CZ20013239A3 - Biologicky čistá kultura, prostředek, izolovaný metabolit, supernatant, částečně přečiątěná frakce, ve vodě rozpustná látka, způsob produkce fungicidního supernatantu, způsob částečného přečiątění supernatantu, způsob zvýąení insekticidní aktivity - Google Patents
Biologicky čistá kultura, prostředek, izolovaný metabolit, supernatant, částečně přečiątěná frakce, ve vodě rozpustná látka, způsob produkce fungicidního supernatantu, způsob částečného přečiątění supernatantu, způsob zvýąení insekticidní aktivity Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20013239A3 CZ20013239A3 CZ20013239A CZ20013239A CZ20013239A3 CZ 20013239 A3 CZ20013239 A3 CZ 20013239A3 CZ 20013239 A CZ20013239 A CZ 20013239A CZ 20013239 A CZ20013239 A CZ 20013239A CZ 20013239 A3 CZ20013239 A3 CZ 20013239A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- composition
- effective amount
- plant
- roots
- supernatant
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 71
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 title claims abstract description 40
- 230000000855 fungicidal effect Effects 0.000 title claims abstract description 38
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 title claims abstract description 37
- 239000000126 substance Substances 0.000 title claims description 68
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 title claims description 23
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 title claims description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims description 6
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 title claims description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 title description 40
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 title description 34
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 5
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 claims abstract description 26
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 claims abstract description 24
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 claims abstract description 24
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 88
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 claims description 62
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 claims description 41
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 37
- 241000194103 Bacillus pumilus Species 0.000 claims description 36
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 36
- FYIPKJHNWFVEIR-UHFFFAOYSA-N Zwittermicin A Natural products OCC(N)C(O)CC(O)C(N)C(O)C(O)C(=O)NC(C(N)=O)CNC(N)=O FYIPKJHNWFVEIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 108010061078 zwittermicin A Proteins 0.000 claims description 30
- FYIPKJHNWFVEIR-VTAUKWRXSA-N zwittermicin a Chemical compound OC[C@H](N)[C@H](O)C[C@@H](O)[C@@H](N)[C@@H](O)[C@H](O)C(=O)N[C@H](C(N)=O)CNC(N)=O FYIPKJHNWFVEIR-VTAUKWRXSA-N 0.000 claims description 30
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 claims description 23
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 21
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 17
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 17
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 17
- 241000123650 Botrytis cinerea Species 0.000 claims description 15
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 claims description 15
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims description 14
- 241000549404 Hyaloperonospora parasitica Species 0.000 claims description 14
- 239000008187 granular material Substances 0.000 claims description 13
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims description 12
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 claims description 12
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 11
- 241000233622 Phytophthora infestans Species 0.000 claims description 10
- 241000233685 Bremia lactucae Species 0.000 claims description 9
- 241000221577 Uromyces appendiculatus Species 0.000 claims description 9
- OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 2-[5-[[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-4-phosphonooxyhexanedioic acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C(C(C1O)O)OC1COC1C(CO)OC(OC(C(O)C(OP(O)(O)=O)C(O)C(O)=O)C(O)=O)C(O)C1O OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 8
- 244000000004 fungal plant pathogen Species 0.000 claims description 8
- 241000510928 Erysiphe necator Species 0.000 claims description 7
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 6
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 5
- 239000012223 aqueous fraction Substances 0.000 claims description 5
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 claims description 3
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- LWTDZKXXJRRKDG-KXBFYZLASA-N (-)-phaseollin Chemical compound C1OC2=CC(O)=CC=C2[C@H]2[C@@H]1C1=CC=C3OC(C)(C)C=CC3=C1O2 LWTDZKXXJRRKDG-KXBFYZLASA-N 0.000 claims 2
- 101710163504 Phaseolin Proteins 0.000 claims 1
- 241000221576 Uromyces Species 0.000 claims 1
- LWTDZKXXJRRKDG-UHFFFAOYSA-N phaseollin Natural products C1OC2=CC(O)=CC=C2C2C1C1=CC=C3OC(C)(C)C=CC3=C1O2 LWTDZKXXJRRKDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 abstract description 18
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 abstract description 17
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 abstract description 12
- 244000000003 plant pathogen Species 0.000 abstract description 9
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 abstract description 6
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 57
- RZSCFTDHFNHMOR-UHFFFAOYSA-N n-(2,4-difluorophenyl)-2-[3-(trifluoromethyl)phenoxy]pyridine-3-carboxamide;1,1-dimethyl-3-(4-propan-2-ylphenyl)urea Chemical compound CC(C)C1=CC=C(NC(=O)N(C)C)C=C1.FC1=CC(F)=CC=C1NC(=O)C1=CC=CN=C1OC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 RZSCFTDHFNHMOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 21
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 20
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 17
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 16
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 15
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 15
- 239000000417 fungicide Substances 0.000 description 15
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 15
- 208000003251 Pruritus Diseases 0.000 description 13
- JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N iron(III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]=O JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 12
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 12
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 12
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 description 10
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 10
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 8
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 8
- 229930183914 Zwittermicin Natural products 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 8
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 8
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 8
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 7
- 230000000361 pesticidal effect Effects 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 6
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 6
- 235000003228 Lactuca sativa Nutrition 0.000 description 6
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000233679 Peronosporaceae Species 0.000 description 6
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 6
- WFDXOXNFNRHQEC-GHRIWEEISA-N azoxystrobin Chemical compound CO\C=C(\C(=O)OC)C1=CC=CC=C1OC1=CC(OC=2C(=CC=CC=2)C#N)=NC=N1 WFDXOXNFNRHQEC-GHRIWEEISA-N 0.000 description 6
- OIPMQULDKWSNGX-UHFFFAOYSA-N bis[[ethoxy(oxo)phosphaniumyl]oxy]alumanyloxy-ethoxy-oxophosphanium Chemical compound [Al+3].CCO[P+]([O-])=O.CCO[P+]([O-])=O.CCO[P+]([O-])=O OIPMQULDKWSNGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 6
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 6
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 6
- 241000213004 Alternaria solani Species 0.000 description 5
- 241000489975 Diabrotica Species 0.000 description 5
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 5
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 5
- 230000000853 biopesticidal effect Effects 0.000 description 5
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 5
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 5
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 5
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 5
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 5
- 208000016444 Benign adult familial myoclonic epilepsy Diseases 0.000 description 4
- 241001465180 Botrytis Species 0.000 description 4
- 240000001817 Cereus hexagonus Species 0.000 description 4
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 4
- 244000299507 Gossypium hirsutum Species 0.000 description 4
- 241000258916 Leptinotarsa decemlineata Species 0.000 description 4
- 241000813090 Rhizoctonia solani Species 0.000 description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 4
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 4
- 244000000005 bacterial plant pathogen Species 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 description 4
- 208000016427 familial adult myoclonic epilepsy Diseases 0.000 description 4
- 235000019387 fatty acid methyl ester Nutrition 0.000 description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 4
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 4
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- ZQEIXNIJLIKNTD-UHFFFAOYSA-N methyl N-(2,6-dimethylphenyl)-N-(methoxyacetyl)alaninate Chemical compound COCC(=O)N(C(C)C(=O)OC)C1=C(C)C=CC=C1C ZQEIXNIJLIKNTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 4
- 239000001965 potato dextrose agar Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 4
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 3
- 241000219198 Brassica Species 0.000 description 3
- 102000012286 Chitinases Human genes 0.000 description 3
- 108010022172 Chitinases Proteins 0.000 description 3
- 241000254173 Coleoptera Species 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- FOEXHEVNPRRHDY-SLPGGIOYSA-N aldehydo-D-kanosamine Chemical compound O=C[C@H](O)[C@@H](N)[C@H](O)[C@H](O)CO FOEXHEVNPRRHDY-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 3
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 3
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 3
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 3
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 3
- ZGNITFSDLCMLGI-UHFFFAOYSA-N flubendiamide Chemical compound CC1=CC(C(F)(C(F)(F)F)C(F)(F)F)=CC=C1NC(=O)C1=CC=CC(I)=C1C(=O)NC(C)(C)CS(C)(=O)=O ZGNITFSDLCMLGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- -1 fractions Substances 0.000 description 3
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 3
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 3
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000003359 percent control normalization Methods 0.000 description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 3
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 3
- 241000243818 Annelida Species 0.000 description 2
- 239000005730 Azoxystrobin Substances 0.000 description 2
- 241000194106 Bacillus mycoides Species 0.000 description 2
- 241001147758 Bacillus thuringiensis serovar kurstaki Species 0.000 description 2
- XFOUAXMJRHNTOP-UHFFFAOYSA-N Bacilysin Natural products CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1CCC(=O)C2OC12 XFOUAXMJRHNTOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001450781 Bipolaris oryzae Species 0.000 description 2
- 235000011331 Brassica Nutrition 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000222290 Cladosporium Species 0.000 description 2
- 241001123536 Colletotrichum acutatum Species 0.000 description 2
- 241000766026 Coregonus nasus Species 0.000 description 2
- ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N D-alpha-tocopherylacetate Chemical compound CC(=O)OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N 0.000 description 2
- 235000008496 Drimys aromatica Nutrition 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241000223221 Fusarium oxysporum Species 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 2
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 description 2
- 239000005807 Metalaxyl Substances 0.000 description 2
- 241000194105 Paenibacillus polymyxa Species 0.000 description 2
- 241000364057 Peoria Species 0.000 description 2
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 2
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 240000008202 Schinus molle Species 0.000 description 2
- 235000005151 Schinus molle Nutrition 0.000 description 2
- 235000013880 Schinus terebinthifolius var. raddianus Nutrition 0.000 description 2
- 241000221696 Sclerotinia sclerotiorum Species 0.000 description 2
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 2
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 2
- 241000256247 Spodoptera exigua Species 0.000 description 2
- 241000228448 Taphrina deformans Species 0.000 description 2
- 241000228452 Venturia inaequalis Species 0.000 description 2
- 241001123668 Verticillium dahliae Species 0.000 description 2
- 241000589634 Xanthomonas Species 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 230000001069 nematicidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000013595 supernatant sample Substances 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- XFOUAXMJRHNTOP-ZABDLSDTSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-aminopropanoyl]amino]-3-[(1r,2r,6r)-5-oxo-7-oxabicyclo[4.1.0]heptan-2-yl]propanoic acid Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)C[C@H]1CCC(=O)[C@@H]2O[C@H]12 XFOUAXMJRHNTOP-ZABDLSDTSA-N 0.000 description 1
- HZJKXKUJVSEEFU-UHFFFAOYSA-N 2-(4-chlorophenyl)-2-(1H-1,2,4-triazol-1-ylmethyl)hexanenitrile Chemical compound C=1C=C(Cl)C=CC=1C(CCCC)(C#N)CN1C=NC=N1 HZJKXKUJVSEEFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710139119 50S ribosomal protein L27, chloroplastic Proteins 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 1
- 240000001436 Antirrhinum majus Species 0.000 description 1
- 241000239290 Araneae Species 0.000 description 1
- 241001092376 Astilbe Species 0.000 description 1
- 241001112741 Bacillaceae Species 0.000 description 1
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 description 1
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 1
- 229920002799 BoPET Polymers 0.000 description 1
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 1
- 235000011299 Brassica oleracea var botrytis Nutrition 0.000 description 1
- 235000004221 Brassica oleracea var gemmifera Nutrition 0.000 description 1
- 240000003259 Brassica oleracea var. botrytis Species 0.000 description 1
- 244000308368 Brassica oleracea var. gemmifera Species 0.000 description 1
- 241000219106 Bryonia Species 0.000 description 1
- 241001451061 Choanephora cucurbitarum Species 0.000 description 1
- 241000207199 Citrus Species 0.000 description 1
- 241000254171 Curculionidae Species 0.000 description 1
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 1
- 241001529716 Entomophaga Species 0.000 description 1
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 1
- 241000221787 Erysiphe Species 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 description 1
- 241000221779 Fusarium sambucinum Species 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000500891 Insecta Species 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 description 1
- 108010028921 Lipopeptides Proteins 0.000 description 1
- 241001518729 Monilinia Species 0.000 description 1
- 241001518731 Monilinia fructicola Species 0.000 description 1
- 239000005811 Myclobutanil Substances 0.000 description 1
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 101150014068 PPIP5K1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000588702 Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum Species 0.000 description 1
- 241000598838 Phymatotrichopsis omnivora Species 0.000 description 1
- 241000233616 Phytophthora capsici Species 0.000 description 1
- 241000233647 Phytophthora nicotianae var. parasitica Species 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000005822 Propiconazole Substances 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000589626 Pseudomonas syringae pv. tomato Species 0.000 description 1
- SLZLXIXUYNEOBA-UHFFFAOYSA-N Pumilin Natural products CC=C(C)C(=O)OC1C(O)C2C(=C)C(=O)OC2C2(O)C(C)=CC(=O)C2=C1C SLZLXIXUYNEOBA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000635201 Pumilus Species 0.000 description 1
- 241000918585 Pythium aphanidermatum Species 0.000 description 1
- 241001385948 Pythium sp. Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241001518705 Sclerotinia minor Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 101710110937 Vegetative protein Proteins 0.000 description 1
- 241000219094 Vitaceae Species 0.000 description 1
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 description 1
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000011149 active material Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000012459 agar diffusion assay Methods 0.000 description 1
- 238000012271 agricultural production Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 108700023668 bacilysin Proteins 0.000 description 1
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 1
- CCDWGDHTPAJHOA-UHFFFAOYSA-N benzylsilicon Chemical compound [Si]CC1=CC=CC=C1 CCDWGDHTPAJHOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000443 biocontrol Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000357 carcinogen Toxicity 0.000 description 1
- 239000003183 carcinogenic agent Substances 0.000 description 1
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000008614 cellular interaction Effects 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 229930002875 chlorophyll Natural products 0.000 description 1
- 235000019804 chlorophyll Nutrition 0.000 description 1
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 description 1
- 235000020971 citrus fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000009194 climbing Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000002592 echocardiography Methods 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 1
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003631 expected effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 235000021021 grapes Nutrition 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- IZZWJPQHPPRVLP-UHFFFAOYSA-N hexane;2-methoxy-2-methylpropane Chemical compound CCCCCC.COC(C)(C)C IZZWJPQHPPRVLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000171 higher toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 150000001261 hydroxy acids Chemical class 0.000 description 1
- UOHLKBVACLXSRE-GXSYYHJRSA-N imk0l48req Chemical compound N([C@H](C(=O)N\C(C=1SC=C(N=1)C(=O)N[C@@H](C=1SC=C(N=1)C(=O)NC(/C=1SC=C(N=1)C1=N2)=C\C)C(C)C)=C/C)[C@@H](C)O)C(=O)C(N=3)=CSC=3C1=CC=C2C(SC=1)=NC=1C1=NC(C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NC[C@H](C)O)=CS1 UOHLKBVACLXSRE-GXSYYHJRSA-N 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- ONUFESLQCSAYKA-UHFFFAOYSA-N iprodione Chemical compound O=C1N(C(=O)NC(C)C)CC(=O)N1C1=CC(Cl)=CC(Cl)=C1 ONUFESLQCSAYKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 108010082754 iturin A Proteins 0.000 description 1
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007653 larval development Effects 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 125000000325 methylidene group Chemical group [H]C([H])=* 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000003415 peat Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000010451 perlite Substances 0.000 description 1
- 235000019362 perlite Nutrition 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 230000007096 poisonous effect Effects 0.000 description 1
- 239000002798 polar solvent Substances 0.000 description 1
- 229920001921 poly-methyl-phenyl-siloxane Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- STJLVHWMYQXCPB-UHFFFAOYSA-N propiconazole Chemical compound O1C(CCC)COC1(C=1C(=CC(Cl)=CC=1)Cl)CN1N=CN=C1 STJLVHWMYQXCPB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- SLZLXIXUYNEOBA-MELKTAGESA-N pumilin Chemical compound C\C=C(\C)C(=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H]2C(=C)C(=O)O[C@@H]2[C@@]2(O)C(C)=CC(=O)C2=C1C SLZLXIXUYNEOBA-MELKTAGESA-N 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 239000007362 sporulation medium Substances 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 239000010455 vermiculite Substances 0.000 description 1
- 235000019354 vermiculite Nutrition 0.000 description 1
- 229910052902 vermiculite Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
- C12P1/04—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Catching Or Destruction (AREA)
Description
BIOLOGICKY ČISTÁ KULTURA, PROSTŘEDEK, IZOLOVANÝ METABOLIT,
SUPERNATANT, ČÁSTEČNĚ PŘEČIŠTĚNÁ FRAKCE, VE VODĚ ROZPUSTNÁ
LÁTKA, ZPŮSOB PRODUKCE FUNGICIDNÍHO SUPERNATANTU, ZPŮSOB ČÁSTEČNÉHO PŘEČIŠTĚNÍ SUPERNATANTU, ZPŮSOB ZVÝŠENÍ INSEKTICIDNÍ
AKTIVITY
OBLAST TECHNIKY
Navrhovaný vynález se zabývá biopesticidy. Konkrétně navrhovaný vynález popisuje zjištění, že nový kmen Bacillus pumilus, NRRL číslo B-30087 může inhibovat celé spektrum rostlinných chorob in vivo. Navrhovaný vynález dále popisuje fungicidní prostředek zahrnující tento nový kmen Bacillus, antibiotika a přečištěnou nebo nepřečištěnou frakci tohoto kmene buď samu o sobě, nebo v kombinaci s jinými chemickými a biologickými pesticidy. Navrhovaný vynález dále popisuje synergistický fungicidní efekt při použití kmenů NRRL číslo B-30087 zároveň s NRRL číslo B-21661, (CCRC 901106).
DOSAVADNÍ STAV TECHNIKY
Je obecně známo, že řada různých mikroorganizmů vykazuje biologickou aktivitu, která je využitelná pro potlačení rostlinných chorob. Ačkoliv na poli identifikace a vývoje biologických pesticidů pro kontrolu různých rostlinných chorob byl učiněn značný pokrok, většina běžně používaných pesticidů obsahuje stále syntetické složky. Rada z těchto chemických fungicidů je označována úřadem pro ochranu prostředí („Environmental Protection Agency“, EPA) jako karcinogeny, jsou toxické pro životní prostředí a další druhy, které nejsou zamýšleným cílem. Navíc, řada patogenů si je schopná vyvinout odolnost k chemickým pesticidům. Viz. např. Schwinn et al., Advances In Plant Pathology: Phytopathora Infestans, The Cause of Latě Blight of Potato, p. 244, Academie Press, San Diego, CA (1991).
Biologická kontrola nabízí atraktivní alternativu syntetických chemických fungicidů. Biopesticidy (živé organizmy a látky, které jsou těmito organizmy přirozeně produkovány) jsou bezpečnější, lépe biodegradovatelné a co se vývoje týče levnější.
Jedním zběžně používaných biopesticidů je gram-pozitivní bakterie Bacillus thuringiensis. Pesticidní kmeny B.thuringiensis produkují krystalické proteiny během sporulace, které jsou specificky toxické pro některé kmeny a druhy hmyzu a kroužkovců (viz. např. patent US 4 999 192 a patent US 5 208 017). Proteinové endotoxiny produkované B.thuringiensis také slouží jako ···· · ·· ·· • · · · · ··· • · · · · · • · · · ··· · • · ♦ · · · • ····· ·· · insektícidní agens proti larvám brouka Diabrotica a jiným broukům (např. patent US 5 187 09 a Johnson et al. (1993), J. Econ. Entomol., 86: 330-333). Endotoxiny B.thuringiensis se ukázaly účinné jako přečištěné krystaly, promyté buněčné pelety a exprimované proteiny. Varren et al. ve WO96/10 083 popisuje proteiny neendotoxinového původu produkované během vegetativních stádií B.cereus a B.thuringiensis. Tyto vegetativní proteiny, označované jako Vipl aVip2, jsou velmi účinné proti larvám brouka Diabrotica (severnímu a západnímu). Viz. Estruch et al. (1997), Nátuře - Biotechnology, 15:137-141.
Jeden z termostabilních metabolitů B.thuringiensis, označovaný jako beta-exotoxin, se také ukázal být účinným pesticidem. Burgieron and Biache (1979), Entomophaga, 11:279-284 uvádějí, že beta-exotoxin je účinný proti mandelince bramborové (Leptinotarsa decemlineata). Dále bylo prokázáno, že beta-exotoxiny z B.thuringiensis vykazují nespecifickou pesticidní aktivitu nejen proti kroužkovcům, ale také proti mouchám, larvám Psaudaletia unipuncta, roztočům a larvám brouka Diabrotica. Sigma-exotoxin má podobnou strukturu jako betaexotoxin a je aktivní proti mandelince bramborové. Viz. Argauer et al. (1991), J. Entomol. Sci., 26:206-213. Alfa-exotoxin je toxický pro larvy Musea domestica (Cluthy (1980), FEMS Microbiol. Lett., 8:1-7). Gama exotoxiny tvoří řada proteolytických enzymů, chitinázy a proteázy. Toxický efekt gama-exotoxinů je patrný pouze v kombinaci s beta-exotoxiny nebo delta-exotoxiny.Viz. Forsberg, „Bacillus thuringiensis: Its Effects on Environmental Quality, National Research Council of Canada, NRCC 15 385, 91-109 (1976). Stonard et al. (1994), ACS Symposium Series, 551:25, popisuje ve vodě rozpustné sekundární metabolity aktivní proti larvám brouka Diabrotica, které se nacházejí v supematantu kmene B.cereus.
Zwittermicin A je ve vodě rozpustný, v kyselině stabilní lineární molekula aminopolyolu (viz. He et al. (1994), Tetrahedron Lett., 35 (16:2499-2502) se širokým spektrem aktivity proti celé řadě houbových a bakteriálních patogenů rostlin. Zwittermicin A také zvyšuje aktivitu B.thuringiensis. Manker et al. (WO96/39 037) byl první, kdo popsal posilující schopnosti zwittermicinu A na B.thuringiensis. Následně, Schnepf et al. rovněž popisuje posílení aktivity B.thuringiensis pomocí zwittermicinu A (patent US 5 702 703).
O bacilech je známé, že produkují sekundární metabolity s antifungální a antibakteriální aktivitou. Viz. Korzybski et al., „Antibiotics Izolated from the Genus Bacillus (Bacillaceae)“ v Antibiotics - Origin, Nátuře end Properties, Američan Society for Microbiology, Washington D.C., 3. vydání (1978), a Berdy, CRC Handbook of Antibiotics Compounds, díly I-XIV, CRC Press, lne., Boča Ranton, FL (1980-87).Látky produkované B.pumilus zahrnují micrococcin P, pumilin a tetain.
···· · ·· ·· • ···· · · · • · · · · · • · ······ • · · · · · • ·· · ·· ·· ·
Kawaguchi et al. v patentu US 4 250 170 izoloval nová ve vodě rozpustná antibiotika z kmene Bacillus, která jsou aktivní proti širokému spektru gram-pozitivních a gram-negativních baktérií. Stabb et al. (1990), Appl. Environ. Microbiol., 60:4404-4412, identifikoval některé konkrétní kmeny rodu Bacillus (rod Bacillus zahrnuje B.subtilis, B.cereus, B.mycoides, B.thuringiensis), které vykazují antifungální aktivitu. U těchto kmenů byla prokázána produkce zwittermicinu A a/nebo kanosaminu. Viz. Milner et al. Appl. Environ. Microbiol., 62:3061-3066 (1996). Toto jsou antibiotika, která jsou účinná proti chorobě způsobné Phytopathora medicagnis, P.nicotianae, P.aphanidermatum nebo Sclerotinia minor (viz. Stabb et al., viz. výše). Zwittermicin A je ve vodě stabilní kyselinám odolný lineární aminopolyol, viz. He et al. (1994), Tetrahedron Lett., 35 (16:2499-2502), má široké spektrum aktivity proti celé řadě houbových a bakteriálních patogenů rostlin. Kanosamin (Milner et al., 1996) také inhibuje široké spektrum houbových rostlinných patogenů a několik bakteriálních druhů. Handelsman et al. v patentu US 5 049 379 popisuje potlačení vadnutí vojtěšky a sóji pomocí B.cereus produkujícího zwittermicin A. Pokud byla zrna pokryta B.cereus ATCC 53 522, patogenní aktivita kořenových vláken houby byla značně potlačena. Podobně přidání některých kmenů B.cereus ve formě spor k sojovým semenům, nebo do půdy obklopující semena zvýšilo výnosnost sóji na příslušném poli, viz. Osbume et al. (1995) Am. Phytopathol. Soc., 79 (6):551-556. Techniky aplikace biopesticidů jsou dobře známé v současném stavu techniky a zahrnují např. rozpustné prášky, prostředky pro suché práškování, mikroenkapsulace a kapalné formy mikrobů, kompletní směsi nebo frakce antibiotik z příslušných kultur, viz. patent US 5 061 495, Rosall et al. a patent US 5 049 379, Handelsman et al.
Tsuno et al., (1986), J. Antibiotics, XXXIX (7): 1001-1003, popisuje nová antibiotika na bázi aminovaných cukrů z B.pumilus, která jsou účinná proti širokému spektru baktérií in vitro. Khmel et al., (1995), v SU 1 817 875 popisuje nový kmen B.pumilus VKM CR-333D, který je možno použít pro potlačení houbových fytopatogenů a bakterií.
Leifert et al., J. Appl. Bacteriol., 78:97-108, (1995), popisuje produkci antibiotik účinných proti rodům Botrytis a Altemaria z dvou kmenů Bacillus B.subtilis CL27 a B.pumilus CL45. Kompletní kultury i bezbuněčné filtráty jsou účinné proti rodům Botrytis a Altemaria v in vitro testech a byly aktivní proti rodu Botrytis v malém in vivo rostlinném testu na rostlinách Astilbe. Leifert et al. (1997), patent US 5 597 565 popisuje B.subtilis, B.pumilus, B.polymyxa, které jsou účinné při inhibici posklizňové choroby způsobné houbami Altemaria brassicicola a Botrytis cinerea. Dále popisují přítomnost antibiotik přítomných vbezbuněčném filtrátu a jejich aktivitu při různých hodnotách pH, nicméně neidentifikují tyto složky. Aktivní složky z B.subtilis ztrácí ····· · ·· ·· · ·· · ·· · · ···· • · ······ • · · ······ · • · ······ • ·· · ····· · · ··· aktivitu při nízkém pH, zatímco aktivita látek z pumilus je prokazatelná pouze při pH nižším než 5,6. Leifert et al., (1998), v patentu US 5 780 080 popisuje druhy hlávkového zelí které mohou být léčeny pomocí B.subtilis, B.pumilus a B.polymyxa, které inhibují Altemaria brassicicola a Botrytis cinerea.
Bacilysin je velmi malá látka s molekulovou hmotností 270, která inhibuje pouze kvasnice. Iturin A, je rozpustný v polárních rozpouštědlech s širokou antifungální a antibakteriální aktivitou.
V patentu US 5 344 647, Rossall popisuje kmeny Bacilla subtila s širokou antifungální aktivitou. Dále, v patentu US 5 061 495 Rossall popisuje nové antibiotikum z Bacilla subtila který má 63,500 daltonů, sráží se při pH pod 5 a je aktivní proti gram-pozitivním bakteriím a houbám (Botrytis a Erysiphe). Sholberg et al., (1995) Can. J. Microbiol. 41:247-252, Swinbume et al., (1975) Trans. Brit. Mycol. Soc. 65:211-217, Singh a Deverall, (1984) Trans. Br. Mycol. Soc. 83:487-490, Ferreira et al., (1991) Phytopatology 81:283-287 a Baker et al., (1983) Phytopatology 73:1148-1152. Všichni popisují použití kmenů Bacillus spp, a Bacillus subtilis jak agens s biocontrolní aktivitou proti houbovím patogenům rostlin. Pusey et al., (1988) Plant. Dis. 72:622-626, Pusey et al., patent US 5 047 239; a McKeen et al., (1986) Phytopatology 76:136139 popisují kontrolu požňové ovocné hniloby za použití B. subtilis. McKeen et al., viz.výše, ukazuje že antibiotika podobná nízkomolekulámímu cyklickému polypeptidu iturinu přispívá k fungicidní aktivitě Bacillus subtilis.
Liu et al., v patentu US 5 403 583 popisuje kmen Bacillus sp., (ATCC 55 000) a způsoby kontroly houbového rostlinného patogenu Rhizoctonia solani. Islám a Nandi (1985) J. Plant. Dis. Protéct. 92(3):241-246, popisuje Bacillus sp. s účinkem proti houbě Drechslera oryzae, původce hnědé skvrnitosti rýže. Stejní autoři, Islám a Nandi (1985) J. Plant. Dis. Protéct. 92(3):233-240, také popisují in vitro účinek kmene Bacillus sp. proti Drechslera oryzae, Altemaria altemata a Fusarium roseum. Uvažují o třech složkách v kultivačního filtrátu. Nejaktivnější antibiotika byla vysoce rozpustná ve vodě a methanolu s maximem UV absorpce v 255 nm a v rozsahu do 260 nm což naznačuje strukturní podobnost s Iipopeptidem podobným polyoxinu. Cook et al., (1987) Beltwide Cotton Production Research Conferences, Dallas, TX, str. 43-45, popisuje použití suspenze Bacillus sp. pro snížení počtu bavlníků zabitých houbou Phymatotrichum omnivorum, která je příčinou kořenové hniloby bavlny.
B'Chir a Namouchi (1988) Revue Nematologique 11(2):263-266, popisuje Bacillus pumilus, který napomáhá hlístům požírajícím houby zvýšit jejich aktivitu. B'Chir a Belkadhi (1986) Med. Fac. Landbouww. Rijksuniv. Gent 5 l/3b: 1295-1310; popisuje buněčné interakce houby (Fusarium) a hlístice, která je příčinou infekce u citrusů. Houba je vázána na B. pumilus
(vyskytují se společně) a když je tam také hlíst, houba je tvrdší. B. pumilus pravděpodobně poskytuje potravu pro hlístice. Gokte a Swarup (1988) Indián J. Nematol. 18(2):313-318, popisuje B. pumilus který je nematocidní, ale nepopisuje jeho antifungální aktivity. Slabospitskaya et al., (1992) Mikrobiol Zh (Kyjev) 54(6):16-22, srovná mnoho různý Bacillus sp., včetně B. pumilus pro jejich schopnost produkovat chitinázu, ale nepopisuje žádnou aktivitu proti rostlinným patogenům. B. pumilus produkuje nejnižší hladiny chitinázy. Mclnroy et al., (1995) Plant and Soil 173(2):337-342, předkládá přehled mnoha typů bakterií, včetně mnoha Bacillus sp. a B. pumilus které jsou endofytické s kořeny a kmeny rostlin. Ani oni nepředkládá žádný důkaz že tyto endofytické kmeny mají antifungální účinky. Chemin et al., (1995) Molecular Genetics, popisuje Bacillus pumilus, který má široké spektrum aktivity proti bakteriím (e.g., Xanthomonas, Pseudomonas, Erwinia) a houbám, které jsou příčinou chorob rostlin. Fey et al., (1991) Akad Landwirts Kart, popisuje kmeny B. pumilus, které poskytují semenu brambor jistou ochranu před Rhizoctonia solani.
PODSTATA VYNÁLEZU
Navrhovaný vynález popisuje nové kmeny Bacillus sp. produkující antibiotikum, s antifungální aktivitou na konkrétní rostlinný patogen a žádnou antibakteriální aktivitou. Také popisuje způsob léčby nebo ochrany rostlin, ovoce a kořenů před houbovou infekcí zahrnující krok aplikace efektivního množství Bacillus sp. produkujícího antibiotikum. Bacillus sp. produkující antibiotikum může být podáván jako suspenze v kompletním kultivačním médiu nebo jako částečně čištěný roztok obsahující antibiotikum získaný z kompletního kultivačního média Bacillus sp. produkujícího antibiotikum. Také je popisováno nové ve vodě rozpustné antibiotikum, který vykazuje antifungální aktivitou ale žádnou antibakteriální aktivitu.
Navrhovaný vynález také popisuje novou látku zvyšující insekticidní aktivitu B. thuringiensis. Látka je izolována z celé kultura nebo média B. pumilus, a po přidání k B. thuringiensis zvyšuje jeho insekticidní aktivitu. Vynález také popisuje techniky ochrany rostlin, při zamoření hmyzem pomocí aplikace na rostliny nebo do rostlin, bakteriální suspenze Bacillus, média z kultury Bacillus obsahující metabolity nebo čištěné metabolity.
Navrhovaný vynález dále popisuje kombinaci kmene B-30 087 s kmenem B21 661 (AQ 713) pro použití jako fungicidy, kde současné použití kmenů je účinnější než použití jednotlivých kmenů samostatně.
Navrhovaný vynález poskytuje biologickou čistou kulturu kmene, který má všechny znaky nového kmene Bacillus sp. a jeho mutanty nebo varianty, s antifungální aktivitou jen proti konkrétnímu rostlinnému patogenu jako jsou rzi, prachová plíseň a ochmýřená plíseň. Tento nový kmen B. pumilus byl uznán 14 ledna, 1999, Agricultural Research Culture Collection (NRRL), 1815 North Universiya Street, Peoria, Illinois 61 604, USA; a přístupovým číslem NRRL B30 087, pod záštitou Budapest Treaty on the Intemational Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Proceduře. Kmen označený NRRL B-21 661 byl uznán stejnou institucí 7. březnu, 1997. Poté byl institucí Američan Type Culture Collection (ATCC) identifikován jako Bacillus subtilis.
Vynález také popisuje způsoby prevence a léčby houbových chorob rostlin, včetně kořenů rostlin, použitím těchto bakteriálních kmenů, antibiotika obsahujících supematantů nebo čistých antibiotik získaných z těchto bakteriálních kmenů. Vynález také popisuje vodorozpustné antifungální antibiotikum s molekulovou hmotností nižší než 10 000 daltonů, mírně teplotně nestálý, s kladným nábojem, a HPLC detekčním maximem při UV absorbance v maximu 280 nm a na krajích v 230 nm. Antibiotikum není zwittermicin A.
Další aspekty navrhovaného vynálezu popisují kompletní kultivační médium nebo supernatanty B. pumilus, které při smíchání s B. thuringiensis zvyšují insekticidní aktivitu B. thuringiensis. Vynález také popisuje způsob léčby rostlin pro zamezení zamoření hmyzem aplikací bakteriální suspenze Bacillus, média obsahujícího metabolity z kultury Bacillus nebo přečištěný čištěný metabolit na povrch nebo do rostlin.
Další aspekt vynálezu je neočekávaný synergický vliv použití kombinace kmene B. pumilus (TVRRL B-30 087) s B. subtilis (NRRL B-21 661) jako fungicidu. Vynález popisuje prostředky a způsoby jeho použití jako fungicidu..
Definice
Jak jsou používána v popisu a nárocích, jednotlivé výrazy pro číslo jednotné, zahrnují i množné číslo, pokud není jasně uvedeno jinak. Například, termín buňka zahrnuje množství buněk, včetně jejich směsi.
Jak je zde používán, termín zahrnující je znamená že prostředky a způsoby zahrnují uvedené složky, ale ne vyřazující jiné. Skládající se v podstatě z“ je použito když je třeba definovat prostředky a způsoby, by mělo znamenat vyřazení dalších prvků jakéhokoliv významu ze směsi. Prostředek se skládá z jednotlivých složek jak jsou definovány výše, ale nemůže být vyloučena stopová kontaminace během izolace a přečišťování a po přidání farmaceuticky přijatelných nosičů, jako jsou fosfátový fyziologický roztok, ochranné prostředky, a podobně. Skládat se z“ • · • · · ·· • · · · «· • · · ·· • · · · ♦ · · · znamená vyloučení všech dalších přísad, kromě stopových prvků. Konkrétní varianty definované těmito výrazy rovněž spadají do rámce navrhovaného vynálezu.
Termín izolovaný je zaměnitelný s termínem biologicky čisté a znamená že požadované složky jsou oddělitelné od doplňků, buněčných i jiných, kdy kmen nebo metabolit spolu v přírodě přirozeně souvisejí.
Jak jsou používán, biologická kontrola je definována jako kontrolu nad šířením patogenů nebo hmyzu pomocí jiného organismu. Známé mechanismy biologického boje zahrnují střevní bakterie, které kontrolují kořenovou hnilobu díky soupeření o prostor na povrchu kořenu s houbami. Bakteriální toxiny, jako antibiotika, byla užíván pro potlačení patogenů. Toxin může být izolovaný a aplikovaný přímo do rostliny nebo mohou být aplikovány bakteriální kmeny, které pak produkuje toxin přímo na místě.
Termín houba nebo houby zahrnují široké spektrum jaderných sporulujících organismů které neobsahují chlorofyl. Příklady houb zahrnují kvasnice, plíseň, rzi, a houby.
Termín bakterie zahrnuje jakýkoliv prokaryotický organismus, který nemá oddělené jádro. Fungicidní znamená mající schopnost zvýšit úmrtnost nebo zpomalit tempo růstu hub. Antibiotikum zahrnuje jakoukoliv substanci, která může zabít nebo potlačit růst mikroorganismů. Antibiotika mohou být vyrobena mikroorganismem, syntetickým postupem nebo polysyntetickým postupem. Termín, tedy zahrnuje substance, které schopné inhibovat nebo zabíjet houby, jako je např. zwittermicin nebo kanosamine.
Proti houbám zahrnuje jakoukoliv substanci, která je schopna zvýšit úmrtnost nebo zpomalit tempo růstu hub
Termín kultivace popisuje množení organismů na nebo v médiích různých druhů. Kompletní kultivační médium popisuje kapalnou kulturu obsahující jak buňky tak médium. Supematant znamená kapalné kultivační médium z něhož jsou kultivované buňky odstraněny odstřeďováním, filtrací, usazováním, nebo dalšími způsoby známými v současném stavu techniky.
Jak je zde používán, termín hmyz zahrnuje všechno organismy v třídě Insecta.
Nedospělý hmyz znamená jakoukoliv formu organismu před dospělým stadiem, včetně, např. vajíčka, larvy a nymfy. Insekticidní znamená mající schopnost zvýšit úmrtnost nebo zpomalit tempo růstu hmyzu. Nematocidní znamená mající schopnost zvýšit úmrtnost nebo zpomalit tempo růstu hlístic.
Pesticidní znamená mající schopnost zvýšit úmrtnost nebo zpomalit tempo růstu hmyzu, hlístic a roztočů.
Pozitivní kontrola znamená prostředek o kterém je známé, že má pesticidní aktivitu.
Pozitivní kontrola zahrnuje, ale není omezena, na komerčně dostupné chemické pesticidy. Termín negativní kontrola popisuje prostředky o kterých je známé že nemají pesticidní aktivitu. Příklady negativní kontroly jsou voda nebo kyselina octová.
Termín rozpouštědlo zahrnuje jakoukoliv kapalinu, která drží další substanci v roztoku. Extrahovatelné rozpouštědlo popisuje jakoukoliv látku, která se rozpustí v rozpouštědle a která pak může být od rozpouštědla oddělena. Příklady rozpouštědel mohou být např. organická rozpouštědla jako kyselina octová.
Termín metabolit popisuje jakoukoliv směs, substanci nebo postranní produkt kvašení mikroorganismu, který má pesticidní aktivitu. Antibiotikum, jak bylo definováno výše, je metabolit specificky aktivní proti mikroorganismům.
Prostředek je definován jako kombinace aktivního agens a dalších látek nebo prostředků, netečných (např. detekovatelné agens nebo značka) nebo aktivních, jako je nepř. adjuvans.
Frakce je část po rozdělení některou technikou dělící supematant dělící molekuly podle velikosti, polarity nebo náboje.
Částečně přečištěná frakce je jedna z frakcí po rozdělení, která může potlačit klíčení nebo zvětšit B+ aktivitu proti lepioloplaus.
Efektivní množství je množství dostačující pro dosažení žádaných výsledků. Efektivní množství může být aplikováno v jedné nebo více dávkách. V rámci ošetření a ochrany je efektivní množství množství dostačující pro zlepšení, stabilizaci, zvrácení, zpomalení nebo zabrždění progrese napadení hmyzem.
Navrhovaný vynález popisuje biologickou čistou kulturu kmene, který je nový antibiotikum produkující kmen Bacillus sp. označený pod NRRL přístupovým číslem B-30 087, a jeho mutanty, se specifickou aktivitou proti konkrétnímu rostlinnému patogenu a který nevykazuje žádnou antibakteriální aktivitu. V jedné variantě, je kmen Bacillus pumilus označený pod NRRL přístupovým číslem B-30 087 a jeho mutanty.
V dalších variantách je kmen mutantem nebo variantou NRRL přístupové číslo B30 087, který má všechny poznávající charakteristické rysy (jak jsou popisovány dále) kmene označeného pod NRRL přístupovým číslem B-30 087. Mutant nebo varianta jsou používány zaměnitelně v rámci této varianty a navíc, mohou být identifikovány neboť mají genom který hybridizuje za přísných podmínek s genomem NRRL přístupové číslo B-30 087.
Hybridizace popisuje reakci v které jeden nebo více polynucleotidů reagují za vzniku komplexu, který je stabilizovaný vodíkovými můstky mezi bázemi nukleotidových zbytků.
• · w
Vodíkové můstky mohou odpovídat Watson-Crickově párování bází, Hoogsteinově vazbě, nebo jiné sekvenčně specifické vazbě. Komplex může obsahovat dva řetězce tvořící duplexní strukturu, tři nebo více řetězců tvořících multiřetězcový komplex, jednotlivý řetězec který hybridizuje sám se sebou, nebo jakékoliv kombinace. Hybridizační reakce mohou probíhat za podmínek různé přísnosti. Obvykle je hybridizační reakce za málo přísných podmínek prováděna asi v 40 °C v 10 x SSC nebo v roztoku o ekvivalentní iontové síle/teplotě. Hybridizace za středně přísných podmínek obvykle probíhá asi v 50 °C v 6 x SSC, a hybridizační reakce za přísných podmínek obvykle probíhá asi v 60 °C v 1 x SSC.
Mutant nebo varianta NRRL přístupové číslo B-30 087 může být také definována jako kmen mající genovou sekvenci, která je více než z 85 %, lépe pak více než z 90 % ještě lépe pak více než z 95 % sekvenčně identická s genomem NRRL přístupové číslo B-30 087. Když polynukleotid nebo polynukleotidová oblast (nebo polypeptid nebo část polypeptidu) má jisté procento (například, 80 %, 85 %, 90 %, nebo 95 %) sekvenční identity kjiné sekvenci znamená že za ideálního uspořádání je procento bází (nebo aminokyselin) stejné při porovnání dvou sekvencí. Toto uspořádání a procentuální homologie nebo sekvenční identita může být stanovena pomocí programů známých v současném stavu techniky například, jak je popsáno v CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F.M. Ausubel et al., eds., 1987) Supplement 30, section 7.7.18, Table 7.7.1. Je vhodné pro nastavení použít standardní parametry. Nejvhodnější program je BLAST a použití standardních parametrů. Zvláště vhodné jsou programy BLASTN a BLASTP, a používání následujících standardních parametrů: genetický kód - standardní; filtr = žádný; řetězec = oba; limit = 60; předpoklad =10; matice = BLOSUM62; popisy = 50 sekvence; třídit =VYSOKÉ SKÓRE; databáze = neredundantní, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + SwissProtein + SPupdate + PIR. Detaily o těchto programech mohou být nalezeny na následující Internetové adrese: http://www.ncbi.nlm.nih.govlcgi-popelnice/BLAST
Navrhovaný vynález dále popisuje supematanty získané z výše uvedených kultur. Supematanty mohou být získány metodami pomocí technik dobře známých v současném stavu techniky, jako jsou: odstřeďování, filtrace, usazování apod.
V dalším aspektu, navrhovaný vynález popisuje izolovaný metabolit, kterým je vodorozpustné fungicidní antibiotikum. Metabolit je izolován z kmene podle navrhovaného vynález, jak je popsán výše. Je menší než 10 000 daltonů, maximum UV absorpce má 280 nm a rozsah do 230 nm, je stabilní v kyselinách i zásadách, při teplotách nad 80 °C je mírně tepelně nestabilní, s kladným nábojem a aktivitou proti specifickým rostlinným patogenům, ale bez aktivity proti • · bakteriím. Navrhovaný vynález dále popisuje postup produkce tohoto metabolitu, kdy tento způsob zahrnuje kultivaci kmene podle navrhovaného vynálezu a izolaci aktivního metabolitu, za použití technik popsaných dále.
Dalším aspektem navrhovaného vynálezu je částečně čištěná aktivní frakce NRRL přístupové číslo B-30 087, která má fungicidní aktivitu. Aktivní frakce není totožná s zwittermicinem A.
Dále navrhovaný vynález popisuje prostředky obsahující jakýkoliv z výše uvedených kmenů (včetně jejich mutant nebo variant), supematanty, frakce a metabolity, samotné nebo v kombinacích a v nosiči. Tento prostředek může být dále doplněn přidáním přinejmenším jedné chemikálie nebo biologického pesticidu. Tento prostředek může mít různé formy, který zahrnují např. rozpustný prášek, granule, vodní suspenze, emulgovaný koncentrát nebo mikrokapsule.
Za účelem dosažení dobré distribuce a soudržnosti prostředku podle navrhovaného vynálezu, může být výhodné použít kompletní kultivační médium, supematant, frakci a/nebo metabolit/antibiotikum se přidanými látkami, které pomáhají rozptylu a adhezi. Vhodné formy budou známé odborníkům v současném stavu techniky (rozpustné prášky, granule apod., nebo mohou být potažené ve vhodném prostředku apod., kapaliny jako vodné roztoky a vodní suspenze, and emulgované koncentráty). Další vhodné formy jsou známé odborníkům v současném stavu techniky.
Jakýkoliv z výše uvedených kmenů, metabolitů, frakcí, supematantů a prostředků obsahujících tyto aktivní ingredience, mohou být používán pro popisovaný způsob léčby a nebo ochrany rostlin, kořenů nebo ovoce proti houbovým infekcím. Tato technika zahrnuje aplikaci efektivního množství kmene, metabolitu, frakce, média nebo prostředku obsahujícího tyto aktivní složky, samotné nebo v kombinaci mezi sebou a/nebo s další biologickým nebo chemickým pesticidem na infikovaný kořen, rostlinu nebo ovoce. Efektivní množství těchto prostředků také může být aplikováno na rostlinu, kořen nebo ovoce předem za účelem zabránit takovému zamoření.
V dalším aspektu, vynález popisuje způsob léčby a nebo ochrany rostlin, kořenů nebo ovoce proti houbovým chorobám zahrnující aplikaci efektivní množství antibiotika vyrobeného kmenem, nebo jeho varianta, která má všechny charakteristický nového kmene Bacillus sp. NRRL přístupové číslo B-30 087. V jedné variantě, je kmen Bacillus sp. NRRL přístupové číslo B-30 087.
Tento vynález dále popisuje ve vodě rozpustnou látky, která zvyšuje insekticidní aktivitu
Bacillus thuringiensis, má molekulovou hmotnost méně než 10 000 daltonů a není to zwittermicin A. Tato látka není beta exotoxin nebo jiný exotoxin produkovaný B. thuringiensis.
Směs je izolována na anexu, srážením v acetonitrilu a chromatografií dělící podle velikosti (SEC). Navrhovaný vynález také popisuje částečně čištěné frakce supernatantu z kmene Bacillus který obsahuje novou látku. Nov látka a aktivní frakce mohou být izolovány z kmene Bacillus patřícího do skupiny Bacillus sp., včetně např. B. subtilis, B. cereus. B. mycoides, a B. pumilus.
Částečně čištěná aktivní frakce může být identifikována pomocí jejího ’HNMR (nebo proton NMR) spektra, které umožňuje odborníkovi v současném stavu techniky určit jestli je látka zcela přečištěná. Pokud je látka čistá, maximum představující jeden proton bude integrovat pro libovolný násobek jedné. Maxima reprezentující dva protony, například methylen, bude pak integrovat pro násobky dvou. Maxima reprezentující tři protony, například methyl, bude pak integrovat pro násobky tří. Toto je případ z Obr. 3, kde je zobrazen čistý standard zwittermicinu A. Jakkoli, 'H NMR spektrum částečně čištěného aktivního zesilovače transkripce z B. thuringiensis má skupinu maxim, které integrují na méně než jedna a proto patří různým látkám smíchaným z větších maxim ve spektru.
Sama o sobě tato látka nevykazuje insekticidní aktivitu. Kombinace s B. thuringiensis zlepšuje insekticidní účinek Bacillus thuringiensis po aplikaci na rostliny a kořeny rostlin. Bacillus thuringiensis může být ve formě mikrobiálního kmene, komerčního produktu, upravené rostliny, insekticidního aktivního metabolitu, insekticidního aktivního supernatantu a nebo delta endotoxinu.
Bacillus thuringiensis je gram-positivní, sporulující Bacillus, charakterizovaný inkluzemi parasporálního krystalického proteinu. Tyto proteiny mohou být vysoce jedovaté pro škodlivé druhy hmyzu a specifické ve své toxicitě. Jak je použito dále v nárocích, termín Bacillus thuringiensis zahrnuje mikrobiální kmeny, komerční produkty obsahující takové kmeny nebo izoláty obsahující aktivní metabolit nebo frakce izolované z kmenů, geneticky upravené nebo konstruované rostliny, které exprimují geny kódující insekticidní protein, genový produkt nebo delta endotoxin z B. thuringiensis. Geny kódující toxin byly izolovány a sekvenovány a produkty založené na rekombinantní DNA pocházející z B. thuringiensis byly připraveny a schváleny pro použití. Techniky genového inženýrství a nové postupy pro aplikaci těchto endotoxinů z Bacillus thuringiensis do zemědělská produkce jsou ve vývoji a komerční výrobě. To zahrnuje použití rostlin geneticky upravených tak aby nesly geny pro endotoxin pro rezistenci proti škůdcům a použití stabilizovaných nedotčených bakteriálních buněk Bacillus thuringiensis pro doručení endotoxin (Gaertner, et al., (1988) TIBTECH 6:S4-S7): Bacillus thuringiensis může být použit proti cílovým škůdcům, podáním divokého kmene B. thuringiensis který přirozeně exprimuje toxin. Eventuelně, je možné gen kódující požadovaný toxin přenést do vhodného * ···· ♦ ♦· * · · «· · · · · · * ··· • « · «··««· · « · ····«· ··· · ··· ·· ·· ♦ ·· rekombinantního hostitele. Mohou být také použity fragmenty toxinu z Bacillus thuringiensis, které si zachovávají insekticidní aktivitu.
Následující patenty US popisují pesticidní Bacillus thuringiensis izoláty nebo rekombinantní mikroby které exprimují Bacillus thuringiensis toxin: patent US. 5 006 335, 5 106 620, 5 045 469, 5 135 867, 4 990 332, 5 164 180, 5 126 133, 5 093 119, 5 208 017, 5 186 934, 5 185 148, 5 211 946, 4 948 734, 4 849 217, 4 996 155, 4 999 192, 4 966 765, 5 073 632, 5 196 342, 5 063 055, 5 080 897, 5 024 837, 5 147 640, 5 173 409 a 5 186 934.
Přípravky z výtrusů a krystaly Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki byly užívané mnoho let jako komerční insekticidy pro škodlivý motýlovitý hmyz. Například, Bacillus thuringiensis var. kurstaki HD-1 produkuje krystalický delta endotoxin který je jedovatý pro larvy celé řady motýlovitého hmyzu. Další druhy Bacillus thuringiensis konkrétně israelensis a tenebrionis byli užívány pro komerční hubení hmyzu.
Klonování a exprese genu Bacillus thuringiensis pro krystalický protein v Escherichia coli byl popsaný v Schnepf, H. et al. (1981) Proč. Nati. Acad Sci. USA 78:2893-2897. Patent US 4 448 885 a patent US 4 467 036 popisují expresi krystalického protein v E. coli. Hybridní geny pro krystalickou bílkovinu z Bacillus thuringiensis byly konstruovány tak aby měly zvýšenou toxicitu a měly rozšířený rozsah účinnosti proti více druhům škodlivého hmyzu. Viz Patent US 5 128 130 a 5 055 294. Patent US 4 797 276 a 4 853 331 popisuje Bacillus thuringiensis kmen San Diego (a.k.a. B.t. tenebrionis, a.k.a. M-7) který může být užíván pro kontrolu škodlivých brouků v různých prostředích. Patent US 4 918 006 popisuje Bacillus thuringiensis mající aktivitu proti dvoukřídlému hmyzu. Patent US 4 849 217 popisuje izolát z Bacillus thuringiensis, který je aktivní proti nosatci napadajícímu vojtěšku. Patent US 5 151 363 a patent US 4 948 734 popisuje určitý izolát z Bacillus thuringiensis jenž je aktivní proti hlísticím.
Kultury Bacillus thuringiensis jsou dostupné ze Spojených států z Ministerstva zemědělství (USDA) v Brownsville, Tex. Žádosti měl by být zaslány USDA, ARS, Cotton Insects Research Unit, P.O. Box 1033, Brownsville, Tex. 78 520 USA; nebo Northem Research Laboratory, U.S. Department of Agriculture, 1815 North University Street, Peoria, 111., USA. Proto, látka a aktivní frakce zvýší insekticidní aktivitu Bacillus thuringiensis proti hmyzu, který jsou např. hlíštice, larvám Psaudaletia unipuncta, roztočům a larvám brouka Diabrotica. a mandelince bramborové. Jak je zřejmé odborníkům v současném stavu techniky aktivní látka může být aplikována ve formě prostředku. Navrhovaný vynález také popisuje prostředek zahrnující novou látku a nosič, jako je rozpouštědlo nebo zemědělsky přijatelný nosič. V další variantě, prostředek dále obsahuje efektivní množství Bacillus thuringiensis, jak je popsán výše. V ještě další variantě prostředek • · obsahuje alespoň jednu chemikálii nebo biologický pesticid který je konvenčně užívaný v současném stavu techniky. Za účelem dosažení dobrého rozptylu a adheze prostředku podle navrhovaného vynálezu, může být výhodné použít kompletní kultivační médium, supematant a/nebo metabolit se složkami které pomáhají rozptýlení a adheze. Pro jednoduchou aplikaci na rostliny nebo kořeny rostlin mohou být aplikované formy zpracované do preparátů jako jsou rozpustné prášky, vodní suspenze, emulgované koncentráty a potažené preparáty.
Nová látka, aktivní frakce nebo prostředky je obsahující, mohou být použity pro zvýšení insekticidní aktivity Bacillus thuringiensis. Navrhovaný vynález také popisuje způsoby zvýšení insekticidní aktivity Bacillus thuringiensis pomocí kombinace s efektivním množstvím nové látky, aktivní frakce nebo prostředku, který je obsahuje s Bacillus thuringiensis. V další variantě, je přidáno k prostředku efektivní množství alespoň jednoho konvenčního biopesticidu nebo chemického pesticidu.
Vynález dále popisuje používání nové látky, NRRL přístupové číslo B-30 087 v kombinaci s NRRL přístupovým číslem B-21 661, použitý jako kompletní kultivační médium na rostlinu, kořen nebo ovoce, pro použití jako fungicid, řečený fungicid má silnější efekt následkem neočekávaného synergický vlivu kombinace látek. Lépe pak, když je kombinace aplikována v poměru 1:2 (B-21 66LB-30 087) k Botrytis cinerea nebo Peronospora parasitica. Ještě lépe pak, když je kombinace aplikovaná k Botrytis cinerea nebo Peronospora parasitica v poměru 1:4. V ještě další variantě, prostředek obsahuje alespoň jednu chemikálii nebo biologický pesticid který je konvenčně užívaný v současném stavu techniky. Za účelem dosažení dobrého rozptylu a adheze prostředků podle navrhovaném vynálezu, může být výhodné použít kompletní kultivační médium, supematant a/nebo metabolit s látkami, které napomáhají rozptylu a adhezi. Pro jednoduchou aplikaci na rostliny nebo kořeny rostlin, mohou být prostředky zpracovány do forem jako jsou např. z rozpustný prášek, vodní suspenze, emulgovaný koncentrát a potažená forma.
V popisu použité publikace, patenty a vydané patentové specifikace jsou referovány ve formě citací. Popisy těchto publikací, patenty a vydaný patentové specifikace jsou tímto způsobem uvedeny pod odkazem k současnm výsledkům, aby úplněji popsaly stav techniky s kterým navrhovaný vynález souvisí.
PŘEHLED OBRÁZKŮ NA VÝKRESECH
Obr. 1 je NMR spektrum zaznamenané při 400 MHz v D20, v částečně čištěné fungicidní frakci Bacillus sp. uložené pod NRRL číslo B30 087.
• ·· · ♦ ♦ ·« • · · ♦ ·· • · · · · ·· «·«· · ♦ · ♦· ♦· ·
Obr. 2 ukazuje !H NMR spektrum zwittermicinu zaznamenané při 400 MHZ v D20.
Čísla 3A až 3C jsou kapilární elektroforetogramy média izolovaného z Bacillus jak popsuje příklad 9. Podmínky pro elektroforézu: nepotažená 56 cm dlouhá kapilára byla používána při 40 °C, 30 kV, kladné polaritě, 100 μΑ, pH 5.8, v pufru fosforečnanu sodného, UV detekce při 200 nm. Obr. 3A je kapilární elektroforetogramy kompletního kultivačního média Bacillus pumilus B-30 087. Obr. 3B je kapilára elektroforetogram kompletního kultivačního média Bacillus pumilus B-30 087 s přidaným standardem zwittermicinu. Maximum zwittermicinu je detekováno kolem 3,25 minuty; stranou od všech maxim detekovaných v celém kultivačním médiu. Obr. 3C ukazuje standard zwittermicinu v čase asi 3,28 minuty.
Obr. 4 srovnává tři elektroforetogramy z kapilární elektroforézy (CE) částečně-čištěné frakce NRRL číslo B-30 087 samostatně (Obr. 4A), částečně čištěné frakce NRRL číslo B-30 087 s přidaným zwittermicinem (Obr. 4B), a zwittermicin samotný (Obr. 4C).
Obr. 5 ukazuje ’H NMR spektrum částečně čištěné aktivní frakce účinné jako B+ zesilovač transkripce izolované z B-30 087 zaznamené při 400 MHz v D2O.
PŘÍKLADY PROVEDENÍ VYNÁLEZU
Následující příklady objasňují, ale nelimitují navrhovaný vynález.
PŘÍKLAD 1: Charakterizace kmene NRRL přístupové číslo B-30 087.
NRRL přístupové číslo B-30 087 byl identifikován podle buněčných mastných kyselin, odvozených od methylester-FAME (Miller, L.T. (1982) Single derivatization method for routine analysis of bacterial whole cell wall fatty acid methyl esters, including hydroxy acids” J Clin. Microbiol. 16:584-586) 584-586) a analyzovaných plynovou chromatografií za použití MIDI systému (Microbial Identification Systém, lne., Newark, DE). Postup a protokoly používané pro růst kultur baktérií a specifikace nástrojů jsou popsané v MIDI (Identification of bacteria by gas chromatography of cellular fatty acids. Technical Notě # 10 1. MIDI, lne., 115 Barksdale Professional Center, Newark, DE). Izoláty byly kultivovány na TSA (BBL) plotnách při 28 °C a buňky byly sklizeny za 24 hodin. Byl přidán 1 ml NaOH v methanolu (15 % (hmotnost/objem) NaOH v 50 % (objem/objem) methylalkoholu) a buňky byl permeabilizovány při 100 °C 30 minut. Esterifikace mastných kyselin probíhala s 2 ml 3,25 N HC1 v 46 % (objem/objem) v methanolu při 80 °C po dobu 10 minut. FAME Byli extrahovány do 1.25 ml 1:1 (objem/objem) methyl-tert-butyléter-hexan, a organický extrakt byl promyt v 3 ml 1,2 % (hmotnost/objem) NaOH před analýzou pomocí plynové chromatografie. Plynový chromatograf (Hewlett-Packard
| • ···« • · | • ·· | ·· | • | ||
| • · · · | • | ||||
| • · | • · · | • | • | ||
| • · · | • · · | • · | • | ||
| • · | • · · | • | • | ||
| ♦ · · | ··· 9· | ·· | ·· |
5890A) byl vybaven ionizačním detektorem a kapilární kolonou (Hewlett-Packard 19091B-102, Prokřížený 5 % fenylmethylsilikon; 25m XO.22 mm ID; film o tloušťce, 0,33 lim; fázový poměr 150) s vodíkem jako nosným plynem. Hewlett-Packard 3392 integrátor automaticky integroval FAME maxima a bakteriální izolát byl určován pomocí MIDI Microbial Identification Software (Sherlock TSBA Library verze 3.80). FAME profil Xanthomonas maltophila ATCC 13 637 byl použit jako kontrola pro stanovení MIDI.
Výsledky tří nezávislých běhů MIDI profilu identifikovaly NRRL přístupové číslo B-30 087 jako Bacillus pumilus s indexem podobnosti 0,875.
PŘÍKLAD 2: Aktivita NRRL přístupové číslo B-30 087 proti rostlinnému patogenu v in vitro kultuře (zónová zkouška)
Pro stanovení jestli NRRL přístupové číslo B-30 087 je účinné proti širokému okruhu rostlinných patogenních hub, byl proveden experiment za použití těchto rostlinných patogenů: Botrytis cinerea, Altemaria brassicicola Colletotrichum acutatum, Cladosporium carophylum, Moniliniafructicola, Venturia inaequalis, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium oxysporum, Taphrina deformans a Verticillium dahliae.
Pro určení aktivity NRRL přístupové číslo B-30 087 v agarovém difuzním (zónovém) testu, rostlinné patogenní výtrusy (výtrusy byli oškrábány z povrchu Petriho misek a zředěné do přibližně 1 x 105 výtrusu/ml (v závislosti na patogenu)) byli rozprostřeny po povrchu bramborového dextrózového agaru v 10 cm Petriho miskách. Pro Rhizoctonia solani a Sclerotinia sclerotiorum, byli namísto výtrusů naneseny na misky fragmenty mycelia. Kruhové jamky, přibližně 7,0 mm byli vyřezány do agaru a 125 1 vzorku supematantu a NRRL přístupové číslo B-30 087 rostlo v médium se sojovým, kvasnicovým extraktem v 250 ml třepacích baňkách a po 72 hodinách bylo přeneseno do jamek.
Supematant byl připraven centrifugám' při 12 000 rpm 10 minut. Typické výsledky představují zóny bez růstu a/nebo s redukovaným růstem patogenu kolem jamky nebo se zóny vůbec neobjeví. Velikost zónz v milimetru byla měřena a zaznamenána jen v případě, je-li zóna patrná. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1, níže.
Tabulka 1.
| In vitro test NRRL přístupové Číslo B-30 087 proti rostliným houbovým patogenům | |
| Altemaria brassicicola | žádná zóna |
| Botrytis cinerea | žádná zóna |
| Cladosporium carpohilum | žádná zóna |
| Colletotrichum acutatum | žádná zóna |
| Fusarium oxysporum | žádná zóna |
| Monilinia fructicold | žádná zóna |
| Rhizoctonia solani | žádná zóna |
| Sclerotinia sclerotiorum | žádná zóna |
| Taphrina deformans | žádná zóna |
| Venturia inaequalis | žádná zóna |
| Verticillium dahliae | žádná zóna |
| Pythium sp. | žádná zóna |
| Phytophthora infestans | slabá aktivita (malá nejasná zóna) |
| Phytophthora capsici | žádná zóna |
| Didimella bryonia | žádná zóna |
| Altemaria brassicicola | žádná zóna |
Supematant z NRRL přístupové číslo B-30 087 nevykázal žádnou aktivitu proti většině houbových rostlinných patogenů v zónovém testu.
PŘÍKLAD 3: Aktivita NRRL přístupové číslo B-30 087 proti bakteriálním patogenům rostlin.
Standardní agarový difůzní test byl proveden jako v příkladu 2. Každý bakteriální patogen byl naočkován na povrch bramborového dextrózového agaru. 125 1 vzorku supematantu z NRRL přístupové číslo B-30 087 byl přenesen do každé jamky, jak je uvedeno výše. Přítomnost zóny nebo velikosti zóny byla měřen v milimetrech.
Tabulka 2.
In vitro test proti rostliným houbovým patogenům (zónový test)
| Supematant NRRL číslo B-30 087: | Zóna inhibice (mm) |
| Pseudomonas syringae pv. rajče | žádná zóna |
| Xanthomonacampestris pv. Campestris | žádná zóna |
| Erwinia carotovora subsp. Carotovora | žádná zóna |
NRRL přístupové číslo B-30 087 nebyl aktivní proti žádnému druhu bakteriálního rostlinného patogenu, což bylo ověřeno in vitro.
PŘÍKLAD 4: Aktivita NRRL přístupové číslo B-30 087 proti rostlinným patogenům v testech na rostlinách.
Aktivita NRRL přístupové číslo B-30 087 byl ověřena proti fazolové rzi Uromyces phaseoli na fazole popínavé a šedé plísni, Botrytis cinerea na pepřovníku, Alternaria solani na rajčeti, a ochmýřené plísni salátu, Bremia lactucae, ochmýřené plísni brukve, Peronospora parasitica, pozdní plísni rajčete, Phytophthora infestans, a prachové plísni grepů, Uncinula necator.
Alternaria solani
Patogen, Alternaria solani, byl pěstován na standardní Petriho misce (10 cm) s PDA. Kolonie hub jsou odříznuty z misky a přeneseny do sporulačního média (20 g sacharóza, 30 g uhličitan vápenatý a 20 g agaru na litr sterilní vody). Sterilní voda je přidána na misku tak aby částečně zakryla kousky mycelia a misky jsou přeneseny a inkubovány v 22 až 26 °C s 14 hodinovou fotoperiodou po dva dny. Výtrusy jsou sebrány stěrkou do nádoby se sterilní vodou. Suspenze výtrusů je naředěna na 2 x 104 výtrusů/ml.
Sazenice rajčat (UC82-B) ve stádiu 3-4 listů v dvoupalcových květináčích a byly umístěny ve sklenících a byli postříkány rozprašovači se suspenzí NRRL přístupové číslo B-30 087 kompletní kultivační médium se sojovou moukou, kvasnicovým extraktem ne 72 hodin v 250 ml třepáčkových baňkách. Po postřiku by sazenice měly schnout minimálně dvě hodiny. Naočkované sazenice byli přeneseny do Percival vlhčící komůrky při 22 °C bez osvětlení pro prvních 40 hodin. Rostliny ve sklenících byly pokryty plastovo kopulí a drženy při 20 až 22 °C 48 hodiny v Percivalově inkubátoru při 14 hodinové fotoperiodě. Voda bez NRRL přístupové číslo B-30 087, s a bez výtrusů patogenu byla použita jako negativní kontrola a pozitivní kontrola. Chemický fungicid (např., Azoxystrobin, Abound® ) byl použit pro srovnání v koncentracích od 100 do 250 ppm. Rostliny byli ohodnoceny podle stupnice od 0 do 5, kde 5 je 100 % infikovaný a 0 nemá žádné symptomy choroby. Ve vodě s kontrolou A. solani, byly jednotné léze nad všech listech a dělohy byly odtrženy a silně infikovány (skóre 5 = kompletní infekcí, žádná kontrola). Rostliny ošetřené NRRL přístupové číslo B-30 087 se neliší od kontroly které byla podána voda. Nebyla žádná kontrola pro patogen s NRRL přístupové číslo B-30 087
·· · (také skóre 5). Negativní kontrola nebyla infikována. Chemicky ošetřené rostliny měly skóre mezi 0 a 1.
Botrytis cinerea
Patogen, Botrytis cinerea, byl pěstován na standardní Petriho misce (10 cm) s PDA a výtrusy byly sebrány pomocí bramborového dextrózového vývaru (PDB doplněného doplněný sladem (0.5 g/L) a kvasnicovým extraktem (0.5 g/L) a naředěny na 2 x 106 výtrusů/ml. Použité rostliny byli pepřovníky (Yolo Wonder) ve stádiu 3 až 5 listů v dvoupalcových květináčích. NRRL přístupové číslo B-30 087 a patogen byly stejné jako výše. Sazenice byli inkubovány při 20 °C bez osvětlení. Rostliny byly pokryty plastovo kopulí a drženy při 2,5 dne (60 až 65 hodin) do vyhodnocení.
Chemický fungicid (např., Iprodion, Rovral® ) byl použit pro srovnání v koncentracích od 20 do 100 ppm. Rostliny byli ohodnoceny podle stupnice od 0 do 5, kde 5 je 100% infikovaný a 0 nemá žádné symptomy choroby. Ve vodě s kontrolou B.cinerea, byly jednotné léze nad všech listech a dělohy byly odtrženy a silně infikovány (skóre 5 = kompletní infekce, žádná kontrola). Rostliny ošetřené NRRL přístupové číslo B-30 087 se neliší od kontroly které byla podána voda. Nebyla žádná kontrola pro patogen s NRRL přístupové číslo B-30 087 (také skóre 5). Negativní kontrola nebyla infikována. Chemicky ošetřené rostliny měly skóre mezi 0 a 1.
Bremia lactucae
Pro test s Bremia lactucae, byla semena salátu vyseta na vrstvu sterilizované klíčící směsi obsahující rašelinu, perlit a vermikulit v malém průhledném plastovém boxu 8 cm vysokém a se čtvercovým půdorysem. Jeden týden po vysetí, byla sadba salátu postříkána NRRL přístupové číslo B-30 087 kompletním médiem nebo supematantem. Když rostliny oschly pak suspenze výtrusů měké plísně sebrané z infikovaného sadby salátu (2 x 104 výtrusů/ml) byla nastříkána na sazenici. Zároveň byly aplikovány také chemické standardy jako Aliette (fosetyl-al) a Ridomil (metalaxyl). Ačkoliv, izolát z Bremia lactucae použitý v těchto testech byl předtím prokázán jako necitlivý k těmto dva chemikáliím které jsou užívány komerčně. Plastové boxy byly uzavřeny těsným víkem a inkubovány v 15 až 16 °C v Percivalově inkubátoru 16 hodin bez osvětlení. Plastikové boxy byli pak přeneseny do pokojové teploty (20 až 26 °C) pod světlem po šest dnů. Sazenice byly nepokryté, postříkané vodou, znovu zakryty, a navráceny do inkubátoru do 15 až 16 °C aby sporulovaly přes noc. Účinek NRRL přístupové číslo B-30 087 proti chemicky rezistentním kmenům ochmýřené plísně salátu je uvedeno dole v tabulce 3.
| Tabulka 3. | |||
| skóre | |||
| č.l | č.2 | č.3 | |
| NRRL č. B-30 087 vzorek 1 | 0.0 | 1.0 | 1.0 |
| NRRL čísla B-30 087 vzorek 2 | 1.0 | 1.0 | 0.0 |
| Aliette 240 ppm. | 5.0 | 3.0 | - |
| Ridomil 125 ppm. | 3.0 | 3.0 | - |
| kontroly s vodou | 5.0 | 5.0 | 5.0 |
NRRL přístupové číslo B-30 087 vykázal vysokou aktivitu proti ochmýřený plísni salátu s malou až nulovou sporulací patogenu na sazenici, zatímco kontrolní (voda) rostliny byly kompletně sporulovány měkkou plísní. Chemikálie neovlivnily kontrolní vzorek patogenu.
Peronospora parasitica
Kmen Bacillus NRRL přístupové číslo B-30 087 byl kultivován jak je uvedeno výše v 250 ml třepáčkových baňkách. Kompletní kultivační médium o síle 1 x byla nastříkána na jeden týden starý květák nebo bruselskou růžičkovou kapustu ve stádiu kompletně vyvinuté dělohy pomocí vzduchového rozprašovače. Tři opakování o 15 až 25 sazenicích/květináč byly ošetřeny. Suspenze výtrusů měkké plísně, Peronospora parasitica v koncentraci 1 až 5 x 104 výtrusu/ml byla nastříkána na rostliny Brassica po první aplikaci NRRL přístupové číslo B-30 087. Jako kontroly byly použity chemické standardy obsahujícíc Aliette (fosetyl-al) a Ridomil (metalaxyl). Izolát z Peronospora parasitica použitý v těchto testech byl dříve prokázán jako necitlivý k těmto dvěma chemikáliím které jsou komerčně používány.
Rostliny byly inkubovány v 15 až 17 °C 16 hodin pro infíkaci, pak byly sazenice přeneseny do 20 až 24°C na šest dnů. Květináče byli vráceny do 15 až 17 °C na noc aby byla umožněna sporulace patogenu. Rostliny byli ohodnoceny podle stupnice od 0 do 5, kde 5 je 100% infikovaný a 0 nemá žádné sporulační léze. Výsledky hodnocení v opakováních jsou uvedeny níže v tabulce 4.
| ♦ *· | · | |||
| • · | ·· · | * | • « | |
| • · | • | • · | ||
| • · · | • t | • | • · · | |
| a · | • · | • | • 9 | |
| ·· · | • 4· ·· | • · |
Tabulka 4.
skóre
| č.l | č.2 | č.3 | |
| NRRL č. B-30 087 vzorek 1 | 0,5 | 1,0 | 0,5 |
| NRRL č. B-30 087 vzorek 2 | 0,5 | 0,5 | 1,0 |
| Aliette 240 ppm | 5,0 | 3,0 | - |
| Ridomil 125 ppm | 4,.0 | 4,0 | 4,0 |
| kontrola s vodou | 5,0 | 3,0 | 5,0 |
NRRL přístupové číslo B-30 087 ovlivnila ochmýřenou plíseň Brassica efektivnější než neošetřené kontroly a chemické standardy.
Uncinula necator
Sadba vinných hroznů (Chardormay) o byla pěstována ve dvou palcových květináčích do té doby, než se objevilo 6 až 9 pravých listů. Kultura prachové plísně byla pěstována na sazenicích vína v 22 až 26 °C s 14 hodinovou fotoperiodou. Všechny, kromě nejmladších se 2 až 4 listy jsou odstraněny. NRRL přístupové číslo B-30 087, chemický fungicid (Rally@, myclobutanil v 25 ppm) a vodní kontroly jsou aplikovány na rostliny jak je výše uvedeno pro další testované patogeny. Pro každý vzorek je použito čtyři až pět opakování. Pro naočkování prachové plísně, listy s plísní z udržovacích rostlin jsou odstřiženy nůžkami a každá rostlina je naočkována jednotlivě. Povrch udržovací sazenice je jemně otřený štětcem tak, aby výtrusy ulpěly na povrchu pokusných rostlin. Procedura je provedena za použití 3x zvětšovacích čoček aby bylo zajištěno, ža na všechny rostliny byl nanesen stejný ekvivalentem inokula. Květináče jsou umístěny ve tmě 16 až 24 hodin v 20 až 24 °C. Rostliny jsou inkubovány v 22 až 26 °C s 14 hodinovou fotoperiodou dalších 9 až 11 dní do té doby, než je test vyhodnotitelný. Jak je výše uvedeno, rostliny jsou hodnoceny skórem 0 až 5. Výsledky použití NRRL přístupové číslo B-30 087 je uveden v tabulce 5.
| • *··· | • ·* | ♦ 4 | ||
| «· · | ·· ♦ 9 | • | 9 | • · |
| • · | 9 · · | 9 | • | |
| • > · | • · · · | • | • | |
| • 4 | • · · | ♦ 4 | ||
| 4·· · | ··· 4· | ·· | ·· |
Tabulka 5.
| č.l | skóre | |||
| č.2 | Č.3 | Č.4 | ||
| NRRL č. B-30 087 | 0,5 | 0,0 | 1,0 | 1,0 |
| Rally 25 ppm | 0,0 | 0,0 | 0,0 | 0,0 |
| kontroly s vodou | 5,0 | 5,0 | 3,0 | 4,0 |
NRRL přístupové číslo B-30 087 efektivně ovlivnil růst prachovou plíseň ve srovnání s neošetřenou kontrolou, s téměř se stejným účinkem chemický standard, Rally.
Phytophthora infestans
Test pozdní plísně rajčete, P. infestans byl proveden za použití sadby rajčete (UC82-B) v stádiu růstu s 4 až 6 pravými listy rostoucí ve dvoupalcových plastových boxech. K sazenicím rajčat byl aplikován NRRL přístupové číslo B-30 087 stejně jak je uvedeno výše. Inokulum P. infestans bylo připraveno setřením sporulujících kolonií napěstováných na agaru se semenem žita a inoculum bylo naředěno na 0,7 až 1,0 x 104 výtrusu/ml. Naočkované sazenice byly umístěn do inkubátoru a inkubovány přesně podle popisu testu pro A. solani. Sazenice byly hodnoceny pomocí 0 až 5 stupnice. Quadris® (azoxystrobin) byl použit pro porovnání v koncentraci 62,5 až 125 ppm. Výsledek používání NRRL přístupové číslo B-30 087 je uveden níže v tabulce 6.
Tabulka 6.
skóre
| č. 1 | č.2 | č. 3 | č. 4 | č. 5 | |
| NRRL č. B-30 087 | 2,0 | 1,5 | 1,5 | 0,5 | 2,0 |
| Quadris 125 ppm | 0,0 | 0,0 | 0,0 | 0,0 | 0,0 |
| Quadris 62,5 ppm | 0,0 | 0,5 | 0,0 | 0,5 | 0,0 |
| kontroly s vodou | 5,0 | 5,0 | 4,0 | 4,0 | 5,0 |
NRRL přístupové číslo B-30 087 ovlivnil růst pozdní plísněn téměř jako chemický standard, Quadris, po čtyřech dnech inkubace.
Uromyces phaseoli
Test fazolové rzi, U. phaseoli, byl proveden pomocí sadby popínavé fazole (Provider varianta) v okamžiku než byl první primární list rozvinut ze 3/4. Aplikace NRRL přístupové číslo B-30
| • 4··· | ·* | • | ||
| ·· · | ·· · · | 9 <9 | • · | |
| • · | • · · | • | • | • |
| • · · | • · · | • · | • | • |
| • · | • · · | 4 | • | • |
| ··· 4 | ··· ·· | ·· | ··· |
087 byla provedena jak je popsáno výše pro jiné kombinace hostitel/patogen. Inoklulum patogenu rzi bylo skladováno jako vysušené výtrusy rzi v ampulkách v -20 °C. Inokulum bylo připraveno přidáním vysušených výtrusů rzi do vody s 0.01 % Tween 20 a promícháno důkladně na magnetickém míchadle alespoň jednu hodinu. Inokulum je naředěno na 2 až 4 x 105 výtrusů/ml. Primární listy jsou naočkovány a sazenice jsou přeneseny do nádob a inkubovány přes noc při 20 °C v Percivalově vlhké komůrce. Sazenice jsou pak inkubovány při pokojové teplotě (20 až 26 °C) dalších 8 až 10 dní. Sazenice byly hodnoceny na stupnici 0 až 5 založené na vážnosti a množství sporulující rzi.
Chemický fungicid, Break® (propiconazole) byly použit pro srovnání v množství 40 ppm. Výsledek použití kompletního kultivačního média NRRL přístupové číslo B-30 087 je uvedeno níže v tabulce 7.
Tabulka 7.
| č. 1 | skóre | ||
| č. 2 | č.3 | ||
| NRRL č. B-30 087 | 0,5 | 0,5 | 0,0 |
| Break® 40 ppm | 0,0 | 0,0 | 0,5 |
| kontroly s vodou | 5,0 | 5,0 | 5,0 |
NRRL přístupové číslo B-30 087 ovlivnilo fazolovou rez téměř právě tak jako chemický standard, Break®.
PŘÍKLAD 5: Antifungální metabolit produkovaný NRRL přístupové číslo B-30 087.
Kompletní kultivační médium z NRRL přístupové číslo B-30 087 bylo rozděleno do kyseliny octové, butanolu a vodné frakce. Každá frakce byla testována proti rzi hledíku většího ve sporulačním testu. Výtrusy rzi hledíku většího klíčily v přítomnosti každého vzorku na mikroskopických sklíčkách obsahujících 40 1 vzorku a 20 1 výtrusů patogenu. Přibližně o 16 hodin později byly výtrusy pozorované pod mikroskopem jestli klíčí. Žádné klíčení (skóre 0) ve srovnání ke kontrole s vodou (100% klíčení a růst = skóre 5) znamená ověřenou aktivitu. Výsledky sporulačního testu rzi s různými frakcemi NRRL přístupové číslo B-30 087 jsou uvedeny níže (skóre 0 až 5 jak je uvedeno výše) v tabulce 8.
Tabulka 8.
| č. 1 | skóre Č.2 | č. 3 | |
| kyselina octová | 5,0 | 2,0 | 3,0 |
| n-butanol | 3,0 | 5,0 | 3,0 |
| vodná frakce | 0,0 | 0,0 | 0,0 |
| kompletní médium | 0,0 | 0,0 | 0,0 |
| kontroly s vodou | 4,0 | 5,0 | 5,0 |
Metabolit je ve vodní frakci a není snadno extrahovatelný v butanolu nebo kyselině octové.
Byl stanoveny další charakteristiky metabolitu. Bylo prokázáno, že molekula projde skrz 10,000 molekulový hmotnostní filtr což dokazuje, že metabolit je menší než 10,000 daltonů. Aktivita se neztratila po inkubaci s proteázami a ani po inkubaci s kyselinou nebo zásadou. Aktivita poklesla po zahřátí na 80 °C po jednu hodinu (skóre proti rzi hledíku většího se zvýšila z 0 na 1,5). Aktivita byla potlačena po průchodu anexem, ale ne na negativním iontoměničem (metabolit má kladný náboj).
PŘÍKLAD 6: Částečné přečištění fungicidní frakce NRRL přístupové číslo B-30 087.
Kompletní kultivační médium z NRRL přístupové číslo B-30 087 (850 ml) byl centrifugován při 4200 rpm 15 minut a supematant byl sebrán. Aktivní uhlí (30 g) bylo přidáno k supematant a směs byla protřepána před centrifugací 20 minut při 11 500 rpm. Supematant byl vysušen na rotačním odpařovači a pak rozpuštěn v 15 ml vody. Vzorek byl pak dále čištěn pomocí velikostní chromatografíe (SEC), tak aby byly odděleny složky podle molekulové hmotnosti.
P-2 pryskyřice (130 g, BioRad) byla pakována pomocí milliQ deionizované vody do kolony 2.5 cm x 80 cm. 15 ml koncentrátu bylo naneseno na P-2 kolonu, a kolona byla vymyta vodou 10 ml frakce byli sbírány. Parametry pro P-2 kolonu: rozsah = 2, nm = 226 um, 16 mv.
Každá frakce byla testována proti rzi hledíku většího ve sporulačním testu popsaném v příkladu 5. Frakce 18 až 24 kompletně inhibovali klíčení. Tyto frakce byly smíchány a sušeny na rotačním odpařovači, pak rozpuštěny v 8 ml vody a filtrovány přes 0.2 m filtry. Filtrát byl nanesen na druhou P-2 kolonu a byly děleny jak je uvedeno výše, s výjimkou že byly sebrány 7 ml frakce.
Frakce 29 až 38 inhibovaly klíčení rzi hledíku většího ve sporulačním testu.. Tyto frakce byly vysušeny a pak rozpuštěny ve vodě. Malý alikvot (5 mg) byl dále dělen na HPLC pomocí amino kolony (4,6 mm x 15 cm, 5 m, 100 angstrómů). Kolona byla ekvilibrována 0.01 Μ KH2PO4 a • ·
gradient byl od 4 % do 44 % acetonitril/0.01 Μ KH2PO4 30 minut, 1 ml/min detekce v UV při 200 nm.
Tři maxima byla zvolena a maximum 1 bylo vysoleno na velikostní HPLC koloně (Toso Haas, G1000 PW, 7,5mm x 30 cm, 10 m), vymyto vodou a 1 ml/min detekován v UV při 200 nm. Jedno maximum bylo zvoleno z velikostní chromatografíe a jak bylo zjištěno, inhiboval klíčení rzi hledíku většího ve sporulačním test. ’Η-NMR spektrum bylo zaznamenané v 400 MHz v D2O a tento poločistý aktivní materiál je zobrazen na obr. 1.
PŘÍKLAD 7: Chemická charakteristika fungicidní složky je jiná než zwittermicin A.
Fungicidní aktivní frakce podle navrhovaného vynálezu se na kapilární elektroforéze chová jinak než zwittermicin A. Kompletní médium s NRRL přístupové číslo B-30 087 bylo napěstováno na bakteriálním kultivačním médiu obsahujícím sojovou mouku, dextrózu, kvasnicový extrakt, KTLPCL, K2HPO4, NACI a MgS04 x 7 H2O. Narostlé kultury byly použity pro naočkováví 250 ml třepáčkových baněk. Lahve byly na třepačce inkubovány při 210 rpm v 30 °C po 4 dny.
Do NRRL přístupové číslo B-30 087 kompletního kultivačního média byl přidán přečištěný zwittermicin A a pak byl dělen na kapilární elektroforéze (CE). 30 μΐ NRRL přístupové číslo B-30 087 kompletního kultivačního média bylo naneseno s 10 μΐ zwittermicinu A. Jeden vzorek z NRRL přístupové číslo B-30 087 kompletního kultivačního média, NRRL přístupové číslo B-30 087 kompletního kultivačního média se zwittermicinem A a zwittermicin A samotný, byli děleny na CE za použití pufru fosforečnanu sodného při pH 5,8. Získaný elektroforetogram jednotlivých vzorků jsou uvedeny na obr. 3.
Částečně-čištěné frakce byly pak srovnány s zwittermicinem A pomocí kapilární elektroforézy (CE). Obr. 4 ukazuje elektroforetogram částečně čištěné fungicidní složky B-30 087, částečně čištěné fungicidní komponent B-30 087 s přidanými 25 μΐ zwittermicinu A a zwittermicin A samotný.
’Η-NMR spektra zwittermicinu A jsou uvedena na obr. 2, a spektrum částečně přečištěného fungicidního metabolitu B-30 087, je zobrazeno na obr. 1, byla zaznamenána v D2O při 400 MHz. Spektra, zobrazená na obr. 1 a 2, dokazují, že fungicidní metabolit z NRRL přístupové číslo B-30 087 je odlišný od zwittermicinu A.
Fungicidní metabolit z NRRL přístupové číslo B-30 087 může být také pomocí ’Η-NMR odlišen od exotoxinu. *H-NMR spektrum exotoxinu má rezonančních ozvěn nad 5 ppm jak je uvedeno Analytical Chemistry of Bacillus thuringiensis, L.A. Hickle and W.L. Fitch, eds., ACS ·· · ···· ··· • · · · ® · · • · · ······ • · · · · · · ··· · ··· ·· ·· ·
Symposium Series 432, p. 131 (1990). Naopak, obr. 1 ukazuje že vzorek z NRRL přístupové číslo B-30 087, žádnou protonovou rezonanci nad 5 ppm nemá.
PŘÍKLAD 8; Přečištění zesilovače transkripce
Zesilovač transkripce byla částečně přečištěn z B-30 087 kompletního kultivačního média takto. 435 ml kompletního kultivačního média bylo přečištěno na anexu, vysráženo v acetonitrilu a děleno velikostní chromatografíí. Kompletní kultivační médium bylo centrifugováno tak aby byly odstraněny buňky, k supematantu bylo přidáno 14,5 g anexu (AG 1 -X8, 100 až 200 mesh, ve formě acetátu) a směs byla jednu minutu třepána. Směs byla odstřeďována při 5000 rpm, 20 minut a supernatant byly přelit a použit v dalším kroku. K supematant byl přidán acetonitril aby vznikl 50 % roztok a ten byl třepán jednu minutu a odstředěn při 5000 rpm 20 minut. Spodní tmavě hnědá vrstva obsahovala zesilovač transkripce z Bacillus thuringiensis.
Vrchní hnědá vrstva byl dále čištěna podle velikosti pomocí chromatografie ve dvou krocích. První, na 130g P-2 pryskyřice (BioRad) byla pakována milliQ deionizovanou vodou do kolony 2.5 cm x 80 cm. Hnědá vrstva byla zahuštěna za použití rotačního odpařovače přibližně 4 x a 15 ml koncentrátu bylo naneseno P2 kolonu. Kolona byla vymyta s MQ vodou pod a deseti minutové frakce byly sbírány 12 hodin (UV detekce při 280 nm, absorbance rozsah 2,0, 10 mV). Další čištění frakcí 26 až 28 bylo prováděno zahuštěním frakcí 3 x pomocí rotačního odpařovače a naneseny na P2 kolonu. Kolona byla vymyta s MQ vodou, deseti minutové frakce byly sbírány prvních 80 minut, poté 2 minutové frakce byly sbírány další dvě hodiny. Zesilovač transkripce z Bacillus thuringiensis byl vymyt ve frakcích 16 až 20. (UV detekce při 280 nm, absorbance rozsah 2,0, 10 mV).
PŘÍKLAD 9: Chemická charakteristika zesilovače transkripce je jiná než zwittermicinu A. Zesilovač transkripce podle navrhovaného vynálezu je jiná než zwittermicinu A, což bylo prokázáno na kapilární elektroforéze. Kompletní médium s NRRL přístupové číslo B-30 087 bylo napěstováno na bakteriálním kultivačním médiu obsahujícím sojovou mouku, dextrózu, kvasnicový extrakt, KPEPCQ K2HPO4, NACI a MgS04 x 7 H2O. Narostlé kultury byly použity pro naočkování 250 ml třepáčkových baněk. Lahve byly na třepačce inkubovány při 210 rpm v 30 °C po 4 dny. Do kompletního kultivačního média Bacillus thuringiensis B-30 087 byl přidán přečištěný zwittermicin A a pak byl dělen na kapilární elektroforéze (CE). 30 μΐ NRRL přístupové číslo B-30 087 kompletního kultivačního média bylo naneseno s 10 μΐ zwittermicinu • · · · ·· • · · · · · ·· • · · · ·· • ····· · ·
A. Jeden vzorek z NRRL přístupové číslo B-30 087 kompletního kultivačního média (obr. 3A), NRRL přístupové číslo B-30 087 kompletního kultivačního média se zwittermicinem A (obr. 3B) a zwittermicin A samotný (obr. 3C), byli děleny na CE za použití pufru fosforečnanu sodného při pH 5,8. Získaný elektroforetogram jednotlivých vzorků jsou uvedeny na obr. 4.
’Η-NMR spektra zwittermicinu A a částečně přečištěného zesilovače transkripce B-30 087, byla zaznamenána v D2O při 400 MHz. Spektra, dokazují, že zesilovač transkripce je odlišný od zwittermicinu A.
PŘÍKLAD 10: Stanovení posílení insektícidní aktivity Bacillus thuringiensis
Posílení insektícidní aktivity B. thuringiensis zvýšení bylo prokázáno za použití kompletního kultivačního média B. pumilus, NRRL přístupové číslo B-30 087 testem na larvách můry řepné (Spodoptera exigua). Test probíhal v 96-jamkových destičkách. Každá jamka obsahovala pevný agarový substrát. 20 μΐ kompletního kultivačního média z B-30 087 s komerčním přípravkem B. thuringiensis, Javelin (0,25 až 1,50 pg/jamku) v biologickém testu. Přípravek Javelin byl postupně ředěn.
Pro stanovení insektícidní aktivity, agar substrát byl připravený pro jamky na destičce podle Mamme et al.,. (1985), J. Econ. Entomol. 78: 290-293. Deionizovaná voda byla použita jako negativní kontrola. Celý test probíhal v dubletech. Destičky pak byly přeneseny na 2 až 3 hodiny do sušičky.
Jeden až tři Spodoptera exigua larvy v prvním instar stádiu byly přidány do každé jamky. Mikrodestičky byla zality vzduchotěsnou substancí jako je Mylar®, a každá jamka byla propíchnuta špendlíkem. Destičky byly inkubovány v 27 °C až 7 dní.
Po inkubaci, jamky byly hodnoceny podle neonatální úmrtností nebo stupně larválního vývoje. Počet mrtvých larev byl zaznamenán. Zakrnělé larvy byli hodnoceny s známkami 1 až 4. Hodnotící skóre je následující: 4 = kontrolní velikost; 3 = 75% velikosti kontroly; 2 = 50% velikosti kontroly; 1 = 25% velikosti kontroly. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 9, níže.
• · · · · · · • · · · · · •·· ·· ·· ···
| Tabulka 9. | ||
| Vzorek | počet mrtvých/celkem | skóre |
| 0,25 pg Javelin | 1/8 | 4 |
| 0,50 pg Javelin | 0/8 | 4 |
| 0,75 pg Javelin | 1/8 | 2 |
| 1,0 pg Javelin | 1/8 | 2 |
| 1,50 pg Javelin | 1/8 | 2 |
| B-30 087 + 0,25 pg Javelin | 3/8 | 2 |
| B-30 087 + 0,50 pg Javelin | 0/8 | 3 |
| B-30 087 + 1,0 pg Javelin | 7/8 | 2 |
| B-30 087 + 1,50 pg Javelin | 8/8 | 1 |
| B-30 087 samotný | 0/8 | 4 |
| kontroly s vodou | 0/8 | 4 |
Další testy probíhaly podle výše uvedených postupů. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 10.
| Tabulka 10. | ||
| Vzorek | počet mrtvých/celkem | skóre |
| 0,0625 pg Javelin | 0/8 | 4 |
| 0,125 pg Javelin | 0/8 | 4 |
| 0,18 7 pg Javelin | 0/8 | 4 |
| 0,250 pg Javelin | 0/8 | 3 |
| 0,375 gg Javelin | 1/8 | 2 |
| B-30 087 + 0,0625 pg Javelin | 1/8 | 3 |
| B-30 087 + 0,125 pg Javelin | 2/8 | 3 |
| B-30 087 + 0,187 pg Javelin | 5/8 | 2 |
| B-30 087 + 0,250 pg Javelin | 8/8 | 1 |
| B-30 087 + 0,375 pg Javelin | 8/8 | 1 |
| B-30 087 samotný | 0/8 | 4 |
| kontroly s vodou | 0/8 | 4 |
Pro stanovení posílení insekticidní aktivity částečně přečištěné frakce, byl vzorek testován, stejně jak bylo popsáno výše s 0,1 pg/jamku přípravku Javelin a 40 pg/jamku testované frakce. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 11 níže.
Tabulka 11.
Vzorek frakce 10 frakce 16 frakce 18 frakce 20 frakce 25 frakce 30 frakce 35 počet mrtvých/celkem skóre
0/92
16/161
17/171
14/141
1/102
3/112
1/123
Javelin 0,1 pg/jamku
0/8 kontroly s vodou
0/14
PŘÍKLAD 11: B. pumilus (B-30 087) a B. subtilis (B-21 661) použity společně jako fungicid. Kmen B. pumilus NRRL B-30 087 byl testován s B. subtilis NRRL B21 661, aby bylo zjištěno, zda jejich fungicidní účinek bude větší jestli budou užívaný současně, než jestli každý kmen bude použit sám. Každý kmen bylo namnožen v 10 litrovém nebo 5,000 litrovém fermentátoru, v médiu obsahujícím sojovou mouku přibližně 50 hodin. Každý kmen byl testován jako kompletní kultivační médium proti Botrytis cinerea šedé plísni na pepřovníku, a Peronospora parasitica, ochmýřené plísni na Brassica. Kompletní kultivační média byla ověřený v lx, l/2x a l/8x ředěních. Dva kmeny byli pak testovány v různých vzájemných poměrech l/2x, l/4x a l/8x. Kontrola s vodou (negativní kontrola) a chemický fungicid (BREAK® v 20 ppm) byl použit pro srovnání. Rostliny byly hodnoceny podle na 0 až 5 stupnice (kde 5 = 100% choroby, žádná kontrola; a 0 = 100% kontroly, žádná choroba). Výsledky jsou uvedeny v tabulce 12, níže.
Tabulka 12.
| Bohytis cinerea průměrný počet onemocnění (4 rostliny) | Peronospora parasitica průměrný počet onemocnění (4 rostliny) | |
| B-21 661 lx | 0,3 | netestováno |
| l/2x | 0,3 | 0,5 |
| IAx | 1,2 | 1,0 |
| l/8x | 1,7 | 2,0 |
| B-30 087 Ix | 1,7 | netestováno |
| l/2x | 2,3 | 1,3 |
| IAx | netestováno | 3,7 |
| l/8x | netestováno | 4,3 |
| B-21 661 l/4xaB-30 087 l/2x | 0,7 | 1,0 |
| B-21 661 l/8xaB-30 087 l/2x | 1,4 | 0,3 |
| B-21 661 l/4xaB-30 087 l/4x | N/A | 0,5 |
| B-21 661 l/2xaB-30 087 l/2x | N/A | 0,3 |
| B-21661 l/2xaB-30 087 l/4x | N/A | 0,3 |
| B-21 661 l/2xaB-30 087 l/8x | N/ | 0,5 |
| BREAK® v 20 ppm | 0,2 | netestováno |
| kontroly s vodou | 4,6 | 5,0 |
Výsledky s Botrytis cinerea prokazují statistické rozdíly v účinnosti, když jsou kmeny použité v kombinaci oproti použití jednotlivých kmenů. Například, skóre 0,7 pro B-21661 l/4x aB-30 087 l/2x je statisticky odlišné od skóre 2 pro B-21661 l/4x když je použit sám. Také, skóre 1,4 pro B-21661 l/8x a B-30 087 l/2x je statisticky odlišné od skóre 1,7 pro B-21661 1/8X samotné nebo 2.3 pro B30 087 l/2x samotné, a společné skóre je menší než očekávaný průměr pro každý kmen, když je použit sám. Toto ukazuje synergistcký vliv současného použití kmenů pro zvýšení fungicidní účinnosti.
Výsledky testů s Peronospora parasitica prokazují, že kombinace B-21 661 l/8x a B-30 087 l/2x je daleko účinnější než by byl očekávaný kumulovaný efekt. V případě že by se jednalo pouze o kumulativní efekt kombinace kmenů bylo by očekáváno skóre 2,05. Skutečné skóre bylo 0,3, což dokazuje určitý synergický vliv použití kmenů v kombinaci. Další skóre jsou také vyšší než očekávané výsledky, například, B-21661 l/4x a B-30 087 l/4x mají skóre 0,5, což je mnohem
lepší než by byla očekávaný účinek pouhého smíchání (odhadnuté skóre 2 až 35) jednotlivých kmenů. Tato stejná spolupráce v činnosti kmenů je také prokázána v kombinacích B-21 661 l/2x a B-30 087 l/2x (skóre 0,3), B-21 661 l/2x a B-30 087 l/4x (skóre 0,3), a B-21 661 l/2x a B-30 087 l/8x (skóre 0,5). Tyto testy prokazují synergický vliv kombinace kmenů což je neočekávaný výsledek.
Je zřejmé, že ačkoliv je vynález popsán výše uvedenými variantami, tak předcházející popis a příklady jsou zamýšlené pouze pro objasnění a ne jako limit navrhovaného vynálezu. Další aspekty, výhody a modifikace v rámci vynálezu jsou zřejmé všem odborníkům v současném stavu techniky.
Claims (85)
1. Biologicky čistá kultura kmene mající všechny identifikační znaky kmene Bacillus pumilus označená NRRL č. B-30 087, nebo její mutanty mající fungicidní aktivitu.
2. Biologicky čistá kultura kmene Bacillus pumilus označená NRRL č. B-30 087.
3. Prostředek vyznačující se tím, že obsahuje biologicky čistou kulturu podle nároku 1 a nosič.
4. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že má formu rozpustného prášku, granulí, vodné suspense, emulgovaného koncentrátu nebo mikrokapslí.
5. Izolovaný metabolit získaný z biologicky čisté kultury kmene majícího všechny identifikační znaky kmene Bacillus pumilus označeného NRRL č. B-30 087, nebo jeho mutant, který má fungicidní aktivitu.
6. Supematant získaný z biologicky čisté kultury kmene majícího všechny identifikační znaky kmene Bacillus pumilus označeného NRRL č. B-30 087, nebo jeho mutant, který má fungicidní aktivitu.
7. Částečně přečištěná frakce vyznačuj ící se tím, že je izolovaná ze supematantu podle nároku 6.
8. Prostředek vyznačující se tím, že obsahuj e metabolit podle nároku 5 a nosič.
9. Prostředek vyznač uj ící se tím, že obsahuj e supematant podle nároku 6 a nosič.
10. Prostředek vyznačující se tím, že obsahuje částečně přečištěnou frakci podle nároku 7 a nosič.
11. Prostředek podle nároku 8, vyznačující se tím, že má formu rozpustného prášku, granulí, vodné suspense, emulgovaného koncentrátu nebo mikrokapslí.
12. Prostředek podle nároku 9, vyznačující se tím, že má formu rozpustného prášku, granulí, vodné suspense, emulgovaného koncentrátu nebo mikrokapslí.
13. Prostředek podle nároku 10, vyznačující se tím, že má formu rozpustného prášku, granulí, vodné suspense, emulgovaného koncentrátu nebo mikrokapslí.
·· · ··♦*··· • · · · · · · • · · ♦♦♦··· • · · · · · · • · · « · · · · · · ♦ ♦
14. Způsob prevence nebo léčby rostlin, kořenů nebo ovoce z houbové infekce zahrnující aplikaci efektivního množství metabolitu podle nároku 1.
15. Způsob prevence nebo léčby rostlin, kořenů nebo ovoce z houbové infekce zahrnující aplikaci efektivního množství supematantu podle nároku 6.
16. Způsob prevence nebo léčby rostlin, kořenů nebo ovoce z houbové infekce zahrnující aplikaci efektivního množství částečně přečištěné frakce podle nároku 7.
17. Způsob prevence nebo léčby rostlin, kořenů nebo ovoce z houbové infekce zahrnující aplikaci efektivního množství prostředku podle nároku 8.
18. Způsob prevence nebo léčby rostlin, kořenů nebo ovoce z houbové infekce zahrnující aplikaci efektivního množství prostředku podle nároku 9.
19. Způsob prevence nebo léčby rostlin, kořenů nebo ovoce z houbové infekce zahrnující aplikaci efektivního množství prostředku podle nároku 10.
20. Způsob prevence nebo léčby rostlin, kořenů nebo ovoce z houbové infekce zahrnující aplikaci efektivního množství prostředku podle nároku 11.
21. Způsob prevence nebo léčby rostlin, kořenů nebo ovoce z houbové infekce zahrnující aplikaci efektivního množství prostředku podle nároku 12.
22. Způsob prevence nebo léčby rostlin, kořenů nebo ovoce z houbové infekce zahrnující aplikaci efektivního množství prostředku podle nároku 13.
23. Způsob podle nároku 17 vyznačující se tím, že houbová infekce je způsobena alespoň jedním mikroorganismem z následujících Bremia lactucae, Peronospora parasitica, Phytophthora infestans, Uncinula necator a Uromyces phaseoli.
24. Způsob podle nároku 18 vyznačující se tím, že houbová infekce je způsobena alespoň jedním mikroorganismem z následujících Bremia lactucae, Peronospora parasitica, Phytophthora infestans, Uncinula necator a Uromyces phaseoli.
25. Způsob podle nároku 197 vyznač uj í c í se tím, že houbová infekce je způsobena alespoň jedním mikroorganismem z následujících Bremia lactucae, Peronospora parasitica, Phytophthora infestans, Uncinula necator a Uromyces phaseoli.
♦ ·· *
26. Způsob podle nároku 20 vyznačující se tím, že houbová infekce je způsobena alespoň jedním mikroorganismem z následujících Bremia lactucae, Peronospora parasitica, Phytophthora infestans, Uncinula necator a Uromyces phaseolin.
27. Způsob podle nároků 21 nebo 22 vyznačující se tím, že houbová infekce je způsobena alespoň jedním mikroorganismem z následujících Bremia lactucae, Peronospora parasitica, Phytophthora infestans, Uncinula necator a Uromyces phaseoli.
28. Prostředek podle nároku 1 vyznačující nebo biologický pesticid.
29. Prostředek podle nároku 7 vyznačující nebo biologický pesticid.
30. Prostředek podle nároku 8 vyznačující nebo biologický pesticid.
31. Způsob podle nároku 14 vyznačující se chemického nebo biologického pesticidu.
32. Způsob podle nároku 15 vyznačující se chemického nebo biologického pesticidu.
33. Způsob podle nároku 17 vyznačující se chemického nebo biologického pesticidu.
se tím, že obsahuje alespoň jeden chemický se tím, že obsahuje alespoň jeden chemický se tím, že obsahuje alespoň jeden chemický tím, že dále zahrnuje aplikaci alespoň jednoho tím, že dále zahrnuje aplikaci alespoň jednoho tím, že dále zahrnuje aplikaci alespoň jednoho
34. Způsob produkce fungicidního supematantu vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci biologicky čisté kultury NRRL č. B-30 087 a izolaci metabolitu ze supematantu.
35. Způsob částečného přečištění supematantu podle nároku 34 vyznačující se tím, že zahrnuje frakcionaci supematantu a provádění biologických testů s jednotlivými frakcemi aby byla identifikována fungicidní frakce.
36. Supematant vyznačující se tím, že je produkován způsobem popsaným v nároku 34.
37. Částečně přečištěná frakce podle nároku 7 vyznačující se tím, že vykazuje aktivitu proti rostlinným patogenním houbám, nachází se ve vodné frakci, je slabě tepelně labilní, je • ······ • · ··♦··♦ * • ·♦···♦ • ♦* 9 ·♦· ♦ ♦ ♦* ·♦♦ stabilní v kyselinách a zásadách, je odolná proteázám, má kladný náboj a její molekulová hmotnost je nižší než 10 000 daltonů.
38. Izolovaný metabolit podle nároku 7 vyznačující se tím, že vykazuje aktivitu proti rostlinným patogenním houbám, nachází se ve vodné frakci, je slabě tepelně labilní, je stabilní v kyselinách a zásadách, je odolná proteázám, má kladný náboj a její molekulová hmotnost je nižší než 10 000 daltonů.
39. Ve vodě rozpustná látka zvyšující insekticidní aktivitu Bacillus thuringiensis, jejíž molekulová hmotnost je nižší než 10 000 daltonů a není to zwittermicin A.
40. Látka podle nároku 39 dále zahrnující Bacillus thuringiensis.
41. Prostředek vyznačující se tím, že obsahuje látku podle nároku 39 a nosič.
42. Prostředek vyznačuj ící se tím, že obsahuje prostředek podle nároku 40 a nosič.
43. Prostředek podle nároku 40 vyznačující se tím, že Bacillus thuringiensis je ve formě mikrobiálního kmene, komerčního produktu, geneticky upravené rostliny nebo delta endotoxinu.
44. Prostředek podle jakéhokoliv z nároků 40 až 43 vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden chemický nebo biologický pesticid.
45. Prostředek podle nároku 40 vyznačující se tím, že má formu rozpustného prášku, granulí, vodné suspense, emulgovaného koncentrátu nebo mikrokapslí.
46. Částečně přečištěná frakce kompletního kultivačního media kultury Bacillus vyznačující se tím, že zvyšuje insekticidní aktivitu Bacillus thuringiensis a není to zwittermicin A nebo β-exotoxin.
47. Částečně přečištěná frakce podle nároku 46 vyznačující se tím, že se jedná o Bacillus pumilus.
48. Částečně přečištěná frakce podle nároku 47 vyznačující se tím, že Bacillus pumilus je Bacillus pumilus uložený pod NRRL přístupovým číslem NRRL B-30 087.
49. Prostředek vyznačující se tím, že obsahuje frakce podle libovolného nároku 46 až 48 a nosič.
50. Frakce podle libovolného nároku 46 až 49 vyznačující se tím, že dále obsahují Bacillus thuringiensis
51. Frakce podle nároku 50 vyznačující se tím, že Bacillus thuringiensis je ve formě mikrobiálního kmene, komerčního produktu, geneticky upravené rostliny nebo delta endotoxinu.
52. Prostředek vyznačující se tím, že obsahuje prostředek podle nároku 49 a Bacillus thuringiensis
53. Frakce podle jakéhokoliv z nároků 46 až 48 vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden chemický nebo biologický pesticid.
54. Prostředek podle nároku 49 vyznačující se tím, že má formu rozpustného prášku, granulí, vodné suspense, emulgovaného koncentrátu nebo mikrokapslí.
55. Prostředek podle nároku 52 vyznačující se tím, že má formu rozpustného prášku, granulí, vodné suspense, emulgovaného koncentrátu nebo mikrokapslí.
56. Prostředek podle nároku 53 vyznačující se tím, že má formu rozpustného prášku, granulí, vodné suspense, emulgovaného koncentrátu nebo mikrokapslí.
57. Způsob zvýšení insekticidní aktivity Bacillus thuringiensis vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci efektivního množství látky podle nároku 39 na rostlinu nebo kořeny a efektivního množství Bacillus thuringiensis na rostlinu nebo kořeny.
58. Způsob zvýšení insekticidní aktivity Bacillus thuringiensis vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci efektivního množství frakce podle nároku 46 na rostlinu nebo kořeny a efektivního množství Bacillus thuringiensis na rostlinu nebo kořeny.
59. Způsob prevence nebo léčby rostlin nebo kořenů před napadením hmyzem vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci efektivního množství látky podle nároku 40 na rostlinu nebo kořeny.
60. Způsob prevence nebo léčby rostlin nebo kořenů před napadením hmyzem vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci efektivního množství prostředku podle nároku 44 na rostlinu nebo kořeny.
• · · · » · » • · · ······ * · » · · · · »»· ♦ ··· ♦· ··
61. Způsob prevence nebo léčby rostlin nebo kořenů před napadením hmyzem vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci efektivního množství frakce podle nároku 50 na rostlinu nebo kořeny.
62. Způsob prevence nebo léčby rostlin nebo kořenů před napadením hmyzem vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci efektivního množství prostředku podle nároku 52 na rostlinu nebo kořeny.
63. Způsob prevence nebo léčby rostlin nebo kořenů před napadením hmyzem vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci efektivního množství prostředku podle nároku 53 na rostlinu nebo kořeny.
64. Způsob podle nároku 51 vyznačující se tím, že dále zahrnuje alespoň jeden chemický nebo biologický pesticid.
65. Způsob podle nároků 49 nebo 50 vyznačující se tím, že dále zahrnuje alespoň jeden chemický nebo biologický pesticid.
66. Prostředek vyznačuj ící se tím, že obsahuje:
a) kompletní kultivační medium kmene majícího všechny identifikační znaky kmene
Bacillus pumilus označeného NRRL č. B-30 087, nebo jeho mutant,
b) kmene majícího všechny identifikační znaky kmene Bacillus subtilis označeného NRRL
č. B-21 661, nebo jeho mutant, a tyto kmeny mají synergistický fungicidní efekt
67. Prostředek podle nároku 66 vyznačující se tím, žerná fungicidní aktivitu proti Botrytis cinerea a Peronospora parasitica.
68. Prostředek podle nároku 66 vyznačují cí se tím, že kmeny jsou smíchány v poměru 1:2 pro NRRL přístupová čísla B-30 087 a B-21 661.
69. Prostředek podle nároku 66 vyznačující se tím, že kmeny jsou smíchány v poměru 1:4 pro NRRL přístupová čísla B-21 661a B-30 087.
70. Prostředek podle nároku 66 vyznačující se tím, že kmeny jsou smíchány v poměru 1:2 pro NRRL přístupová čísla B-30 087 a B-21 661 proti Botrytis cinerea nebo Pemospora parasitica.
• · ♦ · · • · · ♦ ·· ♦ • · · ·· • · · · ·· • · · e« • · ·· · ·· » • · • · ♦ • · ·<♦ ♦
71. Prostředek podle nároku 66 vyznačující se tím, že kmeny jsou smíchány v poměru 1:4 pro NRRL přístupová čísla B-30 087 a B-21 661 proti Botrytis cinerea nebo Pemospora parasitica.
72. Způsob prevence nebo léčby rostlin, kořenů nebo ovoce proti houbové infekci vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci efektivního množství prostředku podle nároku 66.
73. Způsob prevence nebo léčby rostlin, kořenů nebo ovoce proti houbové infekci vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci efektivního množství prostředku podle nároku
67.
74. Způsob prevence nebo léčby rostlin, kořenů nebo ovoce proti houbové infekci vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci efektivního množství prostředku podle nároku
68.
75. Způsob prevence nebo léčby rostlin, kořenů nebo ovoce proti houbové infekci vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci efektivního množství prostředku podle nároku
69.
76. Způsob prevence nebo léčby rostlin, kořenů nebo ovoce proti houbové infekci vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci efektivního množství prostředku podle nároku
70.
77. Způsob prevence nebo léčby rostlin, kořenů nebo ovoce proti houbové infekci vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci efektivního množství prostředku podle nároku
71.
78. Supematant vyznačující se tím, že je sebraný z kultury podle nároku 66.
79. Prostředek vyznačuj ící se tím, že obsahuje supematant podle nároku 78 a nosič.
80. Prostředek podle nároku 79, vyznačující se tím, že má formu rozpustného prášku, granulí, vodné suspense, emulgovaného koncentrátu nebo mikrokapslí.
81. Prostředek podle nároku 66 vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden chemický nebo biologický pesticid.
♦ ·♦ · ♦ ·· ·* · ·· · «·♦♦···· • · ······ • · · ····♦· · • · »··*·* ·«« 9 ··· <· ·* ···
82. Prostředek podle nároku 79 vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden chemický nebo biologický pesticid.
83. Prostředek podle nároku 81, vyznačující se tím, že má formu rozpustného prášku, granulí, vodné suspense, emulgovaného koncentrátu nebo mikrokapslí.
84. Prostředek podle nároku 82, vyznačující se tím, že má formu rozpustného prášku, granulí, vodné suspense, emulgovaného koncentrátu nebo mikrokapslí.
85. Způsob prevence nebo léčby rostlin, kořenů nebo ovoce proti houbové infekci vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci efektivního množství prostředku podle nároku 69.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/281,360 US6245551B1 (en) | 1999-03-30 | 1999-03-30 | Strain of Bacillus pumilus for controlling plant diseases caused by fungi |
| US46170099A | 1999-12-14 | 1999-12-14 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20013239A3 true CZ20013239A3 (cs) | 2002-04-17 |
Family
ID=26960852
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20013239A CZ20013239A3 (cs) | 1999-03-30 | 2000-03-21 | Biologicky čistá kultura, prostředek, izolovaný metabolit, supernatant, částečně přečiątěná frakce, ve vodě rozpustná látka, způsob produkce fungicidního supernatantu, způsob částečného přečiątění supernatantu, způsob zvýąení insekticidní aktivity |
Country Status (29)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6635245B1 (cs) |
| EP (1) | EP1165751B1 (cs) |
| JP (2) | JP4584461B2 (cs) |
| KR (1) | KR100736253B1 (cs) |
| CN (1) | CN1351652A (cs) |
| AP (1) | AP2001002275A0 (cs) |
| AT (1) | ATE396252T1 (cs) |
| AU (1) | AU775016B2 (cs) |
| BG (1) | BG105982A (cs) |
| BR (3) | BR122013028999B1 (cs) |
| CA (1) | CA2367775C (cs) |
| CR (1) | CR6455A (cs) |
| CZ (1) | CZ20013239A3 (cs) |
| DE (1) | DE60038958D1 (cs) |
| ES (1) | ES2304947T3 (cs) |
| HK (1) | HK1046932A1 (cs) |
| HR (1) | HRP20010652A2 (cs) |
| HU (1) | HUP0200562A2 (cs) |
| IL (2) | IL145291A0 (cs) |
| IS (1) | IS6070A (cs) |
| MX (1) | MXPA01009695A (cs) |
| NO (1) | NO20014653D0 (cs) |
| NZ (1) | NZ514040A (cs) |
| PL (1) | PL351956A1 (cs) |
| SK (1) | SK13062001A3 (cs) |
| TR (6) | TR200201745T2 (cs) |
| TW (1) | TWI280976B (cs) |
| WO (1) | WO2000058442A1 (cs) |
| YU (1) | YU69401A (cs) |
Families Citing this family (48)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4904122B2 (ja) * | 2006-10-04 | 2012-03-28 | 出光興産株式会社 | 植物残渣を分解・減容する新規バチルス菌株 |
| MX2009007094A (es) | 2007-01-19 | 2009-08-13 | Basf Se | Mezclas fungicidas a partir de 1-metilpirazol-4-ilcarboxanilidas y azolopirimidinilaminas. |
| JP2010539213A (ja) * | 2007-09-20 | 2010-12-16 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | 殺菌性株及び活性成分を含む組み合わせ |
| AU2014203689B2 (en) * | 2007-09-20 | 2016-02-04 | Bayer Cropscience Lp | Combinations comprising a fungicidal strain and an active compound |
| US8329446B2 (en) * | 2008-02-26 | 2012-12-11 | Monaghan Mushrooms Ltd. | Green mold inhibitor |
| AU2009269456B2 (en) * | 2008-07-11 | 2012-07-12 | University Of Yamanashi | Novel microorganism and plant disease control agent using the microorganism |
| EP2179652B1 (de) | 2008-09-10 | 2019-05-08 | ABiTEP GmbH Gesellschaft für AgroBioTechnische Entwicklung und Produktion | Verwendung eines antibakteriellen Mittels zur Behandlung von bakteriellen Infektionen bei Kulturpflanzen |
| ES2719721T3 (es) * | 2009-05-06 | 2019-07-12 | Bayer Cropscience Lp | Un procedimiento para aumentar el rendimiento de cultivo de plantas agrícolas bajo presión por patógenos esencialmente no existente |
| CN101870959B (zh) * | 2010-06-11 | 2012-06-06 | 河北省科学院生物研究所 | 一种枯草芽孢杆菌、其菌剂、以及其制剂在水果保鲜领域的应用 |
| CN101899408B (zh) * | 2010-06-29 | 2012-07-04 | 南京林业大学 | 一种短小芽孢杆菌及其在毒杀松材线虫中的应用 |
| KR20130132555A (ko) | 2010-12-21 | 2013-12-04 | 바이엘 크롭사이언스 엘피 | 바실루스의 샌드페이퍼 돌연변이체 및 식물 성장을 향상시키고 식물 건강을 촉진하고 질병 및 해충을 방제하기 위한 그의 사용 방법 |
| CN102250793B (zh) * | 2011-06-20 | 2013-09-25 | 中国农业科学院烟草研究所 | 一株具有防霉作用的短小芽孢杆菌 |
| CN102524303A (zh) * | 2011-08-31 | 2012-07-04 | 南京农业大学 | 防治棉花枯黄萎病的合剂 |
| CN102428964B (zh) * | 2011-09-26 | 2013-06-19 | 南京农业大学 | 一种防治黄瓜霜霉病的生防复合菌剂cb28合剂 |
| CN104010511A (zh) * | 2011-11-04 | 2014-08-27 | 拜尔作物科学有限合伙公司 | 线虫的生物控制 |
| CN102415414B (zh) * | 2011-12-13 | 2013-12-18 | 浙江大学 | 短小芽孢杆菌在防治兰花茎腐病中的应用 |
| AR091195A1 (es) | 2012-05-30 | 2015-01-21 | Bayer Cropscience Ag | Composicion que comprende un agente de control biologico y un fungicida |
| BR112014029120A2 (pt) | 2012-05-30 | 2017-06-27 | Bayer Cropscience Ag | composição compreendendo um agente de controle biológico e um fungicida |
| CN104883888B (zh) * | 2012-05-30 | 2017-11-24 | 拜尔农作物科学股份公司 | 包含生物防治剂和杀虫剂的组合物 |
| CN104363758B (zh) | 2012-05-30 | 2017-02-08 | 拜耳作物科学公司 | 包含生物防治剂和杀虫剂的组合物 |
| US9596860B2 (en) | 2012-05-30 | 2017-03-21 | Bayer Cropscience Ag | Composition comprising a biological control agent and a fungicide selected from inhibitors of the mitosis and cell division or compounds having a multi-site action |
| AR091200A1 (es) | 2012-05-30 | 2015-01-21 | Bayer Cropscience Ag | Composicion que comprende un agente de control biologico y un fungicida |
| CN104507318B (zh) | 2012-05-30 | 2018-12-25 | 拜尔农作物科学股份公司 | 包括生物防治剂和来自呼吸链复合体iii抑制剂的杀真菌剂的组合物 |
| CN108669088A (zh) | 2012-05-30 | 2018-10-19 | 拜耳作物科学股份公司 | 包含生物防治剂和选自细胞壁合成抑制剂的杀真菌剂的组合物 |
| TR201808095T4 (tr) | 2012-05-30 | 2018-06-21 | Bayer Cropscience Ag | Bir biyolojik kontrol ajanı ve bir insektisit içeren bileşimler. |
| JP2015519353A (ja) | 2012-05-30 | 2015-07-09 | バイエル・クロップサイエンス・アーゲーＢａｙｅｒ Ｃｒｏｐｓｃｉｅｎｃｅ Ａｇ | 生物的防除剤及び殺虫剤を含んでいる組成物 |
| CN104507310B (zh) | 2012-05-30 | 2018-04-13 | 拜尔农作物科学股份公司 | 包括生物防治剂和杀昆虫剂的组合物 |
| EP2854551A1 (en) | 2012-05-30 | 2015-04-08 | Bayer Cropscience AG | Compositions comprising a biological control agent and a fungicide from the group consisting of inhibitors of the respiratory chain at complex i or ii. |
| MX2015005322A (es) | 2012-11-15 | 2015-07-14 | Basf Corp | Composiciones de acolchado y tierra para macetas que contienen microorganismos y metodos relacionados. |
| BR112015011709A2 (pt) | 2012-11-29 | 2017-07-11 | Bayer Cropscience Lp | métodos de controlar patógenos fúngicos usando fungicidas de polieno |
| CN103103155B (zh) * | 2013-02-05 | 2014-10-29 | 中国农业大学 | 一株短小芽孢杆菌及其在防治小麦禾谷孢囊线虫病中的应用 |
| MX2015010304A (es) | 2013-02-11 | 2015-11-18 | Bayer Cropscience Lp | Composiciones que comprenden un agente de control biologico y un insecticida. |
| AU2014214705A1 (en) | 2013-02-11 | 2015-08-06 | Bayer Cropscience Lp | Compositions comprising a streptomyces-based biological control agent and another biological control agent |
| MX2015016399A (es) * | 2013-05-31 | 2016-03-16 | Novozymes Bioag As | Composiciones y metodos para mejorar la germinacion. |
| US9485994B2 (en) | 2013-11-08 | 2016-11-08 | The Regents Of The University Of California | Synergy-based biocontrol of plant pathogens |
| EP2865265A1 (en) | 2014-02-13 | 2015-04-29 | Bayer CropScience AG | Active compound combinations comprising phenylamidine compounds and biological control agents |
| EP2865267A1 (en) | 2014-02-13 | 2015-04-29 | Bayer CropScience AG | Active compound combinations comprising phenylamidine compounds and biological control agents |
| WO2015160618A1 (en) | 2014-04-16 | 2015-10-22 | Bayer Cropscience Lp | Compositions comprising ningnanmycin and a biological control agent |
| US9826743B2 (en) | 2014-09-17 | 2017-11-28 | Bayer Cropscience Lp | Compositions comprising recombinant bacillus cells and another biological control agent |
| PL3240403T3 (pl) | 2014-12-29 | 2020-03-31 | Fmc Corporation | Kompozycje mikrobiologiczne i sposoby zastosowania w celu sprzyjania wzrostowi roślin i leczeniu chorób roślin |
| CN104789509B (zh) * | 2015-04-30 | 2018-01-12 | 安徽农业大学 | 一株杜仲内生短小芽孢杆菌及其应用 |
| JP2017095397A (ja) * | 2015-11-24 | 2017-06-01 | 朝日工業株式会社 | 植物病害防除剤この発明は、微生物資材を利用している植物病害防除剤に関する。特に、イネ（稲）の重要病害であるイネいもち病の発生を抑制、防除する植物病害防除剤、植物病害防除方法に関する。 |
| EP3205208A1 (en) | 2016-02-09 | 2017-08-16 | Basf Se | Mixtures and compositions comprising paenibacillus strains or fusaricidins and chemical pesticides |
| EP3205209A1 (en) | 2016-02-09 | 2017-08-16 | Basf Se | Mixtures and compositions comprising paenibacillus strains or metabolites thereof and other biopesticides |
| PE20211635A1 (es) * | 2018-07-17 | 2021-08-24 | Bayer Sas | Metodos biologicos para controlar hongos fitopatogenicos |
| AU2019345125A1 (en) * | 2018-09-21 | 2021-03-18 | Novonesis Plant Biosolutions A/S | Pesticidal combinations of Yersinia and Bacillus |
| CN110577904B (zh) * | 2019-07-22 | 2021-05-11 | 新疆农业大学 | 一株短小芽孢杆菌及其在制备葡萄灰霉病杀菌剂中的应用 |
| WO2022254622A1 (ja) | 2021-06-02 | 2022-12-08 | 株式会社エス・ディー・エス バイオテック | 農園芸用殺虫組成物及び農園芸害虫の防除方法 |
Family Cites Families (50)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE293482C (cs) | ||||
| US4250170A (en) | 1979-06-11 | 1981-02-10 | Bristol-Myers Company | Antibacterial agents Bu-2349A and B and method of using same |
| US4467036A (en) | 1981-11-12 | 1984-08-21 | The Board Of Regents Of The University Of Washington | Bacillus thuringiensis crystal protein in Escherichia coli |
| US4448885A (en) | 1981-04-27 | 1984-05-15 | Board Of The Regents Of The University Of Washington | Bacillus thuringiensis crystal protein in Escherichia coli |
| US5047239A (en) | 1984-05-01 | 1991-09-10 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Biological control of fruit rot |
| GB8425487D0 (en) | 1984-10-09 | 1984-11-14 | Agricultural Genetics Co | Strain of bacillus thuringiensis |
| US4797276A (en) | 1985-03-22 | 1989-01-10 | Mycogen Corporation | Control of cotton boll weevil, alfalfa weevil, and corn rootworm via contact with a strain of Bacillus thuringiensis |
| US4918006A (en) | 1985-07-01 | 1990-04-17 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Gene coding for insecticidal crystal protein |
| US4853331A (en) | 1985-08-16 | 1989-08-01 | Mycogen Corporation | Cloning and expression of Bacillus thuringiensis toxin gene toxic to beetles of the order Coleoptera |
| US5049379A (en) | 1987-07-27 | 1991-09-17 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Fungicidal toxin and method and inoculum for controlling root rot and damping off |
| GB8701234D0 (en) | 1987-01-21 | 1987-02-25 | Agricultural Genetics Co | Strain of microorganism |
| US5196342A (en) | 1987-04-16 | 1993-03-23 | Prutech R&D Partnership Ii | Bacillus thuringiensis P-2 toxin gene |
| US5073632A (en) | 1987-04-16 | 1991-12-17 | Ecogen Inc. | CryIIB crystal protein gene from Bacillus thuringiensis |
| US5024837A (en) | 1987-05-06 | 1991-06-18 | Donovan William P | Coleopteran active microorganisms, related insecticide compositions and methods for their production and use |
| US5080897A (en) | 1987-05-08 | 1992-01-14 | Ecogen Inc. | Novel bacillus thuringiensis strains, and related insecticidal compositions |
| US4948734A (en) | 1987-08-12 | 1990-08-14 | Mycogen Corporation | Novel isolates of bacillus thuringiensis having activity against nematodes |
| US5151363A (en) | 1990-07-27 | 1992-09-29 | Mycogen Corporation | Isolates of Bacillus thuringiensis that are active against nematodes |
| US4849217A (en) | 1987-11-19 | 1989-07-18 | Mycogen Corporation | Novel isolates of bacilus thuringiensis having activity against the alfalfa weevil, hypera brunneipennis |
| US5128130A (en) | 1988-01-22 | 1992-07-07 | Mycogen Corporation | Hybrid Bacillus thuringiensis gene, plasmid and transformed Pseudomonas fluorescens |
| US4999192A (en) | 1988-02-12 | 1991-03-12 | Mycogen Corporation | Novel coleopteran-active bacillus thuringiensis isolate |
| US4966765A (en) | 1988-02-23 | 1990-10-30 | Mycogen Corporation | Novel coleopteran-active Bacillus thuringiensis isolate |
| US5055294A (en) | 1988-03-03 | 1991-10-08 | Mycogen Corporation | Chimeric bacillus thuringiensis crystal protein gene comprising hd-73 and berliner 1715 toxin genes, transformed and expressed in pseudomonas fluorescens |
| US4996155A (en) | 1988-03-04 | 1991-02-26 | Mycogen Corporation | Bacillus thuringiensis gene encoding a coleopteran-active toxin |
| GB8805394D0 (en) | 1988-03-07 | 1988-04-07 | Agricultural Genetics Co | Antibiotic |
| US5106620A (en) | 1988-06-10 | 1992-04-21 | Mycogen Corporation | Use of a Bacillus thuringiensis microbe for controlling lesser mealworm, Alphitobius diaperinus |
| US4990332A (en) | 1988-10-25 | 1991-02-05 | Mycogen Corporation | Novel lepidopteran-active Bacillus thuringiensis isolate |
| US5045469A (en) | 1988-10-27 | 1991-09-03 | Mycogen Corporation | Novel bacillus thuringiensis isolate denoted B. T. PS81F, active against lepidopteran pests, and a gene encoding a lepidopteran-active toxin |
| US5135867A (en) | 1988-11-01 | 1992-08-04 | Mycogen Corporation | Gene encoding a lepidopteran-active toxin from Bacillus thuringiensis isolate denoted B.t. .PS81GG active against lepidopteran pests |
| US5147640A (en) | 1988-11-07 | 1992-09-15 | Ecogen Inc. | Strains of bacillus thuringiensis insecticidal compositions containing the same |
| US5164180A (en) | 1989-05-18 | 1992-11-17 | Mycogen Corporation | Bacillus thuringiensis isolates active against lepidopteran pests |
| US5126133A (en) | 1989-06-27 | 1992-06-30 | Mycogen Corporation | Bacillus thuringiensis isolate active against lepidopteran pests, and genes encoding novel lepidopteran-active toxins |
| US5173409A (en) | 1989-12-08 | 1992-12-22 | Ecogen Inc. | Recovery of bt endotoxin protein from lysed cell mixtures |
| CA2035738C (en) | 1990-02-07 | 2001-04-24 | Zongling Liu | Biological agent for control of crop fungal disease |
| US5187091A (en) | 1990-03-20 | 1993-02-16 | Ecogen Inc. | Bacillus thuringiensis cryiiic gene encoding toxic to coleopteran insects |
| DD293482A5 (de) * | 1990-03-21 | 1991-09-05 | Adl Institut Fuer Kartoffelforschung,De | Verfahren zur bekaempfung von rhizoctonia solani kuehn an kartoffelpflanzen mit bacillen |
| SU1817875A3 (ru) | 1990-08-09 | 1995-05-20 | Институт молекулярной генетики РАН | Штамм бактерий bacillus pumilus для получения препарата против фитопатогенных микроорганизмов |
| US5093119A (en) | 1990-09-11 | 1992-03-03 | Mycogen Corporation | Use of a Bacillus thuringiensis microbe for controlling lesser mealworm, Alphitobius diaperinus |
| US5208017A (en) | 1991-02-21 | 1993-05-04 | Mycogen Corporation | Biologically active Bacillus thuringiensis isolates |
| US5186934A (en) | 1991-02-21 | 1993-02-16 | Mycogen Corporation | Bacillus thuringiensis gene encoding a coleopteran-active toxin |
| US5211946A (en) | 1991-09-13 | 1993-05-18 | Mycogen Corporation | Bacillus thuringiensis isolates for controlling acarides |
| US5185148A (en) | 1991-12-16 | 1993-02-09 | Mycogen Corporation | Process for controlling scarab pests with Bacillus thuringiensis isolates |
| GB9206645D0 (en) | 1992-03-26 | 1992-05-06 | Mini Agriculture & Fisheries | Biological control of post harvest pests |
| US5849870A (en) | 1993-03-25 | 1998-12-15 | Novartis Finance Corporation | Pesticidal proteins and strains |
| US5702703A (en) | 1994-11-16 | 1997-12-30 | Mycogen Corporation | Bacillus thuringiensis toxin enhancer |
| ZA963323B (en) | 1995-06-06 | 1997-01-08 | Abbott Lab | Methods for producing a potentiator of bacillus pesticidal activity |
| US5869042A (en) * | 1996-11-22 | 1999-02-09 | Agraquest, Inc. | Methods for controlling above-ground plant diseases using antibiotic-producing bacillus sp. ATCC 55608 or 55609 |
| IL132533A0 (en) * | 1997-05-09 | 2001-03-19 | Agraquest Inc | A novel strain of bacillus for controlling plant diseases and corn rootworm |
| US6103228A (en) * | 1997-05-09 | 2000-08-15 | Agraquest, Inc. | Compositions and methods for controlling plant pests |
| US6001637A (en) * | 1997-08-22 | 1999-12-14 | Agraquest, Inc. | Bacillus pumilus strain for controlling corn rootworm, nematode and armyworm infestations |
| US6245551B1 (en) * | 1999-03-30 | 2001-06-12 | Agraquest, Inc. | Strain of Bacillus pumilus for controlling plant diseases caused by fungi |
-
2000
- 2000-03-21 AU AU37657/00A patent/AU775016B2/en not_active Expired
- 2000-03-21 YU YU69401A patent/YU69401A/sh unknown
- 2000-03-21 US US09/532,021 patent/US6635245B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-21 PL PL00351956A patent/PL351956A1/xx unknown
- 2000-03-21 ES ES00916569T patent/ES2304947T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-21 SK SK1306-2001A patent/SK13062001A3/sk unknown
- 2000-03-21 TR TR2002/01745T patent/TR200201745T2/xx unknown
- 2000-03-21 TR TR2002/01742T patent/TR200201742T2/xx unknown
- 2000-03-21 AT AT00916569T patent/ATE396252T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-03-21 CN CN00805849A patent/CN1351652A/zh active Pending
- 2000-03-21 NZ NZ514040A patent/NZ514040A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-03-21 CZ CZ20013239A patent/CZ20013239A3/cs unknown
- 2000-03-21 WO PCT/US2000/007454 patent/WO2000058442A1/en active IP Right Grant
- 2000-03-21 HR HR20010652A patent/HRP20010652A2/hr not_active Application Discontinuation
- 2000-03-21 DE DE60038958T patent/DE60038958D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-21 BR BR122013028999A patent/BR122013028999B1/pt active IP Right Grant
- 2000-03-21 TR TR2002/01744T patent/TR200201744T2/xx unknown
- 2000-03-21 MX MXPA01009695A patent/MXPA01009695A/es active IP Right Grant
- 2000-03-21 JP JP2000608723A patent/JP4584461B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-21 TR TR2001/02809T patent/TR200102809T2/xx unknown
- 2000-03-21 TR TR2002/01746T patent/TR200201746T2/xx unknown
- 2000-03-21 HU HU0200562A patent/HUP0200562A2/hu unknown
- 2000-03-21 AP APAP/P/2001/002275A patent/AP2001002275A0/en unknown
- 2000-03-21 EP EP00916569A patent/EP1165751B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-21 BR BRPI0009430-7A patent/BR0009430B1/pt active IP Right Grant
- 2000-03-21 BR BRPI0017570-6A patent/BR0017570B1/pt active IP Right Grant
- 2000-03-21 KR KR1020017012574A patent/KR100736253B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2000-03-21 HK HK02108538.0A patent/HK1046932A1/zh unknown
- 2000-03-21 TR TR2002/01743T patent/TR200201743T2/xx unknown
- 2000-03-21 CA CA2367775A patent/CA2367775C/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-21 IL IL14529100A patent/IL145291A0/xx active IP Right Grant
- 2000-03-30 TW TW089105930A patent/TWI280976B/zh not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-09-05 IL IL145291A patent/IL145291A/en not_active IP Right Cessation
- 2001-09-07 CR CR6455A patent/CR6455A/es unknown
- 2001-09-07 IS IS6070A patent/IS6070A/is unknown
- 2001-09-25 NO NO20014653A patent/NO20014653D0/no unknown
- 2001-10-05 BG BG105982A patent/BG105982A/bg unknown
-
2010
- 2010-05-24 JP JP2010118742A patent/JP2010200765A/ja not_active Withdrawn
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6635245B1 (en) | Strain of bacillus for controlling plant diseases | |
| US6586231B2 (en) | Strain of bacillus for controlling plant diseases | |
| JP3471815B2 (ja) | 植物疾病およびコーンルートワームを制御するためのＢａｃｉｌｌｕｓの新規な株 | |
| CA1266824A (en) | Bacillus thuringienis toxin toxic to the cotton boll weevil, alfalfa weevil, and corn rootworm | |
| MXPA99010078A (es) | Cepa novedosa de bacillus para controlar enfermedades de plantas y gusano de raiz de maiz | |
| MXPA01004814A (es) | Composiciones y metodos para controlar plagas de plantas | |
| CA2216794C (en) | Use of streptomyces bacteria to control plant pathogens and degrade turf thatch | |
| CN110506636A (zh) | 用于提高作物产量和防虫害的真菌内生菌 | |
| AU5449898A (en) | A novel strain of Bacillus for controlling plant disease | |
| KR101249283B1 (ko) | 살충 활성이 있는 바실러스 투린지엔시스 아종 쿠르스타키 ｋｂ100 균주 및 이의 용도 | |
| KR101956833B1 (ko) | 리시니바실러스 스패리쿠스 ｔｃ1 균주 및 이를 이용한 식물병 방제 방법 |