JP3268502B2 - 非ａ非ｂ型肝炎ウイルス関連ポリヌクレオチド、ポリペプ タイド - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィル
ス（以下「ＮＡＮＢ肝炎ウイルス」と略記する）の関連
抗原、抗体およびそれらを用いた検出系、ならびにそれ
らの製造に有用なＮＡＮＢ肝炎ウイルスＲＮＡ、ＤＮＡ
およびポリペプタイドに関する。

【０００２】

【従来の技術】ウイルスに由来する肝炎には、既にウイ
ルス本体のＤＮＡやＲＮＡがつきとめられ、その診断法
や予防法が確立したものとしてＢ型肝炎、Ａ型肝炎、Ｄ
型肝炎、Ｅ型肝炎がある。しかし、主として血液を介し
て感染する肝炎で上記の分類に属さない、非Ａ非Ｂ型肝
炎（以下「ＮＡＮＢ肝炎」という）については、世界の
多くの研究者がその原因ウィルスを捜してきたにもかか
わらずウイルス本体の解明はなされていなかった。

【０００３】１９８８年になってカイロン社は、ＮＡＮ
Ｂ型肝炎の原因ウイルスとして、Ｃ型肝炎ウイルス（以
下「ＨＣＶ」と略記する）と命名したＲＮＡウイルスゲ
ノムのクローン化に成功したとして、その塩基配列を発
表した。そしてこれを基にＨＣＶ抗体の測定系を開発
し、現在輸血血液のスクリーニングや患者の診断に用い
られ始めている。このＨＣＶ抗体の測定系はＮＡＮＢ肝
炎との関連性がたしかに一部認められる。しかし、キャ
リアや慢性肝炎の捕捉率が約７０％にすぎないこと、ま
た急性期の抗体検出ができないこと等の重大な問題点が
残されており、カイロン社の前記開発によってもＮＡＮ
Ｂ肝炎への対処は依然として解決されていない。 他
方、Ｂ型肝炎ウイルスの検出法は確立されており、この
ため日本においては輸血後肝炎の９５％以上がＮＡＮＢ
肝炎であり、年間約２８万例の発症が推定されている。
ＮＡＮＢ肝炎の経過は不良であり、大部分の例はキャリ
ア化して慢性肝炎に進展すると予測される。又、かなり
高率に１０〜２０数年にかけて肝硬変へ、さらに肝癌へ
進むことから、一日も早いウイルス本体の解明及び診断
薬の開発が望まれている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】上記カイロン社のＨＣ
Ｖ抗体検出キットでは診断できないＮＡＮＢ肝炎が多数
存在することから、特異性のさらに秀れたＮＡＮＢ肝炎
診断薬の開発が求められる。この開発を進めるためには
ＮＡＮＢ肝炎ウイルスの遺伝子レベル、アミノ酸レベル
での解析が不可欠の課題となる。本発明の目的は、ＮＡ
ＮＢ肝炎ウイルスの構造蛋白質をコードする塩基配列を
解明し、これに基づいてアミノ酸レベルでの解析を行う
ことにより、抗原として有効なポリペプタイドを見出
し、ＮＡＮＢ肝炎ウイルス、関連抗原、抗体の検出系の
確立を図ることである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、抗原とし
て有効なポリペプタイドを見出すために、ヒトおよびチ
ンパンジーキャリアの血清よりＮＡＮＢ肝炎ウイルスの
ＲＮＡを単離し、ウイルスの非コード領域を含む遺伝子
領域全体をカバーするｃＤＮＡをクローン化してその塩
基配列を決定し、さらにアミノ酸配列について検討し
た。その結果、本発明者らは、ウイルスの構造遺伝子中
のコア蛋白質、外殼蛋白質、および非構造遺伝子中のＲ
ＮＡ依存ポリメラーゼをコードしている特定の領域を見
出し、遺伝子およびアミノ酸レベルでの研究によって本
発明を完成した。

【０００６】本発明の要旨は次の通りである。本発明の
ＮＡＮＢ肝炎ウイルスＲＮＡは次のようにして得て、そ
の塩基配列を決定した。ヒト及びチンパンジー血漿より
５種の検体を得た。ＨＣ−Ｊ１、ＨＣ−Ｊ５、ＨＣ−Ｊ
６は日本人供血者より、ＨＣ−Ｊ７は日本人腎透析患者
より得て、いずれもＨＣＶ抗体陽性と判定された検体よ
り得られた。ＨＣ−Ｊ４はＮＡＮＢ肝炎の感染性を確認
したチンパンジーから得た検体に由来するが、しかしこ
れはカイロン社の前記ＨＣＶ抗体では（−）であった。
この５種の検体血漿よりＲＮＡを抽出した。さらに各Ｒ
ＮＡ間の塩基配列の相同性を調べ、実施例に示すように
抽出ＲＮＡの５′末側の約１９００ないし２５００の塩
基配列、および３′末側の約１１００の塩基配列を決定
した。このうちＨＣ−Ｊ１、Ｊ４、Ｊ５の３株の５′末
側については既に特願平２−１５３４０１号および特願
平２−３０４４０５号にその一部を開示したが、今回新
たにＨＣ−Ｊ６、Ｊ７の２株を含め、全株遺伝子の非コ
ード領域、構造蛋白質をコードする領域、および非構造
蛋白質をコードする領域の一部について研究を成就し、
本発明を完成するに至った。

【０００７】実施例１に示すように、ＨＣ−Ｊ１、ＨＣ
−Ｊ４、ＨＣ−Ｊ５、ＨＣ−Ｊ６、ＨＣ−Ｊ７各株由来
のＲＮＡはいずれも５’末端より３４０個ないし３４１
個のヌクレオチドよりなる５’非翻訳領域を有し、これ
に続いて構造蛋白質をコードする領域（１１４９塩基）
が続き、さらに非構造蛋白質をコードする領域を含め、
１８８５個ないし２５５１個のヌクレオチドを有する。
この知見にもどづき、配列番号１ないし５記載のポリヌ
クレオチドを得た。

【０００８】また、実施例３に示すように、ＨＣ−Ｊ
１、Ｊ４、Ｊ５、Ｊ６、Ｊ７においてＲＮＡの３’末端
側は、非構造蛋白質をコードする１０９６塩基に続いて
Ｔ−ストレッチを含む７７塩基以上の非コード領域遺伝
子を有するとの知見を得、これにもとづき配列番号６な
いし１０記載のポリヌクレオチドを得た。

【０００９】なお、ヨーロッパ公開特許第３８８２３２
号（カイロン社）に示されたＨＣＶの配列と比較する
と、本発明のヌクレオチド配列は、非コード領域を含む
５′末端側２４７７塩基に関してＨＣ−Ｊ１、Ｊ４、Ｊ
６、Ｊ７の各株ではそれぞれ９５．２％、８０．５％、
７２．５％、７１．６％の相同性を有し、ＨＣ−Ｊ５株
では１４６８塩基に関して７６．８％の相同性を示すに
すぎない。このことは、ＨＣ−Ｊ１株はカイロン社が同
定したウイルス株に比較的近縁でアメリカ型ウイルスで
あるのに対して、ＨＣ−Ｊ４、Ｊ５、Ｊ６、Ｊ７株はこ
れとはやや異なり、日本型ウイルスであることが示唆さ
れた。

【００１０】ＨＣ−Ｊ１、Ｊ４、Ｊ５、Ｊ６、Ｊ７各株
の塩基配列を基に、ＮＡＮＢ肝炎ウイルス５’末端側お
よび３’末端側コード領域遺伝子によってコードされる
アミノ酸配列を決定した。その結果、各株によってコー
ドされるポリペプタイドはＨＣ−Ｊ１（５’末端側：７
３３個、３’末端側：３６５個）、以下同じくＪ４（７
３３個、３６５個）、Ｊ５（５１５個、３６５個）、Ｊ
６（７３７個、３６５個）、Ｊ７（７１９個、３６５
個）であった。決定されたアミノ酸配列の知見にもとづ
いて、配列番号１１ないし２０記載のポリペプタイドを
化学合成して得た。

【００１１】ＨＣ−Ｊ１とＨＣ−Ｊ４の２つの株で５′
末端側アミノ酸配列を比較すると、下流領域に比べ上流
領域でアミノ酸配列の相同性が高く、また、上流領域に
はアルギニン等の塩基性アミノ酸が多く含まれて親水性
が高い。塩基性アミノ酸はコア蛋白質によくみられ、核
酸との親和性を与えることから、上流領域はウイルスの
コア蛋白質をコードし、下流領域はアミノ酸置換が多
く、また８箇所の糖鎖結合部位が共通に認められたこと
から、外殻（エンベロープ）蛋白質をコードすると推認
された。

【００１２】各株間の５′末端側アミノ酸配列の相同性
を上流域と下流域に分けて比較すると、コア部分と推定
されるａａ１〜１９１ではＨＣ−Ｊ１とＨＣ−Ｊ４の間
で９６．９％、ＨＣ−Ｊ６とＨＣ−Ｊ７の間で９５．３
％と高い相同性を示すが、ＨＣ−Ｊ１とＨＣ−Ｊ６の間
では９０．６％、ＨＣ−Ｊ４とＨＣ−Ｊ７の間でも９
０．６％とやや低くなる。また、エンベロープ部分と推
定されるａａ１９２〜３８３ではＨＣ−Ｊ１とＨＣ−Ｊ
４の間では７７．６％、、ＨＣ−Ｊ６とＨＣ−Ｊ７の間
では７１．４％であるのに対してであり、コア部分に比
してかなり低い。さらに、ＨＣ−Ｊ１とＨＣ−Ｊ６の間
では６０．９％、ＨＣ−Ｊ４とＨＣ−Ｊ７の間では５
２．６％と非常に低い相同性を示した。各株間のコア領
域アミノ酸配列の相同性が高いことは、本発明のポリペ
プタイドを用いた抗体検出系はアメリカ型、日本型を問
わず、広汎にＮＡＮＢ肝炎ウイルス感染を検出できるこ
とを意昧する。

【００１３】本発明者らは、親水性スコアの検討から配
列番号２１〜２７記載の各ポリペプタイドを選択し、こ
れらを合成した（請求項第１項〜第３項）。これらポリ
ペプタイドは、ＨＣ−Ｊ１株、ＨＣ−Ｊ４、ＨＣ−Ｊ
５、ＨＣ−Ｊ６、ＨＣ−Ｊ７の各株に由来する。また、
これらに部分的なアミノ酸置換があっても、抗原性を失
わない範囲であれば有効であり、いずれも本発明に含ま
れる。本発明者らは、配列番号２１〜２７のポリペプタ
イドを合成して、これを用いたＮＡＮＢ肝炎ウイルス抗
体測定系が、高い特異性でＮＡＮＢ肝炎ウイルスを検出
できることを確認した。

【００１４】他方、エンベロープ領域蛋白質を得ること
は該ウイルスの感染防御を目的としたワクチン開発に必
須であり、アミノ酸配列の相同性がアメリカ型と日本型
に大別でき、さらに日本型の中でも変異がみられること
は、カイロン社が見い出したウイルス株のみならず、本
発明で開示された日本型のウイルス株のアミノ酸配列が
ワクチン製造に非常に重要であることを意昧する。ＨＣ
Ｖ、すなわちＣ型肝炎ウイルスはその遺伝子構造からフ
ラビウイルスに近縁であると考えられており、本発明に
おいて明らかにされた５′末端側非構造部分塩基（ｎｔ
１４９１〜）はフラビウイルスでＮＳ１と呼ばれる、糖
蛋白質をコードしている部分に相当すると推定される。
フラビウイルスの一種である黄熱病ウイルスではＮＳ１
にコードされる蛋白質に対する抗体が免疫防御に関係す
るとの報告があり（Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６０，１１５３，１９８
６）、本発明の塩基およびアミノ酸配列を利用してＮＡ
ＮＢ肝炎の治療および予防に有用な蛋白質を得ることが
できる。他方、３′末端側配列の各株間での相同性は、
３６５アミノ酸についてＨＣ−Ｊ１とＨＣ−Ｊ４の間で
は８７．４％、ＨＣ−Ｊ６とＨＣ−Ｊ７の間では８９．
６％であるのに対して、ＨＣ−Ｊ１とＨＣ−Ｊ６の間で
は７３．７％とやや低くなる。また、非コード領域３９
塩基についてもやはりＨＣ−Ｊ１とＨＣ−Ｊ４の間では
６４．１％、ＨＣ−Ｊ６とＨＣ−Ｊ７の間では８２．１
％であるのに対して、ＨＣ−Ｊ１とＨＣ−Ｊ６の間では
３０．８％とかなり低くなり、アメリカ型、日本型の相
違、および日本型の中でも変異が多いことを反映してい
ると想定された。

【００１５】ＨＣＶ、すなわちＣ型肝炎ウイルスはその
遺伝子構造からフラビウイルスに近縁であると考えられ
ており、本発明において明らかにされた３′末端側非構
造部分塩基はＨＣＶではＮＳ５と呼ばれるが、ＲＮＡ依
存ポリメラーゼをコードしている部分であると推定され
る。従って、ＮＳ５にコードされるポリペプタイドを用
いて抗体検出系を組むことは、ＮＡＮＢ肝炎診断に大き
な意義を持つ。さらに、本発明において日本型とアメリ
カ型のＮＳ５領域の塩基配列を解明し、ポリメラーゼの
アミノ酸配列を得たことは、ＮＡＮＢ肝炎ウイルスの治
療、予防、およびそれらの研究手段として非常に有用で
ある。このように、本発明においては、ＮＡＮＢ型肝炎
ウイルスの抗原性に重要な役割を果たす構造蛋白質およ
び非構造蛋白質をコードする遺伝子領域を確認し、その
塩基配列を明らかにした。また、それによって、構造蛋
白質および非構造蛋白質を構成するアミノ酸配列を明ら
かにし、抗原性を有するポリペプタイドの検索と合成に
決定的に有用な材料を提供した。

【００１６】本発明の各ポリペプタイドは、化学合成に
よってのみならず、公知の遺伝子組換えによる発現ペプ
タイドとして得ることもできる。また、本発明者らは上
記各ポリペプタイドに対する抗体を製造し、これをＮＡ
ＮＢ肝炎ウイルス抗原の検出に利用できることを確認し
た。したがって、本発明の各ポリペプタイドもしくはこ
れらの部分的置換物（請求項第１項〜第３項）、あるい
はそれらに対する抗体を用いた検出系は、ＮＡＮＢ肝炎
の特異的診断薬として有効であり、その実用上の価値は
大きい。これらはいずれも本発明の範囲に含まれる。

【００１７】また、上記ポリペプタイドやそれに対する
抗体はワクチンの原料として使用することもできる。

【００１８】

【作用】本発明のポリペプタイド（請求書第１項ないし
第３項）、またはこれに対する抗体は、ＮＡＮＢ肝炎の
検出系、特異的診断薬として有効であり、本発明のポリ
ヌクレオチド（請求項第４項ないし第６項）はこれを宿
主細胞に組み込んで本発明のペプタイドを製造すること
ができる。

【００１９】

【実施例】以下、本発明の実施例について述べるが、も
とより本発明がこれらの実施例に限定されるものではな
い。 実施例１ ＮＡＮＢ型肝炎ウイルスの５′末端塩基配列及びアミノ
酸配列を次のようにして決定した。

【００２０】（１）ＲＮＡ抽出 日本人供血者の血漿から得た、ＨＣＶ抗体陽性（オーソ
・ダイアグノスティック・システムズ株式会社のオーソ
ＨＣＶＡｂＥＬＩＳＡテストによる）と判定された検体
（ＨＣ−Ｊ１、Ｊ５、Ｊ６）、日本人腎透析患者より得
て、同じくＨＣＶ抗体陽性と判定された検体（ＨＣ−Ｊ
７）、ＮＡＮＢ型肝炎の感染性を確認したチンパンジー
から得た、ＨＣＶ抗体（−）の検体（ＨＣ−Ｊ４）よ
り、いずれも次のようにしてＲＮＡを抽出した。１．８
ｍｌの血漿に１ｍｌのトリス塩酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐ
Ｈ８．０）を加え、６８×１０^３ｒｐｍで１時間遠心し
た。得られたペレットに２００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、２％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム
（ＳＤＳ）と１ｍｇ／ｍｌのプロテナーゼＫを含むトリ
ス塩酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）を加え、６０℃
１時間加温し、フェノール／クロロホルムで抽出した
後、エタノール沈殿を行い、ＲＮＡを得た。

【００２１】（２）ｃＤＮＡ合成 ＨＣ−Ｊ１血漿より抽出したＲＮＡを７０℃で１分間加
温し、これを鋳型として１０ユニットの逆転写酵素（ｃ
ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＳｙｓｔｅｍＰｌｕｓ，
Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｊａｐａｎ）及びオリゴヌクレオチ
ドプライマー（２０マー）２０ｐｍｏｌを加えて４２
℃、１．５時間反応させｃＤＮＡを得た。プライマーと
してはヨーロッパ特許出願第８８３１０２２．５号に示
されたＨＣＶの塩基配列を参照して合成した＃８（５′
−ＧＡＴＧＣＴＴＧＣＧＧＡＡＧＣＡＡＴＣＡ−３′）
を用いた。

【００２２】（３）ポリメラーゼチェインリアクション
（ＰＣＲ）によるｃＤＮＡの増幅は次のように行った。
ＤＮＡサーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ
・Ｃｅｔｕｓ）に、Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＤＮＡ増幅試薬
キット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ・Ｃｅｔｕｓ）を用
い、Ｓａｉｋｉらの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９、４８
７−４９１．１９８８）によって３５サイクルのｃＤＮ
Ａ増幅を行った。

【００２３】（４）ｃＤＮＡライブラリーの構築による
Ｊ１、Ｊ４、５′末端側塩基配列の決定 ｃＤＮＡライブラリーを用いたＨＣ−Ｊ１、ＨＣ−Ｊ４
ゲノムの５′末端側の塩基配列解析は図１−（ａ）、
（ｂ）に示すように、ｃＤＮＡをバクテリオファージλ
ｇｔ１０に挿入して得たクローンの解析及びｃＤＮＡを
ＰＣＲにて増幅して得られたクローンの解析結果の両者
を併せて決定した。図１はＮＡＮＢ型肝炎ウイルスゲノ
ムの５′末端を制限酵素切断部位とともに示し、使用す
るプライマーの位置も示す。図中、実線はバクテリオフ
ァージλｇｔ１０のライブラリーによるクローンで塩基
配列を決定した範囲を、点線はＰＣＲによるクローンで
塩基配列を決定した範囲を示す。ＨＣ−Ｊ１のｎｔ４５
４〜２１０９の１６５６塩基はプライマー＃８から得た
ｃＤＮＡをλｇｔ１０ファージベクター（Ａｍｅｒｓｈ
ａｍ）に挿入して得られたクローンφ４１により決定し
た。つぎにこのシークエンスをもとに合成した、ｎｔ８
２４〜８４３の新しいプライマー＃２５（５′−ＴＣＣ
ＣＴＧＴＴＧＣＡＴＡＧＴＴＣＡＣＧ−３′）を用い
て、ＨＣ−Ｊ４のｃＤＮＡライブラリーから順次４つの
ｃＤＮＡクローンφ６０、φ６１、φ６６、φ７５を得
て、上流のｎｔ１８〜８４３の塩基配列を決めた。ＨＣ
−Ｊ４について、さらに上流の５′末端を特定するため
にｎｔ２４６〜２６５のアンチセンスプライマー＃３６
（５′−ＡＡＣＡＣＴＡＣＴＣＧＧＣＴＡＧＣＡＧＴ−
３′）を用いてｃＤＮＡを合成したのち、ターミナルデ
オキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによりｃＤＮ
Ａの５′末端にｄＡ付加を行い、２段階のｏｎｅ−ｓｉ
ｄｅｄＰＣＲ増幅を行った、すなわち、１回目はオリゴ
ｄＴプライマー（２０−ｍｅｒ）とｎｔ１８８〜２０７
のアンチセンスプライマー＃４８（５′−ＧＴＴＧＡＴ
ＣＣＡＡＧＡＡＡＧＧＡＣＣＣ−３′）を用いて３５サ
イクルのＰＣＲ増幅を行い、２回目はそのＰＣＲ産物を
鋳型にしてオリゴｄＴプライマー（２０−ｍｅｒ）とｎ
ｔ１４０〜１６０のアンチセンスプライマー＃１０９
（２１−ｍｅｒ；５′−ＡＣＣＧＧＡＴＣＣＧＣＡＧＡ
ＣＣＡＣＴＡＴ−３′）を用いて３０サイクルのＰＣＲ
を行った。得られたＰＣＲ産物をＭ１３ファージベクタ
ーにサブクローニングした。完全長の５′末端配列を有
すると考えられる６個の独立したクローン、Ｃ８９６
２、Ｃ８９６８、Ｃ８９７０、Ｃ８９７４、Ｃ９０３
４、Ｃ９０３６が得られ、ｎｔ１〜１７の塩基配列を決
定した。

【００２４】一方ＨＣ−Ｊ１の上流のシークエンスは、
ｎｔ１８〜８４３についてはプライマー＃４４（５’−
ＧＣＧＡＣＡＣＴＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＴ−３’）と＃
２５（５’−ＴＣＣＣＴＧＴＴＧＣＡＴＡＧＴＴＣＡＣ
Ｇ−３’）を用いたＰＣＲによって得られたクローンＣ
２５０３、Ｃ２５０８、及びＣ２５１０によって決めら
れた。さらに上流の５’末端は、ＨＣ−Ｊ４と同様の方
法により得られた１６個のクローン、Ｃ８９３１、Ｃ８
９３２、Ｃ８９３５、Ｃ８９３７、Ｃ８９４２、Ｃ８９
４４、Ｃ８９４９、Ｃ８９５０、Ｃ８９５１、Ｃ８９５
４、Ｃ８９５５、Ｃ９０２３、Ｃ９０２６、Ｃ９０３
０、Ｃ９０３１、Ｃ９０３２を用いて、ｎｔ１〜３７の
塩基配列を決めた。次にＨＣ−Ｊ１の５’末端側下流の
塩基配列を決定するため、プライマー＃１４８（５’−
ＴＧＣＡＣＣＴＧＧＡＴＧＡＡＣＴＣＡＡＣ−３’）と
＃１４６（５’−ＡＧＴＡＧＣＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＡ
ＧＣＡ−３’）を用いて３０サイクルのＰＣＲを行っ
た。得られたクローンのＣ１１４４４、Ｃ１１４５０、
Ｃ１１４５１によりｎｔ１９８４〜２５６０の塩基配列
を決定した。一方、ＨＣ−Ｊ４のｎｔ７３８〜１９００
までの下流シークエンス１１６３塩基はプライマー＃３
０（５’−ＣＴＣＡＴＧＧＧＧＴＡＣＡＴＴＣＣＧＣＴ
−３’）と＃４２（５’−ＴＣＧＧＴＣＧＴＣＣＣＣＡ
ＣＣＡＣＡＡＣ−３’）を用いたＰＣＲによって得られ
た３つのクローンＣ２８２１、Ｃ３１７３、Ｃ３１９２
によって決められた。さらにＨＣ−Ｊ４の下流の塩基配
列を決定するため、プライマー＃５７（５’−ＴＡＴＴ
ＧＣＴＴＣＡＣＣＣＣＡＡＧＣＣＣ−３’）と＃１４６
（５’−ＡＧＴＡＧＣＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＡＧＣＡ−
３’）を用いて３０サイクルのＰＣＲを行った。得られ
たクローンＣ１１４６２、Ｃ１１４６３、Ｃ１１４６４
によりｎｔ１８６０〜２５６０の塩基配列を決定した。
以上の解析結果により、ＨＣ−Ｊ１、ＨＣ−Ｊ４は５’
末端側にそれぞれ配列図１、２に示す塩基配列を有する
ものと決定した（配列番号１、２）。

【００２５】（５）ｃＤＮＡライブラリーの構築による
Ｊ５、５′末端側塩基配列の決定 ＨＣ−Ｊ５ゲノムの５′末端側の塩基配列は図１−
（Ｃ）に示すように、ｃＤＮＡをＰＣＲにて増幅して得
られたクローンの解析結果より決定した。ＨＣ−Ｊ５検
体より上記と同様の方法でＲＮＡを抽出し、そのシーク
エンスを決定した。ｎｔ６〜１８６８は次に示すプライ
マーの組み合わせによるＰＣＲにて得られた各クローン
から決められた。

【００２６】さらに５′末端側を特定するために、実施
例１−（４）と同様の方法にて３個のｃＤＮＡクロー
ン、Ｃ８９９５、Ｃ８９９７、Ｃ８９９８を得、ｎｔ１
〜１６０の塩基配列を決めた。

【００２７】以上の解析結果により、ＨＣ−Ｊ５は５’
末端側に配列番号３に示す塩基配列を有するものと決定
した。なお、ＨＣ−Ｊ５における５’側非コード領域で
は、ＨＣ−Ｊ１におけるｎｔ６ないし１０の連続する５
個のシトシンのうちの１個が欠落しており、合計３４０
の非コード領域塩基を有することが明らかとなった。

【００２８】（６）ｃＤＮＡライブラリーの構築による
Ｊ６、５′末端側塩基配列の決定 ＨＣ−Ｊ６ゲノムの５′末端側の塩基配列は図１−
（ｄ）に示すように、ｃＤＮＡをＰＣＲにて増幅して得
られたクローンの解析結果より決定した。ＨＣ−Ｊ６検
体より上記と同様の方法でＲＮＡを抽出し、そのシーク
エンスを決定した。ｎｔ２４〜２５５１は次に示すプラ
イマーの組み合わせによるＰＣＲにて得られたクローン
から決められた。

【００２９】さらに５′末端側を特定するため、実施例
１−（４）と同様の方法にて１３個のｃＤＮＡクロー
ン、Ｃ９５７７、Ｃ９５７９、Ｃ９５８１、Ｃ９５８
４、Ｃ９５８７、Ｃ９５９０、Ｃ９５９１、Ｃ９５９
５、Ｃ９６０６、Ｃ９６０９、Ｃ９６１５、Ｃ９６１
６、Ｃ９６１９を得、ｎｔ１〜１６０の塩基配列を決め
た。

【００３０】以上の解析結果により、ＨＣ−Ｊ６は５’
末端に配列番号４に示す塩基配列を有するものと決定し
た。なお、ＨＣ−Ｊ６における５’側非コード領域で
は、ＨＣ−Ｊ１におけるｎｔ６ないし１０の連続する５
個のシトシンのうちの１個が欠落しており、合計３４０
個の非コード領域塩基を有することが明らかとなった。

【００３１】（７）ｃＤＮＡライブラリーの構築による
Ｊ７、５′末端側塩基配列の決定 ＨＣ−Ｊ７ゲノムの５′末端側の塩基配列は図１−
（ｅ）に示すように、ｃＤＮＡをＰＣＲにて増幅して得
られたクローンの解析結果より決定した。ＨＣ−Ｊ７検
体より上記と同様の方法でＲＮＡを抽出し、そのシーク
エンスを決定した。ｎｔ２４〜２４９８は次に示すプラ
イマーの組み合わせによるＰＣＲにて得られた各クロー
ンから決められた。

【００３２】さらに５′末端側を特定するため、実施例
１−（４）と同様の方法にて８個のｃＤＮＡクローン、
Ｃ１０５１３、Ｃ１０５１５、Ｃ１０５２１、Ｃ１０５
５４、Ｃ１０５５８、Ｃ１０５６８、Ｃ１１２３１、Ｃ
１１２３２を得、ｎｔ１〜１６０の塩基配列を決めた。

【００３３】以上の解析結果より、ＨＣ−Ｊ７は５’末
端側に配列番号５に示す塩基配列を有するものと決定し
た。本実施例により開示されたＨＣ−Ｊ１、Ｊ４、Ｊ
５、Ｊ６、Ｊ７の５’末端側塩基配列は、前記ヨーロッ
パ特許公開第３８８，２３２号に記載されたＨＣＶシー
クエンスとは異なり、本発明により初めて開示されたも
のである。

【００３４】（８）アミノ酸配列の決定 ＨＣ−Ｊ１、Ｊ４、Ｊ５、Ｊ６、Ｊ７の各ゲノムの５’
末端側塩基配列をもとに、５’非翻訳領域の３４０塩基
ないし３４１塩基を除き、開始コドンＡＴＧより始まる
構造遺伝子領域によってコードされる７３３アミノ酸
（Ｊ１、Ｊ４）、５１５アミノ酸（Ｊ５）、７３７アミ
ノ酸（Ｊ６）、７１９アミノ酸（Ｊ７）の配列を決定し
た。各配列はＨＣ−Ｊ１（Ｐ−７３３−１：配列番号１
１）、ＨＣ−Ｊ４（Ｐ−７３３−２：配列番号１２）、
ＨＣ−Ｊ５（Ｐ−５１５：配列番号１３）、ＨＣ−Ｊ６
（Ｐ−７３７：配列番号１４）、ＨＣ−Ｊ７（Ｐ−７１
９：配列番号１５）に示す通りである。

【００３５】（９）コア領域の特定 ＨＣ−Ｊ１とＨＣ−Ｊ４の２つの株間で、構造蛋白質を
構成するアミノ酸配列の相同性を計算すると、ａａ１〜
１９１（コア領域）では９６．６％、ａａ１９２〜３８
３（エンベロープ領域）では７７．６％、ａａ１〜３８
３全体では８７．２％の相同性を有する。ＨＣ−Ｊ１、
ＨＣ−Ｊ４、ＨＣ−Ｊ５、ＨＣ−Ｊ６、ＨＣ−Ｊ７のい
ずれの株間においても下流のａａ１９２〜３８３（エン
ベロープ領域）と比較して、上流のａａ１〜１９１（コ
ア領域）がはるかに高い相同性を示し、株間の保存性が
高いことが明らかとなった。ａａ〜１９１のアミノ酸の
親水性をみると、上流域ａａ１〜１２０に３つの高い親
水性部分が認められた。この領域はアルギニンの様な塩
基性アミノ酸に富んでおり（Ｊ１においては２８／１２
０、２３％）ＮＡＮＢ型肝炎ウイルスのコア蛋白質をコ
ードしている可能性が高い。さらに本発明者らは親水性
スコアの検討から、ａａ３９から７４の３６アミノ酸配
列（ＣＰ−９）がコア蛋白質のエピトープを形成するこ
とを見いだした。（請求項第２項）。ＣＰ−９は配列番
号２２（ＣＰ−９−１：Ｊ１）、配列番号２３（ＣＰ−
９−２：Ｊ４）、配列番号２４（ＣＰ−９−３：Ｊ５、
Ｊ６、Ｊ７）に示すアミノ酸配列を有する。以下ＣＰ−
９−１、２、３を総称してＣＰ−９という。このアミノ
酸配列をコードする遺伝子の塩基配列ＣＮ−９は配列番
号２９（ＣＮ−９−１：Ｊ１）、配列番号３０（ＣＮ−
９−２：Ｊ４）、配列番号３１（ＣＮ−９−３：Ｊ５）
に示す通りである。ＨＣ−Ｊ６、ＨＣ−Ｊ７のＣＮ−９
部分塩基配列はアミノ酸コードが変化しない範囲で配列
番号３１の部分置換された配列であり、配列番号４およ
び５のｎｔ４５６〜５６３に相当する。（請求項第５
項）以下ＣＮ−９−１、２、３を総称してＣＮ−９とい
う。また、実施例、実験例において、ＣＮ−９−１をも
ってＣＮ−９−２、ＣＮ−９−３を代表させてＣＮ−９
と記載することがあり、またＣＰ−９−１をもってＣＰ
−９−２、ＣＰ−９−３を代表させてＣＰ−９と記載す
ることがあるが、ＣＮ−９−２、ＣＮ−９−３、ＣＰ−
９−２、ＣＰ−９−３においても同様の作用効果が確認
された。ＣＮ−５、ＣＰ−５についても同様である。Ｃ
Ｐ−９は、化学合成によって得られたが、また、ＣＮ−
９、または配列番号１ないし５記載の塩基配列のｎｔ４
５６〜５６３に相当するポリヌクレオチドをＥｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ等の宿主細胞に組み込んで発現
させ、得ることもできた。ＮＡＮＢ肝炎ウイルスのコア
蛋白質のエピトープを特定できたことにより、合成ペプ
タイド、遺伝子組み替えによる発現ペプタイド、ポリヌ
クレオチドの合成、抗体の製造、ＮＡＮＢ肝炎診断薬の
製造、ＮＡＮＢ肝炎ワクチン等製品への応用の道が開か
れた。

【００３６】実施例２ 実施例１に示すアミノ酸配列ＣＰ−９のペプタイドを用
いて、ＮＡＮＢ肝炎ウイルス抗体測定系を次のように確
立した。 （１）ペプタイドの製造 Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの固相法に基づき、ペプタイドの
Ｃ末端のアミノ酸をまず架橋ポリスチレンに縮合させ、
ついでｎ末端の方向へ向かってｔ−プトキシカルボニル
アミノ酸を１個づづ順次縮合させていき、アミノ酸配列
がＡｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−
Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｌ
ｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌ
ｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ
−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−
Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇであるペプタ
イド（ＣＰ−９−１、配列番号２２）を合成した（請求
項第２項）。合成後、６Ｎ−ＨＣｌ、１１０℃、２４時
間減圧下で加水分解し、アミノ酸組成を確認した。同様
に配列番号２３、配列番号２４記載のアミノ酸配列を有
するポリペプタイドＣＰ−９−２、ＣＰ−９−３を合成
した。ＣＰ−９同様、配列番号２１記載のアミノ酸配列
を有するポリペプタイドＣＰ−１０を合成した（請求項
第１項）またＣＰ−９同様、配列番号２５ないし２７記
載のアミノ酸配列を有するポリペプタイドＣＰ−５−
１、ＣＰ−５−２、ＣＰ−５−３を合成した。（請求項
第３項）。以下ＣＰ−５−１、２、３を総称してＣＰ−
５という。ＣＰ−１０のアミノ酸配列をコードする遺伝
子は配列番号２８記載の配列（ＣＮ−１０）を有する。
ＣＰ−１０はＣＮ−１０、または、配列番号１ないし５
記載の塩基配列のｎｔ３５４〜４１０に相当するポリヌ
クレオチドを宿主細胞に組み込んで発現させ、得ること
ができる。ＣＰ−５のアミノ酸配列をコードする遺伝子
の塩基配列ＣＮ−５は配列番号３２（ＣＮ−５−１：Ｊ
１）、配列番号３３（ＣＮ−５−２：Ｊ４）配列番号３
４（ＣＮ−５−３：Ｊ６）に示す通りである。ＣＰ−５
はＣＮ−５、または配列番号１ないし５記載の塩基配列
のｎｔ６４２〜７０１に相当するポリヌクレオチドをＥ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ等の宿主細胞に組み込
んで発現させ、得ることができた。

【００３７】（２）ＮＡＮＢ型肝炎ウィルス抗体測定系 測定系は、ポリビニルマイクロタイタープレートを用
い、サンドイッチ法で行った。プレートの固相には、本
実施例のペプタイド５μｇ／ｍｌ濃度のものを５０μｌ
をウェルに注入し、室温にて、１晩静置した。その後、
０．０５％、Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理的食塩水で５回
洗浄した。オーバーコートとして、３０％（ｖ／ｖ）の
牛血清、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、１５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ緩衝液（以下「ＣＳ緩衝液」という）１００μｌ
をいれ、室温３０分静置後、残りをすてた。検体の測定
は、一次反応として、各ウエルにつき３０％牛血清を含
むＣＳ緩衝液５０μｌに検体１０μｌを加え、室温で１
時間振盪した。反応終了後、洗浄を上記と同様５回行っ
た。二次反応は、標識抗体にＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐ
ｅｒｏｘｉｄａｓｅ 標識マウス抗ヒトＩｇＧモノクロ
ーナル抗体（Ｆａｂ′フラグメント：２２Ｇ、特殊免疫
研究所）１ｎｇを牛血清５０μｌに溶解し室温１時間振
盪し反応させた。洗浄は同様に５回行い、基質として過
酸化水素、発色剤として、Ｏ−フェニレンジアミン溶解
液５０μｌを室温３０分反応させた後、４規定硫酸を５
０μｌを加え、反応を停止し、吸光度４９２ｎｍで測定
した。判定基準は、ＡＬＴ値が３４Ｋａｒｍｅｎ ｕｎ
ｉｔ以下の正常値を示し、なおかつ、ａｎｔｉ−ＨＣＶ
陰性の供血者検体を測定し、吸光度の平均値に０．２５
を加えた値（０．０５＋０．２５＝０．３０）をカット
オフ値とした。

【００３８】実施例３ （１）ｃＤＮＡライブラリーの構築による３′末端側塩
基配列の決定 ＨＣ−Ｊ１、Ｊ４、Ｊ５、Ｊ６、Ｊ７各ゲノムの３′末
端側の塩基配列は図１−（ｆ）に示すように、ＰＣＲに
て増幅して得られたクローンの解析結果により決定し
た。ＨＣ−Ｊ１、Ｊ４、Ｊ５、Ｊ６、Ｊ７のｎｔ１〜９
３８の９３８塩基の配列については各検体をプライマー
＃８０（５′−ＧＡＣＡＣＣＣＧＣＴＧＴＴＴＴＧＡＣ
ＴＣ−３′）および＃６０（５′−ＧＴＴＣＴＴＡＣＴ
ＧＣＣＣＡＧＴＴＧＡＡ−３′）を用いたＰＣＲにか
け、各増幅産物の塩基配列から決定した。得られたクロ
ーンを次に示す。 ｎｔ９３９より下流の３′末端側塩基配列は以下の方法
に従って決定した。すなわち、各検体より実施例１記載
の方法に従ってＲＮＡを抽出し、ポリ（Ａ）ポリメラー
ゼを用いてＲＮＡの３′末端にポリ（Ａ）を付加した。
オリゴ（ｄｔ）_２０をプライマーとしてｃＤＮＡ合成を
行い、得られたｃＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲに
供した。ＰＣＲは第１段階としてセンスプライマーとし
て各株ｃＤＮＡに特異的な２０マーオリゴヌクレオチド
を、アンチセンスプライマーとしてオリゴ（ｄｔ）_２０
を用いて行った、次に、得られたｃＤＮＡを第２段階Ｐ
ＣＲとして第１段階より下流に相当する特異センスプラ
イマーを、アンチセンスプライマーとしてオリゴ（ｄ
ｔ）_２０を用いて行った。２段階のＰＣＲで得られた増
幅産物にＴ４ＤＮＡポリラーゼを作用させ両端を平滑に
した後、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼにて５′末端を
リン酸化し、Ｍ１３ｍｐ１９ファージベクターのＨｉｎ
ｃＩＩ部位にサブクローニングして塩基配列を決定し
た。

【００３９】各株について、ＰＣＲに用いた２種類のプ
ライマーと得られたクローンを以下に示す。 ＨＣ−Ｊ１ ＃１００（５’−ＡＡＧＧＣＴＧＣＣＡＴＡＴＧＴＧＧＣＡＡ−３’） ＃９１（５’−ＧＣＣＡＴＡＴＧＴＧＧＣＡＡＧＴＡＣＣＴ−３’） クローン：Ｃ９７０７，Ｃ９７１４，Ｃ９７１９，Ｃ９７２４，Ｃ９７２６， Ｃ９７３０，Ｃ９７３７，Ｃ９７３８，Ｃ９７４１，Ｃ９７４２ Ｃ９７４６，Ｃ９９２５，Ｃ９９３６，Ｃ９９４３，Ｃ９９４５， Ｃ９９４９） ＨＣ−Ｊ４ ＃６１（５’−ＴＴＧＣＧＡＧＴＣＴＧＧＡＧＡＣＡＴＣＧ−３’） ＃７８（５’−ＴＧＴＣＣＧＣＧＣＴＡＡＧＣＴＡＣＴＧＴ−３’） クローン：Ｃ８７６１，Ｃ８７６４，Ｃ８７７６，Ｃ８７８４，Ｃ８７９６， Ｃ８８００，Ｃ８８０３，Ｃ８８１１，Ｃ８８１２，Ｃ８８１９， Ｃ８８２５，Ｃ８８４９，Ｃ８８５１） ＨＣ−Ｊ５ ＃９７（５’−ＡＧＴＣＡＧＧＧＣＧＴＣＣＣＴＣＡＴＣＴ−３’） ＃９０（５’−ＧＣＣＧＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＴ−３’） クローン：Ｃ１０８２０，Ｃ１０８２７，Ｃ１０８２９，Ｃ１０８４３，Ｃ１ ０８４４，Ｃ１０８４８，Ｃ１０８４９，Ｃ１０８６４，Ｃ１０８ ６５，Ｃ１０８７２） ＨＣ−Ｊ６ ＃９７（５’−ＡＧＴＣＡＧＧＧＣＧＴＣＣＣＴＣＡＴＣＴ−３’） ＃９０（５’−ＧＣＣＧＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＴ−３’） クローン：Ｃ１０３１１，Ｃ１０３１３，Ｃ１０３１４，Ｃ１０３２０，Ｃ１ ０３２２，Ｃ１０３２３，Ｃ１０３２６，Ｃ１０３２８，Ｃ１０３ ３０，Ｃ１０３３３，Ｃ１０３３４，Ｃ１０３３６，Ｃ１０３３７ ，Ｃ１０３４５，Ｃ１０３４６，Ｃ１０３４７，Ｃ１０３４９，Ｃ １０３５０，Ｃ１０３５７） ＨＣ−Ｊ７ ＃１２３（５’−ＣＴＴＡＧＡＧＣＧＴＧＧＡＡＧＡＧＴＣＧ−３’） ＃１２４（５’−ＧＣＣＡＴＣＴＧＴＧＧＣＣＧＴＴＡＣＣＴ−３’） クローン：Ｃ１０８０１，Ｃ１０８０４，Ｃ１０８０７，Ｃ１０８０９，Ｃ１ ０８１１，Ｃ１０８１２，Ｃ１０８１４，Ｃ１０８１５，Ｃ１０８ １８） 以上の解析結果により、ＨＣ−Ｊ１，Ｊ４，Ｊ５，Ｊ
６，Ｊ７は３’末端側にそれぞれ配列番号６、７、８、
９、１０に示す塩基配列を有するものと決定した。本実
施例により開示されたＨＣ−Ｊ１、Ｊ４、Ｊ５、Ｊ６、
Ｊ７の３’末端側塩基配列は、前記ヨーロッパ特許公開
第３８８，２３２号に記載されたＨＣＶシークエンスの
ｎｔ７９３８〜８８６６（９２９塩基）において重複す
るが、本発明の配列は明らかにそれと異なり、本発明に
より初めて開示されたものである。

【００４０】（２）アミノ酸配列の決定 ＨＣ−Ｊ１、Ｊ４、Ｊ５、Ｊ６、Ｊ７の各ゲノムの３’
末端側塩基配列をもとに、３’非翻訳領域の７７塩基を
除く１０９６塩基の非構造領域によってコードされる３
６５アミノ酸の配列を決定した。各配列はＨＣ−Ｊ１
（Ｐ−３６５−１：配列番号１６）、ＨＣ−Ｊ４（Ｐ−
３６５−２：配列番号１７）、ＨＣ−Ｊ５（Ｐ−３６５
−３：配列番号１８）、ＨＣ−Ｊ６（Ｐ−３６５−４：
配列番号１９）、ＨＣ−Ｊ７（Ｐ−３６５−５：配列番
号２０）に示す通りである。

【００４１】実験例 コア領域のエピトープを形成すると考えられるＣＰ−９
（Ｐ３９−７４、３６マー）について、さらに長さの異
なる５種類のペプタイド（９１９−３６、Ｐ２７−３
６、Ｐ１９−２７、Ｐ１０−２７、Ｐ１０−１８）に分
けて合成し、吸収試験を行った。吸収試験は、検体と１
００μｌ／ｍｌの濃度に調整した５種類のペプタイドを
３０μｌずつ当量混合し、３７℃２時間反応させた後、
測定に供した。測定法は、実施例１に示すとおりであ
る。その結果は表４に示すとおりである。

【００４２】

【表４】

【００４３】ａｎｔｉ−ＣＰ９陽性検体について測定し
た結果、検体１及び２の吸収率からＣＰ−９は、その全
体が抗原性を保持するペプタイドであることが確認され
た。

【００４４】実験例 実施例２で確立したＮＡＮＢ型肝炎ウイルス抗体測定系
を用いて、輸血後ＮＡＮＢ型肝炎と、肝疾患検体で従来
のａｎｔｉ−ＨＣＶ測定キットとの比較を行った。その
結果、本発明の検出系が特異性及び急性期での検出のい
ずれの点においても従来の測定キットよりもはるかに優
れることが確認された。

【００４５】（１）輸血後ＮＡＮＢ型肝炎 本例では、２回にわたり、７単位の輸血を行い約２ケ月
後に肝機能異常を示す、ＮＡＮＢ型肝炎を発症した例に
ついて調べた。本症例について、レトロスペクティブに
ａｎｔｉ−ＨＣＶ及び本発明キットで供血者血液を測定
したところ、表１に示すように吸光度＞２．０００であ
って供血者血液が陽性であることを示した。

【００４６】

【表１】

【００４７】また、患者血清では、輸血後２ケ月目で、
肝機能の上昇と共に本発明の測定系が吸光度２を越える
陽性を示しているのに対し、ａｎｔｉ−ＨＣＶは本発明
より１ケ月遅れて３ケ月目で初めて（＋）を示してい
る。このように、本発明の抗体測定系では、抗ＨＣＶ測
定系に比べ、供血者血液での検出の特異性、及び患者血
清でのより早期の抗体検出のいずれの点でも有意の差が
認められた。

【００４８】（２）肝疾患検体でのａｎｔｉ−ＣＰ９ 肝疾患検体の分類別にａｎｔｉ−ＣＰ９陽性率を測定し
た結果を表２に示す。

【００４９】

【表２】

【００５０】散発性ＮＡＮＢ急性肝炎の例では、１９例
中１３例（６８％）、輸血後ＮＡＮＢ肝炎例では１８例
中１５例（８３％）で、ａｎｔｉ−ＣＰ９が陽性であっ
た。ＮＡＮＢ慢性肝疾患例では、慢性肝炎で１３３例中
１０３例（７７％）、肝硬変で１１３例中７０例（６２
％）、肝癌で４１例中３１例（７６％）が陽性であっ
た。一方、Ａ型急性肝炎では８例中１例が低い陽性であ
ったが、Ｂ型急性肝炎では１１例中全例が陰性であっ
た。Ｂ型慢性肝炎、肝硬変、肝癌はそれぞれ７％、１２
％、１４％が陽性であった。自己免疫疾患のルポイド肝
炎、原発性胆汁性肝硬変症では、それぞれ６例、９例に
ついていずれも陰性であった。カイロン社のａｎｔｉ−
ＨＣＶのデータ（Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８９：２４４：
３６２−３６６）では、輸血後急性ＮＡＮＢ型肝炎７
０．８％（２４例中１７例）、散発性ＮＡＮＢ型肝炎５
６．６％（５８例中３４例）であることと比較すると、
急性肝炎での捕促率でａｎｔｉ−ＣＰ９がより高く優れ
ていることがわかった。又、日本のデータからＢ型急性
肝炎に関して、２．４％（８２例中２例）が陽性を示す
（オルソ カタログ 臨床研究編）に対し、本発明のａ
ｎｔｉ−ＣＰ９は、前述のように全くクロスしておら
ず、ａｎｔｉ−ＣＰ９の特異性の高いことが示された。

【００５１】（３）オルソａｎｔｉ−ＨＣＶキットとの
一致、不一致検体のＲＮＡ検出 ａｎｔｉ−ＣＰ９とａｎｔｉ−ＨＣＶの測定結果が一致
する割合はＮＡＮＢ急性肝炎（発症時）で４９％、ＮＡ
ＮＢ慢性肝疾患例では慢性肝炎、肝硬変、肝癌いずれも
６６〜６７％であった。ａｎｔｉ−ＨＣＶ陰性でａｎｔ
ｉ−ＣＰ９陽性（吸光度２以上）のＮＡＮＢ型慢性肝疾
患例では表２に示すように１１例中１例を除く１０例
で、ＨＣＶ ＲＮＡの存在が確認された。以上の結果か
ら、ＮＡＮＢ型慢性肝疾患の診断においてａｎｔｉ−Ｃ
Ｐ９が特異性、及び感度に優れることが確認された。

【００５２】（４）ＮＡＮＢ型急性肝炎検体での抗体検
出の比較 ＮＡＮＢ型急性肝炎の、輸血例３例と、散発
性例４例について、肝炎発症時（０月）、発症後３ケ
月、発症後６ケ月の３ポイントでａｎｔｉ−ＣＰ９とａ
ｎｔｉ−ＨＣＶを測定し、両抗体の陽転時期を比較し
た。結果を表３に示す。

【００５３】

【表３】

【００５４】ａｎｔｉ−ＣＰ９は、輸血例４、散発性例
３のいずれにおいても肝炎発症時に既に陽性であるのに
対し、ａｎｔｉ−ＨＣＶは、７例中１例（散発性）が肝
炎発症時に陽性であるのみで、５例は３ケ月、残りの１
例は６ケ月後になってはじめて陽性となっており、ＮＡ
ＮＢ型急性肝炎においてａｎｔｉ−ＣＰ９はａｎｔｉ−
ＨＣＶに比較して、早期に出現する抗体を特異的に検出
できることが確認された（図３）。以上のことから、従
来の除外診断によることなく、ＮＡＮＢ型急性肝炎の診
断が本発明のａｎｔｉ−ＣＰ９で可能となった。

【００５５】実験例 アミノ酸配列ＣＰ−１０（Ｐ５−２３、１９マー）のペ
プタイドを用いたＮＡＮＢ型肝炎ウイルス抗体測定例を
以下に示す。測定法は実施例２に示すとおりである。ａ
ｎｔｉ−ＣＰ１０とａｎｔｉ−ＣＰ９は、ほぼ同程度の
陽性率を示すが検体６にみられるように、ａｎｔｉ−Ｃ
Ｐ１０は、ａｎｔｉ−ＣＰ９陰性検体でも陽性のケース
であり、ａｎｔｉ−ＣＰ９の測定を補足するものと考え
られる。また検体１から５までは、ａｎｔｉ−ＨＣＶ
（カイロン社）が陰性であるが、ａｎｔｉ−ＣＰ１０及
びａｎｔｉ−ＣＰ９は陽性でありＰＣＲ法によるＮＡＮ
ＢＲＮＡが検出されている。このことからａｎｔｉ−Ｃ
Ｐ１０測定系は、ａｎｔｉ−ＨＣＶキットに比して、感
度、特異性ともに優れることが確認された（表５）。

【００５６】

【表５】

【００５７】実験例 アミノ酸配列ＣＰ−５（Ｐ１０１−１２０、２０マー）
のペプタイドを用いた、ＮＡＮＢ型肝炎ウイルス抗体測
定例を以下に示す。測定法は、実施例２に示すとおりで
ある。ａｎｔｉ−ＣＰ５とａｎｔｉ−ＣＰ９を比較する
と同一検体での陽性率は、ａｎｔｉ−ＣＰ９の方が高い
が、ａｎｔｉ−ＣＰ５は検体８〜１０の３検体にみられ
るように、ａｎｔｉ一ＣＰ９陰性検体でも陽性の場合が
あり、ａｎｔｉ−ＣＰ９の測定系を補足するものと考え
られる。また検体５〜７及び検体１０は、ａｎｔｉ−Ｈ
ＣＶ（カイロン社）陰性であるが、ａｎｔｉ−ＣＰ５お
よびａｎｔｉ−ＣＰ９は陽性であり、ＰＣＲ法によるＮ
ＡＮＢ ＲＮＡが検出されている。このことから、ａｎ
ｔｉ−ＣＰ５測定系はａｎｔｉ−ＨＣＶキットに対し、
感度、特異性ともに優れることが確認された（表６）。

【００５８】

【表６】

【００５９】

【発明の効果】本発明によれば、従来の測定法では捕促
できなかったＮＡＮＢ肝炎ウィルスの検出が可能であ
り、特異性及び感度のすぐれた、しかも早期に検出可能
なＮＡＮＢ肝炎検出系を提供する。これによって、早期
にしかも正確に患者の診断を行うことができ、また供血
者血液のスクリーニングにおいてもＮＡＮＢ肝炎ウィル
ス保有者の血液を高率で除去しうる。また、本発明のポ
リヘプタイド及びそれに対する抗体は、ワクチンや免疫
製剤の製造にも使用でき、ＮＡＮＢ肝炎ウィルスの構造
遺伝子は、ポリペプチタイド抗原や抗体を見出すのに不
可欠の情報を与える。

【図面の簡単な説明】

【図１】はＮＡＮＢ肝炎ウィルスの塩基配列決定の方法
を示す。（ａ）はＨＣ−Ｊ１株、（ｂ）はＨＣ−Ｊ４
株、（ｃ）はＨＣ−Ｊ５株、（ｄ）はＨＣ−Ｊ６株、
（ｅ）はＨＣ−Ｊ７株の各５′−末端側塩基配列の決定
方法を示す図。（ｆ）は各ゲノムの３′末端側塩基配列
の決定方法を示す図。図中、実線はバクテリオファージ
λｇｔ１０のライブラリーによるクローンで塩基配列を
決定した範囲、点線はＰＣＲによるクローンで塩基配列
を決定した範囲を示し、クローン名を線の横に示した。

【図２】はＮＡＮＢ肝炎ウィルスの構造蛋白質のアミノ
酸の親水性を示す図、

【図３】は輸血後ＮＡＮＢ型肝炎患者のＧＯＴ値（黒塗
り）および−ＣＰ９（白丸）、−ＨＣＶ（黒丸）の
変化を示す図。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/09 C07K 14/16 C12N 15/02 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号２１記載のアミノ酸配列を有する
   ポリペプタイドＣＰ−１０。
2. 【請求項２】配列番号２２記載のアミノ酸配列を有する
   ポリペプタイドＣＰ−９−１。
3. 【請求項３】配列番号２５記載のアミノ酸配列を有する
   ポリペプタイドＣＰ−５−１。
4. 【請求項４】配列番号２８記載の塩基配列を有するポリ
   ヌクレオチドＣＮ−１０。
5. 【請求項５】配列番号２９記載の塩基配列を有するポリ
   ヌクレオチドＣＮ−９−１。
6. 【請求項６】配列番号３２記載の塩基配列を有するポリ
   ヌクレオチドＣＮ−５−１。