JPH0222299A

JPH0222299A - 抗生物質

Info

Publication number: JPH0222299A
Application number: JP1054866A
Authority: JP
Inventors: Stephen Rossall; スティーブン、ロサール
Original assignee: Agricultural Genetics Co Ltd
Current assignee: MicroBio Group Ltd
Priority date: 1988-03-07
Filing date: 1989-03-07
Publication date: 1990-01-25
Anticipated expiration: 2012-08-25
Also published as: ZA891662B; DE68910350T2; CA1337935C; BR8901057A; GB8805394D0; HUT53676A; ES2059725T3; EP0332369A3; AU3101589A; EP0332369B1; EP0332369A2; US5061495A; KR890014123A; ATE96842T1; JP2644321B2; DE68910350D1; HU204571B; AU618323B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、バチルス・スブチリス（Ｂ４ｃｉｌｌｕｓｓ
ｕｂｔｊｌｌｓ）株ＮＣＩＢ　　１２３７５．１２３７
６及び１２６１６並びに関連株から誘導される抗生物質
に関する。

Ｂ、スブチリス株ＮＣＩＢ　　１２３７５、１２３７６
及び１２６１６の性質は、欧州特許出願公開第２７６．
１３２号明細書に記載されている。これらの株は、スコ
ツトランド、ＡＢ９８ＤＧ、　　アバーディーン（Ａｂ
ｅｒｄｅｅｎ）、アビ−ロードく＾ｂｂｅｙ　Ｒｏａｄ
）１３５．　　Ｐ、　０．ボックス３１のナショナル・
コレクションズ・オブ・インダストリアル・アンド・マ
リン・バクテリア社（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃ
ｔｉｏｎｓ　ｏ「Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　ａｎｄＭａｒ
ｉｎｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａ　Ｌｔｄ、）　　（ＮＣＩ　
Ｂ）　、　　トリー・リサーチ−ステーション（Ｔｏｒ
ｒｙ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＳｔａｔ　１ｏｎ）に１９８６
年１２月２２日付（ＮＣＩＢ１２３７５及び１２３７６
）及び１９８７年１２月２４日付（ＮＣＩＢ　　１２６
１６）で寄託された。

我々は、Ｂ、スブチリス株ＮＣＩＢ　　１２３７５．１
２３７６及び１２６１６の抗真菌性が新規抗生物質と関
係があることを見出した。

バチルス種の株から産生される抗生物質は、既に報告済
みである（参考文献１）。これらが特徴付けられたとき
、それらは典型的には範囲２７０〜４５００ドルトンの
分子量の小さなペプチド及びペプチド脂質であることが
判明した。しかしながら、−例として、Ｂ、スブチリス
株（ＡＰＰＬ−１）から産生される大きさ１００，００
０ドルトン以上の抗生物質もあるが（参考文献３）、後
の論文では５−１００００の大きさと主張している（参
考文献２）。大半のバチルス属抗生物質はグラム陽性閑
に対して活性であるが、一部はグラム陰性菌、酵母及び
真菌に対して活性を有することが判明した（参考文献４
）。

Ｂ、スブチリス株から産生される過去に報告済みのすべ
ての抗真菌抗生物質は、抗生物質の位置（細菌細胞の内
外）及び分子構造から分類された３群のうち一つに属す
る（参考文献５〜７）。これらの群は下記のとおりであ
る：細胞内環状ペプチド脂質、細胞外環状ペプチド脂質
、細胞外環状ペプチド。前記例外を除き、これらの抗生
物質のすべては４５００ドルトン以下の大きさである。

Ｂ、スブチリス株から産生される過去に報告済みの抗真
菌抗生物質は第１表で一括して掲載されている。

第１表Ｂ、スブチリス株から産生される抗真菌抗生物質化合物
のタイプ　　　　　　　名　称細胞内環状ペプチド脂質　　マイニスブチリン細胞外環
状ペプチド脂質　　アスベルギルスファクターバチロマ
イシンＡ〆ｌＢ〃　　　Ｄｔｔ　　　　Ｆ〃　　　Ｌ〃　　　Ｒ〃　　　ＳニーマイシンフエンギシンイツリンＡトキシマイシン細胞外環状ペプチド　　　　ケトマシンファンシスタチ
ンマイコバチリンリゾクトニアファクター第１表に掲載された抗生物質の一部の物理的性質につい
ては報告済みである。抗生物質のイツリン群は水に不溶
性であって、一部はアセトンに可溶性である（参考文献
５．６及び１２）。イツリンＡ及びバチロマイシンＦは
、電気泳動により中性のペプチド脂質であることが示さ
れた（参考文献１２）。イツリンＡ及びバチロマイシン
しは、他のいかなるｐＨ値でもなく　ｐＨ３及びｐＨ１
０において熱安定性である（参考文献５．１４及び２３
）。バチロマイシンしは、中性ｐＨでブタノール中に分
配されない（参考文献２４）。細胞内環状ペプチド脂質
マイコバチリンは、メタノール、エタノール及びブタノ
ールに不溶性である（づ考文献５及び８）。マイコバチ
リン及びケトマシンは双方ともアセトンに可溶性である
が、但し前者はｐＨ値７以下の水に不溶性である（参考
文献２０及び２２）。リゾクトニアファクターはエタノ
ール及びブタノールに不溶性であって、ｐＨ２でのみ熱
安定性である（参考文献５及び９）。ファンシスタチン
は、水と接触した場合に不活性ゲルを形成する両性ペプ
チドである（参考文献１０）。

抗真菌抗生物質の混合物を含有した活性画分は、Ｂ、ス
ブチリス株Ｂ−３の培養物から単離することができる（
参考文献２５）。抗生物質混合物は、タンパク質に関す
るニンヒドリン試験で陽性反応を示す。混合物はｐ、Ｈ
値５．０以下でのみ熱安定性であるが、これは混合物が
ｐＨＨ値７５以下の水に不溶性であるという観察結果に
関係があるのであろう。この混合物はエタノール、メタ
ノール及びイソプロパツールに可溶性であるが、酢酸エ
チル、アセトン、ジエチルエーテル又はジ塩化メチレン
に不溶性である。

Ｂ、スブチリス株ＡＰＰＬ−Ｉの培養物から単離された
抗生物質画分は熱安定性であって、タンパク質９５％及
び炭水化物５％からなる（参考文献２）。

抗生物質イツリンＡ１フェンキシン並びにバチロマイシ
ンＦ及びＬの脂質成分の脂肪酸組成が特徴付けられた（
参考文献１８．２６〜２８）。脂肪酸類はメチル分岐鎖
化されており、炭素原子１３〜１６を含み、フエンギシ
ンの例外を除き、Ｂ−アミノ酸の成分である。

本発明は、バチルス・スブチリス株ＮＣＩ　Ｂ１２３７
５．１２３７６もしくは１２６１６から誘導されかつＢ
、スブチリス株から産生される過去に報告済みの抗生物
質とは異なる性質を有する新規抗生物質を提供する。本
発明の抗生物質は下記特徴を有する：（１）グラム陰性菌に対してではなく、真菌及びグラム
陽性菌に対する抗菌活性；（２）球状タンパク質標準に対して較正されるゲル濾過
クロマトグラフィーにより決定された場合に６３５００
±３７００ドルトンの分子量；（３）タンパク質の存在
に関する下記試験に対する陽性反応：ローリ−、波長２
８０ｎ−の光吸収度、ビウレット及びニンヒドリン；（４）アミノ酸のアスパラギン酸、トレオニン、セリン
、グルタミン酸、プロリン、アラニン、バリン、イソロ
イシン、ロイシン及びチロシンを含むタンパク質性；（５）プロナーゼＥ酵素による消化に対して耐性である
タンパク質性；（６）炭素原子１４〜１７を含有する脂肪酸を含んだ脂
質分；（７）６．０〜７．０の至適ｐＨ；（８）ｐＨ範囲５．０〜９．０にわたり１１０℃で１０
分間維持された場合おける活性の保持；（９）ｐＨＨ値
５０以上の水に可溶性；（１０）メタノール、エタノー
ル及びブタノールにｉｉＪ溶性、かつジメチルスルホキ
シドに一部可溶性；及び（１１）アセトン、石油エーテル、クロロホルム、トル
エン及びヘキサンに不溶性。

Ｂ、スブチリスＮＣＩＢ　　１２３７６は、Ｂ。

スブチリスＮＣＩＢ　　１．２３７５から誘導された。

抗生物質を同じく産生しうるＮＣＩＢ　　１２３７５の
変異株又は誘導株は、株ＮＣＩＢ　　１２６１６である
。ＮＣＩＢ　　１２３７６及びＮＣＩＢ　　１．２６１
６の双方は、ＮＣＩＢ　　１２３７５の抗生物質産生誘
導株としてみなされる。他の８．スブチリス株及び他の
微生物種も本発明の主題である抗生物質を産生ずるのが
見出されうろことは、当業者にとって認識されるであろ
う。

抗生物質は、真菌症に対する植物の保護のために使用さ
れる。抗生物質産生微生物の培養物は、葉の真菌症から
保護するために植物葉上に液体培養物を散布することに
より直接使用することができる。一部の場合では、全培
養物ブロスではなく適切な培養物の抗生物質画分を用い
ることがより効果的である。このような画分は、微生物
の胞子を含有していてもよい。多（の植物ではその上で
植物保護剤の良好な分散及び付着を達成することが困難
な葉を有しており、かかる場合には分散及び付着を助け
る成分と共に培養物又は抗生物質画分を処方することが
有利である。適切な処方剤は、当業者に公知である。

抗生物質は、土壌性真菌症からの植物の保護のためにも
使用可能である。抗生物質産生微生物の培養物又はそれ
から誘導される抗生物質画分も、土壌性の病気から保護
する上で種子をコーティングするために使用することが
できる。一方、培義物又は抗生物質画分は種子近くの土
壌に直接適用してもよい。液体でも又は固体処方剤であ
っても、この目的のために使用可能である。

本発明は下記例によって説明される。

例１　抗生物質の精製細菌Ｂ、スブチリスＮＣＩＢ　　１２３７６をオービタ
ルシェーカー内の液体培地中３０℃で７２時間増殖させ
た。下記の２種の化学的に規定された増殖培地を用いた
：培地１グルコース　　　　　　１０ｇＫＨ２ＰＯ４２，０ｇＭｇ５ｏ４　　　　０．５ｇＫＣｌ　　　　　　　　　　Ｏ，５ｇＭ　ｎ　Ｃ１２０、０１ｇＦ　ｅ　Ｓ　Ｏ４０−０１ｇグルタミン酸　　　　　　５ｇ水　　　　　　　　　　１リツトル培地２ソルビトール　　　　　２０ｇＫＨ２ＰＯ４１，０ｇＭｇ３０４　　　　０．５ｇＫＣｌ　　　　　　　　　Ｏ，５ｇＭ　ｎ　Ｃｌ　２　　　　　０　、　ＯＸ　ｇＦ　ｅ　
Ｓ　０４　　　　　　０−０１　ｇグルタミン酸　　　
　　　２．５ｇアスパラギン　　　　　２．５ｇ水　　　　　　　　　　１リツトル細菌細胞及び胞子を１０，０００ｇで２０分間の遠心分
離によりブロスから除去し、無細胞培地をＨＣＩで処理
して、ｐｉ（を２．０に減少させた。

抗生物質が沈降析出したが、これを更に高速の遠心分離
によって回収した。得られたペレットを少量の０．１Ｍ
　　ＮａＯＨに再溶解し、更に水を加え、ｐＨを８．０
に低下させた。この水性調製液を、抗菌活性がＨ線用で
のみ検出されるまで、等量のブタノールで３回分配した
。

次いで、有機相を集め、回転エバポレーターを用いて真
空下４０℃で蒸発乾固させた。抗生物質ａＨ残渣をｐＨ
６，０のリン酸カリウム緩衝液に再溶解した。容Ｈ５０
ｍｌのセファデックス０１００カラム（セファデックス
（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）は商標名である）を用いて、ゲル
濾過クロマトグラフィーを実施した。カラムがｐＨ７，
０の０．２５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液２倍カラム容量
で平衡化された後、部分的精製抗生物質０．５ｍｌをカ
ラムの最上部に供した。１．５ｍ１画分を１．ＫＢ７０
００画分コレクターで集めた。各画分を例３で記載され
ているように抗菌活性に関して試験した。

抗菌活性は画分１１〜１４でのみ検出された。

分子量マーカー（球状タンパク質、牛血清アルブミン、
卵白アルブミン、キモトリプシン及び千トクロームＣ）
によるカラムの較正から、抗生物質が６３，５００±３
，７００ドルトンの分子量を白゛することを証明した。

線状デキストランとの較正では、抗生物質が３５，００
０ドルトンの分子量を有することを示した。抗菌活性は
４，５００ドルトン以下の分子量に相当する画分て存在
しなかったばかりか、１００，０００ドルトン以上の大
きさの分子が存在する溶出容量分でも活性は全く存在し
なかった。

培地１が細菌増殖用に用いられた場合には、抗菌活性の
あるゲル濾過画分はタンパク質、脂質及び炭水化物を含
有することが見出された（１．２ｍｇ　／　ｍｌ　）。

培地２が細菌増殖用に用いられた場合には、抗生物質画
分は著しく低い炭水化物含有量であったものの（０，１
ａ＋ｇ／ｍｌ）　、抗菌活性がそれに付随して減少する
ことはなかった。このことは、抗生物質がタンパク質及
び脂質成分から構成されていることを示している。

抗生物質含有画分を例１で記載されているようにＢ、ス
ブチリスＮＣｌ３　１２３７６のグルコース増殖培養物
から調製した。タンパク質分解を受は易いいずれのタン
パク質も消化させるために、例６で記載されているよう
に画分をプロナーゼＥで処理した。画分のタンパク質含
有成分を、５　ｍｌ　Ｑセフ（Ｓｅｐｈ）　Ｆ　Ｆカラ
ム〔ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｌａ）製〕の陰イオ
ン交換ＦＰＬＣにより分離した。画分１００μｌをカラ
ムにのせ、ｐＨ８，０の２０ｄトリス緩衝液及びＮａＣ
１勾配（出発濃度０１最終濃度ＩＭ、勾配の全容二５６
ｍ１）で溶出させた（　１．　ｍｌ　／分）、２５４ｎ
ｉ＋検出器（０，４５ＡＵ感度）を用いた。４つのピー
クを検出した。４つの画分を各々１０００倍過剰の蒸溜
水に対して透析し、しかる後真空蒸発により２倍に濃縮
した。次いで、透析画分を例３で記載されているように
抗菌活性に関して試験した。

抗菌活性は、カラムから溶出した４訃目の画分でのみ見
出された。

例３　抗菌活性に関するバイオアッセイ拡散バイオアッ
セイは寒天上にアッセイ用微生物群を有するガラス皿中
で行われ、アッセイ用サンプルを寒天中で切り分けられ
たウェルに供した。

抗生物質の拡散によりアッセイ用生物の増殖阻害ゾーン
を形成するが、このゾーンの径は抗生物質濃度の対数に
ほぼ比例している。したがって、抗菌活性は定量が可能
である。

使用前に、ガラス製バイオアッセイ皿（２０×２０ｃｍ
）をメタノール変性アルコールで洗浄し、しかる後これ
に溶融サブロー（Ｓａｂｏｕｒａｕｄ）グルコース寒天
２００ｍ１を充填して、基本層を設置かつ形成させた。

ボトリチス−シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｌｓ　ｃｉｎｃｒ
ｃａ）分生子懸濁液は、Ｂ、シネレアの胞子形成固体培
養物含何フラスコに無菌蒸溜水約２０ｍ１を加えること
により調製した。分生子を無菌ワイヤーループでこすり
取り、得られた懸濁液を無菌培地で濾過した。次いで、
濾液を集め、胞子を２０００ｇで３分間遠心分離後無菌
蒸溜水で２回洗浄した。分生Ｔ濃度を血球計数器カウン
トにより評価し、無菌蒸溜水による希釈で１×１０５／
ｍｌに調製した。

この懸濁液１０ｍ１を冷（４０℃）溶融サブローグルコ
ース寒天１００ｍ１に加えた。この播種寒天を基本層上
に注ぎ、酸性化させた。６ウ工ル／列で６列の型板を用
いて、ウェルを４号コア孔あけ機で双方の寒天層におい
て切断した。

分析される溶液の１００μｌアリコートをウェル中に分
配したが、１プレートにつき各溶液の同一サンプルで少
なくとも３回行った。バイオアッセイ用水溶液を最初に
０．４５μｍ濾過膜に通した。皿をカバーし、１８℃で
３日間インキュベートした。

インキュベート終了後、阻害ゾーンの径を１対のキャリ
バー（ｃａｌｌｐｅｒ）で′Ａｌｌ定した。ゾーンを水
性トリパンブルーで１分間皿に満たすことにより視覚化
し、しかる後水道水で簡単に洗浄した。

例４　抗生物質中におけるタンパク質の存在抗生物質含
有画分を、例１で記載されているように、Ｂ、スブチリ
スＮＣＩＢ　　１２３７６のグルコース増殖培養物から
＃製した。画分を試験したところ、下記方法によりタン
パク質に関して陽性であることが判明した：ローリー、
ビウレット、ニンヒドリン及び波長２８０　ｎｍの光吸
収度。ローリ−、ビウレット及びニンヒドリンアッセイ
は文献（参考文献２９〜３１）記載のように実施された
。波長２８０ｎ１１の光吸収度は分光測定器でΔ−ｊ定
された。

例５　抗生物質のアミノ酸組成抗生物質含有画分を、例１で記載されているように、Ｂ
、スブチリスＮＣＩＢ　　１２３７６のグルコース増殖
培養物から調製した。塩酸を濃度５．７５Ｍまで加え、
窒素下１００℃で４時間インキュベートすることにより
、画分を酸消化させた。消化されたサンプルを蒸発濃縮
し、水に再懸濁し、ＮａＯＨで中性ｐＨに調整した。ア
ミノ酸分は、２５０　Ｘ　４　＋９＋ｍアミネックス（
Ａａｉｎｅｘ）Ａ　９樹脂カラム及び標準クエン酸リチ
ウム緩衝液溶離系を用いてＬＫＢ４４００アミノ酸アナ
ライザーにより調べた。

アミノ酸に基づき１０の主なピークが存在する。

これらの主な比率は、第２表に示されている。いずれの
一般的タンパク質アミノ酸にも相当しない他の５つの主
ピークも存在する。これらのピークにト目当する化合物
の確認は不明である。

例６　プロナーゼＥによる消化に対する耐性抗生物質含
有画分を、例１で記載されているように、Ｂ、スブチリ
スＮＣＩＢ　　１２３７６のグルコース増殖培養物から
調製した。画分をプロナーゼＥ１ｍｇ含ｈ−ｐＨ７，５
の０．２５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中２０℃で３時間
インキュベートした。次いで、プロナーゼＥを１０分間
のサンプル煮沸により不活性化した。サンプルを例１で
記載されているようにブタノール中に分配させた。

水性及びａ機画分の双方を例３で記載されているように
抗菌活性に関して試験したが、活性は有機画分でのみ存
在し、しかる後これを真空下で蒸発乾固させた。固体物
を少量のＩＭ　　ＮａＯＨにｔｒｉ溶解し、ＨＣＩでｐ
Ｈ７に調整した。溶液を例１で記載されているようにセ
ファデックスＧ−１００カラムでのゲル濾過クロマトグ
ラフィーに供した。分子！６３，５００ドルトンに相当
する画分をプールし、ＩＭ　　ＨＣＩでｐＨ２に調整し
て抗生物質を沈降させた。例３で記載されたバイオアッ
セイにより、抗菌活性が存在することを確認した。沈降
物を前記のように再溶解させた。サンプルを酸消化させ
、例うで記載されているようにアミノ酸分を調べた。プ
ロナーゼＥ処理ではアミノ酸モル比を有意に変化させる
ことはなかったが（第２表）、このことは抗生物質がこ
のプロテアーゼ消化に耐性であることを示している。

第２表抗生物質のアミノ酸組成アミノ酸　　　　　　モ　ル　比４アスパラギン酸トレオニンセリングルタミン酸プロリンアラニンバリンイソロイシンロイシンチロシン８アラニンとの比較５．１　　　　　　　７．０１．８　　　　　　　２．２２．１　　　　　　　２．８８．０　　　　　　　８．２１．４　　　　　　　１．５ｉ、ｏ　　　　　　　　ｉ、。

３．４　　　　　　　４．１１．１　　　　　　　　１．１６．２　　　　　　　３．７４．４　　　　　　　１．５例７　抗生物質の脂肪酸組成抗生物質３６画分を、例１で記載されているように、Ｂ
、スブチリスＮＣｌ３　１２３７６のグルコース増殖培
養物から調製した。画分を乾燥メタノール中５％硫酸と
共に７２℃で２時間インキュベートすることによりケン
価した。ケン価されたサンプルをオクタツールで抽出し
、抽出物の脂肪酸分を２４メトレ（ａｃｔｒｅ）　Ｂ　
Ｐ　２０融解石英キャピラリーカラム装備ヒユーレット
・パラカード（ｔｌｃｖｌｃｔｔ　Ｐａｃｋａｒｄ）　
Ｇ　Ｃ／　Ｍ　Ｓシステム上のガスクロマトグラフィー
／マススペクトロメトリー（ＧＣ／ＭＳ）により分析し
た。７つの主なピークが検出され、第３表で掲載された
脂肪酸に相当することが判明した。脂肪酸は炭素原子鎖
長１４〜１７の範囲内であり、すべて明らかに十分に飽
和されている。脂肪酸のうち３つはメチル側鎖を有する
ことが判っているが、但し分岐点の位置は不明である。

用いられたケン価方法はエステル結合を加水分解するが
、但しペプチド結合を切ることはないよってある。した
がって、脂肪酸はエステル結合によって抗生物質のタン
パク質成分に結合せしめられている可能性が最も高いよ
うである。

よって、他のＢ、スブチリス株から単離される大半の抗
生物質の場合と同様に、それらはＢ−アミノ酸の構成成
分ではない。

第３表抗生物質の脂肪酸組成脂肪酸　　　　　　　　　全体中の９６１４：０　　　
　　　　　　　　７１５：０　　　　　　　　　　　９１５：０　（メチル分岐鎖化）３６１６：０　　　　　　　　　　２３１６：０（メチル分岐鎖化）　　４１７：０　　　　　　　　　　　６１７：Ｏ（メチル分岐鎖化）１５例８　抗生物質の熱安定性Ｂ、スブチリスＮＣＩＢ　　１２３７５をオービタルシ
ェーカー内の酵母ペプトン−グルコースブロス中３０℃
で７２時間増殖させた。細菌細胞及び胞子を１０．ＯＯ
ｇで２０分間の遠心分離によリブロスから除去した。培
養ブロスのアリコートを希ＨＣＩ又は希ＮａＯＨのいず
れかの添加により範囲４〜１０のｐＨ値に調整した。次
いで、各サンプルの一部をマツカートニー（ＭｃＣａｒ
ｔｎｃｙ）ボトル中に分配し、１１０℃で１０分間オー
トクレーブ処理した。冷却後、サンプルを例３で記載さ
れているように抗菌活性に関してバイオアッセイに供し
た。活性はｐＨ４，０及びｐＨ１０，０で加熱時に失わ
れたが、しかしながらｐＨ範囲５．０〜９．０では得ら
れた（第４表参照）。

第４表抗生物質の熱安定性に関するｐＨ効果ｐＨ抗菌活性” ４、０　　　　　　　　　　　　０５．０　　　　　　　　　　　　１１．８６、　０　　
　　　　　　　　　　１７．　８７．０　　　　　　　
　　　　　１９、６８、　０　　　　　　　　　　　　
１９．　６９、　０　　　　　　　　　　　　１６．　
０１０．０　　　　　　　　　　　　　０＊Ｂ、シネレ
アの阻害ゾーンの平均径（ｗ＋）例９　抗菌活性に関す
る至適ｐＨＢ、スブチリスＮＣｌ３　１２３７５の培養ブロスを調
製し、例８で記載されているように範囲４．０〜１０．
０のｐＨ値に調整した。サンプルを例３で記載されたバ
イオアッセイの前に０．４５μｍ濾過膜に通した。抗菌
活性に関する至適ｐＨは、ｐＨ６，０〜７．０である（
第５表参照）。ｐＨ値５，０以下の場合には、抗生物質
が溶液から沈降析出した。

第５表抗菌活性に関する至適ｐＨ１旦　　　　　　　　　抗菌活性８４、　３　　　　　　　　　　　８．　０５．０　　　
　　　　　　　１２．０６、Ｑ　　　　　　　　　　　２１．８７．０　　　　
　　　　　　２１．８８．０　　　　　　　　　　１８．８９．０　　　　　　　　　　１８．８１０．０　　　　　　　　　　１７．８＊Ｂ、シネレア
の阻害ゾーンの平均径（＋ａｍ）例１０　抗生物質の溶
解性Ｂ、スブチリスＮＣＩＢ　　１２３７５をＬ−グルタミ
ン酸５ｇ補充の例１の増殖培地１中オービタルシエーカ
ー内で３０℃にて７２時間増殖させた。ブロスを回収し
、抗生物質を例１で記載された酸沈降及びブタノール分
配により抽出した。ブタノール抽出液のアリコート１０
ｍ１を真空下４０℃で蒸発乾固し、残渣を溶媒１０ｍ１
で３回洗浄した（使用された溶媒に関して第６表参照）
。溶媒洗液を真空蒸発前に集めた。この溶媒抽出物をｐ
Ｈ６，０のリン酸カリウム緩衝液１ｍｌに再溶解した。

洗浄された抽出物の残りも緩衝液１ｍｌに再溶解した。

サンプルを例３で記載されているように抗菌活性に関し
てバイオアッセイに供した（第６表参照）。

第６表抗生物質の溶解性溶　媒　　　　　　　　　　抗菌活性１溶媒　　未溶解
残渣無菌蒸溜水　　　　　　１７．３　　　　０メタノール
　　　　　　　１７．８　　　　０エタノール　　　　
　　　１７．０　　　　　０ブタノール　　　　　　　
１４．８　　　　１０．０ジメチルスルホキシド　１５
．５　　　　１１．５アセトン　　　　　　　　０　　
　　　１７．０石油エーテル　　　　　　０　　　　　
１６．３クロロホルム　　　　　　０　　　　　１Ｂ、
５トルエン　　　　　　　　０　　　　　１ＢＪヘキサ
ン　　　　　　　　０　　　　　１４．５＊Ｂ、シネレ
アの阻害ゾーンの平均径（ｕｓ）抗生物質は水、メタノ
ール、エタノール及びブタノールに可溶性で、ジメチル
スルホキシドに一部可溶性で、アセトン、石油エーテル
、クロロホルム、トルエン及びヘキサンに不溶性である
。

例１１　Ｂ、スブチリスＮＣＩＢ　　１２３７５と菌活
性の比較Ｂ、スブチリスＮＣＩＢ　　１２３７５の抗菌活性を、
インビトロ試験においてＢ、スブチリスＮＣＩＢ　　８
８７２（バチロマイシンＬの公知産生株）及びＢ、スブ
チリスＢＤ−１（イツリンＡの公知産生株）の場合と比
較した。

３種すべての株を、オービタルシェーカー内の酵母ペプ
トン−グルコースブロス又は例１で記載されたグルコー
ス最少培地中３０℃で７２時間増殖させた。細菌細胞及
び胞子を１０．０００ｇで２０分間の遠心分離によりブ
ロスから除去した。

無細胞ブロスを例３に記載されたウェル拡散アッセイに
よりペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｃｎｌｃｌｌｌｌ
ｕｉ　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｌｌ）に対するバイオアッ
セイに供した。２種の寒天を用いた：サブローのグルコ
ース寒天及びＶ８ジュース寒天。後者はｖ８ジュース〔
キャンベルズｅスーブ社（Ｃａｉｂｅｌｌ’ｓ　５ｏｕ
ｐ　Ｌ、ｔｄ、）　）　、蒸溜水８００ｍ１及びオキソ
イド（Ｏｘｏｉｄ）　３号寒天からなっていた。

果は第７表で示されている。

結第７表３種のＢ、スブチリス株由来抗生物質のインビトロ活性の比較寒天バイオ　　阻害ゾーンの径（ｃｍ）　″′液体増殖
培地　　アッセイ基質　ＮＣＩＢ　１２３７５　ＮＣＩ
Ｂ　８８７２　　ＢＤ−１酵母ペプトン最少グルコースサブローサブロー ■、９３１．８３２．００２．６０ ■、４０１．２７１．８６２．６０２．４３２．５０２．４６２．８０＊６回の同一拡散ウェルの平均Ｂ、スブチリスＮＣＩＢ　　１２３７５由来抗生物質の
インビトロ活性は、このアッセイにおけるバチロマイシ
ンし及びイツリンＡの場合の中間であった。前播種プレ
ート技術を用いて、ボトリチス・ファバエ（Ｂｏｔｒｙ
ｔｌｓ　ｆ’ａｂａｅ）、ガウエマンノミセスーグラミ
ニス（Ｇａｕｃｍａｎｎｏｗｙｃｅｓ　ｇｒａｍｌｎｉ
ｓ）及びフサリウム・オキシスボルム（Ｆｕｓａｒｌｕ
ｓＯｘｙｓｐｏｒｕｍ）に対する活性を比較する試験を
行った。

すべての抗生物質が３種すべての真菌に対して活性であ
ったが、但し定量は微生物増殖形態の著しい差異が原因
で不可能であった。

活性の比較例１１で記載された抗菌活性のインビトロ評価はやや人
工的である；更に実際的なデータはインビボ試験から得
ることができる。

Ｂ、スブチリス株ＮＣＩＢ　　１２３７６、ＮＣＩＢ　
　８８７２及びＢＤ−１を、オーとタルシェーカー内の
酵母ペプトン−グルコースブロス中３０℃で７２時間増
殖させた。ブロスを下記のようにボトリチス・ファバエ
に対してインビボで試験した。各Ｂ、スブチリス株に関
して、１２の二葉性葉を四葉成長段階でソラマメ（ｆａ
ｂａ　ｂｅａｎ）から分離し、これに表面流出するまで
ブロスとして散布した。コントロールは水で散布した。

葉を室温で風乾させた。各葉に、Ｂ、ノアバエ胞子１０
５／ｍｌ含有水滴１５μｍを２５滴で侵襲させた。葉を
光存在下２０℃でインキコベートし、病変部位数を数え
た（第８表参照）。各抗生物質による同等の病気抑制レ
ベルが播種後４目目に観察されたが、イ旦し５０目まで
にＢ、スブチリス株ＮＣＩＢ　　１２３７６由来抗生物
質は優れた病気抑制活性を有することを証明した。

第８表３種のＢ、スブチリス株由来抗生物質のインビボ活性の比較コントロールＮＣＩＢ　　１２３７６ＮＣＩＢ　　８８７２Ｄ−１使用Ｂ、スブチリス株ＮＣＩＢ　　１２３７６をオービタル
シェーカー内の酵母ペプトン−グルコースブロス中３０
℃で７２時間増殖させた。第９表に掲載された処方剤を
第９表に示された濃度で培養ブロスのサンプルに加え、
分散又は溶解するまで攪拌した。処方されたブロスは、
Ｅ、グラミニス分生子の水性分散液の播種前に二葉段階
〔ザドックス（Ｚａｄｏｃｋｓ）　Ｇ　Ｓ　１２）で小
麦植物Ｃアクィラ（Ａｑｕｉ　Ｉａ）品種〕に表面流出
するまで散布することにより、小麦ウドンコ病〔エリシ
フエ争グラミニス（Ｅｒｙｓｌｐｈｅ　ｇｒａｉｉｎｌ
ｓ））の抑制に関して試験された。各処方剤に関して、
２０の同一植物鉢に散布した。次いで、各処理において
１０鉢を散布１時間後に４分間にわたりミスト（Ｉｌｌ
ｓｔ）ベンチで完全に水浸させた。すべての鉢を病気レ
ベルの評価前に１４０間温室内でインキュベートした（
第９表）。結果は、処方培養ブロスが植物の病気レベル
を減少させ、一部の場合では市販殺菌剤トリアジメホン
の場合と比較して優れた病気抑制力を発揮することを示
している。培養ブロスによる病気抑制は水浸された植物
でも観察されたが、このことは処方剤が抑制剤の流出を
最少に抑制していることを示している。

第９表未処理トリアジメホン（２ｇ／ｌ）処方された培養物：０．０２５％シルウェットＬ７７（０，０２５％５ｉｌｖｃｔｔ　Ｌ７７）２、　０　’
、／６アシユレードアジユバント油（２，０％　＾５ｈ
ｌａｃｆｅ　　ａｄｊｕｖａｎｔ　　ｏｉ　Ｉ）病気レ
ベル２、　００．２０．６０．１つ８！ｂ仁品訳−光イ註１１Ｅ２．０％スプレープローバー（２，０％５ｐｒａｙｐｒｏｖｅｒ）０．１％ボンド（０，１％Ｂａｎｄ）０．１９ｃ；スプレーファースト（０，１％５ｐｒａｙｒａｓｔ）１．０％ウィルトーブルフＳ−６００（１，０％　Ｗｉｌｔ−Ｐｒｕｆ　Ｓ−６００）０．３０．３０．８１．０１．０５．６０．１１゜Ｏ９０゜Ｏｌ１゜１゜参考文献１、　バーデイ−、Ｊ、、１９７４年、アトパンセス・
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ＢｉｏｃｈＣｍｉｓｔｒｙ、１７．３９９２−３９９８
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ｏｇｉｃａｌ　ｃｈｅｍｌｓｔｒｙ。

１９３．２Ｂ５）　　；３０、　　１９４９年、ジャーナル・オフ・バイオロジ
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カル・ケミストリー、第１７６巻、第３６７頁

Claims

【特許請求の範囲】１、下記特徴：（１）グラム陰性菌に対してではなく、真菌及びグラム
陽性菌に対する抗菌活性；（２）球状タンパク質標準に対して較正されるゲル濾過
クロマトグラフィーにより決定された場合に６３５００
±３７００ドルトンの分子量；（３）タンパク質の存在
に関する下記試験に対する陽性反応：ローリー、波長２
８０ｎｍの光吸収度、ビウレット及びニンヒドリン；（４）アミノ酸のアスパラギン酸、トレオニン、セリン
、グルタミン酸、プロリン、アラニン、バリン、イソロ
イシン、ロイシン及びチロシンを含むタンパク質分；（５）プロナーゼＥ酵素による消化に対して耐性である
タンパク質分；（６）炭素原子１４〜１７を含有する脂肪酸を含んだ脂
質分；（７）６．０〜７．０の至適ｐＨ；（８）ｐＨ範囲５．０〜９．０にわたり１１０℃で１０
分間維持された場合おける活性の保持；（９）ｐＨ値５
．０以上の水に可溶性；（１０）メタノール、エタノール及びブタノールに可溶
性、かつジメチルスルホキシドに一部可溶性；及び（１１）アセトン、石油エーテル、クロロホルム、トル
エン及びヘキサンに不溶性；を有する抗生物質又は抗生物質画分。２、バチルス属の微生物から誘導される、請求項１に記
載の抗生物質又は抗生物質画分。３、バチルス・スブチリス株から誘導される、請求項２
に記載の抗生物質又は抗生物質画分。４、バチルス・スブチリス株ＮＣＩＢ１２３７５、１２３７６もしくは１２６１６、又はそれ
らの抗生物質産生誘導株もしくは変異株から誘導される
、請求項３に記載の抗生物質又は抗生物質画分。５、バチルス・スブチリスＮＣＩＢ１２３７６又はその
抗生物質産生関連株から誘導され、かつ下記特徴：（ａ）範囲３５０００±６３０００ドルトンの分子量；（ｂ）タンパク質試験に対する陽性反応：ローリー、２
８０ｎｍの吸光度、ビウレット及びニンヒドリン；（ｃ）プロナーゼＥによる消化に対して耐性であるタン
パク質分；（ｄ）Ｃ＿１＿４−Ｃ＿１＿７脂肪酸を含んだ脂質分；
を有する抗生物質画分。６、タンパク質画分が第２表で示されているアミノ酸組
成を有する、請求項５に記載の抗生物質画分。７、脂質画分が第３表で示されている脂肪酸組成を有す
る、請求項５又は６に記載の抗生物質画分。８、下記特徴：（１）グラム陰性菌に対してではなく、真菌及びグラム
陽性菌に対する抗菌活性；（２）球状タンパク質標準に対して較正されるゲル濾過
クロマトグラフィーにより決定された場合に６３５００
±３７００ドルトンの分子量；（３）タンパク質の存在
に関する下記試験に対する陽性反応：ローリー、波長２
８０ｎｍの光吸収度、ビウレット及びニンヒドリン；（４）アミノ酸のアスパラギン酸、トレオニン、セリン
、グルタミン酸、プロリン、アラニン、バリン、イソロ
イシン、ロイシン及びチロシンを含むタンパク質分；（５）プロナーゼＥ酵素による消化に対して耐性である
タンパク質分；（６）炭素原子１４〜１７を含有する脂肪酸を含んだ脂
質分；（７）６．０〜７．０の至適ｐＨ；（８）ｐＨ範囲５．０〜９．０にわたり１１０℃で１０
分間維持された場合おける活性の保持；（９）ｐＨ値５
．０以上の水に可溶性；（１０）メタノール、エタノール及びブタノールに可溶
性、かつジメチルスルホキシドに一部可溶性；及び（１１）アセトン、石油エーテル、クロロホルム、トル
エン及びヘキサンに不溶性；を有する抗生物質又は抗生物質画分の産生方法であって
、該抗生物質を産生しうる微生物を培養し、かつ培養物か
ら該抗生物質を回収することを特徴とする方法。９、微生物がバチルス属に属する、請求項８に記載の方
法。１０、微生物がバチルス・スブチリス株である、請求項
９に記載の方法。１１、微生物がバチルス・スブチリス株ＮＣＩＢ１２３
７５、１２３７６もしくは１２６１６、又はそれらの抗
生物質産生誘導株もしくは変異株である、請求項１０に
記載の方法。１２、微生物細胞が培養物から除去され、得られた無細
胞培地が抗生物質を沈降させるために酸性化される、請
求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。１３、胞子形成細胞が増殖細胞よりも優勢であってかつ
胞子及び抗生物質が培養物中で蓄積されるまで微生物が
培養され、ｐＨが抗生物質を沈降させるために減少され
、固体相が液体相から分離され、それによって胞子及び
抗生物質の混合物が回収される、請求項８〜１２のいず
れか一項に記載の方法。１４、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗生物質又
は抗生物質画分及びそのための担体又は希釈剤を含んだ
植物保護組成物。