 순도: 99% 초과.

바이페닐-4-카복실산(22). ¹H NMR (DMSO-d₆, 400MHz)δ 13.07 (br s, 1H), 8.03 (AA'XX', 2H, J_AA'=J_XX'=1.8Hz, J_XA=J_X'A'=8.3Hz, J_X'A=J_XA'=0.3Hz, v _A=v _A'=3210.7Hz, v _X=v _X'=3122.0Hz), 7.81 (AA'XX', 2H, 상기와 같음), 7.75 (m, 2H), 7.51 (tt, 2H, J=7.2, 1.1Hz), 7.43 (tt, 1H, J=7.4, 1.2Hz). ¹³C NMR (DMSO-d₆, 100MHz)δ 167.2, 144.2, 139.0, 130.0, 129.8, 129.1, 128.3, 127.0, 126.8. HREIMS: C₁₃H₁₀O₂(M+)에 대한 산정치: 198.0683, 실험치: 198.0683. 순상 HPLC 보유 시간: 13.8분. 역상 HPLC 보유 시간: 12.2분. 순도: 99%초과.

메틸-5-요오도-2-메톡시벤조에이트. TMS-디아조메탄(19.25ml, 38.50mmol, 헥산 중의 2M 용액)을 MeOH(20mL) 중의 5-요오도살리실산(5.08g, 19.24mmol)의 용액에 첨가하고, 11시간 동안 실온에서 교반하였다. 교반이 끝난 후, 반응물을 진공하에 농축시키고, 잔류물을 추가의 정제 없이 다음 단계로 수행하였다.

메틸 요오드(2.40ml, 38.48mmol) 및 K₂CO₃(10.60g, 76.96mmol)을 DMF(20ml) 중의 5-요오도-2-메톡시벤조에이트(5.37g, 19.24mmol)의 용액에 첨가하고, Ar 하의 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 교반이 끝난 후, 에틸 아세테이트를 첨가하고, 반응물을 1% HCl(20ml, 2회), 염수(1회)로 세척하고, MgSO₄로 건조시키고 진공하에 농축하였다. 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피(3:1 헥산:에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 백색 고체로서 메틸-5-요오도-2-메톡시벤조에이트(4.93g, 88%)를 수득하였다(예를 들어, 문헌[Corey, E.J.; Myers, A.G. J. Am. Chem. Soc. 1985, 107, 5574-5576] 참조, 이는 본원에서 전체가 참고로 인용됨). ¹H NMR (DMSO-d₆, 400MHz)δ 7.90 (d, 1H, J=2.4Hz), 7.80 (dd, 1H, J=8.8, 2.4Hz), 6.96 (d, 1H, J=9.0Hz), 3.81 (s, 3H), 3.79 (s, 3H). ₁₃C NMR (DMSO-d₆, 100MHz)δ 164.7, 158.0, 141.6, 138.5, 122.2, 115.2, 82.1, 55.9, 52.0. HREIMS: C₉H₉IO₃(M+)에 대한 산정치: 291.9608, 실험치: 291.9596.

화합물(23 내지 27)을 반응식 4에 따라 제조하였다. 0.08M의 농도를 얻기에 충분한 톨루엔에 용해된 메틸-5-요오도-2-메톡시벤조에이트(1.0당량)의 용액에 EtOH에 용해된 페닐 붕소산(2.0당량)의 용액을 첨가하여 메톡시벤조에이트에 대해 0.06M의 최종 반응 농도를 얻은 후, Pd(PPh₃)₄(10.0mol%)를 첨가하였다. 반응물을 Ar 하의 실온에서 15시간 동안 교반하고, 교반이 끝난 후에는 실온까지 냉각시키고, CH₂Cl₂(2회)로 추출하고, 염수(1회)로 세척하고, MgSO₄ 상에서 건조시키고, 진공하에 농축하였다. 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피(3:1 헥산:에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 메틸화 살리실레이트를 수득하였다.

0.06M의 농도를 얻기에 충분한 CH₂Cl₂ 중의 메틸화 살리실레이트(1.0당량)의 용액에 BBr₃(2.0당량, CH₂Cl₂ 중의 1M 용액)을 첨가하였다. 반응물을 Ar 하의 실온에서 4시간 동안 교반하고, 교반이 끝난 후에는 H₂O(10ml)로 급냉시키고, CH₂Cl₂(2회)로 추출하고, 염수(1회)로 세척하고, MgSO₄ 상에서 건조시키고, 진공하에 농축하였다. 잔류물을 추가의 정제 없이 다음 단계로 수행하였다.

0.06M의 농도에서 THF:MeOH:H₂O(1:1:1) 중의 메틸 에스테르(1.0당량)의 용액에 LiOHㆍH₂O(3.0당량)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 4시간 동안 교반하고, 교반이 끝난 후에는 30% HCl로 산성화시키고, 에틸 아세테이트(5ml, 3회)로 추출하고, MgSO₄ 상에서 건조시키고, 진공하에 농축하였다. 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피(CH₂Cl₂, 1% MeOH, 0.2% 아세트산)에 의해 정제하여 백색 고체로서 바이페닐 살리실레이트를 12 내지 42%의 수율로 수득하였다.

4'-플루오로-4-하이드록시바이페닐-3-카복실산(23). ¹H NMR (CD₃0D, 400MHz)δ 8.01 (d, 1H, J=2.5Hz), 7.65 (dd, 1H, J=8.7, 2.5Hz), 7.51 (m, 2H), 7.11(tt, 2H, J=10.0, 3.0Hz), 6.97 (d, 1H, J=8.7Hz. ¹³C NMR (CD₃0D, 100MHz)δ 173.5, 165.0, 162.7, 137.7, 135.1, 132.6, 129.6, 129.3, 118.9, 116.7, 116.6, 114.2. HRESIMS: C₁₃H₉FO₃(M-H)에 대한 산정치: 231.0459, 실험치: 231.0457. 순상 HPLC 보유 시간: 14.2분. 역상 HPLC 보유 시간: 12.8분. 순도: 99%초과.

2'-플루오로-4-하이드록시바이페닐-3-카복실산(24). ¹H NMR (CD₃0D, 400MHz)δ 7.98 (dd, 1H, J=2.2, 1.4Hz), 7.59 (ddd, 1H, J=8.7, 2.4, 1.7Hz), 7.36 (td, 1H, J=7.8, 1.7Hz), 7.26 (dddd, 1H, J=9.9, 7.4, 4.9, 1.7Hz), 7.16 (td, 1H, J=7.5, 1.2Hz), 7.10 (ddd, 1H, J=11.1, 8.2, 1.3Hz), 6.95 (d, 1H, J=8.5Hz). ¹³C NMR (CD₃0D, 100MHz)δ 173.5, 162.9, 162.4, 137.2, 131.8, 130.2, 130.1, 129.1, 128.1, 125.8, 118.5, 117.1, 114.0. HRESIMS: C₁₃H₉FO3(M-H)에 대한 산정치: 231.0457, 실험치: 231.0446. 순상 HPLC 보유 시간: 13.8분. 역상 HPLC 보유 시간: 12.7분. 순도: 99%초과.

3',5'-디플루오로-4-하이드록시바이페닐-3-카복실산(25). ¹H NMR (CD₃0D, 400MHz)δ 8.07 (d, 1H, J=2.5Hz), 7.73 (dd, 1H, J=8.5, 2.7Hz), 7.15 (m, 2H), 7.01 (d, 1H, J=8.9Hz), 6.86 (tt, 1H, J=9.0, 2.5Hz). ¹³C NMR (CD₃0D, 100MHz)δ 173.3, 166.3, 163.8, 145.1, 135.2, 131.0, 129.8, 119.2, 114.4, 110.4, 103.0. HRESIMS: C₁₃H₈F₂O₃(M-H)에 대한 산정치: 249.0363, 실험치: 249.0356. 순상 HPLC 보유 시간: 14.5분. 역상 HPLC 보유 시간: 13.3분. 순도: 99% 초과.

2',4'-디클로로-4-하이드록시바이페닐-3-카복실산(26). ¹H NMR (CD₃0D, 400MHz)δ 7.83 (d, 1H, J=2.2Hz), 7.70 (d, 1H, J=2.0Hz), 7.58 (dd, 1H, J=8.6, 2.4Hz), 7.48(ABX, 1H, J_AB=8.4Hz, J_AX=2.2Hz, J_BX=0.0Hz, v _A=2989.4Hz, v _B=2973.0Hz), 7.44 (ABX, 1H, 상기와 같음), 7.06 (d, 1H, J=8.7Hz). ¹³C NMR (CD₃OD, 100MHz)δ 171.6, 160.8, 137.5, 136.4, 132.8, 132.6, 132.4, 130.8, 129.2, 128.5, 127.7, 117.2, 112.9. HRESIMS: C₁₃H₈Cl₂O₃(M-H)에 대한 산정치: 280.9772, 실험치: 280.9782. 순상 HPLC 보유 시간: 13.1분. 역상 HPLC 보유 시간: 14.4분. 순도: 99% 초과.

4-하이드록시바이페닐-3-카복실산(27). ¹H NMR (CD₃0D, 400MHz)δ 8.08 (d, 1H, J=2.4Hz), 7.73 (dd, 1H, J=8.7, 2.3Hz), 7.54 (m, 2H), 7.41 (tt, 2H, J=7.3, 1.8Hz), 7.29 (tt, 1H, J=7.8, 1.7Hz), 7.38 (dddd, 1H, J=8.8, 6.4Hz), 7.05 (d, 1H, J=8.7Hz), 6.93 (m, 1H), 6.90 (ddd, 1H, J=7.3, 1.9Hz), 7.00 (d, 1H, J=8.5Hz). ¹³C NMR (CD₃0D, 100MHz)δ 161.5, 140.1, 134.0, 132.4, 128.7, 128.3, 126.9, 126.3, 117.5, 112.9. HRESIMS: C₁₃H₁₀O₃(M-H)에 대한 산정치: 213.0552, 실험치: 213.0545. 순상 HPLC 보유 시간: 12.9분. 역상 HPLC 보유 시간: 12.6분. 순도: 99% 초과.

4-브로모-2,6-디플루오로아니졸. 메틸 요오드(580L, 10.06mmol) 및 K₂CO₃(2.80g, 20.12mmol)을 DMF(10ml) 중의 4-브로모-2,6-디플루오로페놀(1.05g, 5.03mmol)의 용액에 첨가하고, Ar 하의 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 교반이 끝난 후, 에틸 아세테이트를 첨가하고, 반응물을 1% HCl(20ml, 2회), 염수(1회)로 세척하고, MgSO₄ 상에서 건조시키고, 진공하에 농축하였다. 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피(헥산)에 의해 정제하여 백색 고체로서 4-브로모-2,6-디플루오로아니솔(747mg, 67%)을 수득하였다(예를 들어, 문헌[Chambers, R.D.; et al. J. Fluorine Chem. 2000, 102, 169-174] 참조, 이는 본원에서 전체가 참고로 인용함). ¹H NMR (CDCl₃, 400MHz)δ 7.06 (m, 2H), 3.97 (q, 3H, J=1.1Hz). ¹³C NMR (CDCl₃, 100MHz)δ 155.8, 136.3, 116.2, 113.8, 61.9. LREIMS: C₇H₅F₂OBr(M+)에 대한 실험치: 223.0.

4-브로모-2, 6-디클로로아니솔. 메틸 요오드(4671L, 8.12mmol) 및 K₂CO₃(2.24g, 16.24mmol)을 DMF(10ml) 중의 4-브로모-2,6-디클로로페놀(982mg, 4.06mmol)의 용액에 첨가하고, Ar 하의 실온에서 40분 동안 교반하였다. 교반이 끝난 후, 에틸 아세테이트를 첨가하고, 1% HCl(20ml, 2회), 염수(1회)로 세척하고, MgSO₄ 상에서 건조시키고, 진공하에 농축하였다. 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피(헥산)에 의해 정제하여 백색 고체로서 4-브로모-2,6-디클로로아니솔(768mg, 74%)을 수득하였다(예를 들어, 문헌[Li, J.; et al. J. Med. Chem. 1996, 39, 1846-1856] 참조, 이는 본원에서 전체가 참고로 인용됨). ¹H NMR (DMSO-d₆, 400MHz)δ 7.75 (s, 2H), 38.1 (s, 3H). ¹³C NMR (DMSO-d₆, 100MHz)δ 151.3, 131.5, 129.6, 116.5, 60.6. HREIMS: C₇H₅BrCl₂O(M+)에 대한 산정치: 253.8905, 실험치: 253.8901.

화합물(28 내지 31)을 반응식 5에 따라 제조하였다. 0.25M의 농도를 얻기에 충분한 톨루엔에 용해된 적절한 할로-아니솔(1.0당량)의 용액에 EtOH에 용해된 페닐 붕소산(2.0당량)의 용액을 첨가하여 1.5M 붕소산 용액을 얻었다. Na₂CO₃의 2M 수용액을 첨가하여 할로-아니솔에 대해 0.08M의 최종 반응 용액을 얻은 후, Pb(PPh₃)₄(10.0mol%)를 첨가하였다. 반응물을 65℃에서 17시간 동안 교반하고, 교반이 끝난 후에는 실온까지 냉각시키고, CH₂Cl₂(2회)로 추출하고, 염수(1회)로 세척하고, MgSO₄ 상에서 건조시키고, 진공하에 농축하였다. 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피(20:1 헥산: 에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 백색 고체로서 메틸화 바이페닐을 수득하였다.

0.02M의 농도를 얻기에 충분한 CH₂Cl₂ 중의 메틸화 바이페닐(1당량)의 용액에 BBr₃(2.0당량, CH₂Cl₂ 중의 1M 용액)을 첨가하였다. 반응물을 Ar 하의 실온에서 3시간 동안 교반하고, 교반이 끝난 후에는 H₂O(10ml)로 급냉시키고, CH₂Cl₂(2회)로 추출하고, 염수(1회)로 세척하고, MgSO₄ 상에서 건조시키고, 진공하에 농축하였다. 잔류물을 추가의 정제 없이 다음 단계로 수행하였다.

0.04M 농도의 THF:MeOH:H₂O 중의 메틸 에스테르 용액에 LiOHㆍH₂O(3.0당량)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 5시간 동안 교반하고, 교반이 끝난 후에는 30% HCl로 산성화시키고, 에틸 아세테이트(5ml, 3회)로 추출하고, MgSO₄ 상에서 건조시키고, 진공하에 농축하였다. 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피(CH₂Cl₂, 1% MeOH, 0.2% 아세트산)에 의해 정제하여 백색 고체로서 바이페닐 생성물을 14 내지 39%의 수율로 수득하였다.

3',5'-디플루오로-4'-하이드록시바이페닐-3-카복실산(28). ¹H NMR (DMSO-d₆, 400MHz)δ 10.60 (br s, 1H), 8.14 (t, 1H, J=1.7Hz), 7.91 (dt, 1H, J=7.7, 1.1Hz), 7.88 (ddd, 1H, J=8.0, 2.0, 1.1Hz), 7.55 (t, 1H, J=7.9Hz), 7.41 (m, 2H). ¹³C NMR (DMSO-d₆, 100MHz)δ 167.3 154.0, 151.5, 138.4, 133.6, 131.6, 130.8, 129.9, 129.4, 128.4, 127.1, 110.3. HRESIMS: C₁₃H₈F₂O₃(M-H)에 대한 산정 치: 249.0363, 실험치: 249.0358. 순상 HPLC 보유 시간: 18.3분. 역상 HPLC 보유 시간: 10.5분. 순도: 98% 초과.

3',5'-디플루오로-4'-하이드록시바이페닐-4-카복실산(29). ¹H NMR (DMSO-d₆, 400MHz)δ 7.98 (AA'XX', 2H, J_AA'=J_XX'=1.7Hz, J_XA=J_X'A'=8.2Hz, J_X'A=J_XA'=0.5Hz, v _A=v _A'=3189.9Hz, v _X=v _X'=3122.0Hz), 7.81 (AA'XX', 2H, 상기와 같음), 7.51 (m, 2H). ¹³C NMR (DMSO-d₆, 100MHz)δ 167.7, 154.5, 142.5, 136.0, 130.5, 130.5, 130.4, 126.9, 111.0. HRESIMS: C₁₃H₈F₂O₃ (M-H)에 대한 산정치: 249.0363, 실험치: 249.0375. 순상 HPLC 보유 시간: 18.9분. 역상 HPLC 보유 시간: 10.2분. 순도: 99% 초과.

3',5'-디클로로-4'-하이드록시바이페닐-3-카복실산(30). ¹H NMR (DMSO-d₆, 400MHz)δ 8.13 (t, 1H, J=1.6Hz), 7.91 (m, 2H), 7.70 (s, 2H), 7.56 (t, 1H, J=7.8Hz). ₁₃C NMR (DMSO-d₆, 100MHz)δ 167.2, 149.0, 137.9, 132.2, 131.6, 130.8, 129.3, 128.4, 127.1, 126.8, 122.9, 123.0. HRESIMS: C₁₃H₈Cl₂O₃(M-H)에 대한 산정치: 280.9772, 실험치: 280.9767. 순상 HPLC 보유 시간: 16.2분. 역상 HPLC 보유 시간: 11.6분. 순도: 99%초과.

3',5'-디클로로-4'-하이드록시바이페닐-4-카복실산(31). ¹H NMR (DMSO-d₆, 400MHz)δ 7.98 (AA'XX', 2H, J_AA'=J_XX'=1.7Hz, J_XA=J_X'A'=8.1Hz,J_X'A=J_XA'=0.5Hz, v _A=v _A'=3189.9Hz, v _X=v _X'=3110.0Hz), 7.81(AA'XX', 2H, 상기와 같음), 7.78 (s, 2H). ¹³C NMR (DMSO-d₆, 100MHz)δ 167.2, 141.8, 141.7, 134.7, 129.9, 129.7, 126.9, 126.4, 123.0. HRESIMS: C₁₃H₈Cl₂O₃(M-H)에 대한 산정치: 280.9772, 실험치: 280.9785. 순상 HPLC 보유 시간: 15.9분. 역상 HPLC 보유 시간: 11.4분. 순도: 97% 초과.

메틸-2',4'-디플루오로-4-하이드록시바이페닐-3-카복실레이트(32). 화합물(32 및 33)을 반응식 6에 따라 제조하였다. TMS-디아조메탄(5.87ml, 11.75mmol, 헥산 중의 2M 용액)을 MeOH(10mL) 중의 디푸루니살(1.03g, 4.11mmol)의 용액에 첨가하고, 실온에서 5시간 동안 교반하고, 반응물을 진공하에 농축하고, 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피(10:1 헥산:에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 백색 고체로서 화합물(32)(774mg, 71%)을 수득하였다. ¹H NMR (CDCl₃, 400MHz)δ 7.97 (dd, 1H, J=2.2, 1.3Hz), 7.59 (dt, 1H, J=8.8, 2.1Hz), 7.36 (dq, 1H, J=7.7, 1.5Hz), 7.48 (td, 1H, J=7.8, 1.7Hz), 7.38 (dddd, 1H, J=8.8, 6.4Hz), 7.05 (d, 1H, J=8.7Hz), 6.93 (m, 1H), 6.90 (ddd, 1H, J=10.6, 8.9, 2.5Hz), 3.96 (s, 3H). ¹³C NMR (CDCl₃,100MHz)δ 170.6, 163.6, 161.3, 158.5, 136.4, 131.2, 130.3, 126.2, 124.2, 118.0, 112.6, 111.8, 104.6, 52.6, 124.2. HRFABMS: C₁₄H₁₀F₂O₃(M+) 에 대한 산정치: 264.0596, 실험치: 264.0598. 순상 HPLC 보유 시간: 6.9분. 역상 HPLC 보유 시간: 14.7분. 순도: 99% 초과.

2',4'-디플루오로-4-메톡시바이페닐-3-카복실산(33). 메틸 요오드(350㎕, 1.16mmol) 및 K₂CO₃(320mg, 2.32mmol)을 DMF(4mL) 중의 화합물(32)(152mg, 0.58mmol)의 용액에 첨가하고, Ar 하의 실온에서 14시간 동안 교반하였다. 교반이 끝난 후, 에틸 아세테이트를 첨가하고, 반응물을 1% HCl(20ml, 2회) 염수(1회)로 세척하고, MgSO₄ 상에서 건조시키고, 진공하에서 농축하고, 추가의 정제 없이 다음 단계로 수행하였다.

LiOH-H₂O(60mg, 1.43mmol)를 MeOH:THF:H₂O(4.5ml, 1:1:1) 중의 완전히 메틸화된 디푸루니살(140mg, 0.50mmol)의 용액에 첨가하고, 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 교반이 끝난 후, 반응물을 30% HCl로 산성화시키고, 에틸 아세테이트(5ml, 3회)로 추출하고, MgSO₄ 상에서 건조시키고, 진공하에 농축하였다. 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피(2:1 에틸 아세테이트:헥산, 1% 아세트산)에 의해 정제하여 백색 고체로서 화합물(33)(122mg, 93%)을 수득하였다. ¹H NMR (CDCl₃, 400MHz)δ 10.77 (br s, 1H), 8.31 (dd, 1H, J=2.5, 0.9Hz), 7.75(dt, 1H, J=8.6, 2.1Hz), 7.41 (dt, 1H, J=8.9, 6.6Hz), 7.15 (d, 1H, J=8.8Hz), 6.94 (m, 1H), 4.13 (s, 3H). ¹³C NMR (CDCl₃, 100MHz)δ 177.7, 161.4, 158.2, 135.7, 133.9, 131.4, 129.0, 123.5, 118.1, 112.2, 112.0, 104.6, 56.9. HRESIMS: C₁₄H₁₀F₂O₃(M-H)에 대한 산정치: 263.0520, 실험치: 263.0514. 순상 HPLC 보유 시간: 21.6분. 역상 HPLC 보유 시간: 11.9분. 순도: 99% 초과.

화합물(34 내지 38)을 반응식 7에 따라 제조하였다. 화합물(39 내지 44)을 반응식 8에 따라 제조하였다. 0.07M의 농도를 얻기에 충분한 톨루엔 중의 아릴 요오드(1.0당량)의 용액에 0.4M 붕소산의 농도를 제공하기에 충분한 EtOH에 용해된 적절한 포르밀 페닐붕소산을 첨가하였다. Na₂CO₃의 2M 수용액을 첨가하여 아릴 요오드에 대해 0.04M의 최종 반응 농도를 얻은 후, Pd(PPh₃)₄(3.0mol%)를 첨가하였다. 반응물을 Ar 하에서 18시간 동안 가열 환류시키고, 환류가 끝난 후에는 실온까지 냉각시키고, CH₂Cl₂(2회)로 추출하고, 염수(1회)로 세척하고, MgSO₄ 상에서 건조시키고, 진공하에 농축하였다. 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피(40:1 헥산:에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 백색 고체로서 바이페닐 알데하이드를 40 내지 91%의 수율로 수득하였다.

3',5'-디클로로-3-포르밀바이페닐(39). ¹H NMR (CDCl₃, 400MHz)δ 10.09 (s, 1H), 8.04 (t, 1H, J=1.8Hz), 7.91 (dt, 1H, J=7.6, 1.3Hz), 7.80 (ddd, 1H, J=7.8, 2.0, 1.3Hz), 7.64 (t, 1H, J=7.8Hz), 7.49 (d, 2H, J=1.8Hz), 7.38 (t, 1H, J=1.9Hz). ¹³C NMR(CDCl₃, 100MHz)δ 192.0, 142.8, 139.7, 137.2, 135.8, 133.0, 130.1, 130.0, 128.1, 128.0, 125.9. HRFABMS: C₁₃H₈Cl₂O(M+H)에 대한 산정치: 251.0027, 실험치: 251.0027. 순상 HPLC 보유 시간: 8,0분. 역상 HPLC 보유 시간: 15.2분. 순도: 99% 초과.

3',5'-디클로로-4-포르밀바이페닐(40). ¹H NMR (CDCl₃, 400MHz)δ 7.99 (AA'XX', 2H, J_AA'=J_XX'=2.1Hz, J_XA=J_X'A'=8.5Hz, J_X'A=J_XA'=0.7Hz, v _A=v _A'=3193.7Hz, v _X=v _X'=3077.8Hz), 7.70 (AA'XX', 2H, 상기와 같음), 7.47 (t, 1H, J=1.9Hz), 7.39 (d, 2H, J=1.9Hz). ¹³C NMR (CDCl₃, 100MHz)δ 191.8, 144.4, 142.9, 136.2, 135.8, 130.6, 128.5, 127.9, 126.1. HREIMS: C₁₃H₈Cl₂O(M-H) 에 대한 산정치: 248.9873, 실험치: 248.9874. 순상 HPLC 보유 시간: 7.9분. 역상 HPLC 보유 시간: 15.2분. 순도: 99% 초과.

3',5'-디클로로-2-포르밀바이페닐(41). ¹H NMR (CDCl₃, 400MHz)δ 9.98 (s, 1H), 8.03 (dd, 1H, J=7.8, 1.3Hz), 7.66 (td, 1H, J=7.6, 1.5Hz), 7.55 (tt, 1H, J=7.6, 1.0Hz), 7.44 (t, 1H, J=1.9Hz), 7.39 (dd, 1H, J=7.7, 1.0Hz), 7.27 (d, 2H, J=1.9Hz). ¹³C NMR (CDCl₃, 100MHz)δ 191.4, 142.9, 141.0, 135.3, 134.0, 133.7, 130.7, 129.0, 128.5, 128.4, 128.4. HRFABMS: C₁₃H₈Cl₂O(M+H)에 대한 산정치: 251.0030, 실험치: 251.0029. 순상 HPLC 보유 시간: 7.0분. 역상 HPLC 보유 시 간: 14.9분. 순도: 99% 초과.

화합물(45 내지 47)을 반응식 8에 따라 제조하였다. 0.07M의 농도를 얻기에 충분한 아세톤 중의 바이페닐 알데하이드(1.0당량)의 용액에 0.2M 과망간산염의 농도를 얻기에 충분한 H₂O 중의 KMnO₄(2.0당량)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 16시간 동안 교반하고, 교반이 끝난 후에는 진공하에 농축하고, 얻어진 잔류물을 10:1 CH₂Cl₂:MeOH에 재용해시키고, 유리솜(glass wool)의 플러그를 통해 여과하였다. 조질의 생성물을 플래쉬 크로마토그래피(10:1 CH₂Cl₂:MeOH)에 의해 정제하여 백색 고체로서 카복실산(58mg, 100%)을 82 내지 100%의 수율로 수득하였다.

2',4'-디클로로바이페닐-3-카복실산(45). ¹H NMR (DMSO-d₆, 400MHz)δ 8.22 (br s, 1H), 8.00 (br s,1H), 7.94 (d, 1H, J=7.5Hz), 7.76 (s, 2H), 7.63 (s, 1H), 7.60 (br s, 1H). ¹³C NMR (DMSO-d₆, 100MHz)δ 168.0, 143.7, 138.1, 135.4, 131.6, 129.9, 127.9, 126.2. HRESIMS: C₁₃H₈Cl₂O₂(M-H)에 대한 산정치: 264.9823, 실험치: 264.9810. 순상 HPLC 보유 시간: 12.3분. 역상 HPLC 보유 시간: 14.2분. 순도: 99% 초과.

2',4'-디클로로바이페닐-4-카복실산(46). ¹H NMR (CD₃OD, 400MHz)δ 8.11 (br s, 2H) 7.72 (m, 2H), 7.64 (d, 2H, J=1.9Hz), 7.46 (t, 1H, J=1.7Hz). ¹³C NMR (DMSO-d₆, 100MHz)δ 170.3, 140.6, 135.2, 127.2, 126.4, 119.3, 118.6, 117.4. HRESIMS: C₁₃H₈Cl₂O₂(M-H)에 대한 산정치: 264.9830, 실험치: 264.9823. 순상 HPLC 보유 시간: 12.5분. 역상 HPLC 보유 시간: 14.4분. 순도: 99% 초과.

2',4'-디클로로바이페닐-2-카복실산(47). ¹H NMR (DMSO-d₆, 400MHz)δ 7.75 (br s, 1H), 7.56 (s, 2H), 7.48 (m, 2H), 7.36 (m, 2H). ₁₃C NMR(DMSO-d₆, 100MHz)δ 170.1, 152.5, 145.2, 133.3, 130.0, 129.6, 128.0, 127.2, 126.3. HRESIMS: C₁₃H₈Cl₂O₂(M-H)에 대한 산정치: 264.9823, 실험치: 264.9834. 순상 HPLC 보유 시간: 11.4분. 역상 HPLC 보유 시간: 13.6분. 순도: 99% 초과.

화합물(48 내지 53)을 반응식 8에 따라 제조하였다. 0.1M의 농도를 얻기에 충분한 MeOH 중의 바이페닐 알데하이드(1.0당량)의 용액에 0.3M 보로하이드라이드의 농도를 얻기에 충분한 MeOH 중의 NaBH₄(2.0당량)를 첨가하였다. 반응물을 0℃에서 교반하고, 실온까지 천천히 가온하였으며, 16시간 동안 교반한 후에는 진공하에 농축하고, 플래쉬 크로마토그래피(3:1 헥산:에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 백색 고체로서 바이페닐 알코올을 94 내지 100%의 수율로 수득하였다.

3',5'-디클로로바이페닐-3-일-메탄올(48). ¹H NMR (CDCl₃, 400MHz)δ 7.54 (m, 1H), 7.46 (d, 2H, J=1.8Hz), 7.45 (m, 2H), 7.39 (m, 1H), 7.34 (t, 1H, J=1.9Hz), 4.77 (s, 2H), 1.90 (br s, 1H). ₁₃C NMR (CDCl₃, 100MHz)δ 144.1, 141.9, 139.0, 135.5, 129.5, 127.4, 127.1, 126.5, 125.8, 125.7, 65.3. HREIMS: C₁₃H₁₀Cl₂O(M+)에 대한 산정치: 252.0103, 실험치: 252.0109. 순상 HPLC 보유 시간: 13.9분. 역상 HPLC 보유 시간: 14.0분. 순도: 99% 초과.

3',5'-디클로로바이페닐-4-일-메탄올(49). ¹H NMR (CDCl₃, 400MHz)δ 7.53 (AA'XX', 2H, J_AA'=1.9Hz, J_XX'=3.1Hz, J_XA=8.7Hz, J_X'A'=6.4Hz, J_X'A=J_XA'=0.5Hz, v _A=v _A'=3009.8Hz, v _X=v _X'=2977.8Hz), 7.45 (AA'XX', 2H, 상기와 같음), 7.45 (d, 2H, J=1.9Hz), 7.33 (t, 1H, J=1.9Hz), 4.75 (br d, 2H, J=4.8Hz), 1.81 (br t, 1H, J=5.2Hz). ¹³C NMR (CDCl₃, 100MHz)δ 144.0, 141.4, 138.0, 135.5, 127.8, 127.4, 127.4, 125.8, 65.1. HREIMS: C₁₃H₁₀Cl₂O(M+)에 대한 산정치: 251.0110, 실험치: 252.0109. 순상 HPLC 보유 시간: 15.4분. 역상 HPLC 보유 시간: 14.0분. 순도: 97% 초과.

3',5'-디클로로바이페닐-2-일-메탄올 (50). ¹H NMR (CDCl₃, 400MHz)δ 7.55 (dd, 1H, J=7.5, 1.3Hz), 7.43 (td, 2H, J=7.5, 1.4Hz), 7.38 (m, 2H), 7.29 (d, 2H, J=1.9Hz), 7.24 (dd, 1H, J=7.4, 1.4Hz), 4.58 (s, 2H), 1.79 (s, 1H). ¹³C NMR (CDCl₃, 100MHz)δ 143.7, 138.9, 137.9, 134.9, 130.0, 129.0, 128.9, 128.2, 127.9, 127.6, 63.0. HREIMS: C₁₃H₁₀Cl₂O(M+)에 대한 산정치: 252.0110, 실험치: 252.0109. 순상 HPLC 보유 시간: 11.5분. 역상 HPLC 보유 시간: 14.0분. 순도: 99% 초과.

화합물(54 및 55)을 반응식 9에 따라 제조하였다. 0.07M의 농도를 얻기에 충분한 톨루엔 중의 적절한 요오도벤즈알데하이드(1.0당량)의 용액에 1.0M 붕소산의 농도를 제공하기에 충분한 EtOH 에 용해된 3,5-디플루오로페닐 붕소산(2.0당량)을 첨가하였다. 요오도벤즈알데하이드에 대해 0.04M의 최종 반응 농도를 얻도록 Na₂CO₃의 2M 수용액을 첨가한 후, Pd(PPh₃)₄(4.0mol%)를 첨가하였다. 반응물을 60℃에서 17시간 동안 교반하고, 교반이 끝난 후에는 실온까지 냉각시키고, CH₂Cl₂(2회)로 추출하고, 염수(1회)로 세척하고, MgSO₄ 상에서 건조시키고, 진공하에 농축하였다. 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피(10:1 헥산:에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 백색 고체로서 바이페닐 알데하이드를 78 내지 80%의 수율로 수득하였다.

3',5'-디플루오로-3-포르밀바이페닐(54). ¹H NMR (CDCl₃, 400MHz)δ 10.06 (s, 1H), 8.02 (t, 1H, J=1.4Hz), 7.88 (dt, 1H, J=7.8, 1.4Hz), 7.78 (ddd, 2H, J=7.8, 2.0, 1.2Hz), 7.61 (t, 2H, J=7.7), 7.10 (m, 2H), 6.80 (tt, 1H, J=8.8, 2.3Hz. ¹³C NMR (CDCl₃, 100MHz)δ 192.0, 164.8, 162.3, 143.0, 139.8, 137.1, 132.9, 129.9, 127.9, 110.4, 103.5. HRFABMS: C₁₃H₈F₂O(M+H)에 대한 산정치: 219.0620, 실험치: 219.0621. 순상 HPLC 보유 시간: 8.9분. 역상 HPLC 보유 시간: 13.7분. 순도: 99% 초과.

3',5'-디플루오로-4-포르밀바이페닐(55). ¹H NMR (CDCl₃, 400MHz)δ 9.98 (s, 1H), 8.02 (dd, 1H, J=7.8, 1.5Hz), 7.65 (td, 1H, J=7.3, 1.4Hz), 7.54 (t, 1H, J=7.8Hz), 7.40 (dd, 1H, J=7.6, 1.2Hz), 6.90 (m, 3H). ¹³C NMR (CDCl₃, 100MHz)δ 191.5, 164.1, 161.6, 143.4, 141.3, 134.0, 133.7, 130.6, 129.0, 128.3, 113.3, 103.8. HRFABMS: C₁₃H₈F₂O(M+H)에 대한 산정치: 219.0620, 실험치: 219.0621. 순상 HPLC 보유 시간: 7.0분. 역상 HPLC 보유 시간: 13.4분. 순도: 99% 초과.

수많은 시험관내 시험을 이용하여 트랜스타이레틴 테트라머를 안정화시키고 피브릴의 형성을 방지할 수 있는 이들의 능력에 대해 화합물을 평가할 수 있다. 상기 시험은 피브릴 형성 분석, 플라즈마 선택성 분석, 트랜스타이레틴:화합물 복합체의 3차원 구조의 결정(예를 들어, X-선 결정학에 의해), 트랜스타이레틴 테트라머 해리 또는 피브릴 형성의 동력학, 및 예를 들어 접합 또는 열량 측정에 의한 트랜스타이레틴:화합물 상호작용의 화학양론 및 에너지론의 결정을 들 수 있다. 예시적인 시험관내 분석의 세부사항은 하기에 제시되어 있다.

각각의 화합물은 정체성 피브릴 형성 분석을 수행하였다. 화합물을 P₂O₅ 상에서 하룻밤 동안 건조시키고, DMSO에서 7.2M의 최종 농도가 될 때까지 용해시켜 일차 저장 용액(10배 저장액)을 제공하였다. 이차 저장 용액은 일차 저장 용액을 DMSO로 1.44mM(2배 저장액)의 최종 농도가 될 때까지 5배 희석함으로써 제조하였다. 억제제(1.44mM)의 존재하에 TTR(3.6μM)의 산-중재 아밀로이드 생성은 하기와 같이 측정하였다: 1회용 UV 큐벳(cuvette)에 10mM 소듐 포스페이트, 100mM KC1 및 1mM EDTA(pH 7.6)중의 0.4mg/mL WT TTR 단백질 용액 495㎕, 및 DMSO(2배 저장액)중의 1.44mM 이차 저장액 억제제 용액 5㎕를 첨가하였다. 혼합물을 볼텍싱(vortexing)하고, 30분(25℃) 동안 항온 배양하였으며, 이때 200mM 아세테이트 500㎕, 100mM KC1 및 1mM EDTA(pH 4.2)를 이용하여 pH를 4.4로 낮추었다. 최종 1ml 용액을 볼텍싱하고, 교반 없이 37℃에서 72시간 동안 항온 배양하였다. 72시간 후, 큐벳을 볼텍싱하여 임의의 존재하는 피브릴을 현탁하고, 현탁액의 혼탁도(turbidity)를 UV-비스 분광기(UV-vis spectrometer)를 이용하여 350 및 400nm에서 측정하였다. 피브릴 형성(%)은 각각의 동일한 방법으로 제조되었지만 억제제가 없는 샘플에 비해 TTR + 억제제 샘플에 대한 관측된 혼탁도의 비가 100배인 것으로 관측되었다. 등몰(equimolar)의 억제제 및 TTR 농도(3.6μM)을 이용하는 피브릴 형성 분석은 1배 이차 저장 용액을 이용하여 상기와 같이 수행되었다. 1배 저장 용액은 7.2mM 10배 일차 저장 용액을 0.72mM의 최종 농도가 될 때까지 DMSO로 10배 희석함으로써 제조되었고, 상술한 바와 같은 피브릴 형성 분석에 사용되었다. 모든 분석은 3회 수행되었으며, 모든 화합물은 야생형 TTR을 이용하여 분석되었다. 모든 화합물은 WT TTR의 부재하에 용액의 혼탁도를 이용함으로써 실험 과정을 통해 가용성인 것으로 밝혀졌으며, 이는 혼탁도는 TTR 아밀로이드 형성의 결과인 것을 확실케 하였다.

혈장에서의 잠재성 억제제의 TTR에 대한 결합 화학량론은 항체 포획/HPLC 방법에 의해 측정되었다. 측정시에 1.5-mL 에펜도르프 튜브에 인간 혈장 1.0ml 및 억제제의 1.44mM DMSO 용액 7.5㎕를 충전하였다. 상기 용액을 항온 배양하고, 37℃에서 24시간 동안 부드럽게 흔들어 주었다. 급냉된 세파로즈(sepharose)의 1:1 겔:TSA(트리스 염수) 슬러리(125㎕)를 상기 용액에 첨가하고, 4℃에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 주었다. 상기 용액을 원심분리(16,000 x g)하였고, 상층액을 2개의 400㎕ 분량으로 나누었으며, 이어 이를 항-TTR 항체-접합 세파로즈의 1:1 겔:TSA 슬러리의 다른 200㎕ 샘플에 첨가하였다. 상기 용액을 4℃에서 20분 동안 부드럽게 흔들어 주고, 원심분리(16,000 x g)하였으며, 상층액을 제거하였다. 상기 겔을 4℃에서 1ml의 TSA/0.05% 사포닌(3회, 각각 10분)으로 세척한 후, 4℃에서 1mL의 TSA(2회, 각각 10분)로 세척하였다. 샘플을 원심분리(16,000 x g)하였으며, 최종 세척액을 제거하고, 155㎕의 100mM 트리에틸아민, pH 11.5를 첨가하여 항체로부터 TTR 및 결합된 억제제를 용출하였다. 4℃에서 30분 동안 부드럽게 흔든 후, 용출액 샘플을 원심분리(16,000 x g)하였고, TTR 및 억제제를 포함하는 145㎕의 상층액을 제거하였다. 이어, 상기 상층액을 상술한 바와 같이 역상 HPLC에 의해 분석하였다(예를 들어, 문헌[Purkey, H.E.; Dorrell, M.I. ; Kelly, J.W. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2001, 98, 5566-71] 참조, 이는 본원에서 전체가 참고로 인용됨).

현적(hanging drop) 중의 2M 암모늄 설페이트에 대해 평형화된 7mg/mL(100mM KC1, 1mM EDTA, 10mM 소듐 포스페이트, pH 7.0, 0.35 내지 0.50M 암모늄 설페이트) 의 단백질 용액으로부터 WT TTR의 결정을 수득하였다. TTR-리간드 복합체는 10배 몰 과량의 리간드를 이용하여 3주 이상 동안 적셔진 결정으로부터 제조하였다. RU200 회전 양극 X-선 발생기(rotating anode X-ray generator)에 결합된 CCD-PXL-L600 검출기(Bruker 기기)를 화합물(20 또는 26)으로 적셔진 결정의 데이터 수집을 위해 사용하였다. 14-BM-C, BIOCARS 및 Advance Photon Source의 단색성 고에너지원에서의 양자-4 검출기(Quantum-4 detector)는 화합물(1 또는 18)로 적셔진 결정의 데이터 수집을 위해 사용되었다. 상기 결정을 냉동 보호제(cryo-protectant)로서 파라톤 오일(paratone oil)에 넣고, 회절 시험(화합물(20 및 26)에 대한 120K, 및 화합물(1 및18)에 대한 100K)을 위해 냉각시켰다. TTRㆍ리간도 복합체 구조의 결정은 a=43Å, b=85Å, 및 c=66Å에 근접한 단위 세포 치수; 비대칭 단위에서 2개의 단량체를 갖는 공간 그룹(space group) P2₁2₁2를 갖는 아포(apo) 결정형과 유사형태를 갖는다. 화합물(1 및 18)의 데이터 부류는 DENZO 및 SCALEPACK로 축소되었다(문헌[Otwinowski, Z.; Minor, W. Macromolecular Crystallography, Part A,in Methods in Enzymology; Carter, C.W., Sweet, R.M., Eds.; Academic Press: 1997; Vol. 276, p307-326] 참조, 이는 본원에서 전체가 참고로 인용됨). 화합물(20 및 26)의 데이터 부류는 SAINT 및 PROSCALE(Bruker AXS, Inc.)로 축소되었다.

Protein Data Bank(등록번호: 1BMZ)로부터 TTR에 대한 단백질 원자 좌표를 EPMR에 이한 분자 치환 연구 도중에 출발 모델로서 사용하였다. EPMR로부터의 최고의 용액을 CNS의 분자 역학 및 에너지 최소화 프로토콜에 의해 정류되었다. 얻 어진 차등 푸리에 맵(difference Fourier map)은 TTR 테트라머 각각의 결합 주머니(binding pocket)에서 리간드(화합물(18, 20 및 26)에 대해 2개 형성, 및 화합물(1)에 대해 4개 형성)의 결합을 나타냈다. 이들 맵을 이용하여, 상기 리간드를 밀도속으로 명확하게 넣을 수 있었고, 결정학 제련물에 포함되었다. 모의실험용 어닐링(simulated annealing) 및 후속적인 위치 및 온도 인자 제련물의 수회 주기 이후, 물분자를 차등 푸리에 맵에 넣었다. 셰이크/와프 바이어스 제거 프로토콜(shake/warp bias removal protocol)에 의해 산정된 바이어스되지 않은 가중 전자 밀도 맵을 이용하여 맵-적합성의 최종 주기를 수행하였다. 리간드의 모든 결합 형태는 억제제의 부재하에 단계적으로 수행된 셰이크/와프의 바이어스되지 않은 가중 전자 맵뿐만 아니라, 바이어스되지 않은 어닐링 오밋 맵(omit map)과 양호하게 일치하였다. 제련물의 최종 주기는 Refmac의 억제 제련물 프로토콜에 의해 수행되었다. 최종 맵에서의 해석 가능한 전자 밀도의 부재로 인해, 9종의 N-말단 및 3종의 C-말단 잔기는 최종 모델에서 포함되지 않았다. 결정학 분석에 대한 요약은 표 2에 나타나 있다(예를 들어, 문헌[ Kissinger, C.R.; Gehlhaar, D.K.; Fogel, D.B. Acta Crystallogr., Sect. D 1999, 55, 484-491], 문헌[Brunger, A.T.; et al., Acta Crystallogr., Sect. D 1998, 54, 905-921], 문헌[Kantardjieff, K.; et al. Acta Crystallogr., Sect. D 2002, 58, 735-743], 문헌[Bailey, S. Acta Crystallogr., Sect. D 1994, 50, 760-763], 및 문헌[Murshudov, G.N.; Vagin, A.A.; Dodson, E.J. Acta Crystallogr., Sect. D 1997, 53, 240-255] 참조, 이들 각각은 본원에서 전체가 참고로 인용됨).

TTR 테트라머 해리의 동력학은 우레아에서 연결된 단량체 풀림에 의해 측정되었다. 느린 테트라머 해리는 적외선 CD 분광기에 의해 측정되지 않았지만, 상술한 바와 같은 적외선 CD에 의해 용이하게 검출 가능한 신속한(500,000배 더 빠른) 풀림 단계와 연결된다. 억제제(3.6M)의 함수로서 TTR 테트라머(3.6μM) 해리 동력학은 127.4㎕의 인산 완충액이 첨가된 69㎕의 WT TTR(2.90mg/mL, 10mM 소듐 포스페이트, 100mM KCl, 1mM EDTA, pH 7.0)에 3.6㎕의 관심있는 억제제의 1mM 용액(에탄올 중)을 첨가함으로써 측정되었다. TTR 농도(3.6μM)의 2배인 억제제의 농도(7.2μM)에 있어서, 7.2㎕의 관심있는 억제제의 1mM 용액(에탄올 중)을 123.8㎕의 인산 완충액이 첨가된 69㎕의 WT TTR(2.90mg/mL, 10mM 소듐 포스페이트, 100mM KCl, 1mM EDTA, pH 7.0)에 첨가하였다. 100㎕의 관심있는 단백질-억제제 용액을 10.3M 우레아 및 300㎕의 인산 완충액의 용액 600㎕에 첨가하여 6.5M의 최종 우레아 농도를 얻었다.

상기 용액을 볼텍싱하고, 원편광 이색성 스펙트럼을 하기 간격으로 수집하였다: 0, 5, 8, 23, 46, 71, 95, 118, 144 및 168시간. 억제제가 아닌 7.2㎕의 에탄올을 포함하는 대조군 샘플을 비교를 위해 제조하였고, 스펙트럼을 상술한 시점에서 수집하였다. CD 스펙트럼을 220nm과 213nm 사이에서 수집하였으며, 매 0.5nm 마다 스캐닝하고 10초의 시간으로 평균을 냈다. 각각의 파장은 1회 스캐닝하였다. 진폭에 대한 값은 220nm과 213nm 사이에서 평균을 내어 실험을 통해 β-시트 손실의 정도를 측정하였다.

산-중재 피브릴 형성 속도는 혼탁도에 의해 pH 4.4에서 수행되었다. 화합물 을 P₂O₅ 상에서 하룻밤 동안 건조시키고, 7.2mM의 최종 농도가 될 때까지 DMSO에 용해시켜 일차 저장 용액(10배 저장액)을 제공하였다. 1.44mM(2배 저장액)의 최종 농도를 얻기 위해 일차 저장 용액의 5배 DMSO로 희석함으로써 이차 저장 용액을 제조하였다. 3.6μM TTR(테트라머)에 대해 7.2μM의 억제제 온도를 이용하는 피브릴 형성 분석법은 하기와 같이 수행되었다: 1회용 UV 큐벳에 10mM 소듐 포스페이트, 100mM KC1 및 1mM EDTA (pH 7.6) 중의 0.4mg/mL WT TTR 단백질 용액 495㎕, 및 1.44mM 이차 억제제 저장 용액(2배 저장액)5㎕를 첨가하였다. 혼합물을 볼텍싱하고, 25℃에서 30분 동안 항온 배양하였다. 30분 후에 500㎕의 200mM 아세테이트, 100mM KCl, 1mM EDTA(pH 4.2)를 이용하여 pH를 4.4로 낮추었다. 최종 1㎖ 용액을 볼텍싱하고, 교반 없이 37℃에서 항온 배양하였다. 상기 용액을 볼텍싱하고, 350 및 400nm에서의 혼탁도를 측정하였다. UV 스펙트럼을 하기 간격으로 수집하였다: 산성화 이후 0, 4, 8, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 및 192시간. 5㎕의 DMSO를 포함하는 대조군 샘플은 비교를 위해 제조되었고, 스펙트럼은 상기 시점에서 수집되었다. 각각의 억제제 용액을 판촉하기 전에 상기 큐벳의 교란을 방지하기 위해 10개의 그룹으로 제조하였다. UV 흡광도를 측정한 후, 상기 시점에 상응하는 큐벳을 폐기하였다. 등몰의 (3.6μM) TTR 및 억제제 농도를 이용하는 피브릴 형성 분석법을 하기와 같이 제조된 1배 이차 억제제 저장 용액을 이용하여 상기와 같이 수행하였다: 저장 용액은 DMSO를 이용하여 7.2mM lO배 일차 저장 용액을 0.72mM의 최종 농도가 될 때까지 10배 희석함으로써 제조되었고, 상술한 바와 같은 피브릴 형 성 분석법에 사용되었다. 모든 화합물은 실험의 진행 도중에 가용성인 것으로 밝혀졌으며, 이는 혼탁도가 TTR 아밀로이드 형성의 결과임을 확실케 하였다.

pH 4.4에서 억제제의 존재하의 TTR 4차 구조를 분석하였다. 화합물(18 및 20)이 TTR을 안정화시키는 기작은 3.6㎕ 또는 7.2㎕의 억제제의 존재하에 정체성 피브릴 형성 분석법의 조건하에서 72시간 동안 단백질(3.6μM)을 항온 배양함으로써 측정되었다. 72시간 후, 샘플을 원심분리(14,000 x g)하였고, 상층액을 분석법에서 형성된 임의의 고체로부터 제거하였다. 평형(equilibrium) 및 속도 초원심분리 분석법(ultracentrifugation analysis)은 베크만(Beckman) XL-I 분석용 원심분리기를 이용하여 달성되었다. 데이터의 수집 및 분석을 이전에 기술된 바와 같이 수행되었다(예를 들어, 문헌[Lashuel, H.A.; Lai, Z.; Kelly, J.W. Biochemistry 1998, 37, 17851-64] 및 문헌[Lashuel, H.A.; et al. Biochemistry 1999, 38, 13560-73] 참조, 이들 각각은 본원에서 전체가 참고로 인용됨).

WT TTR에 대한 화합물(18 및 20)의 결합을 특징짓는 해리 상수는 마이크로칼(Microcal) 기기(메릴랜드 주 노쓰햄프톤 소재의 Microcal Inc.)를 이용하여 등온 열량 측정법(isothermal titration calorimetry)에 의해 측정되었다. 억제제의 용액(25mM 트리스 완충액 중의 300㎕ 또는 500㎕, 100mM KCl, 1mM EDTA, 12% EtOH, pH 8.0)을 제조하고, WT TTR(25mM 트리스 완충액 중의 15㎕ 또는 25㎕, 100mM KCl, 1mM EDTA, 12% EtOH, pH 8.0)을 포함하는 ITC 세포내로 적정하였다. 2.5㎕의 초기 주입 이후에 각각 5.0㎕의 주입을 50회 수행하였다(25℃). 블랭크를 뺀 후에 온도 분석도(thermogram)를 통합하여 네가티브 협주성을 갖는 2개의 연속적인 결합 부위 의 모델에 가장 적합한 결합 등온선(binding isotherm)을 얻었다. 상기 데이터는 마이크로칼에 의해 제공되는 ItC 데이터 분석 모듈을 이용하여 4개의 조절 가능한 파라미터, 즉 K_l, △H_l, K₂ 및 △H₂에 의한 비선형 최소 자승 접근법(nonlinear least squares approach)에 의해 조절되었다.

상술된 화합물을 혼탁도 분석법을 이용하여 TTR 아밀로이드 피브릴 억제제로서 평가하였다. WT TTR 아밀로이드 생성은, pH를 4.4의 최종 값으로 만들기 위해 완충액 첨가를 이용함으로써, 억제제(25℃, 30분)에 의해 예비 항온 배양된 TTR의 산성화에 의해 개시되었다. 각각의 혼합물을 72시간(37℃) 동안 항온 배양한 후, UV-비스 분광기를 이용하여 350 및 400nm에서 혼탁도를 측정하였다. 모든 아밀로이드 피브릴 형성 데이터는 억제제의 존재하에 WT TTR 아밀로이드 생성에 표준화하였으며, 이는 100% 피브릴 형성에 지정된다.

따라서, 5% 피브릴 형성은 72시간 이후에 95%의 WT TTR 피브릴 형성을 개시하는 화합물에 상응한다. 각각의 잠재적인 억제제가 3.6μM의 TTR 테트라머 농도에 대해 7.2μM의 농도에서 먼저 측정되었다. 15% 미만의 피브릴 형성을 허용하는 화합물은 최대 효율을 갖는 억제제를 위해 선택된 TTR 농도(3.6μM)와 동일한 농도에서 측정되었다. 이들 조건하에 40% 미만의 피브릴 형성은 매우 양호한 억제제의 특징을 나타내는 반면, 40 내지 70% 억제는 가장 적절한 화합물을 나타낸다. 피브릴 형성 데이터는 표 1-1 내지 표 1-8에 제시되어 있다.

화합물(2 내지 55)에 대한 억제제 효율 데이터에 기초하여, 디-할로겐 작용화 소수성 고리에 직접 연결된 카복실레이트-치환 친수성 고리는 우수한 활성에 충분한 것으로 나타난다(표 1-1 내지 1-8). 카복실레이트(2 내지 10) 대신에 페놀성 치환은 모 화합물(1)보다 훨씬 열등한 상당히 낮을 활성의 억제제를 수득한다. 소수성 고리의 오르토 또는 메타 위치에 할로겐을 갖는 억제제는 할로겐이 없는 화합물, 또는 단일 파라 할로겐을 갖는 화합물보다 우수하다. 이는 파라 할로겐이 메타 및 오르토 할로겐화 아릴과 동일한 방식으로 HBP를 제공하기 못한다는 것을 암시한다. 모든 할로겐의 완전한 제거는 예상 가능하게는 할로겐 결합 주머니를 채우기 위한 입체성 상보성이 없기 때문에 빈약한 억제제를 초래한다.(예를 들어, 화합물 10, 21 내지 22, 27, 42 내지 44, 및 51 내지 53) 시험 조건하에, 최고의 페놀성 화합물(8)은 친수성 고리 상의 페놀성 및 카복실레이트 작용기 둘 모두를 갖는 화합물(1)보다 열등하다. 단일 카복실레이트(예를 들어, 화합물 11 내지 22)에 의해 안정화된 아릴 화합물은 우수한 아밀로이드 피브릴 억제제, 예를 들어 화합물(11, 12, 15 내지 20)일 수 있다. 이들은, 파라 할로겐(예를 들어, 화합물13 및 14) 만을 포함한다는 것을 제외하고는, 억제를 위해 디푸루니살과 경쟁한다. 메타 또는 파라 치환된 아릴 카복실레이트는 우수한 억제 효과를 제공하기에 충분할 수 있으며, 이는 화합물(1)의 하이드록실 치환체가 양호한 역제제 활성에 요구되지 않는다는 것을 제시한다. 또한, 파라 카복실레이트 배치는 우수한 억제제를 제공하는 것으로 보이며, 이는 파라 카복실레이트가 화합물(20)에서와 같이 Lys 15 및 15'의 ε-암모니아 그룹과의 전정기적 상호작용(전방향 결합 모드), 및 화합물(18)의 경우와 같이 Ser 117 및 117' 하이드록실기와의 수소 결합 상호작용(역방향 결합 모드)을 보다 양호하게 이용할 수 있다는 것을 보여준다. 파라 위치가 아닌 다른 위치에서 수소성 고리가 할로겐으로 치환되고, 친수성 고리가 메타 및 특히 파라 카복실레이트로 치환되는 아릴은 매우 효율적인 TTR 아밀로이드 피브릴 형성 억제제를 수득한다.

카복실레이트 치환체(살리실산 치환기, 예를 들어, 화합물 23 내지 27)를 포함하는 고리에 하이드록실 치환체의 부가는 또한 디푸루니살과 유사한 높은 활성은 갖는 억제제를 초래할 수 있다. 살리실산 코어를 갖는 아릴에서, 할로겐의 정확한 배치는 이전의 경우에서와 같이 매우 중요한 것으로 보이지 않으며, 이는 이러한 고리가 결합 에너지에 불균형적으로 기여한다는 것을 제시한다. 파라 하이드록실은 Lys 15 및 15'의 ε-암모니아 그룹(전방향 결합 모드), 및 Ser 117 및 117' 하이드록실기와의 수소 결합(역방향 결합 모드)애 참여할 수 있다. 염소(26)에 의한 불소의 치환은 동일하거나 우수한 활성을 갖는 억제제를 초래하는 반면, 할로겐(27)의 완전한 제거는 최적의 억제제를 초래할 수 있다. 화합물(27)은 시험관내에서 파라 카복실레이트(22)보다 약간 우수하고, 둘 모두는 메타 위치에 카복실레이트를 갖는 할로겐이 없는 억제제인 화합물(21) 및 하이드록실-함유 유사체(10)보다 우수하다.

파라 또는 메타 위치(화합물 28 내지 31)에 카복실레이트를 갖는, 할로겐-함유 고리 상의 3',5'-디할로-4'-하이드록실 치환체의 포함은 디푸루니살과 유사한 높은 억제 활성을 초래할 수 있다. 4-하이드록실 치환기는 더욱 밀접한 모방체인 티록신(TTR의 천연 리간드)에 포함되었다. 이들 억제제는 또한 티록신의 호르몬 활성을 더욱 밀접하게 모방할 수 있으며, 따라서 티로이드 작용제 또는 길항제로서 작용할 수 있으며, 이러한 효과는 바람직하지 않을 수 있다.

메틸 에스테르로서 카복실레이트의 보호, 또는 메틸 에테르(32 및 33)로서 하이드록실의 보호는 화합물(1)에 비해 열등한 억제제를 초래할 수 있다. 전하의 손실과 입체성 부피(steric bulk)의 결합은 가능하게는 이들 관측을 설명한다. 모든 친수성 치환체(예를 들어, 화합물 34 내지 38)의 제거는 빈약한 억제제를 초래할 수 있다. 메타 염소 치환기(예를 들어, 화합물 38)만을 포함하는 아릴 화합물은 최적의 억제제일 수 있으며, 이는 염소가 불소-함유 아릴(37)에 비해 할로겐 결합 주머니와의 향상된 결합을 한다는 것을 제시한다.

몇몇 염소-함유 억제제가 합성되었고, 이들의 TTR 피브릴 억제 활성이 측정되었다. 이러한 부류의 억제제의 부재가 메타 또는 파라 위치에 카복실레이트(예를 들어, 화합물 45 및 46)에 카복실레이트를 함유하는 경우, 이들은 높은 활성을 가질 수 있는 반면, 오르토 카복실레이트(예를 들어, 화합물 47)를 갖는 화합물은 열등한 억제제일 수 있다. 이러한 관측은, 오르토 카복실레이트가 Lys 15 및 15'ε-암모니아 그룹과 훨씬 떨어져서 전정기적 상호작용(전방향 결합 모드)을 할 수 없거나, Ser 117 및 117' 하이드록실기과 떨어져서 수소 결합 상호작용(역방향 결합 모드)을 수행할 수 없다는 것을 암시한다. 벤질성 알코올(48 내지 50)은 놀랍게도 피브릴 형성의 우수한 억제제인 것으로 입증되었다. 하나의 고리상의 메타 디클로로 치환기는 가능하게는 수소 결합 또는 물-중재 수소 결합으로 인해 오르토, 메타 또는 파라 위치에서 벤질 알코올 작용기에 의해 보충되는 것으로 보인다. -CH₂OH기가 할데하이드 작용기로 치환된 일련의 알데하이드 유사체(39 내지 41)는 가능하게는 젬 디올(gem diol)로의 알데하이드의 수화로 인해 파라 알데하이드(41)의 경우를 제외하고는 양호한 억제를 나타냈다. 알데하이드, 벤질성 알코올 및 카복실레이트는 상이한 기작을 통해 상기 주머니에 결합하는 것이 가능하다. 그러나, 구조 형성에서, 유사한 결합 모드를 배제해서는 안된다. 또한, 알데하이드는 헤미아세탈을 통해 Ser 117(117')에 공유 결합하거나, 이민 결합을 통해 Lys 15(15')에 공유 결합하는 것이 가능하다. 알데하이드의 경우에 불소(54 및 55)에 의한 염소의 치환은 다소 빈약한 억제제(39 및 41)를 초래할 수 있다. 이전과 같이, 할로겐의 완전한 제거는 활성이 최적인 메타 알데하이드(43)의 경우를 제외하고 빈약한 활성을 갖는 억제제(42 및 44)를 초래할 수 있다. 이러한 최적의 활성은 높은 정도의 수화로부터 야기될 수 있다. 3',5'-디플루오로-메타 알데하이드(54)가 할로겐이 없는 알데하이드(42)보다 열등하다는 것은 놀랄만하다.

TTR (3.6μM)와 동일한 농도에서 TTR 피브릴 형성을 50% 미만으로 유지하는 억제제는 혈장 중의 모든 다른 단백질에 대해 선택적으로 TTR과 결합하는 이들의 능력에 대해 측정되었다. 혈액 중의 디푸루니살 농도는 1회의 500mg의 투여 20시간 후에 30μM을 초과할 수 있거나, 동일량의 투여 4시간 이후에 300μM을 초과할 수 있다. 이러한 높은 정도의 서방형 플라즈마 농도가 우수한 생체 이용률을 제시할 지라도, 더욱 선택적인 억제제가 보다 적은 투여 및 잠재적으로 보다 낮은 부작용을 나타낼 것이고, 따라서, 인간 플라즈마는 이러한 하위부류의 억제제와 함께 10.8μM(인간 플라즈마 중의 평균 TTR 농도는 약 5μM임)의 농도에서 항온 배양되었다. 이어, TTR은 수지-결합 항체를 사용하여 포획하였고, 고정된 TTR은 TSA(트리설라인)/0.05% 사포닌의 용액으로 3회 세척한 후, TSA로 2회 세척하였다. TTR-억제제 복합체를 100mM 트리에틸아민(pH 11.5)에 의해 수지로부터 유리시키고, TTR에 대해 존재하는 억제제의 화학양론을 역상 HPLC 분석에 의해 결정하였다. 2당량의 억제제의 최소치는 TTR 테트라머 당 결합할 수 있다. 세척 후 플라즈마 결합의 화학양론은 세척-관련 손실로 인해 하한치를 나타내는데, 이는 표 1-1 내지 1-8에 요약되어 있다.

염소-함유 바이페닐은 인간 혈장 중의 TTR(0.8의 평균 화학양론, 및 2.0의 최대 이론치의 화학양론, 표 1-1 내지 1-8 참조)과 결합하는데 선택적일 수 있다. 관측된 평균 화학양론은 시험된 모든 억제제에 있어서 0.4였다. 불소-함유 억제제 중, 화합물(18 및 20)은 TTR에 대한 양호하고 허용 가능한 결합 선택도를 각각 나타내며, 이는 유사한 조건하에서 화합물(1)에 의해 나타나는 0.13 화학양론보다 우수하다. 표 1-1 내지 1-8에서 보고된 화학양론 값은 폴리클로날 항체 수지 상에 분리된 TTR로부터의 억제제의 세척-관련 손실로 인해 하한치를 나타낼 수 있다. 화합물(39 및 41)에 대한 TTR 결합 선택도의 결과는 이들 화합물이 상술한 바와 같이 TTR에 공유 결합하기 때문에 조심스럽게 고려되어야 한다.

시험관내에서 우수한 TTR 아밀로이드 피브릴 억제 데이터를 보이지만 여전히 빈약한 플라즈마 선택도를 나타내는 이들 억제제는 알부민 중의 약물 결합 부위 및/또는 플라즈마에서 발견되는 기타 단백질 중의 유사한 부위에 우선적으로 결합할 수 있다. 이 같은 억제제는 혈장 또는 CSF와 같은 복잡한 환경에서 TTR 잘못 접힘 및 아밀로이드 생성을 방지할 것이라는 것이 불가능할 수 있다.

TTR에 결합된 화합물(1) 및 이의 3개의 유사체(26, 18 및 20)의 고해상도 X-선 공-결정 구조는 3주 이상 동안 10배 몰의 과량의 억제제에 TTR 결정을 담금으로써 수득되었다. 결정학적 전략은 표 2에 요약되어 있다.

결정학 전략

데이터 수집	TTRㆍ1	TTRㆍ18	TTRㆍ20	TTRㆍ26
해상도(Å)	35.58-1.85	42.18-1.54	64.5-1.7	51.30-1.7
일한 반영의 수	20,478	33,741	25,634	25,486
완전성(%)(전체/외피)	98.4/99.0	95.0/98.0	98.0/99.0	99.0/98.0
Rsym(전체/외피)	0.09/0.31	0.03/0.32	0.08/0.39	0.07/0.40
정제(refinement)
해상도(Å)	35.58-1.85	42.18-1.50	64.5-1.7	51.30-1.7
R-인자/R이 없음(%)	21.2/23.6	22.2/24.5	22.5/24.0	21.5/24.2
Rmsd 결합 길이(Å)	0.03	0.06	0.02	0.02
Rmsd 결합각(°)	2.3	2.7	1.9	1.9

디푸루니살(1)은 전방향 및 역방향 모드 둘 모두에서 TTR에 결합한다. TTR의 각 호르몬-결합 부위에서, 디푸루니살의 4종의 상이한 결합 형태는 각각이 대칭적으로 동일한 결합 모드를 갖는 전방향 및 역방향 결합 모드인 대략적으로 동일한 점유도(occupancy)를 갖는 것으로 밝혀졌다. 디푸루니살의 아릴 시스템은 호르몬 결합 주머니의 중심에서 떨어지도록 이동하고, TTR의 호르몬-결합 주머니에서의 전자 밀도의 "V"형 원뿔형을 형성하는 2개의 독특한 위치를 점유한다. 이러한 결합 모드는 Leu l7, Ala 108, Leu 110, Thr 119 및 Val 121에 의해 형성된 TTR의 수소성 주머니와 억제제 사이의 소수성 상호작용 및 반데르 발스()van der Waals 상호작용 둘 모두를 향상시킨다. 디푸루니살의 역방향 결합 모드는 내부 결합 주머니 내의 Thr 119의 측쇄 산소 및 Ala 108의 주쇄 산소와 카복실기 사이의 수소 결합 작용에 의해 증대된다. 놀랍게도, Ser 117은 다중 형태를 구성하지 못하거나 억제제와의 임의의 전정기적 상호작용을 형성할 수 없다. 역방향 결합 모드에서, 디푸루니살의 불소 치환체 중 하나는 Thr 119 측쇄 산소와 수소 결합 거리 이내에 있다(3.3Å). 외부 결합 주머니에서, Lys 15'의 측쇄 원자에 대한 전자 밀도는 하나 이상의 형태를 갖는 것으로 나타난 낮은 시그마 수준에서만 관측되었다. Lys 15 잔기에 대한 최고의 가능한 형태는 전방향 결합 모드에서 디푸루니살의 카복실기로부터 수소 결합 거리에서 모델링되었다.

화합물(20)은 전방향 결합 모드에서 TTR과 결합하며, 카복실레이트-치환 친수성 고리는 Lys 15 및 15'와 전정기적으로 상호 작용하는 외부 결합 주머니로 배향된다. 불소화 아릴 고리는 할로겐이 HBP 2 및 2'에 배치되는 내부 결합 주머니에 배치된다. 놀랍게도, 2개의 결합 부위의 세밀한 검토에서 바이페닐 고리의 배향에서 유의한 차이가 나타났다. 페닐 고리의 평면 사이의 각은 하나의 결합 부위에서 32.6°에서 다른 결합 부위에서 63.8°로 변한다. 이러한 관측은 TTR과의 화합물(20)의 네가티브 협주적 결합의 결과일 수 있다.

화합물(18)은 내부 주머니로 배향된 카복실레이트-치환 친수성 아릴 고리에 의해 역 방향 모드로 TTR와 결합하며, Ser 117과 Ser 117'의 수소 결합 거리 이내에 있다. 아릴 고리는 서로에 대해 34°의 각으로 회전하여 Leu 17, Ala 108, Val 121 및 Thr 119와의 소수성 상호작용을 이용한다. 불소는 할로겐 결합 주머니 1 및 1'에 배치된다. 역방향 결합 모드는 예상되지 않지만, 대신에 카복실레이트는 외부 주머니에 배치되도록 예상되어 Lys 15 및 15'와의 전정기적 상호작용을 이용하며, 불소는 할로겐 결합 주머니 2 및 2'로 분리된다. 그러나, 역방향 결합 모드는 디클로페낙(바이아릴 아민) 및 몇몇 디클로페낙 유사체에 대해 이전에 관측되었기 때문에 그렇게 놀랄만한 것은 아니다.

디푸루니살 중의 불소 대신에 염소의 치환은 TTR에 대한 화합물(26)의 결합에서 유의한 차이를 유발한다. 화합물(26)은 내부 결합 주머니로 배향된 카복실-치환 아릴 고리에 의해 역방향 결합 모드에서 TTR과 결합하며, 염소는 할로겐 결합 주머니 2 및 2'로 분리된다. 화합물(18 및 20)과 같이, 화합물(26)은 또한 호르몬-결합 주머니의 주심을 점유한다. TTR 프로모터의 잔기 Ala 108, Lys 15, Leu 17, Leu 110, Lys 17 및 Thr 119는 억제제와의 반데르발스 및 소수성 상호작용을 형성한다. 내부 결합 주머니에서, Ser 117의 측쇄는 화합물(26)의 카복실 치환기 및 다른 단량체의 Ser 117과 상호작용하기 위해 2개의 형태로 존재한다. 화합물(26)의 동일한 카복실 산소는 또한 Ser 117의 주쇄 산소와 수소 결합 상호작용을 형성한다. 화합물(26)의 기타 카복실 산소는 Ala 108의 주쇄 산소와 수소 결합을 형성한다. 디푸루니살과 대조적으로, Thr 119 잔기는 억제제와 반대 방향으로 배향하며, 이는 억제제 내의 수소 결합보다는 결합 주머니의 소수성에 기인한 것이다.

이들 억제제의 작용 기작을 추가로 입증하기 위해, 이들이 시간의 함수로서 우레아-유도 해리에 대해 TTR을 안정화시키는 능력을 측정하였다. 테트라머 해리 속도는 단량체 재접힘을 가능케 하는 농도를 초과하는 우레아 농도를 이용하여 신속하고 용이하게 모니터링된 단량체 잘못 접힘에 대해 비가역적으로 결합된다. 잘못 점힘-모니터링된 해리는 6.5M 우레아에서 적외선 CD에 의해 입증되었으며, 이는 산 중재 아밀로이드 생성의 모든 양호환 억제제는 농도 의존적으로 테트라머 해리 속도를 감소시킨다는 것을 보여준다(도 2a 및 3b). 화합물(20, 46 및 48)을 비롯한 몇몇 억제제는 아밀로이드 생성의 속도 결정 단계인 TTR 테트라머의 해리에 대한 극적인 효과를 나타낸다(예를 들어, 문헌[Hammarstrom, P.; et al.. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2002, 25, 16427-32] 참조, 이는 본원에서 전체가 참고로 인용됨).

이들 화합물에 의한 TTR 피브릴 형성의 억제 모드가 바닥 상태의 안정화을 통해 테트라머 해리 장벽을 농도 의존적으로 조절하는 것으로 의심되기 때문에, 최고의 억제제는 테트라머 해리를 최대로 감소시켜야 한다. 피브릴 형성 속도는 192시간에 걸쳐 최종 pH 4.4에서 혼탁도에 의해 모니터링되었다(도 3a, 3b, 4a 및 4b 참조). 낮은 pH에서 테트라머성 TTR을 안정화시키는 능력을 갖는 억제제는 아밀로이드로의 테트라머 해리, 잘못 접힘 및 잘못 조립을 방지할 것이다. 아밀로이드 피브릴 형성의 최고의 억제제는 테트라머 해리를 최대로 감소시키는 화합물이다(도 2a 및 도 2b). 그러나, 몇몇 억제제가 산성 조건에서보다 우레아에서보다 양호하게 결합하거나 그 반대로 결합하기 때문에 상관관계는 완벽하지 않다.

상기 억제제가 TTR(3.6μM)의 테트라머성 형태를 안정화시킨다는 것을 확실케 하기 위해, TTR의 4차 구조가 평형 및 속도 분석용 초원심분리 연구로 입증되었다. pH 4.4에서 화합물(18 및 20, 3.6μM 또는 7.2μM)에 의한 72시간의 항온 배양 이후에 상기 단백질의 4차 구조가 결정되었다. 테트라머는 평형 AUC뿐만 아니라 속도 연구에서 3.6μM 및 7.2μM 억제제 농도 둘 모두에서 우점종이었다.

등온 열량 측정법(ITC)을 이용하여 pH 8.0(25℃)에서 TTR에 대한 화합물(18 및 20)의 결합 상수를 측정하였다. 디푸루니살 및 2종의 유사체는 네가티브 협주적으로 TTR에 결합하고, 이러한 특징은 많은 다른 리간드에서도 나타난다. 제 1 부위에서의 결합은 디푸루니살 및 화합물(20)의 경우에 제 2 부위에서의 결합보다 15배 더 강하다. 바이아릴(18)은 K_d2보다 dir 120배 낮은 K_d1을 나타낸다(표 3). 표 3에는 ICT에 의해 측정된 화합물(1, 18 및 20)의 야생형 TTR에 대한 결합을 위한 제 1 및 제 2 해리 상수가 요약되어 있다(실시예 1 참조).1에 대한 결합 상수는 전에 보고되었고 비교의 목적으로 여기에서는 제공하였다.

야생형 TTR에 결합하는 화합물에 대한 해리 상수

억제제	Kd1	Kd2
1	75nM	1,100nM
18	9nM	1,100nM
20	80nM	1,300nM

테트라머 WT TTR은 42시간의 t_1/2로 해리되고, 500,000배 더 신속하게 잘못 접힌다. 따라서, 이의 해리 속도는 이를 잘못 접힘으로 연결시킴으로써 입증될 수 있으며, 잘못 접힘은 6.5M 우레아에서는 비가역적이다. 테트라머 해리가 아밀로이드 생성에서 속도 결정 단계이므로, 우수한 시험관내 활성, 및 플라즈마내의 0.50을 초과하는 결합 화학량론을 나타내는 모든 억제제는, 예상된 작동 기작, 원형 상태에 대한 선택적 결합에 의한 동력학적 안정성이 올바른 경우에 테트라머 해리를 감속시켜야 한다(도 2a 및 도 2b 참조).

TTR 테트라머 해리 속도는 6.5M 우레아에서 168시간에 걸쳐 억제제의 농도의 함수로서 측정되었다. 억제제를 선택하시오, 그러면, 특히 화합물(18, 20, 39, 41, 45, 46, 48 및 49)은 억제제가 없는 TTR에 비해 진폭 변화에서 반영된 바와 같이 160시간에 걸쳐 테트라머 해리의 정도가 전반적으로 감소함을 증명하였다. 테트라머 해리 속도는 또한 시간 경과의 기울기에서의 감소가 반영하는 바와 같이 억제제의 존재하에 극적으로 감속된다. 억제제(20, 45, 46 및 48)는, 가능하게는 상기 억제제가 우레아에서 이들의 높은 결합 친화도로 인해 TTRㆍI 및 TTRㆍI₂로부터 매우 느리게 해리되기 때문에 보다 우수하다.

TTRㆍI 및 TTRㆍI₂의 형성은 이 같은 복합체의 낮은 K_d로 인해 원형 상태을 상당히 안정화시킬 수 있고, 화합물(20, 45, 46 및 48)의 경우에 실질적으로 테트라머 해리에 대하 동력학적 장벽을 증가시킬 수 있다. 화합물(16 및 18)이 TTR과 결합할 지라도, 이들의 능력은 동력학적 안정화에 영향을 미치기에는 불충분한 것으로 보인다. 3.6μM(3.6μM 단백질)의 억제제 농도에서의 우레아 중의 억제제 효율의 순위 결정은 이고, 이는 7.2μM()의 억제제 농도와는 상이하다. 이는 가능하게는 우레아에서의 K_d2 값에서 차이를 반영한다.

원형 상태의 동력학적 안정하는 아밀로이드 경로 상 또는 상기 경로를 벗어나든지 간에 잘못 접힌 올리고머가 신경독성이라는 신생의 증거로 인해 매혹적인 치료 전략이 된다. 억제제에 의한 동력학적 안정화가 달성되면, SSA, FAP 및 FAC에 대한 비-침습성 치료를 제공할 수 있다.

주어진 억제제의 존재하에 우레아 중의 테트라머 해리 속도는 항상 억제제가 낮은 pH에서 아밀로이드 생성을 억제하는 능력을 예상하지 못한다. 아밀로이드가 인간에서 어떻게 및 어디서 형성하는지가 여전히 명확하지 않기 때문에, 다양한 변성 환경에서 잘 작용하는 TTR 테트라머 안정화제가 바람직하다. 억제제 농도의 함수로서 TTR 피브릴 형성 속도는 산성 조건하에서 실험되었다(도 3a, 도 3b, 도 4a 및 도 4b). 억제제(20, 45 및 48)는 이러한 환경에서 또한 예외적으로 잘 작용한다. 억제제(46)는 산에서보다 우레아에서보다 양호한 테트라머 안정화제인 반면, 화합물(1)은 우레아에서보다 산에서 훨씬 더 양호하다. 주어진 환경에서 TTRㆍI 및 TTRㆍI₂ 복합체의 형성과 관련된 유리 안정화 에너지는 테트라머 해리에 대한 바닥 상태의 안정화 및 활성화 유리 에너지의 관련된 증가의 정도를 결정한다. 이러한 데이터는, 억제제가 6.5M 우레아에서 TTR 테트라머 해리를 감속시키는 것보다는 낮은 pH에서 TTR 아밀로이드 생성을 더욱 효과적으로 감속시킨다는 것을 보여준다. 이는 아밀로이드 생성이 해리 이후에 농도 의존적인 재조립을 요구하기 때문일 수 있다. 더욱 효과적인 억제제는 TTR의 단량체성 아밀로이드 유기 중간체의 농도를 피브릴 형성을 불충분하게 하도록 충분히 낮은 정도로 유지할 수 있는 화합물이다. 억제제의 존재하에 TTR의 우레아 변성에서 관측된 바와 같이, 낮은 pH에서 억제제 효율의 순위 결정은 3.6μM 억제제(도 3a 및 도 3b)에서 7.2μM 억제제 농도(도 4a 및 도 4b)까지 상당히 상이하다. 이러한 관측은 가능하게는 낮은 pH에서 억제제 각각의 K_d2 값의 차이를 반영한다. 가장 극적인 예는 디푸루니살로서, 3.6μM에서 피브릴 형성의 가장 효율적인 억제제 중 하나이지만, 비교적 높은 K_d2로 인해 7.2μM에서 최소로 효율적인 억제제 중 하나이다.

디푸루니살 유사체는 TTR 아밀로이드증의 치료에 대한 유망한 부류의 화합물을 대표한다. 몇몇 디클로페낙 유사체는 피브릴 형성의 매우 양호환 억제제일지라도, 디푸루니살 유사체는 부가적인 부류의 매우 효과적인 TTR 테트라머 안정화제를 제공한다. 몇몇 디클로페낙 유사체는 해리 및 2종의 TTR 돌연변이체(즉, Val30Met 및 Leu55Pro)의 잘못 접힘으로부터 야기된 피브릴 형성을 억제하는 능력을 제공한다. X-선 공-결정 구조는 디클로페낙 유사체가 주로 역방향 결합 모드에서 결합하지만, 디푸루니살 유사체의 구조에서의 소수의 방해(perturbation)가 전방향 또는 역방향 결합을 허용한다. 또한, 디푸루니살은 전방향 또는 역방향 결합 모드에서 결합할 수 있으며, 둘 모두의 모드에서 거의 유사한 점유도를 갖는다. 디클로페낙에 대한 해리 상수(K_dl에 대한 60nM 및 K_d2에 대한 1,200nM)는 디푸루니살 및 화합물(20)에 대해 수득된 값에 필적하며, 화합물(18)은 이의 K_dl 값에 의해 예시된 바와 같이 제 1 결합 발생을 위한 보다 약 10배 더 견고한 결합을 증명한다. 또한, 둘 모두의 억제제 부류는 네가티브 협주적 결합을 나타냈다. 가장 두드러지게는, 몇몇 디푸루니살 유사체는 인간 혈장에 대해 매우 높은 선택도를 나타냈으며, 이는 독성 및 부작용의 감소 가능성을 제시한다(문헌[Oza, V.B.; et al. J. Med. Chem. 2002, 45, 321-32] 참조).

합성된 28종의 화합물은 실질적으로 TTR 아밀로이드 생성을 억제할 수 있다. 이들 중 몇몇은 인간 혈장에서 0.50당량을 초과하는 결합 화학양론을 나타냈다. 보다 양호한 억제제의 염소화 및 불소화 아릴 하위구조 둘 모두는 공지된 약물에서 발견되었으며, 따라서 이들 화합물 또는 이들의 유사체는 화합물(1)의 NSAID의 활성을 나타내지 않은 약물로 개발될 수 있다는 것을 믿는 좋은 이유가 된다. 불소화 화합물(18 및 20)은 6.5M 우레아에서 테트라머 TTR에 결합하여 안정화시킬 수 있으며, 이는 잘못 접힘 및 아밀로이드 생성, 및 TTR 테트라머의 해리의 제 1 단계를 극적으로 감속시킨다. 이들 화합물 및 기타 화합물은 또한 산-중재 TTR 아밀로이드 생성을 극적으로 감속시킨다. 시험된 상기 화합물 중 화합물(18, 20, 39, 41, 45, 46, 48 및 49)은 우레아에서 및 산성 조건하에 TTR 테트라머를 가장 잘 안정화시키도록 작용한다. 이들 아릴 화합물은 테트라머 해리와 관련된 활성화 장벽 및 바닥 상태의 안정화에 의해 아밀로이드 형성을 위한 속도 결정 단계를 증가시키는 것 같다.

실시예 3: 경구 투여된 디푸루니살은 변성(denaturation)으로부터 트란스타이레틴를 안정화한다.

트란스타이레틴(Transthyretin, TTR)은 티록신(thyroxine)과 완전레티놀(holo-retinol) 결합 단백질을 운반하는 호모테트라머 단백질이다. 변성 조건하에서, 테트라머 해리를 제한하는 속도(rate) 및 빠른 모노머 미스폴딩(misfolding)은 잘못 조립하여 아밀로이드-야기 노인성 전신성 아밀로이드증, 가족성 아밀로이드 다발신경병증(polyneuropathy), 및 가족성 아밀로이드 심근병증(cardiomyopathy)을 일으킬 수 있다. TTR 내 두 개의 점유되지 않은 티록신 결합 부위 중 적어도 하나에 결합하는 디푸루니살은 TTR 테트라머를 안정화시키는 것으로, 또한 인 비트로에서 해리 활성화 장벽(dissociation activation barrier)을 증가시키는 것으로 알려져 있다. TTR 아밀로이드증의 치료를 위해 디푸루니살을 사용하는 것의 가능성이 조사되었다.

방법

30명의 건강한 자원자들(25명 남성, 5명 여성)이 고지에 입각한 동의가 주어진 후에 참여하였다. 대상자들은 23 내지 53세(평균 나이, 37.6±8.8)이었으며, 평균 체중은 78.0±12.1 kg이었다. 각 대상자는 7일 동안 하루에 두 번(12시간 마다) 125, 250 또는 500 mg의 디푸루니살(Dolobid^®)이 투여되었다 (총 13회 투여). 혈액은 처리 하루 전에 모아졌고 디푸루니살 복용 8, 4 및 12 시간 후에 모아졌다. 이러한 연구 디자인은 the Human Subjects Committee of Scripps Clinic, Scripps Green Hospital, The Scripps Research Institute, 및 The Scripps General Clinical Research Center에 의해 승인되었다.

혈청 디푸루니살 레벨이 측정되었다. 혈청의 100 μL가 단백질을 침전시키기 위하여 900 μL의 아세토니트릴에 첨가되었다. 원심분리 후에, 100 μL의 상등액이 100 mM 트리에틸아민 수용액, pH 11.5 900 μL에 첨가되었다. 여과 후에, 100 μL의 각 샘플이 10분에 걸쳐 40-100% 경사(gradient)의 용액 B (용액 A: 94.8% 물 / 5% 아세토니트릴/ 0.2% 트리플루오로아세틱 산; 용액 B: 94.8% 아세토니트릴 / 5% 물 / 0.2% 트리플루오로아세틱 산)를 사용하는 Keystone 3-cm C18 역상 컬럼에 주입되었고 Waters 600E multisolvent delivery system에 의해 조절되었다. 검출은 Waters 486 tunable absorbance detector로 280 nm에서 수행되었고, 피크들은 표준 커브로부터 디푸루니살의 농도를 얻기 위하여 적분(integration) 되었다.

인간 혈청 내에서 TTR에 결합하는 디푸루니살의 화학량(Stoichiometry)이 분석되었다. 세파로스(Sepharose)의 1:1 겔 / 10 mM Tris·HCl, pH 8.0 / 140 mM NaCl / 0.025% NaN₃ (TSA) 슬러리(62.5 μL)가 500 μL의 혈청에 첨가되었고 1시간 동안 4℃에서 배양되었다. 원심분리 후에, 400 μL의 상등액이 200 μL의 항-TTR 항체-결합(anti-TTR antibody-conjugated) 세파로스의 1:1 겔 / TSA 슬러리에 첨가되었고 20분 동안 4℃에서 천천히 흔들어졌다. 원심분리 후에, 겔은 1 mL TSA / 0.05% 사포닌 (Fisher Scientific) (2회, 1회 10분)으로 세척되었고, 추가로 4℃에서 1 mL의 TSA(1회, 10분)으로 세척되었다. 그 후, 155 μL의 100 mM 트리에틸아민 수용액, pH 11.5이 TTR을 용출하기 위하여 첨가되었고, 항체로부터 디푸루니살과 결합하였다. 30분 동안 4℃에서 가볍게 흔들어준 후에, 샘플은 원심분리되었고 145 μL의 상등액은 제거되었다. 135 μL 샘플 주사(injection)가 분리되었고 전에 설명한 방법(Purkey et al., Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98: 5566-71)으로 분석되었다.

요소(urea) 변성에 대한 혈청 TTR 테트라머 안정성이 평가되었다. 10 μL의 혈청 샘플이(25℃) 50 mM 인산 완충액(pH 7.0; 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) 내 90 μL의 다양한 농도의 요소 내에서 배양되었다. 요소 용액은 중량에 의해 제조된 농도를 검증하기 위하여 굴절률(refractive index)에 의해 확인되었다. 단백질의 글루타르알데히드(Glutaraldehyde) 교차-결합(cross-linking)이 10 μL의 글루타르알데히드(25%)를 첨가하여 수행되었다. 교차-결합 반응은 그것이 10 μL의 NaBH₄₍0.1 M NaOH 내 7%)를 첨가하여 중단되기 전에 4분 동안 이루어졌다. 샘플은 겔 로딩 칵테일(gel loading cocktail, 최종 SDS 농도 = 2.5%)을 감소시키는 120 μL의 SDS와 혼합되었고 5분 동안 끓여졌다. 샘플은 12% SDS-PAGE를 사용하여 분리되었고 겔은 항-TTR 항혈청(Purkey et al., 상동)을 사용하는 면역블롯팅으로 분석되었다.

산 변성에 대한 혈청 TTR 테트라머 안정성이 조사되었다. 10 μL의 샘플이 (37℃) 90 μL의 100 mM 산성화(acidification) 완충액 내에서 배양되었다. 시트레이트 완충액이 최종 pH가 3.8 이하가 바람직할 때 사용되었고; 아세테이트 완충액은 평가 하 pH 범위가 4.2-5.4일 때 적용되었다. 교차-결합 후에, 샘플은 위에서 설명된 바와 같이 SDS-PAGE 및 면역블롯팅으로 분석되었다.

재조합 WT TTR 및 변이체(variant)가 TTR과 암피실린-저항성 유전자를 포함하는 pmmHα 플라스미드로 형질전환된 BL21/DE3 Epicurian gold Escherichia coli (Stratagene)에서 발현되었다. 발현 및 정제는 전에 설명된 방법(Lashuel etal., Biochemistry 1999; 38: 13560-73)에 따라 수행되었다.

TTR 테트라머 해리 속도는 원형 2색성 분광법(circular dichroism spectroscopy)으로 측정되었다. 테트라머 해리 속도의 평가는 6.5 M 요소 내 재조합 TTR(3.6 μM) 샘플, 제3차(tertiary) 구조 변화에 대한 전이-후 지역 내 농도(Hammarstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99: 16427-32)를 사용하여 수행되었다. 시간의 함수로써 TTR의 먼(far)-UV CD 스펙트라(210-220 nm)가 그것을 빠른 제3차 구조 변화와 연결함으로써 느린 테트라머 해리 속도를 평가하기 위하여 사용되었다.

소섬유(fibril) 형성 분석이 다음과 같이 수행되었다. 재조합 TTR 모액(stock solution)(7.2 μM)이 100 mM 산성화 완충액으로 1:1로 희석되었다. 시트레이트 완충액이 최종 pH가 3.8 이하가 바람직할 대 사용되었고; 아세테이트 완충액이 평가 하 pH 범위가 4.2-6.0일 때 적용되었고, 인상 완충액은 pH 6.5에서 아밀로이드형성(amyloidogenesis)을 평가하기 위하여 사용되었다. 샘플은 산성화 후에 교반없이 72시간 동안 37℃에서 배양되었다. 소섬유 형성의 정도는 400 nm에서 혼탁도 측정으로 조사되었다.

소섬유 형성 키네틱(kinetics)은 다음과 같이 측정되었다. 재조합 TTR 용액(7.2 μM)이 동량 부피의 100 mM 아세테이트 완충액과 혼합되어 최종 pH 4.4를 형성하였다. 샘플은 37℃에서 배양되었고 400 nm에서의 혼탁도가 168시간이 경과하는 동안 모니터링되었다. 분리된 샘플은 각 시점에서 보충되었다.

요소-매개 테트라머 해리 및 pH-매개 소섬유 형성에 대한 디푸루니살의 영향은 단백질에 요소 변성 또는 pH-매개 아밀로이드증을 일으키기 전에 TTR 용액에 디푸루니살을 첨가하고 3시간 동안(37℃)에서 배양하여 평가되었다.

결과

13번째 투여량 복용 4 및 12시간 후에 HPLC에 의해 측정된 평균 혈청 디푸루니살 농도는 125 mg 하루 2회 투여 그룹에서 20.1±7.1 및 6.9±3.0 μM, 250 mg 하루 2회 투여 그룹에서 233.5±76.0 및 145.8±38.9 μM, 및 500 mg 하루 2회 투여 그룹에서 517.0±79.5 및 421.9±78.1 μM이었다. 디푸루니살의 99% 이상이 단백 결합을 한다. 250 mg 하루 2회 투여 및 500 mg 하루 2회 투여 그룹에서 관측된 이러한 농도는 혈청 내 TTR 농도(3.6 - 7.2 μM)와 비교하여 매우 높은 것이고 소 분자(small molecules)에 대하여 여러 결합 부위를 가지나 높은 친화도는 아닌 TBG(0.3 - 0.5 μM) 및/또는 알부민(580 - 725 μM)과 같은 경쟁자 단백질에 결합한다면 최대 2에 접근하는 디푸루니살 결합 화학량(stoichiometry)을 산출할 것이다.

디푸루니살은 바람직하게는 혈액 내에서 최대 키네틱 안정화를 이루기 위해서는 적어도 1 및 이상적으로는 2의 화학량으로 테트라머형 TTR과 결합한다. 각 대상자에서 디푸루니살 화학량에 대한 더 낮은 한계를 놓기 위하여, 우리는 전에 설명된 것과 같이 고체상 레진에 결합한 폴리클로날 항체를 가지고 혈청으로부터 트란스타이레틴을 면역침전시켰다 (Purkey et al., 상동). 비-특이 결합을 제거하기 위하여 고정화된 TTR을 3X 세척한 후에, TTR-디푸루니살 복합체는 레진으로부터 해리되었고 디푸루니살 화학량은 표준 커브를 적용한 HPLC에 의해 측정되었다. 복용 4 및 12시간 후에 혈청 내 TTR에 결합한 디푸루니살의 화학량은 125 mg 하루 2회 투여 그룹에서 0.45±0.11 및 0.31±0.12 μM, 250 mg 하루 2회 투여 그룹에서 1.12±0.08 및 0.95±0.13 μM, 및 500 mg 하루 2회 투여 그룹에서 1.51±0.09 및 1.48±0.08 μM이었다. 그것의 혈청 농도와 같이 디푸루니살 화학량은 최대 약 300 μM까지 증가하였다. 300 μM의 혈청 농도에서 기대된 최대 1.5의 화학량보다 적은 것은 방법 (세척-관련 손실) 및/또는 디푸루니살의 다른 플라즈마 단백질 결합의 한계로부터 발생하므로, 우리는 재조합 TTR를 이용하여 디푸루니살 결합 화학량(stoichiometry) 연구를 수행하였다. 세척-관련 손실은 낮은 친화도 부위로부터의 해리에 주로 기인하므로 최대 1.5의 결합 화학량을 설명한다. 디푸루니살은 네거티브적인 공동작용으로 TTR에 결합하고, 이 때문에 낮은 친화도 부위로부터의 해리는 극적으로 더 빠르다. 완충액 내 예상 결합 화학량은 isothermal titration calorimetry에 의해 측정된 해리 상수(dissociation constants) (K_dl, 75 nM; K_d2, 1.1 μM)에 기초하여 계산되었다. 계산된 및 실험에 의해 측정된 화학량(stoichiometry)을 같이 플럿팅하면, 후자는 면역침전 (3번 세척) 및 HPLC 분석에서 얻음, 250 mg bid에서 1.75 - 1.91의 진짜 화학량을 측정할 수 있고, 이것은 이러한 투여량이 이용될 수 있었다는 것을 제안한다.

재조합 TTR(1.5)과 개체들(0.8-1) 사이의 디푸루니살(100 μM) 결합 화학량의 비교는 TTR 이외의 중요한 혈청 단백 결합을 나타내고, 더 선택적으로 TTR에 결합하는 디푸루니살 아나로그를 개발하는 동기를 제공한다. 모든 그룹에 있어 디푸루니살의 투여 후에 TTR의 혈청 레벨은 증가하였고 총 T₄ 및 RBP의 혈청 레벨은 감소하였다. 이러한 발견은 디푸루니살이 TTR 대사를 증가시킨다는 것을 제안한다. 연구 동안 또는 후에 어떠한 명백한 부작용은 관측되지 않았다. 그러나, 500 mg bid 그룹에서 알부민의 혈청 레벨은 유의하게 감소하였고 BUN 및 크레아티닌의 혈청 레벨은 소량 증가하였다. 250 mg bid 그룹에서, 알부민의 혈청 레벨은 중간정도로 감소하였고 BUN의 레벨은 소량 증가하였다.

경구 투여된 디푸루니살이 아밀로이드증을 포함하는 변성 스트레스로부터 혈청 TTR을 안정화시키는지를 파악할 수 있는 새로운 방법이 개발되었다. 이러한 방법은 TTR 미스폴딩 질환을 예방하는 화합물을 식별하기 위한 대용 마커(surrogate marker)로 작용한다. 대상자로부터 얻은 전체 혈청은 요소(0 - 9 M) 또는 산(pH 3.8 - 5.4)을 첨가함으로써 변성되어 졌다. TTR은 변성하기 위해서는 해리하여야 하기 때문에, 4차원적 구조 변화가 언폴딩(unfolding)의 정도를 모니터하기 위하여 사용되어 질 수 있다(Hammarstrom et al, 상동). 글루타르알데히드는 변성 스트레스 적용 후에 혈청에서 모든 단백질을 교차결합시키고 TTR의 어느 정도가 정상적으로 폴딩되었는지(테트라머 또는 다이머) 아니면 변성되었는지(모노머) 확인하기 위하여 첨가되었다. 전체 혈청의 SDS-PAGE는 교차결합된 TTR 테트라머 및 다이머(폴딩된 TTR을 나타내는 것들)를 모노머로부터 분리한다. 면역블롯팅은 폴딩된 TTR의 정량적 비교가 가능하다. 폴리클로날 항체는 폴딩된 TTR과 마찬가지로 폴딩되지 않은 TTR에 거의 결합하지 않으므로, 그것은 디푸루니살의 부재 및 존재하에서 테트라머 및 다이머 밴드의 강도를 비교하는데 가장 유용하다. TTR 변성에 대한 디푸루니살 억제의 시간 의존도 또한 이러한 방법으로 평가될 수 있다. 디푸루니살의 존재하에서 이러한 절차의 거의 발견할 수 없는 시간 의존성은 키네틱 안정화 기전(실시예 1 참조)을 강하게 암시하고, 여기에서 디푸루니살에 의한 기저 상태 안정화(ground state stabilization)는 테트라머 해리 장벽을 이겨낼 수 없게 만든다. 측정된 화학량(0.8 - 1.2)보다 양호한 이러한 변성 시간 경과 내 디푸루니살(250 mg bid)의 효능은 면역침전 방법은 실제 결합 화학량을, 특히 그것이 1을 초과할 때, 과소평가한다는 중요한 증거를 제공한다.

인간 내 디푸루니살 결합 화학량의 범위 및 시험관 내에서 그러한 화학량을 흉내 내기 위해 필요한 디푸루니살의 농도를 아는 것은 TTR·디푸루니살 및 TTR·디푸루니살₂ 복합체가 해리 및 아밀로이드증을 예방하는 기전을 증명하는 관련된 인 비트로 생물 물리학적 연구를 수행할 수 있게 한다. 요소-매개 (6.5 M) 해리 속도 및 산 매개 (pH 4.4) 아밀로이드 소 섬유 형성 속도는 디푸루니살 농도 (5, 10, 20 및 60 μM) 함수로 연구되어왔고, 용량 의존적 느려짐을 나타내었다. 테트라머 해리는 아밀로이드 소섬유 형성의 율속 단계이기 때문에, 그것은 요소 내 테트라머 해리 속도는 산성화에 의해 매개되는 아밀로이드 소섬유 형성의 정도를 예측한다고 할 수 있다. 농도 의존적 재집합(reassembly) 또한 아밀로이드증에서 요구되기 때문에 디푸루니살은 요소 매개 해리를 억제하는 것보다 아밀로이드증을 억제하는데 더 낳다. 디푸루니살과 TTR의 결합과 관련된 K_dl 및 K_d2는 요소 내보다 산 내에서 더 낮다는 것 또한 가능하다.

80 이상 TTR 돌연변이는 변성 에너지 랜드스케이프(landscape)의 순서 의존적 변형(sequence dependent alteration)에 의하여 개인들이 유전적 아밀로이드증에 걸기게 쉽게 한다. 이러한 것 중, V122I의 아밀로이드 침착(deposition)은 가족성 아밀로이드 심근병증(FAC)을 3 - 4%의 아프리카계 미국인에서 초래하고, 반면에 V30M은 주된 가족성 아밀로이드 다발신경병증 (FAP) 돌연변이이다. 디푸루니살은 투여량 의존적으로 V1221 및 V30M 아밀로이드생성 모두를 억제하고, 이것은 이러한 접근의 일반성을 보여준다.

TTR 아밀로이드증을 감소시키기 위한 일반적, 비-침습적 치료 전략을 개발하는 것은 매우 바람직하다. 본 명세서에서 제시된 결과는 디푸루니살의 경구 투여가 비-아밀로이드성 천연 상태에 결합하고 안정화함으로써 테트라머 해리를 늦출 수 있다는 것을 보여준다. 천연 상태 안정화는 아밀로이드 소섬유가 아닌 미스폴딩된 올리고머가 신경퇴행을 야기한다는 최근의 보고를 고려할 때 특히 매력적인 전략이다. 류마티스성 관절염 및 골관절염에의 디푸루니살의 임상적 사용(250 - 500 mg bid)은 장기 사용 시 그것의 낮은 독성을 나타낸다. TTR의 혈청 반감기는 12 - 15 h이므로, 하루 두 번 투여가 디푸루니살의 8 - 10 h 반감기를 고려할 때 최적으로 생각된다. 디푸루니살은 그렇지 않다면 질병-관련 서브유닛으로 구성될 TTR 테트라머 내로 트랜스-억제자(trans-suppressor) 서브유닛을 포함시키는 것에 의해 이용되는 기전과 유사한 키네틱(kinetic) 안정화를 부여하면서 WT 및 TTR 변이체에 결합하기 때문에 SSA, FAC 및 FAP에 대해서도 효과적이고, 이것은 인간 질병을 감소시키는 것으로 알려져 있다. 디푸루니살은 그것이 혈액-뇌 관문을 통과할 수 없기 때문에 CNS 아밀로이드증에 덜 효과적일 수 있으나, 디푸루니살 아나로그(예를 들어, 본 명세서에서 설명된 아나로그)는 그러한 능력을 가질 수 있다.

실시예 4: 수산기를 가진 다염화 바이페닐(Polychlorinated Biphenyl)은 혈액 내에서 선택적으로 트란스타이레틴과 결합하고 아밀로이드생성을 억제한다.

다염화 바이페닐(PCB)은 설치류에 독성이 있고 인간에게도 독성이 있을 수 있는 것으로 보고된 알려진 저항성 환경 오염물질이다. 환경 내 이러한 화합물의 수명은 그들의 낮은 분해 및 높은 지질친화성 때문이고, 이것은 그들이 먹이 사실을 따라 위로 이동하면서 생체축적되고 농축되게 한다. 수산기를 가진 PCB(OH-PCB)는 P450 모노옥시게나제에 의해 PCB가 산화되 형성된 대사체이다. 개별적 PCB 화합물의 인간 독성에 대한 명확한 데이터는 상업적으로 이용가능한 PCB가 일반적으로 여러 가지 다른 이성체를 포함하는 혼합물이고 알려진 독성물질의, 예를 들어 염화 디벤조퓨란, 흔적 량(trace amount) 때문에 발견하기 어렵다. 그러나, 몇몇 정제된 PCB의 독성은 실험 동물에서 보여졌다. OH-PCB의 에스트로겐형성(estrogenicity) 이외에 뼈 손실, 면역 독성, 신경독성 및 낮아진 타이로이드 호르몬 레벨이 이러한 화합물의 투여와 관련이 있다.

많은 연구들은 PCB 및 OH-PCB들이 인 비트로에서 트란스타이레틴(TTR)에 결합한다는 것을 보여주었다. 그것은 TTR이 노출된 개인에 있어 OH-PCB 저항에 기여하는 인간 혈액 내 단백질 타깃이라는 것이 제안되어 왔다. 많은 보고서들이 TTR을 PCB 인 비보 결합 단백질로 보고하였지만, PCB가 혈장 내에서 트란스타이레틴과 결합한다는 명백한 증거는 없다. 우리는 생물의 액에서 TTR에 결합하는 소 분자의 결합 화학량에 대한 낮은 한계를 알아보기 위하여 사용될 수 있는 면역침강 방법을 개발하였다. 인간 혈장 TTR에 대한 PCB 및 OH-PCB들의 TTR 결합 화학량이 본 명세서에서 평가되었다.

속도 제한 테트라머 해리, 모노머 미스폴딩 및 미스어셈블리를 필요로 하는 혈장 TTR의 분히-후 아밀로이드생성은 추정적으로 노인성 전신성 아밀로이드증, 가족성 아밀로이드 심근병증 및 가족성 아밀로이드 다발신경병증을 야기한다. 본 명세서에서, 몇몇 OH-PCB들은 인간 혈장 내 TTR에 선택적으로 결합하고 테트라머 안정화를 통하여 아밀로이드 소섬유 형성을 억제하여 부분적 또는 완전하게 천연 상태의 키네틱 안정화를 이끄는 것으로 나타났다. 네 가지 대표적 TTR·(OH-PCB)₂ 복합체는 결합에 대한 분자 기초를 좀더 자세히 이해하기 위하여 x-레이 결정학에 의해 분석되었고 최적화된 TTR 아밀로이드생성 억제제의 설계를 위한 기초를 제공한다.

인간 혈장 내 트란스타이레틴에 대한 PCB 및 OH-PCB들의 결합 선택성

50 nM 보다 적은 IC₅₀을 가지며 TTR로부터 타이로이드 호르몬을 치환하는 것으로 보도괸 8개 PCB (화합물 1-8, 도 5) 및 생쥐 또는 쥐에서 TTR에 결합하거나 티록신 레벨을 낮추는 것으로 보고된 알려진 PCB 대사체인 14개의 OH-PCB(화합물 9-22, 도 6)들의 결합 선택성이 평가되었다. 혈장 내 TTR과 결합하는 PCB의 결합 화학량에 대한 낮은 한계는 PCB 또는 OH-PCB(10.8 μM)로 미리 처리된 인간 혈장과 혼합된 세파로스 레진에 공유결합된 폴리클로날 TTR 항체를 사용하여 측정되었다. 세척 후에, TTR(약 5 μM)에 대한 PCB 또는 OH-PCB 결합 화학량은 역상 HPLC로 평가되었다.

최대 두 개의 PCB가 TTR 테트라머 내 두 개의 동일한 타이로이드 호르몬 결합 부위에 결합할 수 있다. PCB 1 & 3을 제외하고, 남은 비-수산화된(non-hydroxylated) PCB들은 혈장 TTR에 대하여 다소 낮은 결합 선택성을 나타내었다 (표 4). 대조적으로, OH-PCB들은 혈장 TTR에 대하여 탁월한 결합 선택성을 보여주었다 (표 5). 몇몇 수산화된 PCB들(예를 들어, 16 및 22)는 2의 결합 화학량에 접근한다. 전체 혈액에 있어 OH-PCB의 결합 선택성은 혈장에서 관측된 것과 매우 유사하고, 때문에 적혈구 막은 연구된 OH-PCB들을 유의적으로 격리하지 않는다.
인간 혈장 내 TTR과 PCB의 결합 화학량(Binding Stoichiometry)

화합물	결합 당량(Equivalents Bound)
3	1.50±0.42
1	0.62±0.12
6	0.19±0.11
2	0.18±0.03
5	0.06±0.04
4	0.05±0.04
7	비 결합
8	비 결합

인간 혈장 내 TTR과 수산화된 PCB의 결합 화학량

화합물	결합 당량 (혈장)	결합 당량 (혈액)
16	1.86±0.14	ND
22	1.67±0.40	1.69
17	1.63±0.05	ND
19	1.48±0.16	1.55
21	1.40±0.22	1.33
18	1.36±0.21	ND
12	1.23±0.24	1.47
11	1.12±0.22	1.20
20	1.02±0.09	0.86
10	0.96±0.09	0.93
13	0.84±0.24	0.86
9	0.83±0.19	0.57
14	0.81±0.29	0.73
15	0.70±0.17	0.56

TTR·PCB 복합체의 항체 포획은 5 세척 단계 동안 TTR로부터의 PCB 해리 때문에 PCB 결합 화학량을 과소평가할 가능성을 가진다. PCB 및 OH-PCB(10.8 μM)는 각 세척 단계 후에 고정화된 TTR에 결합한 소 분자의 화학략을 평가하기 위하여 재조합 TTR(3.6 μM)와 함께 배양되었다. 화학량은 5 세척 후에 PCB 2 및 OH-PCB 18에 대하여 10-17% 감소한 반면, PCB 4의 그것은 45% 감소하였다. 세척-관련 손실의 정량화는 우리가 혈장 내에서 PCB 및 OH-PCB의 진정한 결합 화학량을 측정할 수 있게 한다. 게다가, 재조합 TTR에 결합하는 OH-PCB의 최종 화학량과 혈장 내 TTR에 결합하는 양과의 좋은 상관성은 상기 화합물이 혈장 내에서 더 선택적인 TTR 결합물질이라는 것을 보여준다, 예를 들어, OH-PCB 18. 대조적으로, PCB 2 및 4는 혈장보다 완충액 내에서 TTR에 대한 너 높은 결합 화학량을 나타내며, 이것은 그들이 혈장 내 TTR 뿐만 아니라 경쟁 단백질에도 결합한다는 것을 강하게 제안한다.

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수산화된(Hydroxylated) PCB에 의한 TTR 아밀로이드 소섬유 억제

인 비트로에서 TTR 소섬유 형성을 억제하는 OH-PCB 및 PCB 3의 능력이 이러한 화합물은 혈액 내에서 TTR에 대한 좋은 결합 선택성을 나타내기 때문에 조사되었다. 간으로부터 혈액으로 분비된 TTR은 전신성 TTR 아밀로이드의 소스인 것으로 보인다. 아밀로이드가 인간 내에서 어떻게 또는 어디서 형성되는지 아직 명확하지 않지만, 세포 내 전형적인 변성제는 산이며, 이것은 아밀로이드형성 펩타이드 및 단백질을 아밀로이드 및/또는 관련 응집체로 전환시키는데 효과적이다. 이 때문에, 혼탁도에 의해 모니터링 되는 산-매개 (pH 4.4) 소섬유 형성은 억제제로서 PCB의 효율을 모니터하기 위해 적용되었다. 수산화된 PCB 및 PCB 3은 TTR 소섬유 억제제로서 매우 효능이 있다. WT TTR 농도(3.6 μM)와 동리한 농도의 억제제에서, 소섬유 형성의 정상적 양의 단지 12-50%만이 72 시간 배양기간 후에 관측되었다. 이러한 활성은 양성 대조군으로 포함된 flufenamic acid(Flu)와 같은 최근 개발된 가장 좋은 소섬유 억제제에 의해 나타나는 그것과 동일한 것이다.

TTR과 OH-PCB 18의 결합

전의 질량 분광 실험은 OH-PCB 18이 TTR의 두 가지 C₂ 관련 타이로이드 호르몬 결합 부위에 포지티브 결합 협력성(cooperativity)을 나타낸다는 것을 보여주었다. 18의 화학량론적 (< 1:1) 양이 TTR에 첨가될 때, 질량 분광기에서 관측된 우세한 종은 apo-TTR 및 TTR·18₂ 복합체이고, 이는 포지티브 협력성 결합과 일치한다. 18의 TTR 결합 특성은 네가티브 협력성과 결합된 수 많은 다른 TTR 아밀로이드 소섬유 억제제에 의해 나타나는 것과 대조적이다. 생리적 조건하에서 수행된 등온 적정 열량측정법 연구는 WT TTR과 OH-PCB 18의 결합은 해리 상수들이 동일한 K_ds (3.2±1.8 nM)인 모델과 가장 잘 맞는다. 이러한 결과는 포지티브 협력 결합을 부정하는 것은 아니며, 이는 방출된 불충분한 열 때문에 포지티브 협력성을 조사하는 TTR의 낮은 충분한 농도를 달성할 수 없기 때문이다. 포지티브 또는 네거티브 협력 결합(cooperative binding)의 모델에 정정된 데이터를 맞추려는 시도는 나쁜 적합성을 나타내었다.

OH-PCB 12, 16, 17 및 18의 공-결정(Co-Crystal) 구조

WT TTR에 결합한 OH-PCB 12, 16, 17 및 18의 결정이 TTR 결정을 10-배 과량의 억제제에 4주 동안 담가 얻어졌다. 그 후 X-ray 구조가 각 복합체들에 대하여 측정되었다. 결정학상 비대칭 유닛 내의 TTR 다이머는 두 개 리간드-결합 포켓의 반을 형성한다. 양 결합 부위는 동일한 2배 대칭축에 의해 2등분 되기 때문에, 억제제들의 두 가지 대칭 동일한 결합 모드(mode)가 전형적으로 관측되었다. 각 TTR 결합 부위는 내부 및 외부 구멍들로 세분될 수 있다. 이러한 구멍들은 그들이 티록신의 두 가지 방향족 링에 위치한 요오드에 의해 점유될 수 있기 때문에 소위 세 가지 할로겐 결합 포켓(HBP)을 포함한다. HBP 3 및 3'는 내부 결합 구멍 내 깊숙히 위치하고, HBP 2 및 2'는 내부 및 외부 결합 구멍의 경계를 이루는 반면 HBP 1 및 1'은 외부 결합 구멍의 말단 근처에 위치한다. 공-결정 구조는 OH-PCB의 두 개의 방향족 링을 연결하는 C-C 결합이 거의 2배 대칭축 상의 중심에 위치한다는 것을 나타내며, 단일 결합 형태(conformation)의 모습을 나타낸다. 2개의 페닐 링 사이의 이면각(dihedral angle)은 12에 대해서는 59°, 16 및 17에 대해서는 37°, 및 18에 대해서는 44°였다. 모든 OH-PCB들인 내부 및 외부 결합 포켓에 있어 동일한 위치를 점유하였다. 바이아릴(biaryl) 링 시스템의 van der waals 상보성(complimentarity)이 하나의 서브유닛 내 잔류물(residue) X, Y 및 Z 및 각 결합 부위를 구성하는 다른 서브유닛 내 잔류물 n', m', 및 o'을 포함하는 몇몇 내부-서브유닛 상호작용을 촉진한다. 페닐 링 상의 몇몇 치환체는 축에서 벗어나고 (off-axis) 관측된 전자 밀도 내 다중 위치(multiple position) 내에 설계될 수 있다.

TTR에 결합한 OH-PCB 18

TTR·18₂ 복합체의 1.8 Å X-ray 구조는 억제제가 TTR 결합 부위와 우수한 입체 상보성(complementarity)을 가진다는 것을 나타낸다. 분자 역학(Insight Ⅱ, Accelrys)은 18의 미결합 배좌(conformation)가 그것의 결합된 구조 근처라는 것을 나타낸다. 세밀히 구별된 구조는 18의 고 친화성 결합에 기여하는 직접적 및 물-매개 정전기 상호작용을 보여준다. 3-Cl, 4-OH, 5-C1 동일하게 치환된 방향족 링 중 하나가 내부 결합 포켓을 점유하고, 그것의 염소 치환체는 HBP 3 및 3' 내로 튀어나온다. Serl17 및 Thrl19의 사이드 체인은 치우치지 않은 전자 밀도 지도(unbiased electron density map)에 의해 분별 되는 것처럼 Cα-Cβ 결합에 대한 회전에 의해 대안적 배좌(conformation)를 채택한다. Serl17의 사이드 체인은 전자 밀도의 분포에 의해 식별되는 것처럼 모든 세 가지 로토머(rotomer) 배좌를 채택한다. 흥미롭게도, 두 개의 물 분자는 50% 점유도를 가지고 2-배 축(two-fold axis)에 인접한 Ser117 잔류물들 사이 내에 위치하며, 이것은 Ser117 잔류물, 인접한 물 분자 및 18의 페놀 기능성기(functionality)를 연결하는 수소 결합의 네트워크를 촉진한다. 왜 18이 비- 또는 포지티브 협력 양상으로 결합하는지는 구조 관찰로부터는 명백하지 않다. 다른 동일하게 치환된 링은 HBP 1 및 1' 내로 튀어나온 그것을 할로겐으로 외부 TTR 결합 포켓을 점유한다.

TTR에 결합한 화합물 16

16의 3-C1, 4-OH, 5-C1 세 개-치환된 페놀릭 링은 TTR와 동일한 정전기적 및 소수성 상호작용을 만들며 TTR의 내부 결합 부위 내로 향해 있고 이 링은 위에서 설명된 TTR·18₂ 구조 내에 있다. 3,4-염소화된 방향족 링은 외부 결합 포켓을 점유하고, 할로겐은 그것의 대칭적 균등 결합 모드에 따라 HBP-1 또는 1' 내로 향해 있다고 생각되고 있다. OH-PCB 18의 그것과 같이 16의 전자 밀도는 대칭적이고 따라서 전자 밀도 지도에 기초하여 파라 OH 및 파라 Cl을 모호하지 않게 위치 잡는 것은 가능하지 않다. 편중되지 않은 전자 밀도 지도는 Ser117의 세 가지 로토머 배좌(conformation)와 일치하고 TTR·18₂ 구조와 유사하게 Ser117 잔류물 사이 내에 두 개의 물 분자를 함유한다.

TTR에 결합한 OH-PCB 17

억제제 17은 이러한 링인 위에서 설명된 TTR·16₂ 및 TTR·18₂ 구조 내에서 사용하는 동일한 상호작용을 사용하여 내부 결합 포켓 내로 향해 있는 그것의 3-Cl, 4-OH, 5-C1 치환된 아릴 링과 결합한다. 2, 3, 4-트리-염화된 링은 두 가지 대칭 균등 결합 모드 내 HBP-1, HBP-1', HBP-2, HBP-2'와 상호작용으르 사용하여 외부 결합 포켓을 점유한다. Ser117 및 두 가지 보존된 물 분자들의 다중 배좌는 또한 TTR·17₂ 구조의 특징이다. Thr119 사이드 체인의 배좌 변화는 편중되지 않은 전자 밀도 지도로부터 명백하다.

TTR에 결합한 화합물 12

바이아릴 12는 그것의 3-C1, 4-OH 치환된 아릴 링을 외부 결합 포켓에 위치시키고, 그것의 두 개의 염소는 HBP-1 및 1'와 상호작용한다. TTR·16₂ 및 TTR·17₂ 구조와 대조적으로 여기에서 페놀은 내부 결합 포켓에 위치한다. 하이드록실 그룹(아마 이온형)은 Lys15 사이드 체인의 수소 결합 거리 이내에 위치한다. 테트라-염화 링은 내부 결합 포켓에 위치하고 여가에서 할로겐은 HBP 3 및 3' 뿐만 아니라 HBP 2 및 2' 내로 향해 있다. Ser117 및 Thr119 사이드 체인은 16, 17 및 18 위치와 달리 apo-TTR 구조에서 발견되는 것들과 동일한 배좌를 채택한다.

본 명세서에서, 50 nM 보다 적은 IC₅₀을 가지고 T4를 대체시키는 것으로 전에 보고되었던 8개 PCB들 중에서 단지 1 및 3이 인간 혈장 내에서 평가가능한 화학량으로 TTR과 결합하는 것으로 나타났다. 대조적으로, 전에 TTR에 결합하는 것으로 보고된 모든 14개의 OH-PCB들은 혈장 내에서 TTR에 유의적인 결합 선택성을 나타내었다. 이것은 OH-PCB가 혈장 내에서 주로 관측되고 거기에서 선택적으로 보류되는 것으로 나타난다는 관측과 일치하며, PCB가 전형적으로 축적되는 지질 및 다른 조직 내 유치(retention)와는 상반되는 것이다. OH-PCB는 또한 그들이 지질막 내로 분배되지 않는다는 아이디어와 일치하게 전체 혈액 내에서 TTR과 선택적으로 결합한다.

세척 단계 동안 항체·TTR·PCB 복합체의 씻겨 없어지는 PCB(또는 OH-PCB)의 양이 재조합 WT TTR을 사용하여 평가되었다. 세척-관련 PCB 해리의 정도는 분자 특이적이다. 몇몇 화합물들은 세척 후에도 매우 높은 결합 화학량을 나타내었고, 이것은 유의적인 초기 결합 및 낮은 세척-관련 손실과 일치하고 느린 해리 속도를 암시한다. 낮은 결합 화학량을 나타내는 화합물들은 적어도 두 개의 카테고리로 분류된다: 유의적 세척-관련 손실을 가진 높은 초기 결합 화학량 또는 유의적 세척-관련 손실이 없는 낮은 초기 결합 화학량, 후자 시나리오는 TTR에 높은 친화성을 갖고 결합하는 화합물에 적용가능하지만, 다른 혈장 단백질(들)에 높은 친화도를 가질 수 있다. PCB 2 및 4 두 가지는 재조합 TTR에 낮은 세척-후 결합 화학량을 나타낸다. PCB 4의 45%가 세척 때문에 손실된 반면 PCB 2는 단지 세척-관련 손실(10%)이 적은 나쁜 초기 결합 화학량을 나타낸다. 세척-후 선택성 값은 혈장 내 초기 결합한 PCB의 양의 낮은 한계를 반영한다. 높은 세척-후 결합 화학량으로 특징져지는 PCB 18과 같은 화합물들은 높은 결합 친화성 및 선택성을 틀림없이 갖고 있으며 관측된 느린 제거 속도와 일치한다.

혈장 TTR에 대한 그들의 높은 결합 선택성에 더하여, OH-PCB들 및 PCB 3은 또한 인 비트로에서 TTR 소섬유 형성에 대한 탁월한 억제를 나타내었다. 억제제 14, 15, 및 18의 효능은 동일몰(equimolar)의 억제제 및 TTR 농도(3.6 μM)로 최근에 관측된 것들 중에서 가장 높은 것들이다. 이것은 그들의 높은 결합 친화도(또한 그들의 낮은 제거 속도와 일치함) 및 일반적이지 않은 그들의 비- 또는 포지티브 협력 TTR 결합 성질에 기인하는 것이다. 가장 탁월한 억제제인 OH-PCB 18에 의해 나타나는 nM K_ds는 천연 상태의 TTR가 3 kcal/mol 이상에서 안정화될 것으로 나타내었다. 기저 상태(Ground state) 안정화는 테트라머가 생리적 관련 시간 스케일에서 해리할 수 없는 것과 같은 테트라머 해리 장벽(TTR 아밀로이드생성의 속도 제한 단계)을 실질적으로 올린다. 기저 상태와 18의 결합에 의해 매개된 천연 비-아밀로이드생성 상태의 키네틱 안정화는 6 M 요소 및 pH 4.4에서 슬러그성 아밀로이드생성성에서 극적으로 느려진 테트라머 해리에 의해 확인되었다. OH-PCB 18(3.6 μM)은 그것인 테트라머 TTR의 우수한 키네틱 안정화제이기 때문에 인상적인 아밀로이드 억제제로 믿어진다. 즉, TTR·18 및 TTR·18₂이 아밀로이드를 형성하는데 비경쟁적이고, TTR의 나머지(1.18 μM)는 그것의 낮은 농도 때문에 아밀로이드를 매우 비효율적으로 생성하기 때문에 그것은 pH 4.4에서 아밀로이드생성성이 되는 것으로부터 3.6 μM TTR 샘플의 2/3을 예방한다. 가장 좋은 OH-PCB 억제제의 해리 속도느느 또한 OH-PCB 주위의 TTR 구조 어닐링(annealing) 때문에 기대된 것보다 느리지만, 이것은 필요한 만큼 주의하여 평가된 것은 아직 아니다. 최소, 이러한 화합물들은 예외적 억제제의 합성을 위한 가이드를 제공하거나, 또는 그 자체로 그들의 독성 프로파일에 따라 억제제로서 유용하게 판명될 수도 있다.

OH-PCB 12, 16, 17 및 18 에 결합한 TTR에 대한 구조 정보는 이러한 바이아릴이 일반적으로 결정상의 2-배 대칭축을 따라 결합한다는 것을 나타낸다. 두 개 링 사이의 이면각(dihedral angle)은 ∼40-60°이고, 두 개의 이웃한 서브유닛 상의 할로겐 결합 포켓(HBP)이 유사하게 참여하도록 하고, 테트라머 4차원 구조 인터페이스의 안정화를 초래한다. 수산화된 PCB 18은 그것의 염소가 HBP 3 및 3' 뿐만 아니라 HBP 1 및 1'에 동시에 결합할 수 있기 때문에 최적 구조 상보성(complimentarity)을 가진다. 이것은 16 및 17에서는 그러하지 않고, 이것은 HBP 1, 1', 3 및 3' 내로 염소를 확장하기 위해서 두 개의 대칭 균등 결합 모드의 고려를 필요로 한다.

페놀릭 링의 내부 결합 포켓 내로의 방향성은 그것이 TTR의 천연 4차원 구조를 더욱 안정화시키는 것으로 보이는 물 매개 수소 결합 네트워크를 그것과 이웃한 TTR 서브유닛 사이에 형성시킬 수 있다는 점에서 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. Ser117의 세 가지 엇갈린 배좌, 억제제의 페놀릭 그룹 및 두 개의 보존된 물 분자를 포함하는 H-결합 네트워크는 PCB 결합 부위를 형성하는 두 개의 서브유닛의 상호연결하는 정전기적 네트워크를 생성한다. 모든 세 가지 구조들에 있어, Thr119 또한 다중 로토머 배좌를 점유한다. 대조적으로, 이러한 정전기 상호작용의 네트워크는 하이드록실 치환 페닐 링이 외부 결합 포켓에 향해 있고 여기에서 Ser117 및 Thr119이 apo 사이드 체인 배좌를 채택하는 12₂·TTR 복합체에서는 존재하지 않는다.

OH-PCB의 독성은 문헌에 잘 나타나 있지 않다. 다양한 인 비트로 및 동물 연구에서, OH-PCB는 약간의 에스트로겐성 또는 항-에스트로겐성이 있는 것으로 나타난다. 다른 독성 기전은 제안되어 왔으며 거기에는 또한 이러한 화합물에 노출된 동물에서 감소된 타이로이드 호르몬 레벨에 대한 보고가 있다. TTR에 결합한 OH-PCB가 T4 레벨을 낮추고 그러한 낮추어진 T4 레벨이 소 분자 TTR 결합을 반영한다는 제안은 직접적으로 지지하기 어렵다. T4의 대략 반이 알부민에 의해 운반되기 때문에, 알부민 결합 부위로부터 T4의 재위치는 PCB에 노출된 개체 내 낮아진 T4 레벨을 야기할 것으로 보인다. 타이로이드 결합 글로불린은 티록신에 대하여 가장 높은 친화도를 가지고 인간에 있어 주된 운반자이지만, 그것은 이러한 화합물의 많은 독성 프로파일이 연구되어온 쥐 및 생쥐를 포함하는 많은 하등 포유류에서는 존재하지 않는다. 따라서, 이러한 종에서는 TTR에 결합하는 화합물은 T4의 총체적 결합 및 운송에 영향을 가질 것으로 보인다. TTR과 PCB의 결합을 보여주는 데이터는 하나 또는 두 개의 약한 결합 화합물을 제외하고 거의 상호작용이 없는 것으로 나타난다. 그러므로, 인간 타이로이드 레벨에 대한 OH-PCB의 효과는 그들이 알부민에 결합하지 않는다면 최소일 것이다. 이러한 화합물이 타이로이드 호르몬 활성화에 간섭하거나 또는 황산화(sulfation) 속도를 증가시키거나, 및 그로므로 T4의 비활성화할 수 있다는 보고가 또한 있다. OH-PCB는 또한 타이로이드 호르몬 수용체를 포함하는 다른 타이로이드 호르몬 타깃에 결합할 수 있고, 이것은 T4의 구조 유사성을 고려할 때 타당한 것으로 보인다.

수산화된 PCB 독성에, 특히 인간에 있어, 관한 거의 발표되지 않은 것은 확실하다. 설치류 독성은 주 타이로이드 호르몬 운반체로 작용하는 TTR의 역할 때문에 더 심각할 것으로 예상된다. 명백한 것은 수산화된 PCB는 트란스타이레틴 소섬유 형성의 억제제로써 탁월한 활성을 보인다는 것이고, 이것은 이러한 종류의 화합물이 아밀로이드 소섬유 형성의 억제를 위해 유용한 잠재력을 갖는다는 것을 제안한다.

물질 및 방법

트란스타이레틴 항체 정제 및 세파로스 결합

항체가 제조되었고, 정제되었고, 및 세파로스에 커플링되었다. 레진은 TSA (10 mM Tris, pH 8.0 / 140 mM NaCl / 0.025% NaN₃) 내에 1:1 슬러리로 보관되었다. 추가로, 중단(quenched) 세파로스는 항체 대신에 200 mM Tris, pH 8.0를 레진에 커플링하여 제조되었다.

인간 혈장 준비

전체 혈액이 the Scripps General Clinical Research Center's Normal Blood-Drawing Program에서 건강한 자원자로부터 얻어졌고 50 mL 코니칼 튜브에 옮겨졌다. 튜브는 swinging bucket rotor가 장착된 Sorvall RT7 탁상 원심분리기에서 10분 동안 25℃에서 3000 RPM(1730 x g)로 원심분리되었다. 혈장 상등액은 제거되었고 남아 있는 세포를 제거하기 위하여 10분 동안 3000 RPM으로 다시 원심분리하였다. 소디움 아자이드가 첨가되어 0.05% 용액을 생성하였다. 혈장은 사용 때까지 4℃에서 보관되었다.

트란스타이레틴 및 결합된 PCB의 면역침전

2 mL의 에펜도르프 튜브가 1.5 mL의 인간 혈장 및 평가중인 7.5 μL의 2.16 mM PCB DMSO 용액으로 채워졌다. 이 용액은 24시간 동안 37℃에서 배양되었다. 중단 세파로스의 1:1 레진/TSA 슬러리(187 μL)가 상기 용액에 첨가되었고 1시간 동안 4℃에서 가볍게 흔들었다. 용액은 원심분리(16,000 x g)되었고 상등액은 각각 400 μL의 3 부분표본으로 나누어졌다. 이것은 각각 200 μL의 항-트란스타이레틴 항체-접합 세파로스의 1:1 레진/TSA 슬러리에 첨가되었고 20분 동안 4℃에서 천천히 흔들어졌다. 샘플은 원심분리(16,000 x g)되었고 상등액은 제거되었다. 레진은 4℃에서 1 mL TSA / 0.05% 사포닌(Acros)(3X 10분)으로 세척되었고, 추가적으로 4℃에서 1 mL TSA(2X 10분)으로 세척되었다. 샘플은 원심분리(16,000 x g) 되었고, 최종 세척액은 제거되었고, 155 μL의 100 mM 트리에틸아민, pH 11.5이 항체로부터 TTR 및 결합 소 분자를 용출하기 위하여 첨가되었다. 30분 동안 4℃에서 가볍게 흔든 후에, 샘플은 원심분리(16,000 x g)되었고 TTR 및 억제제를 포함하는 145 μL의 상등액은 제거되었다.

HPLC 분석 및 트란스타이레틴과 결합 PCB의 정량

TTR 항체 비드로부터의 상등액 용출 샘플(145 μL)이 Waters 71P autosampler에 로딩되었다. 각 샘플의 135 μL 주사가 Keystone 3 cm C18 역상 컬럼에서 8분 동안 40-100% B 경사 (A: 94.8% H₂0 / 5% 아세토니트릴 / 0.2% TFA; B: 94.8% 아세토니트릴 / 5% H₂0 / 0.2% TFA)를 사용하여 분리되었고, Waters 600E 다용매 전달 시스템에 의해 조절되었다. 검출은 280 nm에서 Waters 486 tunable absorbance detector로 수행되었고, 피크는 TTR 및 소 분자의 면적을 얻기 위하여 적분되었다. 각 종의 양을 측정하기 위하여, 알려진 양의 테트라머 TTR 또는 PCB가 HPLC 상으로 주사되었다. 피크들은 Kaleidagraph(Synergy Software)를 사용하여 데이터의 직선 회귀로부터 검정 곡선을 얻기 위하여 적분되었다. 검정 곡선은 혈장 샘플에 존재하는 각 종의 몰 수를 측정하기 위하여 사용되었다. 단백질 대비 소 분자의 비율은 혈장 내에서 TTR에 결합한 소 분자의 화학량을 얻기 위하여 계산되었다.

트란스타이레틴 아밀로이드 소섬유 형성 분석

상기 화합물들은 720 μM의 농도로 DMSO 내에 용해되었다. 평가중인 화합물의 5 μL 용액이 0.5 mL의 10 mM 인산 pH 7.6, 100 mM KCl, 1 mM EDTA 완충액 내 7.2 μL의 TTR 용액에 첨가되었고, 화합물을 30분 동안 TTR과 배양하였다. 495 μL의 0.2 mM 아세테이트 pH 4.2, 100 mM KCl, 1 mM EDTA이 첨가되었고, 최종 단백질 및 억제제 농도가 3.6 μM 및 pH가 4.4가 되게 하였다. 혼합물을 그 후 72시간 동안 37℃에서 배양한 후에, 튜브는 3초 동안 진탕되었고 광학 밀도가 400 nm에서 측정되었다. 소섬유 형성의 정도는 각 광학 밀도를 억제제 없는 TTR의 그것, 100% 소섬유 형성으로 정의된 것으로 표준화(normalizing)함으로써 측정되었다. TTR의 부재하에서 각 화합물의 대조군 용액 또한 시험되었고 400 nm에서 측정가능하도록 흡광된 것은 없었다.

PCB 18과 TTR의 등온 적정 열량측정(Isothermal Titration Calorimetrv)

화합물 18의 25 μM 용액(10 mM 포스페이트 pH 7.6, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 8% DMSO 내)이 Microcal MCS Isothermal Titration Calorimeter(Microcal, Northampton, MA)를 사용하여 동일한 완충액 내 1.2 μM 용액 내로 적정되었다. 25℃에서 2 μL의 초기 주사 후에 10 μL의 주사 25회가 행해졌다. 온도기록도(Thethermogram)가 적분되었고 블랭크가 공제되었고 ORIGIN 5.0(Microcal)의 ITC 데이터 분석 패키지를 사용하여 두 개의 동일한 결합 부위의 모델에 가장 잘 맞는 결합 등온선(isotherm)을 얻었다.

결정화 및 X-ray 데이터 수집

재조합 TTR의 결정이 hanging drop 실험으로 2M 암모니움 설페이트에 대하여 평형화된(equilibrated) 5 mg/ml(100 mM KCl, 100 mM 포스페이트, pH 7.4, 1M 암모니움 설페이트 내) 단백질 용액으로부터 얻어졌다. TTR·리간드 복합체가 양쪽 결합 부위를 충분히 포화시키기 위하여 10-배 몰 과량의 리간드에 2중 동안 담겨진 결정으로부터 제조되었다. 1:1 아세톤:물 용액이 담금(soaking) 성분으로 사용되었다. RU200 로테이팅 anode X-ray 생성기에 커플링된 DIP2030b 이미징 플레이트 시스템(MAC Science, 요코하마, 일본)이 데이터 수집을 위해 사용되었다. 결정은 냉동-본호제로써 파라톤(paratone) 오일 내에 놓여졌고 회절 실험을 위하여 120 K로 냉각되었다. 모든 TTR·리간드 복합체의 결정은 a=43 Å, b=86 Å 및 c=65 Å의 유닛 셀 디멘션을 포함하는 apo 결정 형태를 가진 동형(isomorphous)이다. 그들은 스페이스 그룹 P2₁2₁2에 속하고 비대칭 유닛 내에 호모테트라머의 반을 포함한다. 데이터는 DENZO 및 SCALEPACK으로 수정되었다(reduced).

구조 결정 및 리파인먼트(Refinement)

단백질 데이터 은행(접근 번호 1BMZ)으로부터 얻은 TTR에 대한 단백질 원자 배위(coordinate)가 프로그램 CNS를 사용하는 분자 역학 및 에너지 최소화(energy minimization)에 의하여 천연 TTR 및 TTR-리간드 복합체의 리파인먼트(refinement)을 위한 출발 모델로 사용되었다. 지도는 PCB 또는 동시에 공결정화된 것과 함께 담가진(soaked) TTR 결정에 대해 수집된 회절 데이터로부터 계산되었다. PCB와 TTR의 복합체에 있어, 생성되는 지도는 TTR 테트라머의 양쪽 결합 포켓 내 리간드의 대략적 위치를 나타내며, 59 r.m.s. 이상의 피크 높이를 가진다. 소 분자 전자 밀도를 좀더 향상시키고 모델 편향을 제거하기 위하여, 모델은 몇몇 사이클의 warp/shake 프로토콜이 수행되었고, 이것은 지도, 특히 억제제 주위의 지도에 있어 감지할 만한 향상을 가져왔다. 연속되는 모델 피팅은 이러한 지도를 사용하여 행해졌고 리간드 분자는 밀도 내에 놓여졌다. 모든 세 가지 경우에 있어, 프로그램 InsightⅡ (Accelrys)에 의해 계산된 억제제의 최소-에너지 배좌(conformation)는 지도와 양호하게 일치하였다. 결합 채널을 따른 2-배 결정성 대칭 축 때문에, 통계적 장애 모델(statistical disorder model)이 적용되어야 하며, 테트라머 TTR의 두 개의 결합 부위의 각각 내에 두 개의 리간드 결합 모드를 야기한다. 물 분자는 편향되지 않은 전자 밀도 지도에 기초하여 첨가되었다. 최종 지도에 있어 해석 가능한 전자 밀도의 부족 때문에 9개 N-말단 및 3개 C-말단 잔류물이 최종 모델에 포함되지 않았다.

실시예 5: 트란스타이레틴 아밀로이드 소섬유 억제제로써의 벤족사졸

트란스타이레틴의 두 가지 티록신 결합 부위는 그것의 4차원 구조 인터페이스에 의해 생성된다. 테트라머는 이러한 부위에 결합하는 소 분자에 의해 안정화될 수 있고, 잠재적으로 소 분자 약물로 TTR 아밀로이드 질병을 치료하는 수단을 제공한다. 많은 족(families)의 화합물들이 발견되어 왔고 그들의 결합은 소 분자 해리 상수 K_dl 및 K_d2에 비례적 정도로 테트라머 기저 상태를 안정화시킨다. 이것은 또한 효율적으로 해리 활성화 장벽을 증가시키고 키네틱 안정화에 의해 아밀로이드증을 억제한다. 그러한 억제제는 전형적으로 두 개의 방향족 링으로 구성되어 있고, 하나의 링은 할로겐 치환체를 포함하고 다른 하나는 수용성 치환체를 포함한다. C(4)-C(7)에 카복실릭 산이 치환되고 C(2)에 할로겐화된 페닐 링이 치환된 벤족사졸 또한 TTR 티록신 결합 부위를 보충하는 것으로 나타났다. 작은 라이브러리의 이러한 화합물들은 그러므로 도 1에 예시되는 것처럼 N-아실 아미노-하이드록시벤조익 산의 데하이드로사이클리제이션(dehydrocyclization)으로 제조되었다.

도식 1: 벤족사졸의 일반적 합성

시약들: (a) ArCOCI, THF, 피리딘 (Ar = 페닐, 3,5-디플루오로페닐, 2,6-디플루오로페닐, 3,5-디클로로페닐, 2,6-디클로로페닐, 2-(트리플루오로메틸)페닐, 및 3-(트리플루오로메틸)페닐); (b) TsOH·H₂O, 환류용(refluxing) 자이렌; (c) TMSCHN₂, 벤젠, MeOH; (d) LiOH, THF, MeOH, H₂O (4단계 8-27% 수율).

벤족사졸은 증가된 설득력을 가지는 연속된 분석법을 사용하여 평가되었다. WT TTR(3.6 μM)은 30분 동안 (pH 7, 37℃) 시험 화합물(7.2 μM)과 배양되었다. 시험 화합물 중 적어도 하나의 분자는 그것을 안정화할 수 있도록 TTR 테트라머의 각 분자에 결합해야 하기 때문에, 7.2 μM의 시험 화합물 농도는 단지 최소 효율 농도의 두 배이다. pH는 그 후 소섬유화(fibrilization)를 위한 최적의 pH인 4.4로 조정되었다. 시험 화합물의 존재 하에서 72시간 (37℃) 후에 형성된 아밀로이드의 양은 400 nm에서 혼탁도에 의해 측정되었고 TTR 단독에 의해 형성된 양을 100%로 보고 % 소섬유 형성(fibril formation, ff)로 표현하였다. 시험된 28개 화합물 중에, 11개가 무시해도 좋은 레벨(ff < 10%; 도 7)로 소섬유 형성을 감소시켰다.

11개의 대부분 활성 화합물은 그 후 혈액 내 모든 다른 단백질에 대하여 TTR에 선택적으로 결합하는 그들의 능력이 평가되었다. 인간 혈장(TTR 농도 3.6- 5.4 μM)이 시험 화합물(10.8 μM)과 37℃에서 24시간 동안 배양되었다. TTR 및 어떠한 결합 억제제는 세파로스-결합 폴리클로날 TTR 항체를 사용하여 면역침전되었다. 억제제 결합이 있는 또는 없는 TTR은 높은 pH에서 레진으로부터 방출되고, 억제제:TTR 화학량(stoichiometry)은 HPLC 분석(도 8)에 의해 확인되었다. 5- 또는 6-위치에 카복실릭 산, 및 2-위치에 2,6-디클로로페닐 (13, 20) 또는 2-트리플루오로메틸페닐 (11, 18) 치환체를 가진 벤족사졸은 가장 높은 결합 화학량을 나타내었다. 특히, 20은 뛰어난 억제 활성 및 결합 선택성을 나타내었다. 그러므로, 그것의 작용 기전이 더욱 조사되었다.

20이 테트라머에 강하게 결합하여 TTR 소섬유 형성을 억제하는지를 확인하기 위하여, 등온 적정 열량분석(ITC) 및 침강 속도 실험(sedimentation velocity experiment)이 wt TTR을 이용하여 수행되었다. ITC는 2 당량의 20이 생리적 조건하에서 K_dl = K_d2 = 55(±10)의 평균 해리 상수를 가지면 결합한다는 것을 보여주었다. 이것은 많은 다른 매우 유효한 TTR 아밀로이드생성 억제제의 해리 상수와 비교할만 하다. 침강 속도 실험에 있어, TTR(3.6 μM)은 최적의 소섬유화 조건(72시간, pH 4.4, 37℃)하에서 20(3.6 μM, 7.2 μM, 36 μM)과 배양되었다. 7.2 또는 36 μM의 20 용액에서 테트라머(55 kDa)만이 검출되었다. 3.6 μM의 20에서 몇몇 큰 응집체가 형성되었지만, 용액 내 남아있는 TTR은 테트라머형이었다.

T119M 서브유닛 봉입(inclusion) 및 소 분자 결합은 테트라머 해리에 대한 활성화 장벽을 상승시켜 TTR 아밀로이드 형성을 예방한다. 이러한 것을 행하는 억제제의 능력은 심한 변성 스트레스인 6 M 요소 내에서 테트라머 해리를 늦추는 것에 대한 그것의 효능을 측정함으로써 매우 엄하게 시험되었다. 따라서, 20, 21 또는 27의 존재 및 부존재 하에서 6 M 요소 내 테트라머 해리 속도가 비교되었다 (도 9). TTR(1.8 μM)은 6 M 요소 하에서 168 시간 후에 완전히 변성되었다. 대조적으로, 3.6 μM의 20은 테트라머 해리 적어도 168 시간 동안 예방하였다 (인간 혈장 내 TTR 반감기의 3배 이상). 동일 몰 량의 20으로, TTR의 단지 27%만이 168 시간 경과 후에 변성되었다. 화합물 27(3.6 μM)은 그것이 비록 소섬유 형성 분석에서 활성을 나타내었지만 테트라머 해리를 예방하는 능력은 적었다 (168시간 후에 90% 언폴딩(unfolding)). 화합물 21은 TTR의 해리를 전해 저해하지 않았다. 이러한 결과는 TTR에 결합하는 억제제는 필요하나 강한 변성 조건에서는 TTR 테트라머를 키네틱적으로 안정화시키기에 충분하지 않다; 해리 상수가 매우 낮다 (또는 off 속도가 매우 느리다)는 것 또한 중요하다는 것을 보여준다. 또한, 20 위 기능 그룹의 디스플레이가 TTR 테트라머를 안정화하는데 분명히 최적이고; 27에서 처럼 카복실릭 산을 C(6)로부터 C(7)로 옮기거나, 21에서 처럼 염소를 제거하는 것은 그것을 활성을 심각하게 감소시킨다.

20에 있어 치환체의 역할은 그것의 TTR과의 공-결정 구조로부터 분명하다 (도 10). 화합물 20은 그것의 염소 원자를 포켓 2 및 2'에 결합하는 할로겐 근처에 위치시킨다 (소위 그들은 티록신이 TTR에 결합할 때 요오드에 의해 점유되기 때문에). 페닐 링 상의 2,6 치환 패턴은 벤족사졸 및 페닐 링을 평면(planarity)에서 벗어나게 하고, 최적으로 벤족사졸 상의 카복실릭 산을 Lys 15/15'의 ε-NH₃ ⁺ 그룹의 수소 결합에 위치시킨다. 20의 방향족 링과 Leu 17, Leu 110, Ser 117, 및 Val 121 사이의 소수성 상호작용은 추가적인 결합 에너지에 기여한다.

방법

벤족사졸 합성 및 상기 프로덕트의 평가 (¹H- 및 ¹³C-NMR 및 고해상도 질량 스펙트럼)에 대한 일반적 절차가 아래에서 상세히 설명된다.

분석용 초원심분리(Analytical Ultracentrifugation)

20의 존재 하에서 TTR의 4차원 구조가 침강 속도 분석용 초원심분리를 사용하여 측정되었다. 샘플은 72시간 동안 3.6, 7.2 또는 36 μM의 20과 배양되었다. 데이터는 온도-조절 Beckman XL-1 분석용 초원심분리기 (An60Ti 로터(rotor) 및 광전 스캐너가 장착됨) 상에서 모아졌다. 12 mm Epon centerpiece 및 사파이어 창이 장착된 이중 섹터 셀이 주사기를 사용하여 400-420 μL의 샘플로 로딩되었다. 데이터는 포인트 당 평균 1 스캔을 적용하는 0.005 cm의 스텝 사이즈를 가지고 25℃에서 연속 모드로 3000 및 50000 rpm의 로터 속도에서 모아졌다. 검출은 280 nm에서 수행되었다. 데이터는 Philo에 의해 개발된 프로그램(Philo, 2000; Stafford, 1992)을 사용하여 time-derivative 분석을 수행하였다. 분석은 용액 내 종의 분포가 일정 범위의 s 값에 의해 표현된다는 것을 보여주었다. 이러한 분포는 그 후 상기 시스템에서 종에 대한 침강 및 확산 계수(coefficient)를 결정하기 위하여 다양한 모델에 피팅되었다. 각 종의 분자량은 전에 보고된 모델(Petrassi, et al 2000)에 의해 결정되었다. TTR에 대하여 발견된 s 값은 7.2 및 36 μM의 20 존재하에서 그것은 테트라머형으로 남아 있고, 반면 3.6 μM에서는 몇몇 응집체의 형성에도 불구하고 용액 내 존재하는 TTR은 테트라머형이라는 것을 보여준다.

결정화 및 X-ray 데이터 수집

wt TTR의 결정이 행잉 드럽(hanging drop) 실험으로 2M 암모니움 설페이트에 대하여 평형화된(equilibrated) 12 mg/ml(100 mM KCl, 1 mM EDTA, 10 mM 소디움 포스페이트, pH 7.0, 0.35 M 암모니움 설페이트 내) 단백질 용액으로부터 얻어졌다. TTR·20 복합체가 양쪽 결합 부위를 충분히 포화시키기 위하여 10-배 몰 과량의 리간드에 3주 동안 담겨진 결정으로부터 제조되었다. 리간드-담가진(ligand-soaked) 결정이 14-BM-C, BIOCARS, Advanced Photon Source (Argonne National Laboratory)의 단색 고 에너지 원에서 콴텀-4 검출기 상에서 최대 1.55 Å까지 회절되었다. 결정은 파라톤(paratone) 오일 내에 놓여졌고 회절 실험을 위하여 100 K로 플래쉬-냉각되었다. 모든 TTR-20 복합체의 결정은 a=43.1 Å, b=84.7 Å 및 c=64.7 Å의 유닛 셀 디멘션의 apo 결정 형태를 가진 동형(isomorphous)이다. 그들은 비대칭 유닛 내에 두 개의 TTR 서브유닛을 가진 스페이스 그룹 P2₁2₁2에 속한다. 데이터는 HKL2000 슈트(suite)의 DENZO 및 SCALEPACK으로 수정되었다(reduced). (Otwinowski, 1997).

구조 결정 및 리파인먼트(Refinement)

단백질 데이터 은행(접근 번호 1BMZ)으로부터 얻은 TTR에 대한 단백질 원자 배위(coordinate)가 분자 대체(replacement) 연구를 위한 출발 모델로 사용되었다. TTR-20 복합체 구조의 리파인먼트는 CNS의 분자 역학 및 에너지 최소화(energy minimization) 프로토콜을 사용하여 수행되었다. 발생하는 차이 Fourier 지도는 TTR 테트라머의 양쪽 결합 포켓 내 리간드의 결합을 나타내었다. 이러한 지도를 사용하여, 리간드는 밀도 내에 모호하지 않게 위치될 수 있었고 결정성 리파인먼트 내에 포함되었다. 프로그램 InsightⅡ (Accelrys)에 의해 계산된 억제제의 최소-에너지 배좌(conformation)가 결정성 리파인먼트를 위한 시작 모델로 사용되었다. 2-배 결정성 대칭 축이 결합 채널을 따라 존재하기 때문에, 통계적 장애 모델(statistical disorder model)이 적용되어야 하며, TTR 결합 포켓 당 두 개의 리간드 결합 모드를 야기한다. 몇몇 사이클의 시뮬레이션된 어닐링 및 연속되는 위치 및 온도 요인 리파인먼트 후에, 물 분자는 차이 Fourier 지도 내로 위치되었다. 지도 피팅의 최종 사이클이 shake n'warp bias removal 프로토콜에 의해 계산된 편향되지 않은 증량된(weighted) 전자 밀도 지도를 사용하여 수행되었다. 리간드의 대칭 관련 결합 배좌는 억제제의 부존재하에서 그려진 shake n'warp 언바이어스된(unbiased) 웨이티드 맵(weighted map) 뿐만 아니라 언바이어스된 이닐된 오미트 맵(annealed omit map)과도 잘 일치한다. 최종 지도의 해석 가능한 전자 밀도의 부족 때문에, 9개의 N-말단 및 3개의 C-말단 잔류물은 최종 지도에 포함되지 않았다. 결정성 분석의 요약이 표 6에 제시되었다.

표 6: X-ray 결정 구조의 통계

벤족사졸 합성- 일반적 방법

다르게 언급되지 않는다면, 모든 반응은 오븐-건조된 유리기구를 사용하여 건조 아르곤 대기하에서 FirstMate Organic Synthesizer(Argonaut Technologies)로 수행되었다. 모든 용매 (무수) 및 시약들은 Aldrich에서 구입하였고 추가 정제 없이 사용하였다. ¹H NMR 스펙트럼은 Bruker DRX-500 spectrometer를 사용하여 500 MHz에서 또는 Bruker DRX-600 spectrometer를 사용하여 600 MHz에서 측정되었고, 내부 CHD₂-S(O)-CD₃ (2.49 ppm)을 표준 물질로 사용하였다. ¹³C 스펙트럼은 Bruker DRX-500를 사용하여 125 MHz 또는 Bruker DRX-600 기기를 사용하여 150 MHz에서 측정되었으며, (CD₃)₂SO (39.5 ppm)로 참고물질을 사용하였다. 박막 크로마토그래피 분석이 Glass-backed 얇은-층 분석 플레이트 (Kieselgel 60 F₂₅₄, 0.25 mm, EM Science no. 5715-7)로 수행되었다. 비주얼리제이션(Visualization)은 UV 흡광 또는 10% 포스포몰리비딕(phosphomolybdic) 산 에탄올을 사용하여 수행되었다. 크로마토그래피는 chromatotron (Harrison Research, Model 7924T, 2 mm plate) 또는 분취용 실리카 겔 플레이트 (Kieselgel 60F2s4 1 mm, EM Science no. 13895-7) 상에서 수행되었다.

벤족사졸 합성의 일반적 절차

아미노 하이드록시벤조익 산 (0.2 mmol)의 THF (3 mL) 혼합물이 연속적으로 피리딘 (500 μl, 0.6 mmol) 및 바람직한 산 클로라이드 (0.2 mmol)로 처리되었다. 반응 혼합물은 10시간 동안 상온에서 교반되었고, 1시간 동안 환류되었고, 진공으로 건조되었고 정제 없이 다음 단계에서 사용되었다.

p-톨루엔설포닉 산 모노하이드레이트 (380.4 mg, 2.0 mmol)이 조 반응 혼합물의 자이렌(5 mL)에 첨가되었고 생성되는 혼합물은 하룻밤 동안 환류하며 교반되었다. 12시간 후에, 반응은 상온으로 냉각되었고, NaOH(2 mL, 1 N)로 중단되었고 상은 분리되었다. 수층은 HCl (1 N)로 pH 2까지 산성화되었고 EtOAc (4 × 3 mL)로 추출되었다. 혼합된 유기층은 MgS0₄로 건조되었고, 여과되었고 진공으로 농축되었다. 생성되는 잔여물은 MeOH:벤젠 (2 mL; 1:4)에 용해되었고, 25℃에서 TMS-CHN₂ (200 μL의 2.0 M 헥산 용액, 0.4 mmol)로 처리되었고 반응 상황은 TLC를 이용하여 모니터링되었다 (일반적으로 0.5 시간 후에 완결). 반응 혼합물은 진공으로 농축되었고, 잔여물은 바람직한 벤족사졸 메틸 에스터를 얻기 위하여 크로마토그래피 (10 내지 25% EtOAc/헥산 경사) 되었다.

벤족사졸 메틸 에스터는 THF:MeOH:H₂0 (3:1:1, 0.07 M)에 용해되었고 LiOH.H₂0 (4 당량)으로 처리되었다. 반응은 상온에서 교반되었고 TLC로 모니터링되었다. 완결시에, 혼합물은 1 N HCl을 사용하여 pH 2로 산성화되었고 EtOAc (4 x)로 추출되었다. 혼합된 유기층은 MgS0₄로 건조되었고, 여과되었고 및 농축되었다. 잔여물은 분취용 박막 크로마토그래피 (4.9% MeOH, 95% CH₂C1₂, 0.1% HOAc)로 정제되어 흰색 고체인 프로덕트를 얻었다.

4-카복시-2-(3,5-디플루오로페닐)-벤족사졸 (1). 일반적 절차에 따라 3-하이드록시안트라닐릭(hydroxyanthranilic) 산으로부터 제조되어 흰색 고체인 화합물 1을 얻었다 (7.0 mg, 13 %). 1에 대한 데이터: ¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 13.70-12.50 (br. s, 1H, CO₂H), 8.04 (AMX, 1H, J= 8.1 Hz, Ar), 7.94 (AMX, 1H, J= 7.3 Hz, Ar), 7.84 (br. d, 2H, J= 5.6 Hz, Ar), 7.62-7.58 (m, 1H, Ar), 7.56 (AMX, 1H, J= 7.3, 8.1 Hz, Ar); ¹³C NMR (125 MHz, DMSO-d₆) δ 165.8, 162.7 (d, J= 248 Hz), 162.6 (d, J= 248 Hz), 161.6, 151.0, 140.3, 129.3, 127.0, 125.8, 123.6, 115.2, 110.8 (d, J= 28 Hz), 107.8 (t, J= 26 Hz); HRMS (MALDI-FTMS) C₁₄H₇F₂NO₃ (MH⁺)에 의해 계산 276.0467, 실험 276.0463.

4-카복시-2-(2,6-디플루오로페닐)-벤족사졸 (2). 일반적 절차에 따라 3-하이드록시안트라닐릭(hydroxyanthranilic) 산으로부터 제조되어 흰색 고체인 화합물 2를 얻었다 (8.2 mg, 15 %). 2에 대한 데이터: ¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 13.00 (br. s, 1H, CO₂H), 8.06 (AMX, 1H, J= 8.1 Hz, Ar), 7.94 (AMX, 1H, J= 7.6 Hz, Ar), 7.80-7.74 (m, 1H, Ar), 7.57 (AMX, 1H, J= 7.6, 8.1 Hz, Ar), 7.40-7.38 (m, 2H, Ar); ¹³C NMR (125 MHz, DMSO-d₆) δ 166.1, 160.4 (d, J= 256 Hz), 160.3 (d, J= 256 Hz), 154.9, 150.6, 139.6, 134.7 (t, J= 10 Hz), 126.8, 125.8, 114.8, 112.8 (d, J= 22 Hz), 105.2 (t, J= 16 Hz); HRMS (MALDI-FTMS) C₁₄H₇F₂NO₃ (MH⁺)에 의해 계산 276.0467, 실험 276.0461.

4-카복시-2-[(3-트리플루오로메틸)페닐]-벤족사졸 (3). 일반적 절차에 따라 3-하이드록시안트라닐릭(hydroxyanthranilic) 산으로부터 제조되어 흰색 고체인 화합물 3을 얻었다 (9.5 mg, 15 %). 3에 대한 데이터: ¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 13.70-12.80 (br. s, 1H, CO₂H), 8.50 (AMX, 1H, J= 7.8 Hz, Ar), 8.43 (s, 1H, Ar), 8.06 (AMX, 1H, J= 8.1 Hz, Ar), 8.03 (ABX, 1H, J= 8.1 Hz, Ar), 7.94 (AMX, 1H, J= 7.8 Hz, Ar), 7.88 (ABX, 1H, J= 7.8 Hz, Ar), 7.54 (AMX, 1H, J= 8.1 Hz, Ar); ¹³C NMR (125 MHz, DMSO-d₆) δ 165.8, 161.9, 151.0, 140.6, 131.4, 130.8, 130.0 (q, J= 33 Hz), 128.7 (d, J= 4 Hz), 127.2, 127.0, 125.5, 123.8, 123.7 (q, J= 273 Hz), 123.2, 115.2; HRMS (MALDI-FTMS) C₁₅H₈F₃NO₃ (MH⁺)에 의해 계산 308.0529, 실험 308.0535.

4-카복시-2-[(2-트리플루오로메틸)페닐]-벤족사졸 (4). 일반적 절차에 따라 3-하이드록시안트라닐릭(hydroxyanthranilic) 산으로부터 제조되어 흰색 고체인 화합물 4을 얻었다 (15.2 mg, 25 %). 4에 대한 데이터: ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ 13.15 (br. s, 1H, CO₂H), 8.18 (d, 1H, J= 7.8 Hz, Ar), 8.06 (AMX, 1H, J= 0.9, 8.2 Hz, Ar), 8.02 (d, 1H, J= 7.9 Hz, Ar), 7.96 (AMX, 1H, J= 0.9, 7.9 Hz, Ar), 7.94-7.87 (m, 2H, Ar), 7.58 (AMX, 1H, J= 0.9, 7.9 Hz, Ar); ¹³C NMR (150 MHz, DMSO-d₆) δ 165.8, 161.9, 151.2, 140.0, 133.0, 132.6, 132.3, 127.6 (q, J= 32 Hz), 127.2 (q, J= 6 Hz), 127.0, 125.6, 124.9, 123.5, 123.4 (q, J= 273 Hz), 115.2; HRMS (MALDI-FTMS) C₁₅H₈F₃NO₃ (MH⁺)에 의해 계산 308.0529, 실험 308.0531.

4-카복시-2-(3,5-디클로로페닐)-벤족사졸 (5). 일반적 절차에 따라 3-하이드록시안트라닐릭(hydroxyanthranilic) 산으로부터 제조되어 흰색 고체인 화합물 5을 얻었다 (8.0 mg, 13 %). 5에 대한 데이터: ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ 13.60-12.60 (br. s, 1H, CO₂H), 8.16(A ₂M, 2H, J= 2.0 Hz, Ar), 8.05 (AMX, 1H, J= 0.9, 8.2 Hz, Ar), 7.96 (A₂ M, 1H, J= 2.0 Hz, Ar), 7.94 (AMX, 1H, J= 0.9, 7.6 Hz, Ar), 7.56 (AMX, 1H, J= 7.9 Hz, Ar); ¹³C NMR (150 MHz, DMSO-d₆) δ 165.8, 160.8, 151.0, 140.4, 135.2, 131.5, 129.4, 127.0, 126.3, 125.9, 125.8, 123.6, 115.2; HRMS (MALDI-FTMS) C₁₄H₇Cl₂NO₃ (MH⁺)에 의해 계산 307.9876, 실험 307.9876.

4-카복시-2-(2,6-디클로로페닐)-벤족사졸 (6). 일반적 절차에 따라 3-하이드록시안트라닐릭(hydroxyanthranilic) 산으로부터 제조되어 흰색 고체인 화합물 6을 얻었다 (5.2 mg, 8 %). 6에 대한 데이터: ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ 13.80-12.50 (br. s, 1H, CO₂H), 8.07 (AMX, 1H, J= 8.2 Hz, Ar), 7.95 (AMX, 1H, J= 7.9 Hz, Ar), 7.77-7.71 (m, 3H, Ar), 7.59 (AMX, 1H, J= 7.9, 8.2 Hz, Ar); ¹³C NMR (150 MHz, DMSO-d₆) δ 165.8, 158.2, 150.8, 139.3, 134.8, 134.0, 128.7, 126.8, 126.7, 125.9, 122.4; HRMS (MALDI-FTMS) C₁₄H₇Cl₂NO₃ (MH⁺)에 의해 계산 307.9876, 실험 307.9880.

4-카복시-2-페닐-벤족사졸 (7). 일반적 절차에 따라 3-하이드록시안트라닐릭(hydroxyanthranilic) 산으로부터 제조되어 흰색 고체인 화합물 7을 얻었다 (10.2 mg, 21 %). 7에 대한 데이터: ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ 13.50-12.60 (br. s, 1H, CO₂H), 8.24-8.22 (m, 2H, Ar), 8.03 (AMX, 1H, J= 0.9, 8.2 Hz, Ar), 7.91 (AMX, 1H, J= 0.9, 7.9 Hz, Ar), 7.68-7.61 (m, 3H, Ar), 7.51 (AMX, 1H, J= 7.9, 8.2 Hz, Ar); ¹³C NMR (150 MHz, DMSO-d₆) δ 166.0, 163.4, 151.0, 140.8, 132.4, 129.4, 127.6, 126.7, 126.1, 125.0, 123.0, 115.0; HRMS(MALDI- FTMS) C₁₄H₉NO3 (MH⁺)에 의해 계산 240.0655, 실험 240.0656.

5-카복시-2-(3,5-디플루오로페닐)-벤족사졸 (8). 일반적 절차에 따라 3-아미노-4-하이드록시벤조익 산으로부터 제조되어 흰색 고체인 화합물 8을 얻었다 (10.2 mg, 19 %). 8에 대한 데이터: ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ 13.60-12.80 (br. s, 1H, CO₂H), 8.32 (ABM, 1H, J= 1.5 Hz, Ar), 8.07 (ABM, 1H, J= 1.5, 8.5 Hz, Ar), 7.90 (ABM, 1H, J= 8.5 Hz, Ar), 7.86-7.85 (m, 2H, Ar), 7.60 (tt, 1H, J= 2.4, 9.2 Hz, Ar); ¹³C NMR (150 MHz, DMSO-d₆) δ 166.8, 162.8 (d, J= 248 Hz), 162.7 (d, J= 248 Hz), 161.5, 153.0, 141.2, 129.1 (t, J= 11 Hz), 128.2, 127.7, 121.4, 111.2, 120.8 (d, J= 23 Hz), 110.7 (d, J= 22 Hz), 107.8 (t, J= 26 Hz); HRMS(MALDI-FTMS) C₁₄H₇F₂NO₃ (MH⁺)에 의해 계산 276.0467, 실험 276.0469.

5-카복시-2-(2,6-디플루오로페닐)-벤족사졸 (9). 일반적 절차에 따라 3-아미노-4-하이드록시벤조익 산으로부터 제조되어 흰색 고체인 화합물 9을 얻었다 (6.8 mg, 12 %). 9에 대한 데이터: ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ 13.50-12.80 (br. s, 1H, CO₂H), 8.39 (ABM, 1H, J= 0.7, 1.6 Hz, Ar), 8.10 (ABM, 1H, J= 1.6, 8.7 Hz, Ar), 7.95 (ABM, 1H, J= 0.7, 8.7 Hz, Ar), 7.77 (m, 1H, Ar), 7.40 (t, 2H, J= 8.8 Hz, Ar); ¹³C NMR (150 MHz, DMSO-d₆) δ 166.8, 160.4 (d, J= 257 Hz), 160.3 (d, J= 257 Hz), 155.4, 152.6, 140.8, 134.8 (t, J= 11 Hz), 128.2, 127.7, 121.6, 113.0 (d, J= 22 Hz), 112.9 (d, J= 22 Hz), 111.2, 104.9; HRMS(MALDI-FTMS) C₁₄H₇F₂NO₃ (MH⁺)에 의해 계산 276.0467, 실험 276.0467.

5-카복시-2-[(3-트리플루오로메틸)페닐]-벤족사졸 (10). 일반적 절차에 따라 3-아미노-4-하이드록시벤조익 산으로부터 제조되어 흰색 고체인 화합물 10을 얻었다 (6.7 mg, 11 %). 10에 대한 데이터: ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ 13.30-12.80 (br. s, 1H, CO₂H), 8.51 (ABX, 1H, J= 7.8 Hz, Ar), 8.45 (s, 1H, Ar), 8.35 (ABM, 1H, J= 1.7 Hz, Ar), 8.08 (ABM, 1H, J= 1.7, 8.6 Hz, Ar), 8.04 (ABM, 1H, J= 7.8 Hz, Ar), 7.93 (ABM, 1H, J= 8.6 Hz, Ar), 7.89 (ABM, 1H, J= 7.8 Hz, Ar); ¹³C NMR (125 MHz, DMSO-d₆) δ 166.8, 162.2, 153.1, 141.4, 131.4, 130.9, 130.1 (q, J= 33 Hz), 128.8, 128.2, 127.5, 127.1, 123.8 (q, J= 4 Hz), 123.7 (q, J= 273 Hz), 121.3, 111.2; HRMS(MALDI-FTMS) C₁₅H₈F₃NO₃ (MH⁺)에 의해 계산 308.0529, 실험 308.0530.

5-카복시-2-[(2-트리플루오로메틸)페닐]-벤족사졸 (11). 일반적 절차에 따라 3-아미노-4-하이드록시벤조익 산으로부터 제조되어 흰색 고체인 화합물 11을 얻었다 (10.3 mg, 17 %). 11에 대한 데이터: ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ 13.19 (br. s, 1H, CO₂H), 8.38 (m, 1H, Ar), 8.19 (d, 1H, J= 7.6 Hz, Ar), 8.09 (dd, 1H, J= 1.8, 8.5 Hz, Ar), 8.03 (d, 1H, J= 7.9 Hz, Ar), 7.94-7.88 (m, 3h, Ar); ¹³C NMR (150 MHz, DMSO-d₆) δ 166.8, 161.6, 153.2, 141.1, 133.1, 132.5, 132.4, 128.2, 127.6, 127.5 (q, J= 32 Hz), 127.2 (q, J= 6 Hz), 124.7, 123.4 (q, J= 274 Hz), 121.6, 111.2; HRMS(MALDI-FTMS) C₁₅H₈F₃NO₃ (MH⁺)에 의해 계산 308.0529, 실험 308.0531.

5-카복시-2-(3,5-디클로로페닐)-벤족사졸 (12). 일반적 절차에 따라 3-아미노-4-하이드록시벤조익 산으로부터 제조되어 흰색 고체인 화합물 12를 얻었다 (7.3 mg, 12 %). 12에 대한 데이터: ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ 13.14 (br. s, 1H, CO₂H), 8.33 (AMX, 1H, J= 0.6, 1.8 Hz, Ar), 8.16 (AM, 2H, J= 1.8 Hz, Ar), 8.08 (AMX, 1H, J= 1.8, 8.5 Hz, Ar), 7.95 (AM, 1H, J= 1.8 Hz, Ar), 7.91 (AMX, 1H, J= 0.6, 8.5 Hz, Ar); ¹³C NMR (150 MHz, DMSO-d₆) δ 166.7, 161.1, 153.0, 141.3, 135.2, 131.6, 129.2, 128.2, 127.7, 125.9, 121.4, 111.3; HRMS(MALDI-FTMS) C₁₄H₇Cl₂NO₃ (MH⁺)에 의해 계산 307.9876, 실험 307.9879.

5-카복시-2-(2,6-디클로로페닐)-벤족사졸 (13). 일반적 절차에 따라 3-아미노-4-하이드록시벤조익 산으로부터 제조되어 흰색 고체인 화합물 13를 얻었다 (10.8 mg, 18 %). 13에 대한 데이터: ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ 13.08 (br. s, 1H, CO₂H), 8.43 (AMX, 1H, J= 0.6, 1.8 Hz, Ar), 8.13 (AMX, 1H,J= 1.8, 8.5 Hz, Ar), 7.98 (AMX, 1H, J= 0.6, 8.5 Hz, Ar), 7.77-7.72 (m, 3H, Ar); ¹³C NMR (150 MHz, DMSO-d₆) δ 166.7, 158.6, 152.8, 140.4, 134.8, 134.2, 128.8, 128.4, 127.8, 126.2, 121.8, 111.5; HRMS (MALDI- FTMS) C₁₄H₇Cl₂NO₃ (MH⁺)에 의해 계산 307.9876, 실험 307.9879.

5-카복시-2-페닐-벤족사졸 (14). 일반적 절차에 따라 3-아미노-4-하이드록시벤조익 산으로부터 제조되어 흰색 고체인 화합물 14를 얻었다 (11.5 mg, 24 %). 14에 대한 데이터: ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ 13.12 (br. s, 1H, CO₂H), 8.30 (ABX, 1H, J= 1.8 Hz, Ar), 8.20 (dt, 2H, J= 1.5, 6.7 Hz, Ar), 8.03 (ABX, 1H, J= 1.8, 8.5 Hz, Ar), 7.87 (ABX, 1H, J= 8.5 Hz, Ar), 7.67-7.60 (m, 3H, Ar); ¹³C NMR (150 MHz,DMSO-d₆) δ 166.9, 163.6, 153.0, 141.6, 132.4, 129.4, 127.9, 127.5, 127.0, 126.0, 121.0, 111.0; HRMS(MALDI- FTMS) C₁₄H₉NO₃ (MH⁺)에 의해 계산 240.0655, 실험 240.0656.

6-카복시-2-(3,5-디플루오로페닐)-벤족사졸 (15). 일반적 절차에 따라 4-아미노-3-하이드록시벤조익 산으로부터 제조되어 흰색 고체인 화합물 15를 얻었다 (10.3 mg, 19 %). 15에 대한 데이터: ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ 13.22 (br. s, 1H, C0₂H), 8.20 (ABM, 1H, J= 1.5 Hz, Ar), 7.98 (ABM, 1H, J= 1.5, 8.2 Hz, Ar), 7.86 (ABM, 1H, J= 8.2 Hz, Ar), 7.79-7.78 (m, 2H, Ar), 7.57 (tt, 1H, J= 2.4, 9.4 Hz, Ar); ¹³C NMR (150 MHz, DMSO-d₆) δ 166.7, 162.7 (d, J= 248 Hz), 162.6 (d, J= 248 Hz), 162.4, 150.0, 144.7, 129.0 (t, J= 11 Hz), 128.7, 126.5, 120.0, 112.1, 110.9 (d, J= 23 Hz), 110.8 (d, J= 22 Hz), 108.0 (t, J= 26 Hz); HRMS(MALDI-FTMS) C₁₄H₇F₂NO₃ (MH⁺)에 의해 계산 276.0467, 실험 276.0468.

6-카복시-2-(2,6-디플루오로페닐)-벤족사졸 (16). 일반적 절차에 따라 4-아미노-3-하이드록시벤조익 산으로부터 제조되어 흰색 고체인 화합물 16를 얻었다 (8.5 mg, 15 %). 16에 대한 데이터: ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ 13.25 (br. s, 1H, CO₂H), 8.30 (ABM, 1H, J= 0.6, 1.5 Hz, Ar), 8.04 (ABM, 1H, J= 1.5, 8.2 Hz, Ar), 7.96 (ABM, 1H, J= 0.6, 8.2 Hz, Ar), 7.76 (m, 1H, Ar), 7.39 (t, 2H, J= 8.8 Hz, Ar); ¹³C NMR (150 MHz, DMSO-d₆) δ 166.7, 160.4 (d, J= 257 Hz), 160.3 (d, J= 257 Hz), 156.6, 149.7, 144.2, 134.9 (t, J= 11 Hz), 128.8, 126.4, 120.1, 113.1, 112.9, 112.2 (d, J= 5 Hz), 105.0 (d, J= 16 Hz); HRMS(MALDI-FTMS) C₁₄H₇F₂NO₃ (MH⁺)에 의해 계산 276.0467, 실험 276.0466.

6-카복시-2-[(3-트리플루오로메틸)페닐]-벤족사졸 (17). 일반적 절차에 따라 4-아미노-3-하이드록시벤조익 산으로부터 제조되어 흰색 고체인 화합물 17를 얻었다 (7.1 mg, 12 %). 17에 대한 데이터: ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ 13.20 (br. s, 1H, CO₂H), 8.48 (ABX, 1H, J= 7.9 Hz, Ar), 8.41 (s, 1H, Ar), 8.28 (ABM, 1H, J= 1.5 Hz, Ar), 8.03 (ABX, 1H, J= 7.9 Hz, Ar), 8.02 (ABM, 1H, J= 1.5, 8.2 Hz, Ar), 7.90 (ABM, 1H, J= 8.2 Hz, Ar), 7.86 (ABX, 1H, J= 7.9 Hz, Ar); ¹³C NMR (150 MHz, DMSO-d₆) δ 168.0, 164.6, 151.4, 146.2, 132.8, 132.2, 131.4 (q, J= 32 Hz), 130.2, 129.8, 128.4, 127.8, 125.2, 125.0 (q, J= 272 Hz), 121.2, 113.6; HRMS(MALDI-FTMS) C₁₅H₈F₃NO₃ (MH⁺)에 의해 계산 308.0529, 실험 308.0531.

6-카복시-2-[(2-트리플루오로메틸)페닐]-벤족사졸 (18). 일반적 절차에 따라 4-아미노-3-하이드록시벤조익 산으로부터 제조되어 흰색 고체인 화합물 18를 얻었다 (6.6 mg, 11 %). 18에 대한 데이터: ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ 13.22 (br. s, 1H, CO₂H), 8.30 (ABX, 1H, J= 0.6, 1.5 Hz, Ar), 8.20 (d, 1H, J= 7.3 Hz, Ar), 8.06 (ABX, 1H, J= 1.5, 8.2 Hz, Ar), 8.04 (d, 1H, J= 7.9 Hz, Ar), 7.98 (ABM, 1H, J= 0.6, 8.2 Hz, Ar), 7.94 (t, 1H, J= 7.3 Hz, Ar), 7.90 (t, 1H, J= 7.9 Hz, Ar); ¹³C NMR (150 MHz, DMSO-d₆) δ 168.0, 164.0, 151.6, 145.9, 133.8, 130.0, 129.0 (q, J= 32 Hz), 128.6 (q, J= 6), 127.7, 126.0, 124.7 (q, J= 273 Hz), 121.6, 113.6; HRMS(MALDI-FTMS) C₁₅H₈F₃NO₃ (MH⁺)에 의해 계산 308.0529, 실험 308.0530.

6-카복시-2-(3,5-디클로로페닐)-벤족사졸 (19). 일반적 절차에 따라 4-아미노-3-하이드록시벤조익 산으로부터 제조되어 흰색 고체인 화합물 19를 얻었다 (6.0 mg, 10 %). 19에 대한 데이터: ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ 13.20 (br. s, 1H, CO₂H), 8.17 (ABX, 1H, J= 0.6, 1.5 Hz, Ar), 8.00 (AB, 1H, J= 2.0 Hz, Ar), 7.96 (ABX, 1H, J= 1.5, 8.5 Hz, Ar), 7.83 (AB, 1H, J= 2.0 Hz, Ar), 7.82 (ABX, 1H, J= 0.6, 8.5 Hz, Ar); ¹³C NMR (150 MHz, DMSO-d₆) δ 166.6, 161.9, 150.0, 144.6, 135.1, 131.6, 129.0, 128.7, 126.4, 125.8, 119.9, 112.1; HRMS (MALDI-FTMS) C₁₄H₇Cl₂NO₃ (MH⁺)에 의해 계산 307.9876, 실험 307.9879.

6-카복시-2-(2,6-디클로로페닐)-벤족사졸 (20). 일반적 절차에 따라 4-아미노-3-하이드록시벤조익 산으로부터 제조되어 흰색 고체인 화합물 20을 얻었다 (12.7 mg, 21 %). 20에 대한 데이터: ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ 13.27 (br. s, 1H, CO₂H), 8.38 (ABX, 1H, J= 0.5, 1.5 Hz, Ar), 8.09 (ABX, 1H, J= 1.5, 8.3 Hz, Ar), 8.02 (ABX, 1H, J= 8.3, 0.5 Hz, Ar), 7.78-7.71 (m, 3H, Ar); ¹³C NMR (125 MHz, DMSO-d₆) δ 166.6, 159.8, 150.0, 143.8, 134.8, 134.2, 129.1, 128.8, 126.4, 126.3, 120.4, 112.6; HRMS (MALDI-FTMS) C₁₄H₇Cl₂NO₃ (MH⁺)에 의해 계산 307.9876, 실험 307.9877.

6-카복시-2-페닐-벤족사졸 (21). 일반적 절차에 따라 4-아미노-3-하이드록시벤조익 산으로부터 제조되어 흰색 고체인 화합물 21을 얻었다 (7.0 mg, 15 %). 21에 대한 데이터: ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ 13.16 (br. s, 1H, CO₂H), 8.27 (d, 1H, J= 0.9 Hz, Ar), 8.25-8.22 (m, 2H, Ar), 8.01 (dd, 1H, J= 1.5, 8.5 Hz, Ar), 7.89 (d, 1H, J= 8.5 Hz, Ar), 7.69-7.62 (m, 3H, Ar); ¹³C NMR (150 MHz, DMSO-d₆) δ 166.8, 164.7, 150.0, 145.2, 132.6, 129.4, 128.0, 127.6, 126.3, 126.0, 119.6, 112.0; HRMS (MALDI-FTMS) C₁₄H₉N0₃ (MH⁺)에 의해 계산 240.0655, 실험 240.0655.

7-카복시-2-(3,5-디플루오로페닐)-벤족사졸 (22). 일반적 절차에 따라 3-아미노실리실릭 산으로부터 제조되어 흰색 고체인 화합물 22를 얻었다 (8.8 mg, 16 %). 22에 대한 데이터: ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ 13.55 (br. s, C0₂H), 8.10 (AMX, 1H, J=1.2, 7.9 Hz, Ar), 7.97 (AMX, 1H, J= 1.2, 7.9 Hz, Ar), 7.80-7.79 (m, 2H, Ar), 7.63 (tt, 1H, J= 2.4, 9.2 Hz, Ar), 7.55 (AMX, 1H, J= 7.9 Hz, Ar); ¹³C NMR (150 MHz, DMSO-d₆) δ 164.5, 162.8 (d, J= 248 Hz), 162.6 (d, J= 248 Hz), 160.9, 149.2, 142.6, 129.2, 128.0, 125.2, 124.9, 116.1, 110.6 (d, J= 28 Hz), 107.7 (q, J= 25 Hz); HRMS (MALDI-FTMS) C₁₄H₇F₂NO₃ (MH⁺)에 의해 계산 276.0467, 실험 276.0469.

7-카복시-2-(2,6-디플루오로페닐)-벤족사졸 (23). 일반적 절차에 따라 3-아미노실리실릭 산으로부터 제조되어 흰색 고체인 화합물 23을 얻었다 (7.3 mg, 13 %). 23에 대한 데이터: ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ 13.48 (br. s, 1H, CO₂H), 8.16 (ABX, 1H, J= 1.2, 8.2 Hz, Ar), 8.00 (ABX, 1H, J= 1.2, 7.6 Hz, Ar), 7.78 (m, 1H, Ar), 7.57 (ABX, 1H, J= 7.6, 8.2 Hz, Ar), 7.40 (t, 2H, J= 8.5 Hz, Ar); ¹³C NMR (150 MHz, DMSO-d₆) δ 164.5, 160.4 (d, J= 256 Hz), 160.3 (d, J= 257 Hz), 154.9, 148.9, 142.1, 134.8 (t, J= 10 Hz), 128.0, 125.1, 125.0, 116.0, 113.0 (d, J= 22 Hz), 112.9 (q, J= 21 Hz), 105.1 (t, J= 17 Hz); HRMS (MALDI-FTMS) C₁₄H₇F₂NO₃ (MH⁺)에 의해 계산 276.0467, 실험 276.0467.

7-카복시-2-[(3-트리플루오로메틸)페닐]-벤족사졸 (24). 일반적 절차에 따라 3-아미노살릭실릭 산으로부터 제조되어 흰색 고체인 화합물 24를 얻었다 (7.9 mg, 13 %). 24에 대한 데이터: ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ 13.51 (br. s, CO₂H), 8.48 (ABX, 1H, J= 8.2 Hz, Ar), 8.40 (s, 1H, Ar), 8.10 (AMX, 1H, J= 1.2, 7.9 Hz, Ar), 8.05 (ABX, 1H, J= 7.9 Hz, Ar), 7.96 (AMX, 1H, J= 1.2, 7.6 Hz, Ar), 7.94 (ABX, 1H, J= 7.9 Hz, Ar), 7.54 (AMX, 1H, J= 7.9, 7.6 Hz, Ar); ¹³C NMR (150 MHz, DMSO-d₆) δ 164.6, 161.7, 149.3, 142.7, 131.3, 131.0, 130.0 (q, J= 32 Hz), 128.6 (d, J= 3 Hz), 127.7, 127.2, 125.0, 124.8, 123.7 (q, J= 272 Hz), 123.5, 116.0; HRMS(MALDI-FTMS) C₁₅H₈F₃NO₃ (MH⁺)에 의해 계산 308.0529, 실험 308.0532.

7-카복시-2-[(2-트리플루오로메틸)페닐]-벤족사졸 (25). 일반적 절차에 따라 3-아미노살릭실릭 산으로부터 제조되어 흰색 고체인 화합물 25를 얻었다 (3.8 mg, 22 %). 25에 대한 데이터: ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ 13.46 (br. s, 1H, CO₂H), 8.18 (d, 1H, J= 7.6 Hz, Ar), 8.14 (AMX, 1H, J= 1.2, 7.9 Hz, Ar), 8.03 (d, 1H, J= 7.9 Hz, Ar), 7.98 (AMX, 1H, J= 1.2, 7.6 Hz, Ar), 7.94 (t, 1H, J= 7.3 Hz, Ar), 7.89 (t, 1H, J= 7.6 Hz, Ar), 7.56 (AMX, 1H, J= 7.9 Hz, Ar); ¹³C NMR (150 MHz, DMSO-d₆) δ 164.6, 161.1, 149.3, 142.4, 133.0, 132.4, 132.2, 127.8, 127.6, 127.2 (q, J= 6 Hz), 125.0, 124.9, 123.4 (q, J= 273 Hz), 116.2; HRMS(MALDI-FTMS) C₁₅H₈F₃NO₃ (MH⁺)에 의해 계산 308.0529, 실험 308.0534.

7-카복시-2-(3,5-디클로로페닐)-벤족사졸 (26). 일반적 절차에 따라 3-아미노살릭실릭 산으로부터 제조되어 흰색 고체인 화합물 26를 얻었다 (7.0 mg, 11 %). 26에 대한 데이터: ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ 14.00-12.80 (br. s, CO₂H), 8.10-8.08 (m, 3H, Ar), 7.98-7.96 (m, 2H, Ar), 7.55 (t, 1H, J= 7.8 Hz, Ar); ¹³C NMR (150 MHz, DMSO-d₆) δ 164.5, 160.5, 149.2, 142.6, 135.2, 131.5, 129.4, 128.0, 125.6, 125.2, 124.8, 116.2; HRMS(MALDI-FTMS) C₁₄H₇Cl₂NO₃ (MH⁺)에 의해 계산 307.9876, 실험 307.9874.

7-카복시-2-(2,6-디클로로페닐)-벤족사졸 (27). 일반적 절차에 따라 3-아미노살릭실릭 산으로부터 제조되어 흰색 고체인 화합물 27를 얻었다 (10.3 mg, 17 %). 27에 대한 데이터: ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ 13.90-13.10 (br. s, CO₂H), 8.16 (AMX, 1H, J= 7.9 Hz, Ar), 8.02 (AMX, 1H, J= 7.9 Hz, Ar), 7.78-7.72 (m, 3H, Ar), 7.60 (AMX, 1H, J= 7.9 Hz, Ar); ¹³C NMR (150 MHz, DMSO-d₆) δ 164.4, 158.3, 149.1, 141.7, 134.9, 134.2, 128.8, 128.2, 126.5, 125.3, 125.2, 116.2; HRMS (MALDI-FTMS) C₁₄H₇Cl₂N0₃ (MH⁺)에 의해 계산 307.9876, 실험 307.9875.

7-카복시-2-페닐-벤족사졸 (28). 일반적 절차에 따라 3-아미노살릭실릭 산으로부터 제조되어 흰색 고체인 화합물 28를 얻었다 (13.1 mg, 27 %). 28에 대한 데이터: ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ 13.48 (br. s, 1H, CO₂H), 8.20-8.19 (m, 2H, Ar), 8.05 (AMX, 1H, J= 1.2, 7.9 Hz, Ar), 7.92 (AMX, 1H, J= 1.2, 7.6 Hz, Ar), 7.66-7.62 (m, 3H, Ar), 7.50 (AMX, 1H, J= 7.9 Hz, Ar); ¹³C NMR (150 MHz, DMSO-d₆) δ 164.8, 163.1, 149.2, 142.9, 132.2, 129.4, 127.4, 127.2, 126.0, 124.7, 124.4, 115.8; HRMS (MALDI-FTMS) C_l4H₉NO₃ (MH⁺)에 의해 계산 240.0655, 실험 240.0656.

다른 실시예들

본 발명은 그의 상세한 설명과 연관되어 설명되었지만, 앞선 설명들은 예시적으로 의도된 것이며 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도된 것이 아니라는 것이 이해되어야 한다. 본 발명의 다른 측면, 이점, 및 변형들은 아래에 설명되는 특허청구범위 내에 존재한다.

Claims (106)

1. 후보 화합물로 트란스타이레틴 테트라머를 접촉하는 단계; 및

   상기 후보 화합물이 트란스타이레틴 테트라머의 해리와 관련된 활성화 에너지를 증가시켜 트란스타이레틴 테트라머의 해리를 저해 또는 감소하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는

   트란스타이레틴(transthyretin) 테트라머의 해리를 예방 또는 감소시키는 화합물 검색 방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 화합물이 트란스타이레틴 테트라머의 해리 전이 상태를 불안정화하여 트란스타이레틴 테트라머의 해리를 저해하는지를 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1항에 있어서, 상기 화합물이 트란스타이레틴 테트라머의 안정화에 의하여 트란스타이레틴 테트라머의 해리를 저해하는지를 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1항에 있어서, 소섬유(fibril) 형성을 저해하는 후보 화합물의 능력을 측정하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트란스타이레틴 테트라머는 야생형 트란스타이레틴을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트란스타이레틴 테트라머는 자연 발생적 트란스타이레틴 돌연변이체인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 6항에 있어서, 상기 트란스타이레틴 테트라머는 가족성 아밀로이드 다발신경병증(polyneuropathy)의 발생과 원인적으로(causally) 관련된 자연 발생적 트란스타이레틴 돌연변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 6항에 있어서, 상기 트란스타이레틴 테트라머는 가족성 아밀로이드 심근병증의 발생과 원인적으로 관련된 자연 발생적 트란스타이레틴 돌연변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트란스타이레틴 테트라머는 트란스타이레틴 돌연변이체 V122I를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트란스타이레틴 테트라머는 트란스타이레틴 돌연변이체 V30M을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트란스타이레틴 테트라머는 트란스타이레틴 돌연변이체 L55P를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 후보 화합물은 소 분자(small molecule)인 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 후보 화합물은 디푸루니살(diflunisal) 유사체(analog)인 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제 13항에 있어서, 상기 디푸루니살(diflunisal) 유사체는 디푸루니살과 비교하여 감소된 NSAID 활성을 가지거나 NSAID 활성이 없는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제 13항에 있어서, 상기 디푸루니살(diflunisal) 유사체는 디푸루니살과 비교하여 감소된 사이클로옥시겐네이즈 저해제 활성을 가지거나 사이클로옥시겐네이즈 저해제 활성이 없는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제 13항에 있어서, 상기 디푸루니살(diflunisal) 유사체가 NSAID 활성을 나타내는지를 결정하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제 13항에 있어서, 상기 디푸루니살(diflunisal) 유사체가 사이클로옥시겐네이즈 저해제 활성을 나타내는지를 결정하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 후보 화합물은 폴리염화 바이페닐(biphenyl)인 것을 특징으로 하는 방법.
19. 제 18항에 있어서, 상기 폴리염화 바이페닐(biphenyl)은 수산화된(hydroxylated) 폴리염화 바이페닐(biphenyl)인 것을 특징으로 하는 방법.
20. 디푸루니살(diflunisal) 유사체(analog)를 포함하는 것을 특징으로 하는 트란스타이레틴 아밀로이드 질환의 치료용 약학 제제.
21. 제 20항에 있어서, 상기 디푸루니살(diflunisal) 유사체는 트란스타이레틴 테트라머의 해리를 저해하는 것을 특징으로 하는 약학 제제.
22. 제 20항 또는 제 21항에 있어서, 상기 디푸루니살 유사체는 디푸루니살과 비교하여 감소된 NSAID 활성을 가지거나 NSAID 활성이 없는 것을 특징으로 하는 약학 제제.
23. 제 20항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 디푸루니살 유사체는 디푸루니살과 비교하여 감소된 사이클로옥시겐네이즈 저해제 활성을 가지거나 사이클로옥시겐네이즈 저해제 활성이 없는 것을 특징으로 하는 약학 제제.
24. 제 20항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트란스타이레틴 아밀로이드 질환은 가족성 아밀로이드 다발신경병증인 것을 특징으로 하는 약학 제제.
25. 제 20항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트란스타이레틴 아밀로이드 질환은 가족성 아밀로이드 심근병증인 것을 특징으로 하는 약학 제제.
26. 제 20항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트란스타이레틴 아밀로이드 질환은 노인성 전신 아밀로이드증인 것을 특징으로 하는 약학 제제.
27. 제 20항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트란스타이레틴 아밀로이드 질환은 간 이식 후의 심장 아밀로이드증(cardiac amyloidosis)인 것을 특징으로 하는 약학 제제.
28. 폴리염화 바이페닐(biphenyl)을 포함하는 것을 특징으로 하는 트란스타이레틴 아밀로이드 질환의 치료용 약학 제제.
29. 제 28항에 있어서, 상기 폴리염화 바이페닐은 트란스타이레틴 테트라머의 해리를 저해하는 것을 특징으로 하는 약학 제제.
30. 제 28항 또는 제 29항에 있어서, 상기 폴리염화 바이페닐은 트란스타이레틴 테트라머의 자연 상태의 운동학적 안정화에 의하여 트란스타이레틴 테트라머의 해리를 저해하는 것을 특징으로 하는 약학 제제.
31. 제 28항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리염화 바이페닐은 수산화된(hydroxylated) 폴리염화 바이페닐인 것을 특징으로 하는 약학 제제.
32. 제 28항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트란스타이레틴 아밀로이드 질환은 가족성 아밀로이드 다발신경병증인 것을 특징으로 하는 약학 제제.
33. 제 28항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트란스타이레틴 아밀로이드 질환은 가족성 아밀로이드 심근병증인 것을 특징으로 하는 약학 제제.
34. 제 28항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트란스타이레틴 아밀로이드 질환은 노인성 전신 아밀로이드증인 것을 특징으로 하는 약학 제제.
35. 제 28항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트란스타이레틴 아밀로이드 질환은 간 이식 후의 심장 아밀로이드증(cardiac amyloidosis)인 것을 특징으로 하는 약학 제제.
36. 디푸루니살(diflunisal) 250 mg을 포함하는 것을 특징으로 하는 트란스타이레틴 아밀로이드 질환의 치료용 약학 제제.
37. 제 36항에 있어서, 상기 트란스타이레틴 아밀로이드 질환은 가족성 아밀로이드 다발신경병증인 것을 특징으로 하는 약학 제제.
38. 제 36항에 있어서, 상기 트란스타이레틴 아밀로이드 질환은 가족성 아밀로이드 심근병증인 것을 특징으로 하는 약학 제제.
39. 제 36항에 있어서, 상기 트란스타이레틴 아밀로이드 질환은 노인성 전신 아밀로이드증인 것을 특징으로 하는 약학 제제.
40. 제 36항에 있어서, 상기 트란스타이레틴 아밀로이드 질환은 간 이식 후의 심장 아밀로이드증(cardiac amyloidosis)인 것을 특징으로 하는 약학 제제.
41. Ar이 3,5-디플루오로페닐(difluorophenyl), 2,6-디플루오로페닐, 3,5-디클로로페닐, 2,6-디클로로페닐, 2-(트리플루오로메틸)페닐 또는 3-(트리플루오로메틸)페닐인 하기 화학식의 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염.

    
42. 제 41항에 있어서, 상기 화합물은

    4-카르복시-2-(3,5-디플루오로페닐)-벤족사졸(benzoxazole);

    4-카르복시-2-(2,6-디플루오로페닐)-벤족사졸;

    4-카르복시-2-[(3-트리플루오로메틸)페닐]-벤족사졸;

    4-카르복시-2-[(2-트리플루오로메틸)페닐]-벤족사졸;

    4-카르복시-2-(3,5-디클로로페닐)-벤족사졸;

    4-카르복시-2-(2,6-디클로로페닐)-벤족사졸;

    5-카르복시-2-(3,5-디플루오로페닐)-벤족사졸;

    5-카르복시-2-(2,6-디플루오로페닐)-벤족사졸;

    5-카르복시-2-[(3-트리플루오로메틸)페닐]-벤족사졸;

    5-카르복시-2-[(2-트리플루오로메틸)페닐]-벤족사졸;

    5-카르복시-2-(3,5-디클로로페닐)-벤족사졸;

    5-카르복시-2-(2,6-디클로로페닐)-벤족사졸;

    6-카르복시-2-(3,5-디플루오로페닐)-벤족사졸;

    6-카르복시-2-(2,6-디플루오로페닐)-벤족사졸;

    6-카르복시-2-[(3-트리플루오로메틸)페닐]-벤족사졸;

    6-카르복시-2-[(2-트리플루오로메틸)페닐]-벤족사졸;

    6-카르복시-2-(3,5-디클로로페닐)-벤족사졸;

    6-카르복시-2-(2,6-디클로로페닐)-벤족사졸;

    7-카르복시-2-(3,5-디플루오로페닐)-벤족사졸;

    7-카르복시-2-(2,6-디플루오로페닐)-벤족사졸;

    7-카르복시-2-[(3-트리플루오로메틸)페닐]-벤족사졸;

    7-카르복시-2-[(2-트리플루오로메틸)페닐]-벤족사졸;

    7-카르복시-2-(3,5-디클로로페닐)-벤족사졸; 또는

    7-카르복시-2-(2,6-디클로로페닐)-벤족사졸인

    것을 특징으로 하는 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염.
43. 제 41항에 있어서, 상기 화합물은 4-카르복시-2-(3,5-디플루오로페닐)-벤족사졸인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염.
44. 제 41항에 있어서, 상기 화합물은 4-카르복시-2-(2,6-디플루오로페닐)-벤족사졸인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염.
45. 제 41항에 있어서, 상기 화합물은 4-카르복시-2-[(3-트리플루오로메틸)페닐]-벤족사졸인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염.
46. 제 41항에 있어서, 상기 화합물은 4-카르복시-2-[(2-트리플루오로메틸)페닐]-벤족사졸인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염.
47. 제 41항에 있어서, 상기 화합물은 4-카르복시-2-(3,5-디클로로페닐)-벤족사졸인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염.
48. 제 41항에 있어서, 상기 화합물은 4-카르복시-2-(2,6-디클로로페닐)-벤족사졸인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염.
49. 제 41항에 있어서, 상기 화합물은 5-카르복시-2-(3,5-디플루오로페닐)-벤족사졸인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염.
50. 제 41항에 있어서, 상기 화합물은 5-카르복시-2-(2,6-디플루오로페닐)-벤족사졸인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염.
51. 제 41항에 있어서, 상기 화합물은 5-카르복시-2-[(3-트리플루오로메틸)페닐]-벤족사졸인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염.
52. 제 41항에 있어서, 상기 화합물은 5-카르복시-2-[(2-트리플루오로메틸)페닐]-벤족사졸인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염.
53. 제 41항에 있어서, 상기 화합물은 5-카르복시-2-(3,5-디클로로페닐)-벤족사졸인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염.
54. 제 41항에 있어서, 상기 화합물은 5-카르복시-2-(2,6-디클로로페닐)-벤족사졸인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염.
55. 제 41항에 있어서, 상기 화합물은 6-카르복시-2-(3,5-디플루오로페닐)-벤족사졸인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염.
56. 제 41항에 있어서, 상기 화합물은 6-카르복시-2-(2,6-디플루오로페닐)-벤족사졸인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염.
57. 제 41항에 있어서, 상기 화합물은 6-카르복시-2-[(3-트리플루오로메틸)페닐]-벤족사졸인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염.
58. 제 41항에 있어서, 상기 화합물은 6-카르복시-2-[(2-트리플루오로메틸)페닐]-벤족사졸인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염.
59. 제 41항에 있어서, 상기 화합물은 6-카르복시-2-(3,5-디클로로페닐)-벤족사졸인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염.
60. 제 41항에 있어서, 상기 화합물은 6-카르복시-2-(2,6-디클로로페닐)-벤족사졸인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염.
61. 제 41항에 있어서, 상기 화합물은 7-카르복시-2-(3,5-디플루오로페닐)-벤족사졸인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염.
62. 제 41항에 있어서, 상기 화합물은 7-카르복시-2-(2,6-디플루오로페닐)-벤족사졸인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염.
63. 제 41항에 있어서, 상기 화합물은 7-카르복시-2-[(3-트리플루오로메틸)페닐]-벤족사졸인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염.
64. 제 41항에 있어서, 상기 화합물은 7-카르복시-2-[(2-트리플루오로메틸)페닐]-벤족사졸인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염.
65. 제 41항에 있어서, 상기 화합물은 7-카르복시-2-(3,5-디클로로페닐)-벤족사졸인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염.
66. 제 41항에 있어서, 상기 화합물은 7-카르복시-2-(2,6-디클로로페닐)-벤족사졸인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염.
67. 제 41항 내지 제 66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적으로 수용가능한 염은 N-메틸-D-글루카민인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염.
68. 제 41항 내지 제 66항 중 어느 한 항의 화합물 및 약학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
69. 제 68항에 있어서, 상기 약학 조성물은 단일 용량(single dosage)으로 투여되도록 제제화된 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
70. Ar이 페닐, 3,5-디플루오로페닐(difluorophenyl), 2,6-디플루오로페닐, 3,5-디클로로페닐, 2,6-디클로로페닐, 2-(트리플루오로메틸)페닐 또는 3-(트리플루오로메틸)페닐인 하기 화학식의 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염을 포함하는 것을 특징으로 하는 트란스타이레틴 아밀로이드 질환의 치료용 약학 제제.

    
71. 제 70항에 있어서, 상기 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염은

    4-카르복시-2-(3,5-디플루오로페닐)-벤족사졸(benzoxazole);

    4-카르복시-2-(2,6-디플루오로페닐)-벤족사졸;

    4-카르복시-2-[(3-트리플루오로메틸)페닐]-벤족사졸;

    4-카르복시-2-[(2-트리플루오로메틸)페닐]-벤족사졸;

    4-카르복시-2-(3,5-디클로로페닐)-벤족사졸;

    4-카르복시-2-(2,6-디클로로페닐)-벤족사졸;

    4-카르복시-2-페닐-벤족사졸;

    5-카르복시-2-(3,5-디플루오로페닐)-벤족사졸;

    5-카르복시-2-(2,6-디플루오로페닐)-벤족사졸;

    5-카르복시-2-[(3-트리플루오로메틸)페닐]-벤족사졸;

    5-카르복시-2-[(2-트리플루오로메틸)페닐]-벤족사졸;

    5-카르복시-2-(3,5-디클로로페닐)-벤족사졸;

    5-카르복시-2-(2,6-디클로로페닐)-벤족사졸;

    5-카르복시-2-페닐-벤족사졸;

    6-카르복시-2-(3,5-디플루오로페닐)-벤족사졸;

    6-카르복시-2-(2,6-디플루오로페닐)-벤족사졸;

    6-카르복시-2-[(3-트리플루오로메틸)페닐]-벤족사졸;

    6-카르복시-2-[(2-트리플루오로메틸)페닐]-벤족사졸;

    6-카르복시-2-(3,5-디클로로페닐)-벤족사졸;

    6-카르복시-2-(2,6-디클로로페닐)-벤족사졸;

    6-카르복시-2-페닐-벤족사졸;

    7-카르복시-2-(3,5-디플루오로페닐)-벤족사졸;

    7-카르복시-2-(2,6-디플루오로페닐)-벤족사졸;

    7-카르복시-2-[(3-트리플루오로메틸)페닐]-벤족사졸;

    7-카르복시-2-[(2-트리플루오로메틸)페닐]-벤족사졸;

    7-카르복시-2-(3,5-디클로로페닐)-벤족사졸;

    7-카르복시-2-(2,6-디클로로페닐)-벤족사졸;

    7-카르복시-2-페닐-벤족사졸; 또는

    이들의 약학적으로 수용가능한 염인

    것을 특징으로 하는 약학 제제.
72. 제 70항에 있어서, 상기 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염은 4-카르복시-2-(3,5-디플루오로페닐)-벤족사졸 또는 그의 약학적으로 수용가능한 염인 것을 특징으로 하는 약학 제제.
73. 제 70항에 있어서, 상기 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염은 4-카르복시-2-(2,6-디플루오로페닐)-벤족사졸 또는 그의 약학적으로 수용가능한 염인 것을 특징으로 하는 약학 제제.
74. 제 70항에 있어서, 상기 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염은 4-카르복시-2-[(3-트리플루오로메틸)페닐]-벤족사졸 또는 그의 약학적으로 수용가능한 염인 것을 특징으로 하는 약학 제제.
75. 제 70항에 있어서, 상기 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염은 4-카르복시-2-[(2-트리플루오로메틸)페닐]-벤족사졸 또는 그의 약학적으로 수용가능한 염인 것을 특징으로 하는 약학 제제.
76. 제 70항에 있어서, 상기 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염은 4-카르복시-2-(3,5-디클로로페닐)-벤족사졸 또는 그의 약학적으로 수용가능한 염인 것을 특징으로 하는 약학 제제.
77. 제 70항에 있어서, 상기 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염은 4-카르복시-2-(2,6-디클로로페닐)-벤족사졸 또는 그의 약학적으로 수용가능한 염인 것을 특징으로 하는 약학 제제.
78. 제 70항에 있어서, 상기 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염은 4-카르복시-2-페닐-벤족사졸 또는 그의 약학적으로 수용가능한 염인 것을 특징으로 하는 약학 제제.
79. 제 70항에 있어서, 상기 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염은 5-카르복시-2-(3,5-디플루오로페닐)-벤족사졸 또는 그의 약학적으로 수용가능한 염인 것을 특징으로 하는 약학 제제.
80. 제 70항에 있어서, 상기 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염은 5-카르복시-2-(2,6-디플루오로페닐)-벤족사졸 또는 그의 약학적으로 수용가능한 염인 것을 특징으로 하는 약학 제제.
81. 제 70항에 있어서, 상기 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염은 5-카르복시-2-[(3-트리플루오로메틸)페닐]-벤족사졸 또는 그의 약학적으로 수용가능한 염인 것을 특징으로 하는 약학 제제.
82. 제 70항에 있어서, 상기 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염은 5-카르복시-2-[(2-트리플루오로메틸)페닐]-벤족사졸 또는 그의 약학적으로 수용가능한 염인 것을 특징으로 하는 약학 제제.
83. 제 70항에 있어서, 상기 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염은 5-카르복시-2-(3,5-디클로로페닐)-벤족사졸 또는 그의 약학적으로 수용가능한 염인 것을 특징으로 하는 약학 제제.
84. 제 70항에 있어서, 상기 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염은 5-카르복시-2-(2,6-디클로로페닐)-벤족사졸 또는 그의 약학적으로 수용가능한 염인 것을 특징으로 하는 약학 제제.
85. 제 70항에 있어서, 상기 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염은 5-카르복시-2-페닐-벤족사졸 또는 그의 약학적으로 수용가능한 염인 것을 특징으로 하는 약학 제제.
86. 제 70항에 있어서, 상기 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염은 6-카르복시-2-(3,5-디플루오로페닐)-벤족사졸 또는 그의 약학적으로 수용가능한 염인 것을 특징으로 하는 약학 제제.
87. 제 70항에 있어서, 상기 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염은 6-카르복시-2-(2,6-디플루오로페닐)-벤족사졸 또는 그의 약학적으로 수용가능한 염인 것을 특징으로 하는 약학 제제.
88. 제 70항에 있어서, 상기 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염은 6-카르복시-2-[(3-트리플루오로메틸)페닐]-벤족사졸 또는 그의 약학적으로 수용가능한 염인 것을 특징으로 하는 약학 제제.
89. 제 70항에 있어서, 상기 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염은 6-카르복시-2-[(2-트리플루오로메틸)페닐]-벤족사졸 또는 그의 약학적으로 수용가능한 염인 것을 특징으로 하는 약학 제제.
90. 제 70항에 있어서, 상기 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염은 6-카르복시-2-(3,5-디클로로페닐)-벤족사졸 또는 그의 약학적으로 수용가능한 염인 것을 특징으로 하는 약학 제제.
91. 제 70항에 있어서, 상기 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염은 6-카르복시-2-(2,6-디클로로페닐)-벤족사졸 또는 그의 약학적으로 수용가능한 염인 것을 특징으로 하는 약학 제제.
92. 제 70항에 있어서, 상기 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염은 6-카르복시-2-페닐-벤족사졸 또는 그의 약학적으로 수용가능한 염인 것을 특징으로 하는 약학 제제.
93. 제 70항에 있어서, 상기 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염은 7-카르복시-2-(3,5-디플루오로페닐)-벤족사졸 또는 그의 약학적으로 수용가능한 염인 것을 특징으로 하는 약학 제제.
94. 제 70항에 있어서, 상기 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염은 7-카르복시-2-(2,6-디플루오로페닐)-벤족사졸 또는 그의 약학적으로 수용가능한 염인 것을 특징으로 하는 약학 제제.
95. 제 70항에 있어서, 상기 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염은 7-카르복시-2-[(3-트리플루오로메틸)페닐]-벤족사졸 또는 그의 약학적으로 수용가능한 염인 것을 특징으로 하는 약학 제제.
96. 제 70항에 있어서, 상기 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염은 7-카르복시-2-[(2-트리플루오로메틸)페닐]-벤족사졸 또는 그의 약학적으로 수용가능한 염인 것을 특징으로 하는 약학 제제.
97. 제 70항에 있어서, 상기 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염은 7-카르복시-2-(3,5-디클로로페닐)-벤족사졸 또는 그의 약학적으로 수용가능한 염인 것을 특징으로 하는 약학 제제.
98. 제 70항에 있어서, 상기 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염은 7-카르복시-2-(2,6-디클로로페닐)-벤족사졸 또는 그의 약학적으로 수용가능한 염인 것을 특징으로 하는 약학 제제.
99. 제 70항에 있어서, 상기 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염은 7-카르복시-2-페닐-벤족사졸 또는 그의 약학적으로 수용가능한 염인 것을 특징으로 하는 약학 제제.
100. 제 70항 내지 제 99항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적으로 수용가능한 염은 N-메틸-D-글루카민인 것을 특징으로 하는 약학 제제.
101. 제 70항 내지 제 99항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트란스타이레틴 아밀로이드 질환은 가족성 아밀로이드 다발신경병증, 가족성 아밀로이드 심근병증, 노인성 전신 아밀로이드증 또는 간 이식 후의 심장 아밀로이드증(cardiac amyloidosis)인 것을 특징으로 하는 약학 제제.
102. 제 70항 내지 제 99항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트란스타이레틴 아밀로이드 질환은 가족성 아밀로이드 다발신경병증인 것을 특징으로 하는 약학 제제.
103. 제 70항 내지 제 99항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트란스타이레틴 아밀로이드 질환은 가족성 아밀로이드 심근병증인 것을 특징으로 하는 약학 제제.
104. 제 70항 내지 제 99항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트란스타이레틴 아밀로이드 질환은 노인성 전신 아밀로이드증인 것을 특징으로 하는 약학 제제.
105. 제 70항 내지 제 99항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트란스타이레틴 아밀로이드 질환은 간 이식 후의 심장 아밀로이드증인 것을 특징으로 하는 약학 제제.
106. 제 41항 내지 제 66항 중 어느 한 항의 화합물을 조직 또는 생체액(biological fluid)에 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 조직 또는 생체액 내의 트란스타이레틴을 안정화하는 방법.

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