CN101870959B - 一种枯草芽孢杆菌、其菌剂、以及其制剂在水果保鲜领域的应用 - Google Patents
一种枯草芽孢杆菌、其菌剂、以及其制剂在水果保鲜领域的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种应用在水果保鲜领域中的枯草芽孢杆菌，及以此为活性物质的菌剂，本发明涉及的枯草芽孢杆菌命名为Bacillussubstilis J18，现保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No：3665，菌株经过发酵培养后，制成发酵剂，发酵剂分别与氯化钙和壳聚糖溶液混合制成干粉剂和被膜剂，其对梨采后黑斑病同时对梨轮纹病、葡萄灰霉病、西瓜枯萎病等都有显著的防治效果，枯草芽孢杆菌J18是一株对水果和农作物病害有广谱抗性的拮抗菌。
Description
技术领域
本发明涉及一种对采后水果的病菌有抑制作用的具有广谱抗病原真菌活性的枯草芽孢杆菌，及以所述枯草芽孢杆菌为活性菌的菌剂及其制备方法，及菌剂在水果保鲜领域的应用。
背景技术
我国水果采后腐烂损失严重，造成了巨大经济损失，采后病原微生物的侵染是造成采后腐烂损失的最主要原因，在水果保鲜领域，大量使用化学杀菌剂以防止水果腐败，但是在水果保鲜中大量使用化学杀菌剂给水果的食用安全造成了很大的影响，如何减少水果保鲜中化学杀菌剂的使用成为公众十分关注的食品安全问题。
枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis是自然界中广泛的一种非致病细菌，在土壤、植物根际和植物体内存在有大量的枯草芽孢杆菌，据文献报道，这些菌株会对植物病原菌起到抑制作用，或是诱导植物产生抗性，有一些菌株对植物还有促生作用，就是常报道的PGPR(Plant growth promoting rhizobacteria)。由于其具有广谱抗菌活性、极强的抗逆能力、存活时间长、而且对人畜无毒害作用等优点，这就有利于制剂的加工，而且大规模生产工艺简单，成本较低，运输也方便，因此，枯草芽孢杆菌越来越多的被引入植病生防领域，是目前一种较为理想的具有生防功能的微生物。
国内研究现状
河南农科院植保所孔建等从果园中分离到的枯草芽孢杆菌B-903对多种果蔬上的病菌有抑制作用，如番茄早疫病菌、苹果轮纹病菌等。用于植病生防研究的枯草芽孢杆菌还包括防治苹果和梨采后青霉病的枯草芽孢杆菌H110，防治西瓜枯萎病菌的B11，防治桃和油桃褐腐病的菌株B-912，防治苹果霉心病的BL03和XM16等。
国外研究现状
美国Agraquest公司用枯草芽孢杆菌QST713菌株开发出活菌制剂杀菌剂Sernade，并于2000年通过美国环保局(EPA)的登记，QST713叶面施用能防治蔬菜、樱桃、葡萄、葫芦和胡桃的细菌和真菌病害。
发明内容
本发明的目的是提供一种对采后水果的病原菌有抑制作用的具有广谱抗病原真菌活性的枯草芽孢杆菌，以及以所述枯草芽孢杆菌为活性菌的菌剂，及菌剂的应用。
本发明是采用如下技术方案实现的：枯草芽孢杆菌，命名为枯草芽孢杆菌Bacillus substilis J18，保藏单位为中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No：3665。
一种以枯草芽孢杆菌Bacillus substilis J18为活性菌制成的发酵液，其是由如下步骤制成：
(1)制备活化的菌液；
(2)种子培养；
(3)发酵培养：将所述种子培养得到的种子培养液按照接种量为1％～3％加入到发酵培养基中，发酵温度为25℃～30℃，通气量为0.3～0.6m3/h，pH值为6.8～7.2，流加食用豆油消泡，不流加调节pH值的酸碱性物质。
流加培养基：葡萄糖15g，酵母膏10g，食用豆油50mL，水1000mL制成混合液灭菌后一起流加；
流加时间：发酵8h开始流加；
发酵周期：34±2h，得发酵液。
在发酵液中加入防腐剂、表面活性剂、紫外防护剂。
每升发酵液中加入防腐剂为凯松2g，表面活性剂为吐温-20 10g，紫外防护剂为山梨醇5g。
一种以枯草芽孢杆菌Bacillus substilis J18为活性菌制成的干粉剂，其制备方法是，将发酵液离心后去上清液得湿菌体，湿菌体与等重量的氯化钙混合均匀，烘干至粉末状，得到干粉菌剂。
一种以枯草芽孢杆菌Bacillus substilis J18为活性菌制成的被膜剂，其制备方法是，将发酵液离心后去上清液得湿菌体，与壳聚糖溶液复配制成被膜剂。
枯草芽孢杆菌Bacillus substilis J18在水果保鲜领域中的应用。
我们从梨果表面，梨树叶片以及梨果园土壤中分离到一株对梨采后病原菌—黑斑病有显著拮抗效果的一株细菌，我们把它命名为J18。
枯草芽孢杆菌Bacillus substilis J18具有以下性质：
在LB培养基上培养，J18菌落乳白色，无光泽，近圆形，边缘不整齐，菌落隆起，表面粗糙有褶皱。经过革兰氏染色、鞭毛染色、芽孢染色和伴孢晶体染色，结果表明：菌株J18为革兰氏染色阳性芽孢杆菌，芽孢中生，鞭毛周生，没有伴孢晶体形成。J18的菌体大小为0.6×2.7μm。
菌株J18的生理生化鉴定结果显示其为好氧生长；接触酶、明胶水解、淀粉水解、硝酸盐还原、柠檬酸盐利用、葡萄糖产酸和甘露醇产酸等反应阳性；吲哚试验、甲基红反应、H2S产生试验、酪氨酸水解等反应为阴性；最高生长温度55℃，能在10％ NaCl及pH5.7条件下生长，以上特征符合《常见细菌系统鉴定手册》中关于枯草芽孢杆菌的描述。
经过进一步的分子生物学鉴定，J18的16S rDNA与GenBank数据库中的序列进行同源性比较，发现其与枯草芽孢杆菌有99％的同源性。利用DNAMAN将测序结果与同源性相近的菌株进行多重序列比较，并做进化树分析，进一步确定其分类地位。根据细菌分类标准，结合菌株J18形态特征、生理生化特征，将菌株J18鉴定为枯草芽孢杆菌。
氯化钙和具有良好的自发成膜性的壳聚糖处理采后水果不仅能保持梨果较高的硬度和VC含量，降低梨果的呼吸强度和失水率，减少果实的底物消耗，，有效地抑制了果实的衰老，提高梨的贮藏品质。同时能高效抑制病原微生物的繁殖和生长，降低果实病害的发生。因此采用氯化钙和壳聚糖与拮抗菌J18发酵液复配的方式使用。
本发明的有益效果是，枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis J18的发酵剂、干粉剂、被膜剂对梨采后黑斑病有显著的防治效果，同时对梨轮纹病、葡萄灰霉病、西瓜枯萎病、黄瓜镰刀霉、棉花黄萎病、小麦赤霉病、玉米小斑病等都有显著的防治效果，因此，枯草芽孢杆菌J18是一株对水果和农作物病害有广谱抗性的拮抗菌。
具体实施方式
实施例1
一种枯草芽孢杆菌，其特征在于其命名为枯草芽孢杆菌Bacillus substilisJ18，在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏名称为中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No：3665。
J18微生物发酵液的生产方法
(1)种子活化：将枯草芽孢杆菌Bacillus substilis J18菌株从保存的甘油菌转接于LB液体培养基中，于30℃、150～250r/min培养18h。取培养好的菌悬液稀释，均匀涂布到LB固体平板培养基中，25℃培养箱培养48h后，用牙签挑单菌落再次接种于LB液体培养基试管中，30℃、150～250r/min培养过夜，取5mL培养好的菌悬液转接到装有150mL LB液体培养基的500mL三角瓶中置摇床30℃振荡培养，转速为150～250r/min。
所述LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，水1000mL。
(2)种子培养：将活化的菌悬液接种到LB液体培养基中，150～250r/min，30℃摇床培养16h。
(3)发酵培养：使用20L发酵罐进行分批发酵。装料系数0.6，接种量为1％，发酵温度30℃，通气量0.3m3/h，搅拌转速150～250r/min，溶氧(DO)保持在75％，pH值为6.8～7.2，流加食用豆油以消除气泡，不流加调节pH值的酸碱性物质。
发酵培养基配方为：葡萄糖10g，蔗糖30g，蛋白胨30g，酵母浸膏30g，硫酸铵20g，水1000mL。
流加培养基：葡萄糖15g，酵母膏10g，食用豆油50mL，水1000mL制成混合液灭菌后一起流加。
流加时间：发酵8h开始流加；
发酵周期：32h；
得到的发酵液芽孢浓度约为3×109cfu/mL。
在每升发酵液中加入防腐剂凯松2g、表面活性剂吐温-20 10g、紫外防护剂山梨醇10g，得到发酵剂，这样使较低浓度的发酵液最大限度发挥拮抗作用，从而节约成本，并且有利于发酵液在外界环境中保持稳定性。
应用时，发酵剂用水稀释300～1000倍，喷施到果实上。
干粉剂的制备方法：
将用发酵罐发酵培养所得的发酵液12000r/min离心20min，弃上清，菌体加入无菌水悬浮混匀，再12000r/min离心15min，弃上清得湿菌体。湿菌体称重后，称取等重量的氯化钙，氯化钙缓慢加入湿菌体中，边加边搅拌，直至均匀，在真空干燥箱中于50℃烘干30min至粉末状，得到干粉菌剂。每克干粉菌剂有1×1011个芽孢。
应用时，加水稀释至5000～10000倍。
(3)被膜剂：
将用发酵罐发酵培养所得的发酵液12000r/min离心20min，弃上清，菌体加入无菌水悬浮混匀，再12000r/min离心15min，弃上清得湿菌体。湿菌体与浓度为1％的壳聚糖溶液(用醋酸调至pH6.0)复配成浓度为1×107cfu/mL的菌悬液，制成被膜剂。
应用时，被膜剂可喷施或浸果使用。能有效降低了拮抗菌的使用浓度，节约成本。
实施例2
J18微生物发酵液的生产方法
(1)种子活化：将枯草芽孢杆菌Bacillus substilis J18菌株从保存的甘油菌转接于LB液体培养基中，于30℃、150～250r/min培养18h。取培养好的菌悬液稀释，均匀涂布到LB固体平板培养基中，25℃培养箱培养48h后，用牙签挑单菌落再次接种于LB液体培养基试管中，30℃、150～250r/min培养过夜，取5mL培养好的菌悬液转接到装有150mL LB液体培养基的500mL三角瓶中置摇床30℃振荡培养，转速为150～250r/min。
所述LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，水1000mL。
(2)种子培养：将活化的菌悬液接种到LB液体培养基中，150～250r/min，30℃摇床培养16h。
(3)发酵培养：使用20L发酵罐进行分批发酵。装料系数0.6，接种量为3％，发酵温度25℃，通气量0.6m3/h，搅拌转速150～250r/min，溶氧(DO)保持在75％，pH值为6.8～7.2，流加食用豆油以消除气泡，不流加调节pH值的酸碱性物质。
发酵培养基配方为：葡萄糖10g，蔗糖30g，蛋白胨30g，酵母浸膏30g，硫酸铵20g，水1000mL。
流加培养基：葡萄糖15g，酵母膏10g，食用豆油50mL，水1000mL制成混合液灭菌后一起流加。
流加时间：发酵8h开始流加；
发酵周期：36h；
得到的发酵液芽孢浓度约为3×109cfu/mL。
在每升发酵液中加入防腐剂凯松2g、表面活性剂吐温-20 10g、紫外防护剂山梨醇10g，得到发酵剂，这样使较低浓度的发酵液最大限度发挥拮抗作用，从而节约成本，并且有利于发酵液在外界环境中保持稳定性。
应用时，发酵剂用水稀释300～1000倍，喷施到果实上。
干粉剂的制备方法：
将用发酵罐发酵培养所得的发酵液12000r/min离心20min，弃上清，菌体加入无菌水悬浮混匀，再12000r/min离心15min，弃上清得湿菌体。湿菌体称重后，称取等重量的氯化钙，氯化钙缓慢加入湿菌体中，边加边搅拌，直至均匀，在真空干燥箱中于50℃烘干30min至粉末状，得到干粉菌剂。每克干粉菌剂有1×1011个芽孢。
应用时，干粉剂加水稀释至5000～10000倍。
(3)被膜剂：
将用发酵罐发酵培养所得的发酵液12000r/min离心20min，弃上清，菌体加入无菌水悬浮混匀，再12000r/min离心15min，弃上清得湿菌体。湿菌体与浓度为1％的壳聚糖溶液(用醋酸调至pH6.0)复配成浓度为1×107cfu/mL的菌悬液，制成被膜剂。
应用时，被膜剂可喷施或浸果使用。能有效降低了拮抗菌的使用浓度，节约成本。
枯草芽孢杆菌Bacillus substilis J18对梨采后黑斑病的防效：
以实施例1所制的发酵液，采收后的梨果上喷施J18发酵液，常温下放置30天梨果的发病率仅为16.44％；喷施干粉制备的药液后，常温下放置30天梨果的发病率为13.75％；以接种无菌水为对照，梨果的发病率达到89.75％；J18与成膜性良好、具有很好保鲜效果的壳聚糖复配，常温下30天后发病率仅为6.37％，以无任何处理的梨果为对照，常温下30天后梨果的发病率为90.38％。
同时，浓度为1×108cfu/mL的J18菌悬液还有对梨轮纹病、葡萄灰霉病、西瓜枯萎病、黄瓜镰刀霉、棉花黄萎病、小麦赤霉病、玉米小斑病有显著的防治效果。其中对梨轮纹病的防效为81.45％，对葡萄灰霉病的防效为75.9％，对西瓜枯萎病的防效为74.77％，对黄瓜镰刀霉的防效为81.92％，对棉花黄萎病的防效为70.29％，对小麦赤霉病的防效为74.27％，对玉米小斑病的防效为79.1％。
Claims (4)
1.枯草芽孢杆菌(Bacillus substilis)J18，其特征在于其保藏编号为CGMCCNo：3665。
2.一种以权利要求1所述的枯草芽孢杆菌J18为活性菌制成的干粉菌剂，其特征在于其制备方法是：
(1)制备活化的菌液；
(2)种子培养；
(3)发酵培养：将所述种子培养得到的种子培养液按照接种量为1％～3％加入到发酵培养基中，发酵温度为25℃～30℃，通气量为0.3～0.6m3/h，pH值为6.8～7.2，再流加含有食用豆油的流加培养基；
所述发酵培养基为：葡萄糖10g，蔗糖30g，蛋白胨30g，酵母浸膏30g，硫酸铵20g，水1000mL；
所述含有食用豆油的流加培养基为：葡萄糖15g，酵母膏10g，食用豆油50mL，水1000mL制成混合液灭菌后一起流加；
流加时间：发酵8h开始流加；
发酵周期：34±2h，得发酵液；
(4)将步骤(3)中得到的发酵液离心后去上清液得湿菌体，湿菌体与等重量的氯化钙混合均匀，烘干至粉末状，得到干粉菌剂，每克干粉菌剂有1×1011个芽孢。
3.一种以权利要求1所述的枯草芽孢杆菌J18为活性菌制成的被膜剂，其特征在于其制备方法是：
(1)制备活化的菌液；
(2)种子培养；
(3)发酵培养：将所述种子培养得到的种子培养液按照接种量为1％～3％加入到发酵培养基中，发酵温度为25℃～30℃，通气量为0.3～0.6m3/h，pH值为6.8～7.2，再流加含有食用豆油的流加培养基；
所述发酵培养基为：葡萄糖10g，蔗糖30g，蛋白胨30g，酵母浸膏30g，硫酸铵20g，水1000mL；
所述含有食用豆油的流加培养基为：葡萄糖15g，酵母膏10g，食用豆油50mL，水1000mL制成混合液灭菌后一起流加；
流加时间：发酵8h开始流加；
发酵周期：34±2h，得发酵液；
(4)将步骤(3)中得到的发酵液离心后弃上清得湿菌体，湿菌体与用醋酸调节至pH6.0的，浓度为1％的壳聚糖溶液复配成浓度为1×107cfu/mL的菌悬液，制成被膜剂。
4.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌J18在抑制采后水果病原菌方面的应用。
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Owner name: HEBEI YUANDA INTERNATIONAL CHEMICAL FERTILIZER CO. Free format text: FORMER OWNER: BIOLOGICAL INST., HEBEI PROV. ACADEMY OF SCIENCES Effective date: 20130325 Free format text: FORMER OWNER: GENETIC PHYSIOLOGY INSTITUTE,HEBEI ACADEMY OF AGRICULTURE AND FORESTRY SCIENCE Effective date: 20130325 |
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Effective date of registration: 20130325 Address after: 054700, Hebei, Xingtai province Weixian County city south of the armed forces base on the west side, 106 National Road 380 kilometers Patentee after: Hebei Yuanda International Fertilizer Co., Ltd. Address before: 050051 No. 46 friendship south street, Hebei, Shijiazhuang Patentee before: Biological Inst., Hebei Prov. Academy of Sciences Patentee before: Genetic physiology Institute ,Hebei Academy of Agriculture and Forestry Science |
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Owner name: HEBEI GENLIDUO BIOTECHNOLOGY CO., LTD. Free format text: FORMER NAME: HEBEI YUANDA INTERNATIONAL CHEMICAL FERTILIZER CO., LTD. |
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