JP3926817B2 - Ｃ型肝炎ウイルス（ｈｃｖ）ポリペプチド - Google Patents

Description

本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染の流行を管理する物質および方法に関する。さらに詳細には、本発明は、ＨＣＶ感染の検出、予防および治療において免疫学的試薬として有用なポリペプチドに関する。

ＨＣＶは、最初、Ｈｏｕｇｈｔｏｎらにより非Ａ非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）の原因として同定され、そして特徴付けられた。このことは、免疫学的試薬として有用な、多くの一般的かつ特異的なポリペプチドの開示を導いた。Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、ヨーロッパ公開公報第３１８,２１６号；Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、ヨーロッパ公開公報第３８８,２３２号；Ｃｈｏｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：３５９−３６２；Ｋｕｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：３６２−３６４；Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（１９９１）１４：３８１−３８８を参照。これらの刊行物は、ＨＣＶ一般に関する広範な背景およびＨＣＶポリペプチド免疫学的試薬の製造および使用を当該技術分野に提供する。それゆえ、簡潔さのために、特にこれらの刊行物の開示は、参考として本明細書中に援用される。

他者により、Ｈｏｕｇｈｔｏｎらの研究が直ちに利用され、そして拡大された。例えば、Ｈｉｇｈｆｉｅｌｄら、英国特許出願第２,２３９,２４５号（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｌｔｄ．）；Ｗａｎｇ、ヨーロッパ公開公報第４４２,３９４（Ｕｎ
ｉｔｅｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ．）；Ｌｅｕｎｇら、ヨーロッパ公開公報第４４５,４２３（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）；Ｈａｂｉｔｓら、ヨーロッ
パ公開公報第４５１,８９１号（Ａｋｚｏ Ｎ．Ｖ．）；Ｒｅｙｅｓら、ＰＣＴ公開公報
第ＷＯ ９１/１５５１６（Ｇｅｎｅｌａｂｓ Ｉｎｃ．）；Ｍａｋｉら、ヨーロッパ公
開公報第４６８,６５７号（Ｔｏｎｅｎ Ｃｏｒｐ．）；およびＫａｍａｄａら、ヨーロ
ッパ公開公報第４６９,３４８号（Ｓｈｉｏｎｏｇｉ Ｓｅｉｙａｋｕ Ｋ．Ｋ．）を参
照。

ＨＣＶのキャリアおよびＨＣＶ汚染された血液または血液製剤をスクリーニングおよび同定する高感度で特異的な方法は、医療における重要な進歩である。輸血後肝炎（ＰＴＨ）は、輸血患者の約１０％で起こり、そしてＨＣＶは、これらの患者の９０％までの割合を占める。これらの病気の主要な問題は、慢性的な肝損傷へしばしば進行することである（２５〜５５％）。患者の看護、そして血液および血液製剤による、または密接な対人接触によるＨＣＶ感染の予防には、ＨＣＶに関連する抗体を検出するために、信頼性のある診断および予後の手段（例えば、ＨＣＶポリペプチド）が必要とされる。そのようなポリペプチドはまた、病気の予防および/または治療のためのワクチンおよび免疫療法的な治
療薬として有用である。

ＨＣＶは、比較的新しい因子なので、病気の臨床経過および集団におけるＨＣＶの疫学の一層の研究を可能にすべく、さらなる免疫学的試薬を明らかにし続ける必要性がある。

したがって、信頼性のある診断および予後の手段、病気の予防および/または治療のた
めのワクチンおよび免疫療法的な治療薬を提供することが、本発明が解決しようとする課題である。

本発明は、新規なＨＣＶエピトープの特徴付けに関する。これらのエピトープの特徴付けをすることにより、ＨＣＶに対する抗体と免疫学的に反応する、および/またはインビ
ボで抗ＨＣＶ抗体の産生を起こすポリペプチド生成物の製造が可能となる。これらのポリペプチド生成物は、診断テストにおける標準物または試薬として、および/またはワクチ
ンの成分として、有用である。これらのポリペプチド配列内に含まれるＨＣＶエピトープに対する抗体、例えば、ポリクローナルおよびモノクローナルの両方を含有する抗体は、例えば、診断テストにおいて、治療薬として、抗ウイルス剤のスクリーニング用に、そしてＨＣＶポリペプチドまたは粒子の単離/精製のうち単離用に有用な試薬である。

最も広い意味では、本発明は、本明細書中に開示された新しく特徴付けられたＨＣＶエピトープを含有するポリペプチド、そのようなポリペプチドを製造する方法（例えば、組換え方法および合成方法）、そのようなポリペプチドを使用する方法（例えば、診断薬、ワクチンおよび治療薬）、およびそのような使用に適合した製造物、組成物または製剤（例えば、イムノアッセイ法または他の支持体に固定されたポリペプチド、経口のまたは注入可能な薬学的組成物）に関する。同様に、本明細書中に開示されたＨＣＶエピトープに対する抗体（ポリクローナル、モノクローナル、または、例えば結合フラグメント、一本鎖抗原結合タンパク質などの等価物）はまた、本発明の範囲内に包含される。さらに、そのような抗体を作製する方法、そのような抗体を使用する方法（例えば、診断薬、ワクチンおよび治療薬）、およびそのような使用に適合した製造物、組成物または製剤（例えば、イムノアッセイ法または他の支持体に固定された抗体、経口のまたは注入可能な薬学的組成物）もまた、本発明の範囲内に包含される。

本発明の別の局面は、適切な容器内に上記の抗体を含有して、ＨＣＶ抗原の存在について試料を分析するキットに関する。本発明のさらに別の局面は、適切な容器内に上記のようなポリペプチドを含有して、ＨＣＶ抗原に対する抗体の存在について試料を分析するキットに関する。

本発明のさらに別の局面は、以下の通りである：新たに開示されたＨＣＶエピトープを含有するポリペプチドを産生する方法であって、該方法が、該ポリペプチドを発現させる条件下でＨＣＶエピトープを含有するポリペプチドをコードする配列を含有する発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養することを包含する方法であり；そしてこの方法により産生したそのようなＨＣＶエピトープを含有するポリペプチドである。

イムノアッセイ法もまた、本発明に包含される。その例として、ＨＣＶ抗原を検出するイムノアッセイ法であって、抗原−抗体複合体を形成させるような条件下で上記のような抗体と共にＨＣＶ抗原を含有すると思われる試料を培養すること；および、その抗体を含有する抗原−抗体複合体を検出することを包含するイムノアッセイ法がある。抗ＨＣＶ抗体を検出するイムノアッセイ法であって、抗原−抗体複合体を形成させるような条件下で、上記のようなポリペプチドと共に抗ＨＣＶ抗体を含有すると思われる試料をインキュベーションすること；および、そのポリペプチドを含有する抗原−抗体複合体を検出することを包含するイムノアッセイ法もある。

さらに、本明細書中に記載されるＨＣＶエピトープを含有する免疫原性ペプチドを含有する、ＨＣＶ感染の治療用ワクチンが、本発明中に包含される。

本発明のさらに別の局面は、ＨＣＶに対する抗体を産生する方法であって、該方法が、免疫応答を生じるのに十分な量で本明細書中に記載のＨＣＶエピトープを含有する単離された免疫原性ポリペプチドを対象に投与することを包含する方法である。

本発明の上記の局面は、以下の式
ａａ_ｘ−ａａ_ｙ
で表されるＨＣＶエピトープを発見したことにより達成されている。
ここで、ａａはアミノ酸を示す；
ｘおよびｙは、ｙ−ｘ≧６である整数である；
ａａ_ｘ−ａａ_ｙは、図１のアミノ酸配列の一部分を示す；そして、
ｘは、以下の２３−３４、３６、６６−７９、８１−９４、９６−９８、１０１−１０３、１８６−１８９、１９１、２０６、２２３、２３２、２５６、２８６、２９７−２９９、３２１、３４７、３５７、４１３、４１４、４３２、４６５−４７１、４８０−４８４、５０１、５０２、５２１、５４０−５４９、５７９、５９４−５９９、６０１−６１３、６４１、６６２−６６５、６８５、７０５、７０６、７２９、７８２−７８９、８０１、８５１−８５５、８９３、９１６、９２８、９４６、９５２−９５４、１０２６、１０７２、１１０９、１１１２−１１１７、１２１８、１２４０、１２８０−１２８５、１３２２、１３３８、１３７１、１３８４、１４１０、１４１１、１４５４、１４９２、１４９３、１５３２−１５３５、１５６０、１５６１、１５６６−１５６８、１５７１−１５７７、１６０１−１６０７、１６１５−１６２０、１６５５、１６９５、１７１０−１７１２、１７２８、１７２９、１７５８−１７６２、１７８１、１８０８、１８２１、１８５１、１８８０、１９０８−１９１３、１９２５、１９４０−１９４８、１９５１、１９６６−１９６９、１９９９、２００１−２００４、２００６−２０１４、２０２４、２０４８−２０５３、２０５５−２０５７、２０７１、２０８８−２０９３、２１０８、２１２２−２１４８、２１６５、２１８７、２２２６−２２３２、２２４４−２２４９、２２６７、２２８１−２２８６、２２８８、２２８９、２３２５−２３２７、２３４６、２３４７、２３４９、２３８２、２４０１、２４１７−２４２２、２４３９−２４４４、２４４６−２４５６、２４６９、２４７１−２４７６、２４９５、２５３３、２５３４、２５７３−２５７８、２６０２−２６０４、２６０６−２６１２、２６３２−２６３８、２６６０、２６７６−２６７９、２６８８−２６９３、２７０７、２７２１、２７５７−２７６２、２７７９、２７９４、２７９５、２７９７−２７９９、２８０１、２８０２、２８１７−２８４３、２８６３−２８６７、２８７８−２８８４、２８８６−２８９５
から成る群から選択される。

上記の目的はまた、以下の式
ａａ_ｘ−ａａ_ｙ
で表されるＨＣＶエピトープを用いて達成される。
ここで、ａａはアミノ酸を示す；
ｘおよびｙは、ｙ−ｘ≧６である整数である；
ａａ_ｘ−ａａ_ｙは、図１のアミノ酸配列の一部分を示す；そして、
Ｘは、以下の３５（ｙが４５以下の場合）、８０（ｙが９０以下の場合）、９５（ｙが１１０以下の場合）、９９（ｙが１２０以下の場合〉、１００（ｙが１５０以下の場合）、１９０（ｙが２１０以下の場合）、５００（ｙが５５０以下の場合）、６００（ｙが６２５以下の場合）、１２６０（ｙが１２８０以下の場合）、１５６９（ｙが１９３１以下の場合）、１５７０（ｙが１５９０以下の場合）、１６９４（ｙが１７３５以下の場合）、１９４９（ｙが２１２４以下の場合）、１９５０（ｙが１９８５以下の場合）、２０００（ｙが２０５０以下の場合）、２００５（ｙが２０２５以下の場合）、２０５４（ｙが２２２３以下の場合）、２２５０（ｙが２３３０以下の場合）、２２８７（ｙが２３８５以下の場合）、２２９０（ｙが２３１０以下の場合）、２３４５（ｙが２３７５以下の場合）、２３４８（ｙが２４６４以下の場合）、２４４５（ｙが２４７５以下の場合）、２４７０（ｙが２４９０以下の場合）、２６０５（ｙが２６２０以下の場合）、２７８０（ｙが２８３０以下の場合）、２７９６（ｙが２８８６以下の場合）、２８００（ｙが２８５０以下の場合）、および２８８５（ｙが２９０５以下の場合）、から成る群から選択される。

上記式のいずれかにおいて、ｘ−ｙは、本発明のいくつかの実施態様において、１０、２０、３０、４０または５０より小さいか、または、等しい数であり得る。

本明細書中で言及される刊行物への完全な引用は、「背景」または「参考文献」の節に見い出され得る。

Ｉ．定義
「Ｃ型肝炎ウイルス」または「ＨＣＶ」は、その病原性株がＮＡＮＢＨを引き起こす当該分野で認識されたウイルス種、および弱毒化株またはそれから誘導される欠陥干渉粒子を表す。一般的には、「背景」と題する節に引用された刊行物を参照。ＨＣＶゲノムは、ＲＮＡから成っている。ＲＮＡを含有するウイルスは、比較的高い割合で自然突然変異を有することが知られており、すなわち組み入れられたヌクレオチド当り１０^−３〜１０^−４の頻度で起こることが報告されている（ＦｉｅｌｄｓおよびＫｎｉｐｅ（１９８６））。それゆえ、遺伝子型の異質性および流動性は、ＲＮＡウイルスに固有であり、ＨＣＶ種内で毒性または無毒性であり得る多種類の株/分離株がある。種々のＨＣＶ株/分離株の増殖、同定、検出および分離は、文献に十分に記載されている。さらに、本明細書中での開示は、種々の株/分離株に対する診断薬およびワクチンの調製を可能にし、そして薬学的
使用のための抗ウイルス剤、例えば、ＨＣＶの複製を阻害する薬剤、に対するスクリーニング手法において使用する組成物および方法の調製を可能にする。

ＨＣＶの幾つかの異なった株/分離株の情報は、本明細書中に開示され、特にＣＤＣ/ＨＣＶ１株または分離株（ＨＣＶ１とも呼ばれる）が開示されている。１つの株または分離株、例えば、部分的ゲノムまたはアミノ酸配列、からの情報は、当業者が、標準的技法を用いて新しい株/分離株を分離し、そしてそのような新しい株/分離株がＨＣＶであるかどうかを同定することを十分可能にする。例えば、幾つかの異なった株/分離株が以下に記
載されている。これらの株は、多くのヒト血清から（および異なった地域から）得られ、ＨＣＶ１のゲノム配列からの情報を利用して分離された。

本明細書中で提供される情報によれば、ＨＣＶはフラビウイルス科と遠い関係にあり得ることが示される。フラビウイルス科は、小さな膜で包まれたヒトの病原体である多数のウイルスを包含する。フラビウイルス粒子の形態および構成は公知であり、そしてＢｒｉｎｔｏｎ（１９８６）により考察されている。一般に、形態に関しては、フラビウイルスは、中央に脂質二重層で囲まれたヌクレオキャプシドを含有している。ビリオンは、球状であり、直径が約４０〜５０ｎｍである。それらのコアは、直径が約２５〜３０ｎｍである。ビリオンのエンベロープの外表面に沿って、末端に直径約２ｎｍのこぶを有する長さ約５〜１０ｎｍ突出部がある。この科の代表的な例としては、黄熱病ウイルス、西ナイルウイルスおよびデング熱ウイルスがある。それらは、ＨＣＶのゲノムよりわずかに大きく、約３５００個のアミノ酸を有するポリタンパク質前駆体をコードする正鎖ＲＮＡゲノム（〜１１,０００ヌクレオチド）を有している。個々のウイルスタンパク質は、この前駆
体ポリペプチドから開裂されて生じる。

ＨＣＶゲノムＲＮＡのゲノム構造およびヌクレオチド配列が推定されている。そのゲノムは、〜１０,０００ヌクレオチドを含有する一本鎖ＲＮＡのようである。そのゲノムは
、正鎖であり、そして約３,０００個のアミノ酸を有するポリタンパク質をコードしてい
る連続的で翻訳されるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有している。そのＯＲＦにおいて、構造タンパク質はＮ末端領域の最初の約４分の１においてコードされており、ポリタンパク質の大部分は非構造タンパク質に対応するようである。すべての既知のウイルス配列と比較すると、小さいが重要な共直線性の相同性が、フラビウイルス科の非構
造タンパク質および（現在フラビウイルスの一部分であるとも考えられている）ペスチウイルスで見られる。

ＨＣＶ１のヌクレオチド配列においてコードされる推定アミノ酸および他の証拠に基づくと、コードされたＨＣＶポリタンパク質の可能なタンパク質ドメインおよびおよその境界は、次の通りである：

しかしながら、これらのドメインは仮のものである。例えば、Ｅ１−ＮＳ２の境界は、多分７５０〜８１０領域にあり、そしてＮＳ３−ＮＳ４の境界は、約１６４０〜１６５０領域である。Ｃの１９１個のアミノ酸バージョンは、（例えば、約１７０アミノ酸の長さに）さらにプロセシングされる前駆体であり、そしてＮＳ２、ＮＳ４およびＮＳ５のタンパク質は、各々さらにプロセシングされて２つの成熟タンパク質になることもまた立証されている。

ＨＣＶの異なった株、分離株またはサブタイプは、ＨＣＶ１と比べて、アミノ酸および核酸における変異を含有すると予想される。多くの分離株は、ＨＣＶ１と比べて、全アミノ酸配列において高い（すなわち、約４０％より高い）相同性を示すと予想される。しかし、他より相同性の少ないＨＣＶ分離株があることもまた見い出され得る。これらは、種々の判定基準に従ってＨＣＶとして定義される。それらの基準としては、例えば、ＨＣＶ１のポリタンパク質と同様の大きさのポリタンパク質をコードしている約９,０００ヌク
レオチドから約１２,０００ヌクレオチドまでのＯＲＦ、ＨＣＶ１のポリタンパク質と同
様の疎水性および/または抗原性を有するコードされたポリタンパク質、およびＨＣＶ１
で保存される共直線性ペプチド配列の存在である。さらに、ゲノムは、正鎖ＲＮＡであろう。

ＨＣＶは、少なくとも１つのエピトープをコードし、そのエピトープは、ＨＣＶ１ポリタンパク質中のエピトープで免疫学的に同定される。エピトープは、既知のフラビウイルスと比較した場合、ＨＣＶに特有である。このエピトープの特有性は、抗ＨＣＶ抗体との免疫反応性および既知のフラビウイルス種に対する抗体との免疫反応性の欠如により測定され得る。免疫反応性を測定する方法は、当該分野では公知であり、例えば、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイ、赤血球凝集反応、およびアッセイに適切な方法のいくつかの例が、本明細書中で提供される。あるいは、ＨＣＶエピトープの配列とフラビウイルス科のメンバーの既知の配列との比較が、「特有性」を評価するために用いられ得る。

上記に加えて、核酸の相同性およびアミノ酸の相同性の以下のパラメーターが、単独ま
たは組合せのいずれかで利用され、ＨＣＶとして株/分離株が同定される。ＨＣＶ株およ
び分離株は、進化的に関連しているので、ヌクレオチドレベルでのゲノムの全体の相同性は、約１０％またはそれより高いものであり得、おそらく約４０％またはそれより高く、おそらく約６０％またはそれより高く、そしてなおいっそうおそらく約８０％またはそれより高いものであろうし、そして、少なくとも約１３個のヌクレオチドの対応する連続した配列があるであろう。ＨＣＶゲノム内に可変領域および超可変領域があることは注目すべきである；それゆえ、これらの領域の相同性は、ゲノム全体の相同性より有意に低いと予想されることが注目されるべきである。推定のＨＣＶ株ゲノム配列と、例えばＣＤＣ/
ＨＣＶｌ ｃＤＮＡとの間の対応が、当該分野の公知の方法により決定され得る。例えば、それらは、推定ＨＣＶからのポリヌクレオチドの配列情報と、本明細書中に記載のＨＣＶ ｃＤＮＡ配列との直接の比較により決定され得る。例えば、さらに、相同領域間で安定な二量体（例えば、Ｓ1消化の前に用いられる二量体）を形成するような条件下で、ポ
リヌクレオチドのハイブリダイゼイションを行い、次いで一本鎖に特異的なヌクレアーゼで消化し、次いで消化されたフラグメントの大きさを決定することにより、それらは決定され得る。

ＨＣＶ株または分離株の進化上の関係により、推定ＨＣＶ株または分離株が、ポリペプチドレベルでの相同性により同定され得る。一般に、ＨＣＶ株または分離株は、ポリペプチドレベルで、少なくとも１０％の相同性があり、約４０％以上の相同性があり、おそらく約７０％以上の相同性があり、そしてなおいっそうおそらく約８０％以上の相同性があることが予想され、そしてある種のものは約９０％以上の相同性さえあり得る。アミノ酸配列相同性の決定方法は、当該分野では公知である。例えば、アミノ酸配列は直接決定され得、そして本明細書中に記載の配列と比較され得る。あるいは、推定ＨＣＶのゲノム物質のヌクレオチド配列が決定され（通常は、ｃＤＮＡ中間体を経て）、その中にコードされるアミノ酸配列が決定され、そして対応する領域が比較され得る。

本明細書中に用いられるところの、指定された配列「に由来する」ポリヌクレオチドとは、指定されたヌクレオチド配列の領域に対応して、およそ少なくとも約６個のヌクレオチド配列、好ましくは少なくとも約８個のヌクレオチド配列、より好ましくは少なくとも約１０〜１２個のヌクレオチド配列、そしていっそうより好ましくは少なくとも約１５〜２０個のヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド配列を示す。「対応する」とは、指定された配列に相同的であるか、または、相補的であることを意味する。好ましくは、ポリヌクレオチドの由来する領域の配列は、ＨＣＶゲノムに特有の配列に相同的であるか、または、相補的である。配列がＨＣＶゲノムに特有であるかどうかは、当業者に公知の方法により決定され得る。例えば、その配列は、（優先日の時点での）データバンク（例えば、Ｇｅｎｅｂａｎｋ）の配列と比較されて、非感染の宿主または他の生物中に存在するかどうかが決定され得る。その配列はまた、（優先日の時点での）他のウイルス性因子の肝炎を誘発することが知られているウイルス性因子、例えば、ＨＡＶ、ＨＢＶおよびＨＤＶを含む既知の配列およびフラビウイルス科のメンバーと比較され得る。由来する配列と他の配列との対応性または非対応性はまた、適切に厳密な条件下でのハイブリダイゼイションにより決定され得る。核酸配列の相補性を決定するハイブリダイゼイション法は、当該分野では公知である。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）を参照。さらに、ハイブリダイゼイションにより形成される二量体ポリヌクレオチドのミスマッチはまた、例えば、二重体ポリヌクレオチド内の一本鎖領域を特異的に消化するＳ１のようなヌクレアーゼとの消化を包含する公知の方法により決定され得る。典型的なＤＮＡ配列が「由来」し得る領域は、例えば、特異的なエピトープをコードする領域、および非転写および/また
は非翻訳の領域を包含するが、それらに限定されるものではない。

由来するポリヌクレオチドは、必ずしも示されたヌクレオチド配列に物理的に由来せず、例えば、化学合成またはＤＮＡ複製または逆転写または転写を包含するような任意の方
法により生じ得る。さらに、指定の配列の領域に対応する領域の組合せは、意図する方法と合致するように、当該分野で公知の方法で改変され得る。

同様に、指定されたアミノ酸配列または核酸配列「に由来する」ポリペプチドまたはアミノ酸配列は、配列内でコードされるポリペプチドのアミノ酸配列またはその一部分と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを示す。ここで、その一部分は、少なくとも３〜５個のアミノ酸、そしてより好ましくは、少なくとも８〜１０個のアミノ酸、そしてより好ましくは少なくとも１１〜１５個のアミノ酸から成り、あるいは配列内でコードされるポリペプチドと免疫学的に同一であり得る。この用語はまた、指定された核酸配列から発現されるポリペプチドを包含する。

組換えまたは由来するポリペプチドは、必ずしも指定された核酸配列から翻訳されない；それは、例えば、化学合成、または組換え発現系の発現、または変異ＨＣＶを含むＨＣＶからの分離を包含する任意の方法により生じ得る。組換えまたは由来のポリペプチドは、その配列内にアミノ酸または非天然アミノ酸の１個またはそれ以上の類似体を含有し得る。アミノ酸の類似体を配列内に挿入する方法は、当該分野では公知である。それはまた、１個またはそれ以上の標識を含有し得、これは当該分野では公知である。

本明細書中で用いられる「組換えポリヌクレオチド」という用語は、ゲノム起源、ｃＤＮＡ起源、半合成起源、または合成起源のポリヌクレオチドを意味し、そしてそれは、その起源または操作により、（１）天然で会合しているポリヌクレオチドの全部または一部分と会合していない、（２）天然で結合しているポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドに結合している、または（３）天然には存在しない。

本明細書中で用いられる「ポリヌクレオチド」という用語は、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形、すなわちリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかを示す。この用語は、分子の一次構造のみを示す。それゆえ、この用語は、二本鎖および一本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。それはまた、既知のタイプの改変、例えば、当該分野で公知の標識、メチル化、「キャップ化」、１個またはそれ以上の天然由来のヌクレオチドの類似体との置換、ヌクレオチド間の改変（例えば、非電荷的結合による改変（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど）および電荷的結合による改変（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオニートなど）、ペンダント部分を含有する改変、例えばタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなどを包含する）、インターカレーターによる改変（例えば、アクリジン、プソラレンなど）、キレーターを含有する改変（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化性金属など）、アルキレーターを含有する改変、改変された結合による改変（例えば、α−アノマー性核酸など）、およびポリヌクレオチドの非改変形を包含する。

「精製された」ポリペプチドは、そのポリペプチドが、実質的に他のポリペプチドのない状態で存在すること、すなわち、組成物中に所望のポリペプチドを最低約５０重量％（組成物中、所望のポリペプチド/総ポリペプチド）、好ましくは最低約７０重量％、そし
てより好ましくは最低約９０重量％を、組成物中の非タンパク質様物質に関係なく含有することを示す。ウイルス性ポリペプチドを精製する方法は、当該分野では公知である。精製された抗体が同様に定義される。

「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞系」、「細胞培養物」、および微生物または単細胞体として培養される高等真核細胞系を表すような他の用語は、組換えベクターまたは他の転移ＤＮＡに対するレシピエントとして用いられ得る、または用いられて来た細胞を示し、そして形質転換された元の細胞の子孫を包含する。単一の親細胞の
子孫は、元の親細胞と形態学的に、あるいは相補的なゲノムＤＮＡまたは全ＤＮＡにおいて、自然変異、偶発性変異または意図的変異によって、必ずしも完全に同一ではないことが理解される。

「レプリコン」は、任意の遺伝的要素であり、例えば、プラスミド、染色体、ウイルス、コスミッドなどであり、細胞すなわち、自身の制御下で複製し得る細胞内のポリヌクレオチド複製の独立単位として挙動する。

「ベクター」は、結合したセグメントの複製および/または発現を引き起こすように別
のポリヌクレオチドセグメントが結合しているレプリコンである。

「制御配列」は、それらが連結するコード配列を発現するのに必要なポリヌクレオチド配列を示す。そのような制御配列の性質は、宿主生物によって異なる；原核細胞では、一般に、そのような制御配列は、プロモーター、リボソーム結合部位、およびターミネーターを含有する；真核細胞では、一般に、そのような制御配列は、プロモーター、ターミネーターおよび、ある場合にはエンハンサーを含有する。「制御配列」という用語は、最低限その存在が発現に必要であるすべての成分を含有することを意味し、そしてその存在が有益である他の成分、例えば、リーダー配列もまた含有し得る。

「作動可能に連結された」は、上記の成分が、それらの成分を意図した方法で機能させる関係であるように並べて配置することを示す。コード配列に「作動可能に連結された」制御配列は、コード配列の発現が制御配列に適合する条件下で行われるような方法で連結される。

「オープンリーディングフレーム」（ＯＲＦ）は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの領域である；この領域は、コード配列の一部分または全コード配列を表す。

「コード配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合、ｍＲＮＡに転写され、そして/またはポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列である。コード配列の境界
は、５’末端での翻訳開始コドンおよび３’末端での翻訳終止コドンにより決定される。コード配列は、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡおよび組換えポリヌクレオチド配列を包含し得るが、それらに限定されるものではない。

「により／として免疫学的に同定可能な」は、指定されたポリペプチド、通常ＨＣＶタンパク質中にもまた存在するエピトープおよびポリペプチドの存在することをいう。免疫学的な同一性は、抗体による結合および/または結合における競合により決定され得る；
これらの方法は、当業者には公知である。

本明細書中で用いられるように、「エピトープ」は、ポリペプチドの抗原性決定基をいう。エピトープは、抗体の結合部位を決定する３個またはそれ以上のアミノ酸を含有し得る。一般に、エピトープは、少なくとも５個のアミノ酸から成り、そしてある場合には少なくとも８個のアミノ酸から成る。エピトープのマッピングの方法は、当該分野では公知である。

ポリペプチド内に含まれる特異的エピトープを抗体が認識することによりそのポリペプチドが抗体に結合するとき、そのポリペプチドは抗体と「免疫学的に反応」する。免疫学的な反応性は、抗体結合により、特に抗体結合の反応速度論により、および/または抗体
が反応するエピトープを含有する既知のポリペプチドを競合因子として用いて結合する際の競合反応により、決定され得る。ポリペプチドが抗体と免疫学的に反応するかどうかを決定する方法は、当該分野では公知である。

本明細書中で用いられる「抗体」という用語は、少なくとも１個の抗体結合部位から成るポリペプチドまたはポリペプチド群をいう。「抗体結合部位」または「結合ドメイン」は、抗体分子の可変ドメインの折りたたみで形成されており、エピトープの特徴と相補的であるような、内部表面の形状および電荷の分布を有する三次元結合空間を形成し、抗原と免疫学的に反応させる。抗体結合部位は、重鎖ドメインおよび/または軽鎖ドメイン（
それぞれＶ_ＨおよびＶ_Ｌ）から形成され得、そしてそれらのドメインは、抗原結合に寄与する超可変ループ構造を形成する。「抗体」という用語は、例えば、脊推動物抗体、ハイブリッド抗体、キメラ抗体、変異抗体、一価抗体、Ｆａｂタンパク質および単一ドメイン抗体を包含する。

本明細書中で用いられる「単一ドメイン抗体」（ｄＡｂ）は、ＶＨドメインから成る抗体であり、指定された抗原と免疫学的に反応する。ｄＡｂは、Ｖ_Ｌドメインを含有しないが、抗体中に存在することが知られている他の抗原結合ドメイン、例えばκドメインおよびλドメインを含有し得る。ｄＡｂを調製する方法は、当該分野では公知である。例えば、Ｗａｒｄら（１９８９）を参照。

抗体はまた、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌドメイン、および他の既知の抗原結合ドメインから成り得る。これらのタイプの抗体およびそれらの調製方法の例は、当該分野では公知であり（例えば、米国特許第４,８１６,４６７号を参照。本明細書中に援用されている。）、そして以下のことを包含する。例えば、「脊椎動物抗体」は、テトラマーまたはその凝集体である抗体を示し、軽鎖および重鎖を含有する。その軽鎖および重鎖は、通常、「Ｙ」立体配置内に凝集され、そして鎖間の共有結合的連結を有し得るか、または有し得ない。脊椎動物抗体において、特定の抗体のすべての鎖のアミノ酸配列は、インサイチュまたはインビトロ（例えば、ハイブリドーマで）でその抗体を産生するリンパ球により産生されるある種の抗体において見い出される鎖と相同性がある。脊椎動物抗体は、典型的に、自然抗体、例えば、精製されたポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を包含する。これらの抗体の調製方法の例としては、下記に示す。

「ハイブリッド抗体」は、一方の対の重鎖および軽鎖が、第一抗体の重鎖および軽鎖と相同的であるが、他方の対の重鎖および軽鎖が、異なる第二抗体の重鎖および軽鎖と相同的である、という抗体である。典型的には、これら２つの対の各々は、異なるエピトープと結合し、特に異なる抗原上で結合する。この結果、「二価」の性質、すなわち２つの抗原を同時に結合する能力を生じる。そのようなハイブリッドはまた、下記のように、キメラ鎖を用いて形成され得る。

「キメラ抗体」は、重鎖および/または軽鎖が融合タンパク質である抗体である。典型
的には、その鎖の定常ドメインは、ある特定の種および/またはクラスに由来し、そして
可変ドメインは、異なる種および/またはクラスに由来する。さらに、重鎖または軽鎖の
いずれかまたは両方が、異なる起源の抗体の配列を模倣する配列の組合せから成ることは、これらの起源のクラスが異なるか、または起源の異なった種であるかどうか、そして融合点が、可変部/定常部の境界にあるかどうか、を包含する。それゆえ、その定常領域ま
たは可変領域のいずれも既知の抗体配列を摸倣しない抗体を産生することは可能である。次いで、例えば、可変領域が特定の抗原に対して高い特異的な親和性を有し、または定常領域への補体結合の程度を大きくし得るような抗体を構築すること、あるいは特定の定常領域が有する性質を他に改良することが可能となる。

別の例としては「変異抗体」があるが、それは、脊椎動物抗体における天然由来のアミノ酸配列が変異された抗体をいう。組換えＤＮＡ技術を用いて、抗体を、所望の特徴を得るために再設計し得る。可能な変異は多数あり、そしてそれは、１個またはそれ以上のア
ミノ酸の変化からある領域、例えば、定常領域、の完全な再設計までの範囲で可能である。定常領域における変化は、一般的に、所望の細胞プロセス特性を得る変化であり、例えば、補体結合、膜との相互作用、および他のエフェクター機能における変化がある。可変領域における変化は、抗原結合特性を変化させるためになされ得る。抗体はまた、分子または物質の特異的な細胞または組織部位への特異的な送達を促進するように設計され得る。所望の改変は、分子生物学における既知の方法、例えば、組換え法、部位特異的突然変異誘発によってなされ得る。

また別の例は「一価抗体」であり、これは、別の重鎖のＦｃ（すなわち、定常）領域に結合した重鎖/軽鎖のダイマーから成る集合体である。このタイプの抗体は、抗原転調を
生じない。例えば、Ｇｌｅｎｎｉｅら（１９８２）を参照。

抗体の定義内には、抗体の「Ｆａｂ」フラグメントもまた含まれる。「Ｆａｂ」領域は、重鎖および軽鎖の部分に関し、この部分は、重鎖および軽鎖の枝部分を含有し、かつ特殊化された抗原に対し免疫学的結合を示すが、Ｆｃ部分を欠く配列と、およそ等価であるか、または類似している。「Ｆａｂ」は、１本の重鎖および１本の軽鎖の集合体（通常Ｆａｂ’として知られる）、および２本のＨ鎖および２本のＬ鎖を含有するテトラマー（Ｆ（ａｂ）_２と呼ばれる）を含み、選択的に所望の抗原または抗体ファミリーと反応し得る。「Ｆａｂ」抗体は、上記に類似のサブセット、すなわち、「脊椎Ｆａｂ」、「ハイブリッドＦａｂ」、「キメラＦａｂ」、および「改変Ｆａｂ」に分けられ得る。抗体の「Ｆａｂ」フラグメントを生成する方法は、当該分野において周知であり、例えば、タンパク質分解、および組換え法による合成を包含する。

また「抗体」という用語には、一本鎖抗原結合（ＳＣＡ）タンパク質が含まれ、例えば、１９９２年６月１５日に発行のＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ中のＳｃｈｌｏｍ、Ｊ．共著の論文（および本明細書中に援用された論文）に記戟されたタイプがある。

本明細書中で用いられている「免疫原性ポリペプチド」という用語は、単独であるいはキャリアと結合して、アジュバンドの存在または非存在下で、細胞性および/または体液
性の免疫応答を生じさせるポリペプチドをいう。

「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸のポリマーについていい、特定の長さの生成物をいうわけではない；従って、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質は、ポリペプチドの定義内に含まれる。この用語はまた、ポリペプチドの発現後の改変物（例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など）について言わず、すなわちこれを除外する。本定義内には、例えば、１つまたはそれ以上のアミノ酸のアナログ（例えば、非天然アミノ酸などを包含する）を含有するポリペプチド、置換された結合を有するポリペプチド、および当該分野で知られる他の改変物が、天然産生および非天然産生のいずれであっても含まれ得る。

本明細書中で用いられている「形質転換」は、挿入に用いられる方法に関わらず、外因性ポリヌクレオチドを宿主細胞へ挿入することをいう。挿入に用いられる方法には、例えば、直接取込み、形質導入、ｆ交配、またはエレクトロポーレーションがある。外因性ポリヌクレオチドは、非組込みベクター（例えば、プラスミド）として維持され得るか、あるいは宿主ゲノム中に組み込まれ得る。

本明細書中で用いられている「処置」は、予防および/または治療についていう。

本明細書中で用いられている「個体」は、脊推動物、特に多数の哺乳類種についていい、動物（例えばイヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット、モル
モットなど）および霊長類（サル、チンパンジー、ヒヒ、およびヒトを包含する）を包含するが、これに限定されない。

本明細書中で用いられている核酸の「センス鎖」は、ｍＲＮＡの配列と配列相同性を有する配列を含む。「アンチセンス鎖」は、「センス鎖」の配列に相補性である配列を含む。

本明細書中で用いられているウイルスの「正鎖ゲノム」は、そのゲノム、すなわちＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかが一本鎖であり、ウイルスポリペプチドをコードするゲノムである。正鎖ＲＮＡウイルスの例には、トガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、およびカリシウイルス科（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ）が含まれる。フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）もまた含まれ、このウイルスは、以前トガウイルス科として分類されていた。ＦｉｅｌｄｓおよびＫｎｉｐｅ（１９８６）を参照。

本明細書中で用いられている「生体成分含有抗体」は、目的とする抗体源である個体生体の成分をいう。生体成分含有抗体は、当該分野において周知であり、例えば、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、気道の外分泌、腸管の外分泌、生殖管の外分泌、涙、唾液、乳、白血球、および骨髄腫を包含するが、これに限定されない。

本明細書中で用いられている「生体試料」は、個体から単離した組織または液状物の試料を言い、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、皮膚の外分泌、気道の外分泌、腸管の外分泌、生殖管の外分泌、涙、唾液、乳、血球、腫瘍、器官、およびインビトロ細胞培養成分の試料（細胞培地における細胞の増殖から得られる馴化培地、推定上ウイルスに感染した細胞、組換え細胞、および細胞成分を包含するがこれに限定されない）もまた包含するが、これに限定されない。

ＩＩ．発明の説明
本発明の実施においては、他に指示されていなければ、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技法が用いられ、これらは当該分野の技術範囲内である。このような技法は、文献に充分に説明されている。例えば、以下を参照。Ｍａｎｉａｔｉｓ、ＦｉｔｓｃｈおよびＳａｍｂｒｏｏｋ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（１９８２）；「ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ」（Ｄ．Ｎ Ｇｌｏｖｅｒ編 １９８５）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編 １９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編 １９８４）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編 １９８４）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編 １９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」（１９８４）；シリーズ、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；「Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ」（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編 １９８７、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ第１５４巻および第１５５巻（それぞれ、ＷｕおよびＧｒｏｓｓｍａｎ、およびＷｕ編）ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編（１９８７）、「Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ）；Ｓｃｏｐｅｓ（１９８７）「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ」、第２版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．）；および「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ，ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編 １９８６）。本明細書中に記載の全ての特許、特許出願、および刊行物は、上記および下記ともに、本明細書中に参考として援用されている。

ＩＩ．Ａ．短型ＨＣＶポリペプチド
本発明の有用な物質および方法は、新規なＨＣＶエピトープを以下のように同定することにより実行可能となる。これらのエピトープ（または抗原領域）を知ることにより、短縮型ＨＣＶ配列を含有するポリペプチドの構築が可能となる。このポリペプチドは、免疫学的試薬として用いられ得る。

少なくとも１つのウイルスエピトープをコードする短縮型ＨＣＶアミノ酸配列は、有用な免疫学的試薬である。例えば、このような短縮型配列を含むポリペプチドは、イムノアッセイの試薬として用いられ得る。これらのポリベプテドはまた、抗血清の生成またはワクチンのための組成物における候補サブユニット抗原である。これらの短縮型配列は天然ウイルスタンパク質の種々の既知の処理により生成され得るが、一般に、ＨＣＶ配列を含む合成または組換えポリペプチドを調製することが好ましい。これらの短縮型ポリペプチドを含むポリペプチドは、ＨＣＶ配列（連続したまたは連続しない１つまたはそれ以上のエピトープ）のみから、またはＨＣＶ配列および融合タンパク質中の異種配列から、形成され得る。有用な異種配列は、組換え宿主から分泌させるか、ＨＣＶエピトープの免疫反応性を高めるか、またはポリペプチドのイムノアッセイ支持体またはワクチンキャリアヘの結合を容易にする配列を包含する。例えば、ヨーロッパ公開公報第１１６,２０１号；
米国特許第４,７７２,８４０号；ヨーロッパ公開公報第２５９,１４９号；米国特許第４,６２９,７８３号。これらの文献の開示は、本明細書中に参考として援用されている。

短縮型ＨＣＶ配列を含むポリペプチドのサイズは、広い範囲で変化し得る。最小サイズは１つのＨＣＶエピトープを与えるのに充分なサイズの配列であり、一方最大サイズは重要ではない。便宜上、最大サイズは、通常、所望のＨＣＶエピトープ、および異種配列がある場合にはその機能を与えるのに必要なサイズよりも実質的に大きいサイズではない。典型的には、短縮型ＨＣＶアミノ酸配列は、長さが約５（または８）から約１００アミノ酸までの範囲内にある。しかし、より典型的には、ＨＣＶ配列は、最大の長さが約５０（または４０）アミノ酸であり、時には最大の長さは約２０、２５、または３０アミノ酸である。少なくとも約８、１０、１２、または１５アミノ酸のＨＣＶ配列を選択することが、通常望ましい。

本明細書中に記載のように有用である短縮型ＨＣＶアミノ酸配列（オクタマー）の例は、以下の実施例中で説明される。これらのペプチドは１つのエピトープを必ずしも正確にマッピングしないことが理解されるべきである。配列中の非免疫原性部分は、従来の方法を用いて定められ、記載の配列から除かれ得る。さらに、エピトープを含有するか、または免疫原性である付加的な短縮型ＨＣＶアミノ酸配列が、本明細書中に記載のようにして同定され得る。

以下で開示される短縮型ＨＣＶアミノ酸配列を含むポリペプチド生成物は、個々のペプチドとして調製され得るか、またはより大きなポリペプチド中に取り込まれ得て、本明細書中に記載のような使用に用いられ得る。好ましい適用においては、Ｅ１および/または
Ｅ２ドメインから得られる短縮型配列が、ワクチンおよび治療生成物に適用される。通常、ドメインのいずれもが診断上の有用性を有し得るが、Ｃ、ＮＳ３、ＮＳ４、およびＮＳ５が特に好ましく、Ｃエピトープと１つまたはそれ以上のＮＳ３、ＮＳ４、またはＮＳ５
ドメインから得られるエピトープとの組合せが特に好ましい。

ＩＩ．Ｂ．ポリペプチドの調製
ＨＣＶアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列が得られることにより、ポリペプチドの抗原活性領域をコードする発現ベクターの構築が可能となる（例えば、図２を参照）。これらの抗原活性領域は、コートまたはエンベロープ抗原、コア抗原、または非構造性の抗原から由来し得る。非構造性の抗原には、例えば、ポリヌクレオチド結合タンパク質、ポリヌクレオチドポリメラーゼ、およびウイルス粒子の複製および/または集合に必要とされ
る他のウイルスタンパク質が包含される。所望のポリペプチドをコードするフラグメントは、例えば、従来の制限消化を用いてウイルスｃＤＮＡクローンから、または合成法により誘導され、そして、例えば、β−ガラクトシダーゼまたはスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）のような融合配列の部分、好ましくはＳＯＤを含み得るベクターに連結される。ＳＯＤの融合配列を含むポリペプチドの産生に有用である方法およびベクターは、１９８６年１０月１日に発行されたヨーロッパ公開公報第０１９６０５６号に記載されている。ＳＯＤおよびＨＣＶポリペプチドの融合ポリペプチドをコードするベクター、すなわちＮＡＮＢ_{５−１−１}、ＮＡＮＢ_８１、およびＣ１００−３（これはＨＣＶ ｃＤＮＡの合成体中でコードされる）は、それぞれ、ＩＶ．Ｂ．１、ＩＶ．Ｂ．２、およびＩＶ．Ｂ．４の部に記載されている。オープンリーディングフレームを含むＨＣＶ ｃＤＮＡのいずれの所望の部分（あるいはそれらの合成変形物）も、組換えポリペプチド、例えば、成熟タンパク質または融合タンパク質を発現するために用いられ得る。

あるいは、ＨＣＶエピトープを含有するポリペプチドは、図面および実施例のアミノ酸配列に基づいて、標準的方法を用いる化学合成により与えられ得る。

所望のポリペプチド配列をコードするＤＮＡは、融合型か非融合型かに関わらず、そして分泌を可能にするシグナル配列を含むかどうかに関わらず、いずれかの便利な宿主に適切である発現ベクター中に連結され得る。真核生物および原核生物の両方の宿主系が、組換えポリペプチドの形成に現在用いられており、宿主細胞株は、ヨーロッパ公開公報第３１８,２１６号に提示されている。次いで、ポリペプチドを、溶解させた細胞、または細
胞培地から単離し、目的とする使用に必要とされる程度にまで精製する。精製は、当該分野において既知である方法によりなされ得、その方法には、例えば、分別抽出、塩分画、イオン交換樹脂クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、遠心分離などがある。例えば、タンパク質を精製する種々の方法に関するＭｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙを参照。このようなポリペプチドは、診断用薬として用いられ得、または中和抗体を生じるポリペプチドは、ワクチンに処方され得る。これらのポリペプチドに対して生成させた抗体もまた、診断用薬として、または受動免疫療法のために用いられ得る。さらに、以下で議論されるように、これらのポリペプチドに対する抗体は、例えば、ＨＣＶ粒子を単離し、同定するのに有用である。

ＨＣＶポリペプチドはまた、ＨＣＶビリオンから単離され、（まだ短縮されていない場合は）短縮され得る。ビリオンは、組織培養におけるＨＣＶ感染細胞中で、または感染宿主中で生育し得る。

ＩＩ．Ｃ．抗原ポリペプチドの調製、およびキャリアとの複合体化
ポリペプチドの抗原領域は、一般的に比較的短い。典型的には８個から１０個のアミノ酸またはそれより短い長さである。わずか５個程度のアミノ酸のフラグメントでも、抗原領域を特徴付け得る。これらのセグメントは、ＨＣＶ抗原の領域に対応し得る。従って、基準としてＨＣＶのｃＤＮＡを用いて、ＨＣＶポリペプチドの短いセグメントをコードするＤＮＡが、融合タンパク質として、または単離されたポリペプチドとして、組換えにより発現され得る。さらに、短いアミノ酸配列は、化学的合成により、好都合に得られ得る
。合成されたポリペプチドが、正確に形成されて正しいエピトープを提供するものの、短すぎるので免疫原性でない場合には、このポリペプチドは適切なキャリアと連結され得る。

このような連結を行うための多くの技法が、当該分野において知られている。その例としては、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）およびスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｏｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）から入手）を用いるジスルフィド結合の形成がある（ペプチドがスルフヒドリル基を有しない場合には、これはシステイン残基の付加により提供され得る）。これらの試薬は、試薬自身と１方のタンパク質上のペプチドシステイン残基との間でジスルフィド結合を創り出し、そして他方のタンパク質におけるリジン上のε−アミノ基または他の遊離アミノ基を介してアミド結合を創り出す。種々のそのようなジスルフィド/アミド形成剤
が既知である。例えば、Ｉｍｍｕｎ Ｒｅｖ（１９８２）６２：１８５を参照。他の二官能性カップリング剤は、ジスルフィド結合ではなくチオエーテルを形成する。多くのこれらのチオ−エーテル形成剤が市販されている。例えば、６−マレイミドカプロン酸、２−ブロモ酢酸、２−ヨード酢酸、４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸などの反応性エステルがある。これらのカルボキシル基は、コハク酸イミドまたは１−ヒドロキシル−２−ニトロ−４−スルホン酸ナトリウム塩との結合により活性化され得る。カップリング剤のさらなる方法は、ヨーロッパ公開公報第２５９,１４９号に記
載のロタウイルス/「結合ペプチド」系を用い、それらの開示は、本明細書中に援用され
ている。上記のリストは包括的ではなく、指定の化合物の改変物が使用され得ることは明らかである。

宿主に有害な抗体の産生をそれ自身誘発しない任意のキャリアが使用され得る。適切なキャリアは、典型的には、代謝速度の遅い巨大分子、例えば、タンパク質；ポリサッカライド（例えば、ラテックス官能化セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（登録商標）、アガロース、セルロース、セルロースビーズなど）；ポリマー性アミノ酸（例えば、ポリグルタミン酸、ポリリジンなど）；アミノ酸コポリマー；および不活性ウイルス粒子である。例えば、セクションＩＩ.Ｄ.を参照。特に、有用なタンパク質基質は、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、オボアルブミン、破傷風トキソイド、および当業者に公知の他のタンパク質である。

ＩＩ．Ｄ．ＨＣＶエピトープを含有するハイブリッド粒子免疫原の調製
ＨＣＶのエピトープの免疫原性は、粒子形成タンパク質と融合させるかまたは構築させた哺乳類系または酵母系においてエピトープを調製することによっても高められ得る。粒子形成タンパク質としては、例えば、Ｂ型肝炎表面抗原に関連するものなどがある。例えば、米国特許第４,７２２,８４０号を参照。粒子形成タンパク質コード配列にＨＣＶエピトープが直接連結している構築物は、ＨＣＶエピトープに関して免疫原性であるハイブリッドを生成する。さらに、調製される全てのベクターは、ＨＢＶに対して特異的であり、例えばプレ−Ｓペプチドのような種々の程度の免疫原性を有するエピトープを含有している。従って、ＨＣＶ配列を含む粒子形成タンパク質から構築される粒子は、ＨＣＶおよびＨＢＶに関して免疫原性である。

肝炎表面抗原（ＨＢＳＡｇ）は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｐ．Ｔａｌｅｎｚｕｅｌａら（１９８２））、および例えば哺乳類細胞（Ｐ．Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら（１９８４））において、形成され、構築されて粒子となることが示されている。このような粒子の形成により、モノマーサブユニットの免疫原性が高められることが示されている。この構築物は、プレ表面（プレ−Ｓ）領域の５５アミノ酸を含むＨＢＳＡｇの免疫優性エピトープをも含有し得る。Ｎｅｕｒａｔｈら（１９８４）。酵母において発現し得るプレ−Ｓ−
ＨＢＳＡｇの構築物は、１９８６年３月１９日に発行されたヨーロッパ公開公報第１７４,４４４号に開示されており；酵母の発現のための非相同のウイルス配列を含むハイブリ
ッドは、１９６６年３月２６日に発行されたヨーロッパ公開公報第１７５,２６１号に開
示されている。これらの構築物はまた、ＳＶ４０−ジヒドロ葉酸レダクターゼベクターを用いて、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のような哺乳類細胞においても発現され得る（Ｍｉｃｈｅｌｌｅら（１９８４））。

さらに、粒子形成タンパク質コード配列の一部は、ＨＣＶエピトープをコードするコドンで置換され得る。この置換では、酵母または哺乳類において免疫原性粒子を形成するためにユニットが集合することを仲介するのに必要でない領域は削除され得、これによりＨＣＶエピトープとの競合から付加的なＨＢＶ抗原部位が除去され得る。

ＩＩ．Ｅ．ワクチンの調製
ワクチンは、１つあるいはそれ以上の、ＨＣＶ由来の免疫原性ペプチドから調製され得る。これらのポリペプチドは種々の宿主細胞（例えば、バクテリア、酵母、昆虫、または哺乳類細胞）で発現され得、またはウイルス調製物から単離され得るか、あるいは合成により生成され得る。ＨＣＶに対する１価または多価のワクチンは、１つあるいはそれ以上の構造タンパク質由来の１つあるいはそれ以上のエピトープ、および/または１つあるい
はそれ以上の非構造タンパク質由来の１つあるいはそれ以上のエピトープから構成され得る。これらのワクチンは、例えば組換えＨＣＶポリペプチドおよび/またはビリオンから
単離されたポリペプチドから構成され得る。特に、１つあるいはそれ以上の以下に示すＨＣＶタンパク質、またはそれら由来のサブユニット抗原を含むワクチンが考察される：Ｅ１、Ｅ２、Ｃ、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４、およびＮＳ５。特に好ましいワクチンは、Ｅ１および/またはＥ２、またはそれらのサブユニットを含んでいる。

上記に加え、１つあるいはそれ以上の組換えＨＣＶポリペプチドを発現する弱毒化微生物の生ワクチンを調製することもまた可能である。適切な弱毒化微生物は、当該分野で既知であり、例えばウイルス（例、ワクチニアウイルス（Ｂｒｏｗｎら（１９８６）を参照））、およびバクテリアを包含する。

活性成分として免疫原性ポリペプチドを含有するワクチンの調製は、当業者に既知である。典型的には、このようなワクチンは、溶液または懸濁液のいずれかとして、注入可能に調製される；注入前の液体中の溶解または懸濁に適した固形物の形態でもまた調製され得る。調製物はまた乳濁され得、またはタンパク質がリポソームにカプセル化され得る。活性免疫原性成分は、薬学的に受容可能であって、活性成分に適合した賦形剤としばしば混合される。適切な賦形剤には、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの混合物がある。さらに、所望であれば、ワクチンは、少量の補助剤（例えば加湿剤または乳化剤）、ｐＨ緩衝剤、および/またはワクチンの
効能を高めるアジュバントを含有し得る。有効であり得るアジュバントの例は、限定されないが、以下を包含する：水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６３７、ｎｏｒ−ＭＤＰと称せられる）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと称せられる）、およびＲＩＢＩ。ＲＩＢＩは、バクテリアから抽出した３成分、すなわちモノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコレート、および細胞壁骨格（ＨＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を２％スクアレン/Ｔｗｅｅｎ（
登録商標）８０エマルジョン中に含有している。アジュバントの効能は、ＨＣＶ抗原配列を含む免疫原性ポリペプチドおよび種々のアジュバントから構成されるワクチンを投与することにより生じる、この免疫原性ポリペプチドに対する抗体の量を測定することにより
決定され得る。

本ワクチンは、通常非経口的に、例えば皮下注射または筋内注射のような、注射により投与される。他の投与態様に適切な別の処方としては、坐薬、およびある場合には経口処方薬が挙げられる。坐薬について、従来の結合剤および担体には、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドが含まれ得る；このような坐薬は、活性成分を０.５
％から１０％までの範囲で、好ましくは１％から２％までの範囲で含有する混合物から形成され得る。経口処方薬は、通常用いられる賦形剤を含有する。この賦形剤としては、例えば、薬学的なグレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、持続放出処方剤、または粉末剤の形態をとり、１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％の活性成分を含有する。 タンパク質は、中性または塩基性の形態でワクチンに処方され得る。薬学的に受容可能な塩は、酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基により形成される）であって、無機酸（例えば、塩酸またはリン酸）または有機酸（酢酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸など）により形成される塩を包含する。遊離カルボキシル基による塩もまた、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第２鉄）、および有機塩基（イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなど）から誘導され得る。

ＩＩ．Ｆ．ワクチンの投与量および投与
本ワクチンは、投与処方に適した方法で、そして予防および/または治療効果があるよ
うな量で投与される。投与されるべき量は、通常投与当たり抗原を５μｇから２５０μｇまでの範囲であり、これは、処置される患者、その患者の免疫系での抗体合成能、および所望の防御の程度に依存する。投与されるべき活性成分の正確な量は、医師の判断に依存し得、各患者に特有であり得る。

本ワクチンは、単独投与スケジュールで、または好ましくは複合投与スケジュールで与えられ得る。複合投与スケジュールでは、予防接種の開始時期に１〜１０の個別の投与を行い、続いて免疫応答を維持するおよびまたは強化するのに必要とされる時間間隔で、例えば２回目の投与として１〜４ヵ月後に、別の投与を行い得る。必要であれば、数ヶ月後に引続き投与を行い得る。投与のレジメもまた、少なくとも部分的には、個体の必要性により決定され、医師の判断に依存する。

さらに、免疫原性ＨＣＶ抗原を含有するワクチンは、他の免疫制御剤（例えば、免疫グロブリン）と共に投与され得る。

ＩＩ．Ｇ．ＨＣＶエピトープに対する抗体の調製
本明細書中に記載される免疫原性ポリペプチドは抗体を産生するために用いられ、この抗体はポリクローナルおよびモノクローナルを包含する。ポリクローナル抗体が所望である場合、選択された哺乳類（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマなど）を、ＨＣＶエピトープを有する免疫原性ポリペプチドで免疫感作する。感作動物由来の血清を採集し、既知の手法に従って処理する。ＨＣＶエピトープに対するポリクローナル抗体を含有する血清が他の抗原に対する抗体を含有する場合、このポリクローナル抗体はイムノアフィニティークロマトグラフィーにより精製され得る。ポリクローナル抗血清を産生および処理する方法は当該分野で既知であり、例えばＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ（１９８７）を参照。あるいは、ポリクローナル抗体は、既にＨＣＶに感染した哺乳類から単離され得る。

ＨＣＶエピトープに対するモノクローナル抗体もまた、当業者により容易に製造され得
る。ハイブリドーマによりモノクローナル抗体を産生する一般的な方法は、周知である。不朽抗体産生細胞株は、細胞融合により生成され得、また、腫瘍遺伝子ＤＮＡによるＢリンパ球の直接形質転換またはＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルスでの形質移入のような他の方法によっても生成され得る。例えば、Ｍ．Ｓｃｈｒｅｉｅｒら（１９８０）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら（１９８１）；Ｋｅｎｎｅｔｔら（１９８０）；さらに米国特許第４,
３４１,７６１号；第４,３９９,１２１号；第４,４２７,７８３号；第４,４４４,８８７
号；第４,４６６,９１７号；第４,４７２,５００号；第４,４９１,６３２号；および第４,４９３,８９０号を参照。ＨＣＶエピトープに対して産生されたモノクローナル抗体のパネルは、種々の特性（例えばイソタイプ、エピトープ親和性など）についてスクリーンされ得る。

ＨＣＶエピトープに対する抗体は、モノクローナルおよびポリクローナルとも、特に診断に有用であり、また中和抗体は受動免疫療法に有用である。モノクローナル抗体は、特に、抗イディオタイプ抗体を増大させるために用いられ得る。

抗イディオタイプ抗体は、それに対する防御が望まれる感染因子の抗原の「内部イメージ」を有する免疫グロブリンである。例えば、Ｎｉｓｏｎｏｆｆ．Ａ．ら（１９８１）およびＤｒｅｅｓｍａｎら（１９８５）を参照。抗イディオタイプ抗体を増大させる方法は、当該分野において既知である。例えば、Ｇｒｚｙｃｈ（１９８５）、ＭａｃＮａｍａｒａら（１９８４）、およびＶｙｔｄｅｈａａｇら（１９８５）を参照。これらの抗イディオタイプ抗体はまた、ＮＡＮＢＨの治療、予防接種、および/または診断、およびＨＣＶ
抗原の免疫原性領域の解明のために有用であり得る。

ＩＩ．Ｈ．イムノアッセイおよび診断キット
本発明のポリペプチドおよび抗体共に、例えば、生体試料における、ＨＣＶ抗体の存在、またはウイルスおよび/またはＨＣＶポリペプチド（またはエピトープ）の存在を検出
するイムノアッセイにおいて有用である。イムノアッセイの設計は多くの変化を受け易く、多くの形式が当該分野において既知である。このイムノアッセイは、ＨＣＶ由来の少なくとも１つのウイルスエピトープを利用する。１つの実施態様においては、イムノアッセイは、ＨＣＶ由来の複数のウイルスエピトープの組合せを利用する。これらのエピトープは、同一のまたは種々のウイルスポリペプチドに由来し得、個々の組換えまたは天然のポリペプチド中に存在し得るか、または同一の組換えポリペプチド中に存在し得る。イムノアッセイは、例えば、ウイルスエピトープに対する１つのモノクローナル抗体、１つのウイルス抗原の複数のエピトープに対するモノクローナル抗体の組合せ、種々のウイルス抗原の複数のエピトープに対するモノクローナル抗体、同一のウイルス抗原に対するポリクローナル抗体、または種々のウイルス抗原に対するポリクローナル抗体を用い得る。プロトコルはまた、例えば、競合、または直接反応、またはサンドウィッチ型アッセイに基づき得る。プロトコルはまた、例えば固体支持体を用い得るか、または免疫沈降によるものであり得る。ほとんどのアッセイは、標識抗体または標識ポリペプチドの使用を包含する；この標識は、例えば酵素、蛍光、ケミルミネッセンス、放射線、または染色分子であり得る。プローブからのシグナルを増幅するアッセイもまた既知である；このようなアッセイの例としては、ビオチンとアビジンとを用いるアッセイ、および酵素標識および媒介イムノアッセイ（例えばＥＬＩＳＡアッセイ（以下に記載する））が挙げられる。

典型的には、抗ＨＣＶ抗体に対するイムノアッセイは、抗体を含有する疑いのある試験試料（例えば生体試料）を選別および調製すること、次いでその試験試料を、抗原抗体複合体が形成し得る条件下で抗原性（すなわちエピトープ含有）ＨＣＶポリペプチドと共にインキュベートすること、さらに次いでそのような複合体の形成を検出することを包含する。適切なインキュベーション条件は、当該分野において周知である。このイムノアッセイは、限定はされないが、均一または不均一な形式であり得、標準タイプまたは競合タイ
プからなり得る。

不均一形式では、インキュベーション後のポリペプチドからの試料の分離を容易にするために、ポリペプチドを典型的には固体支持体に結合させる。用いられ得る固体支持体の例には、ニトロセルロース（例えば、膜状またはマイクロタイターウェル状）、ポリ塩化ビニル（例えば、シート状またはマイクロタイターウェル状）、ポリスチレンラテックス（例えば、ビーズ状またはマイクロタイタープレート状）、ポリフッ化ビニリジン（Ｉｍｍｕｌｏｎ（登録商標）として知られる）、ジアゾ化紙、ナイロン膜、活性化ビーズ、およびプロテインＡビーズがある。例えば、ＤｙａｎａｔｅｃｈＩｍｍｕｌｏｎ（登録商標）１またはＩｍｍｕｌｏｎ（登録商標）２マイクロタイタープレートまたは０.２５イン
チポリスチレンビーズ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｂａｌｌ）が、不均一形式において用いられ得る。抗原性ポリペプチドを含有する固体支持体は、典型的には試験試料から分離した後で、結合された抗体の検出前に洗浄される。標準形式および競合形式共に、当該分野において既知である。

均一形式では、試験試料は溶液中の抗原と共にインキュベートされる。例えば、このインキュベートは、形成される抗原抗体複合体のいずれもを沈降させる条件下で行われ得る。これらのアッセイの標準形式および競合形式共に、当該分野において既知である。

標準形式では、抗体抗原複合体を形成するＨＣＶ抗体量は、直接モニターされる。これは、抗ＨＣＶ抗体上のエピトープを認識する標識抗異種（例えば、抗ヒト）抗体が複合体形成により結合するかどうかを測定することにより行われ得る。競合形式では、試料中のＨＣＶ抗体量は、複合体中の既知の量の標識抗体（または他の競合リガンド）の結合への競合効果をモニターすることにより推定される。

抗ＨＣＶ抗体を含有する形成された複合体（または、競合アッセイの場合では、競合抗体の量）は、多くの既知の方法のいずれかにより検出され、その方法は形式に依存する。例えば、複合体中の非標識ＨＣＶ抗体は、標識と複合体化された抗異種Ｉｇの複合体（例えば、酵素標識）を用いて検出され得る。

ＨＣＶポリペプチドが分析物であるイムノアッセイでは、試験試料、典型的には生体試料は、抗原抗体複合体が形成され得る条件下で、抗ＨＣＶ抗体と共にインキュベートされる。種々の形式が採用され得る。例えば、「サンドウィッチアッセイ」が採用され得るが、このアッセイでは、固体支持体に結合した抗体を試験試料と共にインキュベートし、洗浄して、分析物に対する標識された第２の抗体と共にもう一度インキュベートし、そして支持体を再び洗浄する。分析物は、第２の抗体が支持体に結合されていることを測定することにより検出される。競合アッセイでは、これは不均一または均一のいずれかであり得るが、通常、試験試料を抗体とインキュベートし、そして標識した競合抗原もまた、続けてまたは同時にインキュベートする。これらおよび他の形式は、当該分野において周知である。

ＨＣＶ感染について有効な検出システムは、上述のようにエピトープのパネルの使用を包含し得る。パネル中のエピトープは、１つまたは複数のポリペプチド中に構築され得る。種々のエピトープに対するアッセイは、連続的にまたは同時に行い得る。

固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）は、抗原濃度または抗体濃度のいずれかを測定するために用いられ得る。この方法は、抗原または抗体に対する酵素の複合体化に依存し、定量標識として結合した酵素活性を用いる。抗体を測定するためには、既知の抗原を固相（例えば、マイクロプレートまたはプラスチックカップ）に固定し、それを試験血清希釈液とインキュベートし、洗浄し、さらに酵素で標識した抗免疫グロブリンとインキュベート
し、再び洗浄する。標識するのに適切な酵素は、当該分野において既知であり、例えばワサビダイコン（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼを包含する。特異的な基質を加え、生成物の形成または基質の利用を比色法により測定することにより、固相に結合した酵素活性を測定する。結合した酵素活性は、結合した抗体の量の正の関数である。

抗原を測定するためには、既知の特異的な抗体を固相に固定し、抗原を含有する試験物質を加え、インキュベーション後に固相を洗浄し、さらに別の酵素標識抗体を加える。洗浄後、基質を加え、酵素活性を比色法により評価し、抗原濃度に関連づける。免疫診断に好適であり適切な標識化試薬を含むキットは、適切な材料を包装することにより組み立てられる。このキットは、適切な容器の中に、ＨＣＶエピトープを含有する本発明のポリペプチドまたはＨＣＶエピトープに対する抗体を含み、さらにこのアッセイの実施に必要とされる他の試薬および材料、および適切なアッセイの指示書を含む。

ＩＩＩ．一般方法
本発明の実施に用いられる一般的な方法は、例えば本明細書中に引用した参考文献、特にヨーロッパ公開公報第３１８,２１６号および第３８８,２３２号、および文献目録に載せた参考文献中に見いだされ得る。これらの文献は、本明細書中に参考として援用される。

ＩＶ．実施例
以下に記載する本発明の実施例は、例示の目的でのみ提示され、本発明の範囲を制限しない。本明細書の開示を考慮すると、請求項の範囲内にある多くの実施態様が当業者に明らかである。

ＩＶ．Ａ．ＨＣＶゲノムのエピトープマッピング
以下の実施例は、図１に示されるＨＣＶ１ポリタンパク質配列上で行われたエピトープマッピング実験の結果である。図３〜１１に示されるように、ＨＣＶ分離株間には異質性があり、これらのアミノ酸の置換が以下に記載のオクタマー中でなされ得ることを示している。他のＨＣＶ分離株の対応する位置でのアミノ酸での置換に加え、特定のアミノ酸の合成アナログでの置換または電荷に基づく保存的置換など（特に置換が抗体結合を破壊しない場合）は、本発明の範囲内にある。

ＩＶ．Ａ．１．重複ペプチドの合成
８×１２配列のブロックに配置したポリエチレン製ピン（Ｃｏｓｅｌｃｏ Ｍｉｍｅｔｏｐｅｓ，Ｖｉｃｔｏｒｉａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を、室温で３０分間ピンを浴槽（２０％ｖ/ｖピペリジンのジメチルホルムアミド（ＤＨＦ）溶液）中に置くことにより調製
した。次いでこのピンを取り出してＤＭＦ中で５分間洗浄し、次いでメタノール中で４回（各洗浄に２分）洗浄した。ピンを少なくとも１０分間空気乾燥させ、次いでＤＭＦ中で最終的に洗浄した（５分）。１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ、３６７ｍｇ）をＤＭＦ（８０ｍＬ）に溶解し、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸を結合させるために用いた：Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａ１ａ−ＯＰｆｐ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＰｆｐ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ（Ｏ−ｔＢｕ）−ＯＰｆｐ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（Ｏ−ｔＢｕ）−ＯＰｆｐ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＰｆｐ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＰｆｐ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−ＯＰｆｐ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｉｌｅ−ＯＰｆｐ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＰｆｐ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＰｆｐ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｍｅｔ−ＯＰｆｐ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｎ−ＯＰｆｐ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＰｆｐ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｎ−ＯＰｆｐ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｍｔｒ）−ＯＰｆｐ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＤｈｂｔ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＤｈｂｔ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｖａｌ−ＯＰｆｐ、およびＦｍｏｃ−Ｌ−Ｔｙｒ−ＯＰｆｐ。

保護アミノ酸をＨＯＢｔと共にマイクロタイタープレートウェル中に置き、ピンブロックをプレート上に配し、ピンをウェル中に浸漬した。次いでこの組合せをプラスチックバッグ中にシールし、２５℃で１８時間反応させて最初のアミノ酸をピンに結合させた。次いでブロックを取り外し、ピンをＤＨＦ（２分）、ＭｅＯＨ（４×２分）で洗浄し、さらにＤＭＦ（２分）で洗浄して、結合アミノ酸を清浄化し、脱保護した。この手順を繰り返して、さらに各アミノ酸を結合させ、全てのオクタマーを調製した。

次いで遊離Ｎ末端をアセチル化し、遊離アミドを代償した。これは、エピトープのほとんどはＮ末端に存在せず、従って関連する正の電荷を有さないことによる。マイクロタイタープレートのウェルをＤＭＦ/無水酢酸/トリエチルアミン（５：２：１ｖ/ｖ/ｖ）で満たし、ピンをウェル中で２０℃で９０分間反応させることにより、アセチル化を行った。次いでこのピンをＤＭＦ（２分）およびＭｅＯＨ（４×２分）で洗浄し、少なくとも１０分間空気乾燥した。

ピンをトリフルオロ酢酸/フェノール/ジチオエタン（９５：２.５：２.５ｖ/ｖ/ｖ）を用いてポリプロピレンバッグ中室温で４時間処理し、側鎖保護基を除去した。次いでピンをジクロロメタン（２×２分）中で洗浄し、さらに５％ジイソプロピルエチルアミン/ジ
クロロメタン（２×５分）、ジクロロメタン（５分）中で洗浄し、そして少なくとも１０分間空気乾燥した。次いでピンを水（２分）、次いでＭｅＯＨ（１８時間）中で洗浄し、減圧下で乾燥し、シールしたプラスチックバッグ中にシリカゲル上で保存した。
ＩＶ．Ａ．２．ペプチドのアッセイ
上記のように調製したオクタマー含有ピンを、初めに破壊緩衝液（１％ドデシル硫酸ナトリウム、０.１％２−メルカプトエタノール、０.１Ｍ ＮａＨ_２ＰＯ_４）中６０℃で３０分間超音波処理した。次いでピンを水（６０℃）に数回浸漬し、続いて沸騰ＭｅＯＨ（２分）に浸漬し、空気乾燥した。次いで遮断緩衝液２００μＬ（１％オボアルブミン、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）、および０．０５％ＮａＮ_３のＰＢＳ溶液）を含有するマイクロタイターウェル中で、２５℃で１時間攪拌しながらピンを前被覆した。次いで、このピンを、ＨＣＶを有すると診断されたヒト患者から得られた抗血清１７５μＬを含有するマイクロタイターウェル中に浸漬し、４℃で一晩インキュベートした。ピンは３人の患者から得た抗血清に対してアッセイした。標本＃ＰＡＡ ３６６３−ｓ（「Ａ」）は、ＨＣＶウェスタンブロット、ＨＣＶ競合ＥＬＩＳＡ、クローンＣ１００−３（１：１０００希釈）に対するＨＣＶ ＥＬＩＳＡで強い反応を示し、Ｃ１００、５−１−１、およびＣ３３ｃ（Ｃ２２は行わず）に対するＲＩＢＡ応答で＞４＋を示した。（抗原/クローン名は、ヨーロッパ公開公報第３１８,２１６号および第３８８,２３２号、およ
びＯｒｔｈｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から入手可能なＨＣＶイムノアッセイに関する文献中に記載されている名前による。）血漿原液は遮断緩衝液中で１：５００に希釈した。標本＃ＰＡＡ ３３０２８（「Ｂ」）は、ＨＣＶウェスタンブロット、ＨＣＶ競合ＥＬＩＳＡ、クローンＣ１００−３（１：５００希釈）に対するＨＣＶ ＥＬＩＳＡで強い反応を示し、Ｃ１００、５−１−１、Ｃ３３Ｃ、およびＣ２２に対するＲＩＢＡ応答で＞４＋を示した。ポリクローナル抗血清は、プロテインＡカラムを通すことにより部分的に精製し、遮断緩衝液中で１：２００に希釈して用いた。標本＃ＰＡＡ ｓ３２９３１（「Ｃ」）は、ＨＣＶウェスタンブロット（３＋）、ＨＣＶ競合ＥＬＩＳＡ、クローンＣ１００−３（１：６４希釈）に対するＨＣＶＥＬＩＳＡで中程度の反応を示し、Ｃ１００および５−１−１に対する（Ｃ３３ｃおよびＣ２２は行わず）ＲＩＢＡ応答でそれぞれ３＋および４＋を示した。ポリクローナル抗血清は、プロテインＡカラムを通すことにより部分的に精製し、遮断緩衝液中で１：５００に希釈して用いた。

ピンをＰＢＳ/Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（４×１０分）中で室温で洗浄し、次いで
ワサビダイコンペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇ抗血清（１７５μＬ、ＮａＮ_３を含
まない遮断緩衝液中に１：２０００で希釈）を含有するマイクロタイターウェル中で２５℃で１時間攪拌しながらインキュベートした。抗ヒト抗血清はヒトＩｇ軽鎖および重鎖に対して特異的であり、ＩｇＧクラスとＩｇＭクラスの両方と反応する。ピンを再びＰＢＳ/Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（４×１０分）中で室温で洗浄した。ＮａＨ_２ＰＯ_４（１
Ｍ、２００ｍＬ）およびクエン酸（１Ｍ、１６０ｍＬ）を２Ｌに蒸留水で希釈し、ｐＨを４.０に調整することにより、基質溶液を調製した。使用する直前に、アジノ−ジ−３−
エチルベンズチアゾジンスルホネート（ＡＢＴＳ、５０ｍｇ）および過酸化水素（０.３
μＬ/ｍＬ）を１００ｍＬの緩衝液に加えて、基質溶液を完成した。この基質溶液（１５
０μＬ）をマイクロタイタープレートの各ウェルに加え、ピンをウェル中に浸漬し、暗所で２５℃でインキュベートした。発色後、ピンを取り出して反応を停止させ、この溶液の吸光度を４０５ｎｍで読み取った。

以下に示したオクタマーを、抗ＨＣＶ抗血清と免疫反応させた。３つの抗血清全てと反応するペプチドをエピトープとして記し、一方１つまたは２つの抗血清とのみ反応するペプチドを弱エピトープ（「〜」で示した）として記した。特に強いエピトープは、番号ではなく文字で示した（例えば、ＥｐＡＡ）。

ＩＶ．Ｂ．識別アッセイ
初期抗原を後期抗原と区別するために以下のアッセイを行った。初期抗原に対する抗体が検出され得、そしてその抗体はＨＣＶ感染をより迅速に診断するのに用いられ得る。

高ＡＬＴを有するが、抗Ｃ１００−３抗体に対して陰性であるヒト患者から連続して採血を行った。血清転換（ｓｅｒｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）（Ｃ−１００−３陽性）が完了する前に得た５人の血液をプールし、そして１：２０００に希釈してアッセイに使用した。このアッセイは、上記のセクションＩＶ．Ａ．の記載の通りに行った。しかし、一方のセットのピンをワサビダイコンペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ特異的抗血清とインキュベートし、他方のセットのピンをワサビダイコンペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＭ特異的抗血清とインキュベートした。ＩｇＭ抗体と免疫反応するエピトープが初期抗原である。

この結果は、ほとんどの初期のエピトープはアミノ酸約４８０位からアミノ酸約６５０位までの範囲の領域内で見い出されることを示した。特に、強ＩｇＭエピトープは、アミノ酸番号５０６、５１０、５２３、５５３、５６２、５８０から始まるオクタマーであり、そして５９０位から６２０位までの領域であった。この領域に由来するエピトープを有する抗原を用いるアッセイは、他の抗原を用いるアッセイよりも早い時点でＨＣＶ感染の診断を行い得る。

さらに、開心術輸血後に非Ａ非Ｂ型肝炎になった５人の患者から採取した血漿標本を試験し、この研究は３〜１２年続けた。最初の採血日は１週間未満で行った。１つのコア抗原（Ｃ２２）、２つのエンベロープ抗原（Ｅ１およびＥ２）、および３つの非構造領域抗原（Ｃ３３ｃ、Ｃ１００、およびＮＳ５）に対するＥＩＡにより、各標本をＩｇＧおよびＩｇＭに対して試験した。Ｃ２２およびＣ３３ｃに対するＩｇＭ応答は、それらの抗原のＩｇＧ応答を上回ったことが分かった。ＮＳ−５もまたＩｇＭ応答を誘導したが、この応答はその抗原のＩｇＧ応答を上回るものではなかった。従って、Ｃ２２およびＣ３３ｃ領域に由来したエピトープを用いることにより、そしてＩｇＭ結合に対してアッセイすることにより、感染の極めて初期の段階を測定し得るアッセイが作製され得る。Ｃ３３ｃ領域に対する抗体は長期間持続するので、Ｃ３３ｃに関する診断用アッセイが最も信頼性があることが示唆される。

ＩＶ．Ｃ．種々の固体由来のＨＣＶ分離株における配列変異
ＣＤＣ/ＨＣＶ１から外れる配列を含むＨＣＶの分離株をヒト個体において同定し、そ
のうちいくつかは抗Ｃ１００−３抗体に対して血清学的に陽性であった（ＥＣ１０は抗体陰性）。ＣＤＣ/ＨＣ１配列を用いてＰＣＲ法により増幅したＨＣＶゲノムのセグメント
をクローニングし、配列決定することにより、これらの新規な分離株の同定が行われた。この方法は、本明細書中に記載のＨＣＶ ｃＤＮＡ配列に基づいたプライマーおよびプローブを用いる。本方法の最初の工程は、逆転写酵素を用いて、ＨＣＶゲノムまたはその複製中間体のいずれかに対するｃＤＮＡの合成である。ＨＣＶ ｃＤＮＡの合成後、そして増幅前に、試料中のＲＮＡを当該分野で周知の方法により分解する。次いで、ＨＣＶ ｃＤＮＡの指定されたセグメントを適切なプライマーの使用により増幅した。増幅された配列をクローニングし、そして増幅された配列を含むクローンをプローブにより検出する。そのプローブは、プライマー間にある配列に相補的であるが、プライマーとは重複していない。

ＩＶ．Ｃ．１．米国においてヒトから単離されたＨＣＶ分離株
ＨＣＶビリオン源として用いられる血液試料を、Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ州、Ｃｈａｒｌｏｔｔｅにある米国赤十字社（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓ）、およびＭｉｓｓｏｕｒｉ州、Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙのカンザス州地域血液センター（Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｋａｎｓａｓ）から得た。ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ＨＣＶ Ｃ１００−３抗原に対する抗体に対して試料をスクリーニングし、そしてポリクローナルヤギ抗ヒトＨＲＰを用いて補足的なウェスタンブロット分析を行い、抗ＨＣＶ抗体を測定した。米国赤十字社およびカンザス州地域血液センターからそれぞれ得た２つの試料の＃２３および＃２７は、これらのアッセイによりＨＣＶ陽性であることが決定された。

これらの試料の血清に存在するウイルス粒子をＢｒａｄｌｅｙら（１９８５）により記載された条件下で超遠心分離により単離した。１０μｇ/ｍＬのプロテナーゼＫ、および
０.１％ＳＤＳの最終濃度で、プロテナーゼＫおよびＳＤＳで消化することによりＲＮＡ
を粒子から抽出した；消化は３７℃で１時間行った。ウイルスＲＮＡをクロロホルム−フェノールで抽出することによりさらに精製した。

ＲＮＡの調製におけるＨＣＶ ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡの両鎖を合成した後、次いで、得られたｃＤＮＡをＰＣＲ法により増幅した。各ＨＣＶ分離株に由来する３つのクローン中のＨＣＶ ｃＤＮＡを配列分析にかけた。分析は本質的にＣｈｅｎおよびＳｅｅｂｕｒｇ（１９８５）に記載された方法によった。

試料２３および２７のＨＣＶ由来のクローンのコンセンサス配列を、それぞれ図３および図４に示す。これらの図中に可変配列もまた示されており、これはコンセンサス配列中にコードされたアミノ酸である。

図５および図６は、試料２３、２７、およびＨＣＶ１の一列に並んだプラス（＋）鎖ヌクレオチド配列（図５）および推定アミノ酸配列（図６）の比較を示す。図６中のＨＣＶ１のアミノ酸配列は、ＨＣＶゲノムＲＮＡにおける大きなＯＲＦによりコードされたＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸番号１２９〜４６７を表している。図５および図６の試験は、３つの単離クローンの配列において変異があることを示す。ヌクレオチドレベルおよびアミノ酸レベルでの配列変異を以下に記載の表にまとめた。表では、ＳおよびＮＳ１を示すポリペプチドは、それぞれアミノ酸番号１３０から〜３８０まで、および３８０から〜４７０までを表し、これらのドメインは既知である。番号付けは、推定のイニシエーターメチオニンから開始する。用語ＳおよびＮＳ１は、フラビウイルスモデルを用いてポリペプチドをコードする配列の位置決定に基づく。しかし、上記のように、最近の証拠により、ＨＣＶとフラビウイルスとの間では、ウイルスポリペプチドドメインに関して、特に推定Ｅ/ＮＳ１ドメインにおいて、全体的な相関性がないことが示唆される。実際、ＨＣＶ
ポリペプチドおよびそれらのコーディングドメインは、フラビウイルスモデルから実質的に外れていることを示し得る。

新たに単離されたＨＣＶ配列中には変異があるが、試料２３および２７（ＨＣＶ２３およびＨＣＶ２７と呼ばれる）から得たクローン配列は、各々１０１９個のヌクレオチドを含んでおり、選択されたクローンにおいて、この領域では欠失および付加による突然変異がないことを示す。図５および図６中の配列はまた、単離された配列が、この領域内では転位が生じていないことを示す。

ＨＣＶ１およびＨＣＶの他の分離株に対するコンセンサス配列の比較を、上記の表にまとめる。チンパンジーＨＣＶ１分離株とヒトから単離されたＨＣＶとの間の配列変異は、ヒト起源のＨＣＶ間で見られる変異とほぼ同じである。

２つの推定ドメイン中の配列変異が一様でないことは重要である。推定Ｓ領域の配列は、比較的定常的であり、領域を通じてランダムに散在していると思われる。それに対して、推定ＮＳ１領域は全配列よりも変異の割合が高く、そして変異は約２８個のアミノ酸からなる超可変区域にあると考えられている。この超可変区域は、推定ポリタンパク質の推定Ｎ末端から下流の約７０個のアミノ酸の位置に存在する。

検出された変異は増幅過程で生じたと考察され得るが、全ての変異がこの結果により生じた訳ではないと考えられる。Ｔａｑポリメラーゼが、１サイクルにつきＤＮＡ鋳型１０キロ塩基当り約１塩基の割合で配列中にエラーをもたらすと判断されている（Ｓａｉｋｉら（１９８８））。この判断によれば、７エラーまでは１０１９ｂｐのＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅中にもたらされ得る。しかし、ＨＣＶ−２３およびＨＣＶ−２７の３つのサブクローンは、それぞれ２９塩基および１４塩基の変異を生じた。以下のことにより、これらの変異は天然に生じていることが示唆される。塩基の変化のうち約６０％は、アミノ酸配列を変化させないサイレント突然変異である。ＰＣＲ増幅中にＴａｑポリメラーゼによりもたらされた変異は、ランダムに生じていると考えられる；しかし、この結果により、可変配列は少なくとも１つの特異的領域内に固まって存在していることが示される。

IV.Ｃ.２.イタリアおよび米国においてヒトから単離されたＨＣＶ分離株
異なる分離株に存在するＨＣＶ ＲＮＡのセグメントをＨＣＶ/ｃＰＣＲ法により増幅
した。これらの断片は、推定ＨＣＶポリタンパク質の開始コドンをコードするメチオニンの下流〜０.６Ｋｂから〜１.６Ｋｂの領域に及ぶ。この分離株は、ＨＣＶ感染体から得た生物学的標本に由来する。さらに詳細には、ＨＣＴ＃１８分離株は米国の個体から得たヒト血漿に由来し、ＥＣ１およびＥＣ１０はイタリア人患者の肝生検から得たものであり、そしてＴｈはアメリカ人患者の末梢血液の単核細胞画分に由来する。比較のＨＣＶ ＲＮＡセグメントをチンパンジーから単離した。

フェノール：ＣＨＣｌ_３：イソアミルアルコール抽出液を用いて、ヒト血漿標本からＲＮＡを抽出した。０.１ｍＬまたは０.０１ｍＬの血漿のいずれかを、１０〜４０μｇ/ｍ
Ｌのポリアデニル酸を含有するＴＥＮＢ/プロテナーゼＫ/ＳＤＳ溶液（０.０５Ｍ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８.０）、０.００１Ｍ ＥＤＴＡ、０.１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍｇ/ｍＬプロテナーゼＫ、および０.５％ＳＤＳ）により、最終容量を１.０ｍＬにまで希釈し、そして３７℃で６０分間インキュベートした。このプロテナーゼＫ消化の後、得られた血漿画分をＴＥ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）飽和フェ
ノール（ｐＨ６.５）を用いて抽出することにより除タンパクした。遠心分離によりフェ
ノール相を分離し、そして０.１％ＳＤＳを含有するＴＥＮＢで再抽出した。各抽出で生
じた水相をプールし、そして等量のフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール［１：１（９９：１）］で２回抽出し、次いで等量のクロロホルム/イソアミルアルコールの
９９：１混合液で２回抽出した。遠心分離による相分離に続いて、水相に最終濃度０.２
Ｍとなるように酢酸ナトリウムを加え、核酸を２倍容量のエタノールを加えて沈澱させた。沈澱した核酸を、ＳＷ４１ローター中で３８Ｋ、４℃で６０分間、またはマイクロヒュージ管中で１０Ｋ、４℃で１０分間、超遠心分離により回収した。

肝生検から抽出したＲＮＡは、Ｄｒ．Ｆ．Ｂｏｎｉｎｏ（Ｏｓｐｅｄａｌｅ Ｍａｇｇｉｏｒｅ ｄｉ Ｓ．Ｇｉｏｖａｎｎｉ Ｂａｔｔｉｓｔａ，Ｔｏｒｉｎｏ，Ｉｔａｌｙ）により提供された。単核細胞画分は、個人の血液の一部をＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｃｏｒｐ）によって、製造会社の指示書に従って用いて沈澱させることにより得た。全ＲＮＡを、Ｃｈｏｏら（１９８９）に記載のグアニジニウムチオシアネート法を用いて画分から抽出した。

試料から得たＨＣＶ ｃＤＮＡの合成を逆転写酵素を用いて行った。エタノール沈澱に続いて、沈澱したＲＮＡ画分または核酸画分を乾燥し、そして蒸留水で処理したＤＥＰＣ中に再懸濁した。核酸の二次構造を６５℃で１０分間加熱して破壊し、そして試料を氷上で急冷した。肝臓由来の全ＲＮＡ１〜３μｇを用いて、または１０〜１００μＬの血漿から抽出した核酸（またはＲＮＡ）から、ｃＤＮＡを合成した。合成は逆転写酵素を使用し、製造会社であるＢＲＬにより指定されたプロトコルを用いて、そして２５μＬ反応液中で行った。ｃＤＮＡ合成のための全ての反応混合物には、２３単位のＲＮＡａｓｅインヒビター、Ｒｎａｓｉｎ（登録商標）（Ｆｉｓｈｅｒ/Ｐｒｏｍｅｇａ）を含ませた。ｃＤ
ＮＡ合成に続いて、反応混合物を水で希釈し、そして１０分間沸騰させ、氷上で急冷させた。

各セットの試料を２ラウンドのＰＣＲ増幅にかけた。反応用のプライマーを選択し、「ＥｎｖＬ」および「ＥｎｖＲ」と称する領域を増幅した。「ＥｎｖＬ」領域は、ヌクレオチド６６９〜１２４３位を含有し、そして推定アミノ酸１１７〜３０８位をコードする；「ＥｎｖＲ」領域は、ヌクレオチド１２１５〜１６２９位を含有し、そして推定アミノ酸３００〜４０８位をコードする（推定アミノ酸は推定メチオニン開始コドンを起点に番号を付けている）。

ＰＣＲ反応は、１μｇのＲＮａｓｅ Ａを加えたこと以外は、基本的に製造者の指示書（Ｃｅｔｕｓ−Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）に従って行った。この反応は１００μＬの最終容量で行った。１サイクルを９４℃で１分、３７℃で２分、および７２℃で３分行い、最終サイクルでは７２℃で延長して７分間行うというレジメにより、ＰＣＲを３０サイクル行った。次いで、試料をフェノール：ＣＨＣｌ_３で抽出し、エタノール沈澱を２回行い、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８.０）中で再懸濁し、そしてＣｅｎｔｒｉｃｏｎ
−３０（Ａｍｉｃｏｎ）濾過を用いて濃縮した。この手法により、３０ヌクレオチド未満のサイズのオリゴヌクレオチドが効率よく除去される；従って、最初のラウンドのＰＣＲ
増幅のプライマーが除去される。

次いで、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０濃縮試料を２回目のラウンドのＰＣＲ増幅にかけた。１サイクルを９４℃で１分、６０℃で１分、および７２℃で２分行い、最終サイクルでは７２℃で延長して７分間行うというレジメにより、ＰＣＲによる増幅を３５サイクル行った。次いで、試料をフェノール：ＣＨＣｌ_３で抽出し、２回沈澱させ、そしてＥｃｏＲＩで消化した。ＰＣＲ反応生成物を、６％ポリアクリルアミドゲルの電気泳動によりその生成物を分離することにより分析された。得られるＰＣＲ生成物の推定サイズのＤＮＡをゲルから電気溶出し、そしてｐＧＥＭ−４プラスミドベクター内またはλｇｔ１１内のいずれかにサブクローニングした。増幅の最初のラウンド後のＥｎｖＬおよびＥｎｖＲについて得られた生成物のサイズは、それぞれ６１５ｂｐおよび６８３ｂｐであった；２回目ラウンドの増幅後のＥｎｖＬおよびＥｎｖＲについて得られた生成物のサイズは、それぞれ４１４ｂｐおよび５７５ｂｐであった。宿主細胞を形質転換するために、増幅生成物を含有するプラスミドを用いた；ＤＨ５−αを形質転換するためにｐＧＥＭ−４プラスミドを用い、Ｃ６００デルタ−ＨＦＬを形質転換するためにλｇｔｌｌを用いた。適切なＨＣＶプローブとハイブリダイズする形質転換細胞のクローンか、または正確なサイズの挿入部分を有する形質転換細胞のクローンのいずれかを選択した。次いで、挿入部分をＭ１３内にクローニングし、そして配列決定した。ＨＣＶ/ｃＰＣＲ生成物の全てに対するプロ
ーブは、ＰＣＲ増幅により調製されたＨＣＶｃＤＮＡの^３２Ｐ標識断片から成っていた。

ＥｎｖＬ領域内の変異に関する配列情報は、ＨＣＴ＃１８から得た３つのクローン、ＴＨから得た２つのクローン、ＥＣ１から得た３つのクローン、およびＨＣＶ１クローンから得られた。これらのクローンに由来する各分離株の混成ヌクレオチド配列の比較を図７に示す。この図では、各配列は、ＥｎｖＬ領域のセンス鎖の５’から３’までを示しており、そしてこの配列は一列になっている。縦列および大文字は配列相同性を示し、列の欠如および小文字は相同性がないことを示す。列内に示された配列を以下に示す：第１列、Ｔｈｏｒｎ；第２列、ＥＣ１；第３列、ＨＣＴ＃１８；第４列、ＨＣＶ１。

ＥｎｖＲ領域内の変異に関する配列情報は、ＥＣ１０の２つのクローンおよびＨＣＶ１クローンから得られた。この２つのＥＣ１０クローンは、ただ１個のヌクレオチドが異なっていた。ＥＣ１０（クローン２）および混成のＨＣＶ１配列のヌクレオチド配列の比較を図８に示す；各配列は、ＥｎｖＲ領域のセンス鎖の５’から３’までを示しており、そしてこの配列は一列になっている。配列間の２重点は配列相同性を示す。

ＥｎｖＬ領域（アミノ酸番号１１７〜３０８）およびＥｎｖＲ領域（アミノ酸番号３００〜４３８）内にコードされたアミノ酸配列の各分離株に対する比較を、それぞれ図９および図１０に示す。上記のように、図中には、ＪＨ２３およびＪＨ２７分離株の配列が包含される。日本人の分離株から得た配列もまた示す；これらの配列は日本のＤｒ．Ｔ．Ｍｉｙａｍｕｒａから提供された。これらの図では、ＨＣＶ１に対する領域全体において、その領域に対するアミノ酸配列が示され、そして種々の分離株における非相同的アミノ酸が示される。

図９に見られるように、ＥｎｖＬ領域では、ＨＣＶ１と他の分離株との間で全体で約９３％の相同性がある。ＨＣＴ１８、Ｔｈ、およびＥＣ１は、ＨＣＶ１と９７％の相同性を有し；ＪＨ２３およびＪＨ２７は、それぞれＨＣＶ１と約９６％および約９５％の相同性を有する。図１０は、ＥｎｖＲ領域での相同性が、ＥｎｖＬ領域での相同性よりも顕著に低いことを示す；さらに、１つのサブ領域が超可変部（すなわち、アミノ酸３８３〜４０５位の部分）であると思われる。このデータを以下の表にまとめる。

VI．産業上の利用性
本明細書中で同定されたエピトープは、例えば、ＨＣＶ感染に対する血液のスクリーニング、臨床上のＨＣＶ診断、抗体の産生、および医薬品の製造などの適用に対して、上記のようなポリペプチド生成物を製造するために用いられ得る。他の適用は上記の通りであり、そしてさらに別の適用も当業者には極めて明らかである。

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ＨＣＶプロトタイプ分離株のＨＣＶ１のポリタンパク質を示す。 図１ａの続きである。 図１ｂの続きである。 ＨＣＶ１の混成ｃＤＮＡを示す。 図２ａの続きである。 図２ｂの続きである。 図２ｃの続きである。 図２ｄの続きである。 図２ｅの続きである。 ヒト分離株２３のヌクレオチドコンセンサス配列を示す。変異株の配列は上記配列の下に示す。コンセンサス配列中にコードされるアミノ酸もまた示す。 図３ａの続きである。 ヒト分離株２７のヌクレオチドコンセンサス配列を示す。変異株の配列は上記配列の下に示す。コンセンサス配列中にコードされるアミノ酸もまた示す。 図４ａの続きである。 ヒト分離株２３および２７、およびＨＣＶ１の一列に並んだヌクレオチド配列を示す。相同的な配列は、記号（＊）で示す。非相同的な配列は、小文字で示す。 図５ａの続きである。 図５ｂの続きである。 ヒト分離株２３および２７、およびＨＣＶ１の一列に並んだアミノ酸配列を示す。相同的な配列は、記号（＊）により示す。非相同的な配列は、小文字で示す。 分離株のＴｈｏｒｎ、ＥＣ１、ＨＣＴ ＃１８、およびＨＣＶ１の一列に並んだ混成ヌクレオチド配列の比較を示す。 図７ａの続きである。 図７ｂの続きである。 ＥＣ１０のヌクレオチド配列および混成のＨＣＶ１配列の比較を示す；ＥＣ１０配列は、点の上の列であり、そしてＨＣＶ１配列は、点の下の列である。 ヒト分離株のＨＣＴ ＃１８、ＪＨ２３、ＪＨ２７、Ｔｈｏｒｎｅ、ＥＣ１、およびＨＣＶ１のコンセンサス配列の「ＥｎｖＬ」領域内にコードされるアミノ酸配列１１７〜３０８（ＨＣＶ１と比較して）の比較を示す。 ヒト分離株のＨＣＴ ＃１８、ＪＨ２３、ＪＨ２７、Ｔｈｏｒｎｅ、ＥＣ１、およびＨＣＶ１のコンセンサス配列の「ＥｎｖＲ」領域内にコードされるアミノ酸配列３３０〜３６０（ＨＣＶ１に比較して）の比較を示す。

Claims (6)

1. ＨＣＶ抗体と免疫反応し得るポリペプチドであって、該ＨＣＶ抗体と反応し得る免疫反応性部分は、アミノ酸配列ＲＦＡＱＡＬＰＶを含むＨＣＶポリペプチドの一部分であり、ここで該一部分が最大で２５アミノ酸の長さを有する、免疫反応性ポリペプチド。
2. 前記一部分が最大で２０アミノ酸の長さを有する、請求項１に記載の免疫反応性ポリペプチド。
3. 請求項１〜２のいずれかに記載のポリペプチドを含む、イムノアッセイ試薬。
4. 試料中のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）タンパク質と免疫反応し得る抗体の存在を検出する方法であって、
   固定化した、請求項３に記載のイムノアッセイ試薬を該試料と接触させる工程、
   および
   検出可能な標識を使用して、該試薬に結合した抗体を検出する工程、
   を包含する、方法。
5. 請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチドを製造する方法であって、該ポリペプチドが組換え発現または化学合成によって調製される、方法。
6. ＨＣＶ抗体と免疫反応し得るポリペプチドであって、該ＨＣＶ抗体と反応し得る免疫反応性部分は、アミノ酸配列ＲＦＡＱＡＬＰＶからなる、ポリペプチド。