CN101899408B - 一种短小芽孢杆菌及其在毒杀松材线虫中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种短小芽孢杆菌JK-SD001，其分类命名为短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，其保藏编号是：M 209095，保藏日期：2009年5月4日。本发明还公开了上述短小芽孢杆菌在毒杀松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)中的应用。本发明还提供了一种微生物杀线剂，即将JK-SD001接种于培养基中发酵培养经0.22微米孔径滤器过滤所得。本发明的微生物杀线剂对松材线虫(B.xylophilus)具有较高的毒力，且培养条件简单、容易保存，易于工业化生产，具有良好的应用前景。

Description

一种短小芽孢杆菌及其在毒杀松材线虫中的应用

技术领域

本发明属于微生物农药技术领域，尤其涉及一种短小芽孢杆菌及其在毒杀松材线虫中的应用。

背景技术

松材线虫病是由松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus(Steiner et Buhier)Nickle)引起的导致树木迅速死亡的一种特大毁灭性病害，属国际重要检疫对象，被列为森林病虫害之首。我国于1982年在南京中山陵的黑松(Pinus thunbergii)上首次发现松材线虫，在短短20多年时间里，疫区范围不断扩大。目前，已扩散蔓延至江苏、浙江、安徽、福建、江西、山东、湖北、湖南、广东、广西、重庆、四川、贵州、云南等14个省(自治区、直辖市)的192个县级行政区，674个乡镇，累计致死松树5亿多株，毁灭松林500多万亩，造成经济损失数千亿元(国家林业局，2009)。松材线虫病不仅影响林业生产，而且给园林绿化、旅游事业及人民群众生活等方面带来不可估量的损失，防治该病害成为当前国内外研究的热点和难点。当前，疫情扩散蔓延的形势仍然十分严峻。

目前，对松材线虫病的防治多采用化学防治，但化学药剂因存在毒性大、对环境污染等问题在应用中逐渐受到限制。例如曾广泛应用的化学杀线剂丰索磷、灭线磷等因为致畸、致癌以及引起精子减少等原因而被禁用，胺线磷、丁环硫磷等已停止开发。现有的大多数化学药剂品种也存在着成本高、防效不理想、产生药害和抗药性等问题，使松材线虫的防治工作面临很大的困境。为此，许多国家的科学家都在努力寻找防治植物线虫的新途径。开发高效低毒杀线剂和生物杀线剂已经迫在眉睫。目前，利用资源丰富的有益微生物防治植物线虫成为了发展生物杀线剂的重要途径。

芽孢杆菌在自然界分布非常广泛，生理特性丰富多样，是土壤和植物微生态优势种群之一。它们可以产生丰富的具有潜在植物病害防治和医学应用价值的抗菌物质，是植物病害生防微生物的重要组成部分(Tamenhiro，2002；蒙显英，2004)。芽孢杆菌内生芽孢，繁殖能力强，有利于工业生产，是自然界中广泛存在的非致病细菌，对人无害，不污染环境。目前，已经报道的对植物线虫有防治作用的芽孢杆菌有4个种，杀线虫芽孢杆菌(Bacillus nematocida)、侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporas)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)(Huang等，2005；Smirnova等，1997；We等，2003)。Mari等(1996)研究发现短小芽孢杆菌(B.pumilus)对某些真菌具有拮抗作用，是一种有开发前途的生防菌。目前国外主要将短小芽孢杆菌应用于防治蔬菜的根部病害，Akhtar等(2008)报道短小芽孢杆菌用于防治鹰嘴豆根腐病有很好的效果；近年来，我国也有用短小芽孢杆菌防治番茄灰霉病、黄瓜菌核病菌等植物病害的报道(李桂霞等，2009；于婷等，2009)。目前，国内外未见短小芽孢杆菌在防治植物线虫方面的报道。本发明通过研究测定短小芽孢杆菌无菌发酵滤液的杀线活性、高效产杀线物质发酵条件的筛选，以期制备出高效的杀线剂，这对植物线虫病害的生物防治具有重要的理论指导意义和实践应用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种高效毒杀松材线虫的短小芽孢杆菌。

本发明还要解决的一个技术问题是提供上述短小芽孢杆菌的用途。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

高效防治植物线虫的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)JK-SD001，是一种从杨树干部分离筛选获得的对松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)具有毒杀作用的细菌菌株，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏号M 209095。

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)JK-SD001在牛肉膏蛋白胨培养基平板上菌落较大，淡黄色，直径一般5～6mm，圆形，边缘整齐，中间有褶皱，光滑湿润，菌体直杆状，大小为1×(1.5～2.3)μm，周生鞭毛，芽孢椭圆形，中生。革兰氏染色表现为阳性；淀粉水解阴性；好氧；氧化酶反应为阴性；过氧化氢酶反应阳性。测得16SrDNA大部分序列1443bp，具体如SEQ ID No：1所示。16SrDNA基因序列已提交GenBank，登记号GQ169781。将所测16SrDNA序列通过BLAST比对，能在GenBank中找到同源性非常高的相近菌株序列。与JK-SD001菌株相似性最高的是Bacillus pumilus，同源性达到99％。构建进化树发现，JK-SD001与Bacillus pumilus同属一个遗传分枝，亲缘关系十分接近。

Biolog公司根据细菌代谢的氧化-还原过程，于1989年推出了用于细菌鉴定的Biolog自动鉴定系统。该系统利用细菌对95种碳源的代谢情况来鉴定菌种，即每种细菌形成各自特有的代谢指纹图谱，选用四唑紫作为细菌能否利用供试碳源的指示剂。与传统方法相比，Biolog系统具有自动化和标准化程度高、结果快速准确和操作简便等优点。Biolog细菌鉴定系统已广泛应用于细菌快速鉴定。通过Biolog系统对JK-SD001进行鉴定，该菌株在鉴定板培养16～24h时的读数相似值(SIM值)为0.579，大于0.50，符合Biolog系统关于理想结果的要求，而且鉴定结果的相似性(PROB)都为99％，因此该菌株利用Biolog系统，准确鉴定到了种，为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。

上述短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)JK-SD001发酵产物对松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)具有毒杀作用，因此能够高效防治由松材线虫引起的松材线虫病。

上述短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)JK-SD001产生杀线物质最多的最佳发酵条件如下：

(1)培养基：每1000mL蒸馏水，含牛肉膏3～5g，蛋白胨10～15g，pH 7.2～7.4。

(2)工艺条件为：pH7.2～7.4，接种量为2％(v/v)、温度为35～38℃、转速为100～200r/min，无光照下震荡培养90～100小时。

通过上述发酵工艺得到的发酵液经微孔过滤得到的无菌滤液即为一种高毒的微生物杀线剂。

该杀线剂直接接触松材线虫即可发挥其杀线作用。

有益效果：

(1)短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)JK-SD001对松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)毒杀效果显著，而且无污染，对环境友好，对植物线虫的防治具有重要意义。

(2)短小芽孢杆菌JK-SD001培养条件简单、容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。

附图说明

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)JK-SD001，已保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)；地址：武汉武汉大学；邮编：430072；登记入册的编号：CCTCCNO：M 209095；保藏日期：2009年5月4日。

图1为短小芽孢杆菌JK-SD001无菌发酵滤液对松材线虫的毒杀作用虫体形态图。其中，A～G：松材线虫经拮抗细菌JK-SD001无菌发酵液处理后的形态(A～B：虫体体腔内组织溢缩凝结；C～D：虫体在溢缩处断裂；E～F：虫体出现膨大部位向外凸起；G：虫体体壁破裂，整个虫体消解)

图2为人工皮接法。

具体实施方式

根据下述实施例，可以使本领域的技术人员更好地理解本发明。实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：

试管种培养：培养基配方为：每1000mL蒸馏水，含牛肉膏3g，蛋白胨10g，琼脂15g，pH7.2～7.4，将短小芽孢杆菌JK-SD001接种到该培养基上，25℃～38℃下培养24h，获得试管种；

微生物杀线剂的制备：液体培养基配方为：每1000mL蒸馏水，含牛肉膏3g，蛋白胨10g，pH7.2～7.4，将短小芽孢杆菌JK-SD001试管种接种到50mL液体培养基上，25℃和无光照条件下以120r/min转速震荡培养24h，获得液体种；将液体种接种到装液比为1∶2的液体培养基中，接种量2％(v/v)、37℃、120r/min，无光照下震荡发酵96小时。将发酵液过0.22微米孔径滤器得到的无菌滤液。

实施例2：

按实施例1的方法制备出液体种，将液体种接种到装液比为1∶2的液体培养基中，接种量3％(v/v)、35℃、100r/min，无光照下震荡发酵90小时。将发酵液过0.22微米孔径滤器得到的无菌滤液。

实施例3：

按实施例1的方法制备出液体种，将液体种接种到装液比为1∶2的液体培养基中，接种量5％(v/v)、38℃、200r/min，无光照下震荡发酵100小时。将发酵液过0.22微米孔径滤器得到的无菌滤液。

实施例4：短小芽孢杆菌JK-SD001无菌发酵滤液对松材线虫的毒杀作用。

供试松材线虫的培养与制备：供试松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)由江苏省有害生物预防与控制重点实验室从安徽发病黑松上分离得到并保存(编号AN19)。培养前先接种灰葡萄孢(Botrytis cinerca)于PDA平板上(25℃)，待菌丝长满平板后再接入松材线虫，放置25℃培养箱中继续培养至灰葡萄孢菌丝消失，线虫长满平板。使用时采用贝尔曼漏斗法分离线虫，并配成约20条/μL的线虫悬液。

药效测定方法：将实施例1制备的1mLJK-SD001无菌发酵液分别稀释2倍、4倍和10倍，取1mL不同稀释倍数的无菌发酵液注入1.5mL小离心管中注入到1.5mL小离心管中，再注入100μL约含2000条松材线虫的线虫悬液。混合后置于25℃下，分别于处理后24h、48h和72h吸取混合液在显微镜下观察并统计线虫死亡率，计算出校正死亡率。每个处理3个重复，以不接菌的液体培养基和清水处理作对照。统计线虫死亡率时，摇匀小离心管后用移液枪吸取50μL含有线虫的混合液于载玻片上，由于线虫有假死现象，所以不断滴加清水于载玻片上，以保证线虫有水润湿并刺激假死线虫复苏，4h后线虫仍僵直不动的记录为死亡。

结果(表1)表明：松材线虫经短小芽孢杆菌JK-SD001无菌发酵滤液原液及稀释2倍、4倍和10倍液处理后，死亡率为100％，虫体消解率为100％，说明其具有高毒杀松材线虫的活性。

表1短小芽孢杆菌JK-SD001无菌发酵滤液对松材线虫的毒杀活性

实施例5：短小芽孢杆菌JK-SD001的无菌发酵滤液对松材线虫卵的影响。

采用贝尔曼漏斗法收集松材线虫，挑取一定数量的雌、雄成虫于小培养皿中，加适量清水，放置在25℃恒温培养箱中培养。待线虫产出大量卵时，将培养皿中线虫挑出，并用清水反复冲洗培养皿，因为虫卵可以黏附在培养皿底面，在冲洗线虫时仍可保留在培养皿底部。在显微镜下镜检，确保培养皿中无线虫存在后，取2mL实施例1制备的无菌滤液原液加入到小培养皿中，放置在25℃恒温培养箱中保湿培养，以清水处理为对照，每个处理3个重复。分别在处理24h、48h、72h和96h时，在倒置显微镜下观察卵的孵化情况，并统计孵化率。

表2短小芽孢杆菌JK-SD001无菌发酵液对松材线虫卵孵化率的影响

结果(表2)表明：经JK-SD001无菌发酵滤液处理24h、48h、72h和96h时的卵均未孵化，在高倍显微镜下可以观察到其中部分卵已发育到二龄幼虫期，但未冲破卵壳，而对照清水处理卵孵化率为90％。说明无菌发酵液在一定程度上抑制了松材线虫卵的胚胎发育过程。

实施例6：短小芽孢杆菌JK-SD001的无菌发酵滤液在黑松盆栽苗上的防效测定。

以温室内长势基本一致的3.5年生黑松盆栽苗为试验材料，采用人工皮接法(图2)，用消毒解剖刀在松树偏下的茎干上割开树皮，深及木质部，掀开树皮塞入大小合适的棉球，并用封口膜将其包裹好，用微量进样器分别吸取实施例1制备的无菌滤液原液和2倍稀释液各5mL并分别注入漏斗中，经过一天吸收后在黑松茎干的偏下部做一个与上部一样的漏斗，用微量进样器注入松材线虫悬液，加样量为5000条/株，接入线虫后每两天在上部的漏斗中补加5mL无菌发酵液，共补加三次。以接无菌水的为对照，每个处理5个重复。在接入线虫后第3天开始每天调查各处理松苗的发病情况，根据其发病情况统计发病级值，计算出各处理当天的感病指数、感病率。

通过连续观察发现，对照组在接种后第4天发病，而滴加无菌发酵液原液和2倍稀释液的的处理组分别在接种后第11天和第15天才发病，处理组的松苗发病迟于对照，而且症状发展缓慢，尤其是滴加2倍稀释液处理组的松苗表现更加明显，出现症状后约15天左右才褐变死亡，而对照组松苗感病后4-5天就迅速褐变死亡。观察中还发现，在接种后第17天，滴加无菌发酵液原液的松苗感病率为100％时，滴加2倍稀释液的松苗感病率为60％，显著低于前者。可见通过滴加无菌发酵液在一定程度上可以提高松苗对松材线虫的抗性，无菌发酵液原液和2倍稀释液相比，2倍稀释液更有利于提高松苗的抗性。

核苷酸或氨基酸序列表

<110>南京林业大学

<120>一种短小芽孢杆菌及其在毒杀松材线虫中的应用

<130>njfu100624

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1443

<212>DNA

<213>短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)

<400>1

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tcc                                                                  1443

Claims (3)

1.一种短小芽孢杆菌JK-SD001，其分类学命名为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号是：CCTCC No：M 209095，保藏日期是：2009年5月4日。

2.权利要求1所述的短小芽孢杆菌在毒杀松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)中的应用。

3.一种微生物杀线剂，其特征在于该杀线剂按如下方法制备：将短小芽孢杆菌JK-SD001接种于培养基中，接种量为2～5％(v/v)、温度为35～38℃、转速为100～200r/min，无光照下震荡培养90～100小时，得到的发酵液经微孔过滤得到无菌滤液即为微生物杀线剂；

其中，所述培养基中，各物质含量如下：每1000mL蒸馏水，含牛肉膏3～5g，蛋白胨10～15g，pH 7.2～7.4。

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