JPH044880A - 非ａ非ｂ型肝炎抗原をコードするｄｎａ及びポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明はＤＮＡ及びポリペプチドに関し、より詳細には
、非Ａ非Ｂ型肝炎抗原をコードするＤＮＡ鎖及びポリペ
プチドに関する。

〈従来の技術及び発明が解決しようとする課題〉ウィル
ス性肝炎は起因ウィルスが見出される以前から伝染性肝
炎（Ａ型肝炎）と血清肝炎（Ｂ型肝炎）があることが知
られていた。Ａ型肝炎とＢ型肝炎はその起因ウィルスが
見出されており、免疫学的方法により診断が可能となっ
ている。Ｂ型肝炎のスクリーニング法の確立に伴い、輸
血後肝炎は防止できるものと予想されていたが、実際に
は、輸血後肝炎は減少したものの根絶できなかったこと
から、Ａ型でもＢ型でもないウィルス性肝炎、即ち、非
Ａ非Ｂ型肝炎（Ｃ型肝炎とも称される）が存在すること
が明らかとなった。非Ａ非Ｂ型肝炎は輸血後肝炎の大部
分を占めており、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスの感染に関与
した肝細胞症の増加も指摘されている。非Ａ非Ｂ型肝炎
の存在が明らかになってから、多くの研究者により、非
Ａ非Ｂ型肝炎の起因ウィルスの研究がなされたが、起因
ウィルスは長い間同定されなかった。そのため、非Ａ非
Ｂ型肝炎の診断はＡ型肝炎及びＢ型肝炎の試験並びにエ
プスタイン・バーウィルス、サイトメガロウィルス等の
試験により行われ、これらの試験が陰性であると非Ａ非
Ｂ型肝炎であると診断されてきた。このように、非Ａ非
Ｂ型肝炎の診断には、結果が得られるまでに手間と時間
を要するという問題があった。

最近、非Ａ非Ｂ型肝炎に感染したチンパンジー血清等か
ら採取されたＲＮＡに基づいて得られた相補ＤＮＡ　（
ｃＤＮＡ）がクローニングされ、その塩基配列が提示さ
れた。そして、それにより調製されたポリペプチド（抗
原）を用いる非Ａ非Ｂ型肝炎の診断法及び非Ａ非Ｂ型肝
炎ワクチンが提案されている（ヨーロッパ特許公開公報
Ａ１−３１、８２１６号参照）。しかし、非Ａ非Ｂ型肝
炎ウィルスは地域等により異なるといわれており、上記
公報に記載の抗原を用いた非Ａ非Ｂ型肝炎の診断法で、
全ての非Ａ非Ｂ型肝炎の診断を行うことができるか疑問
視され、またワクチンも十分に効果を奏し得ないとの指
摘がされている。

く課題を解決するための手段〉 本発明はかかる問題に鑑みてなされたもので、本発明者
らが非Ａ非Ｂ型肝炎抗体に特異的に反応する抗原性物質
を鋭意研究した結果、ヒトのＧＴＰ高値血漿より採取し
たＲＮＡから調製したｃＤＮＡ中に非Ａ非Ｂ型肝炎抗原
をコードするＤＮＡ断片が存在することを見出し、当該
ＤＮＡの塩基配列を決定すると共にアミノ酸配列を決定
することにより本発明を完成した。即ち、本発明のＤＮ
Ａ鎖は、第１図に示す塩基配列、第２図に示す塩基配列
、第３図に示す塩基配列又は第８図に示す塩基配列を含
むものである。また、本発明のポリペプチドは第１図、
第２図又は第３図に示された塩基配列でそれぞれコード
されている第４図、第５図又は第６図に示すアミノ酸配
列を含むものである。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明における非Ａ非Ｂ型肝炎抗原をコードする塩基配
列を含むＤＮＡ鎖の単離及び塩基配列の決定は、例えば
、下記の方法により行うことができる。

（ａ）非Ａ非Ｂ型肝炎抗原をコードするＲＮＡを分離し
・ （ｂ）当該ＲＮＡから単鎖のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　％次いで
二重鎖ｃＤＮＡを合成し； （Ｃ）当該二重鎖ｃＤＮＡを、ファージ又はプラスミド
に組み込み、ｃＤＮＡライブラリーを作成しくｄｌ　ｃ
　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリーから、プラークハイブリダイ
ゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等により
スクリーニングし、目的とするＤＮＡを含有するファー
ジ又はプラスミドをクロニングし： （ｅ）クローン化されたファージ又はプラスミドを増幅
し、ＤＮＡを採取した後、制限酵素で切断して得られた
ｃＤＮＡをサブクローニングし、次いで塩基配列を決定
する。

上記の工程をより詳細に説明する。

（ＲＮＡの調製） 非Ａ非Ｂ型肝炎抗原をコードするＲＮＡは、例えば、ヒ
トＧＴＰ高値血漿にポリエチレングリコール等の沈澱剤
を添加してウィルスを濃縮した後、グアニジン・チオシ
アネートを用いたＡＧＴＣ法［Ｃｈｏｎ＋ｃｚｙｎｓｋ
ｉ　　Ｐ、−ｅｔ　　ａｔ　、　（１９８７）　　Ａｎ
ａｌ、　　Ｂｉｏｃｈｅａ＋。

Ｖｏｌ、　１８２．１５６］により得ることができる。

かくして得られたＲＮＡはそのまま次の工程に用いるこ
とができる。

（ｃＤＮＡの合成） ｃＤＮＡの合成は、例えば、Ｇｕｂｌｅｒ−Ｈｏｆｆ’
ｍａｎの方法［Ｇｅｎｅ、　Ｖｏｌ、２５．２８３（１
９８３）］　、岡山・バーブの方法［Ｍｏ１．　Ｃｅ１
１．　ＢＩｏｌ、、Ｖｏｌ、２．１８１（１９８２）１
等の方法にて行うことができる。より具体的には、例え
ば、上記のＲＮＡを鋳型として、６塩基程度のランダム
ブライマーを用いて逆転写酵素によりＲＮＡと相補的な
単鎖ｃＤＮＡを合成する。次いで、リボヌクレアーゼＨ
でＲＮＡを分解し、ＤＮＡポリポリーゼｌを用いて二重
鎖ｃＤＮＡを合成する。この合成法は、ｃＤＮＡ合成キ
ットとして、アマジャム社、ベーリンガー社等より販売
されており、これを使用することができる。

（ｃＤＮＡライブラリーの作製） 上記二重鎖ｃＤＮＡは、両末端に合成リンカ−を連結す
るか又は、ターミナルトランスフェラーゼで適切な地部
（例えば、ポリＣ）を付加し、プラスミドベクターやλ
フアージベクターに結合させ、ｃＤＮＡライブラリーを
作製することができる。

例えば、二重鎖ｃＤＮＡを、例えば、ＥｃｏＲＩメチラ
ーゼでメチル化してしてｃＤＮＡ中に存在するＥｃｏＲ
１切断部位を保護した後、ＥｃｏＲＩ　Ｌｉｎｋｅｒを
Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼで連結し、次いで制
限酵素ＥｃｏＲｌて切断し、ＥｃｏＲＩ粘着末端を持っ
た二重鎖ｃＤＮＡとし、ファージベクターλｇｔｌｌの
ＥｃｏＲ１部位に組み込み、インビトロバ・ソケージン
グを行うことによりｃ　ＤＮＡライブラリーを作製する
。

また、市販されているλｇｉｌｌやλｇｔｌＯのｃＤＮ
Ａライブラリー・キット（ストラタゲン社製、アマジャ
ム社製、プロメガ・バイオチック社製）も使用すること
ができる。

（ｃＤＮＡのクローニング） ｃＤＮＡライブラリーから目的ｃＤＮＡをクロニングす
る方法としては、例えば、ブラークツ１イブリダイゼー
シヨン［５ｃｉｅｎｃｅ、　Ｖｏｌ、１９［ｉ、　１８
０（１９７７）］　、コロニーハイブリダイゼーション
［Ｇｅ口ｅ、　Ｖｏｌ、１０．８３　（１９８０）１等
を用いることができる。

プローブとしては、予備実験により得られたｃＤＮＡの
塩基配列から、その相補ＤＮＡ断片を合成し、放射性同
位元素（例えば、３２Ｐ）で標識化したプローブ等が用
いられる。

クローン化されたファージ又はプラスミドは、適当な宿
主を用いて培養して増幅した後、ＤＮＡを抽出する。

（サブクローニング） 得られたＤＮＡのサブクローニングは以下のように行う
。ｃ　ＤＮＡを含むＤＮＡ及びベクターＤＮＡを制限酵
素で切断してｃＤＮＡ断片及びベクターＤＮＡ断片を調
製する。次いで両者の混合物をＴ４　ＤＮＡリガーゼで
処理した後、大腸菌等に形質転換し、ｃＤＮＡが組み込
まれた形質転換体を得る。用いられるベクターＤＮＡと
しては、ｐＵｃ１８　、ｐＵｃＬ９　、ｐＵｃ１１８等
が挙げられる。また制限酵素としてはＥｃｏＲＩ　、Ｉ
ｌｎｄｍ、Ｐｓｔｌ、　Ｂａｒａ！Ｉｔ等が挙げられる
。

（ｃＤＮＡの塩基配列の決定） ｃＤＮＡの塩基配列の決定は、Ｍａｘａ−Ｇｌｌｂｅｒ
ｔの方法［Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　ＥｎｚｙＩＩｌｏｌｏ
ｇｙ、　Ｖｏｌ、８５．４９９゜Ａｃａｄ、　Ｐｒｅｓ
ｓ　（１９８０）］　、ｄｉｄｅｏｘｙ法［Ｓａｎｇｅ
ｒ、　Ｐ。

（１９８１）　５ｃｉｅｎｃｅ、　２１４．１２０５−
１２１０１等の慣用の方法により行うことができる。

かくして非Ａ非Ｂ型肝炎抗原をコードするｃＤＮＡの塩
基配列を決定することができ、本発明のＤＮＡ鎖は第１
図、第２図及び第３図に示される塩基配列を有するもの
であった。次いで、各ＤＮＡ鎖によって翻訳されるポリ
ペプチドのアミノ酸配列はそれぞれ第４図、第５図及び
第６図に示され、本発明のポリペプチドはかかるアミノ
酸配列を有するものである。なお、本明細書及び図面に
おいて、ポリペプチド中のアミノ酸残基の記号の意味は
下記のとおりである。

Ｎ：アスパラギン Ｄ：アスパラギン酸 Ａ：アラニン Ｒ：アルギニン ■＝イソロイシン Ｇニゲリシン Ｑ：グルタミン Ｅ、グルタミン酸 Ｃニジスティン Ｓ：セリン Ｙ：チロシン Ｗ、トリプトファン Ｔ：トレオニン ■：バリン Ｈ：ヒスチジン Ｆ：フェニルアラニン Ｐニブロリン Ｍ：メチオニン に：リシン Ｌ：ロイシン また、第１図、第２図及び第３図に示された塩基配列並
びに第４図、第５図及び第６図に示されたアミノ酸配列
と、前記ヨーロッパ特許公開公報Ａｌ−３１８２１６号
に記載のｃＤＮＡの塩基配列及びアミノ酸配列とを対比
すると、本発明のＤＮＡ鎖及びポリペプチドは、非Ａ非
Ｂ型肝炎抗原の非構造部５（ＮＳ５）の一部に該当する
ものと推察される。

〈発明の効果〉 本発明のＤＮＡ鎖は非Ａ非Ｂ型肝炎抗原をコードするも
ので、当該ＤＮＡから翻訳されるポリペプチドは非Ａ非
Ｂ型肝炎の診断及び非Ａ非Ｂ型肝炎ワクチンの製造に有
用であり、しかも遺伝子工学的手法により大量に且つ安
全に供給することができるという効果を奏する。

〈実施例〉 以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが
、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例 １、ＧＰＴ高値血漿からのウィルスの濃縮ヒト血漿のＧ
ＰＴ　（グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ）
値が高値のプール血漿３８゜５ｇに、ポリエチレングリ
コール４０００を４％になるように添加し、６３８ｇの
ウィルス沈澱画分を得た。

２、ＲＮＡの抽出 グアニジン・チオシアネートを用いたＡＧＴＣ法［Ｃｈ
ｏｍｃｚｙｎｓｋｌ　Ｐ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９８７
）　Ａｎａｌ、　Ｂｌｏｃｈｅｍ、、　Ｖｏｌ、　１６
２．１５８１によりＲＮＡを抽出した。４Ｍグアニジン
・チオシアネート、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ
７，０，５％サルコシール、０．１Ｍ２−メルカプトエ
タノール中でホモジネート後、１／１０容量の２Ｍ酢酸
ナトリウム（ｐＨ４）、等量のフェノール、２／１０容
量のクロロホルム＋イソアミルアルコール 抽出し、２−プロパツールでＲＮＡを沈澱させた。

再度、４Ｍグアニジン溶液に溶解後、エタノール沈澱さ
せた。微ｆｆｉＵ人すると考えられたＤＮＡは、ＲＮａ
ｓｅ−ｒｒｅｅ　ＤＮａｓｅにより消化し除いた［Ｍａ
ｘｗｅｌｌ　ＩＩｔ．　ｅｔ　ａｔ，　（１９７７）、
　Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ，　Ｖｏｌ．　４。

２４１］。

３、ｃＤＮＡ合成 ｃＤＮＡの合成は、ｃＤＮＡ合成システム・プラス（ア
マジャム社製）を使用した。使用方法はアマジャム社の
プロトコールに従い、ブライマーはｒａｎｄｏｍ　ｈｅ
ｘａｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓを使用した０逆転写酵素反
応を、４２℃、１時間行い、さらにリボヌクレアーゼＨ
，ＤＮＡポリメラーゼＩの反応を１２℃で１時間、２２
℃で１時間行った後、７０℃で１０分間反応し、酵素を
不活性化した。さらに、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼによ
り３７℃、１０分間反応後、フェノール／クロロホルム
抽出２回、クロロホルム抽出を１回行い、その上層に当
量の４Ｍ酢酸アンモニウムを加え、さらに２倍量エタノ
ールを加え、ドライアイスエタノール中で１０分間放置
後、遠心分離し、沈澱を２Ｍ酢酸アンモニウム２００μ
ｐに溶解し、４００ｇｇのエタノールを加え、ドライア
イス−エタノール中で１０分間放置後、遠心分離し、沈
澱を７０％エタノールで洗浄し、ｃＤＮＡを回収した。

得られたｃＤＮＡはアマジャム社製キットにより、λｇ
ｔｌｌに挿入された。このベクターに組み込まれたｃＤ
ＮＡは、宿主の大腸菌Ｙ　１０９０細胞にバクテリオフ
ァージが感染、増殖するさい増幅される。こうして、一
定の条件下で溶菌現象により、肉眼的にプラークとして
認識できるようになる。

同時に、ファージＤＮＡにあらかじめ組み込まれている
β−ガラクトシダーゼとの融合蛋白として、このｃＤＮ
Ａがコードしているアミノ酸配列が表現される。この−
群のアミノ酸配列（ペプチド、蛋白質）の中から、抗体
と反応するクローンをみつける。この融合蛋白を、非Ａ
非Ｂ型肝炎患者血清を大腸菌の菌体で吸収したものでス
クリーニングした。すなわち、プラークを形成している
ベトリ・デイツシュからニトロセルロース膜にプロット
した抗原に、患者血清を菌体で吸収後８倍に希釈したも
のを一次抗体とし、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ
ヒツジＩｇＧを二次抗体として反応させた後、発色反応
により陽性となるプラークを拾い上げた。こうして陽性
クローンＡＭ−　１を得た。

５、λｇｔｌＯに挿入されたｃＤＮＡライブラリーの作
製 ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ　Ｍｅｔｈｙｌａｓｅ　４００で
、３７℃で１時間反応し、クロロホルム抽出、エタノー
ル沈澱によりｃ　ＤＮＡを回収した。このｃＤＮＡとＥ
ｃｏＲＩ　１１ｎｋｅｒ　（ｐＧＧＡＡＴＴＣＣ）２　
ｕ　ｇを、ＤＮＡＬＩｇａｔｌｏｎ　ｋＨ（宝酒造社製
）により、１６℃で２時間反応し、エタノール沈澱によ
りＤＮＡを回収した。このＤＮＡをＥｃｏＲＩ　５０　
Ｕで３７℃にて一夜消化し、Ｑｕｉｃｋ　５ｐｉｎ　ｃ
ｏｌｕｍｎ　Ｌｉｎｋｅｒｓ　６（ベーリンガー社製）
により、ｃＤＮＡとＨｎｋｅｒを分離した。ｃＤＮＡは
エタノール沈澱により回収した。

このｃＤＮＡとλｇｔｔｏａｒｍｓ　（ストラタゲン社
製）１μｇを、Ｉｉｇａｔｉｏｎ　ｂｕｆＴｅｒ（５０
ｍ　Ｍ　　Ｔ　ｒ　ｉ　５−ＨＣＪ７ＳｐＨ８，０，７
ｍＭ　　ＭｇＣ１）２．１ｍＭ　　ＤＴＴ、１ｍＭ　　
ＡＴＰ）中でＴ４　ＤＮＡＩｊｇａｓｅ（宝酒造社製）
１．４Ｕにより２２℃で１時間反応後、４℃で一夜反応
し、全量５μｇを１ｎｖＨｒｏ　ｐａｃｋａｇｉｎｇに
供した。

ｉｎ　ｖｊｔｒｏ　ｐａｃｋａｇｌｎｇはＧｉｇａ　ｐ
ａｃｋ　Ｇｏｌｄ　（ストラタゲン社製）を使用した。

上記で調製したＩ　ｉｇａ−ｔｉｏｎ反応液５μｇをｆ
ｒｅｅｚｅ−ｔｈａｗ　ｅｘｔｒａｃｔに加え、さらに
５ｏｎｉｃ　ｅｘｔｒａｃｔ　１５　μ（ｌを加え、ピ
ペッティングにより穏やかに混合した。これを２２℃で
２時間反応させた後、ＳＭ　（０，１Ｍ　　Ｎａ　ｃＤ
　。

８．１ｍＭ　　Ｍｇ５ｏ４　０．０１％ゼラチン、５０
ｍＭ　　　Ｔｒ　　ｉ　　５−ＨＣＩＩＩ　　　　ｐＨ
７，５）　　０゜５νＲ及びクロロホルム２０μｇを加
え、４℃に保存した。指示菌は、大腸菌Ｃ６００ｈｆｌ
＋とＣ６００ｈｒｌ−を使用した。

１０　ｍ　Ｍ　　Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４及び０．２％マルト
ースを含むＴＢ培地（水１ρ当りＢａｃｔｏ−ｔｒｙｐ
ｔｏｎ　１０ｇＳＮａＣｇ５ｇを溶解）で３７℃、−夜
振盪培養し、１０　ｍ　Ｍ　　Ｍ　ｇ　Ｓ　０４でＡ６
００を２に調製した。Ｉｎ　ｖＨｒｏ　ｐａｃｋａｇｉ
ｎｇしたファージ液はＳＭで希釈し、各ファージ希釈液
１００μｇと上記指示菌１００μｇを混合し、３７℃で
１５分間、反応後、４５℃に保温した０、７％Ｎ　Ｚ　
Ｙ　ｔｏｐ　ａｇａｒ（水１ｐ当りＮ　Ｚ　ａｍｉｎｅ
　　ｔｙｐｅ　Ａ　　１０　ｇ　、　Ｎ　ａＣΩ５ｇｓ
　Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ　５ｇ、　Ｍｇ５Ｏ＋　
　１７Ｈ２０２ｇ、　Ｂａｃｔｏ−ａｇａｒ　　７　ｇ
を加え、オートクレーブ滅菌）２．５ｖｆを加え、３７
℃に保温した１、５％Ｎ　Ｚ　Ｙ　ｂｏｔｔｏＩｉｐｌ
ａｔｅ　　（水１ρ当りＮＺ　　ａｍｌｎｅｌ　Ｏｇｓ
　Ｎ　ａ　Ｃ１）　５　ｇＳＹｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃ
ｔ５　ｇＳＭｇ　Ｓ　０４　　・７Ｈ２０２ｇＳＢａｃ
ｔｏ−ａｇａｒ１５ｇを加え、オートクレーブ滅菌）上
にひろげた。ｊｏｐａｇａｒが固化後、３７℃で一夜培
養し、プラークの数を調べ、ファージタイターを決定し
た。

トータルのタイターは２　、　３　Ｘ　１０６　ｐｆ’
ｕ（ｐｌａｑｕｅｒｏｒｍｉｎｇ　ｕｎｉｔ）であった
。

６、プローブ 上記４で得られた陽性クローン（ＡＭ−１）ＣＤＮＡの
塩基配列（第７図参照）から、その７６〜１２６番目の
塩基配列に対する相補鎖５１１Ｉｌｅｒ（５°−ＧＧＴ
ＧＡＴＧＴＴＧＣＣＧＣＣＣＡＴＣＴＣＣＴＧＣＣＧＣ
ＣＡＴＡＧＡＡＧＡＴＴＧＧＣＣＴＣＧＡＴＧＡＧ−３
°、第８図）を自動ＤＮＡ合成機（＾ｐｐＨｅｄ　Ｂｌ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ製３８１Ａ）により合成し、プラーク
ハイブリダイゼーションのプローブとした。

合成りＮＡ２５０ｎｇを、［７Ｐ］ＡＴＰ（アマジャム
社製Ｐ　Ｂ　１０２１８．５０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）　
２５０μｃｉ、５０ｍＭ　　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣＩ）（
ｐＨ７゜６）　、１０ｍＭ　　Ｍｇ（、Ｑ　２．５ｍＭ
　　ＤＴＴ。

ポリヌクレオチドキナーゼ（ベーリンガー社製）１０Ｕ
により、トータル２０μΩ中で、３７℃、３０分間反応
し、０．５Ｍ　　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８゜０）１μｇを加
え反応を停止した。この反応液は、Ｎｅｎ５ｏｒｂ■−
２０（ＮＥＮ社製）・カラムにより、フリーの［γ　　
ＩＪ　ＡＴＰとラベル化ＤＮＡを分離し、精製した。

７、プラークハイブリダイゼーション フィルターの調製及びプラークハイブリダイゼーション
の工程を以下に示す。

（１）−次スクリーニング ■マスタープレート 指示菌はＣ６００（ｈｒｌ＋）を使用した。直径１５ｃ
＋ｎのＬ−Ｂｏｔｔｏｍ　ｐｌａｔｅ　（水１ｇ当りＢ
ａｃｔｏ−ｔ　ｒｙｐｔｏｎｌＯｇ、ＮａＣρ５　ｇ　
、　Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ　５　ｇ　。

Ｂａｃｔｏ−ａｇａｒｌ　５　ｇを加え、オートクレー
ブ滅菌）に１枚のプレート当りプラークが約４万個とな
るように調製したファージ液とＣ６００（ｈｆ’ｌ＋）
を３７℃で１５分間インキュベートした。それに４５℃
に温めておいた０、７％Ｌ−１０１）　ａｇａｒｏｓｅ
　２．　５１１を混合し、Ｌ−ｂｏｔｔｏｍ　ｐｌａｔ
ｅにひろげた。固化後、３７℃で５〜６時間インキュベ
ートし、プラークの直径が１　＋ａｍ以下になった段階
で、４℃で保存した。

■フィルター フィルターはｃｏｌｏｎｙ＃＋Ｉａｑｕｅ　５ｃｒｅｅ
ｎ　（ＮＥＮ）を使用した。−夜、０．２％マルトース
、１０ｍＭＭｇＳＯ４を含むＴＢ培地で培養したＣ　６
００　（ｈｒ＋＋＞をＴＢ培地で２０倍希釈し、その中
にフィルターを浸し、濾紙上で２〜４時間、乾燥させた
。

■ファージのフィルターへのレプリカ、増幅上記■のフ
ィルターをマスタープレート上に置き、５分後、はがし
て新しいＬ−ａｇａｒ　ｐｌａｔｅ上にｃｏｎｔａｃｔ
　した面を上にして置き、３７℃で６〜１２時間インキ
ュベートした。

■フィルターの変性 プラークが増幅したフィルターは、０．５ＭＮａＯＨ及
び１．５Ｍ　　ＮａＣ（ｌで浸した３ＭＭ濾紙上に５分
間置き、０．５Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）
　、１．５Ｍ　　ＮａＣ１）で浸した３ＭＭ濾紙上に５
分間置き、２ｘＳＳＰＥ　（０，３６Ｍ　　ＮａＣ１１
ｓ　２０ｍＭ　　Ｎａ２　ＨＰＯ４，２ｍＭ　　ＥＤＴ
Ａ）に２分間浸す。室温で乾燥させた後、８０℃で１時
間ベーキングした。

■プレハイブリダイゼーション 上記■のフィルターを、５　ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ（０，７５
ＭＮａＣΩ、７５ｍＭクエン酸ナトリウム）、２０ｍＭ
　　ＮａＨ２ＰＯ４（＋）Ｈ７，０）　、７％ＳＤＳ　
（ドデシル硫酸ナトリウム）　、１０　Ｘ　Ｄｅｎｈａ
ｒｄｔ’ｓ　（０、２％Ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ａ
ｌｂｕｍｉｎ、　０．　２％Ｐｏ１ｙｖｉｎｙｌｐｙｒ
ｒｏｌｌｄｏｎｅ、　０　、　２２６Ｆｌｃｏｌｌ）１
０％ｄｅｘｔｒａｎ　５ｕｌｆ’ａｔｅ　、　１００　
ｕ　ｇ　／　ｉ！ＹｅａｓｔｔＲＮ＾を含むプレハイブ
リダイゼーション溶液の入ったプラスチックバッグ中で
、５０”Ｃ１２時間インキュベートした。

■ハイブリダイゼーション バッグからプレハイブリダイゼーション溶液を除き、５
ＸＳＳＣ，７％Ｓ　Ｄ　Ｓ　、　　１０　Ｘ　Ｄｅｎｈ
ａｒｄｔＳ１１０％ｄｅｘｔｒａｎ　５ｕｌｆａｔｅ　
ｓ　１００　ｔｔ　ｇ　／　１１Ｙｅａｓｔ　ｔＲＮＡ
、３２Ｐラベル化プローブ（２，Ｑｘｌ　０６　ｅｐｍ
／１１ｆ、８　、　６　Ｘ　１０６　ｃｐｉ／ｐｍｏｌ
）を含むハイブリダイゼーション溶液を加え、５０’Ｃ
１１４時間インキュベートした。

■洗浄 フィルターを３ＸＳＳＣ，２０ｍＭ　　ＮａＨ２ＰＯ４
（ｐＨ７，５）　、５％ＳＤＳ、１０ｘＤｅｎｈａｒｄ
ｔ’ｓ溶液で、５０℃１時間、４回洗浄後、１×ＳＳＣ
，１％ＳＤＳ溶液で、６５℃２時間、２回洗浄した。

■Ｘ線フィルムへの感光 洗浄したフィルターはＸ線フィルムに、−８０℃で一夜
感光後、現像し、シグナルの位置を確認した。１．２ｘ
１０６ｐｒｕをスクリーニングし、５個のシグナルが得
られた。

（２）二次スクリーニング シグナルの位置に相当するマスタープレートのゲルをか
きとり、ＳＭに懸濁して、直径１５ｃｍのプレートに約
８００個のプラークが出現する程度にまきなおし、再度
スクリーニングを行った。その結果、３種類の単一プラ
ークが得られた。

８、ファージの増幅 指示菌１００μｇを３７℃で保温した乾熱滅菌試験管に
入れ、５０℃に保温したＮＺＹ　ｔｏｌ）　ａｇａｒ２
．５ｙ１を添加後、軽くポルテックス、３７℃に保温し
たＮＺＹ　ｂｏｔｔｏｍ　ｐｌａｔｅにひろ、げた。

ｔｏｐ　ａｇａｒが固化したら、上記７の単一プラーク
を、オートクレーブ滅菌した爪楊枝の細い方の先端で一
度突いた後、上記ｐｌａｔｅに４〜５回突いた。

コ（７）　ｐｌａｔｅを３７℃で８時間培養すると、フ
ァージによる菌のＩｙｓｌｓが見られた。ファージによ
りＩｙｓｌｓ　した透明部分を乾熱滅菌したパスツール
ピペットの太い方で、ａｇａｒごとがきとり、２００ａ
ｌｌのλｄｉｌｕｅｎｔ　（１０ｍＭ　　Ｔ　ｒ　ｉ　
５−ＨＣＩ）　。

ｐＨ８，０，２ｍＭ　　ＭｇＣ１）ｚ）に懸濁しポルテ
ックス後４℃で一夜ファージを抽出した。抽出液をポル
テックスし、その内の５μｇをＥ、　ｃｏｉｌＣＧＯＯ
ＯＨｒｌ−指示菌１００ｕｌ）と、コーニングディスポ
ーザブル１５１１１遠心管中で混合後、３７℃恒温槽中
２０〜３０分間静置した。ここへ、６１！のＮＺＹ　ｍ
ｅｄｉｕｍを加え、３７℃で４〜６時間振盪培養した。

菌の１ｙｓｉｓが見られたら、培養を中止し、卓上遠心
分離機にテ３．　０００ｒｐＩ１１．２０分間遠心分離
し、得られた上清を乾熱滅菌した短試験管に移した。ク
ロロホルム１００μｇを加えて４℃に保存した。

９、ファージＤＮＡの抽出 上記８で増幅したファージ液（Ｌｙｓａｔｅ）に活性化
したＤＥ−５２懸濁液を当量加えた。ファージ液を２０
〜３０回転倒して混合後３０分間室温に静置し、遠心分
離機で、１０．００Ｏｒｐｍ、１０分間遠心分離した。

遠心分離は２回繰り返した。

上清に、１　ｘｌの５ＭＮａＣ，Ｑ及び’３．４ｙ１の
イソプロパツールを加えて、−４０℃で１時間静置した
。これを１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。

上滑を捨てた後、沈澱を７０％冷エタノールで２回洗浄
した。この沈澱を減圧乾燥し、０、　１　ｍｇ／１１　
ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ：　１０％ＳＤＳ：ＴＥ−５
０　ｕΩ：１．２０ｕｌ：３１１の割合で混合したｐｒ
ｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ溶液２００μｇに溶解して、室温
で１０分間反応した。ＴＥ飽和フェノール：クロロホル
ム−１：１を２００μｇ加えてポルテックスし、マイク
ロ遠心分離機で１５，０００ｒｐｍ、２．５分間遠心分
離した。水相を新しいサンプルカップに移し、２０μｇ
の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６゜０）及び５００μｇの
エタノールを加え、ドライアイス・エタノール中１５分
間以上静置した。これをマイクロ遠心分離機にて１５，
０００ｒｐｍ。

５分間遠心分離し、得られたファージＤＮＡの沈澱を減
圧乾燥した。

１０、ｃＤＮＡの大腸菌ベクターへのサブクローニング 上記９のファージＤＮＡを、ＥｃｏＲｌで消化し、１％
低融点ゲル電気泳動を行い、ｃＤＮＡのバンドを切り出
し、フェノール抽出を２回行いエタノール沈澱によりＤ
ＮＡを回収した。ＥｃｏＲＩで消化した大腸菌ベクター
ｐＵｃ１８と回収したｃＤＮＡをＤ　Ｎ　Ａ　　Ｌｌｇ
ａｔｌｏｎ　ｋｌｔ　（宝酒造社製）により、Ｉ　１ｇ
ａｔ　ｔｏｎ反応を行い、大腸菌ＨＢＩＯＩ：Ｉンピテ
ントセル（宝酒造社製）に形質転換し、２０μｇ／′Ｉ
！のアンピシリン含有Ｌ−ｐｌａｔｅにまき、３７℃で
一夜インキユベートし、ｃＤＮＡが組み込まれたアンピ
シリン耐性菌を得た。

１１、ｃＤＮＡの塩基配列の決定 ｃＤＮＡの塩基配列は、ｄｌｄｅｏｘｙ法［Ｓａｎｇｅ
ｒ、　Ｐ（１９８１）　５ｃｉｅｎｃｅ、　２１４．１
２０５−１２１０］より行い、７−　Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｚ　
Ａ　　Ｓｅｑｕｅｎｃｌｎｇ　Ｋｉｔ　（宝酒造社製）
を用いて行った。３クローン（ｐＫＳ口０１ＳｐＫｓＯ
Ｏ２、ｐＫｓＯＯ３）の塩基数は各々５２６ｂｐ、２８
１ｂｐ、１２５ｂｐであり、それぞれの塩基配列は第１
図、第２図及び第３図に示されるとおりてあった。各配
列をアミノ酸に翻訳し、ストップコドンとの関係を検討
した結果、第１図の塩基配列は第４図のアミノ酸配列を
、第２図の塩基配列は第５図のアミノ酸配列を、第３図
の塩基配列は第６図のアミノ酸配列をコードしているこ
とが判明した。

第１図、第２図及び第３図に示された塩基配列並びに第
４図、第５図及び第６図に示されたアミノ酸配列と、前
記ヨーロッパ特許公開公報Ａｌ−３１８２１６号に記載
のｃＤＮＡの塩基配列及びアミノ酸配列とを対比すると
、本発明のＤＮＡ鎖及びポリペプチドは、非Ａ非Ｂ型肝
炎抗原の非構造部５（ＮＳ５）の一部に該当するものと
推察されるが、両者のホモロジーは下記表に示されると
おりであった。

表

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図及び第３図は本発明の非Ａ非Ｂ型肝炎抗
原をコードするＤＮＡの塩基配列を示す図、第４図、第
５図及び第６図はそれぞれ第１図、第２図及び第３図の
塩基配列から翻訳されるアミノ酸配列を示す図、第７図
及び第８図はそれぞれ陽性クローンＡＭ−１の塩基配列
及びその相補鎖である合成プローブの塩基配列を示す図
である。 第１図 ＣＧＣＣＣＧＧＡＣＴＡＣＡＡＣＣ 第４図 第５図 第６図 ＧＧＮＩＴＲＶＥＳＥＮ 第２図 ＣＡＧＡＣＴＡＣＡＡＣ 第３図 ＧＡＡＣ 第７図 ＣＣＣＧＣＡＧＡＧＡＴＣＣＴＧＣＧＧＡＡＧ第８図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、第１図、第２図、第３図又は第８図に示す塩基配列
   を含むＤＮＡ鎖。 ２、第４図、第５図又は第６図に示すアミノ酸配列を含
   むポリペプチド。