JPS6031477B2 - Ｄ↓−アミノアシラ−ゼ及びその製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はＤ−アミノアシラーゼ及びその製造方法に関し
、詳しくはフアカルタティブ（ｆａｃｕｌｔａｔｉｖｅ
）．メタノール資化性を有する細菌類の生産するＤーア
ミノアシラーゼ及びその製造法に関するものである。

Ｄーアミノ酸類は天然、半合成８−ラクタム抗性物質（
なかんずくペニシリン類やセフアロスポリン類やべプチ
ド抗生物質の合成原料として極めて重要であるが、自然
界に存在するアミノ酸は大部分がＬ型であるため、化学
合成的に製造され、一般的な化学合成法では所望のアミ
ノ酸がＤＬ−ラセミ混合物として得られるので、最終段
階でＤ型とＬ型に分割する必要がある。

公知のＤＬ型アミノ酸の光学分割法としては、化学的方
法、生物学的方法がある。

例えば化学的方法ではＤＬ−アミノ酸に光学活性な分割
剤を作用させ、生じたジアステレオィソマ−塩の溶解度
の差を利用する方法などが知られているが、これらは一
回の操作による収量が少いため、操作の繰返しが必要で
あったり、又分割剤が高価であるなどの欠点がある。他
方、生物学的方法としては、ＤＬーアミノ酸を無差別的
にＮ−アシル誘導体とし、これにＬーアミノアシラーゼ
、又はＤーアミノァシラーゼを作用させ、酵素反応によ
り選択的にＬ−アミノ酸又はＤーアミノ酸として回収す
る方法が知られている。しかしながら微生物の生産する
Ｄ−アミノアシラーゼに関しては報告が少く、亀出らの
シュードモナス属細菌、鈴木らの放線菌の生産するＤ−
アミノアシラーゼの報告があるのみである。本発明者ら
はＣ，化合物資化性グラム陰性菌中で特にメタンを利用
せず、メタノール或いはメチルァミン類を利用し、さら
にＣ２以上の一部の炭素化合物をも利用できる、いわゆ
るフアカルタティブ（ｆａｃｕｌｔａｔｊｖｅ）．メタ
ノール資化性細菌類の中にＤ−アミノアシラーゼ生産菌
を検索したところ、シユードモナス アミノボランス（
ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｍｌｎｏｖｏｒａｎｓ）ＮＣ
ＩＢ９０３９ シユードモナス スピシーズ（Ｐ．ｓｐ
．）１１５８ 徴工研菌寄第４６３２号及びシュードモ
ナス スピシーズ（Ｐ．ｓｐ．）６１７ 徴工研菌寄第
４６３１号などの菌株がＤ−及びＬ−アミノアシラーゼ
の両者を同時に生産し、またあるものはＬーアミノアシ
ラーゼのみを生産することを見出し、その各々について
単離精製することに成功し、本発明を完成するに至った
。

（なお、亀田らの報告の内ＫＴ８３株はＬーアシラーゼ
画分とＤ−アシラーゼ画分を持っていると思われるが、
単離精製がなされていない。

又菌の記載も不充分であるが、青緑色水漆性色素の産生
からシユードモナス エルギノーザ（Ｐ．ａｅｒｕｇｎ
ｏｅａ）に属する細菌と推察される（薬学雑誌 第７袋
藍、７４８頁 １９５８王）ので本発明の使用微生物と
は明らかに異なる。

）本発明のフアカルタティブ（ｆａｃｕｌｔａｔｉｖｅ
）・メタノール質化性細菌類とは、オブリゲート・メチ
ロ ト ロ フ（０ｂｌｉ鞍に（或 はｓｔｒｉｃｔ
）ｍｅｔｈｙｏｔｒｏｐｈ）（即ちメタンやメタノール
のようなＣ，化合物のみを唯一の炭素原として利用し生
育できる例えばパージエイズ・マニュアル・オブ・テタ
ーミネィティブ・バクテリオロジー第８版（１９７４）
２６７頁）のメチロモナダセェ（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎ
ａｄａｃｅａｅ）科の中のメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌ
ｏｍｏＭｓ）属或は メ チ ロ コッカ ス（Ｍｅｔ
ｈｙＩＭｏｃｃｕｓ）属の各菌種とは異なって、Ｃ．化
合物の内でメタンは資化できないが、メタノールあるい
はメチルアミン類を資化し、その上Ｃ２以上の炭素化合
物の一部のもの、（例えば或る種の礎質、アミノ酸、ア
ルコール、有機酸類の一部）を単一の炭素源、エネルギ
ー源として資化し生育する事が可能で、その殆んどは肉
汁寒天やブレィン・ハート・ィンフュ−ジョン寒天等の
普通の栄養塔地に生育する細菌の総称である。

メタノール資化性細菌の検索は１９６８王頃から現在ま
でＳＣＰ生産や各種アミノ酸類生産を目的として盛んに
研究がなされており、研究報告、特許公報、特許公開公
報に多くを見る事ができる。

本発明者等はＤ−アミノアシラーゼ生産能を有する微生
物の検索に当り、これ等メタノール資化性細菌の保存菌
株を対象に研究を進め本願発明を成しとげる事ができた
。本発明のＤーアミノアシラーゼ生産能を有するフアカ
ルタテイブ（ｆａｃ山ｔａｔｊｖｅ）にメタノールを資
化し得る細菌類の内、代表的な１菌株シュードモナス
アミノボランス（Ｐ．ａｍｌｎｏｖｏｒａｎｓ）ＮＣ
ＩＢ９０３９は、ｄｅｎＤｏｏｒｅｎｄｅＪｏｎｇによ
つて士壌或は水より分離され、この菌株の詳細は同氏に
よって１９２６王、Ｔｈｅｉｓ．Ｔｅｃｈｎｉｓｃｈｅ
Ｈｏｏ繋ｓｃｈｏｏｌＤｅｌｆｔに記載され、英国のＴ
ｏｎＲｅｓｅａｒｃｈＳねｔｊｏｎのザ ナシヨナル
コレクシヨン オブ インダストリアル バクテリア（
Ｔｈｅ ＮａｔｉｏｎａｌＣｏ】ｌｅｃｔｉｏｎｏｆｌ
ｎｄ聡ｔｒｉａｌＢａｃｔｅｒｉａ）にシユードモナス
アミノポラ ンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｍｌ
ｎｏｖｏｒａｎｓ）ＮＣＩＢ ９０３９として保存され
ている。

またパージユイ（技て袋ｙ’ｓ Ｍａｍ雌ｌｏｆＤｅｔ
ｅｒｍｉｎａｔｊｖｅ欧ｃｔｅｒｉｏｌｏ鋤）第８版（
１９７４）の２３刀頁のアデンダム１ （「Ａｄｄｅｎ
ｄａのｔｈｅＧｅｎｕｓＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ」の「
Ａｄｄｅｎｄｕｍｌ」）の中にも記されており、公知菌
種のオーセンティック ストレイン（ａｕ比ｅｎｔｉｃ
ｓｔｒａｉｎ）である。本菌株は周知の如くグラム陰性
の程菌で、肉汁塔地にもよく生育し、Ｃ２以上の一部の
有機化合物も利用できるが、その特徴はＣ，化合物の内
、メタンは資化しないがメタノールを資化できる、いわ
ゆるフアカルタティブ（ねｃｕｌｔａｔｉｖｅ）・メタ
ノール資化性細菌類というべき細菌の中の一菌種である
点である。本菌株のコロニー或は斜面培養、表面生育は
白色〜淡黄色で赤色を呈さず、次に述べる赤色ファカル
タティプメタノール資化性細菌群の菌株とは一見して区
別できる。次に赤色フアカルタティブ（ｆａｃｕｌｔａ
ｔｉｖｅ）・メタノール資化性細菌類とは、グラム陰性
、単極毛で運動する無胞子樟菌で、細胞内に額粒を形成
し、菌体内にカロチノィドを含み、コロニー及び斜面培
養は赤色乃至ピンク色を示し、前記の如くＣ，化合物の
内でメタンは利用できないが、メタ／一ル或はメチルア
ミン類を資化し、その他にＣ２以上の有機化合物の一部
のもの（例えばグリセリン、修酸、ピルピン酸、乳酸、
フマール酸等）を資化し得る細菌群を言う。

本発明者等はこれ等「フアカルタテイブ メタノール資
化性細菌」約３勺珠の内からＤ−アミノアシラーゼ生産
強力菌として１９珠、僅かに生産熊あるもの４株を得た
。

第１表にシュードモナス・アミノボランス（Ｐ．ａｍｊ
ｎｏｖｏｒａｎｓ，）及び赤色フアカルタティブ・メタ
ノール資化性供試菌株の結果を例示する。なお、供試赤
色フアカルタティブ・メタノール資化性細菌約４の菊ま
文献記載の菌株であって多数のタイプ ストレイン（Ｔ
ｙｐｅｓｔｒａｉｎ）及びオーセンテツク ストレイン
（ａｕ仇ｅｎｔｉｃ ｓｔｒａｉｎ）を含む。

第 １表 詰１． （１） 文 献 名 ： ＢｅｒｇｅｙｓＭａｎｕａｉ
ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｌｎａｔｌｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌｏｇｙ第７版（１９５７）（２）文 献 名： Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ，． ８１．４６５（１９６１）（３）文
献 名 ： Ｂｉｏｃｈｅｍ 」． ９２．６０９（
１９６４）（４） 文 献 名 ： Ｂｅｒｇｅｖｓン
ｂｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｌｎａｔｌｖｅ Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ第７版（１９５７） ２０１頁（
５）文 献 名 ： 特許公報 昭４９−３７２７４註
２． 十，土をとの記号はデンントメトリ−による相対
活性を表わし、上記のンュードモナス スヒンーズ １
１５８株を１００として日一は１３０以上、十十は７０
〜１３０、÷は２０〜７０、±は２０以下誌１の（１）
，（２），（３）及びシュートモナス・アミノボランス
の供試菌株は総て、註３．「０１−化合物における微生
物の増殖」（ＭＭｉｃｒｏｂｉａＩＧｒｏｗｔｂ ｏｎ
０１０ｏｍｐｏ…ｄｓ【 ｐｌｌ〜２１（１９７５）に
報告の菌株である。

第１表のシュードモナス アミノボランス（Ｐａｍｌｎ
（）ｖｏｒａｎｓ）以外の赤色の細菌は、形態的、培養
的、生理的性質において共通した点が多く、ストック（
Ｐ．Ｋ．Ｓｔｏｃｋ）とマッククレスキー（Ｃ．ＳＭｃ
Ｃ１ｅｓｋｅｙ）等（Ｊ．母ｃｔ．ｅｒｉｏｌ．８８巻
１０６５頁１９６４年）が述べている如く、またクェィ
ル（Ｊ．ＲＱｕａｙｌｅ）（Ａｄｖ．ｉｎ Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏＩ Ｐｈ＄ｉｏｌ．７巻１１９頁１９７２年）が
彼の総説の中で論及しているように近似した性質を共有
する細菌群であって、赤色ファカルタティブ・メタノ−
ル資化性細菌類として総括できる。

第１表に示す如く、これ等赤色フアカルタティブ・メタ
ノール資化性細菌群中の供試した殆んど全ての繭株がＬ
−アミノァシラーゼ生産能を有するものの強力なＤーア
ミノアシラーゼ生産熊ある菌株は限られていた。Ｄ−ア
ミノアシラーゼ生産菌株は、次頃で説明する方法によっ
て選別すれば、この赤色フアカルタティブ・メタノ−ル
資化性細菌群の中に高頻度に存在し、容易に選出可能で
ある。次にこれ等非常に近似し、多くの共通した性質を
有する本願酸素産性の赤色フアカルタティブ・メタ／ー
ル資化性細菌の中から、代表的な２菌株を選んでその繭
学的性質を記す。

この代表２菌株シュードモナス スピシーズ（Ｐ．ｓｐ
．）６１７及びシユードモナス スピシーズ（Ｐ．ｓｐ
．）１１５８はそれぞれ徴工研菌株寄託番地第４６３１
号及び第４６３２号として寄託されている。○ー Ｎｏ
．６１７菌株（徴工研菌株寄託番号第４６３１号）形態
的性質 細胞：樺菌 大きさ：０．８〜１．２×１．５〜４．０
ミクロン単極鞭毛で運動する。

時に分枝（Ｂｒａｎｃｈｉｎｇ）を行い多形態となる。

グラム染色陰性、細胞内に顎粒を有する。胞子を形成し
ない。抗酸性染色で染まらない。各種渚地における生育
状態 １％メタノール・基質寒天平板培養のコロニ−：（３０
００、４報時間）円形、凸円状、全縁、表面平滑、光択
あり、赤色、不透明同上寒天斜面培養：（３０ｏｏ、４
８〜７幼時間）生育中等度、線状、平滑、光択あり、赤
色、培地不変肉汁寒天斜面培養：（３０００、４８〜７
狐寺間）１％メタノール・基礎寒天斜面とほぼ同じ１％
メタノール添加肉汁液体培養：（３０００、４８〜７狐
寺間）混濁する、被膜はつくらないが時々リング生成、
沈査生成、異臭なしゼラチン穿刺培養：（２０００、２
０日間以上）表面或は上部の生育が良い。

ゼラチンを液化しない。リトマス ミルク：（３０００
、２０日間以上）微かにアルカリ性となる。

凝固・液化等はない。生理的性質 １ 硝酸塩の還元：陽性 ２ 脱窒反応：陰性 ３ Ｍ旧テスト：陰性 ４ ＶＰテスト：陰性 ５ インドールの生成：陰性 ６ 硫化水素の生成：陰性 ７ 殿粉の加水分解：陰性 ８ クエン酸の利用性：陽性 ９ 無機窒素源の利用：アンモニウム塩、硝酸塩を単独
窒素源として生育する１０ 色素の生成：水溶性色素を
形成しない。

１１ ウレアーゼ：陽性 １２ オキシターゼ：おくれて陽性 １３ カタラーゼ：陽性 １４ 生育の範囲：ｐＨ４．０〜９．０に生育する。

最適ｐＨ６．５〜７．８生育温度１０℃及び４ゲ０に生
育しない。最適生育２５００〜３〆０１５ 酸素に対す
る態度：通性好気性菌 １６ ０Ｆテスト（Ｈｉｇｈ ＆ い船ｏｎ法）：Ｌ−
〜ａｂｉｎｏｓｅから酸化的及び酸酵的に酸を生成する
。

１７ メタノールを単一炭素源として資化しよく生成す
る。

１８ 各種炭素源から酸及びガスの生成（Ｈｕが＆ 戊
ｊｆｓｏｎ法）｛２） Ｎｏ．１１５８（徴工研菌株寄
託番号第４６３２号）形態的性質細胞は０．８〜１．２
×２．０〜４．５仏の大きさの樟菌。

単極毛により運動する。グラム陰性、抗酸性なく、胞子
は形成しない。細胞内に額粒を蓄積する。培養的性質（
３０００ ４鞘時間） 肉汁寒天平板コロニー：点状〜円形、凸円状、全緑、平
滑、赤色〜ピンク色、不透明肉汁培養：均一に混濁、膜
は作らない。

肉汁寒天斜面：生育中等度、線状、緑なめらか、表面平
滑、赤〜ピンク色、培地は変色しない。

１％添加メタノール合成培地斜面：生育良好、他は前肉
汁寒天培地と同様。

肉汁ゼラチン穿刺培養：表面及び上部生育、ゼラチン液
化せず。

リトマス ミルク：不変、７日頃僅かにアルカリ性とな
る。

生理的性質 硝酸塩の還元：陰性 脱窒反応：陰性 Ｍ旧テスト：陰性 ＶＰテスト：陰性 インドール生成：陰性 硫化水素の生成：陰性 殿粉の加水分解：陰性 クエン酸塩の利用：士 無機窒素の利用：アンモニウム塩を利用する。

色素の生成：水溶性色素を形成しない。ウレアーゼ：陽
性 オキシダーゼ：陰性 カタラーゼ：陽性 リジン・オルニチン脱炭酸反応：陰性 セルラーゼ：陰性 生育の範囲：ｐＨ４．０〜９．５に生育する。

最適生育ｐＨ６．５〜７．５温度：ｌｏｏｏ〜４５ｑｏ
で生育する。

５０ｑｏ以上で生育しない。

最適温度３０ｑｏ〜３５ｑｏ酸素に対する態度：好気性 ＯＦテスト：グルコースから好気的及び嫌気的に酸及び
ガスを生成しないがアラビノースから酸化的、醗酵的に
酸を生成する。

メタノールの資化性：メタノールを唯一の炭素源として
よく生育する。

炭水化物から酸及びガスの生成（Ｈｕｇｈ ＆じｉｆｓ
ｏｎ法）以上の性質から両菌株力む，化合物のメタノ−
ルを資化するがＣ２以上の炭素化合物も利用するから、
Ｂｅｒｇｅｙ’ ｓ ｍａｎ雌ｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒ
ｍｉｎａｔｉｖｅ鞄ｃｔｅｒｊｏｌｏ鋤第８版（１９７
４）の２６８頁メチロモナダセエ（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏ
ｎａｄａｃｅａｅ）科のメチロモナス（Ｍｅ比ｙｌｏｍ
ｏｎａｓ）属に属させるわけには行かない。

同書にはプロタミノバクター（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂｅ
ｃにｒ）属はすでに削除されており、また２６９頁のＦ
ｕｒｔｈｅｒｃｏｍｍｅｎｔｓの中にも記されている如
く「メタン或はメタノールのオブリゲート（ｏｂｌｉ鱒
ｔｅ）資化性でない細菌」は今後更に研究を続けねばな
らないとされている。

これ等の菌株がシュードモナダセ （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ船ｃｅａｅ）科のシュードモナ
ス（Ｐｓｅｕｄｍｏｎａｓ）属に属させるについては、
同書第２１刀官１こＣ，化合物は資化不能とあり、本出
願に使用する細菌が総てＣ，化合物のメタノールを質化
する故、疑問がある。

しかしシュードモナスアミノボランス（Ｐ．ａｍｆｎｏ
ｖｏｒａｎｓ）とシユードモナス エキストーケンス（
Ｐ．ｅ幻ｏｒｑｕｅｎｓ）が２３７〜 ２３８頁 の
「 Ａｄｄｅｎｄａ 上ｏ 比ｅ ＧｅｎｕｓＰｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ」にその名前が追記されているし、又第
１表に示した如く赤色ファカルタティブ・メタノール（
ｒｅｄｆａｃｕｌねｔｉｖｅｍｅ比ａｎｏｌ）資化性細
菌の一菌株のシュードモナス、スピシ−ズＡＭ１（Ｐ．
ｓｐ．ＡＭＩ）はベール（Ｄ．Ｐｅｅｌ）とクヱイル（
Ｊ．Ｒ．Ｑ雌ｙｌｅ）（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．８１巻４
６５頁 １９６１年）によって分離され、同定記載され
ＮＣＩＢ９１３３として寄託保存されており、またシュ
ードモナススピシーズ（Ｐ．ｓｐ．）Ｍ２７はアントニ
ー（Ｃ．抑ｔｈｏｎｙ）とザツトマン（Ｌ．Ｚ．ねｔｍ
ａｎ）（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．９２巻６０９頁１９６４
）等が分離し、同定後、ＮＣＩＢ９６８６として保存さ
れている。これらは総てオーセンティック菌株（ａｕｔ
ｈｅｎｔｉｃｓｔｒａｉｎ）で、その他の菌株は河野と
尾崎（ＭｉｃｒｏｂｉａＩＧｒｏｗｔｈｏｎ○，一Ｃｏ
ｍｐｏ肌ｄｓｌｌ〜２１頁１９７５）が報告したＧｒｏ
ｕｐｍの細菌のものである。現在分類学的に問題はある
が、他に所属すべきところがなくＱｕａｙｌｅ等或はＺ
ａｔｍａｎ等にならってシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ）属に属させるのが最も妥当と考えられる。
（しかし前記した如く今後分類学研究の進展によって、
これ等フアカルタテイブ・メタノール資化性細菌の分類
学上の位置が明確にされ、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄ
ｍｏｎａｓ）属から他の属に移行されたり、或は新属又
は新種名が提案される可能性は大きい）次に、Ｄ−アミ
ノァシラーゼ生産とその酵素の特異性をシュ−ドモナス
スピシーズ（Ｐ．ｓｐ．）１１５８主産の酵素につい
て具体的に説明する。

グルコース２％、フアルマメデイア■ｏ．８％（トレー
ダーズオィル ミル社製）、コーン ステイーブリカー
０．５％の熱水抽出液をｐＨ７．０に調整し、１２００
０ １５分間殺菌したものを培地とし、これに当該菌株
を無菌的に接種した。２８ｑ０、４日間振熱培養後、菌
体を遠心分離によって得、生理食塩水で洗浄後０．０１
Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁し、これ
を超音波破砕機にかけ、酵素を抽出した。

遠心分離後、得られた無細胞抽出液に硫酸ストレプトマ
イシン溶液を最終的に０．４％（ｗ／ｖ）になるように
添加し、更に３粉ご間冷却しながら雛杵した後遠心分離
した上燈に硫酸アンモニウムを加え硫安６０％飽和（ｗ
／ｖ）にし３０分間冷却、損拝すると、酵素は沈殿物と
して得られた。沈殿を遠心分離によって集め、０．０１
Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に熔解し、同じ
緩衝液で一夜透析して硫安を除く。透析内液を予め０．
０１Ｍリン酸カリウム緩衝液で平衡化させたＤＥＡＥ−
Ｓｅｐｈａｃｅｌ■（ファルマシア社製）カラムに吸着
させ、洗浄後、緩衝液濃度をグラジェンタ−で連続的に
増加させて溶出を行った。本酵素は上記緩衝液濃度０．
１Ｍ付近で溶出され、一方同時に生産されるＬ−アミノ
アシラーゼは０．１９Ｍ付近で溶出された。活性画分を
．０１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で透析し
、透析内液を凍結乾燥した。これを予め上記緩衝液で平
衡化したセフアデックス■Ｇ−ｌｏｏ（ファルマシア社
製）カラムでゲル炉過し、活性溶出画分をダイアフロー
■メンブレンＰＭ−１０（アミコン社製）で濃縮した。
これを予め０．０１Ｍリン酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７
．４）で平衡化したセフアデックス■Ｇ−２ｏｏ（ファ
ルマシア社製）（デキストラン ゲル）カラムでゲル炉
過を行った。活性溶出画分を集め限外炉過膜で濃縮し、
下記に示した条件でプレパラティブＤＩＳＣ電気泳動を
行った。活性区分を０．０１Ｍリン酸カルシウム緩衝液
（ｐＨ７．４）に対して透析し透析内液を精製酵素とし
てその諸性質を検討した。この酵素標品は電気泳動的に
均一であった。なお、本酵素の結晶化は未が成功してい
ない。

なお、酵素活性は下記の方法で測定し、１時間ｌＡｍｏ
ｌｅのＤーバリンを生ずる酵素活性を１単位した。活性
測定法：２５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４
）１０一〆、１０ｍＭ塩化コバルト５仏そ、５０のＭ
Ｎ−クロロアセチル−Ｄ−バリン２０仏そを混合し、酵
素液及び蒸留水を加えて液量を５０ム夕に調整した反応
液を３０つ０１５分間反応させ、直ちにドライアイスー
アセトン俗で凍結させ、氷冷下、冷却した５０％酢酸５
０山そを加えて反応を停止させた。

生じたＤーバリンをニンヒドリン法で定量した。ニンヒ
ドリンによる定量はＹｅｍｍらの方法（Ａｎａｌ松ｔ８
碇登２０９頁１９５８王）に準じて下記のように行った
。

反応液を蒸留水で２倍に希釈し、その内１００Ａ夕を分
析試料として用いた。分析試料１００仏〆を小試験管に
取り、４Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）０．５の‘、ＫＣ
Ｎーニンヒドリン溶液（ニンヒドリン０．５夕を５９の
‘のメチルセロソルブに溶かし、０．０１ＭＫＣＮＩの
‘を添加したもの）１羽を加え、よく婿拝した後、ガラ
ス玉でフタをする。以上の操作を氷冷下で行い、操作完
了後直ちに沸騰水溶中に浸し、１５分間煮沸した。冷却
後５０％ｎ−プロパノール３の‘を加えて希釈し、よく
損拝した後、日立２００−１０型分光光度計を用いて５
７仇ので比色定量した。標準液としわ０．１〜０．７ｍ
ＭのＤ−バリン溶液を用い、反応液中のＤ−バリン量を
定量した。又、目的に応じては下記に示す薄層クロマト
グラフィー・デンシトメトリ一法も合わせ用いた。

上言己反応液２．５ｒそをシリカゲルプレートにスポッ
トし、ｎ−プタノール：酢酸：水＝４：１：１の溶媒系
で展開後、プレートを風乾し、０．０２Ｍニンヒドリン
溶液（ｐＨ５．０）中に浸し、１００ｏＣ、５分間発色
後、島津二波長クロマトスキャナ−ＣＳ−９１０を用い
てデンシトメトリ−を行った。標準液として０．１〜０
．７ｍＭのＤ−バリン溶液を用い、反応液中のＤ−バリ
ン量を定量した。なお、デンシトメトリーは発色後１５
分以内に完了する様にした。本酵素は、Ｄ−アミノ酸の
Ｑ−アミノ基のＮ−アシル誘導体（フオルミル、アセチ
ル、クロロアセチル、グリシル、ベンゾィルなど）を特
異的に加水分解し、Ｄ−アミノ酸と当該脂肪酸を生ずる
酵素で下記の性質を持つ。

｛１） 熱安定性： 酵素を州７．４のリン酸カリウム緩衝液中で、１５分間
各温度で処理した後、残存活性を測定した。

図に示す如く７７０の処理でもなお３０％の残存活性が
あった（第１図）。｛２｝ 反応温度： ｐＨ７．４で、他のアシラーゼと同様、失活限界まで相
対活性は増加すると思われる（第２図）。

他のアシラーゼに比較して著しく高温耐性が高い点が特
徴である。｛３｝ ｐＨ安定性： 酵素液を各ｐＨで５℃一夜放置後、残存活性を測定した
ところ、ｐＨ６．９付近で最も安定だった（第３図）。

■ 反応ｐＨ：３０００で種々のｐＨで反応を行った結
果、ｐＨ７．４付近が反応の至造ｐＨであった（第４図
）。

（５｝ 分子量：セフアデックス■Ｇ−２００（ファル
マシア社製）を用いて、ゲル海適法により分子量を測定
した。

本酵素の分子量は約１０００００であった。なお、標準
蛋白としてチトク。−ムｃ（分子量１２５００）、キモ
トリプシノーゲンＡ（分子量２５０００）、鶏卵アルブ
ミン（分子量４５０００）、牛血清アルブミン（分子量
６７０００）、ウサギ筋肉アルドラーゼ（分子量１５８
０００）、ウシ肝臓カタラーゼ（分子量２４００００）
を使用した。‘６｝ 等電点： ＬＫＢ８１０１カラム（ＬＫＢ社製等電点用カラム）と
０．８％アンフオラィン■（ＬＫＢ社製）を用いて４℃
３０び、４８時間通電後１．５の【ずつ分画して等電点
を求めた。

本酵素の等亀点はｐｌ＝４．９５であった｛７’ＤＩＳ
Ｃ電気泳動： ７．５％ポリアクリルアミドゲル（ｐＨ８．９）、トリ
スーグリシン緩衝液（ｐＨ８．３）の条件で４℃、２肌
Ａ／ゲル通電後、ゲルを取出し、泳動方向と平行にゲル
を二分し、一方を染色、一方を活性測定して泳動位置を
求めた。

本酵素のブロモフェノールフル−に対する相対移動度は
ＲｍＢＦＢ＝０．２５であった。【８｝ 元素分析： 上記電気泳動の条件で活性区分を集め、ゲルを蒸留水中
でつきくだいて酵素を抽出した。

それを蒸留水に対して一夜透析し、透析内液を蒸発乾団
して元素分析を行い、下記の組成を得た。Ｃ：５４．３
３％ Ｈ：７．１９％ Ｎ：１６３７％【９｝ 金属イ
オンの影響：標準反応液のＣＯ＋＋イオンの代わりに種
々の金属塩を添加して活性を測定した。

Ｈｇ＋＋、Ｃｕ十十イオンによって阻害されたが、その
他の金属イオンは阻害にも活性化にもあまり影響なく、
本酵素はすでに必要な金属イオンを含有しているか、或
いは酵素反応に金属イオンを必要としないものと推定さ
れる（第２表）。第 ２ 表： 金属ィオンの影響 皿 阻害剤等の影響： 酵素液を各種阻害剤と３０００、１５分間放置後活性を
測定した。

ＳＨ阻害剤であるｐ−クロロ水銀安息香酸で著しい阻害
を受けたが、Ｎ−エチルマレィミド、モノョード酢酸で
はそれ程阻害を受けなかった。又、ＥＤＴＡによる阻害
もゆるやかであった（第３表）。第 ３ 表：阻害剤な
どの影響 （１１）基質特異性： 各種アミノ酸のＮーアシル誘導体を基質として酵素活性
を測定した。

ＮーアセチルーＤーメチオニンを１００とした相対活性
を表に示した（４表）。第４表：基質侍男性 本発明に使用できる微生物はフアカルタティブ・メタノ
ール資化性細菌で、Ｄーアミノアシラーゼ生産能を有す
る菌株であれば、いずれの菌株でも使用できるが、代表
例として、シュードモナス スピシーズ（Ｐｓｅｕｄｍ
ｏｎａｓｓｐ．）１１５８ シユードモナス アミノボ
ランス（Ｐｓｅｕｄｍｏｎａｓａｍｌｎｏｖｏｒａｎｓ
）ＮＣＩＢ９０３９、シユードモナス スピシーズ（Ｐ
．ｓｐ．）６１７などがあげられる。

Ｄーアミノアシラーゼ生産菌の培養は通常の栄養源の存
在下で行われるが、必要に応じて酵素生産誘導物質（Ｄ
ーアミノ酸及びその誘導体などがあげられる）や安定化
剤として塩化コバルトなどを添加しても良い。培養はｐ
Ｈ５〜８の範囲で可能であるが、ｐＨ６〜７の範囲が好
ましい。培養温度は２０〜３７ｏ０、好ましくは２８〜
３０二○の範囲で行われ、通気蝿梓を行う必要がある。
本酵素は主に菌体内に生産されるので、通常の方法で菌
体を回収し、酵素源とする事ができる。

抽出及び精製も通常酵素に対して用いられる方法を使用
できる。即ち菌体を種々の物理的方法で破砕又はリゾチ
ーム等で溶菌して酵素を抽出し、凍結融解、ストレプル
トマィシン、プロタミンなどによる除核酸処理、硫安分
画などで精製し、更に必要ならばＤＥＡＥ−セルロース
、ＤＥＡＥ−セフアデックス■などのイオン交換体、或
いはハイドロキシルアパタィトなどのリン酸ゲル、又は
バイオゲル■、セフアデックス■などにより精製できる
。又連続反応を行うには菌体より抽出、精製した酵素を
通常の方法で固定化しても使用できる。

即ち、ＤＥＡＥ−セルロースなどによるイオン吸着、或
いはポリアクリルアミドゲルによる包括などの固定化法
が用いられる。以下本発明を実施例により具体的に説明
するが、これらの実施例によって本発明が限定されるも
のではない。

実施例 １ グルコース２％、フアルマメデイア■（トレーダーズ
オィル ミル社製）０．８％、コーン ステイーブリカ
ー０．５％の熱水抽出液（冊７．０に調整）１００の‘
を含む５００叫客ェルレンマィヤーフラスコ１０本を１
２０℃、１５分間殺菌し、冷却後シュードモナス スピ
シーズ １１５針珠のスラントの培養物の一部を無菌的
に接種した。

フラスコを２８ｏｏ、２日間振糧培養し、これに種母と
した。同様の靖地組成、操作で５００の‘客ヱルレンマ
ィャーフラスコ５００本を作成し、上記種母フラスコか
ら各２の‘当り、種母を添加した。

添加後、フラスコを２８ｏｏ、４日間振蓋培養した。フ
ラスコ内容を集め、０００、１０００仇ｐｍ、１５分間
の遠心分離により菌体を分離し、生理食塩水及び０．０
１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。
得られた洗浄菌体（湿重量約１００夕）を０．０１Ｍリ
ン酸カリウム緩衝援（ｐＨ７．４）５００泌に懸濁し、
超音波破砕機（トミ‐精工社製ＵＲ−２００Ｐ）で６肌
、１分間の処理によって細胞を破砕し、合計１５分間処
理した。処理液を０℃、１０００仇ｐｍ３０分間遠心分
離し透明な上清を得た。細胞固形分は再び０．０１Ｍリ
ン酸カリウム緩衝液３００の上に懸濁し、同様な処理で
超音波破砕を行った。１度目の上清と２度目の上清とを
合わせ無細胞抽出液８３０泌を得た。

この無細胞抽出液に含まれるＤ−アミノアシラーゼ活性
は約３００山単位であった。因みにＬーアミノアシラー
ゼ活性はＮ−クロロアセチル−Ｌ−バリンを基質として
１時間に１ムｍｏｌｅのＬーバリンを生ずる酵素活性を
１単位とすると約８５０山単位含まれていた。実施例
２ 実施例１で得られた無細胞抽出液８３０の‘に、硫酸ス
トレプトマイシン３夕を５机上の蒸留水に溶解し、ｐＨ
７に調整した液を冷却、燈拝しながらゆっくりと加えた
。

全員添加後更に３０分間櫨拝し０℃、１０００仇ｐｍ、
３０分間遠心分離して透明な上清８００の【を得た。こ
の上情に乳鉢で粉末状に挽いた硫酸アンモニウム３１２
夕を冷却、凝梓しながらゆっくりと加えた。全量添加後
更に３０分間燈梓を続け、生じた沈殿を０℃、１０００
仇ｐｍ、３０分間の遠心分離によって得た。沈殿を０．
０１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解し、
同じ緩衝液５夕に対して３時間透析し、更に同じ緩衝液
１４のこ対して一夜透析した。透析内液を０℃、１００
０仇ｐｍ、１５分間遠心分離して透明な上情１７０の‘
を得た。この上清に含まれるＤ−アミノァシラーゼ活性
は約１５００筆位で、比活性（蛋白１の９当りの酵素単
位）は無細胞抽出液の０．１４単位／雌に対して０．３
５単位／奴９と約２．５倍に上昇した。因みにＬ−アミ
ノアシラーゼ活性は実施例１と同様の酵素単位で約５５
０山単位含まれていた。なお、蛋白の定量はＫａｌｂら
のＵＶ方法（ＡＭ１．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８２巻３６１頁
１９７７年）を用いて行い、次式により算出した。

蛋白〃タ′舷＝１８３×Ａ２３０−７５．８×Ａ２６０
Ａ２３０、Ａ２６０はそれぞれ２３血の、２６触れでの
吸光度を示す。

実施例 ３ 実施例２で得られた粗酵素液１７０の上を予め０．０１
Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化させた
ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌ■（ファルマシア社製）カ
ラム（５伽×６０肌）に吸着させ、６００のとの０．０
２Ｍリン酸カリウム緩衝液（冊７．４）で洗浄した後、
緩衝液濃度を０．０弧から０．２Ｍまで直線的に増加さ
せて熔出を行った。

Ｄ−アミノアシラーゼは緩衝液濃度０．１Ｍ付近で溶出
され、一方Ｌ−アミノアシラーゼは０．１９Ｍ付近で溶
出された。Ｄ−アミノアシラーゼ活性区分を集めて、０
．０１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）１４夕に
対して一夜透析し、透析内液を凍結乾燥した。ここに含
まれるアシラーゼ活性はＤ−アミノアシラーゼ活性のみ
で、約３５０単位であった。又、比活性は３．０９単位
／の９となり無細胞抽出液から約２２倍に上昇した。実
施例 ４ 実施例３で得られた凍結乾燥粉末を０．０山叫ン酸カリ
ウム緩衝液（ｐＨ７．４）２叫に溶解し、同じ緩衝液５
そに対して３時間透析後、予め同じ緩衝液で平衡化させ
せたセフアデックス■Ｇ−ｌｏｏ（ファルマシア社製）
カラム（２肌×６０弧）でゲル炉過を行った。

活性画分を集めダイアフロー■メンブレンＰＭ−１０（
アミコン社製）を用いて濃縮し、これを予め０．０１Ｍ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）べ平衡化させたセ
フアデックス■Ｇ−２００（ファルマシア社製）カラム
（２．５肌×５０ｃの）でゲル炉過を行った。活性区分
を集め精製酵素とした。この精製酵素にはＤ−アミノァ
シラーゼ活性約３００単位が含まれ、比括性は６．２５
単位／収（無細胞抽出液から４封苦）であった。実施例
５ 実施例４で得られた精製酵素についてディスクゲル電気
泳動を行った。

ゲルの調整は○ｍｓｔｅｉｎ、Ｄａｖｉｓらの方法に準
じて行い、７．５％ポリアクリルアミドＰＨ８．９ ４
帆×４．５肌の分離用ゲル、及び２．５％ポリアクリル
アミド（ｐＨ６．９）の濃縮用ゲルを作製した。緩衝液
はトリスーグリシン緩衝液（ｐＨ８．３）（トリヒドロ
キシメチルアミノメタン６夕、グリシン２８．８のこ蒸
留水を加えて１夕にしたもの）を用い、実施例４で得ら
れた精製酵素１００仏ぞと４０％シュクロース１００一
そを混合した液を濃縮用ゲルの上に添加し、泳動を行っ
た。泳動は４℃、２ｍＡ／ゲルの条件で行い、マイナス
側の緩衝液にブロムフェノールフル−を添加して泳動の
指標とした。泳動終了後、ゲルを取り出し、カミソリで
泳動万向に平行にゲルを二分し、一方をアミノブラック
ｌＯＢで一時間染色とした。

その後余分な色素を７％酢酸で脱色した所、図の様に４
本の染色された帯が認められたので、残りの半分のゲル
について染色帯に相当する所を切り取り、下記の方法で
活性を測定した。活性測定法：切り出したゲルを０．２
８Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）１００ムのこ
浸し、４℃、一夜放置後、２５〃その１０ｍＭ塩化コバ
ルト、１００４その５０ｍＭ Ｎ−クロロアセチル−Ｄ
−バリンを添加し、３０こ○、１時間反応させた。

反応後２分間煮沸して反応を停止させ、冷却後その２．
５一そをメルク・キーゼルゲル・プレート（メルク社製
〜ｔ５７１５）にスポットし、ｎーブタノール：酢酸：
水＝４：１：１の溶媒系で展開後、プレートを風乾し、
ニンヒドリン溶液を曙霧して１２０００、５分間発色さ
せた。酵素活性を持つ反応液のみＤ−バリンのスポット
を与えた。以上の方法により、本酵素のブロムフェノー
ルフル一に対する相対移動度は０．２５と決定した。

第５図は本酵素の蟹気泳動バンドを示す図で図中Ｉは農
縮用ゲル、２は分離用ゲルで３は本酵素、４，５，６は
共に不純物及び７はＢＰＢのそれぞれバンドを示す。実
施例 ６ 実施例１及び２、３と同機な方法でシュードモナス ア
ミノボランスＮＣＩＢ９０３９先からＤ−アミノアシラ
−ゼ溶液を得た。

これを実施例５と同様な方法でディスクゲル電気泳動を
行い、泳動位置を求めた。本酵素のプロムフェノールフ
ル一に対する相対移動度は０．２６であった。実施例
７ 実施例１と同様の培地５０私を含む２５０の【客上ルレ
ンマィャーフラスコを実施例１と同様に殺菌後フアカル
タティブ・メタノール資化性細菌株類を接種し、２８０
０、４日間振麹培養した。

培養液を冷却下１０００仇ｐｍ１５分間の遠心分離し、
得られた菌体を０．０１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
７．４）で洗浄後、同じ緩衝液１の【に懸濁した。懸濁
液を超音波破砕機で６肌、１分間の処理をし、０℃、１
０００仇ｐｍ、３０分間の遠心分離により各々の菌株の
無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液７５仏そ、０．
２９Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）５０ｒ〆、
１０ｍＭ塩化コバルト２５仏夕、５０ｍＭ Ｎークロロ
アセチル−Ｄ−バリン１００ムそを混合し、３０℃、１
時間反応させ、２分間の煮沸によって反応を停止した。
同様にして、基質をＮークロロアセチル−Ｌーフェニル
アラニンとした反応も同時に行った。これらの反応液を
メルク・キーゼルゲル・プレートにスポットし、ｎーブ
タノール：酢酸：水：＝４：１：１の溶媒系で薄層クロ
マトグラフィーを行った。プレートを風乾後ニンヒドリ
ン発色により、バリン及びフェニルアラニンのスポット
を与える株、即ちＤーアミノアシラーゼ及びＬーアミノ
アシラーゼ活性を与える株を検索した第１表の結果を得
た。

【図面の簡単な説明】

第１図は本酵素の熱安定性を示し、第２図は反応温度を
示し、第３図は、ｐＨ安定性を示し、第４図は反応ｐＨ
を示す図で、何れも縦幅は本酵素の相対活性を％で示す
。 第５図は本酵素の電気泳動のバンドを示す説明図である
。第１図 第２図 第３図 第４図 第５図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ フアカルタテイブ（ｆａｃｕｌｔａｔｉｖｅ）メタ
   ノール資化性細菌類が生産する次の性質を有するＤ−ア
   ミノアシラーゼ。 （１）基質特異性 Ｎ−アシル−Ｄ−アミノ酸のアシル基を加水分解するア
   ミノアシラーゼ、しかしＮ−アシル−グルコサミン、Ｎ
   −アシル−エタノールアミンには作用しない。 （２）安定性 温度：５０℃でも殆んど活性を保持し、８０℃でもなお
   僅かに活性を残存する（ｐＨ７．４１５分間）ｐＨ：６
   〜７で最も安定、ｐＨ５又は９となると半減する（温度
   ５℃、一夜放置）（３）反応性 温度：他のアシラーゼと同様失活限界に近い８０℃まで
   は直線的に活性を増加し、８０℃以上は急激に反応性を
   失う（ｐＨ７．４）ｐＨ：ｐＨ７〜８が反応性高く、ｐ
   Ｈ７．４で最高、ｐＨ６．５又は９となれば６０％とな
   り、それより下又は上は急激に反応性を失う。 （温度３０℃）（４）分子量１０００００（ゲル濾過法
   ）（５）等電点ｐＩ＝４．９５（６）ＤＩＳＣ電気泳動
   Ｒｍ＿Ｂ＿Ｐ＿Ｂ＝０．２５（７）元素分析（％）Ｃ＝
   ５４．３３Ｈ＝７．１９ Ｎ＝１６．３７ （８）金属イオンの影響 Ｈｇ＾＋＾＋、Ｃｕ＾＋＾＋によつて阻害されるが、そ
   の他のイオンは活性化にも阻害にも影響なし。 （９）阻害剤 Ｐ−クロロ水銀安息香酸で著しく阻害されるが、ＥＤＴ
   Ａによつて僅かに阻害される程度Ｎ−エチルマレイミド
   及びモノイヨード酢酸では阻害されず。