JPH0446196A - 抗原蛋白質およびそれをコードしているｄｎａ断片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は抗原蛋白質およびそれをコードしているＤＮＡ
断片に関する。更に詳しくは非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス感
染時に特異的に見られる非Ａ非Ｂ型肝炎に特異的な抗原
蛋白質およびそれをコードしているＤＮＡ断片に関する
。

〔従来の技術〕

ウィルス性肝炎のうち、Ａ型肝炎およびＢ型肝炎と呼ば
れるものはその原因ウィルスが見出され、現在では免疫
学的な方法による診断か既になされている。

一方、輸血後に発症するＡ型でもＢ型でもない肝炎、い
わゆる非Ａ非Ｂ型肝炎は、慢性化し高い確率で肝硬変ま
たは肝癌に移行するにもかかわらず、長い間その原因ウ
ィルスか分離、同定できなかったため、精製抗原蛋白質
の取得が困難であった。そのため非Ａ非Ｂ型肝炎は現在
、輸血後肝炎の９０％以上を占めるといわれており、大
きな社会的問題となっている。

この非Ａ非Ｂ型肝炎関連の抗原抗体検出系の作成は、当
業界では急務とされ多くの研究者によって試みられてき
たか、未だ高感度な検出系は見出されておらず、非Ａ非
Ｂ型肝炎の診断には、原因の明らかな種々の病因を排除
した上で診断する排除試験の結果に頼っているのが実情
である。

抗原蛋白質を抗原抗体検出系の試薬として使用する場合
、多量の非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原蛋白質を必要とするか
、従来から用いられてきた感染した血液等からの抗原取
得方法では、多量の精製抗原蛋白質を得ることが、前記
の如く極めて困難てあった。近年の遺伝子組換え技術の
進展に伴い、この技術を用いて非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原
蛋白質の生産か可能となったが、このためには非Ａ非Ｂ
型肝炎特異抗原蛋白質をコードする遺伝子の取得か必須
となる。

最近、血液伝播性非Ａ非Ｂ型肝炎に感染しているチンパ
ンジーの血漿から非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスの遺伝子が単
離され、同定がなされ、その遺伝子の核酸配列と推定さ
れるものの一部は既に明らかにされている〔サイエンス
（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２４４巻、第３５９頁（１９８
８年）：サイエンス、第２４４巻、第３６２頁（１９８
８年）；およびヨーロッパ特許第０３１８２１６号明細
書参照〕。一方、本発明者らの一人を含む数人によって
非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス保持者と思われる人の血清から
上記の遺伝子とは核酸配列の異なるウィルス遺伝子が単
離され、同定されたことが報告されている〔ガストロエ
ンテロロシア・ジャポニカ（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏ
ｌｏｇｉａ　Ｊａｐｏｎｉｃａ）　、第２４巻、第５号
、第５４０頁（１９８９年）；ガストロエンテロロシア
・ジャポニカ、第２４巻、第５号、第５４５頁（１９８
９年）ニガストロエンテロロシア・ジャポニカ、第２５
巻、第２号、第２１８頁（１９９０年）および内科、第
６４巻、第６号、第１０２２頁（１９８９年）参照〕。

これらの遺伝子を用いて得られた組み換え抗原蛋白質を
用いれば抗体検査か可能になる。即ち非Ａ非Ｂ型肝炎ウ
ィルスに感染すれば抗体が生しるため、これらの組み換
え抗原蛋白質を用いた抗体テストにより、非Ａ非Ｂ型肝
炎ウィルスに対する抗体の保持者を鑑別することかでき
る。そして、そのような抗体保持者の血液を除外するこ
とにより、かなりの割合で輸血による非Ａ非Ｂ型肝炎に
感染することか防ぎうると考えられる。

このような観点から、非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原蛋白質を
コードしているＤＮＡ断片の検索がなされ、既に報告さ
れたものもある（特開昭６４２５７６号公報）。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原を利用したこれ
までの酵素免疫測定法では、臨床的に経目的感染による
非Ａ非Ｂ型肝炎と診断された患者であっても、その抗体
陽性率は約７５％てあり、残りの２５％は陰性と判断さ
れている。

このことは非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原のエピトープは、複
数個存在することを示している。従って、従来公知のエ
ピトープ部分を有する非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原蛋白質を
利用した酵素免疫測定法では、非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原
に対する抗体の存在を正確に診断することができない。

従って、本発明の目的は、非Ａ非Ｂ型肝炎に対する抗体
を検出するために好適な新規な特異抗原蛋白質を提供す
ることにある。

本発明の他の目的は、前記抗原蛋白質をコードしている
ＤＮＡ断片を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

そこで本発明者らは、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスを構成す
る蛋白質の中から、抗原性が強く発現しているエピトー
プ部分を含む領域を見出すべく鋭意検討した結果、抗体
の検出に有用な特異抗原蛋白質およびそれをコードして
いるＤＮＡ断片を見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明の要旨は、 下記のアミノ酸配列またはその一部を有する非Ａ非Ｂ型
肝炎特異抗原蛋白質に関し、 Ｇ　１ｕ−Ｐｒｏ−Ｇ　１ｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｖａｌ
−Ｔｈｒ−Ｖａ　１−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−３ｅｒ−Ｍｅｔ
−Ｌｅｕ＝Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ｈｉｓ−
ｒｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａ
ｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＡｒｇＧｌｙ
−３ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−
３ｅｒ−３ｅｒ−３ｅｒＡｌａ−３ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅ
ｕ−３ｅｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ
Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｈ
ｉｓ−Ａｓｐ−３ｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｓ
ｐ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ
−ＬｅｕＴｒｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−１１ｅ−ＴｈｒＳｅｒ−Ｖａｌ
−Ｇｌｕ−３ｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−
Ｖａｌ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−３ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇ
ｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｖａ　ｌ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇ
ｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−１１ｅ−３ｅ
ｒまた、前記のアミノ酸配列またはその一部を有する非
Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原蛋白質をコードしているＤＮＡ断
片に関する。

本発明の非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原蛋白質は前記のアミノ
酸配列またはその一部を有する、少なくとも１０個以上
、通常２０〜１００個からなる蛋白質である。

本発明の非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原蛋白質は、これをコー
ドする後述のＤＮＡ断片を用いて遺伝子組み換え方法に
より容易に得ることができる。

本発明の非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原蛋白質をコードするＤ
ＮＡ断片は、例えば次のような塩基配列のものか挙げら
れる。

ＡＡＣＴＴＧＧＣＧＡ ＡＣＡＴＣＧＣＣＴＣ ＣＴＣＣＴＧＣＴＣＧ ＣＣＣＴＴＴＡＧＡＧ 本発明の非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原蛋白質をコードするＤ
ＮＡ断片は、例えば次のような方法により得ることかで
きる。

まず検体中に存在する非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス核酸（Ｒ
ＮＡ）の抽出か行なわれる。

血漿からのＲＮＡの抽出方法としては、例えばグアニジ
ン・チオシアネート、酢酸ソーダ等を添カロしたのちフ
ェノール、およびクロロフォルム／イソアミルアルコー
ルで抽出するチャメジンスキー（Ｐ、　Ｃｈａｍｅｚｙ
ｎｓｋｉ）等の方法〔アナリティカルオブ　バイオケミ
ストリー（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、第１６２
巻、１５６頁（１９８７年）〕か用いられる。また、例
えば１ｍＭ　　ＥＤＴＡを添加した５０ｍＭ　　トリス
塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）を血漿に等量刑えて希釈し、
ショ糖密度勾配遠心法で遠心して得られる最下層の沈澱
物をグアニジンチオシアネートを含む溶液に溶解したの
ち、得られた溶液にキャリアとしてポリＣ（２０μｇ　
／　ｍｌ　）を加え、フェノールとクロロフォルムとイ
ソアミルアルコールの混合液（容量比５０対４８対２）
で蛋白の変性除去を行なう。その後、水層部分に等量の
イソプロパツールを加え核酸を沈澱させる。ついで、沈
澱に混入しているＤＮＡを除去する目的で、市販のＲＮ
ａｓｅか混入していないＤＮａｓ　ｅを更に精製したも
ので処理する。このようにして目的とする非Ａ非Ｂ型肝
炎ウィルスＲＮＡを単離することができる。

また、血清にポリエチレングリコールを加えて冷所で一
夜静置し、ＲＮＡを沈澱させる。キャリアーとしてＭＳ
−２フアージＲＮＡを加え、フェノール・クロロフォル
ム混合液て除蛋白することにより、目的とする非Ａ非Ｂ
型肝炎ウィルスＲＮＡを得ることができる。

また、非Ａ非Ｂ型肝炎に感染した肝組織から非Ａ非Ｂ型
肝炎ウィルスＲＮＡを得る場合には次のような方法が用
いられる。

まず、肝組織をグアニジンチオシアネート水溶液中で常
法に従ってホモジナイズし、遠心分離により、上清を得
る。この上清をスクロースまたは塩化セシウムを用いる
平衡密度勾配超遠心法による分離操作に付し、ＲＮＡを
沈澱として得る。その後、フェノール抽出、エタノール
沈澱により、精製する。

このようにして取得した核酸画分より、ランダムブライ
マー法によりｃＤＮＡを得る。得られたｃＤＮＡを例え
ば市販のキットにより、バクテリオファージ　λｇｔｌ
ｌに挿入し、大腸菌Ｙ　１０９０株等に感染させる。培
養後生じたプラークをニトロセルロース膜に転写し、非
Ａ非Ｂ型肝炎特異抗体保持血清を作用させ、抗体と反応
する陽性クローンを検出する。

このようにして得た抗体反応陽性クローンを例えば、大
腸菌（Ｙ　１０９０株等）に感染させ、増幅後、単離し
て得られた遺伝子断片の核酸配列を常法により決定する
。

このようにして、例えば前記の塩基配列またはその一部
を有するＤＮＡ断片が得られる。

また、前記の塩基配列またはその一部を有するＤＮＡ断
片は、公知のＤＮＡ合成方法によって容易に調製するこ
とがてきる。

〔作用・効果〕

本発明の非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原蛋白質は、大腸菌、酵
母等を用いて本発明の非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原蛋白質を
コードするＤＮＡ断片を発現させることにより大量に得
ることかできる。この特異抗原蛋白質は非Ａ非Ｂ型肝炎
に対する抗体の検出に有用であり、常法に従い抗体検出
用試薬として用いることかできる。例えば、蛍光免疫抗
体法、受身血球凝集法、放射免疫測定法、酵素免疫測定
法等が挙げられる。この場合、特異抗原蛋白質は前記ア
ミノ酸配列またはその一部を有するものであり、通常１
０個以上のアミノ酸配列からなるものが用いられ、２０
個以上のアミノ酸配列からなるものを用いるのか好まし
い。

また、本発明の非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原蛋白質をコード
しているＤＮＡ断片は、核酸ハイブリダイゼーション法
による非Ａ非Ｂ型肝炎関連特異抗原の遺伝子の検出用の
プローブや、遺伝子増幅用ブライマー等の遺伝子診断用
試薬として有用である。

この場合、ＤＮＡ断片はプローブ用としては、通常１５
個以上の塩基配列からなる断片が用いられるが、２０個
以上の塩基配列からなる断片を用いるのか好ましい。ま
たブライマー用としては、通常１０〜３０個の塩基配列
からなる断片か用いられるか、１５〜２５個の塩基配列
からなる断片を用いるのか好ましい。

〔実施例〕

以下に、実施例により本発明を具体的に説明するが、本
発明はこれら実施例により何等限定されるものではない
。

実施例Ｉ Ｂ型肝炎に感染していないことを確認した非Ａ非Ｂ型肝
炎患者血清１００ｍ１にポリエチレングリコール４００
０を４ｇ添加し、４°Ｃにて一夜放置した。この操作で
得られた沈澱を６Ｍ　グアニジンチオシアネーｔ−２０
ｍ１に溶解し、得られた溶液に対して２Ｍ酢酸ソーダ２
ｍｌを添加したのち、フェノール２ｍｌ、クロロフォル
ム／イソアミルアルコール（比率４９／１）４ｍｌにて
除蛋白した。得られた水層にＭＳ−２ファージ０．８μ
ｇを加えイソプロピルアルコールをさらに加え、核酸を
沈澱させた。さらにこの処理で得られた沈澱物を６Ｍ　
グアニジンチオシアネート５ｍｌに溶解し、イソプロピ
ルアルコールで再度沈澱させて精製し、ジエチルピロカ
ルバネートで処理（ＤＥＰＣ処理水）し、オートクレー
ブ滅菌した水に溶解し、ＲＮＡ画分とした。

得られた核酸１０μｇ（Ｉμｇ／μｍ）に対して、１０
０ｍＭメチル化水銀１μｍを加え、室温で１０分間放置
することにより変性させ、７００ｍＭ　　２−メルカプ
トエタノール２μｌ、２５ユニツトヒト胎盤リボヌクレ
アーゼインヒビター（ＲＮａｓ　１ｎ）２μｌを添加し
た。更に、ランダムプライマー（アマジャム社製）１０
μｇ、１Ｍトリスー塩酸（ｐＨ８，３）５μｍ、ＬＭ　
　ＫＣｌ７μＩ、２５０ｍＭ　　ＭｇＣｌ□２２ａＩ、
２０ｍＭ　　ｄＮＴＰｓ　　２．５μＩを添加し、ＤＥ
ＰＣ処理水を加えることにより容量を４８μｍとした。

これに、４０ユニツトの逆転写酵素２μＩを加え、４２
℃、３時間反応させた。

このようにして得られた反応液に、］００ｍＭＭｇＣ１
□２７０ｍ、　　２Ｍ　　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７
，４）　　５μｍ、　　ＩＭ　　（Ｎ［４’）ＳＯ，，
１，５μｌ、　ＲＮａＳｅＨ（ｌユニット／μｍ）１μ
ｌ、　　Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＤＮＡポリメラーゼ（１０ユ
ニツト／μＩ）　　４．５μＩを添加し、１６°Ｃて４
時間反応させたのち、フェノール／クロロフォルム（４
９／１）で抽出し、除蛋白したのち、エタノール沈澱を
行ってＤＮＡを精製した。得られた沈澱物をＴＥバッフ
ァーに溶解し、セファデックス　Ｇ５０　　スピンカラ
ムで精製した。カラムの溶出液より、エタノール沈澱で
ＤＮＡを回収し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーセによりｃＤＮ
Ａを平滑末端化した。この平滑末端に、ＤＮＡリガーゼ
によりＥｃｏＲｒアダプターをライゲーションし、λｇ
ｔｌｌのＥｃｏＲＩサイトに組み込み、パッケージング
した（パッケージングキット　アマジャム社製）。

このｃＤＮＡライブラリーを、大腸菌（Ｙ　１０９０株
）に感染させ、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ
アガロースプレートにまき、４３°Ｃて４時間インキュ
ベートし、挿入したｃＤＮＡをβガラクトシダーゼタン
パクとの融合タンパクとして発現させた。その後、１０
ｍＭ　　ＩＰＴＧを吸収させたニトロセルロース膜（ハ
イボンドＣアマジャム社製）を、プレートにのせ３７°
Ｃて３時間インキュベートした。次いでニトロセルロー
ス膜を１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＭＣＩ　　緩衝液（ｐＨ
７，５）で洗浄し、３９６ゲラチンを含むトリスーボレ
ートーサリン（ＴＢＳ）緩衝液中で室温下で一夜振盪し
てブロッキングを行なった。このようにして得られたニ
トロセルロース膜をＴＢＳ緩衝液で洗浄後、非Ａ非Ｂ型
肝炎特異抗体を有する血清を、あらかじめ大腸菌（Ｙ　
１０９０株）のライセードで処理し、ＴＢＳ緩衝液で２
０倍希釈したものを上記のニトロセルロース膜に作用さ
せ３時間反応させた。

次いで、反応させたニトロセルロース膜を０，０５％　
Ｔｗｅｅｎ　　２０を含むＴＢＳ緩衝液（ＴＢＳＴ）に
て１０分間　３回洗浄した。その後、ペルオキシダーゼ
標識した抗ヒトＩｇＧ（カッペル社製）と反応させた。

ＴＢＳＴ緩衝液で洗浄したのち、ＨＲＰ　　Ｃｏ１ｏｒ
（バイオラッド社）で発色させた。このようにして陽性
プラーク１つを得た。

次に非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原蛋白質をコートする遺伝子
の核酸配列を決定するために、ＤＮＡ断片の取得を試み
た。

滅菌パスツールピペットの先端を用いて、陽性プラーク
の中心を打ち抜き、新たに調製した５０ｍ１遠心チユー
ブに入れた０、　５　ｍ　ｌの感染用大腸菌（Ｙ　１０
９０株）に懸濁した。室温で１５分間放置し、ファージ
を細胞に吸収させた。

上記液に５ｍＭ　　ＣａＣＬと５０μｇ／ｍｌアンピシ
リンを含むＬＢ培地を５ｍｌ加え、振盪しなから４３°
Ｃ１３，５時間培養しファージを増殖させた。このよう
にした得られた溶液にクロロフォルムを２〜３滴加え更
に５分間振盪した。

その後、３０００回転、１０分間遠心分離を行い、得ら
れた上清にクロロフォルムを１滴加え４°Ｃで保存し、
ファージライセードとした。

このファージライセード４ｍｌに、ＳＭバッフ−ｒ　　
（１００ｍＭ　　ＮａＣ］、８．１ｍＭＭｇＳＯ４，５
０ｍＭ）リス−塩酸（ｐ　Ｈ７，５）、０．０１％ゲラ
チン）中に２０％ＰＥＧ６０００と２Ｍ　　ＮａＣ］を
含む液４ｍｌを加えた後、混和し水浴上で１時間インキ
ュベートした。３０００回転、２０分間遠心分離した後
、上清を取り除きチューブに残っているＰＥＧを出来る
限り拭き取った。

遠心分離により得られた沈澱物を７５０μｍのＬＢ培地
に懸濁し、微量遠心管に移し、ＬＢ培地に懸濁したＤＥ
５２　７５０μｌを加え、２０〜３０回転倒混和した。

５分間遠心した後、上清を別の微量遠心管に移しＤＥ５
２添加の操作を再度行い上清を得た。

この上清１ｍｌ当たり１．７５　μｍの０．１ｍｇ／ｍ
１ブロティナーゼにと４２．５　μｍの１０％ＳＤＳ溶
液を加え、混和し室温で５分間放置した。

１７３μｍの３Ｍ酢酸カリウムを加え、８８°Ｃｌ２Ｏ
分間インキュベートした後、水浴上で１０分間冷却した
。１０分間遠心した後、上清をアルコール沈澱させ、真
空下、乾燥させた。この沈澱物をＴＥバッファーに溶解
し、１．０　ｘ制限酵素ＥｃｏＲＩバッファー、制限酵
素ＥｃｏＲＩ　　２０ユニツトで３７°Ｃ，１時間消化
した。

この消化物を３％ＮｕＳｉｅｖｅ、１％ＳｅａＫｅｍア
ガロース電気泳動にかけ、エチジウムブロマイド染色で
検出された約３００ｂｐの単一のＤＮＡバンドをゲルか
ら回収し、シーフェンス決定用プラスミド（Ｂｌｕｓｃ
ｒｉｐｔ）　　のＥｃｏＲｒサイトにライゲーションし
た。これを大腸菌（Ｈ８１０１株）に感染させ、精製プ
ラスミドを得た。

増幅されたフラグメントの塩基配列を決定したところ、
該ＤＮＡ断片は図−１に示されるものであり、これは非
Ａ非Ｂ型肝炎の特異的な抗原蛋白質を発現する、これま
でに明らかにされたものとは異なった新規なものである
ことが判明した。

４、

【図面の簡単な説明】

図− １は実施例で得たＣＤＮＡの塩基配列を表す。 特 許 出 願 人 株式会社 クラレ 特 許 出 願 人 有 馬 暉 勝

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記のアミノ酸配列またはその一部を有する非Ａ
   非Ｂ型肝炎特異抗原蛋白質。 【遺伝子配列があります】
2. （２）下記のアミノ酸配列またはその一部を有する非Ａ
   非Ｂ型肝炎特異抗原蛋白質をコードしているＤＮＡ断片
   。 【遺伝子配列があります】
3. （３）非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原蛋白質をコードしている
   ＤＮＡが下記の塩基配列またはその一部を有することを
   特徴とするＤＮＡ断片。 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】