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CN110215740B - 一种两性离子亲水前处理硅胶材料的制备方法 - Google Patents

一种两性离子亲水前处理硅胶材料的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于分析化学领域，更具体地涉及一种两性离子亲水前处理硅胶材料的制备方法。具体步骤如下：(1)将功能单体4‑氰基苯甲酸与叠氮基修饰的硅胶溶于溶剂中，磁力搅拌混合均匀；(2)加入适量催化剂并在80℃温度下，恒温反应10‑70小时。反应结束以后，将产物采用砂芯漏斗抽滤，依次用10％EDTA二钠、水、甲醇进行冲洗。洗涤后产物干燥，即得本发明的两性离子亲水前处理硅胶材料。

Description

一种两性离子亲水前处理硅胶材料的制备方法
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体地涉及一种两性离子亲水前处理硅胶材料的制备方法。
背景技术
蛋白质糖基化(glycosylation)，是生物体内普遍存在、重要且复杂的蛋白质翻译后修饰行为，糖蛋白参与了许多关键的生物学进程。因此，对糖基化蛋白的研究和发展，不仅对生物体生理机制的深入研究具有重要意义，而且在疾病诊断或生物标志物的发现上也具有临床价值。但是，糖蛋白固有的低丰度、质谱检测信号响应低，以及在复杂的生物体系中非糖基化蛋白与糖基化蛋白的共存对糖蛋白有严重的离子抑制作用。因此，研究发展一个高效的富集策略对进行糖蛋白综合分析是必不可少的步骤。
目前得到广泛应用的富集方法包括凝集素亲和法、肼化学法、硼酸亲和法、以及亲水作用色谱法等。其中，亲水作用色谱法近年来在分离和富集糖蛋白方面得到越来越多的关注，它的作用机理是依靠被分析物在有机相和固定相表面的水层之间的分配作用实现分离。两性离子亲水作用色谱(ZIC-HILIC)是一种新兴的亲水作用色谱,在两性离子亲水固定相的表面一般同时存在着正电荷中心和负电荷中心，从而形成一个牢固的吸附水层[1]，增强了亲水性。同时，这两种带相反电荷基团的摩尔比例相同，净电荷几乎为零，不易产生自发聚合，且双电层可有效的避免硅羟基(基质)的死吸附[2]。因此，ZIC-HILIC在分离富集极性较大的物质时应用优势较为显著。
Cu(I)催化的叠氮基与端基炔的Huisgen1,3-偶极环加成反应(CuAAC)是点击化学中最精华的部分，在材料和表面科学及生物学领域都有广泛的用途[3,4]。我们课题组曾经将点击化学(ClickChemistry)用于合成硅胶基质的色谱固定相，相应的文章发表在国际知名期刊上(Journal of Chromatography A 2009,1216:257-263；ChemicalCommunications 2007,2491-2493；Chemical Communications 2006,4512-4514；Analytical and Bioanalytical Chemistry,2011，399，3359-3365；Talanta,78(2009)916-921；Journal of separation science,33:9(2010)1224-1230；Analytical Method,2012，4,1244-1251)。这些方法采用的均是铜催化的点击化学反应，虽然得到较高的反应效率，但是反应过程中引入铜这个重金属，会给色谱分离带来影响，因此有必要加以改进。研究一种新型无毒、稳定、高转化率的催化剂对点击化学在药物和生物研究领域的应用尤为重要[5,6]。利用醋酸亚铁作为叠氮-氰基“点击”化学反应催化剂，将带有氰基的化合物固定到叠氮基修饰的硅胶表面的方法，不仅反应条件温和简单，而且稳定高效。此外，由于此合成反应能够生成1,4二取代四氮唑类化合物，能够给所制备的色谱分离材料提供阳离子作用力。当功能分子上带有其他阴离子时，会结合产生两性离子作用。因而相对可能会具有更高的富集选择性和富集效率。
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发明内容
本发明的目的是提供一种两性离子亲水前处理硅胶材料制备方法，具体步骤如下：
(1)将功能单体4-氰基苯甲酸与叠氮基修饰的硅胶溶于溶剂中，磁力搅拌混合均匀；
(2)加入适量催化剂并在80℃温度下，恒温反应10-70小时；所述催化剂为醋酸亚铁；
(3)反应结束以后，将产物采用砂芯漏斗抽滤，并分别用10％EDTA水溶液，水，甲醇进行冲洗；洗涤后产物干燥，即得两性离子亲水前处理硅胶材料。
在本发明的一个实施方案中，步骤1中所述的材料为叠氮基修饰的硅胶材料，为实验室自制，制备和表征方法均参照文献(Chemical Communications 2006,4512-4514)；溶剂为二甲基甲酰胺与甲醇的混合物。
在本发明的另一个实施方案中，所述二甲基甲酰胺与甲醇的重量比为10:1～3，优选为9:1。
在本发明的又一个实施方案中，4-氰基苯硼酸、叠氮基硅胶材料与溶剂的重量比为1：1～5：10～100，优选为1：2：60。
在本发明再一个实施方案中，步骤(2)中所述催化剂为醋酸亚铁，4-氰基苯甲酸与催化剂的重量比为10：1，反应温度优选为80℃，反应时间为48小时。
具体实施方式
下面将进一步的来举例说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。
实施例1
(1)氮气保护下，取4-氰基苯甲酸(0.5g，3.4mmol)加入到、二甲基甲酰胺与甲醇(体积比为9:1)混合溶液(20mL)体系中，(2)加入叠氮硅胶(1.0g,1.2mmol)摇匀形成混悬液。另加入醋酸亚铁(0.06g,0.35mmol)作为反应催化剂，氮气保护下于80℃条件冷凝回流并磁力搅拌48小时。
(3)反应完成以后，用砂芯漏斗抽滤，分别用10％EDTA水溶液(500ml)，水(1000ml)，甲醇(100ml)。洗涤后产物于真空干燥箱中干燥，即得两性离子亲水前处理硅胶材料。
实施例2
将实施例1制备的两性离子亲水前处理硅胶材料和分散溶液甲醇以一定比例(1:1.5，v:v)混合后超声分散5min，倒入40mL匀浆罐中，用填装机于60MPa将色谱填料装填于不锈钢管中(150mm×4.6mm)，并使用丙酮作为顶替液，顶替15min。制备出的色谱柱备用。
实施例3
以极性较强的鸟苷为分离对象，考察实施例2制备的两性离子亲水前处理硅胶材料的柱效。高效液相色谱条件为：进样体积2μL(标准品在50％甲醇水溶液的浓度为1mg/mL)，流速1.0mL/min，检测系统为紫外检测器，波长设定为280nm，色谱柱为实施例2所制备的两性离子亲水前处理硅胶材料柱(150mm×4.6mm，5μm)。流动相为95％乙腈水溶液，柱温为30℃。测量峰面积和保留时间，并计算柱效。
另外，本发明还设定了以下对比例，具体如下：
对比例1：溶剂中不添加甲醇，其他同实施例2；
对比例2：溶剂中二甲基甲酰胺与甲醇的重量比为10:0.5，其他同实施例2；
对比例3：4-氰基苯甲酸、叠氮基硅胶材料与溶剂的重量比为1：1：30，其他同实施例2；
对比例4：4-氰基苯甲酸、叠氮基硅胶材料与溶剂的重量比为1：1：10，其他同实施例2；
对比例5：催化剂为醋酸铁，其他同实施例2；
对比例6：催化剂为硫酸亚铁，其他同实施例2。
结果表明，实施例制备的两性离子亲水前处理硅胶材料的色谱行为，具体柱效及相同亲水条件下鸟苷的保留时间详见下表：
Figure BDA0002130872010000061
实施例4
进行糖肽选择性富集实验，采用基质辅助激光解吸(MALDI)质谱以辣根过氧化物酶(HRP)酶解物作为分离对象，进行糖肽选择性富集，富集条件为：称取两性离子亲水前处理硅胶材料(0.25mg)，用200μL的80％ACN溶液配制成1.25μg/μL的材料悬浮液。取50μL悬浮液和HRP酶解物混合，并加入200μL的98％ACN/1％TFA上样液，室温条件下涡旋并于摇床震荡孵化0.5h，离心后(13000r/min,10min)，弃去上清液。继续用上述上样液对材料清洗2次，每次200μL，以除去材料表面吸附的杂质。最后加入200μL的80％ACN/1％FA洗脱液对糖肽进行洗脱，室温下涡旋10min，13000r/min离心10min后保留上清液，冷冻干燥。用20μL的50％ACN/0.1％FA将冻干的样品溶解，用于Q-TOF质谱检测。
具体结果如下表显示
Figure BDA0002130872010000071
本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。

Claims (5)

1.一种两性离子亲水前处理硅胶材料的制备方法，具体步骤如下：
(1)将功能单体4-氰基苯甲酸与叠氮基修饰的硅胶溶于溶剂中，磁力搅拌混合均匀，其中，4-氰基苯甲酸、叠氮基修饰的硅胶与溶剂的重量比为1：1～5：10～100；
(2)加入适量催化剂并在80℃温度下，恒温反应10-70小时；所述催化剂为醋酸亚铁；
(3)反应结束以后，将产物采用砂芯漏斗抽滤，并分别用10％乙二胺四乙酸水溶液，水，甲醇进行冲洗；洗涤后产物干燥，即得两性离子亲水前处理硅胶材料。
2.根据权利要求1所述的一种两性离子亲水前处理硅胶材料的制备方法，其特征在于，步骤1中溶剂为二甲基甲酰胺与甲醇的混合物，二甲基甲酰胺与甲醇的重量比为10:1～3。
3.根据权利要求2所述的一种两性离子亲水前处理硅胶材料的制备方法，其特征在于，步骤1中溶剂为二甲基甲酰胺与甲醇的混合物，二甲基甲酰胺与甲醇的重量比为9:1。
4.根据权利要求1所述的一种两性离子亲水前处理硅胶材料的制备方法，其特征在于，步骤1中4-氰基苯甲酸、叠氮基修饰的硅胶与溶剂的重量比为1：2：60。
5.根据权利要求1所述的一种两性离子亲水前处理硅胶材料的制备方法，其特征在于4-氰基苯甲酸与催化剂的重量比为10：1，反应温度为80℃，反应时间为48小时。
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