KR101431453B1 - 5-아미노레불린산, 포르피린, 포르피린 유사체 또는 헴을 효율적으로 생산할 수 있는 생물학적 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 5-아미노레불린산, 포르피린, 포르피린 유사체 또는 헴의 효율적인 생산을 목적으로 하는 생물학적 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 바이카보네이트의 첨가, 썩시네이트의 첨가, 글리신의 첨가 및 성장 인자의 첨가를 특징으로 하는 pH 안정화 능력이 강화된 조성의 배지를 사용하는 것을 특징으로 하는 5-아미노레불린산, 포르피린, 포르피린 유사체 또는 헴의 생물학적 생산 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 5-아미노레불린산, 포르피린, 포르피린 유사체 또는 헴의 효율적인 생산을 목적으로 하는 생물학적 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 바이카보네이트의 첨가, 썩시네이트의 첨가, 글리신의 첨가 및 성장 인자의 첨가를 특징으로 하는 pH 안정화 능력이 강화된 조성의 배지를 사용하는 것을 특징으로 하는 5-아미노레불린산, 포르피린, 포르피린 유사체 또는 헴의 생물학적 생산 방법에 관한 것이다.
헴(heme)은 철 이온(Fe2 +)을 함유한 포르피린(porphyrin) 복합체(complex)이며, 썩시닐-코에이(succinyl-CoA)와 글리신(glycine)의 중합반응에 의한 경로(C4 경로) 또는 글루타메이트(glutamate)를 출발물질로 ATP, NADPH 조효소를 사용하는 경로(C5 경로)를 통하여 생체 내에서 합성된다. 이 두 경로에 대한 선호도는 종에 따라 다르다. 두 경로 모두 5-아미노레불린산 합성효소(5-aminolevulinic acid synthase; ALAS; hemA)의 작용에 의한 5-아미노레불린산(5-aminolevulinic acid; ALA)의 합성으로부터 시작되며, Fe2+이 페로케라타아제(ferrochelatase; hemH)에 의해 프로토포르피린 IX(protoporphyrin IX; Proto IX)에 삽입(integration)됨으로써 헴의 합성이 완료된다(Appl. Microbiol. Biotechnol. 63: 115-127, 2003).
헴 생합성 과정에서는 다양한 포르피린 유사체(derivatives)들이 생성된다. 포르피린 유사체로는 포르포빌리노겐(porphobilinogen; PBG), 1-하이드록시메틸빌란(1-hydroxymethylbilane; HMB), 우로포르피린 I(uroporphyrin I; Uro I), 우로포르피린 III(uroporphyrin III; Uro III), 코프로포르피린 I(coproporphyrin I; Copro I), 코프로포르피린 III(coproporphyrin III; Copro III), 프로토포르피린 IX 등이 있다. 헴 생합성 경로를 도식적으로 제시하면 도 1과 같다.
헴은 산소전달(oxygen transfer), 활성산소(reactive oxygen) 제거, 에너지 생산과 관련한 전자전달(electron transfer)에 있어 중요한 역할을 한다(Cell 122: 487-489, 2005). 포르피린 유사체나 복합체 중에 상업적으로 그 중요성이 특히 높은 것이 바로 헴이다. 헴은 유기형태의 철분공급원으로 활용될 수 있다. 유기형태의 철분제는 생체 내 흡수율이 무기형태의 철분제에 비하여 2배 정도 높아 보다 우수한 철분공급원으로 인정받고 있다(Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 31: 333-367, 1992; Acta. Med. Scand. 629: 1-46, 1980). 이러한 이유로 헴은 철분공급제나 빈혈치료제로서의 활용 가능성이 매우 높다. 또한, 축산분야에서의 철분공급제나 사료첨가제로도 활용이 가능하다.
5-아미노레불린산도 산업적 활용 측면에서 중요하다고 할 수 있다. 5-아미노레불린산은 친환경적인 생물농약(광활성제초제) 및 식물생장 촉진제로 활용되고 있는데, 5-아미노레불린산을 저농도로 처리할 경우에 무, 강낭콩, 보리, 감자, 마늘, 벼, 옥수수 같은 작물 등에서 처리하지 않은 군과 비교하여 10-60%의 생육을 촉진한다고 알려져 있다(Plant Growth Regulation 22: 109-114, 1997). 또한 의약부문에서도 활용이 가능하다. 5-아미노레불린산은 여드름, 아토피 등의 피부질환 치료제나 피부암 치료제 등으로 현재 활용되고 있으며, 화장품에도 사용되고 있다. 축산분야에서도 가축의 자가 면역력을 증진시키고 사료효율을 향상시키고자 하는 목적으로의 항생제 대체용 성장촉진제로 활용될 수 있다(대한민국특허등록 10-0459918).
한편, 아직 그 산업적 활용이 명확하지 않은 다른 여러 가지의 포르피린 유사체나 복합체들도 점차적으로 그 생리적 활성이 규명됨에 따라 산업적 활용이 뒤따를 것으로 기대된다.
그러나 아직까지 5-아미노레불린산, 포르피린, 포르피린 유사체 또는 헴을 효율적으로 생산할 수 있는 생물학적 방법의 개발은 미흡한 실정이다. 본 발명자들에 의하여 헴의 생물학적 생산 방법이 개시된 바 있으나(대한민국공개특허공보 10-2011-0070977), 이 방법은 헴 생산에 있어 복합배지(complex medium)를 사용하기 때문에 산업적 생산 공정으로 활용하기에는 경제성의 문제를 갖고 있으며, 또한 복합배지 성분의 특성으로 인하여 헴 생산의 제어에 있어 어려움이 있다.
이에 따라 헴의 산업적 생산에 적합한 합성배지(synthetic medium; 이는 화학적 한정배지, 화학성분 한정배지, 화학적 규명배지 또는 화학성분 규명 배지라고도 불린다. 영어로는 chemically defined medium으로 흔히 불린다)의 개발이 필요하다 할 수 있으며, 이러한 배지는 헴 외에도 다양한 산업적 활용이 기대되는 5-아미노레불린산, 포르피린 또는 포르피린 유사체의 생산에도 활용될 수 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용은 괄호 내에 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준과 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
따라서 본 발명은 이러한 종래기술의 문제점과 과거로부터 요청되어온 기술적 과제를 해결하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 목적은 5-아미노레불린산, 포르피린, 포르피린 유사체 또는 헴의 효율적인 생산을 목적으로 하는 생물학적 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 5-아미노레불린산, 포르피린, 포르피린 유사체 또는 헴의 효율적인 생산을 목적으로 하는 생물학적 방법에 적합한 합성배지 조성을 제공하는 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명자들은 다양한 노력을 한 결과로 바이카보네이트(bicarbonate)의 첨가, 썩시네이트(succinate)의 첨가, 글리신(glycine)의 첨가 및 성장 인자의 첨가를 특징으로 하는 pH 안정화 능력이 강화된 합성배지 조성이 5-아미노레불린산, 포르피린, 포르피린 유사체 또는 헴의 생물학적 생산에 보다 적합한 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 바이카보네이트의 첨가는 헴 생합성 C4 경로의 강화를 위해 첨가되는 성분으로 C4 경로에 참여하는 여러 전구물질(precursor)의 합성에 도움을 준다. 특히, 바이카보네이트는 헴 생합성에 있어 중요 효소인 NADP-의존 말릭 효소(NADP-dependent malic enzyme; maeB)의 활성에 필요한 CO3 -의 생성에 있어 기질(substrate)로 작용한다(J. Appl. Microbiol. 103: 2340-2345, 2007). 본 발명의 실시예에서는 소듐 바이카보네이트의 사용을 개시하고 있지만 다양한 염(salt) 형태의 바이카보네이트가 적용 가능함은 자명하다. 상기 바이카보네이트는 사용되는 염의 형태에 따라 그 사용량이 다양할 수 있으며, 0.01 g/L에서부터 50 g/L까지 사용하는 것이 바람직하며, 2 g/L에서부터 20 g/L까지 사용하는 것이 보다 바람직하다.
또한 바이카보네이트의 첨가 대신에 이산화탄소 기체 또는 이산화탄소 기체를 포함하고 있는 혼합가스를 공급하는 방법으로도 대체될 수 있다. 이때 혼합가스의 이산화탄소 함유는 0.5-30%가 바람직하며, 1-10%가 보다 바람직하다.
상기 소듐 썩시네이트의 첨가는 헴 생합성 C4 경로의 활성화를 유도하기 위하여 첨가되는 성분으로서, 헴 생합성 C4 경로의 썩시닐-코에이의 출발물질로 활용되는 성분이다. 본 발명의 실시예에서는 소듐 썩시네이트의 사용을 개시하고 있지만 다양한 염(salt) 형태의 썩시네이트가 적용 가능함은 자명하다. 상기 썩시네이트는 0.01 g/L에서부터 50 g/L까지 사용하는 것이 바람직하며, 2 g/L에서부터 20 g/L까지 사용하는 것이 보다 바람직하다.
상기 글리신의 첨가는 헴 생합성 C4 경로의 활성화를 유도하기 위하여 첨가되는 성분으로서, 헴 생합성 C4 경로의 썩시닐-코에이와 중합반응에 참여하는 성분이다. 상기 글리신은 0.01 g/L에서부터 20 g/L까지 사용하는 것이 바람직하며, 1 g/L에서부터 5 g/L까지 사용하는 것이 보다 바람직하다.
상기 성장인자는 헴 생합성에 필요한 전반적인 세포내 대사체들이나 코엔자임(coenzyme)류의 농도를 증진시키는 효과를 제공하거나 그 자체가 헴 생합성 촉진 성분으로 작용할 수 있는 성분들을 지칭하며 비타민류가 적합하다. 이러한 성장인자로는 다양한 것이 적용될 수 있는데, 티아민(thiamin), 바이오틴(biotin), 니코틴산(nicotinic acid), 판토텐산(pantothenic acid), 코발아민(cobalamin; 비타민 B12로도 불림)에서 선택하는 것이 바람직하며, 이들 모두를 사용하는 것이 가장 바람직하다. 이들 성장인자들은 개별 농도로 0.001 mg/L에서부터 10 mg/L까지 사용하는 것이 바람직하며, 0.005 mg/L에서부터 5 mg/L까지 사용하는 것이 보다 바람직하다.
상기 pH 안정화 능력(pH buffering capacity)의 강화는 첨가된 바이카보네이트의 소비에 의한 배지 pH 변동에 의한 영향을 완화시키기 위해 필요한데, 이는 고농도의 pH 완충액 성분의 첨가로 달성이 가능하다. 본 발명자들이 확인한 바에 따르면 바이카보네이트의 소비에 따라 배지의 pH가 낮아지게 되면 헴의 생산이 심각하게 억제된다. 완충액의 농도는 10-500 mM이 적용 가능하나, 확실한 효과를 위해서는 50-500 mM의 적용이 바람직하고, 100-500 mM의 적용이 보다 바람직하다.
완충액은 pH 완충 효과를 제공할 수 있는 완충액이라면 그 종류에 있어 제한은 없으나, 인산염 완충액(phosphate buffer)의 사용이 바람직하다.
본 발명의 배지 조성을 사용하면 5-아미노레불린산, 포르피린, 포르피린 유사체 또는 헴의 생물학적 생산에 대한 제어가 보다 철저해 질 수 있으며, 그 생산 공정의 경제성이 보다 개선될 수 있다.
도 1은 도식적으로 제시한 헴 생합성 경로이다.
도 2는 포르피린 유사체의 합성을 보여주는 그림이다.
도 3은 헴의 생산을 확인한 LC/MS 분석 결과이다.
도 4는 5-아미노레불린산의 생산을 확인한 LC/MS 분석 결과이다.
도 5는 우로포르피린 III의 생산을 확인한 LC/MS 분석 결과이다.
도 6은 코프로포르피린 III의 생산을 확인한 LC/MS 분석 결과이다.
도 7은 프로토포르피린 IX의 생산을 확인한 LC/MS 분석 결과이다.
도 8은 배양 시간에 따른 결과를 보여주는 분석 결과이다. (A) 5-아미노레불린산; (B) 포르포빌리노겐; (C) 우로포르피린 I; (D) 코프로포르피린 I; (E) 코프로포르피린 III; (F) 헴; 및 (G) 세포농도.
도 2는 포르피린 유사체의 합성을 보여주는 그림이다.
도 3은 헴의 생산을 확인한 LC/MS 분석 결과이다.
도 4는 5-아미노레불린산의 생산을 확인한 LC/MS 분석 결과이다.
도 5는 우로포르피린 III의 생산을 확인한 LC/MS 분석 결과이다.
도 6은 코프로포르피린 III의 생산을 확인한 LC/MS 분석 결과이다.
도 7은 프로토포르피린 IX의 생산을 확인한 LC/MS 분석 결과이다.
도 8은 배양 시간에 따른 결과를 보여주는 분석 결과이다. (A) 5-아미노레불린산; (B) 포르포빌리노겐; (C) 우로포르피린 I; (D) 코프로포르피린 I; (E) 코프로포르피린 III; (F) 헴; 및 (G) 세포농도.
상기한 바와 같이, 본 발명은 5-아미노레불린산, 포르피린, 포르피린 유사체 또는 헴을 효율적으로 생산할 수 있는 생물학적 방법에 적합한 합성배지 조성을 제공하는 것이다.
이하, 본 발명의 내용을 보다 상세하게 설명하지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1: 이용한
생산균주
본 발명의 5-아미노레불린산, 포르피린, 포르피린 유사체 또는 헴의 생산균주로는 본 발명자들에 의해 제작되고 대한민국공개특허공보 10-2011-0070977에 개시한 균주를 사용하였다. 이 균주는 대장균 W3110을 pTrc(PlachemA+-maeB-dctA)로 형질전환시켜 제작한 균주로서, 5-아미노레불린산 합성효소(5-aminolevulinic acid synthase; hemA), NADP-의존 말릭 효소(NADP-dependent malic enzyme; maeB), 디카르복실레이트 트랜스포터(dicarboxylate transporter; dctA)를 발현할 수 있어 헴의 생물학적 방법을 통한 생산에 이용할 수 있는 균주이다.
실시예
2: 사용 배지
본 발명에서 사용한 배지는 M9 배지로 알려진 배지 조성을 변형한 배지 조성을 갖는다. 본 발명의 배지 조성에 있어 가장 큰 특징은 바이카보네이트, 썩시네이트 및 글리신을 포함하고 있다는 점이다. 이에 더하여 성장 인자로 티아민, 바이오틴, 니코틴산, 판토텐산, 코발아민 등에서 선택된 일군의 비타민류를 포함하고 있으며, 또한 고농도의 pH 완충 성분을 특징적으로 포함하고 있다. 본 실시예에서 사용한 배지 조성은 다음의 표 1과 같다.
| 성분 | 함량 또는 첨가량 |
| NaHCO3 | 10 g/L |
| Glucose | 10 g/L |
| NH4Cl | 0.2 g/L |
| NaCl | 0.1 g/L |
| Glycine | 2 g/L |
| Disodium succinate hexahydrate | 10 g/L |
| CaCl2 | 0.015 g/L |
| MgSO4ㆍ7H2O | 0.246 g/L |
| Ampicillin | 20 μg/ml |
| 미량 원소 용액 (하기 표 2 참조) | 200 μl/L |
| 비타민 용액 (하기 표 3 참조) | 1 ml/L |
| pH 안정화 용액 (하기 표 4 참조) | 500 ml/L |
| IPTG | 0.1 mM |
| 성분 | 함량 |
| Citric acid | 50 g/L |
| ZnSO4ㆍ7H2O | 50 g/L |
| FeSO4ㆍ7H2O | 47.5 g/L |
| Fe(NH4)2(SO4)2ㆍ6H2O | 10 g/L |
| CuSO4ㆍ5H2O | 2.5 g/L |
| MnSO4ㆍH2O | 0.5 g/L |
| H3BO3 | 0.5 g/L |
| Na2MoO4ㆍ2H2O | 0.5 g/L |
| CoCl2ㆍ2H2O | 0.5 g/L |
| NiSO4ㆍ6H2O | 0.5 g/L |
| 성분 | 함량 |
| ThiaminㆍHCl | 1 mg/L |
| Nicotinic acid | 5 mg/L |
| Pantothenic acid | 1 mg/L |
| Biotin | 0.01 mg/L |
| Cobalamin | 1.4 mg/L |
| 성분 | 첨가량 (1 L) |
| 0.2 M Na2HPO4 용액 | 333.3 ml |
| 0.2 M KH2PO4 용액 | 666.7 ml |
또한 상기 배지에서 썩시네이트와 글리신이 첨가되지 않은 배지도 제조하였다. 이는 음성 대조 실험에 사용하였다.
한편, 바이카보네이트를 첨가하는 대신에 이산화탄소 기체를 공급하는 방식도 기술적으로 동일한 효과를 제공할 것으로 생각되어, 이에 대한 조사를 실시하기 위해 바이카보네이트가 배제되고 다른 성분들은 동일하게 포함한 배지도 준비하였다.
실시예
3: 배양 방법
5-아미노레불린산, 포르피린, 포르피린 유사체 또는 헴의 생산은 다음의 방법으로 실시하였다. 생산균주의 단일콜로니(single colony)를 3 ml의 LB(Luria-Bertani) 배지를 포함하는 15 ml 튜브에 접종하여 37℃에서 250 rpm으로 교반하면서 16시간 동안 배양하였다. 이렇게 배양한 배양액을 실시예 2에 제시된 바이카보네이트까지가 포함된 배지에 부피비로 5%의 양을 접종해 준 다음에 본배양을 실시하였다. 본배양도 37℃에서 250 rpm으로 교반하는 방식으로 48시간 동안 실시하였다.
추가 실험으로, 실시예 2에 제시된 바이카보네이트가 배제된 배지를 사용하여 동일한 방식으로 본배양을 실시하는 실험도 실시하였다. 단, 이때에는 배제된 바이카보네이트의 역할을 보완하기 위해서 이산화탄소를 포함한 혼합가스(21%산소, 3% 이산화탄소, 76% 질소)를 2 L/min의 속도로 공급해 주었다.
실시예
4: 분석 방법
균체 농도는 통상의 방법에 따라 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 600 nm에서의 흡광도를 측정하는 방식으로 분석하였다.
헴을 포함한 포르피린 유사체들에 대한 분석은 다음과 같이 실시하였다. 5-아미노레불린산(5-aminolevulinic acid; ALA)과 포르포빌리노겐(porphobilinogen; PBG)의 분석을 위하여 배양액 1 ml을 원심분리(4℃에서 13,000 rpm으로 5분간 원심분리)하여 상등액을 회수하였다. 회수한 상등액로부터 ALA/PBG column test kit(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)을 이용한 이온-교환 크로마토그래피(ion-exchange chromatography)를 이용하여 ALA와 PBG를 분리하였다. 분리한 ALA와 PBG의 양은 보고된 방법(Int. J. Biochem. Cell Biol. 30: 535-543, 1998)에 따라 Ehrlich's reagent와 반응시켜 발색시킨 다음에 550 nm에서 흡광도를 측정하는 방식으로 분석하였다.
헴의 분석은 다음과 같이 실시하였다. 배양액 1 ml을 원심분리(4℃에서 13,000 rpm으로 5분간 원심분리)한 다음에 상등액을 제거하여 균체(세포)만을 회수하였다. 회수한 세포는 1 N NaOH 용액 200 μl에 부유시켰다. 세포 부유액에 대하여 초음파파쇄기(sonicator; UP200S sonicator, Hielscher Ultrasonic GmbH, Teltow, Germany)를 이용하여 0℃에서 1초 간격으로 20분간 30 W로 초음파파쇄를 가하여 세포를 파쇄하였다. 세포파쇄물을 4℃에서 13,000 ×g로 10분간 원심분리한 후 상등액을 얻었다. 회수한 상등액에서 200 μl를 취하여 400 μl의 아세토니트릴(acetonitrile)과 디메틸술폭사이드(dimethylsulfoxide; DMSO)의 4:1 혼합용액과 섞어 주었다. 혼합액을 격렬히 섞어 준 후에, 4℃에서 13,000 ×g로 10분간 원심분리하여 두 개의 층으로 분리되게 하였다. 각각의 층을 회수하여 고성능액체크로마토그래피(high-performance liquid chromatography; HPLC) 분석을 실시하였다. HPLC 분석은 옥타데실실릴 CIS 칼럼(octadecylsilyl CIS column; Xbridge C18, Waters)을 이용하여 역상 HPLC(reverse-phase HPLC; RP-HPLC) 방식으로 실시하였다. HPLC 분석에서 이동상(mobile phase)으로 사용한 용매는 pH 5.16이 되게 아세트산으로 조정한 1 M 암모늄 아세테이트 완충액(ammonium acetate buffer)에 부피비로 86%의 메탄올(methanol)을 혼합하여 제조한 용액을 사용하였다. 이동상 용매는 등용매 용리(isocratic elution) 방식으로 1 ml/min의 속도로 흘려주었다. 검출은 UV 검출기(2489 UV/visible detector; Waters)를 사용하여 400 nm에서의 흡광도를 측정하는 방식으로 실시하였다. 본 분석에서의 표준물질로는 헤민(hemin; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 사용하였으며 표준곡선을 작성한 후, 이를 이용하여 헴을 정량하였다.
우로포르피린 I, 코프로포르피린 I 및 코프로포르피린 III의 분석은 다음과 같이 실시하였다. 배양액 1 ml을 4℃에서 13,000 ×g로 10분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수한 상등액에서 200 μl를 취한 후에 동일부피의 찬 산성의 아세톤(cold acid-acetone; 부피비로 0.2%의 10 N HCl을 포함한 아세톤 혼합액을 냉장 보관한 것)을 가하여 섞어주었다. 혼합액에 대하여 65℃에서의 30분간의 물중탕 방식으로 열처리를 실시하여 회수한 상등액에 포함되어 있던 단백질들을 변성시켰다. 변성된 단백질들은 4℃에서 13,000 ×g로 10분간 원심분리하여 제거하였다. 원심분리 후에 얻은 상등액에 대하여 진공 건조(vacuum drying)를 실시하였다. 진공 건조 후에 남은 분말은 200 μl의 1 N NaOH 용액을 가하여 용해시켰다. 이렇게 하여 얻은 용액을 시료로 사용하여 역상 HPLC 분석을 실시하였다. HPLC 칼럼으로는 옥타데실실릴 CIS 칼럼을 사용하였고, 용매 A(0.05%의 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid)을 포함하고 있는 물)와 용매 B(0.05%의 트리플루오로아세트산을 포함하고 있는 아세토니트릴)의 농도구배(gradient) 방식으로 이동상 용액을 흘려주는 방식으로 분석을 실시하였다. 농도구배의 적용은 처음 5분간은 100% 용매 A를 흘려주고, 그 후의 25분간은 0-50%의 부피비로 용매 B를 증가시키면서 흘려주었고, 마지막 10분간은 50-100%의 부피비로 용매 B를 증가시키면서 흘려주는 방식으로 실시하였다. 이동상 용액은 1 ml/min의 속도로 흘려주었다. 검출은 UV 검출기(2489 UV/visible detector; Waters)를 사용하여 400 nm에서의 흡광도를 측정하는 방식으로 실시하였다.
포르피린 유사체들의 확인에는 통상의 방법에 따라 LC/MS(liquid chromatography/mass spectrometry) 분석법을 이용하였다. 이를 간단히 설명하면 다음과 같다. 배양액 10 ml을 원심분리(4℃에서 6,000 ×g로 5분간 원심분리)하여 세포를 회수하였다. 세포는 0.85% NaCl용액으로 세척해 주었다. 그리고 나서 세포를 200 μl의 아세토니트릴과 디메틸술폭사이드의 1:1 혼합용액에 부유시켰다. 세포 부유액에 대하여 초음파파쇄기(sonicator; UP200S sonicator, Hielscher Ultrasonic GmbH, Teltow, Germany)를 이용하여 0℃에서 1초 간격으로 20분간 30 W로 초음파파쇄를 가하여 세포를 파쇄하였다. 세포파쇄물을 4℃에서 13,000 ×g로 10분간 원심분리한 후 상등액을 얻었다. 회수한 상등액을 LC/MS 시료로 사용하였다.
실시예
5: 분석 결과
썩시네이트와 글리신이 첨가되지 않은 배지를 사용하면 헴이 전혀 생산되지 않으며, 썩시네이트와 글리신을 첨가해 줄 때만이 헴의 생산이 가능하였다. 썩시네이트와 글리신의 첨가에 더하여 pH 완충 성분과 바이카보네이트를 첨가한 경우는 썩시네이트와 글리신만 첨가한 경우와 비교하여 60% 이상의 헴 생산을 증가시켰다. 이때 배지의 pH 유지는 효율적인 헴 생산에 있어 매우 중요한 요소임을 확인할 수 있었다. 또한 성장 인자의 첨가는 헴 생산에 긍정적인 영향을 주었는데, 썩시네이트와 글리신만을 첨가해 준 경우와 비교할 때 pH 완충 성분, 바이카보네이트 및 성장 인자 모두를 첨가해 준 경우에서의 헴 생산이 2배 정도 증가하였다. 헴 생산 확인 결과는 도 3에 제시되어 있다. 또한 바이카보네이트 첨가 대신에 이산화탄소를 포함한 혼합가스를 공급해 주는 것도 유사한 효과를 제공해 줄 수 있음도 확인하였다. 이러한 혼합가스 공급 방식은 배양 규모를 증가시킬 때 보다 유리할 것으로 생각한다.
한편, 본 발명을 따르면 헴 이외에 다양한 포르피린 유사체들이 생산되는 것도 확인할 수 있었다. LC/MS를 통해 이를 확인한 결과는 도 4 내지 도 7에 제시되어 있다. LC/MS 결과는 이론적으로 추정한 것과 정확히 일치하였다. 세포 농도 변화 및 헴을 포함한 여러 배양 산물들의 배양 시간에 따른 생성에 대한 분석 결과는 도 8에 제시되어 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (18)
- 썩시네이트(succinate), 글리신(glycine), 성장 인자, 및 C4 경로 강화성분으로 바이카보네이트(bicarbonate)가 포함되며, 바이카보네이트의 농도가 0.01-50 g/L인 것을 특징으로 하는, 5-아미노레불린산, 포르피린(porphyrin), 포르포빌리노겐(porphobilinogen), 1-하이드록시메틸빌란(1-hydroxymethylbilane), 우로포르피린 I(uroporphyrin I), 우로포르피린 III(uroporphyrin III), 코프로포르피린 I(coproporphyrin I), 코프로포르피린 III(coproporphyrin III), 프로토포르피린 IX(protoporphyrin IX) 또는 헴의 생물학적 생산 배지.
- 제 1항에 있어서, 상기 썩시네이트의 농도가 0.01-50 g/L인 것을 특징으로 하는, 배지.
- 제 1항에 있어서, 상기 글리신의 농도가 0.01-20 g/L인 것을 특징으로 하는, 배지.
- 제 1항에 있어서, 상기 성장 인자는 티아민(thiamin), 바이오틴(biotin), 니코틴산(nicotinic acid), 판토텐산(pantothenic acid), 코발아민(cobalamin)에서 선택하는 것을 특징으로 하는, 배지.
- 제 1항에 있어서, 상기 성장 인자의 농도가 0.001-10 mg/L인 것을 특징으로 하는, 배지.
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 하나의 항에 있어서, pH 안정화 능력 강화 성분이 더욱 포함되며, 상기 pH 안정화 능력 강화 성분의 농도가 10-500 mM인 것을 특징으로 하는, 배지.
- 제 6항에 있어서, 상기 pH 안정화 능력 강화 성분이 인산염인 것을 특징으로 하는, 배지.
- 제 1항에서 정의된 배지를 준비하는 단계; 준비된 배지에 5-아미노레불린산, 포르피린(porphyrin), 포르포빌리노겐(porphobilinogen), 1-하이드록시메틸빌란(1-hydroxymethylbilane), 우로포르피린 I(uroporphyrin I), 우로포르피린 III(uroporphyrin III), 코프로포르피린 I(coproporphyrin I), 코프로포르피린 III(coproporphyrin III), 프로토포르피린 IX(protoporphyrin IX) 또는 헴의 생물학적 생산에 적합한 생산균주를 접종하는 단계; 및 생산균주를 배양하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는, 5-아미노레불린산, 포르피린(porphyrin), 포르포빌리노겐(porphobilinogen), 1-하이드록시메틸빌란(1-hydroxymethylbilane), 우로포르피린 I(uroporphyrin I), 우로포르피린 III(uroporphyrin III), 코프로포르피린 I(coproporphyrin I), 코프로포르피린 III(coproporphyrin III), 프로토포르피린 IX(protoporphyrin IX) 또는 헴의 생물학적 생산 방법.
- 제 8항에 있어서, 배지를 준비하는 단계에서 배지에 pH 안정화 능력 강화 성분이 더욱 포함되며, 상기 pH 안정화 능력 강화 성분의 농도가 10-500 mM인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제 9항에 있어서, 상기 pH 안정화 능력 강화 성분이 인산염인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제 1항에서 정의된 배지를 준비하는 단계; 준비된 배지에 5-아미노레불린산, 포르피린(porphyrin), 포르포빌리노겐(porphobilinogen), 1-하이드록시메틸빌란(1-hydroxymethylbilane), 우로포르피린 I(uroporphyrin I), 우로포르피린 III(uroporphyrin III), 코프로포르피린 I(coproporphyrin I), 코프로포르피린 III(coproporphyrin III), 프로토포르피린 IX(protoporphyrin IX) 또는 헴의 생물학적 생산에 적합한 생산균주를 접종하는 단계; 이산화탄소 기체 또는 이산화탄소 기체를 포함하고 있는 혼합가스를 공급하면서 생산균주를 배양하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는, 5-아미노레불린산, 포르피린(porphyrin), 포르포빌리노겐(porphobilinogen), 1-하이드록시메틸빌란(1-hydroxymethylbilane), 우로포르피린 I(uroporphyrin I), 우로포르피린 III(uroporphyrin III), 코프로포르피린 I(coproporphyrin I), 코프로포르피린 III(coproporphyrin III), 프로토포르피린 IX(protoporphyrin IX) 또는 헴의 생물학적 생산 방법.
- 제 11항에 있어서, 배지를 준비하는 단계에서 배지에 pH 안정화 능력 강화 성분이 더욱 포함되며, 상기 pH 안정화 능력 강화 성분의 농도가 10-500 mM인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제 12항에 있어서, 상기 pH 안정화 능력 강화 성분이 인산염인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제 11항에 있어서, 상기 혼합가스는 이산화탄소를 0.5-30% 포함하고 있는 것을 특징으로 하는, 방법.
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