DE69528440T2

DE69528440T2 - 5-Aminolävulinsäure produzierender Mikroorganismus

Info

Publication number: DE69528440T2
Application number: DE69528440T
Authority: DE
Inventors: Yasushi Hotta; Seiji Nishikawa; Tohru Tanaka; Keitaro Watanabe
Original assignee: Cosmo Oil Co Ltd; Cosmo Research Institute
Current assignee: Cosmo Oil Co Ltd; Cosmo Research Institute
Priority date: 1994-12-20
Filing date: 1995-12-19
Publication date: 2003-06-18
Anticipated expiration: 2015-12-20
Also published as: EP1041154A1; DE69529930D1; EP1041154B1; EP0718405B1; DE69529930T2; EP0718405A3; EP0718405A2; US5733770A; US5763235A; DE69528440D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Mikroorganismus, der 5-Aminolävulinsäure (hiernach als "ALA" bezeichnet) in hoher Konzentration erzeugen kann.

Hintergrund der Erfindung

ALA ist eine Verbindung, die weitverbreitet in der Biosphäre vorliegt und eine wichtige Rolle im lebendigen Körper als Intermediat des Pigment-Biosynthese-Stoffwechselweges für Tetrapyrrol-Verbindungen darstellt (Vitamin B&sub1;&sub2;, Häm und Chlorophyll). Spezifisch wird ALA biologisch aus Glycin und Succinyl CoA durch die 5-Aminolävulinsäure-Synthase oder aus Glutamy-tRNA durch Glutamyl-tRNA-Reduktase und Glutamat-1- semialdehydo-Mutase synthetisiert und dann von der 5-Aminolävulinsäure-Dehydratase verstoffwechselt (hiernach bezeichnet als "ALA-Dehydratase")
Außerdem ist ALA ein ausgezeichnetes Herbizid, Insektizid, Regulationsmittel für das Pflanzenwachstum und Verstärker für die pflanzliche Photosynthese und ist für lebende Kreaturen nicht toxisch und verbleibt aufgrund seiner hohen Abbaufähigkeiten nicht in der Umwelt (JP-A-61-502814, JP-A-2- 138201; die Bezeichnung "JP-A" wie hier verwendet, bedeutet eine "ungeprüfte veröffentlichte japanische Patentanmeldung").
Aufgrund seiner hohen Produktionskosten kann ALA jedoch nicht praktisch als Herbizid, als Regulationsmittel für das Pflanzenwachstum oder als Verstärker für die Pflanzenphotosynthese verwendet werden (CHEMICAL WEEK, 29. Oktober 1984).
Unter diesen Umständen wurde eine Anzahl von chemischen Syntheseverfahren überprüft (z. B. JP-A-2-76841 und JP-A-2- 261389), jedoch wurden bis jetzt noch keine völlig zufriedenstellenden Verfahren entwickelt.
Andererseits wurden Versuche zur Entwicklung eines Verfahrens für die Herstellung von ALA unter Verwendung von Mikroorganismen unternommen. Z. B. wurden Verfahren vorgeschlagen, bei denen die Gattung Propionibacterium, Methanobacterium oder Methanosarcina verwendet wurden (z. B. JP-A-5-184376), sie führen jedoch zu einer extrem niedrigen Produktivität, was die Anforderung der Industrie an ALA nicht zufriedenstellen kann.
Ein anderes Verfahren, bei dem die Gattung Rhodobacter verwendet wird (JP-A-6-141875) ist produktiver als die oben diskutierten mikrobiellen Verfahren, jedoch erfordert die Synthese einer signifikanten Quantität von Pigmenten durch photosynthetische Bakterien, einschließlich der Gattung Rhodobacter, eine Bestrahlung mit Licht und daher ist die Erzeugung von ALA als Pigmentvorläufer ebenfalls abhängig von einer ausreichenden Lichtbestrahlung, was hohe Kosten mit sich bringt und es gibt viele Probleme, die gelöst werden müssen, bevor dieses Verfahren realisiert werden kann.
Um ALA durch Mikroorganismen, wie z. B. der Gattung Rhodobacter, Propionibacterium, Methanobacterium und Methanosarcina zu produzieren (um ALA, hergestellt von Mikroorganismen, vor ihrem Stoffwechsel durch ALA-Dehydratase im lebenden Körper zu schützen), wurde ein Verfahren entwickelt, bei dem ein ALA-Dehydratase-Inhibitor (z. B. Lävulinsäure, 4,6-Dioxoheptylsäure) zugefügt wurde (JP-A-6- 277081).
In einigen Verfahren benötigt dieses Verfahren jedoch die Zugabe des Inhibitors in großer Quantität, nämlich 3-fach oder mehr oder 500-fach oder mehr der erzeugten ALA-Menge.
Die Verwendung einer solchen großen Quantität eines ALA- Dehydratase-Inhibitors führt zu einer deutlichen Inhibition des Wachstums und der Funktion des Mikroorganismus, zusätzlich zu erhöhten Produktionskosten und Schwierigkeiten bei der Durchführung von Trenn- und Isolierungsschritten.
Daher haben sich große Bemühungen auf die Entwicklung eines Verfahrens gerichtet, die Menge des ALA-Dehydratase- Inhibitors zu minimieren, der für die erhöhte Produktion von ALA notwendig ist.
Außerdem ist es wünschenswert, um die Produktion von ALA zu erhöhen, einen Mikroorganismus aufzufinden, der unter Bedingungen, unter denen der Stoffwechsel von ALA durch ALA- Dehydratase in einem bestimmtem Grad inhibiert werden kann, voll wachsen und eine ausreichende ALA-Syntheseaktivität erhalten kann und wobei die notwendige Menge einer Tetrapyrrol-Verbindung zum Erhalt von Energie minimiert werden kann, ohne Wachstum und Funktion des Mikroorganismus zu verhindern.
Insbesondere wenn ein solcher Mikroorganismus ein photosynthetisches Bakterium ist, ist die obige Beschreibung industriell günstig, da es bedeutet, daß das Bakterium unter Bedingungen voll wachsen und eine ausreichende ALA- Syntheseaktivität erhalten kann, unter denen es keine Lichtbestrahlung benötigt (Heterotrophismus) und Bacteriochlorophyll lichtsammelndes Pigment benötigt, das aus einer Tetrapyrrol-Verbindung synthetisiert wird.
Demzufolge wurde ein Verfahren vorgeschlagen, bei dem ALA durch Kultivierung eines Mutantenstammes eines Bakteriums erzeugt wird, das zur Gattung Rhodobacter gehört, und zwar unter heterotrophen Bedingungen, die keine Lichtbestrahlung notwendig machen (JP-A-4-333521) jedoch war die Produktivität dieses Verfahrens im Vergleich mit dem Verfahren, das eine Lichtbestrahlung notwendig macht, gering.
Sauerstoff ist für die Bildung von Energie unersetzlich, wenn ein Mikroorganismus unter heterotrophen Bedingungen kultiviert wird, die keine Lichtbestrahlung notwendig machen.
Es wurde jedoch berichtet, daß Sauerstoff die Pigmentsynthese von photosynthetischen Bakterien inhibiert, insbesondere Nicht-Schwefel-Purpurbakterien und auch das ALA-Syntheseenzym inaktiviert (Protein, Nucleic Acid and Enzyme, 15(3): 195 (1970)).
Die Erzeugung von 5-Aminolävulinsäure durch wiederholte Zugabe von Lävulinsäure und ihren Vorläufern, wie z. B. Glycin, zu einer photoheterotrophen Kultur des Wild-Typ- Stamms IFO-12203 von Rhodobacter sphaeroides wurde von Sasaki et al. beschrieben (Journal of Fermentation and Bioengineerung, Band 71, Nr. 6, 403-406, 1991).
Tanaka et al. beschreiben die Bildung von 5-Aminolävulinsäure unter aeroben/dunklen Bedingungen durch einen Mutanten von Rhodobacter sphaeroides, der CR-17 genannt wird (Biotechnology Letters, Band 13, Nr. 8, 589-594).

Zusammenfassung der Erfindung

Demzufolge ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung einen Mikroorganismus bereitzustellen, der eine signifikante Menge ALA durch Zugabe einer niedrigen Konzentration eines ALA-Dehydratase-Inhibitors erzeugen kann.
Dies wurde durch einen Mikroorganismus erreicht, der ALA produziert, der eine ALA-Dehydratasevariante aufweist mit einer reduzierten Inhibitorkonstante für einen ALA- Dehydratase-Inhibitor.
Weiterhin wurde dies durch einen Mikroorganismus erreicht, der ALA erzeugt, wobei es sich um ein photosynthetisches Bakterium handelt, das ALA ohne Lichtbestrahlung erzeugt.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben ausgedehnte Studien durchgeführt und festgestellt, daß (1) ein effektives Verfahren erhalten werden kann, indem ein Mikroorganismus verwendet wird, der in der Lage ist, eine ALA- Dehydratasevariante zu erzeugen mit reduzierten Inhibitorkonstanten gegenüber Inhibitoren oder ein anderer Mikroorganismus, der in der Lage ist eine andere ALA- Dehydratasevariante zu erzeugen, die nicht nur das gerade beschriebene Kennzeichen aufweist sondern auch eine erhöhte Michaeliskonstante der ALA-Dehydratase für ALA. Die vorliegenden Erfinder hatten Erfolg in der Erzeugung eines solchen Mikroorganismus durch Mutationszüchtung.
Als nächstes wurde festgestellt daß (2), da die Photosynthesebakterien Bacteriochlorophyll in großer Menge enthalten und daher eine ausgeprägte Fähigkeit zur Synthese von ALA aufweisen, bei dem es sich um einen Vorläufer des Pigments handelt, die Bildung einer Tetrapyrrol-Verbindung durch Metabolisierung von ALA reduziert werden kann und im Ergebnis kann ALA in einer großen Menge produziert werden, wenn solche Bakterien zu Mutanten umgewandelt werden, die selbst in Gegenwart einer geringen Menge der oben beschriebenen Tetrapyrrol-Verbindung wachsen können.
Im Ergebnis haben die Erfinder festgestellt, daß Bedingungen, die keine Lichtbestrahlung involvieren, effektiv für den Erhalt eines solchen Mikroorganismus durch Mutation und Selektion sind; nämlich Bedingungen, unter denen ein mutierter Stamm mit einer reduzierten Photosynthesekapazität wachsen kann und nur eine geringe Menge einer Tetrapyrrol- Verbindung benötigt. Die vorliegenden Erfinder hatten Erfolg in der Erzeugung eines solchen Mikroorganismus.
Zusätzlich wurde bestätigt, daß (3) Mikroorganismen mit den obigen Eigenschaften (1) und (2) eine beträchtliche Menge ALA durch Zugabe von nur einer extrem geringen Konzentration eines ALA-Dehydratase-Inhibitors erzeugen können.
Weiterhin haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung unter Inbezugnahme dieser Situationen extensive Studien durchgeführt und festgestellt, daß eine große Menge ALA erzeugt werden kann, ohne daß die Menge des notwendigen Sauerstoffs für die Bildung von Energie in Bakterienzellen negativ beeinflußt wird, wenn ein ALA-erzeugendes photosynthetisches Bakterium verwendet wird und die Sauerstoffzufuhr begrenzt ist. Die vorliegende Erfindung wurde auf der Basis dieser Feststellungen erreicht.
Ein Verfahren zur Herstellung des ALA-erzeugenden Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung und ein Verfahren zur Erzeugung von ALA unter Verwendung des erfinderischen Mikroorganismus sind im Detail wie folgt beschrieben.
Zunächst ist der ALA-erzeugende Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung ein mutierter Stamm, der in der Lage ist, eine ALA-Dehydratasevariante mit einer reduzierten Inhibitorkonstante für einen ALA-Dehydratase-Inhibitor zu erzeugen, der erhältlich ist unter Verwendung eines Stamms, der z. B. zu der Gattung Rhodobacter, Rhodopseudomonas, Propionibacterium, Methanobacterium, Methanosarcina, Pseudomonas, Escherichia, Saccharomyces, Rhodospirillum, Rhodopila, Rhodomicrobium oder Rhodocyclus oder einem Mutanten davon als Elternstamm gehört und wobei dieser einer Mutagenese unterzogen wird.
Vorzugsweise kann der ALA-erzeugende Mikroorganismus eine ALA-Dehydratasevariante erzeugen, die nicht nur die oben erwähnten Eigenschaften aufweist, sondern auch eine erhöhte Michaeliskonstante für ALA.
Im folgenden wird ein Verfahren für die Isolierung des ALA- erzeugenden Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung, der diese Eigenschaften aufweist, dargelegt.
Ein Flüssigmedium, in dem der vorstehende Elternstamm wachsen kann, wird in einem Teströhrchen hergestellt und sterilisiert und der Elternstamm wird in das Röhrchen inokuliert und auf einer Rüttelvorrichtung kultiviert. Die so gezüchteten Zellen werden mit einer Pufferlösung gewaschen und einer Mutagenese unterzogen.
Die Mutagenese kann auf dem gewöhnlichen Weg bewirkt werden. Z. B. kann ein physikalisches Mutagen, wie z. B. UV-Strahlen oder ionisierende Bestrahlung auf den Elternstamm auf einem Agar-Medium angewandt werden oder der Elternstamm kann in einer Pufferlösung kultiviert werden, die mit einem chemischen Alkylierungsmutagen, wie z. B. Ethylmethansulfonat (EMS), N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG) oder Ethylnitroharnstoff (ENU) oder einem Basenanalog-Mutagen wie z. B. Bromdesoxyuridin (BrdUrd) supplementiert ist.
Die so Mutagen-behandelten Zellen werden wiederum mit einer Pufferlösung gewaschen, auf einem Agarmedium verteilt und kultiviert.
Als nächstes wird ein Stamm mit den vorstehenden Eigenschaften von den unter diesen Kultivierungsverfahren gewachsenen Mutantenstämmen in der folgenden Weise ausgewählt.
Schritt 1: Die mutierten Stämme werden in einem Medium zur Verwendung für die Kultivierung eines Stamms CR-520 gezüchtet, der später beschrieben werden wird und die resultierenden Zellen werden gesammelt, gewaschen und in einer geeigneten Pufferlösung aufgebrochen und dann zur Entfernung von nicht-aufgebrochenen Zellen zentrifugiert.
Schritt 2: Der durch den obigen Schritt 1 erhaltene zellfreie Extrakt wird mit einer ALA-Dehydratasereaktionslösung gemischt (siehe das unten beschriebene Beispiel 1) um eine Enzymreaktion auszulösen.
Schritt 3: Die Enzymreaktion gemäß Schritt 2 wird unter variierten Bedingungen durchgeführt, wobei die Konzentrationen des Substrats ALA und eines ALA-Dehydratase- Inhibitors (z. B. Lävulinsäure) optional verändert werden mit Kalkulation der Reaktionsrate bei jeder Bedingung.
Obwohl nicht besonders begrenzt, kann die Reaktionsrate durch Messung der Menge von Porphobilinogen kalkuliert werden, gebildet in Übereinstimmung mit dem Ehrlich colorimetrischen Assay-Verfahren (Ehrlich-Reaktion) (J. Biol. Chem., 219: 435 (1956)) und die Gesamtmenge des Porphyrins in Übereinstimmung mit dem Verfahren von Satto (J. Nutr. Sci. Vitaminol., 27: 439 (1981)) und dann durch Kalkulation der Reaktionsrate, basierend auf den folgenden Formeln.
v: Enzymreaktionsrate (U/mg Protein);
a: Menge des Porphobilinogens in 1 ml der Enzymreaktionslösung (umol);
b: Menge des Porphyrins in 1 ml einer Enzymreaktionslösung (umol); es wird 4b, da 1 Molekül Porphyrin aus 4 Prophobilinogen-Molekülen besteht;
p: Proteinmenge in 1 ml der Enzymreaktionslösung (= 1 mg);
t: Reaktionszeit (= 60 min).
Die Michaeliskonstante und die Inhibitorkonstante werden aus der so kalkulierten Reaktionsrate für jede Konzentration von AhA und ALA-Dehydratase-Inhibitor (z. B. Lävulinsäure) berechnet.
Es gibt viele Verfahren um diese Konstanten zu berechnen. Die Michaeliskonstante kann z. B. aus dem Kreuzungspunkt der Regressionslinie und der Substratkonzentrationsachse berechnet werden, erhalten durch den sogenannten Lineweaver- Burk-Plot, worin reziproke Zahlen der Enzymreaktionsrate und Konzentration von ALA aufgetragen werden (siehe Enzyme Reaction Mechanisms, übersetzt von I. Tabuse, veröffentlicht von Tokyo University Press entsprechend E. Zeffren et al., The Study of Enzyme Mechanisms, veröffentlicht von John Wiley & Sons, Inc. (1973)).
Dieses Verfahren, bekannt als Lineweaver-Burk-Verfahren, wird allgemein verwendet um die Michaeliskonstante zu berechnen und die berechnete Michaeliskonstante (Km-Wert) wird häufig verwendet um eine Enzym-Substrat- (bei dieser Erfindung ALA) Affinität als eine der grundlegenden Eigenschaften eines Enzyms zu bestimmen. In diesem Fall kann ein Anstieg des Km- Werts als Abnahme der Affinität betrachtet werden.
Die Inhibitorkonstante kann z. B. durch den sogenannten Dixon- Plot berechnet werden, worin reziproke Zahlen der Enzymreaktionsrate und der Konzentration des Inhibitors aufgetragen werden (siehe z. B. Enzyme Reaction Mechanism, übersetzt von I. Tabuse, veröffentlicht von Tokyo University Press).
Bei diesem Verfahren kreuzen sich Regressionslinien, erhalten von verschiedenen Konzentrationen von ALA, an einem Punkt und die Inhibitorkonstante (Ki-Wert) wird berechnet durch Multiplikation der Zahl, korrespondierend zu der Inhibitor- Konzentrationsachse am Kreuzungspunkt durch -1.
Die Affinität der Enzyme und Inhibitoren kann unter Verwendung von Ki-Werten bestimmt werden und eine Abnahme der Ki-Werte bedeutet im allgemeinen einen Anstieg der Affinität der Inhibitoren für Enzyme.
Die Bezeichnung "ALA-Dehydratase-Inhibitor", wie hier verwendet, bedeutet alle Verbindungen, die die Produktionsrate von Porphobilinogen erniedrigen, wenn sie in einem Reaktionssystem vorliegen, in dem ALA in Porphobilinogen durch Wirkung von ALA-Dehydratase umgewandelt wird. Solche Verbindungen beinhalten diejenigen, die die ALA- Bindungsstelle der ALA-Dehydratase blockieren und dadurch die Assoziation von ALA und ALA-Dehydratase inhibieren, aufgrund von Teilveränderungen der funktionellen Gruppen von ALA, das das primäre Substrat der ALA-Dehydratase ist; oder Verbindungen, die mindestens eine Struktur aufweisen, ausgewählt aus einer ähnlichen Molekülform, einem ähnlichen von der Waals-Radius und anderen ähnlichen elektronischen Zuständen.
Beispiele für solche Verbindungen beinhalten mindestens eine Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Lävulinsäure, 5-Chlorlävulinsäure, 5-Bromlävulinsäure, 5-Ketocapronsäure, 2-Methylbernsteinsäure, 2-Oxoadipinsäure, Essigsäure, Succinamidsäure, 3-Oxoadipinsäure, Monomethylsuccinat, 4-Ketopimelinsäure und Propionsäure.
Wie vorstehend beschrieben erhöht die Inhibition sich, wenn das Verhältnis des Ki-Werts zum Km-Wert abnimmt.
Die Inhibitorkonstante und die Michaeliskonstante der durch den Elternstamm, der in der Mutagenese verwendet wurde, erzeugte ALA-Dehydratase werden auch in Übereinstimmung mit dem vorstehenden Schritt 3 gemessen und diese Werte werden als Kriterien für die Auswahl eines mutierten Stamms mit einem erniedrigtem Ki-Wert und einem erhöhten Km-Wert verwendet.
Der für den Erhalt eines solchen mutierten Stamms verwendete Elternstamm wird optional ausgewählt aus den vorher erwähnten Mikroorganismen.
Z. B. können hier Wildstämme von photosynthetischen Bakterien oder mutierten Stämme verwendet werden, jedoch ist es wünschenswert, einen mutierten Stamm zu verwenden, der in der Lage ist, eine ALA-Dehydratasevariante zu erzeugen, die bereits einen hohen Km-Wert für ALA aufweist, wie z. B. Rhodobacter sphaeroides CR-386 oder seine Variante CR-450.
Wenn jedoch eine ALA-Dehydratase des so erhaltenen mutierten Stamms einen zu großen Km-Wert aufweist, wird das Wachstum des mutierten Stamms sehr gering, was in einigen Fällen an der unzureichenden Bildung von Porphobilinogen liegt, das für sein Wachstum benötigt wird.
Daher ist es wünschenswert einen mutierten Stamm zu verwenden, der einen Km-Wert entsprechend dem Km-Wert des Wildstamms oder weniger als 100-fach des Wertes des Wildstamms aufweist.
In diesem Fall ist eine Wachstumsinhibition aufgrund einer großen Michaeliskonstante nicht notwendig, wenn die Inhibition durch Zugabe einer Nährmittelquelle, wie z. B. Porphobilinogen, zum Kulturmedium verhindert werden kann.
Zusätzlich kann eine effizientere Selektion durch Durchführung einer vorläufigen Selektion erhalten werden, basierend auf der Bestimmung der ALA-Produktivität unter Verwendung des Ehrlich-Verfahrens, vor der vorher erwähnten auf Km und Ki basierenden Selektion.
Rhodobacter sphaeroides CR-520 ist ein bevorzugter Stamm, der durch das obige Mutations/Isolationsverfahren erhalten wird.
Als nächstes wird der ALA-erzeugende Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung, bei dem es sich um ein photosynthetisches Bakterium handelt und der ohne Lichtbestrahlung wachsen und ALA erzeugen kann (hiernach bezeichnet als "ALA-erzeugender photosynthetischer Mikroorganismus") unter Verwendung eines photosynthetischen Bakteriums erhalten, wie z. B. einem Stamm, der zur Gattung Rhodobacter gehört, oder einem mutierten Stamm davon als Elternstamm und dessen Mutagenese.
Im folgenden wird ein Verfahren zur Isolierung des ALA- erzeugenden photosynthetischen Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung mit solchen Eigenschaften dargelegt.
Ein flüssiges Medium, in dem der vorstehende Elternstamm wachsen kann, wird in einem Teströhrchen hergestellt und sterilisiert und der Elternstamm wird in das Medium inokuliert und auf einer Rüttelvorrichtung kultiviert. Die so gezüchteten Zellen werden mit einer Pufferlösung gewaschen und einer Mutagenese unterzogen.
Die Mutagenese wird auf dem gewöhnlichen Weg in derselben Weise wie im Fall der vorstehenden Mutation des ALA- erzeugenden Mikroorganismus durchgeführt.
Um einen Stamm mit den vorstehenden Eigenschaften aus den so erhaltenen mutierten Stämmen auszuwählen, werden diese Bakterienzellen auf einer Rüttelvorrichtung ohne Lichtbestrahlung (im Dunkeln) kultiviert.
Danach kann eine effiziente Selektion durch Durchführung einer Bestimmung der ALA-Produktivität, z. B. durch das Ehrlich-Verfahren, durchgeführt werden.
Tatsächlich kann eine effizientere Selektion durch Kombination des vorstehenden Verfahrens für die Selektion des ALA-erzeugenden Mikroorganismus und dem gerade beschriebenen Verfahren für die Selektion des ALA-erzeugenden photosynthetischen Mikroorganismus erreicht werden.
Rhodobacter sphaeroides CR-520 ist ein bevorzugter Stamm, der durch das obige Mutations/Isolationsverfahren erhalten wird.
Wie später in Beispiel 1 beschrieben werden wird, ist dieser Stamm einer von Rhodobacter sphaeroides CR-450 durch NTG- Behandlung abgeleiteter Mutant. Er weist fast dieselben bakteriologischen Eigenschaften wie der Elternstamm auf, mit der Ausnahme, daß er eine reduzierte photosynthetische Fähigkeit hat, daß der Ki-Wert für den ALA-Dehydratase- Inhibitor vermindert ist, daß der Km-Wert für ALA erhöht ist und er erzeugt eine beträchtliche Menge ALA selbst ohne Lichtbestrahlung und seine Kolonien sind braun, während die des Elternstamms rot sind.
Der Stamm CR-520 wurde im National Institute of Bioscience und Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, unter der Hinterlegungs-Nr. FERM BP-5255, hinterlegt.
Die Erzeugung von ALA durch CR-520 kann einfach unter kommerziell verwendeten mikrobiellen Kulturbedingungen bewirkt werden, vorzugsweise durch Befolgung des ALA- Herstellungsverfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung.
Es ist wünschenswert, das Kulturmedium mit assimilierbaren Kohlenstoff- und Stickstoffquellen zu versetzen. Als Kohlenstoffquelle können Saccharide (z. B. Glucose) und Säuren (z. B. Essigsäure, Äpfelsäure, Milchsäure, Bernsteinsäure) verwendet werden. Beispiele für die Stickstoffquelle beinhalten anorganische Stickstoffquellen wie z. B. Ammoniak- Stickstoffverbindungen (z. B. Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid) Nitrat-Stickstoffverbindungen (z. B. Natriumnitrat) und organische Stickstoff-Verbindungen, wie z. B. Harnstoff, Polypepton und Hefeextrakt.
Das Kulturmedium kann auch Spurenbestandteile enthalten, wie z. B. anorganische Salze; Aminosäuren wie z. B. Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan, Methionin, Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Glutamin, Asparagin, Tyrosin, Lysin, Arginin, Histidin, Asparaginsäure und Glutaminsäure; und natürliche Bestandteile, wie z. B. Hefeextrakt, Trockenhefe, Pepton, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellflüssigkeit (corn steep liquor) und Casaminosäure.
Wenn ALA hergestellt wird, ist es wünschenswert, mindestens entweder Glycin oder Lävulinsäure dem Medium zuzufügen. Glycin kann in einer Menge von vorzugsweise 5 bis 100 mM, noch bevorzugt 10 bis 60 mM zugeführt werden und Lävulinsäure in einer Menge von vorzugsweise 0,01 bis 60 mM, noch bevorzugter 0,1 bis 30 mM. Da die Zugabe von Glycin und Lävulinsäure manchmal eine reduzierte Wachstumsrate auslösen kann, können sie nach einer bestimmten Zeitspanne des Stammwachstums zugefügt werden.
Die Kultivierung kann bei einer solchen Temperatur und bei pH-Bedingungen durchgeführt werden, daß der Stamm wachsen kann, nämlich bei einer Temperatur von 10 bis 40ºC, vorzugsweise 20 bis 35ºC und bei einem pH von 4 bis 9, vorzugsweise 5 bis 8.
Wenn sich der pH des Mediums während der Erzeugung von ALA verändert, ist es wünschenswert, das pH-Niveau mit einer alkalischen Lösung einzustellen wie z. B. Natriumhydroxid, Ammoniak und Kaliumhydroxid oder mit einer Säure, wie z. B. Salzsäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure.
Obwohl in einigen Fällen, in denen der Stamm bei Lichtbestrahlung kultiviert wird, hohe Erträge von ALA erzeugt werden können, kann eine große Menge ALA ohne Lichtbestrahlung erzeugt werden, wenn der ALA-erzeugende Stamm der vorliegenden Erfindung, d. h. CR-520, verwendet wird.
Die Herstellung von ALA kann entweder simultan zu dem Wachstum der Zellen oder unabhängig vom Zellwachstum durchgeführt werden. Der zu verwendende Mikroorganismus kann in Form von wachsenden Zellen oder ruhenden Zellen vorliegen und diese Zellen können als solche für die ALA-Produktion verwendet werden oder sie können nach Erhöhung der Zelldichte verwendet werden, durch Sammeln der Zellen durch Zentrifugation und Resuspension in geeigneter Lösung, wie z. B. einem Medium oder Phosphatpuffer.
Die Sauerstoffzufuhr ist unter mindestens einer der folgenden Bedingungen begrenzt, um eine effiziente Produktion von ALA wie im vorstehenden beschrieben zu erreichen:
(a) Die gelöste Sauerstoffkonzentration im Kulturmedium ist in der Regel auf weniger als 1 ppm begrenzt, vorzugsweise weniger als 0,5 ppm, noch bevorzugter weniger als 0,1 ppm (was weniger ist als die Nachweisgrenze der zur Zeit verfügbaren Meßinstrumente). Diese Konzentration kann unter Verwendung einer gelösten Sauerstoff-Meßvorrichtung gemessen werden.
(b) Das Oxidations/Reduktionspotential im Kulturmedium ist in der Regel auf -180 bis 50 mV begrenzt, vorzugsweise -100 bis 20 mV, noch bevorzugter -50 bis 0 mV. Dieses Potential kann unter Verwendung eines Oxidations/Reduktions-Potentiometers gemessen werden.
(c) Die zelluläre Respirationsrate ist in der Regel auf 5 · 10&supmin;&sup9; bis (KrM - 2 · 10&supmin;&sup8;) (mol O&sub2;/ml·min·Zelle), vorzugsweise auf 1 · 10&supmin;&sup8; bis (KrM - 4 · 10&supmin;&sup8;) (mol O&sub2;/ml·min·Zelle) begrenzt.
In diesem Fall bedeutet KrM die maximale zelluläre Respirationsrate, wenn Sauerstoff in Überschußquantität zugeführt wird, jedoch variiert dies abhängig von jedem Bakterium. Z. B. liegt sie bei ungefähr 8 · 10&supmin;&sup8; mol O&sub2;/ml·min·Zelle im Fall von Rhodobacter sphaeroides oder Rhodobacter capsulatus. Dementsprechend wird die zelluläre Respirationsrate unter Verwendung eines solchen Bakteriums 5 · 10&supmin;&sup9; bis 6 · 10&supmin;&sup8; (mol O&sub2;/ml·min·Zelle), vorzugsweise 1 · 10&supmin;&sup8; bis 4 · 10&supmin;&sup8; (mol O&sub2;/ml·min·Zelle).
Die zelluläre Respirationsrate kann unter Verwendung einer Abluftsauerstoff/Kohlendioxid-Analysevorrichtung gemessen werden.
Die Berechnung der zellulären Respirationsrate wurde unter Verwendung der folgenden Formel durchgeführt, die erhalten wurde durch Teilung der allgemeinen Berechnungsexpression von Hirose et al. (Agric. Biol. Chem. 29: 931 (1965)) durch die Menge der Zellen, um die Variation der Menge der Zellen pro Einheitsvolumen zu korrigieren.
Rab/a: zelluläre Respirationsrate (mol O&sub2;/ml·min·Zelle); Belüftung (ml/min),
V: Volumen des Mediums (ml);
T: Kulturtemperatur (ºC)
X&sub0;, X&sub1;: Sauerstoffkonzentration (%) am Luftauslaß und -einlaß;
Y&sub0;, Y&sub1;, CO&sub2;-Konzentration (%) am Luftauslaß und -einlaß;
a: Menge der Zellen, Trockenzellgewicht/l (Zelle).
Die zelluläre Respirationsrate repräsentiert die Sauerstoffabsorptionsrate der Zellen in einem Kulturgefäß und ein großer Wert zeigt eine hohe Verwendung von Sauerstoff an.
Mindestens einer dieser Indices (a) bis (c) kann verwendet werden, jedoch ist es wünschenswert zwei oder mehr von ihnen zu analysieren, da sie in vielen Fällen eine ähnliche Tendenz zeigen.
Verschiedene Mittel können verwendet werden um diesen Bedingungen zu entsprechen, wie ein Erhöhen oder eine Abnahme des Belüftungsverhältnisses, der Rührgeschwindigkeit und des Mediumvolumens in dem Kulturgefäß; die Kontrolle des Sauerstoffpartialdrucks in dem Belüftungsgas; die Zugabe einer Reduktionsverbindung und die Regulation der Mediumzugabe.
Da die Sauerstoffzufuhr begrenzt ist, ist in einigen Fällen die Wachstumsrate des Stamms begrenzt. In diesem Fall wird ausreichend Sauerstoff während des Wachstums der Zellen zugeführt und die Sauerstoffkontrolle beginnt nach einem geeigneten Wachstum der Zellen.
Das in der so erhaltenen Kulturbrühe erhaltene ALA kann durch allgemein verwendete Mittel gereinigt werden, wie z. B. Ionenaustausch, Chromatographie und Extraktion.
Beispiele für für dieses Verfahren anwendbare Mikroorganismen beinhalten photosynthetische Bakterien und Nicht-Schwefel- Purpurbakterien, die in der Lage sind, ALA zu erzeugen, wie z. B. die bakteriellen Stämme, die zu der Gattung Rhodobacter, Rohdopseudomonas, Propionibacterium, Methanobacterium, Methanosarcina, Pseudomonas, Escherichia, Saccharomyces, Rhodospirillum, Rhodopila, Rhodomicrobium und Rhodocyclus gehören, wie auch ihre mutierten Stämme. Diese Mikroorganismen sind z. B. in Bergey's Manual of Determinative Baceteriology, 3: 1658 (1989) offenbart. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es wünschenswert, einen Stamm zu verwenden, der eine so große Menge ALA wie möglich unter aeroben Bedingungen oder in einem Medium, das mit natürlichem Bestandteilen supplementiert ist, erzeugt. Rhodobacter sphaeroides CR-520, der im National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, unter der Hinterlegungs-Nr. FERM BP-5255 hinterlegt wurde, ist ein Beispiel für einen solchen Stamm.
Gemäß dem Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung, der eine ALA-Dehydratasevariante mit einem reduzierten Ki-Wert für einen ALA-Dehydratase-Inhibitor oder weiter mit einem erhöhten Km-Wert für ALA erzeugen kann, nimmt die Fähigkeit zur Umwandlung von zwei Molekülen ALA, erzeugt durch den Mikroorganismus, zu Porphobilinogen in spezifischer Weise deutlich ab, wenn nur eine Spurenmenge eines ALA-Dehydratase- Inhibitors zugefügt wird.
Aufgrund dessen kann die Erzeugung von ALA durch den Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung unter Bedingungen erreicht werden, unter denen der ALA-Dehydratase-Inhibitor in einem solchen Bereich zugeführt wird, daß er Wachstum und Aktivität des Mikroorganismus nicht inhibiert, so daß die Produktivität von ALA deutlich erhöht ist.
Zusätzlich kann ALA in großer Menge von den ALA-erzeugenden Mikroorganismus erzeugt werden.
Beispiele sind unten illustrativ und nicht begrenzend angegeben. Wenn nicht anders angegeben sind alle Teile, Prozentzahlen, Verhältnisse und ähnliches Gew.-Teile, Gew.-% - Zahlen und Gewichtsverhältnisse.

Beispiele

Beispiel 1

Ein Glutamat·Glucose-Medium (Medium 1), dargestellt in Tabelle 1, wurde in 10 ml-Teilen in Teströhrchen mit einem Durchmesser von 21 mm (21 mm φ Teströhrchen) verteilt, bei 121ºC für 15 min sterilisiert und dann spontan abgekühlt.

Tabelle 1

g/1 (destilliertes Wasser)
Natriumglutamat 3,8
Glucose 9,0
Kaliumhydrogenphosphat 0,5
Kaliumdihydrogenphosphat 0,5
Ammoniumsulfat 0,8
Magnesiumsulfat 0,2
Calciumchlorid 0,053
Mangansulfat 1,2 · 10&supmin;³
Nicotinsäure 1,0 · 10&supmin;³
Biotin 1,0 · 10&supmin;&sup5;
Thiamin 1,0 · 10&supmin;³
Hefeextrakt 2,0
Eine Schlaufe des Stamms CR-450 wurde in das so hergestellte Medium inokuliert und im Dunkeln bei 30ºC 2 Tage auf einer Rüttelvorrichtung kultiviert.
Medium 1 wurde in 10 ml Teilen in andere 21 mm φ-Teströhrchen verteilt und in derselben Weise wie oben beschrieben sterilisiert. Ein 0,5 ml-Teil der oben erhaltenen Kulturbrühe wurde in das so hergestellte Medium inokuliert und im Dunkeln bei 30ºC für 18 Stunden auf einer Rüttelvorrichtung kultiviert.
Die so erhaltene Kulturbrühe wurde 5 Minuten einer Zentrifugation bei 10000 Upm unterzogen, die resultierende Überstandsflüssigkeit wurde verworfen und die so gewaschenen Zellen wurden in demselben Volumen Tris Maleinsäurepuffer (pH 6,0) suspendiert. Dieser Waschschritt wurde zweimal durchgeführt.
Danach wurde die Zellsuspension wieder einer 5 Minuten- Zentrifugation bei 10000 Upm unterzogen, die resultierende Überstandsflüssigkeit wurde verworfen und dann wurden die so erhaltenen Zellen in Tris·Maleinsäurepuffer (pH 6,0) suspendiert, der 100 ug/ml NTG enthielt und sie wurden 80 Minuten einer Stehkultur bei Raumtemperatur unterzogen.
Die auf diese Weise mutagen-behandelten Zellen wurden dreimal in derselben Weise wie oben beschrieben gewaschen und dann in Teströhrchen inokuliert, die sterilisiertes Medium 1 enthielten und im Dunkeln bei 30ºC für 2 Tage auf einer Rüttelvorrichtung kultiviert.
Getrennt hiervon wurde Agar zu Medium 1 in einer Menge von 15 g/l zugefügt und bei 121ºC für 15 Minuten zur Herstellung von Agarplatten sterilisiert. Die oben erhaltene Kulturbrühe wurde verdünnt und auf die Agarplatte verteilt und im Dunkeln bei 30ºC für 4 Tage kultiviert.
Im Ergebnis wurden ungefähr 15000 Kolonien erhalten.

Beispiel 2

Sterilisiertes Medium 1 wurde in 0,2 ml Teilen in Vertiefungen von sterilen Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen verteilt und ungefähr 15 000 Kolonien wie oben beschrieben wurden separat in diese Vertiefungen inokuliert.
Nach 24 Stunden einer Kultur im Dunkeln bei 30ºC auf einer Mikroplattenrüttelvorrichtung wurden Glycin und Lävulinsäure jeder Vertiefung zu endgültigen Konzentrationen von 30 mM bzw. 1 mM zugefügt.
Nach zusätzlichen 24 Stunden eines Rüttelns der Kultur unter denselben Bedingungen wie oben beschrieben wurde die Kulturbrühe in jeder Vertiefung gesammelt und durch die Ehrlich-Reaktion zur Selektion von 70 mutierten Stämmen, die eine hohe Absorption bei 553 nm zeigten, überprüft.

Beispiel 3

Medium 1 (200 ml) wurde in einem Rüttelkolben mit einer Kapazität von 500 ml hergestellt. Dieses wurde bei 121ºC für 15 Minuten sterilisiert und dann spontan abgekühlt.
Jeder der in Beispiel 2 erhaltenen mutierten Stämme von CR- 450 wurde in ein 21 mm φ-Teströhrchen inokuliert, das 10 ml Medium 1 enthielt, das in derselben Weise wie im vorstehenden beschrieben sterilisiert wurde und im Dunkeln bei 30ºC für 48 Stunden auf einer Rüttelvorrichtung kultiviert.
Der gesamte Anteil der Kulturbrühe wurde in den vorher erwähnten Rüttelkolben inokuliert und im Dunkeln bei 30ºC für 48 Stunden auf einer Rüttelvorrichtung kultiviert und die resultierenden Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt.
Die so gesammelten Zellen wurden mit Tris-HCl-Puffer (40 mM, pH 8,1) gewaschen, in 5 ml desselben Puffers suspendiert, unter Verwendung einer Ultraschall-Zellaufbrechvorrichtung auf übliche Weise aufgebrochen und dann 30 Minuten einer Zentrifugation bei 10000 Upm unterzogen. Die so erhaltene Überstandsflüssigkeit wurde als Roh-ALA-Dehydrataselösung verwendet.
Zu 1 ml Tris-HCl-Puffer (40 mM, pH 8,1), der 33 mM KCl und 6,5 mM MgCl&sub2; enthielt, wurde die oben erhaltene Rohenzymlösung in einer Menge von 1,0 mg/ml im Hinblick auf das Protein zugefügt, wodurch eine Enzymreaktionslösung hergestellt wurde.
Die so hergestellte Enzymreaktionslösung wurde mit ALA (0,32, 0,65, 1,3, 3,2 oder 6,5 mM) und Lävulinsäure (0, 0,01, 0,05, 0,2, 1,0 oder 5,0 mM) gemischt und bei 37ºC inkubiert.
Nach 60 Minuten Inkubation wurde die Reaktion durch Zugabe von 2 ml 5 Vol.-% Trichloressigsäure gestoppt. Dieses wurde bei 3 500 Upm 10 min zentrifugiert und 1 ml-Teil der resultierenden Überstandsflüssigkeit wurde durch das vorher erwähnte Ehrlich-Kolorimetrie-Bestimmungsverfahren überprüft um den Prophobilinogen-Gehalt "a" zu überprüfen, der in der Reaktionslösung gebildet wurde.
Ein anderer 1 ml-Teil der Überstandsflüssigkeit wurde durch das vorstehende Satto-Verfahren überprüft um den Gesamtporphyrin-Gehalt "b" in der Reaktionslösung zu überprüfen.
Unter der Verwendung der vorstehenden Formel 1 wurde die Bildungsrate von Porphobilinogen aus diesen Mengen "a" und "b" berechnet und als Reaktionsrate der ALA-Dehydratase verwendet.
Die reziproke Zahl der Reaktionsrate wurde gegen die Konzentration von Lävulinsäure aufgetragen, um die Regressionslinie jeder ALA-Konzentration zu erhalten.
Da sich die jeweiligen Regressionslinien an einer Stelle überkreuzen, wurde die Inhibitionskonstante (d. h. der Ki- Wert) aus dem zum Kreuzungspunkt korrespondierenden Wert der Lävulinsäure-Konzentrationsachse erhalten.
Außerdem wurde die reziproke Zahl der Reaktionsrate gegen die reziproke Zahl der ALA-Konzentration zum Erhalt einer Regressionslinie aufgetragen und die Michaeliskonstante (Km) wurde aus dem Kreuzungspunkt der Regressionslinie und der Achse der reziproken ALA-Konzentration erhalten.
Unter den überprüften mutierten Stämmen besaß der isolierte Stamm CR-514 eine ALA-Dehydratasevariante mit einem reduzierten Ki-Wert für den ALA-Dehydratase-Inhibitor (Lävulinsäure) und war in der Lage ALA zu erzeugen; Stamm CR-520 besaß eine ALA-Dehydratasevariante mit einem erhöhten Km-Wert für ALA und einem reduzierten Ki-Wert für den ALA- Dehydratase-Inhibitor (Lävulinsäure) und war in der Lage ALA durch Wachstum ohne Lichtbestrahlung zu erzeugen; und Stamm CR-533 erzeugte eine beträchtliche Menge ALA selbst im Dunkeln, trotz eines unveränderten Kis und Kms.
Die Ki- und Km-Werte der Stämme CR-514, CR-520 und CR-533 sind in Tabelle 2 angegeben.

Vergleichsbeispiel 1

Das Verfahren von Beispiel 3 wurde durchgeführt, außer daß Rhodobacter sphaeroides IFO 12203 verwendet wurde um die Ki- und Km-Werte zu berechnen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.

Vergleichsbeispiel 2

Das Verfahren von Beispiel 2 wurde durchgeführt, außer daß Rhodobacter sphaeroides CR-450 verwendet wurde, um die Ki- und Km-Werte zu berechnen. Die Ergebnisse sind ebenfalls in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2
Wie sich aus den in Tabelle 2 dargestellten Ergebnissen ergibt, besitzt der Stamm CR-520 eine ALA-Dehydratasevariante mit einem erhöhten Km-Wert für ALA und einem reduzierten Ki- Wert für Lävulinsäure (einem ALA-Dehydratase-Inhibitor).

Beispiel 4

Ein 500 ml-Teil des Mediums 1 wurde in einem Schüttelkolben mit einer 2 l-Kapazität hergestellt. Dieses wurde bei 121ºC für 15 Minuten sterilisiert und dann spontan abgekühlt.
Getrennt hiervon wurden die in Beispiel 3 erhaltenen mutierten Stämme CR-514, CR-520 und CR-533 in ein 21 mm φ- Teströhrchen inokuliert, das 10 ml Medium 1 enthielt, das in derselben Weise wie im vorstehenden beschriebenen sterilisiert worden war und wurden im Dunkeln bei 30ºC für 48 Stunden auf einer Rüttelvorrichtung kultiviert.
Der gesamte Anteil von jeder Kulturbrühe wurde in den vorher erwähnten Rüttelkolben inokuliert und im Dunkeln bei 30ºC für 48 Stunden auf einer Rüttelvorrichtung kultiviert und die resultierenden Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt.
Die so gesammelten Zellen wurden in 150 ml sterilisiertem Medium 1 suspendiert, zu einer Naßzelldichte von ungefähr 0,3 g/10 ml und die Zellsuspension wurde mit 30 mM Glycin gemischt und in 10 ml-Teilen in 21 mm φ-Teströhrchen verteilt. Nach einer Zugabe von unterschiedlichen Konzentrationen von Lävulinsäure wurde die Rüttelkultur bei 30ºC im Dunkeln durchgeführt.
Die Menge des ALA in den resultierenden Kulturbrühen wurde 15 und 30 Stunden danach in Übereinstimmung mit dem Verfahren von Okayama et al. (Clinical Chemistry, 38(8): 1494 (1990)) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt.

Vergleichsbeispiel 3

Das Verfahren von Beispiel 4 wurde durchgeführt, außer daß Rhodobacter sphaeroides IFO 12203 verwendet wurde und daß die Menge der Lävulinsäure wie dargestellt in Tabelle 3 verändert wurde. Die Menge von ALA in den Kulturbrühen nach 15 und 30 Stunden einer Kultur wurde in derselben Weise wie in Beispiel 4 beschrieben bestimmt. Die Ergebnisse sind ebenfalls in Tabelle 3 dargestellt.

Vergleichsbeispiel 4

Das Verfahren von Beispiel 4 wurde durchgeführt, außer daß Rhodobacter sphaeroides CR-450 verwendet wurde und die Menge der Lävulinsäure wurde wie in Tabelle 3 dargestellt verändert. Die Menge von ALA in den Kulturbrühen nach 15 und 30 Stunden einer Kultur wurde in derselben Weise wie beschrieben in Beispiel 4 bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3
Wie sich aus den in Tabelle 3 dargestellten Ergebnissen ergibt, ist der Stamm CR-520 ein Beispiel für einen Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung, der ohne Lichtbestrahlung wachsen kann und der eine ALA- Dehydratasevariante mit einem erhöhten Km-Wert für ALA und einem reduzierten Ki-Wert für Lävulinsäure aufweist, so daß die notwendige Menge der Lävulinsäure für seine Produktion reduziert werden kann.

Beispiel 5

1 l des Mediums 1 wurde in ein Fermentationsgefäß mit einer 2 l-Kapazität gegeben, bei 121ºC für 15 Minuten sterilisiert und dann auf Raumtemperatur abgekühlt.
Der Stamm CR-520 (FERM BP-5255), der vorher durch Rüttelkultur unter aeroben Bedingungen unter Verwendung eines 1 l-Sakaguchi-Kolbens, der 200 ml Medium 1 enthielt (KrM = 8,2 · 10&supmin;&sup8;) gezüchtet worden war, wurde in dem obigen Fermenter zur Durchführung einer Kultur unter Belüftungsbewegung bei 30ºC mit einer Belüftungsrate von 0,1 V/V/m und einer Bewegungsgeschwindigkeit von 200 Upm inokuliert. Alle Kultivierungsschritte wurden ohne Lichtbestrahlung durchgeführt. Nach 48 Stunden der Kultur betrug die Zelldichte 0,64 g pro 1 l Medium.
Als nächstes wurden Glycin, Lävulinsäure, Glucose und Hefeextrakt dem Medium zu einer endgültigen Konzentration von 60 mM, 5 mM, 50 mM bzw. 1% zugefügt. Der pH wurde auf pH 6,5 bis 7,0 unter Verwendung von 1 N NaOH und 1 N Schwefelsäure korrigiert.
Die Belüftungsrate wurde auf 0,014 V Luft/V/m reduziert und N&sub2;-Gas wurde mit einer Rate von 0,086 V/V/m zugeführt. Die Bewegungsgeschwindigkeit wurde auf 200 Upm eingestellt.
Die Kultivierung wurde 84 Stunden unter diesen Bedingungen fortgesetzt.
Die maximale ALA-Anhäufung, die gelöste Sauerstoffkonzentration nach 48 Stunden und das durchschnittliche Oxidations-Reduktionspotential sowie die durchschnittliche zelluläre Respirationsrate nah 48 Stunden bis 84 Stunden der Kultivierung sind in Tabelle 4 dargestellt. In diesem Fall wurde die gelöste Sauerstoffkonzentration unter Verwendung eines gelösten Sauerstoffindikators M-1032 und einer Sauerstoff- Membranelektrode für eine Fermentationsverwendung, hergestellt von Able Co., Ltd. gemessen; das Oxidations- Reduktionspotential wurde unter Verwendung einer digitalen ORP-Kontrollvorrichtung, hergestellt von Mituwa Biosystem Co., Ltd. und einer ORP-Elektrode, hergestellt von Ingold Co., Ltd. gemessen; und die zelluläre Respirationsrate wurde unter Verwendung eines Abluftgas-Analysators WSMR-1400LB, hergestellt von Westron Corp. gemessen.

Beispiel 6

Das Verfahren gemäß Beispiel 5 wurde durchgeführt, außer daß die Bewegungsgeschwindigkeit nach 48 Stunde auf 300 Upm verändert wurde.
Die maximale ALA-Anhäufung, die gelöste Sauerstoffkonzentration nach 48 Stunden und das durchschnittliche Oxidations-Reduktionspotential sowie die durchschnittliche zelluläre Respirationsrate nach 48 Stunden bis 84 Stunden der Kultivierung sind in Tabelle 4 dargestellt.

Beispiel 7

Das Verfahren von Beispiel 5 wurde durchgeführt, außer daß die Bewegungsgeschwindigkeit nach 48 Stunden auf 400 Upm verändert wurde.
Die maximale ALA-Anhäufung, die gelöste Sauerstoffkonzentration nach 48 Stunde und das durchschnittliche Oxidations-Reduktionspotential sowie die durchschnittliche zelluläre Respirationsrate nach 48 Stunden bis 84 Stunden der Kultivierung sind in Tabelle 4 dargestellt.

Beispiel 8

Das Verfahren von Beispiel 5 wurde durchgeführt, außer daß die Bewegungsgeschwindigkeit nach 48 Stunden auf 500 Upm verändert wurde.
Die maximale ALA-Anhäufung, die gelöste Sauerstoffkonzentration nach 48 Stunde und das durchschnittliche Oxidations-Reduktionspotential sowie die durchschnittliche zelluläre Respirationsrate nach 48 Stunden bis 84 Stunden der Kultivierung sind in Tabelle 4 dargestellt.

Beispiel 9

Das Verfahren von Beispiel 5 wurde durchgeführt, außer daß die Bewegungsgeschwindigkeit nach 48 Stunden auf 600 Upm verändert wurde.
Die maximale ALA-Anhäufung, die gelöste Sauerstoffkonzentration nach 48 Stunde und das durchschnittliche Oxidations-Reduktionspotential sowie die durchschnittliche zelluläre Respirationsrate nach 48 Stunden bis 84 Stunden der Kultivierung sind in Tabelle 4 dargestellt.

Vergleichsbeispiel 5

Das Verfahren von Beispiel 5 wurde durchgeführt, außer daß die Bewegungsgeschwindigkeit und die Belüftungsrate nach 48 Stunden auf 400 Upm bzw. 0,5 V Luft/V/m verändert wurden.
Die maximale ALA-Anhäufung, die gelöste Sauerstoffkonzentration nach 48 Stunde und das durchschnittliche Oxidations-Reduktionspotential sowie die durchschnittliche zelluläre Respirationsrate nach 48 Stunden bis 84 Stunden der Kultivierung sind in Tabelle 4 dargestellt. Tabelle 4
Bemerkung:
N.N.: Nicht nachweisbar
ORP: Oxidations-Reduktionspotential
CRR: Zelluläre Respirationsrate (· 10&supmin;&sup8; mol O&sub2;/ml·min·Zelle)

Beispiel 10

Das Verfahren von Beispiel 5 wurde durchgeführt, außer daß der Stamm Rhodobacter capsulatus ATCC 11166 (KrM = 8,5 · 10&supmin;&sup8;) war und daß die Bewegungsgeschwindigkeit nach 48 Stunden auf 400 Upm verändert wurde.
Die maximale ALA-Anhäufung durch dieses Kulturverfahren betrug 0,086 mM, die gelöste Sauerstoffkonzentration in dem Medium nach 48 Stunden einer Kultur war nicht nachweisbar (weniger als 0,1 ppm), das durchschnittliche Oxidations- Reduktionspotential nach 48 Stunden bis 84 Stunden betrug -31 mV und die durchschnittliche zelluläre Respirationsrate nach 48 Stunden bis 84 Stunden betrug 2,7 · 10&supmin;&sup8; (mol O&sub2;/ml·min·Zelle).

Vergleichsbeispiel 6

Das Verfahren von Vergleichsbeispiel 5 wurde durchgeführt, außer daß der Stamm gegen Rhodobacter capsulatus ATCC 11166 ausgetauscht wurde.
Die ALA-Anhäufung durch dieses Kulturverfahren war nicht nachweisbar (weniger als 0,01 mM), die gelöste Sauerstoffkonzentration in dem Medium nach 48 Stunden einer Kultur betrug 8 ppm, das durchschnittliche Oxidations- Reduktionspotential nach 48 Stunden bis 84 Stunden betrug 131 mV und die durchschnittliche zelluläre Respirationsrate nach 48 Stunden bis 84 Stunden betrug 8,5 · 10&supmin;&sup8; (mol O&sub2;/ml·min·Zelle).

Beispiel 11

Medium 1 (18 l) wurde in ein Fermentationsgefäß mit einer Kapazität von 30 l gegeben und bei 121ºC 30 Minuten sterilisiert.
Der Stamm CR-520 (FERM BP-5255), der vorher durch Rüttelkultur unter aeroben Bedingungen unter Verwendung eines 1 l-Sakaguchi-Kolbens, der 200 ml Medium 1 enthielt, gezüchtet worden war, wurde in den obigen Fermenter zur Durchführung einer Belüftungsbewegungskultur bei 30ºC mit einer Belüftungsrate von 0,1 V/V/m und einer Bewegungsgeschwindigkeit von 200 Upm inokuliert. Alle Kultivierungsschritte wurden im Dunkeln durchgeführt. Nach 48 Stunden einer Kultur betrug die Zelldichte 0,68 g pro 1 l Medium.
Als nächstes wurden Glycin, Lävulinsäure, Glucose und Hefeextrakt dem Medium zu einer endgültigen Konzentration von 60 mM, 5 mM, 50 mM bzw. 1% zugefügt und der pH wurde auf pH 6,5 bis 7,0 unter Verwendung von 1 N NaOH und 1 N Schwefelsäure korrigiert.
Die Belüftungsrate wurde auf 0,028 V Luft/V/m reduziert und N&sub2;-Gas wurde mit einer Rate von 0,172 V/V/m zugeführt. Die Bewegungsgeschwindigkeit wurde auf 300 Upm eingestellt.
Die Kultivierung wurde 84 Stunden unter diesen Bedingungen fortgesetzt.
Die maximale ALA-Anhäufung durch dieses Kulturverfahren betrug 12,8 mM, die gelöste Sauerstoffkonzentration in dem Medium nach 48 Stunden einer Kultur war nicht nachweisbar (weniger als 0,1 ppm), das durchschnittliche Oxidations- Reduktionspotential nach 48 Stunde bis 84 Stunden betrug -22 mV und die durchschnittliche zelluläre Respirationsrate nach 48 Stunden bis 84 Stunden betrug 2,2 · 10&supmin;&sup8; (mol O&sub2;/ml·min·Zelle).
Obwohl die Erfindung im Detail und im Hinblick auf ihre spezifischen Ausführungsformen beschrieben wurde, wird dem Fachmann klar sein, daß verschiedene Abwandlungen und Modifikationen durchgeführt werden können, ohne von ihrem Umfang abzuweichen.

Claims

1. Mikroorganismus, der 5-Aminolävulinsäure erzeugt, wobei der Mikroorganismus ein Mutant eines Elternstamms ist und eine 5-Aminolävulinsäure-Dehydratasevariante aufweist mit einer niedrigeren Inhibitorkonstante für einen 5-Aminlävulinsäure-Dehydrataseinhibitor als der Elternstamm.

2. Mikroorganismus gemäß Anspruch 1, wobei die 5-Aminolävulinsäure-Dehydratasevariante eine höhere Michaeliskonstante für 5-Aminolävulinsäure aufweist als der Elternstamm.

3. Mikroorganismus gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Mikroorganismus ein photosynthetisches Bakterium ist.

4. Mikroorganismus gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der mutierte Stamm 5-Aminolävulinsäure ohne Bestrahlung mit Licht erzeugt.

5. Mikroorganismus gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der mutierte Stamm von einem Elternstamm abgeleitet ist, ausgewählt aus der Gruppe der Gattungen, bestehend aus Rhodobacter, Rhodopseudomonas, Escherichia, Saccharomyces, Rhodospirillum, Rhodopila, Rhodomicrobium und Rhodocyclus.

6. Mikroorganismus gemäß Anspruch 5, wobei der Elternstamm ausgewählt ist aus der Gruppe der Gattung Rhodobacter.