JP2883635B2 - 新規トランスアミナーゼおよびその製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 Ｌ−２−アミノ−４−メチルホスフイノ酪酸（以下Ｌ
−ホスフイノスリシンまたはＬ−PPTと称する）または
その塩は西ドイツ特許公開第2,939,269号の記載からも
知られているように化学合成で容易に入手しうるラセミ
化合物の活性成分である。ラセミ化合物は西ドイツ特許
公開第2,717,440号の記載によれば多数の単子葉および
双子葉の、一年生および多年生雑草に対して非常に良好
で幅広い除草活性を有する。Ｌ−PPTおよびその前記し
た誘導体はラセミ化合物に比較して約２倍の活性を有す
るので、Ｌ−PPTを簡単な方法で比較的大量に入手しう
る方法を開発することが望まれていた。

Ｌ−PPTが微生物による酵素法により調製されうるこ
とは既に記載されている（EP0,248,357）。該明細書中
にも、大腸菌DH−１が適当な前駆物質をＬ−第３ロイシ
ンおよびＬ−ホスフイノスリシンに変換しうるトランス
アミナーゼを有することが記載されている。

今、大腸菌DH−１がＬ−ホスフイノスリシンを驚くほ
ど高い特異性を以て生成させる特異的なトランスアミナ
ーゼを合成することが見出された。

それゆえ、本発明は １）分子量20,000〜250,000ダルトン、 pH3.0〜8.0にある等電点、 5.0〜10.0の範囲内にある最適pH、および アミノ基供与体としてのＬ−ホスフイノスリシン、
γ−アミノ酪酸およびグルタメート、ならびにアミノ基
受容体としての適当なケト化合物に対する基質特異性、 を有する、大腸菌DH−１からのトランスアミナーゼ、 ２）大腸菌DH−１を培養しそして前記トランスアミナー
ゼを単離することからなる前記１項の特性を有するトラ
ンスアミナーゼの製法、 および ３）（３−カルボキシ−３−オキソ−プロピル）メチル
ホスフイン酸のＬ−ホスフイノスリシンへのおよびスク
シネートヘミアルデヒドのγ−アミノ酪酸へのアミノ交
換反応への前記１項の特性を有するトランスアミナーゼ
の使用、 に関する。

以下に本発明を特にその好ましい態様に関して詳細に
説明する。

トランスアミナーゼは大腸菌DH−１または適当な突然
変異体または変種から単離される。この目的には微生物
をその生育に最適な栄養培地中で培養する。微生物の培
養は例えば、場合により空気または酸素を導入しながら
振盪フラスコまたは発酵器中で振盪または撹拌下に深部
培養により好気的に行われる。発酵は約20〜40℃、好ま
しくは約25〜37℃、特に30〜37℃で実施できる。pH5〜
8.5、好ましくはpH5.5〜8.0で培養が行われる。これら
の条件下に一般に１〜３日後に培養ブロス中に酵素がか
なり蓄積する。トランスアミナーゼの合成は対数期の中
ごろに始まり、そして対数期の終わりに向かつてその最
大に達する。酵素の産生はHPLC分析によるかまたは測光
的に追跡できる。

トランスアミナーゼの生成に用いられる栄養溶液は0.
2〜５％、好ましくは0.5〜２％の有機窒素化合物ならび
に無機塩を含有する。有機窒素化合物としては、アミノ
酸、ペプトン、さらに肉エキス、例えばとうもろこし、
小麦、豆類、大豆または綿花植物の粉砕された種子、ア
ルコール製造の蒸留残渣、肉荒びき粉または酵母エキス
が適当である。栄養溶液が含有しうる無機塩の例をあげ
ればアルカリ金属またはアルカリ土類金属、鉄、亜鉛お
よびマンガンの塩化物、炭酸塩、硫酸塩または燐酸塩、
さらにアンモニウム塩および硝酸塩である。

酵素の単離および精製は古典的方法によりリゾチーム
による消化、硫酸アンモニウム沈澱、イオン交換クロマ
トグラフイーおよびゲル透過クロマトグラフイーにより
行うことができる。

この酵素調製物は分子量20,000〜250,000ダルトン、
好ましくは25,000〜100,000ダルトン特に40,000〜50,00
0ダルトンを有し、等電点がpH3.0〜8.0好ましくは3.5〜
5.5特に4.0〜5.0にあることを特徴とする。酵素生成物
の最適pHは5.0〜10.0特に8.0〜9.0にある。

精製されたトランスアミナーゼの最初の33個のＮ−末
端アミノ酸がガス相シークエンサーにより決定されてお
りそしてそれは次のとおりである:Met−Asn−Ser−Asn
−Lys−Glu−Leu−Met−Gln−Arg−Arg−Ser−Gln−Ala
−Ile−Pro−Arg−Gly−Val−Gly−Gln−Ile−His−Pro
−Ile−Phe−Ala−Asp−Arg−Ala−Glu（Thr）−Asn−A
sn（Gly）。

このアミノ酸配列はこれまでに文献で知られているト
ランスアミナーゼと何らの相同性も有しない。

このトランスアミナーゼは文献上知られたインヒビタ
ーであるＯ−（カルボキシメチル）−ヒドロキシルアミ
ンにより阻害でき、詳細には標準的なアツセイ条件下で
（実施例３、酵素活性）約0.1〜１μＭのＯ−（カルボ
キシメチル）−ヒドロキシルアミンにより50％まで阻害
されうる。

この酵素は高温で驚くほど安定であることが研究によ
り判明した。従つて酵素の精製において70℃でこの酵素
を10分間インキユベーシヨンする操作を用いて熱変性さ
せることにより他のタンパク質をトランスアミナーゼか
ら分離することができる。

20種のタンパク性アミノ酸のどれも本発明によるトラ
ンスアミナーゼを用いて調製することはできない。この
ものはただ（３−カルボキシ−３−オキソ−プロピル）
−メチルホスフイン酸およびスクシネートヘミアルデヒ
ドまたはそれらのエステルに対してのみ特異性を有して
いて、これらの化合物から非タンパク性アミノ酸である
Ｌ−ホスフイノスリシンおよびγ−アミノ酪酸がグルタ
メートからのアミノ基の伝達により調製されうる。適当
なケト酸エステルとしては特に低級アルキル（C₁−C₆）
−エステルが使用できる。

本発明により、有効量のトランスアミナーゼが遊離の
または固定化された形態でアミノ交換反応に使用でき
る。固定化させるには例えば西ドイツ特許公開第3,237,
341号および3,243,591号に記載されるような知られた方
法が適当である。その際酢酸ビニルとジビニルエチレン
／尿素からなる共重合体を使用し、その表面のアセテー
ト基を加水分解したのちオキシラン基で修飾したものが
特に好都合であることが判明した。このオキシラン基に
本発明によるトランスアミナーゼが高い効率で結合され
うる。担体物質に結合した酵素は非常に安定であること
が判明し、そして長時間にわたり事実上酵素活性の損失
がないことが示された。酵素は必要に応じ約５μＭの少
量のピリドキサール燐酸を用いて再生させるのが好都合
である。

アミノ交換反応は生理学的緩衝溶液中でpH約４〜12好
ましくはpH8〜10で行うことができ、従つて酵素活性が
言うに足るほどの不利な影響を受けない。反応温度は20
〜70℃の範囲にあることができる。これより低温では酵
素反応が遅くなつてゆき、一方これより高い温度では酵
素が漸進的に不活化される。酵素反応は20〜60℃、好ま
しくは30〜60℃、特に40〜55℃で行われる。

グルタメートおよびその塩がアミノ供与体として用い
られる。この反応にはアミノ供与体がα−ケト酸または
そのエステルに対し等モル量または過剰に用いられるの
が好都合であることが判明した。1:1〜5:1、好ましくは
1:1〜2:1の比率が適切であることが判つた。反応成分は
水中における溶液としてまたは固形物質を同時にまたは
連続して添加することにより反応混合物に添加できる。

形成された生成物は知られた方法によりイオン交換ク
ロマトグラフイーおよび噴霧乾燥を用いて反応溶液から
単離できる。

以下の実施例により本発明をさらに説明する。％の記
載は別に断わりなければ重量によるものとする。

実施例 １ 大腸菌DH−１の培養 本発明によるトランスアミナーゼを得るために微生物
学において慣用のように大腸菌DH−１をその菌株の耐久
形の凍結乾燥物から培養した。培養ははじめ液体滅菌完
全培地で行われた。生長した細菌を次に滅菌ペトリシヤ
ーレ中の固形培養基上で画線接種しそして次に単一コロ
ニーをさらに液体培地中で培養した。

液体培地： カゼインペプトン 3.5g/ 肉ペプトン 3.5g/ 塩化ナトリウム 5.1g/ pH−値 7.5 滅菌 120℃、20分 固形培地： 液体培地と同じ組成だがさらに15g/の寒天を含有す
る。

本発明によるトランスアミナーゼを得るための細菌の
インキユベーシヨンは振盪器中における、滅菌培地１
ずつを含有する５の三角フラスコ中の液体培地中で、
37℃および200rpmで行われた。

対数増殖期の終りに遠心分離により細菌を収穫し、液
体窒素中で急速冷凍させそして−80℃で貯蔵した。

実施例 ２ 大腸菌DH−１からのトランスアミナーゼの単離 冷凍された細菌を２倍量（2ml/g細菌）の緩衝液Ａ（2
0mM燐酸塩緩衝液、20μＭピリドキサール燐酸、10mMメ
ルカプトエタノール、（pH7.0））に1mMのフエニルメチ
ルスルホニルフルオライド（PMSF）を加えたものの中に
懸濁させ、そして超音波（15分間）により崩解させた。

細胞屑を遠心分離により除去しそして透明な上清を硫
酸アンモニウム沈澱により分別した。所望のトランスア
ミナーゼ活性部分は硫酸アンモニウム40％飽和と70％飽
和の間で沈澱しそしてこれを遠心分離により単離し、緩
衝液Ａに再懸濁しそして50倍量の緩衝液Ａで透析した。

この透析物を1mMα−ケトグルタレートの保存下に70
℃で10分間加熱しそして変性されたタンパク質を遠心分
離により除去した。透明な上清を0.45μＭメンブランで
過したのち四級アミノ基を有するアガロースからなる
アニオン交換体（Ｑ−Sepharose HP ,Pharmacia）を緩
衝液Ａで平衡化したものに加えた。結合されなかつたタ
ンパク質を緩衝液Ａで洗うことによりカラムから除去
し、結合されたタンパク質は直線状グラジエント（緩衝
液Ａ中０〜1.0M KCl）を用いてカラムから溶離しそして
分別収集した。トランスアミナーゼは約0.3M KClでカラ
ムから洗浄された。

酵素活性を有するフラクシヨンを合し、容量を減少さ
せるためにタンパク質を完全に溶液から沈澱させ（硫酸
アンモニウム80％飽和）そして分別範囲10〜400Kダルト
ンを有するゲル過カラム（Ultrogel AoA 44,Serva）
で分別した。このゲル過で用いられる緩衝液は20mMピ
ペラジン−N,N′−（２−エタンスルホン酸）、10μＭ
ピリドキサール燐酸、5mM2−メルカプトエタノール、0.
1M KCl（pH7.0）であつた。ゲル過後に得られた酵素
活性を有するフラクシヨンを25mMイミダゾール（pH7.
5）で透析しそして得られたタンパク質をその等電点に
従い、Polybuffer 74（Pharmacia製）を含有するPolybu
ffer交換体94（Pharmacia社）で分別した。本発明によ
るトランスアミナーゼはpH4.35でカラムから溶離され
た。酵素活性を有するフラクシヨン中のタンパク質を溶
液から完全に沈澱させ（硫酸アンモニウム80％）、緩衝
液Ａで透析しそして四級アミノ基を有するアガロースか
らなる高度分解性アニオン交換体（Mono Q、Pharmacia
製）でクロマトグラフイーした（Ｑ−セフアロースHPに
記載と同じ緩衝系）。この精製工程後にトランスアミナ
ーゼからすべての異種タンパク質が除去された。

実施例 ３ 酵素の特性化 分子量約44,000ダルトン（ポリアクリルアミドSDSゲ
ル電気泳動により測定）、 等電点pH4.35（Pharmacia社のPBE94/Polybufferでの
等電点クロマトグラフイーにより測定）、 酵素活性。

酵素活性はアミノ基受容体としてのα−ケトグルタレ
ートの存在下にＬ−PPTのアミノ交換反応を測定するこ
とによるか（アツセイ１）、またはアミノ基供与体とし
てのグルタメートを用いる（３−カルボキシ−３−オキ
ソ−プロピル）−メチル−ホスフイン酸からのＬ−PPT
の生成を測定することにより（アツセイ２）測定され
た。いずれのアツセイからもほぼ等しい結果を生じ、従
つてより容易に実施できることからアツセイ１がルーチ
ンに用いられた。

アツセイ1: 100mMトリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン
（トリス）/10μＭピリドキサール燐酸（pH7.5）中の10
mM PPTおよび10mMα−ケトグルタレートを30℃で30分間
インキユベートした。形成されたグルタメートをMethod
s in Enzymology,113、245記載の方法によりグルタメー
トデヒドロゲナーゼと反応させることにより測定した。

アツセイ2: PPTおよびα−ケトグルタレートの代りに10mMの（３
−カルボキシ−３−オキソ−プロピル）−メチル−ホス
フイン酸および10mMのグルタメートを用いる以外はアツ
セイ１におけると同様にした。形成されたＬ−PPTはア
ミノ酸アナライザーを用いて検出した。

これらアツセイを用いて、精製されたタンパク質につ
いての酵素比活性265nkat/mgタンパク質）（1katal＝１
秒当り１モル転換）が測定された。

かくして測定された酵素反応の最適pHは約９、そして
最適温度は約55℃であつた。

精製されたトランスアミナーゼの最初の40個のＮ−末
端アミノ酸の配列をガス相シークエンサーで調べると次
のとおりであつた:Met−Asn−Ser−Asn−Lys−Glu−Leu
−Met−Gln−Arg−Arg−Ser−Gln−Ala−Ile−Pro−Arg
−Gly−Val−Gly−Gln−Ile−His−Pro−Ile−Phe−Ala
−Asp−Arg−Ala−Glu（Thr）−Asn−Asn（Gly）−20。

実施例 ４ 精製トランスアミナーゼを用いるＬ−PPTの生成 精製トランスアミナーゼを50mMトリス/10μＭピリド
キサール燐酸（pH9.0）中の0.1mg/ml濃度（酵素比活性1
5U/mgタンパク質）で30g/のナトリウム（３−カルボ
キシ−３−オキソ−プロピル）−メチルホスフイネート
および60g/のＬ−グルタメートと55℃でインキユベー
トした。０〜24時間のインキユベーシヨン期間中試料を
採取した。試料採取後酵素を95℃で10分間変性させ、遠
心により除去しそして上清をアミノ酸アナライザー中で
Ｌ−ホスフイノスリシンの形成に関して調べた。その際
転換速度は毎時Ｌ−PPT 16.6g/に達した。酵素濃度を
高めることによりこの収量をもつと改良することもでき
る。

反応終了後、用いられたα−ケト酸の94.3％がＬ−PP
Tに転換されていた（28.3g/）。

実施例 ５ トランスアミナーゼの固定 実施例２で部分的に精製された酵素フラクシヨンをト
ランスアミナーゼの固定に用いた。この酵素調製物にお
いては総タンパク質の約20％がトランスアミナーゼであ
りそして酵素活性は76.4nkat/ml（1kat＝1katal＝１モ
ル転換／秒）であつた。

1M燐酸カリウム緩衝液（pH8.0）中のこのトランスア
ミナーゼ調製物47mlを8gのポリマー担体VA−Epoxy Bios
ynth （Riedel de Haｎ社製）に加えこの混合物を室
温で２日間揺り動かした。

下記３種の緩衝液、すなわち （１） 50mM燐酸カリウム緩衝液、pH7.0、 （２） 1M燐酸カリウム緩衝液、pH8.0および （３） 50mM燐酸カリウム緩衝液、pH7.0 で洗浄したのち31gの湿つた樹脂が得られた。

過剰のオキシラン基はこの樹脂を10mMの２−メルカプ
トエタノール（50mM燐酸カリウム緩衝液中）と１時間イ
ンキユベーシヨンすることにより変換させた。

この担体樹脂はカツプリング後に酵素活性1975nkat
（64mkat/g湿潤樹脂）を有しており、これはカツプリン
グ収率55％に相当する。

このものは0.02％のナトリウムアジドを含有する50mM
燐酸カリウム緩衝液（pH7.0）中４℃で貯蔵した。

実施例 ６ 固定化トランスアミナーゼを用いるＬ−PPTの生成 実施例５で得られたカツプリングされたトランスアミ
ナーゼをカラム反応器中でＬ−PPTの生成に用いた。こ
の目的には20mlのクロマトグラフイーカラムに固定化ト
ランスアミナーゼを充填し、このカラムを42℃で平衡化
しそして基質溶液（20g/ 3−カルボキシ−３−オキソ
−プロピル−メチル−ホスフイン酸（ケト−PPT）/60g/
L−グルタミン酸/10μＭピリドキサール燐酸、pH8.
0）を流速0.5ml/分でカラムにポンプで送つた。用いら
れたケトPPTはカラム通過後に90.4％がＬ−PPTに変換さ
れていた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 クラウス・ザウバー ドイツ連邦共和国デー‐6232バートゾー デン・アム・タウヌス．ケーニヒシユタ イナーシユトラーセ144 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 9/10 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】分子量25,000〜100,000ダルトン、 pH3.5〜5.5にある等電点、 8.0〜9.0の範囲内にある最適pH、および アミノ基供与体としてのＬ−ホスフィノスリシン、γ−
   アミノ酪酸およびグルタメート、ならびにアミノ基受容
   体としての適当なケト化合物に対する基質特異性 を有する、大腸菌DH−１からのトランスアミナーゼ。
2. 【請求項２】大腸菌DH−１を培養しそしてトランスアミ
   ナーゼを単離することからなる請求項１記載のトランス
   アミナーゼの製法。