BRPI0317463B1 - composto, composição farmacêutica compreendendo o mesmo e uso do referido composto no preparo de um medicamento para tratar uma doença amilóide de transtiretina - Google Patents

Abstract

"métodos de triar para um composto que evita ou reduz a dissolução de um tetrâmero de transtiretina e de tratar uma doença amilóide transtiretina". a estabilização cinética do estado nativo de transtiretina é um mecanismo eficaz para evitar a má duplicação de proteínas. porque a má duplicação de transtiretina desempenha um papel importante nas doenças amilóides transtiretinas, a inibição desta má duplicação pode ser usada como um tratamento eficaz ou profilaxia para estas doenças. os métodos de tratamento, métodos de triagem, assim como compostos estabilizando transtiretina específicos são descritos.

Description

"COMPOSTO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA COMPREENDENDO O MESMO E USO DO REFERIDO COMPOSTO NO PREPARO DE UM MEDICAMENTO PARA TRATAR UMA DOENÇA AMILÓIDE DE TRANSTIRETINA".

Referência Cruzada a Pedidos Relacionados [001] Este pedido reivindica a prioridade do Pedido Provisório U.S, N° 60/ 435, 070, depositado em 19 de dezembro de 2002, cujo conteúdo total é incorporado a este em sua totalidade, a título referencial.

Declaração Referente à Pesquisa Patrocinada pelo Governo Federal [002] Os fundos usados para auxiliar alguns dos estudos neste expostos foram providos pelo número de concessão NIH DK 46335 pelo National Institutes of Health. O Governo pode ter certos direitos na invenção.

Campo da Invenção [003] Esta invenção refere-se, de modo geral, ao mal dobra mento de proteína. De modo mais particular, esta invenção provê composições e métodos para a estabilização de transtiretina, à inibição do mal dobramento de transtiretina, e ao tratamento de doenças amilóídes associadas a esta.

Fundamentos da Invenção [004] A transtiretina (TTR) é uma proteína homotetramérica de 55 kDA, presente no soro e do fluido espinhal cerebral. A função da TTR é a de transportar L-tiroxina (T4) e a proteína de ligação holo- retinol (RBP). A TTR é uma de mais do que 20 proteínas amiloidogênicas não- homólogas, que podem ser transformadas em fibrilas e outros agregados, conduzindo à patologia de doença em seres humanos. Estas doenças não parecem ser causadas pela perda de função devido à agregação de proteína. Em vez disso, a agregação parece causar uma disfunção neuronal/celular através de um mecanismo, que ainda não está claro.

[005] Sob condições de desnaturação, a limitação da taxa de dissociação do tetrâmero de TTR do tipo selvagem e o mal dobramento do mo-nômero rápido permitem uma má formação em amilóide, causando putati-vamente a amíloídose sistêmica senil (SSA). A dissociação e o mal dobramento de um de mais do que oitenta variantes de TTR resulta na polí-neuropatia amilóide familial (FAP) e em cardiopatia amilóide familial (FAC).

[006] O tetrâmero de TTR possui dois sítios de ligação T4 simétricos C2. A ligação de T4 negativamente cooperativa é conhecida como estabilizando o tetrâmero de TTR e inibindo a formação da fibrila amilóide. Infelizmente, menos do que 1% da TTR possui uma ligação T4 a este no soro humano, devido ao fato de que a globulina de ligação de tireóide (TBG) possuí uma maior afinidade de magnitude para T4 em comparação com a TTR. Além disso a concentração de T4 no soro é relativamente baixa (0,1 μΜ), comparada àquela de TTR (2,6 - 7,2 PM).

Sumário da Invenção [007] A invenção é baseada, pelo menos em parte, verificou-se que a estabilização cinética do estado nativo de transtiretina inibe o mal dobramento da proteína. Esta verificação é importante devido à função que o mal dobramento da proteína desempenha em uma variedade de processos de doenças, incluindo as doenças amilóides de transtiretina. Através da inibição do mal dobramento de transtiretina, é possível intervir em uma tal doença, melhorar os sintomas, e/ ou, em alguns casos, evitar ou curar a doença, [008] A verificação de que a estabilização cinética do estado nativo de transtiretina inibe efetivamente o mal dobramento, possibilita o desenvolvimento de composições terapêuticas, potencial mente com alta especificidade e baixa toxicidade. Deste modo, embora os reagentes biarila exemplares, que possuem a capacidade de estabilizar trans- tiretina sejam aqui expostos, é possível projetar outros reagentes que estabilizem seletivamente a proteína. Por exemplo, como aqui descrito, é possível projetar e preparar bifenilas policloradas, análogos de diflunisal, ou benzoxazóis, que são altamente seletivos quanto à ligação à transtiretina e que estabilizam o estado nativo de transtiretina.

[009] Em um aspecto, a invenção é caracterizada por um método de triagem para um composto, que previne ou reduz a dissociação de um tetrâmero de transtiretina. O método pode incluir os seguintes estágios: contatar um tetrâmero de transtiretina com um composto candidato; e determinar se o composto candidato aumenta a energia de ativação associada com a dissociação do tetrâmero de transtiretina, deste modo prevenindo ou reduzindo a dissociação do tetrâmetro de transtiretina. O método pode opcionalmente incluir um estágio adicional de medição da capacidade do composto candidato para inibir a formação de fibrila.

[0010] Em uma modalidade, o método inclui um estágio de determinação de se o composto previne a dissociação do tetrâmero de transtiretina pela desestabilização do estado de transição de dissociação do tetrâmero de transtiretina. Em outra modalidade, o método inclui um estágio de determinação de se o composto previne a dissociação do tetrâmero de transtiretina pela estabilização do tetrâmero de transtiretina mais do que o estado de transição dissociativo.

[0011] O composto candidato usado em um tal método pode ser opcionalmente uma molécula pequena. Uma tal molécula pequena pode estabilizar o estado nativo de transtiretina através da ligação do tetrâmero, deste modo retardando a dissociação e a amiloidose sob condições de desnaturação e fisiológicas, através de um mecanismo de estabilização cinético. O composto exibe opcionalmente uma este-quiometria de ligação excedendo a 0,1 para TTR no sangue humano, quando administrado em uma concentração de 10,6 μΜ.

[0012] Uma molécula pequena pode opcionalmente ter um peso molecular de menos do que 1500 e ser ligada à transtiretina de modo não ou positivamente cooperativo e conferir uma energia de ligação de > 2,3 kcal/mol. A molécula pequena pode exibir Kd1 e Kd2 < 100 nM (por exemplo, < 10 nM) el ou uma alta concentração no plasma, ambos os quais contribuem para uma estabilização da proteína excedendo a 2,0 kcal/mol. A molécula pequena pode também diminuir o rendimento de amiloidose e diminuir a taxa de amiloidogênese mediada por ácido ou mediada por MeOH e/ ou diminuir a taxa de dissociação de TTR mediada por uréia.

[0013] Em algumas modalidades, a molécula pequena inclui bifenil aminas, bifenilas, éteres oxima, benzazóis ou outras estruturas compostas de dois anéis aromáticos, em que um contém grupos hidrofíli-cos, tais como um ácido e um fenol, e o outro contém grupos hidrofó-bicos, tais como halogênios ou alquilas.

[0014] Em uma modalidade, o composto candidato é um biarila, em que um anel contém um substituinte(s) hidrofílico(s) e o outro possui substituintes hidrofóbicos ou um biarila, em que ambos os anéis contêm pelo menos um substituinte hidrofílico. O grupo hidrofílico pode ser um fenol, um COOH, um álcool benzílico, um ácido borônico ou éster, um tetrazol, um aldeído ou um aldeído hidratado ou um grupo funcional, que serve ou como um doador de ligação H ou em receptor para a proteína, diretamente ou através de uma ligação H mediada por água. O biarila pode ser um biarila simétrico tendo ambos os anéis substituídos por funcionalidade hidrofílica incluindo fenóis, carboxilatos e álcoois e, em alguns casos, halogênios para o complemento das cavidades de ligação de halogênio em TTR, por exemplo, um biarila com a seguinte funcionalidade 3-CI, 4-OH, 5-CI e 3’CI, 4’-OH, 5’,Cl. Em uma modalidade, pelo menos um anel do biarila é substituído por 2,4-difluoro ou 3,5-difluoro ou 2,6-difluoro ou 3,5-difluoro ou 3-CI, 4-OH, 5- Cl ou 3-F, 4-OH, 5-F, 3- COOH, 4- OH ou substituintes 3-OH ou 3-COOH ou 4-COOH ou 3-CH20H ou 4-CH20H. Um biarila exemplar é uma bifenila policlorada, por exemplo, uma bifenila policlorada, em que pelo menos um anel contém substituintes OH e/ ou Cl, incluindo 3-CI, 4-OH, 5-CI ou 2-CI, 3-CI, 4-OH, 5-CL ou 3,4-DiCI, ou 2, 3, 4-tricloro ou 2,3,4,5-tetracloro. Halogênios diferentes de cloreto podem ser usados no composto candidato. O composto candidato pode ser um benzoxa-zol.

[0015] Em uma modalidade, o composto candidato é um análogo de diflunisal. A estrutura de diflunisal, assim como uma variedade de análogos de diflunisal são aqui descritos. O análogo de diflunisal pode opcionalmente ter atividade de NSAID reduzida ou ausente, quando comparado a diflunisal. Por exemplo, o análogo de diflunisal pode ter atividade de inibidor de ciclooxigenase reduzida ou ausente, quando comparado a diflunisal.

[0016] Em uma modalidade, o método inclui um estágio adicional de determinação de se o análogo de diflunisal exibe atividade de NSAID. Por exemplo, o método pode incluir um estágio de determinação de se o análogo de diflunisal exibe atividade de inibidor de ciclooxigenase.

[0017] A transtiretina usada nos métodos de triagem deverá ser transtiretina do tipo selvagem ou uma transtiretina mutante, tal como uma transtiretina mutante de ocorrência natural, casualmente associada com a incidência de uma doença amilóide de transtiretina, tal como polineuropatia amilóide familial ou cardiomiopatia amilóide familial. Transtiretinas mutantes de ocorrência natural exemplares incluem, mas não estão limitadas a, V122I, V30M, L55P (a nomenclatura mutante descreve a substituição em uma posição de aminoácido citada, relativa ao tipo selvagem; vide, por exemplo, Saraiva et al. (2001) Hum. Mut. 17: 493- 503).

[0018] Invenção provê métodos para a estabilização de transtireti-na em um tecido ou em um fluido biológico, e deste modo, inibindo o mal dobramento. De modo geral, o método compreende administrar ao tecido ou ao fluido biológico uma composição, que compreende uma quantidade estabilizadora de um composto aqui descrito, que se liga a transtiretina e que previne a dissociação do tetrâmero de transtiretina através da estabilização cinética do estado nativo do tetrâmero de transtiretina.

[0019] Deste modo, métodos que estabilizam transtiretina em um tecido doente melhoram o mal dobramento e diminuem os sintomas de uma doença associada e, dependendo da doença, podem contribuir para a cura da doença. A invenção contempla a inibição do mal dobramento de transtiretina em um tecido e/ ou no interior de uma célula. A extensão do mal dobramento, e portanto a extensão da inibição alcançada através dos presentes métodos, pode ser avaliada através de uma variedade de métodos, tais como descritos no Exemplos.

[0020] Assim sendo, em outro aspecto, a invenção inclui um método de tratamento de uma doença amilóide de transtiretina, o método compreendendo administrar a um paciente, diagnosticado como tendo uma doença amilóide de transtiretina, uma quantidade terapeutica-mente efetiva de um composto, que previne a dissociação de um te-trâmetro de transtiretina através da estabilização cinética do estado nativo do tetrâmero de transtiretina.

[0021] Em uma modalidade, a invenção é caracterizada por um método de tratamento de uma doença amilóide de transtiretina, o método compreendendo administrar a um paciente, diagnosticado como tendo uma doença amilóide de transtiretina, uma quantidade terapeuti-camente efetiva de um análogo de diflunisal (por exemplo, um análogo de diflunisal que evita a dissociação de um tetrâmero de transtiretina) que previne a dissociação de um tetrâmero de transtiretina. O análogo de diflunisal pode opcionalmente apresentar atividade de NSAID reduzida ou ausente (por exemplo, atividade de inibidor de ciclooxigenase) quando comparado a diflunisal.

[0022] Em outra modalidade, a invenção é caracterizada por um método de tratamento de uma doença amilóide de transtiretina, o método compreendendo administrar a um paciente, diagnosticado como tendo uma doença amilóide de transtiretina, uma quantidade terapeuti-camente efetiva de uma bifenila policlorada (por exemplo, uma bifenila policlorada que evita a dissociação de um tetrâmero de transtiretina) que previne a dissociação de um tetrâmero de transtiretina. A bifenila policlorada pode ser uma bifenila policlorada hidroxilada.

[0023] Em outra modalidade, a invenção é caracterizada por um método de tratamento de uma doença amilóide de transtiretina, o método compreendendo administrar a um paciente diagnosticado como tendo uma doença amilóide uma quantidade efetiva de um benzoxazol (por exemplo, um benzoxazol que evita a dissociação de um tetrâmero de transtiretina) que evita a dissociação de um tetrâmero de transtiretina.

[0024] A doença amilóide de transtiretina pode ser, por exemplo, polineuropatia amilóide familial, cardiopatia amilóide familial, ou ami-loidose sistêmica senil.

[0025] O paciente tratado pelos presentes métodos pode ser um paciente humano, embora esteja entendido que os princípios da invenção indicam que a invenção é eficaz com referência a mamíferos. Neste contexto, um “mamífero” é entendido como incluindo qualquer espécie de mamífero, nas quais o tratamento de doenças associadas com o mal dobramento de transtiretina seja desejável, em partículas espécies de mamíferos agrícolas e domésticos.

[0026] Os compostos aqui descritos (por exemplo, compostos bia-rila, tais como análogos de diflunisal, bifenilas policlorados, ou ben- zoxazóis) podem ser formulados com um farmaceuticamente aceitável para preparar uma composição farmacêutica, que compreenda o composto. Como aqui usados, os termos “farmaceuticamente aceitáveis”, “fisiologicamente toleráveis” e variações gramaticais dos mesmos, na medida em que se referem a composições, veículos, diluentes e rea-gentes, são usados de modo intercambiável, e representam que os materiais são capazes de administração a ou em um mamífero sem a produção de efeitos fisiológicos indesejáveis.

[0027] A invenção também abrange o uso de qualquer dos compostos ou composições farmacêuticas aqui descritos para o tratamento de uma doença amilóide de transtiretina (por exemplo, polineuropatia amilóide failial, cardiomiopatia amilóide familial, ou amiloidose sistêmica senil).

[0028] A invenção também abrange o uso de qualquer dos compostos ou composições farmacêuticas aqui descritos na manufatura de um medicamento para o tratamento de uma doença amilóide de transtiretina (por exemplo, polineuropatia amilóide familial, cardiomiopatia amilóide familial, ou amiloidose sistêmica senil).

[0029] Os compostos e métodos de tratamento aqui descritos proporcionam vantagens significativas em realçai às opções de tratamento correntemente disponíveis para a amiloidose de TTR. A amiloidose de TTR tipicamente conduz à morte em dez anos, ou até recentemente, era considerada incurável. O transplante de fígado é um meio eficaz de substituir o alelo associado à doença por um alelo WT em casos familiais, porque o fígado é tipicamente a fonte de TTR amiloide-gênica. Embora o transplante de fígado seja eficaz como uma forma de terapia genética, ele não ocorre sem problemas. O transplante é complicado pela necessidade de cirurgia invasiva, tanto para o receptor como para o doador, terapia imunossupressora pós- transplante de longo termo, falta de doadores, o seu alto custo, e o grande número de pacientes de amiloidose de TTR, que não são bons candidatos devido ao progresso da doença. Intelizmente, a amiloidose cardíaca progride em alguns pacientes familiais, mesmo após o transplante do fígado, porque a WT TTR continua a se depositar. Nem a deposição de TTR do sistema nervoso central (CNS) é minorada pelo transplante, devido à sua síntese pelo plexo coróide, O transplante não é também uma opção viável para a maioria das doenças de TTR prevalecentes, a amiloidose sistêmica senil afetando aproximadamente 25% daqueles acima da idade de 80, devido ã deposição de WT TTR.

[0030] A não ser que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui usados possuem o mesmo significado que co-mumente entendido por aquele de habilidade ordinária na arte à qual esta invenção pertence. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser usados na prática ou na verificação da presente invenção, os métodos e os materiais preferidos são descritos abaixo. Todas as publicações pedidos de patentes, patentes, e outras referências aqui mencionados são incorporados a este em sua totalidade. No caso de conflito, o presente pedido, incluindo as definições, terá o controle. Em adição, os materiais, métodos e exemplos serão apenas ilustrativos e não têm a intenção de ser limita-tivos.

[0031] Outras características e vantagens da presente invenção serão evidentes a partir da descrição detalhada que se segue, e a partir das reivindicações.

Breve Descricão dos Desenhos [0032] A figura 1 é um diagrama esquemático, que ilustra o sítio de ligação T4 de transti retina.

[0033] As figuras 2A e 2B são gráficos, que ilustram o curso do tempo de mal dobramento de transtiretina na presença de diferentes inibidores.

[0034] As figuras 3A e 3B são gráficos, que ilustram o curso do tempo de formação de dibrila na presença de diferentes inibidores.

[0035] As figuras 4A e 4B são gráficos, que ilustram o tempo de curso de formação de fibrila na presença de diferentes inibidores.

[0036] A figura 5 ilustra as estruturas de bifenilas policloradas, tríadas quanto à ligação de transtiretina no plasma sangüíneo.

[0037] A figura 6 ilustra as estruturas de bifenilas policloradas hi-droxiladas, cuja ligação à transtiretina no plasma foi avaliada junto com as suas propriedades de inibição de amilóide in vitro.

[0038] A figura 7 é um gráfico, que ilustra a supressão de formação de fibrila de transtiretina por compostos benzoxazol. A posição do carboxila no benzoxazol é apresentada ao longo do lado esquerdo, enquanto que o anel fenila C(2) é apresentado ao longo do fundo. As barras indicam que o percentual de formação de fibrila (ff), ou seja, a quantidade de fibrilas formada a partir de transtiretina (3,6 pm) na presença do composto benzoxazol (7,2 pm) em relação à quantidade formada pela transtiretina na ausência de inibidor (que é definida como 100%).

[0039] A figura 8 é um gráfico, que ilustra a(s) estequiometria(s) de benzoxazóis ligados a transtiretina após a incubação no plasma sangüíneo humano. A imunoprecipitação com um anticorpo ligado por resina foi usada para capturar transtiretina. Seguindo-se à liberação de transtiretina a partir da resina, as quantidades de transtiretina e de inibidor foram quantificadas a partir de áreas sob os seus picos em um cromatograma de HPLC. O valor máximo possível de s é 2. Os números do composto são apresentados ao longo do eixo de base. As linhas verticais delgadas indicam o erro de medição.

[0040] A figura 9 é um gráfico, que ilustra a dissociação como uma função do tempo (t) para a transtiretina de WT (1, 8 pM) em uréia 6M sem inibidor, ou na presença de 3, 6 pM dos compostos 10, 21 ou 17, ou de 1,8 μΜ do composto 20.

[0041] A figura 10 ilustra a estrutura do co-cristal do raio X do composto 20 ligado a transtíretina. Resíduos equivalentes em diferentes subunídades são dístinguidos como números de resíduo íníciado-res e não iniciadores, assim como eles são pares das cavidades de ligação de halogênio, Descricão Detalhada da Invenção [0042] Pelo menos algumas doenças amilóides parecem ser causadas pela deposição de qualquer uma de mais do que 20 proteínas não- homólogas ou de fragmentos de proteína, fornecendo final mente uma estrutura quaternária em folha β cruzada fibrilar. A formação de fibrilas amilóides a partir de uma proteína normalmente dobrada, tal como transti retina requer o mau d obra mento da proteína para produzir um intermediário competente conjugado. O processo de amiloidegê-nese de transtíretina (TTR) parece causar três diferentes doenças amilóides - amiloidose sistêmica senil (SSA), polineuropatia amilóide familial (FAP, e cardiomiopatia amilóide familial (FAC). A SSA está associada com a deposição de TTR do tipo selvagem, enquanto que a FAP e a FAC são causadas pela amiloidegênese de uma de mais do que 80 variantes de TTR. Vide, por exemplo, Colon, W; Kelly, J. W. Biochemistry 1992, 31, 8654-60; Kelly, J. W. Curr. Opin. Struct. Biol. 1996, 6, 11-7; Liu, K., et al, Nat. Struct. Biol. 2000, 7. 754-7; Westermark, P.; et al, Proc. Natl. Acad. Sei U. S. A., 1990, 87, 2843-5; Saraiva, M. J,; et al. J. Clin. Invest, 1985, 76, 2171-7; Jacobson, D. R,; et al. N. Engl. J. Med,, 9917, 336, 466-73; Buxbaum, J. N,; Tagoe, C. E. Ann. Rev. Med, 2000, 51, 543-569; e Saraiva, M. J. Hum. Mutat, 1995, 5, 191-6, cada um dos quais é incorporado a este, em sua totalidade, a título referencial.

[0043] A TTR é um homotetrâmero de 55 kDa, caracterizado pela simetria 2,2,2, tendo dois sítios de ligação em forma de funil idênticos na mesma interface dímero-dímero, em que o hormônio de tireóide (T4) pode se ligar no plasma sanguíneo e CSF. A TTR é tipicamente ligada em menos do que 1 equív. de proteína de ligação holo- retinol. O mal d obra mento de TTR, incluindo a dissociação do tetrãmero em monômeros, seguido por alterações estruturais terciárias dentro do monômero, torna a proteína capaz de má formação, finalmente fornecendo amilóide. O tratamento disponível para FAP emprega o transplante de fígado mediado por terapia genética para substituir a variante TTR no sangue pela proteína (WT) de tipo selvagem. Esta abordagem não será provavelmente efetiva para FAC devido à deposição contínua de WT TTR, nem seria útil para o tratamento de SSA, em que o processo de deposição de WT TTR parece ser apenas causativo. A terapia de transplante de fígado falharia apenas em aproximadamente 10 das variantes de TTR que depositam fibrilas amilóides nas lepto-meninges conduzindo à doença do CNS, pois esta TTR é sintetizada pelo plexo coróide, Portanto, é desejável desenvolver uma estratégia terapêutica à base de droga não- invasiva geral. Pode ser desejável que a droga seja baseada em um ácido não- proteína, não- peptídeo, ou não- nucléico. Vide, por exemplo, Blake, C.C; et al. J. ol. Bíol., 1978, 121, 339-56; Wojtczak, A; et al. Acta Crystallogr., Sect. D 1996, 758-810; Monaco, H. L.; Rízzí; M.; Coda, A. Science, 1995, 268, 103941 ;Lai, Z.; Colin, W.; Kelly, J. W. Bíochemistry 1996, 35, 6470 -82; Holmgren, G; et al. Lancet 1993, 341, 1113-6; Suhr, O. B.; Eríczon, B. G; Fríman, S. Líver Transpl. 2002, 8, 787094; Dubrey» S. W. et al. Transplantation 1997, 64, 74-80; Yazaki, M. et al. Bíochem. Biophys. Res. Commun. 2000, 274, 702-6; e Cornwell, C. G. III; et al. Am. J. of Med., 1983, 75, 618- 623, cada um dos quais é incorporado a este, a título referencial, em sua totalidade. Síntese de Análogos de Diflunisal que inibem a Formação de Fibrila Amilóide de Transtiretina [0044] O mal dobramento de TTR, que conduz à formação de fibrila amilóide pode ser evitado pela estabilização do tetrâmero mediada por T4. Várias famílias estruturalmente diversas de estabilizadores de tetrâmero se ligam a um ou ambos os sítios T4 dentro da TTR e previnem a amiloidose sem os prováveis efeitos secundários do hormônio T4. Estes compostos de estabilização de tetrâmero incluem várias drogas anti-inflamatórias não-esteroidais (NSAIDS), tais como o ácido flufenâmico, diclofenaco, flurbiprofeno e diflunisal, que parecem funcionar através do aumento da barreira cinética associada com a dissociação do tetrâmero através da ligação em seu estado mais estável e estabilização. Como a TTR é o veículo secundário de T4 no plasma sangüíneo, mais do que 95% da capacidade de ligação de T4 da TTR permanecem inutilizados, permitindo a administração do composto de estabilização do tetrâmero, que objetiva estes sítios. Como diflunisal é um inibidor de cicilooxige-nase -2, a administração a longo termo poderia conduzir a efeitos colaterais gastrointestinais. Análogos de diflunisal, que apresentam atividade de NSAID ausente ou reduzida, mas possuem alta afinidade para TTR no plasma sangüíneo são, portanto, desejáveis. O primeiro estágio em direção a este objetivo é o projeto e a síntese de análogos de diflunisal como inibidores da formação de fibrila amilóide. Vide, por exemplo, Miroy, G. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 1996, 93, 15051 -6; Klabunde, T. et al. Nat. Struct. Biol. 2000, 7, 312-21; Baures, P. W.; Peterson, S.A.; Kelly, J. W. Bioorg. Med. Chem. 1998, 6, 1389-401; Petrassi, Η. M. et al. J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 2178- 2192; Baures, P. W. et al. Bioorg. Med. Chem. 1999, 7, 1339- 47; Sachettini, J. C..; Kelly, J. W. Nat. Ver. Drug Disc. 2002, 1, 267- 275; Oza, V. B.; et al. J. med. Chem 2002, 45, 321- 32; Bartalena, L.; Robbins, J. Clib. Lab. Med. 1993, 13, 583- 98; Aldred, A. R.; Brack, C. M.; Schreiber, G., Comp. Biochem. Physiol. B. Biochem. Mol. Biol. 1995, 111, 1-15; e Mao, Η. Y. et al. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 10429-10425, cada um dos quais é incorporado a este, a título referencial, em sua totalidade.

[0045] As subunidades do tetrâmero de TTR são relacionadas através de três eixos perpendiculares C2. A figura 1 é uma representação esquemática do sítio de ligação T4 de TTR, demonstrando o modo de ligação dianteiro, em que o carboxilato inibidor participa em interações eletrostáticas com o ε-amônio de Lys 15 e 15'. Os dois sítios de ligação T4 equivalentes, criados pela interface estrutural quaternária, são permutados pelos dois eixos C2, que são perpendiculares ao eixo C2 cristalográfico de simetria. Cada sítio de ligação T4 pode ser divido em uma cavidade interna e uma cavidade externa. Vide, por exemplo, Balke, C.C.; Oatley, S. J. Nature 1977, 268, 115- 20, que é incorporado a este, a título referencial, em sua totalidade. A cavidade de ligação interior compreende um par de cavidades de ligação de halogênio (BP), designados por 3 e 3’, constituídos pelas cadeias laterais de Leu 17, Ala 108, Vai 121 e Thr 119. A convergência de quatro cadeias laterais Ser, das quais cada subunidade define a região mais interna e a interface entre os dois sítios de ligação idênticos. Os grupos hidroxila Ser 117 podem servir como doadores de ligação de hidrogênio ou receptores para a funcionalidade complementar do composto (por exemplo, um inibidor da formação de amilóide) ou mediar interações eletrostáticas com o composto através de moléculas de água. O sítio de ligação externo é composto de HBP 1 e T, enquanto HBP 2 e 2’ são posicionados na interface das cavidades de ligação interna e externa. Os grupos ε-amônio Lys 15 e 15’ definem os alcances mais externos da cavidade de ligação externa, permitindo ligações eletrostáticas com os substituintes aniônicos no composto. Muitos dos compostos de estabilização do tetrâmero TTR se ligam no modo de ligação dianteiro, em que um substituinte aniônico no anel fenila hidrofílico posicionado na cavidade de ligação externa engata, em uma ligação ele-trostática, com os grupos ε-amônio Lys 15. No modo de ligação dian- teiro, um anel fenila hidrofóbico (frequentemente substituído por halo-gênios ) pode ocupar a cavidade de ligação interna. Exemplos de ligação na orientação oposta (o modo de ligação inverso), no entanto, foram também observadas. No modo de ligação inverso, um anel aromático hidrofílico pode ser posicionado na cavidade interna, permitindo com que uma ligação de carboxílato a hidrogênio com Ser 117 e Ser 117’. No modo de ligação inverso, um anel hidrofóbico substituído por halogênio pode ser posicionado na cavidade externa.

[0046] Diflunisal pode reduzir a amiloidogênese mediada por ácido de TTR. A estrutura de diflunisal (vide Exemplo 2) pode ser usada como a base para o projeto de novos compostos, que podem inibir a amiloidogênese de TTR. Vide, por exemplo, Verbeeck, R. K. et al. Biochem. Pharm., 1980, 29, 571- 576; e Nuernberg, B.; Koehler, G.; Brune, K. Clin. Pharmacokin. 1991, 20, 81-89.

[0047] O composto pode ter a fórmula: [0048] em que Ar1 é um grupo arila ou heteroarila, Ar1 sendo opci- onalmente substituído por um ou mais de: halo, -R1, -OR1, -OC{=0}R\ -OC(=0)NHR, -OC(=0)NHR\ -SR1, -S(=0)R1, -S(=0)2R\ -C(=0)R\ -C02R\ -C(=0)NHR1, -NR1R2, - NHC(=0)R\ -NHC(=0)NHR\ - NHC(=0) OR1, ou NHS(=0)2R1.

[0049] Ar2 é um grupo arila ou heteroarila, Ar2 sendo opcional men- te substituído por um ou mais de: halo, -R\ -OR1, -OC(=0)R1, -0C(=0)0R\ -0C(=0)NHR\ -SR1, -S(=0)R1, -S(=0)2R1, -C(=0)R\ -C02R1, -C(=0)NHR1, -NRW, - NHC(=0)R\ -NHC{=0)NHR1, - NHC(=0)OR1, ou NHS(=0)2R1.

[0050] Cada R1 é, independentemente, hidrogênio, ou um grupo alquila substituído ou não-substituído, cicloalquila, heterocicloalquila, alquenila, cicloalquenila, heterocicloalquenila, alquinila, arila ou hete- roarila.

[0051] Cada R2 é, independentemente, hidrogênio, ou um grupo alquila substituído ou não-substituído, cicloalquila, heterocicloalquila, alquenila, cicloalquenila heterocicloalquenila, alquinila, arila ou hetero-arila.

[0052] Em certas circunstâncias, Ar1 pode ser fenila substituído ou não-substituído. Ar1 e Ar2 podem ser simultaneamente fenila substituído ou não-substituído. Os substituintes podem ser flúor, cloro, hidróxi, -C02H, - C02Me, -OMe, -CH2OH, ou formila. R1 pode ser alquila inferior.

[0053] Os compostos podem ser usados sob a forma de sais far-maceuticamente aceitáveis, derivados a partir de ácidos e bases inorgânicos ou orgânicos. Incluídos dentre tais sais ácidos estão os seguintes: acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, benzenossul-fonato, bissulfato, butirato, citrato, canforato, canforsulfonato, ciclopen-tanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanossulfonato, fumarato, glucoeptonato, glicerofosfato, hemissulfato, heptanoato, clorifdreto, bromidreto, iodidreto, 2- hidroxietanossulfato, lactato, maleato, meta-nossulfato, 2-naftalenossulafto, nicotinato, oxalato, pamoato, pactinato, perssulfato, 3-fenil-propionato, picrato, pivalato, propionato, succinato, tartarato, tiocianato, tosilato de undecanoato. Sais básicos incluem sais de amônio, sais de metal alcalino, tais como sais de sódio e de potássio, sais de metal alcalino terroso, tais como sais de cálcio e de magnésio, sais com bases orgânicas, tais como sais de dicicloexilami-na, N-metil-D-glucamina, e sais com aminoácidos, tais como arginina, lisina, e assim por diante. Além disso os grupos contendo nitrogênio básicos podem ser quaternizados com agentes, tais como halogenetos de alquila inferiores, tais como cloretos, brometos e iodetos de metila, etila, propila e butila; sulfatos de dialquila, tais como sulfatos de dimeti-la, dietila, diibutila e diamila, halogenetos de cadeia longa, tais como cloretos, brometos e iodetos de decila, laurila, miristila e estearila, ha-logenetos de aralquila, tais como brometos de benzila e fenetila, e outros. Produtos dispersáveis ou solúveis em óleo são deste modo obtidos.

[0054] Os compostos podem estabilizar tetrâmeros de TTR e inibir a formação de amilóide de TTR. Os compostos podem ser análogos de diflunisal caracterizados por alterações estruturais sutis. Os compostos podem ser usados para avaliar as relações de atividade estrutural, à medida em que eles pertencem à inibição de amilóide de TTR. Padrões de substituição e o número de substituintes incluindo halogê-nios, carboxilatos, acila, alcóxi e hidroxila podem ser variados. Os dados de atividade estrutural a partir de outras classes de compostos revelam que um substituinte de carboxilato ou grupo de ligação aniônico ou H análogo parecem ser importantes, possivelmente participando em interações eletrostáticas com os grupos ε-amônio de Lys 15 e 15’ ou interações de ligação de hidrogênio com Ser 117 e 117’, enquanto que o anel hidrofóbico substituído por halogênio complementa as cavidades de ligação de halogênio da TTR. Ambos arilas substituídos por flúor e cloro podem ser avaliados, incluindo 2-flúor, 4-flúor, 3,5-diflúor, 2,4-diflúor, e 2, 6diflúor. Grupos arila substituídos por iodo podem ser menos desejáveis devido à sua instabilidade e potencial para agir como agonistas de tiroxina. O substituinte carboxilato (aniônico) pode estar ausente em alguns análogos para avaliar a sua influência na inibição de fibrila e seletividade de ligação no plasma. Compostos contendo uma funcionalidade aldeído ou álcool podem ser sintetizados para avaliar a influência de um receptor ou doador de ligação de hidrogênio não- carregado na seletividade de ligação e na inibição de fibrila amilóide. A forma gem-diol do aldeído pode ser o princípio da espécie de ligação.

[0055] Em geral, os compostos podem ser sintetizados através de métodos conhecidos na arte. Um método para a produção dos compostos é um acoplamento de Suzuki: BY2 = B(GH)2, B(OR)2m 9-BBN, B(CHCH3CH(CH3}2)2 X = l, Br, Cl, 0S02(CnF2n, i), n = 0, 1,4 Ri= arila, alquenila, alquila R2 = arila, alquenila, benzila, alila, alquila [0056] Por exemplo, um composto bifenila pode ser formado por um acoplamento de Suzuki de um ácido fenil borônico com um bromo-benzeno ou um iodo benze no. Grupos de proteção apropriados podem ser necessários para evitar a formação de produtos colaterais durante a preparação de um composto. Por exemplo, um substítuínte amino pode ser protegido por um grupo de proteção apropriado, tal como tri-fluoroacetila ou terc-butoxícarbonila. Outros grupos de proteção e condições de reação podem ser encontrados em T. W. Greene, Protectlve Groups in Organic Synthesis, (3a Ed, 1999, John Wiley & Sons, New York, N. Y.).

Composições Farmacêuticas [0057] Os compostos aqui descritos (por exemplo, análogos de diflunisal, bifenilas políclorados, ou benzoxazóis) podem ser formulados em composições farmacêuticas, que podem ser administradas oral mente, parenteral mente, por pulverização por Inalação, topicamen-te, retal mente, nasal mente, bucal mente, vagínalmente ou através de um reservatório implantado. O termo ‘'parenteral", como aqui usado, inclui técnicas de injeção ou infusão subcutâneas, intravenosas, intra-musculares, intra-articulares, intrasinoviais, intraesternais, intratecais, intra-hepáticas, intralesionais e intracranianas.

[0058] As composições farmacêuticas podem incluir quaisquer dos compostos, ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, junto com qualquer veículo farmaceuticamente aceitável. O termo “veículo”, como aqui usado, inclui adjuvantes e veículos aceitáveis. Veículos farmacetuicamente aceitáveis, que podem ser usados nas composições farmacêuticas desta invenção incluem, mas não estão limitados a, trocadores iônicos, alumina, estearato de alumínio, lecitina, proteínas do soro, tais como albumina do soro humano, substâncias de tampão, tais como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potássio, misturas de glicerídeo parcial de ácidos graxos vegetais saturados, água, sais ou eletrólitos, tais como sulfato de protamina, didrogeno fosfato dissódico, hidrogeno fosfato de potássio, cloreto de sódio, sais de zinco, sílica coloidal, trissilicato de magnésio, polivinil pirrolidona, substâncias à base de celulose, polietileno glicol, carboximetilcelulose sódica, poliacrilatos, ceras, polímeros em bloco de polietileno- polioxi-propileno, polietileno glicol e gordura de lã.

[0059] As composições farmacêuticas podem estar sob a forma de uma preparação injetável estéril, pode exemplo, de uma suspensão aquosa ou oleaginosa injetável estéril. Esta suspensão pode ser formulada de acordo com técnicas bem conhecidas na arte usando agentes de dispersão ou umectação adequados e agentes de suspensão. A preparação injetável estéril pode ser também uma solução ou suspensão em um diluente ou solvente parenteralmente aceitável não- tóxico, por exemplo, como uma solução em 1,3-butanodiol. Dentre os veículos e solventes aceitáveis, que podem ser empregados, estão água, solução de Ringer e solução de cloreto de sódio isotônica. Em adição, óleos fixos, estéreis, são convencionalmente empregados como um solvente ou meio de suspensão. Para este propósito, qualquer óleo fixo brando pode ser empregado, incluindo monoglicerídeos ou diglice-rídeos sintéticos. Ácidos graxos, tais como ácidos oléico e seus derivados de glicerídeo são úteis na preparação de substâncias injetáveis, tais como óleos farmaceuticamente aceitáveis naturais, tais como óleo de oliva ou óleo de rícino, em especial em suas versões polietoxiladas. Estas soluções ou suspensões oleosas podem também conter um di-luente ou dispersante de álcool de cadeia longa.

[0060] As composições farmacêuticas podem ser oralmente administradas em qualquer forma de dosagem oralmente aceitável incluindo, mas não limitada a, cápsulas, comprimidos, suspensões ou soluções aquosas. No caso de comprimidos para o uso oral, veículos que são comumente usados incluem lactose e amido de milho. Agentes de lubrificação, tais como estearato de magnésio, são tipicamente adicionados. Para a administração oral em uma forma de cápsula, diluentes úteis incluem lactose e amido de milho seco. Quando são requeridas suspensões aquosas para o uso oral, o ingrediente ativo é combinado com agentes de emulsificação e de suspensão. Se desejado, podem ser também adicionados certos agentes adoçantes, flavorizantes ou colorantes.

[0061] Em alternativa, as composições farmacêuticas podem ser administradas sob a forma de supositórios para a administração retal. Estes podem ser preparados pela mistura do agentes com um excipi-ente não irritante adequado, que está sólido em temperatura ambiente, mas está líquido na temperatura retal, e, portanto, irá ser fundido no reto de modo a liberar a droga. Tais materiais incluem manteiga de cacau, cera de abelhas e polietileno glicóis.

[0062] As composições farmacêuticas podem ser também administradas de modo tópico, em especial quando o alvo do tratamento inclui áreas ou órgãos prontamente acessíveis à aplicação tópica, incluindo doenças dos olhos, pele, ou do trato intestinal inferior. Formulações tópicas adequadas são prontamente preparadas para cada uma destas áreas ou órgãos.

[0063] A aplicação tópica para o trato intestinal inferior pode ser efetuada em uma formulação de supositório retal (vide acima) ou em uma formulação de enema adequada. Adesivos topicamente trans-dérmicos podem ser também usados.

[0064] Para aplicações tópicas, as composições farmacêuticas podem ser formuladas em um ungüento adequado, contendo o componente ativo suspenso ou dissolvido em um ou mais veículos. Veículos para a administração tópica dos compostos incluem, mas não estão limitados a, óleo mineral, petrolato líquido, petrolato branco, propi-leno glicol, polioxietileno, composto polioxipropileno, cera emulsificante e água. De modo alternativo, as composições farmacêuticas podem ser formuladas em uma loção ou creme adequado, contendo os componentes ativos suspensos ou dissolvidos em um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis. Veículos adequados incluem, mas não estão limitados a, óleo mineral monoestearato de sorbitano, polisorba-to 60, cera de ésteres de cetila, álcool cetearílico, 2-octildodecanol, álcool benzílico e água.

[0065] Para o uso oftálmico, as composições farmacêuticas podem ser formuladas como suspensões micronizadas em solução salina estéril ajustada por pH, isotônica, ou, de modo preferido, como soluções em solução salina estéril, ajustada por pH, isotônica, com ou sem um conservante, tal como cloreto de benzilalcônio. De modo alternativo, para usos oftálmicos, as composições farmacêuticas podem ser formuladas em um ungüento, tal como petrolato.

[0066] As composições farmacêuticas podem ser também administradas através de aerossol nasal ou inalação, através do uso de um nebulizador, um inalador de pó seco ou um inalador de dose medida. Tais composições são preparadas de acordo com as técnicas bem conhecidas na arte da formulação farmacêutica e podem ser preparadas de acordo com as técnicas bem conhecidas na arte da formulação farmacêutica e podem ser preparadas como soluções em solução salina, empregando álcool benzílico ou outros conservantes adequados, promotores de absorção para aumentar a biodisponibilidade, fluoro-carbonetos e/ ou outros agentes de solubilização ou dispersão convencionais.

[0067] A quantidade de ingrediente ativo, que pode ser combinada com os materiais de veículo para produzir uma forma de dosagem única irá variar dependendo do hospedeiro tratado, e do modo de administração particular. Deve ser entendido, no entanto, que uma dosagem específica e regime de tratamento para qualquer paciente particular irá depender de uma variedade de fatores, incluindo a atividade do composto específico empregado, a idade, o peso corpóreo, a saúde geral, sexo, dieta, tempo de administração, taxa de excreção, combinação de droga, e julgamento do médico clínico e severidade da doença particular sendo tratada. A quantidade de ingrediente ativo pode também depender do agente terapêutico ou profilático, se houver, com o qual o ingrediente é conjuntamente administrado.

[0068] Uma quantidade efetiva de uma composição farmacêutica é a quantidade que é requerida para conferir um efeito terapêutico ao paciente tratado, e irá depender de uma variedade de fatores, tais como a natureza do inibidor, o tamanho do paciente, o escopo do tratamento, a natureza da patologia a ser tratada, a composição farmacêutica específica usada, e o julgamento do médico clínico. Por questões de referência, vide Freireich et ai., Câncer Chemother. Rep., 1966, 50, 219 e Scientific Tables, Geigy Pharmaceuticals, Ardley, New York, 1970, 537. Níveis de dosagem de entre cerca de 0,001 e cerca de 100 mg/kg de peso corpóreo por dia, entre cerca de 0,1 e cerca de 10 mg/kg de peso corpóreo por dia do composto de ingrediente ativo.

[0069] Os seguintes são exemplos da prática da invenção. Eles não são construídos de um modo limitativo ao escopo da invenção de modo algum.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Prevenção de Doença Amilóide de Transtiretma pela Alteração da Energética de Desdobramento da Proteína [0070] Centenas de doenças humanas, incluindo as amoloidoses, estão associadas com o desdobramento de proteína. As 80 mutações familiais que exarcebam [ por exemplo, Vai 30-» Mert30 (V30M) e leu55-»Pro55 (L55P)] ou melhoram [Thr119 -^Met119 (T119M) a patologia amilóide de transti retina (TTR) fornecem abordagens mecani-cistas valiosas. Todas as mutações associadas a doença até então caracterizadas, desestabilizam o tetrâmero de TTR, e podem influenciar a velocidade de dissociação de tetrâmero que limita a taxa, com taxas rápidas acelerando e taxas lentas retardando a amiloidose. Obtivemos vantagem do mecanismo, pelo qual T119M previne a doença em heterozigotos do composto V30M para desenvolver inibidores ami-lóídes de TTR de molécula pequena, que retardaram dramaticamente o evento de desdobramento inicial (dissociação de tetrâmero) requerido para a desnaturação de monômero parcial, possibilitando a mã formação em amilóide e em outros agregados.

[0071] Tetrâmeros híbridos foram isolados de modo a melhor compreender o mecanismo de trans-supressão. O aumento de este-quiometría da subunidade T119M relativo a V30M [ ou L55P] deslocou a formação de fibrila mediada por ácido máxima a um pH mais baixo, diminuiu o rendimento total de amilóide em pHs fisiologicamente acessíveis (> 4,0), e reduziu a taxa de amiloidegênese mediada por metanol e induzida por ácido (pH 4,4). Vários inibidores de fibrila amilóide de TTR foram verificados, um subconjunto dos quais foi aqui estudado, incluindo duas drogas aprovadas pela U.S. Food and Drug Administration (FDA) (inibidores 8 e 10) (Sacchettini et a!., Nature Rev. Drug Discovery 1, 267 (2002)). A influência de ligação do inibidor de molécula pequena sobre o rendimento e a taxa de formação de fibrila de TTR (WT) de tipo selvagem foi similar àquela de incorporação da subunida- de Τ119Μ. No entanto, o deslocamento a um pH ótimo mais baixo para a formação de fibrila não foi observado com todos os inibidores. Estes inibidores funcionam pela ligação aos dois sítios de tiroxina equivalentes (T4) dentro do tetrâmero de TTR, não do monômero.

[0072] As taxas de dissociação foram medidas pela ligação de alterações estruturais quaternárias lentas à transição de desdobramento, com uma taxa de 5 x 105 vezes aquela de dissociação (Hammars-trõm et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 99, 16427 (2002)). A dissociação detectada por desnaturação é irreversível porque a concentração de uréia usada (> 6, 0 M) não pode suportar o redobramento. O aumento da estequiometria da subunidade T119M com relação às subu-nidades V30M [ou L55P] revelaram uma diminuição da taxa de dissociação de tetrâmero de TTR dramática (1, 8μΜ) (taxa limitativa para a amoloidegênese ) em três diferentes ambientes desnaturantes (pH ácido, metanol aquoso ou uréia), explicando a origem da prevenção da doença.

[0073] As medições da taxa de dissociação do tetrâmero de WT TTR (1,8 μΜ), na presença dos inibidores 6 a 10 (1, 8 e 3, 6 μΜ) demonstraram um retardo dependente de dose para todos os complexos de inibidores de TTR. A taxa inicial de dissociação do tetrâmero foi, a grosso modo, inversamente proporcional à fração molar do tetrâmero ligado a dois inibidores (T. I2). No caso dos inibidores 6, 7 e 9 (1, 8 μΜ), a amplitude do exponencial único correlacionado primariamente com a dissociação do tetrâmero não ligado (e, em uma menor extensão, T.l), implicando que T. I2 evitou a dissociação e uréia 6M. Em contraste, a formação de T.l e T.l2 para os inibidores 8 e 10 não protegeram o tetrâmero substancialmente da dissociação em uréia, revelando que a penas a ligação foi insuficiente. A inibição eficiente observada no caso de 6, 7 e 9 (3, 6 μΜ) resultou a partir da energia de ligação, estabilizando o complexo T. I2 pelas energias livre que excedem a 2,3 kcal/ mol (Delta G1 = RT ln([ T. I]/[T] = RT In([l]/Kd1) e Delta G2 = RT In ([T. I2]/[T] = RT In {[l]2/(kd1*kd2)). A estabilização de T. I2 em relação a T por 2, 7 kcal/mol se traduziria em um decréscimo de duas ordens de magnitude na taxa de dissociação do tetrâmero de TTR. A ligação cooperativa fortemente negativa dos inibidores 8 e 10 (3, 6 μΜ) dita que a ligação ao segundo sítio (constantes de dissociação T. I2) não estabilizaria adicionalmente TTR em relação à ligação ao primeiro sítio (T.l). As constantes de dissociação nM (kdi e kd2) dos inibidores 6,7 e 9 iriam assegurar que a estabilização em estado mais estável (> 2, 3 kcal/mol) seria suficiente para aumentar substancialmente a barreira de ativação para a dissociação do tetrâmero de TTR, contanto que os inibidores não se ligassem a, e similarmente estabilizassem o estado de transição dissociativo. As taxas de dissociação do inibidor de T. I2 e do complexo T.l poderíam também desempenhar uma função na eficácia dos inibidores 6, 7 e 9. A TTR saturada com inibidor foi imobilizada por uma resina de anticorpo, sobre a qual um tampão aquoso foi passado a 5,0 ml/min de modo a avaliar as taxas de dissociação efetivas de 6 a 10. Os melhores inibidores foram aqueles com as menores taxas de dissociação aparentes.

[0074] Embora exista geralmente uma correlação muito boa entre as taxas de amiloidegênese (condições ácidas) e as taxas de dissociação de tetrâmero (em uréia) na presença de inibidores), este não precisa ser o caso. A amiloidegênese requer a má formação dependente de concentração após dissociação. Deste modo, pequenas moléculas serão, de modo geral, mais efetivas em prevenir a formação de fibrila do que a dissociação de tetrâmero, em especial quando o inibidor pode manter a concentração do intermediário amiloidegênico mo-nomérico baixa (< 3, 6 pM), em que a formação de fibrila é muito ineficiente. Ocasionalmente, as taxas de dissociação de tetrâmero medidas em uréia não irão prognosticar, de modo preciso, a ordem de faixa de eficácia do inibidor sob condições ácidas. Por exemplo a droga di-flunisal (8) aprovada pela FDA foi um inibidor de amilóide muito melhor do que um inibidor de dissociação de tetrâmero. Uma explanação similar para esta observação é a de que kd1 el ou kd2 são muito mais baixos no ácido do que na uréia (18). Em adição, alguns inibidores possuem um desempenho muito melhor sob condições de desnaturação do que as suas constantes de ligação determinadas sob condições fisiológicas sugeririam. Por exemplo, o composto 9 foi mais ou igualmente eficiente em prevenir a dissociação de tetrâmero (uréia) e a formação de fibrila (ácido) do que foi o inibidor 7, apesar o inibidor 9 possuir valores de Kd1 e Kd2 que foram 10 e 83 vezes aqueles de 7, respectivamente (medidos sob condições fisiológicas). Deste modo, é importante julgar a eficácia de inibidores de mal dobramento sob uma variedade de condições de desnaturação e não apenas sob condições fisiológicas.

[0075] A inclusão de subunidades de trans-supressor T119M em tetrâmeros, por outro lado compostos de subunidades associadas a doença poderia diminuir a taxa de dissociação de tetrâmero pela estabilização do estado mais estável tetramérico em uma extensão maior do que o estado de transição (como no caso com os inibidores de molécula pequena) e/ ou pela desestabilização do estado de transição de dissociação. Para distinguir entre estas possibilidades, comparamos a cinética de reconstituição de homotrâmeros de T119M e WT. O redo-bramento de monômeros de T119M foi rápido e dentro do erro de taxa de dobra de monômeros de WT TTR. No entanto, o reagrupamento dos monômeros dobrados de T119M foi duas ordens de magnitude mais lento do que a tetramerização dos monômeros de WT TTR iniciados pela diluição de uréia. O processo de reagrupamento é bifásico, o que pode ser explicado pela presença de um intermediário observável no trajeto de formação (provavelmente um dímero). Na direção oposta, o tetrâmero T119M dissocia na taxa de 1/37 daquela exibida pelo tetrâmero de WT TTR. Estes efeitos cinéticos não podem ser atribuídos a diferenças na estabilidade estrutural terciária el ou na estabilidade do tetrâmero. Uma comparação direta da estabilidade termodinâmica dos monômeros de T119 M e WT (empregando um construto de TTR monomérico engenheirado (M-TTR) revelou uma diferença na energia livre Delta Delta G para o desdobramento de apenas 0,4 kcal/ mol, muito inferior aos 2,1 e 2, 7 kcal/ mol requeridos para explicar as diferenças de taxa de dissociação e de formação, respectivamente. Uma análise do ciclo termodinâmico de TT119M e de Wl TTR revelou que T 119M evita a dissociação do tetrâmero pela desestabilização do estado de transição de dissociação em aproximadamente 3,1 kcal/mol, não pela estabilização do tetrâmero. De acordo com esta análise, o tetrâmero de T119M é efetivamente desestabilizado por 0,9 kcal/ mol em relação a WT, dando suporte adicional a um mecanismo de estabilização cinético. A diferença de energia livre entre o tetrâmero de T119M e WT não pode ser medida através do desdobramento mediado por uréia, porque a desnaturação de T119M em uréia requer períodos de incubação excessivamente longos (várias semanas), durante os quais a TTR é modificada. As comparações das curvas de desnaturação de cloreto de guanidínio (GdmCI) e tiocianato de guanidínio (GdmSCN) revelaram que a WT TTR era mais resistente à desnaturação de GdmCI do que a T119M, enquanto que o oposto era verdadeiro na GdmSCN. Estas diferenças em pontos médios de desnaturação podem ser atribuídas à estabilização de ânion diferencial, sugerindo que as estabilidades termodinâmicas reais destas proteínas são muito similares, embora uma análise quantitativa não seja possível nestes caotropos.

[0076] A trans-supressão de T119M é principalmente mediada pela desestabilização do estado de transição dissociativo, consistente com o posicionamento de T119M na interface dímero-dímero. O aumento da energia do estado de transição dissociativo em 3,1 kcal/ mol previne efetivamente a dissociação de tetrâmero, porque a barreira de ativação de torna insuperável (a meia vida de dissociação t1 /2 aumenta de aproximadamente 42 horas a > 1500 horas). A ligação de molécula pequena aumenta símilarmente a barreira de ativação associada com a dissociação de tetrâmero em um modo dependente de dose, embora isto seja mediado através da estabilização de tetrâmero {relativa à estabilização do estado de estabilização). A extensão de estabilização é máxima quando as constantes de dissociação de molécula pequena kd1 e kd2 são tão baixas quanto possível e a concentração de inibidor é tão alta quanto possível. As concentrações usadas em nossos experimentos para a estabilização no estado mais estável são comparáveis àquelas observadas no plasma para numerosas drogas oralmente disponíveis, [0077] A ligação de molécula pequena e a trans-supressão aumentam a energia de ativação associada com a dissociação de tetrâmero, o estágio de limitação de taxa de formação de fibrila de TTR. O estabelecimento desta analogia é importante, porque é conhecido que a trans-supressão previne a doença em heterozigotos do composto V30M. A estabilização cinética do estado nativo é uma estratégia particularmente atraente, considerando a evidência emergente de que os olígômeros mal dobrados são neurotóxicos. A verificação de aglutina n-tes de molécula pequena ou o desenvolvimento de uma abordagem de trans-supressão para ajustar o quadro energético de outros proteínas patologicamente relevantes com uma predileção para o mal dobra-mento deve ser agora considerada.

Exemplo 2: Análogos de Diflunisal Estabilizam o Estado Nativo de Transtiretina e são Inibidores de Formação de Fibrila Amilóide de Transtiretina [0078] O Diflunisal (1) pode reduzir a amiloidegênese de Transtire-tina (TTR). Por exemplo, sob certas condições (por exemplo, TTR 3, 6 QM, diflunisal 3, 6 μΜ, pH 4,4, 72 h, 37°C), o diflunisal reduz a amiloi-dogênese de TTR em 63%. Sob estas condições, dobrando a concentração de diflunisal (para 7, 2 μΜ) a amiloidegênese é reduzida em 97%. Diflunisal é um dos melhores inibidores de fibrila amilóide até hoje relatados e o diflunisal administrado oralmente está altamente bio-disponível, proporcionando uma concentração no plasma sustentada excedendo a 100 pM, em uma dose de 250mg duas vezes ao dia. Como o diflunisal é um inibidor de ciclooxigenase -2, a administração a longo termo poderia conduzir a efeitos colaterais gastrointestinais. Análogos de diflunisal apresentam atividade de NSAID ausente ou reduzida, mas possuem alta afinidade para TTR no plasma sangüíneo, sendo portanto opcionalmente desejáveis. A estrutura do diflunisal pode portanto ser usada como a base para o projeto de novos compostos, que podem inibir a amiloidegênese de TTR. Vide, por exemplo, Verbeeck, R. K.; et ai. Biochem. Pharm., 1980, 29, 571-576; e Nuernberg, B.; Hoelhler, G; Brune, K;; Clin. Pharmacokin., 1991, 20, 81-89.

[0079] Análogos de diflunisal foram sintetizados usando um acoplamento de Suzuki mediado por Pd entre um halogeneto de arila e um ácido arilborônico. A síntese de análogos 2-10 foi alcançada através de acetilação ou de 3- ou 4-iodofenol com anidrido acético e piridi-na, seguida pelo acoplamento de Suzuki com o ácido fluorofenil borô-nico apropriado, sob condições de acoplamento de Suzuki convencionais, conforme apresentado no Esquema 1. A remoção do éster com Na° e MeOH (condições de Zemplén) forneceu os fenóis 2-10. Vide, por exemplo, Miyaura, N.; Uanagi, T.; Suzuki, A. Synth. Commun. 1981, 11, 513-519; Sharp, M. J. Snieckus, V., Tetrahedron Lett., 1985, 26, 5997- 6000; Sharp, M. J.; Cheng, W.; Snieckus, V. Tetrahedron Lett., 1987, 28, 5093- 5096; Pozsgay, V.; Nanasi, P; Neszmelyi, A. Carbohydr. Res. 1981, 90, 215- 231; Jendralla, H; Chen, L, - J,, Synthesis 1990; 827- 833; e Kelm, J.; Strauss, K., Spectrochim. Acta, Parte A, 1981, 37, 689-692, cada um dos aquís é aqui incorporado, a título referencial, em sua totalidade.

Esquema 1 [0080] O análogo de diflunisal 11 foi sintetizado usando métodos de fase sólida, conforme mostrado no Esquema. O ácido 2,3-iodobenzóico foi acoplado à resina de Wang através de uma ligação de éster, fornecendo o iodeto de fenila ligado por resina, que foi então acoplado ao ácido 2,4-difluorofenil borônico, e clívado a partir da resina com uma mistura a 1:1 de TF A: CH^Cb* Vide, por exemplo, Guiles, J. W.; Johnson, S. G. Murray, W. V., J. Org. Chem. 1996, 61, 51695171, que é aqui incorporado, a título referencial, em sua totalidade.

Esquema 2 [0081] Os substratos contendo carboxilato 12- 22 foram reunidos através do acoplamento ou de 3-bromobenzoato de metila ou de 4-bromobenzoato de metila (ambos comercialmente disponíveis) com o ácido fluorofenil borônico apropriado usando condições de acoplamento de Suzuki convencionais (vide acima) tal como mostrado no Esquema 3. O éster foi então saponificado com Li OH; H20 para prover o carboxilato correspondente. Vide, por exemplo, Bumagin, NA; Bykov, V. V. Tetrahedron 1997, 53, 14437- 14450; Ananthakrishnadar, P,; Kanan, N, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2, 1982, 1305- 1308; Homsi, F; Mozakt, K.; Hiyama, T. Tetrahedron Lett. 2000, 41, 58869- 5872; e Hajduk, P. J.; et al. J. Med. Chem., 1997, 40, 3144 - 3150, cada um dos quais é aqui incorporado, a título referencial, em sua totalidade.

Esquema 3 [0082] O ácido 5-ÍodossaIictlico foi esterificado usando TMS-CH2N2 e o fenol foi convertido em um éter metílico empregando Mel. O ácido salicílico protegido foi acoplado com vários ácidos fluorofenil borônicos, e subseqüentemente desprotegido por saponificação com LiOH. H20 e desmetilação com BBr3 para prover os derivados do ácido salicílico 23- 27, conforme mostrado no Esquema 4. Vide, por exemplo, Nicolaou, K. C.; et al. Chem Eur. J. 1999, 5, 2602 — 2621; e Chi- Moyer, Μ. Y. et al., J. med. Chem, 2002, 45, 511 - 528.

Esquema 4 [0083] Análogos contendo 3’, 5'-dihalo-4’-hidroxila 28-31 foram sintetizados primeiramente pela proteção do bromofenol comercial mente disponível como o éter metílico (Mel e K2C03). Acoplamento de Suzuki com um ácido (metoxicarbonilfeníl) borônico resultou na formação dos substratos bifenila total mente protegidos, A clí vagem de éter metílico mediada por BBr3 e a saponificação com LI0H.H20 forneceu os análogos de dlflunlsal inteira mente funcionalízados 28-31, como mostrado no Esquema 5.

Esquema 5 [0084] Os análogos de éster metílico e de éster metílico de difluni-sal foram sintetizados através de esterificação do ácido carboxílico com TMS- diazometano para prover 32, opcionalmente seguido pela esterifi cação com Mel e K2C03 e hidrólise com LiOH: H20 para fornecer 33. Vide Esquema 6.

Esquema 6 [0085] Uma série de bifenilas halogenadas 34-38 foram reunidas através de acoplamento de Suzuki de iodobenzeno com uma série de ácidos borônicos contendo halogênio, conforme mostrado no Esquema 7. Vide, por exemplo, Patrick, T. B.; Willaredt, R. P. DeGonia, D. J. J. Org. Chem, 1985, 50, 2232-2235; Kuchar, M.; et al. Coollection of Choslovak Chemical Communications 1988, 53, 1862- 1872; Allen, K. J.; Bolton, R,; Williams, G, H, J, Chem. Soc, Perkín Trans. 2, 1983, 691- 695; Nakada, M.; et al. Bull. Chem. Soc. Jpn. 1989, 62, 31223126; e Weingarten, H. J. Org. Chem., 1961, 26, 730 -733, cada um dos quais é aqui incorporado, a título referenciai, em sua totalidade Esquema 7 [0086] Biaril aldeídos clorados foram reunidos usando 3,5-dicloroiodobenzeno e ácido 2-, 3-, ou 4- formilfenil borônico, conforme mostrado no Esquema 8. Os aldeídos 42-44, sem a substituição de halogênio, foram preparados de modo análogo. Os aldeídos 39-41, foram ou oxidados com KMn04 em acetona/água para prover os ácidos carboxílicos correspondentes 45-47 ou foram reduzidos com NaBH4 em MeOH para prover os álcoois benzílicos correspondentes 48-50, Esquema 8. A redução dos aldeídos não- clorados 42-44 com NaBH4 e MeOH produziram os álcoois bifenil benzílicos 51-53. Vide, por exemplo, Song X, P.; He, H.T.; Siahaan, T. J. Org, Lett 2002, 4, 549-552; e Nicolaou, K. C.; etal, J. Am. Chem. Soc., 2001, 123, 93139323; Hashizume, H.; et al. Chem. Pharm. Bull., 1994, 42, 512-520; Indolese, A. F. Tetrahedron Lett., 1997, 38, 3513- 3516; Pridgen, L. N.;

Snyder, L; Prol. J., J. Org. Chem. 1989, 54, 1523 —1526; Huang, C. G; Beveridge, K. A.; Wan, P. J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 76767684; Wendeborn, S. et al. Synlett. 1998, 6, 671- 675; Stevens, C. V.; Peristeropoulou, M.; De kimpe, N. Tetrehedron 2001, 57, 7865 - 7870; Tanaka, K.; Kishigami, S., Toda, F. J. Org. Chem. 1990, 55, 29812983; e Clive, D.L. J.; Kang, S. Z. J. Org. Chem., 2001,66, 6083-6091, cada um dos quais é aqui incorporado, a título referencial, em sua totalidade.

Esquema 8 [0087] Bifenilas com funcionalidade 3’,5’-difluoroformila 54 e 55 foram sintetizadas através de acoplamento de Suzuki de ácido 3,5-difluorofenil borôníco ou com 2- ou 3-iodobenzaleído, como mostrado no Esquema 9. Todos os outros inibidores foram sintetizados por métodos similares e previamente relatados. Os compostos 10, 21, 35, 36 e 43 estão comercialmente disponíveis.

Esquema 9 [0088] Os reagentes e solventes foram adquiridos de Aldrich, Lan-caster, Acros, Combi-Blocks, Matrix e Pfaltz-Bauer. THF e CH2CI2 foram secados pela passagem sobre Al203. Outros solventes e reage n-tes foram obtidos a partir de fornecedores comerciais e foram usados sem purificação adicional, a não ser que mencionado de outro modo. As reações foram monitoradas por cromatografia de camada delgada analítica (TLC) em placas previamente revestidas com sílica gel 60 F254 com indicador fluorescente adquirido de EM Science. A visualização das placas de TLC foi efetuada através de iluminação por UV, tratamento com ácido fosfomolibdílico seguido por tratamento térmico ou com molibdato de amônio cérico seguido por calor. A cromatografia de cintilação foi executada usando sílica gel 60 (malha 230- 400 de EM Science. A pureza dos novos compostos foi essencial para as conclusões extraídas no texto e foram determinadas através de HPLC. HPLC de fase normal foi executado com uma bomba/ controlador W ate rs 600, um detector de conjunto de fotodiodo Waters 996 e uma coluna de sílica Waters NovaPak. O sistema de solvente empregado foi hexa-nos e acetato de etila, e os gradientes foram processados de hexa-nosiacetato de etila a 50: 50 para hexanos: acetato de etila a 0: 100 durante 30 minutos. HPLC de fase inversa foi executado com uma bomba/ controlador Waters 600, um detector de comprimento de onda duplo 2487 e uma coluna de proteína e peptídeo C18 Vydac. O sistema de solvente A era compostos de água: acetonitríla a 96:5 com 0,5% de ácido trifluoroacético e o solvente B era compostos de água: acetonitrila a 5:95 com 0,5% de ácido trifluoroacético. Os gradientes foram processados de A:B a 100:0 para A:B a 0:100 durante 20 minutos com uma retenção em 100% de B durante um período adicional de 10 minutos. A espectroscopia de dicroísmo circular foi executada em um espectrômetro de AVIV Instruments, modelo 202SF. Os espectros RMN foram registrados em um espectrômetro de RMN Varian FT em freqüência de próton de 400 MHz. Os desvios químicos de próton são relatados em partes por milhão (ppm) com referência a CHCI3 como o padrão de desvio químico interno (7,26 ppm), a não ser que mencionado de outro modo. As constantes de acoplamento são relatadas em hertz (Hz). O desvios químicos de carbono são relatados em partes por milhão (ppm) com referência a CDCI3 como o padrão de desvio químico (77,23 ppm), a não ser que mencionado de outro modo. Todos os espectros de massa foram obtidos no The Scripps Research Institute Center for Mass Spectrometry ou no University of Illinois Mass Spectrometry Laboratory.

[0089] Os compostos 2-10 foram preparados de acordo com o Esquema 1. A uma solução de ácido acético- éster iodofenílico (1,0 equiv.) dissolvida em tolueno suficiente para fornecer uma concentração de 0,05 M, foi adicionada uma solução de ácido fenil borônico (1,1 equiv.) dissolvida em EtOH para fornecer uma solução 0,6 M com relação ao ácido fenil borônico. Uma solução aquosa 2M de Na2C03 foi adicionada para fornecer uma concentração de reação final de 0,03 M com relação a ácido acético - éster iodofenílico, seguido pela adição de Pd (PPh3)4 (4,0 mol%). A reação foi aquecida até o refluxo sob Ar durante 20 horas, e após ser completada, foi resfriada à temperatura ambiente e extraída com CH2CI2 (2x), lavada com salmoura (1 x), secada com MgS04) e concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado através de cromatografia de cintilação (hexano: acetato de etila a 10:1) para fornecer a bifenila acetilada.

[0090] Uma quantidade catalítica de Na° foi adicionada a uma solução de bifenila acetilada em MeOH para prover uma concentração de reação final de 0,3 Μ. A reação foi deixada em agitação em temperatura ambiente sob Ar durante 12 horas, após o que a resina de troca catiônica Dowex 50 W-X8 foi adicionada para neutralizar a mistura da reação. A resina foi filtrada e o filtrado foi concentrado in vacuo e cro-matografia de cintilação (hexano: acetato de etila a 3:1) para fornecer os produtos hidroxibifenila como sólidos brancos em rendimentos de 22- 75%.

[0091] 2’,4’-Difluorobifenil-3-ol(2). RMN Ή (DMSO- d6, 400 MHz) δ 9,63 (br s, 1H), 7,54 (td, 1H, J= 8,9, 6,7 Hz), 7,34 (ddd, 1H, J= 11, 1, 9,2, 2,6 Hz), 7,27 (m, 1H), 7,17 (tdd, 1H, J = 8,3, 2,6, 1,2 Hz), 6,92 (m, 2H), 6,81 (ddd, 1H, J = 8,1, 2,4 1, 0 Hz). RMN 13C (DMSO-d6, 100 MHz) δ 162, 8, 160,3, 157, 4 135,4, 131, 8, 129, 7, 119,4, 115, 6, 114, 9, 111, 9, 104,4. HRESIMS calculado para C12H8F20 (M-H) 205.0466, encontrado 205.0465. Tempo de retenção de HPLC de fase normal: 10,5 minutos. Tempo de retenção de HPLC de fase inversa: 1,3 minutos, > 99% puro.

[0092] 2’,4’-Difluorofenil-4-ol (3). RMN Ή (DMSO-d6, 400 MHz) δ 7, 49 (td, 1H, J= 9,4, 8,6 Hz), 7,34 (ΑΑ’ΧΧ’, 2H, ϋΑΑ·= Jxx = 2,5 Hz, JXA = 8,7 Hz, JXA= 8,5 Hz, JXA= 0,3 Hz, ϋχΛ·= 0,3 Hz,vA=vA= 2934, 1 Hz, vx— vx. = 2746, 2Hz), 7,28 (ddd, 2H, J = 11,3, 9,4, 2, 6 Hz), 7,13 (dddd, 1H, J= 8,3, 7,5, 2,8, 1,0 Hz), 6, 87 (AA\ X)Ç, 2H, como acima). RMN 13C (DMSO-de, 100 MHz) δ 162,3, 160, 0, 157, 2, 131, 4, 129,9, 124,8, 115, 4, 111, 8, 104,3. HRESIMS calculado para C12H8F20 (M-H) 205,0464, encontrado 205,0465. Tempo de retenção de HPLC de fase normal: 11,2 minutos. Tempo de retenção de HPLC de fase inversa: 12, 6 minutos > 98% puro.

[0093] 3’,5’-Difluorobifenil-3-ol (8). RMN Ή (DMSO-d6, 400 MHz) δ 9,65 (br s, 1H), 7,34 (m, 2H), 7,28 (t, 1H, J = 7,9 Hz), 7,19 (tt, 1H, J= 9,1, 2,2 Hz), 7,13 (ddd, 1H, J = 7,8, 1,8, 1, 0 Hz), 7,8 (t, 1H, J = 7, 9Hz), 7, 19 (tt, 1H, J = 9,1, 2,2 Hz), 7,13 (ddd, 1H, J = 7,8, 1, 8, 1,0 Hz), 7,08 (t, 1H, J = 2,1 Hz), 6,86 (ddd, 1H, J = 8,0, 2,4, 1,0 Hz). RMN 13C (DMSO-de, 100 MHz), δ 162, 9, 158,0, 144, 1, 139, 1, 130, 1, 117,6, 115, 7, 109, 7, 102, 6. HRESIMS calculado para C12H8F20 (ΜΗ) 205, 0465, encontrado 205, 0468. Tempo de retenção de HPLC de fase normal: 11,4 minutos. Tempo de retenção de HPLC de fase inversa: 1,29 minutos > 99% puro.

[0094] 3’, 5’-Difluorobifenil-4-ol (9). RMN 1 (CDCI3, 400 MHz) δ 7, 44 (M’XX\ 2H, Jaa·, Jxx- =3,0 Hz, JXA = 8,0 Hz, Jxw= 8,5 Hz, JXA=0,7 Hz, Jxa’— 0,5 Hz, vA— vA· = 2973, 8 Hz, vx = vx. = 2766,0 Hz), 7,05 (dtd, 2H, J = 6, 6, 2,4, 0,7 Hz), 6,92 (ΑΑ’ΧΧ’, 2H, como acima), 6, 74 (tt, 1H, J + 8,9, 2,4 Hz), 5,11 (s, 1H), RMN 13C (CDCI3, 100 MHz) δ 164, 7, 156, 1, 144, 2, 131, 8, 128, 6, 116, 1, 109, 6, 102, 1. HRESIMS calculado para Ci3H8CI202 (M-H) 205,0465, encontrado 205, 0465. Tempo de retenção de HPLC de fase normal: 10,8 minutos. Tempo de retenção de HPLC de fase inversa: 12,9 minutos > 99% puro.

[0095] Ácido 2’, 4’difluorofenil-3-carboxílico (11). O composto 11 foi preparado de acordo com o Esquema 2. Ácido 3-iodobenzóico (200 mg, 0,81 mmol), DIEA (140 pl, 0,81 mmol), EDCI. HCI e HOBt foram adicionados a uma solução de resina de Wang (265 mg, 0,67 mmol, 2, 53 mmol/g) intumescida em CH2CI2 (10 ml). Após agitação rigorosa em um agitador de peptídeo durante 22horas em temperatura ambiente, o solvente foi removido e a resina foi lavada com DMF (3 x 10 ml) e CH2CI2 (3 x 10 ml) e inteiramente secada in vacuo.

[0096] Ácido 2,4-difluorofenil borônico (112 mg, 0, 71 mmol), K2C03 (98 mg, 0,71 mmol) e Pd2(dba)3 (4 mg, 0,01 mmol) foram adicionados a uma solução de resina de Wang funcionalizada (140 mg, 0,35 mmol) intumescida em DMF (2 ml). Após agitação em temperatu- ra ambiente, a reação foi filtrada e a resina foi lavada com DMF (3 x), H20 (3x), CH2CI2 (3 x) e MeOH (3x) e secada inteiramente in vacuo.

[0097] Uma solução de TFA: CH2CI2 (3 ml 1:1) foi adicionada à resina funcionalizada (140 mg, 0,35 mmol) e agitada vigorosamente em um agitador de peptídeo durante 13 horas em temperatura ambiente. Após ser completada, a reação foi filtrada, a resina foi lavada com CH2CI2 (3 x), o filtrado foi concentrado in vacuo e purificado através de cromatografia de cintilação (hexano: acetato de etila a 2:1)], 0,5% de ácido acético) para fornecer 11 (81 mg, 100%) como um sólido branco. RMN 1H (DMSO d6, 400 MHz) δ 13, 19 (br s, 1H), 8,07 (q, 1H, J = 1,7 Hz), 7,99 (dt, 1H, J = 7,9, 1,6 Hz), 7,78 (dq, 1H, J = 7,8, 1,3 Hz), 7,64 (m, 2H), 7,40 (ddd, 1H, J = 11,1, 8,8, 2,5 Hz), 7,22 (tdd, 1H, J = 8,4, 2,8, 1,0 Hz). RMN 13C (DMSO-d6, 100 MHz) δ 167, 0, 160, 7, 160,4, 134,5, 133,0, 132, 0, 131, 3, 129,4, 129, 1, 128, 7, 123, 9, 112, 2, 104, 6. HRESIMS calculado para Ci3H8F202 (M-H) 233, 0414, encontrado 233, 0426. Tempo de retenção de HPLC de fase normal: 13,7 minutos. Tempo de retenção de HPLC de fase inversa: 12, 5 minutos > 99% puro.

[0098] Os compostos 12-22 foram preparados de acordo com o Esquema 3. A uma solução de bromobenzoato de metila apropriada (1,0 equiv.) dissolvida em tolueno suficiente para fornecer uma concentração de 0,1 M, foi adicionada uma solução de ácido fenil borônico (2,0 equiv.) dissolvida em EtOH para fornecer uma solução 1,0 M de ácido borônico. Uma solução aquosa 2 M de Na2C03 foi adicionada para fornecer uma concentração de reação final de 0,06 M com relação ao bromobenzoato, seguido pela adição de Pd(PPh3)4 (10,9 mol %). A reação foi agitada a 70°C sob Ar durante 25 horas, e após ser completada, foi resfriada à temperatura ambiente e extraída com CH2CI2 (2x), lavada com salmoura (1 x) secada com MgS04 e concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado através de cromatografia de cintilação (hexano: acetato de etila a 10:1) para fornecer o éster metíli-co.

[0099] A uma solução do éster metílico (1,0 equiv.) em THF: MeOH; H20 (1:1:1) em uma concentração de 0,06 M, foi adicionado LiOH. H20 (3,0 equiv.). A reação foi agitada em temperatura ambiente durante 4 horas, e após ser completada, foi acidificada com 30% de HCI, extraída com acetato de etila (3x5 ml), secada com MgS04 e concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado através de cromatogra-fia de cintilação (CH2CI2, 1 % de MeOH, 0,2 % de ácido acético) para fornecer os ácidos carboxílicos bifenílicos como sólidos brancos em rendimentos de 6 - 93%.

[00100] Ácido 2’,4’-Difluorobifenil-4-carboxílico (12). RMN Ή (DMSO- d6, 400 MHz) δ 13,09 (br s, 1H), 8,04 (ΑΑ’ΧΧ’, 2H, Jaa· = Jxx· = 2, 0 Hz, JXA= Jxa’ = 8,0 Hz, Jxa = Jxa’ - 0, 7 Hz, vA = va· =3213, 3 Hz, vx = vx. = 3056, 2 Hz), 7, 65 (ΑΑ’ΧΧ’, 2 H, como acima), 7,63 (m, 1H), 7,38 (ddd, 1H, J = 11, 2, 9,0, 2, 8 Hz), 7,21 (td, 1H, J = 8,4, 2,2 Hz). RMN 13C (DMSO d6, 100 MHz) δ 167, 1, 160, 8, 158, 0, 138,6, 132, 1, 130,1, 129, 6, 129,0, 123, 9, 112,2, 104, 7, HRESIMS calculado para Ci3H8F202 (M-H) 233, 0414, encontrado 233, 0407. Tempo de retenção de HPLC de fase normal: 13, 3 minutos. Tempo de retenção de HPLC de fase inversa: 12, 6 minutos. > 99% puro.

[00101] Ácido 2’-fluorobifenil-3-carboxílico (15). RMN 1H (CD3OD, 400 MHz) δ 8,18 (q, 1H, J = 1,4 Hz), 8,03 (dt, 1H, J = 7,8, 1,3 Hz), 7,76 (dq, 1H, J = 7,7, 1,5 Hz), 7,55 (t, 1H, J = 7,8 Hz), 7,48 (td, 1H, J = 7,8, 1, 7 Hz), 7, 38 (dddd, 1H, J = 8,3, 7,5, 5, 1, 1, 8 Hz), 7,26 (td, 1H, J = 7,6, 1,3 Hz), 7, 20 (ddd, 1H, J = 11,0, 8,2, 1,2 Hz). RMN 13C (CD3OD, 100 MHz) δ 169, 7, 161, 2, 137,5, 134, 6, 132, 4, 132, 0, 131, 3, 130, 1, 129,9, 129,5, 126,0, 117, 2. HRESIMS calculado para Ci3H9F02 (M-H) 215,0508, encontrado 215,0498. Tempo de retenção de HPLC de fase normal: 10,6 minutos. Tempo de retenção de HPLC de fase inversa: 12, 1 minutos. > 99% puro.

[00102] Ácido 2’-fluorobifenil-4-carboxílico (16). RMN Ή (DMSO d6, 400 MHz) δ 13, 10 (brs, 1H), 8,05 (ΑΑ’ΧΧ’, 2H, Jaa· = Jxx· = 1, 7 Hz, Jxa = Jxa’ = 8,5 Hz, Jxa= Jxa’ = 0,3 Hz, va = va= 3217, 9 Hz, νχ = νχ· = 3070,0 Hz), 7,67 (AA’ XX’, 2H, como acima ) 7, 58 (td, 1H, J = 8,0, 1, 8 Hz), 7,34 (m, 1H). RMN 13C (DMSO d6, 100 MHz) δ 167, 1, 159, 1, 139, 4, 130,8, 130, 3, 130,2, 129,6, 129,0, 127,3, 125, 2, 116,2. HRESIMS calculado para C13H9FO2 (Μ - H) 215, 0508, encontrado 215, 0515. Tempo de retenção de HPLC de fase normal: 12, 3 minutos. Tempo de retenção de HPLC de fase inversa: 12,2 minutos. 99% puro.

[00103] Ácido 3’, 5’-difluorobifenil-3-carboxílico (17). RMN Ή (acetona d6, 400 MHz) δ 8, 30 (td, 1H, J = 2, 0,5 Hz), 8,10 (dtd, 1H, J = 7.6, 1,1, 0,5 HZ), 7,97 (DDD, 1H, J = 7,8, 2,0 1,1 Hz), 7,64 (td, 1H, J = 7,8, 0, 6 Hz), 7,39 (m, 2H), 7,06 (tt, 1H, J = 9,3, 2,4 Hz. RMN 13C (acetona d6, 100 MHz) δ 167, 4 165, 6, 163, 2, 144, 6, 139,8, 132, 5, 132, 4, 130.6, 130,3, 128,9, 111, 0, 103,7. HRESIMS calculado para Ci3H8F202 (M-H) 233, 0414, encontrado 233, 0425. Tempo e retenção de HPLC de fase normal: 13,5 minutos. Tempo de retenção de HPLC de fase inversa: 12, 7 minutos. > 99% puro.

[00104] Ácido 3’,5’-difluorobifenil-4-carboxílico (18). RMN Ή (DMSO d6, 400 MHz) δ 13, 15 (br s, 1H), 8,02 (d, 2H, J= 8,2 Hz), 7,85 (d, 2H, J= 8,5 Hz), 7,49 (m, 2H), 7,26 (tt, 1H, J = 9,4, 2,4 Hz). RMN 13C (DMSO d6, 400 MHz) δ 166, 4, 164, 1, 161, 7, 142, 6, 141, 6, 130, 9, 130,0, 127, 1, 110,2, 103, 5. HRESIMS calculado para C13H8F202 (ΜΗ) 233, 0414, encontrado 233, 0423. Tempo de retenção de HPLC de fase normal: 13,0 minutos. Tempo de retenção de HPLC de fase inversa: 12, 8 minutos. > 99% puro.

[00105] Ácido 2’, 6’-difluorobifenil-3-carboxílico (19). RMN Ή (DMSO d6, 400 MHz) δ 8,03 (dt, 1H, J = 7,8, 1,6 Hz), 8,00 (Μ, 1H), 7,72 (dt, 1H, J = 7,8, 1, 4 Hz), 7,64 (t, 1H, J = 7,7 Hz), 7,53 (m, 1H), 7,26 (t, 2H, J = 8,3 Hz). RMN 13C (DMSO d6, 100 MHz) δ 167, 7, 158,7, 135,0, 132,2, 131, 4, 131, 1, 129,9, 129,5, 112,8, 110, 9. HRESIMS calculado para Ci3H8F202 (M-H) 233, 0414, encontrado 233, 0423. Tempo de retenção de HPLC de fase normal: 13,0 minutos. Tempo de retenção de HPLC de fase inversa: 12, 8 minutos. > 97 % puro.

[00106] Ácido 2’,6’-difluorobifenil-4-carboxílico (20). RMN Ή RMN Ή (DMSO d6, 400 MHz) δ [00107] 8,06 (ΑΑ’ΧΧ’, 2H, Ja* = Jxx· =2,0 Hz, JXA= JXA. = 8,0 Hz, Jxa= Jxa’ = 0, 7 Hz, vA = vA. = 3243, 6 Hz, vx = vx· = 3018, 6 Hz), 7,60 (ΑΑ’ΧΧ’, 2H, como acima) 7,54 (m, 1H), 7,27 (t, 1H, J= 8,3 Hz). RMN13C (DMSO d6, 100 MHz) δ 171,0, 164,0, 134,1, 124, 7,12,0, 121,9, 121, 1, 103, 4. HRESIMS calculado para C13H8F202 (M-H) 233, 0414, encontrado 233, 0423. Tempo de retenção de HPLC de fase normal: 14,5 minutos. Tempo de retenção de HPLC de fase inversa: 12, 1 minutos. > 99 % puro.

[00108] Ácido bifenil-4-carboxílico (22). RMN Ή (DMSO d6, 400 MHz) δ 13, 07 (br s, 1H), 803 (ΑΑ’ΧΧ’, 2H, Λ* = Jxx = 1,8 Hz, = */x’A’ = 8, 3 Hz, J X'A = JXA· = 9,3 Hz,, vA = vA· = 3210, 7 Hz, vx = vx· = 3122, 0 Hz), 7,81 (ΑΑ’ΧΧ’, 2H, como acima) 7, 75 (Μ, 2H), 7,51 (tt, 2H, J = 7,2, 1,1 Hz), 7,4 (tt, 1H, J = 7,4, 1,2 Hz). HRESIMS calculado para Ci3H10O2 (M+ ) 198, 0683, encontrado 198, 0683. Tempo de retenção de HPLC de fase normal: 13,8 minutos. Tempo de retenção de HPLC de fase inversa: 12,2 minutos. > 99 % puro.

[00109] 5-lodo-2-metoxibenzoato de metila. TMS - diazometano (19,25 ml, 38,50 mmol, solução 2M em hexano) foi adicionado a uma solução de ácido 5-iodossalicílico (5,08 g, 19,24 mmol) em MeOH (20 ml) e agitada em temperatura ambiente durante 11 horas. Após ser completada, a reação foi concentrada in vacuo e foi executada no próximo estágio sem purificação adicional.

[00110] lodeto de metila (2,40 ml, 38,48 mmol) e K2C03 (10,60 g, 76, 96 mmol) foram adicionados a uma solução de 5-iodo-2-metoxibenzoato (5, 37 g, 19,24 mmol) em DMF (20 ml) e agitado sob Ar durante 24 horas. Após isto ser completado, acetato de etila foi adicionado e a reação foi lavada com 1% de HCI) 2 x 20 ml), salmoura (1 x), secado com MgS04 e concentrado in vacuo. O resíduo foi purificado através de cromatografia de cintilação (hexano: acetato de etila a 3:1) para fornecer 5-iodo-2-metoxibenzoato de metila (4, 93 g, 88%) como um sólido branco. Vide, por exemplo, Corey, E. J.; Myers, A.G. J. Am Chem. Soc. 1985, 107, 5574-5576, que é aqui incorporado, a título referencial, em sua totalidade.

[00111] RMN Ή (DMSO d6, 400 MHz), δ 7, 90 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 7,80 (dd, 1H,J = 8,8, 2, 4 Hz), 6, 96 (d, 1H, J = 9,0 Hz), 3, 81 (s, 3H), 3, 79 (s, 3H). RMN 13C (DMSO d6, 100 MHz) δ 164, 7, 158,0, 141, 6, 138,5, 122,2, 115, 2, 82,1, 55,9, 52, 0. HREIMS calculado para C9H9IO3 (M+) 291, 9608, encontrado 291, 9596.

[00112] Os compostos 23-27 foram preparados de acordo com o Esquema 4. A uma solução de 5-iodo-2-metoxibenzoato de metila (1,0 equiv.) dissolvido em tolueno suficiente para fornecer uma concentração de 0,08 M, foi adicionada uma solução de ácido fenil borônico (2,0 equiv.) dissolvido em EtOH para fornecer uma solução 0,8 M de ácido borônico. Uma solução aquosa 2M de Na2C03 foi adicionada para fornecer uma concentração final de 0,06 M com relação ao metoxibenzo-ato, seguido pela adição de Pd (PPh3)4 (10,0 mol%). A reação foi agitada a 60°C sob Ar durante 15 horas, e quando completada, foi resfriada á temperatura ambiente e extraída com CH2CI2 (2x), lavada com salmoura (1 x), secada com MgS04 e concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado através de cromatografia de cintilação (hexano: acetato de etila a 3:1) para fornecer os salicilatos metilados.

[00113] A uma solução do salicilato metilado (1,0 equiv.) em CH2CI2 para fornecer uma concentração de 0,06 M, foi adicionado BBr3 (2,0 equiv., solução 1 M em CH2CI2). A reação foi agitada em temperatura ambiente, sob Ar, durante 4 horas, e após ser completada foi rapidamente resfriada com H20 (10 ml), extraída com CH2CI2 (2x), lavada com salmoura (1x), secada com MgS04, e concentrada in vacuo.

[00114] O resíduo foi levado ao próximo estágio sem purificação adicional.

[00115] A uma solução de éster metílico (1,0 equiv) em THF: MeOH: H20 (1:1:1) em uma concentração de 0,06 M, foi adicionado LiOH. H20 (3,0 equiv.). A reação foi agitada em temperatura ambiente durante 4 horas, e quando completada foi acidificada com 30% de HCI, extraída com acetato de etila (3x5 ml) secada com MgS04, e concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado através de cromatografia de cintilação (CH2, Cl2, 1% de MeOH, 0,2% de acido acético) para fornecer os salicilatos de bifenila como sólidos brancos em rendimentos de 12- 42%.

[00116] Ácido 4’- fluoro-4-hidroxibifenil-3-carboxílico (23). RMN 1 H (CD3OD 400 MHz) δ 8,01 (d, 1H, J = 2,5 Hz), 7,65 (dd, 1H, J = 8,7, 2, 5Hz), 7,51 (m, 2H), 7,11 (tt, 2H, J = 10,0, 3,0 Hz), 6, 97 (d, 1H, J = 8,7 Hz. RMN 13C (CD3OD 100 MHz) δ 173,5, 165,0, 162, 7, 137,7, 135, I, 132, 6, 129,6, 129,3, 118, 9, 116, 7, 116,6, 114, 2. HRESIMS calculado para C13H9FO3 (M-H) 231, 0459, encontrado 231, 0457. Tempo de retenção de HPLC de fase normal: 14, 2 minutos. Tempo de retenção de HPLC de fase inversa: 12, 8 minutos. > 99% puro.

[00117] Ácido 2’-fluoro-4-hidroxibifenil-3-carboxílico (24). RMN Ή (CD3OD, 400 MHz) δ 7,98 (dd, 1H, J = 2,2, 1,4 Hz), 7, 59 (ddd, 1H, J = 8,7, 2,4, 1,7 Hz), 7,36 (td, 1H, J = 7,8, 1,7 Hz), 7,26 (dddd, 1H, J = 9,9, 7,4, 4,9, 17Hz), 7,16 (td, 1H, J = 7,5, 1,2 Hz), 7,10 (ddd, 1H, J = II, 1, 8,2, 1,3 Hz), 6,95 (d, 1J, J = 8,5 Hz). RMN 13C (CD3OD, 100 MHz) δ 173, 5, 162, 9, 162, 4, 137,2, 131, 8, 130, 2, 130, 1, 129, 1, 128,1, 125, 8, 118, 5, 117,1, 114,0. HRESIMS calculado para C13H9FO3 (Μ-Η) 231, 0457, encontrado 231, 0446. Tempo de retenção de HPLC de fase normal: 13,8 minutos. Tempo de retenção de HPLC de fase inversa: 12,7 minutos. > 99% puro.

[00118] Ácido 3’, 5’-difluoro-4-hidroxibifenil-3-carboxílico (25). RMN Ή (CD3OD, 400 MHz) δ [00119] 8,07(d, 1H, J = 2,5 Hz), 7,73 (dd, 1H, J = 8,5, 2, 7 Hz), 7,14 (m, 2H), 7,01 (d, 1H, J = 8,9 Hz), 6,86 (tt, 1H, j = 9,0, 2, 5 Hz). RMN 13C(CD3OD, 100 MHz) δ 173,3, 166,3, 163, 8, 145, 1, 135, 2, 131, 0, 29,8, 119,2, 114,4, 110,4, 103,0. HRESIMS calculado para C13H8F203 (M-H) 249,0363, encontrado 249,0356. Tempo de retenção de HPLC de fase normal: 14,5 minutos. Tempo de retenção de HPLC de fase inversa: 13,3 minutos. > 99% puro.

[00120] Ácido 2’,4’-dicloro-4-hidroxibifenil-3-carboxílico (26). RMN Ή (CD3OD, 400 MHz) δ 7,83 (d, 1H, J = 2,2 Hz), 7,70 (d, 1H, J = 2, 0 Hz), 7,58 (dd, 1H, J = 8,6, 2,4 Hz), 7, 48 (ABX, 1H, JAB= 8, 4 Hz), Jax = 2,2 Hz, JBX = 0,0 Hz, vA= 2989, 4 Hz, vB = 2973, 0 Hz), 7,44 (ABX, 1H, como acima), 7,06 (d, 1H, J = 8,7 Hz). RMN 13C (CD3OD, 100 MHz) δ 171, 6, 160, 8, 137,5, 136,4, 132, 8, 132, 6, 132,4, 130, 8, 129, 2, 128,5, 127,7, 117, 2, 112, 9.. HRESIMS calculado para C13H8CI203 (M-H) 280. 9772, encontrado 280, 9782. Tempo de retenção de HPLC de fase normal: 13,1 minutos. Tempo de retenção de HPLC de fase inversa: 13,1 minutos. > 99% puro.

[00121] Ácido 4-hidroxibifenil-3-carboxílico (27) RMN 1H (CD3OD, 400 MHz) δ 8,08 (d, 1H, J = 2,4Hz), 7,73 (dd, 1H, J = 8,7, 2,3 Hz), 7,54 (m, 2H), 7,41 (tt, 2H, J = 7,3, 1, 8 Hz), 7,29 (tt, 1H, J = 7,8, 1, 7 Hz), 7,38 (dddd, 1H, J = 8,8, 6,4 Hz), 7,05 (d, 1H, J = 8,7 Hz), 6, 93 (m, 1H), 6,90 (ddd, 1H, J = 7,3, 1, 9 Hz), 7,00 (d, 1H, J = 8,5 Hz). RMN 13C (CD3OD, 100 MHz) δ 161,5, 140,1, 134,0, 132, 4, 128,7, 128,3, 126, 9, 126, 3, 117,5, 112, 9. HRESIMS calculado para C13H10O3 (M-H) 213, 0552, encontrado 213,0545. Tempo de retenção de HPLC de fase normal: 12,9 minutos. Tempo de retenção de HPLC de fase inversa: 12.6 minutos. > 99% puro.

[00122] 4-Bromo-2,6-difluoroanisol. lodeto de metila (580 pl, 10.06 mmol) e K2C03 (2,80 g, 20,12 mmol) foram adicionados a uma solução de 4-bromo-2,6-difluorofenil (1,05 g, 5,03 mmol) em DMF (10 ml) e agitados em temperatura ambiente, sob Ar, durante 24 horas. Após ser completada, acetato de etila foi adicionado e a reação foi lavada com 1% HCI (2 x 20 ml), salmoura (1 x), secado com MgS04 e concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado através de cromatogra-fia de cintilação (hexano) e fornecer 4-bromo-2,6-difluoroanisol (747 mg, 67%) como um sólido branco. Vide, por exemplo, R. D.; et al. J Fluorine Chem. 2000, 102, 169-174, que é aqui incorporado, a título referencial, em sua totalidade. RMN 1H (CDCI3 400 MHz) δ 7,06 (m, 2H), 3, 97 (q, 3H, J= 1,1 Hz). RMN 13C (CDCI3, 100 MHz) δ 155, 8, 136,3, 116,2, 113, 8, 61,9 LREIMS encontrado para C7H5F20br (M+) 223,0.

[00123] 4-Bromo-2,6-dicloroanisol. lodeto de metila (467 μΙ, 8,12 mmol) e K2C03 (2,24 g, 16,24 mmol) foram adicionados a uma solução de 4-bromo-2,6-diclorofenol (982 mg, 4, 06 mmol) em DMF (10 ml) e agitados em temperatura ambiente, sob Ar, durante 40 minutos. Após isto ser completado, acetato de etila foi adicionado e a reação foi lavada com 1% de HCI (2 x 20 ml), salmoura (1 x), secada com MgS04 e concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado através de cromatogra-fia de cintilação (hexano) para fornecer 4-bromo-2,6-dicloroanisol (768 mg, 74%) como um sólido branco. Vide, por exemplo, Li, J. et al. Med. Chem., 1996, 39, 1846-1856, que é aqui incorporado, a título referencial, em sua totalidade. RMN Ή (DMSO - d6, 400 MHz) δ 7, 75 (s, 2H), 3, 81 (s, 3H). RMN 13C (DMSO - d6, 100 MHz) δ 151, 3, 131,5, 129,6, 116,5, 60,6. HREIMS calculado para C7H5BRCI20 (M+) 253, 8905, encontrado 253, 8901.

[00124] Os compostos 28-31 foram preparados de acordo com o Esquema 5. A uma solução do halo-anisol apropriado (1,0 equiv.) dissolvido em tolueno suficiente para fornecer uma concentração de 0,25 M, foi adicionada uma solução do ácido fenil borônico (2,0 equiv.) dissolvido em EtOH para fornecer uma solução 1, 5 M de ácido borônico. Uma solução aquosa 2M de Na2S03 foi adicionada para fornecer uma concentração de reação final de 0,08 M com relação ao halo-anisol, seguida pela adição de Pd(PPh3)4 (10,0 mol %). A reação foi agitada a 65°C durante 17 horas, e após ser completada, foi resfriada á temperatura ambiente e extraída com CH2CI2 (2x), lavada com salmoura (1x), secada com MgS04, e concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado através de cromatografia de cintilação (hexano: acetato de etila a 20:1) para fornecer a bifenila metilada como um sólido branco.

[00125] A uma solução da bifenila metilada (1,0 equiv.) em CH2CI2 suficiente para fornecer uma concentração de 0,20 M, foi adicionado BBr3 (2,0 equiv., solução 1 M em CH2CI2). A reação foi agitada em temperatura ambiente, sob Ar, durante 3 horas, e ao ser completada, foi rapidamente resfriada com H20 (10 ml), extraída com CH2CI2 (2 x), lavada com salmoura (1x), secada com MgS04 e concentrada in vacuo. O resíduo foi levado ao próximo estágio sem purificação adicional.

[00126] A uma solução de éster metílico (1,0 equiv.) em THF: MeOH: H20 (1:1:1) em uma concentração de 0,04 M, foi adicionado LiOH. H20 (3,0 equiv.). A reação foi agitada em temperatura ambiente durante 5 horas, e após ser completada, foi acidificada com 30% de HCI, extraída com acetato de etila (3x5 ml), secada com MgS04 e concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado através de cromatografia de cintilação (CH2CI2, 1% de MeOH, 0,2% de ácido acético) para fornecer os produtos bifenila como sólidos brancos em 14- 39% de rendimentos.

[00127] Ácido 3’,5’-difloro-4’-hidroxibifenil-3-carboxílico (28). RMN 1H (CD3OD, 400 MHz) δ 10,60 (brs, 1 H), 8,14 (t, 1H, J = 1,7 Hz), 7,91 (dt, 1H, J = 7,7, 1,1 Hz), 7,88 (ddd, 1 H, J = 8,0, 2, 0, 1,1 Hz), 7,55 (t, 1H, J = 7,9 Hz), 7,41 (m, 2H). RMN Ή (CD3OD, 100 MHz) δ 167, 3, 154.0, 151, 5, 138,4, 133, 6, 131, 6, 130,8, 129, 9, 129,4, 128, 4, 127.1, 110,3. RMN Ή (CD3OD, 400 MHz) δ 167, 3, 14, 0, 151, 5, 138,4, 133, 6, 131, 6, 130,8, 129,9, 129,4, 128,4, 127, 1, 110,3. HRESIMS calculado para Ci3H8F203 (M-H) 249,0363, encontrado 249,0358. Tempo de retenção de HPLC de fase normal: 18,3 minutos. Tempo de retenção de HPLC de fase inversa: 10,5 minutos. > 98 % puro.

[00128] Ácido 3’,5,-difluoro-4’-hidroxibifenil-4-carboxílico (29). RMN Ή (DMSO d6, 400 MHz) δ 7,98 (ΑΑ’ΧΧ’, 2H, Jaa· = Jxx· =1, 7 Hz, Jxa ~ Jx\ a’ = 8,2 Hz, JxA= Jxa'= 0,5 Hz, vA= va· = 3189, 9 Hz, [00129] vx = vx. = 3122, 0 Hz), 7,81 (ΑΑ’ΧΧ’, 2 H, como acima), 7,51 (m, 2H). RMN Ή (DMSO d6, 100 MHz) δ [00130] 167,7, 154,5, 142, 5, 136,0, 130,5, 130,5, 130,4, 126,9, 111,0. HRESIMS calculado para Ci3H8F203 (M-H) 249,0363, encontrado 249,0375. Tempo de retenção de HPLC de fase normal: 18,9 minutos. Tempo de retenção de HPLC de fase inversa: 10,2 minutos. > 99 % puro.

[00131] Ácido 3’, 5’-dicloro-4’-hidroxibifenil—3-carboxílico (30). RMN Ή (DMSO d6, 400 MHz) δ 8, 13 (t, 1H, J = 1, 6 Hz), 7,91(m, 2H), 7,70 (s, 2H), 7,56 (t, 1H, J = 7,8 Hz). RMN 13C (DMSO d6, 100 MHz) δ 167, 2, 149,0, 137,9, 132,2, 131, 6, 130,8, 129,3, 128,4, 127,1, 126, 8, 122,9, 123,0. HRESIMS calculado para C13H8CI203 (M-H) 280, 9772, encontrado 280, 9767. Tempo de retenção de HPLC de fase normal: 16,2 minutos. Tempo de retenção de HPLC de fase inversa: 11,6 minutos. > 99 % puro.

[00132] Ácido 3’,5’- dicloro-4’-hidroxibifenil-4-carboxílico (31). RMN Ή (DMSO d6, 400 MHz) δ 7,98 (ΑΑ’ΧΧ’, 2H, Jaa= Jxx· = 1, 7 Hz, Jxa = Jx’A,= 8,1 Hz, Jxa= Jxa = 0,5 Hz, va = va’ =3189,9 Hz, νχ = νχ· =3110,0 Hz), 7,81 (ΑΑ’ΧΧ’, 2H, como acima), 7,78 (s, 2H). RMN 13C (DMSO- d6, 100 MHz) δ 167,2, 141,8, 141, 7, 134,7, 129,9, 127,7, 126,9, 126,4, 123,0. HRESIMS calculado para C13H8CI203 (M-H) 280, 9772, encontrado 280, 9785. Tempo de retenção de HPLC de fase normal: 15,9 minutos. Tempo de retenção de HPLC de fase inversa: 11,4 minutos. > 97 % puro.

[00133] 2’,4’-difluoro-4-hidroxibifenil-3-carboxilato de metila (32). Os compostos 32 e 33 foram preparados de acordo com o Esquema 6. TMS- diazometano (5, 87 ml, 11,75 mmol, solução 2M em hexano) foi adicionada a uma solução de diflunisal (1,03 g, 4,1 mmol) em MeOH )(10 ml) e agitada em temperatura ambiente durante 5 horas. Após ser completada, a reação foi concentrada in vacuo e o resíduo foi purificado através de cromatografia de cintilação (hexano: acetato de etila a 10:1) para fornecer 32 (774 mg, 71%) como um sólido branco. RMN1H (CDCI3, 400 MHz) δ 7,97 (dd, 1H, J = 2,2, 1,3 Hz), 7,59 (dt, 1H, J = 8,8, 2,1 Hz), 7,36 (dq, 1H, J = 7,7, 1,5 Hz), 7,48 (td, 1H, J = 7,8, 1, 7 Hz), 7,38 (dddd, 1H, J = 8,8, 6, 4 Hz), 7,05 (d, 1H, j+ 8,7 Hz), 6,93 (m, 1H), 6,90 (ddd, 1J, J = 10,6, 8,9 < 2, 5 Hz), 3, 96 (s, 1H). RMN 13C (CDCI3, 100 MHz) δ 170,6, 163, 6, 161, 3, 158, 5, 136, 4, 131,2, 130,3, 126,2, 124,2, 118, 0, 112, 6, 111,8, 104, 6, 52, 6, 124, 2. HRFABMS calculado para Ci4H10F2O3 (M+) 264, 0596, encontrado 264, 0598. Tempo de retenção de HPLC de fase normal: 6,9 minutos. Tempo de retenção de HPLC de fase inversa: 14,7 minutos. > 99% puro.

[00134] Ácido 2,4’-difluoro-4-metoxibifenil-3-carboxílico (33). lodeto de metila (350 pi, 1, 16 mmol) e K2C03 (320 mg, 2,32 mmol) foram adicionados a uma solução de 32 (152 mg, 0,58 mmol) em DMF (4 ml) e agitados em temperatura ambiente, sob Ar, durante 14 horas.

Após isto ser completado, acetato de etila foi adicionado e a reação foi lavada com 1% de HCI (2 x 20 ml), salmoura (1 x), secado com MgS04, e concentrado in vacuo e levado para o próximo estágio sem purificação adicional.

[00135] LiOH. H20 (60 mg, 1,43 mmol) foi adicionado a uma solução de diflunisal inteiramente metilado (140 mg, 0,50 mmol) em MeOH: THF: H20 (4,5 ml, 1:1:1) e agitada, em temperatura ambiente, durante 4 horas. Após ser completada, a reação foi acidificada com 30% de HCI, extraída com acetato de etila (3x5 ml), secada com MgS04 e concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado através de cromatografia de cintilação (acetato de etila: hexano a 2:1, 1% de ácido acético) para fornecer 33 (122 mg, 93%) como um sólido branco. RMN 1H (CDCI3, 400 MHz) δ 10,77 (br s, 1H), 8,31 (dd, 1H), J = 2, 5, 0,9 Hz), 7,75 (dt, 1H, J = 8,6, 2,1 Hz), 7, 41 (dt, 1H, J = 8,9, 6,6 Hz), 7,15 (d, 1H, J = 8,8 Hz), 6, 94 (Μ, 1H), 4,13 (s, 3H). RMN 13C (CDCI3, 100 MHz) δ 177,7, 161, 4 158,2, 135, 7, 133, 9, 131,4, 129,0, 123,5, 118,1,112,2, 112,0, 104, 6, 56, 9). HRESIMS calculado para Ci4H10F2O3(M-H) 263,0520, encontrado 263,0514. Tempo de retenção de HPLC de fase normal: 21,6 minutos. Tempo de retenção de HPLC de fase inversa: 11,9 minutos. > 99 % puro.

[00136] Os compostos 34-38 foram preparados e acordo com o Esquema 7. Os compostos 39-44 foram preparados de acordo com o Esquema 8. A uma solução de iodeto de arila (1,0 equiv.) em tolueno suficiente para fornecer uma concentração de 0,07 M, foi adicionado ácido formil fenilborônico apropriado, dissolvido em EtOH suficiente para prover uma concentração de ácido borônico de 0,4 M. Uma solução aquosa 2 M de Na2C03 foi adicionada para fornecer uma concentração de reação final de 0,04 M com relação a iodeto de arila, seguida pela adição de Pd(PPh3)4 (3,0 mol %). A reação foi aquecida até o refluxo sob Ar durante 18 horas e, após ser completada, foi resfriada à tempe- ratura ambiente e extraída com CH2CI2 (2 x), lavada com salmoura (1x), secada com MgS04 e concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado através de cromatografia de cintilação (hexano: acetato de etila a 40:1) para fornecer os bifenil aldeídos como sólidos brancos em 4091% de rendimentos.

[00137] 3’,5’-Dicloro-3-formilbifenil (39). RMN Ή (CDCI3. 400 MHz) δ 10,09 (s, 1H), 8,04 (t, 1H, J = 1, 8 Hz), 7,91 (dt, 1H, J = 7,6, 1,3 Hz), 7,80 (ddd, 1Hm J = 7,8, 2,0, 1,3 Hz), 7,64 (t, 1H, J = 7,8 Hz), 7,49 (d, 2H, J = 1,8 Jz), 7,38 (d, 1H, J = 1, 9 Hz). RMN 13C (CDCI3, 100 MHz) δ 192,0, 142, 8, 139,7, 137, 2, 135, 8, 133,0, 130,1, 130,0, 128,1, 128,0, 125,9. HRFABMS calculado para C13H8CI20 (M+ H) 251, 0027, encontrado 251,0027. Tempo de retenção de HPLC de fase normal: 8,0 minutos. Tempo de retenção de HPLC de fase inversa: 15,2 minutos > 99% puro.

[00138] 3’,5’-Dicloro-4-formilbifenil (40). RMN Ή (CDCI3, 400 MHz) δ 7,99, (M’XX\ 2H, Jaa= Jxx= 2,1 Hz, = JXA. = 8,5 Hz, JXA= Jxa· = 0,7 Hz, vA— vA= 3193, 7 Hz, vx= vx· = 3077, 8 Hz), 7,70 (AA’XX\ 2H, como acima ), 7,47 (t, 1H, J = 1, 9 Hz), 7, 39 (d, 2H, J = 1, 9 Hz). RMN 13C (CDCI3, 100 MHz) δ 191, 8, 144,4, 142, 9, 136, 2 135, 8, 130,6, 128, 5, 127, 9, 126,1. HREIMS calculado para C13H8CI20 (M+ H) 248, 9873, encontrado 251,0029. Tempo de retenção de HPLC de fase normal: 7,9 minutos. Tempo de retenção de HPLC de fase inversa: 15,2 minutos > 99% puro.

[00139] 3’,5’-Dicloro-3-formilbifenil (41). RMN Ή (CDCI3. 400 MHz) δ 9,98 (s, 1H), 8,03 (dd, 1H), J = 7,8, 1,3 Hz), 7, 66 td, 1H, J = 7, 6, 1, 5 Hz), 7,55 (tt, 1H, J = 7,6, 1, 0 Hz), 7,44 (t, 1H, J = 1,9 Hz), 7, 39 (dd, 1H, J = 7,7, 1, 0 Hz), 7,27 (d, 2H), J = 1, 9 Hz). RMN 13C (CDCI3, 100 MHz) δ 191,4, 142, 9, 141,0, 135, 3, 134,0, 133,7, 130,7, 129,0, 128,5, 128,4, 128,4. HRFABMS calculado para C13H8CI20 (M+ H) 251, 0030, encontrado 251, 0029. Tempo de retenção de HPLC de fase normal: 7,0 minutos. Tempo de retenção de HPLC de fase inversa: 14,9 minutos > 99% puro.

[00140] Os compostos 45-47 foram preparados de acordo com o Esquema 8. A uma solução de bifenil aldeído (1,0 equiv.) em acetona suficiente para fornecer uma concentração de 0,07 M, foi adicionado KMn04 (2, 0 equiv.) em H20 suficiente para fornecer uma concentração de permanganato 0,2 Μ. A reação foi agitada durante 16 horas em temperatura ambiente, e após ser completada, foi concentrada in vácuo e o resíduo resultante foi novamente dissolvido em CH2CI2: MeOH a 10:1 e filtrado através de um tampão de lã de vidro. O produto bruto foi purificado através de cromatografia de cintilação (CH2CI2: MeOH a 10:1) para fornecer os ácidos carboxílicos (58 mg, 100%) como sólidos brancos em rendimentos de 82-100%.

[00141] Ácido 2’, 4’-diclorobifenil-3-carboxílico (45). RMN Ή (DMSO d6, 400 MHz) δ 8, 22 (br s, 1H), 8,00 (br s, 1H), 7,94 (d, 1H, J = 7,5 Hz), 7,76 (s, 2H), 7,63 (s, 1H), 7,60 (brs, 1H). RMN 13C (DMSO d6, 100 MHz) δ 168,0, 143, 7, 138,1, 135, 4, 131, 6, 129,9, 127,9, 126, 2. HRESIMS calculado para [00142] C13H8CI202 (Μ- H) 265,9823, encontrado 264, 9810. Tempo de retenção de HPLC de fase normal: 12, 3 minutos. Tempo de retenção de HPLC de fase inversa: 14, 2 minutos > 99% puro.

[00143] Ácido 2’, 4’-diclorobifenil-4-carboxílico (46). RMN Ή (CDCI3. 400 MHz) δ 8,11 (br s, 2H), 7,72 (m, 2H), 7,64 (d, 2H, J = 1, 9 Hz), 7,46 (t, 1H, J = 1,7 Hz). RMN 13C (DMSO d6, 100 MHz) δ 170,3, 140,6, 135, 2, 127,2, 126,4, 119,3, 118,6, 117,4. HRESIMS calculado para Ci3H8CI202 (Μ- H) 264,9830, encontrado 264, 9823. Tempo de retenção de HPLC de fase normal: 12,5 minutos. Tempo de retenção de HPLC de fase inversa: 14,4 minutos > 99% puro.

[00144] Ácido 2’, 4’-diclorobifenil-2-carboxílico (47). RMN Ή (DMSO d6, 400 MHz) δ 7,75 (br s, 1H), 7,56 (s, 2H), 7,48 (Μ, 2H), 7,36 (m, 2H). RMN 13C (DMSO d6, 100 MHz) δ 170,1, 152,5, 145,2, 133,3, 130,0, 129,6, 128,0, 127,2, 126, 3. HRESIMS calculado para C13H8CI202 (Μ- H) 264,9830, encontrado 264, 9834. Tempo de retenção de HPLC de fase normal: 11,4 minutos. Tempo de retenção de HPLC de fase inversa: 13,6 minutos > 99% puro.

[00145] Os compostos 48-53 foram preparados de acordo com o Esquema 8. A uma solução de bifenil aldeído (1,0 equiv.) em MeOH suficiente para fornecer uma concentração de 0,1 M, foi adicionado NaBH4 (, 0 equiv.) em MeoH suficiente para fornecer uma concentração de boroidreto 0,3 Μ. A reação foi agitada a 0°C, e lentamente aquecida à temperatura ambiente, e após agitação durante 16 horas, foi concentrada in vacuo e purificada através de cromatografia de cinti-lação (hexano: acetato de etila a 3:1) para fornecer os álcoois binfení-licos como sólidos brancos em rendimentos de 94-100%.

[00146] 3’,5’-Diclorobifenil-3-il-metanol (48). RMN Ή (CDCI3. 400 MHz) δ 7,54 (m, 1H), 7,46 (d, 2H, J = 1, 8 Hz), 7,45 (m, 2H), 7,39 (m, 1H), 7,34 (t, 1H, J = 1, 9 Hz), 4,77 (s, 2H), 1, 90 (br s, 1H). RMN 13C (DMSO d6, 100 MHz) δ 144,1, 141,9,139,0, 135,5, 129,5, 127,4, 126,5, 125.7, 65,3. HRESIMS calculado para C13H10CI2O (M+) 252,0103, encontrado 252,0109. Tempo de retenção de HPLC de fase normal: 13,9 minutos. Tempo de retenção de HPLC de fase inversa: 14,0 minutos > 99% puro.

[00147] 3’,5’-Diclorobifenil-4-il-metanol (49). RMN Ή (CDCI3. 400 MHz) δ 7,53 (ΑΑ’,ΧΧ, 2H, Jaa· = 1, 9 Hz, Jxx= 3,1 Hz, Jxa = 8, 7 Hz, JXA = 6, 4 Hz, Jxa = Jxa’ = 0, 5 Hz, vA= va = 3009, 8 Hz, vx = vx· = 29,77, 8 Hz), 7,45 (ΑΑ’ΧΧ’, 2H, como acima), 7,45 (d, 2H, J =1,9 Hz), 7,33 (t, 1H, J = 1, 9 Hz), 4,75 (br d, 2H, J = 4, 8 Hz), 1,81 (br t, 1H, J = 5, 2 Hz). RMN 13C (DMSO d6, 100 MHz) δ 144,1, 141,4, 138,0, 135,5, 127.8, 127,4, 127,4, 125,8, 65,1. HRESIMS calculado para C13H10CI2O (M+) 252,0110, encontrado 252,0109. Tempo de retenção de HPLC de fase normal: 15,4 minutos. Tempo de retenção de HPLC de fase inversa: 14,0 minutos > 97% puro.

[00148] 3’,5’-Diclorobifenil-2-il-metanol (50). RMN Ή (CDCI3. 400 MHz) δ 7, 55 (dd, 1H, J = 7,5, 1, 3 Hz), 7, 43 (td, 1H, J = 7,5, 1,4 Hz), 7,38 (m, 2H), 7,29 (d, 2H, J = 1, 9 Hz), 7,24 (dd, 1H), J = 7,4, 1,4 Hz), 4, 58 (s, 2H), 1, 79 (s, 1H). RMN 13C (DMSO d6, 100 MHz) δ 144,1, 141.4, 138,0, 135,5, 127,8, 127,4, 127,4, 125,8, 65,1. HRESIMS calculado para Ci3H10CI2O (M+) 252,0110, encontrado 252,0109. Tempo de retenção de HPLC de fase normal: 11,5 minutos. Tempo de retenção de HPLC de fase inversa: 14,0 minutos > 97% puro.

[00149] Os compostos 54 e 55 foram preparados de acordo com o Esquema 9. A uma solução do iodobenzaldeído apropriada (1,0 equiv.) em tolueno suficiente para fornecer uma concentração de 0,07 M, foi adicionado ácido 3,5-difluorofenil borônico. Uma solução aquosa 2M de Na2C03 foi adicionada para fornecer uma concentração de reação final de 0,04 M com relação a iodobenzaldeído, seguida pela adição de Pd(PPh3)4 (4,0 mol%). A reação foi agitada a 60°C durante 17 horas, e após ser completada, foi resfriada à temperatura ambiente e extraída com CH2CI2 (2 x), lavada com salmoura (1x), secada com MgS04 e concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado através de cromatogra-fia de cintilação (hexano: acetato de etila a 10:1) para fornecer os bife-nil aldeídos como sólidos brancos em rendimentos de 78-80%.

[00150] 3,5’-difluoro-3-formilbifenil (54). RMN Ή (CDCI3. 400 MHz) δ 10,06 (s, 1H), 8,02 (t, 1H, J =1,4 Hz), 7,88 (dt, 1H, J = 7,9, 1, 4 Hz), 7,78 (ddd, 2H, J = 7,8, 2,0, 1,2 Hz), 7,61 (t, 2H, J = 7,7), 7,10 (m, 2H), 6,80 (tt, 1H, J = 8,8, 2,3 Hz). RMN 13C (DMSO d6, 100 MHz) δ 192,0, 164,8, 162,3, 143,0, 139,8, 137,1, 132,9, 129,9, 127,9, 110,4, 103.5. HRFABMS calculado para Ci3H8F20 (M+ H) 219, 0620 encontrado 219,0621 Tempo de retenção de HPLC de fase normal: 8,9 minutos. Tempo de retenção de HPLC de fase inversa: 13,7 minutos > 99 % puro.

[00151] 3,5’-difluoro-4-formilbifenil (55). RMN Ή (CDCI3. 400 MHz) δ 9,98 (s, 1H), 8,02 (dd, 1H, J = 7,8, 1, 5 Hz), 7,65 (td, 1H, J = 7.3, 1,4 Hz), 7,54 (t, 1H, J = 7,8 Hz), 7,40 (dd, 1H, J= 7, 6, 1,2 Hz), 6,90 (m, 3H). RMN 13C (CDCI3, 100 MHz) δ 191,5, 164,1, 161,6, 143,4, 141.3, 134,0, 133,7, 130,6, 129,0, 128,3, 113,3, 103,8. HRFABMS calculado para Ci3H8F20 (M+ H) 219, 0620 encontrado 219,0621 Tempo de retenção de HPLC de fase normal: 7,0 minutos. Tempo de retenção de HPLC de fase inversa: 13,4 minutos > 99 % puro.

[00152] Uma quantidade de teste in vitro pode ser usada para avaliar os compostos quanto à sua capacidade de estabilizar tetrâmeros de transtiretina ou para evitar a formação de fibrilas. Os testes podem incluir um ensaio de formação de fibrila, um ensaio de seletividade de plasma, a determinação da estrutura tridimensional de complexo transtiretina: composto (por exemplo, através de cristalografia de raio X) cinética de dissociação de tetrâmetro de transtiretina ou formação de fibrilas, através de, por exemplo, centrifugação ou calorimetria. Os detalhes de ensaios in vitro exemplares são apresentados abaixo.

[00153] Cada composto foi submetido a um ensaio de formação de fibrila estagnado. Os compostos foram secados com P205 durante a noite e dissolvidos em DMSO até uma concentração final de 7,2 mM para prover uma solução de material primário (10 x material). Uma solução de material secundário foi preparada através de dissolução da solução de material primário cinco vezes com DMSO até uma concentração final de 1,44 mM (2x material). A amiloidogeicidade de TTR mediada por ácido (3, 6 μΜ), na presença de inibidores (1,44 mM) foi medida como se segue: A uma cuba de UV descartável foram adicionados 495 pl de uma solução de proteína WT TTR a 0,4 mg/ml em fosfato de sódio 10 mM, KCI 100 mM e EDTA 1 mM (pH 7,6) e 5 pl da solução de inibidor de material secundário 1,44 mM em DMSO (2 x mate- rial). A mistura foi turbilhonada e incubada durante 72 horas a 37°C, sem agitação. Após 72 horas, as cubas foram turbilhonadas para suspender quaisquer fibrilas presentes, e a turvação da suspensão foi medida a 350 e 400 nm usando um espectrômetro UV-vis. A formação de fibrila percentual foi obtida através da razão das turvações para cada TTR acrescida da amostra de inibidor em reação àquela de uma amostra preparada do mesmo modo, mas sem inibidor, multiplicada por 100. O ensaio de formação de fibrila empregando inibidor equimolar e concentração de TTR (3,6 μΜ) foram executadas como acima usando uma solução de material secundário 1 x. A solução de material 1 x foi preparada pela diluição dez vezes da solução de material primário 10 x 7,2 mM com DMSO a uma concentração final de 0,72 mM e usada no ensaio de formação de fibrila como acima descrito. Todos os ensaios foram executados em triplo e todos os compostos foram testados usando TTR do tipo selvagem. Foi verificado que todos os compostos eram solúveis durante todo o curso do experimento através de teste das turvações das soluções na ausência de WT TTR, assegurando que a turvação era o resultado da formação de amilóide de TTR.

[00154] As estequiometrias de ligação de inibidores potenciais de TTR no plasma sangüíneo foram avaliados por um método de captura de anticorpo/ HPLC. Um tubo Eppendorf de 1,5 ml foi enchido com 1,0 ml de plasma sangüíneo humano e 7,5 pi de uma solução de DMSO 1,44 mM do inibidor sob avaliação. A solução foi incubada e agitada suavemente a 37°C durante 24 horas. Uma suspensão de gel: TSA a 1:1 (tris salino) (125 pi) de sefarose rapidamente resfriada foi adicionada à solução e suavemente agitada a 4°C durante 1 hora. A solução foi centrifugada (16.000 x g) e o sobrenadante foram divididos em duas alíquotas de 400 μΙ, que foram então adicionados a diferentes amostras de 200 μΙ de uma suspensão de gel; TSA a 1:1 de sefarose conjugada com anticorpo anti-TTR. As soluções foram suavemente agitadas a 4°C durante 20 minutos, centrifugadas (16.000 x g) e o so-brenadante foi removido. O gel foi lavado com 1 ml de TSA/ 0,05% de saponina (3x10 minutos cada) a 4°C, seguido por 1 ml de TSA (2 x, 10 minutos cada) a 4°C. As amostras foram centrifugadas 16.000 x g), a lavagem final foi removida, e 155 pi de trietilamina 100 mM, pH 11,5, foram adicionados para eluir a TTR e os inibidores ligados a partir dos anticorpos. Após agitação suave a 4°C durante 30 minutos, a amostra de eluição foi centrifugada (16.000 x g) e 145 μΙ do sobrenandante, contendo TTR e inibidor, foram removidos. O sobrenadante foi então analisado através de HPLC de fase inversa como anteriormente descrito. Vide, por exemplo, Purkey, Η. E.; Dorrell, Μ. I.; Kelly, J. W. Proc. Natl. Acad. Sei U. S.A., 2001, 98, 5566-71, que é aqui incorporado, a título referencial, em sua totalidade.

[00155] Os cristais de WT TTR foram obtidos a partir de soluções de proteína a 7 mg/ ml (em KCI 100 mM, EDTA 1 mM, fosfato de sódio 10 mM, pH 7,0, sulfato de amônio 0,35- 0,50 M) equilibrado contra sulfato de amônio 2M, em gotas. Os complexos do ligante de TTR foram preparados a partir de cristais embebidos durante mais do que três semanas com um excesso molar de 10 vezes do ligante. Um detector CCD-PXL- L600 (Bruker Instruments) acoplado a um gerador de raio X de anodo rotativo RU200 foi usado para a coleta de dados dos cristais embebidos com 20 ou 26. O detector Quantum-4 na fonte de energia monocromática de 14-BM-C, BIOCARS, Advance Photon Source foi usado para a coleta de dados de cristais embebidos com 1 ou 18. Os cristais foram colocados em óleo de paratona como um crioprotetor e resfriados para experimentos de difração (120 K para 20 e 26, e 100 K para 1 e 18). Os cristais das estruturas de TTR- complexo ligante são isomorfas com a forma de cristal apo com as dimensões de unidade celular próximas a = 43 Á, b = 85 Á e c= 66 Á; grupo espacial P2-|2-|2 com dois monômeros na unidade assimétrica. Os conjuntos de dados de 1 e 18 foram reduzidos com DENZO e SCALEPACK. Vide Ot-winowski, Z.; Minor, W. Macromolecular Crystallography, Parte A, em Methods in Enzymology; Carter, C.W., Sweet, R. M. Eds.; Academic Press:1997; Vol.276, págs. 307-326, que é aqui incorporado, a título referencial, em sua totalidade. Conjuntos de dados de 20 e 26 foram reduzidos com SAINT e PROSCALE (Bruker AXS, Inc.).

[00156] As coordenadas para TTR do Protein Data Bank (número de acesso 1BMZ) foram usados como um modelo de partida durante a pesquisa de substituição molecular por EPMR. As melhores soluções de EPMR foram refinados através de dinâmica molecular e protocolos de minimização de energia de CNS. Os mapas de Fourier de diferença resultantes revelaram a ligação dos ligantes (em duas conformações para 18, 20 e 26, e quatro conformações para 1) em cada cavidade de ligação do tetrâmero de TTR. Usando estes mapas, o ligante poderia ser colocado na densidade, de modo não ambíguo, e foi incluído no refinamento cristalográfico. Após vários ciclos de recozimento simulado e subseqüente refinamento do fator de temperatura e posicionai, moléculas de água foram colocadas em mapas de Fourier de diferença. O ciclo final do ajuste do mapa foi executado usando o mapa de densidade eletrônica ponderada não polarizada, calculado pelo protocolo de remoção de polarização por agitação/desvio. Todas as conformações de ligação do ligante estavam em boa concordância com os mapas de omissão de recozimento não- polarizados, assim como com os mapas ponderados não- polarizados de agitação/desvio em fase na ausência do inibidor. Os ciclos finais do refinamento foram executados pelo protocolo de refinamento restrito de Refmac. Devido à falta de densidades eletrônicas interpretáveis no mapa final, os nove resíduos N-terminais e os três resíduos C-terminal não foram incluídos no modelo final. Um sumário de análise cristalográfico é apresentado na Tabela 2. Vide, por exemplo, Kissinger, C. R.; Gelhaar, D. K.; Fogel D. B. Acta Crystallogr., Sect. D 1999, 55, 484- 491; Brunger, A. T; et al. Acta Crystallogr., Sect. D 1998, 54, 905-921; Kantardjieff, K.; et al. Acta Crystallogr. Sect. D 2002, 58, 735- 743; Bailey, S. Acta Crytallogr., Sect. D 1994, 50, 760 - 763; e Murshudorv, G. N.; Vagin, A. A.; Dodson, E. J. Acta Crystallogr., Sect. D 1997, 53, 240- 255, cada um dos quais é aqui incorporado, a título referencial, em sua totalidade.

[00157] A cinética de dissociação de tetrâmero de TTR foi avaliada através de desdobramento de monômero ligado em uréia. A dissociação de tetrâmetro lenta não é detectável por espectroscopia CD além de UV, como previamente descrito. A cinética de dissociação de tetrâmero de TTR (3,6 μΜ) como uma função do inibidor (3,6 pM) foi avaliada através da adição de 3, 6 pl de uma solução 1 mM (em eta-nol) do inibidor de interesse a 69 pl de WT TTR (2,90 mg/ ml, fosfato de sódio 10 mM, KCI 100 mM, EDTA 1 mM, pH 7,0), ao qual foi adicionado 127,4 pl de tampão de fosfato. Para uma concentração de inibidor (7, 2 pM) duas vezes aquela da concentração de TTR (3,6 pM), 7,2 pl de uma solução 1 mM (em etanol) do inibidor de interesse foi adicionada a 69 pl de WT TTR (2,90 mg/ ml, fosfato de sódio 10 mM, KCI 100 mM, EDTA 1 mM, pH 7,0), ao qual foi adicionado 123, 8 pl de tampão de fosfato. 100 pl da solução de inibidor de proteína de interesse foram adicionados a uma solução de 600 pl de uréia 10,3 M e 300 pl de tampão de fosfato para fornecer uma concentração de uréia final de 6,5 M. As soluções foram turbilhonadas e os espectros de di-croísmo circular foram coletados nos seguintes intervalos: 0, 5, 8, 23, 46, 71, 95, 118, 144 e 168 horas. Uma amostra de controle contendo 7,2 pl de etanol preferivelmente ao inibidor foi preparada a título comparativo e os espectros foram coletados nos pontos de tempo acima identificados. Os espectros CD foram coletados entre 220 e 213 nm, com escaneamento a cada 0,5 nm e um tempo médio de 10 segundos.

Cada comprimento de onda foi escaneado uma vez. A média dos valores para a amplitude estava entre 220 e 213 nm para determinar a extensão da perda de folha β em todo o experimento.

[00158] A taxa de formação de fibrila mediada por ácido foi seguida em pH de 4,4 por turvação. Os compostos foram secados com P205 durante a noite e dissolvidos em DMSO em uma concentração final de 7,2 mM para prover uma solução de material primário (10 x material). Uma segunda solução de material foi preparada pela diluição de DMSO em cinco vezes da solução de material primário para fornecer uma concentração final de 1,44 mM (2 x material). O ensaio de formação de fibrila empregando uma concentração de inibidor de 7,2 μΜ em relação a TTR (tetrâmero) 3,6 μΜ foi executado como se segue. A uma cuba de UV descartável foram adicionados 495 pi de uma solução de proteína WT TTR em fosfato de sódio 10 mM, KCI 100 mM e EDTA 1 mM (pH 7,6) e 5 pi da solução de material de inibidor secundário 1,44 mM (2 x material). A mistura foi turbilhonada e incubada durante 30 minutos (25°C). Após 30 minutos, o pH foi reduzido para 4,4 com 500 pi de acetato 200 mM, KCI 100 mM, EDTA 1 mM (pH 4,2). A solução final de 1 ml foi turbilhonada e incubada a 371 °C, sem agitação. As soluções foram turbilhonadas e foi medida a turvação a 350 e 400 nm. Os espectros UV foram coletados no seguintes intervalos: 0, 4, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 e 192 horas após a acidificação. Uma amostra de controle contendo 5 pi de DMSO foi preparada a título comparativo, e os espectros foram coletados no pontos de tempo acima. Cada solução de inibidor foi preparada em grupos de 10 para evitar a perturbação das cubas antes que fosse efetuada uma leitura. Após ser obtida uma absorção de UV, as cubas correspondendo àquele ponto de tempo foram descartadas. O ensaio de formação de fibrila empregando concentração de inibidor e de TTR equimolar (3,6 pM) foi executado como acima usando uma solução de material de inibidor secundário 1x, preparada como se segue: Uma solução de material foi preparada pela diluição dez vezes da solução de material primário 10 x 7,2 mM com DMSO a uma concentração final de 0,72 mM e usada no ensaio de formação de fibrila, como acima descrito. Foi verificado que todos os compostos eram solúveis em todo o curso do experimento, assegurando que a turvação era o resultado da formação de amilóide de TTR.

[00159] A estrutura quaternária de TTR, na presença de inibidores em pH de 4,4, foi analisada. O mecanismo pelo qual 18 e 20 estabilizam TTR foi avaliado pela incubação da proteína (3, 6 μΜ) durante 72 horas, sob as condições do ensaio de formação de fibrila estagnada, na presença de inibidor 3,6 pM ou 7,2 pM. Após 72 horas, as amostras foram centrifugadas (14 000 x g) e o sobrenadante foi removido a partir de qualquer sólido que fosse formado no ensaio. A análise de ultra-centrifugação de velocidade e equilíbrio foi alcançada com uma centrífuga analítica Beckkamn XL-I. A aquisição e a análise dos dados foi executada como previamente descrito. Vide, por exemplo, Lashuel, H. A.; Lai, Z.; Kelly, J. W. Biochemistry 1998, 37, 17851-64; e Lashuel, H.A.; et ai. Biochemistry 1999, 38, 13560 - 73, cada um dos quais é aqui incorporado a título referencial, em sua totalidade. As constantes de dissociação, que caracterizam a ligação de 18 e 20 a WT TTR foram determinadas através de calorimetria de titulação isotérmica usando um instrumento Microcal (Microcal Inc., Northhampton, MD). Uma solução de inibidor (300 pM ou 500 pM em tampão tris 25 mM, KCI 100 mM, EDTA 1 mM, 12% de EtOH, pH 8,0) foi preparado e titulado em célula ITC contendo TTR de WT (15 pM ou 25pM em tampão tris 25 mM, KCI 100 mM, EDTA 1 mM, 12% de EtOH, pH 8,0). A injeção inicial de 2,5 pi foi seguida por 50 injeções de 5,0 pi cada (25°C). A integração do termograma após a subtração de espaços em branco forneceu uma isoterma de ligação que melhor se adapta a um modelo de dois sítios de ligação seqüenciais com cooperatividade negativa. Os dados foram ajustados por uma abordagem de quadrados mínimos não lineares com quatro parâmetros ajustáveis, ou seja, Κ-ι, ΔΗ-ι, K2, ΔΗ2, usando o módulo de análise de dados ITC ORIGIN na versão 2,9, provido por Microcal.

[00160] Os compostos descritos foram avaliados como inibidores de fibrila amilóide de TTR usando um ensaio de turvação. A amiloidose de WT TTR foi iniciada pela acidificação de TTR previamente incubada com inibidor (25°C, 30 minutos), empregando adição de tampão para que o pH salte para um valor final de 4,4. Após a incubação de cada mistura durante 72 horas (37°C), a turvação foi medida a 350 e 400 nm usando um espectrômetro US-vis. Todos os dados de formação de fibrila amilóide foram normalizados para amiloidegênese de WT TTR na ausência de inibidor, atribuída a 100% de formação de fibrila. Portanto, 5% de formação de fibrila corresponde a um composto, que inibe 95% da formação de fibrila de WT TTR após 72 horas. Cada inibidor potencial foi primeiramente avaliado em uma concentração de 7,2 μΜ em relação a uma concentração de tetrâmero de TTR de 3,6 μΜ. Os compostos que permitiram menos que 15% de formação de fibrila foram novamente avaliados em uma concentração igual à concentração de TTR (3, 6 μΜ) para selecionar os inibidores com eficácia mais alta. A formação de fibrila de menos do que 40% sob estas condições é caracterizada por um inibidor muito bom, enquanto que 40-70% de inibição é indicativo de um composto modesto. Os dados de formação de fibrila são apresentados na Tabela 1.

[00161] Com base nos dados de eficácia do inibidor para os compostos 2-55, parece que um anel hidrofílico substituído por carboxilato diretamente conectado a um anel hidrofóbico funcionalízado dí- halogênio é suficiente para uma atividade excelente (Tabela 1). Um substituinte fenólico em lugar de um carboxilato (2-10) fornece inibidores consideravelmente menos ativos, muito inferiores ao composto I. Inibidores tendo um halogênio na posição orto ou meta do anel hidro-fóbico são superiores a compostos, em que halogênios não estão presentes ou àqueles tendo um único para- halogênio. Isto sugere que para- halogênios não complementam os HBPs do mesmo modo que biarilas meta ou orto- halogenadas. A remoção completa de todos os halogênios pode resultar em um inibidor fraco, presumivelmente devido à falta de complementaridade estérica para preencher as cavidades de ligação de halogênio (por exemplo, os compostos 10, 21-22, 27, 4244, e 51-53). Sob as condições testadas, o melhor composto fenólico (8) é inferior a 1, que contém tanto uma funcionalidade de carboxilato quanto fenólica no anel hidrofílico. Compostos biarila estabilizados com um único carboxilato (tais como 11-12) podem ser excelentes inibidores de fibrila amilóide, por exemplo, os compostos 11, 12, 15-20. Estes rivalizam diflunisal quanto à inibição, a exceção sendo aqueles contendo apenas um para- halogênio (por exemplo os compostos 13 e 14). Um aril carboxilato meta ou para - substituído pode ser suficiente para conferir excelentes propriedades de inibição, sugerindo que o substituinte hidroxila em 1 não é requerido para uma boa atividade do inibidor. Em adição o posicionamento para- carboxilato parece proporcionar inibidores superiores, sugerindo que um carboxilato pode obter melhor vantagem das interações eletrostáticas com os grupos ε-amônio de Lys 15 e 15’(modo de ligação dianteiro), como no caso de 20, ou de interações de ligação de hidrogênio com os grupos hidroxila Ser 117 e 117’ (modo de ligação inverso) como no caso de 18. Biarilas, em que o anel hidrofóbico é substituído por halogênios em posições outras que a posição para e o anel hidrofílico com meta e particularmente para - carboxilatos, fornece inibidores de formação de fibrila amilóide de TTR altamente eficazes.

[00162] A adição de um substituinte hidroxila a um anel contendo um substituinte carboxilato (a substituição do ácido salicílico, por exemplo, 23-27) pode resultar em inibidores com elevada atividade, similares a diflunisal. Em biarilas com o núcleo de ácido salicílico, o exato posicionamento do halogênio não parece ser tão vital quando nos casos prévios, sugerindo que este anel contribui, de modo desproporcional, para a energia de ligação. O para- hidroxila pode participar na ligação de hidrogênio com os grupos ε- amônio de Lys 15 e 15’ (modo de ligação dianteiro) ou com os hidroxilas Ser 117 e 117’ (modo de ligação inverso). A substituição de flúor em 1 com cloro (26) pode resultar em um inibidor com atividade igual ou superior, enquanto que a completa remoção dos halogênios (27) pode resultar em um inibidor modesto. Deve ser notado que 27 é apenas ligeiramente superior a um para- carboxilato 22 in vitro, e ambos são superiores a aos inibidores isentos de halogênio, com o carboxilato na posição meta, 21, e o análogo contendo hidroxila 10.

[00163] A inclusão de um substituinte 3’, 5’-dialo-4-hidroxila no anel contendo halogênio, com carboxilatos ou nas posições meta ou para (28-31) pode resultar em elevada atividade inibidora, similar a diflunisal. A substituição 4-hidroxila foi incluída de modo a simular mais pro-ximamente tiroxina, o ligante natural de TTR. Estes inibidores podem também simular mais proximamente a atividade do hormônio de tiroxina e podem, portanto, agir como agonistas ou antagonistas da tireóide, um efeito que pode ser indesejável.

[00164] A proteção do carboxilato como um éster metílico ou do hidroxila como um éter metílico (32 e 33) pode resultar em inibidores inferiores, comparados a 1. Uma combinação da perda de carga e do aumento da massa estérica explica provavelmente estas observações. A remoção de todos os substituintes hidrofílicos (por exemplo, 34-38) pode resultar em inibidores fracos. Um composto biarila contendo apenas substituição cloro meta (por exemplo, 38) pode ser um inibidor modesto, sugerindo que os cloros produzem contatos melhorados nas cavidades de ligação de halogênio quando comparados a biarilas contendo flúor (37).

[00165] Vários inibidores contendo cloro foram sintetizados e sua atividade de inibição de fibrila d e TTR avaliada. Quando membros desta classe de inibidores contêm carboxilatos nas posições meta ou para (por exemplo, 45 e 46) eles podem possuir alta atividade, enquanto que aqueles tendo um carboxilato orto (tal como 47) podem ser um inibidor inferior. Esta observação sugere que o carboxilato orto pode estar muito distante dos grupos ε- amônio Lys 15 e 15’ para produzir interações eletrostáticas favoráveis (modo de ligação dianteiro) ou dos grupos hidroxila Ser 117 e 117’ para serem submetidos a interações de ligação de hidrogênio (modo de ligação inverso). Os álcoois benzílicos 48- 50 comprovaram, de modo surpreendente, ser excelentes inibidores de formação de fibrila. A substituição dicloro meta em um anel parece ser complementar à funcionalidade do álcool benzílico em qualquer posição orto, meta ou para, potencialmente devido à ligação de hidrogênio ou à ligação de hidrogênio mediada por água. Uma série de análogos de aldeído (39-41) em que os grupos -CH2OH foram substituídos por uma funcionalidade aldeído, apresentaram boa inibição exceto no caso do para- aldeído 41, possivelmente devido à hidra-tação do aldeído para um gem diol. É possível que os aldeídos, os álcoois benzílicos e os carboxilatos sejam ligados na cavidade através de um mecanismo diferente. Na ausência de informação estrutural, no entanto, um modo de ligação similar não pode ser excluído. É também possível que os aldeídos se liguem, de modo covalente, ou a Ser 117 (117’) através de um hemiacetal ou a LYs 15 (15’) através de uma ligação amina. A substituição dos cloros por flúor (54 e 55) no caso dos aldeídos pode resultar em inibidores substancialmente fracos (39 e 41). Como antes, a remoção completa dos halogênios pode resultar em inibidores com fraca atividade (42 e 44), exceto no caso do meta-aldeído 43, em que a atividade é modesta. Esta atividade modesta pode resultar de um alto grau de hidratação. É surpreendente que o 3’,5’-difluoro-meta-aldeído (54) seja inferior aos halogênios sem aldeído (42).

[00166] Inibidores que mantêm a formação de fibrila de TTR abaixo de 50%, em uma concentração igual àquela de TTR (3, 6 μΜ) foram adicionalmente avaliados quanto à sua capacidade para ligar TTR seletivamente com todas as outras proteínas no plasma sangüíneo. A concentração de diflunisal no sangue pode exceder a 30 pM 20 horas após uma única dose de 500 mg, ou de 300 pM, 4 horas após a mesma dose. Embora este alto nível de concentração no plasma sustentada sugira excelente biodisponibilidade, inibidores mais seletivos irão permitir uma menor dosagem e potencialmente menos efeitos colaterais; portanto, plasma humano foi incubado com este subconjunto de inibidores em uma concentração final de 10, 8 pM (a concentração de TTR média no plasma humano é aproximadamente de 5 pM). TTR foi capturada usando um anticorpo ligado por resina, e a TTR imobilizada foi lavada três vezes com uma solução de TSA (tris salina)/ 0,05 de saponina, seguida por duas lavagens com TSA. O complexo inibidor de TTR foi liberado a partir da resina com trietilamina 100 mM (pH 11,5), e a estequiometria do inibidor presente em relação a TTR foi determinada através de análise de HPLC de fase inversa. Um máximo de 2 equiv. de inibidor podem ser ligados por tetrâme-ro de TTR. As estequiometrias de ligação de plasma pós-lavagem, representando limites inferiores devido a perdas associadas à lavagem, estão sumariadas na Tabela 1.

[00167] Bifenilas contendo cloro podem ser seletivas para a ligação de TTR e plasma sangüíneo humano (estequiometria média de 0,8, com uma estequiometria máxima teórica de 2,0, vide tabela 1). A estequiometria média observada foi de 0,4 para todos os inibidores testados. Dos inibidores contendo flúor, 18 e 20 exibiram seletividade de ligação muito boa e aceitável para TTR, respectivamente, superior à estequiometria de 0,13 exibida por 1 sob condições similares. Os valores de estequiometria relatados na Tabela 1 podem representar um limite inferior devido a perdas associadas á lavagem do inibidor a partir do TTR seqüestrado em uma resina de anticorpo policlonal. Os resultados de seletividade de ligação de TTR para 39 e 41 devem ser considerados com cuidado, porque estes compostos podem estar ligados, de modo covalente, a TTR, tal como acima discutido.

[00168] Aqueles inibidores, que exibem excelentes dados de inibição de fibrila amilóide de TTR in vitro, exibindo contudo fraca seletividade no plasma, podem ser ligar preferencialmente a sítios de ligação de droga em albumina e/ ou a sítios similares em outras proteínas encontradas no plasma. Pode ser improvável que tais inibidores venham a evitar o mal dobramento de TTR e a amiloidose em um ambiente complexo, tal como o plasma sangüíneo ou CSF.

[00169] Estruturas de co-cristal de raio X de alta resolução de 1 e três de seus análogos 26, 18 e 20 ligados a TTR foram obtidos através do embebimento de cristais de TTR com um excesso molar de 10 vezes do inibidor durante mais do que três semanas. As estatísticas cris-talográficas estão sumariadas na Tabela 2.

Tabela 2: Estatísticas Cristalográficas [00170] Diflunisal (1) se liga TTR tanto em um modo dianteiro como em um modo inverso. Em cada sítio de ligação de hormônio de TTR, quatro diferentes conformações de ligação de diflunisal foram encontradas com ocupação aproximadamente igual - cada qual com um modo de ligação dianteiro e inverso com dois modos de ligação simetricamente equivalentes. O sistema biarila de diflunisal foi desviado do centro da cavidade de ligação do hormônio e ocupa duas posições distintas de modo a formar um cone em forma de “V” de densidade de elétron na cavidade de ligação de hormônio de TTR. Este modo de ligação aumenta tanto as interações hidrofóbicas como de van der Waals entre o inibidor e a cavidade hidrofóbica de TTR formado por Leu 17, Ala 108, Leu 110, Thr 119 e Vai 121. O modo de ligação inverso de diflunisal foi aumentado pela interação de ligação de hidrogênio entre o grupo carboxila e o oxigênio da cadeia lateral de Thr 119 e o oxigênio da cadeia principal de Ala 108 na cavidade de ligação interno. De modo surpreendente, nem Ser 117 assume múltiplas conformações, nem forma qualquer interação eletrostática com o inibidor. No modo de ligação inverso, um dos substituintes flúor de diflunisal estava dentro da distância de ligação de hidrogênio a partir do oxigênio da cadeia lateral Thr 119 (3,3 Á). Na cavidade de ligação externa, a densidade de elétron para os átomos da cadeia lateral de Lys 15’ estava visível apenas em um baixo nível sigma, indicando que ele pode estar em mais do que uma conformação. A melhor conformação possível para o resíduo Lys 15 foi modelada em uma distância de ligação de hidrogênio a partir do grupo carboxila de diflunisal no modo de ligação dianteiro.

[00171] O composto 20 se liga a TTR no modo de ligação dianteiro, com o anel hidrofílico substituído por carboxilato orientado na cavidade de ligação externo para interagir eletrostaticamente com Lys 15 e 15’. O anel arila fluorado está posicionado na cavidade de ligação interno, em que os halogênios estão colocados em HBP 2 e 2’. De modo interessante, uma inspeção próxima de ambos os sítios de ligação revela uma diferença significativa na orientação dos anéis bifenila. Os ângulos entre os planos dos anéis fenila variam de 32, 6 graus em um sítio de ligação a 63,8 graus no outro. Esta observação pode ser o resultado de uma ligação negativamente operativa de 20 com TTR.

[00172] O composto 18 se liga a TTR no modo inverso com o anel arila hidrofílico substituído por carboxilato orientado para dentro da cavidade interna, dentro da distância de ligação de hidrogênio de Ser 117 e Ser 117’. Os anéis arila são girados em 34 graus com relação um ao outro, de modo a obter vantagem das interações hidrofóbicas com Leu 17, Ala 108, Vai 121 e Thr 119. Os flúor estão posicionados em cavidades de ligação de halogênio 1 e 1. O modo de ligação inverso não era esperado, em vez disso foi previsto que o carboxilato estivesse posicionado na cavidade externa de modo a obter vantagem das ligações eletrostáticas com Lys 15 e 15’, os flúor sendo seqües-trados ao interior das cavidades de ligação 2 e 2’. No entanto, o modo de ligação inverso não constituiu uma surpresa total, como foi anteriormente observado para diclofenaco (uma biaril amina ) e para vários análogos de diclofenaco.

[00173] A substituição de cloros em lugar de flúor em diflunisal in-duz diferenças significativas na ligação de 26 a TTR. O composto 26 se liga a TTR no modo de ligação inverso com o anel arila substituído por carboxila orientado na cavidade de ligação interna e os cloros se-qüestrados ao interior das cavidades de ligação 2 e 2’. Tal como 18 e 20, 26 também ocupa o centro da cavidade de ligação de hormônio. Os resíduos Ala 108, Lys 15, Leu 17, Leu 110, Lys 17 e Thr 119 de protômeros de TTR forma interações hidrofóbicas e de van der Waals com o inibidor. Na cavidade de ligação interna, a cadeia lateral de Ser 117 existe em duas conformações para interagir com a substituição carboxila de 26 e de Ser 117 dos outros monômeros. O mesmo oxigênio de carboxila 26 forma também uma interação de ligação de hidrogênio com o oxigênio da cadeia principal de Ser 117. O outro oxigênio de carboxila de 26 forma uma ligação de hidrogênio com a cadeia principal de Ala 108. Em contraste com diflunisal, o resíduo Thr 119 é orientado em afastamento a partir do inibidor, contribuindo para a hi-drofobicidade da cavidade de ligação preferivelmente a que à ligação de hidrogênio com o inibidor.

[00174] Para testar adicionalmente o mecanismo de ação destes inibidores, a sua capacidade para estabilizar TTR contra dissociação induzida por uréia como uma função do tempo foi avaliada. A taxa de dissociação de tetrâmero foi ligada irreversível mente ao desdobramento de monômero, facilmente monitorado, rápido, empregando concentrações de uréia excedentes àquelas que possibilitam o redobramento do monômero. A dissociação monitorada por desdobramento foi testada por CD além de UV em uréia 6,5 M, revelando que todos os bons inibidores de amiloidegênese mediada por ácido diminuíram a taxa de dissociação de tetrâmetro em um modo dependente de dose (FIGS. 2A e 2B). Vários inibidores, incluindo 20, 46 e 48, apresentam um efeito dramático sobre a dissociação do tetrâmero de TTR, o estágio de limitação de taxa de amiloidegênese. Vide, por exemplo, Hammars-trom, P.; et ai Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 2002, 25, 16427-32, que é aqui incorporado, a título referencial, em sua totalidade.

[00175] Como o modo de inibição de formação de fibrila de TTR por estes compostos é suspeito de ser o ajuste dependente da dose da barreira de dissociação de tetrâmero através de estabilização em estado mais estável, os melhores inibidores devem retardar, ao máximo, a dissociação de tetrâmero. A taxa de formação de fibrila foi monitorada pela turvação em um pH final de 4,4 ao longo de 192 horas. Vide FIGS. 3A, 3B, 4A e 4B. Inibidores que possuem a capacidade de estabilizar TTR tetramérica em um baixo pH irão evitar a dissociação de tetrâmero, o mal dobramento e a má formação em amilóide. Os melhores inibidores de formação de fibrila amilóide são aqueles que inibem, ao máximo, a dissociação (FIGS. 2A e 2 B). No entanto, a correlação não é perfeita, pois alguns inibidores se ligam melhor em uréia do que em condições ácidas e vice-versa.

[00176] Para assegurar que os inibidores estão estabilizando a forma tetramérica de TTR (3,6 μΜ), a estrutura quaternária de TTR foi testada com estudos de ultracentrifugação analíticos de velocidade e equilíbrio. A estrutura quaternária da proteína após 72 horas de incubação com 18 e 20 (3,6 μ ou 7,2 μΜ) em pH de 4,4 foi determinada. O tetrâmero era a espécie dominante, tanto em concentração de inibidor de 3, 6 μΜ e 7,2 μΜ em equilíbrio AUC, como também em estudos de velocidade.

[00177] A calorimetria de titulação isotérmica (ITC) foi empregada para determinar as constantes de ligação de 18 e 20 para TTR em pH de 8,09 (25°C). Diflunisal e os dois análogos se ligam a TTR com coo-peratividade negativa, uma característica exibida por muitos outros li-gantes. A ligação no primeiro sítio é 15 vezes mais forte do que a ligação no segundo sítio no caso de diflunisal e 20. A biarila 18 possui um kd1 aproximadamente 120 vezes inferior a kd2 (Tabela 3). A Tabela 3 sumaria a primeira e a segunda constantes de dissociação para a ligação de 1, 18 e 20 a TTR do tipo selvagem determinada por ITC. As constantes de ligação para 1 foram previamente relatadas, e são aqui providas para propósitos comparativos. Vide Exemplo 1.

Tabela 3: Constantes de Dissociação para a Ligação de Compostos a TTR do Tipo Selvagem Inibidor Kd1 Kd2 Ϊ 75 TTÕÕ 18 9 1100 20 80 1300 [00178] A WT TTR tetramérica é dissociada com um t-i/2 de 42 horas, e é desdobrada 500.000 vezes mais rápido. Portanto, a sua taxa de dissociação pode ser testada através de sua ligação ao desdobramento, que é irreversível em uréia 6,5 M. Como a dissociação de te-trâmero é limitativa da taxa para a amiloidegênese, todos os inibidores, que exibem excelente atividade in vitro e estequiometria de ligação excedendo a 0,50 em plasma devem diminuir a dissociação de tetrâ-mero se o mecanismo de ação presumido, estabilização cinética através de ligação seletiva ao estado nativo, estiver correto (Vide FIGS. 2A e 2B).

[00179] As taxas de dissociação de tetrâmero de TTR foram medidas como uma função da concentração de inibidor ao longo de um curso de tempo da 168 horas em uréia 6,5 M. Inibidores selecionados, especificamente 18, 20, 39, 41, 45, 48 e 49 demonstram uma redução geral na extensão de dissociação de tetrâmero em 160 horas conforme refletida em alterações de amplitude em relação a TTR sem inibidor. A taxa de dissociação de tetrâmero é também dramaticamente diminuída na presença [00180] de inibidor, conforme refletida no decréscimo na graduação do tempo de curso. Os inibidores 20, 45, 46 e 48 são superiores, presumivelmente porque o inibidor é dissociado muito lentamente a partir de TTR ■ I e de TTR I2 devido à sua alta afinidade de ligação em uréia. A formação de TTR-I e TTR I2 pode estabilizar, de modo significativo, o estado nativo devido aos baixos Kds de tais complexos, e elevar a barreira cinética para a dissociação de tetrâmero, substancial mente no caso de 20, 45, 46 e 48. Mesmo que 16 e 18 se liguem a TTR, parece que a sua afinidade é insuficiente para afetar a estabilização cinética. É igualmente significativo que a faixa de ordenação de eficácia de inibidor em uréia em uma concentração de inibidor de 3, 6 μΜ (3,6 μΜ de proteína ) seja de 20 *45 > 46 »48, que é diferente de uma concentração de inibidor de 7,2 μΜ (20 »46 > 45 48). Isto reflete igual mente uma diferença nos valores de Kd2 e uréia.

[00181] A estabilização cinética do estado nativo é uma estratégia terapêutica atrativa devido à evidência emergente de que oligômeros mal dobrados, seja no trajeto amilóide ou fora dele, são neurotóxicos. O alcance da estabilização cinética com inibidores pode prover um tratamento não- ínvasivo para SSA, FAP e FAC.

[00182] As taxas de dissociação de tetrâmero em uréia, na presença de um determinado inibidor, nem sempre predizem capacidade do inibidor para evitar a amiloidose em baixo pH. Como não está ainda claro como e onde o amilóide é formado em um ser humano, estabilizadores de tetrâmero de TTR, que funcionam muito bem em uma variedade de ambientes desnaturantes são desejáveis. A taxa de formação de fibrila de TTR como uma função da concentração de inibidor foi explorada sob condições ácidas (FIGS. 3A, 3B, 4A e 4B). Os inibidores 20, 45 e 48 possuem um desempenho excepcional mente bom igualmente neste ambiente. O inibidor 46 é um melhor estabilizador de tetrâmero em uréia do que em ácido, enquanto que 1 é muito melhor em ácido do que em uréia. A energia livre de estabilização, associada com a formação dos compostos TTRI e TTR- l2 em um determinado ambiente determina a extensão de estabilização em estado mais estável e o aumento associado na ativação de energia livre para a dissociação de tetrâmero. Estes dados sugerem que os inibidores diminuem a amiloidose de TTR em baixo pH muito mais eficientemente do que eles diminuem a dissociação de tetrâmero de TTR em uréia 6,5 M. Isto se deve ao fato de que a amiloidegênese requer um reagrupamento dependente de concentração após a dissociação. Os inibidores mais efetivos são aqueles, que mantêm a concentração do intermediário ami-loidegênico monomérico de TTR em baixos níveis para tornar a formação de fibrila muito ineficiente. Conforme observado na desnaturação de TTR em uréia na presença de inibidores, a faixa de ordenação de eficácia do inibidor em baixo pH difere significativamente da concentração de inibidor 3, 6 μΜ (FIGS. 3A e 3B) para inibidor 7,2 μΜ (FIGS. 4A e 4B). Esta observação reflete igualmente as diferenças nos valores de Kd2 de cada um dos inibidores em baixo pH. O exemplo mais dramático é aquele de diflunisal - um dos mais eficazes inibidores de formação de fibrila em 3, 6 pM, mas o menos eficaz a 7,2 pM, devido ao seu kd2 extremamente elevado.

[00183] Os análogos de diflunisal representam uma classe de compostos promissora para o tratamento de amiloidose de TTR. Embora vários análogos de diclofenaco sejam muito bons inibidores da formação de fibrila, os análogos de diflunisal oferecem uma classe adicional de estabilizadores de TTR altamente efetivos. Vários análogos de diclofenaco oferecem a capacidade de inibir a formação de fibrila resultante da dissociação e do mal dobramento de dois mutantes de TTR -Val30Met e Leu 55Pro. Estruturas de co-cristal de raio X demonstram que os análogos de diclofenaco se ligam primariamente no modo de ligação inverso, no entanto, perturbações menores nas estruturas de análogos de diflunisal possibilitam ou a ligação dianteira ou inversa. Em adição, o diflunisal é capaz de se ligar no modo dianteiro ou inverso, com quase igual ocupação em ambos os modos. As constantes de dissociação obtidas para diclofenaco (60 mM para kd1 e 1200 mM para kd2 foram comparáveis àquelas obtidas para diflunisal e 20, com 18 demonstrando uma ligação quase 10 vezes mais firme para o primeiro evento de ligação, conforme ilustrado por seu valor de Kd1. Em adição, ambas as classes de inibidor exibiram ligação negativamente cooperativa. De modo mais notável, vários análogos de diflunisal foram seletivos para TTR no plasma sangüíneo humano, oferecendo o potencial para toxicidade e efeitos colaterais diminuídos. Vide Oza, V. B.; et ai. J. Med. Chem. 2002, 45, 321-32.

[00184] Vinte e oito dos compostos sintetizados podem inibir substancialmente a amiloidegênese de TTR. Deste, vários demonstraram estequiometria de ligação excedente a 0,50 equiv. no plasma sangüíneo humano. Ambas as subestruturas arila cloradas e fluoradas dos melhores inibidores são encontradas em drogas conhecidas, portanto, existe uma boa razão para acreditar que estes compostos, ou os seus análogos, poderíam ser evoluídos para drogas que não exibem a atividade de NSAID de 1. Os compostos fluorados 18 e 20 podem se ligar a, e estabilizar TTR tetramérica em uréia 6,5 M, diminuindo drasticamente o primeiro estágio de mal dobramento e amiloidegênese, da dissociação do tetrâmero de TTR. Estes compostos, e outros, também diminuem dramaticamente a amiloidegênese de TTR mediada por ácido. Dos compostos testados, 18, 20, 39, 41, 45, 46, 48 e 49 obtiveram um melhor desempenho na estabilização do tetrâmero de TTR em uréia e sob condições ácidas. Estes compostos biarila parecem aumentar a barreira de ativação associada com a dissociação do tetrâmero, o estágio de limitação de taxa para a formação de amilóide, através de estabilização em estado mais estável.

Exemplo 3: Diflunisal Oralmente Administrado Estabiliza Transti-retina Contra Desnaturação [00185] Transtiretina (TTR) é uma proteína homotetramérica, que transporta tiroxina e a proteína de ligação holoretinol. Sob condições de desnaturação, a limitação da taxa de dissociação de tetrâmero e de mal dobramento de monômero rápido permite a má formação em ami- loidose sistêmica senil causando amilóide, a polineuropatia amilóide familial, e a cardiomiopatia amilóide familial. A ligação de diflunisal a pelo menos um dos dois sítios de ligação de tirosina não ocupados em TTR é conhecida como capaz de estabilizar o tetrâmero de TR, ou seja aumentar a barreira de ativação de dissociação in vitro. Foi investigada a possibilidade do uso de diflunisal para o tratamento de amiloi-dose de TTR. Métodos [00186] Trinta voluntários saudáveis (25 do sexo masculino, 5 do sexo feminino) foram cadastrados após o consentimento ter sido acusado. Os pacientes estavam na faixa de 23 a 53 anos de idade (idade média, 37,6 ± 8,8) com um peso corpóreo médio de 78,0 ± 12, 1. Cada indivíduo foi tratado com Diflunisal (Dolobid®) em uma dose de 125, 250 ou 500 mg duas vezes ao dia (a cada 12 horas) durante 7 dias (13 doses totais). O sangue foi coletado no dia 1 antes do tratamento e no dia 8, 4 e 12 horas após a ingestão. Este projeto de estudo foi aprovado pelo Human Subjects Committee of Scripps Clinic, Scripps Green Hospital, The Scripps Research Institute, e The Scripps General Clinicai Research Center.

[00187] Os níveis de diflunisal no soro foram medidos. Cem pi de soro foram adicionados a 900 μΙ de acetonitrila para precipitar as proteínas. Seguindo-se à centrifugação, 100 μΙ de sobrenadante foram adicionados a 900 μΙ de trietilamina aquosa 100 mM, pH de 11,5. Após a filtração, 100 μΙ de cada amostra foram injetados em uma colina de fase inversa Keystone de 3 cm C18, usando um gradiente de 40-100% de solução B durante 10 minutos (solução A: 94, 8% de água/ 5% de acetonitrila/ 0,2 % de ácido trifluoroacético; solução B: 94, 8% de acetonitrila/ 5% de água/ 0,2 % de ácido trifluoroacético), controlada por um sistema de fornecimento de multissolvente Waters 600 E. A detecção foi executada a 280 nm com um detector de absorção ajustável Waters 486, e os picos foram integrados para fornecer a concentração de diflunisal a partir de curvas padronizadas.

[00188] A estequiometria de ligação de diflunisal a TTR em soro humano foi analisada. Uma suspensão de gel/ Tris. HCI 10 mM a 1:1, pH 8,0/ NaCI 140 mM/0,025% NaN3 (TSA) (62,5 pi) de Sefarose foi adicionada a 500 μΙ de soro e incubada a 4°C durante 1 hora. Seguindo-se à centrifugação, 400 μΙ de sobrenadante foram adicionados a 200 μΙ de uma suspensão de gel/ TSA a 1:1 de Sefarose conjugada com anticorpo anti- TTR e lentamente agitada a 4°C durante 20 minutos. Após a centrifugação, o gel foi lavado com 1 ml de TSA/ 0,05% de saponina (Fisher Scientific) (duas vezes, 10 minutos cada), e adicionalmente com 1 ml de TSA (uma vez, 10 min.) a 4°C. Então, 155 μΙ de trietilamina aquosa 100 mM, pH 11, 5, foram adicionados para eluir a TTR e o diflunisal ligado a partir dos anticorpos. Após suave agitação a 4°C durante 30 minutos, a amostra foi centrifugada e 145 μΙ do sobrenadante foram removidos. Uma infecção de 135 μΙ da amostra foi separada e analisada como previamente descrito. (Purkey et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 2001; 98: 5566-71).

[00189] A estabilidade de tetrâmero de TTR do soro em relação à desnaturação de uréia foi avaliada. Amostras de dez μΙ de soro foram incubadas (25°C) em 90 μΙ de várias concentrações de uréia em tampão de fosfato 50 mM (pH 7,0; KCI 100 mM, EDTA 1 mM, DTT 1 mM). Soluções de uréia foram testadas através de índice refrativo para verificar as concentrações preparadas em peso. A reticulação de glutaral-deído da proteína foi executada através da adição de 10 μΙ de glutaral-deído (25%). A reação de reticulação foi deixada prosseguir durante 4 minutos antes que ela fosse rapidamente resfriada pela adição de 10 μΙ de NaBH4 (7% em NaOH 0,1 M). As amostras foram misturadas com 120 μΙ de coquetel de carga de gel redutor de SDS(concentração de SDS final =2,5%) e fervidas durante 5 minutos. As amostras foram separadas usando 12 % de SDS- PAGE e os géis foram analisados por imunobloting usando anti-soro anti-TTR (Purkey et ai. supra).

[00190] A estabilidade do tetrâmero de TTR do soro contra a desna-turação de ácido foi avaliada. Amostras de dez pi de soro foram incubadas (37°C) em 90 μΙ de tampão de acidificação 100 mM. Tampão de citrato foi usando quando fosse desejado um pH final de < 3,8; tampão de acetato foi empregado quando a faixa de pH sob avaliação era de 4, 2- 5,4. Após a reticulação, as amostras foram analisadas por SDS-PAGE e imunobloting, como acima descrito.

[00191] WT TTR recombinante e variantes foram expressos em BL21/DE3 Epicurian gold Escherichia coli (Stratagene) transformado com o plasmídeo pmmHa contendo TTR e os genes de resistência a ampicilina. A expressão e a purificação foram executadas como previamente descrito (Lashuel et ai. Biochemistry 1999; 38: 13560-73).

[00192] A taxa de dissociação de tetrâmero de TTR foi medida através de espectroscopia de dicroísmo circular. A avaliação das taxas de dissociação de tetrâmero foi executada usando amostras de TTR recombinante (3, 6 μΜ) em uréia 6,5 M, uma concentração na região pós transição para alteração estrutural terciária (Hammarstrõm et ai., Proc. Natl. Acad. Sei USA 2002; 99: 16427 -32).Os espectros CD além de UV de TTR (210 - 220 nm) como uma função do tempo foram medidos para avaliar a lenta taxa de dissociação de tetrâmero pela sua ligação a alterações estruturais terciárias rápidas.

[00193] O ensaio de formação de fibrila foi executado como se segue. Uma solução de material de TTR recombinante (7,2 pm) foi diluída a 1:1 com tampão de acidificação 100mM; O tampão de citrato foi usado quando fosse desejado um pH final de < 3, 8; tampão de acetato foi empregado quando a faixa de pH sob avaliação fosse de 4,2 -6,0; e tampão de fosfato foi utilizado para avaliar a amiloidegênese em um pH de 6,5. As amostras foram incubadas a 37°C durante 72 horas, sem agitação após a acidificação. A extensão de formação de fibrila foi testada pelas medições de turvação a 400 nm.

[00194] A cinética de formação de fibrila foi medida como se segue. Soluções de TTR recombinante (7,2 pm) foram misturadas com igual volume de tampão de acetato 100 mM para fornecer um pH final de 4,4. As amostras foram incubadas a 37°C e a turvação a 400 nm foi monitorada durante o curso de 168 horas. Uma amostra separada foi produzida para cada ponto no tempo.

[00195] O efeito de diflunisal sobre a dissociação de tetrâmero mediada por uréia e a formação de fibrila mediada pelo pH foi avaliada pela adição de diflunisal a uma solução de TTR, que foi incubada durante 3 horas (37°C), antes que a proteína fosse submetida à desnatu-ração em uréia ou à amiloidose mediada por pH.

Resultados [00196] As concentrações de diflunisal no soro médias, medidas por HPLC, 4 e 12 horas após a ingestão da 13a dose, foram de 20,1 ± 7,1 e 6,9 ± 3,0 μΜ no grupo de oferecimento de 125 mg, 233, 5 ± 76,0 e 145, 8 ± 38,9 pM no grupo de oferecimento de 250 mg, e 517, 0 ± 79,5 e 421, 9 ± 78,1 pM no grupo de oferecimento de 500 mg. Mais do que 99% de diflunisal é proteína ligada. Estas concentrações observadas no oferecimento de 250 mg e no oferecimento de 500 mg são muito altas em relação à concentração de TTR no soro (3, 6 - 7,2 pM) e devem fornecer uma estequiometria de ligação de diflunisal, que se aproxime ao máximo de 2 se a ligação de proteínas competidoras, tais como TBG (0,3 - 0,5 pM) e/ ou albumina (580 - 725 pM), que possuí sítios de ligação múltiplos para moléculas pequenas não for de alta afinidade.

[00197] O diflunisal se liga preferivelmente à TTR tetramérica no sangue com estequiometria de pelo menos 1 e de modo ideal de 2, de modo a que seja observada a estabilização cinética máxima. Para es- tabelecer um limite inferior na estequiometria de diflunisal em cada paciente, a transtiretina foi imunoprecipitada a partir do soro com anticorpos policlonais ligados a uma resina de fase sólida, como previamente descrito (Purkey et ai. supra). Após a lavagem de TTR imobilizada 3 X para eliminar a ligação nas específica, o complexo TTR-diflunisal foi dissociado a partir da resina e a estequiometria de diflunisal foi determinada por HPLC empregando curvas padronizadas. A estequiometria de diflunisal ligado à TTR no soro 4 e 12 horas após a ingestão foi de 0,45 ±0,11 e de 0,31 + 0,12 no grupo de oferecimento de 125 mg, de 1,12 + 0,08 e 0,95 + 0,13 no grupo de oferecimento de 250 mg e de 1, 51 + 0,09 e 1, 48 ± 0,08 no grupo de oferecimento de 500 mg. A estequiometria de diflunisal aumentou a sua concentração no soro, a até «300 μΜ. A estequiometria máxima inferior à esperada de 1,5 em uma concentração de soro de 300 pM resulta de uma limitação do método (perdas associadas à lavagem) el ou da ligação de diflunisal a outras proteínas no plasma, portanto foi executado um estudo de estequiometria de ligação de diflunisal com TTR recombinante. As perdas associadas à lavagem explicam a estequiometria de ligação máxima de 1,5 devido primariamente à dissociação a partir do sítio de baixa afinidade. O diflunisal se liga à TTR com cooperatividade negativa, portanto a dissociação a partir do sítio de baixa afinidade é dramaticamente mais rápida. A estequiometria esperada no tampão foi calculada com base nas constantes de dissociação determinada através de calorime-tria de titulação isotérmica (Kd1, 75 nM; Kd2 1,1 _1M). A plotagem conjunta da estequiometria calculada e da estequiometria determinada experimentalmente, a última derivada de imunoprecipitação (3 lavagens) e análise de HPLC), permite com que seja estudada a estequiometria efetiva a 1,75 - 1,91 em oferecimento de 250 mg, sugerindo que esta dose poderia ser utilizada.

[00198] Uma comparação da estequiometria de ligação de diflunisal (100 μΜ) em pacientes (0,8-1) à TTR recombinante (1,5) revela ligação significativa a proteínas do soro além de TTR, proporcionando o incentivo para desenvolver análogos de diflunisal que se ligam mais seletivamente a TTR. O nível de TTR no soro foi aumentado e os níveis de T4 total e RBP no soro foram diminuídos após a administração de diflunisal em todos os grupos. Estas verificações sugerem que diflunisal influencia o metabolismo de TTR. Não foram observados efeitos colaterais óbvios durante ou após o estudo. No entanto, o nível de albumina no soro diminuiu significativamente e os níveis de BUN e creatinina foram ligeiramente aumentados no grupo de oferecimento de 500 mg. No grupo de oferecimento de 250 mg, o nível de albumina no soro diminuiu moderadamente e o nível de BUN aumentou ligeiramente.

[00199] Foi desenvolvido um novo método para demonstrar que o diflunisal administrado oralmente estabiliza TTR no soro conta tensões de desnaturação, incluindo amiloidose. Este método serve como um marcador substituto para identificar compostos, que devem prevenir doenças de mal dobramento de TTR. Todo o soro dos pacientes foi submetido à desnaturação, ou pela adição de uréia (0- 9M) ou pela adição de ácido (pH 3, 8- 5,4). Como a TTR precisa ser dissociada de modo a que seja desnaturada, alterações estruturais quaternárias podem ser usadas para monitorar a extensão do desdobramento (Ham-marstrõm et ai., supra). Glutaraldeído foi adicionado para reticular todas as proteínas no soro após ser submetido a uma tensão de desnaturação e estabelecer que fração de TTR é normalmente dobrada (te-trâmero ou dímero) contra desnaturada (monômero). SDS- PAGE de todo o soro separa o tetrâmero e o dímero de TTR reticulados (estes representando a TTR dobrada) a partir do monômero. O imunobloting possibilita comparações quantitativas acerca da quantidade de TTR dobrada. Os anticorpos policlonais não se ligam ao monômero de TTR desdobrado praticamente tão bem quanto a TTR dobrada, portanto é mais útil comparar a intensidade das faixas de tetrâmero e de dímero na ausência e na presença de diflunisal. A dependência de tempo de inibição de diflunisal de desnaturação de TTR pode ser também avaliada por este método. A dependência de tempo quase imperceptível deste processo na presença de diflunisal apóia o mecanismo de estabilização cinético (vide Exemplo 1), em que a estabilização no estado mais estável por diflunisal torna a barreira de dissociação de tetrâmero insuperável. A eficácia de diflunisal (oferecimento de 250 mg) nestes cursos de tempo de desnaturação é melhor do que a estequiometria medida (0,8 -1,2) poderia prever, fornecendo evidência adicional de que o método de imunoprecipitação subestima a estequiometria de ligação efetiva, especialmente quando ela excede a 1.

[00200] Conhecer faixa de estequiometrias de ligação de diflunisal em humanos e a concentração de diflunisal requerida para simular aquelas estequiometrias em um tubo de teste permite a execução de estudos biofísicos in vitro relevantes para testar o mecanismo, pelo qual os complexos de TTR- diflunisal e TTR- diflunisal 2 evitam a dissociação e a amiloidose. A taxa de dissociação mediada por uréia (6, 5 M) e a taxa de formação de fibrila amilóide mediada por ácido (pH 4,4) foram estudadas como uma função da concentração e diflunisal (5, 10, 20 e 60 μΜ), revelando a diminuição dependente da dose. Como a dissociação de tetrâmero é limitativa da taxa para a formação de fibrila amilóide, segue-se que as taxas de dissociação de tetrâmero em uréia devem prognosticar a extensão de formação de fibrila amilóide mediada por acidificação. Diflunisal é melhor na inibição de amiloidose do que na inibição de dissociação mediada por uréia, porque a reagrupa-mento dependente de concentração é também requerido para a amiloidose. É também possível que Kd1 e Kd2 associados com a ligação de diflunisal a TTR sejam inferiores em ácido do que em uréia.

[00201] Mais do que 80 mutações de TTR predispõem indivíduos à amiloidose hereditária através de alterações dependentes de sequência de quadro de energia de desnaturação. Destas, a deposição ami-lóide de VI22I resulta em cardiomiopatia amilóide famíiíal (FAG) em 34% de Americanos Africanos, em que V30M é a mutação de polineu-ropatia amilóide famílial (FAP) proeminente, O díflunisal inibe tanto a amiloidegênese de V122I e V30M em um modo dependente da dose, demonstrando a generalidade desta abordagem.

[00202] É altamente desejável desenvolver uma estratégica terapêutica não- invasiva, geral, para melhorar a amiloidose de TTR. Os resultados aqui expostos indicam que a administração oral de diflu-nisal pode diminuir a dissociação de tetrâmero através da ligação e, e estabilização do estado nativo não- amiloidegênico. A estabilização do estado nativo é uma estratégia particularmente atrativa, dado a relatórios recentes de que oligômeros mal dobrados e fibrilas não amilóides causam degeneração. O uso clínico de díflunisal (oferecimento de 250 - 500 mg) para a artrite reumatóide e a osteoartrite demonstram a sua baixa toxicidade para usos a longo termo. A meia vida do soro de TTR é de 12-15 horas, portanto a dose duas vezes ao dia parece ótima, dado a meia vida de 8- 10 horas de díflunisal. Díflunisal deve ser efetivo contra SSA, FAC e FAP, porque ele liga tanto a WP e a TTR variante, impondo estabilização cinética, de modo análogo ao mecanismo utilizado pela inclusão de subunidades de trans- supressor em tetrâmeros de TTR, por outro lado compostos de subunidades associadas à doença, que é conhecido como capaz de melhorar doença humana. O díflunisal pode ser menos efetivo contra amiloidose de CNS porque ele não pode atravessar a barreira sangüínea cerebral, embora análogos de díflunisal (por exemplo, um análogo aqui descrito) possam ter tal capacidade. Exemplo 4: Bifenilas Policloradas Hidroxiladas Ligam Seletiva- mente Transtiretina no Sangue e Inibem a Amiloideqênese [00203] Bifenilas policloradas {PCBs) são poluentes ambientais persistentes conhecidos, que são relatados como sendo tóxicos para roedores e possivelmente para humanos. Â longevidade destes compostos no ambiente se deve à sua lenta degradação e à sua alta lipofi-licidade, que permite com que eles sejam bíoacumulados e que se concentrem à medida em que se movem na cadeia alimentar. Os PCBs hidroxilados (OH- PCBs) são metabólitos formados pela oxida-ção de PCBs através de monooxigenases P450. Dados definitivos acerca de toxicidade dos compostos PCB individuais em humanos são difíceis de serem encontrados, devido ao fato de que os PCBs comercialmente disponíveis são geralmente misturas, que contêm muitos isômeros diferentes, assim como quantidades traço de toxinas conhecidas, por exemplo, dibenzofuranos clorados. No entanto, a toxicidade de vários PCBs purificados foi demonstradas em animais de laboratório. Perda óssea, toxicidade imunológica, neurotoxicidade e níveis de hormônio da tireóide reduzidos, em adição à estrogenicidade dos OH-PCBs associados com a administração destes compostos.

[00204] Numerosos estudos demonstram que os PCBs e os PH-PCBs se ligam à transtiretina (TTR) in vitro. Foi sugerido que a TTR é a proteína alvo no sangue humano, que contribui para a persistência dos OH- PCBs em indivíduos expostos. Embora numerosos relatórios sugiram a TTR como uma proteína de ligação de PCB in vivo, não existe evidência definitiva de que os PCBs se ligam à transtiretina no plasma. Desenvolvemos um método de imunoprecipitação, que pode ser suado como estabelecer um limite inferior no que se refere à este-quiometria de ligação de moléculas pequenas à TTR em fluidos biológicos. A estequiometria de ligação de TTR de PCBs e de OH-PCBs à TTR no plasma humano foi aqui avaliada.

[00205] A amiloidegênese pós-secreção da TTR no plasma, que requer a dissociação de tetrâmero limitativa de taxa, o mal dobra mento do monômero e a má formação causa putativamente a amiloidose sistêmica senil, a cardiomiopatia amilóide famílial e as polineuropatias amilóides famílíaís. Neste caso, é demonstrado que vários OH-PCBs se ligam seletivamente à TTR no plasma humano e inibem a formação de fíbrila amilóide através da estabilização de tetrâmero conduzindo à estabilização cinética parcial ou completa do estado nativo. Quatro complexos TTR (OH-PCB)2 foram caracterizados através de cristalografia por raio X para melhor entender a base molecular para a ligação e para prover a base para o projeto de inibidores de amiloídegênese de TTR otimizados.

Seletividade de Ligação de PC Bs e de OH-PCBs para Transtiretina em Plasma Sanqüíneo Humano [00206] A seletividade de ligação de oito PCBs (compostos 1-8, FIG. 5), relatados como deslocando o hormônio da tireóíde de TTR com um IC50 de menos do que 50 nM e catorze OH-PCBs {compostos 9-22, FIG, 6) conhecidos como metabólitos de PCB, que são relatados como se ligando a TTR e a níveis de tiroxina mais baixos em camun-dongos ou ratos foram avaliados. Os limites inferiores de estequiome-tria de ligação de PCB a TTR no plasma foram estabelecidos usando anticorpos de TTR policlonais cova lente mente ligados a uma resina de sefarose, que foi misturada com plasma sanguíneo humano previamente misturado com PCB ou OH-PCB (10,8 ÁM). Após a lavagem, a estequiometria de ligação de PCB ou OH-PCB a TTR (®5 μΜ) foi avaliada através de HPLC de fase inversa, [00207] Até dois PCBs podem se ligar aos sítios de ligação de hormônio da tireóide idênticos em um tetrâmero de TTR. Com exceção dos PCBs 1 & 3, os PCBs não-hidroxilados remanescentes exibiram rei ativa mente baixa seletividade de ligação para TTR no plasma (Tabela 4). Em contraste, os OH- PCBs demonstraram boa a excelente seletividade de ligação para TTR no plasma (Tabela 5). VYios dos PCBs hidroxilados (por exemplo, 16 e 22} se aproximam de uma este-quiometria de ligação de 2. A seletividade de ligação de OH-PCBs no sangue total é muito similar àquela observada no plasma, pois as membranas do eritrócito não sequestram significativamente os OH-PCBs estudados.

Tabela 4: Estequiometria de Ligação de PCBs a TTR no Plasma Sanaüfneo Humano Tabela 5: Estequiometria de Ligação de PCBs Hidrolixados a TTR no Plasma Sangüíneo Humano Ό0208] A captura do anticorpo do comp exo TTR· PCB possui o potencial de subestimar a estequiometria de ligação de PCB, devido à dissociação de PCB a partir da TTR durante os 5 estágios de lavagem. Os PCBs e os OH-PCBs (10,8 μΜ) foram incubados com TTR recom-binante (3,6 μΜ) para avaliar a estequiometria da molécula pequena ligada TTR imobilizada após cada estágio de lavagem, A estequiome-tría diminuiu em de 10-17% para PCB 2 e OH-PCB 18 após 5 lavagens, enquanto que aquela do PCB 4 diminuiu em 45%. A quantificação de perdas associadas à lavagem permite com que se estime a verdadeira estequiometria de ligação de PCBs e OH- PCBs no plasma, Além disso, uma boa correlação entre a estequiometria final do OH-PCB ligado à TTR recombinante e à quantidade ligada à TTR no plasma indica que o composto é altamente seletivo ao agente de ligação de TTR no plasma, por exemplo, OH- PCB 18. Em contraste, os PCBs 2 e 4 exibem uma estequiometria de ligação mais alta para TTR no tampão do que no plasma, sugerindo fortemente que eles se ligam à(s) proteína(s) competidora(s), assim como à TTR no plasma.

Inibição de Fibrila Amilóide de TTR por PCBs Hidroxilados [00209] A capacidade de OH-PCBs e PCB 3 para inibir a formação de fibrila in vitro foi avaliada porque estes compostos exibem boa seletividade de ligação para TTR no sangue. A TTR secretada no sangue a partir do fígado parede ser a fonte de amilóide de TTR sistêmico. Embora não esteja claro onde ou como o amilóide é formado em humanos, o desnaturante típico em células é ácido, o que é efetivo em converter quase todos os peptídeos amiloidegênicos e proteínas em amilóide e/ ou agregados relacionados. Portanto» a formação de fibrila mediada por ácido (pH 4,4) monitorada pela turvação foi empregada para monitorar a eficácia dos PCBs como inibidores. Os POBs hídroxi-lados e o PCB 3 foram altamente eficazes como inibidores de fibrila de TTR. Em uma concentração de inibidor igual à concentração de TTR de WT {3, 6 pIVI), apenas 12-50% da quantidade normal de formação de fibrila foi observada após um período de incubação de 72 horas. Esta atividade é igual àquela descrita pelos melhores inibidores de fibrila até hoje verificados, tais como o ácido flufenâmico (Flu), que foi incluído como um controle positivo.

Ligação de OH-PCB 18 a TTR

[00210] Experimentos de espectrometria de massa prévios sugerem que OH-PCB 18 exibe cooperatividade de ligação positiva para dois sítios de ligação de hormônio de tireóide relacionados C2 de TTR, Quando quantidades estequiométricas {< 1:1) de 18 são adicionadas à TTR, a espécie predominante observada no espectrômetro de massa são apo-TTR e o complexo TTR 182, consistentes com a ligação positivamente cooperativa. As características de ligação de TTR de 18 estão em contraste com aquelas exibidas por numerosos outros inibidores de fibrila amilóide de TTR, que se ligam com cooperatividade negativa. Estudos de calorimetria de titulação isotérmicos, executados sob condições fisiológicas, revelam que a ligação de OH-PCB 18 a TTR de WT se ajusta melhor a um modelo, em que as constantes de dissociação são Kds idênticos (3,2 ±1,8 nM). Este resultado não refuta a ligação positivamente cooperativa, pois não é possível alcançar uma concentração suficientemente baixa de TTR para testar a cooperatividade positiva devido ao calor insuficiente liberado. Tentativas para ajustar os dados coletados a modelos e ligação positivamente ou negativamente cooperativos forneceram ajustes fracos.

Estruturas de Co-Cristal de OH-PCBs 12,16.17e18 [00211] Cristais de OH-PCBs 12, 16, 17 e 18 ligados à WT TTR foram obtidos pelo embebí mento de cristais de TTR com um excesso de 10 vezes de inibidor durante quatro semanas. As estruturas de raio X foram então solucionadas para cada um dos complexos. O d (mero de TTR dentro da unidade assimétrica cristalográfica forma metade das duas cavidades de ligação de ligante, Como os sítios de ligação são divididos ao meio pelo mesmo eixo de duas dobras de simetria, dois modos de ligação de equivalente simetria dos inibidores são tipicamente observados. Cada sítio de ligação de TTR pode ser subdividido em cavidades interna e externa. Estas cavidades compreendem três assim denominadas cavidades de ligação de halogênio (HBPs) porque eles são ocupados pelos iodos nos dois anéis aromáticos de tiroxina. O HBP 3 e o HBP 3' estão profundamente localizados no interior da cavidade de ligação interna, o HBP 2 e 2’ definem os limites entre a cavidade de ligação interna e externa, enquanto que HBP 1 e V estão localizados próximo à periferia da cavidade de ligação externa. As estruturas do co-cristal revelam que a ligação C-C, que conecta os dois anéis aromáticos do OH-PCB está centralizadas proximamente no eixo de simetria de 2 dobras, dando a aparência de uma conformação de ligação única. O ângulo diédrico entre os dois anéis fenila é de 59° para 12, 37° para ambos 16 e 17, e 44° para 18. Todos os OH-PCBs ocupam posições similares nas cavidades de ligação interna e externa. Complementaridade de van der Waals do sistema de anel biaríla facilita várias interações entre as subunidades envolvendo os resíduos X, Y e Z em uma subunídade e os resíduos n\ m’ e o’ na outra subunidade que compõe cada sítio de ligação. Vários dos substituintes nos anéis fenila estão fora de eixo e podem ser modelados em posições múltiplas dentro da densidade eletrônica observada.

OH-PCB Ligado a TTR

[00212] A estrutura de raio X 1, 8 Â do complexo TTR-182 demonstra que o inibidor possui excelente complementaridade estérica com o sítio de ligação da TTR. A mecânica molecular (Insight II, Accelrys) indica que a conformação não- ligada de 18 está próxima à sua estrutura ligada. A estrutura refinada define interações eletrostáticas diretas e mediadas por água, que contribuem para a alta afinidade de ligação de 18. Um dos anéis aromáticos identicamente substituídos 3-CI, 4-OH, 5-CI ocupa a cavidade de ligação interna, os seus substituintes cloro sendo projetados a o interior dos HBPs 3 e 3’. As cadeias laterais de Ser 117 e Thr 119 adotam uma conformação alternativa pela rotação em torno de suas ligações Ca-Οβ discernidas pelos mapas de densidade eletrônica não -polarizada. A cadeia lateral de Ser 117 adota todas as três conformações de rotômero, conforme discernido pela distribuição da densidade eletrônica. De modo interessante, duas moléculas de água estão localizadas entre os resíduos Ser 117 adjacentes no eixo de duas dobras com 50% de ocupação, facilitando uma rede de ligações hidrogênio, que conecta os resíduos Ser 117, as moléculas de água adjacentes e a funcionalidade fenol de 18. Não está claro a partir de uma inspeção da estrutura porque 18 se liga com comportamento não ou positiva mente cooperativo. O outro anel identicamente substituído ocupa a cavidade de ligação de TTR externa, com os seus halogêníos sendo projetados ao interior dos HBPs 1 e T. Composto 16 ligado a TTR

[00213] O anel fenólico 3-CI, 4-OH, 5-CI tri-substituído de 16 é orientado ao interior do sítio de ligação de TTR produzindo as mesmas interações eletrostáticas e hidrofóbicas com TTR que este anel produz na estrutura TTR-182 acima descrita. O anel aromático 3,4-diciorado ocupa a cavidade de ligação externa, com o halogênio dirigido ao interior de HBP- 1 ou T dependendo de que modo de ligação equivalente de simetria está sendo considerado. A densidade eletrônica de 16, tal como aquela de OH-PCB 18, é simétrica e, deste modo, não é possível posicionar o para- OH e o para - Cl de modo não- ambíguo, com base no mapa de densidade. O mapa de densidade eletrônica não-polarizada é consistente com as três confirmações de rotômero de Ser 117 e contém duas moléculas de água entre os resíduos Ser 117, de modo análogo à estrutura TTR-182.

OH- PCB 17 Ligado a TTR

[00214] O Inibidor 17 se liga com o anel atila 3-CI, 4-OH, 5-CI substituído, orientado ao interior da cavidade de ligação interna, utilizando as mesmas Interações que este anel usa nas estruturas TTR162 e TTR'182 acima descritas. O anel 2,3,4-tri-clorado ocupa a cavidade de ligação externa utilizando interações com HBP-1, ΗΒΡ-Γ, HBP-2, HBP-2’ nos dois modos de ligação de equivalente simetria. As conformações múltiplas de Ser 117 e das duas moléculas de água conservadas são também características da estrutura TTR-172. Uma alteração conformactonal da cadeia lateral THr119 estava também evidente a partir dos mapas de densidade eletrônica não polarizada.

Composto 12 Ligado a TTR

[00215] O biarila 12 coloca o seu anel arila 3-CI, 4-OH, 5-CI substituído no interior da cavidade de ligação interna, com os seus dois do-ros interagindo com HBP-1 e T. Em contraste com as estruturas de TTR-162 e TTR-172, em que o fenol está localizado na cavidade de ligação interna. O grupo hidroxila (provavelmente em forma ionizada) está dentro da distância de ligação de hidrogênio das cadeias laterais Lys 15. O anel tetraclorado é colocado na cavidade de ligação interna, em que os halogênios são orientados nos HBPs 2 e 2\ assim como em 3 e 3’. As cadeias laterais Ser 117 e Thr 119 adotam conformações, que são idênticas àquelas encontradas na estrutura apo-TTR, diferentemente da situação em 16,17 e 18.

[00216] Neste caso, 8 PCBs previamente relatados para deslocar Τ4 com uma IC50 inferior a 50 mM, apenas 1 e 3 foram demonstrados como se ligando a TTR com estequiometria apreciável em plasma humano. Em contraste, todos os catorze OH-PCBs previamente relatados como se ligando a TRR, exibiram seletividade de ligação significativa a TTR no plasma, isto é consistente com a observação de que as OH-PCB são observadas primariamente no plasma e parecem ser seletivamente retidas neste, em oposição à retenção em lipídeos e outros tecidos, em que as PCBs são tipicamente acumuladas. Os OH-PCBs também se ligam seletivamente à TTR em todo o sangue, de modo consistente com a idéia de que eles não se dividem em membranas de lipídeo.

[00217] A quantidade de PCB (ou OH-PCB) que é lavada a partir do complexo anticorpo TTR·PCB durante os estágios de lavagem foi avaliada usando WT TTR recombinante. A extensão de dissociação de PCB associada à lavagem é específica da molécula. Alguns compostos exibem alta estequiometria de ligação após as lavagens, de modo consistente com a ligação inicial significativa e baixas perdas associadas à lavagem, implicando em uma lenta taxa de dissociação. Os compostos que exibem baixa estequiometria de ligação recaem em pelo menos duas categorias: alta estequiometria de ligação inicial com perdas associadas à lavagem significativas ou baixa estequiometria de ligação inicial sem perdas associadas à lavagem significativas, o último cenário sendo aplicável a compostos que se ligam com alta afinidade a TTR, mas com afinidade ainda mais alta a outra(s) proteína (s) do plasma. Os PCBs 2 e 4 exibem baixa estequiometria de ligação pós- lavagem a TTR recombinante. Quarenta e cinco % do PCB 4 foram perdidos devido a lavagens, enquanto que o PCB 2 exibem simplesmente uma fraca estequiometria de ligação inicial com perdas associadas à lavagem mínimas (10%). Os valores de seletividade pós-lavagem refletem um limite mais baixo da quantidade de PCB, que é inicialmente ligada no plasma. Compostos tipo PCB 18, que são caracterizados por alta estequiometria de ligação pós- lavagem, precisam Ter alta afinidade e seletividade de ligação, consistente com a lenta taxa de retirada observada.

[00218] Em adição a sua alta seletividade de ligação a TTR no plasma, os OH-PCBs e o PCB 3 também apresentam excelente inibição de formação de fibrila de TTR in vitro. A eficácia dos inibidores 14, 15 e 18 está entre as mais altas observadas até hoje em inibidor equimolar e concentração de TTR (3, 6 μΜ). Isto é provavelmente atribuível à sua alta afinidade de ligação (também consistente com a sua baixa taxa de retirada) e às suas propriedades de ligação a TTR não ou positivamente cooperativas, que não são usuais. Os Kds nM exibido pelo melhor inibidor, OH- PCB 18, dita que o estado nativo de TTR será estabilizado por > 3 kcal/ mol. A estabilização em estado mais estável eleva a barreira de dissociação de tetrâmero (estágio limitativo de taxa na amiloidegênese de TTR) substancialmente, de tal modo que o tetrâmero não pode ser dissociado em uma escala de tempo biologicamente relevante. A estabilização cinética do estado não-amiloidegênico nativo, mediado pela ligação de 18 ao estado mais estável foi confirmada pela dissociação de tetrâmero dramaticamente reduzida em uréia 6 M e amiloidegenicidade morosa em pH 4,4. O OH-PCB 18 (3,6 pM) é tido como sendo um inibidor amilóide significativo, porque ele é um excelente estabilizador cinético da TTR tetramérica, isto é, evita que 2/3 de uma amostra de TTR 3,6 pM seja amiloidegê-nica em pH de 4,4, porque TTR-18 e TTR-182 são incompetentes para formar amilóide, o restante da TTR (1,18 p1M) formando amilóide de modo muito ineficiente devido à sua baixa concentração. As taxas de dissociação dos melhores inibidores de OH-PCB podem ser também menores do que o esperado, devido ao enrijecimento estrutural de TTR em torno do OH-PCB, mas isto não foi ainda avaliado tão cuida- dosamente quanto requerido. No mínimo, estes compostos fornecem orientação para a síntese de inibidores excepcionais, ou podem, em si mesmos, comprovar ser úteis como inibidores, dependendo de seu perfil de toxicidade.

[00219] A informação estrutural acerca de TTR ligada a OH-PCBs 12, 16, 17 e 18 revela que estas biarilas geralmente se ligam ao longo do eixo de simetria de duas dobras cristalográfico. O ângulo diédrico entre os dois anéis está na faixa de «40-60°, permitindo com que as cavidades de ligação de halogênio (HBPs) em duas unidades adjacentes sejam engatados simultaneamente, conduzindo à estabilização da interface estrutural quaternária tetramérica. O PCB hidroxilado 18 possui uma complementaridade estrutural ótima com TTR, pois os seus cloros são capazes de se ligar aos HBPs 1 e T, assim como a 3 e 3’, simultaneamente. Este não é o caso com 16 e 17, que requerem consideração de ambos os modos de ligação equivalentes de simetria, de modo a estender os cloros ao interior de HBPs 1, T, 3 e 3’.

[00220] A orientação do anel fenólico ao interior da cavidade de ligação interna parece desempenhar uma função importante, pelo fato de que ela possibilita com que uma rede de ligação de hidrogênio mediada por água seja formada entre a mesma e subunidades de TTR adjacentes, o que presumivelmente estabiliza ainda mais a estrutura quaternária nativa de TTR. Uma rede de ligação H, que envolve as três conformações escalonadas de Ser 117, o grupo fenólico do inibidor e as duas moléculas de água conservadas, cria uma rede eletros-tática que interconecta as duas subunidades, que formam o sítio de ligação de PCB. Em todas as três estruturas, Thr 119 também ocupa múltiplas conformações de rotômero. Em contraste, esta rede de interações eletrostáticas está ausente no complexo 122 TTR, no qual o anel fenila hidroxil substituído é orientado na cavidade de ligação externa e em que Ser 117 e Thr 119 adotam conformações de cadeia lateral apo.

[00221] A toxicidade de OH-PCBs não está bem estabelecida na literatura. Em uma variedade de estudos in vitro e em animais, OH-PCBs parecem ser ou brandamente estrogênicos ou anti - estrogêni-cos. Outros mecanismos de toxicidade foram sugeridos e existem também relatórios de níveis de hormônio da tireóide diminuídos em animais expostos a estes compostos. A sugestão de que a ligação de OH-PCB a TTR reduz os níveis de T4 e que os níveis de T4 reduzidos refletem que a ligação de TTR de molécula pequena é difícil de ser diretamente suportada. Como, a grosso modo, metade de T4 é transportada por albumina, o deslocamento de T4 a partir de sítios de ligação de albumina parece ser mais provavelmente a causa de níveis de T4 reduzidos em indivíduos expostos a PCBs. A globulina de ligação de tireóide possui a afinidade mais alta para tirosina e é um veículo principal em humanos, mas não está presente em muitos mamíferos inferiores, incluindo ratos e camundongos, em que muitos dos perfis toxicológicos destes compostos foram estudados. Deste modo, nestas espécies é mais provável que os compostos que se ligam a TTR tenham um efeito sobre a ligação geral e o transporte de T4. Os dados, que apresentam a ligação de PCBs a TBG sugerem pouca interação, com exceção de um ou dois compostos de fraca ligação. Portanto, o efeito de OH-PCBs em níveis de tireóide humanos deve ser mínimo,a não ser que eles se liguem a albumina. Existem também relatórios de que estes compostos podem interferir com a ativação do hormônio da tireóide ou aumentar a taxa de sulfatação, e portanto de inativação, de T4. OH- PCBs podem também se ligar a outros alvos do hormônio da tireóide, incluindo receptores de hormônio da tireóide, o que parece razoável, dado à analogia estrutural com T4.

[00222] É claro que pouco é estabelecido com referência à toxicidade de PCB hidroxilado, especialmente em humanos. É esperado que a toxicologia em roedores seja mais severa devido à função de TTR como o transportador de hormônio da tireóide primário. O que é evidente é que os PCBs hidroxilados exibem excelente atividade como inibidores de formação de fibrila de transtiretina, sugerindo que esta classe de compostos possui o potencial de ser útil para a inibição de formação de fibrila amílóíde.

Materiais e Métodos Purificação de Anticorpo de Transti retina e Conjugação a Sefaro- se [00223] Os anticorpos foram produzidos, purificados e acoplados a Sefarose. A resina foi armazenada como uma suspensão a 1:1 em TSA (Tris 10 mM, pH 8,0/ NaCI 140 mM/ 0,025% de NaN3). Em adição, Sefarose rapidamente resfriada foi preparada pelo acoplamento de Tris 200 mM, Ph 8,0 à resina em vez do anticorpo.

Preparação de Plasma Humano [00224] O sangue total foi extraído a partir de voluntários saudáveis no Programa de Extração de Sangue Normal do Scripps General Clinicai Research Center e transferido a tubos cônicos de 50 ml. Os tubos foram centrifugados a 3000 RPM (1730 x g em uma centrífuga de bancada Sorvall RT7, equipada com um rotor de balde de agitação, durante 10 minutos a 25°C. O sobrenadante do plasma foi removido e novamente centrifugado a 3000 RPm durante 10 minutos para remover as células remanescentes. Azída de sódio foi adicionada para fornecer uma solução a 0,05%. O plasma foi armazenado a 4oC até o uso. Imunoprecipitacão de Transti retina e PCBs Ligados [00225] Um tubo Eppendorf foi enchido com 1, 5 ml de plasma sanguíneo humano e 7,5 μΙ de uma solução de DMSO 2,16 mM do PCB sob avaliação. Esta solução foi incubada a 37°C durante 24 horas. Uma suspensão de resina/TSA a 1:1 (187 μ!) de Sefarose rapidamente resfriada foi adicionada à solução e suave mente agitada a 4°C durante 1 hora. A solução foi centrifugada (16.000 x g) e o sobrenadante dividido em 3 alíquotas de 400 μΙ cada, Estas foram então adicionadas a 200 μΙ de uma suspensão de resina/ TSA a 1:1 de Sefarose conjugada a anticorpo anti-transti retina e lentamente agitada a 4°C durante 20 minutos. As amostras foram centrifugadas (16,000 x g) e o sobrenadante removido. A resina foi lavada com 1 ml TSA/ 0,05% de Saponína (Acros) (3x10 min.) a 4°C, e adicionalmente com 1 ml de TSA (2x10 min.) a 4°C. As amostras foram centrifugadas (16.000 x g), a lavagem final foi removida, e 155 μΙ de trietilamina 100 mM, pH de 11,5 foram adicionados para eluir a TTR e moléculas pequenas ligadas a partir dos anticorpos. Seguindo-se à agitação branda a 4°C durante 30 minutos, as amostras foram centrifugadas (16.000 x g) e 145 μΙ do sobrenadante, contendo TTR e inibidor, foram removidos.

Análise de HPLC e Quantificação de Transtiretina e PCBs Ligados [00226] As amostras de eluíção de sobrenadante das contas de anticorpo de TTR (145 μΙ) foram carregadas em um aparelho de auto-amostragem Waters 71P. Uma injeção de 135 μΙ de cada amostra foi separada em uma coluna de fase inversa C18 3 cm Keystone utilizando um gradiente B de 40-100% durante 8 minutos (A: 94,8% Η2ΟΖ 5% acrilonitrila/ 0,2 % TF A; B; 94, 8 % acriionitrilâ/ 5% H20/ 0,2% TFA) controlado por um sistema de distribuição de multisolvente Waters 600 E. A detecção foí executada a 280 nm com um detector de absorção ajustável Waters 486 e os picos foram integrados para fornecer tanto a área de TTR, como da molécula pequena. De modo a determinar a quantidade de cada espécie, quantidades conhecidas de TTR tetramé-rica ou PCB foram injetadas no HPLC, Os picos foram integrados para criar curvas de calibração a partir de regressões lineares dos dados usando Kaleidagraph (Synergy Software). As curvas de calibração foram usadas para determinar o número de moles de cada espécie presente nas amostras de plasma. A razão de molécula pequena para proteína foi calculada para fornecer a estequiometria de molécula pequena ligada a TTR no plasma.

Ensaio de Formação de Fibrila Amilóide de Transtiretina [00227] Os compostos foram dissolvidos em DIVISO em uma concentração de 720 μΜ. Cinco pl de uma solução do composto sendo avaliado foram adicionados a 0,5 ml de uma solução de TTR 7,2 μΜ em tampão de fosfato 10 mM, pH 7,6, KCI 100 mM, EDTA 1 mM, permitindo com que o composto seja incubado em TTR durante 30 minutos. 495 μΙ de acetato 0,2 mM, pH 4,2, KCI 100 mM, EDTA 1 mM foi adicionado, para fornecer a proteína final e concentrações de 3, 6 μΜ cada um e um pH de 4,4. A mistura foi então incubada a 37°C durante 72 horas, apôs o que os tubos foram turbilhonados durante 3 segundos e a densidade óptica foi medida a 400 nm. A extensão de formação de fibrila foi determinada através da normalização de cada densidade óptica por aquela de TTR sem inibidor, definida como sendo 100% de formação de fibrila. Soluções de controle de cada composto na ausência de TTR foram também testadas e nenhuma absorveu apreciável mente a 400 nm.

Calorimetria de Titulação Isotérmica de PCB 18 e TTR

[00228] Uma solução 25 μM do composto 18 (em fosfato 10 mM, pH 7,6, KCI 100 mM, EDTA 1 mM, 8% de DMSO) foi titulada em uma solução 1,2 μΜ de TTR em um tampão idêntico usando um Colo rí metro de Titulação Isotérmico Microcal MCS {Microcal, Northhampton, MA). Uma injeção inicial de 2μΙ foi seguida por 25 injeções de 10μΙ a 25°C. O termograma foi integrado e foi subtraído um espaço em branco para fornecer uma isoterma de ligação que se ajuste melhor a um modelo de dois sítios de ligação idênticos usando o programa de análise de dados ITC em ORIGIN 5.0 (Microcal).

Cristalização e Coleta de Dados de Raio X

[00229] Cristais de TTR recombinante foram obtidos a partir de so- luções de proteína a 5 mg/ ml(em KCI 100 mM, fosfato 100 mM, pH 7,4, sulfato de amônio 1M) equilibradas contra sulfato de amônio 2M em experimentos de gotejamento. Os complexos de TTR ligante foram preparados a partir de cristais embebidos durante 2 semanas com um excesso molar de 10 vezes do ligante, de modo a assegurar a saturação total de ambos os sítios de ligação, A solução a 1:1 de aceto-na: água foi usada como um agente de embebimento, Um sistema de placa de formação de imagem DIP2030 {MAC Science, Yokohama, Japão) acoplado e um gerador de raio X de anodo rotativo foi usado para a coleta de dados. Os cristais foram colocados em óleo de para-tona como um cri o protetor e resfriados a 120 k para os experimentos de difração. Os cristais dos compostos de TTR ligante são isomorfos com a forma de cristal apo contendo dimensões celulares unitárias de a = 43Â, b= 86Â e c = 65 Â. Eles pertencem ao grupo espacial P21t1* e contêm metade do homotetrâmero na unidade assimétrica. Os dados foram reduzidos com DENZO e SCALEPACK.

Determinação da Estrutura e Refinamento [00230] As coordenadas atômicas da proteína para TTR do Proteín Data Bank (número de acesso 1 BMZ) foram usadas como o modelo de partida para o refinamento da TTR nativa e dos complexos TTR· ligante através de dinâmica molecular e minimização de energia usando o programa GNS. Os mapas foram calculados a partir dos dados de dif ração coletados em cristais de TTR ou embebidos com PCBs ou co-cristalizados simultaneamente. Para os complexos de TTR com os PCBs, os mapas resultante revelaram posições aproximadas do lígan-te em ambos as cavidades de ligação do tetra mero de TTR, com alturas de pico de acima de 5-9 r.m.s.. De modo a aperfeiçoar ainda mais a densidade eletrônica de molécula pequena e remover a polarização do modelo, o modelo foi submetido a vários ciclos do protocolo de desvio/ agitação, o que resultou em um aperfeiçoamento significativo no mapa, em especial em torno do inibidor. O ajuste do modelo sub-seqüente foi efetuado usando estes mapas e a molécula de ligante foi colocada na densidade. Em todos os crês casos, a conformação de energia mínima do inibidor, calculada pelo programa Insight II (Accel-rys) estava em boa concordância com o mapa. Devido ao eixo de simetria cristalográfico de duas dobras ao longo do canal de ligação, é necessário aplicar um modelo de desordem estatístico, dando origem a dois modelos de ligação de ligante em cada um dos sítios de ligação da TTR tetramérica. Moléculas de água foram adicionadas com base no mapa de densidade eletrônica não - polarizada. Devido à falta de densidades eletrônicas interpretáveis no mapa final, os nove resíduos N- terminal e três resíduos C-terminal não foram incluídos no modelo final.

Exemplo 5: Benzoxazóis como Inibidores de Fibrila Amilóide de Transtiretina [00231] Dois sítios de ligação de tiroxina de transtiretina são criados pela sua interface estrutural quaternária. O tetrâmero pode ser estabilizado pela ligação da molécula pequena a estes sítios, provendo potencialmente um meio para tratar a doença amilóide de TTR com drogas de molécula pequena. Verificou-se que muitas famílias de compostos, cuja ligação estabiliza o estado mais estável tetramérico a um grau proporcional às constantes de dissociação de molécula pequena Kdi e Kd2. Isto também aumenta, de modo efetivo, a barreira de ativação dissociativa e inibe a amiloidose através de estabilização cinética. Tais inibidores são compostos, de modo típico, de dois anéis aromáticos, com um anel contendo substituintes halogênio e o outros contendo substituintes hidrofílicos. Benzoxazóis substituídos com um ácido carboxílico em C(4) -C(7) e um anel fenila halogenado em C(2) também pareceram complementar o sítio de ligação de tiroxina de TTR. Uma pequena coleção destes compostos foi, portanto, preparada atra- vés de desidrociclização de ácidos N-acil amino-hidrobenzóicos, tal como ilustrado no Esquema 1.

Esquema 1: Síntese Geral de Benzoxazóis [00232] Reagentesi (a) ArCOCI, THF, piridina (Ar = Fenila, 3,5-Difluorofenila, 2,6-difluorofenila, 3,5- diclorofenila, 2, 6-dÍdorofenila, 2-(Trifluorometil) fenila, e 3-(Trifluorometíl) fenila); (b) TsOH-H2ü, xilenos em refluxo; (c) TMSCHN2, benzeno, MeOH; (d) LíOH, THF, MeOH, H20 (8-27% de rendimento em 4 estágios), [00233] Os benzoxazóis foram avaliados usando uma série de análises de rigor crescente, A TTR de WT (3, 6 μΜ) foi incubada durante 30 minutos (pH 7, 37°C) com um composto de teste (7,2 μΜ). Como pelo menos uma molécula do composto de teste precisa se ligar a cada molécula do tetrâmero de TTR de modo a que seja capaz de esta-bílizá-lo, uma concentração de composto de teste de 7,1 μΜ é de apenas duas vezes a concentração efetiva mínima. O pH foi então ajustado para 4,4, o pH ótimo para a fibrílízação, A quantidade de amílóide formada após 72 horas (37°C) na presença do composto de teste foi determinada pela turvação a 400 nm e é expressa como o % de formação de fibrila (ff), 100% sendo a quantidade formadas pela TTR isoladamente. Dos 28 compostos testados, 11 reduziram a formação de fibrila a níveis desprezíveis (ff < 10%; FIG. 7), [00234] Os 11 compostos mais ativos foram então avaliados quanto à sua capacidade para se ligar seletivamente a TTR em todas as proteínas no sangue, O plasma sangüíneo humano (conc. TTR 3,6- 5,4 μΜ) foi incubado durante 25 horas com o composto de teste (10,8 μΜ) a 37°C. A TTR e qualquer inibidor ligado foram imunoprecipitados usando um anticorpo de TTR policlonal ligado por sefarose. A TTR, com ou sem inibidor ligado, foi liberada a partir da resina em pH elevado e a estequiometria de inibidor: TTR foi determinada através de análise de HPLC (FIG. 8). Bezoxazóis com ácido carboxílico na posição 5 ou 6, e 2,6-diclorofenil (13, 20) ou substituintes 2-trifluorometilfenil (11, 18) na posição 2 exibiram as estequiometrias de ligação mais elevadas. Em particular, 20 exibiu excelente atividade inbidora e seletividade de ligação. Portanto, o seu mecanismo de ligação foi adicionalmente caracterizado.

[00235] Para confirmar que 20 inibe a formação de fibrila de TTR através de ligação fortemente ao tetrâmero, experimentos de calorime-tria de titulação isotérica (ITC) e de velocidade de sedimentação foram conduzidos com WT TTR. O ITC mostrou que dois equivalentes de 20 se ligam com constantes de dissociação médias de Kd1= Kd2 = 55 (± 10) nM sob condições fisiológicas. Estas são comparáveis às constantes de dissociação de muitos outros inibidores de amiloidegênese de TTR altamente eficazes. Para os experimentos de velocidade de sedimentação, TTR (3,6 pm) foi incubada com 20 (3, 6 pM, 7,2 pM), 36 pM) sob condições de fibrilação ótimas (72 horas, pH 4,4, 37°C). O tetrâmero (55 kDa) era a única espécie detectável na solução com 20 a 7,2 ou 36 pM. Alguns agregados grandes foram formados com 10 a 3,6 pM, mas a TTR remanescente na solução era tetramérica.

[00236] A inclusão da subunidade T119M e a ligação da molécula pequena ambas previnem a formação de amilóide de TTR pela elevação da barreira de ativação para a dissociação de tetrâmero. A capacidade de um inibidor para fazer isto é mais rigorosamente testada através da medição de sua eficácia em reduzir a dissociação de tetrâmero em uréia 6 M, uma tensão de desnaturação severa. Deste modo, as taxas de dissociação de tetrâmero de TTR em uréia 6M na presen- ça e ausência de 20, 21 ou 27 foram comparadas (FIG. 9). A TTR (1,8 μΜ) foi mais completamente desnaturada após 168 horas em uréia 6 M. Em contraste, 20 a 3, 6 μΜ evitou a dissociação de tetrâmero durante pelo menos 168 horas (> 3 x a meia vida de TTR no plasma humano). Com uma quantidade equimolar de 20, apenas 27% da TTR foram desnaturados em 168 horas. O composto 27 (3, 6 μΜ) foi muito menos capaz de evitar a dissociação de tetrâmero (90% de desdobramento após 168 horas), mesmo que ele fosse ativo no ensaio de formação de fibrila. O composto 21 não impediu a dissociação de TTR de nenhum modo. Estes resultados mostram que o inibidor que se liga à TTR é necessário, mas não suficiente para estabilizar cineticamente o tetrâmero de TTR sob condições fortemente desnaturantes; é também importante que as constantes de dissociação sejam muito baixas (ou que as taxas de retirada sejam muito lentas). Além disso, a presença de grupos funcionais em 20 é aparentemente ótima para a estabilização do tetrâmero de TTR; movendo o ácido carboxílico de C(6) para C(7), como em 27, ou removendo os cloros, como em 21, a sua atividade é severamente diminuída.

[00237] A função dos substituintes em 20 é evidente a partir de sua estrutura de co-cristal com TTR (FIG. 10). O composto 20 orienta os seus dois átomos de cloro próximos às cavidades de ligação de halo-gênio 2 e 2’ (assim denominados porque eles são ocupados por iodos quando tiroxina se liga a TTR) O padrão de substituição 2, 6 no anel fenila força os anéis benzoxazol e fenila para forma da planaridade, posicionado o ácido carboxílico, de modo ótimo, no benzoxazol para ligar o hidrogênio aos grupos ε-ΝΗ3+ de Lys 15/15’. As interações hi-drofóbicas entre os anéis aromáticos de 20 e as cadeias laterais de Leu 17, Leu 110, Ser 117, e Vai 121 contribuem para a energia de ligação adicional. Métodos [00238] O procedimento geral para a síntese de benzoxazol e a caracterização dos produtos (RMN Ή e 13C e espectros de massa de alta resolução) são detalhados abaixo.

Ultracentrifuqacão Analítica [00239] A estrutura quaternária de TTR na presença de 20 foi observada usando ultracentrifugação analítica de velocidade de sedimentação. As amostras foram incubadas com 20 a 3,6, 7,2 ou 36 μΜ durante 72 horas. Os dados foram coletados em uma ultracentrífuga analítica Beckman XL-I controlada por temperatura (equipada com um rotor An6ÜTi e um es-caner fotoelétrioo), Uma célula de setor duplo, equipada com uma peça central Epon de 12 mm e janelas de safira, foi carregada com 400- 420 μΙ da amostra usando uma seringa. Os dados foram coletados em velocidades de rotor de 300 e 50000 rpm, em um modo contínuo a 25°C, com um tamanho de degrau de 0,005 cm, empregando uma média de 1 escanea-mento por ponto. A detecção foi executada a 280 nm. Os dados foram submetidos à análise derivativa de tempo usando o programa DCDT + desenvolvido por Philo (Philo, 2000; Staffòrd, 1992). A análise demonstrou que a distribuição de espécies em solução era representada por uma faixa de valores s. A distribuição foi então ajustada a vários modelos, de modo a determinar os coeficientes de sedimentação e de difusão para as espécies no sistema. O peso molecular de cada espécie foi determinado através de métodos previamente citados (Petrassi et al., 2000). Os valores s encontrados para a TTR demonstraram que ela permanecia tetra mé ri ca na presença de 7,2 e 3,6 μΜ de 20. Enquanto que em 3, 6 μΜ a TTR remanescente na solução era tetramérica a despeito da formação de algum agregado.

Cristalização e Coleta de Dados de Raio X

[00240] Os cristais de WT TTR foram obtidos a partir de soluções de proteína a 12 mg/ ml (em KCI 100 m, EDTA 1 mM, fosfato de sódio 10 mM, e pH 7,0, sulfato de amônio 0,35 M) equilibrado conta sulfato de amônio 2M em experimentos de goteja mento. O complexo de TTR 20 foi preparado a partir de cristais embebidos por 3 wk com um excesso molar de 10 vezes do ligante de modo a assegurar a saturação total de ambos os sítios de ligação. O cristal embebido em ligante foi submetido à difraçâo a 1,55 Â em um detector Quantum- 4 na fonte de alta energia monocromática de 14-BM-C, BIOCARS, Advanced Photon Source (Argonne National Laboratory). Os cristais foram embebidos em óleo de paratona e resfriados por cintilação a 100 k para os experimentos de difraçao. Os cristais do complexo TTR- 20 são isomorfos com a forma de cristal apo com as dimensões celulares unitárias a = 43, 1 Â, b = 84, 7 Â, c = 64, 7 Â, grupo espacial Ρ2,222 com duas subunidades TTR na unidade assimétrica. Os dados foram reduzidos com DENZO e SACALEPACK da sequência HKL2000 (Otwinowski, 1997).

Determinação da Estrutura e Refinamento [00241] As coordenadas atômicas de proteína para TTR a partir do Protein Data Bank (número de acesso 1 BMz) foram usadas como um modelo de partida para as pesquisas de substituição molecular. O refinamento da estrutura do complexo TTR-20 foi executado usando dinâmica molecular e protocolos de minimização de energia de CNS. Os mapas de Fourier de diferença resultante revelaram a ligação do ligante em ambos as cavidades do tetrâmeno de TTR. Usando estes mapas, o ligante pode ser colocado, de modo não- ambíguo, na densidade, e foi incluído no refinamento cristalográfico. A conformação energética mínima do inibidor, calculada pelo programa Insight II (Accelrys Inc.) foi usada como o modelo inicial para o refinamento cristalográfico. Como o eixo de simetria critalo-gráfico de 2 dobras está ao longo do canal de ligação, um modelo de desordem estatística teve que ser aplicado, dando origem a dois modos de ligação de ligante pela cavidade de ligação de TTR. Após vários ciclos de recozimento simulado e subseqüente refinamento de fator de temperatura e posicionai, moléculas de água foram colocadas nos mapas Fourier de diferença, O ciclo final de ajuste do mapa foi executado usando o mapa de densidade eletrônica ponderada não- polarizada» calculado pelo protocolo de remoção de polarização de agitação/ desvio, As conformações de ligação relacionadas à simetria do ligante estavam em boa concordância com os mapas de omissão de recozimento não- polarizado, assim como com os mapas ponderados não polarizados de agitação/desvío colocados em fase na ausência de inibidor. Devido à falta de densidades eletrônicas in-terpretáveis no mapa final, os nove resíduos N-terminal e os três resíduos C-ter minai não foram incluídos no modelo final.

[00242] Um sumário da análise cristalográfica é apresentado na Tabela 6.

Tabela 6: Estatísticas para a Estrutura de Cristal de Raio X Síntese de Benzoxazol - Métodos Gerais [00243] A não ser que mencionado de outro modo, todas as reações foram executadas em vidraria secada em forno sob uma atmosfera de argõnio seco usando um Sintetizador Orgânico FirstMate (Argonaut Technologies), Todos os solventes (anidros) e reagentes foram adquiridos de Aldrich e usados sem purificação adicional. Os espectros RMN 1H foram medidos a 500 MHz em um espectrômetro Bruker DRX- 500 ou a 600 MHz em um espectrô metro Bruker DRX- 600, e se referiram a CHD2-S(0)-CÜ3 (2,49 ppm). Os espectros 13C foram executados a 125 MHZ em um instrumento Bruker DRX- 500 ou a 150 MHz em um Bruker DRX- 600 e se referiram a (ÇD3)2SO (39,5 ppm). Análises cromatográficas de camada delgada foram executadas em placas analíticas de camada delgada revestidas com vidro (Kieselgel 60 F254, 0, 25 mm, EM Science n° 5715- 7). A visualização foi executada usando absorção UV ou 10% de ácido fosfomolibdilico em etanol. A croma-tografia foi executada em um cromatotrônio (Harrison Research, Modelo 7924T, placa de 2 mm) ou em uma placa de sílica gel preparativa (Kieselgel 60 F254, 1 mm, EM Science n° 13895 - 7).

Procedimento Geral para a Síntese de Benzoxazol [00244] Uma mistura de ácido amino hidroxíbenzóico (0,2 mmol) em THF (3 ml) foi tratada seqüencialmente com piridina (500 pl, 0,6 mmol) e o cloreto ácido desejado (0,2 mmol). A mistura da reação foi agitada em temperatura ambiente durante 10 horas, refluída durante 1 hora, concentrada in vacuo e usada no próximo estágio sem purificação.

[00245] Monoidrato de ácido p-toluenossulfônico (380, 4 mg, 2, 0 mmol) foi adicionado à mistura da reação bruta em xilenos (5 ml) e a mistura resultante foi agitada, em refluxo, durante a noite. Após 12 horas, a reação foi resfriada à temperatura ambiente, rapidamente resfriada com NaOH (2 ml, 1 N) e as fases foram separadas. A camada aquosa foi acidificada com HCI (1N) ao pH de 2, e extraída com EtOAc (4x3 ml). As camadas orgânicas combinadas foram secadas com MgS04, filtradas e concentradas in vacuo. O resíduo resultante foi dissolvido em uma mistura de MeOH: Benzeno (2 ml; 1: 4), tratado com TMS- CHN2 (200 pl de solução 2,0 M em hexanos, 0,4 mmol) a 25°C e o progresso da reação foi monitorado por TLC (usualmente completado após 0,5 horas). A mistura da reação foi concentrada in vacuo, e o resíduo foi cromatografado (gradiente de 10 a 265% de EtO-Ac/hexanos) para fornecer o éster metílico de benzoxazol desejado.

[00246] O éster metílico de benzoxazol foi dissolvido em uma mistura de THF: MeoH: H20 (3:1:1, 0,07 M) e tratado com LiOH. H20 (4 equiv.). A reação foi agitada em temperatura ambiente e monitorada por TLC. Após ser completada, a mistura foi acidificada a um pH de 2 com HCI 1 N e extraída com EtOAc (4 x). As camadas orgânicas combinadas foram secadas com MgS04, filtradas e concentradas. O resíduo foi purificado através de cromatografia de camada delgada preparativa (4, 9% MeOH, 95% CH2CI2, 0,1% HOAc) para fornecer o produto como um sólido branco.

[00247] 4-Carboxi-2-(3,5-difluorofenil)-benzoxazol (1). Preparado a partir do ácido 3-hidroxiantranílico de acordo com o procedimento geral, para fornecer 1 como um sólido branco (7,0 mg, 13%). Dados para 1: RMN Ή (500 MHz, DMSO- d6) δ 13,70 - 12,50 (br. s, 1H, C02H), 8,04 (AMX, 1H, J = 8,1 Hz, Ar), 7,94 (AJMX, 1H, J = 7,3 Hz, Ar), 7,84 (br.d, 2 H, J =5,6 Hz, Ar), 7,62- 7, 58 (m, 1H, Ar), 7,56 (AMX, 1H, J = 7,3, 8,1 Hz, Ar); RMN 13C (125 MHz, DMSO-d6) δ 165, 8, 162, 7 (d, J = 248 Hz), 162, 6 (d, J = 248 Hz), 161, 1, 151,0, 140,3, 129,3, 127,0, 125, 8, 123, 6, 115, 2, 110, 8 (d, J = 28 Hz), 107,8 (t, J = 26 Hz): HRMS (MALDI-FTMS) calculado para C14H7F2N03 (MH+) 276, 0467, encontrado 276, 0463.

[00248] 4-Carboxi-2- (2,6-difluorofenil)-benzoxazol (2). Preparado a partir do ácido 3-hidroxiantranílico de acordo com o procedimento geral, para fornecer 2 como um sólido branco (8,2 mg, 15%). Dados para 2: RMN 1H (500 MHz, DMSO- d6) δ 13,00 (br. s, 1H, C02H), 8,06 (AMX, 1H, J = 8,1 Hz, Ar), 7,94 (AJMX, 1H, J = 7,6 Hz, Ar), 7,80 - 7,74 (m, 1H, Ar), 7,57 (AMX, 1H, J = 7,6, 8,1 Hz, Ar), 7,40 - 7,38 (m, 2H, Ar); RMN 13C (125 MHz, DMSO-d6) δ 166, 1, 160, 4 (d, J = 256 Hz), 160, 3 (d, J = 256 Hz), 154,9, 150,6, 139,6, 134,7, (t, J = 10 Hz), 126,8, 125,8, 114,8, 112, 8, (d, J = 22 Hz), 105, 2 (t, J = 16 Hz): HRMS (MALDI-FTMS) calculado para C14H7F2N03 (MH+) 276, 0467, encontrado 276, 0461.

[00249] 4-Carboxi-2-[(3-trifluorometil) fenil]benzoxazol (3). Preparado a partir do ácido 3-hidroxiantranílico de acordo com o procedimento geral, para fornecer 3 como um sólido branco (9,5 mg, 15%). Dados para 3: RMN 1H (500 MHz, DMSO- d6) δ 13,70- 12,80 (br. s, 1H, C02H), 8,50 (ABX, 1H, J = 7,8 Hz, Ar), 8,43 (s, 1H, Ar), 8,06 (AMX, 1H, J = 8,1 Hz, Ar), 8,03 (ABX, 1H, J = 8,1 Hz, Ar), 7,94 (AJMX, 1H, J = 7,8 Hz, Ar), 7,54 (AMX, 1H, J = 8,1 Hz, Ar); RMN 13C (125 MHz, DMSO-d6) δ 165, 8, 161,9, 151,0, 140,6, 131,4, 130,8, 130,0 (q, J = 33 Hz), 128,7 (d, J = 4 Hz), 127,2, 127,0, 125,5, 123, 8, 123,7 (q, J = 273 Hz), 123, 2, 115, 2; HRMS (MALDI-FTMS) calculado para C15H8F3N03 (MH+) 308,0529, encontrado 308,0535.

[00250] 4-Carboxi-2-[(2-trifluorometil) fenil]-benzoxazol (4). Preparado a partir do ácido 3-hidroxiantranílico de acordo com o procedimento geral, para fornecer 4 como um sólido branco (15,2 mg, 25%). Dados para 4: RMN 1H (600 MHz, DMSO- d6) δ 13, 15 (br. s, 1H, C02H), 8,18 (d, 1H, J = 7,6 Hz, Ar), 8,06 (AMX, 1H, J = 0,9, 8,2 Hz, Ar), 8,02 (d, 1H, J = 7,9 Hz, Ar), 7,96 (ΑΜΧ, 1 Η, J = 0,9, 7,9 Ηζ, Ar), 7,94 - 7,87 (Μ, 2Η, Ar, 7,58 (ΑΜΧ, 1 Η, J = 8,2 Ηζ, Ar); RMN 13C (150 ΜΗζ, DMSO-d6) δ 165, 8, 161, 6, 151,2, 140,0, 133,0, 132, 6, 132, 3, 127, 6 (q, J - 32 Ηζ), 127,2 (q, J = 6 Ηζ), 127, 0, 125, 6, 124,9, 123,5, 123,4 (q, J = 273 Hz), 115,2; HRMS (MALDI-FTMS) calculado para C15H8F3N03 (MH+) 308,0529, encontrado 308,0531.

[00251] 4-Carbóxi-2-(3,5-diclorofenil)-benzoxazol (5). Preparado a partir do ácido 3-hidroxiantranílico de acordo com o procedimento geral, para fornecer 5 como um sólido branco (8,0 mg, 13%). Dados para 5: RMN 1H (600 MHz, DMSO- d6) δ 13, 60- 12,60 (br. s, 1H, C02H), 8,16 (A2M, 2H, J= 2, 0 Hz, Ar) 8,05 (ΑΜΧ, 1H, J = 0,9, 8,2 Hz, Ar), 7,96 (d, 1H, J = 7,9 Hz, Ar), 7,96(A2M, 2H, J= 2,0, Hz, Ar), 7, 94(Α]ΜΧ, 1 H, J = 0,9, 7,6 Hz, Ar), 7,56 (ΑΜΧ, 1H, J = 7,9 Hz, Ar); RMN 13C (150 MHz, DMSO-de) δ 165, 8, 160, 8, 151,0, 140,0, 135,2, 131, 5,129,4, 127,0, 126,3, 125,9, 125,8, 123, 6, 115, 2; HRMS (MALDI-FTMS) calculado para Ci4H7CI2 N03 (MH+) 307,9876, encontrado 307,9876.

[00252] 4-Carbóxi-2- (2,6-diclorofenil)-benzoxazol (6). Preparado a partir do ácido 3-hidroxiantranílico de acordo com o procedimento geral, para fornecer 6 como um sólido branco (5,2 mg, 8 %). Dados para 6: RMN 1H (600 MHz, DMSO- d6) δ 13, 80- 12,50 (br. s, 1H, C02H), 8,07 (ΑΜΧ, 1H, J = 8,2 Hz, Ar), 7,95 (AJMX, 1 H, J = 7,9, Ar), 7,77 - 7,71 (m, 3H, Ar), 7,59 (ΑΜΧ, 1H, J = 7,9 Hz, 8,2 Hz, Ar); RMN 13C (150 MHz, DMSO-de) δ 165,8, 158,2, 150,8, 139,3, 134,8, 134, 0,128,7, 126,8, 126,7, 125,9, 122,4; HRMS (MALDI-FTMS) calculado para C14H7CI2 N03 (MH+) 307,9876, encontrado 307,9880.

[00253] 4-Carbóxi-2-fenil-benzoxazol (7). Preparado a partir do ácido 3-hidroxiantranílico de acordo com o procedimento geral, para fornecer 7 como um sólido branco (10,2 mg, 21 %). Dados para 7: RMN 1H (600 MHz, DMSO- d6) δ 13, 50- 12,60 (br. s, 1H, C02H), 8,248,22 (m, 2H, Ar), 8,03 (AMX, 1H, J = 0,9, 8,2 Hz, Ar), 7,91 (AMX, 1 H, J = 0,9, 7,9 Hz, Ar), 7,68 - 7,61 (m, 3H, Ar), 7,51 (AMX, 1H, J = 7,9 Hz, 8,2 Hz, Ar); RMN 13C (150 MHz, DMSO-d6)ô 166,0, 163,4, 151,0, 140,8, 132.4, 129,4, 127,6, 126,7, 126,1, 125,0, 123,0, 115,0; HRMS (MALDI-FTMS) calculado para C-|4H9 N03 (MH+) 240, 0655, encontrado 240,0656.

[00254] 5-Carbóxi-2-(3,5-difluorofenil)-benzoxazol (8). Preparado a partir do ácido 3-amino-4-hidroxibenzóico de acordo com o procedimento geral, para fornecer 8 como um sólido branco (10,2 mg, 19 %). Dados para 8: RMN 1H (600 MHz, DMSO- d6) δ 13, 60- 12,80 (br. s, 1H, C02H), 8,32 (ABM, 1H, J = 1,5 Hz, Ar), 8,07 (ABM, 1H, J = 1,5, 8,5 Hz, Ar), 7,90 (ABM, 1 H, J = 8,5 Hz, Ar), 7,86 - 7,85 (m, 2H, Ar), 7,60 (Tt, 1 H, j = 2.4, 9,2 Hz, Ar); RMN 13C (150 MHz, DMSO-d6) δ 166,8, 162,8 (D, J = 248 Hz), 162,7 (d, J = 248 Hz), 161,5, 153,0, 141,2, 129,1 (t, J = 11 Hz), 128,2, 127,7, 121,4, 111,2, 110,8 (d, J = 23 Hz), 110,7 (d, J = 22 Hz), 107,8 (t, J = 26 Hz);; HRMS (MALDI-FTMS) calculado para C14H7F2 N03 (MH+) 276, 0467, encontrado 276,0469.

[00255] 5- Carboxi-2- (2,6-difluorofenil)-benzoxazol (9). Preparado a partir do ácido 3-amino-4-hidroxibenzóico de acordo com o procedimento geral, para fornecer 9 como um sólido branco (6,8 mg, 12 %). Dados para 9: RMN 1H (600 MHz, DMSO- d6) δ 13,50- 12,80 (br. s, 1H, C02H), 8,39 (ABM, 1H, J = 0,7, 1,6 Hz, Ar), 8,10 (ABM, 1H, J = 1,6, 8,7 Hz, Ar), 7,95 (ABM, 1 H, J = 0,7, 8,7 Hz, Ar), 7,77 (Μ, 1H, Ar), 7,40 (t, 2H, J = 8,8Hz, Ar); RMN 13C (150 MHz, DMSO-d6) δ 166,8, 160,4 (d, J = 257 Hz), 160,3 (d, J = 257 Hz), 155,4, 152,6, 140,8, 134,8 (t, J = 11 Hz), 128,2, 127,7, 121,6, 113,0 (d, J = 22 Hz), 112,9 (d, J = 22 Hz), 111,2, 104,9; HRMS (MALDI-FTMS) calculado para C14H7F2 N03 (MH+) 276, 0467, encontrado 276,0467.

[00256] 5-Carboxi-2-[(3-trifluorometil) fenil]-benzoxazol (10).

Preparado a partir do ácido 3-amino-4-hidroxibenzóico de acordo com o procedimento geral, para fornecer 10 como um sólido branco (6,7 mg, 11 %). Dados para 10: RMN Ή (500 MHz, DMSO- d6) δ 13,3012,80 (br. s, 1H, C02H), 8,51 (ABX, 1H, J = 7,8 Hz, Ar), 8,45 (s, 1H, Ar), 8,35 (ABM, 1H, J = 1,7, Ar), 8,08 (ABM, 1 H, J = 1,7, 8,6 Hz, Ar), 8,04 (ABX, 1H, J = 7,8 Hz, Ar), 7,93 (ABM, 1 H, J = 8,6 Hz, Ar), 7,89 (ABX, 1 H, J = 7,8 Hz, Ar); RMN 13C (125 MHz, DMSO-d6) δ 166,8, 162,2, 153,1, 141,4, 131,4, 130,9, 130,1 (q, J = 33 Hz), 128,8, 128,2, 127.5, 127,1, 123, 8 (q, J = 4 Hz), 123, 7 (d, J = 273 Hz), 121,3, 111,2; HRMS (MALDI-FTMS) calculado para C15H8F3 N03 (MH+) 308,0529, encontrado 308,0530.

[00257] 5-Carboxi-2-[(2-trifluorometil) fenil]-benzoxazol (11).

Preparado a partir do ácido 3-amino-4-hidroxibenzóico de acordo com o procedimento geral, para fornecer 11 como um sólido branco (10,3 mg, 17 %). Dados para 11: RMN Ή (600 MHz, DMSO- d6) δ 13,19 (br. s, 1H, C02H), 8,38 (m, 1H, Ar), 8,19 (d, 1H, = 7,6 Hz, Ar), 8,09 (dd, 1H, J = 1,8, 8,5 Hz, Ar), 8,03 (d, 1H, J = 7,9 Jz, Ar), 7,94 - 7,88 (m, 3H, Ar); RMN 13C (150 MHz, DMSO-d6) δ 166,8, 161,6, 153,2, 141,1, 133,1, 132.5, 132,4, 128,2, 127,6, 127,5 (q, J = 32 Hz), 127,2 (q, J = 6 Hz), 124.7, 123,4 (q, J = 274 Hz), 121,3, 111,2; HRMS (MALDI-FTMS) calculado para Ci5H8F3 N03 (MH+) 308,0529, encontrado 308,0531.

[00258] 5-Carboxi-2-(3,5-diclorofenil)-benzoxazol (12). Preparado a partir do ácido 3-amino-4-hidroxibenzóico de acordo com o procedimento geral, para fornecer 12 como um sólido branco (7,3 mg, 12 %). Dados para 12: RMN Ή (600 MHz, DMSO- d6) δ 13,14 (br. s, 1H, C02H), 8,33 (AMX, 1H, J = 0,6, 1, 8 Hz, Ar), 8,16 (AM, 2 H, J = 1,8 Hz, Ar), 8,08 (AMX, 1H, J = 1,8, 8,5 Hz, Ar), 7,95 (AM, 1H, J = 1,8 Hz, Ar), 7,91 (AMX, 1 H, J =0,6, 8,5 Hz, Ar); RMN 13C (150 MHz, DMSO-d6) δ 166.7, 161,1, 153,0, 141,3, 135,2, 131,6, 129,2, 128,2, 127,7, 125,9, 121, 4, 111,3; HRMS (MALDI-FTMS) calculado para C14H7 Cl2 N03 (MH+) 307,9876, encontrado 307,9879.

[00259] 5-Carboxi-2-(2,6-diclorofenil)-benzoxazol (13). Preparado a partir do ácido 3-amino-4-hidroxibenzóico de acordo com o procedimento geral, para fornecer 13 como um sólido branco (10,8 mg, 18 %). Dados para 13: RMN 1H (600 MHz, DMSO- d6) δ 13,08 (br. s, 1H, C02H), 8,43 (AMX, 1H, J = 0,6, 1, 8 Hz, Ar), 8,13 (AMX, 2 H, J = 1,8, 8,5 Hz, Ar), 7,98 (AJMX, 1H, J = 0,6, 8,5 Hz, Ar), 7,77 - 7,72 (Μ, 3H, Ar); RMN 13C (150 MHz, DMSO-d6) δ 166,7, 158,6, 152,8, 140,4, 134,8, 134,2, 128,8, 128,4, 127,8, 126,2, 121, 8, 111,5; HRMS (MALDI-FTMS) calculado para C14H7 Cl2 N03 (MH+) 307,9876, encontrado 307,9879.

[00260] 5-Carboxi-2-fenil-benzoxazol (14). Preparado a partir do ácido 3-amino-4-hidroxibenzóico de acordo com o procedimento geral, para fornecer 14 como um sólido branco (11,5 mg, 24 %). Dados para 14: RMN Ή (600 MHz, DMSO- d6) δ 13,12 (br. s, 1H, C02H), 8,30 (ABX, 1H, J = 1,8 Hz, Ar), 8,20 (dt, 2H, J = 1,5, 6,7 Hz, Ar), 8,03 (ABX, 2 H, J = 1,8, 8,5 Hz, Ar), 7,87 (ABX, 1H, J = 8,5 Hz, Ar), 7,67 - 7,60 (m, 3H, Ar); RMN 13C (150 MHz, DMSO-d6) δ 166,9, 163,6, 153,0, 141,6, 132,4, 129,4, 127,9, 127,5, 127,0, 126,0, 121,0, 111,0; HRMS (MALDI-FTMS) calculado para C-|4Hg N03 (MH+) 240,0655, encontrado 240, 0656.

[00261] 6-Carboxi-2-(3,5-difluorofenil)-benzoxazol (15). Preparado a partir do ácido 3-amino-4-hidroxibenzóico de acordo com o procedimento geral, para fornecer 15 como um sólido branco (10,3 mg, 19 %). Dados para 15: RMN 1H (600 MHz, DMSO- d6) δ 13,22 (br. s, 1H, C02H), 8,20 (ABM, 1H, J = 1,5 Hz, Ar), 7,98 (ABM, 1H, J = 1,5, 8,2 Hz, Ar) 7,86 (ABM, 1 H, J = 8,2 Hz, Ar), 7,79- 7,78 (Μ, 2H, Ar), 7,57 (tt, 1H, J = 2,4, 9,4 Hz, Ar); RMN 13C (150 MHz, DMSO-d6) δ 166,7, 162,7 (d, J = 248 Hz), 162,6 (d, J = 248 Hz) 162,4, 150,0, 144,7, 129,0 (t, J = 11 Ηζ), 128,7, 126,5, 120,0, 112,1, 110,9 (d, J = 23 Hz), 110,8 (d, J = 22 Hz), 108,0 (t, J = 26 Hz); HRMS (MALDI-FTMS) calculado para C14H7 N03 (MH+) 276, 0467, encontrado 276, 0468.

[00262] 6- carboxi-2-(2,6-difluorofenil)-benzoxazol (16). Preparado a partir do ácido 3-amino-4-hidroxibenzóico de acordo com o procedimento geral, para fornecer 16 como um sólido branco (8,5 mg, 15 %). Dados para 16: RMN 1H (600 MHz, DMSO- d6) δ 13,25 (br. s, 1H, C02H), 8,30 (ABM, 1H, J = 0,6, 1,5 Hz, Ar), 8, 04 (ABM, 1H, J = 1,5, 8,2 Hz, Ar) 7,96 (ABM, 1 H, J = 0,6, 8,2 Hz, Ar), 7,76 (Μ, 1H, Ar), 7, 39 (t, 2H, J = 8,8 Hz), Ar); RMN 13C (150 MHz, DMSO-d6) δ 166,7, 160,4 (d, J = 257 Hz), 160,3 (d, J = 257 Hz), 156,6, 149,7, 144,2, 134,9 (t, J = 11Hz), 128,8, 126,4, 120,1, 113,1, 112,9, 112,2 (d, J = 5 Hz), 105, 0 (t, J = 16 Hz); HRMS (MALDI-FTMS) calculado para C14H7 N03 (MH+) 276, 0467, encontrado 276, 0466.

[00263] 6-Carboxi-2-[(3-trifluorometil) fenil]benzoxazol (17). Preparado a partir do ácido 3-amino-4-hidroxibenzóico de acordo com o procedimento geral, para fornecer 17 como um sólido branco (7,4 mg, 12 %). Dados para 17: RMN 1H (600 MHz, DMSO- d6) δ 13,20 (br. s, 1H, C02H), 8,48 (ABX, 1H, J = 7,9, Ar), 8,41 (s, 1H, Ar), 8,28 (ABJVI, 1H, J = 1,5, Ar) 8,03 (ABX, 1 H, J = 7,9 Hz, Ar), 8,02 (ABM, 1H, J = 1, 5, 8,2 Hz, Ar), 7,90 (ABM, 1H, J = 8,2 Hz, Ar), 7,86 (ABX, 1H, J = 7,9 Hz, Ar); RMN 13C (150 MHz, DMSO-d6) δ 168,0, 164,6, 151,4, 146,2, 132,8, 132,2, 131, 4 (q, J = 32 Hz), 130,2, 129,8, 128,4, 127,8, 125,2, 125,0 (q, J = 272 Hz), 121,2, 113, 6: HRMS (MALDI-FTMS) calculado para C15H8 F3N03 (MH+) 308,0529, encontrado 308, 0531. HRMS (MALDI-FTMS) calculado para C15H8 F3N03 (MH+) 308,0529, encontrado 308, 0531.

[00264] 6-Carboxi-2-[(2-trifluorometil) fenil]-benzoxazol (18).

Preparado a partir do ácido 3-amino-4-hidroxibenzóico de acordo com o procedimento geral, para fornecer 18 como um sólido branco (6,6 mg, 11 %). Dados para 18: RMN Ή (600 MHz, DMSO- d6) δ 13,22 (br. s, 1H, C02H), 8,30 (ABX, 1H, J = 0,6, 1,5 Hz, Ar), 8,20 (d, 1H, j= 7,3 Hz, Ar), 8,06 (ABX, 1H, J = 1,5, 8,2 Hz, Ar) 8,04 (d, 1H, J = 7,9 Hz, Ar), 7,98 (ABX, 1 H, J = 0,6, 8,2 Hz, Ar), 7,94 (t, 1H, J = 7,3 Hz, Ar), 7,90 (t, 1H, J = 7,9 Hz, Ar); RMN 13C (150 MHz, DMSO-d6) δ 168,0, 164,6, 151,4, 146,2, 132,8, 132,2, 131, 4 (q, J = 32 Hz), 130,2, 129,8, 128,4, 127.8, 125,2, 125,0 (q, J = 272 Hz), 121,2, 113, 6: HRMS (MALDI-FTMS) calculado para Ci5H8 F3N03 (MH+) 308,0529, encontrado 308, 0531.

[00265] 6-Carboxi-2-(3,5-diclorofenil)-benzoxazol (19). Preparado a partir do ácido 3-amino-4-hidroxibenzóico de acordo com o procedimento geral, para fornecer 19 como um sólido branco (6,0 mg, 10 %). Dados para 19: RMN Ή (600 MHz, DMSO- d6) δ 13,20 (br. s, 1H, C02H), 8,17 (ABX, 1H, J = 0,6, 1,5 Hz, Ar), 8,00 (AB, 1H, j= 7,3 Hz, Ar), 7,96 (ABX, 1H, J = 1,5, 8,5 Hz, Ar) 7,83 (AB, 1H, J = 2,0 Hz, Ar), 7,82 (ABX, 1 H, J = 0,6, 8,5 Hz, Ar); RMN 13C (150 MHz, DMSO-d6) δ 166,6, 161,9, 150,0, 144,6, 135,1, 131,6, 129,0, 128,7, 126,4, 125,8, 119.9, 112, 1: HRMS (MALDI-FTMS) calculado para C14H7CI2N03 (MH+) 307,9876, encontrado 307, 9879.

[00266] 6-Carboxi-2-(2,6-diclorofenil)-benzoxazol (20). Preparado a partir do ácido 3-amino-4-hidroxibenzóico de acordo com o procedimento geral, para fornecer 20 como um sólido branco (12,7 mg, 21 %). Dados para 19: RMN Ή (500 MHz, DMSO- d6) δ 13,27 (br. s, 1H, C02H), 8,38 (ABX, 1H, J = 0,5, 1,5 Hz, Ar), 8,09 (ABX, 1H, J = 8,3, 0,5 Hz, Ar), 7,78- 7,71 (m, 3H, Ar); RMN 13C (125 MHz, DMSO-d6) δ 166,6, 159,8 150,0, 134,8, 134,2, 129,1, 128,8, 126,4, 126,3, 120,4, 112, 6: HRMS (MALDI-FTMS) calculado para C14H7CI2N03 (MH+) 307,9876, encontrado 307, 9877.

[00267] 6-Carboxi-2-fenil-benzoxazol (21). Preparado a partir do ácido 3-amino-4-hidroxibenzóico de acordo com o procedimento geral, para fornecer 21 como um sólido branco (7,0 mg, 15 %). Dados para 21: RMN 1H (600 MHz, DMSO- d6) δ 13,16 (br. s, 1H, C02H), 8,27 (d, 1H, J = 0,9 Hz, Ar), 8, 25- 8,22 (m, 2H, Ar), 8,01 (dd, 1H, J = 1, 5 8,5 Hz, Ar), 7,89 (d, 1H, J = 8, 5 Hz, Ar), 7,69 - 7,62 (m, 3H, Ar); RMN 13C (150 MHz, DMSO-de) δ 166,8, 164,7, 150,0, 145,2, 132, 6, 129,4, 128,0, 127,6, 126, 3, 126, 0, 119, 6, 112,0; HRMS (MALDI-FTMS) calculado para C14H9NO3 (MH+) 240, 0655, encontrado 240, 0655.

[00268] 7-Carbóxi-2- (3,5-difluorofenil)-benzoxazol (22). Preparado a partir do ácido 3-aminossalicílico de acordo com o procedimento geral, para fornecer 22 como um sólido branco (8,8 mg, 16 %). Dados para 22: RMN 1H (600 MHz, DMSO- d6) δ 13,55 (br. s, C02H), 8,10 (AMX, 1H, J = 1,2, 7,9 Hz, Ar), 7,97 (AJMX, 1H, J = 1,2, 7,9 Hz, Ar), 7,80 - 7,79 (m, 2H, Ar), 7,63 (tt, 1H, J = 2,4, 9,2 Hz, Ar), 7,55 (AMX, 1 H, J = 7,9 Hz, Ar); RMN 13C (150 MHz, DMSO-d6) δ 164,5, 162,8 (d, J= 248 Hz), 162, 6 (d, J = 248 Hz), 160,9, 149, 2, 142, 6, 129,2, 128,0, 125, 2, 124, 9, 116,1, 110,6 (d, J = 28 Hz), 107,7 (q, J = 25 Hz); HRMS (MALDI-FTMS) calculado para C14H7 F2N03 (MH+) 276, 0467, encontrado 276, 0469.

[00269] 7-Carbóxi-2- (2,6-difluorofenil)-benzoxazol (23). Preparado a partir do ácido 3-aminossalicílico de acordo com o procedimento geral, para fornecer 23 como um sólido branco (7,3 mg, 13 %). Dados para 23: RMN 1H (600 MHz, DMSO- d6) δ 13,48 (br. s, C02H), 8,16 (ABX, 1H, J = 1,2, 8,2 Hz, Ar), 8,00 (ABX, 1H, J = 1,2, 7,6 Hz, Ar), 7,78 (m, 1H, Ar), 7,57 (ABX, 1 H, J = 7,6, 8,2 Hz, Ar), 7,40 (t, 2H, J = 8,5 Hz, Ar); RMN 13C (150 MHz, DMSO-d6) δ 164,5, 160,4 (d, J= 256 Hz), 160, 3 (d, J = 257 Hz), 154, 9, 148, 9, 142, 1, 134, 8 (t, J = 10 Hz), 128,0, 125, 1, 125,0, 116, 0, 113,0 (d, J =22 Hz), 112,9 (q, J = 21 Hz), 105,1 (t, J = 17 Hz); HRMS (MALDI-FTMS) calculado para C14H7 F2N03 (MH+) 276, 0467, encontrado 276, 0467.

[00270] 7-Carboxi-2-[(3-trifluorometil) fenil]-benzoxazol (24).

Preparado a partir do ácido 3-aminossalicílico de acordo com o procedimento geral, para fornecer 24 como um sólido branco (7,9 mg, 13 %). Dados para 24: RMN 1H (600 MHz, DMSO- d6) δ 13,51 (br. s, C02H), 8,48 (ABX, 1H, J = 8,2 Hz, Ar), 8,40 (s, 1H, Ar), 8,10 (AMX, 1H, J= 1,2, 7,9 Hz, Ar) 8,05(ABX, 1H, J = 7,9 Hz, Ar), 7,96 (AJMX, 1 H, J = 1,2, 7,6 Hz, Ar), 7,94 (ABX, 1H, J = 7,9 Hz, Ar), 7,54 (AMX, 1H, J = 7,9, 7,6 Hz, Ar); RMN 13C (150 MHz, DMSO-d6) δ 164,6, 161,7, 149, 3, 142, 7, 131, 3, 131,0, 130,0 (q, J = 32 Hz), 128,6 (d, J = 3 Hz), 127, 7, 127, 2, 125,0, 124, 8, 123, 7 (q, J = 272 Hz), 123, 5, 116,0; HRMS (MALDI-FTMS) calculado para C14H7 F2N03 (MH+) 276, 0467, encontrado 276, 0467.

[00271] 7-Carboxi-2-[(2-trifluorometil) fenil]-benzoxazol (25). Preparado a partir do ácido 3-aminossalicílico de acordo com o procedimento geral, para fornecer 25 como um sólido branco (13,8 mg, 22 %). Dados para 25: RMN 1H (600 MHz, DMSO- d6) δ 13,46 (br. s, C02H), 8,18 (d, 1H, J = 7,6 Hz, Ar), 8,14 (AMX, 1H, J= 1,2, 7,9 Hz, Ar), 8,03 (d, 1H, J = 7,9 Hz, Ar), 7,98 (AJMX, 1H, J= 1,2, 7,6 Hz, Ar), 7, 94 (t, 1H, J= 7,3 Hz, Ar), 7,89 (t, 1H, J = 7,6 Hz, Ar), 7,56 (AMX, 1H, J = 7,9, Hz, Ar); RMN 13C (150 MHz, DMSO-d6) δ 164,6, 161,1, 149, 3, 142,4, 133, 0, 132,4, 132,2, 127, 8, 127,6, 127,2 (q, J = 6 Hz), 125,0, 124,9, 123,4 (q, J = 273 Hz), 116,2; HRMS (MALDI-FTMS) calculado para C15H8 F3N03 (MH+) 308,0529, encontrado 308, 0534.

[00272] 7-Carboxi-2-(3,5-diclorofenil)-benzoxazol (26). Preparado a partir do ácido 3-aminossalicílico de acordo com o procedimento geral, para fornecer 26 como um sólido branco (7,0 mg, 11 %). Dados para 26: RMN 1H (600 MHz, DMSO- d6) δ 14,00 - 12,80 (br. s, C02H), 8,10 - 8,08 (Μ, 3H, Ar), 7,98 - 7,96 (m, 2H, Ar), 7,55 (t, 1H, J = 7,8 Hz, Ar); RMN 13C (150 MHz, DMSO-d6) δ 164,5, 160,5, 149,2, 142,6, 135, 2, 131,5, 129,4, 128,0, 125,2, 124,8, 116, 2; HRMS (MALDI-FTMS) calculado para Ci4H7CI2 N03 (MH+) 307,9876, encontrado 307, 9874.

[00273] 7-Carboxi-2-(2,6-diclorofenil)-benzoxazol (27). Preparado a partir do ácido 3-aminossalicílico de acordo com o procedimento geral, para fornecer 27 como um sólido branco (10,3 mg, 17 %). Dados para 27: RMN 1H (600 MHz, DMSO- d6) δ 13,90 - 13,10 (br. s, C02H), 8,16 (AMX, 1H, J = 7,9 Hz, Ar), 8,02 (AJMX, 1H, J = 7,9 Hz, Ar), 7,78 - 7,72 (m, 3H, Ar), 7,60 (AMX, 1H, J = 7,9 Hz, Ar); RMN 13C (150 MHz, DMSO-d6) δ 164.4, 158,3, 149,1, 141,7, 134, 9, 134,2, 128,8, 128,2, 126,5, 125,3, 125,2, 116,2; HRMS (MALDI-FTMS) calculado para C14H7CI2 N03 (MH+) 307,9876, encontrado 307, 9875.

[00274] 7-Carboxi-2-fenil-benzoxazol (28). Preparado a partir do ácido 3-aminossalicílico de acordo com o procedimento geral, para fornecer 28 como um sólido branco (13,1 mg, 27 %). Dados para 28: RMN 1H (600 MHz, DMSO- d6) δ 13,48 (br. s, C02H), 8,20 - 8,19 (m, 2H, Ar), 8,05 (AMX, 1H, J = 1,2, 7,9 Hz, Ar), 7,92 (AJMX, 1H, J = 1,2, 7,6 Hz, Ar), 7,66 - 7,62 (m, 3H, Ar), 7,50 (AMX, 1H, J = 7,9 Hz, Ar); RMN 13C (150 MHz, DMSO-d6) δ 164,8, 163,1, 149,2, 142,9, 132,2, 129.4, 127,2, 126,0, 124,7, 124,4, 115,8; HRMS (MALDI-FTMS) calculado para Ci4H7CI2 N03 (MH+) 240, 0655 encontrado 240, 0656.

Outras Modalidades [00275] Deve ser entendido que, embora a invenção tenha sido descrita em conjunção com a descrição detalhada da mesma, a descrição precedente em a intenção de ilustrar, e não de limitar o escopo da invenção. Outros aspectos, vantagens, e modificações da invenção estão dentro do escopo das reivindicações expostas abaixo: REIVINDICAÇÕES

Claims (39)

1. Composto, caracterizado pelo fato de ser da fórmula: ou um sal farmacêutica mente aceitável do mesmo, em que Ar é fenila, 3,5-difluorofenila, 2,6-difluorofenila, 3,5-diclorofenila, 2,6-diclorofeníla, 2-(trifl uorometi I )feni Ia, ou 3-(trífluorometiI )feniIa.

2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é: 4-carbóxi-2-(3,5-diflu or ofen il)-benzoxazol; 4-ca rbóx i -2- (2,6-d ifl u orofeni I)- be n zoxa zol; 4-carbóxi-2-[(3-trifluorometil)fenil]-benzoxazol; 4-carbóxí-2-[(2-trifluorometil )fenil]-benzoxazol; 4-ca rbóx i-2- (3,5-d i cl o rofe η ί I)- be n zoxa zol; 4-carbóxi-2-(2,6-diclorofenil)-benzoxazol; 4- carbóxi-2-fenil-benzoxazol; 5- carbóxi-2-(3,5-d ifl uorofenil )-benzoxazol; 5-carbóxi-2-(2,6- difl uorofenil )-benzoxazol; 5-carbóxi-2-[(3-trifluorometil)fenil]-benzoxazol; 5-carbóxi-2-[(2-trifluorometil)fenil]-benzoxazol; 5-carbóxi-2-(3,5-d ifl uorofenil )-benzoxazol; 5-carbóxi-2-(2,6- diclorofenil )-benzoxazol; 5- carbòxi-2-feníl-benzoxazol; 6- carbóxi-2-(3,5-difl uorofenil )-benzoxazol; 6-carbóxi-2-(2,6- difl uorofenil )-benzoxazol; 6-carbóxi-2-[(3-trifluorometil)fenil]-benzoxazol; 6-carbóxi-2-[(2-trifluorometil)fenil]-benzoxazol; 6-carbóxi-2-(3,5-diclorofenil)-benzoxazol; 6-carbóxi-2-(2,6- diclorofenil)-benzoxazol; 6- carbóxi-2-fenil-benzoxazol; 7- carbóxi-2-(3,5-difluorofenil)-benzoxazol; 7-carbóxi-2-(2,6-difluorofenil)-benzoxazol; 7-carbóxi-2-[(3-trifluorometil)fenil]-benzoxazol; 7-carbóxi-2-[(2-trifluorometil)fenil]-benzoxazol; 7-carbóxi-2-(3,5-diclorofenil)-benzoxazol; 7-carbóxi-2-(2,6-diclorofenil)-benzoxazol; 7-carbóxi-2-fenil-benzoxazol, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

3. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é ácido 2-(3,5-diclorofenil)-benzoxazol-6-carboxílico ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

4. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é 4-carbóxi-2-(3,5-difluorofenil)- benzoxazol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

5. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é 4-carbóxi-2-(2,6-difluorofenil)- benzoxazol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

6. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é 4-carbóxi-2-[(3-trifluorometil)fenil]-benzoxazol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

7. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é 4-carbóxi-2-[(2-trifluorometil)fenil]-benzoxazol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

8. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é 4-carbóxi-2-(3,5-diclorofenil)- benzoxazol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

9. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é 4-carbóxi-2-(2,6-diclorofenil)-benzoxazol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

10. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é 4-carbóxi-2-fenil-benzoxazol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

11. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é 5-carbóxi-2-(3,5-difluorofenil)-benzoxazol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

12. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é 5-carbóxi-2-(2,6- difluorofenil)- benzoxazol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

13. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é 5-carbóxi-2-[(3-trifluorometil)fenil]-benzoxazol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

14. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é 5-carbóxi-2-[(2-trifluorometil)fenil]-benzoxazol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

15. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é 5-carbóxi-2-(3,5-difluorofenil)- benzoxazol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

16. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é 5-carbóxi-2-(2,6- diclorofenil)- benzoxazol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

17. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é 5-carbóxi-2-fenil-benzoxazol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

18. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é 6-carbóxi-2-(3,5-difluorofenil)- benzoxazol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

19. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é 6-carbóxi-2-(2,6- difluorofenil)-benzoxazol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

20. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é 6-carbóxi-2-[(3-trifluorometil)fenil]-benzoxazol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

21. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é 6-carbóxi-2-[(2-trifluorometil)fenil]-benzoxazol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

22. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é 6-carbóxi-2-(2,6- diclorofenil)-benzoxazol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

23. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é 6-carbóxi-2-fenil-benzoxazol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

24. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é 7-carbóxi-2-(3,5-difluorofenil)- benzoxazol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

25. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é 7-carbóxi-2-(2,6-difluorofenil)- benzoxazol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

26. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é 7-carbóxi-2-[(3-trifluorometil)fenil]-benzoxazol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

27. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é 7-carbóxi-2-[(2-trifluorometil)fenil]-benzoxazol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

28. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é 7-carbóxi-2-(3,5-diclorofenil)- benzoxazol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

29. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é 7-carbóxi-2-(2,6-diclorofenil)-benzoxazol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

30. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é 7-carbóxi-2-fenil-benzoxazol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

31. Composto, caracterizado pelo fato de que é 6-Carboxi-2-(3,5-diclorofenil)-benzoxazol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

32. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 30, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

33. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pelo fato de que é formulada para administração em dosagem única.

34. Uso de um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 30 ou de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de ser para o preparo de um medicamento para tratar uma doença amilóide de transtiretina.

35. Uso de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que a doença amilóide de transtiretina é polineuropatia amilóide familial.

36. Uso de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que a doença amilóide de transtiretina é cardiomiopatia amilóide familial.

37. Uso de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que a doença amilóide de transtiretina é amiloidose sistêmica senil.

38. Uso de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que a doença amilóide de transtiretina é amiloidose cardíaca depois do transplante de fígado.

39. Uso de uma quantidade estabilizante do composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 30, caracterizado pelo fato de ser para preparar um medicamento para estabilizar transtiretina em um tecido ou em um fluido biológico.